TWI714522B - Cpmv強化子元件 - Google Patents
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Abstract
提供包含由X核苷酸(CPMVX)組成的CPMV 5’UTR核苷酸序列的表現強化子，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114，或由包含與CPMVX從大約80%至100%序列相似度的核苷酸序列組成，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114。此表現強化子可進一步含融合至5’UTR核苷酸序列3’端的填充序列(CPMVX+，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114)。此填充序列可包含一或更多植物kozak序列。包含此表現強化子的植物以及使用此表現強化子的方法亦被描述。
Description
本發明係相關於植物中感興趣的蛋白質的表現。本發明亦提供植物中感興趣的蛋白質的生產方法與組成物。
植物提供了作為重組蛋白質生產系統的極大潛力。在植物中生產外來蛋白質的一個途徑為產生穩定的基因轉殖植物系。然而這是個費時並且勞力密集的程序。基因轉殖植物的替代品為以植物病毒為基礎的表現載體的使用。以植物病毒為基礎的載體容許用於植物中蛋白質快速的、高量的、過渡的表現。
實現植物中外來蛋白質高量過渡的表現的一個方法涉及以RNA植物病毒為基礎的載體之使用，該病毒包括豇豆花葉病毒屬(comoviruses)，例如豇豆嵌紋病毒(Cowpea mosaic virus)(CPMV；見，例如WO2007/135480；WO2009/087391；US 2010/0287670,Sainsbury F.et al.,2008,Plant Physiology；148：121-1218；Sainsbury F.et al.,2008,Plant Biotechnology Journal；6：82-92；Sainsbury F.et al.,2009,Plant Biotechnology Journal；7：682-693；Sainsbury F.et al.2009,Methods in Molecular Biology,Recombinant Proteins From Plants,vol.483：25-39)。
豇豆花葉病毒屬為帶有雙向基因體的RNA病毒。豇豆花葉病毒RNA基因體的片段被稱作RNA-1與RNA-2。RNA-1編碼VPg、複製酶與蛋白酶蛋白質。複製酶是病毒在病毒基因體複製時所必需的。豇豆花葉病毒屬豇豆嵌紋病毒（CPMV）的RNA-2生產被處理成4個官能肽的105 kDa或 95 kDa的一聚合蛋白（polyprotein）。
CPMV RNA-2的5’區域包含位於115、161、512與524的起始密碼子（AUGs）。位於161與512的起始密碼子係位於相同的三聯閱讀框架。在位於位置161的起始密碼子的引發導致了105K聚合蛋白的合成，而於位置512的起始密碼子的引發導向95K聚合蛋白的合成。CPMV中於位置512的起始密碼子之轉譯作用的引發較於位置161的引發更有效率，造成比105K聚合蛋白更多的95K聚合蛋白的產生。在位置115的起始密碼子對病毒複製而言不是必需的（Wellink et al., 1993 Biochimie. 75(8):741-7）。
在CPMV RNA-2中位置161與512的起始位點間的框架的維持對於經由RNA-1編碼的複製酶之RNA-2的有效複製為必需的（Holness et al., 1989； Virology 172, 311- 320； van Bokhoven et al. 1993, Virology 195, 377-386； Rohll et al., 1993 Virology 193, 672-679； Wellink et al., 1993, Biochimie. 75(8):741-7）。此需求影響了在CPMV RNA-2表現載體的複製形式中512起始密碼子上游可插入的序列長度。此外，多位點接頭（polylinker）的使用必須小心使用，因為它們可能改變這些起始位點間的密碼子讀取框架（ORF）。
CPMV已擔任適用於植物中異種多肽的生產之載體系統的發展基礎（Liu et al., 2005 Vaccine 23, 1788-1792; Sainsbury et al., 2007 Virus Expression Vectors （Hefferon, K. ed）, pp. 339-555）。這些系統係根據RNA-2的修飾，但異於無論是全長或刪除的版本被使用。經修飾的RNA-2之複製係經由與RNA-1的共同接種而實現。將外來蛋白質融合至RNA-2衍生的聚合蛋白的C末端。N末端多肽的釋放係經由來自口蹄疫病毒（foot-and-mouth- disease virus）的2A催化肽序列的行動來媒介（Gopinath et al., 2000, Virology 267: 159-173）。生成的RNA-2分子能夠於植物中與植物間散播。在豇豆植物中此策略已經使用表現數種重組蛋白質，例如B型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）與小免疫蛋白（SIPs）（Mechtcheriakova et al. J. Virol. Methods 131, 10-15; 2006； Monger et al., 2006, Plant Biotechnol. J. 4, 623-631； Alamillo et al., 2006, Biotechnol. J. 1, 1103-1111）。雖然成功，但全長病毒載體的使用限制了插入序列的大小，且在植物間的移動引起對病毒生物控制的擔憂。
為了解決生物控制與插入物大小的議題， Canizares et al.（2006 Plant Biotechnol, J 4:183-193）以興趣物的序列取代了大部分RNA-2的編碼區域，以產生CPMV RNA-2的帶有缺陷版本（deIRNA-2）。將所要表現的序列緊接於3' 非轉譯區域（UTR）的上游，與RNA-2位於位置512的AUG融合，以產生模仿RNA-2的分子。在RNA-1與沉默抑制子（suppressor of silencing）的存在下，此類構築體當被引入植物中時能夠複製，並且導致大量異種蛋白質的合成（Sainsbury et al., 2008 Plant Biotechnol J 6:82-92）。
在CPMV RNA-2載體中位於位置161的起始密碼子的突變（U162C；HT）增加了由位置512之起始密碼子後插入之序列所編碼的蛋白質表現量。此容許高量的外來蛋白質的生產而不需病毒複製作用，其稱之為CPMV-HT系統（WO2009/087391；Sainsbury and Lomonossoff, 2008, Plant Physiol. 148, 1212-1218）。在pEAQ 表現質體中（Sainsbury et al., 2009, Plant Biotechnology Journal, 7, pp 682-693; US 2010/0287670），將要表現的序列置於5'UTR與3' UTR之間。在pEAQ 系列中的5'UTR 帶有U162C（HT）突變。
本發明係相關於植物中興趣蛋白質的表現。本發明亦提供植物中興趣蛋白質的生產方法與組成。
如本文所描述，提供了表現強化子，該表現強化子包含由X核苷酸（CPMVX），其中X= SEQ ID NO：1的160、155、150或114，或由包含與CPMVX有80%至100%序列相似性，其中X= SEQ ID NO：1的160、155、150或114的核苷酸序列所組成的CPMV 5’UTR核苷酸序列。表現強化子可包含選自SEQ ID NO： 24、27、68、69、70與71的群組之核苷酸序列。
本發明亦提供如上述定義的表現強化子，其中該表現強化子進一步包含填充序列（stuffer sequence）（CPMVX+，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150、114）。填充序列可包含由0至約100核苷酸的長度或其間的任何長度、一或更多的植物kozak序列、一多重轉殖位點、一或更多的連接子序列、一或更多的重組位點或其組合。本發明亦提供如上述定義的表現強化子，其中kozak序列係選自如SEQ ID NO：5 -17中所顯示的序列之群組。如甫定義之表現強化子（CPMVX+，其中X= SEQ ID NO：1的160、155、150或114）可包含選自SEQ ID NO：2、72、73、74、75、76及77之群組的核苷酸序列。
亦提供的為包括含有調節區域的核酸序列之植物表現系統，該調節區域被與如上述定義的表現強化子CPMVX、CPMVX+操作性地連接，該表現強化子係操作性地與興趣核苷酸序列連接。植物表現系統可進一步包含豇豆花葉病毒3’ UTR。此植物表現系統可進一步包含編碼沉默抑制子(例如HcPro或p19)的第二核酸序列。
如上述定義的植物表現系統之興趣核苷酸序列可編碼病毒蛋白質或抗體。舉例來說，病毒蛋白質可能為流感血球凝集素並且可選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16以及流感B型血球凝集素。編碼病毒蛋白質或抗體的核苷酸序列可包含天然信號肽序列、或非天然的信號肽，舉例來說非天然信號肽可從蛋白質雙硫異構酶（PDI）獲得。
如本文所描述，提供了在植物中或在植物的部分生產興趣蛋白質的方法，該方法包含將如上述定義之包含CPMVX或 CPMVX+的植物表現系統引入植物或植物的部分，並且在容許編碼興趣蛋白質的核苷酸序列表現的條件下培養植物或植物的部分。
本發明亦提供以如上描述的植物表現系統過渡地轉染或穩定地轉形之植物或植物的部分。
如本文所描述的以植物為基礎之表現系統造成編碼異種開放閱讀框架的核苷酸序列增加或強化的表現，該異種開放閱讀框架係被操作性地連接至無論是如本文定義之CPMVX或CPMVX+表現強化子。表現的增加可經由比較使用以CPMVX為基礎的、或以CPMVX+為基礎的表現強化子獲得的表現量與編碼操作性地連接至先前技術的包含不完整M蛋白質（如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218中所描述者；將其以引用的方式併入本文）之強化子序列（CPMV HT）的異種開放閱讀框架之相同核苷酸序列的表現量而測定。先前技術CPMV HT序列的範例係於SEQ ID NO：4中提供。
如本文描述之以植物為基礎的表現系統亦可具有數個特性例如，舉例來說，包含用於興趣基因或核苷酸序列的方便轉殖位點、可容易地以成本有效率的方式感染植物、可導致接種植物有效率的局部或系統性感染。此外，感染應提供有用蛋白質材料的良好產量。
此發明摘要不需描述本發明的所有特徵。
本發明係相關於植物中興趣蛋白質的表現。本發明亦提供植物中興趣蛋白質的生產方法與組成。
在下面的描述中，廣泛使用了許多用語，提供下列定義以促進本發明許多方面之了解。說明書中範例的使用，包括用語的範例，僅供說明的目的而不意圖限制本文發明之具體實施例的範圍與意義。
如本文中所使用的，當在本文使用單詞「一（a）」或「一個（an）」結合用語「包含」來使用時，可意指「一個」，但亦可與「一或更多」、「至少一」以及「一或多於一」的意義一致。該用語「大約」意指與所給數值約略+/-10%的變化。該用語「複數」意指多於一個，舉例來說，二或更多、三或更多、四或更多以及諸如此類。
本發明提供表現強化子，該表現強化子包含CPMV 5’ 非轉譯區域（UTR）、包含SEQ ID NO：1的X核苷酸的「CPMVX」，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 ，或包含與CPMVX介於80%至100%序列相似性的序列，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 。此表現強化子通常稱為CPMVX（見第1A圖）。
CPMVX強化子序列可進一步融合至填充序列，其中CPMVX包含SEQ ID NO：1的X核苷酸，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 ，或包含與CPMVX介於80%至100%序列相似性的序列，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 ，且填充序列包含融合至CPMVX序列的3’端之1-100核苷酸。舉例來說，填充序列可包含由大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100核苷酸，或其間任何數目的核苷酸。
若CPMVX序列包含填充片段，則此表現強化子可稱作CPMVX+（見第1A圖），其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150、114，它也可稱作包含填充序列的CPMVX，或當X分別=160、155、150、114時，它可稱作CPMV160+； CPMV155+；CPMV150+；CPMV114+。不含有填充序列之包含CPMVX的構築體可稱作CPMVX+，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150、114，且其中填充序列為長度0核苷酸。
填充序列可經由於核苷酸160之3’位置之天然CPMV5’UTR序列的截斷（truncation ）、刪除（deletion）或取代（replacement）來修飾。當與5’UTR相連接的初始或未修飾（即，天然的）填充序列相比較，經修飾的填充序列可被移除、取代、截斷或縮短（如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218中所描述）。填充序列可包含一或更多限制位點（多位點接頭區域（polylinker），多重轉殖位點，一或更多轉殖位點）、一或更多植物kozak序列、一或更多連接子序列、一或更多重組位點，或其組合。舉例來說而不應設想為限制，填充序列可包含串聯地融合至植物kozak序列之所需長度的多重轉殖位點。 填充序列不包含從位於 3’位置之天然5’UTR序列至天然CPMV 5’UTR序列之核苷酸160的核苷酸序列，舉例來說如Sainsbury F., 與 Lomonossoff G.P.（2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218；將其以引用的方式併入本文）的第1圖所顯示的核苷酸161至512，或SEQ ID NO：4的核苷酸161-509。也就是說，存在於先前技術CPMV HT序列（Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008的第1圖）中之不完整的M蛋白質於本發明中已由5’UTR移除。
表現強化子CPMVX或CPMVX+可於強化子序列的5’端與植物中具活性的調節區域被操作性地連接，並且於表現強化子的3’端操作性地連接至興趣核苷酸序列（第1A圖），以驅動植物宿主中興趣核苷酸序列的表現。
亦提供使用無論CPMVX或CPMVX+於植物中生產一或更多興趣蛋白質的表現系統。本文所描述的表現系統包括含有CPMVX，或含有與CPMVX有80%序列相似度的序列之表現卡匣，以及隨選地，含有融合至CPMVX（CPMVX+）的填充序列。包含CPMVX或CPMVX+的表現卡匣，可進一步包含在植物中具活性的調節區域，係操作性地連接至表現強化子的5’端。可將興趣核苷酸序列操作性地連接至表現卡匣的3’端，這樣當將其引入植物中時，實現植物宿主中興趣核苷酸序列的表現。
亦提供植物細胞、植物組織、整株植物、接種物、核酸、包含編碼興趣蛋白質的興趣核苷酸序列之構築體、包含如本文所描述之CPMVX或CPMVX+的表現卡匣或表現系統，以及在植物中表現興趣蛋白質的方法。
參考第1A圖、第1B圖與第1C圖，提供包括含有來自SEQ ID NO：1的X核苷酸之CPMV 5’ UTR（CPMVX）序列的表現強化子之非限制性範例，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 。當X =160、155、150或114時，表現強化子CPMVX亦可分別稱為CPMV160；CPMV155；CPMV150；CPMV114。
興趣核苷酸序列可採用多種方法被融合（操作性地連接）至包含植物調節區域的強化子序列。舉例來說，不將其視為限制：
1) 可將編碼興趣蛋白質的興趣核苷酸序列融合至表現強化子的3’端 緊接在5’UTR序列之後，舉例來說CPMVX，其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 核苷酸。在此範例中，將興趣核苷酸序列融合至5’UTR 而無多重轉殖位點，且興趣核苷酸序列可於其5’端緊接在興趣核苷酸序列ATG起始位點的上游包括植物kozak序列（見第1B圖）。由於SEQ ID NO：1的核苷酸150-160或155-160包含類似kozak序列，若X=160（即CPMV160），則操作性地連接至CPMV160的興趣核苷酸序列可不需植物kozak序列融合至其5’端。然而，若想要的話，植物kozak序列可包括至含有CPMV160的構築體中（見第1B圖：「+/-植物kozak」）。若X=155、150或114，則為了興趣核苷酸序列的最佳表現，建議在包含CPMV155、CPMV150或CPMV114的構築體中包括融合至興趣核苷酸序列5’端的植物kozak序列。
2)興趣核苷酸序列可被融合至CPMVX+表現強化子（其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 ），於表現強化子的3’端包含植物kozak序列，那麼此興趣核苷酸序列被置於緊接在植物kozak序列之後。在此範例中，融合至CPMVX+的興趣核苷酸序列將不會包括多重轉殖位點或植物kozak序列（生成的構築體將類似於第1B圖中展示者）。
3) 興趣核苷酸序列可被融合至CPMVX+表現強化子（其中X=SEQ ID NO：1的160、155、150或114 ），該表現強化子3’端包含多重轉殖位點（MCS），該興趣核苷酸序列係使用此多重轉殖位點融合至CPMVX+表現強化子。在此範例中，此興趣核苷酸序列可於其5’端包括相對應的序列，以容許與表現強化子的多重轉殖位點融合，以及緊接在興趣核苷酸序列ATG起始位點的上游植物kozak序列 （見第1C圖）。
使用任何上述方法的總體結果，為包含植物調節區域與含有核苷酸X的CPMV 5’UTR序列以操作關聯（操作性地連接）的構築體（或表現卡匣），其中X=SEQ ID NO：1（或包含與CPMV 5’UTR 序列具80%序列相似度的強化子序列）的160、155、150、114 ，CPMV 5’UTR 序列的3’端係融合至植物kozak序列的5’端，植物kozak序列的3’端融合並相鄰於包含ATG起始序列的興趣核苷酸序列之5’端。此構築體可能或可能不包含位於5’UTR 與植物kozak序列間的多重轉殖位點。 此構築體可進一步包含 3’ 非轉譯區（UTR）序列，舉例來說，豇豆花葉病毒3’ UTR ，或質體藍素3’ UTR，以及終止子序列，舉例來說NOS終止子，將其操作性地連接至興趣核苷酸序列的3’端（見第1A圖）。
亦提供包括含有調節區域的核酸之植物表現系統，該調節區域係與如本文描述的一或於多一的表現強化子（例如CPMVX）以及興趣核苷酸序列操作性地連接。此外，包含啟動子（調節區域）序列的核酸，該啟動子係與包含CPMV 5’UTR與經修飾或刪除的填充序列（例如CPMVX+）的表現強化子被描述，以及興趣核苷酸序列操作性地連接。此核酸可進一步包含編碼3’UTR的序列，舉例來說，豇豆花葉病毒3’ UTR ，或質體藍素3’ UTR ，以及包含終止子序列，舉例來說NOS終止子，這樣興趣核苷酸序列係於3’UTR 上游插入。
透過「操作性地連接」的意思是特定的序列直接或間接的交互作用，以進行應有的作用，例如核酸序列的表現之媒介或調節。操作性地連接的序列的交互作用可能，舉例來說，經由與操作性地連接之序列交互作用的蛋白質媒介。
