CN101952446B - 蛋白表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明是基于来自二分体RNA病毒RNA-2基因组节段的表达增强子序列，其中RNA-2基因组节段中的目标起始位点被突变。删除主RNA-2翻译起始上游的合适起始密码子能够大大增加外来蛋白质的积累，而无需病毒复制。还提供了方法、载体和系统，包括基于“超翻译”豇豆花叶病毒(“CPMV-HT”)的蛋白表达系统。

Description

蛋白表达系统

发明领域

本发明一般性地涉及用于提高基因，例如编码目的蛋白质的异源基因，在植物和其它真核生物细胞内表达的方法和材料，特别是源自病毒的序列。

发明背景

豇豆花叶病毒属病毒(comoviruses，CPMV)

豇豆花叶病毒属是具有二分体(bipartite)基因组的RNA病毒。豇豆花叶病毒RNA基因组的节段称作RNA-1和RNA-2。RNA-1编码VPg、复制酶和蛋白酶蛋白(Lomonossoff&Shanks，1983)。复制酶是病毒复制病毒基因组需要的。豇豆花叶病毒属的豇豆花叶病毒(CPMV)的RNA-2编码一个58K和一个48K的蛋白质，以及两个病毒衣壳蛋白L和S。

所有豇豆花叶病毒RNA-2的翻译起始于两个不同的起始位点，它们位于相同的三联阅读框内，最终合成两种共羧基端蛋白质(carboxy coterminalproteins)。这种双起始现象的发生是翻译期间核糖体“遗漏扫描(leakyscanning)”的结果。

CPMV RNA-2的5’端起始密码子(AUG)出现在位置115、161、512和524。位置161和512位的起始密码子处于相同的三联阅读框内。从161位的起始密码子起始则合成一个105K的多聚蛋白(polyprotein)，而从512位的起始密码子起始则合成一个95K的多聚蛋白。因为这两种多蛋白质的合成在3299位的相同终止密码子处终止，所以105K和95K蛋白质是共羧基端的。如果512位的AUG被删除，那么524位的AUG密码子可以作为起始子。然而，在AUG 512存在时，它不发挥这一功能，而只是编码氨基酸甲硫氨酸(Holness et al.，1989；Wellink et al.，1993)。115位的起始密码子不是病毒复制必需的(Wellink et al.，1993)。

由CPMV RNA-2基因组节段编码的105K和95K蛋白质是主要的翻译产物，它们随后被RNA-1编码的蛋白水解活性切割，产生所述的58K或48K蛋白质(这取决于所处理的是105K还是95K蛋白质)和两个病毒衣壳蛋白，L和S。在CPMV的512位的起始密码子处起始翻译比在161位更加高效，从而产生比105K多蛋白质更多的95K多蛋白质。

CPMV RNA-2的115位的起始密码子位于161位和512位起始位置的上游，并处于另一阅读框内。因为该起始密码子与位置175处的种子密码子同相(in-phase)，所以在该位点起始应可产生一条20个氨基酸的肽。然而，迄今尚未发现这种肽的产生。

保持不同AUG之间合框的必要性

突变实验已经显示，保持CPMV RNA-2位置161和512处的起始位点之间合框对于由RNA-1编码的复制酶高效复制RNA-2是至关重要的(Holness et al.，1989；van Bokhoven et al.，1993；Rohll et al.，1993；Wellink etal.，1993)。在基于CPMV RNA-2的表达载体(见下文)中，这种要求限制了512位起始密码子上游可插入的序列的长度，使得将外来基因克隆进入这种载体比理想情况下更难。例如无法使用多接头(polylinker)，因为使用多接头往往会改变这些起始位点之间的开放阅读框(ORF)。

CPMV载体

人们已经使用CPMV作为开发适合于在植物内产生异源多肽的载体系统的基础(Liu et al.，2005；Sainsbury et al.，2007)。这些系统是基于RNA-2的修饰，但是在使用全长型RNA-2还是缺失型的RNA-2上有所不同。然而在两种情况下，都可通过与RNA-1共温育(co-inoculation)实现经修饰的RNA-2的复制。基于全长型RNA-2的表达系统包括将外来蛋白质融合到RNA-2来源多蛋白质的C端。N端多蛋白质的释放由来自口蹄疫病毒2A催化肽序列的作用介导(Gopinath et al.，2000)。最终的RNA-2分子能够在植物内部和植物之间传播。这种策略已经被用于在豇豆植物体内表达许多种重组蛋白质，例如乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和小免疫蛋白(Small Immune Protein)(SIPs)。(Mechtcheriakova et al.，2006；Monger et al.，2006；Alamillo et al.，2006)。尽管全长病毒载体的利用取得了成功，但是在插入序列大小的限制，以及对生物防护的关切方面尚有不足。

为了解决这些问题，最近开发出了基于缺失型CPMV RNA-2的系统(

 et al.，2006)。在该系统中，编码运动蛋白和两种衣壳蛋白的RNA-2区域被除去。然而，经缺失的分子仍然具有RNA-1编码的复制酶进行复制必需的顺式作用序列，因此保持了高水平的基因扩增，但经过修饰的病毒没有污染环境的污染问题。除了RNA-1之外，通过在接种体(inoculum)中进一步引入基因沉默的抑制子，例如来自PVY的HcPro(Brigneti et al.，1998)，经缺失的CPMV载体可用作瞬时表达系统(WO/2007/135480)(Bipartite System，Method And Composition For The Constitutive And Inducible Expression OfHigh Levels Of Foreign Proteins In Plants；同见Sainsbury等，2009)。然而，与使用基于全长RNA-2的载体的情况相对，复制被限制于被接种的叶子。这些CPMV载体已经用于表达由单一类型多肽构成的多链复合体。

基于全长或删节版本CPMV RNA-2的载体的多个拷贝已经显示适合于在植物内产生异聚体(heteromeric)蛋白(Sainsbury et al.，2008)。人们已经利用在RNA-1存在下将两种含有不同标记基因的全长RNA-2构建体共渗透(Co-infiltration)到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中，来显示两个外来蛋白可以在所接种组织的相同细胞内高效表达。而且，蛋白质可以被共定位到相同的亚细胞器，这是形成异聚体至关重要的先决条件。

人们也已经研究了不同CPMV RNA-2载体对于植物内表达异聚体蛋白的适用性。将IgG重链和轻链插入到全长和缺失型RNA-2中，两种方法均显示全长IgG分子在被接种的组织内积累，但使用缺失型RNA-2载体的水平显著更高。因此，全长RNA-2构建体的全身扩散的能力似乎与异聚体蛋白的产生无关，并且使用缺失型RNA-2明显更有利，特别是因为它们提供了生物防护方面的益处。

因此，已知的基于CPMV的载体系统是在植物内表达编码目的蛋白的异源基因的有用工具。然而，在现有技术中对于可提高所表达的异源蛋白质的产量、改善载体的易用性的最优化的载体系统仍然存在需要。

发明内容

本发明人惊奇地发现，突变CPMV RNA-2载体的161位的起始密码子可强烈提高由插入在512位起始密码子之后的基因编码的蛋白质的表达水平。与唯一差异在于161位的起始密码子完整的CPMV RNA-2载体表达的相同蛋白质相比，蛋白质表达水平增加了大约20-30倍(Sainsbury and Lomonossoff，2008)。本发明允许产生高水平的外来蛋白质，而不需要病毒复制。

本发明人还发现，通过突变161位的起始密码子，不再需要保持161位突变的起始密码子与位置512处起始密码子之间的框，因此允许在位置161处被突变的起始密码子之后插入任意长度的序列。这是特别有利的，因为它允许将任意长度的多接头插入到RNA-2载体被突变的起始密码子之后，然后其可用于帮助将目的基因克隆到载体内。

此外，发明人还发现，尽管蛋白表达增加，用161位包含突变起始密码子的CPMV RNA-2载体转化的植物看上去比用已知CPMV RNA-2载体转化的植物更加健康，也就是，显示的坏死更少。植物的健康在蛋白质植物表达中是一个重要的因素，因为健康的植物可存活更长的时间。此外，植物健康在从植物纯化蛋白中也是重要的，因为由于坏死而释放的单宁会干扰蛋白质纯化(Sainsbury and Lomonossoff，2008)。

因此，本发明涉及基于经过修饰的二分体病毒序列的改良的蛋白质产生系统和方法。

因此，在本发明的各种方面中，提供或利用了一种表达增强子序列，该序列源自(或同源于)二分体RNA病毒(例如豇豆花叶病毒属病毒)的RNA-2基因组节段，其中目标起始位点已突变。

本发明进一步提供了用于增加源自二分体病毒RNA-2基因组节段的序列的表达或翻译增强活性的方法，该方法包括突变其中的目标起始位点。

本发明一些特殊的定义和实施方案现在将在下文更加详细地说明。

这里所说的“增强子”序列(或增强子元件)是源自(或同源于)二分体RNA病毒(例如豇豆花叶病毒属病毒)RNA-2基因组节段的序列，其中目标起始位点已突变。这些序列可以增强它们所连接的异源ORF的下游表达。不作为限定，认为当这些序列存在于被转录的RNA中时，能够增强其所连接的异源ORF的翻译。

这里所说的“目标起始位点”是所述增强子序列所来源的二分体病毒(例如豇豆花叶病毒属病毒)野生型RNA-2基因组节段中的起始位点(起始密码子)，其作为起始位点用于产生(翻译)由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基末端蛋白质中较长的一个。

如上所述，由CPMV RNA-2编码的两个共羧基末端蛋白质中较长的一个--105K蛋白质--的产生，起始于野生型CPMV RNA-2基因组节段的第161位处的起始位点。因此，源自CPMV RNA-2基因组节段的增强子序列中的目标起始位点是野生型CPMV RNA-2中第161位的起始位点。

第161位起始密码子的周围的突变可能与第161位起始密码子自身的突变具有相同(或相似)的效果，例如破坏该起始密码子周围的上下文可能意味着起始密码子被绕过的频率更高。

因此在本发明的一个方面中，目标起始位点可以间接地被突变，即通过突变目标起始位点上游和/或下游的一个或多个核苷酸，但保留野生型目标起始位点，其中突变这些核苷酸的效果与当目标起始位点自身被突变时观察到的效果是相同或者相似的。

既然目标起始位点是产生由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基末端蛋白其中较长一个的起始位点，那么由此可知该目标起始位点与同一野生型RNA-2基因组节段上的第二个起始位点-其是产生由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基末端蛋白中较短一个的起始位点-同框(同相)。如果两个起始位点位于同一个三联阅读框内，则它们是同框的(in-frame)。

