JP2017501738A - Ｃｐｍｖエンハンサーエレメント - Google Patents

Ｃｐｍｖエンハンサーエレメント Download PDF

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Abstract

ＸヌクレオチドからなるＣＰＭＶ ５’ＵＴＲヌクレオチド配列（ＣＭＰＶＸ）であって、Ｘ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である配列を含む、またはＣＭＰＶＸと約８０％から１００％の配列類似性を含むヌクレオチド配列であって、Ｘ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４配列番号：１である配列からなる、発現エンハンサーを提供する。発現エンハンサーは、５’ＵＴＲヌクレオチド配列の３’末端に融合されるスタッファー配列をさらに含んでもよい（ＣＭＰＶＸ＋、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４である）。スタッファー配列は１つ以上の植物コザック配列を含んでもよい。発現エンハンサーおよび発現エンハンサーを用いる方法を含む植物もまた記載される。

Description

本発明は、植物における目的のタンパク質の発現に関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。
植物は、組換えタンパク質のための生産系として大きな可能性を提供する。植物において外来タンパク質を生産することへの１つのやり方は、安定なトランスジェニック植物系統を生成することである。しかしながら、これは時間がかかり、および労働集約的な工程である。トランスジェニック植物の代替は、植物ウイルス−ベースの発現ベクターの使用である。植物ウイルス−ベースのベクターは、植物における急速で、高レベルな一過性のタンパク質の発現を可能にする。
植物における、高レベルで、一過性の外来タンパク質の発現を達成する１つの方法は、ササゲモザイクウイルス（Ｃｏｗｐｅａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＣＰＭＶ；例えば、ＷＯ２００７／１３５４８０； ＷＯ２００９／０８７３９１； ＵＳ ２０１０／０２８７６７０， Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ； １４８： １２１−１２１８； Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ； ６： ８２−９２； Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ； ７： ６８２−６９３； Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ． ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｐｌａｎｔｓ， ｖｏｌ． ４８３： ２５−３９を参照されたい）などのコモウイルスを含む、ＲＮＡ植物ウイルスに基づくベクターの使用を伴う。
コモウイルスは、二分節ゲノムを有するＲＮＡウイルスである。コモウイルスのＲＮＡゲノムのセグメントは、ＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と称される。ＲＮＡ−１は、ＶＰｇ、複製酵素（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）およびプロテアーゼタンパク質をコードする。ウイルスは、ウイルスのゲノムの複製のために当該複製酵素を必要とする。コモウイルス、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）のＲＮＡ−２は、４つの機能性ペプチドにプロセシングされる１０５ｋＤａまたは９５ｋＤａのポリプロテインを生産する。
ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２の５’領域は、１１５、１６１、５１２および５２４位に開始コドン（ＡＵＧ）を含む。１６１および５１２位の開始コドンは、同一のトリプレットリーディングフレームにある。１６１位の開始コドンでの開始は、１０５Ｋポリプロテインの合成を生じる一方で、５１２位の開始コドンでの開始は、９５Ｋポリプロテインの合成を指示する。ＣＰＭＶにおける５１２位の開始コドンでの翻訳の開始は、１６１位の開始より、より効率的であり、その結果、１０５Ｋポリプロテインより多くの９５Ｋポリプロテインの生産がもたらされる。１１５位の開始コドンは、ウイルス複製にとって必須ではない（Ｗｅｌｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ． ７５（８）：７４１−７）。
ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２における１６１および５１２位の開始部位間のフレームの維持は、ＲＮＡ−１にコードされる複製酵素によるＲＮＡ−２の効率的な複製に必要とされる（Ｈｏｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２， ３１１− ３２０； ｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９５， ３７７−３８６； Ｒｏｈｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３， ６７２−６７９； Ｗｅｌｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ． ７５（８）：７４１−７）。この要件は、ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２発現ベクターの複製型における５１２開始コドンの上流に挿入されうる配列の長さに影響する。さらに、ポリリンカーの使用は、それらがこれらの開始部位間のコドンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をずらしうるので、慎重に使用されるべきである。
ＣＰＭＶは、植物における異種ポリペプチドの生産に適切なベクター系の開発のための基礎として役立っている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｖａｃｃｉｎｅ ２３， １７８８−１７９２； Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｈｅｆｆｅｒｏｎ， Ｋ． ｅｄ）， ｐｐ． ３３９−５５５）。これらの系は、ＲＮＡ−２の改変に基づくが、完全長型または欠失型が用いられるかどうかという点で異なる。改変ＲＮＡ−２の複製は、ＲＮＡ−１との共接種により達成される。外来タンパク質は、ＲＮＡ−２由来のポリプロテインのＣ−末端に融合される。Ｎ−末端ポリペプチドの解放は、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ触媒ペプチド配列の作用により媒介される（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６７： １５９−１７３）。得られるＲＮＡ−２分子は、植物内および植物間の両方に拡散することができる。この戦略は、ササゲ（ｃｏｗｐｅａ）植物において、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）および小免疫タンパク質（ＳＩＰｓ）などの多くの組換えタンパク質を発現するために使用されてきた（Ｍｅｃｈｔｃｈｅｒｉａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３１， １０−１５； ２００６； Ｍｏｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． ４， ６２３−６３１； Ａｌａｍｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． １， １１０３−１１１１）。成功にもかかわらず、完全長のウイルスベクターの使用は挿入される配列のサイズを制限し、かつ植物間の移動はウイルスの生物学的封じ込めについて懸念される。
生物学的封じ込め、および挿入サイズの問題に対処するために、Ｃａｎｉｚａｒｅｓらは、ＲＮＡ−２のコーディング領域の大部分を目的の配列に置換し、ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２の無効なバージョン（ｄｅＩＲＮＡ−２）を生産した（２００６ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， Ｊ ４：１８３−１９３）。ＲＮＡ−２の５１２位のＡＵＧ、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のすぐ上流に、発現される配列を融合し、ＲＮＡ−２を模倣する分子を作製した。かかる構築物は、ＲＮＡ−１およびサイレンシングサプレッサーの存在下で植物へ導入された際に複製でき、かつ実質的なレベルの異種タンパク質の合成を指示した（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２００８ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ６：８２−９２）。
ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２ベクターにおける１６１位の開始コドンの変異（Ｕ１６２Ｃ；ＨＴ）は、５１２位の開始コドンの後に挿入される配列によりコードされるタンパク質の発現レベルを増加させる。これはウイルス複製を必要としない外来タンパク質の高レベルの生産を可能にし、かつＣＰＭＶ−ＨＴ系と命名された（ＷＯ２００９／０８７３９１； Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ， ２００８， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８， １２１２−１２１８）。ｐＥＡＱ発現プラスミドにおいて（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ７， ｐｐ ６８２−６９３； ＵＳ ２０１０／０２８７６７０）、発現される配列は、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ間に位置している。ｐＥＡＱシリーズにおける５’ＵＴＲは、Ｕ１６２Ｃ（ＨＴ）変異を保有する。
本発明は、植物における目的のタンパク質の発現に関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。
本明細書に記載されるように、ＸヌクレオチドからなるＣＰＭＶ ５’ＵＴＲヌクレオチド配列（ＣＭＰＶＸ）であって、Ｘ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である配列を含む、またはＣＭＰＶＸと約８０％から１００％の配列類似性を含むヌクレオチド配列であって、Ｘ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４である配列からなる、発現エンハンサーが提供される。発現エンハンサーは、配列番号：２４、２７、６８、６９、７０および７１の群から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明はまた、上記で定義されるような発現エンハンサーであって、ここで発現エンハンサーがスタッファー配列（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、１１４である）をさらに含む、発現エンハンサーを提供する。スタッファー配列は、０から約１００ヌクレオチドの長さ、もしくはそれらの間の任意の長さ、１つ以上の植物コザック配列、マルチプルクローニングサイト、１つ以上のリンカー配列、１つ以上の組換え部位、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。本発明はまた、上記で定義されるような発現エンハンサーであって、コザック配列が配列番号：５−１７に示される配列の群から選択される、発現エンハンサーを提供する。既に定義した発現エンハンサー（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４である）は、配列番号：２、７２、７３、７４、７５、７６および７７の群から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
目的のヌクレオチド配列と作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結される、上記で定義されるような発現エンハンサーＣＰＭＶＸ、ＣＰＭＶＸ＋と作動可能に連結される制御領域を含む核酸配列を含む植物発現系もまた提供される。植物発現系は、コモウイルス３’ＵＴＲをさらに含んでもよい。植物発現系は、サイレンシングのサプレッサー、例えばＨｃＰｒｏまたはｐ１９をコードする第二の核酸配列をさらに含んでもよい。
上記で定義されるような植物発現系の目的のヌクレオチド配列は、ウイルスタンパク質または抗体をコードしてもよい。例えば、ウイルスタンパク質は、インフルエンザヘマグルチニンであってもよく、かつＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、およびインフルエンザＢ型ヘマグルチニンの群から選択されてもよい。ウイルスタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列は、天然シグナルペプチド配列、または非−天然シグナルペプチドを含んでもよく、例えば非−天然シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）から得られてもよい。
本明細書に記載されるように、植物または植物の部分に、上記で定義されるようなＣＰＭＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋を含む植物発現系を導入すること、および目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で、植物もしくは植物の部分をインキュベートすることを含む、植物または植物の部分において目的のタンパク質を生産する方法が提供される。
本発明はまた、上記に記載されるような植物発現系を用いて一過性に遺伝子導入されている、または安定的に形質転換されている、植物もしくは植物の部分を提供する。
本明細書に記載される植物−ベースの発現系は、本明細書で定義されるＣＰＭＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋のいずれかの発現エンハンサーに作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の発現の増加、または増強をもたらす。発現の増加は、不完全なＭタンパク質を含む従来技術のエンハンサー配列（ＣＰＭＶ ＨＴ）に作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードする同一のヌクレオチド配列の発現レベルと、ＣＰＭＶＸベースの、またはＣＰＭＶＸ＋ベースの発現エンハンサーを用いて得られる発現レベルを比較することによって決定されてもよい（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．， ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．， ２００８， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８： ｐｐ． １２１２−１２１８に記載される；出典明示により本明細書に組み込まれる）。従来技術のＣＰＭＶ ＨＴ配列の例は、配列番号：４で提供される。
本明細書に記載される植物ベースの発現系はまた、例えば、遺伝子または目的のヌクレオチド配列にとって便利なクローニング部位を含有するなどの多くの特性を有してもよく、費用効果がある方法で植物に容易に感染してもよく、接種される植物の効率的な局所感染または全身感染を引き起こしてもよい。さらに、当該感染は、有用なタンパク質物質の良好な収率を提供するだろう。
この発明の概要は、必ずしも発明の全ての特徴を記載するものではない。
本発明のこれらの、および他の特徴は、添付した図面による参照における以下の記載からより明らかとなるだろう：
図１Ａは、本明細書に記載される、いくつかのエンハンサー配列、ＣＰＭＶＸ、およびＣＰＭＶＸ＋（ＣＰＭＶＸ、およびこの非限定例において、マルチプルクローニングサイトおよび植物コザック配列を含むスタッファーフラグメントを含む）の例の一般的な概略図を示す。ＣＰＭＣＸおよびＣＰＭＶＸ＋を、それらの５’末端で植物制御領域、ならびにそれらの３’末端で順番に、目的のヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始部位およびストップ部位を含む）、３’ＵＴＲ、およびターミネーター配列に作動可能に連結されるようそれぞれ示す。本明細書に記載される構築物ＣＰＭＶＸの例は、ＣＰＭＶ１６０である。本明細書に記載される構築物ＣＰＭＶＸ＋の例は、ＣＰＭＶ１６０＋である。図１Ｂは、５’末端で植物制御領域（これら非限定例２Ｘ３５Ｓにおける）、および３’末端で、目的のヌクレオチド配列、またはＡＴＧ開始部位に隣接する植物コザック配列を含む「ＧＯＩ」（角括弧内で示されるエレメントは文脈に含まれ、かつそれらはＣＰＭＶＸもしくはＣＰＭＶＸ＋エンハンサー配列の一部ではない）に作動可能に連結される、本明細書に記載されるエンハンサー配列を含む構築物のいくつかのバリアントの例を示す（ＣＰＭＶ１６０、配列番号：１で提供される全配列；ＣＰＭＶ１５５、配列番号：２４で提供される全配列；ＣＰＭＶ１５０、配列番号：２７で提供される全配列；およびＣＰＭＶ１１４、配列番号：６８で提供される全配列）。図１Ｃは、５’末端で植物制御領域（これら非限定例２Ｘ３５Ｓにおける）、および３’末端で、スタッファーフラグメント（これらの非限定例において、マルチプルクローニングサイトおよび植物コザック配列を含む）、目的のヌクレオチド配列、ＡＴＧ開始部位を含む「ＧＯＩ」（角括弧内で示されるエレメントは文脈に含まれ、かつそれらはＣＰＭＶＸもしくはＣＰＭＶＸ＋エンハンサー配列の一部ではない）に作動可能に連結される、本明細書に記載されるエンハンサー配列を含む構築物のいくつかのバリアントの例を示す（ＣＰＭＶ１６０＋、配列番号：２で提供される全配列；ＣＰＭＶ１５５＋、配列番号：７２で提供される全配列；ＣＰＭＶ１５０＋、配列番号：７３で提供される全配列；およびＣＰＭＶ１１４＋、配列番号：７４で提供される全配列）。
図２は、目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結される、ＣＰＭＶ−ＨＴ（従来技術）発現構築物、およびＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の粗タンパク質抽出物における相対血液凝集力価（ＨＭＧ）を示す。ＰＤＩシグナルペプチドを有するＨ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（ＰＤＩ−Ｈ１ Ｃａｌ；構築物番号４８４ ５’ＵＴＲ：ＣＰＭＶ ＨＴ；および構築物番号１８９７、５’ＵＴＲ：ＣＰＭＶ１６０＋；実施例５を参照されたい）、ＰＤＩシグナルペプチドを有するＨ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（ＰＤＩ−Ｈ３ Ｖｉｃ；構築物番号１３９１、５’ＵＴＲ：ＣＰＭＶ ＨＴ；および構築物番号１８００、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；それぞれ実施例１および２を参照されたい）、天然シグナルペプチドを有するインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（ＷｔＳｐ−Ｈ５ Ｉｎｄｏ；構築物番号４８９、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１８８０、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例６を参照されたい）、ならびに欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有する、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（ＷｔＳｐ−Ｂ Ｗｉｓ−ＰｒＬ；構築物番号１４４５、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１９７５、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋、実施例１３を参照されたい）由来の、ＨＡの発現のデータが示される。ＰＤＩ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ。
図３は、ＣＰＭＶ−ＨＴ（従来技術）発現構築物、およびＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の粗タンパク質抽出物における相対血液凝集力価（ＨＭＧ）を示す。ＰＤＩシグナルペプチドを有するＨ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（構築物番号４８４、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１８９７ ５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋、実施例５を参照されたい）、ＰＤＩシグナルペプチドを有するＨ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（構築物番号１３９１、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１８００ ５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋、それぞれ実施例１および２を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（構築物番号１０３９ ５’ＵＴＲ ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１９３７、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例９を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号１０６７、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１９７７、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例１０を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２ ２０１２（構築物番号２０７２、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号２０５０、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例１１を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号２０７４、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号２０６０、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例１２を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（構築物番号１４４５、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１９７５、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例１３を参照されたい）、ならびに欠失タンパク質分解ループを有し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号１４５４、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１８９３、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例１４を参照されたい）由来の、ＨＡの発現データが示される。
図４Ａは、試験される植物コザック配列のバリアントの例を示す。ＣＰＭＶＸ＋、植物制御領域、スタッファーフラグメント、および目的のヌクレオチド配列（ＧＯＩ）の部分的な配列を示す構築物。この非限定例において、当該構築物は、２Ｘ３５Ｓ制御領域、ＣＰＭＶ１６０＋、マルチプルクローニングサイトおよび植物コザック配列を含むスタッファーフラグメントを含む（目的のヌクレオチド配列の５’末端はまた：「ＡＴＧ…ＧＯＩ」と示され；ここでＧＯＩは、Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１である）。植物コザック配列のバリアントはまた、配列の下にも示される（図９も参照されたい）。それぞれのバリアント植物コザック配列は、スタッファーフラグメントの３’末端、および目的のヌクレオチド配列（これらの非限定例において、Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１）の５’−ＡＴＧ部位に融合された。構築物の他のエレメントは同じままだった）。図４Ｂは、示されるようなＣＭＰＶ１６０＋発現構築物およびバリアント植物コザック配列を含む植物において生産される目的のヌクレオチド配列のＨＡ力価を示す。
