JP2002539795A - エンドウマメ由来のプラストシアニンｐｅｔＥプロモータに基づいたキメラプロモータ - Google Patents

エンドウマメ由来のプラストシアニンｐｅｔＥプロモータに基づいたキメラプロモータ

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JP2002539795A
JP2002539795A JP2000606765A JP2000606765A JP2002539795A JP 2002539795 A JP2002539795 A JP 2002539795A JP 2000606765 A JP2000606765 A JP 2000606765A JP 2000606765 A JP2000606765 A JP 2000606765A JP 2002539795 A JP2002539795 A JP 2002539795A
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ヴェロニク・グリュベ
マンフレッド・テイザン
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    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータ由来の少なくとも１の核酸配列を含むキメラプロモータに関するものであるが、その核酸配列は好ましくは、ｐｅｔＥプロモータ由来である。このキメラプロモータは、宿主細胞で産生されることが望ましいポリペプチドをコードする遺伝子に、操作可能なように連結して使用され、その連結の位置は、転写開始部位（＋１）に対して-２０１位ないし-１１５位に位置する。本発明は更に、このようなキメラプロモータを産生する方法、発現カセット、ベクター、及びこれらを含むトランスジェニック植物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に植物バイオテクノロジーの分野に使用するのに適切かつ適合し
た、キメラ発現プロモータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、発現プロモータは、バイオテクノロジーおよび遺伝子操作の分野で公
知である。植物バイオテクノロジーに特に関する限り、宿主細胞で産生されるこ
とが望ましいポリペプチドをコードする遺伝子の発現の程度は、使用するプロモ
ータに依存することが多い。広範に使用される様々なプロモータが、しばしば、
特殊な適用または特定の細胞組織に限定される。これは単に、その組織特異性ま
たは発現強度のためである。例えば、比較的に強力なプロモータとして、例えば
nos遺伝子を起源とするプロモータと比べて、カリフラワーモザイクウイルスの3
5Sプロモータを引用し得、これらの両方のプロモータが、植物バイオテクノロジ
ーの分野に特に使用されている。従って、今までに現在使用されているプロモー
タに固有の問題を克服できる、新しく有用なプロモータが現在必要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
この問題を解決する１つの試みが、第WO97/20056号で公開されたPCT出願に報
告され、これは、既知のプロモータにおける「エンハンサ」（すなわち、プロモ
ータの活性に正の効果を有する）の使用による、遺伝子発現の程度の増加を記載
する。「エンハンシング」ヌクレオチド配列は、ＡおよびＴ塩基に富み、前記塩
基の総量は、50％以上の「エンハンサ」のヌクレオチド配列を含む。特に、この
ＰＣＴ出願の出願人は、エンドウマメプラストシアニンプロモータを起源とする
「エンハンサ」領域の使用を明記する。
【０００４】 本明細書および特許請求の範囲に使用した表現は以下の意味を有するものとす
る。
【０００５】 -「核酸」は、DNAまたはRNAを意味する； -「核酸配列」は、５’末端から３’末端に解読されたヌクレオチド塩基の、一
本鎖または二本鎖オリゴマーまたはポリマーを意味し、そして、自己複製プラス
ミド、遺伝子、DNAまたはRNAのポリマー（感染性またはそうではない）、および
またDNAまたはRNA（機能的またはそうではない）を含む。本出願に使用したヌク
レオチド記号において、特記しない限り、一本鎖ヌクレオチド配列の左末端は５
’末端である； -「派生核酸配列」は、配列が、例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの
、置換、欠失、付加、変異、断片化、および／または合成により、言及した配列
から直接的にまたは間接的に派生することを意味する；
【０００６】 -「プロモータ」または「促進核酸配列」は、翻訳の開始コドンの上流にあり
、ポリメラーゼRNAおよび転写に関与する他のタンパク質の認識および結合に関
与する、核酸領域を意味する； -「植物プロモータ」は、植物細胞の転写を開始できるプロモータを意味する； -「構成性プロモータ」は、前記生物の発達中、宿主生物の全てまたはほぼ全て
の組織において、前記プロモータに作動可能に連結した核酸配列を発現できるプ
ロモータを意味する； -「組織特異的プロモータ」は、宿主生物のある特異的な組織において、前記プ
ロモータに作動可能に連結した核酸配列を選択的に発現できるプロモータを意味
する；
【０００７】 -「作動（操作）可能にまたは機能的に連結」は、プロモータが連結核酸配列
の転写に正に影響を及ぼすかまたは駆動するように、産生されることが望まれる
タンパク質をコードする、発現すべき核酸配列または遺伝子への、プロモータま
たはプロモータ核酸配列の連結を意味する。プロモータ配列は、転写開始部位と
翻訳開始コドンの間に位置する転写される配列も含み得ることを理解しなければ
ならない；
【０００８】 -「産生されることが望まれるポリペプチドをコードする、発現すべき核酸配
列または遺伝子」は、ポリペプチド、好ましくは外来性または異種性ポリペプチ
ドをコードする、遺伝子または核酸配列を意味し、前記外来性ポリペプチドは、
より好ましくは、医薬的に、治療的に、または美容的に有効な物質、例えばタン
パク質、酵素、阻害剤、受容体、抗体、抗原、その治療的に有効な断片である。
宿主細胞において対応する遺伝子または核酸配列の発現により産生し得る、異種
または外来性の治療に有効な物質の例は、構造タンパク質、例えばコラーゲン、
鉄輸送タンパク質またはトランスフェリン、例えばラクトフェリン、血液由来タ
ンパク質、例えばヘモグロビン、ヒト血清アルブミン、エリスロポエチン、成長
刺激因子、タンパク質分解性または抗タンパク質分解性酵素、例えばアルファ-
アンチトリプシン、ホルモン、二次代謝物、消化酵素、例えば胃リパーゼ、膵リ
パーゼ、トリプシン、キモトリプシン、アルコールデヒドロゲナーゼ、脳由来神
経栄養因子、強心剤または心変性剤、および血圧制御剤、例えばアンギオテンシ
ンである。
【０００９】 -「発現カセット」は、かかる発現カセット配列と適合性の、宿主生物で産生
されることが望まれるポリペプチドをコードする核酸配列または遺伝子の発現を
駆動できる、ヌクレオチド配列を意味する。かかる発現カセットは、一般に、少
なくとも１つのプロモータおよび転写終結シグナル、および所望により発現に必
要または有用な他の因子を含む；
【００１０】 -「ベクター」は、例えば、DNAで覆膜したプロジェクタイル、核酸をベースと
した輸送ベヒクル、核酸配列の送達に適応した核酸分子、および環状自己複製DN
A、例えばプラスミド、コスミド、ファージミド等の発現系を意味する。組換え
微生物または組換え細胞培養物が「発現ベクター」の宿主として記載される場合
、これはまた、環状染色体外DNA（例えば、ミトコンドリアまたはクロロプラス
トDNA）、宿主染色体（群）に組込まれたDNA、宿主ゲノムに自律的構造として組
込まれた有糸分裂中に細胞により安定に複製される、または宿主の核または細胞
質に維持されるベクターを含む；
【００１１】 -「プラスミド」は、細胞中で複製できる環状自律的DNA分子を意味し、「発現
プラスミド」および「非発現プラスミド」の両方を含む。組換え微生物または細
胞培養液を、「発現プラスミド」の宿主として記載する場合、これはまた、環状
染色体外DNAおよび宿主染色体（群）に組込まれたDNAの分子を含む。プラスミド
が宿主細胞により維持される場合、プラスミドは、自律的構造として有糸分裂中
に細胞により安定に複製されるか、または宿主ゲノムに組込まれる；
【００１２】 -「異種配列」または「異種核酸配列」は、環境に異質な起源または種から起
始する、またはそれが同じ環境から起始する場合、その最初の形と比べて修飾さ
れている配列を意味する。核酸配列の修飾は、例えば、核酸を制限酵素で処理し
て、プロモータに作動可能に連結できる核酸断片を作成することにより実施でき
る。修飾はまた、部位特異的変異誘発のような技法を使用して実施できる。
【００１３】 -「ボックス」は、調節機能を有する核酸配列を意味する；
【００１４】 -「類似（様）」は、ボックスおよび／または核酸配列（この後者の語が関連
する）が、基準として示した既知のボックスおよび／または既知の核酸配列と、
ある配列同一性または相同性を、好ましくは基準配列と少なくとも５０％の配列
同一性、さらにより好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、最も好ましくは
少なくとも９０％の配列同一性を含むことを意味する。
【００１５】 配列の同一性％は、少なくとも６個連続したヌクレオチド塩基の比較窓を基に
計算する。比較窓の決定は、基準配列との相同性を決定するために、配列アライ
ンメントアルゴリズム、例えば、局所相同性アルゴリズム、相同性アラインメン
トアルゴリズム、および類似性探索アルゴリズムを使用することにより実施でき
、これらのアルゴリズムはまたコンピュータープログラムとして存在し、ＧＡＰ
、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどの名称で称される。配列
同一性％は、１つまたはそれ以上の上記の方法を使用して、基準配列を、ボック
スおよび／または核酸配列と比較することにより得られる；
【００１６】 -「位置する」は、例えば「ボックス」、制限部位、または特定の機能を有す
るコドンなどの、同定したエレメントの核酸配列上での位置を意味する。数で示
した位置は、＋１として示した転写開始部位の位置に関する、核酸配列の解読方
向で、すなわち５’→３’の方向での、核酸配列のエレメントの開始の位置を意
味する；
【００１７】 -「トランスジェニック植物」は、遺伝子操作技法の適用により得られた植物
を意味し、かかる技法により得られた全植物、その子孫、並びに、かかる技法に
より得られた、植物器官、例えば、以下に限定されないが、根、幹、葉および葉
群を含む。本発明により得られたトランスジェニック植物はまた、異なる度合い
の複相体を有し得、例えば、倍数体、二倍体、および一倍体であり得る；
【００１８】 -「ムカゴ」は、構造的または非構造的植物細胞の蓄積塊またはその会合また
は凝集を意味し、これはそれから全植物を再生でき；かかる会合は、例えば、外
植片、カルス、幹、葉、根、挿し木、およびさらには種子の形であり得る。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本出願人は、出願人により実施されたもの、または以前に議論されたＰＣＴ出
願とは完全に異なるアプローチを実施している。予期せず見つけたことには、本
出願人は、以前に表明された必要性を満たし、特に、現在使用されている既存の
プロモータと比べて、宿主細胞、好ましくは植物細胞で産生されることが望まれ
るポリペプチドをコードする、前記プロモータに作動可能に連結した遺伝子また
は核酸配列の発現程度を増加できる、キメラプロモータを産生することができた
。
【００２０】 さらに、本出願人は、同時に、選択したプロモータが、使用するつもりの特定
の仕事または適用または環境に最も適し、従って、宿主細胞で産生されることが
望まれるポリペプチドをコードする、発現すべき遺伝子、または前記プロモータ
に作動可能に連結した核酸配列の発現程度を制御できるプロモータの選択が可能
となるように、プロモータのファミリーを作製することができた。
【００２１】 結果として、本発明の目的の１つは、配列番号０１で同定された配列を有する
エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータから得られた少なくとも１つ
の核酸配列を含む、キメラ発現プロモータである。
【００２２】 好ましくは、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータから得られた
核酸配列を含むキメラプロモータは、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０
４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９
、配列番号１０、および配列番号１１で配列表中に同定された配列からなる群か
ら選択される。
【００２３】 さらに、本出願人は、興味深いプロモータ活性を有し、同時に最小の調節ボッ
クス、特に少なくとも１つの、「Ｇ」ボックス、「CAAT」ボックスおよび「TATA
」ボックスを有する、本発明に記載のプロモータ、および特に植物プロモータを
構築することが可能であることを注記し、唯一の条件は、「Ｇ」ボックスが、他
のボックスの上流に、すなわち核酸配列の５’領域に位置し、この「Ｇ」ボック
スは、他のボックスの上流のある距離に優先的に位置し、ヌクレオチド塩基で発
現されることである。従って、本発明の別の目的は、少なくとも１つの「CAAT」
ボックス、１つの「TATA」ボックス、および転写開始部位（図で＋１により示さ
れる）の上流に作動可能に連結した「Ｇ」ボックスを含むキメラ発現プロモータ
である。より好ましくは、「Ｇ」ボックスは、転写開始部位（＋１）に関して、
-２２５位ないし-６５位に位置する。
【００２４】 さらにより好ましくは、「Ｇ」ボックスは、転写開始部位（図で＋１により示
される）に関して-２０１位ないし-１１５位に位置する。最も好ましい実施形態
において、「Ｇ」ボックスは、転写開始部位（図で＋１により示される）に関し
て、-２０１位、または-１１５位に位置する。 有利には、「Ｇ」ボックスは、植物起源である。好ましくは、「Ｇ」ボックス
は、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータから得られる。さらによ
り好ましくは、「Ｇ」ボックスは、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のpetE
プロモータから得られる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明のプロモータの好ましい実施形態によると、プロモータは、「Ｇ」ボッ
クスの上流に作動可能にまたは機能的に連結した「nosE類似」ボックスをさらに
含む。
【００２６】 本発明の別の好ましい実施形態によると、プロモータはまた、連続的にまたは
別々に並んだ、「Ｇ」ボックス、好ましくは２つまたはそれ以上のかかるボック
ス、最も好ましくは４つのかかるボックスに作動可能にまたは機能的に連結した
、少なくとも１つの「as1」または「as1類似」ボックスを含む。これらの「as1
」または「as1類似」ボックスは、前記「Ｇ」ボックスの上流および下流の両方
で連結し得、好ましくはその上流で連結する。本発明の別の好ましい形態におい
て、１つまたはそれ以上の「as1」または「as1類似」ボックスはまた、逆の順序
として知られるもので、すなわち３’から５’の方向で、好ましくは逆位反復順
序で整列し得る。
【００２７】 本発明の１つの特定の好ましい実施形態によると、プロモータはまた、「Ｇ」
ボックス、および連続的にまたは別々に整列した、好ましくは２つまたはそれ以
上のかかるボックス、最も好ましくは４つのかかるボックスに作動可能にまたは
機能的に連結した、少なくとも１つの「as2」ボックスを含む。これらのボック
スはまた、好ましくは、前記「Ｇ」ボックスの上流および下流の両方で連結され
得、より好ましくはその上流に連結する。本発明の別の好ましい形態において、
いくつかまたは全てのボックスがまた、逆の順序として知られるもので、または
上記の逆位反復配列で整列し得る。
【００２８】 最後に、さらにより好ましくは、上記のキメラプロモータは、配列番号０２、
配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配
列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、および配列番号１１で配列表に同定
