FR2791358A1

FR2791358A1 - Promoteurs chimeriques d'expression, cassettes d'expression, plasmides, vecteurs, plantes et semences transgeniques les contenant et leurs methodes d'obtention

Info

Publication number: FR2791358A1
Application number: FR9903635A
Authority: FR
Inventors: Iann Rance; Veronique Gruber; Manfred Theisen
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 1999-03-22
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2000-09-29
Anticipated expiration: 2019-03-22
Also published as: WO2000056906A1; CN1351669A; CA2366228A1; FR2791358B1; JP2002539795A; AU767285B2; AU3185300A; EP1163351A1

Abstract

La présente invention concerne des promoteurs chimériques comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois, la séquence d'acide nucléique étant de préférence dérivée du promoteur petE. L'invention concerne également un procédé pour l'obtention de ces promoteurs, et des cassettes d'expression, vecteurs, et plantes transgéniques les contenant.

Description

PROMOTEURS CHIMERIQUES D'EXPRESSION, CASSETTES D'EXPRESSION, PLASMIDES, VECTEURS, PLANTES ET SEMENCES TRANSGÉNIQUES LES CONTENANT ET LEURS METHODES D'OBTENTION.

[DESCRIPTION] La présente invention concerne des promoteurs chimériques d'expression, destinés notamment à une mise en oeuvre dans le domaine de la biotechnologie végétale.

De manière générale, les promoteurs d'expression sont connus dans le domaine de la biotechnologie et de la manipulation génétique. S'agissant plus particulièrement de la biotechnologie végétale, le taux d'expression d'un gène codant pour un polypeptide à produire dans une cellule hôte est souvent dépendant du promoteur utilisé. Les différents promoteurs utilisés couramment sont souvent limités à des applications ou des tissus particuliers, en raison de leur spécificité tissulaire ou puissance d'expression. On peut, par exemple, citer le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur comme un promoteur relativement fort, comparé par exemple au promoteur provenant du gène nos, ces deux promoteurs étant plus particulièrement utilisés dans le domaine de la biotechnologie végétale. Il existe donc un besoin pour de nouveaux promoteurs permettant de pallier les inconvénients de la mise en oeuvre des promoteurs actuels.

Une tentative de combler ce besoin a été rapportée dans la demande de brevet PCT, publiée sous le numéro WO 97/20056, qui décrit l'augmentation du taux d'expression géniques, en utilisant des "enhancers", (c'est-à-dire ayant un effet positif sur l'activité d'un promoteur), dans des promoteurs connus. Les séquences nucléotidiques des "enhancers" sont riches en bases A et T, la quantité totale de ces bases constituant plus de 50% de la séquence nucléotidique de "l'enhancer". En particulier, les déposants de cette demande préconisent l'utilisation d'une zone "enchancer" provenant du promoteur de la plastocyanine du pois.

Les expressions utilisées dans la description et les

revendications ont la signification suivante : - "acide nucléique" signifie ADN ou ARN ; - "séquence d'acide nucléique" signifie un oligomère ou polymère, simple ou double brin, de bases nucléotidiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', et comprend des plasmides autoréplicants, des gènes, des polymères d'ADN, ou d'ARN, infectieux ou non, et de l'ADN, ou l'ARN, fonctionnel ou non-fonctionnel. Dans la notation nucléotidique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d'une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5' ; - "séquence d'acide nucléique dérivée" signifie que la séquence dérive directement ou indirectement de la séquence à laquelle il est fait référence, par exemple par substitution, délétion, addition, mutation, fragmentation, et/ou synthèse d'un ou plusieurs nucléotides ; - "promoteur" ou "séquence d'acide nucléique promotrice" signifie une région d'acide nucléique en amont du codon de démarrage de la traduction et qui est impliquée dans la reconnaissance et la liaison de l'ARN polymérase et d'autres protéines pour la transcription ; - "promoteur végétal" est un promoteur capable d'initier la transcription dans des cellules végétales ; - "promoteur constitutif" est un promoteur capable d'exprimer des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte pendant tout le développement dudit organisme ; - "promoteur tissulaire spécifique" est un promoteur capable d'exprimer de manière sélective, des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte ; - "liées de manière opérationnelle" signifie la liaison du promoteur, à la séquence d'acide nucléique, ou gène, à exprimer qui code pour une protéine à produire, de telle sorte que le promoteur influence positivement la transcription de la séquence

d'acide nucléique liée. On doit comprendre que la séquence du promoteur inclut également des séquences transcrites entre le site de démarrage de la transcription et le codon de démarrage de la traduction ; - "cassette d'expression" signifie des séquences nucléotidiques capables de diriger l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou d'un gène, codant pour un polypeptide à produire dans un organisme hôte compatible avec de telles séquences. De telles cassettes incluent au moins un promoteur et un signal de terminaison de la transcription, et optionnellement d'autres facteurs nécessaires ou utiles à l'expression ; - "vecteur" signifie des systèmes d'expression, par exemple des projectiles enrobés d'ADN, des véhicules de transit à base d'acides nucléiques, des molécules d'acide nucléique adaptées pour livrer de l'acide nucléique, et de l'ADN circulaire autoréplicant autonome, par exemple plasmides, cosmides, phagemides, etc. Si un micro-organisme ou une culture cellulaire recombinant est décrit comme hôte d'un "vecteur d'expression", ceci inclut de l'ADN circulaire extrachromosomique (tel que par exemple de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique), de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s), le vecteur pouvant être soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, intégré au génome de l'hôte, soit maintenu dans le noyau ou le cytoplasme de l'hôte ; - "plasmide" signifie une molécule d'ADN circulaire autonome capable de réplication dans une cellule, et comprend à la fois les plasmides dits "d'expression" et les plasmides dits "de non-expression". Si un micro-organisme ou culture cellulaire recombinante est décrit comme hôte d'un plasmide "d'expression", ceci comprend à la fois des molécules d'ADN circulaires extrachromosomiques et de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s). Si le plasmide est maintenu par une cellule hôte, le plasmide est soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure

autonome, soit intégré au génome de l'hôte ; - "séquence hétérologue" ou "séquence d'acide nucléique hétérologue" signifie une séquence provenant d'une source, ou d'une espèce, étrangère à son environnement, ou si elle provient du même environnement, a été modifiée par rapport à sa forme originale. La modification de la séquence d'acide nucléique peut avoir lieu par exemple par traitement de l'acide nucléique avec une enzyme de restriction pour générer un fragment d'acide nucléique capable d'être lié de manière opérationnelle à un promoteur. La modification peut également avoir lieu par le biais de techniques comme la mutagenèse dirigée ; - "boîte" signifie une séquence d'acide nucléique à laquelle une fonction régulatrice est imputée ; - "like" signifie que la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique à laquelle ce terme est associé, comporte une certaine identité de séquence ou un consensus avec une boîte et/ou une séquence d'acide nucléique connue dite de référence, de préférence une identité de séquence d'au moins 50%, de manière plus préférée une identité de séquence d'au moins 75%, et plus particulièrement une identité de séquence d'au moins 90% avec la séquence de référence. Le pourcentage d'identité de séquence est calculée sur la base d'une fenêtre de comparaison d'au moins 6 bases nucléotidiques. La détermination d'une fenêtre de comparaison peut être effectuée en utilisant des algorithmes d'alignement de séquences pour déterminer une homologie avec une séquence de référence, par exemple l'algorithme d'homologie locale, l'algorithme d'alignement d'homologie, et l'algorithme de recherche de similitude, ces algorithmes existant également sous forme informatique, connus sous les noms GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA. Le pourcentage d'identité de séquence est obtenue en comparant la séquence de référence avec la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique ; - "située" signifie la position sur une séquence d'acide nucléique d'un élément identifié, tel qu'une "boîte", un site de restriction, ou un codon ayant une fonction particulière. La

position qui est donnée par un chiffre se réfère à la position du début de l'élément dans la séquence d'acide nucléique, dans le sens de la lecture de cette dernière, c'est-à-dire dans le sens 5'->3' ; - "plante transgénique" signifie une plante ayant été obtenue par des techniques de manipulation génétique, et couvre les plantes entières obtenues, leur progéniture, ainsi que les organes végétaux, par exemple les racines, les tiges et les feuilles, obtenus par ces techniques. Les plantes transgéniques selon la présente invention peuvent avoir différents niveau de ploïdie, et peuvent notamment être polyploïde, diploïde, et haploïde ; - "propagule" signifie un amas ou une association de cellules végétales, structuré(e) ou non, permettant la régénération d'une plante entière, par exemples des explants, des cals, des tiges, des feuilles, des racines, des boutures, et même des semences.

La demanderesse de la présente invention a pris une approche différente de celle du déposant de la demande PCT discutée préalablement. En effet, la demanderesse de la présente invention a réussi, et ce de manière surprenante, à produire des promoteurs chimériques permettant de satisfaire au besoin décrit précédemment, et notamment permettant d'augmenter le taux d'expression d'un gène ou d'une séquence d'acide nucléique, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule hôte, et notamment une cellule végétale, par rapport aux promoteurs existants les plus couramment utilisés. Par ailleurs, la demanderesse a réussi en même temps à produire une gamme de promoteurs de manière à pouvoir choisir celui qu'il convient d'utiliser selon l'application envisagée et l'environnement de sa mise en oeuvre, et ainsi de pouvoir contrôler en quelque sorte le taux d'expression d'un gène à exprimer codant pour un polypeptide à produire.

Par conséquent, un objet de la présente invention est un promoteur chimérique d'expression comprenant au moins une

séquence d'acide nucléique dérivée d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois.

De préférence, le promoteur chimérique comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE du gène de la plastocyanine de pois dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ. ID01. De manière plus préférée, la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en l'une quelconque des séquences identifiée sous les numéros SEQ. ID02, SEQ.ID03, SEQ. ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ. ID09, SEQ. ID10 et SEQ.ID11.

En outre, la demanderesse a constaté qu'il était possible de construire des promoteurs, et notamment des promoteurs végétaux, ayant une activité promotrice intéressante, tout en présentant un minimum de boîtes régulatrices, à savoir au moins une boîte "G", une boîte "CAAT" et une boîte "TATA", à condition toutefois que la boîte "G" soit située en amont d'au moins une de ces boîtes, c'est-à-dire en 5', et que cette boîte "G" soit située de manière préférentielle à une certaine distance en amont des autres boîtes. Ainsi, un autre objet de la présente invention est un promoteur chimérique d'expression comprenant une boîte "G" liée de manière opérationnelle en amont d'au moins une boîte "CAAT", une boîte "TATA" ou un site d'initiation (+1) de la transcription. De préférence, la boîte "G" est située en amont de la boîte CAAT. Plus préférentiellement, la boîte "G" est située entre - 225 et-65 par rapport au site d'initiation (+1).

Encore plus préférentiellement, la boîte "G" est située entre - 201 et - 115 par rapport au site d'initiation (+1). Dans des modes d'exécution les plus préférés, la boîte "G" est située soit à - 201, soit à - 115, par rapport au site d'initiation (+1 ) .

Avantageusement, la boîte "G" est d'origine végétale.

Préférentiellement, la boîte "G" est obtenue à partir d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois. Plus préférentiellement encore, la boîte "G" est obtenue à partir du promoteur petE du gène de la plastocyanine de pois.

Selon un mode d'exécution préféré des promoteurs selon la présente invention, ceux-ci comprennent en outre une boîte "nos E like" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".

Selon un autre mode d'exécution préféré de l'invention, les promoteurs comprennent en outre au moins une boîte "asl like" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".

Selon encore un autre mode préféré de l'invention, les promoteurs comprennent au moins une boîte "asl" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".

