PT2240589E - Sistemas de expressão de proteínas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

SISTEMAS DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se de forma geral a métodos e materiais, e especialmente sequências derivadas de vírus, para reforçar a expressão génica em plantas e outras células eucariotas, por exemplo, de genes heterólogos que codificam proteínas de interesse. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Comovírus (CPMV)

Os comovírus são vírus de ARN que um genoma bipartido. Os segmentos do genoma de ARN comoviral são denominados ARN-1 e ARN-2. ARN-1 codifica as proteínas replicase e protease de Vpg (Lomonossoff e Shanks, 1983) . 0 vírus necessita a replicase para a replicação do genoma virai. 0 ARN-2 do comovírus vírus do mosaico do feijão-frade (CPMV) codifica uma proteína de 58K e 48K, assim como duas proteínas da cobertura viral L e S. 0 inicio da tradução do ARN-2 de todos os comovírus é produzido em dois pontos de início diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, o que resulta em duas carboxiproteínas coterminais. Este fenómeno de duplo início é produzido como resultado de um 'escape do varrimento ribossómico (leaky scanning) dos ribossomas durante a tradução.

Os codões de início da extremidade 5' (AUG) do ARN-2 de CPMV estão nas posições 115, 161, 512 e 524. Os codões de inicio nas posições 161 e 512 estão na mesma grelha de leitura do triplete. 0 início no codão de início da posição 161 resulta na síntese de uma poliproteína de 105 K enquanto que o inicio no codão de início da posição 512 dirige a síntese de uma poliproteína de 95K. Como a síntese de ambas as poliproteínas finaliza no mesmo codão de parada na posição 3299, as proteínas 105K e 95K são carboxi coterminais. O codão AUG na posição 524 pode servir como iniciador se o AUG em 512 for apagado. No entanto, em presença do AUG 512, não realiza esta função e simplesmente codifica o aminoácido metionina (Holness et al., 1989; Wellink et al., 1993) . 0 codão de inicio em posição 115 não é fundamental para a replicação do vírus (Wellink et al., 1993) .

As proteínas de 105K e 95K codificadas pelo genoma ARN-2 de CPMV são produtos de tradução primária que posteriormente são clivadas por meio da atividade proteolítica codificada por ARN-1 para produzir a proteína de 58K ou a proteína de 48K, dependendo de se a poliproteína que se está processando é de 105K ou 95K, e as duas proteínas virais da cobertura, L e S. 0 início da tradução no codão de início na posição 512 em CPMV é mais eficaz que o início na posição 161, o que resulta na produção de mais poliproteína de 95K que de poliproteína de 105K. 0 codão de inicio na posição 115 no ARN-2 de CPMV está na direção 5' dos locais de início nas posições 161 e 512 e está numa grelha de leitura diferente. Uma vez que este codão de inicio está em fase com um codão de parada na posição 175, o início neste local poderia dar como resultado a produção de um péptido de 20 aminoácidos. No entanto, até o momento não foi detetada a produção do dito péptido.

Necessidade de manter a grelha entre AUG

Os experiências de mutagénese tÊm mostrado que a manutenção do grelha entre os locais de início nas posições 161 e 512 do ARN-2 de CPMV é essencial para uma replicação eficaz de ARN-2 por meio da replicase codificada por ARN-1 (Holness et al., 1989; van Bokhoven et al., 1993; Rohll et al., 1993; Wellink et al. , 1993) . Este requisito restringe o comprimento das sequências que podem ser inseridas na direção 5' do codão de início 512 em vetores de expressão baseados em ARN-2 de CPMV (veja-se a seguir), fazendo que a clonagem de genes exógenos nos ditos vetores seja mais difícil do que seria ideal. Por exemplo, impede a utilização de poliligantes, já que a utilização destes frequentemente altera a grelha de leitura aberta (ORF) entre estes locais de inicio.

Vetores CPMV CPMV serviu como base para o desenvolvimento de sistemas vetores adequados para a produção de polipéptidos heterólogos em plantas (Liu et al., 2005; Sainsbury et al., 2007). Estes sistemas estão baseados na modificação do ARN-2 mas diferem em se são utilizadas versões de comprimento completa ou deletadas. Em ambos os casos, no entanto, a replicação do ARN-2 modificado é conseguida por meio da inoculação simultânea com ARN-1. Os sistemas de expressão baseados numa versão do ARN-2 de comprimento completo implicam a fusão da proteína exógena com a extremidade C das poliproteínas derivadas do ARN-2. A libertação do polipéptido da extremidade N está mediada pela ação da sequência do péptido catalítico 2A procedente do vírus da doença de mão e pés (Gopinath et al., 2000). As moléculas de ARN-2 resultantes podem ser disseminadas numa planta e também entre plantas. Esta estratégia foi utilizada para expressar numerosas proteínas recombinantes, tal como o antigénio principal da hepatite B (HBcAg) e proteínas imunes pequenas (SIP), em plantas de feijão-frade (Mechtcheriakova et al., 2006; Monger et al., 2006; Alamillo et al., 2006) . Embora tenha tido sucesso, a utilização de um vetor virai de comprimento completo tem desvantagens em termos limitações de tamanho das sequências inseridas e preocupações sobre bioconfinamento.

Para resolver isto, desenvolveu-se recentemente uma versão deletada do ARN-2 de CPMV (Canizares et al., 2006). Neste sistema, foram eliminadas a região do ARN-2 que codifica a proteína do movimento e ambas as proteínas da cobertura. No entanto, as moléculas deletadas continuam tendo as sequências de ação em cis necessárias para sua replicação por meio da replicase codificada por ARN-1 e desta forma são mantidas níveis elevados de amplificação génica sem a possibilidade concomitante de que o vírus modificado contamine o meio ambiente. Com a inclusão de um supressor do silenciamento génico, tal como HcPro de PVY, (Brigneti et al. , 1998) no inoculo além do ARN-1, o vetor CPMV deletado pode ser utlizado como um sistema de expressão transitória (documento WO/2007/135480) Bipartite System, Method And Composition For The Constitutive And Inducible Expression Of High Levels Of Foreign Proteins In Plants; também Sainsbury et al. , 2009) . No entanto, ao contrário da situação com um vetor baseado no ARN-2 de comprimento completa, a replicação fica restringida às folhas inoculadas. Estes vetores de CPMV têm sido utilizados para expressar complexos multicadeia que consistem num único tipo de polipéptido.

Também foi demostrado que múltiplas cópias de vetores baseados nas versões de comprimento completa ou em versões deletadas do ARN-2 de CPMV são adequadas para a produção de proteínas heteroméricas em plantas (Sainsbury et al. , 2008) . Foi utilizada a infiltração simultânea de duas construções de ARN-2 de comprimento completo que incluem diferentes genes marcadores em Nlcotlana benthamiana em presença de ARN-1 para mostrar que duas proteínas exógenas podem ser expressas eficazmente dentro da mesma célula em tecido inoculado. Além disso, as proteínas podem ser localizadas simultaneamente nos mesmos compartimentos subcelulares, que é um pré-requisito essencial da formação de heterómeros.

Também foi investigado a adequabilidade dos diferentes vetores de ARN-2 de CPMV para a expressão de proteínas heteroméricas em plantas. A inserção das cadeias leve e pesada de uma IgG nas versões de ARN-2 tanto de comprimento completo como deletada demostrou que ambos as abordagens levavam à acumulação de moléculas de IgG de comprimento completo no tecido inoculado, mas que os níveis eram consideravelmente maiores quando são utilizados vetores de ARN-2 deletados. A capacidade das construções de ARN-2 de comprimento completo para ser disseminadas sistemicamente parece, portanto, ser irrelevante para a produção de proteínas heteroméricas, e a utilização de versões de ARN-2 deletadas é claramente vantajoso, especialmente porque também oferecem a vantagem do bioconfinamento.

Portanto, os sistemas vetores conhecidos baseados em CPMV representam ferramentas úteis para a expressão de um gene heterólogo que codifica uma proteína de interesse em plantas. No entanto, continua existindo necessidade na técnica de sistemas vetores ótimos para melhorar, por exemplo, o rendimento das proteínas heterólogas expressas e a facilidade de utilização do vetor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que a mutação do codão de início na posição 161 de um vetor de ARN-2 de CPMV aumenta fortemente os níveis de expressão de uma proteína codificada por um gene inserido depois do codão de início na posição 512. Os níveis de expressão de proteína aumentaram cerca de 20-30 vezes em comparação com a expressão da mesma proteína a partir de um vetor de ARN-2 de CPMV que somente difere em que o codão de início na posição 161 estava intato (Sainsbury e Lomonossoff, 2008) . A presente invenção permite a produção de elevados níveis de proteínas exógenas sem a necessidade de replicação virai.

Os inventores descobriram também que a mutação do codão de início na posição 161 nega a necessidade de manter a grelha entre a posição do codão de início na posição 161 mutado e o codão de início na posição 512, permitindo deste modo a inserção de sequências de qualquer comprimento depois do codão de início na posição 161 mutado. Isto é especialmente vantajoso já que permite inserir poliligantes de qualquer comprimento em vetores de ARN-2 após o codão de início mutado, que podem ser utilizados depois para facilitar a clonagem de um gene de interesse no vetor.

Além disso, os inventores descobriram que, apesar do aumento na expressão da proteína, as plantas transformadas com um vetor de ARN-2 de CPMV que compreendem um codão de início na posição 161 mutado tinham um aspeto mais saudável, isto é, mostraram menos necrose, que plantas transformadas com vetores de ARN-2 de CPMV conhecidos. A saúde das plantas é um fator importante na expressão de proteínas a partir de plantes, já que as plantas saudáveis sobrevivem durante períodos de tempo mais prolongados. Além disso, a saúde da planta também é importante para a purificação de proteínas a partir das plantas, já que os taninos libertados como resultado da necrose interferem com a purificação de proteínas (Sainsbury e Lomonossoff, 2008).

Assim, a presente invenção refere-se a sistemas e métodos melhorados de produção de proteínas, baseados em sequências modificadas do vírus bipartido.

Assim, nos diferentes aspetos da invenção tal como é definido nas reivindicações, é utilizada uma sequência potenciadora da expressão, sequência que é derivada de (ou comparte homologia com) o segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido, tal como um comovírus, em que foi mutado um local de início alvo. A presente invenção proporciona além disso processos como é definido nas reivindicações para aumentar a expressão ou potenciar a atividade traducional de uma sequência derivada de um segmento derivado do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido, onde os ditos processos compreendem a mutação de um local de início no mesmo.

Algumas definições e formas de realização particulares da invenção serão descritas agora com mais detalhe.

Sequências "potenciadoras" (ou elementos potenciadores) , tal como se cita no presente documento, são sequências que são derivadas (ou compartem homologia com) o segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido, tal como um comovírus, em que foi mutado um local de início alvo. As ditas sequências podem potenciar a expressão na direção 3' de uma ORF heteróloga à qual estão ligadas. Sem limitação, acredita-se que as ditas sequências, quando estão presentes no ARN transcrito, podem potenciar a tradução de uma ORF heteróloga à qual estão ligadas.

Um "local de início alvo" tal como se cita no presente documento, é o local de início (codão de início) de um segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido natural (por exemplo, um comovírus) do que é derivado o potenciador de sequência em questão, que serve como locais de início para a produção (tradução) da mais longa das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 natural.

Tal como foi descrito anteriormente, da mais longa das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo ARN-2 de CPMV, a proteína de 105K, se inicia no local de início na posição 161 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural. Portanto, as sequências potenciadoras do local de início alvo derivadas do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV é o local de início na posição 161 do ARN-2 de CPMV natural.

As mutações ao redor do codão de inicio na posição 161 podem ter o mesmo efeito (ou um efeito similar) à própria mutação do codão de início na posição 161, por exemplo, perturbando o contexto ao redor deste codão de inicio pode significar que o codão de início é derivado com maior frequência.

Um local de início alvo pode ser 'mutado' indiretamente por meio da mutação de um ou mais nucleótidos na direção 5' e/ou na direção 3' do local de início alvo, mas retendo o local de início alvo natural, em que o efeito da mutação do ditos nucleótidos é o mesmo, ou similar, ao efeito observado quando se muta o próprio local de inicio alvo.

Uma vez que os locais de início alvo servem como o de ligação para a produção da mais longa das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 natural, resulta que os locais de início alvo estão na grelha (em fase) com um segundo local de início no mesmo segmento do genoma de ARN-2 natural, que serve como local de início para a produção da mais curta das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo ARN-2 natural. Dois locais de inicio estão em grelha se estão na mesma grelha de leitura do triplete. 0 local de inicio alvo das sequências potenciadoras derivadas do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural, isto é, o local de inicio na posição 161, está em grelha com respeito ao local de inicio na posição 512, que serve como local de inicio para a produção da mais curta das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo ARN-2 de CPMV (a proteína de 95K) do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural.

Portanto, um local de início alvo localiza-se antes (em 5 ' ) de um segundo local de início no segmento do genoma de ARN-2 natural do qual é derivada a sequência potenciadora, que serve como o local de início para a produção da mais curta das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 natural. Além disso, um local de início alvo também pode ser localizado a jusante (3') de um terceiro local de inicio no segmento do genoma de ARN-2 natural do qual é derivada a sequência potenciadora. Em CPMV, o local de início alvo, isto é, o local de início na posição 161, está situado na direção 5' de um segundo local de inicio em posição 512 que serve como local de início para a produção da proteína de 95K e na direção 3' de um terceiro local de início na posição 115.

Um local de início alvo de uma sequência potenciadora derivada do segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido é, portanto, o primeiro ou o segundo local de início para a produção de duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo ARN-2 natural. 'Primeiro' neste contexto refere-se ao local de inicio situado mais cerca da extremidade 5' do segmento do genoma de ARN-2 natural.

Mais de um local de ligação na sequência pode ser mutado, se for desejado. Por exemplo, o 'terceiro' local de início em (ou correspondente a) a posição 115 também pode ser deletado ou alterado. Foi demostrado que a eliminação de AUG 115 além da eliminação de AUG 161, potência adicionalmente a expressão (Sainsbury e Lomonossoff, 2008) .

As sequências potenciadoras da presente invenção baseiam-se em sequências modificadas procedentes dos segmentos de genoma do ARN-2 dos virus de ARN bipartidos da família Comoviridae. Todos os géneros da família Comoviridae parecem codificar duas carboxiproteínas coterminais. Os géneros da família Comoviridae incluem Comovírus, Nepovírus, Fabavírus, Cheravírus e Sadwavírus. Os comovírus incluem vírus do mosaico do feijão-frade (CPMV), vírus grave do mosaico do feijão-frade (CPSMV), vírus do mosaico da abóbora (SqMV), vírus do mosqueado do trevo vermelho (RCMV), vírus do mosqueado do vaso de feijoeiro (BPMV). Preferentemente, o vírus bipartido (ou comovírus) é CPMV.

As sequências dos segmentos do genoma de ARN-2 destes comovírus e várias estirpes específicas estão disponíveis da base de dados de NCBI com os números de acesso relacionados entre parênteses: ARN-2 de vírus do mosaico do feijão-frade (NC_003550), ARN-2 de vírus grave do mosaico do feijão-frade (NC_003544), ARN-2 de vírus do mosaico da abóbora (NC_003800), ARN-2 de vírus do mosaico da abóbora estirpe Kimble (AF059533) , ARN-2 de vírus do mosaico da abóbora estirpe Arizona (AF059532), ARN-2 de vírus do mosqueado do trevo vermelho (NC_003738), ARN-2 de vírus do mosqueado do vaso de feijoeiro (NC_003495), ARN-2 de vírus do mosqueado do vaso de feijoeiro estirpe K-Hopkinsl (AF394609), ARN-2 de vírus do mosqueado do vaso de feijoeiro estirpe K-Hancockl (AF394607), vírus do mosqueado da batata andina (APMoV: L16239) e vírus do mosaico do rábano (RaMV; AB295644). Também estão disponíveis sequências de ARN-2 disponíveis do vírus do mosaico do feijoeiro rugoso (BRMV; AF263548) e um possível membro do género Comovírus, vírus do mosqueado do nabo (EF191015). Também estão disponíveis numerosas sequências de outros géneros da família Comoviridae.

Até agora, todos os comovírus que foram investigados mostraram ter dois codões de início alternativos para a expressão de dois policarboxiproteínas coterminais a partir de seus segmentos do genoma de ARN-2 . Em particular, os segmentos do genoma de ARN-2 de CPMV, CPSMV, BPMV, SqMV e RCMV são conhecidos por compreender dois locais de inicio alternativos para a expressão de dois policarboxiproteínas coterminais.

Os locais de inicio alvo em outros comovirus, que são equivalentes ao local de inicio na posição 161 do segmento de ARN-2 de CPMV natural (isto é, correspondente ao mesmo) podem ser identificados por métodos conhecidos na matéria. Por exemplo, podem ser identificados locais de inicio alvo por meio de um alinhamento de sequências entre a sequência do segmento do genoma de ARN-2 natural de CPMV e a sequência do segmento do genoma de ARN-2 de outro comovirus. Os ditos alinhamentos de sequência podem ser utilizados depois para identificar um local de inicio alvo na sequência do segmento do genoma de ARN-2 comoviral por meio da identificação de um local de inicio que, pelo menos na alinhamento, está cerca, ou na mesma posição que, o local de inicio alvo na posição 161 do ARN-2 de CPMV natural.

Os locais de inicio alvo em outros comovirus também podem ser identificados determinando o codão de inicio que serve como local de inicio para a síntese da mais longa das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 do comovirus natural. Esta abordagem também pode ser utlizada juntamente com um alinhamento como foi descrito anteriormente, isto é, esta abordagem pode ser utlizada para confirmar que um local de início de um comovirus identificado por meio de um alinhamento com um ARN-2 de CPMV é um local de início alvo.

Obviamente, os métodos anteriores também podem ser utilizados para identificar locais de início em outros segmentos do genoma de ARN-2 comoviral do comovirus que sejam equivalentes ao local de inicio na posição 512 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural. No entanto, em lugar de identificar o codão de início que serve como local de início para a síntese da mais longa das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 do comovírus natural, identifica-se o codão de início que serve como local de início para a síntese da mais curta das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 do comovírus natural.

Uma vez que foram identificados os dois locais de início do ARN-2 do comovírus que poderiam ser equivalentes aos locais de início nas posições 161 e 512 do ARN-2 de CPMV, a identificação do local de início alvo pode srr confirmada comprovando que os dois locais de inicio estão na mesma grelha, isto é, na mesma grelha de leitura do triplete, já que somente podem servir como locais de início para a produção de duas carboxiproteínas coterminais se esse for o caso.

Numa forma de realização da invenção, a sequência potenciadora compreende os nucleótidos 1 a 512 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV (veja-se o Quadro 1), em que o local de início alvo na posição 161 foi mutado. Em outra forma de realização da invenção, a sequência potenciadora compreende uma sequência equivalente de outro comovírus, em que o local de início alvo equivalente ao codão de início na posição 161 foi mutado. 0 local de inicio alvo pode ser mutado por substituição, deleção ou inserção. Preferentemente, o local de início alvo se muta com uma mutação pontual.

Em formas de realização alternativas da invenção, a sequência potenciadora compreende os nucleótidos 10 a 512, 20 a 512, 30 a 512, 40 a 512, 50 a 512, 100 a 512, 150 a 512, 1 a 514, 10 a 514, 20 a 514, 30 a 514, 40 a 514, 50 a 514, 100 a 514, 150 a 514, 1 a 511, 10 a 511, 20 a 511, 30 a 511, 40 a 511, 50 a 511, 100 a 511, 150 a 511, 1 a 509, 10 a 509, 20 a 509, 30 a 509, 40 a 509, 50 a 509, 100 a 509, 150 a 509, 1 a 507, 10 a 507, 20 a 507, 30 a 507, 40 a 507, 50 a 507, 100 a 507, ou 150 a 507 de um de uma sequência do segmento do genoma de ARN-2 do comovírus com um local de início alvo mutado. Em outras formas de realização da invenção, a sequência potenciadora compreende os nucleótidos 10 a 512, 20 a 512, 30 a 512, 40 a 512, 50 a 512, 100 a 512, 150 a 512, 1 a 514, 10 a 514, 20 a 514, 30 a 514, 40 a 514, 50 a 514, 100 a 514, 150 a 514, 1 a 511, 10 a 511, 20 a 511, 30 a 511, 40 a 511, 50 a 511, 100 a 511, 150 a 511, a 509, 10 a 509, 20 a 509, 30 a 509, 40 a 509, 50 a 509, 100 a 509, 150 a 509, 1 a 507, 10 a 507, 20 a 507, 30 a 507, 40 a 507, 50 a 507, 100 a 507, ou 150 a 507 da sequência do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrado no Quadro 1, em que o local de início alvo na posição 161 do segmento do genoma do ARN-2 de CPMV natural foi mutado.

Em algumas formas de realização da invenção, a sequência potenciadora compreende os nucleótidos 1 a 500, 1 a 490, 1 a 480, 1 a 470, 1 a 460, 1 a 450, 1 a 400, 1 a 350, 1 a 300, 1 a 250, ou 1 a 200 de um de uma sequência do segmento do genoma de ARN-2 do comovírus com um local de início alvo mutado.

Em formas de realização alternativas da invenção, a sequência potenciadora compreende os nucleótidos 1 a 500, 1 a 490, 1 a 480, 1 a 470, 1 a 460, 1 a 450, 1 a 400, 1 a 350, 1 a 300, 1 a 250, ou 1 a 200, do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrado no Quadro 1, em que o local de início alvo na posição 161 do segmento do genoma do ARN-2 de CPMV natural foi mutado.

As sequências potenciadoras compreendem pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 460, pelo menos 470, pelo menos 480, pelo menos 490 ou pelo menos 500 nucleótidos de uma sequência do segmento do genoma de ARN-2 do comovírus com um local de início alvo mutado são também formas de realização da invenção.

