ES2675362T3

ES2675362T3 - ARNi para el control de hongos y oomicetos fitopatógenos mediante la inhibición de la expresión de genes CYP51

Info

Publication number: ES2675362T3
Application number: ES14736841.9T
Authority: ES
Inventors: Karl-Heinz Kogel
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2034-07-09
Also published as: CA2917108A1; EP3431601A2; WO2015004174A1; EP3431601B1; BR112016000395B1; EP3019609A1; EP3019609B1; EP3019609B8; EP3431601A3; US11441147B2; US20160215290A1; BR112016000395A2; CN105518136A

Abstract

Una molécula de ARNdc capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, el gen CYP51B y el gen CYP51C de un fitopatógeno del género Fusarium, comprendiendo el ARNdc: i) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51A; ii) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51B; iii) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51C; y iv) secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias a las secuencias sentido (i), (ii) y (iii); en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria.

Description

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DESCRIPCION

ARNi para el control de hongos y oomicetos fitopatógenos mediante la inhibición de la expresión de genes CYP51 Campo de la invención

La presente invención se refiere al silenciamiento génico de genes CYP51 de un fitopatógeno del género Fusarium mediado por ARN de doble cadena. Por consiguiente, la presente invención se refiere a moléculas de ARNdc para la inhibición de la expresión de los genes CYP51 y el uso de tales moléculas de ARNdc inhibidoras para controlar hongos y/u oomicetos fitopatógenos; a secuencias de ADN que proporcionan un molde transcripcional para moléculas de ARNdc inhibidoras o ARN antisentido; y plantas transgénicas tolerantes a fitopatógenos que comprenden tales secuencias de ADN.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades de plantas causadas por hongos y oomicetos fitopatógenos son un riesgo serio en el cultivo de plantas. Las enfermedades de los cultivos de cereales tales como la fusariosis de la espiga y la podredumbre de la raíz causadas por los hongos fitopatógenos del género Fusarium ejercen mayor impacto económico y agronómico sobre la producción global de los cereales y la industria de los cereales. Los daños causados por los hongos y oomicetos fitopatógenos deterioran la calidad y la producción de los productos agrícolas hasta la pérdida total de los cultivos y, por lo tanto, dan como resultado pérdidas económicas significativas. Además, se puede comprometer la seguridad de los alimentos por la contaminación de los productos agrícolas con micotoxinas, que se producen por hongos fitopatógenos durante la infestación de la planta y representan un a grave amenaza para la salud de los seres humanos y de los animales. El riesgo de pérdidas devastadoras debido a los hongos y oomicetos fitopatógenos es particularmente alto en monocultivos, que actualmente representan el procedimiento predominante de producción de plantas de cultivos agrícolas.

En la actualidad, las principales estrategias en la gestión de hongos y oomicetos fitopatógenos incluyen la aplicación ampliamente usada de fungicidas, de estrategias de mejora de resistencia, control biológico e ingeniería genética. La última estrategia se basa en el uso de transgenes tales como quitinasa, defensinas, poligalacturonasa, y el uso de enzimas detoxificantes de micotoxina. Sin embargo, el uso de tales rasgos antifúngicos hasta ahora no ha proporcionado soluciones prácticas convincentes en términos de eficacia y fiabilidad en la práctica agronómica.

Los fungicidas, tales como los IDM (inhibidores de desmetilación) sistémicos, son actualmente esenciales para el control de enfermedades de plantas tales como fusariosis para lograr el nivel de producción que se puede alcanzar con las modernas variedades de cultivo de alto rendimiento. Los fungicidas IDM, tales como tebuconazol, triadimefon y procloraz, inhiben la biosíntesis de ergosterol al unirse a la lanosterol C-14 a-desmetilasa del citocromo P450 (CYP51), lo que da como resultado la alteración de la integridad de la membrana fúngica (Yoshida: Lanosterol 14a- demethylase. En: Schenkman, H., Grein, K. (Eds.), Cytochromes P450. Springer-Verlag, Berlín, 1993. páginas 627639). Sin embargo, la gran dependencia de los fungicidas IDM desde su descubrimiento a mediados de la década de 1970 ha llevado a la aparición de muchas cepas de fitopatógenos resistentes a IDM durante los últimos años. Por estas razones, el control de enfermedades de plantas causado por hongos y oomicetos fitopatógenos continúa siendo un reto.

Liu y col. (Fungal Genetics and Biology 2011, 48, 113-123) han documentado que los genes parálogos cyp51 en Fusarium graminearum median la sensibilidad diferencial a los inhibidores de la desmetilación del esterol.

El ARN de interferencia, también conocido como "ARNi", ha surgido como una herramienta genética que aceleró la investigación en biotecnología de plantas. El ARNi es una parte integral conservada de los procesos de regulación génica presentes en todos los eucariotas. Para el ARNi en plantas, se ha usado la expresión alternativa "silenciamiento génico postranscripcional" (SGPT). El SGPT comienza con el procesamiento o la escisión de un ARN de doble cadena precursor en ARN de interferencia (ARNip) de cadena simple o doble de aproximadamente 20-25 ribonucleótidos de longitud, o micro ARN (ARNmi) (Hamilton & Baulcombe, Science 286:950-952. 1999) mediante una enzima de tipo RNasalII llamada Dicer (Baulcombe, Nature 431:356-363. 2004). Los ARNip o ARNmi se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, del inglés RNA-induced silencing complex) que reconoce moléculas de ARN mensajero (ARNm) complementarias y las degrada, lo que resulta en niveles sustancialmente reducidos de traducción de proteínas y la desactivación de manera eficaz del gen correspondiente.

La expresión de ARN de doble cadena in planta se ha descrito recientemente para inducir el silenciamiento génico inducido por la planta hospedadora (HIGS, del inglés host plant-induce gene silencing) en células fúngicas. En la planta del tabaco, se documentó que el casete de interferencia del gen GUS (p-glucuronidasa) reduce de manera específica los niveles del tránscrito en una cepa de Fusarium verticillioides que expresa GUS durante la colonización de la planta (Tinoco y col., BMC Biol. 31(8):27. 2011). Nowara y col. (Plant Cell 22:3130-41. 2010) prepararon cebada que expresa un ARN de doble cadena dirigido al gen efector fúngico Avra10 y documentaron números reducidos de haustorios funcionales dentro de las células epidérmicas de las hojas. El silenciamiento transitorio de Puccinia triticina (roya foliar) mediado por Agrobacterium tumefaciens de genes de patogenicidad proteína cinasa 1 activada por mitógeno (PtMAPK1), ciclofilina (PtCYC1) y calcinoulina B (PtCNB) se describió que suprimía parcialmente el crecimiento de P. triticina, P. graminis y P. striiformis en trigo (Panwar y col., Plant J 73:521-32.

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2013). Los cereales transgénicos que expresan construcciones de ARNi diseñadas para silenciar determinados genes críticos en patógenos que provocan enfermedades en cereales se describen en el documento WO 2012/155112.

Fue un objeto de la presente invención proporcionar una estrategia basada en ARNi contra fitopatógenos fúngicos y de oomicetos, y en particular, proporcionar un procedimiento y medios para controlar tales fitopatógenos en la práctica agronómica.

Sumario de la invención

Los inventores han descubierto que el ARNi dirigido a al menos un gen CYP51 de un hongo u oomiceto fitopatógeno es eficaz en el control de tales fitopatógenos. Por consiguiente, los productos de protección de la planta y las plantas transgénicas basadas en dicha nueva estrategia pueden ser útiles en la producción de plantas de cultivo.

La presente invención proporciona una molécula de ARNdc capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, del gen CYP51B y del gen CYP51C de un fitopatógeno del género Fusarium. La molécula de ARNdc de la invención comprende:

(i) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51A,

(ii) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51B,

(iii) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51C, y

(iv) una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria a las secuencias sentido (i), (ii) y (iii),

en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria.

La presente invención proporciona adicionalmente una secuencia de ADN o una multitud de secuencias de ADN que proporcionan un molde transcripcional de al menos las secuencias antisentido de la molécula de ARNdc de la invención.

La presente invención proporciona adicionalmente los procedimientos para la preparación de una planta transgénica que comprende la introducción de tal(es) secuencia(s) de ADN de la invención en la planta.

También se proporcionan plantas transgénicas que comprenden la(s) secuencia(s) de ADN de la invención así como los procedimientos para controlar un fitopatógeno fúngico y/o de oomiceto, en las que los procedimientos comprenden el cultivo de una planta transgénica de la invención permita la generación de ARN que comprende las secuencias antisentido de las moléculas de ARNdc de la invención por la planta.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones para controlar un fitopatógeno fúngico y/o de oomiceto que comprende la molécula de ARNdc de la invención y un vehículo compatible con la planta así como procedimientos para controlar un fitopatógeno fúngico y/o de oomiceto, en la que una planta infestada por o en riesgo de ser infectada por dicho fitopatógeno y/o la proximidad de dicha planta está en contacto con tal composición de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Morfología de macroconidias de Fusarium graminearum (Fg) cultivadas en cultivo axénico tras el tratamiento con CYP3RNA o tebuconazol. (a) Se suspendieron cien macroconidias de Fg en 100 pl de medio SNA líquido y se trataron con (i) 1,5 pg de ARNdc de CYP3RNA, (ii) 5 mg/l de tebuconazol y (iii) simulación (50x de tampón de alineamiento) a temperatura ambiente. Las imágenes se tomaron 72 horas después del tratamiento. Las flechas apuntan al hinchamiento y redondeamiento de las puntas de las hifas. (b) Cuantificación de tránscritos fúngicos CYP51A, CYP51B y CYP51C mediante RT-PCR usando las mismas muestras tratadas con simulacro y CYP3RNA que en (a). Los datos se normalizaron a p-tubulina.

Figura 2: Inhibición del crecimiento de macroconidias de Fg mediante CYP3RNA. Se suspendieron cien macroconidias de Fg en 100 pl de medio SNA líquido y se trataron con diferentes concentraciones de ARNdc de CYP3RNA en el intervalo de 75 pg a 1 pg de ARNdc. Las densidades de los cultivos de macroconidias de Fg se midieron al comienzo del tratamiento y a las 72 horas tras el tratamiento.

Figura 3: Síntomas de la infestación en hojas de Arabidopsis tras la inoculación con Fg. (a) Las hojas arrancadas de plantas de 5 semanas de edad se trataron con 5x104 macroconidias de Fg ml-1 y se evaluaron las lesiones necróticas a los 3 días tras la inoculación (dti). (i) Col-0 ts, (ii) Col-0 de control con vector vacío (vv), (iii) Col-0 que expresa CYP3RNA (L8 Col-0-CYP3RNA), y (iv) Col-0 inoculada con simulacro (Tween en agua). (b) Cuantificación del área de la hoja infestada por Fg a 3 dti; los síntomas típicos de infestación se expresan como un porcentaje del área total de la hoja. Las barras representan los valores medios ± DT de tres experimentos

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independientes, cada uno de los cuales usan 20 hojas recolectadas de 15 plantas diferentes de cada línea de planta transgénica, así como las plantas Col-0 ts y Col-0 vv. La reducción en los síntomas de infestación en hojas que expresan CYP3RNA en comparación con los controles Col-0 ts y Col-0 vv fue estadísticamente significativa (*** p<0,0001; prueba de la t de Student). (c)Hojas de Arabidopsis inoculadas con Fg a 5 dti. (i) La hoja de Col-0 vv está muy infestada por Fg; (ii) Col-0 que expresa CYP3RNA no presenta síntomas de infestación, aunque los micelios fúngicos son capaces de crecer en el agar que rodea a la hoja intacta y sin síntomas.

Figura 4: Abundancia de tránscritos del gen CYP51 y ARNip en hojas de Arabidopsis inoculadas con Fg. (a-c) Análisis específicos de gen de tránscritos CYP51 a 3 dti mediante qRT-PCR usando p-tubulina fúngica como el gen de referencia. (a) CYP51A, (b) CYP51B y (c) CYP51C. Se generó ADNc del ARN total aislado de hojas inoculadas con Fg recolectadas durante el ensayo de las hojas arrancadas. Las barras representan los valores medios ± DT de tres colecciones de muestras independientes. La reducción en la expresión génica de CYP51 en las hojas de Col-0-CYP3RNA inoculadas con Fg en comparación con el control de vv fue estadísticamente significativa (**p<0,001, *** p<0,0001; prueba de la t de Student). (d). Detección de ARNip de bajo peso molecular complementario a los genes CYP51 en tejido foliar agrupado de plantas Arabidopsis no infestadas e infestadas por Fg a 3 dti. El análisis por transferencia de Northern que usa CYP3RNA marcado con 32P se siguió mediante autorradiografía. No se detectó señal en las muestras de control de plantas Col-0 y Col-0-vv. El ARNr teñido con bromuro de etidio en el panel inferior sirvió como control de carga.

Figuras 5-9: Estrategia de combinación de fragmentos (apilado) en pGEM-T-CYP3 (Fig. 5) para generar CYP3RNA, una construcción diseñada a partir de secuencias parciales de CYP51A (SEQ ID NO:4), CYP51B (SEQ ID NO:5) y CYP51C (SEQ ID NO:6) para silenciar los tres genes CYP51. (Fig. 6) p7U10-RNAi, un vector binario con promotores CaMV35S de repetición invertida. (Fig. 7) p7U10-CYP3RNAi, generado mediante sustitución del fragmento GUS en p7U10-RNAi por el fragmento CYP3RNA (CYP51B-CYP51A-CYP51C) usando las enzimas de restricción HindIII/XmaI. (Fig. 8) p7i-Ubi-RNAi2, un vector binario con promotores CaMV35S de repetición invertida. (Fig. 9) p7i-UBi-CYP3RNAi, generado mediante sustitución del fragmento GUS en p7i-Ubi- rNaí2 por un fragmento CYP51ABC (CYP51A-CYP51B-CYP51C) usando las enzimas de restricción Hindlll/Xmal.

Figura 10: Hojas de cebada transgénica que expresan CYP51ABC (L2-L9, L14, L42), de una planta de control de tipo silvestre (var. Golden Promise; GP) y de una planta de control transgénica que solo comprende el vector de transfección (vector vacío; vv) 7 días tras la inoculación (7 dti= con Fg tal como se describe en el ejemplo 4.

Figura 11: Abundancia de tránscritos del gen CYP51 en hojas de cebada inoculadas con Fg. (a-c) Análisis específicos de gen de tránscritos CYP51 a 7 dti mediante qRT-PCR usando p-tubulina fúngica como el gen de referencia. (a) CYP51A, (b) CYP51B y (c) CYP51C. Se generó ADNc del ArN total aislado de hojas inoculadas con Fg recolectadas durante el ensayo de las hojas arrancadas.

Figura 12: Inhibición de crecimiento fúngico pulverizando hojas de cebada con ARNdc de CYP3RNA. Las hojas arrancadas de cebada se pulverizaron recubriendo el área (A) o de manera sistémica (B) con ARNdc de CYP3RNA ("ARN"), solo con tampón TE ("control" o ARNdc-GFp ("GFP"), respectivamente. 48 h después de la pulverización, las hojas se inocularon gota a gota con Fg. 6 días tras la infección, se registraron los síntomas de la infección (A, B) y se midió la cantidad relativa de ADN genómico de p-tubulina fúngica en hojas pulverizadas recubriendo la zona (C) o pulverizadas de forma sistémica (D), respectivamente, usando la PCR cuantitativa (qPCR). Los gráficos C y D muestran la cantidad relativa de ADN genómico de p-tubulina fúngica normalizada a la cantidad de ADN genómico de ubiquitina de la planta.

Descripción detallada de la invención

1) Definiciones

La expresión "fitopatógeno fúngico o de oomiceto", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un hongo u oomiceto que es parásito en una planta hospedadora.

Los hongos fitopatógenos incluyen hongos del filo Ascomycota y Basidiomycota. La etapa de reproducción asexual (anamorfo) de tal hongo se puede conocer con un nombre diferente al de su etapa de reproducción sexual (teleomorfo). Por ejemplo, Fusarium graminearum se refiere al anamorfo y Gibberella zeae al teleomorfo de la misma especie fúngica. Para el fin de la presente invención, los nombres de Ascomycota y Basidiomycota usados en el presente documento pretenden referirse a las especies fúngicas per se en lugar de a una etapa de reproducción particular de las mismas.

Los genes CYP51 son genes que codifican una esterol 14a-desmetilasa del citocromo P450 (CYP51) y homólogos de la misma. Un fitopatógeno fúngico o de oomiceto puede tener más de un gen CYP51. Los diferentes genes CYP51 se pueden agrupar en clados mediante análisis filogenético molecular tal como se describe, por ejemplo, por Becher y col. (BMS Genomics 12: 52. 2011). Se han identificado tres clados de CYP51 para hongos del subfilo Pezizomycotina: CYP51A, CYP51B y CYP51C (citado anteriormente). Los genes CYP51, las proteínas CYP51 y las correspondientes secuencias codificantes de los hongos y oomicetos fitopatógenos se conocen en la materia y se pueden identificar mediante búsquedas de homología, por ejemplo, basándose en FGSG_04092.3, FGSG_01000.3

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y FGSG_11024.3, mediante análisis de secuencia tal como se describe, por ejemplo, por Becher y col. (BMS Genomics 12: 52. 2011; véase la sección de bioinformática), y a partir de las bases de datos tales como la base de datos del citocromo P450 fúngico (
http://p450.riceblast.snu.ac.kr).

La expresión "molécula de ARNdc", tal como se usa en el presente documento para designar una materia objeto de la invención, se refiere a una molécula que comprende una, dos o más hebras de polirribonucleótidos capaces de formar al menos una región de ARN de doble cadena. De ese modo, la expresión "moléculas de ARNdc de la invención" incluye moléculas, en las que solo parte del ARN, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % o todo el ARN está presente como ARN de cadena doble. Por ejemplo, la expresión "molécula de ARNdc" incluye moléculas que consisten en uno, dos o más hebras de polirribonucleótidos. También se incluyen en la expresión moléculas que además comprenden grupos químicos adicionales, por ejemplo, grupos que estabilizan las regiones de ARN de cadena doble tal como se describe en el presente documento.

Se asume que el efecto de las moléculas de ARNdc de la invención se debe al ARN de interferencia. Los términos "ARNi" y "ARN de interferencia", usados en el presente documento, se refieren a un proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de la secuencia mediado por ARN de doble cadena. En el proceso del ARNi, se transforma un ARN de doble cadena en fragmentos relativamente pequeños, típicamente de 20-25 nucleótidos de longitud, que llegan a ser parte del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que se une a y escinde el ARNm complementario y, por lo tanto, evita que se use el ARNm como un molde para la traducción.

La expresión "interferencia antisentido" también se refiere a un proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de la secuencia. En la interferencia antisentido, un ARN monocatenario antisentido (ARNmc antisentido) que es sustancialmene complementario a al menos una parte de un gen diana provoca la inhibición de la expresión del gen diana. Se asume que en este proceso, se forma ARN de cadena doble que se forma mediante la hibridación del ARNmc antisentido que hibrida con el ARNm complementario e inhibe la expresión del gen diana usando el mecanismo del ARNi.

La expresión "al menos parte de", cuando se usa con referencia a una secuencia, por ejemplo, con referencia a la secuencia codificante de un gen CYP51, se refiere a al menos 20 nucleótidos contiguos de dicha secuencia. Por ejemplo, "al menos parte de" se refiere a al menos 25, al menos 50, al menos 100, al menos 150 y preferentemente al menos 200 nucleótidos contiguos de la secuencia.

Un "alto grado de identidad", tal como se usa en el presente documento para definir el grado de identidad de secuencia de una secuencia sentido para al menos parte de la secuencia codificante de un gen CYP51 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-6 y 8-13, se refiere a una identidad de al menos el 70 %, tal como, por ejemplo, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90 % y preferentemente se refiere a al menos el 95 % o al menos el 98 % y lo más preferentemente se refiere a al menos el 99 % o el 100 %.

Con relación a la identidad de secuencia entre las secuencias de ARN y de ADN, se considera un uracilo en una secuencia de ARN "idéntico" a una timina en una secuencia de ADN. Los procedimientos y las herramientas tales como programas informáticos para calcular la identidad de secuencia son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, el grado de identidad entre las secuencias de nucleótidos se puede determinar usando una herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, del inglés Basic Local Alignment Search Tool) tal como BLAST de búsqueda de similitud (alineamiento con huecos) disponible en la página web del Broad Institute (
http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_graminearum/Blast.html?sp=Sblastn).

Una "secuencia antisentido" tal como se comprende por las moléculas de ARNdc de la presente invención es una secuencia de ARN que es sustancialmente complementaria a la correspondiente secuencia sentido.

Los polinucleótidos "complementarios" son aquellos de emparejar sus bases de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson y Crick. Específicamente, se formarán pares de bases entre purinas y pirimidinas que incluyen el emparejamiento de guanina con citosina (G:C) y el emparejamiento de adenina bien con timina (A:T) en el caso del ADN o bien el emparejamiento de adenina con uracilo (A:U) en el caso del ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí incluso si no son completamente complementarios entre sí, siempre que cada una tenga al menos una región que es sustancialmente complementaria con la otra.

La expresión "sustancialmente complementaria", tal como se usa en el presente documento, por ejemplo, para caracterizar las secuencias antisentido de la molécula de ARNdc de la invención, significa que dos secuencias de nucleótidos son complementarias en al menos el 80 % de sus nucleótidos. Preferentemente, las dos secuencias de nucleótidos son complementarias en al menos el 85 %, al menos el 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, y lo más preferentemente al menos el 99 % de los nucleótidos hasta su longitud completa. Como alternativa, "sustancialmente complementaria" se puede referir a dos secuencias de ácido nucleico que pueden hibridar en condiciones rigurosas.

El término "hibridación", tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier proceso mediante el cual una cadena de polinucleótidos se une con una cadena complementaria mediante emparejamiento de bases. (Coombs: Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York, 1994). La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de asociación entre las dos cadenas complementarias) están influenciadas por factores tales como el grado

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de complementariedad entre las cadenas, la rigurosidad de las condiciones implicadas, la temperatura de fusión de la doble cadena formada y la proporción de G:C en las cadenas. La temperatura de fusión (Tf) es la temperatura a la cual un grupo de polinucleótidos de cadena doble llega a estar semidisociada en cadenas simples. La Tf se puede calcular usando ecuaciones bien conocidas en la materia. Se da una estimación del valor de la Tf de un polinucleótido en una solución acuosa de NaCl 1 M mediante la ecuación: Tf=81,5+0,41(% G+C) (véase, por ejemplo, Anderson y Young: Quantitative Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hybridization, 1985). Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1989). En particular, la expresión "condiciones rigurosas", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una hibridación con ácido nucleico unido a un filtro en 6x de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C seguido por uno o más lavados en 0,2x de SSC/SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1 % a aproximadamente 50-65 °C.

El término "expresión", tal como se usa en el presente documento con respecto a una secuencia génica, se refiere a la traducción de la secuencia codificante a un polipéptido. La inhibición de la expresión génica puede llegar a ser detectable a nivel de ARNm, a nivel del polipéptido o ambos. Los procedimientos para evaluar cambios a nivel de ARNm o a nivel de proteína de un gen son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, el cambio a nivel de ARNm de un gen se puede evaluar mediante una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) o análisis por transferencia de Northern.

El "control" de un hongo u oomiceto fitopatógeno, tal como se usa en el presente documento, incluye medidas de prevención de la infestación de una planta por dicho patógeno así como medidas para combatir o curar la infestación de una planta por el patógeno. El término "combatir" se refiere a la reducción de la infestación por el patógeno. El término "curar" se refiere a la erradicación de la infestación por el patógeno.