D'une manière particulièrement préférée, les promoteurs selon l'invention comprennent en outre au moins une boîte "as2" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".

Enfin, les promoteurs chimériques selon la présente invention commprennent avantageusement au moins une séquence d'acide nucléique choisie parmi le groupe consistant en SEQ. ID02, SEQ. ID03, SEQ. ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ. ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11.

Encore un autre objet de la présente invention, est une cassette d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois, liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptide à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription.

De préférence, cette cassette d'expression comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE du gène de la plastocyanine de pois dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ.ID01. Encore plus préférentiellement, la cassette d'expression comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE choisi dans le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros SEQ. ID02, SEQ.ID03, SEQ. ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ. ID09, SEQ.ID10, et SEQ.ID11.

Un autre objet de la présente invention est une séquence d'acide nucléique promotrice isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence dérivée de la séquence identifiée sous

le numéro SEQ.ID01. De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique promotrice isolée correspond à une séquence choisie parmi le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros SEQ.ID02,SEQ.ID03, SEQ. ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ.ID07, SEQ. ID08, SEQ. ID09, SEQ.ID10, et SEQ.ID11.

Encore un autre objet de la présente invention concerne des motifs désoxynucléotidiques pour l'obtention des promoteurs ou des séquences d'acide nucléiques promotrices identifiés précédemment. Ces motifs peuvent être : - des motifs de construction, ou "sens", c'est-à-dire des séquences qui se lisent dans le sens de lecture de la séquence final, soit à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'; et/ou - des motifs de guidage, c'est-à-dire des séquences dont les extrémités comportent des bases se chevauchant avec les extrémités des motifs de construction "sens".

Ainsi, et de manière préférée, le motif de construction "sens" correspond à au moins une séquence choisie dans le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros SEQ. ID 12, SEQ. ID 13, SEQ. ID 14, SEQ. ID 15, SEQ. ID 16, SEQ. ID 17, et SEQ. ID 18.

Par ailleurs, on préfère les motifs de guidage désoxynucléotidiques correspondant à au moins une séquence choisie dans le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros SEQ. ID 19, SEQ. ID 20, SEQ. ID 21, et SEQ. ID 22.

Un autre objet de la présente invention est un vecteur comprenant un promoteur, ou une séquence d'acide nucléique promotrice, capable d'initier la transcription d'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide à produire, caractérisé en ce que le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice correspond à un promoteur chimérique d'expression ou à une séquence d'acide nucléique promotrice tels que définis précédemment. De préférence, le vecteur est choisi dans le groupe consistant en les vecteurs binaires identifiés sous les numéros pMRT1151, pMRT1149, pMRT1170.

Enfin, un autre objet de la présente invention est un procédé d'obtention d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée tels que définis précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - effectuer une réaction de ligation en chaîne, appelée LCR, produisant un ADN simple brin continu à partir d'au moins un motif désoxynucléotidique de construction choisi parmi le groupe consistant en les désoxynucléotides "sens" SI, S2, S3, S4, S5, S6, et S7 identifiés sous les numéros SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID14, SEQ.ID15, SEQ.ID16, SEQ. ID17 et SEQ.ID18 respectivement, et au moins un motif de guidage désoxynucléotidique de construction de ladite séquence d'acide nucléique promotrice ou du promoteur choisi parmi le groupe consistant en les désoxynucléotides de guidage Gl, G2, G3, et G4 identifiés sous les numéros SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ. ID21 et SEQ. ID22 respectivement ; - effectuer une amplification PCR sur le simple brin obtenu dans l'étape précédente permettant d'obtenir un ADN double brin correspondant au promoteur chimérique d'expression ou à la séquence d'acide nucléique promotrice; - éventuellement isoler le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice.

Avantageusement, et de manière préférée, on phosphoryle les motifs désoxynucléotidiques de construction avant ligation. Plus préférentiellement encore, la ligation s'effectue en présence d'au moins une ligase d'ADN dans un thermocycleur, selon les conditions suivantes : - un cycle d'environ une minute à environ 94 C : - huit cycles identiques chacun composé de la succession d'étapes suivantes : - une minute à 65 C, une minute à 57 C, une minute à 52 C, une minute à 48 C, une minute à 43 C et dix minutes à 37 C.

Encore un autre objet de la présente invention est une plante transgénique ayant intégré de manière stable dans son génome au

moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice tels que définis précédemment. De préférence, la plante transgénique est choisie parmi les espèces dicotylédones, telles que la pomme de terre, le tabac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.

Un autre objet de la présente invention est une propagule d'une plante transgénique telle que définie précédemment, et de préférence cette propagule est une semence.

Encore un autre objet de la présente invetion est une cellule contenant un promoteur ou une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment, et de préférence cette cellule est une cellule végétale.

Parmi les objets préférés de l'invention, il y a également une méthode d'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment ; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour le polypeptide.

De manière préférentielle, la cellule utilisée dans cette méthode est une cellule procaryote ou eucaryote. Plus préférentiellement encore, la cellule est une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules microbiennes, les cellules fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales, et manière encore plus préférée est une cellule végétale.

Enfin, un autre objet de la présente invention est une méthode d'obtention d'une plante transgénique, ou d'une propagule telles que définies précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à :

- transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.

DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise par la description détaillée des différents modes de réalisation donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, et en se référant au dessin en annexe, dans lequel : - les Figures I, II et III représentent de manière schématique des structures de constructions comparatives de référence, permettant de comparer les promoteurs chimériques décrits dans la présente demande. Dans la Figure I, il s'agit d'une construction contenant le gène rapporteur de la -glucuronidase dépourvue de toute séquence promotrice, et servant donc de contrôle négatif.

- la Figure II représente de manière schématique une construction contenant le gène de la -glucuronidase sous contrôle du promoteur CaMV double 35S, servant de contrôle de référence fort ; - la Figure III représente une construction servant de référence interne lors des expériences d'expression transitoire, et est composée du gène rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur CaMV 35S.

- la Figure IV représente de manière schématique la structure des promoteurs chimériques selon l'invention dérivant du promoteur entier du gène de la plastocyanine de pois (petE prom), qui est également représenté. A partir du promoteur entier (petE prom), les promoteurs MPrl098, MPrl097 et MPrl096 ont été construits par digestions enzymatiques, alors que les promoteurs MPrll08, MPrllO9, MPrlllO, MPrllll et MPrlll2 ont été

obtenu par la technique de lb-PCR. Les promoteurs MPrll43 et MPrll53 ont été respectivement obtenus en délétant les éléments "as-2" et "as-1" de MPrllll, et en fusionant les éléments "as-1 like" et "nos enhancer like" de MPrll08 en amont de MPrll43.

L'ensemble des promoteurs a été cloné au niveau des sites PstI et BamHI dans le vecteur pMRT1144 afin d'obtenir une fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur uidA ; - la Figure V représente un graphique comparant l'activité promotrice relative des différentes constructions après expression transitoire dans des feuilles de tabac. Trois jours après bombardement les feuilles sont broyées puis l'extrait brut clarifié par centrifugation. L'activité ss-glucuronidase et l'activité luciférase sont mesurées par fluorimétrie sur un aliquote de l'extrait brut, puis le rapport activité GUS / activité LUC est déterminé. Les histogrammes correspondent à la moyenne des rapports pour une même construction +/- Erreur Standard à la Moyenne (SEM).

Dans ces différentes figures, certains termes et expressions ont les significations suivantes : - uidA = la séquence codant pour la ss-glucuronidase ; - IV2 = l'intron du gène de la patatine ; - nos term = le terminateur du gène de la nopaline synthase ; - 35S term = le terminateur de l'ARN 35S du CaMV ; - B = le site de restriction de l'endonucléase BamHI ; - E = le site de restriction de l'endonucléase EcoRI ; - H = le site de restriction de l'endonucléase HindIII ; - P = le site de restriction de l'endonucléase PstI ; - Sp = le site de restriction de l'endonucléase SphI ; - as-1 = la séquence activatrice 1 du promoteur CaMV 35S ; - as-2 = la séquence activatrice 2 du promoteur CaMV 35S ; - nos E = l'élément activateur du promoteur de la nopaline synthase ; - B = le site de restriction de l'endonucléase BamHI ; - D = le site de restriction de l'endonucléase DraIII : - H = le site de restriction de l'endonucléase HindIII ;

- P = le site de restriction de l'endonucléase PstI ; - S = le site de restriction de l'endonucléase SpeI ; - Sp = le site de restriction de l'endonucléase SphI ; - CAAT = la boîte "CAAT" ; - G = la boîte "G"; - TATA = la boîte "TATA" ; - +1 = le site d'initiation de la transcription ; - "like" signifie que la séquence n'est pas 100% identique à la séquence de référence.

EXEMPLES Exemple 1 1. Constructions comparatives (témoins) Pour permettre la comparaison des promoteurs chimériques décrits dans ce brevet, le gène uidA codant la f-glucuronidase (Jefferson et: al., 1986) contenant la séquence de l'intron IV2 du gène ST-LS1 de la patatine de pomme de terre (Vancanneyt et al., 1990) (uidA-IV2) a été placé sous contrôle de l'un des promoteurs et du terminateur du gène de la nopaline synthase (nos term) d'Agrobacterium tumefaciens dans le plasmide pGEM3Z commercialisé par Promega Corp. (Madison, USA).

1. 1. Construction du témoin négatif pMRT1144.

Pour faciliter les clonages, un plasmide dérivé de pGEM3Z, ne possédant que les séquences "uidA-IV2/nos term" et dépourvu de toute séquence promotrice a été construit. Ce plasmide est appelé pMRT1144 et sert de témoin négatif (Fig. I).

Pour insérer la séquence uidA/nos term dans pGEM3Z, la séquence uidA sous contrôle du promoteur entier du gène de la plastocyanine de pois et du terminateur de la nopaline synthase, a été isolée à partir de 5 ug du plasmide pGA492-PpetE. Celui-ci a été obtenu en clonant, dans le plasmide pGA492-Pem2-uidA, le promoteur petE du gène plastocyanine de pois du plasmide pKHn2 (Pwee et Gray, 1993) à la place du promoteur em2 (Gaubier et al., 1993), provenant du plasmide pBI221-Pem2. Le plasmide pBI221-Pem2 a été digéré par 20 unités de chacune des enzymes HindIII et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Puis, la cassette

d'expression "Pem2/uidA/nos term" a été séparée par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroéluée, précipitée en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min, centrifugée à 12000 g pendant 30 min, lavée à l'éthanol 70%, séchée, resuspendue dans l'eau et insérée aux sites HindIII et EcoRI du plasmide pGA492 (An, 1986) digéré par ces deux enzymes pendant 1 h à 37 C, précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min, centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70%, séché puis resuspendu dans l'eau.

La ligation a été effectuée en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (Amersham) et 2,5 unités d'ADN ligase T4 (Amersham) à 14 C pendant 16 h. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes ont été transformées (Hannahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB, bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/1, Agar 15 g/1) supplémenté en tétracycline (12 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1983) et analysé par digestions enzymatiques.

A partir du plasmide pGA492-Pem2-uidA obtenu, le promoteur Pem2 a été délété par double digestion par HindIII et XbaI. Le fragment plasmidique a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80"C pendant 30 min, centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70%, séché, soumis à l'action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant. Ensuite, il a été déprotéinisé par extraction avec un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5

volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min, puis centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché, resuspendu dans l'eau. Puis, il a été déphosphorylé pendant 1 h à 37 C à l'aide de 10 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant, déprotéinisé par extraction avec un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min puis centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché puis resuspendu dans l'eau. Le plasmide résultant a été appelé pGA492DPem2.