「表現強化子」、「強化子序列」或「強化子元件」，如本文所述，包括衍生自或與來自RNA-2基因體片段的CPMV 5’UTR的部分共享序列相似性序列。強化子序列可增強下游被連接的異種開放讀取框架（ORF）的表現。
該用語「5’UTR」或「5’ 非轉譯區」或「5’ 引導序列」意指不被轉譯的mRNA 區域。5’UTR 典型地於轉錄起始位點開始並且剛好在編碼區域的轉譯起始位點或起始密碼子（在mRNA中通常為AUG，在DNA序列中為ATG）之前結束。5’UTR 的長度可經由突變例如5’UTR的取代作用（substitution）、刪除或插入來修飾。5’UTR可進一步經由將天然發生的起始密碼子或轉譯起始位點突變來修飾，這樣此密碼子不再作用為起始密碼子，而轉譯可於替代的起始位點開始。
來自CPMV RNA -2 序列（SEQ ID NO： 1）的核苷酸1-160的5’UTR，於轉錄起始位點開始至第一個符合譯讀框（in frame）起始開始密碼子（於位置161），其擔任由野生型豇豆花葉病毒屬的基因體片段編碼的較長兩羧基端蛋白質的生產之起始位點。此外在CPMV RNA-2基因體序列中於(或對應於)位置115的「第三」起始位點亦可被突變、刪除或以其他方式改變。已顯示在AUG 161的移除之外，當與不完整的M蛋白質結合時，AUG 115的移除增強了表現（Sainsbury and Lomonossoff, 2008,Plant Physiology;
148: 1212-1218; WO 2009/087391；將其以引用的方式併入本文）。
表現強化子可包括含有來自SEQ ID NO：1的X核苷酸的CPMV 5’ 非轉譯區 （UTR），其中X = SEQ ID NO：1的160、155、150或 114（CPMVX），或是包含與CPMVX（其中X = SEQ ID NO：1的160、155、150或 114；見第1A圖與第1B圖）80%序列相似度的序列，並且當與編碼異種開放讀取框架之相同核苷酸序列（該核苷酸序列係被操作性地連接至包含不完整M蛋白質的先前技術CPMV HT表現強化子）的表現相比較時，表現出增強編碼異種開放讀取框架的核苷酸序列（該核苷酸序列係被操作性地連接至此表現強化子）之表現的特性（如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218中描述；將其以引用的方式併入本文）。
亦可將CPMVX強化子序列融合至填充序列，舉例來說多重轉殖位點（MCS）或連接至植物kozak序列的MCS，其中CPMVX包含來自SEQ ID NO：1的X核苷酸，其中X=SEQ ID NO：1的 160、155、150或 114，或包含與CPMVX（其中X=SEQ ID NO：1的 160、155、150或 114）80%序列相似度的序列，並且當與編碼操作性地連接至包含不完整M蛋白質的先前技術CPMV HT強化子序列的異種開放讀取框架之相同序列相比較，展現出增強編碼操作性地連接至表現強化子的異種開放讀取框架的核苷酸序列之表現的特性（如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218中描述；將其以引用的方式併入本文）。該填充序列包含融合至CPMVX序列3’端的0-500核苷酸 。優選地，填充序列包含多重轉殖位點（MCS），或連接至植物kozak序列的MCS，並且不包括M蛋白質。若CPMVX序列包含填充片段（不帶有M蛋白質），則此表現強化子可稱作 「CPMVX+」 （見第1A圖與第1C圖）、稱作「包含填充序列與植物kozak序列的CPMVX」或稱作「包含MCS連同植物kozak序列的CPMVX」。
表現強化子CPMVX，其中X=160，由SEQ ID NO： 1的核苷酸1-160組成： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca （SEQ ID NO：1）
若表現強化子由SEQ ID NO：1的核苷酸1-160組成（CPMV160），則可將位於5’端鄰近起始序列(ATG)處帶有或不帶有5’植物kozak序列的興趣核苷酸序列 融合至5’UTR 的3’端（在SEQ ID NO：1的核苷酸160後），使得整個構築體類似第1B圖所顯示者（CPMV160）。包含CPMV160的構築體可進一步包含操作性地連接至表現強化子的5’端之調節區域，以及包含編碼3’UTR的序列，舉例來說豇豆花葉病毒3’ 非轉譯區 （UTR），或質體藍素3’ UTR ，以及包含融合至興趣核苷酸序列3’端的終止子序列，舉例來說NOS終止子。不希望受到理論束縛，CPMV160可不需植物 kozak序列加入到興趣核苷酸序列的5’ 端，因為位於SEQ ID NO：1位置150-155、155-160或150-160的序列在植物中可作用為具活性的（天然的）kozak序列。構築體編號1935（見範例3）以及構築體編號1885（見範例6）為以CPMV160（CPMVX，其中X=160）為基礎之構築體的範例。
表現強化子可包含CPMVX+，其中X=160。此類強化子的非限制性範例為包含SEQ ID NO：2（5’UTR：核苷酸 1-160；多重轉殖位點以斜體，核苷酸161-176；植物kozak序列以大寫及粗體，核苷酸177-181）的序列之CPMV160+（見第1C圖）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtacagggcccaata ccgcgg
A GAA
181 A
（SEQ ID NO：2）
使用SEQ ID NO：2作為表現強化子的構築體範例包括構築體1800、1897、1880、2168、2188、1937、1977、2050、2060、1975、1893、2100、2109、2120、2129 （分別見範例 3以及5-18）。
如對本領域的技術人員將是顯而易見地，可使用任何多重轉殖位點 （MCS）或不同長度的MCS（無論是更短或更長）以取代SEQ ID NO：2的核苷酸161-176的序列。此外，SEQ ID NO：2的植物kozak序列（於核苷酸177-181顯示）可為任何植物kozak序列，其包括但不限於選自SEQ ID NO：5-17的序列中的一者（亦見第4A圖；第4圖的構築體包括SEQ ID NO：2，其伴隨如表示的植物kozak序列之變異，並且包含連接至5’UTR的5’端之植物調節區域，以及興趣核苷酸序列的轉錄起始位點，位於植物kozak序列3’端的ATG）。
表現強化子CPMVX可於位置115包括「A」（115A），使得 CPMVX，115A，其中X=160、155或150，包含野生型CPMV RNA2基因體的序列（見 WO 2009/087391，將其以引用的方式併入本文，用於野生型CPMV RNA-2基因體片段的完整序列）。表現強化子CPMVX，115A的範例為「CPMV160，115A」，如SEQ ID NO： 69所定義的（「A」係以粗體與底線顯示）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgca
tgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca （SEQ ID NO：69）
表現強化子CPMVX+亦可於位置115包括「A」 （115A），使得 CPMVX+，115A，其中X=160、155或150，可包含野生型CPMV RNA2基因體的序列（WO 2009/087391，將其以引用的方式併入本文）。表現強化子CPMVX+，115A的非限制性範例為「CPMV160+，115A」，如由SEQ ID NO： 75所定義的（「A」係以粗體與底線顯示）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgca
tgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtacagggcccaata ccgcgg
A GAA
181 A
（SEQ ID NO：75）
如上述對於SEQ ID NO：2，可使用任何MCS或不同長度的MCS取代SEQ ID NO：75的MCS序列，並且植物kozak序列可為任何植物kozak序列。
若表現強化子由SEQ ID NO：1的核苷酸1-155所組成（CPMV155）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg cacca （SEQ ID NO：24）， 則可將位於5’端鄰近起始序列（ATG）處帶有5’植物kozak序列的興趣核苷酸序列 融合至5’UTR 的3’端（在SEQ ID NO：1的核苷酸155後），使得整個構築體類似第1B圖所顯示者（CPMV155）。包含CPMV155的構築體可進一步包含操作性地連接至表現強化子的5’端之調節區域，以及包含編碼3’UTR的序列，舉例來說豇豆花葉病毒3’ 非轉譯區 （UTR），或質體藍素3’ UTR，以及包含融合至興趣核苷酸序列3’端的終止子序列，舉例來說NOS終止子。在此範例中，由於天然kozak序列或此序列的部分（SEQ ID NO：1的核苷酸155-160）被移除，興趣核苷酸序列於其5’端包含植物kozak序列。
表現強化子可包含CPMV155+，其包含SEQ ID NO：72的序列（5’UTR：核苷酸 1-155；多重轉殖位點以斜體，核苷酸156-171；植物kozak序列以大寫及粗體，核苷酸172-176）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagggcc caataccgcg g AGAAA
（SEQ ID NO：72）
如上述對於CPMV160+（SEQ ID NO：2），任何MCS，包括不同長度的MCS可被使用以取代SEQ ID NO：72的MCS序列，並且植物kozak序列可為任何植物kozak序列。
表現強化子CPMV155可包括於位置115的「A」（115A），使得 「CPMV155，115A」包含野生型CPMV RNA2基因體的序列（見WO 2009/087391，將其以引用的方式併入本文），如由SEQ ID NO： 70所定義的（「A」係以粗體與底線顯示）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgca
tgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg cacca （SEQ ID NO：70）
表現強化子CPMV155+亦可包括於位置115的「A」 （115A），使得 「CPMV155+，115A」包含野生型CPMV RNA2基因體的序列（見WO 2009/087391，將其以引用的方式併入本文），如由SEQ ID NO： 76所定義的（「A」係以粗體與底線顯示）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgca
tgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagggcc caataccgcg g
A GAA
181 A
（SEQ ID NO：76）
如上述對於SEQ ID NO：2，任何MCS或不同長度的MCS可被使用以取代SEQ ID NO：76的MCS序列，並且植物kozak序列可為任何植物kozak序列。
若表現強化子由SEQ ID NO：1的核苷酸1-150所組成（CPMV150）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg （SEQ ID NO：27）， 則可將位於5’端鄰近起始序列（ATG）處帶有5’植物kozak序列的興趣核苷酸序列 融合至5’UTR 的3’端（在SEQ ID NO：1的核苷酸150後），使得整個構築體類似第1B圖所顯示者（CPMV150）。包含CPMV150的構築體可進一步包含操作性地連接至表現強化子的5’端之調節區域，以及包含編碼3’UTR的序列，舉例來說豇豆花葉病毒3’ 非轉譯區 （UTR），或質體藍素3’ UTR ，以及包含融合至興趣核苷酸序列3’端的終止子序列，舉例來說NOS終止子。在此範例中，由於天然kozak序列於位置SEQ ID NO：1的核苷酸150-160被移除，興趣核苷酸序列於其5’端包含植物kozak序列。
表現強化子可包含CPMV150+，其包含SEQ ID NO：73的序列（5’UTR：核苷酸 1-150；多重轉殖位點以斜體，核苷酸156-166；植物kozak序列以大寫及粗體，核苷酸167-171）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc
gtgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgggggcccaata ccgcgg AGAA A
（SEQ ID NO：73）
如上述對於CPMV160+（SEQ ID NO：2），任何MCS，包括不同長度的MCS可被使用以取代SEQ ID NO：73的MCS序列，並且植物kozak序列可為任何植物kozak序列。
表現強化子CPMV150可包括於位置115的「A」 （115A），使得 「CPMV150，115A」包含野生型CPMV RNA2基因體的序列（見WO 2009/087391，將其以引用的方式併入本文），如由SEQ ID NO： 71所定義的（「A」係以粗體與底線顯示）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgca
tgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg （SEQ ID NO：71）
表現強化子CPMV150+亦可包括於位置115的「A」 （115A），使得 「CPMV150+，115A」包含野生型CPMV RNA2基因體的序列（見WO 2009/087391，將其以引用的方式併入本文），如由SEQ ID NO： 77所定義的（「A」係以粗體與底線顯示）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgca
tgagc 121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgggggcccaata ccgcgg
A GAA
181 A
（SEQ ID NO：77）
如上述對於SEQ ID NO：2，任何MCS或不同長度的MCS可被使用以取代SEQ ID NO：77的MCS序列，並且植物kozak序列可為任何植物kozak序列。
若表現強化子由SEQ ID NO：1的核苷酸1-114所組成： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc （SEQ ID NO：68） 則可將位於5’端鄰近起始序列（ATG）處帶有5’植物kozak序列的興趣核苷酸序列 融合至5’UTR 的3’端（在SEQ ID NO：1的核苷酸114後），使得整個構築體類似第1B圖所顯示者（CPMV114）。包含CPMV114的構築體可進一步包含操作性地連接至表現強化子的5’端之調節區域，以及包含編碼3’UTR的序列，舉例來說豇豆花葉病毒3’ 非轉譯區 （UTR），或質體藍素3’ UTR ，以及包含融合至興趣核苷酸序列3’端的終止子序列，舉例來說NOS終止子。在此範例中，由於有類kozak序列在SEQ ID NO：1的核苷酸114的5’，興趣核苷酸序列於其5’端包含植物kozak序列。
表現強化子可包含CPMV114+，其包含SEQ ID NO：74的序列（5’UTR：核苷酸 1-114；多重轉殖位點以斜體，核苷酸115-130；植物kozak序列以大寫及粗體，核苷酸131-135）： 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc gggccc
121aataccgcgg AGAAA
（SEQ ID NO：74）
如上述對於CPMV160+ （SEQ ID NO：2），任何MCS或不同長度的MCS可被使用以取代SEQ ID NO：73的MCS序列，並且植物kozak序列可為任何植物kozak序列。
表現強化子亦可包含SEQ ID NO： 1的核苷酸1-160，其與位在SEQ ID NO： 1的核苷酸160位置下游的植物kozak序列融合。植物kozak序列可位於緊鄰SEQ ID NO： 1的核苷酸160，或表現強化子可包含約0至約500核苷酸或其間的任何數量的填充片段，其位於緊鄰SEQ ID NO： 1的核苷酸160（CPMVX+） 以及連接至填充片段3’端的植物kozak序列。填充片段可包含大約4至100核苷酸或其間的任何數量的多重轉殖位點 （MCS），且包含植物kozak序列的興趣核苷酸序列與在其5’端之相對應的轉殖位點 可使用MCS而操作性地連接至CPMVX表現強化子，或者填充片段可包含融合至植物kozak序列的大約4至100核苷酸的多重轉殖位點，且可將興趣核苷酸序列融合至緊接植物kozak序列下游的表現強化子。優選地，填充片段不包含編碼M蛋白質的序列。
不被視為限制的一個構築體範例為CPMV160+，其串聯地包含融合至CPMV 5’UTR的植物調節區域，該構築體係由融合至填充片段的SEQ ID NO：1之1-160核苷酸組成，如第1C圖所顯示（在第1C圖中，為清楚起見亦顯示興趣核苷酸序列 「GOI」的ATG起始位點）。在此範例中，填充片段係融合至CPMV 1-160序列的3’端，並且串聯地包含融合至植物kozak序列的多重轉殖位點（在此不被視作限制的範例中，該植物kozak序列為：AGAAA）。填充片段不包含編碼M蛋白質的任何序列。若CPMV160+構築體融合至興趣核苷酸序列（如第1C圖中所顯示地），則植物kozak序列位於興趣核苷酸序列的5’ ，並且鄰近於興趣核苷酸序列的ATG起始位點。如本領域的技術人員將理解的，該多重轉殖位點可包含一或多於一個適合的限制位點，且多重轉殖位點的序列不限於第1C圖中所顯示的範例。此外，植物kozak序列可為任何植物kozak序列，並且不限於第1C圖中所顯示的序列。構築體編號1800、1897、1880、2168、2188、1937、1977、2050、2060、1975、1893、2100、2109、2120、2129 （分別見範例3，以及範例5-18）為以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160 ）為基礎的構築體範例。
在第1C圖中亦顯示的是表現強化子CPMV155+、CPMV150+以及CPMV114+的範例，其每個分別包含SEQ ID NO：1的核苷酸1-155、1-150或1-114，以如對於上述CPMV160+描述的類似方式融合至填充片段。在第1C圖中，興趣核苷酸序列（GOI）的ATG起始位點亦於CPMV155+、CPMV150+以及CPMV114+的每一者顯示。在這些範例中，填充片段被融合至CPMV強化子序列的3’端，其串聯地包含融合至植物kozak序列的多重轉殖位點。填充片段不包含任何編碼M蛋白質的序列。 如本領域的技術人員將理解地，此多重轉殖位點可包含一或多於一適合的限制位點，且此多重轉殖位點的序列不限於第1C圖中所顯示的範例。此外，植物kozak序列可為任何植物的kozak序列，且不限於第1C圖中所顯示的序列（AGAAA）。
表現強化子亦可包含表現強化子CPMVX，其中SEQ ID NO： 1的X=160、155、150或114，與多重轉殖位點（多位點接頭區域，限制位點；轉殖位點）組合而融合至5’UTR 序列的3’端，並且缺乏植物kozak序列（即，CPMVX+，其中X=SEQ ID NO： 1的160、155、150或114）。在這些情況中要被連接至強化子的編碼興趣蛋白質之核酸序列（興趣核苷酸序列）由興趣核苷酸序列的5’端至3’端將串聯地包含融合至位於上游並鄰近興趣核苷酸序列的ATG起始位點（轉錄起始位點）的植物kozak序列的多重轉殖位點（與填充片段的多重轉殖位點互補；填充片段不包含任何編碼M蛋白質的序列）。
