CN1351669A

CN1351669A - 基于豌豆质体蓝素pete启动子的嵌合启动子

Info

Publication number: CN1351669A
Application number: CN 00807947
Authority: CN
Inventors: I·朗塞; V·格鲁伯; M·泰森
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 1999-03-22
Filing date: 2000-03-20
Publication date: 2002-05-29
Also published as: AU3185300A; FR2791358A1; EP1163351A1; AU767285B2; WO2000056906A1; FR2791358B1; JP2002539795A; CA2366228A1

Abstract

本发明涉及包含至少1个得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列的嵌合启动子,该核酸序列优选得自petE启动子。本发明还涉及这类嵌合启动子的生产方法,以及含有它们的表达框、载体、和转基因植物。

Description

基于豌豆质体蓝素PETE启动子的嵌合启动子

〔说明〕

本发明涉及嵌合表达启动子，特别是适合并适用于植物生物工程领域的。

一般说来，表达启动子是生物工程和遗传操作领域中众所周知的。更具体就植物生物工程而论，编码希望在宿主细胞中产生的多肽的基因的表达程度常常取决于所用的启动子。遍在使用的各种启动子常常只是因为它们的组织特异性或表达强度而限于具体应用或特定细胞组织。例如，可能列举花椰菜花叶病毒的35S启动子，据说它与来源于nos基因的启动子相比是相对较强的启动子，这两种启动子都更特定地用于植物生物工程领域。因此，现在仍需要使得能够克服迄今常用的启动子所固有的那些问题的新颖而有用的启动子。

在以WO97/20056号公布的PCT申请中已报道了解决该问题的一种尝试，它描述了通过在已知的启动子中使用“增强子”(即对启动子的活性具有正向作用)来增加基因表达的程度。“增强”核苷酸序列富有A和T碱基，所述碱基的总量占该“增强子”核苷酸序列的50％以上。特别是，该PCT申请的申请人详细说明了来源于豌豆质体蓝素启动子的“增强子”区的用途。

此处以及权利要求书中所用的表达方式将具有以下含义：

-“核酸”是指DNA或RNA；

-“核酸序列”是指从5’末端朝向3’末端阅读的核苷酸碱基的单链或双链低聚体或多聚体，它包括自我复制型质粒、基因、感染或非感染性DNA或RNA的聚合体以及功能或非功能性DNA或RNA。在本申请所用的核苷酸符号标示中，除非另有说明，否则单链核苷酸序列的左手末端是5’末端；

-“衍生核酸序列”是指从某序列例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失、添加、突变、断裂和/或合成而直接或间接得到的序列；

-“启动子”或“启动子核酸序列”是指翻译起始密码子的核酸上游区，它参与识别和结合RNA聚合酶以及与转录有关的其他蛋白质；

-“植物启动子”是指能够引发植物细胞转录的启动子；

-“组成型启动子”是指能够在所述生物体的整个发育过程中在该宿主生物体的所有或几乎所有组织中表达与所述启动子操作性连接的核酸序列的启动子；

-“组织特异性启动子”是指能够以选择性方式在宿主生物体的某些特定组织中表达与所述启动子操作性连接的核酸序列的启动子；

-“操作性或功能性连接”是指将启动子或启动子核酸序列与要表达的编码希望产生的蛋白质的核酸序列或基因连接，连接的方式要使得该启动子真正影响或驱动该连接核酸序列的转录。应当理解，该启动子序列还可包括位于转录起始位点和翻译起始密码子之间的转录序列；

-“要表达的编码希望产生的多肽的核酸序列或基因”是指编码多肽、优选外源或异源多肽的基因或核酸序列，所述外源多肽更优选药学、治疗学或化妆品学上的活性物质，诸如蛋白质、酶、抑制剂、受体、抗体、抗原、其治疗活性片段。可以通过相应基因或核酸序列在宿主细胞中的表达生产的例举性的异源或外源治疗活性物质是结构蛋白，诸如胶原，铁转移蛋白或运铁蛋白，诸如乳铁蛋白，血液衍生蛋白，诸如血红蛋白，人血清白蛋白，红细胞生成素，生长刺激因子，蛋白水解酶或抗蛋白水解酶，诸如α-抗胰蛋白酶，激素，次生代谢物，消化酶，诸如胃脂肪酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，醇脱氢酶，脑衍生的神经营养因子，心刺激剂或调节剂，以及血压控制剂诸如血管紧张素；

-“表达框”是指能够驱动编码希望在与这类表达框序列相容的宿主生物体中产生的多肽的核酸序列或基因的表达的核苷酸序列。这类表达框一般至少包括一个启动子和转录终止信号，以及可选的用于表达或表达所需的其他因子；

-“载体”是指表达系统，例如用DNA包被的发射物、基于核酸的转运载体、适于传递核酸序列的核酸分子、和自我复制型自主环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等等。当重组微生物或重组细胞培养物描述为“表达载体”的宿主时，这还可包括环状染色体外DNA(诸如象线粒体或叶绿体DNA)，已整合到宿主染色体中的DNA，或者作为整合到宿主基因组中的自主结构在有丝分裂期间通过细胞稳定复制、或者保持在宿主的核或胞质中的载体；

-“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括“表达质粒”和“非表达质粒”。当重组微生物或细胞培养物描述为“表达质粒”的宿主时，这还包括环状染色体外DNA分子和已整合到宿主染色体中的DNA分子。若质粒保持在宿主细胞中，则该质粒或者作为自主结构在有丝分裂期间由细胞稳定复制，或者整合到宿主基因组中；

“异源序列”或“异源核酸序列”是指来源于对环境来说是外来的来源或种的序列，或者若是来自相同环境，则已对其原始形式进行了修饰。可以对核酸序列进行修饰，例如通过用限制酶处理核酸，以产生能够操作连接到启动子的核酸片段。修饰也可以通过使用象位点特异性诱变等技术进行；

-“盒”是指赋予调节功能的核酸序列；

-“…样”是指包含与作为参照指示的已知盒和/或已知核酸序列相同或同源的某种序列的与该术语相联系的盒和/或核酸序列，优选与参比序列至少50％的序列同一性，甚至更优选至少75％的序列同一性，首选至少90％的序列同一性。序列同一性百分数是在至少6个邻接核苷酸碱基的比较窗口的基础上计算出的。可以使用序列对齐算法来确定比较窗口，以确定与参比序列的同源性，例如局部同源性算法、同源性对齐算法和相似检索算法，这些算法也有计算机程序形式，命名为诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。序列同一性百分数通过使用上述一种或多种方法比较参比序列与盒和/或核酸序列得到；

-“位于”是指鉴定元件核酸序列上的位置，诸如“盒”、限制位点或具有特定功能的密码子。用数字给出的位置指的是该元件在核酸序列中的起始位置，是以核酸序列的读框方向来说的，即，以相对于标明为+1的转录起始位点的位置的5’→3’方向；

-“转基因植物”是指通过应用基因操作技术得到的植物，包括用这类技术得到的完整植物、它们的后代、以及利用这类技术得到的植物器官，例如但不限于根、茎和叶。按照本发明得到的转基因植物还可以有不同的倍性水平，可以是例如多倍体、二倍体和单倍体；

-“繁殖体”是指能够使从其再生完整植物的、有结构或无特定结构的植物细胞的累积块或联合或集合体；这类联合体可以是例如外植体、愈伤组织、茎、叶、根、插枝、甚至是种子的形式。

本申请人采用了与前面所讨论的PCT申请的申请人所用的完全不同的方法。奇迹般地，本申请人已设法生产了满足前述需要的嵌合启动子，特别是相对现有的常用启动子来说，能够增加编码希望在宿主细胞中、优选在植物细胞中产生的多肽的基因或与所述启动子操作性连接的核酸序列的表达程度的嵌合启动子。另外，为了能够选出最适合特定任务或应用或打算要使用的环境的启动子，本申请人同时设法生产了一族启动子，并因此能够控制要表达的基因或编码希望在宿主细胞中产生的多肽的与所述启动子操作性连接的核酸序列的表达程度。

所以，本发明的一个目的是包含至少一个得自豌豆质体蓝素基因启动子的、具有SEQ.ID.No.01所述序列的核酸序列的嵌合表达启动子。优选地，该包含得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列的嵌合启动子选自下列成员：在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

另外，本申请人注意到按照本发明有可能构造这样的启动子、尤其是植物启动子，它们具有令人感兴趣的启动子活性，同时具有最小调节盒，特别是至少1个“G”盒、“CAAT”盒和“TATA”盒，唯一的条件是“G”盒位于其他盒的上游，即位于核酸序列的5’区，且该“G”盒优选位于离开其他盒上游的用核苷酸碱基表达的一定距离处。因此，本发明的另一个目的是包含与至少1个“CAAT”盒、1个“TATA”盒和转录起始位点(在图中用+1标明)上游操作性连接的“G”盒的嵌合表达启动子。更优选该“G”盒位于相对于转录起始位点(+1)的-225位和-65位之间。甚至更优选该“G”盒位于相对于转录起始位点(在图中用+1标明)的-201位和-115位之间。在首选的实施方案中，该“G”盒位于相对于转录起始位点(在图中标明为+1位)的-201位或-115位。

有利地，该“G”盒是植物来源的。优选“G”盒从豌豆质体蓝素基因的启动子得到。更优选“G”盒从豌豆质体蓝素基因的petE启动子得到。

按照本发明启动子的优选实施方案，启动子进一步包含操作性或功能性连接“G”盒上游的“nos E样”盒。按照本发明的另一个优选实施方案，启动子还包含至少一个与“G”盒操作性或功能性连接的“as1”或“as1样”盒，并优选2个或多个邻近或分离排列的这样的盒，首选4个这样的盒。这些“as1”或“as1样”盒可以连接所述“G”盒的上游和下游，优选连接其上游。在本发明的另一个优选方式中，一个或多个“as1”或“as1样”盒也可以和已知的反向的顺序排列，即从3’到5’方向，并优选以反向重复顺序排列。