Além disso, as sequências potenciadoras compreendem pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 460, pelo menos 470, pelo menos 480, pelo menos 490 ou pelo menos 500 nucleótidos da sequência do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrado no Quadro 1, em que o local de início alvo na posição 161 do segmento do genoma do ARN-2 de CPMV natural foi mutado, são também formas de realização da invenção.

As formas de realização alternativas da invenção são sequências potenciadoras que têm pelo menos 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, de identidade com o segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrado no Quadro 1, em que o local de inicio alvo na posição 161 do segmento do genoma do ARN-2 de CPMV natural foi mutado.

Os termos "percentagem de semelhança", "percentagem de identidade" e "percentagem de homologia", quando referem-se a uma sequência particular, são utilizados como é definido no programa informático GCG da Universidade de Wisconsin. Deste modo, as sequências potenciadoras podem ser hibridadas especificamente com a sequência complementar do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrado no Quadro 1, com a condição de que o local de inicio alvo corresponda à posição 161 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural tenha sido mutado. A expressão "híbrida especificamente" refere-se à associação entre duas moléculas de ácido nucleico de cadeia simples com uma complementaridade de sequência suficiente para permitir a dita hibridação em condições predeterminadas geralmente utilizadas na técnica (a vezes denominada "substancialmente complementar"). Em particular, o termo refere-se à hibridação de um oligonucleótido com uma sequência substancialmente complementar incluída numa molécula de cadeia simples de ADN ou ARN da invenção, para a exclusão substancial da hibridação do oligonucleót ido com ácidos nucleicos de cadeia simples de sequência não complementar. "Complementar" refere-se à associação natural de sequências de ácido nucleico por meio de emparelhamento de bases (pares A-G-T com a sequência complementar T-C-A). A complementaridade entre duas moléculas de cadeia simples pode ser parcial, se somente parte das pares de ácidos nucleicos são complementares; ou completa, se todos os pares de bases são complementares. O grau de complementaridade afeta à eficácia e a intensidade da hibridação e das condições de amplificação.

Um local de início alvo de uma sequência potenciadora da invenção pode ser mutado por deleção, inserção ou substituição, de forma que já não funcione como um local de inicio da tradução. Por exemplo, pode ser realizada uma mutação pontual na posição do local de inicio alvo da sequência potenciadora. Como alternativa, o local de inicio alvo da sequência potenciadora pode ser deletado parcialmente ou em sua totalidade. Por exemplo, pode ser realizada uma deleção que amplie o local de inicio alvo da sequência potenciadora. As deleções que ampliam o local de inicio podem ter até 5, até 10, até 15, até 20, até 25, até 30, até 35, até 40, até 45, ou até 50 nucleótidos de comprimento, quando se compara com a sequência do segmento do genoma de ARN-2 natural a partir da que é derivada a sequência potenciadora.

Sem desejar estar ligados a teoria nenhuma, acredita-se que a mutação do codão de inicio na posição 161 de CPMV leva à inativação de um supressor traducional, que resulta em um inicio potenciado da tradução a partir dos codões de inicio situados na direção 3' do supressor traducional inativado.

Portanto, a presente divulgação proporciona uma sequência potenciadora derivada de um segmento do genoma de ARN-2 de um virus de ARN bipartido, em que a sequência potenciadora compreende uma sequência supressor da tradução inativada. A presente invenção proporciona, além disso, um processo como é definido nas reivindicações para aumentar a expressão ou potenciar a atividade traducional de uma sequência derivada de um segmento derivado do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido, processo que compreende a inativação de uma sequência supressora da tradução no anterior.

Como já foi mencionado anteriormente, acredita-se que a mutação do local de início na posição 161 no segmento do genoma de ARN-2 de CPMV leva à inativação de um supressor da tradução normalmente presente no ARN-2 de CPMV.

Uma sequência supressora da tradução, tal como se cita no presente documento, é uma sequência do segmento do genoma de ARN-2 do vírus de ARN bipartido natural (por exemplo, um comovírus) do que é derivada o potenciador de sequência em questão, que compreende, ou consiste de, o local de inicio para a produção (tradução) da mais longa das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 natural.

As sequências supressoras da tradução nas sequências potenciadoras derivadas do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV, são sequências que compreendem, ou consistem em, o local de inicio alvo anteriormente descrito. Portanto, as sequências supressoras da tradução compreendem, ou consistem em, um local de inicio alvo tal como foi definido anteriormente, e pode ser inativado por meio de mutagénese como foi descrito anteriormente.

As sequências potenciadoras anteriormente definidas podem ser utilizadas em vários aspetos e formas de realização da invenção da seguinte forma.

Os aspetos da presente invenção tal como são definidos nas reivindicações podem utilizar um ácido nucleico isolado que consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência potenciadora da expressão como foi descrito anteriormente. "Ácido nucleico" ou uma "molécula de ácido nucleico" tal como é utilizado no presente documento refere-se a qualquer molécula de ADN ou ARN, tanto de cadeia simples como de cadeia dupla e, em caso de ser de cadeia simples, a molécula de sua sequência complementar em forma tanto linear como circular. Na descrição das moléculas de ácido nucleico, uma sequência ou estrutura de uma molécula de ácido particular se pode descrever no presente documento de acordo com a convenção normal de proporcionar a sequência na direção de 5 ' a 3'. Com referência aos ácidos nucleicos da invenção, a vezes é utilizada a expressão "ácido nucleico isolado". Esta expressão, quando se aplica ao ADN, refere-se a uma molécula de ADN que está separada das sequências da qual é imediatamente continua no genoma natural do organismo a partir do que se origina.

Por exemplo, um "ácido nucleico isolado" pode compreender uma molécula de ADN inserida num vetor, tal como um plasmideo ou um vetor virai, ou integrado no ADN genómico de uma célula procariota ou eucariota ou organismo hospedeiro.

Quando se aplica ao ARN, a expressão "ácido nucleico isolado" refere-se principalmente a uma molécula de ARN codificada por meio de uma molécula de ADN isolada tal como foi definido anteriormente. Como alternativa, a expressão pode se referir a uma molécula de ARN que está o suficientemente separada de outros ácidos nucleicos que se associariam com seu estado natural (isto é, em células ou tecidos). Um "ácido nucleico isolado" (tanto de ADN como de ARN) pode representar adicionalmente uma molécula produzida diretamente por meios biológicos ou sintéticos e separados de outros componentes presentes durante a sua produção. 0 ácido nucleico pode consistir, portanto, essencialmente numa porção, ou fragmento, do segmento do genoma de ARN-2 do vírus de ARN bipartido do qual é derivado o potenciador. Por exemplo, numa forma de realização, o ácido nucleico não compreende pelo menos uma porção da região de codificação do segmento do genoma de ARN-2 do que é derivada. A região de codificação pode ser a região do segmento do genoma de ARN-2 que codifica a mais curta das duas carboxiproteínas coterminais. 0 ácido nucleico pode consistir, ou consiste essencialmente na porção de um segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido que se estende desde a extremidade 5' do segmento do genoma de ARN-2 natural ao local de início a partir do que se inicia a produção (tradução) da mais curta das duas carboxiproteínas coterminais codificadas pelo segmento do genoma de ARN-2 natural. A expressão "consiste essencialmente em" quando se refere a um nucleótido ou aminoácido particular significa uma sequência que tem as propriedades de uma SEQ ID N° dada. Por exemplo, quando é utilizada em referência a uma sequência de aminoácidos, a expressão inclui a sequência por si mesma e as modificações moleculares que não afetem as características básicas e novas da sequência. Por exemplo, quando é utilizada em referência a um ácido nucleico, a expressão inclui a sequência por si mesma e os mudanças menores e/ou extensões que não afetem a função potenciadora da sequência, ou proporcionar maior funcionalidade (adicional). A invenção refere-se além disso a sistemas de expressão génica tal como foi definido nas reivindicações que compreende uma sequência potenciadora da invenção.

Portanto, em outro aspeto, a presente invenção proporciona um sistema de expressão génica definida nas reivindicações que compreende uma sequência potenciadora como foi descrito anteriormente. 0 sistema de expressão génica pode compreender também um gene que codifica uma proteína de interesse inserida na direção 3' da sequência potenciadora. As sequências inseridas que codificam uma proteína de interesse podem ter qualquer tamanho.

Num aspeto adicional, portanto, a presente invenção proporciona um sistema de expressão génica como é definido nas reivindicações que compreende: (a) uma sequência potenciadora como foi descrito anteriormente; e (b) um gene heterólogo que codifica uma proteína de interesse, em que o gene está situado na direção 3' da sequência potenciadora. 0 gene e a proteína de interesse são heterólogos, isto é, não codificados por meio do vírus de ARN bipartido natural a partir do que é derivada a sequência potenciadora.

Os sistemas de expressão génica podem ser utilizados para expressar uma proteína de interesse num organismo hospedeiro. Neste caso, a proteína de interesse também pode ser heteróloga com relação ao organismo hospedeiro em questão, isto é, ser introduzida dentro das células em questão (por exemplo, uma planta ou um de seus antepassados) por meio de engenharia genética, isto é, por meio de intervenção humana. Um gene heterólogo de um organismo pode substituir um gene endógeno equivalente, isto é, um que realize normalmente uma função igual ou similar, ou a sequência inserida pode ser adicional ao gene endógeno ou outra sequência.

Os peritos na especialidade entenderão que a expressão de um gene de interesse requererá a presença de um local de inicio (AUG) situado na direção 5' do gene a expressar. Os ditos locais de inicio podem ser proporcionados tanto como parte de uma sequência potenciadora ou como parte de um gene que codifica uma proteína de interesse. 0 organismo hospedeiro pode ser uma planta. No entanto, como os mecanismos traducionais estão bem conservados nos eucariotas, também podem ser utilizados os sistemas de expressão génica para expressar uma proteína de interesse em organismos hospedeiro eucariotas diferentes a plantas, por exemplo, em células de inseto como vetores baculovírus modificados, ou em leveduras ou em células de mamífero.

Os sistemas de expressão génica podem estar operativamente ligados a sequências do promotor e do terminador.

Portanto, os sistemas de expressão génica podem compreender, além disso, uma sequência de terminação e o gene que codifica uma proteína de interesse pode ser situada entre a sequência potenciadora e a sequência de terminação, isto é, na direção 3' (3') da sequência potenciadora e na direção 5' (5') da sequência de terminação.

Também se proporciona no presente documento um cassete de expressão que compreende: (i) um promotor, ligado de maneira operativa a (ii) uma sequência potenciadora como foi descrito anteriormente (iii) um gene de interesse que se deseja expressar (iv) uma sequência de terminação.

Preferentemente o promotor utilizado para impulsionar o gene de interesse será um promotor forte. Os exemplos de promotores para utilização em plantas incluem: (1) p35S: Odell et al., 1985 (2) promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca, pCAS,

Verdaguer et al., 1996 (3) Promotor da subunidade pequena da ribulose bifosfato carboxilase, pRbcS: Outchkourov et al. , 2003.

Outros promotores fortes incluem pUbi (para monocotiledóneas e dicotiledbneas) e pActin.

Numa forma de realização preferida, o promotor é um promotor induzivel. O termo "induzivel" tal como se aplica a um promotor é bem compreendido pelos peritos na especialidade. Essencialmente, a expressão sob o controlo de um promotor induzivel está "ligado" ou aumentado em resposta a um estimulo aplicado. A natureza do estimulo varia entre promotores. Alguns promotores induziveis ocasionam níveis de expressão baixos ou indetetáveis (ou sem expressão) em ausência do estímulo adequado. Outros promotores induziveis ocasionam uma expressão constitutiva detetável em ausência do estímulo. Qualquer que seja o nível de expressão em ausência de estimulo, a expressão de qualquer promotor induzivel aumenta na presença do estímulo correto. A sequência de terminação (terminador) pode ser uma sequência de terminação derivada do segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido, por exemplo um comovírus. Numa forma de realização, a sequência de terminação pode ser derivada do mesmo vírus de ARN bipartido do que é derivada a sequência potenciadora. A sequência de terminação pode compreender um codão de parada. A sequência de terminação também pode ir seguida de sinais de poliadenilação.

Os sistemas de expressão génica da invenção também podem compreender uma região não traduzida (UTR, do inglês: untranslated region) . A UTR pode ser situada na direção 5' de uma sequência terminadora presente na cassete de expressão génica, construção de expressão génica ou sistema de expressão génica. Quando os sistemas de expressão génica compreendem um gene que codifica uma proteína de interesse, a UTR pode estar situada na direção 3' do dito gene.

Portanto, a UTR pode estar situada entre um gene que codifica uma proteína de interesse e uma sequência de terminação. A UTR pode ser derivada de um vírus de ARN bipartido, por exemplo, a partir do segmento do genoma de ARN-2 de um vírus de ARN bipartido. A UTR pode ser a UTR a 3 ' do mesmo segmento do genoma de ARN-2 do que é derivada a sequência potenciadora presente no cassete de expressão génica, construção de expressão génica ou sistema de expressão génica. Preferentemente, a UTR é a UTR a 3' de um segmento do genoma de ARN-2 do comovírus, por exemplo, a UTR a 3 ' de um segmento do genoma de ARN-2 do CPMV.

Tal como foi descrito anteriormente,foi demostrado anteriormente que para conseguir uma replicação eficaz do ARN-2 de CPMV por meio da replicase de CPMV codificada por ARN-1 era fundamental que fosse mantida a grelha entre os locais de início nas posições 161 e 512 do ARN-2, isto é, que os dois locais de inicio permanecessem na mesma grelha de leitura do triplete (Holness et al. , 1989; van Bokhoven et al. , 1993; Rohll et al. , 1993) . Este requisito limita a comprimento das sequências que podem ser inseridas na direção 5' do local de inicio na posição 512 nos vetores de expressão baseados em CPMV. Em particular, impede-se a utilização de poliligantes, já que a utilização destes frequentemente altera a grelha de leitura aberta (ORF) entre estes locais de início.

Os presentes inventores demostraram que a manutenção da grelha de leitura entre os locais de início nas posições 161 e 512 no ARN-2 de CPMV é também um requisito para conseguir um inicio eficaz da tradução no local de inicio na posição 512, isto é, é um requisito para conseguir uma expressão eficaz da mais curta das duas carboxiproteínas coterminais codificadas por meio de CPMV (a proteína de 95K) .

No entanto, os presentes inventores demostraram também que a mutação do local de início na posição 161 no ARN-2 de CPMV permite a inserção de sequências na direção 5' do local de início na posição 512, que alteram a grelha entre o codão de início mutado e o local de início na posição 512, sem nenhum efeito negativo sobre o nível de expressão da proteína de 95K. Em consequência, a mutação do local de início na posição 161 significa que já não há nenhuma restrição no comprimento das sequências que podem ser inseridas na direção 5' do local de início na posição 512.

Embora também seja requerida a manutenção da grelha de leitura entre os locais de início que codificam as duas carboxiproteinas coterminais em outros vírus bipartidos, este requisito também pode ser superado mutando a AUG que serve como local de início para produções da mais longa das duas carboxiproteinas coterminais codificadas por meio do segmento do genoma de ARN-2 do vírus. Portanto, em outro aspeto, a presente invenção proporciona uma construção de expressão génica de acordo com as reivindicações que compreende: (a) uma sequência potenciadora como foi descrito anteriormente; e (b) uma sequência heteróloga para facilitar a inserção de um gene que codifica uma proteína de interesse no sistema de expressão génica, em que a sequência heteróloga está situada na direção 3' do local de início alvo mutado na sequência potenciadora. A sequência heteróloga pode ser localizada na direção 5' do codão de início a partir do qua se inicia a produção da mais curta das duas carboxiproteinas coterminais no segmento do genoma de ARN-2 natural do qual é derivada a sequência potenciadora do sistema de expressão génica. Como alternativa, a sequência heteróloga pode ser proporcionada ao redor do local do codão de início, ou substituir o codão de início, a partir do qual se inicia a produção da mais curta das duas carboxiproteinas coterminais no segmento do genoma de ARN-2 natural do qual é derivada a sequência potenciadora do sistema de expressão génica. Num sistema de expressão génica com uma sequência potenciadora derivada do ARN-2 de CPMV, a sequência heteróloga pode ser proporcionada na direção 5' de, ao redor do local de, ou substituir, o codão de início que está em posição 512 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural. A sequência heteróloga pode ser um poliligante ou um local de clonagem múltiplo, isto é, uma sequência que facilita a clonagem de um gene que codifica uma proteína de interesse no sistema de expressão génica.

Por exemplo, como é descrito a partir de agora no presente documento, os presentes inventores proporcionaram construções que incluem um poliligante entre a sequência líder em 5' e as UTR em 3' de um cassete de expressão baseado em CPMV. Como é descrito a seguir, qualquer poliligante pode codificar opcionalmente um ou mais conjuntos de resíduos histidina para permitir a fusão das etiquetas His das extremidades N ou C para facilitar a purificação da proteína.

Preferentemente, as construções de expressão anteriores estão presentes num vetor, e preferentemente compreendem sequências fronteira que permitem a transferência e a integração da cassete de expressão no genoma do organismo.

Preferentemente, a construção é um vetor binário vegetal. Preferentemente, o vetor binário de transformação está baseado em pPZP (Hajdukiewicz, et al. 1994) . Outros exemplos de construções incluem pBinl9 (veja-se Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, et al. (1995) ."Complete Sequence of the binary vetor Bin 19." Plant Molecular Biology 27: 405-409).

Como é descrito no presente documento, a invenção pode ser realizada movendo uma cassete de expressão com os componentes necessários a uma cassete de expressão pBin existente, ou em outras formas de realização, pode ser utilizado um vetor de expressão pBin de clonagem direta.

Por exemplo, como é descrito a partir de agora no presente documento, os presentes inventores têm vetores binários modulares projetados para (mas, não restringidos a) utilização com as sequências potenciadoras descritas no presente documento. Baseiam-se em melhoras do vetor pBINPLUS, por meio do qual foi demostrado que é possível reduzir de forma importante o tamanho do vetor sem comprometer o rendimento em termos de replicação e transferência de ADN-T. Além disso, os elementos do sistema potenciador (ilustrados por meio do denominado sistema "CPMV-HT") foram incorporado ao vetor resultante de forma modular de forma que podem ser expressas múltiplas proteínas a partir de um único ADN-T. Estas melhoras levaram à criação de um vetor versátil com elevado nível de expressão que permite uma eficaz clonagem direta de genes exógenos.

Estes exemplos representam vetores binários vegetais preferidos. Preferentemente, incluem a origem de replicação ColEI, embora os plasmídeos que incluem outras origens de replicação também proporcionam um alto número de cópias (tais como os plasmídeos baseados em pRi, Lee e Gelvin, 2008) são também preferidos, especialmente para sistemas de expressão transitória.

Se for desejado, podem ser incluídos na construção marcadores genéticos selecionáveis, como os que transmitem fenótipos selecionáveis tais como a resistência a antibióticos ou a herbicidas (por exemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas e glifosato).

Os mais preferidos são os vetores pEAQ descritos a seguir que permitem a versão de clonagem direta por meio da utilização de um poliligante entre a sequência líder em 5 ' e as UTR em 3' de um cassete de expressão que inclui um potenciador traducional da invenção, colocado num ADN-T que também contém um supressor do silenciamento génico e um cassete NPTII. O poliligante também codifica um ou dois conjuntos de 6 resíduos histidina para permitir a fusão das etiquetas His das extremidades N ou C para facilitar a purificação da proteína.

Uma vantagem dos vetores derivados de pEAQ é que cada componente de uma proteína multicadeia tal como uma IgG pode ser administrado automaticamente a uma célula infetada. A presente invenção também proporciona métodos para expressar proteínas de acordo com as reivindicações, por exemplo, proteínas heterólogas, em organismos hospedeiro tais como plantas, leveduras, células de inseto ou de mamífero, utilizando um sistema de expressão génica da invenção. A presente invenção proporciona, além disso, um método de acordo com as reivindicações para potenciar a tradução de uma proteína heteróloga de interesse a partir de um gene ou um ORF que codifica a mesma que está operativamente ligado a uma sequência derivada de um ARN2 como foi descrito anteriormente, compreendendo o método mutar um local de início alvo da sequência derivada de ARN2.

As sequências potenciadoras descritas no presente documento também podem ser utilizadas com sistemas de expressão bipartidos como é descrito no documento WO/2007/135480. A invenção, portanto, refere-se também a sistemas de expressão génica baseados em segmentos génicos de ARN-2 truncados, que compreendem opcionalmente uma segunda construção génica que codifica um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação.

Assim, também é descrito no presente documento um sistema de expressão génica que compreende: (a) uma primeira construção génica que compreende um ARN-2 truncado de um genoma de um vírus bipartido que inclui pelo menos um gene exógeno que codifica uma proteína heteróloga de interesse operativamente ligada a sequências promotoras e de terminação, em que a construção génica compreende um local de início alvo mutado na direção 5' do gene exógeno; e opcionalmente, (b) uma segunda construção génica que compreende ARN-1 do dito genoma de vírus bipartido operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação; e opcionalmente, (c) uma terceira construção génica, que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, a dita segunda construção génica ou à vez, que compreende um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação.

Prefere-se a presença de um supressor do silenciamento génico num sistema de expressão génica (incluindo qualquer dos descritos anteriormente) da invenção, mas não é essencial. Portanto, um sistema de expressão génica, como foi definido anteriormente, compreende preferentemente uma terceira construção génica, que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, a dita segunda construção génica ou à vez, que compreende um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação.

Assim, também é descrito no presente documento um método para expressar uma proteína numa planta que compreende as etapas de: (a) introduzir uma construção de expressão génica da invenção numa célula vegetal; e opcionalmente, (b) introduzir uma segunda construção génica que compreende ARN-1 do dito genoma de vírus bipartido operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação na célula vegetal; e opcionalmente, (c) introduzir uma terceira construção génica, que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, a dita segunda construção génica ou ao mesmo tempo, que compreende um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação na célula vegetal.