源自野生型CPMV RNA-2基因组节段的增强子序列中的目标起始位点，即第161位的起始位点，与第512位的起始位点同框，第512位的起始位点是产生由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基末端蛋白中较短的一个的起始位点。

因此，目标起始位点位于所述增强子序列所来源的野生型RNA-2基因组节段中的第二个起始位点的上游(5’)，其中第二个起始位点是产生由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基末端蛋白中较短的一个的起始位点。此外，目标起始位点还可位于所述增强子序列所来源的野生型RNA-2基因组节段的第三个起始位点的下游(3’)。在CPMV中，目标起始位点，即第161位的起始位点，位于第512位的第二起始位点(它是产生95K蛋白的起始位点)的上游和第115位的第三起始位点的下游。

因此，源自二分体病毒RNA-2基因组节段的增强子序列中的目标起始位点是用于产生由野生型RNA-2编码的两个共羧基末端蛋白的两个起始位点中的第一个。在这个语境中“第一个”是指靠近野生型RNA-2基因组节段5’端的那个起始位点。

如果需要，序列中可以有多于一个起始位点被突变。例如，海可以删除或改变位于(或相应于)第115位的“第三”起始位点。已经证明，除了除去AUG 161之外，除去AUG 115也可进一步增强表达(Sainsbury andLomonossoff，2008)。

本发明的增强子序列是基于源自二分体RNA病毒RNA-2基因组节段的修饰序列。

这里所称的二分体病毒或具有二分体基因组的病毒可以是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)的成员。豇豆花叶病毒科的所有属似乎都编码两个共羧基末端蛋白质。豇豆花叶病毒科的属包括豇豆花叶病毒属(Comovirus)、线虫传多角体病毒属(Nepovirus)、蚕豆萎蔫病毒属(Fabavirus)、樱桃锉叶病毒属(Cheravirus)和矮缩病毒属(Sadwavirus)。豇豆花叶病毒属包括豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)、豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus，CPSMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、红三叶草斑点病毒(Red clover mottle virus，RCMV)、菜豆荚斑点病毒(Bean pod mottle virus，BPMV)。优选地，二分体病毒(或豇豆花叶病毒属病毒)是CPMV。

这些豇豆花叶病毒属病毒的RNA-2基因组节段的序列和数种具体的病毒株可以从NCBI数据库获得，登录号在括弧中列出：豇豆花叶病毒RNA-2(NC_003550)，豇豆重花叶病毒RNA-2(NC_003544)，南瓜花叶病毒RNA-2(NC_003800)，南瓜花叶病毒Kimble株RNA-2(AF059533)，南瓜花叶病毒Arizona株RNA-2(AF059532)，红三叶草斑点病毒RNA-2(NC_003738)，菜豆荚斑点病毒RNA-2(NC_003495)，菜豆荚斑点病毒K-Hopkins1株RNA-2(AF394609)，菜豆荚斑点病毒K-Hancock1株RNA-2(AF394607)，安第斯马铃薯斑驳病毒(APMoV：L16239)和萝卜花叶病毒(RaMV；AB295644)。也有可得自菜豆粗缩豇豆花叶病毒(BRMV；AF263548)和豇豆花叶病毒属的一个试探性成员--芜菁轮点病毒(EF191015)的部分RNA-2序列。源自豇豆花叶病毒科其它属的许多序列也是可得的。

迄今，所有已研究的豇豆花叶病毒属病毒均显示具有两个可选择的起始密码子，用于从其RNA-2基因组节段表达两个共羧基端多蛋白质。特别地，CPMV，CPSMV，BPMV，SqMV和RCMV的RNA-2基因组节段已知包含两个可选择的起始密码子，用于表达两个共羧基端多蛋白质。

因此，可以通过本领域已知的方法鉴定其它豇豆花叶病毒属病毒中与CPMV野生型RNA-2节段第161位的起始位点等价的(即相应的)目标起始位点。例如，可以通过野生型CPMV RNA-2基因组节段序列和另一种豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段序列之间的序列比对来鉴定目标起始位点。然后可以使用这种序列比对，通过鉴定出(至少在该比对中)位于野生型CPMV RNA-2中第161位目标起始位点附近或处于与野生型CPMV RNA-2中第161位目标起始位点相同位置的起始位点，来鉴定出该豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段序列中的目标起始位点。

也可以通过确定担任由该野生型豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段编码的两条共羧基端蛋白质中较长一个的合成的起始位点来鉴定其他豇豆花叶病毒属病毒中的目标起始位点。这种方法还可用于和上述比对结合使用，也就是说，可以利用这种方法来确认通过与CPMV RNA-2比对方法鉴定的豇豆花叶病毒起始位点是目标起始位点。

当然，上述方法还可用于鉴定其它豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段中与野生型CPMV RNA-2基因组节段中第512位起始位点等价的起始位点。不过，不是鉴定出担任由野生型豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段编码的两条共羧基端蛋白质中较长一个的合成的起始位点，而是鉴定出担任由野生型豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段编码的两条共羧基端蛋白质中较短一个的合成的起始位点的起始密码子。

一旦鉴定了可能与CPMV RNA-2的第161和512位起始位点等价的两个豇豆花叶病毒属病毒RNA-2起始位点，即可通过检查这两个起始位点是否同框，即处于同一三联阅读框内，来确认目标起始位点的鉴定结果，因为只有在这两个起始位点同框的情况下，它们才能担任产生两个共羧基端蛋白质的起始位点。

在本发明的一个实施方案中，增强子序列包括CPMV RNA-2基因组节段的核苷酸1-512(见表1)，其中第161位的目标起始位点已突变。在本发明的另一个实施方案中，增强子序列包括来自另一种豇豆花叶病毒属病毒的等价序列，其中与CPMV第161位起始密码子等价的目标起始位点被突变。目标起始位点可以通过替换、删除或插入进行突变。优选地，目标起始位点通过点突变加以突变。

在本发明的一个可选择的实施方案中，增强子序列包括豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段序列的核苷酸10-512，20-512，30-512，40-512，50-512，100-512，150-512，1-514，10-514，20-514，30-514，40-514，50-514，100-514，150-514，1-511，10-511，20-511，30-511，40-511，50-511，100-511，150-511，1-509，10-509，20-509，30-509，40-509，50-509，100-509，150-509，1-507，10-507，20-507，30-507，40-507，50-507，100-507，或150-507，并具有突变的目标起始位点。在本发明的其他实施方案中，增强子序列包括表1所示CPMV RNA-2基因组节段序列的核苷酸10-512，20-512，30-512，40-512，50-512，100-512，150-512，1-514，10-514，20-514，30-514，40-514，50-514，100-514，150-514，1-511，10-511，20-511，30-511，40-511，50-511，100-511，150-511，1-509，10-509，20-509，30-509，40-509，50-509，100-509，150-509，1-507，10-507，20-507，30-507，40-507，50-507，100-507，或150-507，其中野生型CPMVRNA-2基因组节段中第161位的目标起始位点被突变。

在本发明进一步的实施方案中，增强子序列包括豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段序列的核苷酸1-500，1-490，1-480，1-470，1-460，1-450，1-400，1-350，1-300，1-250，1-200，或1-100，并具有突变的目标起始位点。

在本发明的可选择的实施方案中，增强子序列包括表1所示CPMVRNA-2基因组节段序列的核苷酸1-500，1-490，1-480，1-470，1-460，1-450，1-400，1-350，1-300，1-250，1-200，或1-100，其中野生型CPMVRNA-2基因组节段中第161位的目标起始位点被突变。

包括豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段序列至少100或200，至少300，至少350，至少400，至少450，至少460，至少470，至少480，至少490，或者至少500个核苷酸并具有突变的目标起始位点的增强子序列也是本发明的实施方案。

此外，包括表1所示CPMV RNA-2基因组节段序列的至少100或200，至少300，至少350，至少400，至少450，至少460，至少470，至少480，至少490，或者至少500个核苷酸，其中野生型CPMV RNA-2基因组节段第161位的目标起始位点已突变的增强子序列，也是本发明的实施方案。

本发明的可选择的实施方案是与表1所示CPMV RNA-2基因组节段序列具有至少99％，98％，97％，96％，95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％同一性，且其中野生型CPMV RNA-2基因组节段第161位的目标起始位点已突变的增强子序列。

在指具体序列时，术语“百分比相似度”、“百分比同一性”和“百分比同源性”的用法与Wisconsin大学GCG软件程序中所述的相同。因此，增强子序列可以与表1所示CPMV RNA-2基因组节段序列的互补序列特异杂交，条件是与野生型CPMV RNA-2基因组节段中第161位对应的目标起始位点被突变。

词语“特异杂交”是指两条具有足够互补序列的单链核酸分子之间的缔合(association)，从而允许这种杂交在本领域通常使用的预定条件下发生(有时称作“基本上互补”)。特别地，该术语是指寡核苷酸与本发明单链DNA或RNA分子内含有的一段基本上互补的序列杂交，从而基本上排除该寡核苷酸具有非互补序列的单链核酸的杂交。“互补”是指核酸序列通过碱基配对(A-G-T与互补序列T-C-A配对)的自然缔合。两条单链分子间的互补可以是部分的-只有一些核酸对是互补的；或者是完全的-全部的碱基对都是互补的。互补的程度影响杂交和扩增反应的效率和强度。

本发明增强子序列中的目标起始位点可以通过删除、插入或替换加以突变，从而使之不再发挥翻译起始位点的功能。例如，可以在增强子序列目标起始位点的位置处进行点突变。或者，可以将增强子序列中的目标起始位点部分或完全删除。例如，可以进行跨增强子序列目标起始位点的删除。与该增强子所来源的野生型RNA-2基因组节段的序列相比，跨起始位点的删除的长度最多可以达5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。

不希望受限于任何理论，CPMV第161位起始密码子的突变被认为可导致翻译抑制子失活，从而增强从位于该被失活翻译抑制子下游的起始密码子的翻译起始。

因此，本发明进一步提供了源自二分体病毒RNA-2基因组节段的增强子序列，其中该增强子序列包括失活的翻译抑制子序列。

本发明进一步提供了用于增加源自二分体病毒RNA-2基因组节段的序列的表达或翻译增强活性的方法，该方法包括使其中的翻译抑制子序列失活。

如上面已经提到的，CPMV RNA-2基因组节段第161位的起始位点的突变被认为可导致正常存在于CPMV RNA-2中的翻译抑制子失活。

这里所说的翻译抑制子序列，是所讨论的增强子序列所来源的二分体病毒(例如豇豆花叶病毒属病毒)野生型RNA-2基因组节段中的一段序列，其包括产生(翻译)由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基端蛋白质中的较长一个的起始位点，或者由该位点构成。