按照本发明的一个特别优选的实施方案，启动子还包含至少一个与“G”盒操作性或功能性连接的“as2”盒，并优选2个或多个邻近或分离排列的这样的盒，首选4个这样的盒。这些盒还可优选连接所述“G”盒的上游和下游，更优选连接其上游。在本发明的另一个优选方式中，有些或所有盒也可以和已知的反向的顺序排列，或者如上所述为反向重复盒。

最后，甚至更优选的是，如上所述的嵌合启动子包含至少一个选自下列成员的核酸序列：在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

本发明的另一个目的是包含至少一个与编码希望表达的多肽的基因或核酸序列操作性或功能性连接的、得自豌豆质体蓝素基因的基因启动子的核酸序列的表达框，所述编码核酸序列依次与转录终止核酸序列操作性或功能性连接，其中得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列选自在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

本发明的另一个目的是分离的启动子核酸序列，其特征在于该序列选自下列成员：在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。这样的序列可以是从在序列表中由SEQ.ID.No.1所述的序列通过一个或多个核酸的缺失、置换、添加得到的。

本发明的另一个目的涉及用于生产如前所述的启动子核酸序列的启动子的脱氧核苷酸或脱氧核苷模块。这些模块可以是：

-构件或“定向”模块，即以和最终启动子核酸序列相同的方向从序列的5’末端朝向序列的3’末端阅读的序列；和/或

-“引导”模块，即其末端包括与定向构件的末端互补和重叠的核苷酸或核苷碱基的序列。

因此，并首选的是，定向构件对应于至少一个选自下列成员的序列：在序列表中由SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的序列。

另外，优选使用与至少一个选自下列成员的序列相对应的引导模块：在序列表中由SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的序列。

本发明的另一个目的是包含能够引发编码希望产生的多肽的基因或核酸序列的转录的启动子或启动子核酸序列的载体，特征在于该启动子或启动子核酸序列对应于如前所定义的嵌合表达启动子或启动子核酸序列。

优选该载体选自由pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170所述的双元载体。

本发明的另一个目的是生产如前所定义的那些嵌合表达启动子或分离的启动子核酸序列的方法，特征在于它包括以下步骤：

-进行称作LCR的连接链式反应，以从至少一个选自分别由序列表中的SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的定向构件S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的定向构件脱氧核苷酸或脱氧核苷序列和至少一个用于构造所述启动子核酸序列或启动子的脱氧核苷酸或脱氧核苷引导模块来生产单链连续DNA分子，所述引导模块选自分别由序列表中的SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的引导序列G1、G2、G3和G4；

-对从前一步骤得到的单链进行PCR扩增，以生产对应于嵌合表达启动子或启动子核酸序列的双链DNA；

-可选地分离启动子或启动子核酸序列。

优选脱氧核苷酸或脱氧核苷构件在连接前磷酸化。更优选连接在至少一种DNA连接酶的存在下以下列条件下的热循环进行：

-首先在约94℃下约1分钟的1个循环；

-随后8个相同循环，每个由以下步骤组成：

-65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和37℃下10分钟。

本发明的另一个目的是具有稳定整合到其基因组中的至少一个如前所定义的启动子或至少一个启动子核酸序列的转基因植物。该转基因植物最好选自双子叶植物，诸如象并优选马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油菜籽、甜菜根和向日葵，和/或选自单子叶植物，诸如象并优选小麦、大麦、燕麦、稻米和玉米。

本发明的另一个目的是转基因植物繁殖体，其中繁殖体具有前面所给出的定义，优选该繁殖体是种子。

本发明的又一个目的是含有如前所定义的启动子或启动子核酸序列的细胞。优选该细胞是原核或真核细胞，更优选是选自细菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、人类细胞、真菌细胞、藻类、酵母和植物细胞的细胞，首选是植物细胞。

除了本发明的优选目的以外，还有编码希望产生的多肽的核酸序列或基因在细胞中的表达方法，特征在于它包括以下步骤：

-用包含与编码要产生的多肽的核酸序列或基因操作性连接的、如前文所定义的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化细胞，其中所述编码核酸序列自身与转录终止信号操作性连接；

-在使得编码多肽的核酸序列或基因能够表达的条件下培养该细胞。优选在该方法中所用的细胞是原核细胞或真核细胞。更优选是选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的细胞，首选是植物细胞。

最后，本发明的另一个目的是如前所定义的转基因植物或繁殖体的生产方法，特征在于该方法包括以下步骤：

-用包含如前文所定义的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化植物细胞；

-选出具有整合到其基因组中的启动子或启动子核酸序列的植物细胞；

-通过培养或通过再生整个嵌合或转基因植物来繁殖转化和选出的植物细胞。

附图的简要描述

本发明将通过以下对若干个作为最佳方式但非限制性实施例给出的优选实施方案的详细描述并参照附图而得到更好的理解，在附图中：

-图I、II和III图解表示了比较参比分子构建物的结构，使得本发明的嵌合表达启动子能够与所述参比构建物进行比较。图I中，所表示的构建含有在没有任何启动子序列的情况下编码β-葡糖醛酸糖苷酶的报道基因，并因此用作阴性对照。

-图II图解表示了含有受CaMV双35S启动子(d35S CaMV)(也叫做35S增强启动子(ep35S))控制的编码β-葡糖醛酸糖苷酶的基因的构建物，它用作强启动子的参比对照；

-图III表示了用作瞬时表达实验的内部参照的构建物，包括受35SCaMV启动子控制的编码荧光素酶的报道基因；

-图IV图解表示了得自来自豌豆质体蓝素基因的整个启动子(petEprom)的本发明嵌合启动子的几种优选实施方案的结构，也表示了来自豌豆质体蓝素基因的整个启动子(petE prom)的结构。确定为MPr1098、MPr1097和MPr1096的启动子对豌豆质体蓝素基因的整个启动子的酶消化得到，而确定为MPr1108、MPr1109、MPr1110、MPr1111和MPr1112的启动子通过基于配体的PCR(1b-PCR)得到。MPr1143和MPr1153分别通过缺失启动子MPr1111的“as-2”和“as-1”盒得到，和通过在启动子MPr1143的上游融合MPr1108的“as-1样”和“nos增强子样”盒得到。将产生的所有启动子克隆到载体pMRT1144中的限制位点PstI和BamHI之间，以得到具有编码β-葡糖醛酸糖苷酶的报道基因uidA的转录融合体；

-图V表示了烟草叶中不同构建物在瞬时表达后的相对启动子活性的对比图。轰击3天后，将这些烟草叶磨碎并通过离心得到澄清的粗提物。用荧光测定法测量粗提物试样的β-葡糖醛酸糖苷酶和荧光素酶活性，并确定GUS/LUC活性的比率。直方图相当于所示构建物的平均比率加上或减去普及标准误差(MSE)；

-图VI图解表示了烟草植物稳定转化后嵌合启动子活性的对比图。所有初级转化体转移到温室中后，于第2、4、6、8和10周时采集样品，测量每个样品的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，并利用蛋白质总含量进行估量，得到GUS活性，以rlu/mg蛋白质表示。在发育的每个阶段，将每一系列初级转化体的活性按减小的顺序排序并彼此进行比较。

在各图中，某些术语和表达方式具有以下含义：

-uidA＝编码β-葡糖醛酸糖苷酶的序列；

-IV2＝patatin基因内含子；

-nos term＝来自胭脂氨酸合酶基因的终止子；

-35S term＝来自CaMV的35S RNA的终止子；

-B＝内切核酸酶限制位点BamHI；

-E＝内切核酸酶限制位点EcoRI；

-H＝内切核酸酶限制位点HindIII；

-P＝内切核酸酶限制位点PstI；

-Sp＝内切核酸酶限制位点SphI；

-as-1＝来自CaMV 35S启动子的活化序列1；

-as-2＝来自CaMV 35S启动子的活化序列2；

-nos E＝来自胭脂氨酸合酶启动子的活化盒；

-D＝内切核酸酶限制位点DraIII；

-H＝内切核酸酶限制位点HindIII；

-P＝内切核酸酶限制位点PstI；

-S＝内切核酸酶限制位点SpeI；

-Sp＝内切核酸酶限制位点SphI；

-CAAT＝“CAAT”盒；

-G＝“G”盒；

-TATA＝“TATA”盒；

-+1＝转录起始位点；

-“…样”是指与序列从其得到名称的参比序列不是100％相同的序列。

优选实施方案的详细描述

实施例1

1.比较构建物(对照)

为了能够比较本申请中所述的嵌合表达启动子，将编码β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1986年)并含有来自马铃薯patatin的ST-LS1基因的IV2内含子的核酸序列(Vancanneyt等，1990年)的uidA基因(uidA-IV2)置于一种启动子和来自胭脂氨酸合酶基因(nos term)的终止子的控制下。这种构建物然后通过克隆到由Promega公司(Madison，USA)出售的质粒载体pGEM3Z中而转化到根癌农杆菌中。

1.1.阴性对照pMRT1144的构建

为了促进克隆，生产只具有“uidA-IV2/nos term”序列而没有任何启动子序列的得自pGEM3Z的质粒载体。将这种质粒命名为pMRT1144并用作阴性对照(图I)。为了将uidA/nos term序列引入pGEM3Z质粒中，在豌豆质体蓝素基因的整个启动子和胭脂氨酸合酶终止子的控制下从5μg质粒pGA492-PpetE分离uidA序列。pGA492-PpetE质粒通过将从质粒pKHn2得到的来自豌豆质体蓝素基因的petE启动子(Pwee和Gray，1993)代替来源于bpI221-Pem2质粒的em2启动子(Gaubier等，1993年)克隆到质粒pGA492-Pem2-uidA中得到。bpI221-Pem2质粒在37℃下用各20单位的酶HindIII和EcoRI消化1小时。然后，表达框“Pem2/uidA/nosterm”通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水中并插入质粒pGA492(An，1986)的HindIII和EcoRI位点之间。连接在1.0μl T4 10XDNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下进行16小时。转化有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌(Hannahan，1983)。在添加了四环素(12mg/l)的Luria-Bertani培养基(LB，细菌用胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l，琼脂15g/l)上选出的所得克隆的质粒DNA按照Birnboim和Doly的碱裂解法(Bimboim和Doly，1983)提取并通过酶消化进行分析。