Preferentemente, um método para expressar uma proteína numa planta, como foi definido anteriormente, compreende a etapa de introduzir uma terceira construção génica, que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, a dita segunda construção génica ou ao mesmo tempo, que compreende um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação na célula vegetal. A presente invenção proporciona também métodos que compreendem a introdução da dita construção numa célula vegetal.

Os presentes inventores mostraram níveis de expressão muito elevados incorporando tanto um gene de interesse como um supressor do silenciamento no mesmo ADN-T que o potenciador da tradução. Portanto, as formas de realização preferidas podem utilizar os três componentes presentes no mesmo ADN-T.

Adicionalmente, deve ser entendido que o ARN-1 não é necessário para um nível de expressão elevado nos sistemas descritos no presente documento, e deste modo, o sistema "CPMV-HT" descrito no presente documento não está sob a ação do ARN-1.

Assim, num aspeto adicional, a presente invenção refere-se a um sistema de expressão génica de acordo com as reivindicações que compreende: (a) uma primeira construção génica que compreende um ARN-2 truncado de um genoma de um vírus bipartido que inclui pelo menos um gene exógeno que codifica uma proteína heteróloga de interesse operativamente ligada a sequências promotoras e de terminação, em que a construção génica compreende um local de início alvo mutado na direção 5' do gene exógeno; e opcionalmente, (b) uma segunda construção génica que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação.

Portanto, em outro aspeto, a presente invenção proporciona um método para expressar uma proteína numa planta que compreende as etapas de: (a) introduzir uma construção de expressão génica da invenção numa célula vegetal; e opcionalmente, (b) introduzir uma segunda construção génica que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, que compreende um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação na célula vegetal.

Os supressores do silenciamento génico úteis nestes aspetos são conhecidos na matéria e são descritos no documento WO/2007/135480. Incluem HcPro do vírus da batata E, He-Pro de TEV, P19 de TBSV, rgsCam, a proteína 82 de FHV, a proteína pequena da cobertura de CPMV, e a proteína da cobertura de TCV. De maneira mais preferida, o ARN-2 do sistema está truncado de forma que não é produzido um vírus infecioso.

Um supressor preferido quando são produzidas plantas transgénicas estáveis é o supressor P19 que incorpora uma mutação R43W. É descrita, além disso, uma célula hospedeira que contém uma construção heteróloga de acordo com a presente invenção.

Os vetores de expressão génica da invenção podem ser incorporados de forma estável ou transitória às células vegetais.

Para produção em pequena escala, é utilizada a agroinfiltração mecânica das folhas com construções da invenção. O escalonamento é conseguido por meio de, por exemplo, a utilização de infiltração a vácuo.

Em outras formas de realização, poder ser incorporado de forma estável um vetor de expressão da invenção no genoma da planta transgénica ou da célula vegetal.

Também é descrito no presente documento a etapa de regenerar uma planta a partir de uma célula vegetal transformada.

Os procedimentos e vetores específicos anteriormente utilizados com amplo sucesso entre as plantas foram descritos por Guerineau e Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vetors . Em: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148) . Os vetores adequados podem incluir vetores derivados de vírus de plantas (veja-se, por exemplo, o documento EP-A-194809) . Se for desejado, podem ser incluídos na construção marcadores genéticos selecionáveis, como os que transmitem fenótipos selecionáveis tais como a resistência a antibióticos ou a herbicidas (por exemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas e glifosato). 0 ácido nucleico poder ser introduzido nas células vegetais por meio de qualquer tecnologia adequada, tal como um vetor plasmídeo Ti desmontado transportado por Agrobacterium que aproveita sua capacidade natural para transmitir genes (documentos EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12(22) 8711 -87215 1984; o método de imersão floral de Clough e Bent, 1998), bombardeio com partículas ou microprojéteis (documentos US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), microinjeção (documentos WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et ai., (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), eletroporação (documentos EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser), outras formas de captação direta do ADN (documentos DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), captação de ADN mediada por liposoma (por exemplo, Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), ou o método de submeter a vórtice (por exemplo, Kindle, PNAS OU. S.A. 87: 1228 (1990d) . Os métodos físicos para a transformação de células vegetais foram revisados em Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11. Os plasmídeos Ti, especialmente os vetores binários, serão descritos commais detalhe a seguir. A transformação por meio de Agrobacterium é amplamente utilizada pelos peritos na especialidade para transformar espécies dicotiledóneas. No entanto, foi conseguido um notável sucesso na produção rotineira de plantas transgénicas férteis em praticamente todas as plantas monocotiledóneas economicamente relevantes (veja-se por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, 271-282)). O microbombardeio de microprójeteis, a eletroporação e a captação direta de ADN são preferidos quando o Agrobacterium sozinho é ineficiente ou ineficaz. Como alternativa, pode ser utilizada uma combinação de técnicas diferentes para melhorar a eficácia do processo de transformação, por exemplo, bombardeio de partículas revestidas com Agrobacterium (documento EP-A-486234) ou bombardeio com microprójeteis para induzir feridas seguido por cultivo simultâneo com Agrobacterium (documento EP-A-486233) . A seleção particular de uma tecnologia de transformação se determinará por sua eficácia para transformar determinadas espécies vegetais assim como a experiência e a preferência da persona que realiza a invenção com uma metodologia de escolha concreta.

Será evidente para o perito na especialidade que a escolha concreta de um sistema de transformação para introduzir o ácido nucleico em células vegetais não é essencial nem é uma limitação da invenção, também não o é a seleção da técnica para a regeneração da planta. Nas experiências realizadas pelos inventores, o efeito de expressão melhorado observa-se numa variedade de desenhos de integração do ADN-T.

Assim, é descrito no presente documento um método para transformar uma célula vegetal que implica a introdução de uma construção da invenção num tecido vegetal (por exemplo, uma célula vegetal) e que ocasiona ou permite a recombinação entre o vetor e o genoma da célula vegetal para introduzir um ácido nucleico de acordo com a presente invenção no genoma. Isto pode ser feito assim para realizar uma expressão transitória.

Como alternativa, depois da transformação do tecido vegetal, pode ser regenerada uma planta, por exemplo, a partir de células individuais, tecido de calo ou discos de folha, como é conhecido na técnica. Quase qualquer planta pode ser regenerada a partir de células, tecidos e órgãos da planta. As técnicas disponíveis foram revisadas em Vasil et ai., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, 11 e III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, e em Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989. A geração de plantas transgénicas férteis foi conseguido em cereais tais como o arroz, milho, trigo, aveia, e cevada, e também em outras muitas espécies de plantas (revisado em Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, etal. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 página 702).

As plantas regeradas ou partes das mesmas podem ser utilizadas para proporcionar clones, semente, progénie autóloga ou híbrida e descendentes (por exemplo, descendentes FI e F2), cortes (por exemplo, partes comestíveis), guias de propagação, etc. A invenção proporciona, além disso, um organismo transgénico (por exemplo, que pode ser obtido por um método descrito no presente documento) em que foi introduzido um vetor ou cassete de expressão, e em que o gene heterólogo da cassete é extresso a um nível potenciado.

Também é descrito no presente documento um método para gerar a proteína de interesse, onde o método compreende as etapas de realizar um método (ou utilizar um organismo) como foi descrito anteriormente., e opcionalmente recolher, pelo menos, um tecido em que foi expressa a proteína de interesse e isolar a proteína de interesse do tecido.

Especificamente, a presente invenção proporciona, portanto, uma planta ou célula vegetal transgénica transfetada transitoriamente com um vetor de expressão da invenção.

Num aspeto adicional, a presente invenção proporciona também uma planta ou célula vegetal transgénica transformada de forma estável com um vetor de expressão da invenção. A divulgação também proporciona um propágulo de uma planta para as ditas plantas, que é qualquer parte que pode ser utlizada na reprodução ou na propagação, sexual ou assexual, incluindo cortes, sementes e assim sucessivamente. Também proporciona qualquer parte destas plantas que inclui as células vegetais ou o ADN heterólogo anteriormente descrito.

Assim, em vários aspetos (e sem limitação), é descrito no presente documento: • Ácidos nucleicos que consistem ou consistem essencialmente numa sequência potenciadora da invenção, onde a sequência potenciadora pode (por exemplo) consistir nos nucleótidos 1 a 512 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV, ou se derivar do mesmo, ou de outro segmento do genoma de ARN-2 de um virus de ARN bipartido, em cada caso em que o local de início alvo correspondente à posição 161 do ARN-2 de CPMV foi mutado). • Os sistemas de expressão génica que compreendem as ditas sequências potenciadoras, por exemplo, na direção 5' de uma ORF que codifica uma proteína de interesse, ou um poliligante, e opcionalmente um terminador. • Sistemas de expressão bipartida tal como é descrito no documento WO/2007/135480 modificados de acordo com a presente invenção para utilizar as sequências potenciadoras descritas no presente documento. • Cassetes de expressão que compreendem: (i) um promotor, operativamente ligado a (ii) uma sequência potenciadora como foi descrito anteriormente (iii) um poliligante ou gene de interesse que se deseja expressar (iv) a UTR em 3' análoga (isto é, da UTR em 3' do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV), (v) uma sequência de terminação. • Métodos de expressão de proteínas, por exemplo, proteínas análogas, em organismos hospedeiro tais como plantas utilizando sistemas de expressão génica ou vetores da invenção. • As células hospedeiras e os organismos (por exemplo, plantas ou leveduras) que expressam proteínas a partir dos sistemas de expressão génica ou vetores da invenção e métodos para produzir os mesmos. "Gene" a menos que o contexto indique de outro modo refere-se a qualquer ácido nucleico que codifica informação genética para sua tradução num péptido, polipéptido ou proteína. Deste modo, salvo que o contexto demande outra cosa, pode ser utlizado de forma indistinta com "ORF".

Os genes que pode se desejar expressar podem ser transgenes ou endogenes.

Os genes de interesse incluem que codificam traços agronómicos, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, esterilidade, caracteristicas do grão, e similares. Os genes podem estar implicados no metabolismo do óleo, amido, hidratos de carbono, nutrientes, etc. 0 ditos genes ou traços de interesse incluem, mas sem limitação, traços relacionados com o meio ambiente ou o estresse, traços relacionados com doenças, e traços que afetam ao comportamento agronómico. As sequências alvo também incluem genes responsáveis da síntese de proteínas, péptidos, ácidos gordos, lípidos, ceras, óleos, amidos, açúcares, hidratos de carbono, aromas, odores, toxinas, carotenoides, hormonas, polímeros, flavonoides, proteínas de armazenamento, ácidos fenólicos, alcaloides, ligninas, taninos, celulose, glicoproteínas, glucolípidos, etc.

Mais preferentemente, os genes alvo de monocotiledóneas e/ou dicotiledóneas podem incluir aquelas enzimas codificadoras responsáveis da produção de óleo em plantas tais como colza, girassol, soja e milho; as enzimas implicadas na síntese do amido em plantas tais como batata, milho, cereais; enzimas que sintetizam, ou proteínas que são por si mesmas, medicamentos naturais tais como produtos farmacêuticos ou veterinários.

Os ácidos nucleicos heterólogos podem codificar, inter alia, genes de origem bacteriano, fúngico, vegetal ou animal. Os polipéptidos podem ser utilizados in planta (para modificar as caracteristicas da planta por exemplo, com respeito à suscetibilidade a pragas, vigor, diferenciação de tecido, fertilidade, valor nutritivo, etc.) ou a planta pode ser um intermediário para produzir os polipéptidos que podem ser purificados a partir dos anteriores para utilização em outra parte. As ditas proteínas incluem, mas não se limitam, à proteína do retinoblastoma, p53, angiostatina, e leptina. Do mesmo modo, os métodos da invenção podem ser utilizados para produzir proteínas reguladoras de mamífero. Outras sequências de interesse incluem proteínas, hormonas, fatores de crescimento, citoquinas, albumina de soro, hemoglobina, colagénio, etc.

Assim, o gene ou sequência de nucleótidos alvo codifica preferentemente uma proteína de interesse que é uma proteína de resistência a insetos; uma proteína de resistência a doenças; uma proteína de resistência a herbicidas; uma proteína de mamífero. "Vetor" é definido para incluir, inter alia, qualquer vetor binário plasmídeo, cósmido, fago, virai ou de Agrobacterium em forma de cadeia simples ou de cadeia dupla linear ou circular que pode ser transmissível por si mesmo, ou não ou mobilizável por si mesmo, ou não, e que pode transformar um hospedeiro procariota ou eucariota por meio de sua integração no genoma celular ou existir extracromossomicamente (por exemplo, plasmídeo de replicação autónoma com uma origem de replicação). As construções utilizadas serão total ou parcialmente sintéticas. Em particular, são recombinantes porque as sequências de ácido nucleico não estão juntamente na natureza (não se executam de maneira contígua), mas que foram ligados ou combinados artificialmente de outra forma. A menos que seja especificado de outro modo, um vetor de acordo com a presente invenção não tem que incluir um promotor ou qualquer outra sequência reguladora, especialmente se o vetor vai ser utilizar para introduzir o ácido nucleico em células para sua recombinação no genoma. "Vetor binário": como bem sabem os peritos na especialidade, um sistema vetor binário inclui (a) sequências fronteira que permitem a transferência de uma sequência de nucleótidos desejada ao genoma de uma célula vegetal; (b) a própria sequência do nucleótido desejado, que pelo geral compreende um cassete de expressão de (i) um promotor ativo em plantas, operativamente ligado a (ii) a sequência alvo e/ou potenciadora conforme seja adequado. A sequência de nucleótidos desejada se situa entre as sequências fronteira e pode ser inserida no genoma de uma planta nas condições adequadas. 0 sistema de vetor binário necessitará pelo geral outra sequência (derivada de A. tumefaciens) para realizar a integração. Em geral, isto pode ser conseguido por meio da denominada "agroinfiltração" que utiliza uma transformação transitória mediada por Agrobacterium. Em resumo, esta técnica baseia-se na propriedade do Agrobacterium tumefaciens para transferir uma parte de seu ADN ("ADN-T") a uma célula hospedeira onde pode ficar integrado no ADN nuclear. 0 ADN-T é definido pelas sequências fronteira esquerda e direita que têm um comprimento de cerca de 21-23 nucleótidos. A infiltração pode ser conseguida, por exemplo, por meio de seringa (em folhas) ou vácuo (plantas completas) . Na presente invenção, as sequências fronteira estão geralmente incluídas ao redor da sequência de nucleótidos desejada (o ADN-T) onde o um ou mais vetores são introduzidos no material vegetal por meio de agroinfiltração. "Cassete de expressão" refere-se a uma situação em que um ácido nucleico está sob o controlo de, e operativamente ligado a, um promotor adequado ou outros elementos adequados para sua transcrição numa célula hospedeira tal como um micróbio ou célula vegetal.

Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos a partir da qual pode ser iniciada a transcrição de um ADN operativamente ligado posterior (isto é, na direção 3' da cadeia sense do ADN de cadeia dupla). "Operativamente ligado" significa ligado como parte da mesma molécula de ácido nucleico, colocada e orientada adequadamente para iniciar a transcrição a partir do promotor.

As espécies "vegetais" de interesse incluem, mas sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), especialmente aquelas espécies de Brassica úteis como fonte de sementes oleaginosas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, milheto conta (Pennisetum glaucum)), milheto comum (Panicum miliaceum), painço (Setaria italica), milheto africano, (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), Nicotiana benthamiana, batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), ananás (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), papaia (Carica papaya), castanha de caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus arnygdalus) , beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, hortaliças, plantas ornamentais, e coníferas. 0 perito apreciará que o tropismo dos vetores virais descritos no presente documento varia. No entanto, a determinação da suscetibilidade dos ditos vírus está bem compreendida entre as capacidades do perito. Além disso, pode ser possível alterar a dita especificidade por meio da expressão recombinante de recetores que facilitam a entrada do vírus na dita célula vegetal. A invenção será descrita agora adicionalmente com referência às seguintes Figuras e Exemplos não limitantes. Os peritos na especialidade inventarão outras formas de realização da invenção à luz destas.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 mostra um diagrama esquemático dos vetores de expressão de CPMV 00, 10, 01 e 11. Nos vetores de expressão 00, os locais de início nas posições 115 e 161 estão intatas. Nos vetores de expressão 10, os locais de início na posição 115 foram mutados, mas o local de início na posição 161 está intato. Nos vetores de expressão 01, os locais de início na posição 161 foram mutados, mas o local de início na posição 115 está intato. Nos vetores de expressão 11, os locais de início nas posições 115 e 161 estão ambos mutados. Os vetores de expressão de CPMV 00, 10, 01 e 11 incluem um local de início em qualquer das posições 512 (FSC2-152), 513 (FSC2-513) ou 514 (FSC2-514). As barras são utilizadas para indicar os locais de início a partir dos quais a expressão da proteína sucede expressamente. A Figura 2 mostra o nível de proteína fluorescente verde (GFP) solúvel expressada em plantas transfetadas com os vetores de expressão de CPMV ilustrados esquematicamente na Figura 1. Nos vetores de expressão FSC2-512, FSC2-513 e FSC2-514, o gene que codifica GFP foi inserido depois do codão de inicio na posição 512, 513 e 514, respetivamente. As fileiras dos geles SDS-PAGE foram marcados como 00, 10, 01 e 11, dependendo de se os locais de inicio no vetor de CPMV, nas posições 115 e 161, estavam intatos ou mutados. A fileira marcada '500ng' mostra a posição de uma banda correspondente a 500 ng de proteína GFP e indica desta forma a posição esperada da proteína GFP expressada a partir dos vetores de expressão de CPMV. A fileira esquerda de cada gel SDS-PAGE mostra a posição dos marcadores de tamanho de proteína. A Figura 3 mostra o nível de expressão de GFP em folhas de Nicotiana benthamiana transfetadas com os mesmos vetores de expressão de CPMV utilizados no expressão ilustrado na Figura 2. As regiões pálidas nas pontas das folhas correspondem a regiões da expressão de GFP. Também são indicadas as mutações realizadas para inativar os locais de início nas posições 115 e/ou 161 dos vetores de expressão 10, 01 e 11. A Figura 4 amostra uma comparação entre Del-ARN-2 (vetor de expressão 00 [FSC2-512] na Figura 1) e HT (vetor de expressão 01 [FSC2-512] na Figura 1) para a expressão transitória da proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja de Discosoma (DsRed), e o antigénio principal da hepatite B (HBcAg). delARN-2 ou clones HT de cada proteína foram infiltrados com o supressor do silenciamento P19. (A) Tecido 7 dias depois da infiltração com as construções de delARN-2 se torna necrótico quando são expressos DsRed ou HBcAg enquanto que este não é o caso para a expressão impulsada por HT. De facto, o tecido que expressa DsRed por meio de HT parece visivelmente vermelho em condições de luz diurna. (B) Análise da expressão de proteínas por meio de SDS-PAGE corados com Coomassie. As bandas proeminentes correspondentes às proteínas recombinantes que são indicadas foram confirmadas por meio de transferência western. 1-marcador, 2-tecido não infiltrado, 3-construção delARN-2, 4- construção HT, 5-padrão comercial se estivesse disponível. Os extratos brutos de cerca de 5 mg de tecido infiltrado foram carregados por fileira, assim como 2 mg do padrão de GFP e 2 mg do padrão de HBcAg. Nesse momento não estava disponível um padrão para DsRed. A Figura 5 mostra uma comparação entre Del-ARN-2 (vetor de expressão 00 [FSC2-512] na Figura 1) e HT (vetor de expressão 01 [FSC2-512] na Figura 1) para a expressão transitória do anticorpo 2G12 humano dirigido contra o vírus da imunodeficiência humana: A cadeia pesada da IgG estava em sua forma natural (HL) ou retida com ER (HEL) e infiltrada com a cadeia leve e P19. (A) A expressão de 2G12-HEL por meio de do-ARN-2 leva à necrose do tecido infiltrado, enquanto que isto não ocorre com a expressão de HT . (B) Análise por meio de SDS-PAGE dos extratos brutos de tecido infiltrado com as cadeias pesadas do anticorpo (delARN-2 ou HT) mais P19. Para cada amostra, 0 extrato bruto de 5 mg de tecido infiltrado foi carregado juntamente com 1 mg de padrão de IgG humana. Observa-se facilmente uma banda que corresponde a 2G12 após a coloração de coomassie. (C) 0 acúmulo do anticorpo 2G12 depois de 5 dias foi medido por meio de captura de proteína A e espectroscopia de ressonância de plasmon superficial, e representa a concentração depois de su extração em 2 volumes de tampão (PBS, EDTA 5 mM) . Portanto, os autores derivam concentrações em peso fresco próximas a 150 mg/kg (para HT HEL) sem nenhuma otimização da incubação ou a extração das plantas. Foram medidas três amostras para cada tratamento. A Figura 6 mostra uma microfotografia eletrónica de partículas de HBcAg reunidas, que foram expressas utilizando o sistema de expressão HT (vetor de expressão 01 [FSC2-512] na Figura 1) descrito no presente documento. As partículas de HBcAg reunidas aparecem como esferas ocas, de cerca de 30 nm de diâmetro. A seiva que contém as partículas de HBcAg não foi concentrada antes de adquirir a micrografia eletrónica, embora tenham sido eliminados os sais indesejados. Portanto, a microfotografia eletrónica representa a concentração de partículas de HBcAg na seiva. A Figura 7 mostra o vetor pM81-FSCl. A Figura 8 mostra o vetor pM81-FSC2. A Figura 9 mostra uma representação esquemática da construção de pEAQ. (A) Plasmídeo inicial baseado em pBINPLUS com a sequência exógena mostrada em gris. (B) Produtos da PCR que contêm os elementos essenciais do vetor binário. (C) Plasmídeo intermediário depois da ligação em três partes dos produtos da PCR com a cauda personalizada. (D) Plasmídeo final depois da amplificação e ligação posterior de dois fragmentos a partir do intermediário. A Figura 10 mostra uma representação esquemática do ADN-T dos derivados principais de pEAQ. Os ADN-T incluem qualquer ou ambos cassetes P19 e NPTII tal como se indica, deixando possíveis locais de clonagem nos locais de restrição como se indica. A Figura 11 mostra níveis de expressão de GFP gerados por vetores pEAQ comparados com su plasmídeo precursor pBB-FSC2-512-HT. 0 tecido foi analisado 6 dias depois da infiltração com P19 e o vetor indicado, salvo para pEAQexpress, que foi infiltrado somente para a DO do padrão, ou com uma diluição de duas vezes. (A) Folhas visualizadas com luz UV light, (B) SDS-PAGE corado com coomassie a 12 %, e (C) análise espetrofluorométrico. A Figura 12 mostra a capacidade de P19(R43W) para potenciar a expressão de GFP comparado com P19 natural. 0 tecido foi analisado 6 dias depois da infiltração com pEAQselectK a uma diluição de duas vezes (selK -P19), pEAQselectK e P19 (selK); pEAQspecialK (spK), pEAQspecialK a uma diluição de duas vezes (spK 1:2), pEAQspecialKm (spKm), pEAQspecialKm a uma diluição de duas vezes (spK 1:2), pEAQexpress (ex), e pEAQexpress a uma diluição de duas vezes (spK 1:2) . (A) Folhas visualizadas sob luz UV e (B) análise espetrofluorométrico. A Figura 13 mostra a expressão da IgG de tamanho completo, 2G12, com um único plasmídeo pEAQ. (A) Representação esquemática dos dois plasmídeos derivados de pEAQexpress construídos para expressar 2G12. (B) Esquema de infiltração que indica diluições e suas respetivas DO para cada combinação de plasmídeo, e a concentração de extratos de proteínas realizados após as infiltrações a cada DO (± SD). (C) Análise por SDS-PAGE corado com coomassie a 12 %-4 % e (D) deteção imunológica de 2G12 pesada (γ) e (E) deteção imunológica da região 2G12 Fab (Fab) da cadeia 8 dias depois da infiltração. M, marcador com tamanhos indicados; C, extrato de controlo Pat. 2G12 produzido por CHO. Para a coloração de coomassie, proteína procedente do equivalente de 3 mg de tecido infiltrado foram carregados em cada fileira com 1 pg de CH02G12 e, para transferência western, o equivalente de 0,75 mg de tecido em cada fileira com 250 ng de CH02G12. São indicadas os produtos de montagem/degradação estimados. A Figura 14 mostra a clonagem e expressão de GFP depEAQ-HT em variantes naturais e marcadas com His. (A) Representação esquemática do pEAQ-HT ADN-T com detalhe do poliligante. (B) Análise espetrofluorométrico da expressão de GFP. spK = pEAQspecialK-GFP-HT, GFP, HisGFP, e GFPHis = clones pEAQ-HT. (C) Análise de SDS-PAGE a 12 % e western da expressão de GFP. C = extrato de controlo. A Figura 15 mostra uma construção de ácido nucleico da presente invenção que é adequada para utilização em células de inseto como parte de um vetor baculovírus. Exemplos Exemplo 1