Un vehículo "fitocompatible", tal como se usa en el presente documento, es un compuesto o una mezcla de compuestos que, en condiciones de su uso, no genera una actividad fitotóxica inaceptable para la planta tratada.

El término "planta" se usa en el presente documento para designar una planta completa en cualquier etapa de desarrollo, así como una parte o derivado de la misma, y por lo tanto, incluye, por ejemplo, una célula vegetal, un grupo de células vegetales, un tejido vegetal (por ejemplo, un tejido meristemático, tejido calloso), un órgano vegetal (por ejemplo, tallo, hojas, raíz, óvulo, estambre), una forma reproductiva o una parte reproductiva de una planta (por ejemplo, una semilla, tubérculo, esqueje, gametofito, esporofito, polen, microspora, embrión). Una célula vegetal o un grupo de células vegetales puede estar aislado (por ejemplo, en un cultivo en suspensión) o comprendido en un tejido vegetal, en un órgano vegetal o planta completa de cualquier etapa del desarrollo.

Una planta "transgénica" es una planta completa o una parte de la misma que se ha alterado usando la tecnología del ADN recombinante para que contenga una secuencia de ácido nucleico que de otro modo no estaría presente en dicha planta o que se habría expresado en un grado considerablemente menor. El término "planta transgénica" también incluye la progenie transgénica de una planta transgénica. una planta transgénica de la presente invención puede ser resultado de un cruzamiento de una planta transgénica de la invención con una planta no transgénica o con otra planta transgénica de la invención o con una planta transgénica que tiene un transgen diferente. En particular, el término "planta transgénica" también comprende el cultivo de verdaderas plantas transgénicas que se obtienen mediante etapas repetidas de endogamia.

Un "molde transcripcional" de una secuencia de ARN es una secuencia de ADN que puede servir como un molde para la generación del ARN mediante transcripción de enzimas con una ARN polimerasa.

El término "promotor", cuando se usa en el presente documento en el ámbito de la(s) secuencia(s) de ácido nucleico de la invención, se refiere al singular así como al plural, salvo que se indique explícitamente lo contrario. Un "promotor", tal como se usa en el presente documento, es una secuencia de ADN que, cuando se une a una secuencia de ADN de interés, es capaz de controlar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN. Un promotor se localiza típicamente en 5' (por ejemplo, aguas arriba) de la secuencia de ADN de interés cuya transcripción a ARNm controla (por ejemplo, próximo al sitio de comienzo de la transcripción), y proporciona un sitio para la unión específica mediante ARN polimerasa y otros factores de transcripción para la iniciación de la transcripción. Un promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor regulado.

Un "promotor regulado" es un promotor que dirige la transcripción de manera no constitutiva pero de forma temporal y/o espacialmente restringida. Un promotor es regulado si la cantidad de ARN producida bajo el control del promotor activado es al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 % o 300 % superior a la cantidad de ARN producida en partes de la planta o en períodos de tiempo, en los que el promotor no está activado. Los promotores regulados incluyen promotores inducibles, promotores específicos de tejidos y promotores específicos del desarrollo. Los promotores específicos de tejido o específicos del desarrollo facilitan la transcripción de una secuencia de interés en tejidos específicos, órganos o tipos celulares, o en diferentes etapas específicas del desarrollo mientras que dejan al resto del organismo sin modificar. En el caso de las plantas, tales promotores pueden influir de manera específica en la expresión de genes en las raíces, inflorescencia, espigas de cereales, frutos o semillas, o durante la etapa vegetativa, de florecimiento o de establecimiento de la semilla. Los promotores inducibles facilitan la transcripción de una secuencia de interés en presencia o ausencia de compuestos químicos

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particulares (por ejemplo, un alcohol, tetraciclina, un esteroide o un metal) o dependiendo de las condiciones físicas particulares (por ejemplo, la presencia o ausencia de luz, bajas o altas temperaturas).

La expresión "tolerante para fitopatógenos" se usa en el presente documento para designar una planta transgénica de la invención capaz de reducir o prevenir el crecimiento y/o la propagación del fitopatógeno. La tolerancia al fitopatógeno puede ser transitoria, es decir, está presente durante un período de tiempo limitado, por ejemplo, debido a una expresión transitoria del ARNmc antisentido de la invención o la molécula de ARNdc descrita en el presente documento. Una planta que es "tolerante" a un fitopatógeno está infestada con menor gravedad y/o menor frecuencia por el fitopatógeno. La gravedad de la infestación del hongo u oomiceto se puede determinar basándose en los síntomas de la enfermedad observados después de que la planta se haya inoculado con o sea atacada por el fitopatógeno. Los síntomas de la enfermedad dependen de la naturaleza (especie, variedad) del fitopatógeno y de la planta. Los síntomas de infestaciones fúngicas o de oomicetos incluyen, pero sin limitación, el blanqueo prematuro de las espigas de los cereales y/o de las hojas; lesiones necróticas de la superficie exterior de los flósculos y de la gluma; atrofia del grano; deformación de la arista; decoloración de los granos y/o espiguillas; crecimiento del patógeno visible sobre las hojas, el tallo y/o las espigas de cereales.

2) Realizaciones particulares de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de ARNdc y a secuencias de ADN que proporcionan moldes transcripcionales de ARNmc antisentido capaces de inhibir la expresión de genes CYP51 de un fitopatógeno del género Fusarium.

Además, las moléculas de ARNdc y el ARNmc antisentido descrito en el presente documento son capaces de reducir o evitar el crecimiento y/o la propagación de fitopatógenos fúngicos o de oomicetos. Específicamente, las moléculas de ARNdc y el ARNmc antisentido descritos en el presente documento son capaces de reducir o de erradicar la infestación de una planta por fitopatógenos fúngicos o de oomicetos, en los que dicha planta contiene y/o se trata con dichas moléculas de ARNdc o el ARNmc antisentido.

Las moléculas de ARNdc y el ARNmc antisentido descritos en el presente documento son útiles para controlar hongos y oomicetos fitopatógenos que incluyen, pero sin limitación, Albugo spp. (roya blanca) en plantas ornamentales, hortalizas (por ejemplo, A. candida) y girasoles (por ejemplo, A. tragopogonis); Alternaría spp. (mancha foliar de Alternaria) en hortalizas, colza (A. brassicola o brassicae), remolachas azucareras (A. tenuis), frutas, arroz, soja, patatas (por ejemplo A. solani o A. alternata), tomates (por ejemplo A. solani o A. alternata) y trigo; Aphanomyces spp. en remolachas azucareras y hortalizas; Ascochyta spp. en cereales y hortalizas, por ejemplo A. tr/t/c/(antracnosis) en trigo y A. hordei en cebada; Bipolaris y Drechslera spp. (teleomorfo: Cochliobolus spp.), por ejemplo, tizón sureño de la hoja (D. maydis) o tizón norteño de la hoja (B. zeicola) en maíz, por ejemplo la mancha parda (B. sorokiniana) en cereales y por ejemplo B. oryzae en arroz y césped; Blumeria (formalmente Erysiphe) graminis (oídio) en cereales (por ejemplo, en trigo o cebada); Botrytis cinerea (teleomorfo: Botryotinia fuckeliana: moho gris) en frutos y bayas (por ejemplo, fresas), hortalizas (por ejemplo, lechuga, zanahorias, apio y coles), colza, flores, vides, plantas forestales y trigo; Bremia lactucae (mildiú velloso) en lechugas; Ceratocystis (sin. Ophiostoma) spp. (podredumbre o marchitez) en árboles frondosos y árboles de hoja perenne, por ejemplo C. ulmi (enfermedad del olmo holandés) en olmos; Cercospora spp. (manchas foliares de Cercospora) en maíz (por ejemplo, mancha foliar gris: C. zeaemaydis), arroz, remolacha azucarera (por ejemplo C. beticola), caña de azúcar, hortalizas, café, soja (por ejemplo, C. sojina o C. kikuchii) y arroz; Cladosporium spp. en tomates (por ejemplo C. fulvum: moho foliar) y cereales, por ejemplo, C. herbarum (espiga negra) en trigo; Claviceps purpurea (cornezuelo) en cereales; Cochliobolus (anamorfo: Helminthasporium de Bipolaris) spp. (manchas foliares) en maíz (C. carbonum), cereales (por ejemplo, C. sativus, anamorfo: B. sorokiniana) y arroz (por ejemplo C. miyabeanus, anamorfo: H. oryzae); Colletatrichum (teleomorfo: Glomerella) spp. (antracnosis) en algodón (por ejemplo C. gossypii), maíz (por ejemplo, C. graminicola: podredumbre del tallo por antracnosis), frutos blandos, patatas (por ejemplo, C. coccodes: mancha negra), judías (por ejemplo C. lindemuthianum) y soja (por ejemplo C. truncatum o C. gloeosporioides); Corticium spp., por ejemplo, C. sasakii (tizón de la vaina) en arroz; Corynespora cassiicola (manchas foliares) en soja y plantas ornamentales; Cycloconium spp., por ejemplo, C. oleaginum en olivos; Cylindrocarpon spp. (por ejemplo, decaimiento del árbol frutal o declive de la vid joven, teleomorfo: Nectria o Neonectria spp.) en árboles frutales, vides (por ejemplo, C. liriodendri, teleomorfo: Neonectria liriodendri: Enfermedad del pie negro) y plantas ornamentales; Dematophora (teleomorfo: Rosellinia necatrix) (podredumbre de la raíz y del tallo) en soja; Diaporthe spp., por ejemplo, D. phaseolorum (marchitamiento fúngico) en soja; Drechslera (sin. Helminthosporium, teleomorfo: Pyrenophora) spp. en maíz, cereales, tales como la cebada (por ejemplo D. teres, mancha reticulada) y trigo (por ejemplo, D. tritici-repentis: mancha parda), arroz y césped; Esca (muerte regresiva, apoplejía) en vides, causados por Formitiporia (sin. Phellinus) punctata, F. mediterranea, Phaeomoniella chlamydospora (antes Phaeoacremonium chlamydosporum), Phaeoacremonium aleophilum y/o Botryosphaeria obtusa; Elsinoe spp. en frutas pomáceas (E. pyri), frutos blandos (E. veneta: antracnosis) y vides (E. ampelina: antracnosis); Entyloma oryzae (tizón foliar) en arroz; Epicoccum spp. (moho negro) en trigo; Erysiphe spp. (oídio) en remolachas azucareras (E. betae), hortalizas (por ejemplo E. pisi), tales como cucurbitáceas (por ejemplo E. cichoracearum), coles, colza (por ejemplo, E. cruciferarum); Eutypa lata (decaimiento o muerte regresiva de Eutypa, anamorfo: Cytosporina lata, sin. Libertella blepharis) en árboles frutales, vides y árboles ornamentales; Exserohilum (sin. Helminthosporium) spp. en maíz (por ejemplo, E. turcicum); Fusarium (teleomorfo: Gibberella) spp. (marchitez, podredumbre de raíz o tallo) en diversas plantas, tales como F. graminearum o F. culmorum (podredumbre de raíz, sarna o tizón de la espiga) en cereales

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(por ejemplo, trigo o cebada), F. oxysporum en tomates, F. solani (f. sp. glycines ahora sin. F. virguliforme) y F. tucumaniae y F. brasiliense causando cada uno el síndrome de la muerte súbita en la soja, y F. verticillioides en maíz; Gaeumannomyces graminis (mal del pie) en cereales (por ejemplo, trigo o cebada) y maíz; Gibberella spp. en cereales (por ejemplo G. zeae) y arroz (por ejemplo, G. fujikuroi: enfermedad de Bakanae); Glomerella cingulata en vides, frutas pomáceas y otras plantas y G. gossypii en algodón; complejo de tinción de grano en arroz; Guignardia bidwellii (podredumbre negra) en vides; Gymnosporangium spp. en plantas rosáceas y enebros, por ejemplo, G. sabinae (roya) en peras; Helminthosporium spp. (sin. Drechslera, teleomorfo: Cochliobolus) en maíz, cereales y arroz; Hemileia spp., por ejemplo H. vastatrix (roya de la hoja del café) en el café; Isariopsis clavispora (sin. Cladosporium vitis) en vides; Macrophomina phaseolina (sin. phaseoli) (podredumbre del tallo y de la raíz) en soja y algodón; Microdochium (sin. Fusarium) nivale (moho de nieve rosa) en cereales (por ejemplo, trigo o cebada); Microsphaera difusa (oídio) en soja; Monilinia spp., por ejemplo, M. laxa, M. fructicola y M. fructigena (tizón de la floración y de las ramitas, podredumbre marrón) en frutos con hueso y otras plantas rosáceas; Mycosphaerella spp. en cereales, plátanos, frutos blandos y cacahuetes, tales como por ejemplo M. graminicola (anamorfo: Septoria tritici, mancha de Septoria) en trigo o M. fijiensis (enfermedad de Sigatoka negra) en plátanos; Peronospora spp. (mildiú lanoso) en coles (por ejemplo, P. brassicae), colza (por ejemplo, P. parasítica), cebollas (por ejemplo P. destructor), tabaco (P. tabacina) y soja (por ejemplo, P. manshurica); Phakopsora pachyrhizi y P. meibomiae (roya de la soja) en soja; Phialophora spp. por ejemplo en vides (por ejemplo P. tracheiphila y P. tetraspora) y soja (por ejemplo, P. gregata: podredumbre del tallo); Phoma lingam (podredumbre de la raíz y del tallo) en colza y col y P. betae (podredumbre de la raíz, mancha foliar y marchitamiento) en remolachas azucareras; Phomopsis spp. en girasoles, vides (por ejemplo, P. viticola: mancha de caña y hoja) y soja (por ejemplo, podredumbre del tallo: P. phaseoli, teleomorfo: Diaporthe phaseolorum); Physoderma maydis (manchas pardas) en maíz; Phytophthora spp. (marchitez, podredumbre de raíz, hojas, fruto y tallo) en diversas plantas, tales como pimentón y cucurbitáceas (por ejemplo, P. capsici), soja (por ejemplo, P. megasperma, sin. P. sojae), patatas y tomates (por ejemplo P. infestans: tizón tardío) en árboles frondosos (por ejemplo, P. ramorum: muerte súbita del roble); Plasmodiophora brassicae (hernia de la col) en col, colza, rábano y otras plantas; Plasmopara spp., por ejemplo, P. viticola (mildiú lanoso de la vid) en vides y P. halstedii en girasoles; Podosphaera spp. (oídio) en plantas rosáceas, lúpulo, pomo y frutos blandos, por ejemplo, P. leucotricha en manzanas; Polymyxa spp., por ejemplo, en cereales, tales como cebada y trigo (P. graminis) y remolachas azucareras (P. betae) y, por lo tanto, enfermedades víricas transmitidas; Pseudocercosporella herpotrichoides (cercosporelosis, teleomorfo: Tapesia yallundae) en cereales, por ejemplo, trigo o cebada; Pseudoperonospora (mildiú lanoso) en diversas plantas, por ejemplo, P. cubensis en cucurbitáceas o P. humili en lúpulo; Pseudopezicula tracheiphila (enfermedad de fuego rojo o enrojecimiento parasitario, anamorfo: Phialophora) en vides; Puccinia spp. (roya) en diversas plantas, por ejemplo, P. triticina (roya marrón o foliar), P. striiformis (roya lineal amarilla), P. hordei (roya enana), P. graminis (roya negra o del tallo) o P. recondita (roya marrón o foliar) en cereales, tales como, por ejemplo, trigo, cebada o arroz, P. kuehnii (roya naranja) en caña de azúcar y P. asparagi en espárragos; Pyrenophora (anamorfo: Drechslera) tritici-repentis (mancha parda) en trigo o P. teres (mancha reticulada) en cebada; Pyricularia spp., por ejemplo, P. oryzae (teleomorfo: Magnaporthe grisea, añublo del arroz) en arroz y P. grisea en césped y cereales; Pythium spp. (marchitamiento) en césped, arroz, maíz, trigo, algodón, colza, girasoles, soja, remolacha azucarera, hortalizas y otras diversas plantas (por ejemplo, P. ultimum o P. aphanidermatum); Ramularia spp., por ejemplo R. collo-cygni (manchas foliares de Ramularia, manchas foliares fisiológicas) en cebada y R. beticola en remolachas azucareras; Rhizoctonia spp. en algodón, arroz, patatas, césped, maíz, colza, patatas, remolacha azucarera, hortalizas y otras diversas plantas, por ejemplo, R. solani (podredumbre de raíz y tallo) en soja, R. solani (tizón de la vaina) en arroz o R. cerealis (tizón de la primavera de Rizoctonia) en trigo o cebada; Rhizopus stolonifer (moho negro,podredumbre blanda) en fresas, zanahorias, col, vides y tomates; Rhynchosporium secalis (escaldadura) en cebada, arroz y triticale; Sarocladium oryzae y S. attenuatum (podredumbre de la vaina) en arroz; Sclerotinia spp. (podredumbre del tallo o moho blanco) en hortalizas y cultivos de campo, tales como colza, girasoles (por ejemplo, S. sclerotiorum) y soja (por ejemplo, S. rolfsii o S. sclerotiorum); Septoria spp. en diversas plantas, por ejemplo, S. glycines (mancha marrón) en soja, S. tritici (mancha de Septoria) en trigo y S. (sin. Stagonospora) nodorum (mancha de Stagonospora) en cereales; Uncinula (sin. Erysiphe) necator (oídio, anamorfo: Oidium tuckeri) en vides; Setospaeria spp. (tizón foliar) en maíz (por ejemplo, S. turcicum, sin. Helminthosporium turcicum) y césped; Sphacelotheca spp. (tizón) en maíz, (por ejemplo, S. reiliana: tizónde la espiga), sorgo y caña de azúcar; Sphaerotheca fuliginea (oídio) en cucurbitáceas; Spongospora subterranea (sarna pulverulenta) en patatas y, por lo tanto, enfermedades víricas transmitidas; Stagonospora spp. en cereales, por ejemplo, S. nodorum (mancha de Stagonospora, teleomorfo: Leptosphaeria [sin. Phaeosphaeria] nodorum) en trigo; Synchytrium endobioticum en patatas (sarna verrugosa de la patata); Taphrina spp., por ejemplo, T. deformans (enfermedad de enrollamiento foliar) en melocotones y T. pruni (ciruela pequeña) en ciruelas; Thielaviopsis spp. (podredumbre negra de la raíz) en la planta del tabaco, frutas pomáceas, hortalizas, soja y algodón, por ejemplo, T. basicola (sin. Chalara elegans); Tilletia spp. (copo común o tizón apestoso) en cereales, tales como por ejemplo T. tritici (sin. T caries, copo del trigo) y T. cantraversa (copo enano) en trigo; Typhula incarnata (moho de nieve gris) en cebada o trigo; Urocystis spp., por ejemplo, U. occulta (tizón del tallo) en arroz; Uromyces spp. (roya) en hortalizas, tales como judías (por ejemplo U. appendiculatus, sin. U. phaseoll) y remolachas azucareras (por ejemplo U. betae); Ustilago spp. (carbón desnudo) en cereales (por ejemplo U. nuda y U. avaenae), maíz (por ejemplo, U. maydis, tizón del maíz) y caña de azúcar; venturia spp. (sarna) en manzanas (por ejemplo, V. inaequalis) y peras; y Verticillium spp. (marchitez) en diversas plantas, tales como frutales y ornamentales, vides, frutos blandos, hortalizas y cultivos de campo, por ejemplo, V. dahliae en fresas, colza, patatas y tomates.

En particular, las moléculas de ARNdc y el ARNmc antisentido descrito en el presente documento son capaces de

inhibir la expresión de al menos un gen CYP51 de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto seleccionado de los géneros Fusarium, Blumeria, Magnaparthe, Sclerotinia, Phakopsara, Botrytis, Puccinia, Pyrenophora, Phaeosphaeria, Fez, Cochliobolus, Ustilago, Rhynchosporium y Venturia. Los fitopatógenos particulares de estos géneros y sus genes CYP51 se enumeran en la Tabla 1 a continuación. Preferentemente, el fitopatógeno es un 5 hongo del género Fusarium.

Tabla ^ 1: Fitopatógenos fúngicos y de oomicetos y genes ^ CYP51 de los mismos

Fitopatógeno: Enfermedades gen(es) CYP51 [SEQ ID NO de la secuencia codificante]

Fusarium graminearum (Fg): tizón de la espiga en trigo, cenada y otros cultivos de cereales CYP51A (FGSG- [1] 04092.3) 1 CYP51B (FGSG_ [2] 01000.3) 1 CYP51C (FGSG_ [3] 11024.3) 1

Fusarium oxysporum: marchitez de tomate y otros cultivos CYP51A (FOXG_ [8] 11545.2) 1 CYP51B (FOXG_ [9] 00394.2) 1 CYP51C (FOXG_ [10] 13138.2) 1

Fusarium verticillioides: podredumbre de la mazorca de maíz CYP51A (FVEG_ [11] 10277.3) 1 CYP518 (FVEG_ [12] 01123.3) 1 CYP51C (FVEG_ [13] 12391.3) 1

Blumeria graminis: oídio en céspedes CYP51 [14]

Magnaporthe grisea: Tizón de la plántula del arroz, añublo del arroz, mancha foliar ovalada de gramínea, enfermedad de la picadura, añublo de la ballica y mancha de Johnson CYP51A [15] CYP51B [16]

Sclerotinia sclerotinium: Moho blanco, podredumbre del algodón, podredumbre blanda acuosa, podredumbre del tallo, gotas, podredumbre de la copa y tizón de las flores CYP51B [17]

Phakopsora pachyrhizi: Roya de la soja asiática CYP51 [18]

Botrytis cinerea: Tizón de las flores y podredumbre del fruto también como manchas foliares y podredumbre del bulbo CYP51B [19]

Puccinia triticina: Enfermedad de la roya en cereales CYP51 [20]

Puccinia graminis: Enfermedad de la roya en cereales CYP51 [21]

Puccinia recondita: Enfermedad de la roya en cereales CYP51 [22]

Pyrenophora teres: Mancha de la cebada, mancha reticulada, y mancha reticulada de forma puntuada CYP51 [23]

Pyrenophora tritici: Mancha parda o helmintosporiosis en cereales CYP51A [24] CYP51B [25]

Phaeosphaeria nodorum: Mancha de la gluma y mancha de Septoria nodorum CYP51B [26]

Septoria tritici: Mancha foliar de Septoria CYP51 [27]

Cochliobolus sativus: Mancha puntuada y podredumbre común de la raíz CYP51B [28]

Ustilago maydis: Enfermedad del tizón en maíz CYP51 [29]

Rhynchasporium secalis: Escaldadura de la cenada y del centeno CYP51 [30]

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Venturia inaequalis: Enfermedad de sarna de la manzana CYP51 [31]

1 Las designaciones del gen se refieren a los loci en la base de datos comparativa de Fusarium accesible a través de, por ejemplo, la página web del Broad Institute ( http://www.broadinstitute.org).

La molécula de ARNdc es capaz de inhibir la expresión de una, dos, tres o todos los genes CYP51 de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto y preferentemente es capaz de inhibir todos los genes CYP51 del fitopatógeno. La molécula de ARNdc de la invención es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, el gen CYP51B y el gen CYP51C de un hongo fitopatógeno del género Fusarium.

Por ejemplo, el(los) gen(es) CYP51 a inhibir mediante la molécula de ARNdc descrita en el presente documento se selecciona(n) de los genes CYP51 de un fitopatógeno enumerado en la Tabla 1.