En parallèle, le promoteur petE (818 pb) qui correspond au promoteur du gène de la plastocyanine de pois, a été obtenu à partir du plasmide pKHn2 par digestion par NcoI pendant 1 h à 37 C. Le fragment promoteur de 828 pb a été isolé sur gel d'agarose 0,8 %, électroélué, précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min, centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché, resuspendu dans l'eau, puis soumis à l'action de 5 unités de nucléase Mung Bean (New England Biolabs) pendant 30 min à 30 C selon les recommandations du fabriquant, déprotéinisé par extraction avec un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24: 1 v/v), précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min puis centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché puis resuspendu dans l'eau. Ce fragment promoteur a été inséré dans le plasmide pGA492DPem2, décrit ci-dessus, en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (Amersham) et de 2,5 unités d'ADN ligase T4 (Amersham) à 14 C pendant 16 h. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont

été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en tétracycline (12 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide résultant a été appelé pGA492-petE prom.

Pour isoler la cassette d'expression "petE prom/uidA/nos term", 5 pg du plasmide pGA492-petE prom ont été digérés par PstI (site situé en 5' du promoteur du gène de la plastocyanine) et EcoRI (site localisé en 3' de la séquence terminatrice) pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, et purifié sur colonne d'affinité Qiaquick (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les recommandations du fournisseur. Par ailleurs, 500 ng de plasmide pGEM3Z ont été digérés simultanément pendant 1 h à 37 C par EcoRI et PstI (sites de restriction présents dans le site de clonage multiple ou polylinker), soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

La ligation a été réalisée avec 50 ng de vecteur pGEM3Z-PstI/EcoRI et 50 ng de la cassette d'expression "petE prom/uidA/nos term" pendant 1 nuit à 18 C dans un milieu réactionnel de 12 l en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et de 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DHSa, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par le mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et a été analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pGEM3Z-petE prom.

Cinq ug de plasmide pSCV1.2-GI ont été digérés pendant 1 h à 37 C par SnaBI (Site de restriction situé à la position +383 pb en aval du codon initiateur ATG du gène uidA) puis pendant 1 h à 65 C par BstBI (site localisé à la position +1285 pb). Le fragment de 902 pb a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 1,0%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

La ligation a été réalisée avec 20 ng de vecteur pGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI et 80 ng du fragment de 902 pb BstBI/SnaBI, pendant 1 nuit à 18 C dans un milieu réactionnel de 10 l en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et a été analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pGEM3Z-petE prom/IV2.

Afin d'insérer l'intron IV2 de 192 pb du gène de la patatine de pomme de terre dans la séquence codante uidA, une portion interne de ce gène (fragment SnaBI / BstBI de 710 pb dans pGEM3Z-petE prom) a été excisé puis remplacé par la séquence équivalente contenant l'intron IV2 (fragment SnaBI / BstBI de 902 pb). Pour ce faire, le plasmide pGEM3Z-petE prom a été digéré pendant 1 h à 37 C par SnaBI (site de restriction situé à la position +383 pb en aval du codon initiateur ATG du gène uidA) puis pendant 1 h à 65 C par BstBI (site localisé à la position +1093 pb). Le plasmide ainsi délété du fragment de 710 pb a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Le fragment BstBI/SnaBI de 902 pb correspondant à la séquence de l'intron IV2 suivie de la séquence de uidA s'étendant de la position 383 à 1093 pb, a été isolé et purifié à partir du plasmide pSCV1.2-GI. Celui ci dérive du plasmide pSCVl.2 qui dérive lui-même du plasmide pSCVl construit par G.A. Edwards en 1990 selon les méthodes usuelles de clonage. Le plasmide binaire pSCVl.2 a été obtenu par clonage du fragment HindIII portant la cassette d'expression "35S prom/ nptII / nos term" (Fromm et al., 1986) au site HindIII de pSCVl.

La cassette d'expression "35S prom/ GUS-IV2/ 35S term" a été obtenue en digérant par HindIII pendant 1 h à 37 C le plasmide p35S GUS INT décrit par Vancanneyt et al. (1990). Le fragment

d'ADN correspondant à la cassette d'expression a été isolé sur gel d'agarose 0,8 %, électroélué puis précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min puis, centrifugés à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché et resuspendu dans l'eau. Les extrémité 5' sortantes de ce fragment ont été rendues bouts-francs par l'action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant, et le fragment a été déprotéinisé par extraction avec un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24: 1 v/v), précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min puis, centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché et enfin ligaturé avec 20 ng de plasmide pSCVl.2 digéré par SmaI pendant 1 h à 25 C, en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (Amersham) et 2,5 unités d'ADN ligase T4 (Amersham) à 14 C pendant 16 h. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.

Afin d'éliminer la séquence promotrice correspondant au fragment de 818 pb (petE) du plasmide pGEM3Z-petE prom/IV2, celui-ci a été digéré pendant 1 h à 37 C par BamHI puis, pendant 1 h à 37 C par PstI, isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Les extrémités 5' sortantes de ce plasmide ont été rendues bouts-francs en utilisant l'ADN polymérase Pfu (Stratagene, La Jolla, USA) selon les recommandations du fournisseur. La ligation a été réalisée avec 10 ng de plasmide ainsi modifié pendant 1 nuit à 18 C dans un volume réactionnel de 12 l, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme

ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées avec la moitié du milieu réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, analysé par digestions enzymatiques, et vérifié par séquençage selon le procédé de Sanger et al.

(1977). Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1144 (Fig. I).

1. 2. Construction du témoin positif MPr1092.

Afin de disposer d'une séquence promotrice de référence, le promoteur "double 35S" du virus de la mosaïque du choux fleur (CaMV D35S prom), a été placé en amont de la séquence uidA-IV2/nos term. Le plasmide pMRT1092 (Fig. II) résulte des étapes de clonage suivantes : Dans un premier temps, l'intron IV2 de 192 pb du gène de la patatine de pomme de terre a été inséré dans la séquence codante uidA à la position +383 pb comme décrit à la section 1. 1. Une quantité de 1 ug de plasmide pBI221 (Clontech, CA, USA) a été digérée pendant 1h30 à 37 C par SnaBI puis, pendant lh30 à 65 C par BstBI. Le plasmide délété d'un fragment de 710 pb a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

Une quantité de 20 ng de vecteur pBI221 BstBI/SnaBI et 80 ng du fragment de 902 pb BstBI/SnaBI provenant de pSCV1.2-GI comme décrit précédemment, ont été ligaturés pendant 1 nuit à 18 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence d'1 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et de 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB additionné d'ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.

Le plasmide obtenu a été appelé pBI221/uidA-IV2.

Dans un deuxième temps, la séquence du promoteur 35S du CaMV

présente au niveau du plasmide pBI221/uidA-IV2 a été remplacée par la séquence "CaMV D35S". Pour ce faire, le plasmide pBI221/uidA-IV2 a été digéré pendant 10h30 à 37 C par 10 unités de HindIII, puis les extrémités cohésives ont été rendues bouts-francs par l'action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant. Après purification du produit de cette réaction sur colonne d'affinité Qiaquick, l'ADN a été digéré pendant une nuit à 37 C par 10 unités de BamHI. Le fragment plasmidique, correspondant au vecteur délété du fragment promoteur CaMV 35S de 828 pb, a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

CaMV D35S prom a été obtenu à partir du plasmide pJIT163D.

Celui-ci dérive du plasmide pJIT163 qui dérive lui-même du plasmide pJIT160 (Guérineau et Mullineaux, 1993). Le plasmide pJIT163 possède un codon ATG entre les sites HindIII et SalI du polylinker. Pour supprimer cet ATG et obtenir le plasmide pJIT163D, l'ADN plasmidique pJIT163 a été digéré par HindIII et SalI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min, centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70%, séché, soumis à l'action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant, déprotéinisé par extraction avec un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min, puis centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70 %, séché et enfin ligaturé en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (Amersham) et 2,5 unités d'ADN ligase T4 (Amersham) à 14 C pendant 16 h. Des bactéries Escherichia coli

DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.

Dix ug de plasmide pJIT163D ont été digéré pendant 10h30 à 37 C par 10 unités de KpnI (site localisé en 5' du promoteur) puis les extrémités cohésives ont été rendues bouts francs par l'action de 6 unités de l'ADN polymérase T4 (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant. Après purification du produit de cette réaction sur colonne d'affinité Qiaquick, l'ADN a été digéré pendant une nuit à 37 C par 10 unités de BamHI. Le fragment d'ADN résultant de 761 pb, correspondant au promoteur CaMV D35S a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 1,0 %, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

Le mélange réactionnel contenant 10 ng de vecteur plasmidique, 100 ng du fragment de 761 pb, 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs) a été soumis à ligation dans 10 l pendant une nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DHSa, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1092 (Fig. II).

1. 3. Description du plasmide de référence pCaMV35Sluc.

Le plasmide servant de référence interne lors de l'expression transitoire est pCaMV35Sluc (Torrent et al., 1997) qui contient la cassette d'expression du gène rapporteur luciférase (lue) sous contrôle du promoteur et du terminateur de l'ARN 35S du CaMV.

Exemple 2.

Construction de plasmides contenant des séquences promotrices délétées du gène de la plastocyanine de pois.

Le promoteur entier du gène de la plastocyanine de pois (Last et Gray, 1989) correspond à une séquence de 834 pb (SEQ. ID01) allant de la position-771 pb à la position + 63 pb, sur laquelle diverses séquences potentiellement régulatrices sont identifiées (du côté 5' au côté 3', et par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, Fig. IV) : - une série de répétitions inversées, s'étendant des positions -734 à-607 pb, - une boîte de 20 pb (as-1 like) présentant une similitude vis à vis de l'élément activateur 1 (as-1) présent au niveau du promoteur CaMV 35S, s'étendant de la position - 579 à la position-559 pb, - une boîte de 21 pb (nos enhancer like) présentant une certaine homologie a un élément activateur présent dans le promoteur du gène de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens, s'étendant de la position - 540 à la position - 519 pb, - une boîte "G" de 8 pb, s'étendant de la position-201 à la position-193 pb, - une boîte de 14 pb, s'étendant de la position-83 à la position-69 pb, présentant une similitude vis à vis des boîtes de type III des promoteurs des végétaux supérieurs, - une boîte "CAAT", à la position-63 - une boîte "TATA", à la position-37 - le point +1 de transcription (position 1) - une région 5' non traduite allant de la position +1 à la position 63 pb.

Le plasmide pGEM3Z-petE prom a été obtenu comme décrit à la section 1.1de l'exemple 1. Il correspond au plasmide pGEM3Z contenant le gène rapporteur uidA-IV2 sous contrôle du promoteur entier du gène de la plastocyanine de pois (petE prom, Fig IV, SEQ.ID01), et sert de promoteur de référence pour toutes les constructions basées sur le promoteur plastocyanine.

Afin d'étudier l'effet des différents éléments, des délétions

des régions 5' de petE prom ont été réalisées par digestions enzymatiques.

2. 1. Construction du promoteur MPrlO97.

Le promoteur MPrl097 dérive de petE prom par une délétion en 5' des séquences répétées inversées ainsi que de la boîte as-1 like porté par le fragment Sphl de 212 pb (Fig. IV). Pour ce faire, 5 ug de plasmide pGEM3Z-petE/IV2 ont été digérés pendant 2 h à 37 C par 20 unités SphI, isolés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifiés sur colonne d'affinité Qiaquick.

La ligation a été réalisée avec 25 ng de plasmide ainsi modifié pendant 1 nuit à 18 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence de 1 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et de 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs).

Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1097 et la séquence promotrice MPr1097 (SEQ. ID02) a été vérifiée par séquençage.

2. 2. Construction du promoteur MPr1096.

Le promoteur MPrl096 dérive de petE prom par une délétion en 5' des séquences répétées inversées, des éléments "as-1 like" et "nos enhancer like" portés par deux fragments SpeI de 403 pb et de 105 pb (Fig. IV). Pour ce faire, 5 ug de plasmide pGEM3Z-petE /IV2 ont été digérés pendant 2 h à 37 C par 20 unités de SpeI, isolés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifiés sur colonne d'affinité Qiaquick.

Des bactéries Escherichia coli DH5oc, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange

réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1096 et la séquence promotrice MPrl096 (SEQ. ID03) a été vérifiée par séquençage.

2. 3. Construction du promoteur MPrl098.

Afin de disposer d'une séquence promotrice minimale de référence basée sur petE prom, le promoteur MPrl098 de 207 pb ne contenant que les boîtes "TATA" et "CAAT" (Fig. IV) a été construit.

Pour ce faire, 5 pg de plasmide pGEM3Z-petE /IV2 ont été digérés pendant 2 h à 37 C par 1,5 unité de DraIII (1 site présent à la position-128) et 15 unités de PstI (1 site situé en 5' du promoteur à la position-759 pb). Le plasmide ainsi délété du fragment PstI/DraIII de 631 pb situés en 5' du petE prom a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Les extrémités cohésives de ce fragment ont été rendues bouts-francs par l'action de 6 unités de l'enzyme ADN polymérase T4 (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant. Après purification du produit de cette réaction sur colonne d'affinité Qiaquick, la ligation a été réalisée avec 25 ng de plasmide ainsi modifié pendant 1 nuit à 18 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence de 1 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et de 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5[alpha], rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1098 et la séquence promotrice MPr1098 a été vérifiée par séquençage (SEQ. ID04). Elle correspond au promoteur plastocyanine minimal (Fig. IV).

Exemple 3.

Construction de plasmides contenant des séquences promotrices chimériques.

En plus des promoteurs obtenus par délétion de régions situées en 5', une série de promoteurs, ayant pour base le promoteur MPrl098 a été synthétisée par la technique lb-PCR qui combine une réaction de ligation en chaîne, appelée LCR (Barany, 1991) produisant un ADN simple brin continu à l'aide d'oligodésoxynucléotides "sens", avec une réaction de PCR conduisant à l'obtention de l'ADN double brin.

3. 1. Construction du promoteur MPr1108.

Le promoteur MPrll08 (Fig. IV) a été créé en fusionnant la séquence de 72 pb, s'étendant de la position-641 pb à la position-569 pb de petE prom (SEQ. ID01) portant les motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" à la séquence promotrice minimale de 187 pb de MPrl098 (position-128 à +59 pb, SEQ.ID04) par la technique de lb-PCR.

L'ADN simple brin continu a été formé à l'aide des oligodésoxynucléotides "sens" suivants : - SI = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAG AGGATCCCCG 3' (SEQ. ID12) - S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTC TCTCTTTCGA 3' (SEQ.ID13) - S3 = 5' CATAATTTGAACACTCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACATATTCTTCCACACAT CTTAGCCA 3' (SEQ. ID14) - S4 = 5' GGAATCTGCAGTTGAACACGTACAAACTTACGTCATTTGTGCATGCAGAAGCATAGAGCT GAGCACACAATT 3' (SEQ.ID15) Cent pmol des oligodésoxynucléotides SI, S2 et S3 ont été phosphorylés en 5' par l'action de 15 unités de kinase (Amersham) en présence de 5 l du tampon kinase 10X (Amersham) et 500 pmol d'ATP (Sigma), pendant 30 minutes à 37 C. Les oligodésoxynucléotides phosphorylés ont été purifiés par

extraction par un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), avant d'être précipités par 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 20 min puis centrifugés à 16060 g pendant 30 min. Les oligodésoxynucléotides précipités ont été lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis remis en suspension dans de l'eau à une concentration de 10 pmol/pl.

Pour relier les oligodésoxynucléotides "sens", les oligodésoxynucléotides "guides" suivants ont été utilisés: - Gl= 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID18) - G2= 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID19) - G3= 5' CAGAGTGTTCAAATTATGAATTGTGTGCTCAGC 3' (SEQ. ID20) Pour réaliser la réaction LCR, 10 pmol des oligodésoxynucléotides sens SI phosphorylé, S2 phosphorylé, S3 phosphorylé et S4 ont été ligaturés en présence de 10 pmol des oligodésoxynucléotides guides Gl, G2 et G3,5 l du tampon ADN ligase Taq 10X (New England Biolabs) et 40 unités d'ADN Ligase Taq (New England Biolabs). La réaction de ligation a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk, USA). Elle est constituée d'un cycle d'l min à 94 C, et de 8 cycles identiques constitués chacun de la succession des étapes suivantes : 1 min à 65 C, 1 min à 57 C, 1 min à 52 C, 1 min à 48 C, 1 min à 43 C, et enfin 10 min à 37 C.

Puis, le mélange réactionnel de ligation a été purifié sur colonne Qiaquick selon les recommandations du fournisseur.

Enfin, l'amplification PCR de l'ADN simple brin obtenu a été réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 100 pmol de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' GGAATCTGCAGTTGAACACGT 3' et 5 CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', 50 nmol de chacun des dNTP, 10 l de tampon ADN polymérase Vent 10X (New England Biolabs), et 2 unités d'ADN polymérase Vent (New England Biolabs). L'ADN a été dénaturé pendant 5 min à 94 C, soumis à 25 cycles constitués chacun de 30 sec de dénaturation à 95 C, de 30 sec d'hybridation

à 56 C, et d'1 min d'élongation à 72 C, puis l'élongation à 72 C a été poursuivie pendant 5 min.

Les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été digérés par 20 unités de BamHI pendant 45 min à 37 C, puis par 20 unités de PstI pendant 1 h à 37 C, et enfin purifiés sur colonne Qiaquick. Ils ont été insérés dans le plasmide pGEM3Z-petE/IV2 digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C, puis par PstI pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, déphosphorylé pendant 1 h à 37 C en présence de 12 l de "tampon 3" 10X (New England Biolabs) et de 5000 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIP, New England Biolabs), et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Pour réaliser la ligation, 25 ng de du plasmide traité comme décrit ci-dessus ont été mis en présence de 100 ng des fragments d'ADN obtenus par PCR, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs) pendant 1 nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, et analysé par digestions enzymatiques. Deux plasmides pMRT1108 et pMRT1109 résultants ont été séquences. Le plasmide pMRT1108 contient le promoteur attendu (SEQ.ID05), tandis que le plasmide pMRT1109 est porteur du promoteur MPrll09 (SEQ. ID06) qui diffère de MPrll08 par une délétion de 33 pb dans la région 5' non traduite, 11 pb en aval du point +1 (Fig. IV).

3. 2. Construction du promoteur MPr1110.

Le promoteur MPrlllO a été créé en insérant à la position-99 pb de MPrl098 (SEQ.ID04), un motif de 18 pb contenant une boîte "G" (s'étendant des positions - 204 pb à - 186 pb de petE prom, SEQ.ID01) et en fusionnant à ce promoteur minimal modifié une séquence de 44 pb du promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du choux fleur (CaMV) contenant les motifs as-2 et as-1

(Lam, 1989 ; et al., 1989) (Fig. IV). MPrlllO a été synthétisé par la technique de lb-PCR.

L'ADN simple brin continu a été formé à l'aide des oligodésoxynucléotides "sens" suivants : - SI = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAG AGGATCCCCG 3' (SEQ. ID12) - S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTC TCTCTTTCGA 3' (SEQ. ID13) - S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCAC ACATCTTAGCCA 3' (SEQ. ID16) - S6 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCC ACT 3' (SEQ. ID17) Cent pmol des oligodésoxynucléotides Sl, S2 et S5 ont été phosphorylés en 5' grâce à l'action de 15 unités de kinase (Amersham) en présence de 5 ul du tampon kinase 10X (Amersham) et 500 pmol d'ATP (Sigma), pendant 30 min à 37 C. Les oligodésoxynucléotides phosphorylés ont été purifiés par extraction par un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), avant d'être précipités par 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 20 min puis centrifugés à 16060 g pendant 30 min. Les oligodésoxynucléotides précipités ont été lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis remis en suspension dans de l'eau à une concentration de 10 pmol/pl.

Pour relier les oligodésoxynucléotides "sens", les oligodésoxynucléotides "guides" suivants ont été utilisés: - Gl= 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID19) - G2= 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID20) - G4= 5' TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT 3' (SEQ. ID22) Pour réaliser la réaction LCR, 10 pmol des

oligodésoxynucléotides sens SI phosphorylé, S2 phosphorylé, S5 phosphorylé et S6 ont été ligaturés en présence de 10 pmol des oligodésoxynucléotides guides Gl, G2 et G4,5 l du tampon ADN ligase Taq 10X et 40 unités d'ADN Ligase Taq (New England Biolabs). La réaction de ligation a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk, USA). Elle est constituée d'un cycle d'1 min à 94 C, et de 8 cycles identiques constitués chacun de la succession des étapes suivantes : 1 min à 65 C, 1 min à 57 C, 1 min à 52 C, 1 min à 48 C, 1 min à 43 C, et enfin 10 min à 37 C. Puis, le mélange réactionnel de ligation a été purifié sur colonne Qiaquick selon les recommandations du fournisseur.

Enfin, l'amplification PCR de l'ADN simple brin obtenu a été réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 100 pmol de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3', et 5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', de 50 nmol de chacun des dNTP, de 10 l de tampon ADN polymérase Vent 10X (New England Biolabs), et de 2 unités d'ADN polymérase Vent (New England Biolabs). l'ADN a été dénaturé pendant 5 min à 94 C, soumis à 25 cycles constitués chacun de 30 sec de dénaturation à 95 C, de 30 sec d'hybridation à 56 C, et d'1 min d'élongation à 72 C, puis l'élongation à 72 C a été poursuivie pendant 5 min.

Les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été digérés par 20 unités de BamHI pendant 45 min à 37 C puis par 20 unités de PstI pendant 1 h à 37 C, et enfin purifiés sur colonne Qiaquick. Ils ont été insérés dans le plasmide pGem3Z-petE /IV2 digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C, puis par PstI pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, déphosphorylé pendant 1 h à 37 C en présence de 12 l de "tampon 3" 10X (New England Biolabs) et de 5000 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIP, New England Biolabs), et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Pour réaliser la ligation, 25 ng de plasmide traité comme décrit ci-dessus ont été mis en présence de 100 ng des

fragments d'ADN obtenus par PCR, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs) pendant 1 nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et a été analysé par digestions enzymatiques. La séquence promotrice MPrlllO portée par ce plasmide pMRT1110 a été vérifié par séquençage (SEQ.ID07).

3. 3. Construction du promoteur MPrllll.

Le promoteur MPrllll a été créé en insérant à la position-99 pb de MPrl098 (SEQ. ID04), un motif de 18 pb contenant une boîte "G" (s'étendant des positions - 204 pb à - 186 pb de petE prom, SEQ.ID01) et en fusionnant à ce promoteur minimal modifié une séquence de 58 pb correspondant à une duplication du motif as-2 (Lam et Chua, 1989) et au motif as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S. MPrllll (Fig. IV) a été synthétisé par la technique de lb-PCR.

