CN108384799A

CN108384799A - 利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法

Info

Publication number: CN108384799A
Application number: CN201810060589.2A
Authority: CN
Inventors: 顾周杭; 孙玉强; 刘廷利; 张保龙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2018-01-22
Publication date: 2018-08-10

Abstract

本发明公开了一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法(利用病毒载体提高植物抗黄萎病抗性的方法)：利用植物病毒载体在植物体内特异表达针对大丽轮枝菌多个致病关键基因的小干扰RNA，从而多靶点抑制大丽轮枝菌侵染，提高植物对于黄萎病抗性。本发明对棉花叶皱缩病毒载体进行改造，插入多个大丽轮枝菌致病关键基因片段，从而实现了棉花体内表达针对大丽轮枝菌致病关键基因的多靶点小干扰RNA，下调其致病关键基因的表达量，抑制大丽轮枝菌侵染，达到提高棉花黄萎病抗性的目的。本发明可用于提高植物抗真菌病害抗性和研究植物抗病性育种。

Description

利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，即，涉及利用病毒载体提高植物黄萎病抗性的方法及应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(VIGS)现象是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒入侵植物时，病毒基因组转录产生病毒来源的RNA(vsRNA)被植物细胞防御机制中一些蛋白所识别，经过RNA-dependent RNA Polymerase 6(RDR6)复制，使原本单链的vsRNA形成了双链RNA(dsRNA)。该dsRNA在植物体内迅速被Dicer-like(DCL)的RNaseIII酶切割形成大小约为21-24nt的short interfering RNA(siRNA)，siRNA与Argonaute(AGO)RNA结合蛋白以及其他RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，这一RISC复合体能够特异地与同源的靶标mRNA结合，并降解这些靶标mRNA，从而达到抗病毒的目的。利用这一机制，我们可以在病毒侵染性克隆上插入植物内源的基因片段，当该病毒侵染植物时，诱发VIGS反应，从而可以特异沉默植物内源基因的表达。

寄主诱导的基因沉默(HIGS)是在VIGS的基础上进一步发展，将含有特定病原物靶基因相关片段转染或转化到寄主体内，产生相应的小干扰RNA(siRNA)。当寄主遭受该病原物侵染时，病原物相应的基因表达就会受到这些小干扰RNA的调控，其积累量就会下调，减轻病害影响。

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是棉花上的重要病毒之一，对棉花的生产有着严重威胁。

大丽轮枝菌侵染棉花引起的棉花黄萎病是农业生产中毁灭性真菌病害，被称为棉花的“癌症”，给世界棉花生产带来巨大威胁。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，即，提供利用病毒载体提高棉花抗黄萎病抗性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法(利用病毒载体提高植物抗黄萎病抗性的方法)：利用植物病毒载体在植物体内特异表达针对大丽轮枝菌多个致病关键基因的小干扰RNA，从而多靶点抑制大丽轮枝菌侵染，提高植物对于黄萎病抗性。

作为本发明的利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法的改进：

在植物病毒载体中插入针对大丽轮枝菌多个致病关键基因片段(通过分子生物学方法实现)，使其含有如下序列：5’-actagtTGTCTGCGGCTAATGTCCCCCTTGAGGCCACCTGGCAAGGCCATGTCGCCTCGACTCTTGATGCCGTTGTTCTGTTCGAGGCTTGCCTGTCTGGCAATCTTCGTCACGTCCCCCGTCGACCCCACGATCGTGAGCGCCACGTCACTTGGAGCCCGAGTCGAATCCTCGGGAACTATTTGATCTACCGGGAGCTGGAGAGttaattaaTGAAGCTTTCTACGCTTGGAGCCCTCATTTCATTGACTTCACTGGTCACTGCCGATCTAGGGACCGCATCCTACTATAACCCACCCTACCTTCCCACTGCCTGCGGCGGCAGCAATCCCAGCCAATTTCCCTCTGGTAATCTGTTCGTTGCTGTTTCAGACGGTCTCTGGGATAACGGTGCTGCCTGTGGTCGGCGATACAGcctaggTGCACGGCTACAGCTCCTCCGAGGAGTCCGACGACCCCAAGAGGCCGAGGCCTCCGCCCGCCTCTGCAACGAGCACCACCGACAAGAAGGTGAAAAAGAAGAAGAAGGTGCCGCCACAGCAGTCGATCAACCACATCTGGAAGACGTTCCAGAAGCGCACCTTCAACAAGGCGCTGGCAATACTTCCCTTCGACCCCGcctagg-3’。