La molécula de ARNdc de puede estabilizar contra la degradación química y enzimática indeseada reduciendo la disociación del ARN de cadena doble en ARN de cadena simple no hibridado. Para este fin, las dos secuencias de ribonucleótidos de hibridación o las regiones adyacentes a las mismas se pueden unir de manera química entre sí tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 2008/0171861 A1. Los grupos de unión química adecuados para las regiones de estabilización del ARN de cadena doble incluyen, pero sin limitación, análogos de purina que sustituyen purinas y análogos de nucleótidos ramificados que sustituyen nucleótidos. La molécula de ARNdc también se puede estabilizar contra la degradación enzimática indeseada mediante modificaciones de ribonucleótidos. Las modificaciones de ribonucleótidos adecuadas incluyen la sustitución del grupo 2'-hidroxilo de uno o más de un ribonucleótido mediante, preferentemente, un grupo 2'-amino o 2'-metilo; y la sustitución de uno o más de un ribonucleótido por el mismo número de nucleótidos bloqueados correspondientes, en los que el anillo de azúcar está químicamente modificado, preferentemente por un puente de 2'-O 4'-C metileno.

Las moléculas de ARNdc descritas en el presente documento comprenden una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de un gen CYP51 de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto, y una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria con dicha secuencia sentido. En este contexto, una "secuencia sentido" se refiere a una o más de una secuencia sentido, y un "gen CYP51" se refiere a uno o más de un gen CYP51. Ventajosamente, las secuencias antisentido abarcan una secuencia antisentido sustancialmente complementaria para cada secuencia sentido comprendida por la misma molécula de ARNdc. Generalmente, las expresiones tales como "una secuencia sentido", "una secuencia antisentido", "un polinucleótido", "un gen CYP51", cuando se usan en el presente documento, se refieren al singular así como al plural, a menos que se indique otra cosa.

Por consiguiente, las moléculas de ARNdc descritas en el presente documento pueden comprender

una primera secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de un primer gen CYP51, y

una segunda secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de un segundo gen CYP51,

en el que el primer gen CYP51 y el segundo gen CYP51 son diferentes genes CYP51 de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto.

De manera más específica, las moléculas de ARNdc descritas en el presente documento pueden comprender

una primera secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de un primer gen CYP51,

una segunda secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de un segundo gen CYP51, y

una tercera secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de un segundo gen CYP51,

en la que el primer gen CYP51, el segundo gen CYP51 y el tercer gen CYP51 son diferentes genes CYP51 de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto.

La secuencia codificante del al menos un gen CYP51, por ejemplo, el primer, el segundo y el tercer gen CYP51, se puede seleccionar de las secuencias codificantes de los genes CYP51 enumerados en la Tabla 1.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la molécula de ARNdc es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, del gen CYP51B y del gen CYP51C de Fusarium graminearum, y comprende (i) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:1 o 4, (ii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:2 o 5, (iii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:3 o 6, y (iv) secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias a dichas secuencias sentido (i), (ii) y (iii); en la que la disposición de las secuencias en la molécula

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de ARNdc permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria. De acuerdo con realizaciones particulares de dicho aspecto de la invención, la molécula de ARNdc:

(a) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A de Fusarium graminearum y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:4; y

(b) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51B de Fusarium graminearum y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:5; y

(c) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51C de Fusarium graminearum y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:6.

De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, la molécula de ARNdc es capaz de inhibir la expresión de al menos un gen CYP51 de Fusarium graminearum y comprende una secuencia sentido que es al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 % o al menos el 98 %, y lo más preferentemente al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO:7, y una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria a dicha secuencia sentido; en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de dicha secuencia sentido y dicha secuencia antisentido correspondiente. De acuerdo con realizaciones particulares de dicho aspecto de la invención, la molécula de ARNdc consiste en dicha secuencia sentido y dicha secuencia antisentido. Por ejemplo, dicha molécula de ARNdc puede consistir en una primera cadena de ARN que tiene dicha secuencia sentido y una segunda secuencia de ARN que tiene dicha secuencia antisentido.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la molécula de ARNdc es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, del gen CYP51B y del gen CYP51C de Fusarium axysparum, y comprende (i) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO: 8, (ii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:9, (iii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:10, y (iv) secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias a dichas secuencias sentido (i), (ii) y (iii); en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria. De acuerdo con realizaciones particulares de dicho aspecto de la invención, la molécula de ARNdc:

(a) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A de Fusarium oxysporum y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:8; y

(b) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51B de Fusarium oxysporum y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:9; y

(c) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51C de Fusarium oxysporum y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:10.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la molécula de ARNdc es capaz de inhibir la expresión de al menos un gen CYP51 de Fusarium vertlolllloides, y comprende (i) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO: 11, (ii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:12, (iii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO: 13, y (iv) secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias a dichas secuencias sentido (i), (ii) y (iii); en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria. De acuerdo con realizaciones particulares de dicho aspecto de la invención, la molécula de ARNdc:

(a) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A de Fusarium verticillioides y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:11; y

(b) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51B de Fusarium verticillioides y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:12; y

(c) es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51C de Fusarium verticillioides y comprende una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO:13.

La molécula de ARNdc de la invención es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, del gen CYP51B y del gen CYP51C de especies fitopatógenas de Fusarium; y dicha molécula de ARNdc comprende

(i) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de dicho gen CYP51A;

(ii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de dicho gen CYP51B;

(iii) una secuencia sentido que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la secuencia codificante de dicho gen CYP51C; y

(iv) secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias las secuencias sentido (i), (ii) y (iii);

En realizaciones en las que la especie fitopatógena de Fusarium es Fusarium graminearum, la secuencia codificante

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de los genes CYP51 pueden ser las secuencias establecidas en la SEQ ID NO:1 (CYP51A), SEQ ID NO:2 (CYP51B) y SEQ ID NO:3 (CYP51C).

En realizaciones en las que la especie fitopatógena de Fusarium es Fusarium oxysporum, la secuencia codificante de los genes CYP51 pueden ser las secuencias establecidas en la SEQ ID NO:8 (CYP51A), SEQ ID NO:9 (CYP51B) y SEQ ID NO:10 (CYP51C).

En realizaciones en las que la especie fitopatógena de Fusarium es Fusarium verticillioides, la secuencia codificante de los genes CYP51 pueden ser las secuencias establecidas en la SEQ ID NO:11 (CYP51A), SEQ ID NO:12 (CYP51B) y SEQ ID NO:13 (CYP51C).

De acuerdo con una realización particular adicional de la invención, la molécula de ARNdc de la invención es capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, del gen CYP51B y del gen CYP51C de Fusarium graminearum, y dicha molécula de ARNdc comprende

una secuencia sentido (i) que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO: 4, una secuencia sentido (ii) que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO: 5, una secuencia sentido (iii) que tiene un alto grado de identidad con al menos parte de la SEQ ID NO: 6, y secuencias antisentido (iv) que son sustancialmente complementarias a las secuencias sentido (i), (ii) y (iii);

La expresión "al menos parte de" la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6 se refiere a al menos 20 nucleótidos contiguos, por ejemplo, al menos 25, al menos 50, al menos 100, al menos 150 y preferentemente al menos 200 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la invención, el alto grado de identidad de las secuencias sentido (i), (ii) y (iii) pertenece a la longitud completa de la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente.

Debido a la homología de secuencia de los genes CYP51A, CYP51B y CYP51C de las especies de Fusarium, se pueden diseñar moléculas de ARNdc, en las que las secuencias sentido tengan un alto grado de identidad con al menos pare de las secuencias codificantes de los genes CYP51A, los genes CYP51B y los genes CYP51C, respectivamente, de más de una especie fitopatógena de Fusarium. Por ejemplo, las secuencias sentido de ARNdc pueden tener un alto grado de identidad con al menos pare de la secuencia codificante de los genes CYP51A, los genes CYP51B y los genes CYP51C, respectivamente, de dos o más especies de Fusarium seleccionadas de F. graminearum, F. oxysporum y F. verticillioides.

Las secuencias sentido y antisentido se disponen en la molécula de ARNdc en una manera que permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria, formando de este modo regiones de ARN de cadena doble.

De acuerdo con una realización preferida, cada secuencia sentido se localiza en una cadena diferente de ARN de la molécula de ARNdc que su secuencia antisentido sustancialmente complementaria. De ese modo, las secuencias sentido y antisentido se pueden localizar en dos o más de dos cadenas separadas de la molécula de ARNdc. Tras la hibridación de las secuencias sustancialmente complementarias, las cadenas se pueden unir mediante emparejamiento de bases para formar una o más de una región de ARN de cadena doble. Las secuencias sentido pueden estar en cadenas separadas de la molécula de ARNdc. De acuerdo con una realización particular, las secuencias sentido y antisentido sustancialmente complementarias de la molécula de ARNdc de la invención se localizan en dos cadenas sustancialmente complementarias de la molécula de ARNdc.

Como alternativa, las secuencias sentido y antisentido sustancialmente complementarias de la molécula de ARNdc de la invención se localizan en una única cadena de la molécula de ARNdc. Las secuencias sustancialmente complementarias se disponen en la cadena simple de ARN de tal manera que tras su hibridación, la cadena se enrolla sobre sí misma mediante emparejamiento de bases para formar una o más de una estructura de horquilla. Una estructura de horquilla consiste en un tallo de cadena doble formado mediante la hibridación de un primer segmento de polinucleótidos con un segundo segmento de polinucleótidos, y un bucle monocatenario que une los dos segmentos.

Las secuencias sentido y antisentido hibridadas de la molécula de ARNdc de la invención pueden estar comprendidas en una región contigua de ARN de cadena doble. De acuerdo con una realización preferida, la molécula de ARNdc de la invención comprende una región de ARN de cadena doble que consiste esencialmente (es decir, en al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 %) en las secuencias sentido y antisentido, lo más preferentemente consiste en una secuencia sentido (i), una secuencia sentido (ii) y una secuencia sentido (iii), cada una de ellas hibridada con una secuencia antisentido sustancialmente complementaria.

El orden de las regiones de ARN de cadena doble que comprende las secuencias sentido (i), (ii) y (iii) no está particularmente restringido. Por ejemplo, el ARN de cadena doble formado mediante la secuencia sentido (i) y su secuencia antisentido está flanqueado en un lado por el ARN de cadena doble formado por la secuencia sentido (ii) y

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su secuencia antisentido y en el otro lado por el ARN de cadena doble formado por la secuencia sentido (iii) y su secuencia antisentido.

Las moléculas de ARNdc de la presente invención son capaces de inhibir la expresión de los genes CYP51 del fitopatógeno fúngico o de oomiceto. La inhibición de la expresión del gen CYP51 mediante moléculas de ARNdc de la presente invención llega a ser detectable a nivel de ARNm, a nivel del polipéptido o ambos. Por ejemplo, el cambio a nivel de ARNm de un gen CYP51 se puede evaluar mediante una PcR cuantitativa en tiempo real (qRT- PCR) o análisis por transferencia de Northern.

Las moléculas de ARNdc de la presente invención son eficaces en la inhibición de la expresión del(los) gen(es) CYP51 del fitopatógeno fúngico o de oomiceto. La generación de moléculas de ARNdc de la invención en una planta inoculada con el fitopatógeno fúngico o de oomiceto puede dar como resultado niveles de ARNm del(los) gen(es) CYP51 que son al menos el 50 %, al menos el 60%, al menos el 70 % o, preferentemente, al menos el 75 % más bajos en comparación con los de una planta de control que no genera moléculas de ARN de la invención. Por ejemplo, tal cambio en los niveles de ARNm de CYP51 fúngico o de oomiceto (por ejemplo, niveles de ARNm de CYP51A, CYP51B y CYP51C de Fg) se puede determinar en hojas de Arabidopsis thaliana inoculadas tres días antes con el hongo u oomiceto (por ejemplo macroconidia Fg) del que proviene(n) el(los) gen(es) CYP51 que definen las secuencias sentido de la molécula de ARNdc. Por ejemplo, tal cambio en los niveles de ARNm de CYP51 fúngico o de oomiceto (por ejemplo, niveles de CYP51A, CYP51B y CYP51C Fg) se pueden determinar como alternativa en hojas de cebada inoculadas 7 días antes con el hongo u oomiceto (por ejemplo, macroconidia Fg) del que proviene(n) el(los) gen(es) CYP51 que definen las secuencias sentido de la molécula de ARNdc.

Las moléculas de ARNdc de la invención son útiles para controlar fitopatógenos fúngicos o de oomiceto, por ejemplo, fitopatógenos como los listados en la Tabla 1. En particular, las moléculas de ARNdc de la invención son adecuadas para el control de hongos del género Fusarium. De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, el hongo fitopatógeno a controlar se selecciona de Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum y Fusarium verticillioides.

Una molécula de ARNdc de la invención puede ser capaz de inhibir la expresión de dos o más fitopatógenos fúngicos y/o de oomicetos y, por consiguiente, pueden ser útiles para controlar dichas dos o más especies diferentes de fitopatógenos.

El control de un hongo u oomiceto fitopatógeno se refiere a medidas de prevención de la infestación de una planta por dicho patógeno así como medidas para combatir o curar la infestación de una planta por el patógeno. La infestación de una planta con un fitopatógeno fúngico o de oomiceto puede llegar a ser visible como una enfermedad de la planta. Por consiguiente, los usos y los procedimientos de la presente invención para el control de un hongo u oomiceto fitopatógeno son usos y procedimientos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de la planta causadas por el hongo u oomiceto fitopatógeno, por ejemplo, los listados en la Tabla 1.

La presente divulgación también proporciona ARNmc antisentido que comprende las secuencias antisentido pero no las secuencia sentido de la molécula de ARNdc de la presente invención descrita en el presente documento. Tal ARNmc antisentido es capaz de inhibir la expresión de gen(es) CYP51 del fitopatógeno fúngico o de oomiceto y es útil para el control de dicho patógeno de forma comparable con las moléculas de ARNdc de la invención.

Para controlar un hongo u oomiceto fitopatógeno, se pueden aplicar las moléculas de ARNdc de la invención a una planta infestada por o en riesgo de ser infectada por el fitopatógeno y/o las proximidades de dicha planta. La molécula de ARNdc de la invención se aplica ventajosamente en la forma de una composición. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición para controlar un hongo u oomiceto fitopatógeno que comprende la molécula de ARNdc de la invención y un vehículo fitocompatible.

Los vehículos fitocompatibles pueden ser líquidos, sólidos o mezclas de los mismos, por ejemplo, seleccionadas de agua, alcoholes (por ejemplo, disolventes orgánicos de butanol), glicoles, ácidos grasos, aceites minerales y vegetales, derivados de aceites minerales y vegetales, minerales naturales (por ejemplo, caolines, arcillas, talco, creta) y minerales sintéticos (por ejemplo, sílice finamente dividida, silicatos), ceras, fertilizantes sólidos, derivados de celulosa (por ejemplo, metilcelulosa), y mezclas de los mismos. El vehículo se elige ventajosamente para ser compatible con la aplicación de la composición a la planta a proteger o a curar, o a las proximidades de la misma. Por ejemplo, en composiciones líquidas, el vehículo puede incluir al menos un tensioactivo (es decir, un compuesto que modifica la tensión superficial) para modificar de manera positiva la dispersión, la suspensión o la precipitación de los ingredientes y/o mejorar la humectación y la dispersión de la composición.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la composición comprende moléculas de ARNdc de la invención aisladas o purificadas. De acuerdo con realizaciones alternativas, la composición de la invención comprende células hospedadoras, por ejemplo, células bacterianas o de levadura, capaces de expresar moléculas de ARNdc de la invención, o un extracto de tales células.

La composición de la invención puede comprender agentes adicionales que incluyen

agentes de protección de ARN que reducen o evitan la degradación química y/o enzimática indeseada de las

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moléculas de ARNdc, por ejemplo, inhibidores de RNasa;

compuestos que potencian o promueven la absorción de ARNdc por el fitopatógeno, por ejemplo, compuestos que generalmente promueven la absorción de ARN en células tales como lipofectamina; y fitofármacos y/o compuestos que promueven el crecimiento de la planta, por ejemplo, seleccionados de fungicidas, herbicidas, insecticidas, nematicidas, acaricidas, molusquicidas y sustancias activas de feromonas.

Las composiciones de la invención que comprenden tales fitofármacos y/o agentes que promueven el crecimiento de la planta pueden ejercer un espectro amplio de actividad biológica. Son particularmente ventajosas las composiciones que comprenden moléculas de ARNdc de la invención y un vehículo fitocompatible junto con uno o más de un fungicida adicional.

Las composiciones de la invención también son adecuadas para el control de hongos nocivos en la protección de productos almacenados o cosechas en la protección de materiales. La expresión "protección de materiales" se debe de entender que denota la protección de materiales técnicos y no vivos, tales como adhesivos, pegamentos, madera, papel y cartón, materiales textiles, cuero, dispersiones de pintura, plástico, lubricantes de enfriamiento, fibra o telas, frente a la infestación y la destrucción por microorganismos nocivos, tales como hongos. En cuanto a la protección de madera y otros materiales, se presta una particular atención a los siguientes hongos nocivos: Ascomicetos tales como Ophiostoma spp., Ceratocystis spp., Aureobasidium pullulans, Sclerophoma spp., Chaetomium spp., Humicola spp., Petriella spp., Trichurus spp.; Basidiomicetos tales como Coniophora spp., Coriolus spp., Gloeophyllum spp., Lentinus spp., Pleurotus spp., Poria spp., Serpula spp. y Tyromyces spp., Deuteromicetos tales como Aspergillus spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Trichorma spp., Alternaria spp., Paecilomyces spp. y Zigomicetos tales como Mucor spp., y además de la protección de productos almacenados y de cultivos, los siguientes hongos de levadura son dignos de mención: Candida spp. y Saccharomyces cerevisae.

La forma de la composición de la invención se adapta ventajosamente al modo de aplicación deseado. Las formas adecuadas incluyen composiciones listas para usar as'í como concentrados. Por ejemplo, la composición de la invención puede tener la forma de un líquido pulverizable, un polvo espolvoreable, un concentrado emulsionable, gránulos (por ejemplo, gránulos recubiertos, encapsulados o impregnados), una pasta, un polvo dispersable en agua o soluble en agua para el tratamiento de semillas. Los procedimientos de preparación de tales composiciones se conocen en la materia.

La invención proporciona un kit que comprende moléculas de ARNdc de la invención, o una célula hospedadora capaz de expresar las moléculas de ARNdc de la invención, o los ingredientes de una composición de la invención, o una composición de la invención. Se puede suministrar el kit con instrucciones adecuadas para su uso.

La presente invención proporciona el uso de moléculas de ARNdc de la invención, o una célula hospedadora capaz de expresar moléculas de ARNdc de la invención, o una composición de la invención para controlar el hongo u oomiceto fitopatógeno.

La presente invención proporciona adicionalmente procedimientos para controlar el hongo u oomiceto fitopatógeno, en los que una planta infestada por o en riesgo de ser infestada por el hongo y/o las proximidades de dicha planta se ponen en contacto con la composición.

Los procedimientos de aplicación para poner en contacto una planta y/o las proximidades de la misma con una composición son conocidas en la materia. Los procedimientos de aplicación adecuados incluyen, pero sin limitación, pulverizar una composición líquida, espolvorear una composición de polvo, incorporar una composición de polvo o granular en el suelo, embadurnar una composición pastosa, y recubrir o aplicar una película a las semillas de la planta con la composición.

La dosis de moléculas de ARNdc de la presente invención aplicada en el procedimiento de la presente invención es típicamente de 0,0001 a 10.000 g/ha, preferentemente de 0,0001 a 1.000 g/ha y más preferentemente de 0,001 a 300 g/ha para el tratamiento foliar; de 0,0001 a 200 g de composición por 100 kg de semilla, preferentemente de 0,001 a 150 g por 100 kg de semilla; y de 0,0001 a 10.000 g/ha y preferentemente de 0,0001 a 5.000 g/ha para el tratamiento del suelo.

Las moléculas de ARNdc de la invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la materia tales como síntesis química clásica, mediante procedimientos de transcripción in vitro, o mediante expresión heteróloga en, por ejemplo, microorganismos (bacterias, levaduras), cultivos celulares o plantas. Por consiguiente, la transcripción puede estar mediada por una ARN polimerasa endógena de la célula hospedadora in vivo, o por una ARN polimerasa clonada para la transcripción in vivo o in vitro. Las moléculas de ARNdc de la invención pueden ser ARNdc purificado o aislado. Por ejemplo, el ARN puede purificarse a partir de una mezcla por extracción con un disolvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una combinación de los mismos. Como alternativa, el ARNdc puede usarse con ninguna o solo con un mínimo de purificación para evitar pérdidas debido al procesamiento de la muestra. El ARN puede secarse para su almacenamiento o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales para promover el alineamiento y/o la estabilización de las regiones de ARN de cadena doble.

En el procedimiento de la presente invención para controlar un hongo u oomiceto fitopatógeno mediante la aplicación

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de una composición de la invención, la planta infestada por o en riesgo de ser infestada por el fitopatógeno y/o las proximidades de dicha planta se ponen ventajosamente en contacto con una cantidad eficaz de la composición. Una "cantidad eficaz" de una composición de la invención es una cantidad que comprende una cantidad de moléculas de ARNdc de la invención que es suficiente como para controlar el hongo. Tal cantidad eficaz puede variar en función del fitopatógeno a controlar, de la planta a proteger (especie, variedad, etapa de desarrollo), de las condiciones climáticas y de los componentes adicionales de la composición. La cantidad eficaz de la composición de la invención se puede determinar mediante ensayos de campo sistemáticos que son habituales y están dentro de las capacidades de un experto en la materia.

La presente invención también proporciona medios y procedimientos para controlar un hongo u oomiceto fitopatógeno generando las moléculas de ARNdc de la invención o ARNmc antisentido que comprende las secuencias antisentido pero no las secuencias sentido de la molécula de ARNdc de la invención en una planta a proteger del hongo. Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una planta transgénica que es tolerante a un hongo u oomiceto fitopatógeno mediante la introducción en una planta de un molde transgénico de al menos las secuencias antisentido (iv) de la molécula de ARNdc de la invención.

Una planta a proteger de o a ser tratada contra la infestación con un fitopatógeno de acuerdo con la invención, por ejemplo, una planta transgénica de acuerdo con la presente invención, puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea.

Los ejemplos de plantas monocotiledóneas son plantas que pertenecen a los géneros Avena (avena), Triticum (trigo), Secale (centeno), Hordeum (cebada), Oryza (arroz), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum y Zea (maíz).

Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen algodón, plantas leguminosas, en particular, alfalfa y soja, colza, tomate, remolacha azucarera, patata, plantas ornamentales y árboles. Las plantas útiles adicionales incluyen frutos (en particular, manzanas, peras, cerezas, uvas, cítricos, piña y plátanos), calabaza, pepino, vid, palmeras oleaginosas, arbusto del té, árboles del cacao y arbusto del café, tabaco, sisal, así como, con plantas medicinales, rauwolfia y digitalis.

La planta transgénica o no transgénica usada en los procedimientos de control del fitopatógeno de la presente invención en el presente documento se selecciona preferentemente de cebada, maíz, trigo, soja, avena, centeno, arroz, mijo, remolacha azucarera, colza, tomate, patata, algodón y tabaco; más preferentemente se selecciona de plantas de cebada, maíz, trigo, soja, avena, centeno y arroz; y lo más preferentemente se selecciona de plantas de cebada, de maíz y de trigo.