从由此得到的pGA492-Pem2-uidA质粒开始，通过用HindIII和XbaI双重消化除去启动子Pem2。所研究的质粒片段通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，按照制造商的建议在37℃下接受DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)作用30分钟。然后，其通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最终用1体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，并再悬浮于水。之后，其在37℃下借助10单位的小牛肠碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)按照制造商的建议去磷酸化1小时，通过用1体积的苯酚萃取、然后用1体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最终用1体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水中。所得质粒命名为pGA492ΔPem2。

并列地，对应于豌豆质体蓝素基因的启动子的petE启动子(818个碱基对)通过在37℃下用NcoI消化1小时而从质粒pKHn2得到。该828bp启动子片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水中，然后按照制造商的建议在30℃下接受5单位的绿豆核酸酶(New EnglandBiolabs)作用30分钟，通过用1体积的苯酚萃取、然后用1体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最终用1体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，再悬浮于水。如前所述，将这种启动子片段在1.0μl T410X DNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小时而插入到质粒pGA492ΔPem2中。转化有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌。在添加了四环素(12mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pGA492-petE prom。

为了分离表达框“petE prom/uidA/nos term”，5μg质粒pGA492-petEprom用PstI(在质体蓝素基因启动子上的5′位点)和EcoRI(在终止序列上的3′位点)在37℃下消化1小时，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳并按照制造商的建议在Qiaquick亲和柱(Qiagen，Hilden，Germany)上纯化。另外，500ng质粒pGEM3Z同时在37℃下用EcoRI和PstI(存在于多克隆部位或多接头中的限制位点)消化1小时，接受0.8％凝胶电泳，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

连接用50ng载体pGEM3Z-PstI/EcoRI和50ng表达框“petE prom/uidA/nos term”在18℃下在12μl反应介质中在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)的存在下进行1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α通过与连接反应混合物混合而转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pGEM3Z-petE prom。

为了将来源于马铃薯patatin基因的192bp IV2内含子插入到uidA编码序列中，将该基因的内部部分(pGEM3Z-petE prom中的BstBI 710bp片段)切除，然后用含有IV2内含子的同等序列(SnaBI/BstBI 902bp片段)取代。为此，质粒pGEM3Z-petE prom在37℃下用SnaBI(位于uidA基因的ATG起始子密码子上游的+383bp位的限制位点)消化1小时，然后在65℃下用BstBI(位于+1093bp位的限制位点)消化1小时。缺失了710bp的质粒通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。对应于IV2内含子序列的BstBI/SnaBI 902bp片段再加上从383延伸至1093bp位的uidA序列从质粒pSCV1.2-GI分离并纯化。按照克隆中常用的和本领域技术人员熟知的方法，质粒pSCV1.2-GI得自质粒pSCV1.2，它又依次得自由G.A.Edwards于1990年构建的质粒pSCV1。双元质粒pSCV1.2通过带有表达框“35S prom/nptll/nos term”的HindIII片段(Fromm等，1986)在pSCV1的HindIII位点的克隆得到。表达框“35Sprom/GUS-IV2/35S term”通过如Vancanneyt等(1990)所述在37℃下用HindIII消化质粒p35S GUS INT达1小时而得到。对应于该表达框的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，电洗脱，然后在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥并再悬浮于水中。该片段的5′突出端按照制造商的建议在37℃下用DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)钝化30分钟，并且该片段通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟后，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥并最终在1.0μl T410X DNA连接酶缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小时而与事先在25℃下用SmaI消化了1小时的20ng质粒pSCV1.2连接。转化先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。

5微克(5μg)pSCV1.2-GI质粒在37℃下用SnaBI(位于uidA基因ATG起始密码子上游+383bp位的限制位点)消化1小时，然后在65℃下用BstBI(位于+1285bp位的位点)消化1小时。该902bp片段通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。连接用20ng载体pGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI和80ng 902bp片段BstBI/SnaBI在18℃下在10μl反应介质中在1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的从这些克隆得到的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pGEM3Z-petE prom/IV2。

为了从质粒pGEM3Z-petE prom/IV2除去对应于818bp片段(petE)的启动子序列，该质粒在37℃下用BamHI消化1小时，然后在37℃下用PstI消化1小时，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。该质粒的5′突出端按照供应商的建议用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。连接用10ng由此修饰的质粒在18℃下以12μl的反应体积在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，通过酶消化进行分析，并按照Sanger等(1977)所述方法通过测序检定。所得质粒命名为pMRT1144(图I)。

1.2.阳性对照启动子MPr1092的构建

为了得到参比启动子序列，将“双35S”花椰菜花叶病毒启动子(CaMV D35S prom)置于uidA-IV2/nos term序列的上游。质粒pMRT1092(图II)由以下克隆步骤得到：

首先，如1.1部分中所述将马铃薯patatin基因的192bp IV2内含子插入到uidA编码序列的+383bp位。1微克量(1μg)的质粒bpI221(Clontech，CA，USA)在37℃下用SnaBI消化1.5小时，然后在65℃下用BstBI消化1.5小时。缺失了710bp片段的质粒通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

20纳克(20ng)量的bpI221 BstBI/SnaBI载体和80ng如前所述来源于pSCV1.2-GI的902bp BstBI/SnaBI片段在18℃下以10μl的反应体积在1μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下连接1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α用一半的连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为bpI221/uidA-IV2。

在第二步中，存在于bpI221/uidA-IV2质粒中的CaMV35S启动子序列用“CaMV D35S”序列置换。为此，bpI221/uidA-IV2质粒在37℃下用10单位的HindIII消化10.5小时，然后粘端通过DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)按照制造商的建议在37℃下作用30分钟而钝化。该反应的产物在Qiaquick亲和柱上纯化后，DNA在37℃下用10单位的BamHI消化1夜。对应于缺失828bp CaMV 35S启动子片段的载体的质粒片段通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

CaMV D35S prom从质粒pJIT163D得到。该质粒得自pJIT163质粒，它又依次得自质粒pJIT160(Guerineau和Mullineaux，1993)。质粒pJIT163具有在多接头的HindIII和SalI位点之间的ATG密码子。为了除去该ATG并得到质粒pJIT163D，pJIT163的质粒DNA用HindIII和SalI消化，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，按照制造商的建议在37℃下接受DNA聚合酶I的克列诺片段(New England Biolabs)作用30分钟，通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白质，在1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分钟，然后以12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥并最终在1.0μl T4 10X DNA连接酶(Amersham)和2.5单位的T4 DNA连接酶(Amersham)的存在下在14℃下连接16小时。转化有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。

10微克(10μg)质粒pJIT163D在37℃下用10单位的KpnI(位于启动子5′区中的位点)消化10.5小时，然后粘端用6单位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃下按照制造商的建议作用30分钟而钝化。该反应的产物在Qiaquick亲和柱上纯化后，DNA在37℃下用10单位的BamHI消化1夜。所得对应于CaMV D35S启动子的761bp DNA片段通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。含有10ng质粒载体、100ng 761bp片段、1.0μl T4 10X DNA连接酶(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的反应混合物以10μl在18℃下连接1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α用一半的连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1092(图II)。

1.3.参比质粒pCaMV35Sluc的描述

用作瞬时表达的内部参照的质粒是pCaMV35Sluc(Torrent等，1997)，它含有在RNA 35S花椰菜花叶病毒启动子和终止子控制下的荧光素酶报道基因(luc)的表达框。

实施例2

含有来自豌豆质体蓝素基因的缺失启动子序列的质粒的构建

豌豆质体蓝素基因的整个启动子(Last和Gray，1989年)对应于从-771bp位延伸至+63bp位的834bp序列(SEQ.ID01)，其中已鉴定了几个可能的调节序列(相对于序列的5′末端朝向3′末端并相对于转录起始位点+1所给出的数字，图IV)：

-从-734延伸至-607bp位的一系列反向重复序列，

-与存在于CaMV 35S启动子中的活化序列1(as-1)具有一定相似性的20bp盒(as-1样)，从-579bp位延伸至-559bp位，

-与存在于根癌农杆菌的胭脂氨酸合酶基因的启动子中的活化序列具有一定同源性的21bp盒(nos增强子样)，从-540bp位延伸至-519bp位，

-从-201位延伸至-193bp位的8bp“G”盒，

-与在高等植物的启动子中发现的III型盒具有一定相似性的从-83位延伸至-69bp位的14bp盒，

-在-63位的“CAAT”盒，

-在-37bp位的“TATA”盒，

-转录起始点+1(1位)，

-从+1位延伸至63bp位的5′未翻译区。

质粒pGEM3Z-petE prom如上所述在实施例1的1.1部分中得到。它对应于在豌豆质体蓝素基因的整个启动子(petE prom，图IV，SEQ.ID01)控制下的含有报道基因uidA-IV2的质粒pGEM3Z，并用作所有基于质体蓝素启动子的构建的参比启动子。为了研究不同元件的作用，在petE prom的5’区中的缺失通过酶消化进行。

2.1.启动子MPr1097的构建

启动子MPr1097从petE启动子通过反向重复序列以及212bp Sphl片段上的as-1样盒(图IV)的5’缺失得到。为此，5微克(5μg)质粒pGEM3Z-petE/IV2在37℃下用20单位的SphI酶消化2小时，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

连接用25ng由此修饰的质粒在18℃下在10μl反应混合物中在1μlT4 10X DNA连接酶(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1097，命名为MPr1097的启动子序列(SEQ.ID02)通过测序检定。

2.2.启动子MPr1096的构建

启动子MPr1096从petE启动子通过反向重复序列、由两个403bp和105bp的SpeI片段分别带有的“as-1样”元件和“nos增强子样”元件(图IV)的5’缺失得到。为此，5微克(5μg)质粒pGEM3Z-petE/IV2在37℃下用20单位的SpeI酶消化2小时，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