1.1 MÉTODOS

Criação do vetor FSC2 e sus derivados

Foi criado um vetor de clonagem útil para a expressão das proteínas de um plasmídeo baseado em pBinP-l-GFP (Canizares et al., 2006) clivando a sequência completa do ARN-2 flanqueado pelo promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e o terminador da nopalina sintase (nos) de pBinP-S2NT (Liu e Lomonossoff, 2002) e inserindo este no plasmídeo de mutagénese pM81W (Liu e Lomonossoff, 2006) como um fragmento Ascl/Pacl. O plasmídeo resultante, pM81W-S2NT, foi submetido a um único ciclo de mutagénese que introduziu simultaneamente quatro mudanças (veja-se o método em Liu e Lomonossoff, 2006) para dar pM81B-S2NT-1. A mutagénes eliminou dois locais Bsphl da estrutura do vetor e introduziu um local BspHI (T/CATGA) ao redor de AUG 512 e um local StuI (AGG/CCT) depois de UAA 3299, o codão de terminação para a poliproteína codificada pelo ARN-2. Posteriormente, o fragmento BamHI/AscI foi clivado de pBinP-NS-1 (Liu et al., 2005) e se ligó em pM81B-S2NT-l que foi digerido de forma similar, dando como resultado pM81-FSC-l. Este vetor permite que o ORF completo seja clivado do ARN-2 ORF na direção 3' de AUG 512 por meio de digestão com BspHI e StuI e foi substituído com qualquer sequência nas extremidades compatíveis com BspHI e StuI (rombo) . É importante a utilização do local BspHI já que preserva o AUG em 512 e foi utilizado este iniciador para impulsionar a tradução do gene inserido. Para expressar o gene exógeno em plantas, o plasmídeo derivado de pM81-FSC-l foi digerido com Asei e Pad e o fragmento que continha a cassete de expressão que incluía as sequências exógenas transferidas a pBINPLUS foi digerido de forma similar e os plasmídeos resultantes foram transformados finalmente em A. tumefaciens.

Para melhorar a facilidade da clonagem, ampliar a seleção de enzimas de restrição aplicáveis, e investigar o efeito da grelha de leitura sobre a expressão do gene exógeno, foi substituído o ORF completo do ARN-2 ORF com um poliligante corto. Uma combinação de inserção de oligonucleótidos e de mutagénese dirigida ao local resultou em pM81-FSC-2, que permite a clonagem com NruI (TCG/CGA) e tanto Xhol (C/TCGAG) como StuI. A adenina terminal do local NruI está na posição 512 preservando, portanto, o AUG que está aqui. As modificações alteraram os nucleótidos imediatamente em 5' do AUG em 512, no entanto, foi mantido um bom contexto. A clonagem de GFP em pM81-FSC-2 de tal maneira que foi iniciado sua tradução a partir de AUG em 512, 513, 514, ou 515 proporcionou o pM81-FSC-l derivado das construções pM81-FSC2-512, pM81-FSC2-513, pM81-FSC2-514, e pM81-FSC2-515. Estes plasmídeos baseados em pM81 são os vetores de clonagem que contêm as cassetes de expressão que foram transferidos a seguir no vetor binário para produzir os vetores de expressão FSC2-512, FSC2-513 e FSC2-514 utilizados nos experiências que se mostram nas Figuras 2 e 3. No Quadro 3 são mostradas as diferenças entre a sequência do segmento natural do genoma de ARN-2 de CPMV e os vetores pM81-FSCl e pM81-FSC2. Os nucleótidos alterados nos vetores comparados com a sequência CPMV natural são mostrados em maiúscula. A transformação transitória mediada por Agrobacteria após a mobilização em pBINPLUS (como foi destacado anteriormente para pM81-FSC-l) mostrou que foram obtidos níveis menores de proteínas quando não foi mantida a continuidade da grelha entre AUG 161 e AUG na direção 3'. Observou-se uma diminuição significativa na quantidade de GFP traduzido desde as posições + 1 e +2 com respeito aos AUG 161 e 512, enquanto que a tradução desde a posição +3 (isto é, desde 515 e posterior na grelha) foi tão eficaz como a tradução desde um AUG em 512 . Para mostrar que isto não foi devido a contextos debilitados dos AUG em 513 e (numa extensão menor) 514, foi criado FSC2-515+ para iniciar desde a posição +3 mas com o mesmo pobre contexto que FSC2-513. A expressão a partir FSC2-515+ foi tão elevada como a conseguida a partir de FSC2-512 ou 515, indicando que o contexto inferior não explica a redução na expressão de FSC2-513 e 514.

Dado que não se sabe que os mecanismos conhecidos pelos quais a tradução pode escapar da ordem do primeiro AUG requeiram a continuidade da grelha, é intrigante que a tradução eficaz procedente de vetor baseado em ARN-2 eliminado dependa da continuidade da grelha entre AUG 161 e AUG na direção 3' . Com a finalidade de compreender, e esperemos que de superar este fenómeno, foram criadas uma série de mutantes com modificações na sequência 5' de ARN-2. Utilizaram-se pares de complementos de oligonucleótidos (veja-se a Quadro 2) na mutagénese dirigida ao local de pM81-FSC2-512, 513, e 514. As mutações eliminaram qualquer de AUG 115 (o codão de início para o uORF), AUG 161 (sem mudar a sequência de aminoácidos do uORF), ou ambos locais de início na direção 5'. Foram realizadas mutações duplas submetendo a mutagenização os mutantes A115G com os oligos U162C (Quadro 2) . A expressão transitória destes transcritos mutantes foi realizada como foi descrito para as construções pM81-FSC-2 anteriores. A análise da expressão de GFP procedente destes mutantes utilizando SDS-PAGE corado com coomassie (Figura 2) ou luz UV para visualizar as folhas completas (Figura 3) mostra um forte aumento da expressão em ausência do AUG em 161. Além disso, a eliminação de AUG 161 só ou dos AUG 115 e 161 alivia a dependência da continuidade em grelha entre AUG 161 e AUG na direção 3' . Pelo contrário, a eliminação de solo AUG 115 parece potenciar esta dependência assim como inibir geralmente a tradução. Em conclusão, o uORF parece funcionar para regular negativamente a tradução a partir de AUG 161, que é geralmente inibidora e confere dependência da continuidade da grelha. Imagem ao microscópio eletrónico da seiva que contém partículas de HBcAg A seiva utilizada para a micrografia eletrónica das partículas de HBcAg reunidas na Figura 6 foi preparada como segue. 0 tecido da folha foi extraído em 2 volumes de tampão Tris/NaCl e foi permutado para TE sem concentração numa coluna MWCO delOO kDa. A concentração final de HBcAg foi de cerca de 0,2 mg/ml tal como se considera por comparação com o padrão num gel SDS-PAGE corado com coomassie.

1.2 RESULTADOS (1) Efeito de alterar as fases relativas dos locais de início na posição 161 (AUG161) e 512 (AUG512).

Para conseguir isto, nucleótidos extra foram inseridos imediatamente na direção 5' de AUG512 (FSC2-512) para imobilizar o AUG à posição 513, 514 e 515 (FSC2-513, FSC2-514 e FSC2-515) (Figura 1) . Colocar AUG512 fora de fase com AUG161 (FSC2-513 e FSC2-514) proporciona menos expressão de GFP tal como foi determinada por meio de fluorescência (Figura 3) e geles corados com Coomassie (Figura 2). Ao restaurar a fase (FSC2-515) foi devolvida a expressão aos níveis observados com a situação natural (FSC2-512). A conclusão é que quando AUG161 está presente, o início na direção 3 ' de AUG é mais eficaz quando está em fase com AUG na posição 161. (2) A eliminação do local de início na posição 115 (AUG115) foi acoplada com a alteração das fases relativas dos locais de início na posição 161 (AUG161) e 512 (AUG512). A eliminação de AUG115 tem pouco ou nenhum efeito quando é impulsionada a expressão de GFP a partir de AUG512 isto é, quando este segundo AUG está em fase com AUG161 (vejam-se as bandas marcadas 10 nas Figuras 2 e 3). No entanto, a deleção de AUG115 quando o segundo AUG está fora de fase com AUG161 (513, 514) não resulta em, virtualmente, a expressão de GFP (vejam-se as bandas marcadas 10 nas Figuras 2 e 3) . Conclusão: AUG115 está algo implicado na capacidade dos ribossomas de derivar AUG161 e alcançar AUG512. No entanto, isto requer que o AUG na direção 3' esteja na fase correta. (3) Efeito da eliminação do local de início na posição 161 (AUG161) O efeito desta mutação é muito drástico, e os níveis de expressão de GFP alcançam 20-30 vezes a quantidade que está quando AUG161 está presente (vejam-se as bandas marcadas 01 nas Figuras 2 e 3) . Além disso, já não parece que seja importante que AUG512 esteja em fase, pensa-se que em ausência de AUG161, a ideia de fase não significa muito. Além de que a presença ou ausência de AUG115 não marca diferença (vejam-se as bandas marcadas 11 nas Figuras 2 e 3) .

Quando são utilizadas construções de delARN-2 (vetor de expressão 00 [FSC2-512] na Figura 1) para a expressão de DsRed e HBcAg, em 5 dias, os parches infiltrados têm menos pressão de turgência e se tornam cloróticos (pálidos). Em 7 dias, o tecido aparece cinza e está completamente morto. Quando é utilizado HT (vetor de expressão 01 [FSC2-512] na Figura 1), o tecido continua estando turgente depois de 7 dias e o único sinal de estresse é uma leve clorose do tecido que expressa HBcAg. Quando a cadeia pesada da IgG 2G12 IgG é expressa por meio de delARN-2 e é retida no ER, a clorose é evidente depois de 7 dias, enquanto que isto não observou-se para HT. O nível de necrose visto em plantas quando é utilizado HT para expressar uma proteína heteróloga é desta maneira muito menor, apesar do maior nível de expressão de proteína heteróloga conseguido, que quando é utilizado delARN-2 para expressar a proteína heteróloga.

DISCUSSÃO

Podem ser expressos níveis muito elevados de expressão de genes exógenos a partir das construções de delARN-2 eliminando AUG161. De facto, utilizando GFP, os inventores estimam os níveis como 25-30 % da proteína solúvel total (TSP) ou cerca de 1 grama expressado em proteínas por Kg de folhas. Este é um nível muito elevado e a solução que os inventores utilizam é extremamente simples. O facto de que os inventores já não necessitem preservar uma grelha de leitura significa que podem ser produzidos vetores respeitosos com o utilizador com poliligantes.

Exemplo 2 2.1 ANTECEDENTES

Tal como é descrito no Exemplo 1, para investigar as características necessárias para uma expressão eficaz da região 5' não traduzida (UTR) de ARN-2 de CPMC, Os presentes inventores resolveram o papel de dois codões AUG que estão na sequência líder em 5' na direção 5' do local de início principal. Os inventores demostraram que a deleção de um codão de inicio em grelha (161) na direção 5' do local de início da tradução principal (512) levou a um aumento massivo no acúmulo de proteína exógena.

Utilizando este sistema, os inventores mostraram que 6 d depois da infiltração, numerosas proteínas não relacionadas, incluindo uma IgG de tamanho completo com uma partícula de tipo vírus com automontagem, foram expressas em >10 % e 20 % da proteína extraível, respetivamente. Portanto, este sistema proporciona um veículo ideal para uma expressão de alto nível que não se baseia na replicação virai dos transcritos.

Este novo sistema (como foi ilustrado pelo vetor de expressão 01 [FSC-512] na Figura 1) foi denominado "CPMV-HT" para o sistema de expressão da proteína com o vírus do mosaico do tabaco hipertraduzível. O sistema HT-CPMV mostra aumentos drásticos nos níveis de proteínas e desta maneira, é um método excelente para a expressão rápida de alto nível de proteínas exógenas em plantas.

Foi desenvolvida uma matriz de crescimento de vetores binários para a transformação de plantas nos últimos 25 anos (Hellens et al. , 2000b; Veluthambi et al. , 2003; Lee e Gelvin, 2008) . O principal objetivo destes desenvolvimentos foi centrado sobretudo em melhorar a integração estável, por exemplo, ampliando a gama de hospedeiro de Agrobacteria (Hiel et al., 1994), a criação de uma série de vetores que permite uma escolha de marcadores selecionáveis, cassetes de expressão e proteínas de fusão (ilustrados pela gama pCAMBlA de vetores binários de código aberta; http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/3725.html), ou desenvolvendo sistemas para minimizar a integração de ADN exógeno e a transformação isenta de marcadores (por exemplo pCLEAN; Thole et al., 2007).

Foram projetados também vetores binários para replicar um número sob de cópias para reduzir a frequência de múltiplos acontecimentos de integração do mesmo, já que isto leva ao silenciamento do gene (Johansen e Carrington, 2001) .

No entanto, para a expressão transitória, não se requer estritamente assegurar uma eficaz integração no núcleo hospedeiro e a presença de um marcador para a seleção de plantas. Além disso, após a agro-infiltração, cada célula foi inundada com moléculas de ADN-T, que se pensa que são transcricionalmente competentes no núcleo incluso sem a integração do genoma (Janssen e Gardner, 1989; Narasimhulu et al., 1996) . Isto sugere que a expressão transitória poderia se beneficiar de um maior número de cópias de plasmideos binários .

Outra área de melhora de vetores binários foi a redução em tamanho da estrutura do vetor. Dois exemplos destacados que seguem demostrando os benefícios dos plasmideos mais pequenos são pPZP (Hajdukiewicz et al., 1994) e pGREEN (Helens et al., 2000a). Além de melhorar a eficácia dos procedimentos de clonagem e transformação bacteriana, estes vetores proporcionaram molde para os sistemas de expressão que se baseiam em múltiplas cassetes num único ADN-T (Tzfira et al., 2005; Thole et al. , 2007) . O presente exemplo descreve refinamentos não óbvios deste vetor que facilitam a sua utilização prática permitindo que se realize a clonagem numa única etapa, em lugar da necessária subclonagem das cassetes de expressão entre o vetor de clonagem (por exemplo, pM81-FSC2) e os sistemas de expressão (por exemplo, PB1N-PLUS). Mais especificamente, os resultados no presente documento mostraram que era possível reduzir drasticamente o tamanho de pBINPLUS sem comprometer o rendimento em termos de replicação e transferência do ADNT. Além disso, os elementos do sistema CPMV-HT foram incorporados ao vetor resultante de forma modular de forma que podem ser expressas múltiplas proteínas a partir de um único ADN-T. Estas melhoras levaram à criação de vetores de expressão de vetores versáteis de alto nível de expressão que permitem uma clonagem eficaz direta de genes exógenos.

2.2 MATERIAIS E MÉTODOS pBD-FSC2-512-U162C (HT) contém a cassete FSC2-512-U162C (veja-se o Exemplo 1) inserido nos locais Pacl/Ascl de pBINPLUS (van Engelen et al., 1995) . Os segmentos essenciais deste plasmídeo (veja-se a seguir) foram amplificados com a polimerase de alta fidelidade PHUS10N (New England Biolabs) utilizando oligonucleótidos que codificam locais de enzimas de restrição únicos para a religação (Quadro 4,1) . A região do ADN-T foi amplificada com um iniciador de sentido direto homólogo para a sequência na direção 5 ' de um único local Ahdl (pBD-LB-F) e um iniciador de sentido contrário que incluiu um local Apal (pBD-RB-Apal-R) . Uma região que incluía a origem de replicação ColEl, o gene NPT111, e o locus TrfA foi amplificado com um iniciador sense que incluía um local Apal (pBD-ColEl-Apal-F), e um iniciador antisense que incluía um local Spel (pBD-TrfA-Spel-R) . A origem de replicação RK2 (OriV) foi amplificada com um iniciador sense que incluiu um local Spel (pBD-oriVSpel-F) e um iniciador antisense que incluía um local Ahdl (pBD-oriV-Ahdl-R) . Após a purificação, os produtos foram digeridos de acordo com locais de restrição únicos codificados em seus termos e foram misturados em três pontos de ligação. Isto resultou no plasmídeo pEAQbeta, para o qual foram verificadas as uniões por ligação por meio de sequenciamento. Foi detetada uma deleção de cerca de 1,2 kb procedente do ADN-T que tinha eliminado uma porção do terminador nos da cassete CPMV-GFP-HT. Portanto, uma porção do terminador que inclui a fronteira direita de pBD-FSC2-GFP-HT foi reamplifiçada com os iniciadores pMini>pMicroBlN-F2 e pBD-RB-Apal-R, assim como a estrutura de pEAQbeta, que incluía a fronteira direita, utilizando os iniciadores pBD-ColEl-Apal-F e pMini>pMicroBlN-R (Quadro 4,1) . Os produtos purificados foram digeridos com Apal e Fsel e foram ligados para dar pEAQ (Figura 9) . 0 gene P19 flanqueado pelo promotor 35S e o terminador 35S foi amplificado a partir de pBlN61-P19 (Voinnet et al., 2003) utilizando qualquer de 35SP19-Pacl-F e 35SP19-AsclR, ou 35SP19-Fsel-F e 35S-P19-Fsel-R como iniciadores (Quadro 4,1). O gene NPT11 flanqueado pelo promotor e o terminador de nos foi amplificado a partir de pBD-FSC2-GFPHT utilizando os iniciadores pBD-NPTll-Fsel-F e pBD-NPTll-Fsel-R (Quadro 4,1) . Após a prolongação de A, foram ligados as cassetes amplificados em pGEM-T easy (Promega) . a cassete P19 foi clivado de pGEM-T easy com Fsel e foi ligado em pEAQ-GFP-HT digerido com Fsel para dar pEAQexpress-GFP-HT. a cassete NPT11 clivado com Fsel foi ligado em pEAQ-GFP-HT digerido com Fsel em ambas as direções para dar pEAQselectK-GFP-HT e pEAQselectK(rev)-GFP-HT. Foi clivado também a cassete NPT11 com Pacl/Ascl e foi ligado nos locais AsiSl/Mlul de pEAQselectK-GFP-HT para dar pEAQspecialK-GFP-HT. 0P19 em pGEM-T foi submetido amutagénese dirigida ao local por meio do método QU1CKCHANGE (Stratagene) para efetuar a conversão da Arginina43 a um resíduo triptofano utilizando os iniciadores P19-R43W-F e P19-R43W-R. A cassete P19 mutante foi libertada com a digestão de Pacl/Ascl e foi inserido nos locais AsiSl/Mlul de pEAQselectK-GFP-HT para dar pEAQspecialKm-GFP-HT.