La presente invención proporciona una secuencia de ADN o una multitud de secuencias de ADN que proporcionan un molde transcripcional de al menos las secuencias antisentido (iv) de la molécula de ARN de la invención. De acuerdo con una realización preferida, la(s) secuencia(s) de ADN de la invención proporcionan un molde transcripcional de la molécula de ARNdc de la invención, es decir, que incluye las secuencias antisentido así como las secuencias sentido descritas en el presente documento. Como alternativa, la planta transgénica de la invención comprende un molde transcripcional de solo las secuencias antisentido, es decir, un molde transcripcional del ARNmc antisentido de la invención.

La(s) secuencia(s) de ADN de la invención pueden comprender adicionalmente al menos un promotor. El promotor comprendido por la(s) secuencia(s) de ADN de la invención está unido de manera operativa al molde transcripcional para permitir la generación de la molécula de ARNmc antisentido o de ARNdc de la presente invención mediante transcripción. Preferentemente, dicho promotor es un promotor que es funcional en una célula vegetal para permitir la generación de la molécula de ARNmc antisentido o ARNdc de la presente invención por una planta. El promotor se puede seleccionar a partir de promotores constitutivos y promotores regulados.

Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos incluyen el promotor 35S y el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S y CaMV19S; documento Us 6255560), un promotor de ubiquitina tal como el promotor de ubiquitina-10 (UBQ10) de Arabidopsis (documentos EP 1210446, EP 342926) un promotor de opina (documento EP 729514), y un promotor activo tal como el promotor de actina 1 (Act-1) de arroz.

Los promotores regulados incluyen promotores inducibles, promotores específicos de tejidos y promotores específicos del desarrollo. Los ejemplos no limitantes de promotores inducibles regulados químicamente incluyen el promotor del gen de alcohol deshidrogenasa I (alcA) (documento EP 637339); sistemas de promotores sensibles a tetraciclina, por ejemplo, sistemas de promotores que incluyen una proteína represora de tetraciclina (TetR), una secuencia operadora de tetraciclina y una proteína de fusión transactivadora de tetraciclina, que es la fusión de TetR y una secuencia de activación de proteína 16 de virus herpes simple (VP16) (documentos US 6242667 y US 6252136); promotores sensibles a esteroides, por ejemplo, promotores basados en receptores de ecdisona, receptor de estrógeno humano o receptor de glucocorticoide de rata (documentos EP 1232273, EP 1242604, US 6379945, EP 1112360); promotores regulados por metales, por ejemplo, derivados de la metalotioneína; y promotores derivados de proteínas relacionadas con la patogénesis, por ejemplo, de Arabidopsis o de maíz (documentos US 5689044 y EP 1056862). Los ejemplos no limitantes de los promotores inducibles físicamente regulados incluyen promotores inducidos por choque de frío y de calor (documentos EP 159884, EP 787194) así como promotores

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inducibles por luz (documento EP 310619) y promotores represores de luz (documentos US 5639952 y EP 1077257). Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejidos incluyen los promotores específicos de la raíz (documento EP 1248850), promotores del fruto (documentos EP 316441, eP 968292, EP 973922), y promotores de semilla (documentos eP 255378, EP 781849, US 6642437, EP 1019517). Los promotores regulados particularmente adecuados para la presente invención son los promotores inducidos por la presencia de un hongo u oomiceto fitopatógeno, pero no mediante organismos útiles tales como la micorriza; y promotores que son activos en el sitio de entrada del hongo u oomiceto fitopatógeno, tal como los promotores específicos de la epidermis. Se pueden usar promotores inducibles para generar de manera transitoria el ARNmc o la molécula de ARNdc de la invención, por ejemplo, en momentos cuando hay un riesgo agudo o elevado de infestación por fitopatógenos fúngicos o de oomicetos.

La presente invención proporciona un polinucleótido aislado que tiene o que comprende la(s) secuencia(s) de ADN de la presente invención, o una multitud de polinucleótidos aislados que tienen o que comprenden las secuencias de ADN de la presente invención. Dichos polinucleótidos aislados pueden ser vectores de transformación útiles para introducir secuencias de ADN en una planta. Tales vectores de transformación en plantas incluyen plásmidos (por ejemplo, plásmidos Ti, plásmidos Ri, plásmidos de la serie pUC o de la serie M13mp, pBR322), vectores víricos (por ejemplo, derivados del virus X de la patata, del virus del cascabeleo del tabaco, del virus Gemini) y otros vectores conocidos en la materia de la ingeniería genética. Los vectores de transformación en plantas pueden comprender secuencias de ADN que facilitan la transformación y/o la selección de plantas, tales como secuencias que codifican los marcadores de selección en plantas (por ejemplo, el gen bar) y secuencias de T-ADN.

La presente invención proporciona procedimientos para preparar una planta transgénica que comprende la introducción de la(s) secuencia(s) de ADN de la invención en la planta. La(s) secuencia(s) de ADN se puede(n) introducir en la forma de polinucleótido(s) aislado(s) de la invención (por ejemplo, en la forma de vectores de transformación en plantas). Están disponibles una serie de procedimientos bien conocidos para introducir polinucleótidos en una célula vegetal. Los procedimientos adecuados de transformación en plantas incluyen, pero sin limitación, la transformación en plantas por medio de T-ADN y la transformación de plantas Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes (documento EP 0116718) usando vectores víricos e infección vírica (documentos EP 0067553, US 4407956, WO 9534668, WO 9303161), la transformación en plantas por medio de polen (documento EP 0270356), la fusión de protoplastos, la absorción de ADN inducida por polietilenglicol, la transformación mediada por liposoma (documento US 4536475), la introducción biolística de ADN (Fromm y col., Bio/Technology 8(9):833-9, 1990), la electroporación, la microinyección y la incubación de embriones de planta secos en solución que comprende ADN.

Una planta transgénica de la presente invención es una planta, en la que al menos una célula de la planta contiene una secuencia de ADN o multitud de secuencias de ADN que proporcionan un molde transcripcional de al menos la(s) secuencia(s) antisentido de la molécula de ARNdc de la invención (es decir, un molde transcripcional para el ARNmc antisentido o la molécula de ARNdc de la invención). Preferentemente, dicha(s) secuencia(s) de ADN de la invención se integra(n) de manera estable en un cromosoma o en un elemento extracromosómico estable de la planta transgénica, de manera que la(s) secuencia(s) de ADN se pueda(n) pasar a la progenie de la planta transgénica. La tolerancia a hongos y/u oomicetos fitopatógenos conferida por la(s) secuencia(s) de ADN de la invención pueden ser heredadas, por lo tanto, por la progenie de la planta transgénica. La planta transgénica de la presente invención es preferentemente un cultivo cereal, por ejemplo, una planta de cebada, capaz de generar ARNmc antisentido o moléculas de ARNdc para controlar uno o más de un fitopatógeno, en particular, seleccionado de hongos fitopatógenos del género Fusarium, por ejemplo, F. graminearum.

Además de la transformación directa de una planta con secuencia(s) de ADN recombinante de la invención, se pueden preparar plantas transgénicas autopolinizando plantas que tienen dicha(s) secuencia(s) de ADN, o cruzando una primera planta que tiene dicha(s) secuencia(s) de ADN recombinante con una segunda planta que carece de tal secuencia de ADN recombinante. La semilla resultante se puede usar para cultivar una progenie de plantas que incluyen líneas de plantas que comprenden la(s) secuencia(s) de ADN de la presente invención. Por ejemplo, la(s) secuencia(s) de ADN de la invención se puede(n) introducir en una primera línea de plantas que es modificable para la transformación para producir una planta transgénica que se puede cruzar con una segunda línea de plantas para introducir dicha(s) secuencia(s) de ADN en la segunda línea de plantas. Puede ser ventajoso expresar secuencias de ADN de la invención en una planta estéril masculina, por ejemplo, como un medio para reducir la preocupación sobre el flujo de transgenes a las plantas adyacentes. En la práctica, la presente invención se puede combinar con otros rasgos antipatógenos en una planta.

De acuerdo con una realización preferida, la planta transgénica de la invención es capaz de genera ARNmc antisentido o la molécula de ARNdc de la invención. Dicho ARNmc antisentido y la molécula de ARNdc de la invención son capaces de inhibir la expresión del(los) gen(es) CYP51 del fitopatógeno fúngico o de oomiceto, preferentemente, los genes CYP51A, CYP51B y CYP51C de un hongo fitopatógeno del género Fusarium. Los niveles de ARNm de dicho(s) gen(es) CYP51 en una planta transgénica de la invención inoculada con el fitopatógeno pueden ser al menos el 50 %, al menos el 60%, al menos el 70 % o, preferentemente, al menos el 75 % más bajos en comparación con los de una planta de control que no genera ARNmc antisentido o moléculas de ARNdc de la invención. Tal cambio en los niveles de ARNm del(los) gen(es) CYP51 se puede determinar, por ejemplo, en hojas de planta inoculadas tres días antes con el fitopatógeno (por ejemplo, macroconidia de Fusarium).

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La planta de control es una planta que es sensible al fitopatógeno, y se cultiva e inocula con el fitopatógeno como la planta transgénica con la que se compara. La planta de control puede ser una planta que difiere de la planta transgénica de la invención en que carece de un molde transcripcional del ARNmc antisentido o la molécula de ARNdc de la invención. Por ejemplo, como planta de control, se puede usar una planta transgénica que comprende un vector vacío o un gen marcador pero no secuencia(s) de ADN de la invención o una planta no transgénica (es decir, tipo silvestre). Ventajosamente, los perfiles de expresión de la planta transgénica de la invención y la correspondiente planta de control difieren solo en la generación del ARNmc antisentido o de las moléculas de ARNdc de la invención, o la ausencia de las mismas.

La presente invención también proporciona procedimientos para controlar el hongo u oomiceto fitopatógeno, en los que los procedimientos comprenden el cultivo de una planta transgénica de la invención para permitir la generación del ARNmc antisentido o la molécula de ARNdc de la invención por la planta (es decir, la generación de ARN que comprende al menos la(s) secuencia(s) antisentido de las moléculas de ARNdc de la invención). La generación de ARNmc antisentido o moléculas de ARNdc de la invención mediante la planta transgénica puede conferir tolerancia al hongo u oomiceto fitopatógeno. En una planta transgénica tolerante a fitopatógenos de la presente invención, la gravedad y/o la frecuencia de la infestación con el fitopatógeno se puede reducir al menos el 5 %, al menos el 20 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, preferentemente al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % en comparación con una correspondiente planta de control. Como alternativa, la tolerancia a los patógenos de una planta transgénica de la presente invención se puede describir en referencia a un índice de susceptibilidad relativa que compara la susceptibilidad de la planta transgénica a dicho patógeno con la susceptibilidad de una planta control a dicho patógeno, estableciéndose la última al 100 %. El índice de susceptibilidad relativa de plantas transgénicas de la presente invención puede ser menos del 95 %, menos de 80, menos de un 50 %, menos de un 40 %, preferentemente menos de un 35 %, menos de un 20 % o menos de un 10 %.

La tolerancia de una planta a las infestaciones fúngicas o de oomicetos se puede ensayar mediante inoculación experimental con una dosis de fitopatógeno del hongo u oomiceto (por ejemplo, poniendo en contacto la planta o parte de la misma con una suspensión de conidias fúngicas). La infestación fúngica o de oomicetos se puede evaluar, por ejemplo, comparando el grado de infestación fúngica o de oomicetos en la planta transgénica con el grado de infestación fúngica o de oomicetos en una correspondiente planta de control. Los parámetros cuantificables incluyen, pero sin limitación, el número relativo de plantas infestadas, el número total de plantas infestadas en un tamaño de parcela dado; el número promedio de síntomas de enfermedad; el tamaño relativo del área de la hoja que presenta decoloración inducida por el hongo, necrosis o crecimiento fúngico; el número promedio de granos y/o el peso por planta; o el rendimiento por área cultivada. Por ejemplo, tras un tiempo dado (tal como 3 o 7 días después) la inoculación con el fitopatógeno, el área de la hoja infestada de una planta transgénica de la invención puede ser al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, preferentemente al menos el 75 %, al menos el 80 o al menos el 90 % más pequeña que el área de la hoja infestada de una correspondiente planta de control que no genera ARNmc antisentido o moléculas de ARNdc de la invención.

Los procedimientos de control de un fitopatógeno descrito en el presente documento usando una composición y/o una planta transgénica de la invención son útiles para aumentar el rendimiento y/o la calidad de las plantas. Las ventajas particulares de estos procedimientos de la invención incluyen:

• El ARNmc antisentido o las moléculas de ARNdc de la invención son altamente selectivas para el hongo fitopatógeno a controlar. De ese modo, los organismos benevolentes tales como las micorrizas o las abejas no se ven afectados.

• Los seres humanos y los animales que consumen alimentos producidos a partir de una planta transgénica de la invención, o de plantas tratadas con moléculas de ARNdc de la invención no están afectados por el ARNmc antisentido o las moléculas de ARNdc de la invención que son altamente selectivas y, siendo ARN biodegradable, no persiste ni se acumula en el ambiente.

• El ARNmc antisentido o las moléculas de ARNdc de la invención se pueden expresar en o transportar hacia partes de la planta que son difíciles de alcanzar con tratamiento químico, proporcionando de este modo una protección comprehensiva de la planta.

• La actividad antifúngica de las plantas transgénicas de la presente invención no recae en la expresión de nuevas proteínas en la planta, lo que podría suponer un riesgo alergénico.

• Las plantas transgénicas de la presente invención pueden tener una elevada homología proteómica o incluso una identidad proteómica total con el parental correspondiente, por ejemplo, plantas de tipo silvestre.

Ejemplos

Tabla 2: Listado de cebadores útiles para estudios de PCR y de qPCR

N.°: Nombre del cebador Secuencia del cebador Aplicación SEQ ID NO

1: CYP51A_F CGGTCCATTGACAATCCCCGT Clonación de CYP51A 32

CYP51A_R: G CAG CAAACTCG G CAG TGAG Clonación de CYP51A 33

(continuación)

N.°: Nombre del cebador Secuencia del cebador Aplicación SEQ ID NO

2: CYP51B(Aatll)_F G ACGT CCAG CAAGTTT GACG AG TC Clonación de CYP51B, Síntesis de ARNdc 34

CYP518(Ncol)_R: CCATGGAGAGTTCATAAGGTGC TTCA Clonación de CYP51B 35

3: CYP51 C(Bcul)_F ACTAGTATTGGAAGCACCGTAC AAT Clonación de CYP51C 36

CYP51C(Sacl)_R: GAG CTCCATT G GAG CAGTCAT A AACAA Clonación de CYP51C, Síntesis de ARNdc 37

4: CYP51 B(Hindlll)_ F AAGCTTCAGCAAGTTTGACGAG TC Transformación de la planta 38

CYP51 C(Xma!) _R: CCCGGGCATTGGAGCAGTCATA Transformación de la planta 39


: AACAA

5: T7_F T AAT ACGACT CACT AT AGG CAGC AAGTTT GACG AGT C Síntesis de ARNdc 40

T7_R: T AAT ACGACT CACT AT AGGCA TTGGAGCAGTCATAAACAA Síntesis de ARNdc 41

6: CYP51A4_F CCTTTGGTGCCGGTAGACAT RT-PCR en tiempo real 42

CYP51A4_R: CCCATCGAATAAACGCAGGC RT-PCR en tiempo real 43

7: QCYP51 B_F T CT ACACCGTT CT CACT ACTCC RT-PCR en tiempo real 44

QCYP51 B_R: GCTTCTCTTGAAGTAATCGC RT-PCR en tiempo real 45

8: CYP51C2_F CGAGTCCCTGGCACTGAATG RT-PCR en tiempo real 46

CYP51C2_R: GCTCATCACCCCAAAACCGT RT-PCR en tiempo real 47

9: qpcrBtubulin_F ATCTCGAGCCCGGTACCATGG RT-PCR en tiempo real 48

qpcrBtubuHn_R: CTCGGTGTAATGACCCTTGGCC RT-PCR en tiempo real 49

A) Procedimientos usados en los ejemplos

i) Construcción de moldes de CYP51A, CYP51B y CYP51C y síntesis de ARNdc

Las anotaciones de genes para Fg esterol 14 alfa-desmetilasas (CYP51) se obtuvieron de la base de datos del 5 Broad Institute (
http://www.broadinstitute.org). Se diseñaron cebadores para generar amplicones de PCR de 200-300 pb de longitud que se corresponden con exones de genes seleccionados: 294 pb de CYP51A (SEQ ID NO:4), 220 pb de CYP51B (SEQ ID NO:5), y 238 pb de CYP51C (SEQ ID NO:6). El ADN genómico del molde se extrajo de Fg usando el minikit de plantas DNeasy (Qiagen). Los tres amplicones se apilaron en el vector de clonación pGEM-T Easy cloning (Promega) (Fig. 5). El clon apilado (CYP51B-CYP51A-CYP51C) se usó como molde para la síntesis de 10 ARNdc (CYP3RNA; SEQ ID nO:7) usando los cebadores cyp51B (AatII)_F y cyp51C (Sacl)_R (Tabla 2). La síntesis de ARNdc para estudios in vitro se realizó usando el kit de transcripción BLOCK-iT RNAi TOPO (Invitrogen) así como el kit de transcripción de alto rendimiento MEGAscript® Kit (Ambion). Siguiendo los protocolos de MEGAscript®, los pares de cebadores T7_F y T7_R con la secuencia del promotor T7 en el extremo 5' de ambos cebadores directo e inverso se diseñaron para la amplificación de ARNdc (Tabla 2).

15 ii) Preparación de macroconidias fúngicas y tratamiento de silenciamiento de ARN in vitro

Tanto la cepa Fg de tipo silvestre (wt, del inglés wildtype) como la cepa de Fg que expresa GFP, WT-GFP (Jansen y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 46:16892-16897. 2005) se cultivaron de forma habitual en medio nutritivo SnA sintético (Nirenberg, Can. J. Bot. 59:1599-1609. 1996). Las placas se incubaron a temperatura ambiente en iluminación constante de un tubo de UV cercano (Phillips TLD 36 W/08) y un tubo de luz blanca (Phillips TLD 36 20 W/830HF). Se recolectaron las conidias de cultivos de 1 semana con una varilla de vidrio estéril y agua estéril. Las

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macroconidias se filtraron a través de 4 capas de miracloth estéril, se recolectaron y se lavaron tres veces con agua destilada estéril y finalmente se diluyeron a 100 macroconidias en un volumen de 100 jl de medio SNA líquido, y se colocaron en una placa de microtítulo de 96 pocillos. Se añadieron 1,5 jg de ARNdc (600 ng/jl) suspendidos en 2,5 jl de 50x de tampón de alineamiento a muestras fúngicas y se añadió el mismo volumen de 50x de tampón de alineamiento a la muestra de control. Las placas se incubaron a temperatura ambiente. Tras la incubación durante 72 h, se realizaron estudios microscópicos con un microscopio invertido (Leica DM IL). Cada experimento se hizo por triplicado. En paralelo, se llevaron a cabo experimentos con tebuconazol (Sigma Aldrich). Se suspendieron cinco mg de tebuconazol en 1 ml de etanol absoluto para obtener una solución madre de 5 mg/ml. La muestra de control incluía la adición del mismo volumen de disolvente (agua estéril y alcohol) sin tebuconazol.

iii) Generación de plantas Arabidopsis transgénicas

La construcción de ARNdc CYP3RNAse amplificó mediante los cebadores específicos del gen CYP51B-HindIII_F y CYP51C-XmaI_R (Tabla 2) y se clonaron en le vector binario p7U10-RNAi (servicio de clonación de ADN) que contiene el gen del marcador seleccionable bar bajo el control del promotor de Ubiquitina-10 (UBQ10) de Arabidopsis y el promotor constitutivo CaMV35s (Fig. 5b). La construcción del plásmido resultante p7U10-CYP3RNA (Fig. 7) se introdujo en la cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1 (Lazo y col., Biotechnology (NY). 9:963-7. 1991) mediante electroporación. La transformación de la planta y la regeneración se realizó tal como se describe (Bechtold y col., C. R. Acad. Sci. París, Life Sciences 316:1194-1199. 1993), y se seleccionaron los transformantes mediante Basta (7 mg/l, Duchefa Biochemies).

iv) Selección molecular de los transformantes de Arabidopsis

El ADN genómico de las hojas jóvenes de 5 semanas de edad de líneas de A. thaliana transgénicas (T1) y no transgénicas se extrajo usando el procedimiento CTAB (Chen y col., Plant Mol Biol Rep 17:53-57. 1999). La integración de CYP3RNA en el genoma de Arabidopsis se confirmó mediante PCR usando los cebadores específicos del gen CYP51B-HindIII_F y CYP51 C-Xmal_R (Tabla 2).