连接用25ng由此修饰的质粒在18℃下在10μl反应混合物中在1μlT4 10X DNA连接酶(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1096，启动子序列MPr1096(SEQ.ID03)通过测序检定。

2.3.启动子Mpr1098的构建

为了得到基于petE启动子的最小参比启动子序列，构建只含有“TATA”和“CAAT”盒的207bp启动子Mpr1098(图IV)。

这通过以下步骤完成：5微克(5μg)质粒pGEM3Z-petE/IV2在37℃下用1.5单位的DraIII酶(存在于-128位的1个位点)和15单位的PstI酶(存在于启动子5’区中-759bp位的1个位点)消化2小时。由此缺失了位于petE启动子5’区中的631bp片段PstI/DraIII的质粒通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。该片段的粘端通过6单位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)按照制造商的建议在37℃下作用30分钟而钝化。该反应的产物在Qiaquick亲和柱上纯化后，连接用25ng由此修饰的质粒在18℃下在10μl反应混合物中在1μl T410X DNA连接酶(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1098，启动子序列MPr1098(SEQ.ID04)通过测序检定。该序列对应于最小豌豆质体蓝素启动子(图IV)。

实施例3

含有嵌合启动子序列的质粒的构建

除了通过缺失某些5’区得到的启动子外，从基本的最小启动子MPr1098开始，使用结合了称为LCR(Barany，1991)并借助“定向”寡脱氧核苷酸生产单链连续DNA的连接链式反应和生产双链DNA产物的PCR反应的1b-PCR技术合成一系列启动子。

3.1.启动子MPr1108的构建

启动子MPr1108(图IV)通过使用1b-PCR技术将petE启动子(SEQ.ID.01)的从-641bp位延伸至-569bp位并带有“as-1样”和“nos增强子样”盒的72bp序列与Mpr1098的187bp最小启动子序列(-128到+59bp，SEQ.ID04)融合来制备。

连续单链DNA借助以下定向寡脱氧核苷酸形成：

-S1＝5′

TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG3′(SEQ.ID12)

-S2＝5′

CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID13)

-S3＝5′

CATAATTTGAACACTCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID14)

-S4＝5′

GGAATCTGCAGTTGAACACGTACAAACTTACGTCATTTGTGCATGCAGAAGCATAGAGCTGAGCACACAATT3′(SEQ.ID15)

100微微摩尔(100pmol)的寡脱氧核苷酸S1、S2和S3通过在5μl10X激酶(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下用15单位的激酶(Amersham)在37℃下作用30分钟而5’磷酸化。磷酸化的寡脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。

为了连接“定向”寡脱氧核苷酸，使用以下“引导”寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID18)

-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID19)

-G3＝5′CAGAGTGTTCAAATTATGAATTGTGTGCTCAGC3′(SEQ.ID20)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化“定向”寡脱氧核苷酸S1、S2、S3和S4在10pmol的“引导”寡脱氧核苷酸G1、G2和G3、5ul Taq10X DNA连接酶(New England Biolabs)和40单位Taq DNA连接酶(NewEngland Biolabs)的存在下进行连接。该连接反应以GeneAmp PCRSystem 9700热循环(Perkin Elmer，Norwalk，USA)进行。该反应涉及以下步骤：94℃下1分钟，1个循环；和随后8个相同循环，各自由下列步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在Qiaquick亲和柱上纯化。最后，所得单链DNA的PCR扩增以GeneAmp PCR System 9700热循环在各100pmol的寡脱氧核苷酸探针5′GGAATCTGCAGTTGAACACGT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10ul Vent 10XDNA聚合酶缓冲液(New England Biolabs)和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下进行。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、56℃下30秒杂交步骤和72℃下1分钟延伸步骤组成的25个循环，然后在72℃下继续延伸5分钟。

该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI消化1小时，最后在Qiaquick柱上纯化。将它们插入到已在37℃下用BamHI酶消化1小时然后在37℃下用PstI酶消化了1小时的质粒pGEM3Z-petE/IV2中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在Qiaquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl“缓冲液3”10X(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在Qiaquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如上所述处理的25ng质粒和100ng通过PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接触1夜。有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。由此得到的两个质粒pMRT1108和pMPR1109进行测序。质粒pMRT1108含有预期启动子(SEQ.ID05)，而质粒pMRT1109带有启动子序列MPr1109(SEQ.ID06)，它与Mpr1108的不同在于缺失了5’未翻译区中的33bp，+1位上游11bp(图IV)。

3.2.启动子Mpr1110的构建

启动子MPr1110通过在MPr1098启动子(SEQ.ID04)的-99bp位插入含有“G”盒(从petE启动子的-204bp位延伸至-186bp位，SEQ.ID01)的18bp模块并向该修饰最小启动子序列中融合入来自RNA35S花椰菜花叶病毒启动子(CaMV)的含有as-1和as-2元件(Lam，1989；Lam等，1989)的44bp序列来制备(图IV)。MPr1110利用1b-PCR技术合成。

单链连续DNA借助以下“定向”寡脱氧核苷酸形成：

-S1＝5′

-S2＝5′

-S5＝5′

CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID16)

-S6＝5′

CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID17)

100微微摩尔(100pmol)寡脱氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl10X激酶缓冲液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下借助15单位的激酶(Amersham)5′磷酸化30分钟。这些磷酸化的寡脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。为了连接“定向”寡脱氧核苷酸，使用以下“引导”寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID19)

-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID20)

-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID22)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化“定向”寡脱氧核苷酸S1、S2、S5和S6在10pmol的“引导”寡脱氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq10X DNA连接酶缓冲液和40单位Taq DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下连接。该连接反应以GeneAmp PCR System 9700热循环(PerkinElmer，Norwalk，USA)进行。它的组成为：94℃下1分钟，1个循环；和8个相同循环，各自由下列步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在Qiaquick柱上纯化。

最后，所得单链DNA的PCR扩增以GeneAmp PCR System 9700热循环在各100pmol下列寡脱氧核苷酸探针5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下进行。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、56℃下30秒杂交步骤和72℃下1分钟延伸步骤组成的25个循环，然后进一步在72℃下延伸5分钟。

该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI酶消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI酶消化1小时，最后在Qiaquick柱上纯化。将它们插入到已在37℃下用BamHI酶消化1小时然后在37℃下用PstI酶消化了1小时的质粒pGEM3Z-petE/IV2中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在Qiaquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl“缓冲液3”10X(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在Qiaquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如上所述处理的25ng质粒和100ng通过PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接触1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。质粒pMRT1110带有的启动子序列MPr1110通过测序检定(SEQ.ID07)。

3.3.启动子MPr1111的构建：

启动子MPr1111通过在MPr1098(SEQ.ID04)的-99bp位插入含有“G”盒(从petE启动子的-204bp位延伸至-186bp位，SEQ.ID01)的18bp元件并向该最小启动子中融合入对应于CaMV 35S的as-2元件(Lam和Chua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)的复本的58bp序列来制备。MPr1111(图IV)利用如前所述的lb-PCR技术合成。

单链连续DNA使用以下“定向”寡脱氧核苷酸产生：

-S1＝5′

-S2＝5′

-S5＝5′

-S7＝5′

CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID18)

100微微摩尔(100pmol)寡脱氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl10X激酶缓冲液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下通过使用15单位的激酶(Amersham)在5′区中磷酸化30分钟。这些磷酸化的寡脱氧核苷酸通过用适当体积的苯酚萃取、然后用适当体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最终用适当体积的氯仿∶异戊醇(24∶1 v/v)萃取而纯化，接着用1/10体积的3M醋酸钠pH4.8和2.5体积的无水乙醇在-80℃下沉淀20分钟，然后以16060g离心30分钟。沉淀的寡脱氧核苷酸用70％乙醇洗涤，干燥，然后以10pmol/μl的浓度再悬浮于水中。为了连接“定向”寡脱氧核苷酸，使用以下“引导”寡脱氧核苷酸：

-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID19)

-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID20)

-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID22)

为了进行LCR反应，10pmol的磷酸化“定向”寡脱氧核苷酸S1、S2、S5和S7在10pmol的“引导”寡脱氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和40单位Taq DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下连接。该连接反应以GeneAmp PCRSystem 9700热循环(Perkin Elmer，Norwalk，USA)进行。它的组成为：94℃下1分钟，1个循环；和8个相同循环，各自由下列连续步骤组成：65℃下1分钟，57℃下1分钟，52℃下1分钟，48℃下1分钟，43℃下1分钟和最后37℃下10分钟。然后该连接反应混合物按照供应商的建议在Qiaquick柱上纯化。

最后，所得单链DNA的PCR扩增以GeneAmp PCR System 9700热循环在各100pmol寡脱氧核苷酸探针5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下进行。该DNA在94℃下变性5分钟，接受各自由在95℃下30秒变性步骤、56℃下30秒杂交步骤和72℃下1分钟延伸步骤组成的25个循环，然后继续在72℃下延伸5分钟。

该反应混合物的DNA片段在37℃下用20单位的BamHI消化45分钟，然后在37℃下用20单位的PstI消化1小时，最后在Qiaquick柱上纯化。将它们插入到事先已在37℃下用BamHI酶消化1小时然后在37℃下用PstI酶消化了1小时的质粒pGEM3Z-petE/IV2中，接受0.8％琼脂糖凝胶电泳，在Qiaquick亲和柱上纯化，在37℃下在12μl“缓冲液3”10X(New England Biolabs)和5000单位的小牛肠碱性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小时，最后在Qiaquick亲和柱上纯化。为了进行连接，使如上所述处理的25ng质粒和100ng通过PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接触1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得两个质粒pMRT1111和pMRT1112进行测序。质粒pMRT1111含有预期启动子MPr1111(SEQ.ID08)，而在质粒pMRT1112中，启动子MPr1112(图IV)与MPr1111的不同在于缺失了从-127位延伸至-89位的含有“G”盒的35bp和位于-78和-76位的2bp(SEQ.ID09)。