Os oligonucleótidos que codificam as cadeias sense e antisense de um poliligante curto (Quadro 4,1) foram hibridados deixando a metade de um local NruI na direção 3' na extremidade 5' e um saliente que se corresponde com o de Xhol na extremidade 3'. Os oligos hibridados foram ligados com pM81-FSC2-A115G-U162C digerido com Nrul/Xhol (veja-se anteriormente) para dar pM81-FSC2-POW. Foi eliminado o local Nrul da cassete P19 em pGEM-T por meio de mutagénese dirigida ao local (QU1CKCHANGE; Stratagene) com os iniciadores P19-ANrul-F e P19-ANrul-R, e foi reinserido nos locais AsiSl/Mlul de pEAQselectK-GFP-HT para dar pEAQspecialKANrul-GFP-HT que não mostrou redução na expressão em comparação com pEAQspecialK-GFP-HT (os dados não são mostrados). A seguir foi libertado o fragmento Pacl/Ascl de pM81-FSC2-P0W e foi inserido em pEAQspecialKANrul-GFP-HT de forma similar substituindo, portanto, a cassete de expressão GFP HT e dando como resultado pEAQ-HT. GFP foi amplificado a partir de pBD-FSC2-GFP-HT com um conjunto de quatro iniciadores (Quadro 4,1) em três combinações para a inserção em pEAQ-HT: GFP-Agel-F e GFP-Xhol-R; GFP-Agel-F e GFP-Xmal-R; e GFP-Xmal-F e GFP-Xhol-R. Os produtos da PCR foram digeridos com as enzimas especificadas em sus iniciadores e foram inseridos em pEAQ-HT adequadamente digerido para dar pEAQ-HT-GFP, pEAQ-HT-GFPHis, e pEAQ-HT-HisGFP.

Quadro 4.1. São mostrados os oligonucleótidos utilizados para a amplificação e a mutagénese. Os locais de enzimas de restrição, ou partes dos mesmos, no quadro inferior, e são sublinhadas as mutações em negrita.

2.3 RESULTADOS 2.3.1 pBINPLUS contém pelo menos 7,4 kb de sequência exógena A expressão de CPMV-HT permite a produção de níveis extremadamente elevados de proteínas recombinantes. No entanto desejou-se melhorar adicionalmente o sistema e sua utilização para uma transformação transitória. A primeira área de melhora refere-se ao facto de que os plasmídeos pequenos são mais eficazes que os maiores em reações de ligação e procedimentos de transformação bacteriana. As comparações com as estruturas de vetores binários menores indicaram que pBINPLUS contém igualmente quantidades significativas de sequências exógenas. Foi determinado que são essenciais quatro elementos de pBINPLUS para uma adequada função como um vetor binário: o ADN-T, o RK2 (OriV) é uma origem de replicação de uma ampla gama de hospedeiro, o gene NPTIII que confere resistência à kanamicina (Trieu-Cuot e Courvalin, 1983), e TrfA de RK2 que promove a replicação (Figura 9). A análise bioinformático das seções restantes da estrutura as amostra como artefactos da construção de pBIN19, que se baseiam na presença de locais de restrição adequados nos plasmídeos progenitores (Bevan, 1984). Foram confirmadas estas observações por um relatório sobre a sequenciamento completo de pBIN19 (Frisch et ai., 1995). pBINPLUS inclui o origem de replicação ColEI não essencial para um número maior de cópias em E. coli. Podem ser encontradas cerca de 2,6kb de ADN supérfluo no ADN-T. Isto inclui o marcador selecionável NPTII para a transformação de plantas que não se requer para a expressão transitória. No seu conjunto, a quantidade total de sequência exógena com pBINPLUS parece estar em excesso de 7,2kb.

2.3.2 Construção da série pEAQ

Para vigiar os efeitos sobre a expressão resultantes das modificações do vetor, os inventores escolheram começar com o plasmídeo derivado de pBINPLUS, pBD-FSC2-512-U162C(HT). Três regiões, consistentes no ADN-T, a origem de replicação RK2 (OriV) , e um segmento que contém a origem ColEI, NPTIII, e TrfA, foram amplificados por meio da PCR a partir de pBD-FSC2-GFP-HT. A ligação destes três fragmentos resultou no plasmídeo pEAQbeta (Figura 9), que tem 4584 pb mais pequenos que seu plasmídeo progenitor. Um ciclo adicional de amplificação por meio da PCR de pEAQbeta deletou 2639 pb de sequências não essenciais da região do ADN-T região e inseriu três únicos locais de restrição, AsiSI, Mlul, e Fsel. A digestão de AsiSI/MluI é compatível com a inserção de fragmentos de PacI/AscI, e é portanto, extremamente útil para os cassetes de clonagem múltipla procedentes de todos os vetores de clonagem de CPMV anteriores. Fsel proporciona um único local de reconhecimento de 8 bases para intercambiar diferentes marcadores de seleção ou silenciar as cassetes supressores. 0 plasmídeo pEAQGFP-HT resultante é menor que a metade do tamanho de pBINPLUS e sem a cassete de expressão de CPMVHT seria somente de 5137 pb, fazendo deste um dos vetores binários conhecidos mais pequenos (Figura 9) . Foi sequenciado o plasmídeo pEAQ completo e descobriu-se que a origem da replicação de RK2 estava em orientação contrária à do anteriormente notificado (Frisch et al. , 1995) e está indicado, portanto, na orientação correta em pEAQ-GFP-HT.

Foi utilizado pEAQ-GFP-HT como ponto de partida para a inclusão de diversas caracteristicas adicionais no ADN-T (Figura 10) . a cassete NPTII de pBINPLUS foi reinserido no local Fsel de pEAQ nas orientações direta e inversa com respeito ao cassete GFP-HT para dar pEAQselectK-GFP-HT e pEAQselectK(rev)-GFP-HT. A cassete 35S-P19 foi inserida no local Fsel para dar pEAQexpress-GFP-HT. Finalmente, a cassete 35S-P19 foi inserida nos locais Mlu/AsiSI de pEAQselectK-GFP-HT para dar pEAQspecialK-GFP-HT. Portanto, foram construídas uma série de pequenos vetores binários para uma expressão transitória fácil e rápida.

2.3.3 Ά redução do tamanho não compromete a expressão transitória de pEAQ A agro-infiltração da série pEAQ de vetores amostra que a grande redução no tamanho não compromete significativamente os níveis de expressão nos ensaios transitórios. A infiltração simultânea de pEAQ-GFP-HT, e pEAQselectK(rev)-GFP-HT com P19 proporcionada por pBIN61-P19, resultou em níveis de expressão não significativamente diferentes à infiltração simultânea de pBD-FSC2-512-HT e P19. Isto pode ser observado com iluminação UV (Figura 11A) , SDS-PAGE (Figure 11B), e medidas de espetrofluorescência de GFP em extratos de proteínas (Figura 11C). De maneira interessante, a orientação da cassete NPTII no ADN-T parece afetar o nível de expressão. pEAQselectK amostra uma marcada melhora em comparação com pEAQselectK (rev) idêntico de outra maneira, o que resulta em uma redução na acúmulo de GFP.

Teoricamente, a incorporação de um supressor da cassete de silenciamento em pEAQ não deveria afetar sua capacidade para melhorar o nível de expressão transitória de um gene exógeno que vai ser expresso desde o mesmo ADN-T. De facto, a infiltração de pEAQexpress-GFP-HT em solitário resulta em também níveis de expressão similares a, ou melhores que, pBD-FSC2-GFP-HT (Figure 7,3) . Além disso, para testar a eficácia de pEAQexpress, o cultivo de Agrobacterium se diluyó duas vezes, de tal maneira que a densidade ótica final (DO) foi a de cada cultura individual das infiltrações simultâneas.

Como era de esperar, isto resultou em níveis de expressão similarmente elevados e demonstra que a incorporação que incorporavam ambos genes de interesse e o supressor do silenciamento no mesmo ADN-T permite a utilização da metade da quantidade de Agrobacterias (Figura 11). Portanto, pode ser utlizado CPMV-HT para expressar elevados níveis da proteína exógena quando todos os componentes estão presentes no mesmo ADN-T. 2.3.4 O mutante PI 9 pode suprimir o silenciamento de um transgene num ensaio transitório

Para aproveitar o aumento na expressão que resulta na orientação direta da cassete NPTII no ADN-T, foi inserido a cassete P19 entre os locais AsiSI e MluI em pEAQselectK-GFP-HT para dar pEAQspecialK-GFP-HT (Figure 10) . A presença de P19 no mesmo ADN-T como a sequência de GFP resulta em similares níveis de expressão de pEAQselectK-GFPHT infiltrado simultaneamente com P19 (Figura 12). Isto é mais que a expressão gerada por pEAQexpress-GFP-HT, e parece ser devido à presença da cassete NPTII (Figura 12). Por outra parte, a expressão inferior de pEAQexpress poderia ser devido à posição e orientação diferentes da cassete P19 no ADN-T. No entanto, como com os vetores pEAQexpress, os vetores pEAQspecialK proporcionam um nível de expressão elevado com suspensões de Agrobacteria à metade da DO final da utilizada quando devem ser infiltrados simultaneamente dois cultivos.

Combinar a cassete de expressão génica exógeno com uma cassete P19 e um marcador selecionável torna possível testar o rendimento de CPMV-HT em plantas transgénicas. No entanto, a expressão constitutiva dos supressores do silenciamento de tipo P19 pode dar como resultado fenótipos intensos devido a sua interferência com o silenciamento de genes endógenos associados com os processos de desenvolvimento (Silhavy e Burgyan, 2004). Foi proposto que uma mutação recentemente caracterizada de P19 (R43W) tem uma atividade reduzida para o silenciamento do gene endógeno e, portanto, pode ser um candidato melhor para a supressão do silenciamento do transgene em transformantes estáveis (Scholthof, 2007) . Para investigar a factibilidade de uma transformação estável com o sistema CPMV-HT, ambos P19 natural e mutante foram inseridos no ADN-T de pEAQselectK-GFP-HT para avaliar transitoriamente as variantes. Como se amostra por meio da iluminação UV das folhas infiltradas, SDS-PAGE dos extratos de proteínas, e as medidas espetrofluorométricas dos níveis de GFP, o mutante P19 em pEAQspecialKm é cerca da metade de eficaz na melhora da expressão do gene exógeno que o PI 9 natural em pEAQspecialK (Figura 12) . Isto representa o primeiro estudo sobre o efeito da mutação R43W em P19 sobre a capacidade de suprimir o silenciamento de um transgene.

Exemplo 3

Expressão de IgG de nível elevado a partir de um único plasmideo Com a finalidade de aproveitar a natureza modular da série pEAQ, cassetes de expressão de CPMV-HT que continham a cadeia pesada retida por ER (HE) e a cadeia leve (L) da IgG dirigida contra VIH humano, 2G12 nos locais PacI/AscI e AsiSI/MluI de pEAQexpress. Para determinar se o local de inserção influencia os níveis de expressão, as cadeias L e HE foram inseridos em ambas posições dando como resultado pEAQex-2G12HEL e pEAQex-2G12LHE (Figura 13A). A infiltração de N. benthamiana com cultivos individuais de Agrobacterium que continham os plasmideos anteriores resultou na formação de anticorpos 2G12 ensamblados completamente idênticos em tamanho aos 2G12 produzidos por meio de mistura de três cultivos de Agrobacterium que expressaram cada um os componentes individuais, L, HE e P19 (Figura 13C) . A proteína carregada em cada banda representa 1/30 do extrato obtido a partir de 90 mg de tecido infiltrado ou 1/333 da proteína potencialmente obtenível a partir de 1 g de tecido. A quantidade máxima da IgG unida produzida a partir da mistura das três estirpes corresponde a 1 mg de 2G12 produzido por CHO no gel SDS-PAGE não reduzido corado com coomassie. Isto sugere um nível de expressão de 2G12 superior a 325 mg/kg de peso de tecido fresco, o que concorda com as concentrações medidas com SPR. a utilização de pEAQex-2G12HEL parece superar este nível já alto de acúmulo de anticorpo.

Uma vantagem dos vetores derivados de pEAQ é que cada componente de uma proteína multicadeia tal como uma IgG pode ser administrado automaticamente a uma célula infetada. Portanto, deveriam ser mantidos níveis de expressão elevados a diluições mais altas das suspensões de Agrobacteria que as culturas múltiplas que foram utilizado. Para testar isto neste caso de forma prática, as culturas que foram ressuspensas inicialmente a DO 1,2, e foram misturadas quando foi necessário, foram submetidas a diluições em série de duas vezes (Figura 13B). Isto resultou em DO finais para cada cultura individual da mistura de três culturas de 0,4-0,13, e 0,04. As culturas individuais que incluem construções pEAQexpress foram infiltradas a DO de 1,2, 0,4, e 0,13. Quando são utilizados três culturas independentes, o nível de 2G12 ensamblado diminuiu intensamente durante a diluição em série. Pelo contrário, a expressão de 2G12 derivada de pEAQex-2G12HEL e pEAQex-2G12LHE, foi mantido num nível consistentemente elevado, sendo muito modesta qualquer redução na diluição (Figura 13C-E). A falta de sensibilidade devido à diluição confirma a eficácia melhorada conseguir ao colocar as três cassetes de expressão no mesmo ADN-T. De maneira interessante, a quantidade de proteína total extraída do tecido infiltrado foi quase a metade quando a DO do infiltrado foi reduzida de 1,2 a 0,4. Isto sugere que uma fração significativa da proteína nos extratos tisulares aos quais tinha se infiltrado a suspensão de maior DO pode consistir em proteínas derivadas de Agrobacteria ou proteínas vegetais produzidas em resposta às concentrações mais elevadas de Agrobacteria. A inspeção da Figura 13C sugere que a posição relativa de uma cassete dentro do ADN-T pode afetar aos níveis de expressão. A expressão global procedente de pEAQex-2G12LHE foi levemente inferior que para pEAQex-2G12HEL. Isto foi confirmado por meio de transferência western das amostras não reduzidas, o que também indicou algumas diferenças na abundância dos produtos de degradação e das cadeias de imunoglobulina não incorporadas (Figura 13C - E) . 0 tecido infiltrado com pEAQex-2G12LHE parece não possuir de um produto de degradação específico da cadeia pesada de cerca de 70 a 80 kDa (Figura 13D). Do mesmo modo, parece ter muito menos do intermediário unido HL2, assim como mais cadeia leve livre (Figura 13E) . Como se sabe que a cadeia pesada limita a montagem de 2G12 em plantas (Markus Sack, pers . comm., RWTH, Aachen, Alemanha), o que se confirma pela falta de cadeia pesada livre discernível em todas as amostras, estes resultados indicam que pEAQex-2G12LHE produz menos cadeia pesada que pEAQex-2G12HEL. Isto poderia ser devido a uma expressão reduzida desde a cassete CPMV-HT cercano à fronteira esquerda do ADN-T.

Em outras experiências (os dados não são mostrados), o sistema CPMV-HT também foi utilizado com sucesso no formato transitório em N. benthamiana para expressar: • o vírus da lingua azul (serotipo 10) VP2, VP3, VP5, VP7 e NS1. • o rotavirus NSP5. • a calmodulina de Medicago truncatula (que depois foi purificada). • O ectodominio difícil de expressar do recetor Fc gama recetor 1 humano (CD64) que tinha sido purificado e demostrado funcional em estudos de ligação de anticorpo. • As proteínas da cobertura de CPMV pequena (S) e grande (L) foram expressas simultaneamente e se demostrou que se uniam em partículas análogas a vírus (não são mostradas os dados)

Exemplo 4

Clonagem direta num vetor de expressão CPMV-HT

Apesar da combinação de elementos do sistema num único plasmideo, os vetores descritos anteriormente no presente documento continuam necessitando um procedimento de clonagem em duas etapas para introduzir uma sequência a expressar no plasmideo binário. 0 presente exemplo proporciona um plasmideo binário em que poder ser introduzida diretamente um gene de interesse. 0 plasmideo incorpora um poliligante que não somente permite a inserção direta no plasmideo baseado em pEAQ, também permite a fusão a uma etiqueta de histidina da extremidade C ou N se for desejado (pEAQ-ΗΤ; Figura 14A). 0 poliligante foi inserido primeiro como oligonucleótidos hibridados no pM81-FSC2-512(A115G)(U162C) proporcionando pM81-FSC-P0W. Esta construção pode seguir sendo utilizado no procedimento convencional de clonagem em dois etapas para a geração de construções basadas em pEAQ para a expressão de múltiplas polipéptidos. Além disso, a utilização de um líder em 5' duplamente mutado pode permitir níveis de expressão incluso mais elevados do possível com a mutação simples. A cassete CPMV-HT foi transferida depois a pEAQspecialK por meio dos locais PacI/AscI para proporcionar pEAQ-ΗΤ. A inserção de GFP nas três posições do poliligante de pEAQ-ΗΤ resultou em um GFP não marcado, e fusiones da etiqueta His em 5' (HisGFP) e 3' (GFPHis).

Como era de esperar, o GFP não marcado foi expresso num nível incluso maior do obtido com pEAQspecialK-GPP-HT e um excesso de 1,6 g/kg de tecido FW (Figura 14B). Isto é devido provavelmente ao facto de que o líder CPMV 5' de pEAQ-ΗΤ inclui a mutação extra que elimina AUG 115 que, quando se elimina juntamente com AUG 161, potência adicionalmente a expressão. A presença desta etiqueta His detetada por meio de transferência western confirmou a fusão correta em ambos extremidades N e C dos resíduos de aminoácidos codificados por meio do poliligante. Os três variantes de GFP foram detetáveis, com anticorpos contra GFP, enquanto que somente HisGFP e GFPHis foram detetáveis com anticorpos contra His (Figura 14C), e a presença da etiqueta His reduz a mobilidade da banda GFP em SDS-PAGE na quantidade esperada. A etiqueta também reduziu a quantidade de GFP detetada por meio de análise de fluorescência (Figura 14B) . Este efeito foi mais intenso para a etiqueta His da extremidade N. A intensidade das bandas coradas com coomassie sugere que isto representa uma redução na acúmulo de GFP mercado (Figura 14C) , mais que a interferência com as propriedades fluorógenas de GFP. No entanto, os níveis das proteínas etiquetadas com His continuaram sendo muito elevados superando 0,6 e 1,0 g de GFP por kg de tecido FW.

Discussão dos exemplos 2-4

Para melhorar a facilidade de utilização e o rendimento do sistema de expressão CPMV-HT, foi criado um conjunto modular de vetores para conseguir uma expressão fácil e rápida em plantas. A eliminação de mais da metade da estrutura principal do plasmídeo do vetor binário, pBINPLUS, e parte da região ADN-T não essencial para a expressão transitória resultou em um dos plasmídeos Ti binários mais pequenos conhecidos sem comprometer os níveis de expressão.

Uma proporção similar da estrutura principal já tinha sido retirada de pBINl9 sem perda de rendimento (Xiang et al. , 1999). No entanto, pBINPLUS tem duas melhoras significativas com relação a pBIN19 (van Engelen et al., 1995); um maior número de cópias em E. coli devido à adição da origem de replicação ColEI e um ADN-T reorientado que garante que o gene de interesse está mais longe da fronteira esquerda para evitar que experimente demasiadas deleções na planta (Rossi et al., 1996). Embora o menor tamanho dos plasmídeos pEAQ não tenha efeitos notáveis sobre o número de cópias, proporcionam rendimentos muito melhorados durante os procedimentos de clonagem utilizando kits comerciais de extração de plasmideos já que estes são mais eficazes para plasmideos que tenham menos de 10 kb (não são mostradas os dados). A natureza modular do vetor binário pEAQ adiciona funcionalidade à expressão de CPMV-HT ao permitir que qualquer gene supressor do silenciamento e/ou marcador, se for necessário, seja expreso simultaneamente com um dos cassetes de CPMV-HT. Por exemplo, a inserção de um segundo cassete de HT que inclui uma sequência heteróloga nos locais AsiSI/MluI de pEAQexpress-GFP-HT permitiria o rastreo da expressão com a fluorescência GFP.