Para la detección de ARNip, se extrajo el total de ARN de las líneas de Arabidopsis usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se separó un total de 15 jg de ARN en un gen de poliacrilamida al 16 %-urea 7 M y se transfirió a una membrana de nylon Hybond (Amersham, Reino Unido) usando un material absorbente semiseco (BioRad) a corriente constante (250 mA) durante 3 horas. El ARN se reticuló por UV a la membrana a 1200 x 100 jjulios de energía (UV Stratalinker). La membrana se prehibridó durante 45 minutos a 42 °C en 20 ml de PerfectHyb-Puffer (Sigma). El amplicón completo de PCR de CYP3RNA de 791 pb se usó como molde para marcar de manera aleatoria (marcado aleatorio de ADN del cebador con Kit, NEB), se añadió al tampón de hibridación y se hibridó toda la noche a 42 °C. La membrana se lavó dos veces a temperatura ambiente con 5x de SSC + SDS al 0,01 %. La membrana se expuso en pantallas de autorradiografía (phosphorimaging) y se detectaron las señales usando un generador de imágenes molecular y el programa Quantity One (BioRad). Se usó una carga paralela de marcador de ARN de rango bajo (Fermentas) como marcador de tamaño.

v) Ensayo de infección de la planta Arabidopsis

Para el ensayo de infección de la hoja, se ajustó la concentración de conidias de Fg en el inóculo a 5 x104 conidias por ml. Para cada una de las plantas de la línea transgénica (T2) y de control (vector vacío y de tipo silvestre Col-0) se arrancaron veinte hojas en roseta de 15 plantas diferentes de 5 semanas de edad y se transfirieron a placas petri cuadradas que contienen agar al 2 % en agua. La inoculación se llevó a cabo tal como se describe por Koch y col., J Phytopathology 160(10):606-610. 2012. Para evaluar la progresión de los síntomas de la enfermedad, se midió el tamaño de la lesión (en cm) mediante 3 ppp de las imágenes digitales usando el programa informático gratuito Image J (
http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Se calculó el porcentaje de área de la hoja que presente síntomas de infestación en relación con la hoja no inoculada. Se recogieron las hojas infestadas a 3 ppp, se transfirieron en tubos de 2 ml que contenían 1 ml de solución de azul de tripano (10 g de fenol, 10 ml de glicerol, 10 ml de ácido láctico, 10 mg de azul de tripano, disueltos en 10 ml de agua destilada), seguido por un hervido durante 3 minutos. Las hojas se destiñeron después en 1 ml de solución de hidrato de cloral (2,5 g de hidrato de cloral disueltos en 1 ml de agua destilada) durante toda la noche, y se analizaron con un microscopio de luz (Zeiss Axioplan 2 Imaging). Se analizó la Fg marcada con GFP usando un microscopio confocal (Leica TCS SP2).

vi) Análisis del tránscrito fúngico

Para evaluar el silenciamiento de los genes CYP51 en Fg, se realizó un análisis de la expresión de ARNm usando una RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Para el ensayo in vitro, se cultivaron 1,2 x 10 5 conidias de Fg en 2 ml de medio líquido SNA. Se añadieron 162 jg de ARNdc suspendidos en 200 jl agua sin nucleasa (810 ng/jl). Las muestras se cultivaron a temperatura ambiente mientras se agitaban (72 horas). Para el ensayo in vivo, las hojas de Arabidopsis arrancadas se inocularon con macroconidias de Fg y se recolectaron 3 días tras la inoculación (dti). La extracción de ARN de la muestra fúngica in vitro así como de las hojas enfermas se realizó con TRIzol® (Invitrogen, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm recién extraído se usó para la síntesis de ADNc usando el kit de transcripción inversa QuantiTect® (QIAGEN, Alemania). Se almacenó ADNc a -20 °C. Para la qRT-PCR, se usaron 50 ng de ADNc como molde en el sistema de PCR en tiempo real 7500 FAST de Applied

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Biosystems. Las amplificaciones se realizaron en 7,5 |jl de SYBER green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Alemania) con 0,5 pmol de oligonucleótidos. Cada muestra tuvo tres repeticiones. Los cebadores se usaron para estudiar la expresión de los genes diana CYP51 con referencia al gen de la beta tubulina (Tabla 2). Tras una etapa de activación inicial a 95 °C durante 5 minutos, se realizaron 40 ciclos (95 °C durante 30 segundos, 53 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos). Los valores de Ct se determinaron con el programa informático 7500 Fast suministrado con el instrumento. Los niveles de transcripción de genes CYP51 se determinaron mediante el procedimiento 2"ññCt (Livak y col., Methods 25:402-408. 2001) normalizando la cantidad de tránscrito diana a la cantidad de beta tubulina.

vii) Pulverización de ARNdc y ensayo de infección de la hoja

Se arrancaron hojas de plantas de cebada de la variedad de cultivo Golden Promise de tipo silvestre de 2-3 semanas de vida y se transfirieron a placas de Petri cuadradas que contienen agar al 1 %. Las hojas se pulverizaron después con ARNdc. El ARNdc se generó usando el kit de ARNi MEGAscript® (Invitrogen). Siguiendo los protocolos de MEGAscript®, los pares de cebadores T7_F y T7_R con la secuencia del promotor T7 en el extremo 5' de ambos cebadores directo e inverso se diseñaron para la amplificación de ARNdc (véase la Tabla 2). Para la aplicación por pulverización, se diluyó el ARNdc en 500 jl de Tween 20 al 0,02 % (v/v) hasta una concentración final de 20 ng/jl. La pulverización de las hojas se llevó a cabo usando un matraz de pulverización (capacidad de 10 ml). Cada placa que contenía seis hojas arrancadas se pulverizó de manera uniforme con ARNdc de CYP3RNA, solo tampón TE o ARNdc-GFP, respectivamente, rociándolas 3-4 veces. A continuación, las placas se dejaron en reposo abiertas hasta que se secó la superficie de cada hoja (lo que llevó aproximadamente 2 horas) y después se recubrieron con tapas. 48 horas después de la pulverización las hojas se trataron con una suspensión de conidias de Fg en Tween 20 al 0,02 % a una concentración de 2 x 10 4 conidias por ml aplicando una gota de 20 jl de suspensión a cada una de las partes superior, media e inferior de la hoja. De nuevo, las placas se recubrieron con tapas y se incubaron durante 6 días a temperatura ambiente. Para evaluar la gravedad de la infección, se evaluó el crecimiento fúngico midiendo la cantidad relativa de expresión del gen fúngico usando la qPCR. A tal fin, se eliminaron las gotas de cada hoja usando un papel de filtro, las hojas se recolectaron en tubos de 15 ml y se almacenaron a -80 °C hasta que se extrajo el ADN.

viii) Extracción de ADN y análisis de PCR para la cuantificación fúngica

Para evaluar la inhibición del crecimiento fúngico se midió la cantidad relativa del ADN genómico fúngico usando una PCR cuantitativa (qPCR). El ADN se extrajo usando el procedimiento CTAB (Chen y col., Plant Mol Biol Rep 17:53- 57. 1999). Para la qPCR, se usaron 50 ng de ADN como molde en el sistema de PCR en tiempo real 7500 FAST de Applied Biosystems. Las amplificaciones se realizaron en 7,5 jl de SYBER green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma- Aldrich) con 0,5 pmol de oligonucleótidos. Cada muestra tuvo tres repeticiones. Se usaron los cebadores para determinar la cantidad de ADN genómico de beta tubulina fúngica con referencia al ADN genómico de ubiquitina de la cebada. Tras una activación inicial de la etapa a 95 °C durante 5 minutos, se realizaron 40 ciclos (95 °C durante 30 segundos, 57 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos). Los valores de Ct se determinaron con el programa informático 7500 Fast suministrado con el instrumento. Los niveles de transcripción del gen de beta tubulina se determinaron mediante el procedimiento 2'ññCt (Livak y col., Methods 25:402-408. 2001) normalizando la cantidad de ADN fúngico de beta tubulina a la cantidad de ADN de la planta de ubiquitina.

B) Ejemplos

Ejemplo 1: Inhibición del crecimiento fúngico y silenciamiento de genes Fg CYP51 mediante aplicación directa de ARNdc

Se generó un ARNdc de 791 pb (CYP3RNA) complementario con los tres genes fúngicos CYP51 (Fig. 5). El análisis microscópico de las macroconidias de Fg tratadas con CYP3RNA reveló un hinchamiento de las puntas de las hifas en 48 tras el tratamiento (htt, datos no mostrados). En 72 htt, los cambios morfológicos se habían vuelto más pronunciados, particularmente en las puntas de las hifas, (Fig. 1a,ii). En comparación, no se detectó tal hinchamiento en el control tratado por simulación (Fig. 1 a,i). Dado que las proteínas CYP51 son la diana de los fungicidas de azol, también se controló el fenotipo de las macroconidias de Fg tratadas con tebuconazol. Las macroconidias de Fg tratadas con tebuconazol (5 mg/l) presentaron un fenotipo comparable con el generado mediante el tratamiento de CYP3RNA (Fig. 1 a,iii).

El fenotipo similar de Fg tratado con CYP3RNA y tebuconazol indicó que el ARNdc silenció la expresión de uno o más genes CYP51. Esto se confirmó mediante la cuantificación de los niveles de transcripción para CYP51A, CYP51B, y CYP51C en macroconidias de Fg de control y tratadas con ARNdc a 72 htt usando una qPCR con beta tubulina como el gen de referencia. Los tránscritos para los tres genes se redujeron significativamente en macroconidias de Fg tratadas con CYP3RNA en comparación con los controles de simulación (Fig. 1b).

El crecimiento fúngico (determinado basándose en las densidades ópticas de cultivos de Fg a 600 nm a 0 htt y 72 htt) se inhibió fuertemente mediante CYP3RNA en una forma dependiente de la dosis (Fig. 2).

La capacidad de CYP3RNA para reducir el crecimiento de Fg y silenciar los genes CYP51 en macroconidias de Fg indica que el hongo puede tomar hasta un ARNdc de 791 pb sin un soporte de administración adicional, tal como

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polietilenglicol, cloruro de calcio, lipofectamina o electroporación.

Ejemplo 2: La expresión de CYP3RNA in planta confiere resistencia a Fg

Las plantas Col-0 de Arabidopsis thaliana se transformaron bien con p7U10-CYP3RNA, que contiene dos promotores 35S invertidos que dirigen la producción constitutiva de copias sentido y antisentido de CYP3RNA, o un control de vector vacío (vv) (Figs. 7 y 8). La resistencia a Fg se evaluó mediante la inoculación de hojas arrancadas de plantas Arabidopsis T2 de 5 semanas de vida (que expresan CYP3RNA) y las respectivas plantas control Col-0 vv de Arabidopsis con 5 x 104 macroconidias deFg por ml (véase el procedimiento v) anteriormente).

A los 3 días tras la inoculación (dti), tanto el Col-0 de tipo silvestre (ts) como la línea de control de vv presentaron lesiones empapadas en agua con lesiones cloróticas o necróticas; estos son síntomas típicos de una infestación de Fg (Fig. 3a, i-ii). En marcado contraste, cuatro líneas T2 de Arabidopsis independientes que contienen la construcción de silenciamiento de CYP3RNA (L1, L8, L10, L11) no presentaron síntomas de la enfermedad y sus hojas eran indistinguibles de las de los controles inoculados con un simulacro (Fig. 3a, iii, iv). El porcentaje de área infestada de la hoja en las cuatro líneas transgénicas fue del 0,9 %, mientras que el de los controles de vv fueron del 77 % (Fig. 3b). Las líneas que expresan CYP3RNA permanecieron sin síntomas de enfermedad a 5 dti, a diferencia de las plantas vv Col-0 que presentaron síntomas sustanciales en ese momento (Fig. 3c). Las hifas fúngicas se deben a la germinación y al crecimiento de los hongos en el agar inoculado, no sobre la hoja (Fig 3b,ii). Además, el crecimiento fúngico fue más lento y el pigmento de la colonia fue amarillo o pardusco en placas con líneas que expresan CYP3RNA en lugar del típico rosa en placas de control (datos no mostrados).

El crecimiento fúngico se caracterizó mediante análisis microscópico de las hojas arrancadas teñidas con azul de tripano para visualizar las hifas fúngicas tal como se describe anteriormente. Sobre las hojas del control de vv Col-0, las macroconidias fúngicas germinaron y desarrollaron micelios en 3 dti (datos no mostrados). El crecimiento de hifas profusas se vio fuera y dentro de la hoja, y no se restringió al sitio de inoculación. El desarrollo exitoso del hongo se indicó adicionalmente mediante la formación de esporodoquia suelta formada por conidióforos ramificados. En marcado contraste, la formación de micelios fúngicos en hojas que expresan CYP3RNA se redujo fuertemente (a cerca del 100 %) y se limitó exclusivamente al área herida que rodea de los sitios de infección; no se detectó colonización fúngica en el tejido foliar de alrededor. El crecimiento del hongo y los sitios de la herida formaron rápidamente un gran número de esporodoquia, que es indicativo de que el hongo se está desemparejando por el estrés.

Los resultados del ensayo de las hojas arrancadas se confirmaron mediante microscopia confocal de hojas intactas del control vv Col-0 y de plantas que expresan CYP3RNA inoculadas con macroconidias de una cepa de Fg que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). Tal como se evidencia mediante la fluorescencia GFP, las hojas vv Col-0 de control colonizadas de manera eficaz por Fg, desarrollan micelios en 3 dti. En comparación, el crecimiento fúngico en hojas que expresan CYP3RNA se restringió al sitio de inoculación, en donde se observó una esporulación inducida por estrés.

Sorprendentemente, el nivel de resistencia alcanzado direccionando los tres genes parálogos CYP51 de Fg para inducir HIGS fue sustancialmente mayor que el observado en los estudios de HIGS publicados anteriormente.

Ejemplo 3: La resistencia a Fg en las líneas que expresan CYP3RNA se debe a HIGS de los genes CYP51

Para evaluar si el HIGS de los genes CYP51 fue responsable de la resistencia a Fg en las líneas que expresan CYP3RNA, a 3 dti (véase procedimiento (vi) anteriormente) se realizó un análisis de RT-PCR cuantitativa del ARN total de las hojas inoculadas con Fg de plantas que expresan CYP3RNA y plantas control con vv. Los niveles relativos de transcripción de Fg CYP51A, Fg CYP51B y Fg CYP51C se redujeron en promedio al 92 %, 89 % y 77 %, respectivamente, en muestras de líneas que expresan CYP3RNA (L1, L8, L10 y L11), en comparación con la línea de control con vv (Figs. 5-7).

Se analizó adicionalmente si esta reducción en los tránscritos de Fg CYP51 estaba asociada con la producción de los correspondientes ARNip. En análisis por transferencia de Northern que usa CYP3RNA como la sonda, se detectaron los ARNip que se corresponden con las secuencias diana de CYP51 tanto en hojas infestadas con Fg como en hojas no infestadas de plantas que expresan CYP3RNA (Fig. 8). Por el contrario, estos ARNip no se observaron en las hojas de plantas de ts o control con vv. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión de CYP3RNA silencia de manera eficaz los tres genes Fg CYP51, posiblemente dirigiendo la maquinaria de silenciamiento de la planta hospedadora para producir los correspondientes ARNip.

Ejemplo 4: Resistencia a Fg en hojas de cebada que expresan CYP3RNA

La cebada se transformó con p7i-Ubi-CYP3RNAi (Fig. 9). Se generó p7i-Ubi-CYP3RNA análogo a p7U10-CYP3RNAi sustituyendo el fragmento de GUS en p7i-Ubi-RNAi2 (Fig. 8) por un fragmento CYP51ABC (CYP51A-CYP51B- CYP51C) usando enzimas de restricción HindIII/Xmal. El vector binario p7i-Ubi-CYP3RNAi contiene dos promotores 35S que dirigen la producción constitutiva de copias sentido y antisentido de CYP51ABC. Para preparar las plantas de control, se transformó la cebada con el vector vacío (vv) (Fig. 8). Las plantas de cebada transgénicas que expresan CYP51ABC se identificaron mediante RT-PCR usando cebadores específicos del gen. Para cada línea

5

10

15

20

25

30

35

40

transgénica (L2 a L9, L15 y L42) y las plantas de control (vector vacío y tipo silvestre var. Golden Promise) se arrancaron dos hojas de plantas de cebada de 2 semanas de edad y se transfirieron a placas de petri cuadradas que contienen agar al 2 % en agua. Cada hoja se inoculó en tres puntos diferentes (superior, medio, inferior) con gotas de 20 |jl de una suspensión que comprende 5x 10 4 macroconidias de Fg por ml. Después de 7 días, se tomaron imágenes de las hojas (véase la Fig. 10) y se determinaron los niveles relativos de los tránscritos de CYP51A, CYP51B y CYP51C análogo al procedimiento (vi) anterior (véase la Fig. 11). Las hojas de las líneas transgénicas (L2-L9, L14, L42) difirieron de manera significativa de las hojas de los controles (vv, GP) en relación con los síntomas de una infestación fúngica. Cuatro de las 10 líneas transgénicas (L2, L7, L9, L42) no presentaron síntomas de infestación fúngica (resistencia al 100 %). Las seis líneas restantes (L3-L6, L8 y L14) solo presentaron síntomas débiles y localmente restringidos. Por el contrario, las líneas de control presentaron una decoloración y un blanqueo significativo de las hojas inoculadas con Fg (véase Fig.10).

Ejemplo 5: Reducción del crecimiento de Fg tras la aplicación de ARNdc en hojas

Se generó un ARNdc de 791 pb (CYP3RNA) complementario con los tres genes fúngicos CYP51 (Fig. 5) y se aplicó a las hojas de cebada arrancadas y montadas sobre placas de agar. Como controles negativos, solo se aplicó tampón o una molécula de ARNdc no relacionada (ARNdc-GFP, que no tiene homología con genes fúngicos). 48 horas después de pulverizar las hojas de cebada con ARNdc CYP3RNA o los controles negativos, se infectaron las hojas con macroconidias de Fg. 6 días después de la inoculación (es decir, 8 días tras la pulverización), se observó una inhibición significativa del crecimiento fúngico con hojas tratadas con CYP3RNA ("ARNdc") en comparación con las hojas de control (que se pulverizaron solo con tampón ("control") o ARNdc-GFP ("GFP"), Fig. 12A). Estos hallazgos fueron consistentes con los resultados de la qPCR, en los que se descubrió que la cantidad relativa de ADN fúngico en hojas infectadas tratadas con CYP3RNA es significativamente menor que en hojas de control infectadas (Fig. 12C). Ni el tampón TE ni el ARNdc-GFP no relacionado tuvieron un efecto inhibidor sobre el crecimiento fúngico.

Ejemplo 6: Reducción del crecimiento de Fg tras la aplicación de ARN en áreas distales de la hoja

La parte superior de las hojas se pulverizó con ARNdc (CYP3RNA) o una muestra de control (solo tampón ("control") o ARNdc-GFP ("GFP")), mientras que las zonas media e inferior se recubrieron. Después de 2 días, la parte inferior de las hojas se sometió a inoculación fúngica. Se determinó la gravedad de la infección 6 días tras la inoculación midiendo la cantidad relativa del ADN fúngico. La inhibición del crecimiento fúngico en comparación con las hojas tratadas con control se observó no solo en la zona superior de la hoja tratada con CYP3RNA, sino también en el área inferior de la hoja de la misma hoja (Figs. 12B y 12D). Estos hallazgos indican que el ARNdc de CYP3RNA se toma por y se transporta en la hoja para proporcionar una protección sistémica de la infestación fúngica.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BASF SE

<120> ARNi para el control de hongos y oomicetos fitopatógenos mediante la inhibición de la expresión de genes CYP51

<130> 75207/JAB <160> 49

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211>1524 <212> ADN

<213> Fusarium graminearum <400> 1

atgttccatc

gccaacctat

tggttccctt

aagtgccgag

gcttgccttg

gcagaagaag

tgtcccaact

gcactcgagt

ccatcctttt

atctttactg

tttgctgctc

tggttgccac

tatatggata

atgatagcca

atcgcccaca

tcttggatcg

cagctcgtaa

aagctccctc

tcaatcctgc

acagacaaag

aacgccaaaa

gaagatgtca

tactcatcta: tcccttatgg gtcttggtag cactctttgc tgtcataatt 60

tgtatcagca: gcttcctcga aggccggacg agcctccact agttttccac 120

tctttggaaa: cgcagtcgct tacggcctgg acccttgtgg cttctttgag 180

agaagcacgg: agacgtcttc acctttatct tattcggtcg aaaaatcgtc 240

gcgtcgacgg: caatgatttt gttctcaaca gtcgcctcca ggatgccaat 300

tttacggtcc: attgacaatc cccgtctttg gtagcgatgt cgtatacgat 360

cgaagctcat: ggaacaaaag aagtttgtca agtttggcct tacgcaaaaa 420

cacacgtcca: gttaatcgag cgagaggttc ttgactacgt cgaaactgat 480

ctggcagaac: tagcaccatc gatgtcccca aggcaatggc tgagataaca 540

cctcacgttc: tttgcagggt gaggaagttc ggagaaaact cactgccgag 600

tgtatcacga: tcttgacctt ggatttagac ctgtcaactt tctgtttcca 660

tgcctcacaa: ccgaaaacga gatgctgctc atataaagat gcgggaagtc 720

tcatcaacga: tcgaagaaaa gggggcattc gaacagaaga tggtactgat 780

acttgatggg: ctgcacttac aagaacggac agcctgttcc tgacaaggaa 840

tgatgattac: tctactcatg gcaggccagc actcttcatc ttctgccagt 900

tgctgcacct: tgcttcttct cccgacatta ccgaagaact ctaccaggag 960

atttgagcgt: taacggtgct ctacctcccc ttcagtactc tgaccttgac 1020

ttctccagaa: cgtcgtcaag gagactctcc gcgtccactc ttccatccac 1080

ggaaagtcaa: gagacccatg caagttccca attcccctta cacgatcact 1140

tcatcatggc: ttcacctaca gttaccgcga tgagtgaaga gtacttcgag 1200

catggaaccc: tcatcgatgg gacaacagag caaaggagga ggttgacact 1260

tcgactatgg: atatggggct gtgtctaaag gaacgaagag cccgtacttg 1320

ccggtagaca: tcgctgcatt ggagagaagt ttgcctatgt caacttgggt 1380

ctactttggt: gcgcaacttc agactttcga ccattgatgg aagacctgga 1440

cagactatac: ttctttgttc tcacgacccg cccagcctgc gtttattcga 1500

ggaagaagat: atag 1524

<210>2 <211> 1581 <212> ADN

<213> Fusarium graminearum

atgggtctcc ttcaagaact ggcgggccat ctgggccagc aagttggaat tggctttgca gtcctcaacc agctcctctt ccgaaacccc ccctttgttg gaagcaccat cacatacgga cgtgccaagc acggcgatgt cttcaccttt gttggccctg ctggaaacga cttcatcctc gagatctaca ccgttctcac tactcctgtc aacgccaagc tcatggaaca gaagaagttc cgatcctacg ttcccatcat ctcctccgag ttcaagggca agtctggcat tgccgatatc actgcttccc atgctctcca gggcagcgcc gctctctacc acgacctcga tatgggcttc cctctcccct ggaaccgtaa gcgcgaccac gacactatca aggagcgccg cgccaagggc caccttatga actctacata caagaacggt atgatgattg ccctccttat ggctggccag atgctccgtc tcgctcagta ccctcacatc aacctcggtg ctgatctgcc tcctctgact caggctatcg tcaaggagac ccttcgtctc gtcaagtctc ccatgcccgt ccctggcact ctcgctgctc ctggtgtcag tgctaccgac gaccctcacc gatgggaggc agactctccc gacgaggaga agatcgacta cggttacggc ctgcctttcg gcgctggccg tcaccgatgc