された配列からなる群から選択された少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００２９】 本発明のさらに別の目的は、発現が望まれるポリペプチドをコードする遺伝子
または核酸配列に作動可能にまたは機能的に連結した、エンドウマメプラストシ
アニン遺伝子のプロモータから得られた少なくとも１つの核酸配列を含む発現カ
セットであり、前記コーディング核酸配列は、次いで、転写終結核酸配列に作動
可能にまたは機能的に連結しており、ここで、エンドウマメプラストシアニン遺
伝子のプロモータから得られた核酸配列は、配列番号０２、配列番号０３、配列
番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番
号０９、配列番号１０、および配列番号１１で配列表に同定した配列から選択さ
れる。
【００３０】 本発明の別の目的は、配列が、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、
配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配
列番号１０、および配列番号１１で配列表に同定した配列からなる群から選択さ
れることを特徴とする、単離プロモータ核酸配列である。かかる配列は、配列番
号０１で配列表に同定した配列への、またはそれからの、１つまたはそれ以上の
核酸の欠失、置換、付加により得られ得る。
【００３１】 本発明のまたさらに別の目的は、以前に同定したプロモータまたはプロモータ
核酸配列の作成のための、デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド要
素に関する。これらの要素は以下であり得る：
【００３２】 -構成要素（ビルディングブロック）または「指向性（directional）」要素、
すなわち、配列の５’末端から配列の３’末端である、最終プロモータまたはプ
ロモータ核酸配列と同じ方向に解読される配列；および／または -「ガイド用」要素、すなわち、末端が、指向性構成要素の末端を補完および重
複するヌクレオチドまたはヌクレオシド塩基を含む配列。
【００３３】 従って、最も好ましくは、指向性構成要素は、配列番号１２、配列番号１３、
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１
８で配列表に同定された配列からなる群から選択された少なくとも１つの配列に
対応する。
【００３４】 さらに、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２で
配列表に同定された配列からなる群から選択された少なくとも１つの配列に対応
するガイド用要素を使用することが好ましい。
【００３５】 本発明の別の目的は、プロモータまたはプロモータ核酸配列が、前記に定義し
たキメラ発現プロモータまたはプロモータ核酸配列に対応することを特徴とする
、産生されることが望まれるポリペプチドをコードする遺伝子または核酸配列の
転写を開始できる、プロモータまたはプロモータ核酸配列を含むベクターである
。好ましくは、ベクターは、pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170で同定されたバイナ
リーベクターからなる群から選択される。
【００３６】 本発明のまたさらなる別の目的は、以前に同定したようなキメラ発現プロモー
タまたは単離プロモータ核酸配列の製造プロセスであり、これは、以下の段階を
含むことを特徴とする：
【００３７】 -ＬＣＲと称されるライゲーション連鎖反応を実施して、前記プロモータ核酸
配列またはプロモータを構築するために、それぞれ配列番号１２、配列番号１３
、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１
８で配列表に同定された、指向性構成要素Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６
、およびＳ７からなる群から選択された、少なくとも１つの指向性構成要素デオ
キシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド配列、および、少なくとも１つの
デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドガイド用要素から、連続的一
本鎖DNA分子を作成し、ここでのガイド用要素は、それぞれ配列番号１９、配列
番号２０、配列番号２１および配列番号２２で配列表に同定されたガイド用配列
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４からなる群から選択され；
【００３８】 -前の段階から得られた一本鎖にＰＣＲ増幅を実施し、よって、キメラ発現プ
ロモータまたはtotプロモータ核酸配列に対応する二本鎖DNAを作成でき；
【００３９】 -所望によりプロモータまたはプロモータ核酸配列を単離する。
【００４０】 好ましくは、デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド構成要素は、
ライゲーション前にリン酸化する。さらにより好ましくは、ライゲーションは、
以下の条件下で、サーモサイクル中で少なくとも１つのDNAリガーゼの存在下で
実施する： -約94℃で約１分間の第一サイクル； -各々が以下の段階を含む、８回のその後の同一サイクル： -65℃で１分間、57℃で１分間、52℃で１分間、48℃で１分間、43℃で１分間、
および37℃で１０分間。
【００４１】 本発明の別の目的は、そのゲノムに、以前に定義した少なくとも１つのプロモ
ータまたは少なくとも１つのプロモータ核酸配列が安定に組込まれたトランスジ
ェニック植物である。好ましくは、トランスジェニック植物は、双子葉種、例え
ば、好ましくはジャガイモ、タバコ、ワタ、レタス、トマト、メロン、キュウリ
、エンドウマメ、セイヨウアブラナ、アオゲイトウ、およびヒマワリから、およ
び／または、単子葉種、例えば、好ましくはコムギ、オオムギ、カラスムギ、イ
ネおよびトウモロコシから選択される。
【００４２】 本発明の別の目的は、トランスジェニック植物ムカゴであり、ここでのムカゴ
は以前に定義した定義を有し、好ましくはムカゴは種子である。
【００４３】 本発明のまた別の目的は、以前に定義したプロモータまたはプロモータ核酸配
列を含む細胞である。好ましくは、細胞は、原核または真核細胞であり、さらに
より好ましくは、細菌、昆虫、動物、ヒト、真菌、藻類、酵母および植物細胞か
らなる群から選択される細胞であり、最も好ましくは植物細胞である。
【００４４】 本発明の他の好ましい目的には、細胞で産生されることが望まれるポリペプチ
ドをコードする、核酸配列または遺伝子の発現プロセスがあり、これは、以下の
段階を含むことを特徴とする： -産生すべきポリペプチドをコードする核酸配列または遺伝子（これ自体、転写
終結シグナルに作動可能に連結している）に作動可能に連結した、以前に定義し
た少なくとも１つのプロモータまたは少なくとも１つのプロモータ核酸配列を含
むベクターで、細胞を形質転換し； -細胞を、ポリペプチドをコードする、核酸配列または遺伝子の発現が可能とな
る条件で培養する。
【００４５】 好ましくは、この方法に使用した細胞は、原核または真核細胞である。さらに
より好ましくは、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞
、および植物細胞からなる群から選択された細胞であり、最も好ましくは植物細
胞である。
【００４６】 最後に、本発明の別の目的は、以前に定義した、トランスジェニック植物の、
またはムカゴの産生プロセスであり、プロセスは以下を含む段階を含むことを特
徴とする： -植物細胞を、以前に定義した少なくとも１つのプロモータまたは少なくとも１
つのプロモータ核酸配列を含むベクターで形質転換し； -プロモータまたはプロモータ核酸配列がそのゲノムに組込まれた植物細胞を選
択し； -培養により、全キメラまたはトランスジェニック植物の再生により、形質転換
および選択した植物細胞を増殖させる。
【００４７】 本発明は、最善の形態であるが、非限定的な実施例として以下に示した数個の
好ましい実施形態の以下の詳細な説明により、および図面を参照することにより
、より良く理解されるだろう。図１、２および３は、本発明のキメラ発現プロモ
ータと前記基準作成物の間の比較を可能とする、比較基準分子作成物の構造の図
解を示す。
【００４８】 様々な図において、ある用語および表現は、以下の意味を有する： -uidA＝ベータ-グルクロニダーゼをコードする配列； -IV2＝パタチン遺伝子イントロン； -nos term＝ノパリンシンターゼ遺伝子由来の終結因子； -35S term＝CaMVの35S RNA由来の終結因子； -Ｂ＝エンドヌクレアーゼ制限部位BamHI； -Ｅ＝エンドヌクレアーゼ制限部位EcoRI； -Ｈ＝エンドヌクレアーゼ制限部位HindIII； -Ｐ＝エンドヌクレアーゼ制限部位PstI； -Ｓｐ＝エンドヌクレアーゼ制限部位SphI； -as-1＝CaMV35Sプロモータ由来の活性化配列１； -as-2＝CaMV35Sプロモータ由来の活性化配列２； -nosE＝ノパリンシンターゼプロモータ由来の活性化ボックス； -Ｄ＝１’エンドヌクレアーゼDraIIIの制限部位； -Ｈ＝エンドヌクレアーゼ制限部位HindIII； -Ｐ＝エンドヌクレアーゼ制限部位PstI； -Ｓ＝エンドヌクレアーゼ制限部位SpeI； -Ｓｐ＝エンドヌクレアーゼ制限部位SphI； -CAAT＝「CAAT」ボックス； -Ｇ＝「Ｇ」ボックス； -TATA＝「TATA」ボックス； -＋１＝転写開始部位； -「類似（様）」は、配列がその名称を得る基準配列に１００％同一ではないこ
とを意味する。
【００４９】
【実施例】
実施例１ １．比較作成物（対照） 本出願に記載のキメラ発現プロモータの比較を可能にするために、ベータ-グ
ルクロニダーゼ（Jeffersonら、１９８６）をコードし、またジャガイモパタチ
ンからの遺伝子ST-LS-1のIV2イントロンの核酸配列を含む（Vancanneytら、１９
９０）（uidA-IV2）uidA遺伝子を、プロモータの１つおよびノパリンシンターゼ
遺伝子（nos term）由来の終結因子の制御下に配置した。この作成物を、Agroba
cterium tumefaciensに、Promega Corp（マジソン、米国）により販売のプラス
ミドベクターpGEM3Zにクローニングすることにより移した。
【００５０】 １．１．pMRT1144として同定された陰性対照の作成 クローニングを容易にするために、全てのプロモータ配列の非存在下で「uidA
-IV2/nos term」配列のみを有した、pGEM3Zから得られたプラスミドベクターを
作成した。このプラスミドは、pMRT1144と称され、陰性対照として作用した（図
１）。uidA/nos term配列を、pGEM3Zプラスミドに導入し、uidA配列を、エンド
ウマメプラストシアニン遺伝子の全プロモータの制御下に配置し、ノパリンシン
ターゼ終結因子を、５μｇのpGA492-PpetEプラスミドから単離した。後者のプラ
スミドは、プラスミドpGA492-Pem2-uidAに、bpI1221-Pem2プラスミドを起源とす
る、em2プロモータ（Gaubierら、１９９３）の代わりに、プラスミドpKHn2から
得られたエンドウマメプラストシアニン遺伝子由来のpetEプロモータ（Pweeおよ
びGray、１９９３）をクローニングすることにより得られた。bpI221-Pem2プラ
スミドを、２０単位の各酵素HindIIIおよびEcoRIで１時間37℃で消化した。次い
で、発現カセット「Pem2/uidA/nos term」を、0.8%アガロースゲル電気泳動によ
り分離し、電気溶出し、ｐＨ4.8の１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび-80
℃の２．５容量の無水エタノールの存在下で３０分間沈降させ、１２０００ｇで
３０分間遠心分離し、70％エタノール中で洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁し、プ
ラスミドpGA492の部位HindIIIとEcoRIの間に挿入した（An、１９８６）。ライゲ
ーションを、１．０μｌのT410×DNAリガーゼ緩衝液（Amersham）および２．５
単位のＴ４DNAリガーゼ（Amersham）の存在下で14℃で１６時間実施した。生存
可能でコンピテントEscherichia coli DH5アルファ細菌を形質転換した（Hannah
an、１９８３）。テトラサイクリン（１２ｍｇ／ｌ）で補充したルリア-ベルタ
ニ培地（ＬＢ、バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出液５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１
０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNA
を、BirnboimおよびDoly（Birnboim&Doly、1983）のアルカリ溶解法に従って抽
出し、酵素的消化により解析した。
【００５１】 かくして得られたpGA492-Pem2-uidAプラスミドから出発して、プロモータPem2
を、HindIIIおよびXbaIによる二重消化により欠失させた。目的のプラスミド断
片を、0.8％のアガロースゲル電気泳動により分離し、電気溶出し、１／１０容
量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の-80℃の無水エタノー
ルの存在下で３０分間沈降させ、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、70％エタ
ノール中で洗浄し、乾燥させ、製造業者の薦めに従って、DNAポリメラーゼＩ（N
ew England Biolabs）のクレノウ断片の作用にかけた。次いで、１容量のフェノ
ール、次いで１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５
：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）および最後に１容量のクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１ｖ／ｖ）で抽出することにより除タンパクし、１／１０容量のｐ
Ｈ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の-80℃の無水エタノールの存
在下で沈降させ、次いで、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、７０％エタノー
ルで洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁した。次いで、製造業者の薦めに従って、１
０単位の子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim）の助けによ
り１時間37℃で脱リン酸化し、１容量のフェノール、次いで１容量のフェノール
：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）および最
後に１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）での抽出
により除タンパクし、１／１０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２
．５容量の-80℃の無水エタノールの存在下で３０分間沈降させ、次いで１２０
００ｇで３０分間遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、次いで水に再懸濁し
た。得られたプラスミドはpGA492deltaPem2と称した。
【００５２】 平行して、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータに対応する、pe
tEプロモータ（８１８塩基対）が、NcoIによる１時間で37℃の消化によりプラス
ミドpKHn2から得られた。８２８ｂｐプロモータ断片を、0.8%ゲルアガロース上
で単離し、電気溶出し、１／１０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび
２．５容量の-80℃の無水エタノールの存在下で３０分間沈降させ、１２０００
ｇで３０分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁し、
次いで５単位のマグビーンヌクレアーゼ（New England Biolabs）の作用に３０