3.4.启动子Mpr1153的构建

启动子MPr1153(图IV)通过将petE启动子的从-582bp位延伸至-510bp位并带有“as-1样”和“nos增强子样”元件的78bp序列(SEQ.ID01)融合到通过附加含有“G”盒的18bp元件进行了修饰的启动子Mpr1098中得到。

为此，质粒pMRT1111在37℃下用20单位的PstI酶和1单位的DraIII酶消化1小时。由此缺失了含有CaMV的2个“as-2”元件和“as-1”元件的72bp片段的质粒用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。含有petE启动子的2个“as-1样”元件和“nos增强子样”元件的78bp PstI/DraIII片段通过10μg质粒pMRT1108用20单位的PstI酶和1单位的DraIII酶在37℃下消化1小时而产生，然后该片段利用Nu-Sieve 3％琼脂糖凝胶电泳(FMC，Rockland，USA)分离并最终在Quiaquick亲和柱上纯化。

连接用20ng载体pMRT1111 pstI/DraIII和80ng 78bp片段在18℃下在10μl反应混合物中在1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1153，启动子序列MPr1153(SEQ.ID10)通过测序检定。

3.5.启动子MPr1143的构建

启动子MPr1143(图IV)通过除去带有MPr1111的“as-2，as-2，as-1”元件的72bp序列得到。这通过下列步骤实现：质粒pMRT1111在37℃下同时用20单位的PstI酶和1单位的DraIII酶消化1小时。由此缺失了含有CaMV的2个as-2元件和as-1元件的70bp片段的质粒用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。该片段的末端按照供应商的建议通过Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用钝化。该片段在18℃下在含有20ng载体、1.0μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)的10μl反应混合物中再连接1夜。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。这些克隆之一的启动子序列MPr1143(SEQ.ID11)通过测序检定。

实施例4

含有启动子MPr1151、MPr1149、MPr1170和Mpr1092的双元质粒的构建

对于含有MPr1111、MPr1098、MPr1143和MPr1092的各种表达框来说双元载体的制备是相同的。25μg量的质粒pGA492(An，1986)用80单位的HindIII酶在37℃下消化1小时，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。该质粒的5′突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。由此修饰的质粒用80单位的EcoRI酶在37℃下消化1小时，然后所得缺失了291bp片段的载体在0.7％琼脂糖凝胶上分离，并在Qiaquick亲和柱上纯化。

4.1.pMRT1151的生产

表达框“MPr1111/uidA-IV2/nos term”插入双元质粒pGA492的修饰HindIII位点。它从事先用80单位的PstI酶在37℃下消化1小时并在Qiaquick亲和柱上纯化的质粒pMRT1111得到。该质粒的5′突出端按照供应商的建议使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)钝化。由此修饰的质粒用80单位的EcoRI酶在37℃下消化1小时，然后对应于表达框的2.5kb DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离并在Qiaquick亲和柱上纯化。

连接通过将100ng如上所述制备的双元质粒pGA492和50ng表达框在18℃下以20μl的反应体积在2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下混合在一起过1夜来进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了四环素(12mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化以及通过借助从双元质粒的转化DNA选出的寡脱氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和从uidA序列周围的表达框选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因扩增加以分析。所得克隆命名为pMRT1151。

4.2.双元质粒pMRT1149的生产

表达框“MPr1143/uidA-IV2/nos term”按照与对质粒pMRT1151所述的相同的方案在双元质粒pGA492的修饰HindIII位点克隆，不同的只是该表达框从质粒pMRT1143分离。所得克隆命名为pMRT1149。

4.3.双元质粒pMRT1170的生产

表达框“petE启动子/uidA-IV2/nos term”按照与对质粒pMRT1151所述的相同的方案在双元质粒pGA492的修饰HindIII位点克隆，不同的只是该表达框从质粒pGem3Z-petE/IV2分离。

4.4.双元质粒pGA492MPr1092的生产

将启动子片段MPr1092和”uidA-IV2/nos term”序列插入如上所述制备的双元质粒pGA492中。这两个片段以下列方式制备：

CaMV D35S启动子通过10μg质粒pJIT163Δ在37℃下用40单位的KpnI酶消化1小时而分离。该线型化质粒的末端按照制造商的建议借助6单位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃下钝化30分钟。由此修饰的质粒在Qiaquick亲和柱上纯化，然后用80单位的HindIII酶在37℃下再消化1小时。对应于该启动子的743bp片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

“uidA-IV2/nos term”序列通过4μg质粒pMRT1092用40单位的HindIII酶和EcoRI酶消化1小时而得到。对应于序列“uidA-IV2/nosterm”的2.2kb片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。

这三个片段之间的连接通过将100ng双元质粒、50ng启动子片段和50ng对应于“uidA-IV2/nos term”序列的片段以20μl的反应体积、在2μl T4 10X DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下混合而进行。培养通过使连接混合物经受198个各自由“在30℃下培养30秒和在10℃下培养30秒”组成的循环而以热循环进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细胞用一半连接反应混合物转化。在添加了四环素(12mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，并通过酶消化以及借助从双元质粒的转化DNA选出的寡脱氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和从“uidA”序列中的表达框选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′进行的基因扩增加以分析。保留的克隆之一命名为pGA492MPr1092。

4.5.双元质粒pMRT1182的生产

双元质粒pMRT1182通过在双元质粒pMRT1118中插入启动子片段CaMV D35S和序列uidA-IV2/term-nos得到。质粒pMRT1118在以本申请人的名义于1999年9月3日提交的法国专利申请FR9911112中作了充分描述，该申请的具体说明结合在此作用参考。双元质粒pMRT1118(5971pb)通过利用AvrII酶消化将T-DNA片段引入到另一个去磷酸化质粒(该质粒也在同一申请人的前述在先申请中作了充分描述，并命名为pMRT1106，该文也具体结合在此作为参考)的AvrII位点中得到。为了实现插入，pMRT1106质粒DNA(5μg)用AvrII酶消化，借助《QIAquick PCR Purification》试剂盒纯化，然后用50单位的小牛肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)以120μl终反应混合物体积在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)的存在下在37℃下去磷酸化1小时，通过电泳在0.6％琼脂糖凝胶上在TBE缓冲液中分离，用《QIAquick GelExtraction》试剂盒纯化，在上述条件下用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化1秒钟，最后用《QIAquick PCR Purification》试剂盒纯化并转移到50μl H2O中。

PCR连接反应用32.5ng经过消化的去磷酸化质粒pMRT1106和50ng的以10μl反应混合物体积在1μl T4 10x DNA连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行了消化的T-DNA片段进行。连接包含各自包括2个步骤的180个循环，第一个是在《GeneAmp PCR System 9700》热循环中在10℃下进行30秒，第二个步骤是在30℃下进行30秒。

转化先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取(Bimboim et Doly，1979)并通过酶消化和测序加以检定。所得质粒命名为pMRT1118。

启动子CaMV D35S通过10μg质粒pJIT163Δ在37℃下连续用KpnI和HindIII酶消化1小时而分离。对应于CaMV D35S的743bp片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。“uidA-IV2/nosterm”序列通过质粒pMRT1092用40单位的HindIII和EcoRI酶消化1小时而得到。对应于所需序列的2.2kb片段在0.8％凝胶琼脂糖上分离，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。平行地，10μg双元质粒pMRT1118在37℃下连续用KpnI和HindIII酶消化1小时。该线型化载体片段然后在3X缓冲液的存在下在37℃下用40单位的小牛肠碱性磷酸酶(NewEngland Biolabs)去磷酸化1小时。连接在100ng双元质粒、50ng CaMVD35S片段和50ng对应于“uidA-IV2/term-nos”的片段的存在下以20μl的反应体积、在T4(lX)DNA连接酶缓冲液和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)的存在下进行。培养如前所述以“GeneAmp PCRSystem 9700”热循环通过PCR循环进行。先前制备的有活力且感受态的大肠杆菌DH5α细菌用一半连接反应混合物转化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取并通过酶消化进行分析。所得质粒命名为pMRT1182。

质粒pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170和pMRT1182按照Holsters等(1978)描述的技术转移到根癌农杆菌菌株LBA4404中。在添加了利福平(50mg/l)和四环素(5mg/l)的LB培养基上选出的所得克隆的质粒DNA按照碱裂解法提取，通过向细胞再悬浮缓冲液中加入溶菌酶(25mg/ml)进行修饰。所得质粒DNA通过酶消化以及借助从双元质粒的转化DNA选出的寡脱氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′和从“uidA”序列周围的表达框选出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′进行的基因扩增加以分析。所得农杆菌克隆用于进行农杆菌介导的植物遗传转化。

实施例5

使用瞬时表达技术测量和对比不同启动子的表达水平。

5.1烟草的体外培养物，叶制剂。

瞬时表达实验用6周大的烟草叶(Nicotiana tabacum L.)品种bpD6进行。烟草cv.bpD6的成熟种子在饱和次氯酸钙溶液(70g/l)中灭菌10分钟，然后用无菌去离子水冲洗三次5分钟。将这些无菌种子置于MS20培养基(Murashige和Skoog，1962)上并在培养室中培养6周(恒温24℃，光周期为16小时阴暗/8小时光，发光强度为200μmol光子.m^-2.sec^-1)。

为了避免叶肉细胞在转化过程中分裂，在用基因枪转化前24小时从6周大的烟草植物bpD6上切下几片主叶，并将其面朝上附着地置于温和的质壁分离BY3培养基上(MS盐4，4g/l，肌醇100mg/l，硫胺1mg/l，KH₂PO₄200mg/l，蔗糖30g/l，山梨糖醇45，5g/l，2，4 D 1mg/l，pH5.8)。

5.2.用嵌合构建物的DNA包被的金颗粒

基因枪转化需要优先将DNA包被到直径为0.6mm的球形金珠上，这些金珠已用无水乙醇(99.98％，小于0.02％的水)灭菌10分钟，用无菌去离子水洗涤4次，并最终在最高-20℃下在50％甘油溶液中储存最多4周。

在转化过程中所用的所有对照和实验质粒的浓度都调节至1mg/ml。在每个转化实验中，共同转化内部参比对照(pCaMV35Sluc)，以使不同实验间GUS活性的差异正常化(Leckie等，1994)。