表現強化子可進一步包含一或更多「kozak一致性序列（kozak consensus sequence）」或「kozak序列」。Kozak序列在轉譯的起始扮演主要角色。 轉譯的速率可經由確保任何mRNA不穩定序列已從轉基因構築體消除以及轉譯開始位點或起始位點與植物的Kozak一致性相配（Gutierrrez, R.A. et al., 1999, Trends Plant Sci. 4, 429–438；Kawaguchi, R. and Bailey-Serres, J., 2002, Curr. Opin. Plant Biol. 5, 460–465）而最佳化。在此單元中最高度保留的位置為在ATG密碼子上游三個核苷酸的嘌呤（最常見者為A），其表示轉譯的開始（Kozak, M., 1987, J. Mol. Biol. 20:947-950，將其併入本文所作為參考）。植物Kozak一致性序列為本領域已知的（見例如Rangan et al. Mol. Biotechnol., 2008, July 39(3), pp. 207-213）。天然發生的與合成的Kozak序列兩者皆可使用於表現強化子或可融合至如本文所描述的興趣核苷酸序列 。
植物kozak序列可為任何已知的植物kozak序列（見例如L. Rangan et. al. Mol. Biotechnol., 2008, July 39(3), pp. 207-213），其包括但不限於下列的植物一致性序列（consensus sequence）： caA(A/C)a （SEQ ID NO：5；植物界） aaA(A/C)a （SEQ ID NO：6；雙子葉植物） aa(A/G)(A/C)a （SEQ ID NO：7；阿拉伯芥）
植物kozak序列亦可選自（見第4圖）： AGAAA （SEQ ID NO： 8） AGACA （SEQ ID NO： 9） AGGAA （SEQ ID NO： 10） AAAAA （SEQ ID NO： 11） AAACA （SEQ ID NO： 12） AAGCA （SEQ ID NO： 13） AAGAA （SEQ ID NO： 14） AAAGAA （SEQ ID NO： 15） AAAGAA （SEQ ID NO： 16） (A/-)A(A/G)(A/G)(A/C)A. （SEQ ID NO： 3；一致性序列） 之群組。
表現強化子可進一步包含一或更多「限制位點」或「限制辨識位點」、「多重轉殖位點」、「MCS」、「轉殖位點」、「多位點接頭序列」或「多位點接頭」，以促成興趣核苷酸的插入至植物表現系統。限制酵素位點為被如本領域所熟知的限制酵素辨識的特定序列單元。表現強化子可包含位於5’UTR下游（3’）的一或更多限制位點或轉殖位點。此一或更多限制位點或轉殖位點可進一步位於一或更多kozak序列的上游（5’），並且位於5’ UTR 與kozak序列之間。多位點接頭序列（多重轉殖位點）可包含任何對加入與移除包括編碼興趣蛋白質的核苷酸序列之核酸序列至5’UTR的3’端有用的核酸序列。多位點接頭區域序列可包含由4至約100或其間的任何數量的核酸。
表現強化子亦可包含與植物調節區域操作性連接的SEQ ID NO：1的序列以及融合至興趣核苷酸序列（GOI）的轉錄起始位點（ATG），如第1B圖中所顯示的（CPMVX；其中X=160、155、150或114）。 CPMVX 亦可包含任何植物kozak序列，其包括但不限於SEQ ID NO：5-17序列中的一者。
用於本文所描述的表現強化子（CPMVX 或 CPMVX+，其中X=160、155、150或144）之5’UTR，可衍生自雙向RNA病毒，例如，來自雙向RNA病毒例如豇豆花葉病毒屬的RNA-2基因體區段，條件是它表現出與前述的SEQ ID NO：1 與 2任一者100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85% 或80%一致。舉例來說強化子序列可具有與SEQ ID NO：1 與 2的序列從大約80%至大約100%或其間的任何量的一致、與SEQ ID NO：1 與 2的序列從大約90%至大約100%或其間的任何量的一致、與SEQ ID NO：1 與 2的序列從大約95%至大約100%或其間的任何量的一致、與SEQ ID NO：1 與 2的序列從大約98%至大約100%或其間的任何量的一致，其中當表現強化子操作性地連接至如本文所描述的植物調節區域以及植物kozak序列時，比起使用相同的植物調節區域而融合至CPMV HT的興趣核苷酸序列（SEQ ID NO：4；如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P.,2008,Plant Physiol.148：pp.1212-1218中所描述的包含不完整M蛋白質的先前技術強化子序列；將其以引用的方式併入本文)的表現量，操作性地連接至表現強化子的興趣核苷酸序列的表現量增加。
SEQ ID NO：4包含如先前技術已知的CPMV HT表現強化子(例如Sainsbury and Lomonossoff 2008,Plant Physiol.148：pp.1212-1218的第1圖；將其以引用的方式併入本文)。「CPMV HT」包括來自SEQ ID NO：4的核苷酸1-160的序列伴隨在位置115(gtg)與162(cgt)的修飾核苷酸，以及不完整的M蛋白質，並且缺乏植物kozak序列(5’UTR：核苷酸1-160；不完整的M蛋白質下加底線，核苷酸161-509)。SEQ ID NO：4亦包括不存在於先前技術的CPMV HT序列多重轉殖位點(斜體，核苷酸510-528)：
SEQ ID NO：4
包含CPMV HT的構築體在本文中使用作為參考構築體，以便可比較興趣核苷酸序列的表現量或由使用包含CPMVX或CPMVX+的構築體生產的興趣核苷酸序列編碼產物。構築體1391、484、489、2140、2130、1039、1067、2072、2074、1445、1454、5001、5002、5021 與5022 （分別見範例1與5-18）包含參考構築體CPMV HT。
如第2圖至第5圖所顯示，如本文所描述的表現強化子的用途造成當相較於使用相同啟動子與3’UTR與終止子序列之相同興趣核苷酸序列下的表現，興趣核苷酸序列的表現增加。舉例來說，參考第2圖、第3圖與第5圖，顯示了包含CPMV-HT（先前技術）表現構築體與CPMV160+為基礎的表現構築體之植物中所生產蛋白質表現的比較 ，其中構築體係操作性地連接至： H1 A/加州/07/2009（「PDI-H1 Cal」或「H1 A/加州/07/2009」）：以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1897、以CPMV HT 為基礎的構築體編號484 （見範例5）； H3 A/維多利亞/361/2011（「PDI-H3 Vic」或「H3 A/維多利亞/361/2011」）： 以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1800； 以CPMV HT 為基礎的構築體編號1391（分別見範例1與範例2）； 來自帶有天然信號肽的流感 A/印尼/5/2005之H5（WtSp-H5 Indo）： 以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1880；以CPMV HT 為基礎的構築體編號489 （見範例6）； 帶有刪除的蛋白水解環以及帶有天然信號肽的B/威斯康辛/1/2010（「WtSp-B Wis-PrL」或「B/威斯康辛/1/2010」）： 以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1975；以CPMV HT 為基礎的構築體編號1445 （見範例13）； 帶有刪除的蛋白水解環以及帶有PDI信號肽的B 布里斯本/60/08（「B 布里斯本/60/08」）：以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1937； 以CPMV HT 為基礎的構築體編號1039 （見範例9）； 帶有融合至穿膜區與胞質尾之刪除的蛋白水解環以及帶有PDI信號肽的B 布里斯本/60/08+H1Tm（「B 布里斯本/60/08+H1Tm」）： 以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1977；以CPMV HT 為基礎的構築體1067 （見範例10）、 帶有刪除的蛋白水解環以及帶有PDI信號肽的B 麻薩諸塞/2/2012 2012（「B 麻薩諸塞/2/2012 2012」）：以CPMV160+ 為基礎的構築體編號2050；以CPMV HT 為基礎的構築體編號2072 （ 見範例11）、 帶有融合至穿膜區與胞質尾之刪除的蛋白水解環以及帶有PDI信號肽的B 麻薩諸塞/2/2012+H1Tm（「B 麻薩諸塞/2/2012+H1Tm」）：以CPMV160+ 為基礎的構築體編號2060；以CPMV HT 為基礎的構築體2074 （見範例12）、 帶有融合至穿膜區與胞質尾之刪除的蛋白水解環以及帶有天然信號肽的B 威斯康辛/1/2010+H1Tm（「B 威斯康辛/1/2010+H1Tm」）：以CPMV160+ 為基礎的構築體編號1893；以 CPMV HT 為基礎的構築體1454 （見範例14）； 伴隨天然或PDI信號肽在CPMV-HT控制下的利妥昔單抗（Rituxan）（「CPMV-HT/野生型 SP」 以及 「CPMV-HT/PDISP」；構築體編號5001 與 5002，分別見範例15與16）或CPMV160+ （「CPMV160+/野生型SP」 與 「CPMV160+/PDISP」； 構築體編號2100 與 2109，分別見範例15 與 16）。
在每個情況下，當與對於先前技術CPMV為基礎的構築體的表現相比較，在CPMV160+為基礎的構築體中的表現（視情況可以是以血球凝集作用活性或利妥昔單抗（Rituxan）表現測定）增加。此外，數個興趣核苷酸序列 編碼的嵌合或修飾蛋白質，舉例來說包含異種信號肽（例如PDI）、異種穿膜區域胞質尾 序列（TDCT）及/或經修飾的序列包括刪除的蛋白水解環（PrL-）。
若使用於上述CPMV160+為基礎之構築體的植物kozak序列被以其他植物kozak序列，例如在SEQ ID NO：8-16中所定義的那些植物kozak序列中的一者替代，亦觀察到使用以CPMV160+為基礎之構築體觀察到的表現增加。舉例來說，參考第4圖，顯示了包含以CPMV160+ 為基礎的表現構築體的植物中生產的蛋白質表現的比較，該構築體係與興趣核苷酸序列（H3 A/維多利亞/361）操作性地連接，每個皆與各種植物kozak序列融合。在每個情況下，以CPMV160+為基礎的構築體顯示的表現（以血球凝集作用滴定量測定）顯著的表現量並且多於先前技術以CPMV HT為基礎的構築體。
該用語「相似百分比（percent similarity）」或「一致性百分比（percent identity）」當使用參考的特定序列時，例如University of Wisconsin GCG軟體程式中闡述的，或經由手工比對與目視檢查（見，例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement）。用於比較的序列比對方式為本領域熟知的。可以使用例如Smith & Waterman演算法（1981, Adv. Appl. Math. 2:482）、經由Needleman & Wunsch的比對演算法（1970, J. Mol. Biol. 48:443）、經由Pearson & Lipman的搜尋相似度方法（1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444）、經由這些演算法的電腦化執行（舉例來說：GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group （GCG）, 575 Science Dr., Madison, Wis.）來進行比較的最佳序列比對。
適合用於測定序列一致性百分比與序列相似度的演算法範例為BLAST 與 BLAST 2.0 演算法，其分別在Altschul et al.（1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402）與Altschul et al.（1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）中描述。使用BLAST 與 BLAST 2.0 ，伴隨本文所描述之參數，以測定本發明之核酸與蛋白質的序列一致性百分比。舉例來說，可使用BLASTN 程式（用於核苷酸序列）字長（W） 11、期望值 （E） 10、M=5、N= -4以及兩股的比較作為預設值。對於胺基酸序列，可使用BLASTP程式字長3與期望值（E）10作為預設值，以及BLOSUM62 得分矩陣（見Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）對齊 （B） 50、期望值 （E） 10、M=5、N= -4以及兩股的比較作為預設值。執行BLAST分析的軟體係透過國家生物科技資料中心（National Center for Biotechnology Information）而為公開提供的（見URL：ncbi.nlm.nih.gov/）。
編碼蛋白質的興趣核苷酸序列需要位於要表現的基因上游之「轉譯起始位點（translation initiation site）」或「起始位點（initiation site）」或「轉譯開始位點（translation start site）」或「開始位點（start site）」「開始密碼子（start codon）」的存在。此類起始位點可以無論是作為強化子序列的一部分或作為編碼興趣蛋白質的核苷酸序列的一部分來提供。
「表現卡匣（expression cassette）」意指在宿主細胞中興趣核酸轉錄的適當啟動子或其他調節元件的控制下與可操作地（操作性地）連接之包含興趣核酸的核苷酸序列 。
由「蛋白水解環（proteolytic loop）」或「切割位點（cleavage site）」意指涉及前驅物HA0切割之蛋白水解位點的一致序列。「一致（consensus）」或「一致序列（consensus sequence）」如本文所使用，意指包含根據多種序列，例如特定流感亞型的HA0序列之比對分析而得的相關序列之序列變異性的序列（無論是胺基酸或核苷酸序列）。流感HA0切割位點的一致序列可包括A型流感一致血球凝集素胺基酸序列，其包括例如一致的H1、一致的H3、一致的H5或B型流感一致血球凝集素胺基酸序列，例如但不限於B佛羅里達、B馬來西亞、B 威斯康辛 以及 B 麻薩諸塞。蛋白水解環區域的序列之非限制性範例係顯示於US臨時申請案編號No.61/806,227的第15圖與第18B圖（於2013年3月28日申請，將其以引用的方式併入本文；亦可見Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79:7380-7388；將其以引用的方式併入本文）。
蛋白水解環或切割位點中的殘基可能為突變，舉例來說但不限於，點突變、取代、插入或刪除。該用語「胺基酸突變（amino acid mutation）」或「胺基酸修飾（amino acid modification）」如本文所使用，係意指包含胺基酸取代、刪除、插入與修飾。可如US臨時申請案編號No.61/806,227中描述（於2013年3月28日申請，將其以引用的方式併入本文）行任何組合的取代、刪除、插入與修飾，以達到最終的構築體，前提是最終的構築體具有所需的特性，例如蛋白水解環或切割位點被蛋白酶的切割降低或消除。
如本文所描述，提供了包含與編碼興趣蛋白質的興趣核苷酸序列操作性地連接之表現強化子序列的核酸構築體（表現系統）。亦提供的是包含如本文所描述之強化子序列的植物表現系統。亦提供的是包含植物調節區域的植物表現系統，其與操作性地連接至編碼興趣蛋白質的興趣核苷酸序列之強化子序列在操作上相關聯。強化子序列可選自SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者，或表現與SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者所闡述的序列100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85% 或80%一致性的核苷酸序列，其中當操作性地連接至如本文所描述的植物調節區域與植物kozak序列時，在與融合至CPMV HT（SEQ ID NO：4；如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218中描述的包含不完整M蛋白質之先前技術的強化子序列；將其以引用的方式併入本文）使用相同植物調節區域的興趣核苷酸序列之表現量比較時，此表現強化子增加操作性地連接至表現強化子的興趣核苷酸序列的表現量。
本發明的強化子序列可用以在宿主生物體例如植物中表現興趣蛋白質。在此情況下，興趣蛋白質亦可與所討論的宿主生物體為異種的，並且可以使用本領域已知的轉形技術引入至植物細胞中。在生物體中的異種基因可取代內源性相等物基因，即正常地執行相同或類似功能的基因，或者插入的序列可附加至內源性基因或其他基因。
操作性地連接至興趣核苷酸序列的強化子序列亦可被操作性地連接至啟動子，或植物調節區域，以及3’UTR與終止子序列。強化子序列可由舉例來說SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者，或表現與SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者所闡述的序列100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85% 或80%一致性的核苷酸序列來定義。因此，興趣核苷酸序列係位於強化子序列與終止序列之間（見第1A圖）。無論表現強化子或興趣核苷酸序列 可包含植物kozak序列。
本發明進一步提供串聯地包含啟動子或操作性地連接至如本文所描述的表現強化子序列之植物調節區域，該表現強化子序列係與興趣核苷酸序列融合、3’UTR序列，以及終止子序列的表現卡匣。強化子序列可由舉例來說SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者，或表現與SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者所闡述的序列100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85% 或80%一致性的核苷酸序列來定義。無論表現強化子或興趣核苷酸序列 可包含植物kozak序列。
本領域的技術人員將理解的，終止（終止子）序列可為在植物宿主中具活性的任何序列，舉例來說終止序列可衍生自雙向RNA病毒例如豇豆花葉病毒的RNA-2基因體片段，或終止序列可為NOS終止子。
本發明的構築體可進一步包含3’ 非轉譯區（UTR）。3’ 非轉譯區包含多腺核苷酸化（polyadenylation）信號以及任何能夠影響mRNA處理或基因表現的其他調節信號。多腺核苷酸化信號經常以影響多腺核苷酸徑跡的加入至mRNA前驅物的3’端為特徵。多腺核苷酸化信號一般由對標準形式5’ AATAAA-3’同源性的存在來確認，雖然變化並不少見。適合的3’區域的非限制性範例為包含農桿菌腫瘤誘發（Agrobacterium
tumor inducing（Ti））質體基因之多腺核苷酸化信號的3’轉錄非轉譯區域，其基因例如胭脂鹼合成酶（Nos基因）以及植物基因例如大豆儲存蛋白基因、核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶基因（ssRUBISCO；US 4,962,028；將其以引用的方式併入本文）的小次單元，其為在調節質體藍素表現所使用的啟動子（Pwee and Gray 1993；將其以引用的方式併入本文）。終止（終止子）序列可由苜蓿草質體藍素基因的3’UTR獲得。