分間30℃で製造業者の薦めに従ってかけ、１容量のフェノール、次いで１容量の
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ
）および最後に１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ
）での抽出により除タンパクし、１／１０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび２．５容量の-80℃の無水エタノールの存在下で３０分間沈降させ、次
いで、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ
、次いで水に再懸濁した。このプロモータ断片を、上記したプラスミドpGA492de
ltaPem2に、１．０μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（Amersham）および２．５
単位のT4DNAリガーゼ（Amersham）の存在下で14℃で１６時間で挿入した。生存
可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細菌を形質転換した。テト
ラサイクリン（１２ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクロ
ーンのプラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析
した。得られたプラスミドをpGA492-petE promと称した。
【００５３】 発現カセット「petE prom/uidA/nos term」を単離するために、５μｇのプラ
スミドpGA492-petE promを、PstI（プラストシアニン遺伝子プロモータ上の５’
部位）およびEcoRI（終結配列上の３’部位）により１時間37℃で消化し、0.8％
アガロースゲル電気泳動にかけ、Qiaquickアフィニティーカラム（Qiagen、Hild
en、Allemagne）上で製造業者の薦めに従って精製した。その間に、５００ｎｇ
のpGEM3Zプラスミドを、１時間37℃でEcoRIおよびPstI（マルチクローニングサ
イトまたはポリリンカーに存在する制限部位）で同時に消化し、0.8%ゲル電気泳
動にかけ、次いで、Qiaquickアフィニティーカラム上で精製した。
【００５４】 ライゲーションを、５０ｎｇのベクターpGEM3Z-PstI/EcoRIおよび５０ｎｇの
発現カセット「petE prom/uidA/nos term」を用いて、一晩18℃で、１２μｌの
反応媒体中で、１．２μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs
）および４００単位のT4DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施し
た。以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファを
、ライゲーション反応混合物を混合することにより形質転換した。アンピシリン
（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラス
ミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られ
たプラスミドをpGEM3Z-petE promと称した。
【００５５】 ジャガイモパタチン遺伝子を起源とする１９２ｂｐのＩＶイントロンを、uidA
コーディング配列に挿入するために、次いで、この遺伝子の内部部分（pGEM3Z-p
etE promのSnaBI/BstBI７１０ｂｐ断片）を切り出し、次いでIV2イントロン（Sn
aBI/BstI９０２ｂｐ断片）を含む等価な配列で置換した。これを達成するために
、プラスミドpGEM3Z-petE promを１時間37℃で、SnaBI（uidA遺伝子のＡＴＧ開
始コドンの上流の＋３８３ｂｐに位置する制限部位）により、次いで、１時間65
℃でBstBI（＋１０９３ｂｐ位に位置する制限部位）により消化した。７１０ｂ
ｐの欠失を含むプラスミドを、0.8%アガロースゲル電気泳動により単離し、次い
で、Qiaquickアフィニティカラムで精製した。
【００５６】 ３８３から１０９３ｂｐ位に伸長したuidA配列の続く、IV2イントロン配列に
対応するBstBI/SnaBI９０２ｂｐ断片を単離し、プラスミドpSCV1.2-GI.から精製
した。このプラスミドは、プラスミドpSCV1.2から得られ、これは次いでクロー
ニングで常々使用され当業者に公知の方法に従って１９９０年にG.A.Edwardsに
より作成されたプラスミドpSCV1から得られる。バイナリープラスミドpSCV1.2を
、pSCV1のHindIII部位に発現カセット「35S prom/nptII/nos term」（Frommら、
1986）を有するHindIII断片をクローニングすることにより得られた。発現カセ
ット「35S prom/GUS-IV2/35S term」は、Vancanneytら（１９９０）に記載のよ
うに、プラスミドp35S GUS INTを、HindIIIで１時間37℃で消化することにより
得られた。発現カセットに対応するDNA断片を、0.8%アガロースゲル上で単離し
、次いで電気溶出し、１／１０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２
．５容量の-80℃の無水エタノールの存在下で３０分間沈降させ、１２０００ｇ
で３０分間遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁した
。この断片の突出５’末端を、製造業者の薦めに従って３０分間37℃でDNAポリ
メラーゼＩのクレノウ断片（New England Biolabs）を用いて平滑とし、断片を
、１容量のフェノール、次いで１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）、最後に１容量のクロロホルム：イソ
アミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）での抽出により除タンパクし、１／１０容
量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の-80℃の無水エタノー
ルの存在下で３０分間沈降させ、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、７０％エ
タノールで洗浄し、乾燥させ、最後に、SmaIで１時間25℃で以前に消化した２０
ｎｇのプラスミドpSCV1.2と、１．０μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（Amersha
m）および２．５単位のT4DNAリガーゼ（Amersham）の存在下で14℃で１６時間で
ライゲートした。
【００５７】 以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細菌
を形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択し
た、得られたクローンのプラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵
素消化により解析した。
【００５８】 ５マイクログラム（５μｇ）のpSCV1.2-GIプラスミドを、１時間37℃で、SnaB
I（uidA遺伝子のATG開始コドンの上流＋３８３ｂｐ位に位置する制限部位）によ
り消化し、次いで１時間65℃でBstBI（＋１２８５ｂｐ位に位置する部位）によ
り消化した。９０２ｂｐ断片を、1.0%アガロースゲル電気泳動により単離し、次
いでQiaquickアフィニティーカラム上で精製した。
【００５９】 ライゲーションを、２０ｎｇのベクターpGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI、およ
び８０ｎｇの９０２ｂｐ断片BstBI/SnaBIを用いて、一晩１８℃で、１０μｌの
反応媒体中、１．０μｌのT4 10×DNAリガーゼ（New England Biolabs）および
４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。生
存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細菌を、半分のライゲー
ション反応混合物により形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充し
たＬＢ培地上で選択した、クローンから得られたプラスミドDNAを、アルカリ溶
解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られたプラスミドを、pGEM3Z
-petE prom/IV2と称した。
【００６０】 プラスミドpGEM3Z-petE prom/IV2の８１８ｂｐ断片（petE）に対応するプロモ
ータ配列を排除するために、後者を、１時間37℃で、BamHIにより、次いで１時
間37℃でPstIにより消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動により単離し、次いで
Quiaquickアフィニティーカラム上で精製した。このプラスミドの突出５’末端
を、業者の薦めに従って有用なPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、
米国）を使用することにより平滑とした。ライゲーションを、１０ｎｇのこのよ
うに修飾したプラスミドを用いて、一晩18℃で、１２μｌの反応容量中、１．２
μｌのT4 10×DNAリガーゼ（New England Biolabs）および４００単位の酵素T4D
NAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。生存可能でコンピテ
ントなエシェリヒアコリDH5アルファを、半分のライゲーション反応混合物で形
質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、
得られたクローンのプラスミドDNAをアルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化
により解析し、Sangerら（１９７７）の方法に従ってシークエンスにより確認し
た。得られたプラスミドはpMRT1144（図１）と称した。
【００６１】 １．２．陽性対照プロモータMPr1092の作成 基準プロモータ配列を利用できるようにするために、「二重35S」カリフラワ
ーモザイクウイルスプロモータ（CaMV D35S prom）を、uidA-IV2/nos term配列
の上流に配置した。プラスミドpMRT1092（図２）は、以下のクローニング段階の
結果である。
【００６２】 初めに、ジャガイモパタチン遺伝子の１９２ｂｐのIV2イントロンを、１．１
．章で記載したような＋３８３ｂｐのuidAコーディング配列に挿入した。１マイ
クログラム量（１μｇ）のbpI221プラスミド（Clontech、CA、米国）を、１時間
３０分37℃で、SnaBIにより、次いで１時間３０分65℃でBstBIにより消化した。
７１０ｂｐ断片を欠失したプラスミドを、0.8%アガロースゲル電気泳動により単
離し、次いでQiaquickアフィニティーカラム上で精製した。
【００６３】 ２０ナノグラム（２０ｎｇ）の量のbpI221BstBI/SnaBIベクターおよび前記pSC
V1.2-GIを起源とする８０ｎｇの９０２ｂｐのBstBI/SnaBI断片を、一晩18℃で１
０μｌの反応容量中で、１μｌのT4 10×DNAリガーゼ（New England Biolabs）
および４００単位のT4DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下でライゲー
トした。生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファを、半分のラ
イゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充
したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを、アルカリ溶
解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られたプラスミドをbpI221/u
idA-IV2と称した。
【００６４】 第二の段階で、bpI221/uidA-IV2プラスミドに存在するCaMV35Sプロモータ配列
を、「CaMV D35S」配列で置換した。これは、bpI221/uidA-IV2プラスミドを、１
０時間３０分37℃で１０単位のHindIIIで消化することにより達成され、次いで
粘着末端を、製造業者の薦めに従って３０分間37℃でDNAポリメラーゼＩ（New E
ngland Biolabs）のクレノウ断片の作用により平滑とした。Qiaquickアフィニテ
ィーカラム上でこの反応産物を精製した後、DNAを一晩37℃で１０単位のBamHIで
消化した。８２８ｂｐのプロモータCaMV 35S断片を欠失したベクターに対応する
、プラスミド断片を、0.8%アガロースゲル電気泳動により単離し、次いでQiaqui
ckアフィニティーカラム上で精製した。
【００６５】 CaMV 35S promを、プラスミドpJIT163Dから得た。これは、プラスミドpJIT163
から得られ、これは次いでプラスミドpJIT160（GuerineauおよびMullineaux、１
９９３）から得られる。プラスミドpJIT163は、ポリリンカーのHindIIIとSalI部
位の間にATGコドンを有する。このATGを欠失させ、よってプラスミドpJIT163Dを
得るために、pJIT163のプラスミドDNAを、HindIIIおよびSalIにより消化し、0.8
%アガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、１／１０容量のｐＨ４．
８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の-80℃の無水エタノールの存在下で
３０分間沈降させ、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄
し、乾燥させ、DNAポリメラーゼI（New England Biolabs）のクレノウ断片の作
用に３０分間37℃で製造業者の薦めに従ってかけ、１容量のフェノール、次いで
１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ
／ｖ／ｖ）および最後に１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：
１ｖ／ｖ）での抽出により除タンパクし、１／１０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸
ナトリウムおよび２．５容量の-80℃の無水エタノールの存在下で３０分間沈降
させ、次いで、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、
乾燥させ、最後に１．０μｇのT4 10×DNAリガーゼ（Amersham）および２．５単
位のT4 DNAリガーゼ（Amersham）の存在下で14℃で１６時間ライゲートした。生
存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファバクテリアを、形質転換
した。（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンの
プラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。
【００６６】 １０マイクログラム（１０μｇ）のプラスミドpJIT163Dを、１０時間３０分37
℃で１０単位のKpnI（プロモータの５’に位置する部位）で消化し、次いで粘着
末端を６単位のT4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）の作用により３０
分間37℃で製造業者の薦めに従って平滑とした。Qiaquickアフィニティーカラム
上でこの反応産物を精製した後、DNAを、一晩37℃で１０単位のBamHIで消化した
。プロモータCaMV D35Sに対応する、得られた７６１ｂｐのDNA断片を、1.0%アガ
ロースゲル電気泳動により単離し、次いでQiaquickアフィニティーカラム上で精
製した。
【００６７】 １０ｎｇのプラスミドベクター、１００ｎｇの７６１ｂｐ断片、１．０μｌの
