CN116836250A - GmTB1a/b在调控大豆分枝数和产量中的应用 - Google Patents

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CN116836250A CN202310857810.8A CN202310857810A CN116836250A CN 116836250 A CN116836250 A CN 116836250A CN 202310857810 A CN202310857810 A CN 202310857810A CN 116836250 A CN116836250 A CN 116836250A
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Abstract

本发明公开了GmTB1a/b在调控大豆分枝数和产量中的应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及GmTB1a/b在调控大豆分枝数和产量中的应用。本发明提供了蛋白质GmTB1a和GmTB1b或调控其表达物质或调控蛋白质活性或含量的物质在调控植物叶片结构中的应用。实验证明，蛋白质GmTB1a和GmTB1b可以调控大豆分枝数或/和产量，通过基因敲除GmTB1a和GmTB1b发现，蛋白质GmTB1a和GmTB1b可以控制大豆分枝数或/和产量增加，对优势大豆创制和大豆育种具有重要的理论意义。

Description

GmTB1a/b在调控大豆分枝数和产量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及GmTB1a/b在调控大豆分枝数和产量中的应用。
背景技术
株型改良是培育大豆高产品种的有效途径，一直是大豆育种的重要目标。在过去的几十年里，株型育种在提高大豆产量方面发挥了重要作用。其中，成功的例子是将大豆抗倒伏的有限结荚习性基因dt1转育到无限结荚习性的高产品种中，从而培育出适宜窄行高密植的半矮杆高产新品种。但是，大豆单产与水稻、玉米和小麦等高产作物相比，差距巨大。其中一个重要原因就是水稻、玉米和小麦等通过矮化育种相继完成了各自的绿色革命。与水稻等禾本科作物不同，大豆荚着生在主茎或分枝节部，且每节能够承载荚数有限，单纯通过矮化育种并不能大幅提高大豆单产，导致大豆绿色革命迟迟不能发生。因此，主茎节数变化不大的情况下，增加分枝数，有望增加单株节数，增加单株荚数，提高大豆产量。但是，调控大豆分枝数的分子机理和作用网络依旧不清晰，也未见GmTB1a/b调控大豆分枝数的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高增加分枝数，增加单株荚数，以提高大豆产量。
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分枝数或/和产量中的应用。
本发明所提供的应用为蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分枝数或/和产量中的应用；
2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物分枝数或/和产量的产品中的应用；
3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育分枝数或/和产量改变的植物中的应用；
4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育分枝数或/和产量改变的植物的产品中的应用；
5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质和氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质组成的组合物；
G2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质或氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
G3)将G1)和G2)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物分枝数或/和产量相关功能的蛋白质；
G4)在G1)或G2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上文所述氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的名称为GmTB1a。
上文所述氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的名称为GmTB1b。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述调控分枝数或/和产量可为增加分枝数或/和提高产量。
上述应用中所述的蛋白质来源于大豆(Glycine max(L.)Merr.)。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GmTB1a和GmTB1b。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达的物质和调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：
c1)编码前文所述蛋白的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述生物材料中，c1)所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子：
d1)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
d2)编码区序列是序列表中SEQ ID NO.5所示的DNA分子；
d3)核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
d4)编码区序列是序列表中SEQ ID NO.6所示的DNA分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
上述e3)中，所述重组载体可为用植物基因编辑载体。所述植物基因编辑载体可为pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b载体。