由「興趣核苷酸（或核酸）序列」或「興趣編碼區域」意指在宿主生物體內例如植物要被表現的任何核苷酸序列或編碼區域（這些用語可交替使用），以生產興趣蛋白質。此類興趣核苷酸序列可編碼但不限於天然的或經修飾的蛋白質、工業酶或經修飾的工業酶、農業蛋白質或經修飾的農業蛋白質、輔助蛋白質、蛋白質補充劑、藥學上具活性的蛋白質、營養食品、增值產品，或者用於飼料、食品或用於飼料與食品兩者的其片段。
興趣蛋白質可包含天然的或非天然的信號肽；非天然的信號肽可以是植物來源。舉例來說，信號肽可以是蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽 （PDI）。天然信號肽可與被表現的興趣蛋白質的信號肽相對應。
興趣核苷酸序列或興趣編碼區域亦可包括編碼藥學上具活性的蛋白質之核苷酸序列，該蛋白質例如生長因子、生長調節劑、抗體、抗原以及對於免疫或接種有用的其片段或其衍生物以及諸如此類。此類蛋白質包括但不限於人類病原體、病毒蛋白質，舉例來說但不限於，VLP形成抗原、來自呼吸系融合細胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）、輪狀病毒、流感病毒、人類免疫缺乏病毒（HIV）、狂犬病病毒、人類乳突瘤病毒（HPV）、腸病毒71型（EV71）的一或更多蛋白質，或白細胞介素（interleukin），舉例來說IL-1至IL-24、IL-26與IL-27中的一或多於一者、細胞介素、促紅血球形成素（EPO）、胰島素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或其組合物、 干擾素，舉例來說干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、凝血因子，舉例來說因子VIII、因子IX或tPA Hgh、受體、受體促效劑、抗體例如但不限於利妥昔單抗（Rituxan）、神經多肽（neuropolypeptide）、胰島素、疫苗、生長因子例如但不限於表皮生長因子、角質細胞生長因子、轉化生長因子、生長調節劑、抗原、自體抗原、其片段或其組合。
興趣蛋白質亦可包括流感血球凝集素（HA；見WO 2009/009876，將其以引用的方式併入本文）。HA為同源三聚體膜第一型糖蛋白（homotrimeric membrane type I glycoprotein），一般來說包含信號肽、HA1區域，以及於C端包含跨膜錨定位點（membrane-spanning anchor site）的HA2區域，以及小的胞質尾。編碼HA的核苷酸序列是為人熟知且可取得的（見，舉例來說，生物防禦與公共衛生資料庫（流感研究資料庫； Squires et al., 2008 Nucleic Acids Research 36:D497-D503）於URL：biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza；或由國家生物科技資料中心（National Center for Biotechnology Information）維護的資料庫（見 URL：ncbi.nlm.nih.gov），其兩者皆以引用的方式併入本文）。
HA蛋白質可以是流感A型的、流感B型的或為流感A型選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15與H16之群組的亞型之HA。在本發明的一些方面 ，HA可以是來自流感A型，選自H1、H2、H3、H5、H6、H7與H9之群組。上述列出的HA片段亦視為興趣蛋白質。此外，可結合來自HA上述所列的型或亞型之區域，以產生嵌合HA（見例如WO2009/076778，將其以引用的方式併入本文）。
包含HA蛋白質的亞型之範例包括A/新喀里多尼亞/20/99 （H1N1）、A/印尼/5/2006 （H5N1）、A/雞/紐約/1995、A/鯡鷗/DE/677/88 （H2N8）、A/德州/32/2003、A/綠頭鴨/MN/33/00、A/鴨/上海/1/2000、A/尖尾鴨/TX/828189/02、A/火雞/安大略省/6118/68（H8N4）、A/琵嘴鴨/伊朗/G54/03、A/雞/德國/N/1949（H10N7）、A/鴨/英國/56（H11N6）、A/鴨/亞伯達/60/76（H12N5）、A/鷗/馬里蘭州/704/77（H13N6）、A/綠頭鴨/Gurjev/263/82、A/鴨/澳洲/341/83 （H15N8）、A/紅嘴鷗/瑞典/5/99（H16N3）、B/Lee/40、C/約翰尼斯堡/66、A/波多黎各/8/34 （H1N1）、A/布里斯本/59/2007 （H1N1）、A/所羅門群島 3/2006 （H1N1）、A/布里斯本 10/2007 （H3N2）、A/威斯康辛/67/2005 （H3N2）、B/馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達/4/2006、A/新加坡/1/57 （H2N2）、A/安徽/1/2005 （H5N1）、A/越南/1194/2004 （H5N1）、A/水鴨/香港/W312/97 （H6N1）、A/馬/布拉格/56 （H7N7）、A/香港/1073/99 （H9N2）。
HA蛋白質可以為H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亞型。舉例來說，H1蛋白質可來自A/新喀里多尼亞/20/99 （H1N1）、A/波多黎各/8/34 （H1N1）、A/布里斯本/59/2007 （H1N1）、A/所羅門群島3/2006 （H1N1）、A/加州/04/2009 （H1N1） 或 A/加州/07/2009 （H1N1） 病毒株。H3蛋白質亦可以是來自A/布里斯本 10/2007 （H3N2）、A/威斯康辛/67/2005 （H3N2）、A/維多利亞/361/2011 （H3N2）、A/德州/50/2012 （H3N2）、A/夏威夷/22/2012 （H3N2）、A/紐約/39/2012 （H3N2）或 A/伯斯/16/2009 （H3N2） 病毒株。在本發明的進一步方面，H2蛋白質可以是來自A/新加坡/1/57 （H2N2） 病毒株。H5蛋白質可以是來自A/安徽/1/2005 （H5N1）、A/越南/1194/2004 （H5N1）或A/印尼/5/2005 病毒株。在本發明的一方面， H6蛋白質可以是來自A/水鴨/香港/W312/97 （H6N1） 病毒株。H7蛋白質可以是來自A/馬/布拉格/56 （H7N7）病毒株，或H7 A/杭州/1/2013、A/安徽/1/2013 （H7N9），或A/上海/2/2013 （H7N9） 病毒株。在本發明的一方面， H9 蛋白質係來自A/香港/1073/99 （H9N2） 病毒株。在本發明的進一步方面，HA蛋白質可以是來自流感病毒，可能是流感B型病毒，包括B/馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達/4/2006、B/布里斯本/60/08、類B/麻薩諸塞/2/2012 病毒（山形譜系）或B/威斯康辛/1/2010 （山形譜系）。來自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亞型的HA蛋白質的胺基酸序列之非限制性範例包括如WO 2009/009876、WO 2009/076778、WO 2010/003225中描述的序列（將其以引用的方式併入本文）。流感病毒HA蛋白質可以是H5 印尼。
HA亦可為嵌合HA，其中HA的天然穿膜區係以異種穿膜區取代。HA蛋白質的穿膜區為高度保留的（見例如WO 2010/148511的第1C圖；將其以引用的方式併入本文）。異種穿膜區可由任何HA穿膜區獲得，其例如而不限於來自 H1 加州、 B/佛羅里達/4/2006 （GenBank 登錄號ACA33493.1）、B/馬來西亞/2506/2004 （GenBank 登錄號ABU99194.1）、H1/Bri （GenBank 登錄號ADE28750.1）、H1 A/所羅門群島/3/2006 （GenBank 登錄號ABU99109.1）、 H1/NC（GenBank 登錄號AAP34324.1）、H2 A/新加坡/1/1957 （GenBank 登錄號AAA64366.1）、H3 A/布里斯本/10/2007 （GenBank 登錄號ACI26318.1）、H3 A/威斯康辛/67/2005 （GenBank 登錄號ABO37599.1）、H5 A/安徽/1/2005 （GenBank 登錄號ABD28180.1）、 H5 A/越南/1194/2004 （GenBank 登錄號ACR48874.1）、H5-Indo （GenBank 登錄號ABW06108.1）的穿膜區。穿膜區亦可由下列的一致性胺基酸序列（consensus amino acid sequence）來定義： iLXiYystvAiSslXlXXmlagXsXwmcs （SEQ ID NO：78）
HA可包含天然或非天然信號肽；非天然信號肽可以是植物來源的。天然信號肽可與要表現的血球凝集素的信號肽相對應。此外，信號肽可以是來自流感以外的病毒之結構蛋白或血球凝集素 。可使用的信號肽之非限制性範例為苜蓿草蛋白質雙硫鍵異構酶（PDI SP；登錄號Z11499的核苷酸32-103）或帕他汀（patatin） 信號肽（PatA SP；位於GenBank登錄號A08215的核苷酸1738 - 1806 ）。此登錄號的PatA SP 之核苷酸序列為： ATGGCAACTACTAAAACTTTTTTAATTTTATTTTTTATGATATTAGCAACTACTAGTTCAACATGTGCT （SEQ ID NO：79） 帕他汀A信號肽的胺基酸序列為： MATTKTFLILFFMILATTSSTCA （SEQ ID NO：80）
本發明亦提供包含編碼HA蛋白質的序列之核酸分子。核酸分子可進一步包含操作性地連接至編碼HA蛋白質之序列的一或更多調節區域。核酸分子可包含編碼H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或來自流感B型的HA之序列。舉例來說，由核酸分子編碼的HA蛋白質可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9 亞基以及來自B型的HA 。 由核酸分子編碼的 H1 蛋白質可以是來自A/新喀里多尼亞/20/99 （H1N1）、A/波多黎各/8/34 （H1N1）、A/布里斯本/59/2007 （H1N1）、A/所羅門群島 3/2006 （H1N1）、A/加州/04/2009 （H1N1） 或 A/加州/07/2009 （H1N1） 病毒株。由核酸分子編碼的 H3 蛋白質可以是來自A/布里斯本 10/2007 （H3N2）、A/威斯康辛/67/2005 （H3N2）、A/維多利亞/361/2011 （H3N2）、A/德州/50/2012 （H3N2）、A/夏威夷/22/2012 （H3N2）、A/紐約/39/2012 （H3N2）或A/伯斯/16/2009 （H3N2） 病毒株。由核酸分子編碼的 H2 蛋白質可以是來自A/新加坡/1/57 （H2N2） 病毒株。由核酸分子A/安徽/1/2005 （H5N1）、A/越南/1194/2004 （H5N1）或 A/印尼/5/2005 病毒株編碼 H5 蛋白質。由核酸分子編碼的 H6 蛋白質可以是來自A/水鴨/香港/W312/97 （H6N1） 病毒株。 由核酸分子編碼的 H7蛋白質可以是來自 A/馬/布拉格/56 （H7N7） 病毒株，或H7 A/杭州/1/2013、A/安徽/1/2013 （H7N9）或 A/上海/2/2013 （H7N9） 病毒株。此外，由核酸分子編碼的 H9蛋白質可以是來自 A/香港/1073/99 （H9N2） 病毒株。由核酸分子編碼的 HA 蛋白質可以是來自流感病毒B型病毒，其包括B/馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達/4/2006、B/布里斯本/60/08、類B/麻薩諸塞/2/2012病毒 （山形譜系）或 B/威斯康辛/1/2010 （山形譜系）。來自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亞型的HA蛋白質的胺基酸序列之非限制性範例包括如WO 2009/009876、WO 2009/076778、WO 2010/003225中描述的序列（將其以引用的方式併入本文）。流感病毒HA蛋白質可以是H5 印尼。
表1：已如本文所描述製備的構築體範例： 
1
: SP – 信號肽2
: PDI – 苜蓿草蛋白質雙硫鍵異構酶3
: WT – 野生型或天然的4
: TMCT – 穿膜區與胞質尾
如果興趣核酸序列編碼對植物直接或間接有毒性的產物，那麼此類毒性可經由選擇性地在植物發育的所需組織或所需階段內表現興趣核苷酸序列而減低。
可將興趣編碼區域或興趣核苷酸序列在任何適合的植物宿主中表現，該植物宿主被轉形或是包含本發明之核苷酸序列或核酸分子，或基因構築體或載體。適合的宿主範例包括但不限於阿拉伯芥（Arabidopsis
）、農作物包括例如油菜、蕓薹屬、玉米、菸草屬（菸草）舉例來說，菸草（Nicotiana benthamiana
）、苜蓿草、馬鈴薯、番薯（Ipomoea batatus
）、人蔘、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、大麥、向日葵、棉花、玉米、黑麥（Secale cereale
）、高粱（Sorghum bicolor
,Sorghum vulgare
）、紅花（Carthamus tinctorius
）。
該用語「生物質量（biomass）」與「植物物質（plant matter）」如本文所使用意指衍生自植物的任何材料。生物質量或植物物質可包含整株植物或植物的部分，其包括葉片、根、花、種子，其亦包括植物的任何組織、植物的任何細胞或植物的任何餾分（fraction ）、植物的部分、組織或細胞。進一步，生物質量或植物物質可包含細胞內植物組成物、細胞外植物組成物、植物的液體或固體萃取物或其組合物。進一步地，生物質量或植物物質可包含來自植物葉片、莖、果實、根或其組合的植物體、植物細胞、組織、液體萃取物或其組合物。植物的部分可包含植物物質或生物質量。
由「調節區域（regulatory region）」、「調節元件（regulatory element）」或「啟動子（promoter）」其意指核酸的部分，係典型但非總是在基因的蛋白質編碼區域的上游，其可包含DNA或是RNA ，或DNA與RNA兩者。當調節區域為具活性，且與興趣基因具操作性關聯或操作性地連接時，這可造成興趣基因的表現。調節元件可能是能夠媒介器官特異性，或控制發育或時間的基因活化。「調節區域」包括啟動子元件、表現基本啟動子活性的核心啟動子元件、對外部的刺激回應可誘發型元件、媒介啟動子的元件例如負向調節元件或轉錄強化子。「調節區域」如本文所使用，亦包括在轉錄後具活性的元件，舉例來說，調節基因表現例如轉譯與轉錄強化子、轉譯與轉錄抑制子、上游活化序列以及mRNA 不穩定因素。這些後者元件中的數種可位於編碼區域的近端。
在此揭露內容的上下文中，該用語「調節元件（regulatory element）」或「調節區域（regulatory region）」典型地意指DNA序列，其經常但並不總是在結構基因編碼序列的上游（5’），其經由提供RNA聚合酶及/或轉錄作用需要的其他因子之辨識以於特定位置開始而控制編碼區域的表現。然而，要了解的是位於內含子中的其他核苷酸序列或序列的3'亦可對興趣編碼區域的表現調節有貢獻。提供RNA聚合酶或其他轉錄因子的辨識，以確保在特定位點的開始之調節元件的範例為啟動子元件。大部分但非全部地，真核啟動子元件包含TATA盒，其為包含腺苷與胸苷核苷酸鹼基對之保留的核酸序列，通常位於轉錄起始位點的上游大約25鹼基對的位置。啟動子元件可包含基礎的啟動子元件，其負責轉錄的開始，以及修飾基因表現的其他調節元件（如上述所列者）。
有數種類型的調節區域，包括在發育上調節型、可誘發型或持續型（constitutive）的那些者。在發育上調節，或在其控制下控制基因的分化表現的調節區域，在某些器官或器官的組織中，於那個器官或組織發育期間的特定時間是具有活性的。然而，一些在發育受調節的調節區域可優選地在某些器官或組織內於特定的發育階段具有活性，它們亦可能以發育調節的方式而具活性，或者也在植物內的其他器官或組織中處於基本量。 組織特異性調節區域的範例，舉例來說視特異性（see-specific）調節區域，包括napin 啟動子以及cruciferin 啟動子（Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130）。葉片特異性啟動子的範例包含質體藍素啟動子（見US 7,125,978，將其以引用的方式併入本文）。
可誘發型調節區域為能夠回應誘發物質（inducer）而直接或間接地活化一或更多DNA序列或基因的轉錄作用。在缺乏誘發物質下，DNA序列或基因將不被轉錄。典型地特異性地結合至可誘發型調節區域，以活化轉錄作用的蛋白質因子可以未活化的形式存在，其再經由誘發物質被直接或間接地轉變成活化的形式。然而，蛋白質因子亦可不存在。誘發物質可能是化學藥劑例如蛋白質、代謝物、生長調節子、 除草劑或酚樹脂化合物或直接由熱、冷、鹽或毒性元素或間接地經由病原（pathogen）或病原體（disease agent）例如病毒施加的生理壓力。可將包含可誘發調節區域的植物細胞經由外部應用誘發物質於細胞或植物例如經由噴霧、澆水、加熱或類似的方法而使其暴露於誘發物質中。可誘發調節元件可衍生自植物或非植物基因（例如 Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358；將其以引用的方式併入）。潛在可誘發型啟動子範例包括但不限於四環素誘導型啟動子（Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108；將其以引用的方式併入）、steroid inducible promoter （Aoyama, T. and Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404；將其以引用的方式併入）與乙醇可誘發型啟動子（Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180 ；將其以引用的方式併入）細胞分裂素可誘發型IB6與CKI1基因（Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019；Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985；將其以引用的方式併入）以及植物生長素可誘發型元件DR5（Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971；將其以引用的方式併入）。
持續型調節區域在整個植物的各個部分且持續地在整個植物發育過程中引導基因的表現。已知的持續型調節元件的範例包括與CaMV 35S轉錄本相關的啟動子（p35S；Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812）、稻肌動蛋白1（Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165）、肌動蛋白2（Anet al
., 1996,Plant J