源自CPMV RNA-2基因组节段增强子序列中的翻译抑制子序列是包括或者由上述目标起始位点构成的序列。因此，翻译抑制子序列包括如上文定义的目标起始位点或者由如上文定义的目标起始构成，并可以通过如上所述的突变加以失活。

上面定义的增强子序列可以用在下面本发明的各种方面和实施方案中。

因此，在本发明的一个方面中，提供或者使用了一种分离的核酸，其由或者基本上由如上所述的表达增强子序列构成。

这里使用的“核酸”或“核酸分子”是指任何DNA或RNA分子，单链或者是双链，如果是单链，其互补序列的分子可以是线性或环状形式。在讨论核酸分子时，具体核酸分子的序列或结构可以按照常规的方式描述，即以从5’到3’的方向给出序列。当提及本发明核酸时，有时会使用术语“分离的核酸”。该术语在用于DNA时，是指和在其来源的生物体的天然存在的基因组内与其直接相邻的序列分离的DNA分子。

例如，“分离的核酸”可以包括插入到载体(例如质粒或病毒载体)内的DNA分子，或者整合到原核或真核细胞或宿主生物体基因组DNA内的DNA分子。

在用于RNA时，术语“分离的核酸”主要是指由上面定义的分离DNA分子编码的RNA分子。可选择地，该术语可以指与其在自然状态下(例如在细胞或组织中)相关联的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)还可以是通过生物或合成方法直接产生的、并已与其在产生过程中存在的其它成分分离的分子。

因此，核酸可以由该增强子所来源的二分体RNA病毒RNA-2基因组节段的一部分或片段组成，或者基本上由其组成。例如，在一个实施方案中，核酸至少不包括一部分其所来源的RNA-2基因组节段的编码区。该编码区可能是编码两个共羧基端蛋白质中较短一个的RNA-2基因组节段的区域。核酸可以由二分体病毒RNA-2基因组节段的如下所述的一部分组成或者基本上由其组成：该部分从野生型RNA-2基因组节段的5’端起，延伸到起始产生(翻译)由野生型RNA-2基因组节段编码的两个共羧基端蛋白质中较短一条的起始位点。

词语“基本上由......组成”在指示特定的核苷酸或氨基酸时，意思是指具有给定SEQ ID NO.性质的序列。例如，当用于指示氨基酸序列时，该词语包括该序列本身和不会影响该序列基本和新特征的分子修饰。例如，当用于指示核酸时，该词语包括序列本身和不会影响序列的增强子功能或可提供进一步(附加)功能的少量改变和/或延伸。

本发明进一步涉及包括本发明增强子序列的基因表达系统。

因此，在本发明的另一个方面中，提供了一种包括上述增强子序列的基因表达系统。

该基因表达系统还可以包括插入在增强子序列下游的编码目的蛋白的基因。所插入的编码目的蛋白质的序列可以是任何大小。

因此，在本发明进一步的方面中，提供了一种基因表达系统，其包括：

(a)如上所述的增强子序列；和(b)编码目的蛋白质的基因，其中该基因位于增强子序列的下游。

目标基因和蛋白质可以是异源的，即不是由该增强子所来源的野生型二分体RNA病毒编码的。

基因表达系统可用于在宿主生物体内表达目的蛋白质。在这种情况下，目的蛋白还可以是相对所讨论的宿主生物体异源的，即使用基因工程，即通过人类干预，引入到所讨论的细胞内(例如植物或其祖先)。生物体内的异源基因可以代替内源的等价基因，即在通常情况下执行相同或相似功能的基因，或者插入序列是可以在内源基因或其它序列的基础上添加的。

本领域的技术人员会理解，目的基因的表达需要存在位于被表达基因上游的起始位点(AUG)。这些起始位点可以作为增强子序列的一部分提供或者作为编码目的蛋白质的基因的一部分加以提供。

宿主生物体可以是植物。然而，因为翻译机制在真核生物中是非常保守的，所以基因表达系统也可以用于在除植物之外的其它真核宿主生物体中，例如在昆虫细胞中作为修饰的杆状病毒载体，或者在酵母或哺乳动物细胞中，来表达目的蛋白质。

基因表达系统可以和启动子和终止子序列可操作地连接。

因此，基因表达系统可以进一步包括终止序列，并且编码目的蛋白质的基因可以位于增强子序列和终止序列之间，即在增强子序列的下游(3’)和终止序列的上游(5’)。

因此，本发明进一步提供了一种表达盒，其包括：

(i)启动子，其可操作地连接于

(ii)如上所述的增强子序列

(iii)期望表达的目的基因

(iv)终止子序列。

优选地，用于驱动目的基因的启动子是强启动子。在植物中使用的强启动子的实例包括：

(1)p35S：Odell et al.，1985

(2)木薯叶脉花叶病毒启动子，pCAS，Verdaguer et al.，1996

(3)核酮糖二磷酸羧化酶小亚单位的启动子，pRbcS：Outchkourov et al.，2003.

其它的强启动子包括pUbi(用于单子叶和双子叶植物)和pActin。

在一个优选实施方案中，启动子是诱导型启动子。

用于启动子的术语“诱导型”是本领域技术人员完全理解的。本质上，诱导型启动子控制下的表达会响应施加的刺激而“开启”或增加。不同启动子间刺激的性质存在差异。一些诱导型启动子在不存在合适刺激时导致的表达很少或者表达水平不可检测到(或不表达)。其它诱导型启动子在不存在刺激的情况下导致可检测的组成性表达。无论不存在刺激时的表达水平如何，任何诱导型启动子在存在正确的刺激时表达都会提高。

终止(终止子)序列可以是源自二分体RNA病毒(例如豇豆花叶病毒属病毒)RNA-2基因组节段的终止序列。在一个实施方案中，终止序列可以与增强子序列来源于相同的二分体RNA病毒。终止序列可以包括终止密码子。终止序列之后还可以有多聚腺苷酸信号。

本发明的基因表达盒、基因表达构建体和基因表达系统还可以包括非翻译区(UTR)。UTR可以位于存在于基因表达盒、基因表达构建体或基因表达系统中的终止子序列的上游。当基因表达盒、基因表达构建体或基因表达系统包括编码目的蛋白质的基因时，UTR可以位于所述基因的下游。因此，UTR可以位于编码目的蛋白质的基因和终止子序列之间。UTR可以源自二分体RNA病毒，例如源自二分体RNA病毒的RNA-2基因组节段。UTR可以是与存在于基因表达盒、基因表达构建体和基因表达系统中增强子序列所来源相同的RNA-2基因组节段的3’UTR。优选地，UTR是豇豆花叶病毒属病毒属RNA-2基因组节段的3’UTR，例如CPMV RNA-2基因组节段的3’UTR。

如上所述，先前已经证明，保持CPMV RNA-2中第161位和512位起始位点之间的框，即将两个起始位点保持在同一三联阅读框内，对于由CPMV RNA-1编码的复制酶高效复制CPMV RNA-2是至关重要的(Holnesset al.，1989；van Bokhoven et al.，1993；Rohll et al.，1993)。这个要求限制了在基于CPMV的表达载体中第512位起始位点上游可以插入的序列的长度。特别地，它排除了使用多接头的可能，因为多接头的使用往往会改变这两个起始位点之间的阅读框(ORF)。

本发明人已经证明，保持CPMV RNA-2第161位和512位起始位点之间的阅读框也是在第512位起始位点的高效翻译起始所需要的，也就是说，它是由CPMV编码的两个共羧基端蛋白质较短一条(95K蛋白质)的高效表达所需要的。

然而，本发明人还证明，CPMV RNA-2中第161位起始位点的突变使得在第512位起始位点的上游插入可改变突变起始密码子与第512位起始位点之间的框的序列成为可能，而对95K蛋白质的表达水平没有任何负面影响。因此，第161位起始位点的突变意味着能够插入到第512位起始位点上游的序列的长度不再有限制。

当在其它二分体病毒中也需要保持用于编码两个共羧基端蛋白质的起始位点之间的阅读框时，这种需要也可以通过突变用作产生由病毒RNA-2基因组节段编码的两个共羧基端蛋白质中较长一个的起始位点的AUG加以克服。因此，在本发明的另一个方面中，提供了一种基因表达构建体，其包括：

(a)如上所述的增强子序列；和

(b)用于帮助将编码目的蛋白质的基因插入基因表达系统的异源序列，其中异源序列位于增强子序列中被突变的目标起始位点的下游。

异源序列可以位于该基因表达系统增强子序列所来源的野生型RNA-2基因组节段中负责两个共羧基端蛋白质中较短的一个的产生的起始密码子的上游。或者，异源序列可以设置在该基因表达系统增强子序列所来源的野生型RNA-2基因组节段中负责两个共羧基端蛋白质中较短的一个的产生的起始密码子位点的周围(around)，或者代替该起始密码子。在具有源自CPMV RNA-2的增强子序列的基因表达系统中，异源序列可以设置在野生型RNA-2CPMV基因组节段第512位起始密码子的上游、其周围、或代替该起始密码子。

异源序列可以是多接头或多克隆位点，即帮助将编码目的蛋白质的基因克隆到表达系统内的序列。

例如，如下文中介绍的，本发明人提供了构建体，其包括位于基于CPMV的表达盒的5’前导序列和3’UTR之间的多接头。如下文所述，任何多接头可以任选地编码一组或多组多聚组氨酸残基，以便融合N-或C-端His标签来帮助蛋白质提纯。

优选地，上面的表达构建体存在于载体内，并且优选地包括可用于将表达盒转移和整合到生物体基因组中的边界序列(border sequence)。

优选地，构建体是植物双元载体。优选地，双元转化载体基于pPZP(Hajdukiewicz，et al.1994)。其它的示例构建体包括pBin19(见Frisch，D.A.，L.W.Harris-Haller，et al.(1995).“Complete Sequence of the binary vector Bin 19.”Plant Molecular Biology 27：405-409)。

如这里所述，本发明可以通过将具有必要组件的表达盒移动到现有的pBin表达盒内来实施，或者，在其它实施方案中，可以使用直接克隆型(direct-cloning)pBin表达载体。

例如，如下文所述，本发明人拥有设计用于(但不仅限于)与这里所述的增强子序列一起使用的模块性双元载体。这些载体是基于对pBINPLUS载体的改良，通过这些改良已经证明，在不损害复制和TDNA转化方面性能的前提下大大降低载体的大小有可能的。而且，增强子系统(例如所谓的“CPMV-HT”系统)的元件已经以模块化的方式整合到所得的载体内，从而能够从单个T-DNA表达多个蛋白质。通过这些改良获得了一种多功能、表达水平高、允许高效地直接克隆外来基因的载体。