caaaccattg ttgccgaggt tgttcgcgag

accctgatcg ataccgacta cgcctcgctc

cactgggagc gacgccagta a

<210>3 <211> 1554 <212> ADN

5 <213> Fusarium graminearum

ccgctcgccc: aacaattcca ggaacttccc 60

gtcttcctcg: tgctctccgt cgtcctcaat 120

aatgagcccc: ctatggtctt ccactggttc 180

atggaccccc: ccacgttctt cagagagaac 240

atcctcctcg: gaaagaaaac cactgtcgct 300

aacggcaagc: tcaaggatgt gtgtgctgag 360

tttggcaagg: atgtcgtcta tgactgcccc 420

atgaagattg: ccctgaccac cgaagccttc 480

gttcgcgatt: acttcaagag aagccccgac 540

cccaagaaga: tggccgagat cactatcttt 600

atccgcagca: agtttgacga gtccctggcc 660

acccccatca: acttcatgct tcactgggcc 720

gcccagcgca: ctgttgccaa gatctacatg 780

aacaacgaat: ccgagcatga catgatgaag 840

atccgtgtcc: ctgaccacga ggttgcccac 900

cactcttctt: cttccaccag ctcatggatc 960

atggaagagc: tctaccagga gcaggtcaag 1020

tacgaagacc: ttgccaagct gccccttaac 1080

catgctccta: tccactccat catgcgcgcc 1140

aagtatgtca: ttcccacttc gcacactctt 1200

tctgccttct: tccccaaccc tgatgagtgg 1260

aacttccccc: gcatggcttc caagggcgag 1320

cttgtcagca: agggttcagc ttctccctac 1380

attggtgagc: actttgccaa cgcccagctt 1440

ttcaagttcc: gcaacgttga tggcggtcac 1500

ttctcccgac: ctctggagcc cgccaacatt 1560



: 1581

accagcatca tcatcatctt gtccatcgtc accaacgtgg tcaaacaatt atggtttccc 120

aacccacatc gtccacccgt tgtattccat atcttcccct tcattggaag caccgtacaa 180

tatggcatcg acccgtacgc ttttttcttc gactgcagag ataaatacgg cgactgcttt 240

acctttattc tccttggcaa atcaacgact gtctttcttg gtcccaaggg caatgacttt 300

atcctcaacg gcaaacacgc cgatctcaac gccgaggacg tttatgggaa acttaccacg 360

cccgtgtttg gtgaggaggt tgtttatgac tgctccaatg ctcgtttcat ggaccaaaag 420

aggcttctca aacttggtct caccacagat tccttacggt gctacatccc aaagttcgtc 480

aaagaagtcg aagactatgt taaaaactcg ccatacttca agggtgacac aggaatcgtc 540

aacattacag aagtcatggc cgaaatcaca atctacacag catccggatc cctcctagga 600

aacgaagtcc gatctatgtt tgacagcaca ttcgccactc tctaccgcca tctagatgat 660

ggcttccaac ccattaattt cgtcatgcca ggtcttcccc tcccgcaaaa cttccgtcga 720

aaccatgctc gaaaggtaat ggagaagctt ttcagcgata ttatttccaa gcgtcgcgag 780

actggcaatc aaggcgacga gacggatatg atttggatgc ttatgaatgc acagtataag 840

gatggggaac ctcttccgga tcaccatgct gcgcgtatgt tgattgctat cctgatgggt 900

ggccagcata atactgctgt tagtggtgct tggcttcttc tcaatctggc ccataagcct 960

catcttgttc aggaactgta cgaggaacag acccaggtcc ttggctcacc acaagagcct 1020

ctgacatggg agaacttaca gaaattaact ctcaacggcc aagtcatcaa ggaaactctc 1080

cgtcttcaca gtccaatcca ctccatcctc cgacaagtca aatcacccat gcgagtccct 1140

ggcactgaat gggtagtgcc accatcccac acactgcttt cgtctcccgg cacaatggcc 1200

cgctcagaag aattcttccc tcgaccatca gaatgggatc ctcatcgttg ggacaagatt 1260

gaacctctcg tgaagaccgc cgaagatggt caaacagtgg attacggttt tggggtgatg 1320

agcaaatccg tcagcagtcc ttatttgccc tttggagctg gacgacatcg atgtgttggc 1380

gagaattacg cttatgcaca gctgggagct attgttgcca cgtttatcag attggttcac 1440

attgaacagc ctgacccgaa ggctcctctt ccggcaccag attattcttc catgttttct 1500

cggcccatga accctgccga gatccgatgg cgtcgacgcg agacagtaga atga 1554

<210>4 <211> 294 <212> ADN

<213> Fusarium graminearum <400> 4

5

10

15

20

gctcatggaa caaaagaagt ttgtcaagtt tggccttacg caaaaagcac tcgagtcaca 120

cgtccagtta atcgagcgag aggttcttga ctacgtcgaa actgatccat ccttttctgg 180

cagaactagc accatcgatg tccccaaggc aatggctgag ataacaatct ttactgcctc 240

acgttctttg cagggtgagg aagttcggag aaaactcact gccgagtttg ctgc 294

<210>5 <211> 220 <212> ADN

<213> Fusarium graminearum <400>5

cagcaagttt gacgagtccc tggccgctct ctaccacgac ctcgatatgg gcttcacccc 60

catcaacttc atgcttcact gggcccctct cccctggaac cgtaagcgcg accacgccca 120

gcgcactgtt gccaagatct acatggacac tatcaaggag cgccgcgcca agggcaacaa 180

cgaatccgag catgacatga tgaagcacct tatgaactct 220

<210>6 <211> 238 <212> ADN

<213> Fusarium graminearum <400> 6

attggaagca ccgtacaata tggcatcgac

aaatacggcg actgctttac ctttattctc

cccaagggca atgactttat cctcaacggc

tatgggaaac ttaccacgcc cgtgtttggt

<210>7 <211> 785 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> combina secuencias parciales de CYP51B-CYP51A-CYP51C de Fusarium graminearum <400> 7

cagcaagttt gacgagtccc tggccgctct ctaccacgac ctcgatatgg gcttcacccc 60

catcaacttc atgcttcact gggcccctct cccctggaac cgtaagcgcg accacgccca 120

ccgtacgctt ttttcttcga cttggcaaat caacgactgt aaacacgccg atctcaacgc gaggaggttg tttatgactg

ctgcagagat: 60

ctttcttggt: 120

cgaggacgtt: 180

ctccaatg: 238

5

gcgcactgtt

cgaatccgag

cgatatcggt

ctcgaagctc

gtcacacgtc

ttctggcaga

tgcctcacgt

cactagtatt

cagagataaa

tcttggtccc

ggacgtttat

caatg

<210>8 <211> 1521 <212> ADN

gccaagatct acatggacac tatcaaggag catgacatga tgaagcacct tatgaactct ccattgacaa tccccgtctt tggtagcgat atggaacaaa agaagtttgt caagtttggc cagttaatcg agcgagaggt tcttgactac actagcacca tcgatgtccc caaggcaatg tctttgcagg gtgaggaagt tcggagaaaa ggaagcaccg tacaatatgg catcgacccg tacggcgact gctttacctt tattctcctt aagggcaatg actttatcct caacggcaaa gggaaactta ccacgcccgt gtttggtgag

cgccgcgcca: agggcaacaa 180

ccatggcggc: cgcgggaatt 240

gtcgtatacg: attgtcccaa 300

cttacgcaaa: aagcactcga 360

gtcgaaactg: atccatcctt 420

gctgagataa: caatctttac 480

ctcactgccg: agtttgctgc 540

tacgcttttt: tcttcgactg 600

ggcaaatcaa: cgactgtctt 660

cacgccgatc: tcaacgccga 720

gaggttgttt: atgactgctc 780


: 785

<213> Fusarium oxysporum <400>8

atgttctcac tcctatacta ccctctatgg ctcaacgtct tataccagaa gctccctcga tggcttccat tcgttgggaa tgctgttgct aagtgtcgag aaaagcacgg cgatgtcttc gcctgtcttg gtgttgacgg caatgacttt gccgaagaaa tctacagtcc attgacaacg tgtcccaact cgaagctcat ggagcaaaag gctctcgagt cccatgtcca gttgatcgag ccttcattct ctggaaagtc tggcacagtt atcttcactg ctgctcgctc tctgcagggc tttgcagctc tgtatcatga ccttgaccta tggctacctt tgcctcataa ccgacgtcga tacatggaca tcattaacgg acgaagaaga atgatcgcca acctgatgaa ttgcgagtac atcgcgcaca tgatgatcac ccttctcatg tcatggatca tactacatct ggcttcatcc

caactcatta acttgagtgc tgatggtgtt

aagcttcccc ttcttcagaa tgtcgtcaaa

tccattctgc gaaaggttaa gagacctatg

acagacaagg ttctcctcgc ttcaccaact

gacgcccaga gatggaatcc tcatcggtgg

gacgatgtca ttgactacgg ctacggcgct

ccctttggcg ctggtcggca tcgctgcatc

gttatcgtcg cgactttggt gcgcaacttc

attccagcaa ctgactacac ttctctcttc

tgggagcgca ggagggctta a

<210>9 <211>1584 <212> ADN

5 <213> Fusarium oxysporum

gcctttgctt: cctgcctagt tatcatcact 60

aatgccaacg: aacctccgtt agtgttccac 120

tatggactcg: acccttatgg tttctttgtg 180

acctttatcc: tcttcggtcg aaaaatcgtt 240

gttctcaaca: gtcgaattca ggacgccaac 300

cctgtctttg: gtagtgatgt cgtatacgat 360

aagtttgtca: agtttggcct tacacaaaag 420

cgagaggttc: tggagtacat ccaagctgta 480

gatgtatcca: aggcaatggc tgagataacc 540

gaagaagttc: gacggaagct tacagctgag 600

ggcttcactc: ctgtaaactt cctgttcccc 660

gatgctgctc: atgcaaagat gagagagatc 720

ggcgtagggg: acttggagaa aggaactgac 780

aaaaacgggc: agccgattcc ggacaaagag 840

gctggacaac: actcttcgtc atctgctagt 900

actgacattg: ctgaggaact ctaccaagag 960

ctccctcccc: ttcagtacac cgacctcgac 1020

gaaacactcc: gtgttcattc ttccattcac 1080

caagcacctg: gatcacctta caccatcacc 1140

gttacagcgt: tgagtgaaga acacttcacg 1200

gataacaaac: cccaggagga ggccgtgacg 1260

gtttctaaag: gaacgaagag cccatactta 1320

ggggagaagt: ttgcttatgt caacttgggc 1380

agactgtcga: ctcttgatgg caagcctggt 1440

tcaaggccag: cccaacctgc atacataaac 1500



: 1521

atgggtctcc tccaagaact tgcgagccac ctgggccagc agattggaat tggcttcgga gtgctcaacc agctactctt caagaaccgc cctttcgttg gaagcactat cacatacgga cgcgccaagc atggtgatgt tttcaccttt gttggcccca ctggaaacga cttcatcctc gagatttaca ctgttctcac tactcctgtc aatgccaaac tcatggagca gaagaagttc cgatcatacg tgcctattat ctccgccgag ttcaagggca agtccggtat tgtcgatatt actgcttcgc atgcccttca gggcagcgtc gctctctacc acgatctcga catgggtttc cctctcccct ggaaccgcaa gcgtgaccac gacaccatta aggagcgacg cgctaaggac catctcatga actctactta caagaacggc atgatgattg ctctcctcat ggctggccag atgctccgtc tcgctcagta ccctcacatc gaactcggtg ctgatttgcc tcccctgact

caggccatta tcaaggagac tctccgcctt

gtcaagtctc ccatgcctgt ccctggaacc

ctcgccgccc ccggtgtcag cgctactgac

gatcctcacc gatgggaggt cgactctccc

gacgaagaga agatcgacta tggctacggc

ctgccctttg gtgctggtcg tcaccgatgc

cagacaattg ttgctgaggt tgtgcgtgag

actctaatcg acaccgacta cgcctcgctt

cactgggaga gacgccagca gtag

<210> 10 <211> 1149 <212>ADN

5 <213> Fusarium oxysporum

ccgctcgcac: aacaatatca ggagctcccc 60

gcattcataa: ttctctctgt cgttctgaat 120

aatgaacctc: ccctagtctt ccactggttc 180

atggaccccc: ctaagttctt caaggagaac 240

gtcctccttg: gaaagaaaac cactgtcgct 300

aacggaaagc: tcaaggatgt ctctgccgag 360

tttggcaagg: atgtcgtgta cgattgccct 420

atgaaaatcg: ccctcacgac cgaagccttc 480

gttcgcgatt: acttcaagaa gagccctgat 540

cccaagaaaa: tggccgagat cactatcttc 600

attcgtaaca: agtttgacga gtctctggcc 660

actcccatca: acttcatgct tcactgggct 720

gcccagcgca: ctgttgccaa gatctatatg 780

aacgatgaca: ccgagcacga tatgatgaag 840

acccctgtcc: ctgatcatga ggtcgcccac 900

cactcttctt: cttctaccag ctcttggatc 960

atggaggagc: tgtaccaaga gcaggtcaga 1020

tacgacaacc: ttgccaagct gcccctcaac 1080

cacgccccta: tccactctat catgcgcgcc 1140

aagtacacca: tcccgacctc gcacactctt 1200

tcggcctact: tccccaaccc cgatgagtgg 1260

aacttcccca: gaatggctac ccgtggcgat 1320

cttgtcagca: agggttccgc ctctccttat 1380

attggcgagc: actttgccaa cgcccagctt 1440

ttcaagttcc: gcaatgtgga tggcggcaac 1500

ttctcgcgac: ccttggagcc cgccaacatt 1560



: 1584

5

atggatcaga agaggcttct caaacttggt ctcacaactg actcattgcg atgctacatc 60

cccaaattcg tcaaagaagt cgaagaatac atcgctactt caccctactt caaaggatca 120

actggcatcg tcaacatcac cgaagtaatg gccgagatca caatctacac cgcagcaggc 180

tccctcctcg gtaacgaagt ccgctccatg tttgacagca cattcgcaac cctgtaccgc 240

catctcgacg atggctttca acctatcaac ttcgtcatgc ctggtcttcc cctaccacaa 300

aacttccgtc gcgatcacgc acgaaaggtc atggaggaat tgttcagcga catcatccgc 360

aagcgtcgtg agattggaaa tcaaggcggt gagactgata tggtttggac gcttatgaat 420

gctaaataca aggatggtga ggacttgccg gatcatcatg cggcgaggat gttgattgct 480

attctgatgg gtgggcagca caacactgct gctagtggcg cctggctact tctcaatctt 540

gcgcataaac cgcatctcgt tcaagagttg tatgatgagc agcttgaggt tttgggatca 600

ccgcaagagc cgttgacgtg ggagaatttg cagaagttga cgctgaatgg acaggttatc 660

aaggagacct tgcgtcttca cagtccaatc cactctattc tccgacaggt caagtcacct 720

atgcgagttc ccggcacaga ctgggttgtt ccgccgtctc atacactcct cgcttctccc 780

ggtacacaag cacgatctga ggaattcttt cctagaccta tggaatggga tcctcatcgg 840

tgggataaaa ttgagtctct tgaggactcg aagggtaatg gggagacagt tgattatggc 900

ttcggcgtga tgaacaagtc tgtgagcagc ccatatctac cctttggcgc gggacggcat 960

cgctgtgttg gagagaacta cgcgtatgcc cagttgggcg ccatcattgc aacgtttgtg 1020

agactgcttc atattgaaca gcctgatccc aatgcacctc tacctgcgcc tgactattcg 1080

tcaatgtttt ctcggcctat gaacccagcc gtcatccgat ggactcgtcg taacacggag 1140

gccaattag 1149

<210> 11 <211> 1338 <212> ADN

<213> Fusarium verticiMioides <400> 11

5

tgtcttggtg

gaagaaatct

ccaaactcaa

cttgagtccc

tcattctctg

tttactgctg

gcagctctgt

ctacctctgc

atgggcatta

atcgccaact

gcacacatga

tggatcgtac

gtcatcaact

ctcccgcttc

attctgcgaa

gacaaggtta

gcccaaagat

gaagtcattg

tttggtgcgg

atcgtcgcga

ccagcaaccg

gaacgcagga

tgcacggcga tgtcttcacc ttgatggcaa tgactttgtt acgggccatt gacaacgcct agctcatgga gcaaaaaaag atgttcagtt gatcgaacga agaagtctgg cacagttgat cccgttctct gcaaggtgaa atcatgacct cgatctaggc ctcacaaccg acgtcgagac tcaatgaacg aagaagaggc tgatgagttg tgcctacaag tgatcactct tctcatggcc tgcatctggc ttcatcccct tgagtgctag cggcgctctc tccagaatgt tgtcaaagaa aggtcaagag acccatgcaa tcctcgcttc accaactgtt ggaatcctca tcggtgggat actacggcta cggtgctgtc gccggcatcg atgtatcgga cgttggtgcg taacttcaga acttcacttc tctcttctcg aggcttag

tttgtcctct tcggtcgaaa ctcaacagtc gaattcaaga gtctttggca gcgatgtcgt tttgtcaagt ttggtcttac gaggttttag agtacatcca gtatccaaag cgatggctga gaagttcgac ggaagcttac tttactccgg tcaacttcct gctgctcatt caaagatgag ggaggagact tggaaaaaag aacaggcagc ccattcctga ggacaacact cttcatcatc gatatcactg aggaactcta ccacccctgc agtactccga acactccgag ttcattcttc gcacctggcc caccttacac acagcgttga gtgaagaaca aataagcccc aggaggaggc tctaaaggaa caaaaagccc gagaagtatg cttatgtcaa ctgtcgactc ttgatggcaa agaccagccc aacctgccta

gatcgttgcc: 60

cgccaacgcc: 120

atacgattgt: 180

ccaaaaggct: 240

agcagtacct: 300

gatcaccatc: 360

cgctgagttt: 420

gttcccctgg: 480

agagatctat: 540

aaccgatatg: 600

caaggagatc: 660

tgctagttca: 720

ccaagagcaa: 780

cctcgacaag: 840

tatccactct: 900

catcaccacc: 960

cttcccagac: 1020

cgtgacggac: 1080

atatttaccc: 1140

cttaggagtt: 1200

gcctggtgtt: 1260

catcaaatgg: 1320

: 1338

<210> 12 <211> 1584 <212> ADN

<213> Fusarium verticiMioides

<400> 12

ctggcccagc

gtactcaacc

cccttcgttg

cgtgccaagc

gttggcccca

gagatttaca

aatgccaaac

cgatcatatg

ttcaagggca

actgcctcgc

gctctctacc

cctctgccct

gacaccatta

catctcatga

atgatgattg

atgctccgtc

gagctcggtg

caggccatta

gtcaagtctc

ctcgccgctc

gatcctcacc

gacgaagaga

ctgccctttg

cagacaattg

actctgatcg

cactgggaaa

tccaagaact: tgcgagccac

aaattggaat: tggctttgga

agctactctt: caagaaccgc

gaagcactat: cacatacgga

atggtgatgt: cttcaccttt

ctggaaacga: cttcatcctc

ctgttctcac: tactcctgtc

tcatggagca: gaagaagttc

tgcctattat: ctcctccgag

agtccggtat: tgtcgacatt

atgccctcca: aggcagcgtt

acgatctcga: catgggtttc

ggaaccgcaa: gcgcgatcac

aggagcgacg: cgctaaggac

actctactta: caagaacggc

ctcttctcat: ggctggccag

tcgctcagta: ccctcacatc

ctgatttgcc: tcccctgact

tcaaggagac: tctccgcctt

ccatgcctgt: tcctggaacc

ctggtgtcag: cgctaccgac

gatgggaggc: cgactctccc

agatcgacta: cggctacggt

gtgctggtcg: tcaccgatgc

ttgctgaggt: tgtgcgtgag

acaccgacta: cgcctcgctt

gacgacagca: gtag

ccgctcgcac aacaatatca gctttcgtag ttctctctgt aatgaaccac ccctggtctt atggaccccc ctaaattctt gtcctcctcg gaaagaaaac aacggaaagc tcaaggatgt ttcggcaagg atgtcgtgta atgaaaatcg ccctcacgac gttcgcgatt acttcaagaa cccaagaaaa tggccgagat atccgtaaca agtttgacga actcccatca actttatgct gcccagcgca ctgttgccaa aacgatgaca ccgagcacga acccctgtcc ctgatcacga cactcttctt cttctaccag atggaagagc tgtaccaaga tacgacgacc ttgccaagct cacgctccta ttcactccat aagtacacca tcccgacctc tcggcctact tccccaaccc aacttcccca gaatggctaa cttgtcagca agggttctgc attggcgagc actttgccaa ttcaagttcc gcaatgtgga ttctcacgac ccttggagcc

ggagcttccc: 60

cgttctcaat: 120

ccactggttc: 180

cagggagaac: 240

cactgtcgct: 300

atctgccgag: 360

tgattgcccc: 420

cgaagccttc: 480

gagccccgat: 540

cactatcttc: 600

gtctctggcc: 660

tcactgggct: 720

gatctatatg: 780

tatgatgaag: 840

ggtcgcccac: 900

ctcttggatt: 960

gcaggttaga: 1020

gcccctcaac: 1080

catgcgcgcc: 1140

gcacactctt: 1200

cgatgagtgg: 1260

ccgtggcgat: 1320

ctctccttat: 1380

cgcccagctt: 1440

tggcggcaac: 1500

cgccaacatc: 1560

: 1584

<210> 13 <211> 1146 <212> ADN

<213> Fusarium verticiMioides

5

cccaaattcg tcaaagaagt agaagactac atcgccacgt caccatactt caaaggtaac 120

accggaatcg tcaacatcac cgaagtaatg gccgagatca caatctacac tgcagcaggc 180

tccctcctcg gcaacgaagt ccgctccatg ttcgatagca cattcgcaac gctttaccga 240

catctcgacg atggtttcca gcccataaac ttcgtcatgc ctggtcttcc cttaccacag 300

aacttccgac gcgatcatgc gcgaaaggtc atggaagagc ttttcagcga tatcattcgc 360

aagcgtcgtg agatgggcaa tcaaggtgat gagactgata tggtttggac gcttatgaat 420

gctaaataca aggatggtga ggatctgccg aatcatcatg ccgcgaggat gttgattgct 480

attcttatgg gtggacagca taacactgct gcgagtggtg cttggctact tctcaacctt 540

gcgcataaac cgcatctggt caaggaattg tatgacgaac aagttgaggt tttgggatca 600

ccgcaggagc ccttgacgtg ggagaattta cagaaattga ccctcaatgg acaggtcatc 660

aaggaaactc tacgtcttca cagtccaatt cattctattc tccggcaggt caaatcacct 720

atgcgagttc ccggcacaga ctgggtagtt cctccatctc atacacttct cgcttcacct 780

ggtacacaag ctcgatctga ggaattcttc cctcggccta tggaatggga tcctcatcga 840

tgggataaga tcgagtctct tgatgatgcc aagaatgggg agacagtcga ttatgggttc 900

ggtatgatga gcaagtccgt cagcagcccg tatctgcctt ttggtgcagg gcgacatcgt 960

tgtgttgggg agaactacgc atatgcacag cttggtgcga ttattgcatc gtttgtgaga 1020

ttgcttcata ttgagcagcc tgatcctaag gcacctcttc ctgcgccaga ttattcttca 1080

atgttttctc ggcctatgaa cccagccgtc atccgatgga ctcgccgtaa cgcggagact 1140

ggttag 1146

<210> 14 <211> 1593 <212> ADN

<213> Blumeria graminis <400> 14

agcattgcgt tggctagtgg aattataagt ttattattac tattaacctt cttgaatgta 120

ttgaagcagc tactattcaa aaatccaaat gagccaccga tcgtgtttca ttggattcct 180

atcattggta gtacaatttc atatggaatg aatccctata aattctttca tgaatcccaa 240

gccaagtacg gaaatatttt cactttcata ttactgggta aaaagacgac agtatatcta 300

ggtcgacagg gaaacaattt tattcttaat ggaaaactga gggatgttaa tgctgaagaa 360

gtttattcag tcttaacgac tcctgtcttc gggactgatg tagtgtatga ctgtcctaat 420

tcaaaattaa tggaacaaaa gaagttcatg aaagcagccc ttacaactga ggccttccgc 480

tcttatgtac ctatcatcca aaatgaagtg gagagcttta taaataaatg cgacgatttt 540

cgaaaatcag aaggtatcat caatatcgct gccgtaatgg ctgaaattac gatatatacc 600

gcttcacaca ccctacaagg aaaagaggtt cgcgatagat ttgattcttc tttggcagtt 660

ttgtatcatg acctagatat gggctttacc ccaatcaatt tcatgcttca ctgggcacca 720

cttccgcaca atcgagctcg tgatcatgcc caacggacag tcgcaaaaat atacatggag 780

attatcaaca gccgtcggac gcagaaagaa actgataatt ccaatttaga tatcatgtgg 840

caattaatgc gctcttccta caaagatggc actcccgtac cggataaaga aattgcacat 900

atgatgatcg cgctcctgat ggctgggcaa cattcttcgt cctcgtccag cacatggatc 960

atgctgtggc ttgctgctcg accagatatc actgaagaac tctaccaaga acagctagaa 1020

atattgggat cagaattacc tcctgctaaa tatgaagatc tctcgaaact tactctgcat 1080

caaaatgtag tgaaagaggt cctccgtctg catgctccca tacattcgat cttacgaaaa 1140

gtaaagaatc caatgcccgt tccaggaact agttatgtaa tacctaagac caattctctc 1200

ttggcggccc ctgggtggac aagtcgagac gcctcatact tccctaatcc gcttacgtgg 1260

gacccacatc gttgggacac tggatctagt ggggtgatag gcacggatat ggaggatgaa 1320

aaattcgact atgggtatgg attaattagc acaggggcag caagccctta cttaccgttt 1380

ggggccggac ggcatcgctg cataggcgag cagtttgcaa cggtgcaatt agttacaatc 1440

atggccacca tggttcgcag tttcaagttt cacaaccttg acggaaggga gggcgttgcc 1500

gaaactgatt actcaagtat gttttctcgg ccaatggcac ctgccataat tgcatgggag 1560

aagagggaca aaaaggacaa aacggagtgt taa 1593

<210> 15 <211> 1581 <212> ADN

<213> Magnaporthe grísea <400> 15

atgggccttc tacaggacac caccggcccg ggggcgcagg ttggtgttgc cttcgtcagc gcgcagcaga tcttcttcaa gaacccccat gtcgtcggtt cgacggtcac gtatggaaag aagaagtacg gcaacatctt taccttcatt ggcaccgaag gcaacgagtt catcctcaac atctacggac ccatgaccac tcccgtgttc gccaagctga tggagcaaaa gaagtttatg tcttacgttc ctatcattgc cgacgaggtt aagggcccgt cgggcgtcgt caacatcccg

