JP2011509081A - タンパク質発現系 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
コモウイルスは、2分節ゲノムを有するRNAウイルスである。コモウイルスRNAゲノムのセグメントは、RNA−1およびRNA−2と呼ばれている。RNA−1は、VPg、レプリカーゼおよびプロテアーゼタンパク質をコードする(非特許文献1)。レプリカーゼは、ウイルスゲノムの複製のためにウイルスによって必要とされる。コモウイルスのササゲモザイクウイルス(cowpea mosaic virus)(CPMV)のRNA−2は、58Kおよび48Kのタンパク質、ならびに2つのウイルスコートタンパク質LおよびSをコードする。
突然変異誘発実験により、CPMVのRNA−2における161位および512位での開始部位の間のフレームの維持が、RNA−1にコードされるレプリカーゼによって、RNA−2の効果的な複製に必須であることが示された(非特許文献2;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献3)。この条件は、CPMVのRNA−2(以下に示す)に基づく発現ベクターにおける512位の開始コドンの上流に挿入され得る配列の長さを制限し、そのようなベクターに外因性遺伝子をクローニングすることを、理想的なものよりも困難にさせる。例えば、それらの使用がしばしば、それらの開始部位の間のオープンリーディングフレーム(ORF)を変化させるため、ポリリンカーの使用を妨げる。
CPMVは、植物における異種ポリペプチドの産生に適切なベクター系の開発のための基礎として役立っている(非特許文献6;非特許文献7)。これらの系は、RNA−2の修飾に基づくが、完全長か欠失した型を使用するか否かにより異なる。しかしながら、両方の場合において、修飾したRNA−2の複製は、RNA−1との共接種によりなされる。RNA−2の完全長型に基づいた発現系は、RNA2由来のポリペプチドのC末端に対する外来性タンパク質の融合に関与する。N末端ポリペプチドの解放は、口蹄疫ウイルス由来の2A触媒ペプチド配列の作用により媒介される(非特許文献8)。得られるRNA−2分子は、植物内および植物間の両方で分離できる。この戦略は、cowpea植物において、Hepatitis Bコア抗原(HBcAg)および小さな免疫タンパク質(SIP)などの多くの組み換えタンパク質を発現するために使用されている(非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11)。成功的ではあるが、完全長のウイルスベクターの使用は、挿入される配列のサイズ制限の点で不都合であり、生物学的封じこめについての問題がある。
(a)上記のエンハンサー配列、および(b)目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子発現系を提供し、ここで、その遺伝子はエンハンサー配列の下流に位置する。
(i)作動可能に連結されるプロモーター
(ii)上記のエンハンサー配列
(iii)発現することが所望される目的の遺伝子
(iv)終結配列
を含む、発現カセットを提供する。
(1)p35S:Odellら、1985
(2)Cassava Vein Mosaic Virusプロモーター、pCAS、Verdaguerら、1996
(3)リブロース二リン酸カルボキシラーザの小さいサブユニットのプロモーター、pRbcS:Outchkourovら、2003
が挙げられる。
(a)上記のエンハンサー配列、および
(b)遺伝子発現系に目的のタンパク質をコードする遺伝子の挿入を促進するための異種配列を含む遺伝子発現構築物を提供し、ここで、その異種配列は、エンハンサー配列における変異された標的開始部位の下流に位置する。
(a)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される目的の異種タンパク質をコードする少なくとも1つの外来性遺伝子を保有する2分節のウイルスゲノムの切断されたRNA−2を含む第1の遺伝子構築物であって、その第1の遺伝子構築物は、外来性遺伝子の上流に変異された標的開始部位を含む、第1の遺伝子構築物と、必要に応じて、
(b)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、前記2分節のウイルスゲノムのRNA−1を含む第2の遺伝子構築物と、必要に応じて、
(c)前記第1の遺伝子構築物、前記第2の遺伝子構築物またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第3の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、第3の遺伝子構築物と、
を含む遺伝子発現系に関連する。