这些实施例代表了优选的双元植物载体。优选地，它们包括ColEI复制起点，尽管含有其它可产生高拷贝数的复制起点的质粒(例如基于pRi的质粒，Lee and Gelvin，2008)也是优选的，特别是对于瞬时表达系统而言。

如果需要，构建体中可以包括可选择遗传标记，例如提供可选择的表型的标记，例如赋予对抗生素或除草剂(例如卡那霉素、潮霉素、草铵膦(phosphinotricin)、绿黄隆(chlorsulfuron)、甲氨蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮类和草甘膦)的抗性的标记。

最优选的载体是如下所述的pEAQ载体，它们允许直接克隆的版本(direct cloning version)，其是通过使用位于T-DNA上包含本发明的翻译增强子的表达盒的5’前导序列和3’UTR之间的多接头，其中该T-DNA同时还有基因沉默抑制子和NPTII盒。该多接头还编码一组或多组6x组氨酸残基，以便融合N-或C-端His标签来帮助蛋白质提纯。

pEAQ来源载体的一个优点是，多链蛋白质(例如IgG)的每个组分可以被自动地输送到每一个被感染的细胞。

本发明还提供了使用本发明的基因表达系统在宿主生物体(例如植物、酵母、昆虫或哺乳动物细胞)内表达蛋白质(例如异源蛋白质)的方法。

本发明进一步提供了提高从与上述RNA-2来源序列可操作地连接的编码目的异源蛋白质的基因或ORF翻译该异源蛋白质的方法，该方法包括突变所述RNA-2来源序列中的目标起始位点。

这里描述的增强子序列也可以和如WO/2007/135480所述的二分体表达系统一起使用。因此，本发明还涉及基于截短的RNA-2基因节段的基因表达系统，任选地进一步包括与启动子和终止子序列可操作地连接的编码基因沉默抑制子的第二基因构建体。

因此，在进一步的方面中，本发明涉及一种基因表达系统，其包括：

(a)第一基因构建体，其包括携带至少一个与启动子和终止子序列可操作地连接编码异源目的蛋白质的外来基因的二分体病毒基因组截短型RNA-2，其中该基因构建体包括位于该外来基因上游的突变的目标起始位点；和任选地

(b)第二基因构建体，其包括与启动子和终止子序列可操作地连接的所述二分体病毒基因组的RNA-1；和任选地

(c)第三基因构建体，其任选地被整合在所述第一基因构建体中、所述第二基因构建体中或两者中，并包括与启动子和终止子序列可操作地连接的基因沉默抑制子。

本发明基因表达系统(包括上述的任何一个)中存在基因沉默抑制子是优选的，但不是必需的。因此，如上定义的基因表达系统优选包括第三基因构建体，其任选地整合在所述第一基因构建体、所述第二基因构建体或两者内，并包括与启动子和终止子序列可操作地连接的基因沉默抑制子。

因此，在本发明另一个方面中，提供了在植物内表达蛋白质的方法，包括如下步骤：

(a)将本发明的基因表达构建体引入到植物细胞内；和任选地

(b)将包含与启动子和终止子序列可操作地连接的所述二分体病毒基因组RNA-1的第二基因构建体引入到植物细胞内；和任选地

(c)将第三基因构建体引入到植物细胞内，所述第三基因构建体任选地整合在所述第一基因构建体、所述第二基因构建体或两者内的，并包括与启动子和终止子序列可操作地连接的基因沉默抑制子。

优选地，在如上定义的在植物内表达蛋白质的方法包括将第三基因构建体引入到植物细胞内的步骤，该第三基因构建体任选地整合在所述第一基因构建体、所述第二基因构建体或两者内，并包括与启动子和终止子序列可操作地连接的基因沉默抑制子。

本发明还提供了包括将这种构建体引入到植物细胞内的方法。

本发明人已经揭示，通过将目的基因和作为翻译增强子的沉默抑制子一起整合到同一T-DNA上可获得非常高的表达水平。因此，优选的实施方案可以利用所有这些存在于同一T-DNA上的组件。

此外，应当理解，RNA-1不是在这里所述的系统内实现高水平表达所必需的，并且确实，这里描述的“CPMV-HT”系统不借助RNA-1的作用(not bythe action of RNA-1)。

因此，在进一步方面中，本发明涉及一种基因表达系统，其包括：

(a)第一基因构建体，其包括携带至少一个与启动子和终止子序列可操作地连接的编码目的异源蛋白的外来基因的二分体病毒基因组截短型RNA-2，其中该基因构建体包括位于该外来基因上游的突变的目标起始位点；和任选地

(b)第二基因构建体，其任选地被整合在所述第一基因构建体内，包括与启动子和终止子序列可操作地连接的基因沉默抑制子。

因此，在另一个方面中，本发明提供了在植物内表达蛋白质的方法，包括如下步骤：

(a)将本发明的基因表达构建体引入到植物细胞内；和任选地

(b)将任选地整合在所述第一基因构建体内、并包括与启动子和终止子序列可操作地连接的基因沉默抑制子的第二基因构建体引入到植物细胞内。

可用于这些方面中的基因沉默抑制子是本领域已知的，并且在WO/2007/135480中有说明。它们包括源自马铃薯病毒Y的HcPro，源自TEV的He-Pro，源自TBSV的P19，源自FHV的rgsCam，B2蛋白，CPMV的小衣壳蛋白、和源自TCV的衣壳蛋白。最优选地，该系统的RNA-2是截短的，从而不会产生感染性病毒。

在产生稳定转基因植物时，优选的抑制子是具有R43W突变的P19抑制子。

在本发明进一步方面中，公开了一种宿主细胞，其含有根据本发明的异源构建体。

本发明的基因表达载体可以被瞬时或稳定整合到植物细胞内。

对于小规模生产，用本发明的构建体对叶子进行机械农杆菌渗入(agroinfiltration)。大规模可以通过例如使用真空渗透实现。

在其它实施方案中，本发明的表达载体可以被稳定地整合到转基因植物或植物细胞的基因组内。

在一个方面中，本发明可以进一步包括从被转化植物细胞再生植物的步骤。

在下列文献中介绍了先前被广泛成功地用于植物的具体实验程序和载体：Guerineau and Mullineaux(1993)(Plant transformation and expressionvectors.In：Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford，BIOSScientific Publishers，pp 121-148)。合适的载体可以包括源自植物病毒的载体(见例如EP-A-194809)。如果期望，可以在构建体内包含选择遗传标记，例如赋予对抗生素或除草剂(例如卡那霉素、潮霉素、草铵膦、绿黄隆、甲氨蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮类和草甘膦)的抗性的标记。

可以用任何合适的技术将核酸引入到植物细胞内，例如由农杆菌携带的利用其天然基因转移能力的去甲(disarmed)Ti质粒载体(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR 12(22)8711-872151984；the floral dip method ofCloughand Bent，1998)、微粒或微弹(microprojectile)轰击(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)、显微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP 175966，Green et al.(1987)Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press)、电穿孔(EP290395，WO 8706614 Gelvin Debeyser)、其它形式的直接DNA摄取(DE4005152，WO 9012096，US 4684611)、脂质体介导的DNA摄取(例如Freemanet al.Plant Cell Physiol.29：1353(1984))、或涡旋方法(例如Kindle，PNASU.S.A.87：1228(1990d))。在Oard，1991，Biotech.Adv.9：1-11中综述了用于转化植物细胞的物理方法。Ti质粒，特别是双元载体，在下面有更详细的讨论。

农杆菌转化被本领域技术人员广泛用于转化双子叶物种。然而，在几乎所有有经济意义的单子叶植物内常规产生稳定可育的转基因植物方面也取得了相当的成功(见例如Hiei et al.(1994)The Plant Journal 6，271-282))。当单独使用农杆菌效率低或无效时，微弹轰击、电穿孔和直接DNA摄取是优选的。可选择地，不同技术的组合可用于提高转化过程的效率，例如使用涂布有农杆菌的微粒轰击(EP-A-486234)，或者用微弹轰击诱导伤口，随后与农杆菌共培养(EP-A-486233)。

转化技术的具体选择可以根据其转化特定植物物种的效率以及实践本发明的人在特殊方法学选择方面的经验和偏爱来确定。

对于技术人员显而易见的是，用于将核酸引入植物细胞内的转化系统的具体选择不是本发明至关重要的或构成限制，用于植物再生的技术的选择也不是。在本发明人实施的实验中，在多种T-DNA整合模式中均见到了提高的表达效果。

因此，本发明的各个方面提供了转化植物细胞的方法，涉及将本发明的构建体引入到植物组织(例如植物细胞)内，并导致或允许载体和植物细胞基因组重组，从而将根据本发明的核酸引入到基因组内。可以这样做来引起瞬时表达。

或者，转化植物组织之后，可以被再生植株，例如从单个细胞、愈伤组织或叶盘再生，这是本领域的常规技术。几乎任何植物均能够从植物的细胞、组织或器官完整再生。可以获得的技术在下列文献中有综述：Vasil etal.，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol I，II and III，Laboratory Procedures and Their Applications，Academic Press，1984，和Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，1989。

可育转基因植物的产生已经在谷类植物中实现，例如水稻、玉米、小麦、燕麦和大麦，以及许多其它植物物种(综述见Shimamoto，K.(1994)Current Opinion in Biotechnology 5，158-162.；Vasil，et al.(1992)Bio/Technology 10，667-674；Vain et al.，1995，Biotechnology Advances 13(4)：653-671；Vasil，1996，Nature Biotechnology 14page 702)。

再生植物或其部分可用于提供克隆、种子、自交或杂交子代和后代(例如F1和F2后代)、插枝(cuttings)(例如可食用部分)、繁殖体等。

本发明进一步提供了转基因生物体(例如通过这里所述方法获得的或可以获得的)，其中引入了表达载体或盒，并且其中盒中的异源基因以高水平表达。

本发明进一步包括用于产生目的蛋白质的方法，该方法包括如下步骤：执行如上所述的方法(或使用生物体)，和任选地至少收获一种组织，其中目的蛋白质被表达，并从该组织分离目的蛋白质。

具体地，本发明因此提供了一种转基因植物或植物细胞，其被本发明的表达载体瞬时转染。

在一个进一步的方面中，本发明还提供了一种转基因植物或植物细胞，其被本发明的表达载体稳定转染。

本发明还提供了源自这类植物的植物繁殖体，它是任何可以用在生殖或繁殖的部分，有性或者无性，包括插枝、种子等。还提供了包含上述植物细胞或异源DNA的这些植物的任何部分。