図５は、ＣＰＭＶ−ＨＴ（構築物番号５００１および５００２、実施例１５および１６を参照されたい）もしくはＣＰＭＶ１６０（構築物番号２１００および２１０９、実施例１５および１６を参照されたい）の制御下の、それらの天然シグナルペプチドもしくはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）のシグナルペプチドで置換された天然シグナルペプチドのいずれかを有する、抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）の発現を示す。
図６は、構築物番号１３９１（Ａ‐２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ‐ＨＴ ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例１を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１３９１は、従来技術ＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に異種のコザック配列を含まない。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図６Ａは、プライマー配列ＩＦ−ＰＤＩ．Ｓ１＝３ｃ（配列番号：６７）を示す。図６Ｂは、プライマー配列ＩＦ‐Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１‐４ｒ（配列番号：１７）を示す。図６Ｃは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａの配列（配列番号：１８）を示す。図６Ｄは、構築物１１９１の概略図を示す。図６Ｅは、構築物１１９１を示し；左から右に、ｔ‐ＤＮＡボーダー（下線）、プラストシアニン‐Ｐ１９‐プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ‐ＨＴ ＮＯＳ（配列番号：１９）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１３９１を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線が引かれ；ＣＰＭＶ ５’ＵＴＲは太字で示され；不完全なＭ−タンパク質（配列番号：２０）はイタリックである。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａのアミノ酸配列を示す（配列番号：２１）。図６Ｈは、構築物番号１３９１（参照構築物）の概略図を示す。
図７は、構築物番号１８００（Ａ‐２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例２を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図７Ａは、プライマー配列ＩＦ＊＊（ＳａｃＩＩ）−ＰＤＩ．ｓ１＋４ｃ（配列番号：２２）を示す。図７Ｂは、プライマー配列ＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号：２３）を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａの配列は、図６Ｃに示される（配列番号：１８）。図７Ｃは、構築物２１７１の概略図を示す（プラスミド線状化のために使用されるＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位が示されている）。図７Ｄは、構築物２１７１（配列番号：２５）を示し、左から右に、ｔ−ＤＮＡボーダー（下線）、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセット、Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ膜貫通細胞質側末端、およびＣＰＭＶ３’ＵＴＲを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ。図７Ｅは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターの発現カセット番号１８００を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線が引かれ；５’ＵＴＲは太字で示され；植物コザック配列に二重下線が引かれ；１６塩基対のスタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）は、５’ＵＴＲおよび植物コザック配列間に位置する（配列番号：２６）。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａのアミノ酸配列は、図６Ｇに示される（配列番号：２７）。図７Ｆは、構築物番号１８００（ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図８は、構築物番号１９３５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ；実施例３を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１９３５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、かつスタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、もしくは植物コザック配列を含まず（この構築物はまた、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０（ＣＰＭＶＸ、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図８Ａは、プライマー配列ＩＦ−ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号：２８）を示す。図８Ｂは、構築物１１９０の概略図を示す。図８Ｃは、構築物１１９０の核酸配列を示し、左から右に、ｔ−ＤＮＡボーダー（下線）、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセットおよびＣＰＭＶ３’ＵＴＲを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０／ＮＯＳの（配列番号：２９）。図８Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターの発現カセット番号１９３５を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線が引かれ、５’ＵＴＲは太字で示される（配列番号：３０）。このカセットは、植物コザック配列またはスタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）を含まない。図８Ｅは、構築物番号１９３５（ＣＰＭＶＸベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図９は、「ＣＰＭＶ１６０＋」ベースの構築物（構築物番号１９９２−１９９９）の選択を調製するために使用される植物コザック配列におけるバリエーションを含む配列を示す。植物コザック配列におけるバリエーションを含む、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系におけるＳａｃＩＩ制限酵素部位とＰＤＩＳＰ／Ｈ３ ＶｉｃｔｏｒｉａのＡＴＧとの間の配列のバリエーションが示される（構築物１８００由来の対応する配列からのバリエーションとして、配列が示される；実施例４を参照されたい）。バリアント植物コザック配列に下線が引かれる。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。図９Ａは、ＩＦ−ＨＴ１＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３１；構築物番号１９９２を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｂは、ＩＦ−ＨＴ２＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３２；構築物番号１９９３を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｃは、ＩＦ−ＨＴ３＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３３；構築物番号１９９４を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｄは、ＩＦ−ＨＴ４＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３４；構築物番号１９９５を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｅは、ＩＦ−ＨＴ５＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３５；構築物番号１９９６を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｆは、ＩＦ−ＨＴ６＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３６構築物番号１９９７を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｇは、ＩＦ−ＨＴ７＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３７；構築物番号１９９８を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｈは、ＩＦ−ＨＴ８＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（配列番号：３８；構築物番号１９９９を調製するために使用される）のヌクレオチド配列を示す。図９Ｉは、配列番号：３１（図９Ａ）を用いる、植物コザック配列（コザック１）を含む構築物番号１９９２の概略図を示す。それぞれの構築物（１９９３−１９９９）が、それぞれ図９Ｂから９Ｈ（配列番号：３２−３８）に示される改変植物コザック配列（コザック１）を含むことを除き、構築物１９９３−１９９９は、構築物１９９２と同一の特徴を含む。
図１０は、構築物番号４８４および１８９７（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＮＯＳ；実施例５を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号４８４は、従来技術ＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８９７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を、含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１０Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのヌクレオチド配列（配列番号：３９）を示す。図１０Ｂは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。図１０Ｃは、構築物番号４８４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１０Ｄは、構築物番号１８９７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１１は、構築物番号４８９、１８８０および１８８５（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＯＳ；ＣＰＭＶ１６０＋ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＯＳ、およびＣＰＭＶ１６０ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＯＳ；実施例６を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号４８９は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８８０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１８８５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物はまた、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０（ＣＰＭＶＸ、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１１Ａは、天然Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示す。図１１Ｂは、天然Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。図１１Ｃは、構築物番号４８９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１１Ｄは、構築物番号１８８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。図１１Ｅは、構築物番号１８８５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０、ＣＰＭＶＸベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１２は、構築物番号１２４０および２１６８（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＮＯＳ；実施例７を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１２４０は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８９７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１２Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのヌクレオチド配列（配列番号：４３）を示す。図１２Ｂは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのアミノ酸配列（配列番号：４４）を示す。図１２Ｃは、構築物番号２１４０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１２Ｄは、構築物番号２１６８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１３は、構築物番号２１３０および２１８８（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例８を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２１３０は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８９７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１３Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：４５）を示す。図１３Ｂは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す。図１３Ｃは、構築物番号２１３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１３Ｄは、構築物番号２１８８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１４は、構築物番号１０３９および１９３７（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−） ＮＯＳ；実施例９を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１０３９は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１９３７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ。図１４Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号：４７）を示す。図１４Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。図１４Ｃは、構築物番号１０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１４Ｄは、構築物番号１９３７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１５は、構築物番号１０６７および１９７７（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例１０を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１０６７は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１９７７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１５Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示す。図１５Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。図１５Ｃは、構築物番号１０６７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１５Ｄは、構築物番号１９７７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１６は、構築物番号２０７２および２０５０（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−） ＮＯＳ；実施例１１を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２０７２は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２０５０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ。図１６Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号：５１）を示す。図１６Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。図１６Ｃは、構築物番号２０７２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１６Ｄは、構築物番号２０５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１７は、構築物番号２０７４および２０６０（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例１２を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２０７４は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２０６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１７Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：５３）を示す。図１７Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：５４）を示す。図１７Ｃは、構築物番号２０７４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１７Ｄは、構築物番号２０６０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１８は、構築物番号１４４５、１８２０および１９７５（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−） ＮＯＳ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−） ＮＯＳ；実施例１３を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１４４５は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１９７５は１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、かつスタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、もしくは植物コザック配列を含まず（この構築物はまた、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつ「ＣＰＭＶ１６０」（ＣＰＭＶＸ）ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１８Ａは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号：５５）を示す。図１８Ｂは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号：５６）を示す。図１８Ｃは、構築物番号１４４５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１８Ｄは、構築物番号１８２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物）の概略図を示す。図１８Ｅは、構築物番号１９７５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０；ＣＰＭＶＸベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図１９は、構築物番号１４５４および１８９３（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例１４を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１４５４は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８９３は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１９Ａは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：５７）を示す。図１９Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：５８）を示す。図１９Ｃは、構築物番号１４５４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１９Ｄは、構築物番号１８９３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図２０は、構築物番号５００１および２１００（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳ；実施例１５を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号５００１は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ））との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２１００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＨＣ：重鎖；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図２０Ａは、ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：５９）のヌクレオチド配列を示す。図２０Ｂは、ＨＣ リツキシマブのアミノ酸配列を示す（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６０）。図２０Ｃは、構築物番号５００１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図２０Ｄは、構築物番号２１００（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図２１は、構築物番号５００２および２１０９（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳ；実施例１６を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号５００１は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＣ Ｒｉｔｕｚａｎ）との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２１００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＨＣ：重鎖；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図２１Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６１）のヌクレオチド配列を示す。図２１Ｂは、ＰＳＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６２）のアミノ酸配列を示す。図２１Ｃは、構築物番号５００２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図２１Ｄは、構築物番号２１０９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図２２は、構築物番号５０２１および２１２０（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳ；実施例１７を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号５０２１は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ））との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２１２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＬＣ：軽鎖；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図２２Ａは、ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６３）のヌクレオチド配列を示す。図２２Ｂは、ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６４）のアミノ酸配列を示す。図２２Ｃは、構築物番号５０２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図２２Ｄは、構築物番号２１２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