(a)本発明の遺伝子発現構築物を植物細胞に導入する工程と、必要に応じて、
(b)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、前記2分節のウイルスゲノムのRNA−1を含む第2の遺伝子構築物を植物細胞に導入する工程と、必要に応じて、
(c)前記第1の遺伝子構築物、前記第2の遺伝子構築物、またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第3の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む第3の遺伝子構築物を植物細胞に組み込む工程と、
を含む植物においてタンパク質を発現する方法を提供する。
前記第1の遺伝子構築物、前記第2の遺伝子構築物、またはその両方内に必要に応じて組み込まれる第3の遺伝子構築物であって、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む第3の遺伝子構築物を植物細胞に導入する工程を含む。
(a)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される目的の異種タンパク質をコードする少なくとも1つの外来性遺伝子を保有する2分節のウイルスゲノムの切断されたRNA−2を含む第1の遺伝子構築物であって、その遺伝子構築物は、外因性遺伝子の上流に変異された標的開始部位を含む、第1の遺伝子構築物と、必要に応じて、
(b)前記第1の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第2の遺伝子構築物、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子と、
を含む遺伝子発現系に関する。
(a)本発明の遺伝子発現構築物を植物細胞に導入する工程と、必要に応じて、
(b)前記第1の遺伝子構築物内に必要に応じて第2の遺伝子構築物を導入する工程であって、前記第2の遺伝子構築物は、植物細胞内のプロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、工程と、
を含む植物においてタンパク質を発現する方法を提供する。
・本発明のエンハンサー配列から構成されるか、またはエンハンサー配列から実質的に構成される核酸(そのエンハンサー配列は、(例えば)CPMV RNA−2ゲノムセグメントのヌクレオチド1〜512から構成されるか、あるいはそれら由来であるか、または2分節のRNAウイルスの別のRNA−2ゲノムセグメント由来であり、各々の場合において、CPMV RNA−2の161位に対応する標的開始部位が変位される)。
・例えば、目的のタンパク質、またはポリリンカー、および必要に応じてターミネーターをコードするORFの上流にそのようなエンハンサー配列を含む遺伝子発現系。
・本明細書に記載されるエンハンサー配列を使用するために本発明に従って修飾されたWO/2007/135480に記載される2分節の発現系。
・(i)作動可能に連結されるプロモーター、(ii)上記のエンハンサー配列、(iii)発現することが望まれる目的のポリリンカーまたは遺伝子、(iv)同系の3’UTR(すなわち、CPMV RNA−2ゲノムセグメントの3’UTR由来)、(v)終結配列を含む、発現カセット。
・本発明の遺伝子発現系またはベクターを用いる植物などの宿主生物におけるタンパク質、例えば異種タンパク質を発現する方法。
・本発明の遺伝子発現系またはベクター由来のタンパク質を発現する宿主細胞および生物(例えば、植物または酵母)ならびにそれらを産生する方法。
1.1方法
発現ベクターFSC2およびその誘導体の作製
pBinP−1−GFPベースのプラスミド(Canizaresら,2006)由来の外来性タンパク質の発現のために有用なクローニングベクターを、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35SプロモーターおよびpBinP−S2NT(LiuおよびLomonossoff,2002)由来のノパリン合成(nos)ターミネーターに隣接するRNA−2の完全な配列を切断し、それを、Ascl/Pacl断片として変異誘発プラスミドpM81W(LiuおよびLomonossoff,2006)に挿入することによって作製した。得られたプラスミド、pM81W−S2NTに、4つの変更を同時に導入する単一ラウンドの変異誘発(LiuおよびLomonossoff,2006における方法を参照のこと)を行って、pM81B−S2NT−1を得た。変異誘発により、ベクターバックボーンから2つのBspHI部位を除去し、AUG512付近にBspHI部位(T/CATGA)およびUAA3299後にStuI部位(AGG/CCT)、RNA−2によりコードされるポリタンパク質についての終止コドンを導入した。