L'ADN simple brin continu a été généré à l'aide des oligodésoxynucléotides sens suivants : - SI = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAG AGGATCCCCG 3' (SEQ. ID12) - S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTC TCTCTTTCGA 3' (SEQ. ID13) - S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCAC ACATCTTAGCCA 3' (SEQ. ID16) - S7 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTA AGGGATGACGCATGCCACT 3' (SEQ.ID18)

Cent pmol des oligodésoxynucléotides SI, S2 et S5 ont été phosphorylés en 5' grâce à l'action de 15 unités de kinase (Amersham) en présence de 5 l du tampon kinase 10X (Amersham) et 500 pmol d'ATP (Sigma), pendant 30 min à 37 C. Les oligodésoxynucléotides phosphorylés ont été purifiés par extraction par un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : isoamylique (24:1 v/v), avant d'être précipités par 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 20 min puis centrifugés à 16060 g pendant 30 min. Les oligodésoxynucléotides précipités ont été lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis remis en suspension dans de l'eau à une concentration de 10 pmol/ul.

Pour relier les oligodésoxynucléotides "sens", les oligodésoxynucléotides "guides" suivants ont été utilisés: - Gl= 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID19) - G2= 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID20) - G4= 5' TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT 3' (SEQ. ID22) Pour réaliser la réaction LCR, 10 pmol des oligodésoxynucléotides sens SI phosphorylé, S2 phosphorylé, S5 phosphorylé et S7 ont été ligaturés en présence de 10 pmol des oligodésoxynucléotides guides Gl, G2 et G4,5 l du tampon ADN ligase Taq 10X (New England Biolabs) et 40 unités d'ADN ligase Taq (New England Biolabs). La réaction de ligation a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk, USA). Elle est constituée d'un cycle d'1 min à 94 C, et de 8 cycles identiques chacun composé de la succession des étapes suivantes : 1 min à 65 C, 1 min à 57 C, 1 min à 52 C, 1 min à 48 C, 1 min à 43 C, et enfin 10 min à 37 C. Puis, le mélange réactionnel de ligation a été purifié sur colonne Qiaquick selon les recommandations du fournisseur.

Enfin, l'amplification PCR de l'ADN simple brin obtenu a été réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 100 pmol de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3', et

5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', 50 nmol de chacun des dNTP, 10 l de tampon ADN polymérase Vent 10X (New England Biolabs), et 2 unités d'ADN polymérase Vent (New England Biolabs). l'ADN a été dénaturé pendant 5 min à 94 C, soumis à 25 cycles constitués chacun de 30 sec de dénaturation à 95 C, de 30 sec d'hybridation à 56 C, et d'1 min d'élongation à 72 C, puis l'élongation à 72 C a été poursuivie pendant 5 min.

Les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été digérés par 20 unités de BamHI pendant 45 min à 37 C, puis par 20 unités de PstI pendant 1 h à 37 C, et enfin purifiés sur colonne Qiaquick.

Ils ont été insérés dans le plasmide pGEM3Z-petE/IV2 digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C, puis par PstI pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, déphosphorylé pendant 1 h à 37 C en présence de 12 l de "tampon 3" 10X (New England Biolabs) et de 5000 unités de phosphatase d'intestin de veau (CIP, New England Biolabs), et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Pour réaliser la ligation, 25 ng de plasmide traité comme décrit ci-dessus ont été mis en présence de 100 ng des fragments d'ADN obtenus par PCR, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs) pendant 1 nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5[alpha], rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et a été analysé par digestions enzymatiques. Deux plasmides résultants, pMRT1111 et pMRT1112, ont été séquences. Le plasmide pMRT1111 contient le promoteur MPrllll attendu (SEQ. ID08), tandis que dans le plasmide pMRT1112, le promoteur MPrlll2 (Fig. IV) diffère de MPrllll par une délétion de 35 pb contenant la boîte "G" et s'étendant de la position-127 à la position-89 et une délétion de deux pb situées en position-78 et-76 (SEQ. ID09).

3. 4. Construction du promoteur MPrll53.

Le promoteur MPrll53 (Fig. IV) a été obtenu en fusionnant la séquence de 78 pb de petE prom, s'étendant de la position-582 à la position-510 pb (SEQ.ID01) et portant les motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" à MPrl098 modifiée par adjonction du motif de 18 pb contenant la boîte "G".

Pour ce faire, le plasmide pMRTllll a été digéré par 20 unités de PstI et 1 unité de DraIII pendant 1 h à 37 C. Le plasmide ainsi délété du fragment de 72 pb, contenant les deux motifs "as-2" et le motif "as-1" du CaMV, a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Le fragment PstI/DraIII de 78 pb contenant les deux motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" de petE prom a été généré en digérant 10 ug de plasmide pMRT1108 par 20 unités de PstI et 1 unité de DraIII pendant 1 h à 37 C, puis isolé par électrophorèse sur gel d'agarose Nu-Sieve 3% (FMC, Rockland, USA) et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

La ligation a été réalisée avec 20 ng de vecteur pMRT1111 PstI/DraIII et 80 ng du fragment de 78 pb pendant 1 nuit à 18 C dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1153 et la séquence promotrice MPrll53 (SEQ. ID10) a été vérifiée par séquençage .

3. 5. Construction du promoteur Mprll43.

Le promoteur MPrll43 (Fig. IV) a été obtenu en délétant la séquence de 72 pb portant les motifs "as-2, as-2, as-1" de MPrllll.

Pour ce faire, le plasmide pMRT1111 a été digéré pendant 1 h à 37 C simultanément par 20 unités de PstI et 1 unité de DraIII.

Le plasmide ainsi délété du fragment de 70 pb contenant les deux motifs as-2 et le motif as-1 du CaMV a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Les extrémités de ce fragment ont été rendues bouts-francs par l'action de l'ADN polymérase Pfu (Stratagene, La Jolla, USA) selon les recommandations du fournisseur. Ce fragment a été religaturé pendant 1 nuit à 18 C dans un milieu réactionnel de 10 l contenant 20 ng de vecteur, 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5[alpha], rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. La séquence promotrice MPrll43 (SEQ. ID11) de l'un de ces clones a été vérifiée par séquençage.

Exemple 4.

Construction des plasmides binaires contenant les promoteurs MPrll51, 1149,1170 et 1092.

La préparation du vecteur binaire a été la même pour les cassettes d'expression contenant MPrllll, MPrl098, MPrll43 et MPrl092. Une quantité de 25 ug de plasmide pGA492 (An, 1986) a été digéré par 80 unités de HindIII pendant 1 h à 37 C, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Les extrémités 5' sortantes de ce plasmide ont été rendues bouts francs en utilisant l'ADN polymérase Pfu (Stratagene, La Jolla, USA) selon les recommandations du fournisseur. Le plasmide ainsi modifié a été digéré par 80 unités d'EcoRI pendant 1 h à 37 C, puis le vecteur délété d'un fragment de 291 pb a été séparé sur gel d'agarose 0,7 % et purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

4. 1. Obtention de pMRT1151.

La cassette d'expression MPrllll / uidA-IV2/ nos term a été insérée au site HindIII modifié du plasmide binaire pGA492.

Elle a été obtenue à partir du plasmide pMRTllll digéré par 80

unités de PstI pendant 1 h à 37 C et purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Les extrémités 5' sortantes de ce plasmide ont été rendues bouts francs en utilisant l'ADN polymérase Pfu (Stratagene, La Jolla, USA) selon les recommandations du fournisseur. Le plasmide ainsi modifié a été digéré par 80 unités d'EcoRI pendant 1 h à 37 C, puis le fragment d'ADN de 2,5 kb correspondant à la cassette d'expression a été séparé sur gel d'agarose 1 % et purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

La ligation a été réalisée en mélangeant 100 ng de plasmide binaire pGA492 préparé comme décrit ci-dessus et 50 ng de cassette d'expression pendant 1 nuit à 18 C, dans un volume réactionnel de 20 l en présence de 2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du milieu réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en tétracycline (12 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques ainsi que par amplification génique à l'aide des oligodésoxynucléotides 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' choisi sur l'ADN de transfert du plasmide binaire et 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' choisi sur la cassette d'expression au niveau de la séquence uidA. Le clone résultant est appelé pMRT1151.

4. 2. Obtention du plasmide binaire pMRT1149.

La cassette d'expression MPrll43 / uidA-IV2/ nos term a été clonée au site HindIII modifié du plasmide binaire pGA492 en suivant le même protocole que pour le plasmide pMRT1151, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1143. Le clone résultant a été appelé pMRT1149.

4. 3. Obtention du plasmide binaire pMRT1170.

La cassette d'expression petE prom/ uidA-IV2/ nos term a été clonée au niveau du site HindIII modifié du plasmide binaire pGA492 en suivant le même protocole que pour le plasmide

pMRT1151, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pGem3Z-petE/IV2 4. 4. Obtention du plasmide binaire pMRT1182.

Les fragments promoteur MPrl092 et séquence uidA-IV2/nos term ont été insérés dans le plasmide binaire pGA492 préparé comme décrit ci-dessus. Les deux fragments ont été préparés de la manière suivante : CaMV D35S prom a été isolé en digérant 10 pg du plasmide pJIT163D par 40 unités de KpnI pendant 1 h à 37 C. Les extrémités de ce plasmide linéarisé ont été rendues bouts-francs à l'aide de 6 unités de l'ADN polymérase T4 (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C selon les recommandations du fabriquant. Le plasmide ainsi modifié a été purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, puis redigéré par 80 unités de HindIII pendant 1 h à 37 C. Le fragment de 743 pb correspondant au promoteur a été séparé sur gel d'agarose à 0,8 %, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

La séquence uidA-IV2/nos term a été obtenue en digérant 4 pg du plasmide pMRT1092 par 40 unités de HindIII et d'EcoRI pendant 1 h. Le fragment de 2,2 kb correspondant à la séquence uidA-IV2/nos term a été séparé sur gel d'agarose à 0,8 %, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.

La ligation entre les trois fragments a été réalisée en mélangeant 100 ng de plasmide binaire, 50 ng de fragment promoteur et 50 ng du fragment correspondant à la séquence uidA-IV2/nos term dans un volume réactionnel de 20 l, en présence de 2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs). L'incubation a été réalisée dans un thermocycleur en soumettant le mélange de ligation à 198 cycles constitués chacun de 30 sec d'incubation à 30 C, et de 30 sec d'incubation à 10 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du milieu réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en tétracycline (12

mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques et amplification génique à l'aide des oligodésoxynucléotides 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' choisi sur l'ADN de transfert du plasmide binaire et 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' choisi sur la cassette d'expression au niveau de la séquence uidA. L'un des clones retenu a été dénommé pMRT1182.

Les plasmides pMRT1151, pMRT1149, pMRT1170 et pMRT1182 ont été transférés dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens LBA4404 selon la technique décrite par Holsters et al. (1978). l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en rifampicine (50 mg/1) et en tétracycline (5 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, modifiée en ajoutant du lysozyme (25 mg/ml) dans le tampon de resuspension des cellules. L'ADN plasmidique obtenu a été analysé par digestions enzymatiques et par amplification génique à l'aide des oligodésoxynucléotides 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' choisi sur l'ADN de transfert du plasmide binaire et 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' choisi sur la cassette d'expression au niveau de la séquence uidA. Les clones d'agrobactérie obtenus ont été utilisés en transformation génétique végétale.

Exemple 5.

Mesure et comparaison des niveaux d'expression des différentes promoteurs par la méthode d'expression transitoire.

5. 1 Culture in vitro du tabac, préparation des feuilles.