., 10: 107-121）或tms 2（U.S. 5,428,147，將其以引用的方式併入本文）以及丙醣磷酸異構酶 1（Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467）基因、 玉米泛素1基因（Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、阿拉伯芥泛素1與6基因（Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、菸草轉譯起始因子4A基因（Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004） 、 木薯葉脈花葉病毒啟動子pCAS（Verdaguer et al., 1996）；核酮糖二磷酸羧化酶的小次單元的啟動子pRbcS: （Outchkourov et al., 2003）、pUbi （對單子葉植物與雙子葉植物）。
如本文所描述，已發現包含強化子序列的調節區域以顯示的速率在葉片之表現，在過渡的表現是有效率的。不希望被理論所約束，經由至核基質的連接，光合作用基因上游調節元件的連接可媒介極大的表現。舉例來說可使用距離豌豆質體藍素的轉譯起始位點（US 7,125,978，將其以引用的方式併入本文）達-784的位置以媒介極大的報導基因表現。
該用語「持續型（constitutive）」如本文所使用並不一定表示在所有細胞類型中，於持續型調節區域的控制下的核苷酸序列是以相同程度表現，而是常常觀察到即使在廣泛的細胞類型中序列係以大量的變化來表現。
如上述的表現構築體可存在於載體中。此載體可包含容許表現卡匣的轉移與插入至生物體或宿主的基因體之邊界序列。 此構築體可能是植物二元載體（binary vector ），舉例來說以pPZP為基礎的二元轉形載體（Hajdukiewicz, et al. 1994）。其他範例構築體包括pBin19（見Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, et al. 1995,Plant Molecular Biology
27: 405-409）。
如果需要的話，可進一步操縱本發明的構築體以含可篩選的標記。然而，這可以是不需要的。有用的可篩選標記包括提供對化學物質的抗性的酵素例如抗生素，舉例來說健他黴素（gentamycin）、潮黴素（hygromycin）、康黴素（kanamycin）或除草劑例如phosphinothrycin、草甘膦（glyphosate）、克速能（chlorosulfuron）以及諸如此類。同樣地，可使用提供可由顏色變化識別的化合物產生之酵素例如GUS（β-葡萄醣醛酸酶，beta-glucuronidase）或螢光例如螢光素酶（luciferase）或GFP。
載體亦包括如本文所描述之表現強化子。表現強化子可被置於亦包含基因沉默抑制子與NPTII的 T-DNA上。多位點接頭區域亦可編碼一或二組的6 x 組胺酸殘基，以容許N-或C-端His-標記至興趣蛋白質，以便於蛋白質純化。
轉錄後基因沉默（PTGS）可涉及限制植物中轉基因的表現，並且可使用來自馬鈴薯病毒Y（HcPro）的沉默抑制子之共同表現以抵消轉基因mRNA的特異性降解（Brigneti et al., 1998,EMBO J. 17
, 6739-6746，將其以引用的方式併入本文）。替代的沉默抑制子在本領域是已知的，並且可如本文所描述使用（Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；將其以引用的方式併入本文），舉例來說但不限於，TEV-p1/HC-Pro（煙草蝕刻病毒-p1/HC-Pro）、BYV -p21、番茄叢生矮化病毒的p19（TBSV p19； p19 的建構係於WO 2010/0003225中描述，將其以引用的方式併入本文）、番茄皺縮病毒的殼體蛋白質（TCV -CP）、胡瓜嵌紋病毒的2b （CMV-2b）、馬鈴薯病毒X的p25（PVX-p25）、馬鈴薯病毒M的p11（PVM-p11）、馬鈴薯病毒S的p11（PVS-p11）、藍莓焦枯病毒的p16（BScV –p16）、萎縮病病毒的p23（CTV-p23）、葡萄藤捲葉關聯病毒的p24（GLRaV-2 p24）、葡萄藤病毒A的p10（GVA-p10）、葡萄藤病毒B的p14（GVB-p14）、獨活潛隱病毒的p10（HLV-p10）或大蒜普通潛隱病毒的p16（GCLV-p16）。
因此，一或更多沉默抑制子，舉例來說但不限於，HcPro、TEV -p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、rgscam、來自FHV的 B2蛋白質、CPMV的小外殼蛋白以及來自TCV、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2 p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10的外殼蛋白，可連同豇豆花葉病毒為基礎的表現卡匣、雙生病毒衍生的擴增元件、以及編碼興趣蛋白質的核酸序列共同表現，以進一步確保植物內高量的蛋白質生產。
可使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉形作用、微注射、電穿孔法等將本發明的構築體引入至植物細胞。對此類技術的回顧見例如Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology
, Academy Press, 紐約 VIII, pp. 421-463 （1988）；Geierson and Corey,Plant Molecular Biology
, 2d Ed. （1988） ；以及Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. InPlant Metabolism
, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell （eds）, Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 （1997）。其他方法包括直接DNA攝取、脂質體（liposome）的使用、電穿孔法，舉例來說使用原生質體、顯微注射、微量拋射（microprojectiles）或晶鬚法（whisker）與真空滲透（vacuum infiltration）。見例如Bilang, et al. （1991,Gene
100: 247-250）、Scheid et al. （1991,Mol. Gen. Genet
. 228: 104-112） 、Guerche et al. （1987,Plant Science
52: 111-116） 、Neuhause et al. （1987,Theor. Appl Genet
. 75: 30-36） 、Klein et al. （2987,Nature
327: 70-73）；Freeman et al. （1984,Plant Cell Physiol
. 29: 1353） 、Howell et al. （1980,Science
208: 1265） 、Horsch et al. （1985,Science
227: 1229-1231） 、DeBlock et al. （1989,Plant Physiology
91: 694-701） 、Methods for Plant Molecular Biology （Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988） 、Methods in Plant Molecular Biology （Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989） 、WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Liu and Lomonossoff （2002,J Virol Meth
, 105:343-348） 、EP 290395；WO 8706614；美國專利號4,945,050；5,036,006；以及1995年5月10日申請的5,100,792, U.S. 專利申請輯編號08/438,666，以及於1992年9月25日申請的07/951,715（其全部係以引用的方式併於本文）。
可使用過渡的表現方法來表現本發明的構築體（見D’Aoust et al., 2009,Methods in molecular biology
, Vol 483, pages41-50；Liu and Lomonossoff, 2002,Journal of Virological Methods
, 105:343-348；將其以引用的方式併入本文）。替代地，可使用以真空為基礎的過渡表現方法，如Kapila et al.（1997,Plant Sci. 122
, 101-108;將其以引用的方式併入本文）或WO 00/063400、WO 00/037663所描述者（將其以引用的方式併入本文）。這些方法可包括，舉例來說但不限於，農桿菌接種法或農桿菌浸潤法、針筒浸潤法，然而其他過渡的方法亦可如上所述使用。伴隨農桿菌接種法或農桿菌浸潤法或針筒浸潤法，包含所需核酸的農桿菌混合物進入組織的細胞間隙，舉例來說葉片、植物的地上部分（包括莖、葉與花）、植物的其他部分（莖、根、花）或整株植物。在跨越表皮之後，農桿菌感染並轉移t-DNA 副本至細胞中。t-DNA 被游離基因體轉錄且mRNA被轉譯，導致受感染細胞中興趣蛋白質的生產，然而，t-DNA的通過至核內是過渡的。
亦考量此發明的部分為包含本發明之基因構築體的轉基因植物、植物細胞或種子，可將其使用為適於本文所描述的過渡蛋白質表現的平台植物。從植物細胞再生整株植物的方法亦為本領域所知悉（舉例來說見Guerineau and Mullineaux （1993, Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax（Croy RRD ed）Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148）。一般而言，在可包含篩選性藥劑例如抗生素之合適的培養基中培養轉形的植物細胞 ，其中使用可選擇性標記以便利對形植物細胞的鑑識。一 旦癒傷組織形式、萌芽形成可根據已知的方法經由採取合適的植物荷爾蒙促進，且將芽轉移至發根培養基以供植物的再生。可再使用植物無論是由種子或使用無性繁殖技術以建立重複的子代。亦可不使用組織培養而生成轉基因植物。穩定的轉形作用以及這些生物體的再生方法係為本領域建立並為本領域的技術人員所知悉。可行的技術係於Vasil et al.,（Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, VoI I, Il and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984）以及Weissbach and Weissbach（Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989）中回顧 。獲得轉形與再生的植物方法非本發明的關鍵。
若植物、植物部分或植物細胞要被二或更多核酸構築體轉形或共同轉形，可將核酸構築體以匯集核酸的單一轉染事件引入至農桿菌中，並且如描述地轉染細菌細胞。替代地可連續地引入構築體。在此情況中，引入至如描述之農桿菌的第一構築體，在篩選條件下生長的細胞（例如在抗生素的存在下）僅有單一轉形細菌能夠生長。在此第一篩選步驟之後，引入第二核酸構築體至如描述之農桿菌，並且在雙重篩選條件下生長的細胞僅有雙重轉形的細菌能夠生長。可再將雙重轉形細菌用來轉形如本文所描述的植物、植物部分或植物細胞，或可經過進一步的轉形步驟，以容納第三個核酸構築體。
替代地，若植物或植物部分或植物細胞要被以二或更多核酸構築體轉形或共同轉形，可將核酸構築體經由與植物、植物部分或植物細胞共同浸潤的農桿菌混合物引入至植物中，每個農桿菌細胞可包含要被引入至植物內的一或更多構築體。為了於浸潤的步驟期間改變植物、植物部分或植物細胞內構築體中興趣核苷酸序列的相對表現量，可改變包含所需構築體的各種農桿菌族群的濃度。
本揭露內容進一步提供轉基因植物，其包含如本文所描述之表現系統，其中當與缺少如本文所描述的表現系統中的一或更多組成分之其他類似表現系統，舉例來說CPMV HT （SEQ ID NO：4）相比時，以增強的量表現卡匣中的異種興趣核酸。
本揭露內容進一步包含生成興趣蛋白質的方法，其包含提供表現如本文所描述之表現系統的植物或植物部分的步驟、收穫至少是已表現興趣蛋白質的組織，並且隨選地自組織中分離興趣蛋白質。
因此在各種方面，並且沒有限制地，本發明提供： - 表現強化子，其包含選自SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者之豇豆花葉病毒5’UTR ，或表現與SEQ ID NO：1、2、24、27、68、69 與 70-77中的任一者所闡述的序列100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85% 或80%一致性的核苷酸序列，其中當操作性地連接至如本文所描述的植物調節區域與植物kozak序列時，在與融合至CPMV HT（SEQ ID NO：4；如Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218中描述的包含不完整M蛋白質之先前技術的強化子序列；將其以引用的方式併入本文）使用相同植物調節區域的興趣核苷酸序列之表現量比較時，此表現強化子增加操作性地連接至表現強化子的興趣核苷酸序列的表現量。 - 包含如上述定義的豇豆花葉病毒為基礎之表現強化子或表現卡匣、啟動子（調節區域）、隨選地多位點接頭區域、kozak序列、編碼興趣蛋白質的核酸以及終止子的一或更多表現系統。 - 在宿主生物體例如植物中使用如本文所描述的一或更多表現系統或載體之表現興趣蛋白質的方法。 - 由本發明的一或更多表現系統或載體表現興趣蛋白質的宿主細胞與生物體，以及生產宿主與生物體的方法。
表2：序列表 
範例 1 - 2X35S/CPMV-HT/PDISP/H3 維多利亞/ NOS （構築體編號 1391）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/H3 維多利亞）的信號肽取代、編碼來自流感A/維多利亞/361/2011 之H3的序列使用下列以PCR為基礎的方法轉殖至2X35S-CPMV-HT-NOS表現系統（ 原始CPMV-HT）。包含PDISP/H3 維多利亞編碼序列的片段使用引子IF-PDI.S1+3c（第6A圖，SEQ ID NO：67）與IF-H3V36111.s1-4r（第6B圖，SEQ ID NO：17）擴增 ，使用PDISP/H3 維多利亞序列（第6C圖， SEQ ID NO：18）作為模板。將PCR產物使用融合（In-Fusion）轉殖系統（Clontech, Mountain View, CA）轉殖至2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統 。將構築體編號1191 （第6D圖）以SacII 與 StuI 限制酵素消化並且將線性化質體用於融合組裝反應。構築體編號1191為意圖作為CPMV-HT為基礎之表現卡匣中「融合」興趣基因轉殖的接受體質體。亦包括在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制子的共同表現基因構築體。骨架為pCAMBIA雙向質體，且由左至右t-DNA邊界的序列係於第6E圖（SEQ ID NO： 19）中表示。 將生成的構築體給定編號1391（第6F圖， SEQ ID NO： 20）。將與PDISP融合、來自流感A/維多利亞/361/2011之成熟的H3之胺基酸序列於第6G圖表示（SEQ ID NO： 21）。質體1391的圖式係於第6H圖中表示。
範例 2 – 2X35S/CPMV160+/PDISP/H3 維多利亞/ NOS （構築體編號 1800）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/H3 維多利亞）的信號肽取代、編碼來自流感A/維多利亞/361/2011 之H3的序列使用下列以PCR為基礎的方法轉殖至2X35S/CPMV160+/NOS表現系統（CPMV160+）。包含PDISP/H3 維多利亞編碼序列的片段使用引子IF**(SacII)-PDI.s1+4c（第7A圖，SEQ ID NO：22）與IF-H3V36111.s1-4r（第7B圖，SEQ ID NO：23）擴增 ，使用PDISP/H3 維多利亞序列（第7C圖， SEQ ID NO：24）作為模板。將PCR產物使用融合（In-Fusion）轉殖系統（Clontech, Mountain View, CA）轉殖至2X35S/CPMV160+/NOS表現系統 。將構築體編號2171 （第7D圖）以SacII 與 StuI 限制酵素消化並且將線性化質體用於融合組裝反應。構築體編號2171為意圖作為CPMV160+為基礎之表現卡匣中「融合」興趣基因轉殖的接受體質體。亦包括在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制子的共同表現基因構築體。骨架為pCAMBIA雙向質體，且由左至右t-DNA邊界的序列係於第7E圖（SEQ ID NO： 25）中表示。 將生成的構築體給定編號1800（第7F圖， SEQ ID NO： 26）。將與PDISP融合、來自流感A/維多利亞/361/2011之成熟的H3之胺基酸序列於第7G圖表示（SEQ ID NO： 27）。質體1800的圖式係於第7H圖中表示。
範例 3 - 2X35S/CPMV160/PDISP/H3 維多利亞/ NOS （構築體編號 1935）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/H3 維多利亞）的信號肽取代、編碼來自流感A/維多利亞/361/2011 之H3的序列使用下列以PCR為基礎的方法轉殖至2X35S-CPMV160-NOS表現系統。包含PDISP/H3 維多利亞編碼序列的片段使用引子IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c（第8A圖，SEQ ID NO：28）與IF-H3V36111.s1-4r（第7B圖，SEQ ID NO：23）擴增 ，使用PDISP/H3 維多利亞序列（第7C圖， SEQ ID NO：24）作為模板。將PCR產物使用融合（In-Fusion）轉殖系統（Clontech, Mountain View, CA）轉殖至2X35S/CPMV160/NOS表現系統 。將構築體編號1190（第8B圖）以SacII 與 StuI 限制酵素消化並且將線性化質體用於融合組裝反應。構築體編號1190為意圖作為CPMV160為基礎之表現卡匣中「融合」興趣基因轉殖的接受體質體。亦包括在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制子的共同表現基因構築體。骨架為pCAMBIA雙向質體，且由左至右t-DNA邊界的序列係於第8C圖（SEQ ID NO： 29）中表示。 將生成的構築體給定編號1935（第8D圖， SEQ ID NO：30）。將與PDISP融合、來自流感A/維多利亞/361/2011之成熟的H3之胺基酸序列於第7G圖表示（SEQ ID NO： 27）。質體1935的圖式係於第8E圖中表示。
範例 4 - 2X35S/CPMV160+/NOS表現系統中PDISP/H3 維多利亞的SacII 限制位點與ATG之間的序列變化形（構築體編號1992 至 1999）