続いて、BamHI/Ascl断片を、pBinP−NS−1(Liuら,2005)から切断し、同様に消化したpM81B−S2NT−1にライゲーションして、pM81−FSC−1を得た。このベクターにより、AUG512の下流のRNA−2 ORFの全てを、BspHIおよびStuIでの消化により切断でき、BspHIおよびStuI(平滑)適合性末端((blunt)−compatible end)を有する任意の配列と置換できる。BspHI部位の使用は重要である。なぜなら、それは、512位のAUGを保存し、このイニシエーターは、挿入した遺伝子の翻訳を駆動するために使用されるからである。植物において外来性遺伝子を発現するために、pM81−FSC−1由来プラスミドはAsclおよびPaclで消化され、同様に消化されたpBINPLUSに移入された外来性配列を含む発現カセットを有する断片および得られるプラスミドは、最終的に、A.tumefaciensに形質転換される。
図6に示した集合したHBcAg粒子の電子顕微鏡写真に使用した樹液(sap)は以下のように調製した。葉組織を、2容量のTris/NaCl緩衝液中に抽出し、100kDa MWCOカラムで濃縮せずにTEと交換した。HBcAgの最終濃度は、coomassie染色したSDS−PAGEゲルでの標準物との比較により判断した場合、約0.2mg/mlであった。
(1)161位(AUG161)および512位(AUG512)における開始部位の相対位相を変化させる効果
これを達成するために、余分なヌクレオチドを、AUG512(FSC2−512)のすぐ上流に挿入して、AUGを513位(FSC2−513)、514位(FSC2−514)および515位(FSC2−515)に移動させた(図1)。AUG161と位相をずらしてAUG512(FSC2−513およびFSC2−514)を配置すると、蛍光(図3)およびCoomassie染色したゲル(図2)によって判断した場合、GFP発現は低かった。位相(FSC2−515)を元に戻すと、天然の状態(FSC2−512)で見られたレベルの発現に戻った。結論としては、AUG161が存在し、161位のAUGと位相が一致する場合、下流のAUGでの開始が最も効率的である。
GFP発現がAUG512から駆動される場合、すなわち、この第2のAUGがAUG161と位相が一致する場合、AUG115の除去は、ほとんどまたは全く影響を与えない(図2および図3の標識した10のレーンを参照のこと)。しかしながら、第2のAUGがAUG161(513、514)と位相がずれる場合、AUG115の欠失は、実質的にGFP発現を生じない(図2および図3の標識した10のレーンを参照のこと)。結論:AUG115は、何らかの形で、AUG161を回避し、AUG512に到達することによってリボソームの能力に関与する。しかしながら、このことは、正確な位相に存在する下流のAUGを必要とする。
この変異の効果は信じられないほど劇的であり、GFP発現レベルが、AUG161が存在する場合に見られる量の20〜30倍に到達する(図2および図3における標識した01のレーンを参照のこと)。さらに、AUG161の非存在にもかかわらず、位相AUG512はもはや問題ではないように見え、位相の考えは大して重要ではない。さらに、AUG115の存在または非存在に差異はない(図2および図3における標識した11のレーンを参照のこと)。DsRedおよびHBcAg発現についてのdelRNA−2(図1における発現ベクター00[FSC2−512])構築物を用いる場合、5日以内に、浸潤したパッチは膨圧を失い、クロロティック(chlorotic)(薄い)になった。7日までに、組織は灰色のように見え、完全に死んだ。HT(図1における発現ベクター01[FSC2−512])を用いる場合、組織は7日後に膨張し、ストレスのサインのみが、HBcAg発現組織をわずかに白化する。2G12 IgGの重鎖が、delRNA−2によって発現され、ERに残存する場合、白化は7日後に明らかであるが、HTについては、これは観測されない。従って、異種タンパク質を発現するためにHTを用いる場合、植物に見られる壊死のレベルは、より高いレベルの異種タンパク質発現が達成されるにもかかわらず、異種タンパク質を発現するためにdelRNA−2を用いる場合より非常に低い。
非常に高レベルの外来性遺伝子発現が、AUG161を欠失することによってdelRNA−2構築物から発現され得る。現在のところ、GFPを用いて、本発明者らは、全可溶性タンパク質(TSP)のうちの25〜30%または1Kgの葉あたり約1gの発現されたタンパク質のレベルと測定する。これは非常に高いレベルであり、かつ、本発明者らが用いるアプローチは非常に簡単である。本発明者らがもはやリーディングフレームを保存する必要がないという事実は、ポリリンカーを有する、使用者によって使いやすいベクターが産生され得るということを意味する。