T4 10×DNAリガーゼ（New England Biolabs）および４００単位のT4 DNAリガー
ゼ（New England Biolabs）を含む反応混合物を、１０μｌ中で一晩18℃でライ
ゲーションにかけた。生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ
を、半分のライゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ
／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを
、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られたプラスミ
ドを、pMRT1092と称した（図２）。
【００６８】 １．３．基準プラスミドpCaMV35Slucの記載 一過性発現の内部基準として作用するプラスミドはpCaMV35Sluc（Torrentら、
１９９７）であり、これはRNA 35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータお
よび終結因子の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子（luc）の発現カセッ
トを含む。
【００６９】 実施例２ エンドウマメプラストシアニン遺伝子由来の欠失プロモータ配列を含むプラス
ミドの作成 エンドウマメプラストシアニン遺伝子の全プロモータ（LastおよびGray、１９
８９）は、-７７１ｂｐ位から＋６３ｂｐ位までの８３４ｂｐ（配列番号０１）
の配列に対応し、ここに数個の可能性ある調節配列が同定されている（数は、配
列の５’末端から３’末端に関して、そして転写開始部位＋１に関して示す、図
４）。
【００７０】 --７３４ｂｐから-６０７ｂｐまで伸長する、一連の逆位反復配列、 -CaMV 35Sプロモータに存在し、-５７９ｂｐ位から-５５９ｂｐ位に伸長してい
る、活性化配列１（as-1）に対してある類似性を有する２０ｂｐのボックス（as
-1類似）、 -Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモータに存在し
、-５４０ｂｐ位から-５１９ｂｐ位に伸長している、活性化配列に対してある相
同性を有する２１ｂｐのボックス（nosエンハンサ類似）、 --２０１ｂｐ位から-１９３ｂｐ位まで伸長している、８ｂｐの「Ｇ」ボックス
、 --８３ｂｐ位から-６９ｂｐ位まで伸長し、高等植物のプロモータに見られるＩ
ＩＩ型ボックスに対してある類似性を有する、１４ｂｐのボックス、 --６３位の「CAAT」ボックス -３７位の「TATA」ボックス -転写開始部位＋１（１位） -＋１ｂｐ位から６３ｂｐ位まで伸長している５’非翻訳領域
【００７１】 プラスミドpGEM3Z-petE promは、実施例１の第１．１章で上記したように得ら
れた。それは、エンドウマメプラストシアニン遺伝子の全体の制御下で（petE p
rom、図４、配列番号０１）レポーター遺伝子uidA-IV2を含むプラスミドpGEM3Z
に対応し、プラストシアニンプロモータに基づいて全ての作成物の基準プロモー
タとして役立つ。
【００７２】 異なるエレメントの効果を研究するために、petE promの５’領域の欠失を、
酵素消化により実施した。
【００７３】 ２．１．プロモータMPr1097の作成 プロモータMPr1097は、逆位反復配列の５’欠失によるpetEプロモータから、
並びに、２１２ｂｐのSph1断片（図４）に生じたas-1類似ボックスから得られる
。これを実施するために、５マイクログラム（５μｇ）のプラスミドpGEM3Z-pet
E/IV2を、２時間37℃で２０単位のSphI酵素で消化し、0.8%アガロースゲル電気
泳動により単離し、次いでQiaquickアフィニティカラム上で精製した。
【００７４】 ライゲーションは、２５ｎｇのこのように修飾したプラスミドを用いて、一晩
18℃で、１０μｌの反応混合物中、１μｌのT4 10×DNAリガーゼ（New England
Biolabs）および４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下
で実施した。生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細胞を、
半分のライゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ
）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを、ア
ルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られたプラスミドは
、pMRT1097と称し、MPr1097（配列番号０２）と称したプロモータ配列をシーク
エンスにより確認した。
【００７５】 ２．２．プロモータMPr1096の作成 プロモータMPr1096は、逆位反復配列の５’欠失によるpetEプロモータ、それ
ぞれ４０３ｂｐおよび１０５ｂｐの２つのSpeI断片により生じた「as-1類似」エ
レメントおよび「nosエンハンサ類似」エレメントから生じる（図４）。これを
実施するために、５マイクログラム（μｇ）のプラスミドpGEM3Z-petE/IV2を、
２時間37℃で２０単位のSpeI酵素で消化し、0.8%のアガロースゲル電気泳動によ
り単離し、次いでQiaquickアフィニティカラム上で精製した。
【００７６】 ライゲーションは、２５ｎｇのこのように修飾したプラスミドを用いて、一晩
18℃で、１０μｌの反応混合物中、１μｌのT4 10×DNAリガーゼ（New England
Biolabs）および４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下
で実施した。生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細胞を、
半分のライゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ
）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを、ア
ルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られたプラスミドは
、pMRT1096と称し、MPr1096（配列番号０３）と称したプロモータ配列をシーク
エンスにより確認した。
【００７７】 ２．３．プロモータMpr1098の作成 petEプロモータに基づいた基準最小プロモータ配列を得るために、２０７ｂｐ
のプロモータMPr1098を、「TATA」および「CAAT」ボックスのみを含むように作
成した（図４）。
【００７８】 これは、５マイクログラム（５μｇ）のプラスミドpGEM3Z-petE/IV2を２時間3
7℃で１．５単位のDraIII酵素（-１２８位に存在する１部位）および１５単位の
PstI酵素（-７５９ｂｐ位のプロモータの５’領域に存在する１部位）で消化す
ることにより達成した。petEプロモータの５’領域に位置する６３１ｂｐ断片Ps
tI/DraIIIのこのように欠失したプラスミドを、0.8%アガロースゲル電気泳動に
より単離し、次いでQuiaquickアフィニティカラム上で精製した。この断片の粘
着末端を、製造業者の薦めに従って、６単位のT4 DNAポリメラーゼ（New Englan
d Biolabs）の作用により３０分間37℃で平滑とした。Quiaquickアフィニティカ
ラム上でこの反応産物を精製した後、ライゲーションを、２５ｎｇのこのように
修飾したプラスミドを用いて、一晩18℃で、１０μｌの反応混合物中、１μｌの
T4 10×DNAリガーゼ（New England Biolabs）および４００単位のT4 DNAリガー
ゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。生存可能でコンピテントなエ
シェリヒアコリDH5アルファ細胞を、半分のライゲーション反応混合物で形質転
換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得ら
れたクローンのプラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化に
より解析した。得られたプラスミドは、pMRT1098と称し、プロモータ配列MPr109
8をシークエンスにより確認した（配列番号０４）。この配列は、最小のエンド
ウマメプラストシアニンプロモータに対応する（図４）。
【００７９】 実施例３ キメラプロモータ配列を含むプラスミドの作成 ある５’領域の欠失により得られたプロモータに加えて、ＬＣＲ（Barany、１
９９１）と称されるライゲーション連鎖反応および「指向性」オリゴデオキシヌ
クレオチドの助けをかりて一本鎖連続的DNAの産生を、二本鎖DNA産物をもたらす
ＰＣＲ反応と合わせる、ｌｂ-ＰＣＲ技術を使用して、基本最小プロモータMpr10
98から開始して、一連のプロモータを合成した。
【００８０】 ３．１．プロモータMPr1108の作成 プロモータMpr1108（図４）を、petEプロモータ（配列番号０１）の-６４１ｂ
ｐ位から-５６９ｂｐ位まで伸長し、「as-1類似」および「nosエンハンサ類似」
ボックスを有する７２ｂｐの配列を、ｌｂ-ＰＣＲ技術を使用して、MPr1098（-
１２８ｂｐ位から＋５９ｂｐ位まで、配列番号０４）の１８７ｂｐの最小プロモ
ータ配列に融合させることにより創製した。
【００８１】 連続的一本鎖DNAを、以下の指向性オリゴデオキシヌクレオチドの助けをかり
て形成した：
【００８２】 「配列表１」
【００８３】 １００ピコモル（１００ｐｍｏｌ）のＳ１、Ｓ２およびＳ３オリゴデオキシヌ
クレオチドを、１５単位のキナーゼ（Amersham）の作用により、５μｌの１０×
キナーゼ（Amersham）および５００ｐｍｏｌのＡＴＰ（Sigmaの）存在下で、３
０分間37℃でリン酸化した。リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドを、１容量の
フェノール、次いで１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）および最後に１容量のクロロホルム：イソアミル
アルコール（２４：１ｖ／ｖ）での抽出により精製し、その後、１／１０容量の
ｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび-80℃の２．５容量の無水エタノールで
２０分間で沈降させ、次いで１６０６０ｇで３０分間遠心分離した。沈降したオ
リゴデオキシヌクレオチドを、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、次いで、１
０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で水に再懸濁した。
【００８４】 「指向性」オリゴデオキシヌクレオチドに連結するために、以下の「ガイド用
」オリゴデオキシヌクレオチドを使用した：
【００８５】 「配列表２」
【００８６】 ＬＣＲ反応を実施するために、１０ｐｍｏｌのリン酸化Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およ
びＳ４「指向性」オリゴデオキシヌクレオチドを、１０ｐｍｏｌのＧ１、Ｇ２お
よびＧ３「ガイド用」オリゴデオキシヌクレオチド、５μｌのTaq 10×DNAリガ
ーゼ（New England Biolabs）および４０単位のTaq DNAリガーゼ（New England
Biolabs）の存在下でライゲートした。ライゲーション反応は、GeneAmp PCRシス
テム9700thermocycle中（Perkin Elmer、Norwalk、米国）で実施した。反応は、
１分間94℃の１サイクルおよび８回の同じその後のサイクルからなる段階を含み
、各々が以下からなる：65℃で１分間、57℃で１分間、52℃で１分間、48℃で１
分間、43℃で１分間、および最後に37℃で１０分間。次に、ライゲーション反応
混合物を、業者の薦めに従って、Qiaquickアフィニティカラムで精製した。
【００８７】 最後に、得られた一本鎖DNAのPCR増幅は、GeneAmp PCRシステム9700thermocyc
le中で、１００ｐｍｏｌの各オリゴデオキシヌクレオチドプローブ5’ GGAATCTG
CAGTTGAACACGT 3’および5’ CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3’、５０ｎｍｏｌの各dNT
P、１０μｌのVent 10×DNAポリメラーゼ緩衝液（New England Biolabs）、およ
び２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した
。DNAを、５分間94℃で変性させ、各々、３０秒間の95℃での変性段階、３０秒
間の56℃でのハイブリダイゼーション段階、および１分間の72℃での伸長からな
る、２５回のサイクルにかけ、次いで72℃での伸長段階を５分間続けた。
【００８８】 反応混合物のDNA断片を、２０単位のBamHIで４５分間37℃で消化し、次いで２
０単位のPstIで１時間37℃で消化し、最後にQiaquickアフィニティカラムで精製
した。
【００８９】 それらを、BamHI酵素で１時間37℃で消化しておいた、プラスミドpGEM3Z-petE
/IV2に挿入し、次いでPstI酵素で１時間37℃で消化し、0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、Quiaquickアフィニティカラムで精製し、１時間37℃で１２μｌの
「緩衝液３」１０×（New England Biolabs）および５０００単位の子ウシ腸ア
ルカリホスファターゼ（CIP、New England Biolabs）の存在下でリン酸化し、最
後にQuiaquickアフィニティカラムで精製した。ライゲーションを実施するため
に、２５ｎｇの上記のように処理したプラスミドを、ＰＣＲにより得られた１０
０ｎｇのDNA断片と、１．２μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Bio
labs）および４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で
一晩18℃で接触させた。生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルフ
ァ細胞を、半分のライゲーション反応混合物により形質転換した。アンピシリン
（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのDNAを
、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。それから得られた
プラスミドpMRT1108およびpMRT1109をシークエンスにかけた。プラスミドpMRT11
08は、期待されたプロモータ（配列番号０５）を含み、一方、プラスミドpMRT11
09はプロモータ配列MPr1109（配列番号０６）を有し、これは、＋１位の１１ｂ
ｐ上流の、５’非翻訳領域の３３ｂｐの欠失だけpMRT1108と異なる。
【００９０】 ３．２．プロモータMPr1110の作成 プロモータMpr1110は、Mpr1098プロモータ（配列番号０４）の-９９ｂｐ位に
、「Ｇ」ボックス（petEプロモータの-２０４ｂｐ位から-１８６ｂｐ位に伸長、
配列番号０１）を含む１８ｂｐの要素を挿入することにより、そしてこの修飾さ
れた最小プロモータに、as-2およびas-1エレメントを含むRNA 35Sカリフラワー
モザイクウイルスプロモータ（CaMV）の４４ｂｐの最小配列を融合することによ
り創製した（Lam、１９８９；Lamら、１９８９）（図４）。MPr1110は、ｌｂ-Ｐ
ＣＲ技術により合成した。連続的な一本鎖DNAを、以下の「指向性」オリゴデオ
キシヌクレオチドの助けをかりて形成した：
【００９１】 「配列表３」
【００９２】 １００ピコモル（１００ｐｍｏｌ）のＳ１、Ｓ２およびＳ５オリゴデオキシヌ
クレオチドを、１５単位のキナーゼ（Amersham）の助けをかりて、５μｌの１０
×キナーゼ緩衝液（Amersham）および５００ｐｍｏｌのＡＴＰ（Sigma）の存在
下で、３０分間37℃でリン酸化した。リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドを、
１容量のフェノール、次いで１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルア
ルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）および最後に１容量のクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）での抽出により精製し、その後、１／１
０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の-80℃の無水エタ
ノールで２０分間で沈降させ、次いで１６０６０ｇで３０分間遠心分離した。沈
降したオリゴデオキシヌクレオチドを、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、次
いで１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で水に再懸濁した。
【００９３】 「指向性」オリゴデオキシヌクレオチドを連結するために、以下の「ガイド用
」オリゴデオキシヌクレオチドを使用した： 「配列表４」
【００９４】 ＬＣＲ反応を実施するために、１０ｐｍｏｌのリン酸化「指向性」オリゴデオ
キシヌクレオチドＳ１、Ｓ２、Ｓ５およびＳ６を、１０ｐｍｏｌの「ガイド用」
オリゴデオキシヌクレオチドＧ１、Ｇ２およびＧ４、５μｌのTaq 10×DNAリガ
ーゼ緩衝液および４０単位のTaq DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下
でライゲートした。ライゲーション反応を、GeneAmp PCRシステム9700サーモサ
イクル中（Perkin Elmer、Norwalk、米国）で実施した。それは、94℃で１分間
のサイクル、各々、以下の段階を含む８回の同じサイクルからなり：65℃で１分
間、57℃で１分間、52℃で１分間、48℃で１分間、43℃で１分間、および最後に
37℃で１０分間、次いで、ライゲーション反応混合物を業者の薦めに従ってQiaq
uickカラムで精製した。
【００９５】 最後に、以前に得られた一本鎖DNAのPCR増幅を、GeneAmp PCRシステム9700the
rmocycle中で、１００ｐｍｏｌの各以下のオリゴデオキシヌクレオチドプローブ
5’ CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3’および5’ CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3’、５０ｎ
ｍｏｌの各ｄＮＴＰ、１０μｌのVent 10×DNAポリメラーゼ緩衝液（New Englan
d Biolabs）、および２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）の
存在下で実施した。DNAを、５分間94℃で変性させ、各々が95℃での３０秒間の
変性段階、56℃での３０秒間のハイブリダイゼーション段階、および72℃での１
分間の伸長段階からなる２５回のサイクルにかけ、次いで72℃での伸長を５分間
続けた。
【００９６】 反応混合物のDNA断片を、２０単位のBamHI酵素で４５分間37℃で消化し、次い
で２０単位のPstI酵素で１時間37℃で消化し、最後にQiaquickカラムで精製した
。それらを、以前にBamHI酵素で１時間37℃で、次いでPstI酵素で１時間37℃で
消化しておいたプラスミドpGem3Z-petE/IV2に挿入し、0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、Qiaquickアフィニティカラムで精製し、１時間37℃で、１２μｌの
「緩衝液３」１０×（New England Biolabs）および５０００単位の子ウシ腸ア
ルカリホスファターゼ（CIP、New England Biolabs）の存在下で脱リン酸化し、
Qiaquickアフィニティカラムで精製した。ライゲーションを実施するために、２
５ｎｇの上記のように処理したプラスミドを、PCRにより得られた１００ｎｇのD
NA断片と、１．２μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）お
よび４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で一晩18℃
で接触させた。以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5
アルファ細胞を、半分のライゲーション反応混合物で形質転換した。アンピシリ
ン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのDNA
を、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。プラスミドpMRT
1110により生じたプロモータ配列MPr1110は、シークエンスにより確認した（配
列番号０７）。
【００９７】 ３．３．プロモータMpr1111の作成 プロモータMpr1111は、「Ｇ」ボックスを含む１８ｂｐのエレメント（petEプ
ロモータの-２０４ｂｐ位から１８６ｂｐ位に伸長、配列番号０１）を、MPr1098
（配列番号０４）の-９９ｂｐ位に挿入し、この最小プロモータに、CaMV 35Sのa
s-2エレメント（LamおよびChua、１９８９）およびas-1エレメント（Lamら、１
９８９）の複製に対応する５８ｂｐの配列を融合することにより創製した。Mpr1
111（図４）は、前記したようなｌｂ-ＰＣＲ技術により合成した。一本鎖連続DN
Aは、以下の「指向性」オリゴデオキシヌクレオチドを使用して作成した。
【００９８】 「配列表５」
【００９９】 １００ピコモル（１００ｐｍｏｌ）のＳ１、Ｓ２およびＳ５オリゴデオキシヌ
クレオチドを、５’領域において、１５単位のキナーゼ（Amersham）を使用して
、５μｌの１０×キナーゼ緩衝液（Amersham）および５００ｐｍｏｌのＡＴＰ（
Sigma）の存在下で、３０分間37℃でリン酸化した。リン酸化オリゴデオキシヌ
クレオチドを、１容量のフェノール、次いで１容量のフェノール：クロロホルム
：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）および最後に１容量のク
ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）での抽出により精製し、
その後、１／１０容量のｐＨ４．８の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の-8
0℃の無水エタノールで２０分間沈降させ、次いで１６０６０ｇで３０分間遠心
分離した。沈降したオリゴデオキシヌクレオチドを、７０％エタノールで洗浄し
、乾燥させ、次いで、１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で水に再懸濁した。
【０１００】 「指向性」オリゴデオキシヌクレオチドを連結するために、以下の「ガイド用
」オリゴデオキシヌクレオチドを使用した：
【０１０１】 「配列表６」
【０１０２】 ＬＣＲ反応を実施するために、１０ｐｍｏｌのリン酸化Ｓ１、Ｓ２、Ｓ５およ
びＳ７「指向性」オリゴデオキシヌクレオチドを、１０ｐｍｏｌの「ガイド用」
オリゴデオキシヌクレオチドＧ１、Ｇ２およびＧ４、５μｌのTaq 10×DNAリガ
ーゼ緩衝液（New England Biolabs）および４０単位のTaq DNAリガーゼ（New En
gland Biolabs）の存在下でライゲートした。ライゲート反応は、GeneAmp PCRシ
ステム9700thermocycle中（Perkin Elmer、Norwalk、米国）で実施し、94℃で１
分間の１回のサイクル、次いで各々が以下の連続段階を含む８回の同じサイクル
から構成された：65℃で１分間、57℃で１分間、52℃で1分間、48℃で１分間、4
3℃で１分間、そして最後に37℃で１０分間。次に、ライゲーション反応混合物
を、業者の薦めに従って、Qiaquickカラムで精製した。
【０１０３】 最後に、得られた一本鎖DNAのPCR増幅を、GeneAmp PCRシステム9700thermocyc
le中で、１００ｐｍｏｌの各オリゴデオキシヌクレオチドプローブ5’ CATGCTGC
AGACTAGTGGATT3’および5’ CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3’、５０ｎｍｏｌの各dNTP
、１０μｌのVent 10×DNAポリメラーゼ緩衝液（New England Biolabs）および
２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。D
NAを、５分間94℃で変性させ、各々が95℃の３０秒間の変性段階、56℃の３０秒
間のハイブリダイゼーション段階、および72℃の１分間の伸長を含む２５回のサ
イクルにかけ、次いで72℃で５分間伸長を続けた。
【０１０４】 反応混合物のDNA断片を、２０単位のBamHIで４５分間37℃で消化し、次いで２
０単位のPstIで１時間37℃で消化し、最後にQiaquickカラムで精製した。それら
を、BamHI酵素で１時間37℃で消化し、次いでPstIで１時間37℃で消化しておい
た、プラスミドpGEM3Z-petE/IV2に挿入し、0.8%アガロースゲル電気泳動にかけ
、Quiaquickアフィニティカラムで精製し、１時間37℃で１２μｌの「緩衝液３
」１０×（New England Biolabs）および５０００単位の子ウシ腸アルカリホス
ファターゼ（CIP、New England Biolabs）の存在下で脱リン酸化し、最後にQuia
quickアフィニティカラムで精製した。ライゲーションを実施するために、２５
ｎｇの上記のように処理したプラスミドを、ＰＣＲにより得られた１００ｎｇの
DNA断片と、１．２μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）お
よび４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で一晩18℃
で接触させた。以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5
アルファ細胞を、半分のライゲーション反応混合物により形質転換した。アンピ
シリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローン由
来のDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られ
た２つのプラスミドpMRT1111およびpMRT1112をシークエンスした。プラスミドpM
RT1111は、期待されたプロモータMpr1111（配列番号０８）を含み、一方、プラ
スミドpMRT1112では、プロモータMpr1112（図４）は、「Ｇ」ボックスを含み、-
１２７位から-８９位に伸長する３５ｂｐの欠失、およびまた-７８位および-７
６位に位置する２ｂｐの欠失によりpMRT1111とは異なる（配列番号０９）。
【０１０５】 ３．４．プロモータMPr1153の作成 プロモータMPr1153（図４）が、-５８２位から-５１０位に伸長し（配列番号
０１）、「as-1類似」および「nosエンハンサ類似」エレメントを有する、petE
プロモータからの７８ｂｐの配列を、「Ｇ」ボックスを含む１８ｂｐの付加によ
り修飾されたプロモータMPr1098に融合することにより得られた。
【０１０６】 これを実施するために、プラスミドpMRT1111を、２０単位のPstI酵素および１
単位のDraIII酵素で１時間37℃で消化した。CaMVの２つの「as-2」エレメントお
よび「as-1」エレメントを含む７２ｂｐ断片のこのように欠失したプラスミドを
、0.8%アガロースゲル電気泳動により単離し、次いでQuiaquickアフィニティカ
ラムで精製した。petEプロモータの２つの「as-1類似」および「nosエンハンサ
類似」エレメントを含む７８ｂｐのPstI/DraIII断片が、１０μｇのプラスミドp
MRT1108を、２０単位のPstI酵素および１単位のDraIII酵素で１時間37℃で消化
することにより作成され、次いでこの断片を、Nu-Sieve 3%アガロースゲル電気
泳動（FMC、Rockland、米国）により単離し、最後にQuiaquickアフィニティカラ
ムで精製した。
【０１０７】 ライゲーションは、２０ｎｇのベクターpMRT1111 PstI/DraIIIおよび８０ｎｇ
の７８ｂｐ断片を用いて、一晩18℃で、１０μｌの反応混合物中、１．０μｌの
T4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）および４００単位のT4 DNA
リガーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。以前に調製した生存可
能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細菌を、半分のライゲーショ
ン反応混合物により形質転換した。アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬ
Ｂ培地上で選択した、得られたクローン由来のプラスミドDNAを、アルカリ溶解
法に従って抽出し、酵素消化により解析した。得られたプラスミドを、pMRT1153
と称し、プロモータ配列MPr1153（配列番号１０）をシークエンスにより確認し
た。
【０１０８】 ３．５．プロモータMpr1143の作成 プロモータMpr1143（図４）を、Mpr1111の「as-2、as-2、as-1」エレメントを
有する７２ｂｐの配列を欠失することにより得た。これは、プラスミドpMRT1111
を１時間37℃で、同時に２０単位のPstI酵素および１単位のDraIII酵素で消化す
ることにより達成された。CaMVのas-2エレメントおよびas-1エレメントを含む７
０ｂｐ断片のかくして欠失したプラスミドを、0.8%アガロースゲル電気泳動によ
り単離し、次いでQuiaquickアフィニティカラムで精製した。この断片の末端を
、業者の薦めに従って、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、米国）
の作用により平滑とした。この断片を一晩18℃で、２０ｎｇのベクター、１．０
μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）および４００単位のT
4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）を含む１０μｌの反応混合物中、再度ラ
イゲートした。以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5
アルファ細胞を、半分のライゲーション反応混合物により形質転換した。アンピ
シリン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンの
プラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により解析した。
これらのクローンの１つのプロモータ配列MPr1143（配列番号１１）を、シーク
エンスにより確認した。
【０１０９】 実施例４ プロモータMPr1151、MPr1149、MPr1170およびMPr1092を含むバイナリープラス
ミドの作成 バイナリーベクターの調製は、Mpr1111、Mpr1098、Mpr1143およびMpr1092を含
む各発現カセットについて同じであった。２５μｇの量のプラスミドpGA492（An
、１９８６）を、８０単位のHindIII酵素で１時間37℃で消化し、次いでQuiaqui
ckアフィニティカラムで精製した。このプラスミドの突出５’末端を、製造業者
の薦めに従って、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、米国）を使用
して平滑とした。かくして修飾したプラスミドを、８０単位のEcoRI酵素で１時
間37℃で消化し、次いで、２９１ｂｐ断片の欠失した得られたベクターを、0.7%
アガロースゲル上で分離し、Quiaquickアフィニティカラムで精製した。
【０１１０】 ４．１．pMRT1151の製造 発現カセット「Mpr1111/uidA-IV2/nos term」を、バイナリープラスミドpGA49
2の修飾HindIII部位に挿入した。それは、８０単位のPstI酵素で１時間37℃で以
前に消化した、プラスミドpMRT1111から得られ、Quiaquickアフィニティカラム
で精製した。このプラスミドの突出５’末端を、製造業者の薦めに従って、Pfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、米国）を使用して平滑とした。かく