使用如構築體編號1800相同的以PCR為基礎的方法（見範例2）創造包含2X35S/CPMV160+/NOS表現系統中PDISP/H3 維多利亞的SacII 限制位點與ATG之間的序列變化形的八個構築體，使用經修飾的正向引子，並保持所有其他成分相同。使用列於第9A圖至第9H圖中的引子擴增變異型HT1* 至 HT8*，引子： IF-HT1*(-Mprot)-PDI.c （第9A圖， SEQ ID NO： 31）、 IF-HT2*(-Mprot)-PDI.c（第9B圖， SEQ ID NO： 32）、 IF-HT3*(-Mprot)-PDI.c（第9C圖， SEQ ID NO：33）、 IF-HT4*(-Mprot)-PDI.c（第9D圖， SEQ ID NO：34）、 IF-HT5*(-Mprot)-PDI.c（第9E圖， SEQ ID NO：35）、 IF-HT6*(-Mprot)-PDI.c（第9F圖， SEQ ID NO：36）、 IF-HT7*(-Mprot)-PDI.c （第9G圖， SEQ ID NO：37）以及 IF-HT8*(-Mprot)-PDI.c （第9H圖， SEQ ID NO：38）， 以分別創造構築體編號1992至1999。質體1992的圖式係於第9I圖中表示。使用類似特徵來製備構築體1993-1999。
範例 5 – PDISP/H1 加州的2X35S/CPMV HT（構築體編號484）與 2X35S/CPMV160+ （構築體編號1897）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/H1 加州）（第10A圖，SEQ ID NO：39）的信號肽取代、與來自流感A/加州/7/2009的H1相對應之編碼序列使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/H1 加州設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160。將與PDISP融合、來自流感A/加州/7/2009之成熟的H1之胺基酸序列於第10B圖表示（SEQ ID NO： 40）。質體484與1897的圖式係於第10C圖與第10D圖中表示。
範例 6 - H5 印尼的2X35S/CPMV HT（構築體編號489）、2X35S/CPMV160+ （構築體編號1880）與2X35S/CPMV160 （構築體編號1885）
將來自流感A/印尼/5/2005的天然H5（第11A圖，SEQ ID NO： 41）相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）、1800（見範例2）與1935（見範例3）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為H5 印尼設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 、CPMV160+與 CPMV160。將與來自流感A/印尼/5/2005之天然H5之胺基酸序列於第11B圖表示（SEQ ID NO： 42）。質體489、1880與1885的圖式係於第11C圖至第11E圖中表示。
範例 7 - PDISP-H7 杭州的2X35S/CPMV HT（構築體編號2140）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2168）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/H7 杭州）（第12A圖，SEQ ID NO： 43）的信號肽取代、與來自流感A/杭州/1/2013的H7相對應之編碼序列使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/H7 杭州設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP融合、來自流感A/杭州/1/2013之成熟的H7之胺基酸序列於第12B圖表示（SEQ ID NO： 44）。質體2140與2168的圖式係於第12C圖與第12D圖中表示。
範例 8 - PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT的 2X35S/CPMV HT（構築體編號2130）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2188）
將融合至來自流感A/印尼/5/2005的H5之穿膜區與胞質尾（TMCT）以及融合至苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT）（第13A圖，SEQ ID NO： 45）信號肽的來自流感A/杭州/1/2013的H7之胞外區域相對應之嵌合血球凝集素編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP融合的H7 杭州+H5 印尼 TMCT之胺基酸序列於第13B圖表示（SEQ ID NO： 46）。質體2130與2188的圖式係於第13C圖與第13D圖中表示。
範例 9 - PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）的2X35S/CPMV HT（構築體編號1039）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號1937）
將伴隨刪除的蛋白水解環（PrL-）（見2013年3月28日申請之US臨時申請號61/806,227 ，將其以引用的方式併入本文，關於其他訊息re: HA序列中刪除的蛋白質水解環區域）、其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-））（第14A圖，SEQ ID NO： 47）的信號肽取代、與來自流感B/布里斯本/60/2008的HA相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP融合、成熟的HA B 布里斯本 （PrL-）之胺基酸序列於第14B圖表示（SEQ ID NO： 48）。質體1039與1937的圖式係於第14C圖與第14D圖中表示。
範例 10 - PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT的 2X35S/CPMV HT（構築體編號1067）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號1977）
將伴隨刪除的蛋白水解環（PrL-）（見2013年3月28日申請之US臨時申請號61/806,227 ，將其以引用的方式併入本文，關於其他訊息re: HA序列中刪除的蛋白質水解環區域）、融合至來自流感A/加州/7/2009的H1之穿膜區與胞質尾（TMCT）以及融合至苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT）（第15A圖，SEQ ID NO： 49）信號肽的來自B/布里斯本/60/08的HA之胞外區域相對應之嵌合血球凝集素編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP融合的成熟HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT之胺基酸序列於第15B圖表示（SEQ ID NO： 50）。質體1067與1977的圖式係於第15C圖與第15D圖中表示。
範例 11 - PDISP/HA B 麻薩諸塞州（PrL-）的2X35S/CPMV HT（構築體編號2072）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2050）
將伴隨刪除的蛋白水解環（PrL-）（見March 28, 2013申請之US臨時申請號61/806,227，關於其他訊息re: HA序列中刪除的蛋白質水解環區域，將其以引用的方式併入本文）、其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/HA B 麻薩諸塞州（PrL-））（第16A圖，SEQ ID NO： 51）的信號肽取代、與來自流感B/麻薩諸塞州/2/2012的HA相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/HA B 麻薩諸塞州（PrL-）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP融合、成熟的B 麻薩諸塞州（PrL-）之胺基酸序列於第16B圖表示（SEQ ID NO：52）。質體2072與2050的圖式係於第16C圖與第16D圖中表示。
範例 12 - PDISP/HA B 麻薩諸塞州（PrL-）+H1 加州 TMCT 的2X35S/CPMV HT （構築體編號2074）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2060）
將伴隨刪除的蛋白水解環（PrL-）（見March 28, 2013申請之US臨時申請號61/806,227 ，將其以引用的方式併入本文，關於其他訊息re: HA序列中刪除的蛋白質水解環區域）、融合至來自流感A/加州/7/2009的H1之穿膜區與胞質尾（TMCT）以及融合至苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/HA B 麻薩諸塞州（PrL-）+H1 加州 TMCT）（第17A圖，SEQ ID NO：53）信號肽的來自B/麻薩諸塞州/2/2012的HA之胞外區域相對應之嵌合血球凝集素編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/HA B 麻薩諸塞州（PrL-）+H1 加州 TMCT設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP融合的成熟HA B 麻薩諸塞州（PrL-）+H1 加州 TMCT之胺基酸序列於第17B圖表示（SEQ ID NO： 54）。質體2074與2060的圖式係於第17C圖與第17D圖中表示。
範例 13 - HA B 威斯康辛 （PrL-）的2X35S/CPMV HT（構築體編號1445）、2X35S/CPMV160+ （構築體編號1820）與CPMV160（構築體編號1975）
將伴隨刪除的蛋白水解環（PrL-）（見March 28, 2013申請之US臨時申請號61/806,227，關於其他訊息re: HA序列中刪除的蛋白質水解環區域，將其以引用的方式併入本文）伴隨其天然信號肽（HA B 威斯康辛 （PrL-）的與來自流感B/威斯康辛/1/2010的HA相對應之編碼序列（第18A圖，SEQ ID NO：55）分別使用如構築體編號1391（見範例1）、構築體編號1800（見範例2）與構築體編號1935（見範例3）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為HA B 威斯康辛 （PrL-）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 、CPMV160+與CPMV160。將伴隨其天然肽的HA B 威斯康辛 （PrL-）之胺基酸序列於第18B圖表示（SEQ ID NO：56）。質體1445、1820與1975的圖式係分別於第18C圖、第18D圖與第18E圖中表示。
範例 14 - HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT的2X35S/CPMV HT（構築體編號1454）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號1893）
將伴隨刪除的蛋白水解環（PrL-）（見March 28, 2013申請之US臨時申請號61/806,227 ，將其以引用的方式併入本文，關於其他訊息re: HA序列中刪除的蛋白質水解環區域）、融合至來自流感A/加州/7/2009的H1之穿膜區與胞質尾（TMCT）以及融合至HA B 威斯康辛的天然信號肽（HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT）（第19A圖，SEQ ID NO：57）的來自B/ 威斯康辛 /2/2012的HA之胞外區域相對應之嵌合血球凝集素編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT之胺基酸序列於第19B圖表示（SEQ ID NO： 58）。質體1454與1893的圖式係於第19C圖第19D圖中表示。
範例 15 - HC 利妥昔單抗（Rituxan）的2X35S/CPMV HT（構築體編號5001）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2100）
將與單株IgG1抗體利妥昔單抗的重鏈（HC 利妥昔單抗（Rituxan）；第20A圖，SEQ ID NO： 59）相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391（見範例1）與構築體編號1800（見範例2）相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為HC 利妥昔單抗（Rituxan）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將HC 利妥昔單抗（Rituxan）的胺基酸序列於第20B圖表示（SEQ ID NO：60）。質體5001與2100的圖式係於第20C圖與第20D圖中表示。
範例 16 - PDISP/HC 利妥昔單抗（Rituxan）的2X35S/CPMV HT （構築體編號5002）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2109）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/HC 利妥昔單抗（Rituxan）；第21A圖，SEQ ID NO：61）的信號肽取代、與單株IgG1抗體利妥昔單抗的重鏈（HC 利妥昔單抗（Rituxan）；第20A圖，SEQ ID NO： 59）相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391與構築體編號1800相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/HC 利妥昔單抗（Rituxan）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將與PDISP 融合之HC 利妥昔單抗（Rituxan）的胺基酸序列於第21B圖表示（SEQ ID NO：62）。質體5002與2109的圖式係於第21C圖與第21D圖中表示。
範例 17 - LC 利妥昔單抗（Rituxan）的2X35S/CPMV-HT（構築體編號5021）與2X35S/CPMV160+（構築體編號2120）
將與單株IgG1抗體利妥昔單抗的輕鏈（LC 利妥昔單抗（Rituxan）；第22A圖，SEQ ID NO：63）相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391與構築體編號1800相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為LC 利妥昔單抗（Rituxan）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT 與 CPMV160+。將LC 利妥昔單抗（Rituxan）的胺基酸序列於第22B圖表示（SEQ ID NO：64）。質體5021與2120的圖式係於第22C圖與第22D圖中表示。
範例 18 - PDISP/LC 利妥昔單抗（Rituxan）的2X35S/CPMV-HT （構築體編號5022）與2X35S/CPMV160+ （構築體編號2129）
將其中天然信號肽已被苜蓿草蛋白質雙硫異構酶（PDISP/LC 利妥昔單抗（Rituxan）；第23A圖，SEQ ID NO：65）的信號肽取代、與單株IgG1抗體利妥昔單抗的輕鏈（LC 利妥昔單抗（Rituxan）；第20A圖，SEQ ID NO： 59）相對應之編碼序列分別使用如構築體編號1391與構築體編號1800相同的以PCR為基礎的方法，但使用特別為PDISP/LC 利妥昔單抗（Rituxan）設計的經修飾的PCR引子轉殖至原始的CPMV-HT與CPMV160+。將與PDISP融合之LC利妥昔單抗(Rituxan)的胺基酸序列於第23B圖表示(SEQ ID NO：66)。質體5022與2129的圖式係於第23C圖與第23D圖中表示。
範例19-農桿菌轉染
使用由D’Aoust et al 2008描述的方法(Plant Biotechnology Journal 6：930-940)將農桿菌菌株AGL1以DNA構築體經由電穿孔法轉染。將被轉染之農桿菌於以10mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20μM乙醯丁香酮、50μg/ml康黴素以及25μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並且重新懸浮於滲透培養基(10mM MgCl 2以及10mM MES pH 5.6)。
植物生質、接種與農桿菌滲透的製備
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係從充滿商業的泥炭蘚基質之平地中的種子生長。容許植物生長於16/8光照週期以及25℃日/20℃夜之溫度制度下的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。
將以每種基因構築體轉染之農桿菌於以10mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20μM乙醯丁香酮、50μg/ml康黴素以及25μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於滲透培養基(10mM MgCl 2以及10mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在滲透之日，將培養批次以2.5培養體積稀釋並在使用前使其回溫。將圓葉菸草整株植物在20-40Torr真空下倒置於在一氣密的不銹鋼罐中之細菌懸浮液2分鐘。將植物返回溫室2-6日的培養期間直到收穫。
葉收穫以及總蛋白質萃取
在培養之後，收穫植物的空中部分，於-80℃下冷凍並粉碎成片狀。經由在三倍體積的冷50mM Tris pH 8.0、0.15M NaCl、0.1% Triton X-100以及1mM苯基甲磺醯氟中將每個冷凍粉碎的植物材料樣品均質化(Polytron)以萃取總可溶性蛋白質。在均質化作用之後，將泥漿狀物於4℃以10,000g離心10分鐘並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)保存用於分析。
範例20-蛋白質分析與免疫墨點法
澄清的粗萃取物之總蛋白質含量係經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且以電轉移至用於免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)之0.1% Tween-20中於4℃遮蔽16-18小時。
經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中以2μg/ml的一級抗體(表4介紹了用於每個HA偵測的抗體與條件)的第一培養以操作免疫墨點法。化學發光偵測使用的二級抗體係於表4中表示，在TBS-Tween 20 0.1%之2%脫脂牛奶中以如所示者稀釋。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。
JIR：Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA；CBER：Center for Biologics Evaluation and Research，洛客維爾，MD,USA.