2.1背景
実施例1に記載したように、効果的な発現に必要なCPMC RNA−2の5’非翻訳領域(UTR)に必要な特徴を調べるために、本発明者らは、主要な開始部位の上流の5’リーダー配列内に見られる2つのAUGコドンの役割について扱った。本発明者らは、フレーム内の主要な翻訳開始部位(512)の上流の開始コドン(161)の欠失が、外来性タンパク質蓄積の大幅な増加をもたらすことを実証した。
pBD−FSC2−512−U162C(HT)は、pBINPLUSのPacI/AscI部位に挿入されるFSC2−512−U162Cカセット(実施例1を参照のこと)を含む(van Engelenら、1995)。このプラスミドの本質的なセグメント(以下を参照のこと)を、再ライゲーションのための特有の制限酵素部位をコードするオリゴヌクレオチドを用いて、高忠実度のポリメラーゼ、PHUSION(New England Biolabs)で増幅させた(表4.1)。T−DNA領域を、特有のAhdI部位(pBD−LB−F)の上流の配列と相同のセンスプライマーおよびApaI部位(pBD−RB−ApaI−R)を含むアンチセンスプライマーで増幅させた。ColEI複製起点、NPTIII遺伝子、およびTrfA遺伝子座を含む領域を、ApaI部位(pBD−ColEI−ApaI−F)を含むセンスプライマー、およびSpeI部位(pBD−TrfA−SpeI−R)を含むアンチセンスプライマーで増幅させた。RK2複製起点(OriV)を、SpeI部位(pBD−oriVSpeI−F)を含むセンスプライマーおよびAhdI部位(pBD−oriV−AhdI−R)を含むアンチセンスプライマーで増幅させた。精製後、それらの産物を、それらの末端でコードされ、3点のライゲーションのために混合した特有の制限部位に従って消化した。これにより、プラスミドpEAQbetaが得られ、そのためのライゲーション結合を、シークエンシングにより確認した。CPMV−GFP−HTカセットのnosターミネーターの一部を除去したT−DNAからの約1.2kbの欠失を検出した。従って、プライマーpBD−ColEI−ApaI−FおよびpMini>pMicroBIN−Rを用いて、右側の境界を含むpEAQbetaバックボーンのように、pBD−FSC2−GFP−HTからの右側の境界を含むターミネーターの一部を、プライマーpMini>pMicroBIN−F2およびpBD−RB−ApaI−Rで再び増幅させた(表4.1)。精製した産物を、ApaIおよびFseIで消化して、pEAQを得るためにライゲーションした(図9)。
2.3.1 pBINPLUSは、少なくとも7.4kbの外来性配列を含む
CPMV−HTからの発現は、非常に高レベルの組み換えタンパク質の産生を可能にする。それにも関わらず、一過性形質転換のための系およびその使用をさらに改良することが望まれた。
ベクターに対する修飾を生じる発現の効果をモニターするために、本発明者らは、pBINPLUS由来プラスミド、pBD−FSC2−512−U162C(HT)で開始することを選択した。T−DNA、RK2(OriV)複製起点、ならびにColEI起点、NPTIIIおよびTrfAを含むセグメントからなる3つの領域を、pBD−FSC2−GFP−HTからPCRによって増幅させた。これらの3つのフラグメントのライゲーションにより、プラスミドpEAQbeta(図9)が得られ、それは、その親プラスミドより4584bp小さい。pEAQbetaのPCR増幅のさらなるラウンドにより、T−DNA領域由来の2639bpの必須でない配列を除去し、3つの特有の制限部位、AsiSI、MlulおよびFseIを挿入した。AsiSI/Mlul消化は、Pacl/Ascl断片の挿入と適合するので、全ての以前のCPMVクローニングベクターから複数のカセットをクローニングするのに非常に有用である。FseIは、異なる選択マーカーまたはサイレンシング抑制因子カセットを置き換えるのに有用な特有の8塩基の認識部位を提供する。得られるpEAQGFP−HTプラスミドは、pBINPLUSのサイズの半分より小さく、CPMVHT発現カセットを有さず、5137bpのみで、最も小さい公知のバイナリーベクターの1つである(図9)。pEAQプラスミド全体の配列を決定し、RK2複製起点が以前に報告されたもの(Frischら、1995)と逆方向であることを発見したので、pEAQ−GFP−HTの正確な方向を示す。