备注：小写字母代表相应酶切位点。

作为本发明的利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法的进一步改进：利用病毒载体在棉花体内特异表达针对大丽轮枝菌致病关键基因的小干扰RNA(即，对植物病毒载体中沉默靶基因片段进行修饰的方法)，包括如下步骤：

1)、针对需要沉默的大丽轮枝菌靶基因sge1,ave1,clp1，分别设计PCR克隆靶基因序列的特异引物：

Sge1FspeI6.3:ATCactagtCGCCGCAAAGAAGAACAAGA，

Sge1RpacI6.3:ATCttaattaaTGAAAGGGTATGAGTCAACCAGAG；

AVE1F PacI:ATCttaattaaTGAAGCTTTCTACGCTTGGA，

AVE1R AVRII:ATCcctaggCTGTATCGCCGACCACA；

Clp1AvRII F:ATCcctaggTGCACGGCTACAGCT，

Clp1AvRII1R:ATCcctaggCGGGGTCGAAGGGAAG；

说明：在大丽轮枝菌基因组数据库(http://genome.jgi.doe.gov/)中通过序列比对，搜索需要沉默的大丽轮枝菌靶基因如sge1,ave1,clp1等序列；

2)、以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，用步骤1)设计的特异引物Sge1FspeI6.3和Sge1RpacI6.3；AVE1F PacI和AVE1R AVRII；Clp1AvRII F和Clp1AvRII1R这三对引物，通过PCR方法，使克隆的靶基因带有相应位点，分别命名为Sge1、Ave1、Clp1；

然后将Sge1通过SpeI和PacI酶切位点，Ave1通过AvRII和PacI酶切位点，Clp1通过AvRII位点，构建到病毒沉默载体pCLCrVA中，得到pCLCrV-sge1+ave1+clp1；

3)、将pCLCrV-sge1+ave1+clp1和pCLCrVB分别电击转化到农杆菌EHA105中，得到分别含pCLCrV-sge1+ave1+clp1的EHA105和含pCLCrVB的EHA105两个菌株；

4)、将含pCLCrV-sge1+ave1+clp1的EHA105和含pCLCrVB的EHA105菌液以1:1的比例混合后，对2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润处理；

上述浸润处理具体为：一次性1ml注射器吸取上述混合液，在2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润，用针头在子叶背面刺小洞以便于浸润；

5)、浸润后的棉花幼苗，置于温室培养，培养条件为：温度为23～27℃，相对湿度为65％～75％，光周期为16L：8D；10～20天后接种大丽轮枝菌；

6)、接种大丽轮枝菌30天后，经过病情指数统计，相比于对照组CLCrV空载体(即，pCLCrVA+pCLCrVB)接种植株，接种CLCrV-sge1+ave1+clp1的植株表现出病情指数下降的情况。

本发明的利用病毒载体提高植物抗黄萎病抗性的方法，可用于提高植物抗真菌病害抗性和研究植物抗病性育种。

相比于传统基于转基因的棉花育种过程，本发明能够在短时间提高棉花抗黄萎病能力，这为提高棉花黄萎病抗性和分子育种提供了新的方法。

本发明对棉花叶皱缩病毒载体进行改造，插入多个大丽轮枝菌致病关键基因片段，从而实现了棉花体内表达针对大丽轮枝菌致病关键基因的多靶点小干扰RNA，下调其致病关键基因的表达量，抑制大丽轮枝菌侵染，达到提高棉花黄萎病抗性的目的。从病情指数统计结果看，该方法可以有效地降低病情指数约20％。该方法不依赖于传统的转基因技术并且能够实现提高棉花黄萎病抗性的目的，为棉花抗性育种提供了新思路，新方法。