Les expériences d'expression transitoire ont été réalisées sur des feuilles de tabac (Nicotiana tabacum L. ) du cultivar PBD6 âgées de 6 semaines. Des graines matures de tabac cv. PBD6 ont été stérilisées pendant 10 min dans une solution d'hypochlorite de calcium saturée (70 g/1), puis rincées trois fois pendant 5 min dans l'eau déionisée stérile. Les graines stériles ont été déposées sur milieu MS20 (Murashige et Skoog, 1962) et incubées pendant 6 semaines en chambre de culture (température constante de 24 C, photopériode 16 h obscurité/ 8 h lumière,

intensité lumineuse de 200 pmol photons.m-2.sec-1).

Afin d'éviter l'éclatement des cellules du mésophylle foliaire lors de la transformation, les 2 feuilles principales des plantes de tabac PBD6 âgées de 6 semaines ont été excisées de la plante 24 h avant transformation par biolistique, et déposées, face ad-ligneuse vers le haut, sur milieu BY3 de plasmolyse douce (Sels MS 4,4 g/1, myoinositol 100 mg/1, thiamine 1 mg/l, KH2PO4 200 mg/1, Saccharose 30 g/1, Sorbitol 45,5 g/1, 2,4 D 1 mg/1, pH 5,8).

5. 2. Enrobage des particules d'or par l'ADN des constructions chimériques.

La transformation par biolistique nécessite le dépôt préalable de l'ADN sur des billes d'or sphériques de 0,6 mm de diamètre stérilisées 10 min dans l'éthanol absolu (99,98 %, à moins de 0,02 % d'eau), lavées quatre fois dans l'eau déionisée stérile, et enfin conservées pendant 4 semaines maximum à -20 C dans une solution de glycérol à 50%.

La concentration de l'ensemble des plasmides contrôles et essais, utilisés durant la transformation à été ajustée à 1 mg/ml. Dans chacune des expériences de transformation, un contrôle interne de référence (pCaMV35Sluc) a été cotransformé afin de normaliser les variations de l'activité GUS entre les différentes expériences (Leckie et al., 1994).

L'enrobage de l'ADN sur les billes d'or ainsi préparées a été réalisé en enceinte stérile à flux laminaire. Une fraction aliquote de 1,8 mg de suspension de billes stériles dans 30 l de glycérol 50 %, a été mélangée vigoureusement au vortex pendant 1 min, puis pendant 10 sec avec 20 l de suspension d'ADN contenant 4 g de l'un des plasmides à tester et 2 pg du plasmide de référence pCaMV35Sluc. Puis, 20 l de CaCl 2,5 M ont été ajoutés et mélangés vigoureusement pendant 10 sec. Ensuite, 20 l de spermidine 0,1 M ont été ajoutés au mélange et l'ensemble a été agité au vortex pendant 30 sec supplémentaires.

L'enrobage de l'ADN sur les billes a été poursuivi en incubant le mélange dans la glace pendant 15 min, puis les billes

enrobées ont été centrifugées à faible vitesse pendant 5 sec et lavées deux fois dans l'éthanol absolu.

Après lavage, les billes enrobées ont été remises en suspension dans 32 l d'éthanol absolu, soniquées 3 fois 2 sec, mélangées vigoureusement au vortex pendant 15 sec, puis immédiatement réparties en 4 parties aliquotes identiques sur les disques "macrocarriers" stériles du système Biolistic PDS-1000/He préparés selon les recommandations du fournisseur (Bio-Rad, Hercule, USA). L'ensemble "support du macrocarrier/ macrocarrier portant le dépôt de billes", a été mis à sécher pendant 5 min.

5. 3. Bombardement des tissus foliaires de tabac et expression transitoire.

Le bombardement des feuilles de tabac a été effectué à l'aide du système Biolistic PDS-1000/He en suivant les recommandations générales du fournisseur (Bio-Rad, Hercule, USA) concernant les manipulations et montages des différents éléments de l'appareil.

Chaque feuille a été bombardée deux fois successivement en suivant les caractéristiques de tir suivantes : - la pression d'hélium choisie pour accélérer les billes est de 6200 kPa (900 psi).

- l'échantillon végétal a été placé à 9 cm de la zone d'accélération des billes.

- le tir a été effectue sous une atmosphère en dépression de 27 mm de mercure.

Après bombardement les feuilles ont été laissées sur milieu BY3 et incubées 48 h à l'obscurité en salle de culture à 24 C. Cette incubation doit permettre l'expression transitoire des transgènes introduits dans les cellules.

5. 4. Evaluation de l'activité des différents promoteurs par coloration histochimique.

La révélation de l'expression de la ss-glucuronidase a été réalisée par coloration histochimique comme décrit par Jeffersson et al. (1987). Après 48 h en chambre de culture, chaque feuille a été coupée en deux selon l'axe de la nervure

centrale. La moitié de la feuille a été incubée dans du tampon de coloration de la B-glucuronidase (5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl glucuronide (X-Gluc) 500 mg/1, Triton xlOO 0,05% dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,0) pendant 48 h à 37 C, alors que l'autre moitié a été congelée dans l'azote liquide, puis conservée à -80 C.

Après coloration, les feuilles ont été dépigmentées par passage dans deux bains d'éthanol 95 % pendant respectivement 3 et 12 h, puis rincées dans l'eau distillée et séchées à plat entre deux feuilles de cellophane.

L'activité promotrice des différentes constructions a été évaluée par le nombre de points bleus révélés sur chaque feuille après deux bombardements totalisant 2 g d'ADN portant le gène rapporteur GUS.

Trois catégories de promoteurs ont été identifiées. Les feuilles bombardées avec les promoteurs MPrl096, MPrl098, MPrll08, MPrll09, MPrll43 et MPrll53 présentent en moyenne un nombre de points bleu inférieur à 30. Les feuilles bombardées par les promoteurs petE, MPrl097 et MPrlllO présentent une nombre de points bleus compris entre 50 et 150. Enfin, les feuilles bombardées par MPrllll et par le promoteur de référence MPrl092 présentent en moyenne un nombre de points bleus très importants et comparables supérieurs à 200.

En conclusion, les promoteurs chimériques MPrlllO et MPrllll permettent d'obtenir une expression de la ss-glucuronidase à un niveau supérieur ou égal au promoteur petE entier ; et MPrllll présente une activité promotrice comparable à celle obtenue à l'aide du promoteur constitutif fort de référence D35S prom.

5. 5. Quantification de l'expression de la B-glucuronidase par les différents promoteurs, par dosage enzymatique au luminomètre.

Les demi-feuilles congelées ont été broyées dans un mortier, puis la poudre a été mise à décongeler dans du tampon d'extraction (Tris Phosphate 25 mM pH 7,8, Dithiothréitol 2 mM, acide 1,2-diaminocyclohexane, N,N,N',N'-tétracétique 2 mM,

glycérol 10 %, Triton xlOO 1 %) à raison de 1 ml de tampon pour 200 mg de tissu. Le mélange a été homogénéisé puis incubé pendant 15 min dans la glace avant d'être clarifié par centrifugation pendant 5 min à 16060 g.

L'activité GUS a été mesurée sur 20 l d'extrait brut clarifié de feuille à l'aide du kit de détection "GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay" (Tropix Inc., Bedford, USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière a été effectuée à l'aide d'un luminomètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne).

L'activité luciférase a été mesurée sur 20 l d'extrait brut de feuille à l'aide du kit de détection "Luciférase assay system" (Promega Corp., Madison, USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière a été effectuée à l'aide du luminomètre Lumat LB 9507.

Les résultats sont rapportés Fig. V. Pour chaque essai (une feuille bombardée = un extrait brut), le rapport entre l'activité f-glucuronidase et l'activité luciférase mesurées au luminomètre, a été calculé. La moyenne des différents essais pour une construction donnée et l'erreur standard à la moyenne ont été déterminées.

Les promoteurs se répartissent en 6 classes ordonnées de manière croissante du taux d'expression le plus faible (classe 1) au taux d'expression le plus élevé (classe 6) : - la classe 1 renferme les promoteurs MPr1108 et MPrll09 (Fig.

IV). L'expression conférée par ces promoteurs semble peu différente de celle obtenue avec la construction pMRT1144 (Fig.

I) qui ne contient pas de promoteur. La fusion des 2 boîtes, "as-1 like" et "nosE like", au promoteur minimal MPrl098 (Fig.

IV) pour obtenir MPr1108, ne diminue que très peu l'expression moyenne engendrée par MPrl098. Ce résultat semble suggérer un très faible effet inhibiteur de ces boîtes et de leur localisation dans MPrllO8. Le promoteur MPrll09 confère une expression sensiblement identique à celle obtenue avec le promoteur MPr1108. La délétion de la séquence située en aval du

site d'initiation de la transcription, à savoir la région 5' non traduite, ne semble pas modifier l'expression obtenue avec MPr1108.

- la classe 2 comporte les promoteurs MPrl098, MPrll43 et MPrlll2 (Fig. IV). Les promoteurs MPrl098 et MPrll43 présentent une activité similaire. Le promoteur MPrll43 résulte de l'insertion d'une boîte "G" à une distance de 36 pb localisée en amont de la boîte "CAAT" dans le promoteur minimal MPrl098. La présence de cette boîte n'a pas d'effet significatif sur l'expression obtenue avec le promoteur MPrl098. Le promoteur MPrlll2 renferme en amont de la boîte "CAAT", une duplication de la boîte "as-2" suivie de la boîte "as-1" du promoteur 35S du CaMV. Ces éléments à eux seuls ne semblent pas contribuer à améliorer le taux d'expression qui est sensiblement identique à celui obtenu avec le promoteur MPrl098.

- la classe 3 regroupe les promoteurs MPrl096 et MPrl097 (Fig.

IV). L'expression conférée par ces 2 promoteurs est identique.

L'obtention de MPrl096 par délétion des fragments SphI-SpeI portant la boîte "nosE like" et SpeI-Spel de MPR1097, portant une région de la séquence enhancer de petE prom (Fig. IV), ne semble pas affecter le taux d'expression. Dans le promoteur MPrl096, la présence de la boîte "G", précédée de 31 pb de la séquence enhancer de petE et distante de 122 pb de la boîte "CAAT", permet d'augmenter le taux d'expression engendré par MPrl098 d'un facteur 2,5. Il est à noter que dans le cas de MPrll43, la présence de la boîte "G" précédée de 28 pb de la séquence enhancer de petE et distante de 36 pb de la boîte "CAAT", ne permet pas d'accroître le taux d'expression obtenu avec MPrl098. Il semblerait que la distance entre les boîtes "G" et "CAAT" influence le taux d'expression.

- la classe 4 renferme le promoteur petE (Fig. IV) qui sert de référence.

- la classe 5 contient le promoteur MPrlllO (Fig. IV). La fusion des boîtes as-2 et as-1 en amont du promoteur MPrll43 générant le promoteur MPrlllO permet d'augmenter considérablement le taux

d'expression qui est bien plus élevé que celui obtenu avec le promoteur petE (facteur 1,4). Il apparaît que les boîtes "G", "as-1" et "as-2" agissent en synergie positive sur le taux d'expression.

- la classe 6 regroupe les promoteurs MPrllll (Fig. IV) et MPrl092 (Fig. I). Le promoteur MPrllll confère un taux d'expression similaire à celui du promoteur double 35S du CaMV de référence (MPrl092). L'ajout d'un élément "as-2" augmente considérablement le taux d'expression par rapport à celui obtenu avec MPrlllO (facteur 1,7). Les éléments agissent en synergie positive. La duplication de la boîte "as-2" augmente cet effet.