pEAQシリーズのベクターのアグロ浸潤法(agro−infiltration)により、サイズの大幅な減少が一過性アッセイにおいて発現レベルをほとんど妥協しないことが示される。pEAQ−GFP−HT、およびpBIN61−P19によって提供されるP19を有するpEAQselectK(rev)−GFP−HTの同時浸潤は、pBD−FSC2−512−HTおよびP19の同時浸潤とほとんど変わらない発現レベルを生じる。これは、UV照射下(図11A)、SDS−PAGE(図11B)、およびタンパク質抽出物におけるGFPのスペクトル蛍光測定(図11C)で見られ得る。興味深いことに、T−DNA内のNPTIIカセットの方向は、発現レベルに影響を与えるようである。pEAQselectKは、GFP蓄積の減少を生じる他の同等のpEAQselectK(rev)と比べて著しい向上を示す。
T−DNA内のNPTIIカセットの順方向によって得られる発現の増加を利用するために、P19カセットを、pEAQselectK−GFP−HTにおけるAsiSIとMlul部位との間に挿入して、pEAQspecialK−GFP−HTを得た(図10)。GFPの配列として同じT−DNA上のP19の存在により、P19で同時浸潤したpEAQselectK−GFPHTと同様のレベルの発現が生じる(図12)。これは、pEAQexpress−GFP−HTによって産生される発現より多く、NPTIIカセットの存在に起因するように見える(図12)。対照的に、pEAQexpressからの低い発現は、T−DNA内のP19カセットの異なる位置および方向に起因し得る。それにも関わらず、pEAQexpressと同様に、pEAQspecialKベクターは、2つの培養物が同時浸潤されなければならない場合に使用されるものの最終的なODの半分のアグロバクテリウムの懸濁液で高レベルの発現を与える。
単一のプラスミドからの高レベルIgG発現
pEAQシリーズ、ヒト抗HIV IgGのERを保有する重鎖(HE)および軽鎖(L)を含むCPMV−HT発現カセットのモジュールの性質を利用するために、2G12を、pEAQexpressのPacl/AsclおよびAsiSI/Mlul部位に挿入した。挿入部位が発現レベルに影響を与えるか否かを決定するために、LおよびHE鎖を、pEAQex−2G12HELおよびpEAQex−2G12LHEを生じる両方の位置に挿入した(図13A)。上記のプラスミドを含む単一のアグロバクテリウム培養物でのN.benthamianaの浸潤により、各々が個々の要素、L、HEおよびP19を発現する3つのアグロバクテリウム培養物を混合することにより産生された2G12とサイズが同一の完全に集合した2G12抗体の形成が生じた(図13C)。各レーンに負荷したタンパク質は、90mgの浸潤した組織から得た抽出物の1/30または1gの組織から潜在的に得られるタンパク質の1/333を示す。3つの株の混合物から産生された集合したIgGの最大量は、coomassie染色した減少していないSDS−PAGEゲルでの1μgのCHOにより産生された2G12に相当する。このことは、325mg/kgの新鮮な重量の組織を超える2G12の発現レベルを示唆し、SPRにより測定された濃度と一致する。pEAQex−2G12HELの使用は、このすでに高レベルの抗体の蓄積を抑制するように見える。
・ブルータングウイルス(Bluetongue Virus)(血清型10)VP2、VP3、VP5、VP7およびNS1。
・ロタウイルスNSP5
・Medicago truncatula由来のカルモジュリン(これは後で精製された)
・発現するのが困難なヒトFcγ受容体1(CD64)の細胞外ドメイン−これは精製され、抗体結合研究において機能的であることが示されている。
・CPMV小(S)および大(L)コートタンパク質が同時発現され、ウイルス様粒子内で集合することが示されている(データは示さず)。
CPMV−HT発現ベクターへの直接クローニング
単一のプラスミド上に系の要素を組み合わせるが、上記のベクターはなお、バイナリープラスミドに発現される配列を組み込むために2段階のクローニング手順を必要とした。本実施例は、目的の遺伝子が直接挿入され得るバイナリープラスミドを提供する。そのプラスミドはpEAQベースのプラスミドへ直接挿入できないポリリンカーを組み込むが、所望の場合、CまたはN末端ヒスチジンタグの融合も可能にする(pEAQ−HT;図14A)。ポリリンカーをまず、アニールしたオリゴヌクレオチドとしてpM81−FSC2−512(A115G)(U162C)に挿入し、pM81−FSC−POWを得た。この構築物はなお、複数のポリペプチドを発現させるためのpEAQベースの構築物を発生させるための標準的な2段階クローニング手順に使用できる。さらに、二重変異した5’リーダーの使用は、単一の変異で得られるよりも、さらに高発現レベルを得ることができる。次いで、CPMV−HTカセットを、Pacl/Ascl部位を介してpEAQspecialKに移して、pEAQ−HTを得た。pEAQ−HTのポリリンカー内の全ての3つの位置へのGFPの挿入により、非標識GFP、および5’(HisGFP)および3’(GFPHis)His−タグ融合を得た。