附图说明

图1是大丽轮枝菌侵染30天后，棉花表型图；

图2是大丽轮枝菌侵染30天后，棉花病情指数统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所涉及pCLCrVA和pCLCrVB质粒及包含相应质粒的农杆菌均由浙江大学周雪平教授惠赠。

实施例1、大丽轮枝菌sge1基因片段的克隆

在大丽轮枝菌基因组数据库(http://genome.jgi.doe.gov/)搜寻大丽轮枝菌sge1基因序列，设计PCR克隆靶基因序列的特异引物：

Sge1FspeI6.3:ATCactagtCGCCGCAAAGAAGAACAAGA，

Sge1RpacI6.3:ATCttaattaaTGAAAGGGTATGAGTCAACCAGAG。

以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，反应体系为10X扩增缓冲液2ul，dNTP 2ul，正向引物1ul，反向引物1ul，taq酶1ul，大丽轮枝菌cDNA 1ul，无菌水12ul；通过PCR扩增(反应参数为：94℃3min；94℃变性45sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min)扩增得到约200bp左右片段，命名为sge1，如SEQ ID NO:1所述。

实施例2、大丽轮枝菌ave1基因片段的克隆

在大丽轮枝菌基因组数据库(http://genome.jgi.doe.gov/)搜寻大丽轮枝菌ave1基因序列，设计PCR克隆靶基因序列的特异引物：

AVE1F PacI:ATCttaattaaTGAAGCTTTCTACGCTTGGA，

AVE1R AVRII:ATCcctaggCTGTATCGCCGACCACA。

以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，反应体系参照实施例1，通过PCR扩增(反应参数为：94℃3min；94℃变性45sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min)扩增得到约200bp左右片段，命名为ave1。如SEQ ID NO:2所述。

实施例3、大丽轮枝菌clp1基因片段的克隆

在大丽轮枝菌基因组数据库(http://genome.jgi.doe.gov/)搜寻大丽轮枝菌clp1基因序列，设计PCR克隆靶基因序列的特异引物：

Clp1AvRII F:ATCcctaggTGCACGGCTACAGCT，

Clp1AvRII1R:ATCcctaggCGGGGTCGAAGGGAAG。

以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，反应体系参照实施例1，通过PCR扩增(反应参数为：94℃3min；94℃变性45sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min)扩增得到约200bp左右片段，命名为clp1。如SEQ ID NO:3所述。

实施例4、将sge1基因片段构建到CLCrV载体

将pCLCrVA和sge1同时用SpeI+PacI双酶切，具体反应条件为37℃30分钟。将双酶切反应后的pCLCrVA和sge1经过Axygen PCR清洁试剂盒清洁后，分别得到pCLCrV-1和sge1-1。

将pCLCrV-1和sge1-1以1:7的摩尔比混匀，加入T4连接酶和配套缓冲液(T4DNA连接酶缓冲液(10×))，在22℃条件下，反应过夜。次日，将连接反应液热激转化大肠杆菌DH5α，具体步骤为：

1.将连接反应液加入DH5α感受态细胞中，置于冰上30min；

2.将冰浴30min后的感受态细胞置于42℃，热激1min，立即置于冰上5min；

3.在冷却的感受态细胞中加入1ml LB培养液，37℃220rpm摇菌；

4.一小时后，菌液经过1200rpm 1min离心，弃上清，将菌体均匀涂布于含有Km(50mg/ml)的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