して修飾したプラスミドを、８０単位のEcoRI酵素で１時間37℃で消化し、次い
で、発現カセットに対応する２．５ｋｂのDNA断片を、1%アガロースゲル上で分
離し、Quiaquickアフィニティカラムで精製した。
【０１１１】 ライゲーションを、上記のように調製した１００ｎｇのバイナリープラスミド
pGA492と５０ｎｇの発現カセットを一晩18℃で、２０μｌの反応容量中、２μｌ
のT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）および４００単位のT4 DN
Aリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で混合することにより実施した。
【０１１２】 以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細胞
を、半分のライゲーション反応混合物により形質転換した。テトラサイクリン（
１２ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミ
ドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化、並びに、バイナリープラ
スミドの導入DNAから選択された、オリゴデオキシヌクレオチド5’ ATATGAGACTC
TAATTGGATACCGAGGGG 3’およびuidA配列周辺の発現カセットから選択された、5
’TTGATTTCACGGGTTGGG 3’の助けをかりて遺伝子操作により解析した。得られた
クローンは、pMRT1151と称した。
【０１１３】 ４．２．バイナリープラスミドpMRT1149の製造 発現カセット「MPr1143/uidA-IV2/nos term」を、発現カセットをプラスミドp
MRT1143から単離することを除き、プラスミドpMRT1151と同じプロトコルに従っ
て、バイナリープラスミドpGA492の修飾HindIII部位にクローニングした。得ら
れたクローンは、pMRT1149と称した。
【０１１４】 ４．３．バイナリープラスミドpMRT1170の製造 発現カセット「petEプロモータ/uidA-IV2/nos term」を、発現カセットをプラ
スミドpGem3Z-petE/IV2から単離することを除き、プラスミドpMRT1151と同じプ
ロトコルに従って、バイナリープラスミドpGA492の修飾HindIII部位にクローニ
ングした。
【０１１５】 ４．４．バイナリープラスミドpGA492MPr1092の製造 プロモータ断片MPr1092および配列「uidA-IV2/nos term」を、上記のように調
製したバイナリープラスミドpGA492に挿入した。この断片は以下のように調製し
た：
【０１１６】 CaMV 35Sプロモータは、１０μｇのプラスミドpJIT163deltaを、４０単位のKp
nI酵素で１時間37℃で消化することにより単離した。この線形プラスミドの末端
を、製造業者の薦めに従って、６単位のT4 DNAポリメラーゼ（New England Biol
abs）の助けをかりて３０分間37℃で平滑とした。このように修飾したプラスミ
ドを、Quiaquickアフィニティカラムで精製し、次いで８０単位のHindIII酵素で
１時間37℃で再消化した。プロモータに対応する７４３ｂｐの断片を、0.8%アガ
ロースゲル上で分離し、次いでQuiaquickアフィニティカラムで精製した。
【０１１７】 「uidA-IV2/nos term」配列は、４μｇのプラスミドpMRT1092を、４０単位のH
indIII酵素およびEcoRI酵素で１時間消化することにより得た。配列「uidA-IV2/
nos term」に対応する２．２ｋｂの断片を、0.8%アガロースゲル上で分離し、次
いでQuiaquickアフィニティカラムで精製した。
【０１１８】 ３つの断片間のライゲーションは、１００ｎｇのバイナリープラスミドと、５
０ｎｇのプロモータ断片と、５０ｎｇの配列「uidA-IV2/nos term」に対応する
断片を、２０μｌの反応容量中で、２μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New En
gland Biolabs）および４００単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の
存在下で混合することにより実施した。
【０１１９】 インキュベートは、ライゲーション混合物を、各々が30℃での３０秒間のイン
キュベート、および10℃での３０秒間のインキュベートを含む１９８回のサイク
ルにかけることにより、サーモサイクル中で実施した。以前に調製した生存可能
でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細胞を半分のライゲーション反
応混合物で形質転換した。テトラサイクリン（１２ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培
地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従っ
て抽出し、酵素消化、および、バイナリープラスミドの導入DNAから選択された
、オリゴデオキシヌクレオチド5’ ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3’および
「uidA」配列の発現カセットから選択された、5’TTGATTTCACGGGTTGGG 3’の助
けをかりて遺伝子増幅により解析した。保持されたこれらのクローンの１つのを
pGA492-MPr1092と称した。
【０１２０】 ４．５ バイナリープラスミドpMRT1182の製造 バイナリープラスミドpMRT1182は、プロモータ断片CaMV D35Sの、および配列u
idA-IV2/term-nosの、バイナリープラスミドpMRT118への挿入により得られた。
この後者のプラスミドは、１９９９年９月３日に、本出願人の名称で提出された
、仏国特許出願番号第ＦＲ９９１１１１２号に完全に記載され、この明細書を本
明細書に参考として取込む。バイナリープラスミドpMRT1118（５９７１ｂｐ）は
、AvrII酵素により消化されたT-DNA断片の、同じ出願人の以前に注記した先行出
願に完全に記載され、pMRT1106と称され、本明細書に参考として特に取込まれた
、別の脱リン酸化プラスミドのAvrII部位への導入により得られる。
【０１２１】 挿入を実施するために、pMRT1106プラスミドDNA（５μｇ）をAvrII酵素で消化
し、「QIAquick PCR精製」キットの助けをかりて精製し、次いで５０単位の子ウ
シ腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs）を用いて、１２０μｌの
最終反応混合物中、１２μｌの３×１０緩衝液（New England Biolabs）の存在
下で37℃で１時間脱リン酸化し、TBE緩衝液中0.6%アガロースゲル上での電気泳
動により単離し、「QIAquickゲル抽出」キットで精製し、上記した条件下で子ウ
シ腸アルカリホスファターゼで２回目の脱リン酸化を実施し、最後に「QIAquick
PCR精製」キットで精製し、５０μｌのＨ2Ｏに移した。
【０１２２】 ＰＣＲライゲーション反応を、３２．５ｎｇの消化脱リン酸化プラスミドpMRT
1106および５０ｎｇの消化T-DNA断片を用いて、１０μｌの反応混合物容量中、
１μｌのT4 10×DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）および４００単位
のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。ライゲーショ
ンは、各々２段階を含む１８０サイクルを含み、最初のサイクルは、「GeneAmp
PCRシステム9700」thermocycle中、10℃で３０秒間、第二段階は30℃で３０秒間
であった。
【０１２３】 以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH5アルファ細菌
を形質転換した（Hanahan、１９８３）。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充
したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを、アルカリ溶
解法に従って抽出し（Birnboim etDoly、１９７９）、酵素消化およびシークエ
ンスにより確認した。得られたプラスミドをpMRT1118と称した。
【０１２４】 プロモータCaMV D35Sは、１０μｇのプラスミドpJIT163deltaを、連続的に、K
pnIおよびHindIII酵素で１時間37℃で消化することにより単離した。CaMV D35S
に対応する７４３ｂｐ断片を、0.8%アガロースゲル上で分離し、次いでQuiaquic
kアフィニティカラムで精製した。配列「uidA-IV2/nos term」は、プラスミドpM
RT1092を、４０単位のHindIIIおよびEcoRI酵素で１時間消化することにより得ら
れた。必要な配列に対応する２．２ｋｂ断片を、0.8%アガロースゲル上で分離し
、次いでQuiaquickアフィニティカラムで精製した。平行して、１０μｇのバイ
ナリープラスミドpMRT1118を、連続的に、KpnIおよびEcoRI酵素で１時間37℃で
消化した。次いで、線形ベクター断片を、４０単位の子ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ（New England Biolabs）で、３×緩衝液の存在下で１時間37℃で脱リン
酸化した。ライゲーションは、１００ｎｇのバイナリープラスミド、５０ｎｇの
CaMV D35S断片および５０ｎｇの「uidA-IV2/nos term」に対応する断片の存在下
で、２０μｌの反応容量中、T4（１×）DNAリガーゼ緩衝液および４００単位のT
4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）の存在下で実施した。インキュベートは
、前記したように「GeneAmp PCRシステム9700」thermocycle中でＰＣＲサイクル
により実施した。以前に調製した生存可能でコンピテントなエシェリヒアコリDH
5アルファ細菌を、半分のライゲーション反応混合物で形質転換した。カナマイ
シン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプ
ラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、酵素消化により確認した。得
られたプラスミドをpMRT1182と称した。
【０１２５】 プラスミドpMRT1151、pMRT1149、pMRT1170およびpMRT1182を、Holstersら（１
９７８）の記載した技術に従って、Agrobacterium tumefaciens LBA4404株に移
した。リファンピシン（５０ｍｇ／ｌ）およびテトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）
を補充したＬＢ培地上で選択した、得られたクローンのプラスミドDNAを、アル
カリ溶解法に従って抽出し、細胞再懸濁緩衝液へのリゾチーム（２５ｍｇ／ｍｌ
）の添加により修飾した。得られたプラスミドDNAを、酵素消化により、および
、バイナリープラスミドの導入DNAから選択されたオリゴデオキシヌクレオチド5
’ ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3’および「uidA」配列周辺の発現カセット
から選択された、5’TTGATTTCACGGGTTGGG 3’の助けをかりて遺伝子増幅により
解析した。得られたAgrobacteriumクローンを使用して、Agrobacterium媒介植物
遺伝子形質転換を実施した。
【０１２６】 実施例５ 一過性発現技術を使用した、異なるプロモータの発現レベルの測定および比較 ５．１ タバコの葉の調製物のインビトロ培養 一過性発現実験を、６週令のbpD6品種のタバコの葉（Niccotiana tabacum L.
）に実施した。タバコbpD6品種の成熟種子を、１０分間、飽和次亜塩素酸カルシ
ウム溶液（７０ｇ／ｌ）中で滅菌し、次いで３回５分間無菌脱イオン水で濯いだ
。次いで、無菌種子を、ＭＳ２０培地（MurashigeおよびSkoog、１９６２）に入
れ、６週間培養チャンバー中でインキュベートした（24℃の一定温度、光期間１
６時間の暗がり／８時間の光、光強度２００μｍｏｌ光子．ｍ-２．ｓｅｃ-１）
。
【０１２７】 形質転換中の葉肉細胞の分裂を回避するために、６週令のbpD6タバコ植物の主
要な葉を、遺伝子銃形質転換の２４時間前に植物から切り出し、リグニン面を上
にして、光原形質分離ＢＹ３培地（ＭＳ塩、４．４ｇ／ｌ、ミオイノシトール１
００ｍｇ／ｌ、チアミン１ｍｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4２００ｍｇ／ｌ、サッカロース
３０ｇ／ｌ、ソルビトール４５．５ｇ／ｌ、２．４Ｄ１ｍｇ／ｌ、ｐＨ５．８）
に置いた。
【０１２８】 ５．２ キメラ作成物のDNAで覆膜した金粒子 遺伝子銃形質転換は、１０分間無水エタノール（９９．９８％、０．０２％以
下の水）で滅菌し、４回滅菌脱イオン水で洗浄し、最後に最大４週間-20℃で50%
グリセロール溶液中で保存しておいた、直径０．６ｍｍの金ビーズ球上にDNAを
前以って覆膜することが必要である。
【０１２９】 形質転換中に使用した全ての対照および実験プラスミドの濃度を１ｍｇ／ｍｌ
に調整した。各形質転換実験において、内部基準対照（pCaMV35Sluc）を同時形
質転換して、異なる実験間のＧＵＳ活性の変動を基準化した（Leckieら、１９９
４）。
【０１３０】 以前に調製した金ビーズ上へのDNAの覆膜は、無菌容器で、層流条件下で実施
した。３０μｌの50%グリセロール中の１．８ｍｇの無菌ビーズの懸濁液のアリ
コートを、ボルテックス器で１分間激しく混合し、次いで１０秒間、４μｇの試
験すべきプラスミドの１つおよび２μｇの基準プラスミドpCaMV35Slucを含む、
２０μｌのDNA懸濁液と混合した。次いで、２０μｌの２．５ＭのＣａＣｌ2を加
え、激しく１０秒間混合した。次に、２０μｌの０．１Ｍのスペルミンを混合物
に加え、全混合物をボルテックス下でさらに３０秒間撹拌した。ビーズ上へのDN
Aの覆膜は、混合物を氷中で１５分間インキュベートすることにより継続し、覆
膜したビーズを、低速度で５秒間遠心分離し、２回無水エタノール中で洗浄した
。
【０１３１】 洗浄後、覆膜したビーズを、３２μｌの無水エタノールに再懸濁し、各２秒間
、３回、超音波にかけ、ボルテックス器で１５秒間激しく混合し、次いで製造業
者（Bio-Rad、Hercule、米国）の薦めに従って調製したBiolistic PDS-1000/He
システムに使用した無菌マクロキャリアーディスク上の４つの同量のアリコート
に直ちに分けた。沈着させたビーズを有するマイクロキャリア支持体およびマイ
クロキャリアの全配置を５分間乾燥させた。
【０１３２】 ５．３ タバコの葉組織の照射および一過性発現 タバコ葉の照射は、取扱および装置の異なる成分の搭載に関して、一般的な製
造業者（Bio-Rad、Hercule、米国）の薦めに従って、Biolistic PDS-1000/Heシ
ステムの助けをかりて実施した。各葉を、２回連続的に、以下の条件を使用して
照射した：
【０１３３】 -ビーズの加速に使用したヘリウム圧力は、６２００ｋＰａ（９００プサイ）
に等しかった。 -植物サンプルを、ビーズ加速領域から９ｃｍの距離に配置した。 -照射は、２７ｍｍ水銀の真空で実施した。
【０１３４】 照射後、葉を、ＢＹ３培地に置き、４８時間暗闇で培養チャンバー中24℃でイ
ンキュベートした。このインキュベートにより、細胞への導入遺伝子の一過性発
現が可能となる。
【０１３５】 ５．４ 組織化学的染色を使用した異なるプロモータの活性の評価 ベータ-グルクロニダーゼの発現の関連を、Jefferssonら（１９８７）の記載
のような組織化学的染色により実施した。培養チャンバー中で４８時間後に、各
葉を、中心のとげの軸に沿って２つに切断した。葉の半分を、ベータ-グルクロ
ニダーゼ染色緩衝液（０．１ＭのｐＨ７．０のリン酸緩衝液中、５-ブロモ、４-
クロロ、３-インドリルグルクロニド（Ｘ-Ｇｌｕｃ）５００ｍｇ／ｌ、トリトン
Ｘ１００ 0.05%）中で４８時間37℃でインキュベートし、一方、他の半分は、液
体窒素中で凍結させ、次いで-80℃で保存した。
【０１３６】 染色後、葉を、それらを95%エタノール浴にそれぞれ３および１２時間浸漬す
ることにより漂白し、次いで蒸留水で濯ぎ、２シートのセロファンの間で平らに