gcctcgcacg ccctccaggg taaggagatc

ttgtaccacg acctcgacat gggcttccac

ctcccccgca acatccgccg cgacaaggca

accatccagc gccgccgtgc gaagggtaag

cttatgaact cgacctacaa aaatggcacc

atgatcgctc tcctgatggc cggacagcac

ctccgcctcg ccagccgccc ggatattatg

ctgggtgccg acttgccccc tctccgctac

gccgtcatea aggagactct ccgcctccac

aagcaggacc tccccgttcc gggtaccaac

gccgcccccg gatactcggc cggtgacccc

ccgcaccgtt gggaggccga ctcgcgcctg

gatgaggagg agaagattga ttacggatac

tacttgccct ttggcgccgg tcgccaccgc

cttcagacca ttgtcgccat gattgtgcgc

ggcaaggtcg tcggcaccaa ctacgcctcg

atttactggg agaggcgcta a

<210> 16 <211> 1548 <212> ADN

5 <213> Magnaporthe grísea

ctggtagatg: ccttctacca gctgggcact 60

ttcatcttcc: tctcggtctt tttccacgta 120

gagccgcccg: tcgtcttcag ctggttcccc 180

gacccgccac: agttcttccg ggacatggcc 240

ctcctcggaa: agaagacaac cgtctacate 300

ggcaagctgc: gcgatgtcaa tgcagaggag 360

ggcaaggacg: tcgtctatga ctgccccaac 420

aagatcgccc: tcaccaccga ggccttccgt 480

tcgagctacc: tgaagcggac ccccgccttc 540

cccaagatgg: ccgagattac catcttcacc 600

cgcgaccagt: tcgacgagac cctggccgat 660

ccggtcaact: tcaagcttca ctggctaccc 720

caaaagacca: tcgccaagat ctacatggac 780

gactccgagg: ccaaggatat gatgtaccac 840

cccgtccctg: accacgagat cgcccacatg 900

tcgtcgtcgt: ccaccagctc ctggatcatg 960

gaggaactgt: accaggagca ggtccgcgcg 1020

gaggacctcg: ccaatctgcc tctccacctc 1080

gctccgatca: actccattct ccgcgccgtg 1140

tacgtcatcg: ccaaggacac caccgtcctc 1200

aaccacttcc: ctgagccgga actttgggag 1260

gctccacgca: tctcgatgag caacgacaac 1320

ggcctcgtca: gcaagggtac tacctctcct 1380

tgcatcggtg: aacacttcgc caacgtccag 1440

gagttcaagt: tccgcaacgt cgacggcagc 1500

ctcttctcca: ggcctgagga gcccgccaaa 1560



: 1581

ttcatcattg gctccataat actcaacttc atctggcagc aactgccccg tcccaaatcg 120

gaaccaccgc tggttttcca ctggttgccc ttcatcggca acgccgtctc ctacggcatg 180

gacccctacc gcttctactc tcaatgccgg gaaaagcacg gcgatgtctt tacgtttgtc 240

ttgttcggca ggcgcatgac cgtcttctta ggcgtccagg gcaacgactt catcctgaac 300

ggcaagctgc aggacctcaa tgctgaggag atatacagcc ctctcaccac accagttttc 360

ggaagtgata ttatctacga ctgccccaac tccaaactca tggagcaaaa gaagtttgtc 420

aagtttggcc tgacgcaaaa ggctctggat tcctacgtcc ccctgatcga gagggaggtc 480

ctcgactaca tagagtcctc acccgtcttc caagccggca accacggcat cgtagacatt 540

cccagcatga tggccgagat aaccattttc acagccagtc gtaccttgca aggccccgag 600

gtcaggaaga agctgactgg agaattcgca cgactctatc acgacttgga cctgggtttc 660

cgccccatca acttcctagc cccgtgggcg ccccttcccc agaaccgccg acgcgacgtt 720

gctcatgctc gaatgcgcga tgtttacatg gacctcatca acaaacgccg ccgacagaag 780

gacgatcaag aagaagaaga agaagcagag ccagacatga tccgccacct gatgggcagc 840

tgcgtgtaca aaaacggcca agccctcccc gacaaggaaa tcgcccacat gatgatcacg 900

cttctcatgg caggccagca ttcttcctcc tcttcgagcg cgtggatcat gctccgcctc 960

gcgtcgcggc ccgacatcgc cgaggaggtg taccaagaag tgcagcggct cgggcacgca 1020

tccctgcagc actcggacct cgacaagctg ccgctgctcg caaacgtggt caaggagacg 1080

ctgcgggtgc actcgtccat ccactccatc atgcgcaagg tgaagcggcc gatgcggatt 1140

ccgggcagcg actacgtcgt caccccgggc aaggtgctcg tgtccgcgcc catcatgacg 1200

cacctggacg aggagcactt ccgcgacgcg cgggcttggg agccgcatcg gtgggatgac 1260

gccgtcgacg cccaggacga cgagattgtc gattacggct acggggccac gtccaagggc 1320

accaagagtc cttacctgcc ctttggcgcc ggtcggcatc gctgcatcgg tgaaaagttt 1380

gcctatctca acctggcggc catcgtcagc accttggtcc ggaacttcaa gttctccacg 1440

ctggatggca aggccaccgt gccgcccact gattacactt ctatgttctc tcggcctatg 1500

cagcctgcga cggtgaggtg ggagcgacgc agcccgaaga ctgcgtag 1548

<210> 17 <211> 1569 <212> ADN

<213> Sclerotinia sclerotinium <400> 17

tttgctgttg

ctgaatcaag

atcattggta

gcaaagtacg

ggacgaaatg

atatatactg

gcgaaattga

tcctacgtcc

aagggacaaa

gcttcgcata

ctctaccacg

cttcctcaca

attattaaaa

caattgatgc

atgatgatcg

ctgcttcgtc

gttctgggcg

caaaacatct

gtcacaacac

atggcatctc

gaccctcata

ttccaagatt

ggtgctggca

atggccactg

ggtactgatt

cgacgataa

tcgaaacaat: tgccgggcca ttggctcaag agatttcgca aaggtcaacc 60

ttgctgctgg: cgtggcagca ttcgtcgttc tatctgtcat tctcaatgtc 120

tgttatttgc: gaaccccaat gaaccaccag tggtcttcca ctggtttcca 180

gcaccgtcac: ttatggtatg gacccttata aattcttctt cgagtgtcgc 240

gtgatatttt: cacatttgtc ttgctcggaa agaagaatac agtatatctt 300

gcaatgactt: tattctcaat ggcaagctta aggatctcaa tgcggaggaa 360

ttttgacaac: tcccgtgttt ggaaaggatg tagtctacga ttgccccaat 420

tggagcaaaa: aaagttcatg aaaattggct tgtctactga agctttccga 480

caattataca: aatggaagtg gaaaacttca tgaaacgttc ttcggtattc 540

agggaactgc: cgatattggt cccgctatgg ctgaaatcac catctatacc 600

ctctacaagg: aaaggaagtc cgtgatcgat ttgatactac tttcgcctct 660

accttgatat: gggctttagt cccatcaact ttatgcttca ctgggctcct 720

accgtgcccg: cgaccatgcg cagagaactg tcgcagcaac atatatggat 780

aacgacgtgc: tcaggctacg gaagccgact tcaaatccga cattatgtgg 840

gctcgtccta: caaagatgga acccccgttc cagaccgaga gattgctcac 900

ctcttctcat: ggccggacag cactcttcct catcttctat ctcttggatt 960

ttgcctcacg: cccagatatc atggaagaac tctatcaaga acaaatccaa 1020

ccgatctccc: tgctctcaag tacgaggacc tggccaaact tcctcttcat 1080

tgaaggaaac: tctccgcatc cacactccca tccattctat tatgcgcaaa 1140

caatgccaat: tagcggaaca aaatatgtca ttccaacctc gcatactctt 1200

ctggttgtac: aagtcgagac gcggattact tcccagagcc acttgagtgg 1260

gatgggacat: tggctcgggc cgtgtaattg gcaatgatca ggacgaagaa 1320

atggctatgg: aatgatcagc aaaggtgctt ctagtcctta ccttccattc 1380

gacacaggtg: tatcggtgaa caattcgcca atgtacagct catcactatc 1440

tggttagaat: gttcaaattc aagaacgttg atggcagcaa ggatgtcatt 1500

acaccagttt: attcaccagg ccattggcgc cagcagttat agcatgggag 1560





: 1569

<210> 18 <211> 1587 <212> ADN

<213> Phakopsora pachyrhizi

atgtcttcca

acatcgctaa

ttcaaggaca

ataagctatg

gtgtttacgt

acgttggtct

actacacctg

cagaaaaagt

attgttagag

tctgtcacta

actctacagg

gacctagatg

tacagacgta

aaaaggagag

cagcactaca

gtccttatgg

gctcattgcc

ggggatggta

aattcttgta

gttaagtcac

atcataccct

gtttgggacc

aagcaggaac

aattcgccct

tacatccagt

agaaaggagt

actgtgaagt

<210> 19 <211> 1569

gcgttataat: cgatcagctc tactcattct caactaccag tctcatcatc 60

cttccatcct: cacaatcatc gtcatcctca atgtcactaa tcagttgttg 120

ggaatacccc: accgctagtc ttccacatat ttccggtgct cggctctgtg 180

gcatggatcc: gtaccaattc tttgaggact gtcggaggaa gcatggaaat 240

ttgtgctgtt: gaacaagaag gtcaccgtag ctctcggtcc ggagggaaac 300

taaatggaaa: gctctcagag gtcaatgccg aagaagctta cacccatttc 360

tctttggtaa: ggatgtagtc taygatgtac ccaactcgat cctaatgcag 420

tcatcaaggc: tggccttact actgagaaat ttaagaaata tgtggggata 480

aarcaacaag: ttacctggaa gatcatttat tctgctctcc aaatgtaaaa 540

aggacgtcca: tgatattact tctgagataa cgatttgtac tgcagcagca 600

gaaaagaagt: cagagaaggg ctagacaaat cctttgctaa actctatcac 660

gtggatttac: accgttgaac tttgtttttc cgaacctgcc cttaccctcc 720

gggacaaggc: acaggtctcg atgacaaact tttatctgaa cattctaaag 780

ccgaaaacag: gcaggatgag ttcaatgaca tgttggatgt cttgcaggrg 840

aggacggcag: agctttatcg gacagggaaa ttgctcacat aatgattgcc 900

ctggtcaaca: cactagtgct gcgaccggcg cctggttatt gacccatctg 960

ctgacttggt: tgatagactg aggcgtgaac aggycgaggt ctttggtaag 1020

gtggagagtt: ggaagatcta gattacgatc gactccaaac acctctatta 1080

tcaaagaggt: cttacgtcta caccctccca ttcattcaat cttgcgcaaa 1140

cgatccttgt: tcccaaaaca ctctcctcaa ttgacaagaa caaccaatac 1200

cttcccacta: cgtcctagcc gcacctggcg tctctcagat tgatccatcg 1260

atccaaaaga: gttcagacca gagagatggc tatcgaactt taagaaagat 1320

aggaggagga: gatggttgac tacggctttg gagcgatcag cagcggagcc 1380

atctaccctt: tggggctggt cgacatcggt gtatcggaga gcagtttgcg 1440

tggccgccgt: tgctgttgct gtcattagga actgcgacct cgagctcgtc 1500

tccctctacc: tgattatacc acgatgttag ttggacccag gaaacctaca 1560

ttactagaag: aaattaa 1587

<212> ADN <213> Botrytis cinerea

ggcgttgttg

ttgaaccaag

gtaattggca

gcaaagtatg

ggacgcaagg

atatatactg

gcgaagttga

tcctacgtcc

aaaggtccaa

gcttcgcaca

ctctaccacg

ctccctcaca

atcattcaaa

cagttgatgc

atgatgattg

atgcttcgcc

gtcttaggtg

cagaacgttc

gttaccacac

atggcatctc

gatcctcaca

ttccaagatt

ggtgctggca

atggcaactg

ggtaccgatt

cgacgataa

ttgaagctgt aaccgggcca tagctgctgg cgtggcagca tgttatttgc aaaccccaat gcactatcac ttatggtatg gtgacatttt cacatttgtc gcaacgactt tattctcaat ttttgacaac ccccgtattt tggagcaaaa gaagttcatg caatcataca aatggaggtg agggaactgc tgacattggt ctctgcaagg aaaggaagtc acctcgacat gggcttcagt accgtgcccg cgatcatgcc accgacgtgc tcaagctacg gctcgtctta caaggatgga

ctcttctcat ggccggacaa tcgcctcacg cccagacatt ctgatctccc tgctctcaag tcaaggaaac tctacgcctc caatgccaat cagcggaacc ctggttgcac aagtcgagat gatgggatct tggttccggc atggttacgg aatgattagc gacatagatg cattggtgaa tcgttagatt gttcaaattt acgcaagttt attcaccagg

ttggctcagg aaatttcgca ttcatcgttt tatctgtcgt gagcctccca tggtcttcca gacccttaca aattcttctt ttgcttggaa agaagaccac ggcaagctca aggatctcaa ggcaaagatg tagtttacga aaaattggct tgtctacaga gaaaacttta tgaagcgttc cccgctatgg ctgaaatcac cgcgatcgat tcgatacete cctatcaact ttatgettea cagcgaactg tagccaaaac gaagcagagt tcaaatctga actccagttc cagataagga

cattcttcct catcttctat atggaagaac tctaccaaga tatgaggatt tgtccaaact cacaccccaa tccattctat aaatatgtca ttccaacatc gacgaattct tccccgaagc cgtgttgttg gaaatgatca aaaggcgctt ccagtcctta caattcgcga ctgtacagct aagaacattg atggcagcaa ccattggcgc cagccgttgt

gcggtcaact: 60

tctcaatgtt: 120

ctggctccca: 180

cgattgtcgc: 240

cgtatatete: 300

cgcggaggag: 360

ctgcccaaat: 420

agctttccga: 480

ttcggcgttc: 540

catctacact: 600

ctttgcctct: 660

ctgggcccct: 720

ctatatggat: 780

tattatgtgg: 840

aatcgctaac: 900

ctcgtggatt: 960

acaaatccaa: 1020

ccctctccat: 1080

catgcgcaaa: 1140

acatacactt: 1200

acttgagtgg: 1260

ggatgaggaa: 1320

ccttccattt: 1380

tgtcacgatc: 1440

ggatgtgatt: 1500

agcttgggag: 1560

: 1569

<210> 20

<211> 1569

<212> ADN

<213> Puccinia triticina

gtgctcatct acttggtgct agccgttgtc tcgatcatct cgatcaacat cttcgaccaa 120

ttggctattc ccaaagatcc gacggctcca ccagtggtgt ttcatttgtt tccgttcatt 180

ggctcggccg tgtcctacgg aatcgacccc tacgctttct tggaatcatg caggaagaag 240

tatgggaatg tgttcacctt cgtcctcttg aacaagaaag tcaccgtcgc tctcggtctc 300

gaaggaaacg cactggtcct caacggaaaa ctatctcaag ttaatgctga agaagcttac 360

acagcactca caatcttgat gcaacaaaag aaattcgtca agtctgggtt gactaacgaa 420

aactttcgga aatacgtatc actgattgcg gaggagacga taagctatct tgaagatcat 480

gtatttgaga accccaaaac gcaacagact gtgaaagata ccttcaaagt ggcttctgag 540

attactatct gcacggcctc agccaccctc caagggcccg aagtccgaga agctctcaac 600

aaatcattcg cccagttata ccatgactta gatggcggtt ttaccccttt gcatttcgct 660

ttccccaact tgcccttacc atcatatcgg cgtcgagacc gggcgcaact ggcgatgcga 720

aacttctata tgaacatcat caagaagaga cgagaagatg acagagaggg ccagcttgga 780

gacatgatcg atagcttaca gggccaaacg tacaaggatg gccgcccttt gaacgataaa 840

gagatcgccc acattatgat tgcccttctg atggccggcc aacacaccag tgctgctact 900

ggctcctggc tactcctgca tctcgcttct cgtcccgaca tcgtcgctga attgagacag 960

gagcagatcg acttgtttgg caaaccgggc caaactgacg atcaagaact cgaccctcta 1020

gaccttgaac gtgtccagag tcccttaatg attgcatgca tcaaggaagt cctcaggctt 1080

catcccccaa tccattctat catgcgaaag gttaaatcgc ctatcaccgt gccgaggact 1140

ttggcgtcac gcaacgagga tacaccatac ataatccctt caagcaactt tgtcttggca 1200

gcgccgggaa cagcccagct cgacggatcg atctggagct cgccccacga gttcgacccg 1260

agccgatggc tgaagctcca gtctcctttc aaggccggag agacgcagga agagatggtc 1320

gattacggct tcgggatgat cagcagtggg gctaattcgc ccttcctgcc cttcggcgcc 1380

ggccgtcatc gctgtatcgg tgaacagttc gcttacatcc agctgtctac tttcgccgct 1440

accgtcatca ggaactgcga tctcgaatta actgcccctg agttccctaa acctgattat 1500

accgttcgtt tatctctctg tctctcacac atttcgatta tcagccgtca agttgaagct 1560

catctctga 1569

<210>21 <211> 1524 <212> ADN

<213> Puccinia graminis <400> 21

atgtcttccc tcatcgaccc actgatcgag ttcattggct cattctcaac cttcaatcaa 60

atcctcatct acttcctact ctccatcacc tcgatcatct ccatcaacat cttcaaccaa 120

ttggctattc ccaaagatcc gaccacccca cctgtggtct tccatctatt cccattcatc 180

ggctcagctg tgtcctacgg aatcgaccct tacgctttcc tcgaatcttg tcggaagaaa 240

tacgggaatg tcttcacctt cgtcctcttg aataaaaaag tcaccgtcgc actcggtctc 300

gaaggaaacg cattgatcct caacggaaaa ctgtctcaag ttaatgctga agaagcttac 360

acagcactca ctacacctgt gttcggaact aaaatggtct atgatacgat aagctacctc 420

gaagaccatg tatttgagaa accgaaaacg cagcaagctg tcaaagactg cttcaaagtg 480

gcatctgaga tcactatctg cacagcctca gccacccttc aaggtcccga agtccgcgaa 540

ggactcaaca aatcatttgc caatctatac cacgatttag acggcgggtt taccccacta 600

catttcgcat tccccaacct acccttacca tcatatcgac gacgagatcg ggcgcaagtg 660

gcgatgcgca acttctacat gaacataatc cagaagagac gagaggacaa ccgagaaggc 720

cagctcggag acatgatcga cagcttgcag ggccaaacct acaaggatgg gcggccgttg 780

accgacaagg agatcgctca tatcatgatt gcccttctga tggccggcca acataccagt 840

gctgccactg gatcatggct cctcctccac ctcgcctctc gcccagatat tgttgccgaa 900

ttgaggcagg aacagatcga agtgttcggc aaacctggac aaactgatga taaagaactc 960

gaccctctag acctcgaacg tgtgcagagt cccttgatgc tcgcttgcat caaggaggtc 1020

ctcagacttc atccgcccat ccattcaatc atgcgaaagg tcaaatcacc gatcactgtc 1080

ccgcgaacat tagcatccca taacgaagat acgccataca tcattccgtc gagtaacttt 1140

gtcttagcag cgccgggggc atcgcagatc gacccggcaa tctggagctc acctcacgag 1200

ttcgagccca gtcgatggct gaagctcacc tcgcccttca aggccggcgg gggagagaca 1260

caagaagaga tggtcgacta cggcttcgga atgatcagca gcggcgccaa ctcgcccttc 1320

ctccccttcg gcgcaggccg tcatcgctgt atcggcgaac agttcgctta ccttcagctc 1380

tctactctcg gcgctaccgt cattaggaac tgcgaactcg aactagtctc caatcagttc 1440

cctaaacctg attatactac tatgttggtc tgtcctatca aaccaagaga cgtcaagttt 1500

actaggagga acacccactc gtaa 1524

<210> 22 <211> 1611 <212>ADN

<213> Puccinia recóndita <400> 22

atgtcttctg

gtgctcatct

ttggctattc

ggctcggccg

tatgggaatg

gaaggaaacg

acagcactca

ttgatgcaac

gtatcactga

aaaacgcaac

gcctcagcca

ttataccatg

ttaccatcat

atcatcaaga

ttacagggcc

atgattgccc

ctgcatctcg

tttggcaaac

cagagtccct

tctatcatgc

gaggatacac

cagctcgacg

ctccagtctc

atgatcagca

atcggtgaac

tgcgatctcg

tgtcctctga

tgatcggctc: gctgctcgag

acttggtgct: agccgttgtc

ccaaagatcc: gacggctcca

tgtcctacgg: aatcgacccc

tgttcacctt: cgtcctcttg

cactggtcct: caacggaaaa

cgacccctgt: attcggaact

aaaagaaatt: cgtcaagtct

ttgcggagga: gacgataagc

agactgtgaa: agataccttc

ccctccaagg: gcccgaagtc

acttagatgg: cggttttacc

atcggcgtcg: agaccgggcg

agagacgaga: agatgacaga

aaacgtacaa: ggatggccgc

ttctgatggc: cggccaacac

cttctcgtcc: cgacatcgtc

cgggccaaac: tgacgatcaa

taatgattgc: atgcatcaag

gaaaggttaa: atcgcctatc

catacataat: cccttcaagc

gatcgatctg: gagctcgccc

ctttcaaggc: cggagagacg

gtggggctaa: ttcgcccttc

agttcgctta: catccagctg

aattaactgc: ccctgagttc

aaccaaggga: catcaaattt

cccatcggat ccttctcaac tcgatcatct cgatcaacat ccagtggtgt ttcatttgtt tacgctttct tggaatcatg aacaagaaag tcaccgtcgc ctatctcaag ttaatgctga gatgttgtct atgatgtccc gggttgacta acgaaaactt tatcttgaag atcatgtatt aaagtggctt ctgagattac cgagaagctc tcaacaaatc cctttgcatt tcgctttccc caactggcga tgcgaaactt gagggccagc ttggagacat cctttgaacg ataaagagat accagtgctg ctactggctc gctgaattga gacaggagca gaactcgacc ctctagacct gaagtcctca ggcttcatcc

accgtgccga ggactttggc aactttgtct tggcagcgcc cacgagttcg acccgagccg caggaagaga tggtcgatta ctgcccttcg gcgccggccg tctactttcg ccgctaccgt cctaaacctg attataccac actcgaagaa accatctctg