第二天，通过PCR方法利用特异引物008F：5'-GCCTAATGGGTATAGAGCAAAATGGCA-3'和008R：5'-AAGCTTACCTGAACTTCCAAGTCTGGA-3'进行菌落PCR，反应体系为10X扩增缓冲液2ul，dNTP 2ul，正向引物1ul，反向引物1ul，taq酶1ul，无菌水13ul；具体步骤为：94℃3min；94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，筛选阳性克隆，由此得到CLCrV-sge1(DH5α)。将CLCrV-sge1(DH5α)接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养后，离心收集菌体，利用Axgen质粒提取kit提取质粒pCLCrV-sge1。

实施例5、将ave1基因片段构建到pCLCrV-sge1载体

将pCLCrV-sge1和ave1同时用AvrIII+PacI双酶切，具体反应条件为37℃30分钟。将双酶切反应后的pCLCrV-sge1和ave1经过Axygen PCR清洁试剂盒清洁后，得到pCLCrV-sge1-1和ave1-1。

将pCLCrV-sge1-1和ave1-1以1:7的摩尔比混匀，加入T4连接酶和配套缓冲液，在22℃条件下，反应过夜。次日，将连接反应液热激转化大肠杆菌DH5α，具体步骤为：

1.将连接反应液加入DH5α感受态细胞中，置于冰上30min；

3.在冷却的感受态细胞中加入1ml LB恢复培养液，37℃220rpm摇菌；

第二天，通过PCR方法利用特异引物008F：5'-GCCTAATGGGTATAGAGCAAAATGGCA-3'和008R：5'-AAGCTTACCTGAACTTCCAAGTCTGGA-3'进行菌落PCR，反应体系参照实施例4，具体步骤为：94℃3min；94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，筛选阳性克隆，由此得到CLCrV-sge1+ave1(DH5α)。将CLCrV-sge1+ave1(DH5α)接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养后，离心收集菌体，利用Axgen质粒提取kit提取质粒pCLCrV-sge1+ave1。

实施例6、将clp1基因片段构建到pCLCrV-sge1+ave1载体

将pCLCrV-sge1+ave1和clp1同时用AvrIII酶切，具体反应条件为37℃30分钟。将酶切反应后的pCLCrV-sge1+ave1和clp1经过Axygen PCR清洁试剂盒清洁后，得到pCLCrV-sge1+ave1-1和clp1-1

将pCLCrV-sge1+ave1-1和clp1-1以1:7的摩尔比混匀，加入T4连接酶和配套缓冲液，在16℃条件下，反应过夜。次日，将连接反应液热激转化大肠杆菌DH5α，具体步骤为：

1.将连接反应液加入DH5α感受态细胞中，置于冰上30min；

3.在冷却的感受态细胞中加入1ml LB恢复培养液，37℃220rpm摇菌；4.一小时后，菌液经过1200rpm 1min离心，弃上清，将菌体均匀涂布于含有Km(50mg/ml)的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

第二天，通过PCR方法利用特异引物008F：5'-GCCTAATGGGTATAGAGCAAAATGGCA-3'和008R：5'-AAGCTTACCTGAACTTCCAAGTCTGGA-3'进行菌落PCR，反应体系参照实施例4，具体步骤为：94℃3min；94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，筛选阳性克隆，由此得到CLCrV-sge1+ave1+clp1(DH5α)。将CLCrV-sge1+ave1+clp1(DH5α)接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养后，离心收集菌体，利用Axgen质粒提取kit提取质粒pCLCrV-sge1+ave1+clp1。其插入片段序列如SEQ IDNO:4所述。

实施例7.pCLCrV-sge1+ave1+clp1和pCLCrVB电击转化农杆菌EHA105

农杆菌EHA105接种5ml含Rif(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；离心后弃上清培养液，用无菌水重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复3-4次，得到EHA105感受态细胞。

