CN1243545A - 植物苹果青霉素启动子序列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种陆地棉启动子区域,它来自在形成纤维中表达的苹果青霉素基因。

Description

植物苹果青霉素启动子序列
                         引言技本领域
本发明涉及编码棉花苹果青霉素(expansin)启动子的序列，及其用于在修饰棉花纤维表型中有用的构建体。
本发明特别涉及使用能在棉花中指导感兴趣的DNA序列进行纤维组织转录的体外构建的DNA转录或表达盒以产生表型改变的纤维细胞的方法，和提供或改良棉花纤维的各种特征的方法以及以该方法生产的改良的棉花纤维。背景
一般来说，遗传工程技术涉及改良单独的原核和真核细胞，特别是在培养物中的表型。已证明植物细胞比其它真核细胞更不易改变，这不仅是因为缺乏合适的载体系统，而且也由于所涉及的不同目的所致。对于许多应用，需要能在植物生长的特定阶段或在特定的植物部分控制基因表达。为达到该目的，需要调控序列在合适的细胞类型和/或在植物发育的合适的时间负责所需的转录启动而不对植物的发育和产量产生严重的有害影响。
因此，感兴趣的是能分离可用于在宿主植物生长循环期间的植物细胞中提供所需转录调节的序列。
本发明的一个方面是改变特定细胞类型，如在纤维组织，即棉花纤维细胞中产生的分化的表皮细胞的表型以提供改变或改进特性的成熟细胞类型的能力。棉花是一种具有重要商业意义的植物。除了在纺织品生产中使用棉花纤维外，棉花的其它用途包括含有棉籽油的食品和来自棉籽壳的动物饲料。
尽管作为庄稼的棉花具有重要性，但对棉花纤维表型的培育和遗传改造进展相当缓慢，因为缺乏用于选择性实现纤维表型改变的可靠启动子。为了实现所需的表型改变，需要能启动发育期间纤维细胞转录的转录起始区。因此，棉花生物工程研究的一个重要目的是获得可靠的启动子，它能允许在棉花纤维中选择性地表达蛋白质以影响诸如纤维强度，长度，颜色和可染性的品质。相关文献。
棉花纤维特异性启动子在PCT公开WO94/12014和WO95/08914，以及John和Crow，美国科学院学报，89：5769-5773，1992中讨论。已分离出了优选在棉花纤维中表达的cDNA克隆。其中一个分离的克隆相应于在晚期初生细胞壁和早期次生细胞壁合成阶段期间最高的mRNA和蛋白质。John和Crow，出处同上。
土壤杆菌介导的棉花转化在Umbeck，美国专利号5,004,863和5,159,135中描述，经粒子轰击转化棉花在1992年9月17日公开的WO92/15675中报道。Radke等，理论和应用遗传学(1988)75；685-694；植物细胞报道(1992)11：499-505已描述了芸苔属(Brassica)的转化。
                     发明简述
本发明提供了一种棉花(陆地棉Gossypium hirsutum)启动子区，它来自在纤维形成中表达的苹果青霉素基因。提供了新的DNA启动子序列，且描述了使用来自在棉花纤维中表达的苹果青霉素基因的启动子区指导棉花纤维中目的基因转录的使用方法。
在鉴定对纤维发育至关重要的基因的努力中，我们启动了随机测序选定的cDNA克隆的程序，该克隆来自在次生细胞壁合成达到其最大速率(大约21dpa)的阶段从纤维收获的mRNA制备的文库。
我们已鉴定了一个陆地棉cDNA克隆，它是苹果青霉素基因的同源物。该cDNA克隆的序列与编码其它苹果青霉素的序列同源。已对该基因的5’基因组启动子区的大约2200个碱基对进行了测序。
因此，本申请提供了涉及使用棉花苹果青霉素基因启动子修饰棉花纤维表型的序列及其使用方法。
                     附图描述
图1，棉花苹果青霉素基因编码序列启动子区域5’的大约2200个碱基的核酸序列。
                     发明详述
根据本发明，描述了新的构建体和方法，它可用于在植物宿主细胞，优选在棉花纤维细胞中提供感兴趣的核苷酸序列的转录以产生表型改变的棉花纤维。
棉花纤维是胚珠外珠被的一种分化的单个表皮细胞。它具有四个不同的生长时期；起动，伸长(初生细胞壁合成)，次生细胞壁合成，和成熟。纤维形成的起动似乎由激素触发。初生细胞壁在伸长期产生，并持续到开花后(DPA)25天。次生细胞壁的合成在伸长期停止前开始并持续到大约40DPA，形成的细胞壁几乎是纯的纤维素。