En conclusion, le promoteur chimérique MPrlllO permet d'obtenir une expression moyenne de la ss-glucuronidase à un niveau supérieur ou égal au promoteur petE entier. Le promoteur MPrllll présente une activité promotrice comparable à l'activité moyenne obtenue à l'aide du promoteur de référence D35S prom.

Ces résultats sont en accord avec ceux observés après coloration histochimique des feuilles bombardées avec ces mêmes promoteurs.

Le promoteur CaMV D35S étant communément rapporté dans la littérature comme étant un promoteur chimérique apportant une augmentation de l'activité promotrice du gène rapporteur GUS de l'ordre de 8 à 12 fois supérieure à celle apportée par le promoteur CaMV 35S (Kay et al., 1987), MPrllll constitue l'un des promoteurs chimériques, actif dans les feuilles de tabac, le plus fort décrit à ce jour.

Les promoteurs de plus faible expression peuvent présenter un intérêt en tant que promoteurs utilisables pour conférer une résistance à des antibiotiques pour les besoins de la sélection, par exemple, de la même manière que les promoteurs type "nos".

Exemple 6.

Expression des différents promoteurs dans le tabac après transformation stable.

6. 1. Transformation stable dans le tabac.

La transformation du tabac (Nicotiana tabacum L., cultivar PBD6) a été réalisée en infectant des disques foliaires isolés de

plantes de tabac âgées de 6 semaines par les agrobactéries recombinantes selon la méthode décrite par Horsch et al. (1985).

Tout au long de la transformation, les boîtes de Pétri ont été incubées en chambre de culture dans les conditions suivantes : température de 24 C, photopériode de 16 h obscurité/ 8 h lumière, intensité lumineuse de 200 umol photons.m-2.sec-1 , et hormis pour l'étape initiale de coculture, l'ensemble des étapes de callogénèse, de régénération et d'enracinement a été réalisé sur divers milieux sélectifs supplémentés en Augmentin (400 mg/1) et Kanamycine # (200 ou 100 mg/1) ; Les différentes étapes et les milieux utilisés sont les suivants - une étape de coculture de trois jours, lors de laquelle les agrobactéries infectent les cellules végétales, sur milieu de coculture MS30 solide (milieu de base MS (Murashige et Skoog, 1962) additionné de vitamines (Gamborg et al., 1968) 4,4 g/1 (Sigma, M0404), Saccharose 30 g/1, agar 8 g/1 (Merck), pH 5,7) supplémenté en Benzyl Amino Purine à 1 mg/1 et Acide Indole-3 Acétique à 0,1 mg/1 .

- une étape de formation des bourgeons de deux fois 2 semaines en chambre de culture sur milieu de régénération MS20 solide (Sels et vitamines MS 4,4 g/1 (Sigma, M0404), Saccharose 20 g/1, , agar 8 g/1 (Merck), pH 5,7), supplémenté en Benzyl Amino Purine à 1 mg/1, Acide Indole-3 Acétique à 0,1 mg/1, Augmentin # à 400 mg/1 et Kanamycine # à 200 mg/1.

- une étape de développement et d'enracinement de 3 semaines en chambre de culture sur milieu de développement MS20 solide supplémenté en Augmentin # à 400 mg/1 et Kanamycine à 100 mg/1.

- une étape de repiquage en pots de verre en chambre de culture sur milieu de développement MS20 solide supplémenté en Augmentin # à 400 mg/1 et Kanamycine # à 100 mg/1.

6. 2. Mesure et comparaison de l'activité B-glucuronidase dans les plantes de tabac.

L'activité -glucuronidase a été mesurée sur des échantillons de plantes transgéniques de première génération, prélevés 2

semaines après leur acclimatation en serre. Pour chaque plante, trois échantillons de feuille ont été prélevés, sur une feuille "âgée" (située au rang foliaire basal), sur une feuille mature (située au rang foliaire médian), et sur une feuille jeune (située à l'apex).

Chaque échantillon a été broyé dans l'azote liquide dans un mortier, puis la poudre a été resuspendue dans du tampon d'extraction (Tris Phosphate 25 mM pH 7,8, Dithiothréitol 2 mM, acide 1,2-diaminocyclohexane, N,N,N',N'-tétracétique 2 mM, glycérol 10 %, Triton X100 1 %) à raison d'1 ml de tampon pour 200 mg de tissu. Le mélange a été homogénéisé puis incubé pendant 15 min dans la glace avant d'être clarifié par centrifugation pendant 5 min à 16060 g.

L'activité GUS a été mesurée sur 20 l d'extrait brut clarifié de feuille à l'aide du kit de détection "GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay" (Tropix Inc., Bedford, USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière à été effectuée à l'aide d'un luminomètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne).

La quantité de protéine totales présentes dans l'extrait brut a été mesurée selon la technique de Bradford (1976), en utilisant le réactif "Bio-Rad protein assay" (Bio-Rad, München, Allemagne).

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LISTAGE DE SEQUENCE <110> MERISTEM THERAPEUTICS <120> Promoteurs chimériques, leur procédé d'obtention, et cassettes, vecteurs et plantes transgéniques les contenant <130> Promoteur Chimérique PPc <140> <141> <160> 22 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 834 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222>(1)..(834) <223> Séquence entière du promoteur petE du gène de la plastocyanine du pois <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome <303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

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<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993

<400> 1 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga actagtggat ctatgcaact tacaacgtgc 60 actcgcggag gattggacgt gtgcaactta caacgtacgc attgttcgtc catacaatag 120 tgtagaattg gacatgtgca acttacaaca tgtgcaactt acaacgtgcg ctcgcggagg 180 aatgtgaagt tgaacacgta caacttacgt catttgtgca tgcagaagca tagagctgag 240 cacacaattc ataatttgaa ggacacatga tttgctataa agaactcttt agaagtacca 300 caactttgac tgagtttgat atagctaata aagatggagc tcattataat ttgaalggca 360 taatcaagct aaacgaacaa gcttagttaa tcatgttaaa caacaattct ttgtaataat 420 aaattgtctt tcaactagtc caagtttatg agttgattct tcggaataaa ttagaaaata 480 tcttagactt tatacttcat tgattatttc atagagcaag taggagaaat aaaaatatac 540 tagtattatt tactaaaaaa aatctaagcc acgtcggagg ataacatcca acccagccaa 600 tcacagcaat gttcatcaga taacccactt taagcccacg cactctgtgg cacatctaca 660 ttatctaaat cacatattct tccacacatc ttagccacac aaaaacccaa tccacatctt 720 tatcatccat tctataaaaa atcaccttct gtgtgtctct ctttcgattc ccttcaaaca 780 catacaaatt cagtagagaa gaaactcatt actcttgaga aacctagagg atcc 834 <210> 2 <211> 623 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1). (623) <223> Promoteur MPr1097 dérive du promoteur petE par une délétion en 5' des séquences répétées inversées ainsi que de laboîte as-1 like porté par le fragment Sphl de 212 pb <220> <223> Promoteur MPrl097 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

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<400> 2 aagcttgcat gcagaagcat agagctgagc acacaattca taatttgaag gacacatgat 60 ttgctataaa gaactcttta gaagtaccac aactttgact gagtttgata tagctaataa 120 agatggagct cattataatt tgaatggcat aatcaagcta aacgaacaag cttagttaat 180 catgttaaac aacaattctt tgtaataata aattgtcttt caactagtcc aagtttatga 240 gttgattctt cggaataaat tagaaaatat cttagacttt atacttcatt gattatttca 300 tagagcaagt aggagaaata aaaatatact agtattattt actaaaaaaa atctaagcca 360 cgtcggagga taacatccaa cccagccaat cacagcaatg ttcatcagat aacccacttt 420 aagcccacgc actctgtggc acatctacat tatctaaatc acatattctt ccacacatct 480 tagccacaca aaaacccaat ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg 540 tgtgtctctc tttcgattcc cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta 600 ctcttgagaa acctagagga tcc 623 <210> 3 <211>326 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(326) <223> Le promoteur MPr1096 dérive du promoteur petE une délétion en 5' des séquences répétées inversées, des éléments "as-1 like" et " enhancer like" portés par deux fragments Spel 403 pb <220> <223> Promoteur MPrl096 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

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<400> 3 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga actagtatta tttactaaaa aaaatctaag 60 ccacgtcgga ggataacatc caacccagcc aatcacagca atgttcatca gataacccac 120 tttaagccca cgcactctgt ggcacatcta cattatctaa atcacatatt cttccacaca 180 tcttagccac acaaaaaccc aatccacatc tttatcatcc attctataaa aaatcacctt 240 ctgtgtgtct ctctttcgat tcccttcaaa cacatacaaa ttcagtagag aagaaactca 300 ttactcttga gaaacctaga ggatcc 326 <210> 4 <211> 207 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(207) <223> Le promoteur MPr1098 de 207 pb ne contient que les boîtes "TATA" et "CAAT" et correspond à une séquence promotrice minimale de référence sur le promoteur petE.

<220> <223> Promoteur Mpr1098 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

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<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 4 aagcttgcat gcctgctctg tggcacatct acattatcta aatcacatat tcttccacac 60 atcttagcca cacaaaaacc caatccacat ctttatcatc cattctataa aaaatcacct 120 tctgtgtgtc tctctttcga ttcccttcaa acacatacaa attcagtaga gaagaaactc 180 attactcttg agaaacctag aggatcc 207 <210> 5 <211> 281

<212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(281) <223> Le promoteur MPrl 108 a été créé en fusionnant la séquence de 72 pb, du promoteur petE portant les motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" à la séquence promotrice minimale de 187 pb de MPr1098 <220> <223> Promoteur MPrl 108 <300> <301>Last,D I.

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11pb en aval du point +1 <220> <223> Promoteur MPrl 109 <300>

<301 > Last, D. I.

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<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 6 aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60 tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg cacatctaca ttatctaaat 120 cacatattct tccacacatc ttagccacac aaaaacccaa tccacatctt tatcatccat 180 tctataaaaa atcacctttg tgtgtctctc tttcgattcc cttcaaacac atgagaaacc 240 tagaggatcc 250 <210> 7 <211> 280 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <22 1 > promoter <222> (1)..(280) <223> Le promoteur MPrl 110 a été créé en insérant à position-99 pb de MPr1098 un motif de 18 pb contenant une boîte "G" et en fusionnant séquence de 44 pb du promoteur de l'ARN 35S CaMV <220> <223> Promoteur MPrl 110 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 7 aagcttgcat gcctgcagac tagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 60 cgcatgccac tctgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 120 tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 180 taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 240 agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 280 <210> 8 <211>303 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221 > promoter <222> (1)..(303) <223> Le promoteur MPrl 153 aété obtenu en fusionnant séquence de 78 pb du promoteur petE, s'étendant la position -582 à la position -510 pb à modifiée par adjonction de la boîte "G" <220> <223> Promoteur MPrl 1153 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> PlantMol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 8 aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60 tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg cacatctaca ttatctaaat 120 ctaagccacg tcggaggata acatattctt ccacacatct tagccacaca aaaacccaat 180 ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg tgtgtctctc tttcgattcc 240 cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta ctcttgagaa acctagagga 300

<210> 9 <211> 296 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(296) <223> Promoteur MPrl 111 créé en insérant à la-99 pb de MPr1098, un motif de 18pb contenant une boîte "G" et en fusionnant une séquence de 58 pb (duplication du motif as-2 et asl) <220> <223> Promoteur MPrl 111 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 9 aagcttgcat gcctgcagac tagtgattga tgtgatatca agattgatgt gatatctcca 60 ctgacgtaag ggatgacgca tgccactctg tggcacatct acattatcta aatctaagcc 120 acgtcggagg ataacatatt cttccacaca tcttagccac acaaaaaccc aatccacatc 180 tttatcatcc attctataaa aaatcacctt ctgtgtgtct ctctttcgat tcccttcaaa 240 cacatacaaa ttcagtagag aagaaactca ttactcttga gaaacctaga ggatcc 296 <210> 10 <211>220 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(220) <223> Le promoteur MPrl 143 (Fig. II) a été obtenu délétant la séquence de 72 pb portant les motifs "as-2, as-2, as-1" de MPrl 111.