分别取质粒pCLCrV-sge1+ave1+clp1和pCLCrVB各2ul，与EHA105感受态细胞混匀，用Bio-rad gene pluser xcell电击仪，电压2400V，电击转化EHA105，将转化后的农杆菌加入1mlLB液体培养基，28℃220rpm摇菌3小时后，取50ul菌液，均匀涂布在含有Rif(50mg/ml)和Km(50mg/ml)双抗性的YEP固体培养基上，28℃培养两天。第三天，利用M13F:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’和M13R：5‘-CAGGAAACAGCTATGAC-3’这对引物，进行PCR筛选阳性菌落，反应体系参照实施例4；反应参数为：94℃3min；94℃变性45sec，50℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环，最后72℃延伸10min，选取阳性单克隆含pCLCrV-sge1+ave1+clp1的EHA105和含pCLCrVB的EHA105。

实施例8.含pCLCrV-sge1+ave1+clp1和含pCLCrVB的EHA105混合后浸润棉花

将含CLCrV-sge1+ave1+clp1的EHA105和含CLCrVB的EHA105分别接种于含有Rif(50mg/ml)和Km(50mg/ml)的YEP培养液中，28℃下200rpm培养48小时后，含CLCrVtSmiR173的EHA105和含CLCrVB的EHA105按1：1比例混合菌液，12000rpm离心1分钟，离心后弃上清培养液，用浸润缓冲液(10mM MgCl₂、10mM 2-吗啉乙磺酸、200mM乙酰丁香酮，无菌水为溶剂)重悬菌体，室温放置2-3小时。含pCLCrVA的EHA105和含pCLCrVB的EHA105的组合同样处理后，作为对照组浸润棉花子叶。

用不带针头的1ml一次性注射器，吸取适量浸润液，在2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润，必要时可以用针头在子叶背面刺适量小洞，便于浸润。浸润后的棉花幼苗，放于温室培养，温度为23～27℃，相对湿度为65％～75％，光周期为16L：8D；10-20天后观察表型。

实施例9.大丽轮枝菌侵染实验及病情指数统计

CLCrV相关载体浸润15天后，实验组(CLCrV-sge1+ave1+clp1)与对照组棉花每株植物根部分别浇灌30ml含有1×10⁶孢子的大丽轮枝菌孢子悬液。

20天后根据棉花发病程度统计病情指数，具体方法如下：根据发病轻重程度将病情指数分为4级，划分标准为：外表健康植株(0级)，1-2片子叶出现黄化或坏死(1级)，一片真叶出现黄化或坏死表型(2级)，多片真叶出现黄化或坏死表现(3级)，全部叶片出现脱落或整株死亡(4级)。综合病情指数＝[相应病情指数×相应发病植株数/(总植株数量×40)]×100。结果表明，CLCrV-sge1+ave1+clp1相比于对照组病情指数下降约20％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江理工大学

江苏省农业科学院

<120> 利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 219

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcactagtt gtctgcggct aatgtccccc ttgaggccac ctggcaaggc catgtcgcct 60

cgactcttga tgccgttgtt ctgttcgagg cttgcctgtc tggcaatctt cgtcacgtcc 120

cccgtcgacc ccacgatcgt gagcgccacg tcacttggag cccgagtcga atcctcggga 180

actatttgat ctaccgggag ctggagagtt aattaagat 219

<210> 2

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcttaatta atgaagcttt ctacgcttgg agccctcatt tcattgactt cactggtcac 60

tgccgatcta gggaccgcat cctactataa cccaccctac cttcccactg cctgcggcgg 120

cagcaatccc agccaatttc cctctggtaa tctgttcgtt gctgtttcag acggtctctg 180

ggataacggt gctgcctgtg gtcggcgata cagcctaggg at 222

<210> 3

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atccctaggt gcacggctac agctcctccg aggagtccga cgaccccaag aggccgaggc 60

ctccgcccgc ctctgcaacg agcaccaccg acaagaaggt gaaaaagaag aagaaggtgc 120

cgccacagca gtcgatcaac cacatctgga agacgttcca gaagcgcacc ttcaacaagg 180

cgctggcaat acttcccttc gaccccgcct agggat 216

<210> 4

<211> 625

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actagttgtc tgcggctaat gtcccccttg aggccacctg gcaaggccat gtcgcctcga 60