因此，在各种方面中(没有限制)，本发明提供了：

·由本发明增强子序列构成或基本上由其构成的核酸(该增强子序列可以(例如)由CPMV RNA-2基因组节段核苷酸1-512构成，或者来源于它，或者来源于另一种二分体RNA病毒的RNA-2基因组节段，在每种情况下，相应于CPMV RNA-2位置161的目标起始位点被突变)。

·基因表达系统，其包括位于例如编码目的蛋白质的ORF上游的这些增强子序列，或者多接头，和任选地终止子。

·如WO/2007/135480中描述的二分体表达系统，其根据本发明进行了修改以便使用本文所述的增强子序列。

·表达盒，其包括：(i)启动子，其可操作地连接于(ii)如上所述的增强子序列，(iii)多接头或期望表达的目的基因，(iv)同源3’UTR(即源自CPMV RNA-2基因组节段的3’UTR)，(v)终止子序列。

·使用本发明的基因表达系统或载体在宿主生物体内(例如植物内)表达蛋白质(例如异源蛋白质)的方法。

·从本发明的基因表达系统或载体表达蛋白质的宿主细胞和生物体(例如植物或酵母)，和产生它们的方法。

除非上下文有其它要求，否则“基因”是指编码用于翻译成肽、多肽或蛋白质的遗传信息的任何核酸。因此，除非上下文有其它要求，否则它可以和“ORF”互换使用。

可能期望表达的基因可以是转基因或内源基因。

目的基因包括编码农艺性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育、颗粒特征等的基因。基因可以参与油、淀粉、碳水化合物、营养物质等的代谢。因此，目的基因或性状包括，但不仅限于，环境或胁迫相关性状、疾病相关性状、和影响农艺性质的性状。目标序列还包括负责蛋白质、肽、脂肪酸、脂类、蜡质、油、淀粉、糖、碳水化合物、香料、气味、毒素、类胡萝卜素、激素、聚合物、黄酮、储藏蛋白、酚酸、生物碱、木质素、丹宁、纤维素、糖蛋白、糖脂等的基因。

最优选地，单子叶植物和/或双子叶植物中的目标基因可以包括编码如下酶或蛋白质的基因，如负责在植物中，例如在油菜、向日葵、大豆和玉米中产生油的酶；参与植物中，例如马铃薯、玉米、谷物中淀粉合成的酶；合成天然药物(例如药品或兽药产品)的酶或本身即为天然药物的蛋白质。

异源核酸可以编码(除其它之外)细菌、真菌、植物或动物来源的基因。多肽可以在植体内(in planta)使用(用于改变植物的特征，例如关于害虫易感性、活力(vigor)、组织分化、育性、营养价值等)，或者植物可以是用于产生多肽的中间媒介，可以从中提纯多肽并用于其它方面。这样的蛋白质包括，但不仅限于，视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein)、p53、血管抑制素、和瘦蛋白。类似地，本发明的方法可用于产生哺乳动物调节蛋白。其它的目的序列包括蛋白质、激素、生长因子、细胞因子、血清白蛋白、血红蛋白、胶原蛋白等。

因此，目标基因或核苷酸序列优选编码下述目的蛋白：抗虫蛋白、抗病蛋白、抗杂草蛋白、哺乳动物蛋白。

“载体”定义为包括任何质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌双元载体，等等，处于双链或单链线性或环形形式，其可以是或者不是自身可传递(transmissible)或可移动(mobilizable)的，能够转化原核或真核宿主，或者通过整合到细胞基因组内，或者在染色体外存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)。所用的构建体可以是完全或部分合成的。特别地，它们是重组的，体现在自然条件下不出现在一起(不连续相接)的核酸序列被连接在一起或者人工组合在一起。除非特别指出，否则根据本发明的载体不需要包括启动子或其它调节序列，特别是当载体是用于将核酸引入到细胞内以重组进入基因组时。

“双元载体”：正如本领域技术人员众所周知的，双元载体系统包括(a)边界序列，其允许将期望的核苷酸序列转移到植物细胞基因组中；(b)期望的核苷酸序列本身，其一般包括由下构成的表达盒(i)植物活性启动子，其可操作地连接于(ii)目标序列和/或增强子(视情况合适)。期望的核苷酸序列位于边界序列之间，并且能够在合适的条件下插入到植物基因组中。双元载体系统一般需要其它的序列(源自根瘤农杆菌)来实现整合。一般地，这可以通过使用所谓的“农杆菌渗透”来实现，其使用农杆菌介导的瞬时转化。简而言之，该技术是基于农杆菌将其部分DNA(″T-DNA″)转移进入宿主细胞，并可在细胞内整合进入核DNA的性质。T-DNA由左右边界序列限定，长度为大约21-23个核苷酸。渗透可以通过例如注射器(叶子)或真空(整个植物)实现。在本发明中，边界序列一般地包围在期望核苷酸序列(T-DNA)的周围，并有一个或多个可通过农杆菌渗透引入到植物材料中的载体。

“表达盒”是指如下的情况，其中核酸处于合适的启动子或其它调节元件的控制下，并与之可操作地连接，用以在宿主细胞，例如微生物或植物细胞内转录。

“启动子”是这样的核苷酸序列，从该序列可以起始该序列下游与之可操作地连接(即沿着双链DNA有义链3’方向)的DNA的转录。

“可操作地连接”的意思是连接起来作为同一核酸分子的一部分，并适当地定位和取向，以便从启动子起始转录。

目的“植物”物种包括，但不仅限于，玉米(Zea mays)、芸薹属(例如甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜)，特别是那些可用作种子油来源的油菜物种，紫花苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(甜高粱、高粱)、粟米(例如珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicummiliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶树(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物(ornamentals)和针叶树。技术人员会意识到，这里公开的病毒载体的趋向性会不同。然而，确定对这些病毒的易感性完全是技术人员能力可及的。而且，还有可能通过重组表达易化病毒进入植物细胞的受体来改变这种特异性。

现在，本发明将通过参考下面的非限制性附图和实施例进行更详细的说明。鉴于这些，本领域的技术人员可以获得本发明的其它实施方案。

因为这里引用的所有参考文献的公开可被本领域技术人员用于实施本发明，因此本文特别通过提述并入它们。

附图简述

图1显示了CPMV表达载体00、10、01和11的示意图。在00表达载体中，第115和161位的起始位点均是完整的。在10表达载体中，第115位的起始位点已突变，但第161位的起始位点是完整的。在01表达载体中，第161位的起始位点已突变，但第115位的起始位点是完整的。在11表达载体中，第115和161位的起始位点均已突变。CPMV表达载体00、10、01、11还包括位于第512(FSC2-152)，513(FSC2-513)或514(FSC2-514)位的起始位点。柱条用来指示预期从该起始位点发生蛋白质表达。

图2显示了在用图1中示意的CPMV表达载体转染的植物体内表达的可溶性绿色荧光蛋白(GFP)的水平。在表达载体FSC2-512，FSC2-513和FSC2-514中，编码GFP的基因被分别插入在第512、513和514位的起始密码子之后。SDS-PAGE凝胶泳道被标记为00、10、01和11，这取决于CPMV载体第115和161位起始位点中哪个是完整的或是突变的。标记‘500ng’的泳道显示了一个相应于500ng GFP蛋白的条带的位置，因此指示了从CPMV表达载体表达的GFP蛋白的预期位置。每个SDS-PAGE凝胶的左手边的泳道显示了蛋白质大小标记物的位置。

图3显示了在用与图2所示实验所用相同的CPMV表达载体转染的本氏烟叶片中的GFP表达水平。叶片尖端的灰白区域对应于GFP表达区域。用于使表达载体10、01和11中第115和/或161位的起始位点失活的突变也已标明。

图4显示了用于瞬时表达绿色荧光蛋白(GFP)、海葵(Discosoma)红色荧光蛋白(DsRed)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的Del-RNA-2(图1中的表达载体00[FSC2-512])和HT(图1中的表达载体01[FSC2-512])的比较结果。每种蛋白的delRNA-2或HT克隆用沉默抑制子P19渗透。(A)用delRNA-2构建体渗透7天后的组织当DsRed或HBcAg表达时开始坏死，而在HT驱动表达的场合则不是如此。实际上，通过HT表达DsRed的组织在日光条件下看上去明显呈红色。(B)蛋白质表达的考马斯染色SDS-PAGE分析。所示的相应于重组蛋白的显著条带经过了western印迹确认。1-标记，2-未渗透组织，3-delRNA-2构建体，4-HT构建体，5-市售标准品(如果有的话)。每个泳道加载来自大约5mg经渗透组织的粗提物，2μg GFP标准品，2μg HbcAg标准品。目前无法获得DsRed的标准品。

图5显示了用于瞬时表达人抗人免疫缺陷病毒抗体2G12的Del-RNA-2(图1中的表达载体00[FSC2-512])和HT(图1中的表达载体01[FSC2-512])的初步比较。IgG重链或者是天然型(HL)或者是内质网滞留型(ER-retained)(HEL)并经轻链和P19渗透。(A)通过del-RNA-2表达2G12-HEL，导致被渗透组织坏死，而这在HT表达中没有发生。(B)用抗体重链加P19渗透过的组织粗提物(delRNA-2或HT)的SDS-PAGE分析。对于每个样品，加载来自5mg渗透组织的粗提物，或1μg人IgG标准品。考马斯染色后可以容易地看到对应于2G12的条带。(C)通过俘获到蛋白质A和表面等离子体共振光谱学来测量5天后抗体2G12的积累量，其代表提取到2体积缓冲液(PBS，5mM EDTA)中后的浓度。这样，我们在没有对植物温育或提取进行优化的条件下可以得到接近150mg/kg(对于HT HEL)的鲜重浓度。每个处理测量了三个样品。

图6显示了已装配的HbcAg颗粒的电子显微图片，这些颗粒是用这里所述的HT(表1中的表达载体01[FSC2-512])表达载体表达的。已装配HbcAg颗粒呈空心球体状，直径大约30nm。含有HbcAg颗粒的汁液(sap)在进行电子显微照相之前并未浓缩，但除去了不需要的盐。因此，电子显微图片代表了汁液中HbcAg颗粒的浓度。

图7显示了载体pM81-FSC1。

图8显示了载体pM81-FSC2。

图9显示了pEAQ构建的示意图。(A)用灰色显示的带有外来序列的基于pBINPLUS的起始质粒。(B)含有双元载体必需元件的PCR产物。(C)末端剪裁(end-tailored)PCR产物的3部分连接反应后的中间质粒。(D)从中间物扩增并随后连接两条片段后得到的最终质粒。