CPMV−HT発現系の使用の容易さおよび機能を改良するために、ベクターのモジュラーセットが、容易かつ迅速な植物発現のために作製される。
pEAQプラスミドおよびトランスジェニック植物での安定な組み込み
pEAQベクターシリーズを、一過性発現を考慮して設計したが、T−DNA内にNPTIIカセットの再挿入をして、ゲノム組み込みのための選択マーカーを与えた。これは、それらのより小さく、安定な植物および植物細胞培養形質転換に使用するための、より有用なバイナリーベクターを潜在的に可能にする。N.benthamiana葉片を形質転換するために使用する場合、T−DNA内にNPTIIカセットを含むpEAQベクターは、pBINPLUSベースの構築物と同じ効率を有する選択下でカルス形成を誘導できた。さらに、GFP発現は、UV光下でこれらの組織において検出可能であった(データは示さず)。これは、pEAQベクター由来のマルチカセットT−DNA分子が、植物ゲノム内に安定して組み込み、外来性遺伝子の発現を駆動することができることを実証する。
バキュロウイルスベクターを用いるCPMVベースのHT系の使用
図15は、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを用いるCPMVベースのHT系を利用するのに適切な構築物を示す。p10プロモーターの制御下で、HyperTrans CPMV RNA−2 UTRもまた、バキュロウイルス発現系を用いる昆虫細胞におけるGFPの発現を向上させる。フローサイトメトリーによって測定される場合、バキュロウイルス感染sf21細胞の蛍光レベルの約5倍の向上を、CPMV−HTカセットを有さない構築物と比較して得た。
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Claims (29)
- 2分節RNAウイルスのRNA−2ゲノムセグメント由来の発現エンハンサー配列であって、前記RNA−2ゲノムセグメントの標的開始部位が変異される、発現エンハンサー配列。
- 前記2分節RNAウイルスがコモウイルスである、請求項1に記載の発現エンハンサー配列。
- 前記コモウイルスがササゲモザイクウイルスである、請求項2に記載の発現エンハンサー配列。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の発現エンハンサー配列から構成されるか、またはそれらから実質的に構成される、単離された核酸。
- 2分節ウイルスのRNA−2ゲノムセグメント由来の配列の発現または翻訳を増強する活性を増加させるためのプロセスであって、前記配列内の標的開始部位を変異させることを含む、プロセス。
- 前記2分節RNAウイルスがコモウイルスである、請求項5に記載のプロセス。
- 前記コモウイルスがササゲモザイクウイルスである、請求項6に記載のプロセス。
- (a)請求項1〜3のいずれか1項に記載のエンハンサー配列と、
(b)目的のタンパク質をコードする遺伝子の、遺伝子発現系への挿入を促進するための異種配列であって、前記エンハンサー配列内の変異された標的開始部位の下流に位置する異種配列と、必要に応じて、
(c)3’UTRと、
を含む、遺伝子発現構築物。 - (i)作動可能に連結されるプロモーターと、
(ii)請求項1〜3のいずれか1項に記載のエンハンサー配列と、
(iii)発現することが所望される目的の遺伝子と、
(iv)終結配列と、必要に応じて、
(v)前記終結配列の上流に位置する3’UTRと、
を含む、発現カセット。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のエンハンサー配列を含む、遺伝子発現系。
- 目的のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、前記エンハンサー配列の下流に位置する、請求項10に記載の遺伝子発現系。
- 前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、請求項11に記載の遺伝子発現系。
- 前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、前記エンハンサー配列の下流で、かつ、前記終結配列の上流に位置する、請求項12に記載の遺伝子発現系。
- 3’UTRを含むか、またはさらに含み、前記3’UTRは必要に応じて、同じ2分節RNAウイルス由来である、請求項8〜13のいずれか1項に記載の遺伝子発現系。
- 請求項8または9に記載の発現構築物または発現カセットを含む、遺伝子発現系。
- 請求項10〜15のいずれか1項に記載の遺伝子発現系を用いて、宿主生物内で目的のタンパク質を発現させるための方法。
- 前記宿主生物は真核性宿主であり、前記真核性宿主は必要に応じて植物または昆虫である、請求項16に記載の方法。