用于该细胞中的构建体可以包括一些形式，这取决于构建体的所需用途。因此，构建体包括载体，转录盒，表达盒和质粒。转录和翻译起动区(有时也称为“启动子”)含有转录和翻译功能元件及可从苹果青霉素基因产生或获得的起动控制区(图1)。
在一些实施方案中，启动子可经过添加诸如增强子的序列或删除非必需和/或不需要的序列进行修饰。“可获得”是指具有启动子的DNA序列与天然启动子足够相似以提供对目的DNA序列转录所需的特异性。它包括天然和合成序列以及可结合合成和天然序列的序列。
用于转录棉花纤维中感兴趣的核苷酸序列的转录盒按转录方向包括来自苹果青霉素的棉花纤维转录起动区，感兴趣的DNA序列和在植物细胞中具有功能的转录终止区。当转录盒提供对感兴趣的DNA序列的转录和翻译时，认为它是表达盒。也可存在一个或多个内含子。
同时可存在其它序列，包括编码所需转运肽和分泌性先导序列的那些序列。
苹果青霉素转录/翻译起动控制区的下游并在其调控下的序列优选是提供对纤维表型进行修饰的感兴趣的核苷酸序列。核苷酸序列优选可以是编码感兴趣的多肽，例如，一种酶的任意开放阅读框或者是互补于基因组序列的序列，其中基因组序列可以是开放阅读框，内含子，非编码先导序列或任意其它序列，其中的互补序列抑制转录，信使RNA加工，例如，剪接或翻译。本发明的核苷酸序列可以是合成的，天然产生的或其结合。取决于感兴趣的DNA序列的特性，可按需要合成具有植物优选密码的序列。植物优选的密码可从在感兴趣的特定植物种类中大量表达的蛋白质的最高频率的密码子测定。表型修饰的实现可经过调节内源性转录或翻译产物的生产，例如，对其量，相对分布等，或调节外源性转录或翻译产物，例如以便在转基因宿主细胞或组织中提供新的功能或产品。特别感兴趣的是编码与植物纤维形成相关的表达产物的DNA序列，包括涉及细胞分裂素，生长素，乙烯，脱落酸等代谢的基因。用于调节细胞分裂素表达的方法和组合物在美国专利号5,177,307中描述，本文引用该说明书以供参考。作为选择，可使用从包括其它真核或原核细胞(包括细菌)来源的各种基因，例如来自根癌土壤杆菌T-DNA生长素和细胞分裂素生物合成基因产物，和来自例如，哺乳动物，例如干扰素的那些基因。
表达盒中采用的终止区首先是一种方便的终止区，因为终止区似乎是可变性相当大的。终止区可以是转录起始区本身的序列，可以是感兴趣的DNA序列本身的序列，也可来自其它来源。终止区可以是天然存在的，或是全部或部分合成的。方便的终止区可从根癌土壤杆菌Ti-质粒获得，如章鱼氨酸合成酶和胭脂氨酸合成酶终止区。在一些实施方案中，需要使用在特定构建体中所用的棉花纤维转录起始区本身的3’终止区。
如本文所述，在一些例子中，构建体中会存在其它的核苷酸序列以提供靶向特定细胞位置的特定基因产物。
对于本领域的技术人员而言，将构建体导入植物细胞宿主的各种技术是可获得的且是已知的。这些技术包括采用根癌土壤杆菌或发根病土壤杆菌作为转染剂用DNA转染，原生质融合，注射，电穿孔，粒子加速等。为了用土壤杆菌转化，可在大肠杆菌中制备质粒，它含有与Ti-质粒同源的DNA，特别是T-DNA。该质粒能够或不能在土壤杆菌中复制，即它可以具有或不具有诸如pRK290的广谱原核复制系统，这部分取决于转录盒是否能整合进Ti-质粒或保留在独立的质粒中。土壤杆菌宿主含有一种质粒，它具有对T-DNA转移进植物细胞所必需的vir基因且可以含有或不含完整的T-DNA。Ti-或Ri-质粒T-DNA的至少右侧边界且通常是左侧及右侧边界作为侧翼区域与转录构建体连接。对T-DNA用于转化植物细胞进行了广泛的研究并在下列文献中进行了充分的描述：EPA系列号120,516，Hoekema，在：双重植物载体系统，Offset-drukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，1985，第V章，Knauf，等，用土壤杆菌表达的宿主范围的遗传分析，在：细菌—植物相互作用的分子遗传学，Puhler，A.编辑，Springer-Verlag，NY，1983，p.245和An，等，EMBO J.(1985)4：277-284。
对于感染，粒子加速和电穿孔，可将缺乏在T-DNA区域发现的特定的肿瘤基因的无臂的Ti-质粒导入植物细胞。借助于辅助质粒，可将构建体转移进根癌土壤杆菌，所得的转染生物用于转染植物细胞；可用转化的根癌土壤杆菌或发根病土壤杆菌培养外植体以便将转录盒转移进植物细胞。作为选择，为了促进整合进植物基因组，转座子的末端重复可用作与转座酶结合的边界。在这种情况下，转座酶的表达应是可诱导的，以便转录构建体一旦整合进基因组，应相当稳定地整合。然后，将转基因植物细胞放入合适的选择培养基中用于选择转基因细胞，随后该转基因细胞生长成愈伤组织，经过在生根培养基中生长长成幼苗并从幼苗产生小植株。