作为一个具体实施例，所述重组载体为重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。所述重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b是将在pYLCRISPR/Cas9P35-B载体限制性内切酶Bsa I的酶切位点之间插入针对GmTB1a和GmTB1b基因表达的sgRNA1和sgRNA2(所述sgRNA1的靶序列为序列1的第839-858位的DNA片段或序列3的第1902-1921位的DNA片段，所述sgRNA2的靶序列为序列1的第845-863位的DNA片段或序列3的第1908-1926位的DNA片段)的表达盒，且保持pYLCRISPR/Cas9P35-B载体其他序列不变得到的重组载体。将重组质粒命名为重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。
上述e4)所述的微生物可为农杆菌。所述农杆菌为EHA105。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GmTB1a和GmTB1b的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GmTB1a和GmTB1b的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GmTB1a和GmTB1b且具有蛋白质GmTB1a和GmTB1b功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。
可用现有的植物表达载体构建包含所述GmTB1a和GmTB1b基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用GmTB1a和GmTB1b基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明还提供了一种调控植物分枝数或/和产量的方法。
本发明提供的调控植物分枝数或/和产量的方法，包括通过同时调控蛋白质GmTB1a与GmTB1b的编码基因的表达或调控所述蛋白质的活性和/或含量，或调控所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，来调控植物分枝数或/和产量。
本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。
本发明还提供了培育分枝数或/和产量改变的植物的方法。
本发明提供的培育分枝数或/和产量改变的植物的方法，包括下调或抑制或降低目的植物中所述蛋白质GmTB1a与GmTB1b的编码基因的表达量，或/和下调或抑制或降低所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到分枝数或/和产量改变的植物。
上述培育方法中，所述下调或抑制或降低目的植物中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，所述蛋白的编码基因的表达量可通过向受体植物中导入包含抑制或降低或沉默所述蛋白质GmTB1a和GmTB1b的的编码基因表达的核酸分子的重组表达载体，得到植物分枝数或/和产量提高的目的植物。
所述GmTB1a和GmTB1b基因编码所述GmTB1a和GmTB1b蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述培育分枝数或/和产量改变的植物的方法包括如下步骤：
1)构建包含抑制或降低或沉默SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示DNA分子的重组表达载体；
2)将步骤1)构建的重组表达载体转入受体植物中；
3)经筛选和鉴定获得分枝数或/和产量改变的转基因植物。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的用于敲除蛋白质GmTB1a和GmTB1b的编码基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物分枝数或/和产量改变的转基因细胞系及转基因植株。携带敲除蛋白质GmTB1a和GmTB1b的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。
作为一个具体实施例，所述重组载体为重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。所述重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b是将在pYLCRISPR/Cas9P35-B载体限制性内切酶Bsa I的酶切位点之间插入针对GmTB1a和GmTB1b基因表达的sgRNA1和sgRNA2(所述sgRNA1的靶序列为序列1的第839-858位的DNA片段或序列3的第1902-1921位的DNA片段，所述sgRNA2的靶序列为序列1的第845-863位的DNA片段或序列3的第1908-1926位的DNA片段)的表达盒，且保持pYLCRISPR/Cas9P35-B载体其他序列不变得到的重组载体。将重组质粒命名为重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。
本发明中，所述植物育种的目的可包括培育分枝数或/和产量改变的植物。
本发明中，前文所述的蛋白质和/或所述的生物材料也属于本发明要求保护的范围。
本发明中，所述植物可为双子叶植物。
上述应用或方法中，所述双子叶植物可为N1)或N2)或N3)或N4)：
N1)豆目植物；
N2)豆科植物；
N3)大豆属植物；
N4)大豆。
上文中，所述大豆可为大豆品种天隆1号。
本发明通过编辑大豆GmTB1a基因和GmTB1b基因，通过CRISPR-Cas9载体对大豆内源GmTB1a或/和GmTB1b的基因进行敲除，获得单突或者双突变体，基因敲除大豆植株分枝数增加，在子叶处长出分枝，提高了大豆产量。实验结果表明大豆GmTB1a/b是调控大豆分枝数、提高产量的重要候选基因，具有潜在的育种价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中野生型对照(WT)和tb1-10和tb1-12的T1代突变体单株的表型和分子鉴定。