図２３は、構築物番号５０２２および２１２９（それぞれ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ ＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ） ＮＯＳ；実施例１８を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号５００１は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ））との間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２１００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイト）、および植物コザック配列を含み（この構築物は、不完全なＭタンパク質をコードする配列を含まない）、かつＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＨＣ：重鎖；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図２３Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブのヌクレオチド配列（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６５）を示す。図２３Ｂは、ＰＳＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブのアミノ酸配列（Ｒｉｔｕｘａｎ；配列番号：６６）を示す。図２３Ｃは、構築物番号５０２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図２３Ｄは、構築物番号２１２９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここでＸ＝１６０）の概略図を示す。
詳細な説明
本発明は、植物における目的のタンパク質の発現に関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。
以下の記載において、多くの用語は広く使用され、以下の定義は発明の種々の態様の理解を容易にするために提供される。用語の例を含む、本明細書における例の使用は、例示的な目的のみのためであり、かつ本明細書の発明の実施形態の範囲および意味を限定することを企図するものではない。
本明細書で使用されるように、用語「を含む」と併せて本明細書で使用される際に、単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味してもよいが、それらはまた、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１より大きい」の意味と一致する。用語「約」は、指定される値からおよそ＋／−１０％のバリエーションを指す。用語「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」は、１より大きいこと、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上等を意味する。
本発明は、配列番号：１のＸヌクレオチド（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である）を含むＣＰＭＶ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、「ＣＰＭＶＸ」、またはＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である）と８０％から１００％の間の配列類似性を含む配列、を含む、発現エンハンサーを提供する。この発現エンハンサーは、一般的にＣＰＭＶＸと称される（図１Ａを参照されたい）。
ＣＰＭＶＸエンハンサー配列は、さらにスタッファー配列に融合されていてもよく、ここでＣＭＰＶＸは、配列番号：１のＸヌクレオチド（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である）、またはＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４）と８０から１００％の間の配列類似性を含む配列を含み、かつスタッファー配列は、ＣＭＰＶＸ配列の３’末端に融合される１−１００ヌクレオチドを含む。例えば、スタッファー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ヌクレオチド、またはそれらの間のヌクレオチドの任意の数を含んでもよい。
もしＣＭＰＶＸ配列がスタッファーフラグメントを含むならば、この発現エンハンサーはＣＰＭＶＸ＋と称されてもよく（図１Ａを参照されたい）、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、１１４であり、それぞれＸ−１６０、１５５、１５０、または１１４の場合に、それらはまたスタッファー配列を含むＣＭＰＶＸと称されてもよく、あるいはそれらはＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶ１５５＋；ＣＰＭＶ１５０＋；ＣＰＭＶ１１４＋と称されてもよい。スタッファー配列を含まないＣＰＭＶＸを含む構築物は、ＣＰＭＶＸ＋と称されてもよく、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、１１４であり、かつスタッファー配列は０ヌクレオチド長である。
ヌクレオチド１６０に対して３’に位置するスタッファー配列を、天然ＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ配列のトランケーション、欠失、または置換により改変してもよい。５’ＵＴＲに関連する最初のまたは未改変（すなわち天然）のスタッファー配列と比較して、改変スタッファー配列を除去し、置換し、トランケートし、または短縮してもよい（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．， ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．， ２００８， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８： ｐｐ． １２１２−１２１８に記載されるように）。スタッファー配列は、１つ以上の制限酵素部位（ポリリンカー、マルチプルクローニングサイト、１つ以上のクローニング部位）、１つ以上の植物コザック配列、１つ以上のリンカー配列、１つ以上の組換え部位、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、限定と考えられるものではないが、スタッファー配列は、植物コザック配列に融合される所望の長さのマルチプルクローニングサイトを順番に含んでもよい。スタッファー配列は、天然ＣＰＭＶ ５’ＵＴＲのヌクレオチド１６０に対して３’に位置する、天然５’ＵＴＲ配列由来のヌクレオチド配列、例えばＳａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．（２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８；出典明示により本明細書に組み込まれる）の図１に示されるヌクレオチド１６１−５１２、または配列番号：４のヌクレオチド１６１−５０９を含まない。すなわち、従来技術のＣＰＭＶ ＨＴ配列にある不完全なＭタンパク質（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．，２００８の図１）は、本発明において５’ＵＴＲから除去されている。
植物宿主内の目的のヌクレオチド配列の発現を駆動するために、発現エンハンサーＣＰＭＶＸ、またはＣＰＭＶＸ＋を、植物において活性な制御領域とエンハンサー配列の５’末端で作動可能に連結してもよく、かつ発現エンハンサーの３’末端で目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい（図１Ａ）。
ＣＭＰＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋のいずれかを用いる、植物において１つ以上の目的のタンパク質を生産するための発現系もまた、提供される。本明細書に記載の発現系は、ＣＰＭＶＸ、もしくはＣＰＭＶＸと８０％の配列類似性を含む配列、ならびに任意に、ＣＭＰＶＸ（ＣＰＭＶＸ＋）に融合されるスタッファー配列を含む、発現カセットを含む。ＣＭＰＶＸまたはＣＭＰＶＸ＋を含む発現カセットは、発現エンハンサーの５’末端に作動可能に連結される、植物において活性である制御領域をさらに含んでもよい。目的のヌクレオチド配列は発現カセットの３’末端に作動可能に連結してもよく、その結果、植物内に導入される時に植物宿主内の目的のヌクレオチド配列の発現を達成する。
目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列、本明細書に記載されるＣＰＭＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋を含む、発現カセットもしくは発現系を含む、植物細胞、植物組織、植物全体、接種源（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）、核酸、構築物、ならびに植物において目的のタンパク質を発現する方法もまた提供される。
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを参照すると、配列番号：１のＸ由来のヌクレオチド（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である）を含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ（ＣＰＭＶＸ）配列を含む、発現エンハンサーの非限定例が提供される。発現エンハンサーＣＭＰＶＸはまた、それぞれＸ−１６０、１５５、１５０、または１１４の場合に、ＣＰＭＶ１６０；ＣＰＭＶ１５５；ＣＰＭＶ１５０；ＣＰＭＶ１１４、と称されてもよい。
目的のヌクレオチド配列は、様々なやり方を用いて、植物制御領域を含むエンハンサー配列に融合（作動可能に連結）されてもよい。例えば、限定と考えられるべきではないが：
１）目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲ配列、例えばＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝配列番号：１のヌクレオチド１６０、１５５、１５０、１１４である）のすぐ後の発現エンハンサーの３’末端に融合されてもよい。この例では、目的のヌクレオチド配列は、マルチプルクローニングサイトを有しない５’ＵＴＲに融合され、かつ目的のヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列のＡＴＧ開始部位のすぐ上流の５’末端で植物コザック配列を含んでもよい（図１Ｂを参照されたい）。配列番号：１のヌクレオチド１５０−１６０、または１５５−１６０はコザック様配列を含むので、もしＸ＝１６０（すなわちＣＰＭＶ１６０）ならば、ＣＰＭＶ１６０に作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列は、その５’末端に融合される植物コザック配列を必要としなくてもよい。しかしながら、所望であればＣＰＭＶ１６０を含む構築物において、植物コザック配列は含まれてもよい（図１Ｂを参照されたい：「＋／−植物コザック」）。もしＸ−１５５、１５０、または１１４ならば、ＣＰＭＶ１５５、ＣＰＭＶ１５０、またはＣＰＭＶ１１４を含む構築物において目的のヌクレオチド配列の５’末端に融合される植物コザック配列を含むことが、目的のヌクレオチド配列の最適な発現のために推奨される。
２）目的のヌクレオチド配列は、発現エンハンサーの３’末端で植物コザック配列を含むＣＭＰＶＸ＋発現エンハンサー（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、１１４である）に融合されてもよく、結果、目的のヌクレオチド配列が植物コザック配列のすぐ後に位置する。この例では、ＣＰＭＶＸ＋に融合される目的のヌクレオチド配列は、マルチプルクローニングサイトまたは植物コザック配列を含まないだろう（得られる構築物は図１Ｂにおいて示されるものに類似するだろう）。
３）目的のヌクレオチド配列は、発現エンハンサーの３’末端でマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むＣＰＭＶＸ＋発現エンハンサー（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、１１４である）に、マルチプルクローニングサイトを用いて、融合されてもよい。この例では、発現エンハンサーのマルチプルクローニングサイトおよび目的のヌクレオチド配列のＡＴＧ開始部位からすぐ上流の植物コザック配列との融合を可能にするために、目的のヌクレオチド配列はその５’末端に対応する配列を含んでもよい（図１Ｃを参照されたい）。
上記方法のいずれかを用いる全体的な結果は、ヌクレオチドＸ（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、１１４である）を含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ配列（またはＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ配列と８０％の配列類似性を含むエンハンサー配列）と作動可能に関連する（作動可能に連結される）植物制御領域を含む、構築物（または発現カセット）であり、ＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ配列の３’末端は植物コザック配列の５’末端に融合され、植物コザック配列の３’末端はＡＴＧ開始配列を含む目的のヌクレオチド配列の５’末端に融合され、かつ隣接する。構築物は、５’ＵＴＲと植物コザック配列との間に位置するマルチプルクローニングサイトを含んでもよく、または含まなくてもよい。構築物は、目的のヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結される、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、例えば、コモウイルス３’ＵＴＲ、もしくはプラストシアニン３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーター、をさらに含んでもよい（図１Ａを参照されたい）。
本明細書に記載される１つまたは１より多くの発現エンハンサー（例えばＣＰＭＶＸ）と作動可能に連結される制御領域、および目的のヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物発現系もまた提供される。さらに、ＣＰＭＶ ５’ＵＴＲおよび改変もしくは欠失されるスタッファー配列を含む発現エンハンサー（例えばＣＰＭＶＸ＋）と作動可能に連結されるプロモーター（制御領域）配列、ならびに目的のヌクレオチド配列を含む、核酸が記載される。３’ＵＴＲ、例えばコモウイルス３’ＵＴＲ、もしくはプラストシアニン３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターをコードする配列を核酸はさらに含んでもよく、結果、目的のヌクレオチド配列は３’ＵＴＲより上流に挿入される。
「作動可能に連結される」により、核酸配列の発現の媒介または調節などの意図される機能を実施するために、直接的または間接的のいずれかで、特定の配列が相互作用することが意味される。例えば、作動可能に連結される配列の相互作用は、作動可能に連結される配列と相互作用するタンパク質により媒介されてもよい。
本明細書で参照される「発現エンハンサー」、 「エンハンサー配列」または「エンハンサーエレメント」は、ＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のＣＰＭＶ ５’ＵＴＲの部分に由来する、またはＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来のＣＰＭＶ ５’ＵＴＲの部分と配列類似性を共有する、配列を含む。それらが取り付けられた下流の異種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を、エンハンサー配列は高めることができる。
用語「５’ＵＴＲ」もしくは「５’非翻訳領域」または「５’リーダー配列」は、翻訳されないｍＲＮＡの領域を指す。典型的に５’ＵＴＲは転写開始部位で開始し、かつコーディング領域の翻訳開始部位もしくは開始コドン（通常ｍＲＮＡにおいてＡＵＧ、ＤＮＡ配列においてＡＴＧ）の直前で終結する。５’ＵＴＲの変異、例えば置換、欠失または挿入によって、５’ＵＴＲの長さは改変されてもよい。コドンがもはや開始コドンとして機能せず、翻訳が代替開始部位で開始しうるように、自然に存在する開始コドンまたは翻訳開始部位に変異導入することによって、５’ＵＴＲはさらに改変されてもよい。
ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２配列（配列番号：１）のヌクレオチド１−１６０由来の５’ＵＴＲは、第一のインフレーム開始開始コドン（１６１位の）まで、転写開始部位で開始し。これは、野生型コモウイルスゲノムセグメントによりコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方の生産のための開始部位として機能する。さらにＣＰＭＶ ＲＮＡ−２ゲノム配列における１１５位での（または、に対応する）「第三の」開始部位はまた、変異され、欠失され、またはそうでなければ変更されてもよい。不完全なＭタンパク質と組み合わされると、ＡＵＧ１６１の除去に加えて、ＡＵＧ１１５の除去は発現を高めることが示されている（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ， ２００８， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ； １４８： １２１２−１２１８； ＷＯ ２００９／０８７３９１；出典明示により本明細書に組み込まれる）。
発現エンハンサーは、配列番号：１のＸ由来のヌクレオチド（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４）（ＣＰＭＶＸ）、またはＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４；図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）と８０％の配列類似性を含み、かつ不完全なＭタンパク質を含む従来技術のＣＰＭＶ ＨＴエンハンサー配列に作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードする同一のヌクレオチド配列の発現と比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードするクレオチド配列の発現を高める特性を示す配列を含む、ＣＰＭＶ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでもよい（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載される；出典明示により本明細書に組み込まれる）。
ＣＰＭＶＸエンハンサー配列はまた、スタッファー配列、例えばマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）もしくは植物コザック配列に連結されるＭＣＳに融合されてもよく、ここでＣＭＰＶＸは、配列番号：１のＸ由来のヌクレオチド（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４）、またはＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４）と８０％の配列類似性を含み、かつ不完全なＭタンパク質を含む従来技術のＣＰＭＶ ＨＴエンハンサー配列に作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードする同一の配列の発現と比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の発現を高める特性を示す配列を含む（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載されるように；出典明示により本明細書に組み込まれる）。スタッファー配列は、ＣＭＰＶＸ配列の３’末端に融合される０−５００ヌクレオチドを含む。好ましくは、スタッファー配列は、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、または植物コザック配列に連結されるＭＣＳを含み、かつＭタンパク質を含まない。もしＣＭＰＶＸ配列がスタッファーフラグメント（Ｍタンパク質を有しない）を含むならば、この発現エンハンサーは、「ＣＰＭＶＸ＋」（図１Ａおよび１Ｃを参照されたい）、「スタッファー配列および植物コザック配列を含むＣＭＰＶＸ」、または「植物コザック配列とともにＭＣＳを含むＣＭＰＶＸ」と称されてもよい。
発現エンハンサーＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝１６０）は配列番号：１のヌクレオチド１−１６０からなる：
Figure 2017501738
 もし発現エンハンサーが、配列番号：１のヌクレオチド１−１６０からなる（ＣＰＭＶ１６０）ならば、開始配列（ＡＴＧ）に隣接する５’末端に位置する５’植物コザック配列を有するまたは有しない目的のヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲの３’末端（配列番号：１のヌクレオチド１６０の後）に融合されてもよく、結果、構築物全体が、図１Ｂ（ＣＰＭＶ１６０）に示される構築物に似る。ＣＰＭＶ１６０を含む構築物は、発現エンハンサーの５’末端に作動可能に連結される制御領域、および３’ＵＴＲ、例えばコモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくはプラストシアニン３’ＵＴＲをコードする配列、ならびに目的のヌクレオチド配列の３’末端に融合されるターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターをさらに含んでもよい。いかなる理論にも拘束されることはないが、配列番号：１の１５０−１５５、１５５−１６０、または１５０−１６０位の配列は、植物において活性な（天然）コザック配列として機能し得るので、ＣＰＭＶ１６０は目的のヌクレオチド配列の５’末端に植物コザック配列の付加を必要としなくてもよい。構築物番号１９３５（実施例３を参照されたい）および構築物番号１８８５（実施例６を参照されたい）は、ＣＰＭＶ１６０（ＣＰＭＶＸ、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の例である。
発現エンハンサーは、ＣＰＭＶＸ＋（Ｘ＝１６０）を含んでもよい。かかるエンハンサーの非限定例は、配列番号：２の配列を含むＣＰＭＶ１６０＋である（図１Ｃを参照されたい）（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１−１６０；マルチプルクローニングサイト イタリックのヌクレオチド１６１−１７６；植物コザック配列 大文字および太字のヌクレオチド１７７−１８１）：
Figure 2017501738
発現エンハンサーとして配列番号：２を用いる構築物の例は、構築物１８００、１８９７、１８８０、２１６８、２１８８、１９３７、１９７７、２０５０、２０６０、１９７５、１８９３、２１００、２１０９、２１２０、２１２９を含む（それぞれ実施例３、および５−１８を参照されたい）。