DNA向事先制备好的金珠上的包被在无菌容器中在层流条件下进行。1.8mg无菌珠粒在30μl 50％甘油中的悬浮液试样在涡旋机中充分混合1分钟，然后与含有4μg要测试的质粒之一和2μg参比质粒pCaMV35Sluc的20μl DNA悬浮液一起混合10秒。然后加入20μl 2.5MCaCl₂并用力混合10秒。接着向该混合物中加入20μl 0.1M亚精胺并将整个混合物在涡旋下再搅拌30秒。这些珠粒通过将该混合物在冰中培养15分钟继续进行DNA包被，然后包被的珠粒以低速率离心5秒并用无水乙醇洗涤两次。洗涤后，将这些包被的珠粒再悬浮于32μl无水乙醇中，接受超声处理三次，每次2秒钟，在涡旋机中用力混合15秒，然后立即在按照制造商的建议制备的Biolistic PDS-1000/He系统(BioRad，Hercule，USA)中所用的无菌大载体圆盘上分成4等份试样。大载体支持物和带有沉积珠粒的大载体的整个排列放置干燥5分钟。

5.3烟草叶组织的轰击和瞬时表达

按照一般制造商(BioRad，Hercule，USA)关于装置的不同组件的操作和装配的建议借助Biolistic PDS-1000/He系统进行对烟草叶的轰击。每片叶子用下列条件连续轰击两次：

-用于加速金珠的氦压等于6200kPa(900psi)。

-将植物样品置于距离珠粒加速区9cm处。

-轰击在27mm汞的真空中进行。

轰击完后，将这些叶子置于BY3培养基中并在培养室中在黑暗中在24℃下培养48小时。这种培养使得引入到细胞中的转基因能够瞬时表达。

5.4使用组织化学染色评估不同启动子的活性

β-葡糖醛酸糖苷酶表达的揭示如Jefferson等(1987)所述通过组织化学染色进行。在培养室中培养48小时后，将每片叶子沿着中棱轴切成两半。半片叶子在β-葡糖醛酸糖苷酶染色缓冲液(5-溴，4-氯，3-吲哚基葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)500mg/l，在0.1M，pH7.0磷酸盐缓冲液中的0.05％ Triton x100)中在37℃下培养48小时，而另半片在液氮中冷冻，然后保存在-80℃下。

染色后，通过将这些叶子分别浸到两份95％乙醇浴中3小时和12小时进行漂白，然后用蒸馏水冲洗并在两张玻璃纸之间平展干燥。

不同构建物的启动子活性通过每片叶子在用总量为2μg的带有GUS报道基因的DNA轰击两次后所显示出的蓝色斑点的数量来评估。

鉴定出三类启动子。用启动子MPr1096、MPr1098、MPr1108、MPr1109、MPr1143和MPr1153轰击的叶子都显示出平均小于30个蓝色斑点。用启动子petE、MPr1097和MPr1110轰击的叶子都显示出在50至150之间的蓝色斑点数。最后，用MPr1111和参比启动子MPr1092轰击的叶子有非常大的平均蓝色斑点数，一般大于200。

总之，嵌合启动子MPr1110和MPr1111使得β-葡糖醛酸糖苷酶能够以大于或等于用整个petE启动子达到的水平进行表达；且MPr1111显示出至少比得上用强组成型参比启动子D35S prom得到的启动子活性。

5.5.利用发光酶测定量化不同启动子对β-葡糖醛酸糖苷酶的表达

将冷冻的半片叶子在乳钵中磨碎，然后让这些粉末以1ml缓冲液对200mg植物组织的比例融解在提取缓冲液(Tris磷酸盐25mM pH7.8，二硫苏糖醇2mM，1，2-二氨基环己烷N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中。使该混合物均匀后在冰中培养15分钟，然后通过以16060g离心5分钟使澄清。

借助“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供应商的建议测量20μl澄清的粗制叶提取物的GUS活性。光发射的测量借助Lumat LB-9507发光计(EGG-Berthold，BadWildbad，Germany)进行。

借助“荧光素酶测定系统”检测试剂盒(Promega Corp.，Madison，USA)按照供应商的建议测量20μl粗制叶提取物的荧光素酶活性。光发射的测量借助Lumat LB-9507发光计完成。

结果呈现在图V中。对于每项实验(1片受过轰击的叶子＝1份粗提物)，计算利用发光计测量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和荧光素酶活性间的比例。确定所给构建物不同实验的均值和平均标准误差。

这些启动子可以按照从最弱(第1组)开始到最强表达(第6组)的递增顺序分成6组：

-第1组包括启动子MPr1108和MPr1109(图IV)。由这些启动子带来的表达似乎与用不含启动子的构建物pMRT1144(图I)得到的区别非常小。“as-1样”和“nosE样”盒融合到最小启动子MPr1098(图IV)中得到MPr1108，这只稍微降低了由MPr1098促进的平均表达。该结果似乎提示由这些盒和它们在MPr1108中的位置引起的抑制剂作用非常小。启动子MPr1109带来基本上与用启动子Mpr1108得到的相同的表达。位于转录起始位点下游、即5’未翻译区的序列的缺失看来没有改变用Mpr1108得到的表达。

-第2组包括启动子MPr1098、MPr1143和MPr1112(图IV)。启动子MPr1098和MPr1143显示出近似活性。启动子MPr1143从在最小启动子MPr1098中距离“CAAT”盒36bp的“G”盒的插入得到。这种盒的出现看来对用启动子MPr1098得到的表达没有明显作用。启动子MPr1112包括“CAAT”盒的上游，“as-2”盒的复本，接着是来源于CaMV的启动子35S的“as-1”盒。这些元件自己看来无助于表达率的提高，它们带来的表达率与用启动子Mpr1098得到的基本上相同。

-第3组包括启动子MPr1096和MPr1097(图IV)。由这两种启动子带来的表达是相同的。MPr1096是通过带有“nosE样”盒的片段SphI-SpeI和带有来自petE启动子(图IV)的序列增强子的1个区域的MPr1097的SpeI-SpeI的缺失得到的，这种缺失看来不影响表达率。在启动子MPr1096中，在31bp petE序列增强子的前面并在距离“CAAT”盒122bp处的“G”盒的存在看来使得用MPr1098得到的表达率增加了2.5倍。应当注意到MPr1143的情况，在28bp petE序列增强子前面在距离“CAAT”盒36bp处的“G”盒的存在没有使用MPr1098得到的表达率增加。因此，似乎“G”盒和“CAAT”盒之间的距离会影响表达率。

-第4组包括用作参照的启动子petE(图IV)。

-第5组包括启动子MPr1110(图IV)。在启动子MPr1143的上游as-2和as-1盒的融合得到了启动子MPr1110，这使得表达率有相当大的增加，比用petE启动子得到的高很多(高1.4倍)。看来“G”、“as-1”和“as-2”盒一起对表达有积极的正向协同作用。

-第6组包括启动子MPr1111(图IV)和MPr1092(图1)。启动子MPr1111带来与参比双35S CaMV启动子(MPr1092)类似的表达率。“as-2”元件或盒的加入大大增加了相对于用MPr1110得到的表达率(增加了1.7倍)。这些元件看来协同起作用。“as-2”盒的复本也增加这种作用。总之，嵌合启动子MPr1110使得β-葡糖醛酸糖苷酶能够以平均大于或等于整个petE启动子的水平表达。启动子MPr1111具有比得上用参比启动子D35S得到的平均活性的启动子活性。

这些结果与用相同启动子轰击的叶子的组织化学染色后观察到的那些结果一致。

CaMV D35S启动子在文献中一般报道为是强启动子。本发明的嵌合启动子使GUS报道基因的启动子活性比参比启动子CaMV 35S(Kay等，1987)的增加了8-12倍。另外，Mpr1111构成了迄今所述的烟草叶中最具活性和最强的嵌合启动子之一。较小强度的启动子可以用作与编码选择试剂的基因有关的启动子，例如为了赋予抗生素抗性，例如用和“nos”型启动子相同的方式。

实施例6

稳定转化后不同启动子在烟草中的表达

6.1.在烟草中的稳定转化

烟草(Nicotiana tabacum L.，品种bpD6)的转化通过按照Horsch等(1985)描述的方法用重组农杆菌感染6周大的从烟草植物分离的叶片来进行。转化期间，陪替氏培养皿在培养室中在下列条件下培养：温度为24℃，光周期为8小时黑暗/16小时光，发光强度为200μmol光子.m-2.sec^-1，且除了开始的共培养步骤以外，整个callogenesis、再生和生根步骤都在添加了Augmentin(400mg/l)和卡那霉素(200或100mg/ml)的不同选择培养基上进行；

所用的不同步骤和培养基如下：

-共培养步骤持续3天，在用农杆菌感染植物细胞期间，在添加了1mg/l苄氨基嘌呤和0.1mg/l吲哚-3乙酸的固体MS30共培养基(添加了维生素(Gamborg等，1968)4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖30g/l、琼脂8g/l(Merck)，pH5.7的基于MS的培养基(Murashige和Skoog，1962))上进行。

-芽尖形成步骤在培养室中持续4周，在添加了1mg/l苄氨基嘌呤、0.1mg/l吲哚-3乙酸、400mg/l Augmentin和200mg/l卡那霉素的固体MS20再生培养基(盐和维生素MS 4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖20g/l、琼脂8g/l(Merck)，pH5.7)上进行。

-发育和生根步骤持续3周，在培养室中在添加了400mg/lAugmentin和100mg/l卡那霉素的固体MS20发育培养基上进行。

-移植到玻璃盆中的步骤在培养室中在添加了400mg/lAugmentin和100mg/l卡那霉素的固体MS20发育培养基上进行。

6.2.在烟草植物中稳定表达后嵌合启动子活性的比较

初级转化体转移到温室中后第2、4、6、8和10周时测量其中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。对于每个植物，取3份样品并汇集在试管中。一份样品取自“老化”叶(位于基底的叶子)，一份来自成熟叶(位于中部的叶子)，一份来自位于植物顶端的幼叶。