图2为本发明实施例1中野生型对照(WT)和tb1-10和tb1-12的T2代纯合突变体表型鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的pYLsgRNA-AtU3b、pYLsgRNA-AtU3d和pYLCRISPR/Cas9P35S-B质粒由华南农业大学生命科学学院刘耀光教授馈赠，已记载于：Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,GuoJ,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu Y.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.MolecularPlant.2015.8:1274-1284.公众可以从华南农业大学生命科学学院刘耀光教授处获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的根癌农杆菌EHA105记载于：Bao A,Chen H,Chen L,Chen S,HaoQ,Guo W,Qiu D,Shan Z,Yang Z,Yuan S,Zhang C,Zhang X,Liu B,Kong F,Li X,Zhou X,Tran LP,Cao D.CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmSPL9 genesalters plant architecture in soybean.BMC Plant Biol.2019.19(1):131.”公众可以从中国农业科学院油料作物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的大豆品种天隆一号记载于：Chen L,Yang H,Fang Y,Guo W,ChenH,Zhang X,Dai W,Chen S,Hao Q,Yuan S,Zhang C,Huang Y,Shan Z,Yang Z,Qiu D,LiuX,Tran LP,Zhou X,Cao D.Overexpression of GmMYB14 improves high-density yieldand drought tolerance of soybean through regulating plant architecturemediated by the brassinosteroid pathway.Plant Biotechnol J.2021，19(4):702-716.公众可以从中国农业科学院油料作物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
实施例1、GmTB1a/b基因编辑突变体的创制
GmTB1a/b基因编辑突变体的创制具体操作流程如下：
1、sgRNA靶点设计与接头引物合成
从大豆数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Gmax_Wm82_a4_v1)下载GmTB1a(见SEQ ID No.1)，GmTB1b(见SEQ ID No.3)的基因组DNA序列。
GmTB1a基因在大豆品种天隆一号的编码序列(CDS)是SEQ ID No.5，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的GmTB1a蛋白。大豆品种天隆一号的基因组DNA中，编码GmTB1a蛋白的基因组基因如序列表的SEQ ID No.1所示。
GmTB1b基因在大豆品种天隆一号的编码序列(CDS)是SEQ ID No.6，编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的GmTB1b蛋白。大豆品种天隆一号的基因组DNA中，编码GmTB1a蛋白的基因组基因如序列表的SEQ ID No.3所示。
利用CRISPR-P在线软件(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计两个GmTB1a，GmTB1b双基因编辑的靶点序列，分别名为sgRNA1、sgRNA2具体序列如下：
sgRNA1：5’-TGTCCCTCGAAGTCGCGAAG-3’(针对的靶点序列为SEQ ID No.1的第839-858位和SEQ ID No.3的第1902-1921位)；
sgRNA2：5’-TCGAAGTCGCGAAGCGGTT-3’(针对的靶点序列为SEQ ID No.1的第845-863位和SEQ ID No.3的第1908-1926位)。
根据sgRNA1序列和sgRNA2序列合成两个靶点的Oligo DNA单链正反向引物序列，序列如下：
AtU3b-sgRNA1-F：5’-gtcaTGTCCCTCGAAGTCGCGAAG-3’；
AtU3b-sgRNA1-R：5’-aaacCTTCGCGACTTCGAGGGACA-3’；
AtU3d-sgRNA2-F：5’-gtcaAACCGCTTCGCGACTTCGA-3’；
AtU3d-sgRNA2-R：5’-aaacTCGAAGTCGCGAAGCGGTT-3’。
2、GmTB1a/b基因编辑突变体的创制
a.靶点接头制备：将接头引物用TE溶解成100μM母液，各取1μL加入到98μL0.5x TE混合稀释到1μM。约90℃30S，移至室温冷却完成退火。
b.sgRNA表达盒的制备：
1)在10μL Bsa I-内切酶Buffer中加入ATP至终浓度0.5-1.0mM，加入20ngpYLsgRNA-AtU3b质粒(预先配好20ng/μL保存)，0.5μL sgRNA1接头(最终浓度0.05-0.1μM)，5U BsaI，35U T4 DNA ligase。用PCR仪反应5-10个循环：37℃5min，20℃5min。
2)在10μL Bsa I-内切酶Buffer中加入ATP至终浓度0.5-1.0mM，分别加入20ngpYLsgRNA-AtU3b/LacZ(GeneBank登录号：KR029098)和pYLsgRNA-AtU3d(GeneBank登录号：KR029099)质粒(预先配好20ng/μL保存)，0.5μL sgRNA2接头(最终浓度0.05-0.1μM)，5UBsaI，35U T4 DNA ligase。用PCR仪反应5-10个循环：37℃5min，20℃5min。
c.sgRNA表达盒的扩增
在50μL反应体系种加入1μL上述酶切-连接产物为模板，分别用T1和T2的引物组合(工作液1.5μM)，适量高保真PCR酶及其工作液，在95℃10s，58℃15s，68℃20s。25-35个循环条件下完成sgRNA表达盒的扩增。
T1引物组合：