<220> <223> Promoteur MPr1143 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> PlantMol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 10 aagcttgcat gccgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 60 tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 120 taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 180 agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 220 <210> Il <21 1> 70 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de Construction "sens" SI <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> PlantMol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449

<307> 1993 <400> 11 ttcccttcaa acacatacaa attcagtaga gaagaaactc attactcttg agaaacctag 60 aggatccccg 70 <210> 12 <211>70 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de Construction "sens" S2 <220> <223> Oligonucléotide "sens" pour la construction des promoteurs par lb-PCR <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 12 cacaaaaacc caatccacat ctttatcatc cattctataa aaaatcacct tctgtgtgtc 60 tctctttcga 70 <210> 13 <211> 68 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de Construction "sens" S3 <220> <223> Oligonucléotide "sens" pour la construction des promoteurs par lb-PCR <300> <301>Last,D.I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 13 cataatttga acactctgtg gcacatctac attatctaaa tcacatattc ttccacacat 60 cttagcca 68 <210> 14 <211> 72 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de construction "sens" S4 <220> <223> Oligonucléotide "sens" pour la construction des promoteurs par Ib-PCR <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 14 ggaatctgca gttgaacacg tacaaactta cgtcatttgt gcatgcagaa gcatagagct 60 gagcacacaa tt 72

<210> 15 <211> 72 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de Construction "sens" S5 <220> <223> Oligonucléotide "sens" pour la construction des promoteurs par Ib-PCR <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 15 tgtggcaca tctacattat ctaaatctaa gccacgtcgg aggataacat attcttccac 60 acatcttagc ca 72 <210> 16 <211>63 <212>ADN <213> Artificial Séquence <220> <223> Motif de construction "sens" S6 <220> <223> Oligonucléotide "sens" pour la construction des promoteurs par lb-PCR <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989

<300> <301> Pwee, K H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 16 catgctgcag actagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 60 act 63 <210> 17 <211> 79 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de construction "sens" S7 <220> <223> Oligonucléotide "sens" pour la construction des promoteurs par lb-PCR <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 17 catgctgcag actagtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc cactgacgta 60 agggatgacg catgccact 79 <210> 18 <211>31 <212> ADN <213> Artificial Sequence

<220> <223> Motif de guidage de construction G <220> <223> Oligonucléotide de guidage pour la construction des promoteurs <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 18 tgtgtttgaa gggaatcgaa agagagacac a 31 <210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif de guidage G2 <220> <223> Oligonucléotide de guidage de construction des promoteurs <300> <301> Last, D. I
Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> PlantMol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<302> The pea plastocyanin promoter directs cell-specific but not full light-regulated expression in transgenic tobacco plants <303> Plant Journal

<304> 3 <306> 437-449 c307> 1993 <400> 19 attgggttt ttgtgtggct aagatgtgtg 30 <210)> 20 <211> 33 <212> ADN -213> Artificial Sequence 220> <223> Motif de guidage G3 220> <223> Oligonucléotide de guidage de construction des promoteurs 300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 20 agagtgttc aaattatgaa ttgtgtgctc agc 33 <210> 21 <211>28 <212>ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Motifde guidage G4 <220> <223> Oligonucléotide de guidage de construction des promoteurs <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H
Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993 <400> 21 tgtagatgtg ccacagagtg gcatgcgt 28 <210> 22 <211> 259 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(259) <223> Promoteur MPrl 112 diffère de MPrl 111 par une délétion de 35 pb contenant la boîte "G" et s'étendant de la position-127 à la position-89 et une délétion de deux pb situées en position -78 et -76 <220> <223> Promoteur MPr1 112 <300> <301> Last, D. I.

Gray, J. C.

<302> Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.

<303> Plant Mol. Biol.

<304> 12 <306> 655-666 <307> 1989 <300> <301> Pwee, K. H.

Gray, John C.

<303> Plant Journal <304> 3 <306> 437-449 <307> 1993

<400> 22 aagcttgcat gcctgcagac tagtgattga tgtgatatca agattgatgt gatatctcca 60 ctgacgtaag ggatgacgca tgccactctg tggcacatct acattatccc acacatctac 120 cacacaaaaa cccaatccac atctttatca tccattctat aaaaaatcac cttctgtgtg 180 tctctctttc gattcccttc aaacacatac aaattcagta gagaagaaac tcattactct 240 tgagaaacct agaggatcc 259

Claims

[REVENDICATIONS] 1) Promoteur chimérique d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois.

2) Promoteur chimérique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE du gène de la plastocyanine de pois dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
3) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID02.
4) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID03.
5) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID04.
6) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID05.
7) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID06.
8) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID07.
9) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence

<Desc/Clms Page number 67>

d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID08.

LO) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID09.

Ll) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID10.

L2) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID11.

L3) Promoteur chimérique d'expression comprenant une boîte "G" liée de manière opérationnelle en amont d'au moins une boîte "CAAT", une boîte "TATA" ou un site d'initiation (+1) de la transcription.

.4) Promoteur chimérique d'expression selon la revendication

13, caractérisé en ce que la boîte "G" est située en amont de la boîte CAAT.

.5) Promoteur chimérique d'expression selon la revendication

13, caractérisé en ce que la boîte "G" est située entre - 225 et - 65 par rapport au site d'initiation (+1).

.6) Promoteur chimérique d'expression selon la revendication

13, caractérisé en ce que la boîte "G" est située entre - 201 et - 115 par rapport au site d'initiation (+1).

.7) Promoteur chimérique d'expression selon la revendication

13, caractérisé en ce que la boîte "G" est située à - 201 par rapport au site d'initiation (+1).

.8) Promoteur chimérique d'expression selon la revendication

13, caractérisé en ce que la boîte "G" est située à - 115 par rapport au site d'initiation (+1).

.9) Promoteur chimérique selon la revendication 13, caractérisé en ce que la boîte "G" est d'origine végétale.

<Desc/Clms Page number 68>
20) Promoteur chimérique selon la revendication 13, caractérisé en ce que la boîte "G" est obtenue à partir d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois.
21) Promoteur chimérique selon la revendication 13, caractérisé en ce que la boîte "G" est obtenue à partir du promoteur petE du gène de la plastocyanine de pois.
22) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une boîte "nos E like" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".
23) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte "asl like" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".
24) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte "asl" liée de manière opérationnelle en amont de la boite "G".
25) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte "as2" liée de manière opérationnelle en amont de la boîte "G".
26) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence choisie parmi le groupe consistant en SEQ. ID02, SEQ. ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05,

SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ. ID09, SEQ. ID10, SEQ. ID11.
27) Cassette d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un promoteur du gène de la plastocyanine de pois, liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptide à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription.
28) Cassette d'expression selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence

<Desc/Clms Page number 69>

d'acide nucléique dérivée du promoteur petE du gène de la plastocyanine de pois dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
29) Cassette d'expression selon la revendication 28 caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID02.
30) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID03.
31) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID04.
32) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID05.
33) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID06.
34) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID07.
35) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID08.
36) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID09.

<Desc/Clms Page number 70>
37) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID10.
38) Cassette d'expression selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dérivée du promoteur petE consiste en la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID11.
39) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence dérivée de la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
40) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID02.
41) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID03.
42) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID04.
43) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID05.
44) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID06.
45) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID07.
46) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID08.
47) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID09.

<Desc/Clms Page number 71>
48) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID10.
49) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID11.
50) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID12.
51) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID13.
52) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID14.
53) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID15.
54) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID16.
55) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la

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séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID17.
56) Motif désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications

1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID18.
57) Motif de guidage désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro

SEQ. ID19.
58) Motif de guidage désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro

SEQ. ID20.
59) Motif de guidage désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro

SEQ. ID21.
60) Motif de guidage désoxynucléotidique de construction d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence identifiée sous le numéro

SEQ.ID22.
61) Vecteur comprenant un promoteur, ou une séquence d'acide nucléique promotrice, capable d'initier la transcription d'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide à produire, caractérisé en ce que le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice correspond à un

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promoteur chimérique d'expression ou à une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49.
62) Vecteur selon la revendication 61, caractérise en ce qu'il est choisi dans le groupe consistant en les vecteurs binaires identifiés sous les numéros pMRT1151, pMRT1149, pMRT1170.
63) Procédé d'obtention d'un promoteur chimérique d'expression ou d'une séquence d'acide nucléique promotrice isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - effectuer une réaction de ligation en chaîne, appelée

LCR, produisant un ADN simple brin continu à partir d'au moins un motif désoxynucléotidique de construction choisi parmi le groupe consistant en les désoxynucléotides "sens"

SI, S2, S3, S4, S5, S6, et S7 identifiés sous les numéros

SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID14, SEQ.ID15, SEQ.ID16, SEQ.ID17 et SEQ. ID18 respectivement, et au moins un motif de guidage désoxynucléotidique de construction de ladite séquence d'acide nucléique promotrice ou du promoteur choisi parmi le groupe consistant en les désoxynucléotides de guidage

Gl, G2, G3, et G4 identifiés sous les numéros SEQ.ID19,

SEQ. ID20, SEQ.ID21 et SEQ.ID22 respectivement ; - effectuer une amplification PCR sur le simple brin obtenu dans l'étape précédente permettant d'obtenir un ADN double brin correspondant au promoteur chimérique d'expression ou à la séquence d'acide nucléique promotrice; - éventuellement isoler le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice.
64) Procédé selon la revendication 63, caractérisé en ce que l'on phosphoryle les motifs désoxynucléotidiques de construction avant ligation.
65) Procédé selon la revendication 63, caractérisé en ce que la ligation s'effectue en présence d'au moins une ligase d'ADN dans un thermocycleur, selon les conditions suivantes :

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- un cycle d'environ une minute à environ 94 C : - huit cycles identiques chacun composé de la succession d'étapes suivantes : - une minute à 65 C, une minute à 57 C, une minute à 52 C, une minute à 48 C, une minute à 43 C et dix minutes à 37 C.
66) Plante transgénique ayant intégré de manière stable dans son génome au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49 respectivement.
67) Plante transgénique selon la revendication 66, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les espèces dicotylédones, telles que la pomme de terre, le tabac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.
68) Propagule d'une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 66 ou 67.
69) Propagule d'une plante transgénique selon la revendication

68, caractérisée en ce qu'elle est une semence.
70) Cellule contenant un promoteur ou une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49 respectivement.
71) Cellule selon la revendication 70, caractérisée en ce qu'elle est une cellule végétale.
72) Méthode d'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49 ; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique,

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ou gène, codant pour le polypeptide.
73) Méthode selon la revendication 72, caractérisée en ce que la cellule est une cellule procaryote ou eucaryote.
74) Méthode selon l'une quelconque des revendications 72 ou 73, caractérisée en ce que la cellule est une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules microbiennes, les cellules fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales.
75) Méthode selon l'une quelconque des revendications 72 à 74, caractérisée en ce que la cellule est une cellule végétale.
76) Méthode d'obtention d'une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 66 ou 67, ou d'une propagule selon la revendication 68, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 ou 39 à 49 ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.