Além disso, a flexibilidade dos vetores simplifica o sistema de expressão transitória, necessitando somente a infiltração de uma sola construção de Agrobacterium, e melhora a eficácia ao reduzir a quantidade de infiltração necessária em proporção com o número de cassetes de expressão presentes no ADN-T. Ao ocupar P19 o local Fsel, a presença de dois locais de clonagem para aceitar cassetes HT dos vetores de clonagem (tais como pM81-FSC2-U162C) também permite uma expressão inclusive mais eficaz de proteínas de multisubunidades como anticorpos de tamanho completo. O efeito de P19 sobre a melhora dos níveis de expressão de transgenes está bem caracterizado (Voinnet et al., 2003) . No entanto, este estudo apresenta a primeira demostração de sua eficácia quando são administrados simultaneamente a cada célula com do mesmo ADN-T. Um estudo anterior tinha informado da administração simultânea de PI9 com um ADN-T independente dentro do mesmo Agrobacterium como transgene que contém ADN-T (Hellens et al. , 2005) . No entanto, não foram observados efeitos do P19 até 6 dias depois da infiltração, que sugere uma transferência ineficaz do ADN-T. O presente estudo também demonstra a primeira utilização do P19 de R43W mutante para potenciar a expressão de um transgene. O achado de que o mutante era cerca da metade de eficaz para potenciar a expressão de GFP que P19 natural concorda com sua redução na atividade conhecida, que compromete tanto a infetividade de TBSV (Chu et al., 2000) , como a capacidade da proteína para se ligar à classe mais pequena (21 - 22 nts) dos ARN interferentes curtos (Omarov et al., 2006) . No entanto, é possível que este traço converta potencialmente ao mutante R43W em mais adequado para aplicações que implicam uma transformação estável. Os micro ARN associados com o desenvolvimento também estão na classe de tamanho menor (Vaucheret, 2006; Zhang et al. , 2006) e, portanto, é possível que os processos de desenvolvimento não sejam tão gravemente afetados pela presença do P19 mutante do que seriam por meio da versão natural (Scholthof, 2007) . Além disso, o mutante pode proporcionar uma forma de controlar a expressão transitória das proteínas citotóxicas exógenas. A expressão de 2G12 a partir de um único plasmídeo representa o maior rendimento informado de um anticorpo procedente de tecido vegetal infiltrado com uma única cultura de Agrobacterium. Além disso de utilizar 3 culturas de Agrobacterium para expressão der CPMV-HT, a única forma de conseguir níveis similares com outro sistema implicou a infiltração de 6 culturas independentes e uma abordagem de vetor virai (Giritch et al., 2006). Além disso, a utilização de um único plasmídeo permite uma redução na quantidade de bactérias necessárias para garantir a administração simultânea de múltiplas cassetes de expressão, o que proporcionaria uma economia de custos significativos a níveis de produção industrial. O processo de infiltração é também fisicamente mais simples de realizar com culturas mais diluídas devido a que é produzido menos entupimento dos espaços intercelulares do tecido foliar. Além disso, a diluição até uma DO total de 0,4 reduziu a quantidade de contaminantes derivados de infiltração de proteínas. A análise de nove infiltrações separadas em cada DO mostrou uma redução nas concentrações de proteína nos extratos de 2,7 ± 0,2 a 1,5 ± 0,1 mg/ml quando a DO da cultura foi reduzida de 1,2 a 0,4. Uma vez que que a utilização de pEAQexpress gera tanto 2G12 a DO 0,4 como os três sistemas de cultura a uma DO infiltrada de 1,2, a proteína alvo recombinante deve ser purificada a partir de somente a metade da quantidade de proteína contaminante utilizando pEAQexpress. Isto proporciona uma vantagem muito útil e inesperada para o processamento na direção 3'. A expressão de 2G12 a partir de pEAQexpress também indica um efeito da posição numa cassete de expressão incluído no ADN-T dos vetores pEAQ sobre o nível de expressão obtido. 0 aumento no acúmulo de cadeia leve livre a partir de pEAQex-2G12LHE sugere que se expressa menos cadeia leve com esta construção, que parece dar como resultado menos anticorpo ensamblado. Isto poderia ser devido à disposição das cassetes de expressão no ADN-T. Como alternativa, uma parte dos ADN-Ts são suscetíveis à degradação nucleolítica na fronteira esquerda (Rossi et al., 1996) . A reinserção da cassete NPTII dentro do ADN-T parece ter um marcado efeito sobre a expressão dependendo de sua orientação. Durante as manipulações de clonagem resultou que pEAQselectK-GFP-HT alcançava um número de cópias de plasmídeo em E. coli de cerca de 1,5 vezes o de pEAQselectK(rev)- GFP-HT (determinado a partir de medições do rendimento de três preparações de plasmídeo independentes realizadas com o kit QIAprep, QIAGEN). Isto se correlaciona pouco com a diferença nos níveis de expressão observados entre os dois vetores. Não se sabe o que contribui ao maior número de cópias, ou incluso se a diferencia já existe quando os plasmídeos se transferir a Agrobacteria. No entanto, estas observações sugerem que o número de cópias do plasmídeo pode ser importante para conseguir uma expressão transitória mediada por Agrobacterium eficaz . A este respeito, a utilização da origem RK2 (oriV na Figura 9) por pBIN19 e sues derivados a converte numa boa escolha para a expressão transitória, já que os plasmídeos RK2 são conhecidos por acumular de 7 a 10 copies em Agrobacterium (Veluthambi et al. , 1987) . Isto é similar ao origem pVSl utilizado por pPZP e cerca de 2-5 vezes maior do gerado pelo origem pSa (Lee e Gelvin, 2008) , que está presente no vetor binário pGREEN amplamente utilizado (Helens et al., 2000) . Os plasmídeos que contêm origens de replicação que proporcionam maiores números de cópia tais como os plasmídeos baseados em pRi (Lee e Gelvin, 2008) podem estar inclusive mais adequados para a expressão transitória.

Para conseguir um elevado nível de expressão com vetores pEAQ facilmente acessíveis a laboratórios sem experiência previa com a expressão basada em CPMV ou inclusive, a expressão basada em plantas, de forma geral, foi criado uma versão de pEAQ para clonagem direta. Isto foi conseguida inserindo um poliligante entre a sequência líder em 5 ' e as UTR em 3' de um cassete de expressão CPMVHT, que foi colocado num ADN-T que também incluía cassetes P19 e NPTII. A cassete NPTII foi incluída porque sua presença parecia potenciar a expressão (veja-se anteriormente) . O poliligante também codifica ou dois conjuntos de 6 resíduos histidina para permitir a fusão das etiquetas His das extremidades N ou C para facilitar a purificação da proteína. As construções resultantes também aproveitam a segunda mutação no líder 5' que potência a expressão com respeito a HT.

Estas cassetes de expressão potenciados também pode ser subclonadas a partir do vetor de clonagem pM81-FSC-P0W em qualquer plasmídeo pEAQ. a utilização de pEAQHT leva a uma maior expressão de GFP comparada com pEAQspecialK, que contém somente a mutação única (U162C) . Além disso, o projeto do poliligante também permitiu a expressão de variantes marcadas com His utilizando um procedimento de clonagem numa etapa. Os vetores binários modulares apresentados aqui estão projetados especificamente, mas não de forma restringida, para su utilização com a expressão de CPMV-HT. Um nível de expressão extremadamente elevado foi vinculado com uma melhor eficácia de clonagem e facilidade de utilização. O sistema proporciona o método mais eficaz e direto para a expressão transitória de proteínas de valor adicionado sem as complicações da amplificação virai. Permite obter quantidades de miligramas de proteína recombinante num prazo de duas semanas desde a identificação da sequência em qualquer laboratório de biologia molecular com acesso a instalações de crescimento de plantas. Portanto, se antecipa que proporcionará uma ferramenta extremadamente valiosa em cenários tanto académicos como industriais.

Exemplo 5

Integração de grapa com plasmídeos pEAQ e plantas transgénicas

Embora a série do vetor pEAQ tenha sido projetada pensando na expressão transitória, a reinserção da cassete NPTII no ADN-T proporciona um marcador selecionável para a integração do genoma. Isto permite potencialmente que se utilizam estes vetores binários mais pequenos e mais úteis para transformação estável de plantas e culturas de células vegetais. Quando é utilizado para transformar discos de folhas de N. benthamiana, os vetores pEAQ que contêm a cassete NPTII dentro do ADN-T foram capazes de induzir a formação de calos após seleção com a mesma eficácia que as construções basadas em pBINPLUS. Além disso, a expressão de GFP foi detetável nestes tecidos com luz UV (não são mostradas os dados). Isto demonstra que as moléculas de ADN-T muti-cassete dos vetores pEAQ se podem integrar de forma estável no genoma vegetal e impulsionar a expressão de genes exógenos.

Também foram regeneradas plantas fluorescentes. As folhas dos transformantes primários (T0) foram fluorescentes sob luz uv indicando elevados niveis de expressão de GFP. A semente das plantas T0 autofertilizadas foram viáveis, e as plântulas Ti resultantes que incluíam o transgene também foram fluorescentes (não são mostradas os resultados).

Exemplo 6

Utilização do sistema HT baseado em CPMV com vetores baculovírus A Figura 15 amostra uma construção adequada para utilizar um sistema HT baseado em CPMV com vetores baculovírus em células de inseto. Sob o controlo do promotor plO, as UTR HyperTrans ARN-2 de CPMV também potenciaram a expressão de GFP em células de inseto utilizando o sistema de expressão em baculovirus. Se obtuvo uma potenciação de cerca de 5 vezes nos níveis de fluorescência nas células sf21 infetadas com baculovirus, medidos por meio de citometria de flujo, em comparação com uma construção sem a cassete CPMV-HT.

REFERÊNCIAS

Alamillo, J.M., Monger, W., Sola, I., Garcia, B., Perrin, E., Bestagno, M., Burrone, O.R., Plana-Duran, J., Enjuanes, L., Lomonossoff, P.G. e Garcia, J.A. (2006) Use of vírus vetors for the expression in plants of ative full-length and single chain anticoronavirus antibodies. Biotechnol. J. 1, 1103-1111.

Brigneti, G., Voinnet, 0., Li, W.x., Ji, L.H., Ding, S.Wand Baulcombe, D.C. (1998) Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO Journal 17: 6739-6746.

Cahizares, M.C., Liu, L., Perrin, E., Tsakiris, E. e Lomonossoff, G.P. (2006). A bipartite system for the constitutive and induzivel expression of high levels of foreign proteins in plants. Plant Biotechnol. J. 4, 183-193. Gopinath, K., Wellink, J., Porta, C., Taylor, K.M., Lomonossoff, G.P. e van Kammen, A. (2000) Engineering cowpea mosaic vírus RNA-2 into a vetor to express heterologous proteins in plants. Virology 267: 159-173.

Holness, C.L., Lomonossoff, G.P., Evans, D. e Maule, A.J. (1989) . Identification of the initiation codons for translation of cowpea mosaic virus middle component RNA using site direted mutagenese of an infetious cDNA clone. Virology 172, 311 320.

Liu, L. e Lomonossoff, G.P. (2002) Agroinfetion as a rapid method for propagating Cowpea mosaic virus-based constructs . J. Virol. Methods 105, 343-348.

Liu, L. e Lomonossoff, G.P. (2006) A site-direted mutagenese method utilising large double-stranded DNA templates for the simultaneous introduction of multiple changes and sequential multiple rounds of mutation: Application to the study of whole viral genomes. J. Virol. Methods 137, 63-71.

Liu, L., Canizares, M.C., Monger, W., Perrin, E., Tsakiris, E., Porta, C., Shariat, N., Nicholson, L. e Lomonossoff, G.P. (2005). Cowpea mosaic virus-based systems for the production of antigens and antibodies in plants. Vaccine 23, 1788-1792 .

Lomonossoff, G. P. & Shanks, M. (1983) . The nucleotide sequence of cowpea mosaic virus B RNA. EMBO Journal 2, 2253-2258 .

Mechtcheriakova, I.A., Eldarov, M.A., Nicholson, L., Shanks, M., Skryabin, K.G. e Lomonossoff, G.P. (2006) The use of viral vetors to produce hepatite B virus core particles in plants. J. Virol. Methods 131, 10-15.

Monger, W., Alamillo, J.M., Sola, I., Perrin, E., Bestagno, M., Burrone, O.R., Sabella, P., Plana-Duran, J., Enjuanes, L., Garcia, J.A. e Lomonossoff, G.P. (2006) An antibody derivative expressed from viral vetors passively immunizes pigs against transmissible gastroenteritis virus infetion when supplied orally in crude plant extracts. Plant Biotechnol. J. 4, 623-631.

Rohll, J.B., Holness, C.L., Lomonossoff, G.P. e Maule, A.J. (1993). 3' terminal nucleotide sequences important for the accumulation of cowpea mosaic virus M-RNA. Virology 193, 672-679.

Sainsbury, F., Lavoie, P-O., D'Aoust, M-A., Vezina, L-P. e Lomonossoff, G.P. (2008) . Expression of Multiple Proteins Using Full-Length and Deleted Versions of Cowpea Mosaic Virus RNA-2. Plant Biotechnology Journal, 6: 82-92.

Sainsbury, F., Canizares, M.C. e Lomonossoff, G.P. (2007) Cowpea mosaic virus-based expression vetors. In: Virus

Expression Vetors (Hefferon, K. ed), pp. 339-555. Kerala, India: Transworld Research Network.

Sainsbury, F. e Lomonossoff, G.P. (2008). Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology 148, 1212-1218 .

Sainsbury, F., Liu, L. e Lomonossoff G.P. (2009) Cowpea mosaic virus-based expression of antigens and antibodies in plants. Em: Methods in Molecular Biology Vol. 483 :

Recombinant Pharmaceutical Proteins from Plants (Faye, L. e Gomord, V. eds), pp25-39, NY: Humana Press, van Bokhoven, H., Le Gall, O, Kasteel, D., Verver, J., Wellink, J. e van Kammen, A. (1993). Cis- and Trans-acting Elements in Cowpea Mosaic Virus RNA Replication. Virology 195, 377-386.

Wellink J, Verver J, van Kammen A. (1993) . Mutational analyse of AUG codons of cowpea mosaic virus M RNA. Biochimie. 75(8):741-7.

Referências adicionais:

Lee LY, Gelvin SB (2008) T-DNA binary vetors and systems. Plant Physiology 146: 325-332

Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vetors for plant transformation. Plant Molecular Biology 25: 989-994 Hellens R, Mullineaux P, Klee H (2000b) A guide to Agrobacterium binary Ti vetors. Trends in Plant Science 5: 446-451

Hiei E, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryzasativa L) mediated by Agrobacterium and seguence-analyse of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6: 271-282

Veluthambi K, Jayaswal RK, Gelvin SB (1987) Virulence genes-a, gene-G, and gene-D mediate the double-stranded border cleavage of T-DNA from the Agrobacterium Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84: 1881-1885

Thole V, Worland B, Snape JW, Vain P (2007) The pCLEAN dual binary vetor system for Agrobacterium-Mediated plant transformation. Plant Physiology 145: 1211-1219

Johansen LK, Carrington JC (2001) Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology 126: 930-938

Janssen BJ, Gardner RC (1989) Localized transient expression of Gus in leaf-disks following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology 14: 61-72 Narasimhulu SB, Deng X, Sarria R, Gelvin SB (1996) Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize. Plant Cell 8: 873-886

Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM (2000a) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vetor for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology 42: 819-832

Tzfira T, Tian GW, Lacroix B, Vyas S, Li JX, Leitner-Dagan E, Krichevsky A, Taylor T, Vainstein A, CitovskyV (2005) pSAT vetors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology 57: 503-516

Voinnet 0, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal 33: 949-956

Frisch DA, Harrishaller LW, Yokubaitis NT, Thomas TL, Hardin SH, Hall TC (1995) Complete sequence of the binary vetor BIN-19. Plant Molecular Biology 27: 405-409

Trieu-cuot P, Courvalin P (1983) Nucleotide-sequence of the

Streptococcus-faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-Aminoglycoside phosphotransferase type-III. Gene 23: 331-341

Bevan M (1984) Binary Agrobacterium vetors for plant transformation . Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 Silhavy D, Burgyan J (2004) Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs. Trends in Plant Science 9: 76-83

Scholthof HB (2007) Heterologous expression of viral RNA interference suppressors: RISC management Plant Physiology 145: 1110-1117 van Engelen FA, Molthoff JW, Conner AJ, Nap JP, Pereira A, Stiekema WJ (1995) pBINPLUS - an improved plant transformation vetor based on pBIN19. Transgenic Research 4: 288-290

Rossi L, Hohn B, Tinland B (1996) Integration of complete transferred DNA units is dependent on the ativity of virulence E2 protein of Agrobacterium tumefaciens.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 126-130 Xiang CB, Han P, Lutziger I, Wang K, Oliver DJ (1999) A mini binary vetor series for plant transformation. Plant Molecular Biology 40: 711-717

Hellens RP, Allan AC, Friel EM, Bolitho K, Grafton K, Templeton MD, Karunairetnarn S, Gleave AP, Laing WA (2005) Transient expression vetors for functional genomics, quantification of promoter ativity and RNA silencing in plants. Plant Methods 1: 13

Chu M, Desvoyes B, Turina M, Noad R, Scholthof HB (2000) Genetic dissection of tomato bushy stunt virus pi 9-protein-mediated host-dependent symptom induction and systemic invasion. Virology 266: 79-87

Omarov R, Sparks K, Smith L, Zindovic J, Scholthof HB (2006) Biological relevance of a stable biochemical interaction between the tombusvirus-encoded P19 and short interfering RNAs. Journal of Virology 80: 3000-3008

Vaucheret H (2006) Pds-transcriptional small RNA pathways in plants: mechanisms and regulations. Genes & Development 20: 759-771

Zhang BH, Pan XP, Cobb GP, Anderson TA (2006) Plant microRNA: A small regulatory molecule with big impact. Developmental Biology 289: 3-16

Giritch A, Marillonnet S, Engler C, van Eldik G, Botterman J, Klimyuk V, Gleba E (2006) Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfeted with noncompeting viral vetors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 14701-14706

Os codões de início nas posições 115, 161, 512 e 524 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV são mostrados em negrita e sublinhado.

Os nucleótidos mutantes dos oligonucleótidos utilizados na mutagénese da região 5' dos clones pM81-FSC-2 são mostrados em negrita.

As diferenças de nucleótidos entre a sequência dos vetores pM81-FSC-l e pM81-FSC-2 e a sequência CPMV natural da Quadro 1 são mostradas em maiúsculas.

JtoCJUâ pK8Í~KS®2 ”233 pb &ESS &Í«®$i2«WE cm&cT&skisTtcjks Localização s h^viac^csv S’OTfc 342,,443, /mfcilk-s^ * 5$ w / b^x»CMVWÃ3\ s >« í5,ros8«t.«.!r 3?, , Ml t&mxíMtee$n*£W·' / Í&fe®3>*Ç&KCA âSS\promaS&®r 4&€8 < ,4422

Kmm&am*··' '<,y'4 /wnte&fjfe&s** 4 4 2 * /Wí£l toj?**^* 3‘^S^ 4422 ,,<m /mtlfksy*eS«* /XiStfe«l*CíW\K3«3\31 s?m C8S CCfR5p2«iSSS?3i£ ÍSS44 , , 4444 $ /4*ϊ&Μϊ6«^**4* «s4«r» ®saspl«sSK*!í4 (2242* -2M&3 /ν&ίί^Μ¥»*%Χ* ;prossstor (4444, , «4242 /mti«k»r«'*S©<í /l^bRlwÃís^XssKíSKo-fc^r ^..origem / vtifc i£&»y w *33*

origem b®®grí&«®&S f 83.72, . 822 2 J /mfei £2*y« *33* /Íâ&43.>B|5S422S^«®i^i» »&fc ;S}8s£>&ií&a S&S* ,2873 /4SSfeÍ3SS42fi»*a44 \^TO£«Í?3 .mt..p4pfcl4s> 24^.,3844 *? /1 «tfeíS l#«w\i5i, * \ in CONTAGEM DE BASES *19« « 1481 β AAM § lltS ti

GH5ÍGEM A MAseaMM MSg«fc*fc«t SA &&gglf£eAe M»K»Mfcge «Μ«Μ&8<ϊ$ ASA «.A»*agg»&* ggee«fcc$fc« ^&a^«te§ôí»t. «fegecg&eag SfMggae«©e

ISA e^e<íc«.*3SEf gag«&feôgs<j g&aa&agst&g &«gftAe«&&s e&essffcctstM MA ate^Afeftx^a tt*«cfce«acte g&«g%&*$gg »tgS3$M«Sf roísfet®gftaAS ASA *«çs<MtMfc« Mtoattatigga «g£. toante «6fctfcgg;*gA-g cffcAA&fc&ggfc MA iitfcgataa»* gcf^acgtgg gga.3*sç:«.cg& *«xss®»s.s«t£ «McMmca çfcctKtca«« 43A fcctfffeta«»g £aa*t&tttfèe teçtgMtfefc etfcge*fc^sg cgatefcteui eg£.t,gt,ç»fa

Ml gcaseagta# ®»fegt&«tet sfeAsstssistg f»MA«£fctg MA tfpsMSftà gtsrcggesoe gegtaettgfc eetutèfcMfcg fe«§gs.gt;ggt sii ga*sf«Atge sgfagsesfe s^mmswss s&fcas&M&ir «.egttaegaç Sá A t-«tf£rfcg«íjt tteffcffgt ge**tafc«t« t»cfct«tge« fcf&«sg&ggfc& ttgrtte^ecA^ ?11 fc&efctí«tfctie tfccttfcfflfcfccfc AgeAgatsgg &%«%*&«&$& aMe&agt&A A.ç.Mfcfc.fcg&« T8l aea$«$«tt& c<i«gtgfftte fcfc*»s««s«$ 841 «erai.g*A&s(.g eMMfcgags «gsggMAM e«t«ag$ea& MA asagçfeatUWí «gteteMaeg tg«es.*s&M* ggg»«fc»»«.a <s«fcfcg«.ag^* fcgag*tefc«s«