Uctcg-B1’：5’-TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
gRctga-B2：5’-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’
T2引物组合:
Uctga-B2’：5’-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
BL：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’
将PCR产物进行凝胶电泳，确定产物大小后和大致浓度后，根据各样品产物估算的量，把两个PCR回收产物大致等量混合，用PCR产物纯化试剂盒纯化回收扩增产物，得到靶标sgRNA表达盒，所述靶标sgRNA表达盒表达sgRNA1和sgRNA2。
(3)gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9P35-B的连接与转化
在15μL BsaI-连接反应液中加入约50ng混合回收产物(即步骤2中获得的sgRNA表达盒)，加入60-100ng pYLCRISPR/Cas9P35-B((GeneBank登录号：KR029113)质粒，加入5-10U BsaI 37℃酶切10min，加入1.5μL 10 x DNA ligase buffer和35U ligase。
用PCR仪循环酶切连接约15循环:37℃5min；10℃3min，20℃5min；最后37℃5min，将酶切酶连产物转化大肠杆菌。冰浴静置30分钟，轻轻取出，42℃热激60秒，置于冰上2分钟；加入600μl LB液体培养基，37℃150rpm复苏培养1小时后铺板，取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行PCR鉴定，测序分析靶点序列，如两个靶点序列均存在，则表明该重组载体表达sgRNA1、sgRNA2已经成功转入pYLCRISPR/Cas9P35-B中，并将上述构建的重组表达载体命名为pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。重组质粒pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b的核苷酸序列是序列表中的序列7。
重组表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b的结构描述如下：在pYLCRISPR/Cas9P35-B载体限制性内切酶Bsa I的酶切位点之间插入sgRNA1和sgRNA2表达盒(即序列为序列7的第7344-8313位的DNA片段)保持pYLCRISPR/Cas9P35-B载体其他序列不变得到的重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。
pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b表达靶向于GmTB1a和GmTB1b基因的sgRNA1，靶序列为：5’-TGTCCCTCGAAGTCGCGAAG-3’，该sgRNA1的靶点位于GmTB1a基因的第一外显子，位于GmTB1b基因的第一外显子，该sgRNA1的靶点的核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第839-858位和SEQ ID No.3的第1902-1921位。
pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b表达靶向于GmTB1a和GmTB1b基因的sgRNA2，靶序列为：5’-TCGAAGTCGCGAAGCGGTT-3’，该sgRNA2的靶点位于GmTB1b基因的第一外显子，位于GmTB1b基因的第一外显子，该sgRNA2的靶点的核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第845-863位和SEQ ID No.3的第1908-1926位。
实施例2、GmTB1a/b基因编辑大豆的获得和鉴定
1、大豆遗传转化
将重组表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b转化到根癌农杆菌EHA105中，得到重组根癌农杆菌EHA105-pYLCRISPR/Cas9P35S-GmTB1a/b。所用大豆品种为天隆一号，作为受体材料进行子叶节介导的大豆遗传转化。具体方法参照文献“Bao A,Chen H,Chen L,Chen S,Hao Q,Guo W,Qiu D,Shan Z,Yang Z,Yuan S,Zhang C,Zhang X,Liu B,Kong F,LiX,Zhou X,Tran LP,Cao D(2019)CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis ofGmSPL9 genes alters plant architecture in soybean.BMC Plant Biol.19(1):131.”，获得T0代转基因大豆植株，再进行扩繁，获得T1和T2代转基因大豆植株。
2、GmTB1a/b基因编辑突变体的分子鉴定
分别提取步骤1中获得的T1代基因大豆突变体单株的叶片基因组DNA，以野生型大豆品种天隆一号为阴性对照(简称WT)，分别以TB1a-F和TB1a-R，以及TB1b-F和TB1-R为引物，进行PCR扩增，然后用1％琼脂糖电泳分离PCR产物。利用软件DNAMAN Version 9.0和BioEdit 7.0对纯化后的PCR产物进行测序和分析。具体鉴定引物如下：
TB1a-F1:5’-ACGGCAATGACCTAATCTCGT-3’
TB1a-R1:5’-GATGATGCACTCTTGCCACC-3’
TB1b-F1:5’-TGGTGCAGTCCCAAGCTTAAT-3’
TB1b-R1:5’-CACTCTTCGCACCACCAACA-3’
结果如图1所示：纯合突变体的序列和野生型大豆品种天隆一号参考序列相比，存在缺失或插入突变。通过序列比对分析鉴定，获得T1代GmTB1a/b双基因突变体tb1-10和tb1-12(图1中B和C)。
其中GmTB1a在SEQ ID No.1的序列第849位至870位有7个碱基插入的同时有21个碱基缺失，导致GmTB1a蛋白的氨基酸序列提前终止；GmTB1b在SEQ ID No.3的序列第1911-1912位碱基缺失，导致GmTB1b氨基酸序列提前终止。其中，tb1-10和tb1-12为2个不同的转基因事件，但都是GmTB1a和GmTB1b双基因纯合突变。