图10显示了主要的pEAQ衍生物的T-DNA的示意图。T-DNA如所示地含有P19和/或NPTII，并且如所示地保留了克隆到限制位点中的可能。

图11显示了由pEAQ载体产生的GFP的表达水平，并与其亲本质粒pBB-FSC2-512-HT比较。将组织用P19和所示的载体渗透(除pEAQexpress之外；pEAQexpress以标准OD或两倍稀释单独渗透)6天后进行分析。将叶子在(A)UV光、(B)考马斯染色12％SDS-PAGE和(C)荧光分光光度分析下成像。

图12显示了与野生型P19相比，P19(R43W)增强GFP表达的能力。组织在用两倍稀释的pEAQselectK(selK-P19)、pEAQselectK与P19(selK)、pEAQspecialK(spK)、两倍稀释的pEAQspecialK(spK 1∶2)、pEAQspecialKm(spKm)、两倍稀释的pEAQspecialKm(spKm 1∶2)、pEAQexpress(ex)、和两倍稀释的pEAQexpress(ex 1∶2)渗透6天后进行分析。叶子在(A)UV光和(B)荧光分光光度分析下成像。

图13显示了用单个pEAQ质粒表达全长IgG 2G12。(A)两个被构建来表达2G12的pEAQexpress驱动的质粒的示意图。(B)渗透方案指示了每种质粒组合的稀释度和其各自的OD，以及在每个OD下渗透后获得的蛋白提取物的浓度(±SD)。(C)渗透8天后2G12重链(γ)的考马斯染色12-4％SDS-PAGE分析和(D)渗透8天后2G12重链(γ)的免疫检测，和(E)渗透8天后2G12Fab区(Fab)链的免疫检测。M，标明了大小的标记；C，对照提取物；Std，CHO产生的2G12。对于考马斯染色，每条泳道内添加来自相当于3mg渗透组织的量的蛋白质与1μg CHO2G12。对于western印迹，每条泳道内添加来自相当于0.75mg渗透组织的量的蛋白质与250ng CHO2G12。标明了估计的组装/降解产物。

图14显示了从pEAQ-HT克隆和表达天然和his-标签变体形式的GFP。(A)具有pEAQ-HT T-DNA示意图，标明了多接头的详情。(B)GFP表达的荧光光度分析。spK＝pEAQspecialK-GFP-HT，GFP，HisGFP，GFPHis＝pEAQ-HT克隆。(C)GFP表达的12％SDS-PAGE和western分析。C＝对照提取物

图15显示了本发明的核构建体，其适于作为杆状病毒载体的一部分用在昆虫细胞中。

实施例

实施例1

1.1方法

表达载体FSC2及其衍生物的产生

从pBinP-S2NT(Liu and Lomonossoff，2002)中切出两侧翼为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶(nos)终止子的完整RNA-2序列，并将其作为一个AscI/PacI片段插入到诱变质粒pM81W(Liu and Lomonossoff，2006)中，构建出一个合适的克隆载体用来从基于pBinP-1-GFP的质粒(

et al.，2006)表达外来蛋白质。对于所得的质粒，pM81W-S2NT，进行一轮诱变，同时引入4个变化(见Liu and Lomonossoff，2006中的方法)，得到pM81B-S2NT-1。该诱变从载体骨架除去两个BspHI位点，而在AUG512附近引入一个BspHI位点(T/CATGA)，并且在UAA 3299(RNA-2编码的多聚蛋白的终止密码子)后面引入一个StuI位点(AGG/CCT)。随后，从pBinP-NS-1(Liu et al.，2005)切出BamHI/AscI片段，并连接到同样消化的pM81B-S2NT-1中，产生pM81-FSC-1。该载体允许通过BspHI和StuI消化将AUG512下游的整个RNA-2ORF加以切离，并用任何具有与BspHI和StuI(平末端)兼容的末端的序列代替。BspHI位点的使用是重要的，因为它可以保留512位的AUG，而该起始位点(initiator)被用来驱动所插入基因的翻译。为了在植物内表达外来基因，将该pM81-FSC-1衍生的质粒用AscI和PacI消化，将含有包括外来序列在内的表达盒的片段转移到同样消化的pBINPLUS中，并将所得的质粒转化进入农杆菌。

为了使克隆更容易，扩大可应用限制酶的选择，也为了研究阅读框对外来基因表达的影响，将整个RNA-2ORF用一个短的多接头代替。核苷酸插入和定点突变的组合产生了pM81-FSC-2，其允许用NruI(TCG/CGA)与XhoI(C/TCGAG)或StuI进行克隆。NruI位点的末端腺苷酸位于512位，这样就保留了这里的AUG。这些修饰改变了与512位AUG的5’紧邻核苷酸，然而仍保留了良好的上下文。将GFP克隆到pM81-FSC-2中使其翻译从512、513、514或515位的AUG起始，这样得到了源自构建体pM81-FSC-1的pM81-FSC2-512，pM81-FSC2-513，pM81-FSC2-514和pM81-FSC2-515。这些基于pM81的质粒是含有表达盒的克隆载体，这些表达盒随后被转移到双元载体中，产生在图2和3所示的实验中所用的表达载体FSC2-512，FSC2-513和FSC2-514。CPMV的wtRNA-2基因组节段与pM81-FSC1和pM81-FSC2载体之间的序列差异如表3所示。载体内与wt CPMV序列相比发生改变的核苷酸用大写字母显示。

在转移到pBINPLUS中(如上文关于pM81-FSC-1所概述的)后进行的农杆菌介导的瞬时转化显示，当没有保持AUG161和下游AUG之间的框的连续性时，所得蛋白质的水平较低。从相对于AUG 161和512的+1和+2位翻译的GFP量有显著降低，而从+3位翻译(即从515翻译，返回到对框)的效率则与从AUG 512的翻译一样高。为了证明这不是由于513和(在较低的程度上)514位的AUG的上下文被弱化的结果，我们生成了FSC2-515+，其从+3位起始，但其上下文与FSC2-513一样差。从FSC2-515+的表达与从FSC2-512或515起始的表达一样高，这表明上下文不好(inferior context)不能解释从FSC2-513和514起始的表达的降低。

考虑到已知的翻译逃离第一AUG规则的机制并不知道需要保持框的连续性，从经缺失的基于RNA-2的载体进行高效翻译需要依赖AUG161和下游AUG之间的框的连续性这一点是让人很感兴趣的。为了理解这一现象并且希望解决它的办法，我们生成了一系列的突变体，它们的RNA-25’序列被修饰。将成对的互补寡核苷酸(见表2)用于pM81-FSC2-512，513和514的定点诱变。突变除去了AUG 115(uORF的起始密码子)、AUG 161(未改变uORF的氨基酸序列)或者将这两个上游起始位点一起去除。通过用U162C寡核苷酸(表2)诱变A115G突变体制造了双突变。

如上文pM81-FSC-2构建体的描述进行这些突变体转录本的瞬时表达。用考马斯染色的SDS-PAGE(图2)或全叶片UV光成像(图3)对这些突变体的GFP表达进行分析显示，161位的AUG缺如可使表达强烈增加。而且，单除去AUG 161或同时除去AUG 115和161可减轻对AUG161和下游AUG之间框的连续性的依赖。对比地，仅除去AUG 115似乎会增强这种依赖性并会一般性地抑制翻译。总之，uORF似乎发挥下调从AUG 161起始的翻译的功能，其是普遍抑制性的并造成对框连续性的依赖。

含有HbcAg颗粒的汁液的电子显微照相。

用于对如图6所示的已组装HbcAg颗粒进行电子显微照相的汁液的制备如下。将叶片组织在2体积Tris/NaCl缓冲液中提取，并在100kDa MWCO柱上更换为TE，而无浓缩。通过与考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的标准品比较判断，HbcAg的最终浓度为大约0.2mg/ml。

1.2结果

(1)改变161位(AUG161)和512位(AUG)处起始位点的相对相位的影响

为了实现这个目的，在AUG512(FSC2-512)的直接上游插入了额外的核苷酸，从而将AUG移动到位置513，514和515(FSC2-513，FSC2-514和FSC2-515)(图1)。通过荧光(图3)和考马斯染色凝胶(图2)判断，使AUG512与AUG161异相(FSC2-513和FSC2-514)导致了GFP表达降低。而恢复相位(FSC2-515)可以将表达返回到自然状况下(FSC2-512)所见的水平。结论是，在存在AUG161的情况下，下游AUG当与第161位的AUG在同一相时，起始最有效。

(2)除去第115位的起始位点(AUG115)同时改变第161位(AUG161)和第512位(AUG512)的起始位点的相对相位

当GFP表达从AUG512驱动时，也就是当该第二个AUG与AUG161同相时，除去AUG115的影响很小或者没有影响(见图2和3中泳道10)。然而，当第二个AUG与AUG161异相时(513，514)，删除AUG115导致GFP几乎不表达(见图2和3中泳道10)。结论：AUG115在一定程度上参与核糖体绕过AUG161和到达AGU512的能力。然而，这需要下游的AUG处于正确的相位。

(3)除去第161位起始位点(AUG161)的影响

该突变的影响令人难以置信地剧烈，GFP的表达水平达到存在AUG161时的20-30倍(见图2和3的泳道01)。而且，AUG512处于哪个相位似乎不再重要，虽然当不存在AUG161时相位这个概念的意义也不大。此外，存在或不存在AUG115无关紧要(见图2和3中的泳道11)。

当使用delRNA-2(图1中的表达载体00[FSC2-512])构建体表达DsRed和HbcAg时，在5天内，经渗透的叶块(infiltrated patches)丧失了膨压(turgorpressure)，并且退绿(chlorotic)(变灰白)。到7天，组织变灰，并且完全死亡。当使用HT(图1中的表达载体01[FSC2-512])时，组织在7天后仍然保持膨胀(turgid)，唯一的胁迫征象是表达HbcAg的组织有轻微的退绿。当2G12IgG的重链通过delRNA-2表达并且滞留在内质网内时，7天后退绿明显，而对于HT则没有观察到这个现象。当使用HT表达异源蛋白质时，尽管获得了比使用delRNA-2表达异源蛋白质时更高水平的异源蛋白质表达，在植物中见到的坏死水平却低得多。

讨论

通过删除AUG161可以从delRNA-2构建体表达非常高水平的外来基因。目前，使用GFP，我们估计水平为总可溶蛋白质(TSP)的25-30％，或者每千克叶子大约1克表达蛋白。这是一个极高的水平，并且我们使用的方法极其简单。我们不再需要保持阅读框的事实意味着可以产生具有多接头的使用者友好的载体。

实施例2

2.1背景

如实施例1所述，为了研究高效表达必需的CPMC RNA-25’非翻译区(UTR)的必需特征，本发明人考察了在主起始位点上游5’前导序列中发现的两个AUG密码子的作用。发明人证明，删除主翻译起始位点(512)上游的一个合框的起始密码子(161)可导致外来蛋白质积累大量增加。