して乾燥した。
【０１３７】 異なる作成物のプロモータ活性を、ＧＵＳレポーター遺伝子を有する２μｇの
DNAに積載した２回の照射後に各葉に認められた青い点の数により評価した。
【０１３８】 ３つのカテゴリーのプロモータを同定した。プロモータMPr1096、MPr1098、MP
r1108、MPr1109、MPr1143およびMPr1153で照射した葉は、全て、平均して３０個
以下の青点を示した。プロモータpetE、Mpr1097およびMpr1110で照射した葉は、
全て、５０ないし１５０個の数の青点を示した。最後に、Mpr1111および基準プ
ロモータMPr1092で照射した葉は、平均して非常に多量の、一般に２００個以上
の青点を有した。
【０１３９】 結論すると、キメラプロモータMPr1110およびMPr1111は、全petEプロモータの
それより高いまたはそれに等しいレベルでベータ-グルクロニダーゼの発現を可
能とし；Mpr1111は、強力な構成性基準プロモータD35S promにより得られたもの
と少なくとも同等なプロモータ活性を示す。
【０１４０】 ５．５ 発光定量酵素アッセイを使用した異なるプロモータによるベータ-グ
ルクロニダーゼの発現の定量 凍結した葉の半分を乳鉢で摩砕し、粉末を、２００ｍｇの植物組織あたり１ｍ
ｌの緩衝液の抽出緩衝液（トリスホスフェート２５ｍＭ ｐＨ７．８、ジチオト
レイトール２ｍＭ、１，２-ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラ
酢酸２ｍＭ、グリセロール１０％、トリトン×１００ １％）で解凍した。混合
物をホモジナイズし、次いで１５分間氷中でインキュベートし、その後５分間１
６０６０ｇで遠心分離により清澄とした。
【０１４１】 ＧＵＳ活性を、検出キット「ＧＵＳ-光化学発光受容体遺伝子アッセイ」（Tro
pix Inc.、Bedford、米国）の助けをかりて、業者の薦めに従って２０μｌの粗
清澄化葉抽出物について測定した。発光の測定は、Lumat LB 9507ルミノメータ
ー（EGG-Berthold、Bad Wildbad、Allemagne）の助けをかりて実施した。
【０１４２】 ルシフェラーゼ活性を、検出キット「ルシフェラーゼアッセイシステム」（Pr
omega Corp.、Madison、米国）の助けをかりて、業者の薦めに従って、２０μｌ
の粗葉抽出物について測定した。発光測定は、Lumat LB 9507ルミノメーターの
助けをかりて実施した。
【０１４３】 結果を図５に報告する。各実験（１つの照射した葉＝１つの粗抽出物）につい
て、ルミノメーターにより測定した測定ベータ-グルクロニダーゼ活性とルシフ
ェラーゼ活性の間の比を計算した。ある作成物の異なる実験の平均および平均標
準誤差を決定した。
【０１４４】 プロモータを、最も弱いもの（クラス１）から始めて最も強いもの（クラス６
）まで、発現尺度の増加順で６つのクラスに分けた：
【０１４５】 -クラス１は、プロモータMPr1108およびMPr1109を含む（図４）。これらのプ
ロモータにより付与された発現は、プロモータを全く含まない、作成物pMRT1144
（図１）で得られた発現とほとんど異ならないようである。「as-1類似」および
「nosE類似」ボックスを、最小プロモータMpr1098（図４）に融合してMpr1108を
得ることにより、Mpr1098により促進される平均発現をほんの僅かしか低下させ
ない。この結果は、非常に僅かな阻害効果は、これらのボックスおよびMPr1108
内でのその位置に起因することを示唆するようである。プロモータMPr1109は、
プロモータMpr1108で得られる発現と実質的に同じ発現を付与する。転写開始部
位の下流に位置する配列、すなわち５’非翻訳領域の欠失は、MPr1108で得られ
る発現を修飾しないようである。
【０１４６】 -クラス２は、プロモータMPr1098、MPr1143およびMPr1112（図４）を含む。プ
ロモータMPr1098およびMPr1143は、類似の活性を示す。プロモータMpr1143は、
最小プロモータMPr1098の「ＣＡＡＴ」ボックスの上流の３６ｂｐの距離の「Ｇ
」ボックスの挿入から生じる。このボックスの存在は、プロモータMPr1098で得
られた発現に対して有意な効果を及ぼさないようである。プロモータMPr1112は
、「ＣＡＡＴ」ボックスの上流に、「as-2」ボックスの複製、続くCaMVのプロモ
ータ35Sを起源とする「as-1」を含む。これらのエレメントはそれ自体で、発現
率の向上に寄与しないようであり、これはプロモータMPr1098で得られる発現率
と実質的に同一である。
【０１４７】 -クラス３は、プロモータMPr1096およびMPr1097（図４）を含む。これらの２
つのプロモータにより付与された発現は同一である。petEプロモータの配列エン
ハンサ由来の領域を有する、MPr1097の「nosE類似」ボックスおよびSpeI-SpeIを
有する断片SphI-SpeIの欠失によるMPr1096の創製は、発現率に影響を及ぼさない
ようである。プロモータMPr1096では、petE配列エンハンサの３１ｂｐ前にあり
、「CAAT」ボックスから１２２ｂｐの距離にある、「Ｇ」ボックスの存在は、２
．５の係数で、MPr1098により得られた発現率の増加を可能とするようである。M
Pr1143の場合、「CAAT」ボックスから３６ｂｐの距離で２８ｂｐのpetT配列エン
ハンサの前にある「Ｇ」ボックスの存在により、MPr1098で得られた発現率の増
加は不可能となることに注意すべきである。従って、「Ｇ」と「CAAT」ボックス
の間の距離は、発現率に影響を及ぼすようである。
【０１４８】 -クラス４は、プロモータpetE（図４）を含み、これは基準として使用される
。
【０１４９】 -クラス５は、プロモータMPr1110（図４）を含む。プロモータMPr1110を創製
している、プロモータMPr1143の上流のas-2およびas-1ボックスの融合により、
発現率のかなりの増加が可能となり、これは、petEプロモータで得られる発現率
よりも非常に高い（１．４の係数）。「Ｇ」、「as-1」および「as-2」ボックス
は共に、発現に関して活発な正の相乗効果を有するようである。
【０１５０】 -クラス６は、プロモータMPr1111（図４）およびMPr1092（図１）を網羅する
。プロモータMPr1111は、基準二重35S CaMVプロモータ（MPr1092）の発現率と類
似した発現率を付与する。「as-2」エレメントまたはボックスの付加は、MPr111
0により得られた発現率と比べて、発現率をかなり増加させる（係数１．７）。
これらのエレメントは、相乗的に作用するようである。「as-2」ボックスの複製
もこの効果を増加させる。
【０１５１】 結論すると、キメラプロモータMPr1110は、全petEプロモータより高いまたは
等価なレベルでベータ-グルクロニダーゼの平均的発現を可能とする。プロモー
タMPr1111は、基準プロモータD35Sで得られた平均活性と同等なプロモータ活性
を有する。
【０１５２】 これらの結果は、同じプロモータで照射した葉の組織化学的染色後に観察され
たものと一致する。
【０１５３】 CaMV D35Sプロモータは、強力なプロモータであるとして文献に一般的に報告
されている。本発明のキメラプロモータは、基準プロモータCaMV35Sのプロモー
タ活性の８から１２倍の次元で、ＧＵＳレポーター遺伝子のプロモータ活性の増
加をもたらす（Kayら、１９８７）。さらに、MPr1111は、現在までに記載された
タバコ葉の最も活発で最も強力なキメラプロモータの１つを構成する。より強度
の低いプロモータを、例えば、「nos」型のプロモータと同じように、抗生物質
耐性を付与するために、選択物質をコードする遺伝子に関連したプロモータとし
て使用できる。
【０１５４】 実施例６ 安定な形質転換後のタバコでの異なるプロモータの発現 ６．１ タバコの安定な形質転換 タバコ（Nicotiana tabacum L.、bpD6品種）の形質転換を、６週令のタバコ植
物から単離した葉ディスクを、Horschら（１９８５）の記載した方法に従って組
換えAgrobacteriumにより感染することにより実施した。
【０１５５】 形質転換中、ペトリ皿を、以下の条件下で培養チャンバー中でインキュベート
し：24℃の温度、光期間８時間の暗がり／１６時間の光、光強度２００μｍｏｌ
光子．ｍ-２．ｓｅｃ-１、そして、最初の共培養段階とは別に、全てのカルロー
ス生成、再生、および根形成段階を、オーグメンチン（登録商標）（４００ｍｇ
／ｌ）およびカナマイシン（登録商標）（２００または１００ｍｇ／ｌ）を補充
した様々な選択培地上で実施した；
【０１５６】 異なる段階および培地は以下であった：
【０１５７】 -ビタミン（Gamborgら、１９６８）、４．４ｇ／ｌ（Sigma、M0404）、サッカ
ロース３０ｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌ（Merck）、ｐＨ５．７）、１ｍｇ／ｌのベン
ジルアミノプリンおよび０．１ｍｇ／ｌのインドール-３酢酸を補充したＭＳ（M
urashigeおよびSkoog、１９６２）に基づいた固体ＭＳ３０共培養培地上で、共
培養段階を３回続け、その間にAgrobacteriaは植物細胞を感染する。
【０１５８】 -培養チャンバー中の、１ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン、０．１ｍｇ／ｌ
のインドール-３酢酸、４００ｍｇ／ｌのオーグメンチン（登録商標）および２
００ｍｇ／ｌのカナマイシン（登録商標）を補充した、固体ＭＳ２０培地（塩お
よびビタミンＭＳ４．４ｇ／ｌ（Sigma.M0404）、サッカロース２０ｇ／ｌ、寒
天８ｇ／ｌ（Merck）、ｐＨ５．７）上で、４週間からなる芽尖端形成段階。
【０１５９】 -培養チャンバー中の、４００ｍｇ／ｌのオーグメンチン（登録商標）および
１００ｍｇ／ｌのカナマイシン（登録商標）を補充したＭＳ２０固体発達培地上
で、３週間続ける発達および根形成段階。
【０１６０】 -培養チャンバー中の、４００ｍｇ／ｌのオーグメンチン（登録商標）および
１００ｍｇ／ｌのカナマイシン（登録商標）を補充したＭＳ２０固体発達培地上
のガラスポットへの植え替え段階。
【０１６１】 ６．２ タバコ植物での安定な発現後のキメラプロモータ活性の比較 ベータ-グルクロニダーゼ活性を、温室に移した２、４、６、８週間後に、一
次形質転換体で測定した。各植物について、３つのサンプルを採取し、共に試験
チューブにプールした。１つのサンプルを「古い」葉（基本葉レベル）から、１
つのサンプルを成熟葉（中間葉レベル）から、および１つのサンプルを植物の頂
点に位置する若い葉から採取した。各サンプルを、乳鉢中液体窒素で摩砕し、粉
末を抽出緩衝液（トリスホスフェート２５ｍＭ、ｐＨ７．８、ジチオトレイトー
ル２ｍＭ、１，２-ジアミノシクロヘキサン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラ酢酸２
ｍＭ、グリセロール１０％、トリトンＸ１００１％）中に、２００ｍｇの植物粉
末あたり１ｍｌの緩衝液の比率で、再懸濁した。物質をホモジナイズし、１５分
間氷上でインキュベートし、その後、１６０６０ｇで５分間の遠心分離により清
澄とした。
【０１６２】 ＧＵＳ活性を、２０ｍｌの清澄化した粗抽出物で、製造業者の薦めに従って、
「ＧＵＳ光化学発光レポーター遺伝子アッセイ」検出キット（Tropix Inc.、Bed
ford、米国）の助けをかりて測定した。発光測定は、Lumat LB9507ルミノメータ
ー（EGG-Berthold、Bad Wildbad、独国）を使用して実施した。
【０１６３】 粗抽出物中の全タンパク質含量を、ブラッドフォード技術（Bradford、１９７
６）により、製造業者の薦めに従って、「バイオラッドタンパク質アッセイ」試
薬（Bio-Rad、Munchen、Allemagne）を使用して評価した。
【０１６４】 異なるカテゴリーの植物におけるレポーター遺伝子活性を、１個の作成物あた
り、２０個の形質転換体の個体群におよび、そして植物成長および発達の全期間
を通じて解析した。
【０１６５】 解析は、あるカテゴリーの異なる形質転換におけるランダムな挿入部位および
可変的なコピー数のために、個々のレベルでは実施しなかった。
【０１６６】 最初のpPetEプロモータ、最小MPr1143および基準MPr1092プロモータに比較し
た、キメラプロモータMPr1111の結果を図６に提示する。
【０１６７】 MPr1092基準植物のＧＵＳ活性は、プラストシアニンをベースとしたプロモー
タで形質転換した植物で観察されたものと比較して、比較的少ない変動を示した
。活性は、植物を温室に移した２ないし４週間後に、僅かに減少し；６週目に約
４倍増加し、再度、８週目に、４週目に観察された数値に下降し、最後に、１０
週目に僅かに増加した。プラストシアニンをベースとしたプロモータの解析によ
り、どのプロモータまたは植物を考慮しても、ＧＵＳ活性は、温室に移した２か
ら６週間後に規則的に増加し、その後、開花まで減少することが判明した。
【０１６８】 ＧＵＳ活性のこの発生は、植物発達に関連した。なぜなら、プラストシアニン
遺伝子は光合成組織で活発に発現されているからである。pPetEおよび派生プロ
モータの活性の後に、温室に移した後から順化の６〜８週間後にわたり植物の活
発な成長が起こり、その後、８週目から、温室に移した１０〜１２週間後に起こ
る開花まで、植物のより遅い発達が起こる。比較すると、高度に活性な構成性プ
ロモータとして知られる、基準MPr1092プロモータは、これらの発達に関連した
効果への依存度はより低かった。 キメラプロモータMpr1143および基準MPr1092を有する形質転換体の比較により
、どの発達段階であれ、「MPr1143植物」は、「D35S植物」に比べて非常に低い
ＧＵＳ活性を示すことが示された。これらのデータにより、MPr1143は、基底レ
ベルでレポーター遺伝子の最小限の発現を駆動することしかできないことが判明
し、最小pPetE配列に挿入された、「Ｇボックス」はそれ自体、発現を効率的に
促進するには十分ではないことを示す一過性発現実験の後に得られたデータを確
認した。
【０１６９】 最初のpPetEプロモータを有する形質転換体の個体群と、基準「MPr1092植物」
の比較により、pPetEは、植物を温室に移した２週間後に基準と同程度活性であ
り、活発な発達中（２から８週間）では３から４倍であることが示された。２つ
のプロモータ間の差異は、移動の６週間後から規則的に減少し、１０週目で逆転
した。なぜなら、基準植物が、「pPetE植物」の２倍以上の平均活性を示したか
らである。これらのデータは、pPetEが、Mpr1092よりも２．５倍活性が低い、一
過性発現後に得られたデータを実証しなかった。
【０１７０】 「MPr1111植物」とpPetEを有するものとの比較により、MPr1111は、平均して
、６週目までpPetEよりも２〜３倍活性が低く、その後少なくとも活性であるこ
とが判明した。
【０１７１】 ８および１０週目に、数個の「MPr1111個体」は、実際、「PetE個体」よりも
活性であった。この程度まで、安定な発現により、MPr1111は平均してpPetEより
も２．５倍活性である一過性発現に比べて、異なる結論に至った。
【０１７２】 MPr1111は、一次形質転換体の個体群において、植物を温室に移した４から８
週間後にわたる成長および発達の期間におよび、基準MPr1092よりも活性である
ことが示され、８週目に最大の２から３倍の活性であった。
【０１７３】 これらの時間経緯解析を基に、我々は、それぞれのプロモータ強度は、植物の
成長を通じて静的ではないと結論づけることができ、これは、おそらく、異なる
調節プロセスによる。MPr1111は、植物を温室に移した８週間後に最大レベルに
レポータータンパク質ＧＵＳの発現を駆動するプロモータであり、それ故、この
タバコ発達段階で、大量の異種タンパク質の発現に使用できる最善の候補のよう
である。
【０１７４】
【参考文献】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１では、示した作成物は、全てのプロモータ配列の非存在下で
ベータ-グルクロニダーゼをコードするレポーター遺伝子を含み、それにより陰
性対照として作用する。
【図２】 図２は、強力なプロモータの基準対照として作用する、３５Ｓ増
強プロモータ（ep35S）としても知られる、CaMV二重３５Ｓプロモータ（d35SCaM
V）の制御下でベータ-グルクロニダーゼをコードする遺伝子を含む作成物を図解
で示す。
【図３】 図３は、一過性発現実験の内部基準として作用する作成物を示し
、35SCaMVプロモータの制御下でルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子