Ml **s«$«&$agg afea&gfeaAffe «£%*&»&$$& «fcsfcSflM®** Aftaaa,fcMs® ASSA c&SMgaeSjsr «egMctrtfce «a&sgeagset getgfgstgg $ac&«a&G*a imi (gtsts«gt9f®« &ssMtfc«fg« &A&A&«««$& «αομμι3$*& 114 A &«M©»«tfe$f eg»fesg«c*g fcMtttt&fct »t«t«*a$fee feftefcgcMtfe ASOl eMMtgg&g mttwt; &*&%*&««»& *g<sA&t;g«tfc M«Mgr«®&sf feg&AAA&Ma USA etaafegetat fcsgtageafcsi A331 fctS&ttSaSM MSt^áMfSS' gtNSaffngtíggf &3&Μ*ΑϊϊΜ M*t»«ss.«t;g USA $*awsc*%te»fc Aitgfefstct $a»«a&%a$a tteiAgctc» fettf^tsatt ssçsssstst A441 ga.fe&t:tgt5S« af®gfeA§««& «gftagsaga» gfe^iffegfeM &A$ifc§«&M &fcgtf«fe&«fe AMA. tos«s«p Mfce&e&CM scmMmm tsgMfeMSf ASSA sreAMÈSA^Sf «ífMjMaf sscftsltfÁg *sfc«s*M<5fc&g Mtótwsi ASM SSStMftSfc gmt&tÇMKg Μ3Μ«Μ«£ S«gtsffesstg 1S8A «s^tStttusett etteeiigea» tgtcge&cfcfet $fcc&srgfg«m Aas^MfegMs aft»efcetatfe lisi tMgscMsf Mfsagaasi «tpsiga eafefetiietg sffMtsfeSf «f&agfgfet, issi t£!t^^«;tisí ai2&&ge&&&& fcsgfM'SMSf çg*s«gg»e«c aegaaMggf láSA astfS^geAt. ttocassast gg»g«aaaA«i ttgltzgcxa· çt-.Kctttgga fefKt^ííaa^e 2S>32 tc&gtfecgfcfí gfctcttvgt'fc bgasacaa&a tfccgcacaas esegagtfcS t gttgseeasg 1682 gctstggcfcg gS^g^.gafegt gttatfeggat gagiu&fccteb afcgatsrsggt. easfcggacaa 5043 gafcttfcagag «tâ.etgte$« ftttfcttgfcge acecatgtta s.&asaggc&s aafcaaaggtg 2101 aeagtfcaeca ecaacattfcc fcgaeaaetcg g^tKgtitíg^ fcgaogfecggs cataaatagt 3161 ggc.gtgagg» gtatags&fcag taetgac.gtt tataesatet gcfccfceaagra ctecatgaeg 2 222 tgíjsacecag gg-t^gsas-s-aa ga.aettetcg ttcacsStta atcca&aeee ttgfcgggg&í: 3863. tefctgglctg ctç&gatg&t aagttgaagc ágagttag-ga tgacsgStst tfcgtg-fcttog! 2341 ggatgg&cct. t&tctset&c eacagsfcgsg attgctaagc tagaetggts sat.fcgtca.as 3403. g«g&<&atgfcg «gceçaccat. tssccaettg gretgattgté «gaafctsrsjtt aseccttaat 2401 egtfcgs»tg$í gá.a«4£Sgâe tttsccccag ggfcgtgacaa gfcgagfgttcg aaggatgcct 2521 cttfcctatag gaggcggcgc tçgegcgast ca&gesttss tggeeaat&t geecaaetca Ó.SS3 tggátafeffàs tf-fcggagafea ttfcfcagaggtt gaaettcsct. ètgaagstae tasaafegage 2641 ír.cteeasista tta&sgce&e fcgfcfcaeatfcfc ete-atagett fctggtrastcte tagfegatgce 3301 tfctgrgstfcfcs afcgsgagfctfc isesea t&ga attgfctca.at SftgeEsr&gígs fegaggaaísaa 2761 fcgtscfcfctgg fcttfccteeca, acaagagrçtt gfccastgçtt ggtqjaacaca «gfcaaííçeçc 3821 agaacc&c&c ttg&age&afa tggefcgfccec taccfcasasg sa&fetst.fcea tgas&gfcs.ea 2061 an&ggrt&caa tstecgg&ga feEstates fcg SjFggfct&agos fcgttggeatt ís.agg&cfcttt 2341 gfcggt8í.agg tfcstaasceg ggt&sfcgasg gKEcccgest gettg^acet atagescaag 3002 gaeec.gtttg tgcfegaagEse tCAgatgsgt Afcsge-csatg tatgasagei: a§e&«sectf? 1061 cfegetcce.tfc Etcagacgfcíj acagoagtaa acttstgaes t&atc&scçjg caaaa&aaab 8121 setgtsggfcg afcgaaaattg gaaEa«g«a.s afeSsstaste sfcee;»att.«,s gaaegtiastg 3161 cgs&ctgcfcg efctggaaafce tggaaetatt catgttcaaé ttaatgstag gggtgetggfc 3241 sfcc&A&agag cagattggga tggtcaagse tttgfcfctasc Sgcgccagfcc catgaacect 3.301 gaaagitafcg atgçgaggac alctgtgaio sogcaicstg gtbft&gceal gstgaasitc 3311 tstcttgafea teafc&gggso, gaacagcgga sfctgaatttg csg&a&gccc afcgggceaar 3431 «agaccacet: ggrt&tcsfcga atgfcgfctgct âeessfceccr» gacs.aacaca gcaaíccfcgag 3462 gtea&c&tgc gettegatct taatttsagg gttgccggcs afcascetg&t geccícattt 3S41 cc&etgfce&« cggaaacçt?c acsgbt&tsa aagfcfctaggt stccggatss igaaegcs.cc 3001 aagsgtagtg tfc-stfcggstgg acasaclgct as&gcfegcag cgcíssgcaaa acagcscita 3661 aacÇlbgasc t&sSSaagSt agcaggSgas gtSgsgfccCís ae-SCtgggoK eagtas-agga 3721 gaagaacfebs tcattcgagt sgicccaase cfeçgttgaat s&g&sggtga tçtsa&tggg 3761 cacaaatstt ctg-tcagssg agagggsgaa ggtgafcgcaa casacggaa-a acttaccctt 3841 saattsatct gcacsacfcggf aaaactacct gssscasggc eaacaclfcgs castacfcsfcc 3601 sxtsatggsg ss-caasgctt ttca«gasae ccagascata tgaaacggca sgaetsetse 3361 aagagsgcca tgscccaagg fetstgascag gaaagaact» eatttticaa ggatgacggg 4021 aastacasga çaegtgstga agt.eaags.çt gaaggtgats ecettgttaa sagaasecag 4081 ttaaaaggfca tfcgra.ttctaa agaagatgga aacattcltg gacacaaast gg.a.atac«ac 4141 sataacfccas acaatgtafca cafccafeggca gacaaacaaa agaafcggaafc caaagttaac 4501 ttcaaaatta gaçacaacafc tgasgatgga «gcgteoaac tagcsgacca fetafcca&s&a 4261 aatactccaa ttggcgasgg e.cctgseets ttaecaqas» aecatfeaccfc gtcea.casaa 4323. taGgcccttt tgaaag.&tcs caaeg&aasg agaf*ea&e& fcggtseXtòt tg&gStfcgfca 43SI acagotgctcj gfgf-afcfescaea t-$geafcggst gaaeírsca^a a&feaa&gget' ttta&efcssXg 4441 gttteattaa atxfcxettfci gtttg&attt asfcg&tattc ggfcsrírgeax t tct&tgtttg 4$01 gt^ágeggfcfc tfccrt.sjtgete «tgagfcgfcgXt fc&EetXatge, aattXa,at£X cttfcgfcgsyge: 4$S3 tcctgtxxag <;Aggt«gt;e« ett.esge»&g gaçae&a&aa gatttçasfcl. tfeaifca&aàa 4423 asagae-cggg aatccgataE caagcfct&te gatetf caga tegfcXc&aae 4483. afcfcfcggeraast aaagfcttcfcí sa^atfcgaát ccfcgttgccg gtettgce&t'· g&fctafccata 474-1 ta&fctfcetgt tg-aafcfcáçgt taagesfegis ataattaaea tgt.&atgcat gaegttafct-X 48&1 atg&gatggg tttttôtg&t tagagfecccg e&axtstses tttâasacge £&&&$&.&&&£ 4843 aaaatafcagaí gcgeaaaefca ggataa&tta tegegegos^' tgte&Eotafc g-fcfcaot&gait 4$3l eftetagagtg te&agettgg «ge-gtsagct gsattaafcga ateggeeasc gegirgggg&g 4S81 aggcggfctfcg egt^ttggge eetetteege tecctegetc acfegaefesge tgggeteggt SO 41 egtteggttg eggegagegg t&te*gctca cteaâagsc^ gta&taegg-E. EafccX'sestgs. $18$. ato&gggg&t asogeaggaa agsaeatgfcg ageasaagge eage&aasgg ec&ggaaceg 32«1 EÃaaasi^-aíS geytegctgg egttxtesta taggeteegc ecocetgasgj agciateaossa S231 »A&tcga.egt fcea&>gte»g& ggtggegaaa etKgacagga «tatasagat &ecagge$fct 5281 teececfcgga ageteco-esg sgegotefc&a tgtteeg&cc otgeeaett** c-eggatatiet 5541 gftccgpectfct stcccttegg gasgegfcgge gsífcfefcetsâte agatoaegct gt&ggtatcít: $403 cACflfceggtg t&ggfcegtte g-cfccca&get gggefcgtgfcg casjgaaeecf; ecgtttagoc $443, egategetge gcottat«eg ftaactatcg tottgagtco a&eçeggt&a gaeaegastt $$31 ae.cfccactg fcsgcageca «feggtsaeag gattage&ga gcgaggtatg t&ggtggtge $583 t&cagagtte ttg&agtggt ggttfca&sxta cggofc&caet agáágaaeag tatttggtat $#4X etetgetctg oçfs&gGesg tt&ccEXegg aas&agagXfc ggt&gststt; gatecgfcaa $781 seaaaecaee getggt&geg gtggcfcfcttfc cagoagatta, egggcsgaaa 5?43. aaastygstfcci; s-sagaagatc eÈfctg&tott ttís-fcaogggg tefcgacgete ogtggaaoga. $821 s&ssfce&egfc taagggattt tffttstgag att&teaaaa aafasette^ cefc&gsteet 5881 tttaaattaa aaatga&gtt ttaaatea&E. ctaa.agtata tatgagtaaa cttggeofcga $$43 cagrfctaocaa tgcttaatca gcgaggcace tatctt«gcg atctgfcctst tfccgttcaxe 4801 c&fesgtfcgec tgaateeoag tcgtgt&gat aactacgata eggg&gggeX t&ecSstetgg $041 ccceagtgcfc goaatgataer cgeg&gatcrc &egcte»eeg getccr&g&tfc fcj&fco&sròssoafc $38$ aaaecagtea £?eeg$44ggg gog&gegcssg a&gtggceet geaactfcfcafc gegcrafctíc&t $181 et;agt.cfeatfc aattxgfctgeo gggaagetag agtaagtagt tggccagtta atagtttgog 5341 caaegttgtfe gceattgcta c*gg»sfc«gfe ggtgteaogc fcegtogtttg gtafcggctfc« $301 atfce&gctea ggetcacsac gaceaaggcg agrttaeatga tceeeeatgt tgtgcaaaaa 4381 agcggetage tcgttcggtc ctecgafccgí: tgcoagaagt aa.gfceggcsg cagtgttatc $431 aetçatgpgtt atgg<sag«a<; tggafes.4ttc fcattaetgfcò afegíseateog taag&ftgetE $481 ttetgtgaet ggtgagtaot caactaegtt: attctfagaa tagtgtgtgc ggcgaccgag $S41 Itgefccttgc: ccggcgtcaa tacggg&Ea* taçcgogtrca cãtageagaa afcttaa&agt $881 gctcgeçett ggaaaacgtfc efefccggggcf aaaaetet sa aggafcettac çgretgttgag $041 otecá^tfccg afcgtwsseca etçg-fegtaco caAsfcgatot taagtatctt ttacttteraa cagcgsttct g-ggtg.swaas gís&aaafcgce s-ca.aas.aagg sraafc&agggc 67® A gscseggsaa fc£f£tgsaí;&c tcsfcactctfc. «cfSCCfcfccaa tattaCfegaa gc&fcfctafcca S6s2 gggfcfcat'fcgt: «fctafcejsgcg gatscafc&tt tgaacg&afcft tagaas.a»ta asc&a&fcagg ss&l gg^teegcgc acattfcccce gs&s&gfegcc accfc&ât&tfcg ta&sfcgfct&a fc&fctitgtxa $SC1 aa&fcfccgcgt. «saattcceg cfcasaccage tcafcttfctta «.ccsst&gge cgaa&tcggc 7021 as&aiíccefcfc ataa&fcE&aa agaatagacc g&gaKagggt fcgagtffctgtt fcccágfcfcfcg-g 7$®l aacsagafííc cactaç^aas gaacgtggss teccaaegríuea sacsft:ct&ft 7141 csgggcgssfcg gcccsetacg vgasac&tca ccctaatcaa gtttfettgg-g gtcgaggtgc 72 ÔX cgfc&aagcac ts&atcgg&s cectaaaggg agccccegat fctag&gettg aeggcgstaag vasa. ccggcgsacg tggcsraers&a ggsagggaag aaascgaaag ssgcggscgc tagggcg-ccg 7331. gfcaagfgtag çggçcacgct gcgcgtaacc accacscccg ecgcgcttaa tgcgc.egcta 7391 cagggcgcgfe ccc&tcsgcc «Afccag-gístg srgcu&a.etgtt gggssfíjgc-g &£egg%gsgg 7443- gccteçfccgc -fcat-e&cgces gcfeggcgaas gggggatgfc§ etgeaaggcg attâagttgg 7S01 g-fcascgccag ggtttfescoa gtcacgscgt; fcgsaaaacsfa çggcc&grtga gtactfctgs?? 7591 gfcaefcc&tgg- fccaXàgafcgfc t£cctg£g-fcg aáattgttat cs^atca«a» ttceàcacaa 76SÍ csfci&ega.gcc ggaagcafcsà agtg^s&sgc etgsggcgec fc&stgagfcg» gctaaôtcsc 7£®X aetaafcsgcg fcfcgcgs^cac tgcccgcttt ceagtcggga aacc-fcggcgc gc //

i «§«,«,§»**£««9** e<?*#&«ac!«tiS $1 ttetasactc tctctcatct etettaaaga eaaefcfcetcfc etfcgtctfctc tfcgcatg&gc: 1 Si gaseetease gtfcgt&agst cgtgcfctegg eatcagtaca atget texts fceactgaagc 181 gaaatca&ag atetetttgt ggacaegtag tgeggcgcea ttaaafc&acg fcgfcaefcegse 241 «tafcscttgt cggtgfcggfcc ttgggaasiag aa&gcfctgcfc ggaggctgct gttcagcirec 881 atasrattact. fcgfcfeaergatife cfcgetgaetfc fceggcgggtg ea&ftafcctcfc aefcsctgett 3«X g&cgaggsst tgttgcefcgt. aefcsctttct tstfcettett gcfcg&tsggt tet&taag&a 422 afcet&gfcafcfc ttcrtfctgaaa csgagfcfefctc ccgfcggtttfe egaactegga gaaag&fcfcgfc. 481 tasgefctetg t&t&tfcctgc sesaattege gaega&tgta etsteg&gge ctfetsacttct $42 gg-fcttKs.etia a«s.K-fetELcttt agtttgaatt fc&stgfcsafct; eggtgfcgcae. fcfcetsbgfcfct «81 ggfcgsgeggt efct'ttgtgct «a.g.sgtgtgt SÈsttttatg t&atttaatt tefcfctgtgag ££2 ceeetgtts-s gcaggtsgte cettc&fc&a ggaeasa&aa ag&tttt&at fetfc«ttaaa& 321 Mi»4wa4 a&a&gacagg gaat.Sisgafea tcaagct^sit cgaeetgeag ategttcasa 78.1 c&sctggcsA t&s&gsstefc taagattg&a seetgttgee ggscttgçga tgaetatcat 841 afcaafcSfcctg fcSga&fcfcaeg fcfca&gcistgfc ««taafetaac afcgtaafcgca fcgaegfcfcafct gal tv&tgâga&gf gtttfct&tg» tt&g&gtsKS ggg&ttatas &££t8MSi£§ ega (&$$&&* «1 C»&»&test«g crgegeatAatut «ggat.aaa.tt BX«gí?g<?geg gtgteaiç.ct.a tgtEaxfcagst 1821 fcefcct-agagt: çtea&gcttg gcgggceagt tgcafcfcsustg aateggscaa cgegcg-gggs ItSl gaggeggfcfefe gcgtattggg egefcetfceeg çtfesMXegçt eactgaefteg etgegcfccgg 1241 tegetegget geggegsgeg gt&fce&gfiitc seteaaagge ggfcaafcaegg tt&teeacag ISO! a&fcsafggga t&aegeagga «sg&se&tgfc gagcaa&agg ee«ge&»s&.g geeagga&ee 2282 gfcas.aaaggc egcgtfcgctg gcgtttfetce &tagge.teeg sccfCC-ctgsc g&ge&teac» 23:21 asastegaeg eteasgteag aggtggcga.» aeeegaeagg acrtaea.«aga taceaggçrge 2381 ttcccs«tg«¥ aageteette gtgegettste etgttccgae acftgKcgett aeeggafc&ee 2481 fegteegeest· t«tc:e<rttsg g^aagsxgsgg egett,t«tea tagetoaege tgt»ggs&.t<; 2$81 Seagtteggt gtaggtegtt cgetce&agc tgggfftgtgt gc&egataei! ggcgttosgs 2SSI seg&cssgetg egeestatec ggeasstate gtettgagtc eaacccggta agacacg&cfe 2422 fcafccgeeact ggeagc&gsrs acEg-gtaaca ggattageag agcgsggfcat gtaggcggtg 1481 staaagagtfe ettfaagtgg fcggeet&act aeggatsaac tag&ag&aea gtatttggfcs 2341 tetfftgctct getg&ageea gttaesetteg' gaaaaagagt tggtsgstat sgatecggaa 3 801 aacaaacctc egetggt&gc ggtggtttlx ttgtfcfcgxaa geageagatfc aegcgcagaa 1S81 aaaaaggatc tcaagaagat ccefcxgatet ttsefcscrggg gtatgaeget eagtgga®«g 2222 aaa&steacg tt&agggatt r.fcggttatg.a gafcfcateaaa aaggateste ac.etagstee 1881 tftfeta&stta aaaatgaagt ttta&ataaa fcefcaaag.fcat atatgagtaa a«t,tggtebg 2881 ac&gttacea assettaatc agtgaggsas ctstet.eage gatctgteta stfcegtteat SIS2 ecatagfc Ege cfcgacteeee g&sgtgtaga taaet&egat acgggaggge fctaceatctg S283. geeeeagfcge tgeaatgata ccgegagaee eacgctaaee ggefcecragafe ttat*agca& 222.1 taaaeeagee ageeggaagg geegagcg&s gaagtggtce tgcaagtfcta tccgccfceea 3232 teeagtet&t ta&ttgfcfcgc eggg&ageea gagtaagtag ttcgcx-agfct «.atagtttgs S341 geaaegfctft tgsesttgcfc axagge&tag tgftgtcaeg etcgtegttt ggfcatggett 24Ô2 cattcagetc eggttcccaa cgatcaagge gagttasatg ateecccatg ttgfcgeaaaa 24S1 aagaggltag ctcetxeggt ectecgatcg ttgteagaag taagtegtee ge&gfcgfcfcat 3531 eaci-.catggfe tatggoagea etarçafcaatt etctfcactgt cafcgceatac gtaagatgcfc 3SSX tttctgtgaa tg^tg&gtaa eeaacca&gt eafctctgaga atagtgtafcg eggcg&çcga 3t£4X cttgctettg eacggegffcea «.fcae-ggg&ts atâeegcgcs; «cafc&gcagja aatttaa&ag 3731 fcgcfcc&taafc fcgg&aa&egt; feetfccgggge. gaa&aetgr;:? ssagafcetta cçgctgfetga 3?£X gatccagfctc gatgt&acee aafcçgfcgeac ecaactgsffcc tfceagcatet cfc&aetttea 3S31 ceagegfcfcfce fcgggtgagea aaassagsraa ggeaaastgs cscaaaaaag gcfeafe&aggg SSSX eg&sacggsa atgftfegaafca ctcatactcfc tccfestfcfcea atat-tstcga age at it st tc S3 41 agggfctáfcfcgr totfc&tgaga gg&fcscatat ttg&atgtat tfca.eía.aaaat aaacaaakag 50 01 gggttcegcg caeattatees eg&a««gKge eacefcaaaet gtaagcgtfca acatltigii 3<2£X a&g&tttgcg ttaaatfcfctt gtfcaa&tcag cteatfcfcttfc aaeeaa&agg cegaaatagg XXSX caaaateoct t&taaatcaa a&gaafcag&C! cgagstsggg tfcgaatfjttg ttecagrfcfcfcg 3XSX gaacaagsgfc eeacfcattaa aga&cgtgga atcaaa&gsc aaagg-gega» aaasassess. 1X41 tsagggcgafe ggeeeaet&í: gtgaaceate aeeetaafeea «gtfcfefetfcgg ggtegaggtg JlSl cegtaaagea etaaatcgga acectaa&gg gagecceega tttagagett gacgggg&aa. 3561 gecggega&e gtageg&gaa aggaaggg&a gaaa«$egaa& grgagegggeg ct&gggcget 34ÍX ggaaagtgfca gcggteaega fegcgcgtaac· caccasasicç gccgegçfcfca algogscgat 3481 acagggcgcgf tceeaefcefe çsfcteaggct gegca&etgt; tgggasggge gatewfegcg 354 i ggcctrctte^f efcafctacgcc agetgfegaa agg>fgfatíjS: gatge&aggc fateaagttg 3«ex ggta&cgcea gggtttfecce agtcacg&ag ttgtasaacg aeggceagtg agiacstttgg 34SX egç.aafccafcg gtçafcagefcg fcttcsxfcgfcgfc gaaattgfcta tccgcfceaca. attaaaaaca 37ÃX aeafca«gagc cggaàgeata aagfcgtaaag eetggggtge etaatgagtg «getaaciea, a ?8l gattaattge gfctgegefcea atfeee^cfct tçeagteggg aaascfcggcc getaa&tt&a 3541 gaafct.cgage tccaeegcgg aaaceteet-e ggafcteeatt geccagçfc&t ctgtssacttt 33õX attaagaaga tagtggaaaa gg&aggtgge tcet&c&aat ««esacattg cgataaagga 3 961 aaggççafccg ttgaagatga ctetgcagrae agtggteeca aagacggaec e-ceaeecaeg 4 331 «ggagcafccg tggaaaaaga agacgtt««a aseaegtcfcfc eaa&geaagt ggattgatgt 4&S1 gatatcteea etf&egfca&g ggatgaogça «aafeeec&ct afccçtt-sgea agaeaçttee 4.14.1 tetatataag gasgfcte&tt teatttggag agg 0'

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2007135480 A [0009] [0095] [0105] [0126] • EP 194809 A [0112] • EP 270355 A [0113] • EP 0116718 A [0113] • US 5100792 A [0113] • EP 444882 A [0113] • EP 434616 A [0113] • WO 9209696 A [0113] • WO 9400583 A [0113] • EP 331083 A [0113] • EP 175966 A [0113] • EP 290395 A [0113] • WO 8706614 A [0113] • DE 4005152 [0113] • WO 9012096 A [0113] • US 4684611 A [0113] • EP 486234 A [0114] • EP 486233 A [0114]

Documentos de não patente citados na descrição • FRISCH, D. A. ; L. W. HARRIS—HALLER et al. Complete Sequence of the binary vector Bin 19. Plant Molecular Biology, 1995, vol. 27, 405-409 [0086] • Plant transformation and expression vectors. GUERINEAU ; MULLINEAUX. Plant Molecular Biology Labfax. BIOS Scientific Publishers, 1993, 121-148 [0112] • NAR, 1984, vol. 12 (22), 8711-87215 [0113] • GREEN et al. Plant Tissue and Cell Culture. Academic Press, 1987 [0113] • FREEMAN et al. Plant Cell Physiol., 1984, vol. 29, 1353 [0113] • KINDLE. PNAS U. S.A., 1990, vol. 87, 1228 [0113] • OARD. Biotech. Adv., 1991, vol. 9, 1-11 [0113] • HIEIetal. The Plant Journal, 1994, vol. 6, 271-282 [0114] • Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. VASIL et al. Laboratory Procedures and Their Applications. Academic Press, 1984, vol. I, II, III [0118] • WEISSBACH ; WEISSBACH. Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press, 1989 [0118] • SHIMAMOTO, K. Current Opinion in Biotechnology, 1994, vol. 5, 158-162 [0119] • VASIL et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 667-674 [0119] • VAIN et al. Biotechnology Advances, 1995, vol. 13 (4), 653-671 [0119] • VASIL. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 702 [0119] • ALAMILLO, J.M. ; MONGER, W. ; SOLA, I. ; GARCIA, B. ; PERRIN, Y. ; BESTAGNO, M. ; BURRONE, O.R. ; PLANA-DURAN, J. ; ENJUANES, L. ; LOMONOSSOFF, P.G. Us e of virus vectors for the expression in plants of active full-length and single chain anticoronavirus antibodies. Biotechnol. J., 2006, vol. 1, 1103-1111 [0192] • BRIGNETI, G. ; VOINNET, O. ; LI, W.X. ; JI, L.H. ; DING, S.W ; BAULCOMBE, D.C. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO Journal, 1998, vol. 17, 6739-6746 [0192] • CANIZARES, M.C. ; LIU, L. ; PERRIN, Y. ; TSAKIRIS, E. ; LOMONOSSOFF, G.P. A bipartite system for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants. Plant Biotechnol. J., 2006, vol. 4, 183-193 [0192] • GOPINATH, K. ; WELLINK, J. ; PORTA, C. ; TAYLOR, K.M. ; LOMONOSSOFF, G.P. ; VAN KAMMEN, A. Eng ineering cowpea mosaic virus RNA-2 into a vector to express heterologous proteins in plants. Virology, 2000, vol. 267, 159-173 [0192] • HOLNESS, C.L. ; LOMONOSSOFF, G.P. ; EVANS, D. ; MAULE, A.J.