Sino：Sino Biological inc.，北京，中國。
TGA：診療產品局，澳洲，NIBSC：國立生物標準與控制機構，英國。
ITC：Immune Technology Corp.，紐約，NY，USA。
範例21-血球凝集試驗
血球凝集試驗係根據由Nayak與Reichl(2004)描述的方法。簡言之，在包含100μL PBS的V底96孔微量盤製作測試樣本(100μL)的連續二倍稀釋，留下每孔100μL的稀釋樣本。加入一百微升的0.25%火雞紅血球懸浮液(Bio Link Inc.,Syracuse,NY；對於所有B病毒株、H1、H5與H7)或0.5%豚鼠紅血球懸浮液(對於H3)至每孔中，並且將盤於室溫下培養2h。將顯示完全的血球凝集作用的最高倍稀釋的倒數記錄為HA活性。
所有引用文獻係以引用的方式併入本文。
本發明已關於一或更多具體實施例而描述。然而，對於本領域的技術人員而言，在不悖離如申請專利範圍中所定義之本發明的範圍下可作出數個變化與修改將是明顯的。
484、1039、1067、1191、1391、1445、1454、1800、1820、1880、1885、1893、1897、1935、1937、1975、1977、1992、2050、2060、2072、2074、2100、2109、2120、2129、2140、2168、2171、5001、5002、5021、5022:構築體
ATG:鄰近起始序列
CPMV:豇豆嵌紋病毒
HC:重鏈
HMG:血球凝集作用滴定量
NOS:胭脂鹼合成酶終止子
PDI:蛋白質雙硫異構酶
PDI-H1 Cal:帶有PDI信號肽的H1 A/加州/07/2009
PDI-H3 Vic:帶有PDI信號肽的H3 A/維多利亞/361/2011
PDISP:蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽
PrL-:刪除的蛋白水解環
TMCT:穿膜區域胞質尾
UTR:非轉譯區域
WtSp-B Wis-PrL:帶有天然信號肽的B/威斯康辛/1/2010
WtSp-H5 Indo‧‧‧帶有天然信號肽的流感 A/印尼/5/2005之H5
本發明的這些與其他特徵由參考所附圖式的下列描述中將變得更為明顯，其中：第 1A 圖
顯示如本文所描述的數個強化子序列CPMVX與CPMVX+（包含CPMVX，以及在此非限制性的範例中，包含多重轉殖位點以及植物kozak序列的填充片段）的範例之一般示意圖式。CPMVX與CPMVX+分別顯示出於其5’端操作性地連接至植物調節區域，且於其3’端串聯地連接至興趣核苷酸序列（包括ATG起始位點與STOP位點）、3’ UTR以及終止序列。如本文所描述的構築體CPMVX之範例為CPMV160。如本文所描述的構築體CPMVX+之範例為CPMV160+。第 1B 圖
顯示包含如本文所描述的強化子序列之構築體的數個變化形範例（CPMV160，以SEQ ID NO：1提供完整序列；CPMV155，以SEQ ID NO：24提供完整序列；CPMV150，以SEQ ID NO：27提供完整序列；以及CPMV114，以SEQ ID NO：68提供完整序列），這些構築體於其5’端操作性地連接至植物調節區域（在這些非限制性範例中的2X35S），且於其3’端連接至興趣核苷酸序列或「GOI」，其包括毗鄰ATG起始位點的植物kozak序列（於方形括號中顯示的元件都包括上下文，且它們不是CPMVX或CPMVX+強化子序列的一部分）。第 1C 圖
顯示包含如本文所描述的強化子序列之構築體的數個變化形範例（CPMV160+，以SEQ ID NO：2提供完整序列；CPMV155+，以SEQ ID NO：72提供完整序列；CPMV150+，以SEQ ID NO：73提供完整序列；以及CPMV114+，以SEQ ID NO：74提供完整序列），這些構築體於其5’端操作性地連接至植物調節區域（在這些非限制性範例中的2X35S），且於其3’端連接至填充片段（在這些非限制性範例中，包含多重轉殖位點與植物kozak序列）、興趣核苷酸序列、包含ATG起始位點的「GOI」 （於方形括號中顯示的元件都包括上下文，且它們不是CPMVX或CPMVX+強化子序列的一部分）。第 2 圖
顯示包含CPMV-HT（先前技術）表現構築體、以及包含CPMV160+為基礎之表現構築體的植物中生產的蛋白質之粗蛋白質萃取物相對的血球凝集作用滴定量（HMG）該構築體係操作性地與興趣核苷酸連接。顯示來自帶有PDI信號肽的H1 A/加州/07/2009（PDI-H1 Cal；構築體編號484 ，5’ UTR：CPMV HT；以及構築體編號1897，5’UTR：CPMV160+；見範例5）、帶有PDI信號肽的H3 A/維多利亞/361/2011（PDI-H3 Vic；構築體編號1391，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1800，5’UTR：CPMV160+；分別見範例1 與範例 2）的HA、帶有天然信號肽的來自流感 A/印尼/5/2005的H5（WtSp-H5 Indo；構築體編號489，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1880，5’UTR：CPMV160+；見範例6）以及帶有刪除的蛋白水解環以及帶有天然信號肽的B/威斯康辛/1/2010（WtSp-B Wis-PrL；構築體編號1445，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1975，5’UTR：CPMV160+，見範例13）表現的資料。PDI：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽； PrL-：刪除的蛋白水解環。第 3 圖
顯示包含CPMV-HT（先前技術）表現構築體、以及包含CPMV160+為基礎之表現構築體的植物中生產的蛋白質之粗蛋白質萃取物相對的血球凝集作用滴定量（HMG）。顯示帶有PDI信號肽的來自H1 A/加州/07/2009（構築體編號484，5’ UTR：CPMV HT；以及構築體編號1897，5’UTR：CPMV160+；見範例5）、帶有PDI信號肽的H3 A/維多利亞/361/2011（構築體編號1391，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1800，5’UTR：CPMV160+；分別見範例1 與範例 2）、帶有刪除的蛋白水解環以及帶有PDI信號肽的B 布里斯本/60/08（構築體編號 1039，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1937，5’UTR：CPMV160+；見範例9）、帶有刪除的蛋白水解環、帶有被H1 A/加州/07/2009的穿膜區域與胞質尾取代之穿膜區域與胞質尾，以及帶有PDI信號肽的B 布里斯本/60/08+H1Tm（構築體編號1067，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1977，5’UTR：CPMV160+；見範例10）、帶有刪除的蛋白水解環以及帶有PDI信號肽的B 麻薩諸塞/2/2012 2012（構築體編號 2072，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號2050，5’UTR：CPMV160+；見範例11）、帶有刪除的蛋白水解環、帶有被H1 A/加州/07/2009的穿膜區域與胞質尾取代之穿膜區域與胞質尾，以及帶有PDI信號肽的B 麻薩諸塞/2/2012+H1Tm（構築體編號 2074，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號2060，5’UTR：CPMV160+；見範例12）、帶有刪除的蛋白水解環以及帶有天然信號肽的B 威斯康辛/1/2010 （構築體編號 1445，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1975，5’UTR：CPMV160+；見範例13）以及帶有刪除的蛋白水解環、帶有被H1 A/加州/07/2009的穿膜區域與胞質尾取代之穿膜區域與胞質尾，以及帶有天然信號肽的B 威斯康辛/1/2010+H1Tm（構築體編號 1454，5’UTR：CPMV HT；以及構築體編號1893，5’UTR：CPMV160+；見範例14）的HA表現的資料。第 4A 圖
顯示測試的植物Kozak序列變化形之範例。顯示CPMVX+、植物調節區域、填充片段以及興趣核苷酸序列（GOI）部分序列的構築體。在此非限制性的範例，構築體包含2X35S調節區域、CPMV160+、包含多重轉殖位點與植物kozak序列的填充片段（興趣核苷酸序列的5’端亦表示為：「ATG…GOI」；其中GOI為H3 A/維多利亞/361）。植物kozak序列的變化形亦於序列下顯示（亦見第9圖）。將每個變化形植物Kozak序列融合至填充片段的3’端，以及融合至興趣核苷酸序列（在這些非限制性範例中，為H3 A/維多利亞/361）的5’-ATG位點。構築體的其他元件保持不變）。第 4B 圖
顯示包含CPMV160+表現構築體以及如所指出的變化形植物Kozak序列的植物中所生產之興趣核苷酸序列的HA滴定量。第 5 圖
顯示抗體利妥昔單抗（Rituxan）在CPMV-HT（構築體編號5001 與 5002，見範例15與16）或CPMV160（構築體編號2100 與 2109，見範例15與16）以及帶有無論是其天然信號肽或以蛋白質雙硫鍵異構酶（PDI）信號肽取代的天然信號肽的控制下之表現。第 6 圖
顯示用來製備構築體編號1391（A‐2X35S CPMV‐HT PDISP H3維多利亞 NOS；見範例1）的序列組成分。構築體編號1391 結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR，且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/H3 維多利亞）間不包含異種kozak序列）。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 6A 圖
顯示引子序列 IF-PDI.S1=3c （SEQ ID NO：67）。第 6B 圖
顯示引子序列 IF‐H3V36111.s1‐4r （SEQ ID NO：17）。第 6C 圖
顯示PDISP/H3 維多利亞（SEQ ID NO：18） 的序列。第 6D 圖
顯示構築體1191的示意圖式。第 6E 圖
顯示構築體1191；由左至右t‐DNA 邊界 （下加底線）、伴隨質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制子表現卡匣的2X35S CPMV‐HT NOS（SEQ ID NO：19）。第 6F 圖
顯示由2X35S 啟動子至NOS終止子的表現卡匣編號1391。將PDISP/H3 維多利亞核苷酸序列下加底線； CPMV 5’UTR以粗體；不完整的M蛋白質以斜體（SEQ ID NO：20）。第 6G 圖
顯示PDISP/H3 維多利亞 （SEQ ID NO：21）的胺基酸序列。第 6H 圖
顯示構築體編號1391的示意圖式（參考構築體）。第 7 圖
顯示用來製備構築體編號1800（A‐2X35S CPMV160+ PDISP H3維多利亞 NOS；見範例2）的序列組成分。構築體編號1800包括含160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 7A 圖
顯示引子序列 IF**(SacII)-PDI.s1+4c （SEQ ID NO：22）。第 7B 圖
顯示引子序列 IF-H3V36111.s1-4r （SEQ ID NO：23）。PDISP/H3 維多利亞的序列係於第6C圖中顯示（SEQ ID NO：18）。第 7C 圖
顯示構築體2171（表示用於質體線性化的SacII 與 StuI限制酵素位點）的示意圖式。第 7D 圖
顯示由左至右t‐DNA 邊界 （下加底線）、伴隨質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制子表現卡匣的2X35S/CPMV160+/NOS、H1加州穿膜胞質尾，以及CPMV 3’UTR （SEQ ID NO：25）的構築體2171。第 7E 圖
顯示由2X35S 啟動子至NOS終止子的表現卡匣編號1800。將PDISP/H3 維多利亞核苷酸序列下加底線； 5’UTR以粗體顯示；植物kozak序列雙重底線；將16鹼基對的填充片段（多重轉殖位點）置於5’UTR與植物kozak序列（SEQ ID NO：26）之間。PDISP/H3 維多利亞的胺基酸序列係於第6G圖中顯示（SEQ ID NO：27）。第 7F 圖
顯示構築體編號1800的示意圖式（以CPMVX+為基礎的構築體，其中X=160）。第 8 圖
顯示用來製備構築體編號1935（2X35S/CPMV160/ PDISP/H3 維多利亞/ NOS；見範例3）的序列組成分。構築體編號1935包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR ，且不包括填充片段（多重轉殖位點）或植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160（CPMVX，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 8A 圖
顯示引子序列 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c （SEQ ID NO：28）。第 8B 圖
顯示構築體1190的示意圖式。第 8C 圖
顯示構築體1190的核酸序列由左至右t‐DNA 邊界 （下加底線）、伴隨質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制子表現卡匣的2X35S/CPMV160/NOS，以及CPMV3’UTR（SEQ ID NO：29）。第 8D 圖
顯示由2X35S 啟動子至NOS終止子的表現卡匣編號1935。PDISP/H3 維多利亞核苷酸序列下加底線，將5’UTR以粗體顯示（SEQ ID NO：30）。此卡匣不包括植物kozak序列或填充片段（多重轉殖位點）。第 8E 圖
顯示構築體編號1935的示意圖式（以CPMVX為基礎的構築體，其中X=160）。第 9 圖
顯示植物kozak序列中含有變異之序列，將其用於製備「CPMV160+」為基礎之構築體（構築體編號1992 至 1999）的篩選。顯示在SacII限制位點與2X35S/CPMV160+/NOS表現系統中PDISP/H3 維多利亞的ATG間的序列變異，包含植物kozak序列中的變異（將序列顯示為由來自構築體1800相對應之序列的變異；見範例4）。變異型植物kozak序列下加底線。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。第 9A 圖
顯示 IF-HT1*(-Mprot)-PDI.c的核苷酸序列（SEQ ID NO： 31；將其用以製備構築體編號1992）。第 9B 圖
顯示IF-HT2*(-Mprot)-PDI.c的核苷酸序列（SEQ ID NO：32；將其用以製備構築體編號1993）。第 9C 圖
顯示IF-HT3*(-Mprot)-PDI.c的核苷酸序列（SEQ ID NO：33；將其用以製備構築體編號1994）。第 9D 圖
顯示IF-HT4*(-Mprot)-PDI.c的核苷酸序列 （SEQ ID NO：34；將其用以製備構築體編號1995）。第 9E 圖
顯示IF-HT5*(-Mprot)-PDI.c的核苷酸序列（SEQ ID NO：35；將其用以製備構築體編號1996）。第 9F 圖
顯示IF-HT6*(-Mprot)-PDI.c 的核苷酸序列（用以製備構築體編號1997的SEQ ID NO：36）。第 9G 圖
顯示IF-HT7*(-Mprot)-PDI.c 的核苷酸序列（SEQ ID NO：37；將其用以製備構築體編號1998）。第 9H 圖
顯示IF-HT8*(-Mprot)-PDI.c的核苷酸序列（SEQ ID NO：38；將其用以製備構築體編號1999）。第 9I 圖
顯示包含使用SEQ ID NO：31（第9A圖）的植物kozak序列（Kozak1）之構築體編號1992示意圖式。包含如構築體1992的相同特徵之構築體1993-1999，除了每個構築體（1993-1999）包含如第9B圖至第9H圖中分別顯示之經修飾的植物Kozak序列（Kozak1）（SEQ ID NOs：32 至 38）。第 10 圖
顯示用來製備構築體編號484與1897（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/H1 加州 NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/H1 加州 NOS；見範例5）的序列組成分。構築體編號484結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/H1 加州）間不包含異種kozak序列。構築體編號1897 包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 10A 圖
顯示PDISP/H1 加州的核苷酸序列（SEQ ID NO： 39）。第 10B 圖
顯示PDISP/H1 加州的胺基酸序列（SEQ ID NO： 40）。第 10C 圖
顯示構築體編號484的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 10D 圖
顯示構築體編號1897的示意圖式 （2X35S/CPMV 160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 11 圖
顯示用來製備構築體編號489、1880與1885（分別為2X35S/CPMV HT H5 印尼 NOS；CPMV160+ H5 印尼 NOS以及CPMV160 H5 印尼 NOS；見範例6）的序列組成分。構築體編號489結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/H1 加州）間不包含異種kozak序列。構築體編號1880包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。構築體編號1885包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR ，且不包括填充片段（多重轉殖位點）或植物kozak序列（此構築體亦不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160（CPMVX，其中X=160）為基礎的構築體範例。NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 11A 圖
顯示天然 H5 印尼的核苷酸序列（SEQ ID NO： 41）。第 11B 圖
顯示天然 H5 印尼的胺基酸序列（SEQ ID NO： 42）。第 11C 圖
顯示構築體編號489的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 11D 圖
顯示構築體編號1880的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以 CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 11E 圖
顯示構築體編號1885的示意圖式（2X35S/CPMV160，以CPMVX為基礎的構築體，其中X=160）。第 12 圖
顯示用來製備構築體編號1240與2168（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/H7 杭州 NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/H7 杭州 NOS；見範例7）的序列組成分。構築體編號1240結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/H7 杭州）間不包含異種kozak序列。構築體編號1897包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 12A 圖
顯示PDISP/H7 杭州的核苷酸序列（SEQ ID NO： 43）。第 12B 圖
顯示PDISP/H7 杭州的胺基酸序列（SEQ ID NO： 44）。第 12C 圖
顯示構築體編號2140的示意圖式 （2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 12D 圖
顯示構築體編號2168的示意圖式 （2X35S/CPMV160+；以CPMVX+為基礎的構築體，其中X=160）。第 13 圖
顯示用來製備構築體編號2130與2188（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT NOS；見範例8）的序列組成分。構築體編號2130結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/H7杭州+H5 印尼 TMCT）間不包含異種kozak序列。構築體編號1897包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；NOS：胭脂鹼合成酶終止子；TMCT：穿膜區域胞質尾。第 13A 圖
顯示PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT 的核苷酸序列（SEQ ID NO： 45）。第 13B 圖
顯示PDISP/H7 杭州+H5 印尼 TMCT的胺基酸序列（SEQ ID NO： 46）。第 13C 圖
顯示構築體編號2130的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 13D 圖
顯示構築體編號2188 的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 14 圖
顯示用來製備構築體編號1039與1937（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-） NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-） NOS；見範例9）的序列組成分。構築體編號1039結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-））間不包含異種kozak序列。構築體編號1937包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽。NOS：胭脂鹼合成酶終止子；PrL-：刪除的蛋白水解環。第 14A 圖
顯示 PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）的核苷酸序列（SEQ ID NO： 47）。第 14B 圖
顯示PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）的胺基酸序列（SEQ ID NO： 48）。第 14C 圖
顯示構築體編號1039的示意圖式 （2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 14D 圖
顯示構築體編號1937的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 15 圖
顯示用來製備構築體編號1067 與 1977（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT NOS；見範例10）的序列組成分。構築體編號484結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT）間不包含異種kozak序列。構築體編號1977包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；NOS：胭脂鹼合成酶終止子； PrL-：刪除蛋白水解環；TMCT：穿膜區域胞質尾。第 15A 圖
顯示PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT的核苷酸序列（SEQ ID NO： 49）。第 15B 圖
顯示PDISP/HA B 布里斯本 （PrL-）+H1 加州 TMCT的胺基酸序列（SEQ ID NO： 50） 。第 15C 圖
顯示構築體編號1067的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 15D 圖
顯示構築體編號1977的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 16 圖
顯示用來製備構築體編號2072 與 2050（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-） NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-） NOS；見範例11）的序列組成分。構築體編號2072結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-））間不包含異種kozak序列。構築體編號2050 包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；NOS：胭脂鹼合成酶終止子； PrL-：刪除蛋白水解環。第 16A 圖
顯示PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-）的核苷酸序列（SEQ ID NO： 51）。第 16B 圖
顯示PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-） 的胺基酸序列（SEQ ID NO：52）。第 16C 圖
顯示構築體編號2072的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 16D 圖
顯示構築體編號2050的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 17 圖
顯示用來製備構築體編號2074 與 2060（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-）+H1 加州 TMCT NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-）+H1 加州 TMCT NOS；見範例12）的序列組成分。構築體編號2074結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/HA B 麻薩諸塞（PrL-）+H1 加州 TMCT）間不包含異種kozak序列。構築體編號2060 包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；NOS：胭脂鹼合成酶終止子；PrL-：刪除蛋白水解環；TMCT：穿膜區域胞質尾。第 17A 圖
顯示 PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-）+H1 加州 TMCT的核苷酸序列（SEQ ID NO： 53）。第 17B 圖
顯示PDISP/HA B 麻薩諸塞 （PrL-）+H1 加州 TMCT的胺基酸序列（SEQ ID NO：54）。第 17C 圖
顯示構築體編號2074的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 17D 圖