为了证实在转基因细胞和植物中存在转基因，可使用本领域的技术人员已知的方法进行Southern印迹分析。根据产物的特性可使用任意一种方法检测转基因产物的表达，该方法包括免疫测定，酶测定或肉眼观察，例如在合适的植物部分或细胞中检测色素形成。一旦获得转基因植物，可培育它们以产生具有所需表型的纤维。可收获纤维，和/或收集种子。种子可用作培育更多具有所需特征的植物的来源。术语转基因植物和转基因细胞包括转基因植物或者转基因细胞产生的植物和细胞。
本文提供的各种序列可用作分子探针用于分离在本发明中有用的其它序列，例如，从相同或不同植物来源获得相关转录起动区。可从本发明提供的序列获得的相关转录起动区显示出至少大约60％的同源性，更优选的区域与该探针显示出更高的同源性百分数。
特别重要的是获得具有定时和本文所述的组织参数的相关转录起动控制区的能力。因此，经过采用本申请所述的技术和本领域已知的其它技术(如，Maniatis等，分子克隆，实验室手册(冷泉港，纽约)1982)，可测定本发明所述的其它编码区或苹果青霉素的转录起始区。该构建体也可用于与植物再生系统结合以获得植物细胞和植物；因此，该构建体可用于修饰纤维细胞的表型，以提供着色的棉花纤维，作为遗传工程的结果修饰成在此以前不能获得的颜色和/或强度。
使用所述方法可发现棉花的各种变种和品系。培育的棉花种类包括Gossypium hirsutum和G.babadense(超长稳定，或Pima棉花)，它从西半球，和东半球庄稼G.herbaceum和G.arboreum进化而来。
                       实施例
下面的实施例以说明的方式而不是限制的方式提供。
                       实施例1
                       cDNA文库
使用从陆地棉Acala SJ-2纤维制备的polyA+mRNA所产生的cDNA将未扩增的cDNA文库用于制备λUni-Zap载体(Stratagene，LaJolla，CA)，其中所述纤维在次生细胞壁苹果青霉素达到最大比率(13)时的21DPA收获。从cDNA文库随机选择大约250个噬斑，纯化噬菌体，从噬菌体载体切下质粒并转化。
将所得的克隆/插入片断在0.8％琼脂糖凝胶上进行大小筛选(排除低于600bp的DNA插入片断)。
                          实施例2
                      分离并测序cDNA克隆
使用应用生物系统(Foster City，CA)373A型DNA测序仪随机测序质粒DNA插入片断。
                          实施例3
                      Northern和Southern分析
棉花植物(G.hirsutum cv.Coker 130)在温室中生长且在所示的合适时间收获组织并在液氮中冷冻。制备总棉花RNA和棉花基因组DNA并按以前所述(14)进行Northern和Southern分析。
                          实施例4
棉花苹果青霉素基因的鉴定，差别表达和基因组分析
在从棉花纤维特异性cDNA文库中筛选并测序随机cDNA克隆的过程中，发现有一个cDNA克隆在初生细胞壁形成期间非常活跃且与苹果青霉素基因编码的蛋白质具有同源性。
然后将该克隆用作Northern印迹分析的探针以测定在棉花组织和形成的棉花纤维中的差别表达。苹果青霉素基因编码在开花后大约第一天开始到大约第20天初生细胞壁形成期间在纤维形成中高水平表达的mRNA。
                     实施例5
                    基因组DNA
苹果青霉素克隆的cDNA用于探测基因组克隆。从使用来自StratageneTM的λ短条2载体制备的文库获得全长基因组DNA，其中使用从发芽幼苗获得的DNA将该载体用于构建棉花变体Coker 130(Gossypium hirsutum cv.coker 130)的基因组DNA文库。
用苹果青霉素探针探测棉花基因组文库，鉴定并纯化基因组噬菌体候选物。图1提供了苹果青霉素启动子区大约2200碱基对的序列。苹果青霉素酶编码区的起始处在碱基号2297的ATG，且基因组克隆在图1碱基号122处开始。