当業者に明らかなように、任意のマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、または様々な長さ（より短い、またはより長いのいずれか）のＭＣＳは、配列番号：２のヌクレオチド１６１−１７６の配列の代わりに使用されてもよい。さらに、配列番号：２の植物コザック配列（ヌクレオチド１７７−１８１で示される）は、配列番号：５−１７から選択される配列の１つを含むが、これらに限定されない、任意の植物コザック配列であってもよい（図４Ａも参照されたい；図４の構築物は、示されるような植物コザック配列のバリエーションを有する配列番号：２を含み、かつ５’ＵＴＲの５’末端に取り付けられる植物制御領域、および植物コザック配列に対して３’に位置する目的のヌクレオチド配列の転写開始部位、ＡＴＧを含む）。
発現エンハンサーＣＰＭＶＸは、１１５位において「Ａ」を含んでもよく（１１５Ａ）、結果、ＣＭＰＶＸ、１１５Ａ（ここでＸ＝１６０、１５５または１５０）が、野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ２ゲノムの配列を含む（野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの全配列について、出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０８７３９１を参照されたい）。発現エンハンサーＣＰＭＶＸ、１１５Ａの例は、配列番号：６９により定義される「ＣＰＭＶ１６０、１１５Ａ」である（「Ａ」は、太字および下線で示される）：
Figure 2017501738
発現エンハンサーＣＰＭＶＸ＋もまた、１１５位において「Ａ」を含んでもよく（１１５Ａ）、結果、ＣＭＰＶＸ＋、１１５Ａ（ここでＸ＝１６０、１５５または１５０）が、野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ２ゲノムの配列を含む（出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０８７３９１）。配列番号：７５により定義される、発現エンハンサーＣＰＭＶＸ＋、１１５Ａの非限定例は、「ＣＰＭＶ１６０＋、１１５Ａ」である（「Ａ」は、太字および下線で示される）：
Figure 2017501738
配列番号：２について上述したように、任意のＭＣＳ、または様々な長さのＭＣＳは、配列番号：７５のＭＣＳ配列の代わりに使用されてもよく、かつ植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよい。
もし発現エンハンサーが配列番号：１のヌクレオチド１−１５５からなるならば（ＣＰＭＶ１５５）：
Figure 2017501738
 開始配列（ＡＴＧ）に隣接する５’末端に位置する植物コザック配列を有する目的のヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲの３’末端に融合されてもよく（配列番号：１のヌクレオチド１５５の後）、結果、構築物全体が、図１Ｂに示される構築物（ＣＰＭＶ１５５）に似る。ＣＰＭＶ１５５を含む構築物は、発現エンハンサーの５’末端に作動可能に連結される制御領域、および３’ＵＴＲ、例えばコモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくはプラストシアニン３’ＵＴＲをコードする配列、ならびに目的のヌクレオチド配列の３’末端に融合されるターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターをさらに含んでもよい。この例において、天然コザック配列またはこの配列の一部（配列番号：１のヌクレオチド１５５−１６０）、は除去されているので、目的のヌクレオチド配列は、その５’末端で植物コザック配列を含む。
発現エンハンサーは、配列番号：７２の配列を含むＣＰＭＶ１５５＋を含んでもよい（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１−１５５；マルチプルクローニングサイト イタリックのヌクレオチド１５６−１７１；植物コザック配列 大文字および太字のヌクレオチド１７２−１７６）：
Figure 2017501738
ＣＰＭＶ１６０＋（配列番号：２）について上述したように、様々な長さのＭＣＳを含む任意のＭＣＳは、配列番号：７２のＭＣＳ配列の代わりに使用されてもよく、かつ植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよい。
配列番号：７０により定義されるように、発現エンハンサーＣＰＭＶ１５５は１１５位において「Ａ」を含んでもよく（１１５Ａ）、結果、「ＣＭＰＶ１５５、１１５Ａ」が野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ２ゲノムの配列を含む（出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０８７３９１を参照されたい）（「Ａ」は、太字および下線で記載される）：
Figure 2017501738
配列番号：７６により定義されるように、発現エンハンサーＣＰＭＶ１５５＋はまた、１１５位において「Ａ」を含んでもよく（１１５Ａ）、結果、「ＣＭＰＶ１５５＋、１１５ａ」が野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ２ゲノムの配列を含む（ＷＯ２００９／０８７３９１、出典明示により本明細書に組み込まれる）（「Ａ」は、太字および下線で示される）：
Figure 2017501738
配列番号：２について上述したように、任意のＭＣＳ、または様々な長さのＭＣＳは、配列番号：７６のＭＣＳ配列の代わりに使用されてもよく、かつ植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよい。
もし発現エンハンサーが配列番号：１のヌクレオチド１−１５０からなるならば（ＣＰＭＶ１５０）：
Figure 2017501738
 開始配列（ＡＴＧ）に隣接する５’末端に位置する植物コザック配列を有する目的のヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲの３’末端に融合されてもよく（配列番号：１のヌクレオチド１５０の後）、構築物全体が図１Ｂに示される構築物（ＣＰＭＶ１５０）に似る。ＣＰＭＶ１５０を含む構築物は、発現エンハンサーの５’末端に作動可能に連結される制御領域、および３’ＵＴＲ、例えばコモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくはプラストシアニン３’ＵＴＲをコードする配列、ならびに目的のヌクレオチド配列の３’末端に融合されるターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターをさらに含んでもよい。この例において、配列番号：１の１５０−１６０位の天然コザック配列は、除去されているので、目的のヌクレオチド配列は、その５’末端で植物コザック配列を含む。
発現エンハンサーは、配列番号：７３（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１−１５０；マルチプルクローニングサイト イタリックのヌクレオチド１５６−１６６；植物コザック配列 大文字および太字のヌクレオチド１６７−１７１）の配列：
Figure 2017501738
 （配列番号：７３）
を含むＣＰＭＶ１５０＋を含んでもよい。
ＣＰＭＶ１６０＋（配列番号：２）について上述したように、様々な長さのＭＣＳを含む任意のＭＣＳは、配列番号：７３のＭＣＳ配列の代わりに使用されてもよく、かつ植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよい。
配列番号：７１により定義されるように、発現エンハンサーＣＰＭＶ１５０は、１１５位において「Ａ」を含んでもよく（１１５Ａ）、結果、「ＣＭＰＶ１５０、１１５Ａ」が、野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ２ゲノムの配列を含む（出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０８７３９１を参照されたい）（「Ａ」は、太字および下線で示される）：
Figure 2017501738
配列番号：７７により定義されるように、発現エンハンサーＣＰＭＶ１５０＋はまた、１１５位において「Ａ」を含んでもよく（１１５Ａ）、結果、「ＣＭＰＶ１５０＋、１１５Ａ」が、野生型ＣＰＭＶ ＲＮＡ２ゲノムの配列を含む（ＷＯ２００９／０８７３９１、出典明示により本明細書に組み込まれる）（「Ａ」は、太字および下線で示される）：
Figure 2017501738
配列番号：２について上述したように、任意のＭＣＳ、または様々な長さのＭＣＳは、配列番号：７７のＭＣＳ配列の代わりに使用されてもよく、かつ植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよい。
もし発現エンハンサーが配列番号：１のヌクレオチド１−１１４からなるならば：
Figure 2017501738
 開始配列（ＡＴＧ）に隣接する５’末端に位置する植物コザック配列を有する目的のヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲの３’末端に融合されてもよく（配列番号：１のヌクレオチド１１４の後）、結果、構築物全体が、図１Ｂに示される構築物（ＣＰＭＶ１１４）に似る。ＣＰＭＶ１１１４を含む構築物は、発現エンハンサーの５’末端に作動可能に連結される制御領域、および３’ＵＴＲ、例えばコモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくはプラストシアニン３’ＵＴＲをコードする配列、ならびに目的のヌクレオチド配列の３’末端に融合されるターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターをさらに含んでもよい。この例において、配列番号：１のヌクレオチド１１４に対して５’のコザック−様配列があるので、目的のヌクレオチド配列は、その５’末端で植物コザック配列を含む。
発現エンハンサーは、配列番号：７４（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１−１１４；マルチプルクローニングサイト イタリックのヌクレオチド１１５−１３０；植物コザック配列 大文字および太字のヌクレオチド１３１−１３５）の配列：
Figure 2017501738
 を含むＣＰＭＶ１１４＋を含んでもよい。
ＣＰＭＶ１６０＋（配列番号：２）について上述したように、様々な長さのＭＣＳを含む任意のＭＣＳは、配列番号：７３のＭＣＳ配列の代わりに使用されてもよく、かつ植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよい。
発現エンハンサーはまた、配列番号：１の１６０位から下流に位置する植物コザック配列に融合される配列番号：１のヌクレオチド１−１６０を含んでもよい。植物コザック配列は、配列番号：１のヌクレオチド１６０に直接隣接して位置してもよく、または発現エンハンサーは、配列番号：１のヌクレオチド１６０に直接隣接して位置する約０−約５００ヌクレオチドもしくはそれらの間の任意の量のスタッファーフラグメント（ＣＰＭＶＸ＋）、ならびにスタッファーフラグメントの３’末端に連結される植物コザック配列を含んでもよい。スタッファーフラグメントは、約４−１００ヌクレオチドもしくはそれらの間の任意の量のマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含んでもよく、ならびに植物コザック配列およびその５’末端の対応するクローニング部位を含む目的のヌクレオチド配列は、ＭＣＳを用いて、ＣＭＰＶＸ発現エンハンサーに作動可能に連結されてもよく、またはスタッファーフラグメントは、植物コザック配列に融合される約４−１００ヌクレオチドのマルチプルクローニングサイトを含んでもよく、ならびに目的のヌクレオチド配列は、植物コザック配列のすぐ下流の発現エンハンサーに融合されてもよい。好ましくは、スタッファーフラグメントは、Ｍタンパク質をコードする配列を含まない。
限定と考えられるものではないが、順番に、スタッファーフラグメントに融合される配列番号：１のヌクレオチド１−１６０からなるＣＰＭＶ ５’ＵＴＲに融合される植物制御領域を含む構築物の例は、図１Ｃに示されるＣＰＭＶ１６０＋である（図１Ｃにおいて、目的のヌクレオチド配列「ＧＯＩ」のＡＴＧ開始部位もまた明確に示される）。この例において、スタッファーフラグメントは、ＣＰＭＶ１−１６０配列の３’末端に融合され、かつ順番に、植物コザック配列（この例において、限定と考えられるものではないが、植物コザック配列は：ＡＧＡＡＡである）に融合されるマルチプルクローニングサイトを含む。スタッファーフラグメントは、Ｍタンパク質をコードする任意の配列を含まない。もしＣＰＭＶ１６０＋構築物が、目的のヌクレオチド配列に融合されるならば（図１Ｃに示されるように）、植物コザック配列は目的のヌクレオチド配列の５’に位置し、かつ目的のヌクレオチド配列のＡＴＧ開始部位に隣接する。当業者に理解されるように、マルチプルクローニングサイトは、１つまたは１より多くの適切な制限酵素部位を含んでもよく、およびマルチプルクローニングサイトの配列は、図１Ｃにおいて示される例に限定されない。さらに、植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよく、かつ図１Ｃにおいて示される配列に限定されない。構築物番号１８００、１８９７、１８８０、２１６８、２１８８、１９３７、１９７７、２０５０、２０６０、１９７５、１８９３、２１００、２１０９、２１２０、２１２９（それぞれ実施例３、および５−１８を参照されたい）は、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０）ベースの構築物の例である。
上述のＣＰＭＶ１６０＋について記載されるものと同様の方法で、それぞれスタッファーフラグメントに融合される、配列番号：１のヌクレオチド１−１５５、１−１５０、または１−１１４をそれぞれ含む、発現エンハンサーＣＰＭＶ１５５＋、ＣＰＭＶ１５０＋、およびＣＰＭＶ１１４＋の例はまた、図１Ｃにおいて示される。図１Ｃにおいて、目的のヌクレオチド配列（ＧＯＩ）のＡＴＧ開始部位はまた、ＣＰＭＶ１５５＋、ＣＰＭＶ１５０＋、およびＣＰＭＶ１１４＋のそれぞれについて示される。これらの例において、ＣＰＭＶエンハンサー配列の３’末端に融合されるスタッファーフラグメントは、順番に、植物コザック配列に融合されるマルチプルクローニングサイトを含む。スタッファーフラグメントは、Ｍタンパク質をコードする任意の配列を含まない。当業者に理解されるように、マルチプルクローニングサイトは、１つまたは１より多くの適切な制限酵素部位を含んでもよく、かつマルチプルクローニングサイトの配列は、図１Ｃにおいて示される実施例に限定されない。さらに、植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよく、かつ図１Ｃにおいて示される配列（ＡＧＡＡＡ）に限定されない。
５’ＵＴＲ配列の３’末端に融合され、かつ植物コザック配列を欠如しているマルチプルクローニングサイト（ポリリンカー、制限酵素部位；クローニング部位）と組み合わせて、発現エンハンサーはまた、発現エンハンサーＣＰＭＶＸ（ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４）を含んでもよい（すなわちＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、または１１４）。これらの場合において、エンハンサーに接合される目的のタンパク質をコードする核酸配列（目的のヌクレオチド配列）は、目的のヌクレオチド配列の５’末端から３’末端まで順番に、目的のヌクレオチド配列のＡＴＧ開始部位（転写開始部位）の上流に位置し、かつ隣接する植物コザック配列に融合されるマルチプルクローニングサイト（スタッファーフラグメントのものと相補的；スタッファーフラグメントは、Ｍタンパク質をコードする任意の配列を含まない。）を含むだろう。
発現エンハンサーは、１つ以上の「コザックコンセンサス配列」または「コザック配列」をさらに含んでもよい。コザック配列は、翻訳の開始において重要な役割を果たす。任意のｍＲＮＡ不安定配列が、導入遺伝子構築物から排除されること、および翻訳開始部位（ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ）または開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）が、植物のためのコザックコンセンサスと一致することを確保することによって、翻訳の割合は最適化されうる（Ｇｕｔｉｅｒｒｒｅｚ， Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４， ４２９-４３８； Ｋａｗａｇｕｃｈｉ， Ｒ． ａｎｄ Ｂａｉｌｅｙ−Ｓｅｒｒｅｓ， Ｊ．， ２００２， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． ５， ４６０-４６５）。このモチーフにおいて最も高度に保存される位置は、ＡＴＧコドンの３ヌクレオチド上流のプリン（最も頻繁にはＡ）であり、翻訳の開始を示す（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：９４７−９５０、出典明示により本明細書に組み込まれる）。植物コザックコンセンサス配列は、当技術分野で知られている（例えばＲａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００８， Ｊｕｌｙ ３９（３）， ｐｐ． ２０７−２１３を参照されたい）。本明細書に記載されるように、自然に存在するコザック配列および合成コザック配列の両方は発現エンハンサーにおいて使用されてもよく、または目的のヌクレオチド配列に融合されてもよい。
植物コザック配列は、以下の植物コンセンサス配列を含むがこれらに限定されない、任意の既知の植物コザック配列であってもよい（例えばＬ． Ｒａｎｇａｎ ｅｔ． ａｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００８， Ｊｕｌｙ ３９（３）， ｐｐ． ２０７−２１３を参照されたい）：
ｃａＡ（Ａ／Ｃ）ａ （配列番号：５；植物界）
ａａＡ（Ａ／Ｃ）ａ （配列番号：６；双子葉植物）
ａａ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）ａ （配列番号：７；シロイヌナズナ）
植物コザック配列はまた：
ＡＧＡＡＡ （配列番号：８）
ＡＧＡＣＡ （配列番号：９）
ＡＧＧＡＡ （配列番号：１０）
ＡＡＡＡＡ （配列番号：１１）
ＡＡＡＣＡ （配列番号：１２）
ＡＡＧＣＡ （配列番号：１３）
ＡＡＧＡＡ （配列番号：１４）
ＡＡＡＧＡＡ （配列番号：１５）
ＡＡＡＧＡＡ （配列番号：１６）
（Ａ／−）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ．（配列番号：３；コンセンサス配列）
の群から選択されてもよい（図４を参照されたい）。
発現エンハンサーは、植物発現系への目的のヌクレオチドの挿入を容易にするための１つ以上の「制限酵素部位」または「制限酵素認識部位」、「マルチプルクローニングサイト」、「ＭＣＳ」、「クローニング部位」「ポリリンカー配列」または「ポリリンカー」をさらに含んでもよい。制限酵素部位は、当技術分野でよく知られた制限酵素によって認識される特定の配列モチーフである。発現エンハンサーは、５’ＵＴＲの下流（３’）に位置する１つ以上の制限酵素部位またはクローニング部位を含んでもよい。１つ以上の制限酵素部位またはクローニング部位は、１つ以上のコザック配列の上流（５’）にさらに位置してもよく、また５’ＵＴＲおよびコザック配列間に位置してもよい。ポリリンカー配列（マルチプルクローニングサイト）は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列を５’ＵＴＲの３’末端に付加および除去するために有用な核酸の任意の配列を含んでもよい。ポリリンカー配列は、４から約１００核酸、またはそれらの間の任意の量を含んでもよい。
図１Ｂに示されるように、発現エンハンサーはまた、目的のヌクレオチド配列（ＧＯＩ）に融合される植物制御領域および転写開始部位（ＡＴＧ）と作動可能に関連する配列番号：１の配列を含んでもよい（ＣＰＭＶＸ；ここでＸ＝１６０、１５５、１５０または１１４）。ＣＰＭＶＸはまた、配列番号：５の−１７の１つの配列を含むが、これらに限定されない、任意の植物コザック配列を含んでもよい。
配列番号：１および２のいずれかに記載の配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を示す限り、本明細書に記載の発現エンハンサー（ＣＰＭＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋、ここでＸ＝１６０、１５５、１５０または１４４）における使用のための５’ＵＴＲは、二分節ＲＮＡウイルス由来、例えばコモウイルスなどの二分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来であってもよい。例えばエンハンサー配列は、配列番号：１および２の配列と約８０％から約１００％の同一性もしくはそれらの間の任意の量、配列番号：１および２の配列と約９０％から約１００％の同一性もしくはそれらの間の任意の量、配列番号：１および２の配列と約９５％から約１００％の同一性もしくはそれらの間の任意の量、または配列番号：１および２の配列と約９８％から約１００％の同一性もしくはそれらの間の任意の量を有してもよく、ここで、発現エンハンサーは、本明細書に記載される植物制御領域および植物コザック配列に作動可能に連結される場合に、同一の植物制御領域を用いてＣＭＰＶ ＨＴ（配列番号：４；不完全なＭタンパク質を含む、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載される従来技術のエンハンサー配列；出典明示により本明細書に組み込まれる）に融合される目的のヌクレオチド配列の発現レベルと比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させる。
配列番号：４は、従来技術において知られたＣＰＭＶ ＨＴ発現エンハンサー（例えばＳａｉｎｓｂｕｒｙ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ ２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８：ｐｐ．１２１２−１２１８の図１；出典明示により本明細書に組み込まれる）を含む。「ＣＰＭＶ ＨＴ」は、１１５（ｃｇｔ）および１６２（ａｃｇ）位の改変ヌクレオチドを有する配列番号：４のヌクレオチド１−１６０由来の５’ＵＴＲ配列、ならびに不完全なＭタンパク質を含み、かつ植物コザック配列を欠く（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１−１６０；不完全なＭタンパク質 下線、ヌクレオチド１６１−５０９）。配列番号：４はまた、従来技術のＣＰＭＶ ＨＴ配列において存在しないマルチプルクローニングサイト（イタリック、ヌクレオチド５１０−５２８）を含む：
Figure 2017501738
ＣＰＭＶ ＨＴを含む構築物は、参照構築物として本明細書で使用され、結果、目的のヌクレオチド配列の発現レベル、またはＣＰＭＶＸもしくはＣＰＭＶＸ＋を含む構築物を用いて生産される目的のヌクレオチド配列によりコードされる生産物が比較されてもよい。構築物１３９１、４８４、４８９、２１４０、２１３０、１０３９、１０６７、２０７２、２０７４、１４４５、１４５４、５００１、５００２、５０２１および５０２２（それぞれ実施例１および５−１８を参照されたい）は、参照構築物ＣＰＭＶ ＨＴを含む。
図２−５に示されるように、同一のプロモーターおよび３’ＵＴＲならびにターミネーター配列を用いる同一の目的のヌクレオチド配列の発現と比較すると、本明細書に記載される発現エンハンサーの使用は、目的のヌクレオチド配列の発現の増加をもたらした。例えば、図２、３および５を参照すると：
Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（「ＰＤＩ−Ｈ１ Ｃａｌ」、または「Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１８９７、ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物番号４８４（実施例５を参照されたい）；
Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（「ＰＤＩ−Ｈ３ Ｖｉｃ」、または「Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１８００；ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物番号１３９１（それぞれ実施例１および２を参照されたい）；
天然シグナルペプチドを有するインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（ＷｔＳｐ−Ｈ５ Ｉｎｄｏ）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１８８０；ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物番号４８９（実施例６を参照されたい）；
欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（「ＷｔＳｐ−Ｂ Ｗｉｓ−ＰｒＬ」、または「Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１９７５；ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物番号１４４５（実施例１３を参照されたい）；
欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（「Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１９３７；ＣＭＰＶ ＨＴベースの構築物番号１０３９（実施例９を参照されたい）；
膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合される欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１Ｔｍ（「Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１Ｔｍ」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１９７７；ＣＭＰＶ ＨＴベースの構築物１０６７（実施例１０を参照されたい）、
欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２ ２０１２（「Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２ ２０１２」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号２０５０；ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物番号２０７２（実施例１１を参照されたい）、
膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合される欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ（「Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号２０６０；ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物２０７４（実施例１２を参照されたい）、
膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合される欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ（「Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ」）：ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物番号１８９３；ＣＰＭＶ ＨＴベースの構築物１４５４（実施例１４を参照されたい）；
天然またはＰＤＩシグナルペプチドを有するＣＰＭＶ−ＨＴ（「ＣＰＭＶ−ＨＴ／野生型ＳＰ」および「ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ」；構築物番号５００１および５００２、それぞれ、実施例１５および１６を参照されたい）、またはＣＰＭＶ１６０＋（「ＣＰＭＶ１６０＋／野生型ＳＰ」および 「ＣＰＭＶ１６０＋／ＰＤＩＳＰ」；構築物番号２１００および２１０９、それぞれ実施例１５および１６を参照されたい）の制御下の、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）
と作動可能に連結されるＣＰＭＶ−ＨＴ（従来技術）発現構築物およびＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の発現の比較が示されている。
それぞれの場合において、発現（場合によっては血液凝集活性として、またはリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）発現で決定される）が、従来技術のＣＰＭＶベースの構築物に関するものと比較される場合、ＣＭＰＶ１６０＋ベースの構築物において増加する。さらに、目的のヌクレオチド配列のいくつかは、例えば異種のシグナルペプチド（例えばＰＤＩ）、異種の膜貫通ドメイン細胞質側末端配列（ＴＤＣＴ）、および／または欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を含む改変配列を含む、キメラタンパク質または改変タンパク質をコードした。
もし、上述のＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物において使用される植物コザック配列が、他の植物コザック配列、例えば、配列番号：８−１６において定義されるそれらの植物コザック配列の１つと置き換わっていれば、ＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物を用いて観察される発現の増加もまた、観察される。例えば、図４を参照すると、種々の植物コザック配列にそれぞれ融合される目的のヌクレオチド配列（Ｈ３ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１）と作動可能に連結されるＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の発現の比較が示されている。それぞれの場合において、ＣＭＰＶ１６０＋ベースの構築物による発現（血液凝集力価として決定される）は、顕著な発現レベル、かつ従来技術のＣＭＰＶ ＨＴベースの構築物より大きいことを実証する。
特定の配列に言及する場合の用語「パーセントの類似性」、または「パーセントの同一性」は、例えばウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプログラムに記載されるように、またはマニュアルアラインメントおよび外観検査によって、使用される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ． １９９５補足を参照されたい）。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（１９８１，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２）を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈのアラインメントアルゴリズムによって（１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３）、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似性方法のための研究によって（１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ”ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４）、これらのアルゴリズムのコンピューター化される実装によって（例えば：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ） ｉｎ ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）実行できる。
パーセントの配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ ）にそれぞれ記載される。本発明の核酸およびタンパク質に対するパーセントの配列同一性を決定するために、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は本明細書に記載されるパラメーターを用いて使用される。例えばＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用してもよい。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用してもよい。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通じて利用可能である（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい）。
タンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列は、発現される遺伝子の上流に位置する「翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」もしくは「開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」または「翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ）」もしくは「開始部位（ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ）」または「開始コドン」の存在を必要とする。かかる開始部位が、エンハンサー配列の一部、または目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部のいずれかとして提供されてもよい。
「発現カセット」は、宿主細胞における目的の核酸の転写のための適切なプロモーターまたは他の制御エレメントの制御下で、およびそれらと作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（もしくは作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ））連結される目的の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。
「タンパク質分解ループ」または「開裂部位」は、前駆体ＨＡ０開裂に伴うタンパク質分解部位のコンセンサス配列を意味する。本明細書に使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、複数の配列のアラインメントの解析に基づく関連配列の配列可変性、例えば、特定のインフルエンザＨＡ０配列のサブタイプを含む配列（アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれか）を意味する。インフルエンザＨＡ０開裂部位のコンセンサス配列は、例えばコンセンサスＨ１、コンセンサスＨ３、コンセンサスＨ５を含むインフルエンザＡコンセンサスヘマグルチニンアミノ酸配列、または例えば、Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ、Ｂ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎおよびＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓに限定されないインフルエンザＢコンセンサスヘマグルチニンアミノ酸配列を含んでもよい。タンパク質分解のループ領域の配列の非限定例は、米国仮出願番号６１／８０６，２２７（２０１３年、３月２８出願、出典明示により本明細書に組み込まれる；またＢｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７９：７３８０−７３８８を参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）の図１５および１８Ｂにおいて示される。
例えば点変異、置換、挿入、または欠失に限定されないが、タンパク質分解ループまたは開裂部位における残基はいずれかが変異されてもよい。本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」または「アミノ酸改変」は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および改変を包含することを意味する。最終的な構築物が、所望の特徴、例えば、減少されるもしくは消滅されるタンパク質分解ループの開裂またはプロテアーゼによる開裂部位を所有する限り、置換、欠失、挿入、および改変の任意の組み合わせは、米国仮出願番号６１／８０６，２２７（２０１３年、３月２８出願、出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、最終的な構築物に到達するよう作製されうる。
本明細書に記載されるように、目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現エンハンサー配列を含む核酸構築物（発現系）が提供される。本明細書に記載されるエンハンサー配列を含む植物発現系もまた、提供される。また、目的のタンパク質をコードする、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるエンハンサー配列と作動可能に関連する植物制御領域を含む植物発現系が提供される。エンハンサー配列は、配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つ、または配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つに記載の配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を示すヌクレオチド配列から選択されてもよく、ここで、発現エンハンサーは、本明細書に記載される植物制御領域および植物コザック配列に作動可能に連結される場合に、同一の植物制御領域を用いてＣＭＰＶ ＨＴ（配列番号：４；不完全なＭタンパク質を含む従来技術のエンハンサー配列、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載されるように；出典明示により本明細書に組み込まれる）に融合される目的のヌクレオチド配列の発現レベルと比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させる。
本発明のエンハンサー配列が、宿主生物、例えば植物における目的のタンパク質を発現するために使用されてもよい。この場合では、目的のタンパク質はまた、問題となっている宿主生物に異種であってもよく、かつ当技術分野で知られた形質転換技術を用いて植物細胞に導入されてもよい。生物における異種の遺伝子は、内在性等価遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｇｅｎｅ）、すなわち同一のもしくは類似の機能を正常に実行するもの、と置き換わってもよく、または挿入される配列は、内在性遺伝子もしくは他の配列に付加されてもよい。
目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるエンハンサー配列はまた、プロモーター、もしくは植物制御領域、ならびに３’ＵＴＲおよびターミネーター配列に作動可能に連結されてもよい。エンハンサー配列は、例えば、配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つ、または配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つに記載の配列に１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を示すヌクレオチド配列によって定義されてもよい。従って、目的のヌクレオチド配列は、エンハンサー配列とターミネーション配列との間に位置する（図１Ａを参照されたい）。発現エンハンサーまたは目的のヌクレオチド配列のいずれかは、植物コザック配列を含んでもよい。
本発明はさらに、目的のヌクレオチド配列、３’ＵＴＲ配列、およびターミネーター配列に融合される、本明細書に記載される発現エンハンサー配列に作動可能に連結される、プロモーターまたは植物制御領域を順番に含む発現カセットを提供する。エンハンサー配列は、例えば、配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つ、または配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つに記載の配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を示すヌクレオチド配列によって定義されてもよい。発現エンハンサーまたは目的のヌクレオチド配列のいずれかは、植物コザック配列を含んでもよい。
当業者が理解するように、ターミネーション（ターミネーター）配列は、植物宿主で活性な任意の配列であってもよく、例えばターミネーション配列は、二分節ＲＮＡウイルス、例えばコモウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来であってもよく、またはターミネーション配列は、ＮＯＳターミネーターであってもよい。
本発明の構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含みうる。３’非翻訳領域は、ポリアデニレーションシグナルおよびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる任意の他の制御シグナルを含有する。ポリアデニレーションシグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラック（ｔｒａｃｋｓ）の付加に影響を与えることによって特徴付けられる。バリエーションは共通ではないが、ポリアデニレーションシグナルは、一般に標準型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’への相同性の存在により認識される。適切な３’領域の非限定例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、およびダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；米国４，９６２，０２８；出典明示により本明細書に組み込まれる）、プラストシアニン発現を制御する際に使用されるプロモーター（Ｐｗｅｅ および Ｇｒａｙ １９９３；出典明示により本明細書に組み込まれる）のポリアデニレーションシグナルを含有する、３’転写非翻訳領域である。ターミネーション（ターミネーター）配列は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲから得られてもよい。
「目的のヌクレオチド（もしくは核酸）配列」、または「目的のコーディング領域」によって、目的のタンパク質を生産するための、宿主生物、例えば植物内で発現される任意のヌクレオチド配列、またはコーディング領域（これらの用語は、互換的に使用されてもよい）が意味される。かかる目的のヌクレオチド配列は、限定されないが、天然もしくは改変タンパク質、工業用酵素もしくは改変工業用酵素、農業用タンパク質もしくは改変農業用タンパク質、ヘルパータンパク質、タンパク質サプリメント、医薬活性タンパク質、栄養補助食品、付加価値のある生産物、または飼料、食品もしくは飼料および食品用途の両方のためのそれらのフラグメントをコードしてもよい。
目的のタンパク質は、天然、または非天然シグナルペプチドを含んでもよく；非天然シグナルペプチドは、植物由来であってもよい。例えば、シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＰＤＩ）であってもよい。天然シグナルペプチドは、発現されている目的のタンパク質のシグナルペプチドに対応してもよい。
目的のヌクレオチド配列、または目的のコーディング領域はまた、医薬活性タンパク質、例えば、予防接種もしくはワクチン接種等のため有用な、成長因子、成長調節因子、抗体、抗原、およびそれらのフラグメント、またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。かかるタンパク質は、ヒト病原体であるタンパク質、ウイルスタンパク質、例えば限定されないがＶＬＰ−形成抗原、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）由来の１つ以上のタンパク質、またはインターロイキン、例えば１つまたは１より多くのＩＬ-１からＩＬ−２４、ＩＬ−２６およびＩＬ-２７、サイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦもしくはそれらの組み合わせ、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはｔＰＡ ｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、例えばリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）を含むがこれに限定されない抗体、神経ポリペプチド、インスリン、ワクチン、例えば表皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、形質転換成長因子に限定されない成長因子、成長調節因子、抗原、自己抗原、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
目的のタンパク質はまた、インフルエンザヘマグルチニンを含んでもよい（ＨＡ；出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／００９８７６を参照されたい）。ＨＡは、シグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、および一般的にＣ−末端および小細胞質側末端で膜貫通アンカー部位を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質である。ＨＡをコードするヌクレオチド配列はよく知られており、かつ利用可能である（例えば、ＢｉｏＤｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ；Ｓｑｕｉｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６：Ｄ４９７−Ｄ５０３）ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇ／ＧＳｅａｒｃｈ／ｈｏｍｅ．ｄｏ？ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ；または国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）によって維持されるデータベースを参照されたい。両方が出典明示により本明細書に組み込まれる）。
ＨＡタンパク質が、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザのものであってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６の群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡのサブタイプであってもよい。発明のいくつかの態様において、ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９群から選択されるＡ型インフルエンザ由来であってもよい。上に列挙されたＨＡのフラグメントもまた、目的のタンパク質であると考えられてもよい。さらに、ＨＡタイプまたは上に列挙されたサブタイプ由来のドメインが、キメラＨＡを生産するために組み合わせられてもよい（例えば出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０７６７７８を参照されたい）。
ＨＡタンパク質を含むサブタイプの例は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））を含む。
ＨＡタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプであってもよい。例えば、Ｈ１タンパク質が、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来であってもよい。Ｈ３タンパク質はまた、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／２２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）株由来であってもよい。本発明のさらなる態様において、Ｈ２タンパク質が、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株由来であってもよい。Ｈ５タンパク質が、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５株由来であってもよい。本発明の態様において、Ｈ６タンパク質が、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株由来であってもよい。Ｈ７タンパク質が、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）株、またはＨ７Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、もしくはＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）株由来であってもよい。本発明の態様において、Ｈ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株由来である。本発明のさらなる態様において、ＨＡタンパク質が、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２−様ウイルス（山形系統）、またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（山形系統）を含むＢ型ウイルスであってもよいインフルエンザウイルス由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の非限定例は、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載される配列を含む。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａであってもよい。