每份样品在液氮下在乳钵中磨碎，将这些粉末以1ml缓冲液对200mg植物粉末的比例再悬浮于提取缓冲液(Tris磷酸盐25mM pH7.8，二硫苏糖醇2mM，1，2-二氨基环己烷，N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中。使该物质均匀后在冰上培养15分钟，然后通过以16060g离心5分钟使澄清。

借助“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照制造商的建议测量20ml澄清的粗提物的GUS活性。光发射的测量使用Lumat LB-9507发光计(EGG-Berthold，Bad Wildbad，Germany)进行。

粗提物中的蛋白质总量通过Bradford技术(Bradford，1976)使用“BioRad蛋白质测定”试剂(BioRad，Munchen，Allemagne)按照制造商的建议进行评定。

不同种类植物中的报道基因活性用每种构建物的20个转化体并在植物生长和发育的整个期间进行分析。分析不在每个浓度下进行，因为所给种类的不同转化体中的随机插入位点和拷贝数不同。

嵌合启动子MPr1111的结果与原始pPetE启动子、最小MPr1143和参比MPr1092启动子的结果进行比较，这显示在图VI中。

MPr1092参比植物中的GUS活性与在用基于质体蓝素的启动子转化的植物中观察到的相比显示出相当小的变化。植物转移到温室中后2至4周之间活性稍有降低；在6周时增加约4倍，8周时再次下降至4周时观察到的值，最后在10周时稍有增加。对基于质体蓝素的启动子的分析显示：无论考察的是哪种启动子或植物，GUS活性有规律地在转移到温室中后从第2至6周增加，而在之后直到开花又下降。

GUS活性的这种表现与植物的发育相关，因为质体蓝素基因活跃地在光合组织中表达。因此pPetE和衍生启动子的活性遵循植物的活跃生长期，是从转移到温室中开始到适应环境后6-8周期间，接下来是从第8周直到开花的植物的缓慢发育期，这出现在转移到温室中后的10-12周。与此对照，已知是高活性组成型启动子的参比MPr1092启动子较小依赖于这些与发育有关的作用。

带有嵌合启动子MPr1143和带有参比MPr1092的转化体的比较显示，无论在发育的哪个阶段，“MPr1143植物”都显示出与“D35S植物”相比非常低的GUS活性。这些数据表明MPr1143只能驱动在基础水平上的报道基因的最小表达，并证实了瞬时表达实验得到的结果，该结果显示“G盒”自身插入到最小pPetE序列中不足以有效地促进表达。

带有原始pPetE启动子的转化体与参比“MPr1092植物”的比较显示：植物转移到温室中后2周时，pPetE与参比物活性相同，在活跃的发育期间(从2至8周)活性要高3至4倍。这两种启动子之间的差异有规律地从转移后的6周开始减小，在第10周时反转，因为参比植物显示出的平均活性比“pPetE植物”的大两倍。这些数据没有证实瞬时表达后得到的结果，在瞬时表达实验中pPetE的活性比MPr1092的小2.5倍。

“MPr1111植物”与带有pPetE的那些植物间的比较显示：直到第6周MPr1111的活性都比pPetE的平均低2至3倍，从那以后活性至少相同。在第8和第10周时，有一些“MPr1111个体”确实比“PetE个体”更具活性。在这种程度上，稳定表达与瞬时表达相比导致了不同的结论，在瞬时表达中MPr1111比pPetE的活性平均高2.5倍。在植物转移到温室中后在从第4周到第8周的生长发育期里初级转化体中的MPr1111显示出比参比MPr1092更具活性，在第8周时活性最大高了2至3倍。

在这些时间过程分析的基础上，我们可以得出结论：启动子各自的强度在植物的整个生长过程中不是静止不变的，这可能是因不同的调节过程导致的。MPr1111是驱动报道蛋白GUS在植物转移到温室中后第8周时以最高水平表达的启动子，因此看来是在烟草发育的这一阶段用于大量异源蛋白的表达的最佳候选者。

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序列表<110>默里斯坦治疗公司(MERISTEM THERAPEUTICS)<120>嵌合启动子，它们的生产方法，以及含有它们的框、载体和转基因植物<130>嵌合Ppc启动子<140><141><160>22<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>834<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(834)<223>豌豆质体蓝素基因的petE启动子的整个序列<300><301>Last，D.I.

Gray，J.C.<302>质体蓝素是由豌豆单倍体基因组中的单拷贝基因编码的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特导性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>1aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga actagtggat ctatgcaact tacaacgtgc 60actcgcggag gattggacgt gtgcaactta caacgtacgc attgttcgtc catacaatag 120tgtagaattg gacatgtgca acttacaaca tgtgcaactt acaacgtgcg ctcgcggagg 180aatgtgaagt tgaacacgta caacttacgt catttgtgca tgcagaagca tagagctgag 240cacacaattc ataatttgaa ggacacatga tttgctataa agaactcttt agaagtacca 300caactttgac tgagtttgat atagctaata aagatggagc tcattataat ttgaatggca 360taatcaagct aaacgaacaa gcttagttaa tcatgttaaa caacaattct ttgtaataat 420aaattgtctt tcaactagtc caagtttatg agttgattct tcggaataaa ttagaaaata 480tcttagactt tatacttcat tgattatttc atagagcaag taggagaaat aaaaatatac 540tagtattatt tactaaaaaa aatctaagcc acgtcggagg ataacatcca acccagccaa 600tcacagcaat gttcatcaga taacccactt taagcccacg cactctgtgg cacatctaca 660ttatctaaat cacatattct tccacacatc ttagccacac aaaaacccaa tccacatctt 720tatcatccat tctataaaaa atcaccttct gtgtgtctct ctttcgattc ccttcaaaca 780catacaaatt cagtagagaa gaaactcatt actcttgaga aacctagagg atcc 834<210>2<211>623<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(623)<223>启动子MPr1097从启动子petE通过重复反向序列以及212bp Sph1片段上带有的

as-1样盒的5′缺失得到<220><223>启动子MPr1097<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>2aagcttgcat gcagaagcat agagctgagc acacaattca taatttgaag gacacatgat 60ttgctataaa gaactcttta gaagtaccac aactttgact gagtttgata tagctaataa 120agatggagct cattataatt tgaatggcat aatcaagcta aacgaacaag cttagttaat 180catgttaaac aacaattctt tgtaataata aattgtcttt caactagtcc aagtttatga 240gttgattctt cggaataaat tagaaaatat cttagacttt atacttcatt gattatttca 300tagagcaagt aggagaaata aaaatatact agtattattt actaaaaaaa atctaagcca 360cgtcggagga taacatccaa cccagccaat cacagcaatg ttcatcagat aacccacttt 420aagcccacgc actctgtggc acatctacat tatctaaatc acatattctt ccacacatct 480tagccacaca aaaacccaat ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg 540tgtgtctctc tttcgattcc cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta 600ctcttgagaa acctagagga tcc 623<210>3<211>326<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(326)<223>启动子MPr1096从启动子petE通过由两个SpeI 403bp片段带有的“as-1样”

和“增强子样”元件和重复反向序列5′缺失得到<220><223>启动子MPr1096<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>3aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga actagtatta tttactaaaa aaaatctaag 60ccacgtcgga ggataacatc caacccagcc aatcacagca atgttcatca gataacccac 120tttaagccca cgcactctgt ggcacatcta cattatctaa atcacatatt cttccacaca 180tcttagccac acaaaaaccc aatccacatc tttatcatcc attctataaa aaatcacctt 240ctgtgtgtct ctctttcgat tcccttcaaa cacatacaaa ttcagtagag aagaaactca 300ttactcttga gaaacctaga ggatcc 326<210>4<211>207<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(207)<223>207bp的启动子MPr1098只含有“TATA”和“CAAT”盒并对应于启动子petE

上的最小参照启动子<220><223>启动子Mpr1098<300><301>Last，D.I.

Gray，J.C.<302>质体蓝素是由豌豆单倍体基因组中的单拷贝基因编码的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989300><30l>Pwee，K.H.

Gray，JohnC.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>4aagcttgcat gcctgctctg tggcacatct acattatcta aatcacatat tcttccacac 60atcttagcca cacaaaaacc caatccacat ctttatcatc cattctataa aaaatcacct 120tctgtgtgtc tctctttcga ttcccttcaa acacatacaa attcagtaga gaagaaactc 180attactcttg agaaacctag aggatcc 207<210>5<21l>28l<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(281)<223>启动子MRr1108通过将带有“as-1样”和“nos增强子样”元件的启动子petE

的72bp序列融合到MPr1098的187bp的最小启动子序列中而得到<220><223>启动子MPr1108<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>5aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg caatctaatt atctaaatca 120atattcttcc acacatctta gccacacaaa aacccaatcc acatctttat catccattct 180ataaaaaatc accttctgtg tgtctctctt tcgattccct tcaaacacat acaaattcag 240tagagaagaa actcattact cttgagaaac ctagaggatc c 281<210>6<211>250<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(250)<223>启动子MPr1109与MPr1108的不同在于缺失了5′UTR中的33bp，

+1点上游11bp<220><223>启动子MPr1109<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>6aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg cacatctaca ttatctaaat 120cacatattct tccacacatc ttagccacac aaaaacccaa tccacatctt tatcatccat 180tctataaaaa atcacctttg tgtgtctctc tttcgattcc cttcaaacac atgagaaacc 240tagaggatcc 250<210>7<211>280<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(280)<223>启动子MPr1110通过在MPr1098的-99bp位插入含有“G”盒的18bp元件

并通过融合RNA 35S CaMV启动子的44bp序列而得到<220><223>启动子MPr1110<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>7aagcttgcat gcctgcagac tagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 60cgcatgccac tctgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 120tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 180taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 240agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 280<210>8<211>303<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(303)<223>启动子MPr1153通过融合从-582位延伸至-510bp位的通过加入“G”盒进行了