使用该系统，发明人显示，渗透后6天，包括一种全长IgG和一种自组装病毒样颗粒在内的若干无关蛋白质的表达分别占总可提取蛋白质的＞10％和20％。因此，该系统提供了一种用于高水平表达的理想媒介，其不依赖转录本的病毒复制。

这种新系统(以图1中的表达载体01[FSC-512]为例)被称作“CPMV-HT”，代表“超翻译豇豆花叶病毒属病毒蛋白表达系统”。

HT-CPMV系统显示蛋白质水平急剧增加，因此是一种在植物内快速高水平表达外来蛋白质的优良方法。

在过去25年，已经开发出了越来越多系列的双元载体用于植物转化(Hellens et al.，2000b；Veluthambi et al.，2003；Lee and Gelvin，2008)。迄今，这些发展的主要目的聚焦于提高稳定整合，例如通过扩展农杆菌的宿主范围(Hiei et al.，1994)，产生一系列允许对选择标记、表达盒和融合蛋白进行选择的载体(以pCAMBIA范围的开放源代码双元载体(open source binaryvector)为例；http://www.cambia.org/daisy/bioforge legacy/3725.html)，或者通过开发用于将无关DNA整合最小化和无标记转化的系统(例如pCLEAN；Thole et al.，2007)。

人们也已对双元载体进行工程化改造使其以低拷贝数复制，以便降低同一转基因多次整合事件的频率，因为这会导致基因沉默(Johansen andCarrington，2001)。

然而，对于瞬时表达，并不严格需要保证高效整合到宿主核内和存在用于植体内选择(in planta selection)的标记。而且，在农杆菌渗透时，每个细胞都遇到大量T-DNA分子，这些分子被认为即使没有基因组整合也能够在核内转录(transcriptionally competent in the nucleus)(Janssen and Gardner，1989；Narasimhulu et al.，1996)。这提示，更高拷贝数的双元质粒可能有益于瞬时表达。

改良双元载体的另一个领域是降低载体骨架的大小。pPZP(Hajdukiewicz et al.，1994)和pGREEN(Helens et al.，2000a)这两个实例一直都在证明着较小质粒的好处。除了提高克隆程序和细菌转化的效率之外，这些载体还为那些依赖于单个T-DNA上存在的多个表达盒的表达系统提供了模板(Tzfira et al.，2005；Thole et al.，2007)。

本实施例公开了这种载体的非显而易见的改良，其允许在单个步骤内完成克隆，而不必将表达盒在克隆载体(例如pM81-FSC2)和表达载体(例如PBINPLUS)之间进行亚克隆，方便了该载体实际使用。更具体地，这里的结果显示，有可能大大降低pBINPLUS的大小，而不会损害其在复制和T-DNA转化方面的性能。而且，CPMV-HT系统的元件已经已模块化的方式合并到所得的载体内，使得多个蛋白质可以从单个T-DNA表达。通过这些改良获得了一种多功能的高水平表达载体，便于高效地直接克隆外来基因。

2.2材料和方法

pBD-FSC2-512-U 162C(HT)，含有被插入在pBINPLUS PacI/AscI位点内的FSC2-512-U162C盒(见实施例1)(van Engelen et al.，1995)。使用高保真聚合酶PHUSION(New England Biolabs)和编码用于再连接的独特限制酶位点的寡核苷酸(表4.1)扩增该质粒的基本节段(见下文)。T-DNA区的扩增使用与独特AhdI位点上游序列同源的有义引物(pBD-LB-F)和包含ApaI位点的反义引物(pBD-RB-ApaI-R)。使用含有ApaI位点的有义引物(pBD-ColEI-ApaI-F)和含有SpeI位点的反义引物(pBD-TrfA-SpeI-R)扩增出了一个包含ColEI复制起点、NPTIII基因和TrfA座位的区域。使用含有SpeI位点的有义引物(pBD-oriVSpeI-F)和含有AhdI位点的反义引物(pBD-oriV-AhdI-R)扩增了RK2复制起点(OriV)。纯化后，根据它们末端编码的独特限制位点对这些产物进行消化，并混合进行三点连接。这样就产生了质粒pEAQbeta，并通过测序确认其连接部位。检测到了T-DNA的大约1.2kb的一段缺失，其除去了CPMV-GFP-HT盒的nos终止子的一部分。因此，用引物pMini＞pMicroBIN-F2和pBD-RB-ApaI-R再扩增包含源自pBD-FSC2-GFP-HT的右边界的一部分终止子，并用引物pBD-ColEI-ApaI-F和pMini＞pMicroBIN-R(表4.1)再扩增pEAQbeta骨架，包括右边界。纯化的产物用ApaI和FseI消化，并连接产生pEAQ(图9)。

用35SP19-PacI-F和35SP19-AscIR，或35SP19-FseI-F和35S-P19-FseI-R作为引物(表4.1)从pBIN61-P19(Voinnet et al.，2003)扩增两侧为35S启动子和35S终止子的P19基因。用引物pBD-NPTII-FseI-F和pBD-NPTII-FseI-R(表4.1)从pBD-FSC2-GFPHT扩增两侧为nos启动子和终止子的NPTII基因。A加尾(A-tailing)后，将扩增的盒连接到pGEM-T easy(Promega)中。将用FseI从pGEM-T easy切出的P19盒连接到FseI消化的pEAQ-GFP-HT中，得到pEAQexpress-GFP-HT。将用FseI切出的NPTII盒以两个方向连接到FseI消化的pEAQ-GFP-HT中，得到pEAQselectK-GFP-HT和pEAQselectK(rev)-GFP-HT。又用PacI/AscI切离NPTII盒，并连接到pEAQselectK-GFP-HT的AsiSI/MluI位点内，给出pEAQspecialK-GFP-HT。通过QUICKCHANGE方法(Stratagene)对pGEM-T中的P19进行定点突变，用引物P19-R43W-F和P19-R43W-R将精氨酸43转变成色氨酸残基。用PacI/AscI消化以释放出突变体P19盒，并插入到pEAQselectK-GFP-HT的AsiSI/MluI位点内，得到pEAQspecialKm-GFP-HT。

将编码短多接头的有义和反义链的寡核苷酸(表4.1)退火，在5’端留下NruI位点的下游半段，在3’端留下与XhoI匹配的突出端(overhang)。退火的寡核苷酸与经NruI/XhoI消化的pM81-FSC2-A115G-U162C(见上文)连接，得到pM81-FSC2-POW。通过利用引物P19-ΔNruI-F和P19-ΔNruI-R定点突变(QUICKCHANGE；Stratagene)从pGEM-T中的P19盒中除去NruI位点，并重新插入到pEAQselectK-GFP-HT的AsiSI/MluI位点内，得到pEAQspecialKΔNruI-GFP-HT，其在表达上与pEAQspecialK-GFP-HT相比没有减少(数据未显示)。然后从pM81-FSC2-POW释放PacI/AscI片段，并插入到经同样消化的pEAQspecialKΔNruI-GFP-HT中，借此替代GFP HT表达盒，并产生pEAQ-HT。用一组4个引物(表4.1)以三种组合从pBD-FSC2-GFP-HT扩增GFP，用于插入到pEAQ-HT：GFP-AgeI-F和GFP-XhoI-R；GFP-AgeI-F和GFP-XmaI-R；以及GFP-XmaI-F和GFP-XhoI-R。纯化的PCR产物用其引物中设定的酶消化，并插入到适当消化的pEAQ-HT中，得到pEAQ-HT-GFP，pEAQ-HT-GFPHis，和pEAQ-HT-HisGFP。

表4.1.用于扩增和诱变的寡核苷酸。限制酶位点或其部分用小写字母显示，突变用粗体下划线标记。

2.3结果

2.3.1pBINPLUS含有至少7.4kb无关序列

从CPMV-HT的表达能够产生极高水平的重组蛋白质。尽管如此，还是期望进一步改进该系统以及其在瞬时转化方面的应用。

本改进的第一个方面与如下的事实有关，即小质粒在连接反应和细菌转化程序中比大质粒更有效。与较小的双元载体的结构进行比较表明，pBINPLUS很可能含有大量的无关序列。有4个pBINPLUS元件被确认是适当发挥双元载体功能至关重要的：T-DNA、RK2(OriV)广范围宿主复制起点、提供对卡那霉素抗性的NPTIII基因(Trieu-Cuot and Courvalin，1983)、和来自RK2的促进复制的TrfA(图9)。对其余骨架部分的生物信息学分析显示它们是pBIN19的构建中的人工产物，依赖亲本质粒内存在的合适的限制位点(Bevan，1984)。这些观点得到了pBIN19全测序报告的确证(Frisch et al.，1995)。pBINPLUS包括非必需的ColEI复制起点，用于在大肠杆菌内获得高拷贝数。在T-DNA内可以发现大约2.6kb的多余DNA。这包括用于植物转化的而非瞬时表达所需要的NPTII选择标记。总体上，pBINPLUS内无关序列的总量似乎超过7.2kb。

2.3.2pEAQ系列构建

为了监视载体修饰对表达的影响，我们选择从pBINPLUS来源的质粒pBD-FSC2-512-U162C(HT)开始。通过PCR从pBD-FSC2-GFP-HT扩增了三个区域，包括T-DNA、RK2(OriV)复制起点和一个含有ColEI起点、NPTIII和TrfA的节段。连接这三条片段产生质粒pEAQbeta(图9)，该质粒比其亲本质粒小4584bp。再一轮的pEAQbeta PCR扩增从T-DNA区除去了2639bp的非必需序列，并插入了三个独特的限制位点AsiSI、MluI和FseI。AsiSI/MluI消化与PacI/AscI片段的插入相兼容，因此对于从所有先前的CPMV克隆载体克隆多个表达盒极其有用。FseI提供了一个独特的8碱基识别位点，可用于交换不同的选择标记或沉默抑制子盒。所得的pEAQGFP-HT质粒比pBINPLUS尺寸的一半还要小，没有CPMVHT表达盒的话仅有5137bp，使它成为已知的最小的双元载体之一(图9)。对整个pEAQ质粒进行测序，发现RK2复制起点的方向与先前报告的相反(Frisch et al.，1995)，因此在pEAQ-GFP-HT中按正确的方向标示。

用pEAQ-GFP-HT作为起点，将各种额外的特征纳入T-DNA中(图10)。将来自pBINPLUS的NPTII盒沿着相对于GFP-HT的正反两个方向重新插入到pEAQ的FseI位点内，从而得到pEAQselectK-GFP-HT和pEAQselectK(rev)-GFP-HT。将35S-P19盒插入到FseI位点内，得到pEAQexpress-GFP-HT。最后，将35S-P19盒插入到pEAQselectK-GFP-HT的Mlu/AsiSI位点内，得到pEAQspecialK-GFP-HT。因此，构建了一系列用于容易并且快速瞬时表达的小双元载体。