ＨＡはまた、ＨＡの天然膜貫通ドメインが異種の膜貫通ドメインと置き換わっている、キメラＨＡであってもよい。ＨＡタンパク質の膜貫通ドメインは、高度に保存されている（例えばＷＯ２０１０／１４８５１１の図１Ｃを参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）。異種の膜貫通ドメインは、任意のＨＡ膜貫通ドメイン、例えば、限定されないが、Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＣＡ３３４９３．１）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＵ９９１９４．１）、Ｈ１／Ｂｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＤＥ２８７５０．１）、Ｈ１ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＵ９９１０９．１）、Ｈ１／ＮＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＡＰ３４３２４．１）、Ｈ２Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＡＡ６４３６６．１）、Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＣＩ２６３１８．１）、Ｈ３ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＯ３７５９９．１）、Ｈ５Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＤ２８１８０．１）、Ｈ５Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＣＲ４８８７４．１）、Ｈ５−Ｉｎｄｏ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＷ０６１０８．１）由来の膜貫通ドメインから得られてもよい。膜貫通ドメインはまた、以下のコンセンサスアミノ酸配列によって定義されてもよい：
ｉＬＸｉＹｙｓｔｖＡｉＳｓｌＸｌＸＸｍｌａｇＸｓＸｗｍｃｓ（配列番号：７８）
ＨＡが天然または非天然シグナルペプチドを含んでもよく；非天然シグナルペプチドが、植物起源のものであってもよい。天然シグナルペプチドが、発現されているヘマグルチニンのものに対応してもよく、または第二のヘマグルチニンに対応してもよい。さらに、シグナルペプチドが、インフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質またはヘマグルチニン由来であってもよい。使用されてもよいシグナルペプチドの非限定例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ ＳＰ；アクセッション番号．Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２−１０３）のもの、またはパタチンシグナルペプチド（ＰａｔＡ ＳＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ０８２１５のヌクレオチド１７３８−１８０６に位置する）である。このアクセッション番号についてのＰａｔＡ ＳＰのヌクレオチド配列は：
ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴ（配列番号：７９）である。
パタチンシグナルペプチドのアミノ酸配列は：
ＭＡＴＴＫＴＦＬＩＬＦＦＭＩＬＡＴＴＳＳＴＣＡ（配列番号：８０）である。
本発明はまた、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子が、ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結される１つ以上の制御領域をさらに含んでもよい。核酸分子が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型インフルエンザ由来のＨＡをコードする配列を含んでもよい。例えば、当該核酸分子によりコードされるＨＡタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９サブタイプ、Ｂ型由来のＨＡであってもよい。当該核酸によりコードされるＨ１タンパク質が、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ３タンパク質が、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／２２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ２タンパク質が、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ５タンパク質が、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ６タンパク質が、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ７タンパク質が、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）株、またはＨ７Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、もしくはＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）株由来であってもよい。さらに、当該核酸分子によりコードされるＨ９タンパク質が、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨＡタンパク質が、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２−様ウイルス（山形系統）、またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（山形系統）を含むＢ型ウイルスインフルエンザウイルス由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の非限定例は、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載される配列を含む。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａであってもよい。
表１：本明細書に記載される調製された構築物の例：
Figure 2017501738
Figure 2017501738
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 １：ＳＰ−シグナルペプチド
２：ＰＤＩ−アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
３：ＷＴ−野生型または天然
４：ＴＭＣＴ−膜貫通ドメインおよび細胞質側末端
もし目的の核酸配列が、直接的にまたは間接的に植物に毒性な生産物をコードするならば、かかる毒性が、所望の組織内または所望の植物発達の段階で、目的のヌクレオチド配列を選択的に発現させることによって減少されてもよい。
本発明のヌクレオチド配列、または核酸分子、または遺伝的構築物、またはベクターで形質転換されている、またはこれらを含んでいる、任意の適切な植物宿主において、目的のコーディング領域または目的のヌクレオチド配列が発現されてもよい。適切な宿主の例は、シロイヌナズナ、例えばキャノーラ、アブラナ属、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、タバコ属（タバコ）、例えば、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）、エンドウ、オートムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタ、コーン（ｃｏｒｎ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）を含む農作物を含むが、これらに限定されない。
本明細書に使用される用語「バイオマス」および「植物物質」は、植物由来の任意の物質を指す。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、または葉、根、茎、花、種子を含む植物の部分を含んでもよく、それはまた、植物の任意の組織、植物の任意の細胞、または植物の任意の画分、植物、組織もしくは細胞の部分を含んでもよい。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内の植物構成要素、細胞外の植物構成要素、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組み合わせ由来の、植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。植物の一部分が、植物物質またはバイオマスを含んでもよい。
「制御領域」「制御エレメント」または「プロモーター」によって、典型的に、常にではないが、遺伝子のタンパク質コーディング領域の上流の核酸の部分が意味され、それはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでもよい。制御領域が活性であり、かつ目的の遺伝子と作動可能に関連する、もしくは目的の遺伝子と作動可能に連結される場合、これは、目的の遺伝子の発現という結果をもたらしうる。制御エレメントが、器官特異性を媒介することができ、または発達もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することができてもよい。「制御領域」は、プロモーターエレメント、基本的なプロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に反応して誘導性であるエレメント、負の制御エレメントなどのプロモーター活性を媒介するエレメントまたは転写エンハンサーを含む。本明細書で使用されるように「制御領域」はまた、転写後に活性なエレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサーなどの遺伝子発現を調節する制御エレメント、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子、を含む。これらの後者のエレメントのいくつかが、コーディング領域の近位に位置してもよい。
この開示の文脈において、用語「制御エレメント」または「制御領域」は、常にではないが、通常、構造的な遺伝子のコーディング配列の上流（５’）のＤＮＡの配列を典型的に指し、それは、特定の部位で開始する転写のために必要とされるＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子のための認識を提供することによってコーディング領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内に位置する、または配列の３’の他のヌクレオチド配列もまた、目的のコーディング領域の発現の制御に貢献しうることが理解されるだろう。特定の部位での開始を保証する、ＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供する制御エレメントの例は、プロモーターエレメントである。全てではないが、ほとんどの真核生物のプロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位のおよそ２５塩基対上流に通常位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対を含む保存された核酸配列を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基本的なプロモーターエレメント、並びに遺伝子発現を改変する他の制御エレメント（上に列挙されたような）を含んでもよい。
発生制御される、誘導性の、または構成的なものを含む、いくつかのタイプの制御領域が存在する。発生制御される、またはその制御下で遺伝子の差次的発現を制御する制御領域は、特定の器官もしくは器官の組織内で、その器官もしくは組織の発達の間の特定の時点で活性化される。しかしながら、発生制御されるいくつかの制御領域が、特定の発達段階で特定の器官または組織内で優先的に活性であってもよく、それらはまた、発生制御される方法で活性であってもよく、または同様に植物内の他の器官もしくは組織において基本的なレベルであってもよい。組織特異的な制御領域の例、例えば、種子特異的制御領域は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む（Ｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １５２：５９５−５９９；Ｂｉｌｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１２５−１３０）。葉特異的なプロモーターの例は、プラストシアニンプロモーターを含む（米国７，１２５，９７８を参照されたい、出典明示により本明細書に組み込まれる）。
誘導性制御領域は、誘導物質に反応して１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を、直接的にまたは間接的に活性化することが可能なものである。誘導物質の不在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は、転写されないだろう。典型的に、転写を活性化するための誘導性制御領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性型で存在してもよく、それは次いで直接的にまたは間接的に誘導物質により活性型に変換される。しかしながら、タンパク質因子もまた、不在であってもよい。誘導物質は、タンパク質、代謝産物、成長調節剤、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学的薬剤、または熱、低温、塩、もしくは毒性エレメントにより直接的に課される生理的ストレス、もしくは間接的にウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用を介す生理的ストレスでありうる。噴霧、散水、加熱、もしくは同様の方法によってなど、外部から誘導物質を細胞もしくは植物に加えることによって、誘導性制御領域を含有する植物細胞が誘導物質にさらされてもよい。誘導性制御エレメントは、植物または非植物遺伝子のいずれか由来であってもよい（例えばＧａｔｚ、Ｃ． ａｎｄ Ｌｅｎｋ、Ｉ．Ｒ．Ｐ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ３、３５２−３５８；出典明示により組み込まれる）。潜在的な誘導性プロモーターの例は、テトラサイクリン−誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ、Ｃ．，１９９７，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８，８９−１０８；出典明示により組み込まれる）、ステロイド誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ、Ｔ． ａｎｄ Ｃｈｕａ、Ｎ．Ｈ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２，３９７−４０４；出典明示により組み込まれる）およびエタノール−誘導性プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６，１２７−１３２；Ｃａｄｄｉｃｋ、Ｍ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６、１７７−１８０、出典明示により組み込まれる）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，Ｉ． ａｎｄ Ｋｉｅｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０，１００９−１０１９；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、９８２−９８５；出典明示により組み込まれる）およびオーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ、Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９，１９６３−１９７１；出典明示により組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。
植物の様々な部分にわたって、および継続的に植物発達にわたって、構成的な制御領域は、遺伝子の発現を指示する。既知の構成的な制御エレメントの例は、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写産物に関連するプロモーター（ｐ３５Ｓ；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−８１２）、ライスアクチン１（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：１１５５−１１６５）、アクチン２（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０：１０７−１２１）、またはｔｍｓ２（米国５，４２８，１４７、出典明示により本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕ ｅｔ． ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０６：４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９：６３７−６４６）、シロイヌナズナユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９：６３７−６４６）、タバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９：９９５−１００４）。キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ Ｖｅｉｎ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ｐＣＡＳ、（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）；リブロースニリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター、ｐＲｂｃＳ：（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ｐＵｂｉ（単子葉植物および双子葉植物のための）を含む。
本明細書に記載されるように、葉発現における実証される効率を有するエンハンサー配列を含む制御領域が、一過性発現において効果的であるとわかった。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、核マトリックスへの付着による光合成遺伝子の上流制御エレメントの付着が、強い発現を媒介しうる。例えばエンドウプラストシアニンの翻訳開始部位から−７８４まで（米国７，１２５，９７８、出典明示により本明細書に組み込まれる）が、強いレポーター遺伝子発現を媒介するために使用されてもよい。
本明細書に使用される用語「構成的な」は、構成的な制御領域の制御下のヌクレオチド配列が、全ての細胞タイプにおいて同一のレベルで発現されるが、存在量のバリエーションがよく観察されるとしても当該配列が広い範囲の細胞タイプにおいて発現されることを、必ずしも示すものではない。
上記に記載されるような発現構築物が、ベクター中に存在してもよい。ベクターは、生物または宿主のゲノムへの発現カセットの導入およびインテグレーションを可能にするボーダー配列を含んでもよい。当該構築物は、植物バイナリーベクター、例えばｐＰＺＰ（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ、ｅｔ ａｌ． １９９４）に基づくバイナリー形質転換ベクターであってもよい。当該構築物の他の例は、ｐＢｉｎ１９（Ｆｒｉｓｃｈ、Ｄ． Ａ．，Ｌ． Ｗ． Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ． １９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７：４０５−４０９を参照されたい）を含む。
所望であれば、この発明の構築物は、選択可能なマーカーを含むようにさらに操作されてもよい。しかしながら、これは、必要とされなくてもよい。有用な選択可能なマーカーは、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン、カナマイシン、などの化学物質、またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｙｃｉｎ）、グリホサート、クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）などの除草剤への抵抗性を提供する酵素を含む。同様に、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）などの色変化、またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰなどの発光により同定可能な化合物の生産のために提供する酵素が使用されてもよい。
ベクターはまた、本明細書に記載される発現エンハンサーを含んでもよい。発現エンハンサーは、遺伝子サイレンシングのサプレッサーおよびＮＰＴＩＩも含有するＴ−ＤＮＡに位置されてもよい。ポリリンカーはまた、タンパク質精製を容易にするために、目的のタンパク質へのＮ−またはＣ−末端Ｈｉｓ−タグの包含を可能にする、１つまたは２つの６ｘヒスチジン残基のセットをコードしてもよい。
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）が、植物における導入遺伝子の発現を制限することを伴ってもよく、およびジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）由来のサイレンシングサプレッサーの共発現が、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的な分解に対抗するために使用されてもよい（Ｂｒｉｇｎｅｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ． １７、６７３９−６７４６、出典明示により本明細書に組み込まれる）。代替サイレンシングサプレッサーが、当技術分野でよく知られており、かつ本明細書に記載されるように使用されてもよい（Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４６：７−１４；出典明示により本明細書に組み込まれる）、例えば、限定されないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、トマト・ブッシー・スタント・ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ）のＢＹＶ−ｐ２１、ｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９；ｐ１９の構築は、ＷＯ２０１０／０００３２２５に記載される、出典明示により本明細書に組み込まれる）、トマト・クリンクル・ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ）のカプシドタンパク質（ＴＣＶ −ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ；ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリー・スコーチ・ウイルス（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｃｏｒｃｈ ｖｉｒｕｓ）のｐ１６、（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、シトラス・トリステザ・ウイルス（Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ）のｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴病ウイルス（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｌｅａｆｒｏｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）−２のｐ２４、（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウ葉巻ウイルスＡ（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ）のｐ１０、（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウ葉巻ウイルスＢ（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｂ）のｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド潜在ウイルス（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）のｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜在ウイルス（Ｇａｒｌｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）。