Identification of the initiation codons for translation of cowpea mosaic virus middle component RNA using site directed mutagenesis of an infectious cDNA clone. Virology, 1989, vol. 172, 311-320 [0192] • LIU, L.; LOMONOSSOFF, G.P. Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpea mosaic virus- based constructs. J. Virol. Methods, 2002, vol. 105, 343-348 [0192] • LIU, L.; LOMONOSSOFF, G.P. A site-directed mutagenesis method utilising large double-stranded DNA templates for the simultaneous introduction of multiple changes and sequential multiple rounds of mutation: Application to the study of whole viral genomes. J. Virol. Methods, 2006, vol. 137, 63-71 [0192] • LIU, L.; CANIZARES, M.C. ; MONGER, W. ; PERRIN, Y. ; TSAKIRIS, E. ; PORTA, C. ; SHARIAT, N. ; NICHOLSON, L. ; LOMONOSSOFF, G.P. Cowpea mosaic virus-based systems for the production of antigens and antibodies in plants. Vaccine, 2005, vol. 23, 1788-1792 [0192] • LOMONOSSOFF, G. P. ; SHANKS, M. The nucleotide sequence of cowpea mosaic virus B RNA. EMBO Journal, 1983, vol. 2, 2253-2258 [0192] • MECHTCHERIAKOVA, I.A. ; ELDAROV, M.A. ; NICHOLSON, L. ; SHANKS, M. ; SKRYABIN, K.G. ; LOMONOSSOFF, G.P. The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants. J. Virol. Methods, 2006, vol. 131, 10-15 [0192] • MONGER, W. ; ALAMILLO, J.M. ; SOLA, I. ; PERRIN, Y. ; BESTAGNO, M. ; BURRONE, O.R. ; SABELLA, P. ; PLANA-DURAN, J. ; ENJUANES, L. ; GARCIA, J.A. An antibody derivative expressed from viral vectors passively immunizes pigs against transmissible gastroenteritis virus infection when supplied orally in crude plant extracts. Plant Biotechnol. J., 2006, vol. 4, 623-631 [0192] • ROHLL, J.B. ; HOLNESS, C.L. ; LOMONOSSOFF, G.P. ; MAULE, A.J. 3' terminal nucleotide sequences important for the accumulation of cowpea mosaic virus M-RNA. Virology, 1993, vol. 193, 672-679 [0192] • SAINSBURY, F. ; LAVOIE, P-O. ; D'AOUST, M-A. ; VEZINA, L-P . ; LOMONOSSOFF, G.P. Expression of Multiple Proteins Using Full-Length and Deleted Versions of Cowpea Mosaic Virus RNA-2. Plant Biotechnology Journal, 2008, vol. 6, 82-92 [0192] • Cowpea mosaic virus-based expression vectors . SAINSBURY, F. ; CANIZARES, M.C. ; LOMONOSSOFF, G.P. Vi rus Expression Vectors. Transworld Research Network, 2007, 339-555 [0192] • SAINSBURY, F. ; LOMONOSSOFF, G.P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology, 2008, vol. 148, 1212-1218 [0192] • Cowpea mosaic virus-based expression of antigens and antibodies in plants. SAINSBURY, F. ; LIU, L. ; LOMONOSSOFF G.P. Methods in Molecular Biology Vol. 483 : Recombinant Pharmaceutical Proteins from Plants. Humana Press, 2009, vol. 483, 25-39 [0192] • VAN BOKHOVEN, H. ; LE GALL, O ; KASTEEL, D. ; VERVER, J. ; WELLINK, J. ; VAN KAMMEN, A. Cis- and Trans-acting Elements in Cowpea Mosaic Virus RNA Replication. Virology, 1993, vol. 195, 377-386 [0192] • WELLINK J ; VERVER J ; VAN KAMMEN A. Mutational analysis of AUG codons of cowpea mosaic virus M RNA. Biochimie, 1993, vol. 75 (8), 741-7 [0192] • LEE LY ; GELVIN SB. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology, 2008, vol. 146, 325-332 [0193] • HAJDUKIEWICZ P ; SVAB Z ; MALIGA P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology, 1994, vol. 25, 989-994 [0193] • HELLENS R; MULLINEAUX P ; KLEE H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science, 2000, vol. 5, 446-451 [0193] • HIEI Y ; OHTA S ; KOMARI T ; KUMASHIRO T. Efficient transformation of rice (Oryzasativa L) mediated by Agrobacterium and sequence-analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal, 1994, vol. 6, 271-282 [0193] • VELUTHAMBI K ; JAYASWAL RK ; GELVIN SB. Virulence genes-a, gene-G, and gene-D mediate the double-stranded border cleavage of T-DNA from the Agrobacterium Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1987, vol. 84, 188 1-1885 [0193] • THOLE V; WORLAND B ; SNAPE JW ; VAIN P. The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium- Mediated plant transformation. Plant Physiology, 2007, vol. 145, 1211-1219 [0193] • JOHANSEN LK ; CARRINGTON JC. Silencing on the spot.

Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology, 2001, vol. 126, 930-938 [0193] • JANSSEN BJ ; GARDNER RC. Localized transient expression of Gus in leaf-disks following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology, 1989, vol. 14, 61-72 [0193] • NARASIMHULU SB ; DENG X ; SARRIA R ; GELVIN SB. Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize. Plant Cell, 1996, vol. 8, 87 3-886 [0193]

• HELLENS RP ; EDWARDS EA ; LEYLAND NR ; BEAN S ; MULLINEAUX PM. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology, 2000, vol. 42, 819-832 [0193] • TZFIRA T ; TIAN GW ; LACROIX B ; VYAS S ; LI JX ; LEITNER—DAGAN Y ; KRICHEVSKY A ; TAYLOR T ; VAINSTEIN A ; CITOVSKY V. pSAT vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology, 2005, vol. 57, 503-516 [0193] • VOINNET O ; RIVAS S ; MESTRE P ; BAULCOMBE D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal, 2003, vol. 33, 949-956 [0193] • FRISCH DA ; HARRISHALLER LW ; YOKUBAITIS NT ; THOMAS TL ; HARDIN SH ; HALL TC. Complete sequence of the binary vector BIN-19. Plant Molecular Biology, 1995, vol. 27, 405-409 [0193] • TRIEU-CUOT P ; COURVALIN P. Nucleotide-sequence of the Streptococcus-faecalis plasmid gene encoding the 3'5''-Aminoglycoside phosphotransferase type-III. Gene, 1983, vol. 23, 331-341 [0193] • BEVAN M. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research, 1984, vol. 12, 8711-8721 [0193] • SILHAVY D ; BURGYAN J. Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs. Trends in Plant Science, 2004, vol. 9, 76-83 [0193]

• SCHOLTHOF HB. Heterologous expression of viral RNA interference suppressors: RISC management. Plant

Physiology, 2007, vol. 145, 1110-1117 [0193] • VAN ENGELEN FA ; MOLTHOFF JW ; CONNER AJ ; NAP JP ; PEREIRA A ; STIEKEMA WJ. pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Research, 1998, vol. 4, 28 8-290 [0193] • ROSSI L ; HOHN B ; TINLAND B. Integration of complete transferred DNA units is dependent on the activity of virulence E2 protein of Agrobacterium tumefaciens.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, vol. 93, 126-130 [0193] • XIANG CB ; HAN P ; LUTZIGER I ; WANG K ; OLIVER DJ. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Molecular Biology, 1999, vol. 40, 711-717 [0193] • HELLENS RP ; ALLAN AC ; FRIEL EN ; BOLITHO K ; GRAFTON K ; TEMPLETON MD ; KARUNAIRETNARN S ; GLEAVE AP ; LAING WA. Transient expression vectors for functional genomics, quantification of promoter activity and RNA silencing in plants. Plant Methods, 2005, vol. 1, 13 [0193] • CHU M ; DESVOYES B ; TURINA M ; NOAD R ; SCHOLTHOF HB. Genetic dissection of tomato bushy stunt virus pi 9-protein-mediated host-dependent symptom induction and systemic invasion. Virology, 2000, vol. 266, 79-87 [0193] • OMAROV R ; SPARKS K ; SMITH L ; ZINDOVIC J ; SCHOLTHOF HB.

Biological relevance of a stable biochemical interaction between the tombusvirus-encoded P19 and short interfering RNAs . Journal of Virology, 2006, vol. 80, 3000-3008 [0193] • VAUCHERET H. Post-transcriptional small RNA pathways in plants: mechanisms and regulations. Genes & Development, 2006, vol. 20, 759-771 [0193] • ZHANG BH ; PAN XP ; COBB GP ; ANDERSON TA. Plant microRNA: A small regulatory molecule with big impact. Developmental Biology, 2006, vol. 289, 3-16 [0193] • GIRITCH A; MARILLONNET S ; ENGLER C ; VAN ELDIK G ; BOTTERMAN J ; KLIMYUK V ; GLEBA Y. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, vol. 103, 1470 1-14706 [0193]

Lisboa, 19 de Maio de 2015

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um sistema de expressão génica que compreende: (a) uma sequência potenciadora da expressão derivada do segmento do genoma de ARN-2 virus de ARN bipartido de um Comoviridae, em que um local de início da tradução foi mutado no segmento do genoma de ARN-2, em que o segmento do genoma do ARN-2 natural do vírus Comoviridae codifica duas carboxiproteinas coterminais através de dois locais de início da tradução diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, em que o local de início mutado é o primeiro destes dois locais de início e corresponde ao local de início na posição 161 no segmento de ARN-2 do CPMV natural; em que a sequência potenciadora da expressão: (i) compreende pelo menos uma sequência de 200 nucleótidos do segmento do genoma de ARN-2 que inclui o local de início mutado, ou (ii) tem pelo menos uma identidade de 70 % com os nucleótidos 1 a 507 do segmento do genoma de ARN-2 da sequência de CPMV mostrado no Quadro 1, e em que o local de início na posição 161 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural foi mutado e (b) um gene heterólogo que codifica uma proteína de interesse em que o gene que codifica a proteína de interesse está situado na direção 3' da sequência potenciadora e está operativamente ligado à sequência promotora e à sequência de terminação.
2. 2. Um sistema de expressão génica que compreende uma construção de expressão génica que compreende: (a) uma sequência potenciadora da expressão derivada do segmento do genoma de ARN-2 vírus de ARN bipartido de um Comoviridae, em que foi mutado um local de início no segmento do genoma de ARN-2, em que o segmento do genoma do ARN-2 natural do vírus Comoviridae codifica duas carboxiproteínas coterminais através de dois locais de início da tradução diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, em que o local de início mutado é o primeiro destes dois locais de início e corresponde ao local de início na posição 161 no segmento de ARN-2 do vírus do mosaico do feijão-frade (CPMV) natural, em que a sequência potenciadora da expressão: (i) compreende pelo menos uma sequência de 200 nucleótidos do segmento do genoma de ARN-2 que incluir o local de início mutado, ou (ii) tem pelo menos uma identidade de 70 % com os nucleótidos 1 a 507 do segmento do genoma de ARN-2 da sequência de CPMV mostrado no Quadro 1, e em que o local de início na posição 161 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural foi mutado; e (b) uma sequência heteróloga para facilitar a inserção de um gene que codifica uma proteína de interesse no sistema de expressão génica, em que a sequência heteróloga está situada na direção 3' do local de início mutado na sequência potenciadora; e opcionalmente, (c) uma UTR em 3 ' .
3. 3. Um sistema de expressão génica de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 que compreende ou que compreende adicionalmente uma UTR em 3' UTR que é derivada opcionalmente do mesmo vírus de ARN bipartido.
4. 4. Um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o vírus de ARN bipartido é um comovírus, em que o comovírus é opcionalmente um CPMV.
5. 5. Um sistema de expressão génica de acordo com a reivindicação 4, em que a sequência potenciadora compreende pelo menos os nucleótidos 10 a 512, 20 a 512, 30 a 512, 40 a 512, 50 a 512, 100 a 512, 150 a 512, 1 a 514, 10 a 514, 20 a 514, 30 a 514, 40 a 514, 50 a 514, 100 a 514, 150 a 514, 1 a 511, 10 a 511, 20 a 511, 30 a 511, 40 a 511, 50 a 511, 100 a 511, 150 a 51,1, 1 a 509, 10 a 509, 20 a 509, 30 a 509, 40 a 509, 50 a 509, 100 a 509, 150 a 509, 1 a 507, 10 a 507, 20 a 507, 30 a 507, 40 a 507, 50 a 507, 100 a 507, ou 150 a 507 de um de uma sequência do segmento do genoma de ARN-2 do comovírus com o dito local de início alvo mutado.
6. 6. Um sistema de expressão génica de acordo com a reivindicação 5 em que a sequência potenciadora compreende os nucleótidos 10 a 512, 20 a 512, 30 a 512, 40 a 512, 50 a 512, 100 a 512, 150 a 512, 1 a 514, 10 a 514, 20 a 514, 30 a 514, 40 a 514, 50 a 514, 100 a 514, 150 a 514, 1 a 511, 10 a 511, 20 a 511, 30 a 511, 40 a 511, 50 a 511, 100 a 511, 150 a 511, 1 a 509, 10 a 509, 20 a 509, 30 a 509, 40 a 509, 50 a 509, 100 a 509, 150 a 509, 1 a 507, 10 a 507, 20 a 507, 30 a 507, 40 a 507, 50 a 507, 100 a 507, ou 150 a 507 da sequência do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrado no Quadro 1, em que o local de início na posição 161 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural foi mutado.
7. 7. Um sistema de expressão génica de acordo com a reivindicação 4, em que a sequência potenciadora tem pelo menos 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, ou 75 % de identidade com a sequência do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV mostrados no Quadro 1, em que o local de inicio na posição 161 do segmento do genoma de ARN-2 de CPMV natural foi mutado.
8. 8. Um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7 que compreende: (a) um promotor; (b) nucleótidos 1 a 507 da sequência do segmento do genoma de ARN-2 do vírus do mosaico do feijão-frade mostrado no Quadro 1, em que o AUG na posição 161 foi mutado como é mostrado no Quadro 2, situada na direção 3' do promotor; (c) um gene que codifica uma proteína de interesse situada na direção 3' da sequência definida em (b); (d) nucleótidos 3302 a 3481 da sequência do segmento do genoma de ARN-2 do vírus do mosaico do feijão-frade mostrado no Quadro 1, situada na direção 3' do gene que codifica a proteína de interesse; e (e) um terminador da nopalina sintase situado na direção 3' da sequência definida em (d), ou que compreende: (a) um promotor; (b) uma sequência potenciadora da expressão que tem pelo menos uma identidade de 70 % com os nucleótidos 1 a 507 do segmento do genoma de ARN-2 da sequência de CPMV amostra no Quadro 1, em que o AUG na posição 161 foi mutado, situada na direção 3' do promotor; (c) um gene que codifica uma proteína de interesse situada na direção 3' da sequência definida em (b); (d) nucleótidos 3302 a 3481 da sequência do segmento do genoma de ARN-2 do vírus do mosaico do feijão-frade mostrado no Quadro 1, situada na direção 3' do gene que codifica a proteína de interesse; e (e) um terminador da nopalina sintase situado na direção 3' da sequência definida em (d).
9. 9. Um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, em que o vírus de ARN bipartido é um CPMV, e o AUG na posição 115 também está mutado.
10. 10. Um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7 que compreende: (a) uma primeira construção génica que compreende uma sequência derivada de um ARN-2 truncado de um genoma de um vírus bipartido Comoviridae que inclui pelo menos um gene exógeno que codifica uma proteína heteróloga de interesse operativamente ligada a sequências promotoras e de terminação, em que a construção génica compreende o local de início mutado na direção 5 ' do gene exógeno, em que o segmento do genoma do ARN-2 do vírus Comoviridae codifica duas carboxiproteínas coterminais através de dois locais de início da tradução diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, em que o local de início mutado é o primeiro destes dois locais de início e corresponde ao local de início na posição 161 no segmento de ARN-2 do CPMV natural; e opcionalmente, (b) uma segunda construção génica incorporada opcionalmente na dita primeira construção génica que compreende um supressor heterólogo do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação.
11. 11. Um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é um vetor binário de ADN.
12. 12. Um processo para aumentar a expressão ou potenciar a atividade traducional de uma sequência derivada de um segmento derivado do genoma de ARN-2 de um vírus bipartido Comoviridae, que compreende a mutação de um local de início no mesmo, em que o segmento do genoma do ARN-2 do vírus Comoviridae codifica duas carboxiproteínas coterminais através de dois locais de inicio da tradução diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, em que o local de início mutado é o primeiro destes dois locais de inicio e corresponde ao local de inicio na posição 161 no segmento de ARN-2 do CPMV natural, em que a dita mutação é realizada por meio de: (i) uma mutação pontual no local de início, ou (ii) uma deleção de até 50 nucleótidos de comprimento que inclui o dito local de inicio, em que a dita mutação potência a expressão de uma ORF heteróloga ao que se liga a sequência.
13. 13. Um método para expressar uma proteína de interesse heteróloga num organismo hospedeiro utilizando um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o organismo hospedeiro é um hospedeiro eucariota, que é opcionalmente uma planta ou um inseto.
14. 14. Um método para potenciar a tradução de uma proteína de interesse heteróloga a partir de um gene ou uma grelha de leitura aberta (ORF) que codifica o mesmo que está operativamente ligado a um segmento de genoma de ARN-2 de uma sequência derivada de um vírus bipartido Comoviridae, em que o segmento do genoma do ARN-2 do vírus Comoviridae codifica duas carboxiproteínas coterminais através de dois locais de início da tradução diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, que compreende mutar o primeiro destes dois locais de início na sequência derivada de ARN-2, em que o local de início mutado corresponde ao local de início na posição 161 no segmento de ARN-2 do CPMV natural, em que a dita mutação é realizada por meio de: (i) uma mutação pontual no local de início, ou (ii) uma deleção de até 50 nucleótidos de comprimento que inclui o dito local de início.
15. 15 . Um método de acordo com a reivindicação 13, para expressar uma proteína heteróloga numa planta, que compreende as etapas de: (a) introduzir uma construção de expressão génica que compreende uma primeira construção génica que compreende uma sequência derivada de um ARN-2 truncado de um genoma de um vírus bipartido Comoviridae que inclui pelo menos um gene exógeno que codifica uma proteína heteróloga de interesse operativamente ligada a sequências promotoras e de terminação, em que a construção génica compreende um local de início mutado na direção 5' do gene exógeno; em que o segmento do genoma do ARN-2 do vírus Comoviridae codifica duas carboxiproteínas coterminais através de dois locais de início da tradução diferentes situados na mesma grelha de leitura do triplete, em que o local de início mutado é o primeiro destes dois locais de início e corresponde ao local de início na posição 161 no segmento de ARN-2 do CPMV natural; e opcionalmente, (b) introduzir uma segunda construção génica que incorpora opcionalmente na dita primeira construção génica, que compreende um supressor do silenciamento génico operativamente ligado a sequências promotoras e de terminação na célula vegetal.
16. 16. Um organismo hospedeiro transfetado transitoriamente com, e que compreende, um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o organismo hospedeiro é opcionalmente uma planta ou uma célula vegetal.
17. 17 . Um organismo hospedeiro transgénico transformado de forma estável com, e que compreende, um sistema de expressão génica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11. Lisboa, 19 de Maio de 2015