tttcaaccaa: 60

cttcgaccaa: 120

tccgttcatt: 180

caggaagaag: 240

tctcggtctc: 300

agaagcttac: 360

caacgcaatc: 420

tcggaaatac: 480

tgagaacccc: 540

tatctgcacg: 600

attcgcccag: 660

caacttaccc: 720

ctatatgaac: 780

gatcgatagc: 840

cgcccacatt: 900

ctggctactc: 960

gatcgacttg: 1020

cgaacgtgtc: 1080

cccaatccat: 1140

gtcacgcaac: 1200

gggaacagcc: 1260

atggctgaag: 1320

cggcttcggg: 1380

tcatcgctgt: 1440

catcaggaac: 1500

catgttggtt: 1560

a: 1611

<210> 23 <211> 1584 <212> ADN

<213> Pyrenophora teres

cctgtcgtcg

ctcaagcagt

ataattggca

aagaagtatg

gacacggcgg

atttactctc

tcgaaactca

tcctacgtca

aagggacaac

gcctctcgtt

ctgtaccacg

cttccccaca

ctggttcgca

ctgatggaat

atgattgccc

ctccgcctcg

ctaggcaaaa

caagtcgtca

aagcaacctc

tcctcgcccg

ccccaccgtt

gagaagattg

tttggcgctg

atcctagtag

gttggcaccg

gagaggcggc

tcgctgatgt: cgccggccct

ctgccgccgc: cttcgcctcc

tgctgttcaa: gaaggcgaat

gtacagtcac: atatggcatg

gcaatgtctt: cacatttatt

gcaacaactt: catcctaaac

cgctgaccac: ccccgtcttc

tggagcagaa: aaagtttgtc

ccctcatcac: acaagaatgc

ggggcacttt: tgacgtgacc

cgctccaggg: cgaggaaatc

acctcgacat: gggcttttca

accgcgcacg: cgacaatgca

agcgcaggtc: gggcgccgtg

gcaagtacaa: ggacggcacc

tgctcatggc: tggacagcat

cgcagaaccc: gcacattatt

acctccccgc: ccttacctat

aggaaaccct: ccgtatccac

tggttgtcga: tggaacaaat

gtttctctgc: acagctcgat

gggatccaga: ccaaaacaac

actatggctg: gggtgtcgtg

gacggcatcg: ttgcattggt

cgtttgtgag: agagttcaag

actactccag: tctcttctcc

agaaggaatg: ttag

ctggctaact ttacatccaa tttatcctgc tctccgtcgt gagccgccca tggtcttcca gatccgtatg ccttcttctt ctccttggcc gcaagatgac ggaaagatca aggacgtcaa ggcaaggacg tcgtgtacga aagtatggac tcacgcagga gaagacttca tgaagcgcca aaggtcatgg ctgagctcac cgcaagtcgt tcgattcaaa cctgtcaact ttatgctctc cgcgagacta tgataaagct aagaaggact cacacgacat caggtgccgg aacacgagat tcgtcttcct cgaccatcgc gacgaactgc ttgcggagca gacgacctcc agaagcttcc gcccccatcc actccatcat tacgttgttc ccacttccca

acccactttg tcaaccccgc tacgacgaag agcgcgacga tccaagggaa ccaactcgcc gagcaatttg cctacttgca ctcaggaatg ttggtggtag cgcccactag cacctggcat

gtcgtccacg: 60

cctcaatgta: 120

ttggctgcct: 180

tgcgaatcac: 240

cgtgtgcctt: 300

cgccgaggag: 360

ctgtccaaac: 420

ggccctccgt: 480

caaagctttc: 540

catctacact: 600

gtttgccgaa: 660

atgggccccg: 720

atactctgat: 780

gatttggcac: 840

tgctggcatc: 900

atggatcctc: 960

aacgtccatc: 1020

ccttcacgcc: 1080

gcgcaaggtc: 1140

cacactcatg: 1200

tgtctgggac: 1260

cgccgatcag: 1320

atatcttccc: 1380

attacagact: 1440

taaagacatt: 1500

agttgagtgg: 1560

: 1584

<210> 24 <211> 1584 <212> ADN

<213> Pyrenophora tritici

cctgtcgtcg ctgccgccgc cttcgcctcc tttatcctgc tctccgtcgt cctcaatgta 120

ctcaagcagt tgctgttcaa gaaggcgaat gagccgccca tggtcttcca ttggctgcct 180

ataattggca gtacagtcac atatggcatg gatccgtatg ccttcttctt tgcgaatcac 240

aagaagtatg gcaatgtctt cacatttatt ctccttggcc gcaagatgac cgtgtgcctt 300

gacacggcgg gcaacaactt catcctaaac ggaaagatca aggacgtcaa cgccgaggag 360

atttactctc cgctgaccac ccccgtcttc ggcaaggacg tcgtgtacga ctgtccaaac 420

tcgaaactca tggagcagaa aaagtttgtc aagtatggac tcacgcagga ggccctccgt 480

tcctacgtca ccctcatcac acaagaatgc gaagacttca tgaagcgcca caaagctttc 540

aagggacaac ggggcacttt tgacgtgacc aaggtcatgg ctgagctcac catctacact 600

gcctctcgtt cgctccaggg cgaggaaatc cgcaagtcgt tcgattcaaa gtttgccgaa 660

ctgtaccacg acctcgacat gggcttttca cctgtcaact ttatgctctc atgggccccg 720

cttccccaca accgcgcacg cgacaatgca cgcgagacta tgataaagct atactctgat 780

ctggttcgca agcgcaggtc gggcgccgtg aagaaggact cacacgacat gatttggcac 840

ctgatggaat gcaagtacaa ggacggcacc caggtgccgg aacacgagat tgctggcatc 900

atgattgccc tgctcatggc tggacagcat tcgtcttcct cgaccatcgc atggatcctc 960

ctccgcctcg cgcagaaccc gcacattatt gacgaactgc ttgcggagca aacgtccatc 1020

ctaggcaaaa acctccccgc ccttacctat gacgacctcc agaagcttcc ccttcacgcc 1080

caagtcgtca aggaaaccct ccgtatccac gcccccatcc actccatcat gcgcaaggtc 1140

aagcaacctc tggttgtcga tggaacaaat tacgttgttc ccacttccca cacactcatg 1200

tcctcgcccg gtttctctgc acagctcgat acccactttg tcaaccccgc tgtctgggac 1260

ccccaccgtt gggatccaga ccaaaacaac tacgacgaag agcgcgacga cgccgatcag 1320

gagaagattg actatggctg gggtgtcgtg tccaagggaa ccaactcgcc atatcttccc 1380

tttggcgctg gacggcatcg ttgcattggt gagcaatttg cctacttgca attacagact 1440

atcctagtag cgtttgtgag agagttcaag ctcaggaatg ttggtggtag taaagacatt 1500

gttggcaccg actactccag tctcttctcc cgcccactag cacctggcat agttgagtgg 1560

gagaggcggc agaaggaatg ttag 1584

<210> 25 <211> 1512 <212>ADN

<213> Pyrenophora tritici <400> 25

gccaacatca tccgccagct gcttcttcca aacaccaaag aaccacccgt cgtcttccac 120

tggcttccct ggcttgggag cgccatcacc tacggcaaag acccctataa gtttctgttc 180

gccgccagag agaagcatgg agatgtcttc acctttgtcc tgctaggccg caacgtcacc 240

gttcacttgg gcgttgccgg aaacgatttt gtcttcaacg gcaaagagac acatgtcaat 300

gccgaggaaa tctacggtcc cctatgtaac cccgtcttcg gcgagggcgt cgtgtacgac 360

tgtcccaatt ccaagctcat ggaacagaaa aaattcgtca agtttggtct gacaaccgac 420

gctctcaagg cacatgtgca actgattgag caagaggtcg tagactacat caaagcctcc 480

cgagagttca agggacaatc aggcaccatc aatgtgcccc ccgtcatggc tcaaatcacc 540

atcttcaccg ccgccatcgc cttacaaggg cctgaagtgc gcagcaagct cacaaacgag 600

tttgcaagcc tataccacga tctcgacggc ggttttagtc ccatcaattt tgttctccct 660

cgcgcgccct tcccccacaa catcaagaga gatcgggccc agctaaagat gcgcaagatt 720

tacgagacca tcatcgcaga acgccgcgct ggcaagatcc ctcccaccac cgacatgatc 780

agtcatctca tgcagtgctc gtataaagac ggccgtcctg tgccagactc ggaaatcgca 840

aacatgatga ttaccattct aatggcgggc cagcacaact cctccaacat tgcgtcttgg 900

atcatgttgc accttgccaa caagccgcaa ctctgcgaag agctatacca ggaacagctt 960

gatcaactgg ctgatgagca tggcaacttg cccaagctcg acctgcagac cttggagaag 1020

ctcaagctgc attctaatgt cgtcaaagag acgcttcgca tgcacaactc cattcactct 1080

atcatgcgcc ttgtcaaaca gccactcccc gtccccaata cgtcgtggac cataccgcct 1140

ggccatgccc ttctcgcttc acctggtatc tcagcaaaca gcgaagaata cttctataac 1200

ccggataagt ggaatccaca tcgctgggac gaccgcgtca tcgaagaaga cgatgagagc 1260

gagatggtgg actacggcta tggacgcatg tccaggggta caaagagcgc ctacctcccg 1320

ttcggtggag gtcgccatcg ctgcattggc gaaaagtttg cttacctcaa cttggaagtc 1380

atcacggcga ttatggtgcg aaacttttgc tttaagaatc tcgatggtag ggagggtgtt 1440

ccaggcaccg attacagcac catgttttcg cgtccgctag agcctgccga gattgtttgg 1500

cagaggcgat ga 1512

<210> 26 <211> 1599 <212> ADN

<213> Phaeosphaeria nodorum <400> 26

gccactctca ttgccgcggg cttcgcctcc tttatcgtcc tctccgtcgt tctcaacgtt 120

ttgaagcagc tgctgtggaa ggatcccact gcgcccccgg tcgtcttcca cctgttcccg 180

atcatcggaa gcaccgtcac gtacggcatc gacccgtaca agttcttctt cgcgcagcag 240

aagaagaagg cgcaagctaa caagagacag tatggcgatg tcttcacctt catccttctc 300

ggccgcaaga tgaccgtgtg tctcgacacc aagggcaaca acctcatcct gaacggaaag 360

ctcaaggagg tcaatgccga ggagatctac tcgccgctca ccacacccgt cttcggcaag 420

gatgtcgtct acgactgccc gaactcgaag ctcatggagc agaagaagtt cgtcaagttt 480

ggtctgaccc aggaagccct ccgctcctac gttggcatca tcacccaaga atgcgaggat 540

tttttcaagc gtcacaaggc tttcaaggga caaaagggca cttttgatgt gaccaaggtc 600

atggccgagc tcaccatcta caccgcctcc cactctcttc agggtaagga gatccgcaag 660

tcgttcgact ccaagtttgc cgacctttac cacgatctcg atatgggctt ctctcccgtc 720

aacttcatgc tgtcatgggc cccccttccc cacaaccgcg cccgcgacgt cgctcgcgag 780

acaatgatca agctatactc cgagattgtg cgcaagcgaa gggctggcaa cgtcaagaag 840

gactcgcatg acatgatctg gcacttgatg gactgcaagt acaaggatgg cacacaggtt 900

cctgaacacg agatcgctgg tatcatgatt gcgctgctga tggctggaca acactcctct 960

tcctccacaa tcgcctggat tattctccgt ctggcacagt accctcacct tctcgaagag 1020

cttcttgcag agcagaaggc ggtcatgggc gaggaccttc cagcagtcac ctacgaagac 1080

ctcaacaagc tgccgctaca cgcccaggtt gtcaaggaga ctcttcgcat ccacgctcct 1140

atccactcaa tcatgcgcac cgtcaaatcg cctatcgttg ttgagggaac aaactacgtt 1200

atccccactt cgcacaacct catgtcctcc cccggctact ccgcactcct cgacagctac 1260

tttgtcaacg ctgcaacctg ggacccacat cgatgggacg ccggccagca caactacgac 1320

gaggctgaga acgacgacga cgagaagatc gactatggct ggggtgttgt ctccaaaggc 1380

acaaactcgc cttacctacc atttggtgct ggaaggcatc gatgcattgg cgagcagttc 1440

gcctacctgc agctccagac gatcctcgtc gcatttgtca gggagttcaa gttcaggaac 1500

gttaacggta gcaaggacat tgttggtaca gattacacaa gtctgttctc gagaccgctt 1560

gcacctggta cggtcgagtg ggagcgcagg gaatcatag 1599

<210> 27 <211> 1635

<212> ADN <213> Septoria tritici 5 <400> 27

tggaaacttg tcggacttgg attcctcgcc ttcagcacgc tcgccatcct cctcaatgtc 120

ctctcacaac ttctcttccg tggcaagttg tccgatccgc cactcgtatt ccactgggtg 180

cccttcatcg gaagcaccat cacatacggc atcgacccat acaagttctt cttctcctgt 240

cgggaaaagt atggagatgt ctttacattc atcctgctgg gaaagaagac gacggtgtgc 300

ttgggcacca agggcaatga ttttattttg aatggaaaac tgaaggacgt caacgcggag 360

gagatataca gcccgctgac cactcctgtc tttggcaagg atgtggttta tgattgtccc 420

aattcgaagc tcatggagca gaagaagttc gtcaagtacg gcctcacaac ctctgccctc 480

cagtcctacg tgaccttgat cgccgccgag acccgccagt tcttcgaccg caacaaccct 540

cataagaagt tcgcatcgac cagcggcacg atcgatctcc caccagccct cgccgaactt 600

acgatctata ctgccagccg atcattgcaa ggaaaggaag tccgcgaggg cttcgactcg 660

tctttcgcgg acctctacca ctacctcgat atgggattca caccgatcaa ctttatgctt 720

ccgtgggcgc cccttcccca gaaccgacgc cgcgattatg cgcagaagaa gatgtccgag 780

acatacatgt cgatcattca gaagagacga gagtccaaaa cgggcgaaca tgaggaagac 840

atgatccaca acttgatgca gtgcaaatac aaggacggca atgccattcc cgacaaggag 900

attgctcata tgatgattgc gctgctcatg gccggccagc actcttcatc tgcgaccgag 960

tcctggatca ctctccgcct cgcatcccgc cccgacatcc aagacgaact cctccaagaa 1020

caaaaggata tgctcggtgt gaacgccgac ggcagtatca aggagctcac atacgccaac 1080

ctctcgaaac tcaccctcct caatcaagtc gtcaaagaaa cccttcgtat tcacgctcca 1140

atccactcca ttctgcgcaa ggtcaagtct cccatgccca tcgaaggtac ggcatacgtc 1200

attccaacca cccacactct tctggccgct ccgggcacaa cgagccgcat ggacgagcac 1260

tttcccgact gcctccattg ggagccgcat cgatgggacg agagcccgtc cgagaaatac 1320

aagcacctgt ccccgacgac tgccctagga agcatcgccg aggagaaaga agactatggc 1380

tacggcctgg taagcaaggg cgcggcgtcg ccatacttac cctttggtgc gggacgacac 1440

agatgtatcg gcgagcaatt cgcgtacgtg caattgcaga ccattacagc gacgatggtt 1500

cgcgatttca agttttacaa tgtggatggc agcgacaacg tggtgggtac ggattacagc 1560

agtttgttca gccggccgct gtcgccggca gtagtaaagt gggagaggag ggaggagaag 1620

gaggagaaga actga 1635

<210> 28 <211> 1581 <212> ADN

5 <213> Cochliobolus sativus

5

cctgtcgtcg

ctgaagcagt

ataattggta

aagaagtatg

gacacggcgg

atttactctc

tcgaaactca

tcctacgtca

aagggagaaa

gcctctcgtt

ctgtaccacg

cttcctcaca

ctggttcgca

ctgatggact

atgattgccc

ctccgcctcg

ctaggcaaaa

caggttgtca

aagcaacctc

tcctcgcccg

ccccaccgtt

gagaagattg

tttggcgctg

attctagtag

gttagcaccg

gagaggcggc

<210> 29 <211> 1686 <212> ADN <213> Ustilago

tggctgatgt: caccggccct

cttctgccgc: cttcgcctcc

tgctgttcaa: gaaggcgaat

gtacagtcac: atatggcatg

gcaatgtctt: tacatttatt

gcaacaactt: catcctaaat

ccctcaccac: acccgtcttc

tggagcagaa: aaagtttgtc

ccctcatcac: acaagaatgc

agggcacttt: tgacgtgacc

cgctccaggg: cgaggaaatc

acctcgatat: gggcttttcg

accgcgcacg: cgacaatgca

agcgcaggtc: gggcgccgtg

gcaagtacaa: ggacggcacc

tgctcatggc: cggacagcat

cgcagaaccc: gcacgttatt

acctccccgc: cctaacctac

aggaaaccct: ccgtatccac

ttgttgtcga: tggaacaaac

gtttctccgc: acagctcgat

gggatccaga: ccaaaacaac

actatggctg: gggtgtcgtg

gacggcatcg: ttgtattggg

catttgtgag: agagttcaag

actacaccag: tctcttctcc

agaacctata: a

ctggccaact ttacatccca tttatcctgc tctccgtcgt gagccgccca tggtcttcca gatccgtatg ccttcttctt cttctcggcc gcaagatgac ggaaagatca aggacgtcaa ggcaaggacg tcgtgtatga aagtacggtc tcacgcagga gaagacttta tgaagcgcca aaggtcatgg ctgagctcac cgcaagtctt tcgattcaaa cctataaact ttatgctctc cgcgagacca tgataaagct aagaaggact cgcacgacat caggtgcccg aacacgagat tcgtcttcct caaccatcgc gaggaattac ttgccgagca gacgacctcc agaagcttcc gcccccattc actccatcat tacgttgttc ccacttccca acccactttg tcaaccccgc tacgacgaag agcgcgacga tccaagggaa ccaactcacc gagcaattcg cctacctgca ttcaggaacg ttggtggtag

cgcccactag cacctggcat

gtcgtccacg: 60

cctcaatgta: 120

ttggctgcct: 180

cgcgaatcac: 240

tgtgtgtctg: 300

cgccgaggag: 360

ttgtccaaac: 420

ggccctccgt: 480

caaggctttc: 540

catctacacc: 600

gtttgccgaa: 660

atgggccccg: 720

atactcggat: 780

gatttggcac: 840

tgctggcatc: 900

atggatcctt: 960

aaagtccatc: 1020

cctccatgcc: 1080

gcgcaaggtc: 1140

cacactcatg: 1200

tgtctgggac: 1260

cgccgaccag: 1320

atatcttccc: 1380

actacagact: 1440

caaagacatt: 1500

agttgagtgg: 1560

: 1581

maydis

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ARNdc capaz de inhibir la expresión del gen CYP51A, el gen CYP51B y el gen CYP51C de un fitopatógeno del género Fusarium, comprendiendo el ARNdc:

i) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51A;

ii) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51B;

iii) una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante del gen CYP51C; y

iv) secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias a las secuencias sentido (i), (ii) y (iii);

en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de cada secuencia sentido con su secuencia antisentido sustancialmente complementaria.
2. La molécula de ARNdc de la reivindicación 1, en la que el fitopatógeno es Fusarium graminearum, y

la secuencia sentido (i) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1; la secuencia sentido (ii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:2; y la secuencia sentido (iii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:3.
3. La molécula de ARNdc de la reivindicación 2, en la que,

la secuencia sentido (i) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:4; la secuencia sentido (ii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:5; y la secuencia sentido (iii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:6.
4. La molécula de ARNdc de la reivindicación 1, en la que el fitopatógeno es Fusarium oxysporum, y

la secuencia sentido (i) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:8; la secuencia sentido (ii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:9; y la secuencia sentido (iii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:10.
5. La molécula de ARNdc de la reivindicación 1, en la que el fitopatógeno es Fusarium verticillioides, y

la secuencia sentido (i), es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:11; la secuencia sentido (ii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:12; y la secuencia sentido (iii) es al menos el 70 % idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:13.
6. La molécula de ARNdc de la reivindicación 1, que comprende una secuencia sentido que es al menos el 70 % idéntica a la SEQ ID NO:7, y una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria a dicha secuencia sentido, en la que la disposición de las secuencias en la molécula de ARNdc permite la hibridación de dicha secuencia sentido con dicha secuencia antisentido.
7. La molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la identidad de secuencia de cada secuencia sentido pertenece a al menos 25, al menos 50, al menos 100, al menos 150, al menos 200 o todos los nucleótidos contiguos de su respectiva secuencia de referencia.
8. La molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la identidad de secuencia de cada secuencia sentido con su respectiva secuencia de referencia es de al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 100 %.
9. La molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que cada secuencia sentido se localiza en una cadena de ARN diferente de la molécula de ARNdc que su correspondiente secuencia antisentido.
10. La molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que las secuencias sentido y las secuencias antisentido se localizan en una única cadena de ARN que se enrolla sobre sí misma para formar una estructura de horquilla.
11. Una secuencia de ADN o una multitud de secuencias de ADN que proporcionan un molde transcripcional de al menos las secuencias antisentido de la molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. La(s) secuencia(s) de ADN de la reivindicación 11 que proporciona(n) un molde transcripcional de la molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
13. La(s) secuencia(s) de ADN de la reivindicación 12, en la(s) que el molde transcripcional está unido de manera operativa a al menos un promotor.
14. La(s) secuencia(s) de ADN de la reivindicación 13, en la(s) que el al menos un promotor es funcional en una célula vegetal.
15. Un polinucleótido aislado que comprende la(s) secuencia(s) de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones

11-14 o una multitud de polinucleótidos aislados que comprenden las secuencias de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14.
16. Una planta transgénica que comprende la(s) secuencia(s) de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1114 o el polinucleótido de la reivindicación 15.

5 17. La planta transgénica de la reivindicación 16, en la que la planta es capaz de generar al menos las secuencias

antisentido de la molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
18. La planta transgénica de la reivindicación 17, en la que la planta es capaz de generar moléculas de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
19. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en la que la planta transgénica es un 10 cultivo cereal.
20. Un procedimiento de control de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto, en el que una planta transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-19 se cultiva para permitir la generación de ARN que comprende las secuencias antisentido de la molécula de ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y dicho ARN inhibe el crecimiento y/o la propagación de dicho fitopatógeno.

15 21. Una composición para controlar un fitopatógeno fúngico o de oomiceto que comprende la molécula de ARNdc de

una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y un vehículo fitocompatible.
22. Un procedimiento de control de un fitopatógeno fúngico o de oomiceto, en el que una planta infestada por o en riesgo de ser infestada por dicho fitopatógeno y/o la proximidad de dicha planta, se pone en contacto con una cantidad eficaz de la composición de la reivindicación 21.

20

a

en

b

imagen1

0,035

<

LO 0,03

U 0,025 « ! 5 0,02 JT5

2 0,015

C

1 0,01

Q_

UJ 0,005 0

imagen2

control

imagen3

ARNde

imagen4

0,05

imagen5

Control ARNde

c5’

Q>

imagen6

imagen7

imagen8

LíneaB Línea 10 Línea 11 Lineal

imagen9

p EjnB|j

8I.0Z-90-ZZ

Lfr89eZH3

imagen10

imagen11

UBQ10

RNAt

11610 pb

BamHI

ColEI

Figura 6

imagen12

imagen13

Sm/Sp

p7i-Ubi-RNA¡2

Aflll

Xmal

Intron

ColE1

35S

Pvu

Sbfl

Sse232l

Sa

Intron 1 /Sac

BsrGI

BsiWI

T35s Hindl

BamHI

Spel

Aatll

imagen14

BamlU

p7i-Ubi-CYP3RNAi 12974 pb

Figura 9

Xma I

Hindlll

BsrG I

imagen15

imagen16

imagen17

Figura 11

imagen18

Figura 12

ARN a las 48 h Control a las 48 h GFP a las 48 h
0.34

Ü.33

0,32

0,31

0,29

0,28

0,27

ARN a las 48 h Control a las 48 h GFP a las 48 h