からなる。
【図４】 図４は、本発明に記載され、エンドウマメプラストシアニン遺伝
子由来の全プロモータ（petE prom）から得られた、キメラプロモータの数個の
好ましい実施形態の構造を図解で示し、後者も示す。MPr1098、MPr1097およびMP
r1096として同定されたプロモータは、エンドウマメプラストシアニン遺伝子の
全プロモータの酵素的消化により得られ、一方、MPr1108、MPr1109、MPr1110、M
Pr1111、およびMPr1112として同定されたプロモータは、リガンドをベースとし
たＰＣＲ（ｌｂ-ＰＣＲ）により得られた。プロモータMPr1143およびMPr1153は
、それぞれプロモータMPr1111の「as-2」および「as-1」ボックスの欠失から、
およびプロモータMPr1143の上流のMPr1108の「as-1類似」および「nosエンハン
サ類似」ボックスの機能により得られた。作成された全プロモータを、ベクター
pMRT1144の制限部位PstIとBamHIの間にクローニングし、ベータ-グルクロニダー
ゼをコードするレポーター遺伝子uidAを有する転写融合物を得た。
【図５】 図５は、タバコ葉での一過性発現後の、様々な作成物の相対的プ
ロモータ活性を比較したグラフを示す。照射の３日後、葉を研磨し、得られた粗
抽出物は遠心分離により清澄化した。ベータ-グルクロニダーゼおよびルシフェ
ラーゼ活性は、粗抽出物のアリコートの蛍光定量法により測定し、ＧＵＳ／ＬＵ
Ｃ活性比を決定した。ヒストグラムは、ある作成物の比の平均プラスまたはマイ
ナス平均標準誤差（ＭＳＥ）に対応する；
【図６】 図６は、タバコ植物の安定な形質転換後の、キメラプロモータ活
性の比較の図解的グラフを示す。サンプルを、温室に移した２、４、６、８およ
び１０週間後に全ての一次形質転換体で採取し、ベータ-グルクロニダーゼ活性
を各サンプルから測定し、全タンパク質含量を量り、タンパク質のＧＵＳ活性を
ｒｌｕ／ｍｇで出す。各発達段階で、各シリーズの一次形質転換体について桁を
減少させることにより選別し、互いに比較した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マンフレッド・テイザン フランス・Ｆ−63400・シャマリエール・ リュ・デ・ロゼレー・１ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 CD10 CD13 4B024 AA08 AA20 BA12 CA04 DA05 EA04 FA02 FA07 GA12 4B065 AA11X AA88Y AB01 BA04 CA31 CA53

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号０１の配列を有する、エンドウマメプラストシアニ
    ン遺伝子のプロモータに由来する少なくとも１の核酸配列を含むキメラ発現プロ
    モータ。
  2. 【請求項２】 前記の、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータ
    由来の核酸配列が、配列番号０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０９
    、１０及び１１の配列からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記
    載のキメラプロモータ。
  3. 【請求項３】 「ＣＡＡＴ」ボックス、「ＴＡＴＡ」ボックス、及び転写開
    始部位（＋１）の少なくとも１の上流に操作可能なようにして、又は機能するよ
    うにして連結された「Ｇ」ボックスを含むことを特徴とするキメラ発現プロモー
    タ。
  4. 【請求項４】 前記の「Ｇ」ボックスが、転写開始部位（＋１）に対して-
    ２２５と-６５の間の部位に位置することを特徴とする請求項３に記載のキメラ
    発現プロモータ。
  5. 【請求項５】 前記の「Ｇ」ボックスが、転写開始部位（＋１）に対して-
    ２０１と-１１５の間の部位に位置することを特徴とする請求項３に記載のキメ
    ラ発現プロモータ。
  6. 【請求項６】 前記の「Ｇ」ボックスが、転写開始部位（＋１）に対して-
    ２０１の部位に位置することを特徴とする請求項３に記載のキメラ発現プロモー
    タ。
  7. 【請求項７】 前記の「Ｇ」ボックスが、転写開始部位（＋１）に対して-
    １１５の部位に位置することを特徴とする請求項３に記載のキメラ発現プロモー
    タ。
  8. 【請求項８】 前記の「Ｇ」ボックスが、植物起源であることを特徴とする
    請求項３に記載のキメラプロモータ。
  9. 【請求項９】 前記の「Ｇ」ボックスが、エンドウマメプラストシアニン遺
    伝子のプロモータより得られたものであることを特徴とする請求項３に記載のキ
    メラプロモータ。
  10. 【請求項１０】 前記の「Ｇ」ボックスが、エンドウマメプラストシアニン
    遺伝子のｐｅｔＥプロモータより得られたものであることを特徴とする請求項３
    に記載のキメラプロモータ。
  11. 【請求項１１】 前記「Ｇ」ボックスの上流に操作可能なようにして、又は
    機能するようにして連結された「ｎｏｓ Ｅ様」ボックスを更に含むことを特徴
    とする請求項３乃至１０の何れか一項に記載のキメラプロモータ。
  12. 【請求項１２】 前記の「Ｇ」ボックスに操作可能なようにして、又は機能
    するようにして連結された、少なくとも１の、「ａｓ１」又は「ａｓ１様」ボッ
    クスを更に含むことを特徴とする請求項３乃至１１の何れか一項に記載のキメラ
    プロモータ。
  13. 【請求項１３】 前記のプロモータが、連続して又は分離して配置された、
    ２以上の「ａｓ１」又は「ａｓ１様」ボックスを含むことを特徴とする請求項１
    ２に記載のキメラプロモータ。
  14. 【請求項１４】 前記のプロモータが、４つの、「ａｓ１」又は「ａｓ１様
    」ボックスを含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載のキメラプロモー
    タ。
  15. 【請求項１５】 前記の「ａｓ１」又は「ａｓ１様」ボックスが、前記の「
    Ｇ」ボックスの上流と下流の両方に、好ましくはその上流に連結していることを
    特徴とする請求項１２乃至１４の何れか一項に記載のキメラプロモータ。
  16. 【請求項１６】 前記の「ａｓ１」又は「ａｓ１様」ボックスの１以上が、
    逆順、好ましくは逆反復順に配置されていることを特徴とする請求項１２乃至１
    ５の何れか一項に記載のキメラプロモータ。
  17. 【請求項１７】 前記の「Ｇ」ボックスに操作可能なように連結した少なく
    とも１の「ａｓ２」ボックスを更に含むことを特徴とする請求項３乃至１６の何
    れか一項に記載のキメラプロモータ。
  18. 【請求項１８】 前記のプロモータが、少なくとも２以上の「ａｓ２」ボッ
    クス、好ましくは４つの「ａｓ２」ボックスを含むことを特徴とする請求項１乃
    至１７の何れか一項に記載のキメラプロモータ。
  19. 【請求項１９】 前記の「ａｓ２」ボックスが、前記の「Ｇ」ボックスの上
    流及び下流の両方、好ましくはその上流に連結していることを特徴とする請求項
    １８に記載のキメラプロモータ。
  20. 【請求項２０】 前記の１以上の「ａｓ１」又は「ａｓ１様」ボックスが、
    逆順、好ましくは逆反復順に配置されていることを特徴とする請求項１７乃至１
    ９の何れか一項に記載のキメラプロモータ。
  21. 【請求項２１】 配列番号０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０
    ９、１０及び１１の配列からなる群より選択される少なくとも１の核酸配列を含
    むことを特徴とする請求項３乃至２０の何れか一項に記載のキメラプロモータ。
  22. 【請求項２２】 産生されるポリペプチドをコードし、それ自身が操作可能
    なようにして又は機能するようにして転写終止核酸配列に連結された、発現され
    る核酸配列に、操作可能なようにして又は機能するようにして連結された、エン
    ドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータ由来の少なくとも１の核酸配列を
    含む発現カセットであって、 エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモータに由来する当該核酸配列が
    、配列番号０２、０３、０４、０５、０６、０７、０８、０９、１０及び１１の
    配列からなる群より選択されることを特徴とする発現カセット。
  23. 【請求項２３】 前記の配列が、配列番号０２、０３、０４、０５、０６、
    ０７、０８、０９、１０及び１１の配列からなる群より選択されることを特徴と
    する単離されたプロモータ核酸配列。
  24. 【請求項２４】 前記の配列が、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、
    １７、及び１８の配列からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃
    至２１、又は２３の何れか一項に記載のキメラ発現プロモータ又は単離されたプ
    ロモータ核酸配列のための、指向性デオキシヌクレオチド構成要素。
  25. 【請求項２５】 前記の配列が、配列番号１９、２０、２１、及び２２の配
    列からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至２１、又は２３の
    何れか一項に記載のキメラ発現プロモータ又は単離されたプロモータ核酸配列の
    ための、ガイド用デオキシヌクレオチド構成要素。
  26. 【請求項２６】 産生されるポリペプチドをコードする核酸配列の転写を開
    始することができる、プロモータ又はプロモータ核酸配列を含むベクターであっ
    て、当該プロモータ又は当該プロモータ核酸配列が、請求項１乃至２１、又は２
    ３の何れか一項に記載のキメラ発現プロモータ又はプロモータ核酸配列に対応す
    ることを特徴とするベクター。
  27. 【請求項２７】 前記のベクターが、ｐＭＲＴ１１５１、ｐＭＲＴ１１４９
    、ｐＭＲＴ１１７０のバイナリーベクターからなる群より選択されることを特徴
    とする請求項２６に記載のベクター。
  28. 【請求項２８】 請求項１乃至２１、又は２３の何れか一項に記載のキメラ
    発現プロモータ又は単離されたプロモータ核酸配列の製造方法であって、下記：
    -ＬＣＲとよばれる連結連鎖反応を実行して、それぞれ配列番号１２、１３、１
    ４、１５、１６、１７、及び１８で同定される、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５
    、Ｓ６及びＳ７の「指向性」デオキシヌクレオチドからなる群より選択される少
    なくとも１つの指向性デオキシヌクレオチド構成要素と、少なくとも１つの「ガ
    イド用」デオキシヌクレオチド構成要素とから、連続した一本鎖ＤＮＡを産生す
    る工程であって、当該プロモータ核酸配列又は当該プロモータが、それぞれ配列
    番号１９、２０、２１、及び２２で同定される、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、及びＧ４の
    「ガイド用」デオキシヌクレオチドからなる群より選択されることを特徴とする
    工程； -上記の工程で得られた当該一本鎖ＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を実行し、キメラ
    発現プロモータ又はプロモータ核酸に対応した二本鎖ＤＮＡを得ることを可能に
    する工程； -任意に、当該プロモータ又は当該プロモータ核酸配列を単離する工程； からなる工程を含むことを特徴とする方法。
  29. 【請求項２９】 前記のデオキシヌクレオチド要素が、連結前にリン酸化さ
    れることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記の連結を、少なくとも１のＤＮＡリガーゼの存在下に
    、サーモサイクル中で、以下の条件下： -約９４℃で約１分間を１サイクル； -それぞれが以下の工程からなる同一のサイクルを８回： -６５℃で１分間、５７℃で１分間、５２℃で１分間、４８℃で１分間、４３
    ℃で１分間、そして３７℃で１０分間； で実行することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 そのゲノム内に、請求項１乃至２１、又は２３の何れか一
    項に記載のそれぞれ少なくとも１のプロモータ、又は少なくとも１のプロモータ
    核酸配列が、安定に組み込まれたトランスジェニック植物。
  32. 【請求項３２】 前記の植物が、双子葉種、好ましくはジャガイモ、タバコ
    、ワタ、レタス、トマト、メロン、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブラナ
    、アオゲイトウ、又はヒマワリ、あるいは単子葉種、好ましくはコムギ、オオム
    ギ、カラスムギ、イネ、又はトウモロコシより選択されることを特徴とする請求
    項３１に記載のトランスジェニック植物。
  33. 【請求項３３】 請求項３１又は３２に記載のトランスジェニック植物のム
    カゴ。
  34. 【請求項３４】 前記のムカゴが、種子であることを特徴とする請求項３３
    に記載のトランスジェニック植物のムカゴ。
  35. 【請求項３５】 それぞれ請求項１乃至２１、又は２３の何れか一項に記載
    のプロモータ、又はプロモータ核酸配列を含む細胞。
  36. 【請求項３６】 前記の細胞が、植物細胞、ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞
    、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、そして好ましくは植物細胞であることを特徴
    とする請求項３５に記載の細胞。
  37. 【請求項３７】 産生されるポリペプチドをコードする、核酸配列又は遺伝
    子を細胞内で発現する方法であって、下記： -それ自身が転写終止シグナルに操作可能なようにして連結された産生されるポ
    リペプチドをコードした核酸配列又は遺伝子に操作可能なようにして連結された
    、請求項１乃至２１、又は２３の何れか一項に記載の少なくとも１のプロモータ
    又は少なくとも１のプロモータ核酸配列を含むベクターで、細胞を形質転換する
    工程； -形質転換された細胞を、前記のポリペプチドがコードされた核酸配列又は遺伝
    子の発現が起るような条件下で培養して、当該ポリペプチドを産生させる工程； からなる工程を含むことを特徴とする方法。
  38. 【請求項３８】 前記の細胞が、原核細胞又は真核細胞であることを特徴と
    する請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記の細胞が、微生物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細
    胞、及び植物細胞からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項
    ３７又は３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記の細胞が、植物細胞であることを特徴とする請求項３
    ７乃至３９の何れか一項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３１又は３２に記載のトランスジェニック植物、又
    は請求項３３に記載のムカゴを製造する方法であって、下記： -請求項１乃至２１、又は２３の何れか一項に記載の、少なくとも１のプロモー
    タ又は少なくとも１のプロモータ核酸配列を含むベクターで、植物細胞を形質転
    換する工程； -前記のプロモータ又は前記のプロモータ核酸配列が組み込まれた植物細胞を選
    択する工程； -前記の形質転換され、且つ選択された植物細胞を、培養により、又は、キメラ
    植物又はトランスジェニック植物の全体の再生の何れかにより増殖させる工程； からなる工程を含むことを特徴とする方法。
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