tb1-10和tb1-12与野生型相比，对于GmTB1a基因，在SEQ ID No.1的序列第849位至870位有7个碱基插入的同时有21个碱基缺失，导致GmTB1a氨基酸序列提前终止。该突变使序列表中序列1的第850-870位的核苷酸“5’-GTCGCGAAGCGGTTTTTCGGG-3’”缺失，同时在序列表中序列1的第849位后有7核苷酸“5’-AAACCGC-3’”的插入，引起了移码，导致翻译提前终止，造成GmTB1a蛋白功能缺失，从而将GmTB1a基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中B。对于GmTB1b基因，在SEQ ID No.3的序列第1911-1912位的核苷酸“AA”缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成GmTB1b蛋白功能缺失，从而将GmTB1b基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中C。
2、GmTB1a/b基因编辑突变体的表型鉴定
挑取籽粒饱满且表面光滑无病斑的野生型大豆天隆一号和T1代纯合的双突变体株系tb1-10和tb1-12的大豆种子，播种于营养土中(土和蛭石比例3:1)，每盆2粒，长日照(14h光照/10h黑暗)，28℃培养；持续观察野生型大豆和转基因大豆突变体表型，第一个三出复叶长出时期(简称V1期)拍照并记录。
结果表明，tb1-10和tb1-12的T1代基因突变体都在V1期时，在子叶节处有两个分枝，而野生型大豆没有分枝(图1中A)。
待收获种子后，将野生型WT，tb1-10和tb1-12的T2代双基因突变体大豆种子，播种在营养土中(土和蛭石比例3:1)，在人工气候室(14h光照/10h黑暗)，28℃培养；持续观察野生型和转基因大豆突变体表型并拍照并记录。
结果表明，tb1-10和tb1-12两个株系的双突变体，都在第一个三出复叶长出时，在子叶节处有两个分枝，而野生型大豆没有分枝(图2中A)。
等到大豆成熟时，拷种表型性状，结果表明，tb1-10和tb1-12两个株系的双突变体的分枝数、单株荚数和单株粒数都增加(图2中B、C和D)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
U1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分枝数或/和产量中的应用；
U2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物分枝数或/和产量的产品中的应用；
U3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育植物分枝数或/和产量改变的植物中的应用；
U4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育植物分枝数或/和产量改变的植物的产品中的应用；
U5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质和氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质组成的组合物；
G2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质或氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
G3)将G1)和G2)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物分枝数或/和产量相关功能的蛋白质；
G4)在G1)或G2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于大豆。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：
c1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
e1)抑制或降低或沉默权利要求1或2所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子，
d1)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
d2)编码区序列是序列表中SEQ ID NO.5所示的DNA分子；
d3)核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
d4)编码区序列是序列表中SEQ ID NO.6所示的DNA分子。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：e3)所述重组载体为核苷酸序列是SEQ IDNO.7所示的DNA分子。
6.一种调控植物分枝数或/和产量的方法，其特征在于：包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和调控权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物分枝数或/和产量。
7.培育分枝数或/和产量改变的植物的育种方法，包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和调控权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到植物分枝数或/和产量改变的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，包括向受体植物中导入包含抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子的重组表达载体，得到植物分枝数或/和产量改变的目的植物；所述编码基因编码权利要求1或2中所述蛋白质。
9.如权利要求1或2中所述的蛋白质和/或权利要求3或4中所述的生物材料。
10.如权利要求1-4任一所述的应用，权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：
所述植物为如下任一种：
N1)双子叶植物
N2)豆目植物；
N3)豆科植物；
N4)大豆属植物；
N5)大豆。
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