顯示構築體編號2060的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 18 圖
顯示用來製備構築體編號1445 、 1820與1975（分別為2X35S/CPMV HT HA B 威斯康辛 （PrL-） NOS、2X35S/CPMV160+ HA B 威斯康辛 （PrL-） NOS 以及 2X35S/CPMV160 HA B 威斯康辛 （PrL-） NOS；見範例13）的序列組成分。構築體編號1445結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（HA B 威斯康辛 （PrL-））間不包含異種kozak序列。構築體編號1820包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。構築體編號1975包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR ，且不包括填充片段（多重轉殖位點）或植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以「CPMV160」 （CPMVX）為基礎的構築體範例。PrL-：刪除蛋白水解環； NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 18A 圖
顯示HA B 威斯康辛 （PrL-） 的核苷酸序列（SEQ ID NO： 55）。第 18B 圖
顯示HA B 威斯康辛 （PrL-） 的胺基酸序列（SEQ ID NO： 56）。第 18C 圖
顯示構築體編號1445的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 18D 圖
顯示構築體編號1820的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體）。第 18E 圖
顯示構築體編號1975 的示意圖式 （2X35S/CPMV160；以CPMVX 為基礎的構築體，其中X=160）。第 19 圖
顯示用來製備構築體編號1454 與 1893（分別為2X35S/CPMV HT HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT NOS 以及 2X35S/CPMV160+ HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT NOS；見範例14）的序列組成分。構築體編號1454結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT）間不包含異種kozak序列。構築體編號1893 包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。NOS：胭脂鹼合成酶終止子；PrL-：刪除蛋白水解環；TMCT：穿膜區域胞質尾。第 19A 圖
顯示HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT的核苷酸序列（SEQ ID NO： 57）。第 19B 圖
顯示PDISP/HA B 威斯康辛 （PrL-）+H1 加州 TMCT的胺基酸序列（SEQ ID NO：58）。第 19C 圖
顯示構築體編號1454的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 19D 圖
顯示構築體編號1893的示意圖式（2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 20 圖
顯示用來製備構築體編號5001 與 2100（分別為2X35S/CPMV HT HC利妥昔單抗（Rituxan） NOS 以及 2X35S/CPMV160+ HC利妥昔單抗（Rituxan）NOS；見範例15）的序列組成分。構築體編號5001結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（HC利妥昔單抗（Rituxan））間不包含異種kozak序列。構築體編號2100包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。HC：重鏈；NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 20A 圖
顯示HC 利妥昔單抗的核苷酸序列（Rituxan；SEQ ID NO： 59）。第 20B 圖
顯示HC 利妥昔單抗的胺基酸序列（Rituxan；SEQ ID NO：60）。第 20C 圖
顯示構築體編號5001的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 20D 圖
顯示構築體編號2100的示意圖式 （2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 21 圖
顯示用來製備構築體編號5002 與 2109（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/HC利妥昔單抗（Rituxan）NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/HC利妥昔單抗（Rituxan）NOS；見範例16）的序列組成分。構築體編號5002結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/HC Rituxan）間不包含異種kozak序列。構築體編號2109包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；HC：重鏈；NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 21A 圖
顯示PDISP/HC利妥昔單抗的核苷酸序列（Rituxan；SEQ ID NO： 61）。第 21B 圖
顯示PDISP/HC利妥昔單抗的胺基酸序列（Rituxan；SEQ ID NO：62）。第 21C 圖
顯示構築體編號5002的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 21D 圖
顯示構築體編號2109的示意圖式 （2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 22 圖
顯示用來製備構築體編號5021 與 2120（分別為2X35S/CPMV HT LC利妥昔單抗（Rituxan）NOS以及2X35S/CPMV160+ LC利妥昔單抗（Rituxan）NOS；見範例17）的序列組成分。構築體編號5021結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（LC利妥昔單抗（Rituxan））間不包含異種kozak序列。構築體編號2120包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；LC：輕鏈；NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 22A 圖
顯示LC 利妥昔單抗的核苷酸序列（Rituxan；SEQ ID NO： 63）。第 22B 圖
顯示LC 利妥昔單抗的胺基酸序列（Rituxan；SEQ ID NO：64）。第 22C 圖
顯示構築體編號5021的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 22D 圖
顯示構築體編號2120的示意圖式 （2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。第 23 圖
顯示用來製備構築體編號5022 與 2129（分別為2X35S/CPMV HT PDISP/LC 利妥昔單抗（Rituxan） NOS 以及 2X35S/CPMV160+ PDISP/LC 利妥昔單抗（Rituxan） NOS；見範例18）的序列組成分。構築體編號5022結合先前技術的CPMV-HT序列（帶有在位置161的突變起始密碼子，融合至編碼不完整M蛋白質的序列之CPMV 5’UTR），且在5’UTR與興趣核苷酸序列（PDISP/LC 利妥昔單抗（Rituxan））間不包含異種kozak序列。構築體編號2129包括含有160核苷酸的CPMV 5’UTR 、填充片段（多重轉殖位點），以及植物kozak序列（此構築體不包含編碼不完整M蛋白質的序列）並且是以CPMV160+（CPMVX+，其中X=160）為基礎的構築體範例。PDISP：蛋白質雙硫鍵異構酶信號肽；HC：重鏈；NOS：胭脂鹼合成酶終止子。第 23A 圖
顯示PDISP/LC 利妥昔單抗的核苷酸序列（Rituxan；SEQ ID NO： 65）。第 23B 圖
顯示PDISP /LC 利妥昔單抗的胺基酸序列（Rituxan；SEQ ID NO：66）。第 23C 圖
顯示構築體編號5022的示意圖式（2X35S/CPMV HT；參考構築體）。第 23D 圖
顯示構築體編號2129的示意圖式 （2X35S/CPMV160+；以CPMVX+ 為基礎的構築體，其中X=160）。
<110> 加拿大商苜蓿股份有限公司
<120> CPMV強化子元件
<130> PCT/CA2015/050009
<150> US61/925,852
<151> 2014-01-10
<160> 80
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV160
<400> 1
<210> 2
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV160+
<400> 2
<210> 3
<400> 3
<210> 4
<211> 517
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV HT(先前技術5'UTR) <400> 之序列「narrma」中「n」表示「A/-」
<400> 4
<210> 5
<400> 5
<210> 6
<400> 6
<210> 7
<400> 7
<210> 8
<400> 8
<210> 9
<400> 9
<210> 10
<400> 10
<210> 11
<400> 11
<210> 12
<400> 12
<210> 13
<400> 13
<210> 14
<400> 14
<210> 15
<400> 15
<210> 16
<400> 16
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-H3V36111.s1-4r
<400> 17
<210> 18
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H3維多利亞的核苷酸序列
<400> 18
<210> 19
<211> 4903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體1191的核苷酸序列
<400> 19
<210> 20
<211> 3465
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表現卡匣編號1391的核苷酸序列
<400> 20
<210> 21
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H3維多利亞的胺基酸序列
<400> 21
<210> 22
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF**(SacII)-PDI.s1+4c
<400> 22
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-H3V36111.s1-4r
<400> 23
<210> 24
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV155
<400> 24
<210> 25
<211> 4644
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體2171的核苷酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 3129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表現卡匣編號1800從2X35S啟動子到NOS終止子的核苷酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV150
<400> 27
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-CPMV(f15'UTR)_SpPDI.c
<400> 28
<210> 29
<211> 4540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體1190的核苷酸序列
<400> 29
<210> 30
<211> 3108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表現卡匣編號1935從2X35S 啟動子至NOS終止子的核苷酸序列
<400> 30
<210> 31
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT1*(-Mprot)-PDI.c
<400> 31
<210> 32
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT2*(-Mprot)-PDI.c
<400> 32
<210> 33
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT3*(-Mprot)-PDI.c
<400> 33
<210> 34
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT4*(-Mprot)-PDI.c
<400> 34
<210> 35
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT5*(-Mprot)-PDI.c
<400> 35
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT6*(-Mprot)-PDI.c
<400> 36
<210> 37
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT7*(-Mprot)-PDI.c
<400> 37
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-HT8*(-Mprot)-PDI.c
<400> 38
<210> 39
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H1加州的核苷酸序列
<400> 39
<210> 40
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H1加州的胺基酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 1707
<212> DNA
<213> 流感病毒H5印尼
<400> 41
<210> 42
<211> 568
<212> PRT
<213> 流感病毒H5印尼
<400> 42
<210> 43
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H7杭州的核苷酸序列
<400> 43
<210> 44
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H7杭州的胺基酸序列
<400> 44
<210> 45
<211> 1698
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H7杭州+H5印尼TMCT的核苷酸序列
<400> 45
<210> 46
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/H7杭州+H5印尼TMCT的胺基酸序列
<400> 46
<210> 47
<211> 1734
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B布里斯本(PrL-)的核苷酸序列
<400> 47
<210> 48
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B布里斯本(PrL-)的胺基酸序列
<400> 48
<210> 49
<211> 1734
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B布里斯本(PrL-)+H1加州TMCT的核苷酸序列
<400> 49
<210> 50
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B布里斯本(PrL-)+H1加州TMCT的胺基酸序列
<400> 50
<210> 51
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B麻薩諸塞(PrL-)的核苷酸序列
<400> 51
<210> 52
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B麻薩諸塞(PrL-)的胺基酸序列
<400> 52
<210> 53
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B麻薩諸塞(PrL-)+H1加州TMCT的核苷酸序列
<400> 53
<210> 54
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HA B麻薩諸塞(PrL-)+H1加州TMCT的胺基酸序列
<400> 54
<210> 55
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA B威斯康辛(PrL-)的核苷酸序列
<400> 55
<210> 56
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA B威斯康辛(PrL-)的胺基酸序列
<400> 56
<210> 57
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA B威斯康辛(PrL-)+H1加州TMCT的核苷酸序列
<400> 57
<210> 58
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA B威斯康辛(PrL-)+H1加州TMCT的胺基酸序列
<400> 58
<210> 59
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC Rituxan的核苷酸序列
<400> 59
<210> 60
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC Rituxan的胺基酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HC Rituxan的核苷酸序列
<400> 61
<210> 62
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/HC Rituxan的胺基酸序列
<400> 62
<210> 63
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC Rituxan的核苷酸序列
<400> 63
<210> 64
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC Rituxan的胺基酸序列
<400> 64
<210> 65
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/LC Rituxan的核苷酸序列
<400> 65
<210> 66
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDISP/LC Rituxan的胺基酸序列
<400> 66
<210> 67
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF-PDI.S1+3c
<400> 67
<210> 68
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV114
<400> 68
<210> 69
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV160,115A
<400> 69
<210> 70
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV155,115A
<400> 70
<210> 71
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV150,115A
<400> 71
<210> 72
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV155+
<400> 72
<210> 73
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV150+
<400> 73
<210> 74
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV114+
<400> 74
<210> 75
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV160+,115A
<400> 75
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<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV155+,115A
<400> 76
<210> 77
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV150+,115A
<400> 77
<210> 78
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穿膜區域一致性胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<400> 78
<210> 79
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Patatin信號肽；核苷酸序列
<400> 79
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Patatin信號肽；胺基酸序列
<400> 80
ATG‧‧‧鄰近起始序列
CPMV‧‧‧豇豆嵌紋病毒
UTR‧‧‧非轉譯區域
Claims (22)
- 一種核酸表現構築體，包含一表現強化子序列，操作性地連接至位於該表現強化子序列3’之一興趣異種序列，其中該表現強化子序列由SEQ ID NO：1的核苷酸1-160組成或由具有取代G115A的SEQ ID NO：1的核苷酸1-160組成，並且其中該核酸表現構築體不包含SEQ ID NO：4的核苷酸161-509。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸表現構築體，其中該興趣異種序列係選自由一植物kozak序列、一多重轉殖位點、一連接子、一多位點接頭、一重組位點、編碼一興趣蛋白質的一核苷酸序列及其組合所組成之群組。
- 如申請專利範圍第2項所述之核酸表現構築體，其中該興趣異種序列包含一植物kozak序列。
- 如申請專利範圍第3項所述之核酸表現構築體，其中該興趣異種序列進一步包含一多重轉殖位點。
- 如申請專利範圍第3項所述之核酸表現構築體，其中該kozak序列係選自如SEQ ID NO：5-17中所顯示的序列之群組。
- 如申請專利範圍第2項所述之核酸表現構築體，其包含SEQ ID NO：2的一核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之核酸表現構築體，其中該表現強化子序列由SEQ ID NO：69所組成。
- 如申請專利範圍第2項所述之核酸表現構築體，其包含SEQ ID NO：75的一核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第2項所述之核酸表現構築體，其中該興趣蛋白質為一流感血球凝集素(HA)，且該興趣核苷酸序列係選自B HA、C、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15與H16。
- 如申請專利範圍第9項所述之核酸表現構築體，其中該HA為一嵌合HA，其中該HA的一天然穿膜區係被一異種性穿膜區取代。
- 如申請專利範圍第10項所述之核酸表現構築體，其中該異種性穿膜區係由H1加州獲得。
- 一種植物表現系統，包含如申請專利範圍第1項所述之核酸表現構築體，其中該表現強化子與一調節區域操作性地連接。
- 如申請專利範圍第12項所述之植物表現系統，其中該核酸表現構築體進一步包含一豇豆花葉病毒3’UTR。
- 如申請專利範圍第12項所述之植物表現系統，進一步包含一第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一沉默抑制子。
- 如申請專利範圍第14項所述之植物表現系統，其中該沉默抑制子係選自HcPro與p19的群組。
- 如申請專利範圍第12項所述之植物表現系統，其中該調節區域係選自一質體藍素啟動子、一CaMV 35S啟動子、一2x CaMV35S啟動子、一CAS啟動子、一RbcS啟動子、一Ubi啟動子或一肌動蛋白啟動子。
- 如申請專利範圍第12項所述之植物表現系統，其中該興趣核苷酸序列編碼一病毒蛋白質或一抗體。
- 如申請專利範圍第17項所述之植物表現系統，其中該病毒蛋白質為一流感血球凝集素，該流感血球凝集素係選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16以及流感B型血球凝集素所組成之群組。
- 如申請專利範圍第17項所述之植物表現系統，其中編碼該病毒蛋白質或該抗體的該核苷酸序列係包含一天然信號肽序列或一非天然信號肽。
- 如申請專利範圍第19項所述之植物表現系統，其中該非天然信號肽係來自蛋白質雙硫鍵異構酶(PDI)。
- 一種在一植物或該植物的部分中生產一興趣蛋白質的方法，該方法包含將如申請專利範圍第12項所述之植物表現系統引入至該植物或至該植物的部分，其中該興趣異種序列包含編碼該興趣蛋白質的一核苷酸序列，以及在容許編碼該興趣蛋白質的該核苷酸序列表現之條件下培養該植物或該植物的部分。
- 一種生產一植物或一植物的部分的方法，該方法包含：以如申請專利範圍第12項所述之植物表現系統過渡地轉染或穩定地轉形一植物或一植物的部分，其中該興趣異種序列包含編碼該興趣蛋白質的一核苷酸序列。
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-
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