従って、１つ以上のサイレンシングのサプレッサー、例えば、限定されないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ｒｇｓｃａｍ、ＦＨＶ由来のＢ２タンパク質、ＣＰＭＶの小コートタンパク質、およびＴＣＶ由来のコートタンパク質、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６、またはＧＶＡ−ｐ１０が、さらに植物内で高レベルのタンパク質生産を保証するためにコモウイルス−ベースの発現カセット、ジェミニウイルス由来増幅エレメント、および目的のタンパク質をコードする核酸配列とともに共発現されてもよい。
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、等を用いて植物細胞に導入されうる。かかる技術の評価のためには、例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ、ｐｐ． ４２１−４６３（１９８８）；Ｇｅｉｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．（１９８８）；ならびにＭｉｋｉ ａｎｄ Ｉｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ、Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ２ｄ Ｅｄ． ＤＴ． Ｄｅｎｎｉｓ， ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ， ＤＤ Ｌｅｆｅｂｒｖｅ， ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ（ｅｄｓ）， Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ， Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ． Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ． ５６１−５７９（１９９７）を参照されたい。他の方法は、直接的なＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、エレクトロポーレーション、例えばプロトプラストを用いるもの、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）またはウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）、および減圧浸潤（ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含む。例えば、Ｂｉｌａｎｇ、ｅｔ ａｌ．（１９９１、Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０）、Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２８：１０４−１１２）、Ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１−１１６）、Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７、Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ７５：３０−３６）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２９：１３５３）、Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：１２６５）、Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１）、ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１：６９４−７０１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｐｌｎａｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ａｎｄ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９８９）、ＷＯ９２／０９６９６、ＷＯ９４／００５８３、ＥＰ３３１０８３、ＥＰ１７５９６６、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ、１０５：３４３−３４８）、ＥＰ ２９０３９５；ＷＯ ８７０６６１４；米国特許番号４，９４５，０５０；５，０３６，００６；および５，１００，７９２、１９９５年５月１０日出願の米国特許出願番号０８／４３８，６６６、および１９９２年９月２５日出願の０７／９５１，７１５を参照されたい（これらの全ては出典明示により本明細書に組み込まれる）。
一過性発現方法を使用して、本発明の構築物を発現させもよい（ Ｄ’Ａｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ４８３、ｐａｇｅｓ４１−５０；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５：３４３−３４８を参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）。あるいは、Ｋａｐｉｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １２２、１０１−１０８；出典明示により本明細書に組み込まれる）、またはＷＯ００／０６３４００、ＷＯ００／０３７６６３（これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）により記載されるような減圧−ベースの一過性発現方法が使用されてもよい。これらの方法は、例えば、限定されないがアグロイノキュレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）またはアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、シリンジインフィルトレーション（ｓｙｒｉｎｇｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の方法を含んでもよいが、他の一過性方法もまた、上述のように使用されてもよい。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーション、またはシリンジインフィルトレーションにより、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば葉、植物の地上部分（茎、葉および花を含む）、他の植物の部分（茎、根、花）、または植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を横切った後、アグロバクテリアは感染し、かつｔ−ＤＮＡコピーを細胞に導入する。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、およびｍＲＮＡが翻訳され、感染される細胞における目的のタンパク質の生産をもたらすが、しかしながら、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
本明細書に記載される一過性タンパク質発現のための適切なプラットフォーム植物として使用されてもよい本発明の遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物、植物細胞または種子も、本発明の一部と見なされる。植物細胞から植物全体を再生する方法もまた、当技術分野で知られている（例えばＧｕｅｒｉｎｅａｕ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３、Ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ ＲＲＤ ｅｄ） Ｏｘｆｏｒｄ， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ｐｐ １２１−１４８を参照されたい）。一般的に、形質転換されている植物細胞は適切な培地において培養され、それは抗生物質などの選択的な薬剤を含有してもよく、ここで選択可能なマーカーは、形質転換されている植物細胞の同定を容易にするために使用される。カルスが形成されると、既知の方法に従い適切な植物ホルモンを用いることにより、シュート形成を促し、かつ当該シュートは、植物の再生のための発根培地に導入される。次に、種子から、または栄養繁殖技術を用いるいずれかで反復的発生（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を樹立するために、当該植物が使用されてもよい。トランスジェニック植物は、組織培養を用いずに生成されうる。安定な形質転換、およびこれらの生物の再生のための方法は、当技術分野で樹立され、かつ当業者に知られている。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， ＶｏＩ Ｉ， Ｉｌ ａｎｄ ＩＩＩ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８４）、および Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）において検討される。形質転換されている植物、および再生される植物を獲得する方法は、本発明に重要ではない。
もし植物、植物の部分もしくは植物細胞が形質転換、または２つ以上の核酸構築物により共形質転換される場合、核酸構築物が、核酸がプールされる単一の遺伝子導入事象においてアグロバクテリウムに導入されてもよく、またバクテリア細胞は記載されるように遺伝子導入されてもよい。あるいは、構築物は連続的に導入されてもよい。この場合では、第一の構築物は、記載されるようアグロバクテリウムに導入され、唯一単独で形質転換されているバクテリアだけが、増殖することができる選択的な条件下（例えば抗生物質の存在下）で当該細胞を増殖させる。この第一の選択工程の後、第二の核酸構築物を、記載されるようアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍ）に導入し、かつ二重−形質転換されているバクテリアだけが増殖することができる二重−選択的条件で細胞を増殖させる。その後、本明細書に記載されるように、二重−形質転換されているバクテリアが植物、植物の部分もしくは植物細胞を形質転換するために使用されてもよく、または第三の核酸構築物に適応するさらなる形質転換工程に供されてもよい。
あるいは、もし植物、植物の部分、もしくは植物細胞が形質転換されている、または２つ以上の核酸構築物により共形質転換されているならば、アグロバクテリウム細胞と植物、植物の部分、または植物細胞の共浸潤性の（ｃｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）混合物によって、核酸構築物が、植物に導入されてもよく、それぞれアグロバクテリウム細胞が、植物内導入される１つ以上の構築物を含んでもよい。当該浸潤の工程の間に、構築物内の目的のヌクレオチド配列の植物、植物の部分または植物細胞内の相対発現レベルを変化させるために、所望の構築物を含む種々のアグロバクテリア集団の濃度は、変化されてもよい。
本開示はさらに、本明細書で定義される発現系を含むトランスジェニック植物を提供し、ここで、本明細書に記載されるような発現系、例えばＣＭＰＶ ＨＴ（配列番号：４）の１つ以上の構成要素を欠く他の類似する発現系と比較して強化されるレベルで、カセットにおける目的の異種核酸は発現される。
本開示はさらに、本明細書に記載される発現系を発現する植物、または植物の部分を提供する工程、少なくとも目的のタンパク質が発現されている組織を採取する工程、および任意に、組織から目的のタンパク質を単離する工程を含む、目的のタンパク質を生成するための方法を含む。
従って、種々の態様において、限定無しに、本発明は：
−配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つ、または配列番号：１、２、２４、２７、６８、６９および７０−７７のいずれか１つに記載の配列に１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を示すヌクレオチド配列から選択されるコモウイルス ５’ＵＴＲを含む発現エンハンサーであって、ここで、当該発現エンハンサーは、本明細書に記載される植物制御領域および植物コザック配列に作動可能に連結される場合に、同一の植物制御領域を用いてＣＭＰＶ ＨＴ（配列番号：４；不完全なＭタンパク質を含む従来技術のエンハンサー配列、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．，ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載される；出典明示により本明細書に組み込まれる）に融合される目的のヌクレオチド配列の発現レベルと比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させるものである、発現エンハンサーを提供する。
−上記で定義されるようなコモウイルス−ベースの発現エンハンサーもしくは発現カセット、プロモーター（制御領域）、任意にポリリンカー、コザック配列、目的のタンパク質をコードする核酸、ならびにターミネーターを含む１つ以上の発現系を提供する。
−本明細書に記載される１つ以上の発現系またはベクターを用いて、植物などの宿主生物において目的のタンパク質を発現する方法を提供する。
−本発明の１つ以上の発現系またはベクターから目的のタンパク質を発現する宿主細胞および生物、ならびに当該宿主および生物を生産する方法を提供する。
表２：配列のリスト
Figure 2017501738
Figure 2017501738
Figure 2017501738
Figure 2017501738
Figure 2017501738
実施例１−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１３９１）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）をコードする配列を以下のＰＣＲ−ベースの方法を用いて、２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系（元のＣＭＰＶ−ＨＴ）へクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａコーディング配列を含有するフラグメントを、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図６Ｃ、配列番号：１８）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ−ＰＤＩ．Ｓ１＋３ｃ（図６Ａ、配列番号：６７）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図６Ｂ、配列番号：１７）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１１９１（図６Ｄ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、かつ線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリー反応のために使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴ−ベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを企図するアクセプタープラスミドである。それはまた、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物を組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、かつ左から右に配列ｔ−ＤＮＡボーダーが図６Ｅに示されている（配列番号：１９）。得られた構築物は、番号１３９１が与えられた（図６Ｆ、配列番号：２０）。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列は、図６Ｇに示されている（配列番号：２１）。プラスミド１３９１の表示は、図６Ｈに示されている。
実施例２−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１８００）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）をコードする配列を以下のＰＣＲ−ベースの方法を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系（ＣＰＭＶ１６０＋）へクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａコーディング配列を含有するフラグメントをＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図７Ｃ、配列番号：２４）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ＊＊（ＳａｃＩＩ）−ＰＤＩ．ｓ１＋４ｃ（図７Ａ、配列番号：２２）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図７Ｂ、配列番号：２３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号２１７１（図７Ｄ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、かつ線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリー反応のために使用した。構築物番号２１７１は、ＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを企図するアクセプタープラスミドである。それはまた、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物を組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、かつ左から右に配列ｔ−ＤＮＡボーダーが図７Ｅに示されている（配列番号：２５）。得られた構築物は、番号１８００が与えられた（図７Ｆ、配列番号：２６）。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列は、図７Ｇに示されている（配列番号：２７）。プラスミド１８００の表示は、図７Ｈに示されている。
実施例３−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１９３５）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）をコードする配列を以下のＰＣＲ−ベースの方法を用いて２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ１６０−ＮＯＳ発現へクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａコーディング配列を含有するフラグメントをＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図７Ｃ、配列番号：２４）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ−ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（図８Ａ、配列番号：２８）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図７Ｂ、配列番号：２３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１１９０（図８Ｂ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、かつ線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリー反応のために使用した。構築物番号１１９０は、ＣＰＭＶ１６０−ベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを企図するアクセプタープラスミドである。それはまた、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物を組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、かつ左から右に配列ｔ−ＤＮＡボーダーが図８Ｃに示されている（配列番号：２９）。得られた構築物は、番号１９３５が与えられた（図８Ｄ、配列番号：３０）。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列は、図７Ｇに示されている（配列番号：２７）。プラスミド１９３５の表示は、図８Ｅに示されている。
実施例４−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系におけるＳａｃＩＩ制限酵素部位とＰＤＩＳＰ／Ｈ３ ＶｉｃｔｏｒｉａのＡＴＧとの間の配列のバリエーション（構築物番号１９９２−１９９９）
改変フォワードプライマーを用いて、および全ての他の構成要素を同一に保って、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系におけるＳａｃＩＩ制限酵素部位とＰＤＩＳＰ／Ｈ３ ＶｉｃｔｏｒｉａのＡＴＧとの間の配列バリエーションを含む８構築物を、構築物番号１８００（実施例２を参照されたい）に関して同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いて作製した。バリアントＨＴ１＊からＨＴ８＊を図９Ａ−９Ｈにおいて記載されるプライマーを用いて増幅した：
ＩＦ−ＨＴ１＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ａ、配列番号：３１）、
ＩＦ−ＨＴ２＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｂ、配列番号：３２）、
ＩＦ−ＨＴ３＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｃ、配列番号：３３）
ＩＦ−ＨＴ４＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｄ、配列番号：３４）
ＩＦ−ＨＴ５＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｅ、配列番号：３５）
ＩＦ−ＨＴ６＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｆ、配列番号：３６）
ＩＦ−ＨＴ７＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｇ、配列番号：３７）および
ＩＦ−ＨＴ８＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図９Ｈ、配列番号：３８）、
構築物番号１９９２から１９９９をそれぞれ作製するためのプライマー。プラスミド１９９２の表示は図９Ｉに示されている。類似する特徴を用いて構築物１９９３−１９９９を調製した。
実施例５−ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号４８４）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１８９７）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に対応するコーディング配列（図１０Ａ、配列番号：３９）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０へ、それぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来の成熟Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号：４０）は、図１０Ｂに示されている。プラスミド４８４および１８９７の表示は、図１０Ｃおよび１０Ｄにおいて示される。
実施例６−Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号４８９）、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１８８０）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０（構築物番号１８８５）
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の天然Ｈ５に対応するコーディング配列（図１１Ａ、配列番号：４１）を元のＣＰＭＶ−ＨＴ、ＣＰＭＶ１６０＋およびＣＰＭＶ１６０へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）、１８００（実施例２を参照されたい）および１９３５（実施例３を参照されたい）としてＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の天然Ｈ５のアミノ酸配列は、図１１Ｂに示されている（配列番号：４２）。プラスミド４８９、１８８０および１８８５の表示は、図１１Ｃから図１１Ｅにおいて示される。
実施例７−ＰＤＩＳＰ−Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２１４０）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２１６８）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ）に対応するコーディング配列（図１２Ａ、配列番号：４３）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）としてＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７成熟のアミノ酸配列は、図１２Ｂに示されている（配列番号：４４）。プラスミド２１４０および２１６８の表示は、図１２Ｃおよび１２Ｄにおいて示される。