修饰的启动子petE的78bp序列而得到<220><223>启动子MPr1153<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>8aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg cacatctaca ttatctaaat 120ctaagccacg tcggaggata acatattctt ccacacatct tagccacaca aaaacccaat 180ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg tgtgtctctc tttcgattcc 240cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta ctcttgagaa acctagagga 300tcc 303<210>9<211>296<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(296)<223>启动子MPr1111通过在MPr1098的-99bp位插入含有“G”盒的18bp元件并融合

58bp序列(as2和as1元件的复本)而得到<220><223>启动子MPr1111<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>9aagcttgcat gcctgcagac tagtgattga tgtgatatca agattgatgt gatatctcca 60ctgacgtaag ggatgacgca tgccactctg tggcacatct acattatcta aatctaagcc 120acgtcggagg ataacatatt cttccacaca tcttagccac acaaaaaccc aatccacatc 180tttatcatcc attctataaa aaatcacctt ctgtgtgtct ctctttcgat tcccttcaaa 240cacatacaaa ttcagtagag aagaaactca ttactcttga gaaacctaga ggatcc 296<210>10<211>220<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(220)<223>启动子MPr1143(图II)通过除去MPr1111的带有元件“as-2，as-2，as-1”的

72bp序列而得到<220><223>启动子MPr1143<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>10aagcttgcat gccgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 60tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 120taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 180agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 220<210>11<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S1<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>11ttcccttcaa acacatacaa attcagtaga gaagaaactc attactcttg agaaacctag 60aggatccccg 70<210>12<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S2<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的定向构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>12cacaaaaacc caatccacat ctttatcatc cattctataa aaaatcacct tctgtgtgtc 60tctctttcga 70<210>13<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S3<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的定向构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>13cataatttga acactctgtg gcacatctac attatctaaa tcacatattc ttccacacat 60cttagcca 68<210>14<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S4<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的定向构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>14ggaatctgca gttgaacacg tacaaactta cgtcatttgt gcatgcagaa gcatagagct 60gagcacacaa tt 72<210>15<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S5<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的定向构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>15ctgtggcaca tctacattat ctaaatctaa gccacgtcgg aggataacat attcttccac 60acatcttagc ca 72<210>16<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S6<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的定向构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>16catgctgcag actagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 60act 63<210>17<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向构件S7<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的定向构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>17catgctgcag actagtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc cactgacgta 60agggatgacg catgccact 79<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导构件G1<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的引导构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>18tgtgtttgaa gggaatcgaa agagagacac a 31<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导构件G2<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的引导构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>19gattgggttt ttgtgtggct aagatgtgtg 30<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导构件G3<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的引导构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>20cagagtgttc aaattatgaa ttgtgtgctc agc 33<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引导构件G4<220><223>用于通过1b-PCR构建启动子的引导构件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>21tgtagatgtg ccacagagtg gcatgcgt 28<210>22<211>259<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>(1)..(259)<223>启动子MPr1112与MPr1111的不同在于缺失了含有“G”盒并从-127位延伸至-89位的35bp和缺失了位于-78和-76bp位的2bp<220><223>启动子MPr1112<300><301>Last，D.I.

Gray，John C.<302>豌豆质体蓝素启动子指导转基因烟草植物中的细胞特异性但非全光调节的表达<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>22aagcttgcat gcctgcagac tagtgattga tgtgatatca agattgatgt gatatctcca 60ctgacgtaag ggatgacgca tgccactctg tggcacatct acattatccc acacatctac 120cacacaaaaa cccaatccac atctttatca tccattctat aaaaaatcac cttctgtgtg 180tctctctttc gattcccttc aaacacatac aaattcagta gagaagaaac tcattactct 240tgagaaacct agaggatcc 259

Claims

1、包含至少一个得自豌豆质体蓝素基因启动子的、具有SEQ.ID.No.01所述序列的核酸序列的嵌合表达启动子。

2、按照权利要求1的嵌合启动子，其中得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列选自下列成员：由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

3、包含与至少1个“CAAT”盒、“TATA”盒和转录起始位点(+1)上游操作性或功能性连接的“G”盒的嵌合表达启动子。

4、按照权利要求3的嵌合表达启动子，其中“G”盒位于相对于转录起始位点(+1)的-225位和-65位之间。

5、按照权利要求3的嵌合表达启动子，其中“G”盒位于相对于转录起始位点(+1)的-201位和-115位之间。

6、按照权利要求3的嵌合表达启动子，其中“G”盒位于相对于转录起始位点(+1)的-201位。

7、按照权利要求3的嵌合表达启动子，其中“G”盒位于相对于转录起始位点(+1)的-115位。

8、按照权利要求3的嵌合启动子，其中“G”盒是植物来源的。

9、按照权利要求3的嵌合启动子，其中“G”盒从豌豆质体蓝素基因的启动子得到。

10、按照权利要求3的嵌合启动子，其中“G”盒从豌豆质体蓝素基因的petE启动子得到。

11、按照权利要求3-10任一项所述的嵌合启动子，其中它进一步包含操作性或功能性连接“G”盒上游的“nos E样”盒。

12、按照权利要求3-11任一项所述的嵌合启动子，其中它进一步包含至少一个与“G”盒操作性或功能性连接的“as1”或“as1样”盒。

13、按照权利要求12的嵌合启动子，其中该启动子包含2个或多个邻近或分离排列的“as1”或“as1样”盒。

14、按照权利要求12或13的嵌合启动子，其中该启动子包含4个“as1”或“as1样”盒。

15、按照权利要求12-14任一项所述的嵌合启动子，其中“as1”或“as1样”盒连接所述“G”盒的上游和下游，优选连接其上游。

16、按照权利要求12-15任一项所述的嵌合启动子，其中一个或多个“as1”或“as1样”盒以反向顺序排列，优选以反向重复顺序排列。

17、按照权利要求3-16任一项所述的嵌合启动子，其中它进一步包含至少一个与“G”盒操作性连接的“as2”盒。

18、按照上述权利要求任一项所述的嵌合启动子，其中该启动子包含至少2个或多个“as2”盒，优选4个“as2”盒。

19、按照权利要求18的嵌合启动子，其中所述“as2”盒连接所述“G”盒的上游和下游，优选连接其上游。

20、按照权利要求17-19任一项所述的嵌合启动子，其中一个或多个“as1”或“as1样”盒以反向顺序排列，优选以反向重复顺序排列。

21、按照权利要求3-20任一项所述的嵌合启动子，其中它包含至少一个选自下列成员的核酸序列：由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

22、包含至少一个与要表达的编码要产生的多肽的核酸序列操作性或功能性连接的、得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列的表达框，所述编码核酸序列自身与转录终止核酸序列操作性或功能性连接，其中得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列选自由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

23、分离的启动子核酸序列，其中该序列选自下列成员：由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。

24、用于权利要求1-21或23任一项所述的嵌合表达启动子或分离的启动子核酸序列的定向脱氧核苷酸构件，其中序列选自下列成员：由SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的序列。

25、用于权利要求1-21或23任一项所述的嵌合表达启动子或分离的启动子核酸序列的引导脱氧核苷酸构件，其中序列选自下列成员：由SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的序列。

26、包含能够引发编码要产生的多肽的核酸序列的转录的启动子或启动子核酸序列的载体，其中所述启动子或启动子核酸序列对应于权利要求1-21或23任一项所述的嵌合表达启动子或启动子核酸序列。

27、按照权利要求26的载体，其中该载体选自下列成员：由pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170所述的双元载体。

28、权利要求1-21或23任一项所述的嵌合表达启动子或分离的启动子核酸序列的制备方法，其中它包括以下步骤：

-进行称作LCR的连接链式反应，以从至少一个选自分别由SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的“定向”脱氧核苷酸S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的定向脱氧核苷酸构件和至少一个用于所述启动子核酸序列或启动子的“引导”脱氧核苷酸构件来生产连续单链DNA，所述引导构件选自分别由SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的“引导”脱氧核苷酸G1、G2、G3和G4；

-对从前一步骤得到的单链DNA进行PCR扩增，以生产对应于嵌合表达启动子或启动子核酸序列的双链DNA；

-可选地分离启动子或启动子核酸序列。

29、按照权利要求28的方法，其中脱氧核苷酸构件在连接前磷酸化。

30、按照权利要求28的方法，其中连接在至少一种DNA连接酶的存在下以下列条件下的热循环进行：

-在约94℃下约1分钟的1个循环；

-8个相同循环，每个由以下步骤组成：

31、具有稳定整合到其基因组中的至少一个分别如权利要求1-21或23任一项所述的启动子或至少一个启动子核酸序列的转基因植物。

32、按照权利要求31的转基因植物，其中该植物选自双子叶植物，优选马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油菜籽、甜菜根或向日葵，或选自单子叶植物，优选小麦、大麦、燕麦、稻米或玉米。

33、按照权利要求31或32任一项所述的转基因植物的繁殖体。

34、按照权利要求33的转基因植物繁殖体，其中该繁殖体是种子。

35、含有如权利要求1-21或23任一项所述的启动子或启动子核酸序列的细胞。

36、按照权利要求35的细胞，其中该细胞选自植物细胞、人类细胞、动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞、藻类细胞和真菌细胞，优选是植物细胞。

37、编码要产生的多肽的核酸序列或基因在细胞中的表达方法，其中所述方法包括以下步骤：

-用包含与编码要产生的多肽的核酸序列或基因操作性连接的、如权利要求1-21或23任一项所述的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化细胞，其中所述编码核酸序列自身与转录终止信号操作性连接；

-在使得编码多肽的核酸序列或基因能够表达的条件下培养该转化细胞，由此产生了多肽。

38、按照权利要求37的方法，其中细胞是原核细胞或真核细胞。

39、按照权利要求37或38任一项所述的方法，其中细胞选自微生物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞。

40、按照权利要求37-39任一项所述的方法，其中细胞是植物细胞。

41、权利要求31或32任一项所述的转基因植物或权利要求33所述的繁殖体的生产方法，其中该方法包括以下步骤：

-用包含如权利要求1-21或23任一项所述的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化植物细胞；

-选出具有整合启动子或启动子核酸序列的植物细胞；