                         实施例6
                         棉花转化构建体制备
含有与感兴趣的基因和感兴趣的其它遗传元件相连的苹果青霉素启动子序列的启动子构建体以本领域已知的任意方式制备，例如经过连接来制备。外植体制备
Coker315种子经过放入50％Clorox(2.5％次氯酸溶液)中20分钟并在无菌蒸馏水中漂洗3次进行表面消毒。表面灭菌后，种子在含有25ml 1/2×MS盐；1/2×B5维生素；1.5％葡萄糖；0.3％脱乙酰吉兰糖胶的25×150无菌管中发芽。籽苗在28℃黑暗中萌发7天。在第7天将籽苗放入28±2℃的光线中。共同培养和植物再生
含有二元质粒pCGN2917和pCGN2926的根癌土壤杆菌菌株2760的单个菌落转移进5ml MG/L培养基并在30℃生长过夜。细菌培养物刚好在共同培养前用MG/L稀释至1×108细胞/ml。从8日龄籽苗切下下胚轴，切成0.5-0.7cm切片并放在烟草饲养平板上(Horsch等，1985)。使用前一天经过将1.0ml烟草悬浮培养物涂布到含有无抗生素的愈伤组织起动培养基(MS盐：B5维生素：3％葡萄糖：0.1mg/L2，4-D：0.1mg/L细胞分裂素：0.3％脱乙酰吉兰糖胶，高压灭菌前将pH调到5.8)的培养平板上制备饲养平板。使用前将无菌滤纸园片(Whatman#1)放在饲养细胞上面。制备所有的切片后，将各切片浸入根癌土壤杆菌培养基中，印迹到无菌滤纸巾上并转移到烟草饲养平板上。
在饲养平板上共同培养2天后，将下胚轴切片放在含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的新鲜愈伤组织起动培养基上。在28±2℃，30uE16∶8光照：黑暗周期下培养组织4周。在四周时将完整的外植体转移进含有抗生素的新鲜愈伤组织起动培养基中。在第二步两周后，从外植体取出愈伤组织并分配进愈伤组织起动培养基和再生培养基(MS盐：40mM KNO3：10mM NH4Cl：B5维生素：3％葡萄糖：0.3％脱乙酰吉兰糖胶：400mg/L羧苄青霉素：75mg/L卡那霉素)中。
起动2-6个月后鉴定胚发生愈伤组织并传代到新鲜再生培养基中。选择用于发芽的胚，放入静态液体胚脉冲培养基(Stewart和Hsu培养基：0.01mg/l NAA：0.01mg/L细胞分裂素：0.2mg/L GA3)中并在30℃培养过夜。将胚吸印到纸巾上并放入含有40ml用脱乙酰吉兰糖胶固化的Stewart和Hsu培养基的品红盒中。发芽的胚在28±2℃ 50uEm-2s-116∶8光周期下维持。将生根的小植株转移进土壤并在温室中生长。
生长室的棉花生长条件如下：16小时光周期，大约80-85°的温度，大约500μ爱因斯坦的光强度。温室中的棉花生长条件如下：14-16小时光周期，光强度至少为400μ爱因斯坦，白天温度为90-95°F，夜晚温度为70-75°F，相对湿度达到大约80％。植物分析
温室生长的T1植物的花在温室中开花时被标记。在发育的各阶段从这些植物收获棉蕾(棉花花芽)，花，棉桃等并测定观察到的表型或试验酶活性。
上述结果证实了苹果青霉素cDNA如何用于改变转基因植物细胞的表型，及该启动子如何用于修饰转基因棉花纤维细胞。
本说明书引用的所有文献和专利申请作为参考文献引入本文，与各文献或专利申请具体和单独指明作为参考文献引入一样。
尽管为了清楚和了解的目的以说明和实施例的方式在一定程度上详细描述了上述发明，但对本领域的技术人员而言显而易见的是可对其作出某些改变和修饰而不偏离所附权利要求的实质或范围。

Claims (6)

1.一种分离的棉花植物苹果青霉素启动子区的DNA序列。
2.编码权利要求1的序列的启动子，其中所述的棉花苹果青霉素启动子区取自图1的序列。
3.一种重组DNA构建体，含有编码权利要求1-2的序列的任意DNA。
4.一种植物细胞，含有权利要求3的DNA构建体。
5.一种含有权利要求4的细胞的植物。
6.一种修饰棉花植物中纤维表型的方法，所述的方法包括：
用包含构建体的DNA转化植物细胞，所述的构建体具有与感兴趣的基因连接的权利要求3的启动子，
其中所述的感兴趣的基因在纤维细胞中表达时能修饰纤维特性。
CN98801714A 1997-01-07 1998-01-07 植物苹果青霉素启动子序列 Pending CN1243545A (zh)

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