ctcttgatgc cgttgttctg ttcgaggctt gcctgtctgg caatcttcgt cacgtccccc 120

gtcgacccca cgatcgtgag cgccacgtca cttggagccc gagtcgaatc ctcgggaact 180

atttgatcta ccgggagctg gagagttaat taatgaagct ttctacgctt ggagccctca 240

tttcattgac ttcactggtc actgccgatc tagggaccgc atcctactat aacccaccct 300

accttcccac tgcctgcggc ggcagcaatc ccagccaatt tccctctggt aatctgttcg 360

ttgctgtttc agacggtctc tgggataacg gtgctgcctg tggtcggcga tacagcctag 420

gtgcacggct acagctcctc cgaggagtcc gacgacccca agaggccgag gcctccgccc 480

gcctctgcaa cgagcaccac cgacaagaag gtgaaaaaga agaagaaggt gccgccacag 540

cagtcgatca accacatctg gaagacgttc cagaagcgca ccttcaacaa ggcgctggca 600

atacttccct tcgaccccgc ctagg 625

Claims

1.利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，其特征在于：利用植物病毒载体在植物体内特异表达针对大丽轮枝菌多个致病关键基因的小干扰RNA，从而多靶点抑制大丽轮枝菌侵染，提高植物对于黄萎病抗性。

2.根据权利要求1所述的利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，其特征在于：

在植物病毒载体中插入针对大丽轮枝菌多个致病关键基因片段，使其含有如下序列：5’-actagtTGTCTGCGGCTAATGTCCCCCTTGAGGCCACCTGGCAAGGCCATGTCGCCTCGACTCTTGATGCCGTTGTTCTGTTCGAGGCTTGCCTGTCTGGCAATCTTCGTCACGTCCCCCGTCGACCCCACGATCGTGAGCGCCACGTCACTTGGAGCCCGAGTCGAATCCTCGGGAACTATTTGATCTACCGGGAGCTGGAGAGttaattaaTGAAGCTTTCTACGCTTGGAGCCCTCATTTCATTGACTTCACTGGTCACTGCCGATCTAGGGACCGCATCCTACTATAACCCACCCTACCTTCCCACTGCCTGCGGCGGCAGCAATCCCAGCCAATTTCCCTCTGGTAATCTGTTCGTTGCTGTTTCAGACGGTCTCTGGGATAACGGTGCTGCCTGTGGTCGGCGATACAGcctaggTGCACGGCTACAGCTCCTCCGAGGAGTCCGACGACCCCAAGAGGCCGAGGCCTCCGCCCGCCTCTGCAACGAGCACCACCGACAAGAAGGTGAAAAAGAAGAAGAAGGTGCCGCCACAGCAGTCGATCAACCACATCTGGAAGACGTTCCAGAAGCGCACCTTCAACAAGGCGCTGGCAATACTTCCCTTCGACCCCGcctagg-3’。

3.根据权利要求2所述的利用植物病毒载体多靶点调控大丽轮枝菌基因表达的方法，其特征在于：利用病毒载体在棉花体内特异表达针对大丽轮枝菌致病关键基因的小干扰RNA，包括如下步骤：

Sge1FspeI6.3:ATCactagtCGCCGCAAAGAAGAACAAGA，

Sge1RpacI6.3:ATCttaattaaTGAAAGGGTATGAGTCAACCAGAG；

AVE1F PacI:ATCttaattaaTGAAGCTTTCTACGCTTGGA ，

AVE1R AVRII:ATCcctaggCTGTATCGCCGACCACA；

Clp1AvRII F:ATCcctaggTGCACGGCTACAGCT，

Clp1AvRII1R:ATCcctaggCGGGGTCGAAGGGAAG；

6)、接种大丽轮枝菌30天后，经过病情指数统计，相比于对照组CLCrV空载体接种植株，接种CLCrV-sge1+ave1+clp1的植株表现出病情指数下降的情况。