- RNA2由来の配列に作動可能に連結される、目的の異種タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレーム(ORF)から前記目的の異種タンパク質の翻訳を増強する方法であって、前記RNA2由来の配列内の標的開始部位を変異させることを含む、方法。
- (a)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された目的の異種タンパク質をコードする少なくとも1つの外来性遺伝子を保有する2分節ウイルスゲノムの切断されたRNA−2を含む第1の遺伝子構築物であって、前記遺伝子構築物は前記外来性遺伝子の上流に変異された標的開始部位を含む、第1の遺伝子構築物と、必要に応じて、
(b)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、前記第1の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第2の遺伝子構築物と、
を含む、遺伝子発現系。 - 以下の工程:
(a)プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された目的の異種タンパク質をコードする少なくとも1つの外来性遺伝子を保有する2分節ウイルスゲノムの切断されたRNA−2を含む第1の遺伝子構築物を含む遺伝子発現構築物を導入する工程であって、前記遺伝子構築物は、植物細胞内の前記外来性遺伝子の上流に変異された標的開始部位を含む工程と、必要に応じて、
(b)前記植物細胞内のプロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、前記第1の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第2の遺伝子構築物を導入する工程と、
を含む、植物においてタンパク質を発現させる方法。 - 前記遺伝子発現系を前記宿主生物内に導入する工程を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、向上したレベルで発現される、請求項20または21に記載の方法によって得たか、または得られる宿主生物。
- 請求項10〜15および19のいずれか1項に記載の遺伝子発現系で一過性にトランスフェクトされる宿主生物。
- 前記宿主生物は植物または植物細胞である、請求項22または23に記載の宿主生物。
- 請求項10〜15および19のいずれか1項に記載の遺伝子発現系で安定に形質転換されたトランスジェニック宿主生物。
- 請求項22〜24のいずれか1項に記載の宿主生物を使用することと、必要に応じて、前記目的のタンパク質が発現される組織を収集することと、前記組織から前記目的のタンパク質を単離することと、を含む、目的のタンパク質を産生するための方法。
- (a)プロモーターと、
(b)表1に示されるササゲモザイクウイルスRNA−2ゲノムセグメント配列のヌクレオチド1〜507であって、161位のAUGは表2に示されるように変異され、前記プロモーターの下流に位置する、ヌクレオチド1〜507と、
(c)(b)に規定される配列の下流に位置する目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
(d)前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置する、表1に示されるササゲモザイクウイルスRNA−2ゲノムセグメント配列のヌクレオチド3302〜3481と、
(e)(d)に規定される配列の下流に位置するノパリン合成ターミネーターと、
を含む遺伝子発現系。 - 前記遺伝子発現系は、
(a)プロモーターと、
(b)表1に示されるササゲモザイクウイルスRNA−2ゲノムセグメント配列のヌクレオチド1〜507と少なくとも70%の同一性を有する発現エンハンサー配列であって、161位のAUGは変異され、前記プロモーターの下流に位置する、発現エンハンサー配列と、
(c)(b)に規定された配列の下流に位置する目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
(d)表1に示され、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置する、ササゲモザイクウイルスRNA−2ゲノムセグメント配列のヌクレオチド3302〜3481と、
(e)(d)に規定される配列の下流に位置するノパリン合成ターミネーターと、
を含む、請求項27に記載の遺伝子発現系の変異体。 - 請求項27または28に記載の遺伝子発現系を用いて、植物において目的のタンパク質を発現させる方法。
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