実施例８−ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２１３０）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２１８８）
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、インフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴ）の外部ドメインに対応するキメラヘマグルチニン（ｃｈｉｍｅｒ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）コーディング配列（図１３Ａ、配列番号：４５）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）としてＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合されたＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１３Ｂに示されている（配列番号：４６）。プラスミド２１３０および２１８８の表示は、図１３Ｃおよび１３Ｄにおいて示される。
実施例９−ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１０３９）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１９３７）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））（出典明示により本明細書に組み込まれる、米国仮出願番号６１／８０６，２２７ ２０１３年３月２８日出願、付加情報：ＨＡ配列における欠失タンパク質分解ループ領域を参照されたい）に対応するコーディング配列（図１４Ａ、配列番号：４７）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）としてＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列は、図１４Ｂに示されている（配列番号：４８）。プラスミド１０３９および１９３７の表示は、図１４Ｃおよび図１４Ｄにおいて示される。
実施例１０−ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１０６７）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１９７７）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有し、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）の外部ドメイン（出典明示により本明細書に組み込まれる、米国仮出願番号６１／８０６，２２７ ２０１３年３月２８日出願、付加情報：ＨＡ配列における欠失タンパク質分解ループ領域を参照されたい）に対応するキメラヘマグルチニン（ｃｈｉｍｅｒ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）コーディング配列（図１５Ａ、配列番号：４９）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いて クローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１５Ｂに示されている（配列番号：５０）。プラスミド１０６７および１９７７の表示は、図１５Ｃおよび図１５Ｄにおいて示される。
実施例１１−ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７２）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２０５０）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換され、欠失タンパク質分解ループを有するインフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））（ＰｒＬ−）（出典明示により本明細書に組み込まれる米国仮出願番号６１／８０６，２２７ ２０１３年３月２８日出願 付加情報：ＨＡ配列における欠失タンパク質分解ループ領域、を参照されたい）に対応するコーディング配列（図１６Ａ、配列番号：５１）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）としてＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列は、図１６Ｂに示されている（配列番号：５２）。プラスミド２０７２および２０５０の表示は、図１６Ｃおよび図１６Ｄにおいて示される。
実施例１２−ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７４）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２０６０）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有し、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）の外部ドメイン（出典明示により本明細書に組み込まれる米国仮出願番号６１／８０６，２２７ ２０１３年３月２８日出願 付加情報：ＨＡ配列における欠失タンパク質分解ループ領域、を参照されたい）に対応するキメラヘマグルチニン（ｃｈｉｍｅｒ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）コーディング配列（図１７Ａ、配列番号：５３）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）および１８００（実施例２を参照されたい）としてＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１７Ｂに示されている（配列番号：５４）。プラスミド２０７４および２０６０の表示は、図１７Ｃおよび１７Ｄにおいて示される。
実施例１３−ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１４４５）、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１８２０）およびＣＰＭＶ１６０（構築物番号１９７５）
天然シグナルペプチドを有し、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡ（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））（出典明示により本明細書に組み込まれる米国仮出願番号６１／８０６，２２７ ２０１３年３月２８日出願 付加情報：ＨＡ配列における欠失タンパク質分解ループ領域、を参照されたい）に対応するコーディング配列（図１８Ａ、配列番号：５５）を元のＣＰＭＶ−ＨＴ、ＣＰＭＶ１６０＋、およびＣＰＭＶ１６０へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）、１８００（実施例２を参照されたい）および１９３５（実施例３を参照されたい）としてＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。天然シグナルペプチドを有するＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列は、図１８Ｂに示されている（配列番号：５６）。プラスミド１４４５、１８２０および１９７５の表示は、それぞれ図１８Ｃ、１８Ｄおよび１８Ｅにおいて示される。
実施例１４−ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１４５４）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１８９３）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの天然シグナルペプチドを有し、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ／２／２０１２由来のＨＡ（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）の外部ドメイン（出典明示により本明細書に組み込まれる米国仮出願番号６１／８０６，２２７ ２０１３年３月２８日出願 付加情報：ＨＡ配列における欠失タンパク質分解ループ領域、を参照されたい）に対応するキメラヘマグルチニン（ｃｈｉｍｅｒ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）コーディング配列（図１９Ａ、配列番号：５７）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）、および１８００（実施例２を参照されたい）としてＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１９Ｂに示されている（配列番号：５８）。プラスミド１４５４および１８９３の表示は、図１９Ｃおよび１９Ｄにおいて示される。
実施例１５−ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号５００１）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２１００）
モノクローナルＩｇＧ１抗体リツキシマブの重鎖に対応するコーディング配列（ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；図２０Ａ、配列番号：５９）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１（実施例１を参照されたい）、および１８００（実施例２を参照されたい）としてＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のアミノ酸配列は、図２０Ｂに示されている（配列番号：６０）。プラスミド５００１および２１００の表示は、図２０Ｃおよび図２０Ｄにおいて示される。
実施例１６−ＰＤＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号５００２）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２１０９）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているモノクローナルＩｇＧ１抗体リツキシマブの重鎖に対応するコーディング配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；図２１Ａ、配列番号：６１）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１および１８００としてＰＤＩＳＰ／ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のアミノ酸配列は、図２１Ｂに示されている（配列番号：６２）。プラスミド５００２および２１０９の表示は、図２１Ｃおよび図２１Ｄにおいて示される。
実施例１７−ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ（構築物番号５０２１）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２１２０）
モノクローナルＩｇＧ１抗体リツキシマブの軽鎖に対応するコーディング配列（ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；図２２Ａ、配列番号：６３）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１および１８００としてＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のアミノ酸配列は、図２２Ｂに示されている（配列番号：６４）。プラスミド５０２１および２１２０の表示は、図２２Ｃおよび図２２Ｄにおいて示される。
実施例１８−ＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ（構築物番号５０２２）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２１２９）
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているモノクローナルＩｇＧ１抗体リツキシマブの軽鎖に対応するコーディング配列（ＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；図２３Ａ、配列番号：６５）を元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋へそれぞれ構築物１３９１および１８００としてＰＤＩＳＰ／ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＬＣ リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のアミノ酸配列は、図２３Ｂに示されている（配列番号：６６）。プラスミド５０２２および２１２９の表示は、図２３Ｃおよび図２３Ｄにおいて示される。
実施例１９−アグロバクテリウム遺伝子導入
Ｄ’Ａｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ ２００８（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：９３０−９４０）により記載される方法を用いて、ＤＮＡ構築物をエレクトロポーレーションによりアグロバクテリウム株ＡＧＬ１に遺伝子導入した。１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したｐＨ５．６のＹＥＢ培地において、遺伝子導入されているアグロバクテリウムを０．６および１．６間のＯＤ６００まで増殖させた。浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）において使用および再懸濁される前に、アグロバクテリウム懸濁液を遠心分離した。
植物バイオマス、接種源およびアグロインフィルトレーションの調製
市販の基材ピートモスで満たされる平地で、種子からニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を生長させた。当該植物を１６／８光周期および、日中２５℃／夜２０℃の温度管理体制下で温室において生長するようにした。播種から３週間後、個々の苗木を取り出し、鉢に移植し、かつ同じ環境条件下でさらに３週間温室で生長させた。
１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したｐＨ５．６ＹＥＢ培地において、それぞれ構築物が遺伝子導入されているアグロバクテリアを０．６および１．６間のＯＤ６００に達するまで増殖させた。浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）において使用および再懸濁される前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離し、かつ一晩４°Ｃで貯蔵した。浸潤の日に、培養バッチを２．５培養容積で希釈し、かつ使用前にあたためた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を２分間２０−４０トルの真空下で気密ステンレススチールタンクにバクテリア懸濁液に逆さまに置いた。採取までの２−６日インキュベーション期間のために、植物を温室に戻した。
葉の採取および総タンパク質抽出
インキュベーション後、植物の地上の一部を採取し、−８０℃で凍結し、かつ破砕した。３倍容積の、冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）において、凍結−破砕の植物物質のそれぞれのサンプルをホモジナイズ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）することで総可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後、スラリーを４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離し、かつこれらの清澄粗抽出物（上清）を解析のために保存した。
実施例２０−タンパク質解析およびイムノブロッティング
参照標準としてウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をすることによって、清澄粗抽出物の総タンパク質内容を決定した。免疫検出のために、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、かつポリフッ化ビニレン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に電気転写した。イムノブロッティングの前に、４℃で１６−１８時間トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％スキムミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で膜をブロッキングした。
ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中２％スキムミルクにおいて２μｇ／ｍｌの一次抗体を用いて、第一のインキュベーションでイムノブロッティングを実施した（表４は、それぞれのＨＡの検出のために使用される条件および抗体を提示する）。表４において示されるように、化学発光検出のために使用される二次抗体を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中２％スキムミルクにおいて希釈した。基質としてルミノールを用いる化学発光により、免疫反応複合体を検出した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
表４：発現されるタンパク質のイムノブロッティングのための電気泳動条件、抗体、および希釈。
Figure 2017501738
Figure 2017501738
 ＪＩＲ： Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ， ＵＳＡ；
ＣＢＥＲ： Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ．
Ｓｉｎｏ： Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ．， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ．
ＴＧＡ： Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｏｏｄｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ．
ＮＩＢＳＣ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
ＩＴＣ： Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡ
実施例２１−血液凝集アッセイ
血液凝集アッセイは、Ｎａｙａｋ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｌ（２００４）により記載される方法に基づいた。簡潔には、ウェル当たりに希釈されるサンプルの１００μＬを残して試験サンプル（１００μＬ）の二倍段階希釈を、１００μＬ ＰＢＳを含有するＶ−底９６−穴マイクロタイタープレートにおいて作製した。０．２５％ターキー赤血球懸濁液（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．， Ｓｙｒａｃｕｓｅ， ＮＹ；全てのＢ株、Ｈ１、Ｈ５およびＨ７のため）または０．５％モルモット赤血球懸濁液（Ｈ３のため）の１００マイクロリッターをそれぞれのウェルに加え、および室温で２時間プレートをインキュベートした。ＨＡ活性として、完全な血液凝集を示す最大希釈の逆数を記録した。
全ての引用文献は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
１つ以上の実施形態に関して、本発明は記載されている。しかしながら、請求項に明らかにされるような本発明の範囲から逸脱することなく多くの変形および改変を行えることは当業者には自明であろう。

Claims (23)

  1. ＸヌクレオチドからなるＣＰＭＶ ５’ＵＴＲヌクレオチド配列（ＣＭＰＶＸ）であって、Ｘ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である配列を含む、またはＣＭＰＶＸと約８０％から１００％の配列類似性を含むヌクレオチド配列であって、ヌクレオチドＸ＝配列番号：１配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である配列からなる、発現エンハンサー。
  2. ＣＭＰＶ ５’ＵＴＲヌクレオチド配列の３’末端に融合される、約１から１００ヌクレオチド長のスタッファー配列をさらに含む、請求項１に記載の発現エンハンサー（ＣＭＰＶＸ＋、ここでＸ＝配列番号：１の１６０、１５５、１５０、もしくは１１４である）。
  3. スタッファー配列が植物コザック配列を含む、請求項２に記載の発現エンハンサー。
  4. スタッファー配列が、マルチプルクローニングサイトをさらに含む、請求項３に記載の発現エンハンサー。
  5. コザック配列が配列番号：５−１７に示される配列の群から選択される、請求項３に記載の発現エンハンサー。
  6. 配列番号：２のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の発現エンハンサー。
  7. 配列番号：２４、２７、６８、６９、７０および７１の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の発現エンハンサー。
  8. 配列番号：７２、７３、７４、７５、７６および７７の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の発現エンハンサー。
  9. 請求項１に記載の発現エンハンサーおよび目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結される制御領域を含む核酸配列を含む、植物発現系。
  10. コモウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項９に記載の植物発現系。
  11. サイレンシングのサプレッサーをコードする第二の核酸配列をさらに含む、請求項９に記載の植物発現系。
  12. サイレンシングのサプレッサーが、ＨｃＰｒｏおよびｐ１９の群から選択される、請求項１１に記載の植物発現系。
  13. 制御領域がプラストシアニンプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣＡＳプロモーター、ＲｂｃＳプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、またはアクチンプロモーターから選択される、請求項９に記載の植物発現系。
  14. 目的のヌクレオチド配列がウイルスタンパク質または抗体をコードする、請求項９に記載の植物発現系。
  15. ウイルスタンパク質がＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、およびインフルエンザＢ型ヘマグルチニンからなる群から選択されるインフルエンザヘマグルチニンである、請求項１４に記載の植物発現系。
  16. ウイルスタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列が、天然シグナルペプチド配列または非天然シグナルペプチドを含む、請求項１４に記載の植物発現系。
  17. 非天然シグナルペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）由来である、請求項１６に記載の植物発現系。
  18. 請求項９に記載の植物発現系を、植物または植物の部分に導入すること、および目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で、植物もしくは植物の部分をインキュベートすることを含む、植物または植物の部分において目的のタンパク質を生産する方法。
  19. 請求項９に記載の植物発現系を用いて一過性に遺伝子導入されている、または安定的に形質転換されている、植物または植物の部分。
  20. 目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項１に記載の発現エンハンサーを含む核酸。
  21. 目的のヌクレオチド配列が、Ｂ ＨＡ、Ｃ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６から選択されるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）である、請求項２０に記載の核酸。
  22. ＨＡが、ＨＡの天然膜貫通ドメインが異種の膜貫通ドメインと置き換わっている、キメラＨＡである、請求項２１に記載の核酸。
  23. 異種の膜貫通ドメインがＨ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる、請求項２２に記載の核酸。
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