2.3.3尺寸减小不损害从pEAQ的瞬时表达

pEAQ系列载体的农杆菌渗透显示，在瞬时测定中，尺寸的大幅减小对表达水平没有显著损害。pEAQ-GFP-HT，和pEAQselectK(rev)-GFP-HT与由pBIN61-P19提供的P19的共渗透得到的表达水平与pBD-FSC2-512-HT和P19的共渗透没有显著差异。这可以在对蛋白提取物中GFP的UV照射(图11A)、SDS-PAGE(图11B)和荧光光度(图11C)等测量中看出。有趣的是，T-DNA中NPTII盒的方向似乎影响表达水平。pEAQselectK显示出明显优于其它方面相同的pEAQselectK(rev)，后者导致GFP积累减少。

理论上，在pEAQ中整合针对沉默盒的抑制子不会影响其提高从相同T-DNA表达的外来基因的瞬时表达水平的能力。确实，pEAQexpress-GFP-HT的单独渗透也可产生与pBD-FSC2-GFP-HT相似或较之更好的表达水平(图7.3)。而且，为了测试pEAQexpress的效率，将农杆菌培养物稀释2倍，从而使最终的光密度(OD)与共渗透中的每个单个培养物相同。

与预期相同，这产生了相似的高表达水平，证明通过在相同T-DNA上同时整合目的基因和沉默抑制子可以使用一半量的农杆菌(图11)。因此，当所有的组分存在于同一T-DNA上时，CPMV-HT可用于表达高水平的外来蛋白质。

2.3.4突变体P19能够在瞬时测定中抑制转基因的沉默

为了利用NPTII盒在T-DNA内的正向取向提供的表达增加，将P19盒插入在pEAQselectK-GFP-HT AsiSI和MluI位点之间，得到pEAQspecialK-GFP-HT(图10)。P19与GFP序列存在于相同T-DNA上时，产生的表达水平与pEAQselectK-GFPHT和P19共渗透相似(图12)。这不仅仅是由pEAQexpress-GFP-HT产生的表达，而似乎是由于NPTII盒的存在(图12)。另一方面，pEAQexpress的表达较低可能是由于P19盒在T-DNA内的位置和取向不同造成的。尽管如此，和pEAQexpress一样，使用当两种培养物必须共渗透时所用的最终OD的一半的最终OD的农杆菌悬液，pEAQspecialK载体可以给出高水平表达。

外来基因表达盒与P19盒以及选择标记的组合使得检测转基因植物内CPMV-HT的性能成为可能。然而，沉默抑制子(如P19)的组成性表达会干扰与发育过程相关的内源基因沉默(Silhavy and Burgyán，2004)，因此可能造成严重的(severe)表型。最近表征的一种P19突变(R43W)被认为对内源基因的沉默活性较低，因此可能是用于抑制稳定转化体内转基因沉默的较好候选者(Scholthof，2007)。为了研究用CPMV-HT系统稳定转化的可行性，将wt和突变体P19插入到pEAQselectK-GFP-HT的T-DNA中，以瞬时测定这些变异体。如被渗透叶子的UV照射、蛋白提取物的SDS-PAGE和GFP水平的荧光光度测量所示，pEAQspecialKm中的突变体P19提高外来基因表达方面效力是pEAQspecialK中wt P19的大约一半(图12)。这是第一个关于P19中R43W突变对抑制转基因沉默能力的影响的研究。

实施例3

从单个质粒高水平表达IgG

为了利用pEAQ系列的模块性质，将含有人抗-HV IgG 2G12之ER滞留型重链(HE)和轻链(L)的CPMV-HT表达盒插入到pEAQexpress的PacI/AscI和AsiSI/MluI位点。为了确定插入位点是否会影响表达水平，将L和HE链插入到这两个位置，产生pEAQex-2G12HEL和pEAQex-2G12LHE(图13A)。用含有上述质粒的单个农杆菌培养物渗透本氏烟草，结果形成了完全组装的2G12抗体，其大小与通过混合分别表达单个组分L、HE和P19的三个农杆菌培养物所产生的2G12相同(图13C)。每个泳道内加载的蛋白质代表从90mg经渗透组织获得的提取物的1/30，或者说从1g组织可能能够获得的蛋白质的1/333。在考马斯染色的非还原SDS-PAGE凝胶上可见，从3菌株混合物产生的组装IgG的最大量相当于1μg CHO产生的2G12。这提示2G12的表达水平超过325mg/kg组织鲜重，这与SPR测得的浓度相符。pEAQex-2G12HEL的使用似乎可以超过这种已经属于高水平的抗体积累。

pEAQ来源载体的一个优点是能够将多链蛋白质，例如IgG，的每一个组分自动地投递到每一个被感染细胞。因此，与必须使用多个培养物的情况相比，可以在更高的农杆菌稀释度下保持高表达水平。为了检验在实践中是否如此，对最初重悬到OD 1.2并在需要时混合的培养物进行两个三倍系列稀释(图13B)。结果，在三培养物混合物中的每个单个培养物的最终OD为0.4、0.13和0.04。带有pEAQexpress构建体的单个培养物在OD 1.2，0.4和0.13下进行渗透。当使用三种单独的培养物时，组装成的2G12的水平随系列稀释显著降低。相反，pEAQex-2G12HEL和pEAQex-2G12LHE的2G12表达仍保持在恒定的高水平，随稀释的发生的任何降低都非常微弱(图13C-E)。对稀释的不敏感确证了将全部三个表达盒置于同一T-DNA上能提供更高的效率。有趣的是，当渗透物的OD从1.2降低到0.4时，从被渗透组织提取的蛋白总量几乎减半。这提示，在用较高OD的悬浮液渗透的组织的提取物的蛋白质中，有相当大一部分可能是应答于较高的农杆菌浓度而产生的农杆菌源蛋白质或植物蛋白质。

观察图13C可发现，表达盒在T-DNA内的相对位置会影响表达水平。pEAQex-2G12LHE的整体表达比pEAQex-2G12HEL略微降低。这个结果得到了非还原样品western印迹的证实：western印迹也显示降解产物和未整合的免疫球蛋白链的丰度存在一些差异(图13C-E)。用pEAQex-2G12LHE渗透的组织似乎缺乏大约70-80kDa的重链特异降解产物(图13D)。另外，似乎有少得多的HL2组装中间体，以及更多的游离轻链(图13E)。由于已知重链是在植物中组装2G12的限制因素(Markus Sack，pers.comm.，RWTH，Aachen，Germany)-所有样品中都没有可辨认的游离重链就证实了这一点-所以这些结果表明，pEAQex-2G12LHE产生的重链比pEAQex-2G12HEL更少。这可能是由于从更靠近T-DNA左边界的CPMV-HT盒的表达较少造成的。

在其它实验中(数据未显示)，CPMV-HT系统还被成功地用于在本氏烟草中瞬时性表达：

·蓝舌病毒(血清型10)VP2，VP3，VP5，VP7和NS1。

·轮状病毒NSP5。

·源自苜蓿(Medicago trunatula)的钙调蛋白(其随后被纯化)。

·人Fc gamma受体1(CD64)的难表达胞外域-其已被纯化，并且在抗体结合研究中证明有功能。

·共表达CPMV小(S)和大(L)衣壳蛋白，并且证明它们可组装成病毒样颗粒(数据未显示)。

实施例4

直接克隆到CPMV-HT表达载体内

尽管将系统的元件组合到单个质粒上，但是这里前文介绍的载体仍然需要两步克隆程序才能将待表达序列引入到双元质粒内。本实施例提供了一种可以向其中直接插入目的基因的双元质粒。该质粒含有多接头，其不仅允许直接插入到基于pEAQ的质粒内，如果期望的话，还允许融合C-或N-端组氨酸标签(pEAQ-HT；图14A)。首先将多接头作为退火寡核苷酸插入到pM81-FSC2-512(A115G)(U162C)内，得到pM81-FSC-POW。该构建体仍然可以进一步用于标准的两步克隆程序来产生表达多个多肽的基于pEAQ的构建体。而且，使用双突变的5’前导序列(leader)能够获得比使用单突变更高的表达水平。然后，通过PacI/AscI位点将CPMV-HT盒转移到pEAQspecialK中，得到pEAQ-HT。将GFP插入到pEAQ-HT多接头内的所有三个位置内，产生无标签的GFP，和5’(HisGFP)和3’(GFPHis)His标签融合物。

正如预期的那样，无标签GFP的表达水平甚至高于用pEAQspecialK-GFP-HT所得的水平，超过1.6g/kg FW组织(图14B)。这很可能是由于如下的事实，即pEAQ-HT的CPMV 5’前导序列含有除去AUG115的额外突变，在除去AUG 161的基础上进一步除去AUG 115时，可进一步增强表达。

通过western印迹检测到His标签的存在，证实了在由多接头编码的N-和C-端氨基酸残基处的正确融合。所有三种GFP变异体均可用抗-GFP抗体检测到，而用抗-His抗体则仅能检测到HisGFP和GFPHis(图14C)，His标签的存在降低了GFP条带在SDS-PAGE的迁移率，所降低的量符合预期。该标签还降低了通过荧光分析检测的GFP量(图14B)。这个效果对于N-端His标签而言更加显著。考马斯染色条带的强度提示，这代表了带标签的GFP积累的减少(图14C)，而不是对GFP的荧光性质的干扰。尽管如此，带His标签的蛋白质的水平仍然非常高，产生了超过0.6和1.0g/kg FW组织的GFP。

实施例2-4的讨论

为了提高使用的便利性和CPMV--HT表达系统的性能，我们生产了一系列模块化载体，用于简便迅速的植物表达。

从双元载体pBINPLUS除去了超过一半的质粒骨架，并除去了T-DNA区域中一部分对瞬时表达非必需的区域，产生了一种双元Ti质粒，它是已知最小双元Ti质粒之一，但其表达水平没有受损。

先前有人从pBIN19中除去相似的骨架部分，而未损失性能(Xiang et al.，1999)。然而，pBINPLUS比pBIN19(van Engelen et al.，1995)具有两个显著的改进：在大肠杆菌中具有更高的拷贝数，这是由于其具有额外的ColEI复制起点；重定向的T-DNA，其保证目的基因更远离左边界，因为左边界在植体内会遭受大量的删除(Rossi et al.，1996)。尽管pEAQ质粒更小的尺寸对其拷贝数没有明显的影响，但是在使用商用质粒提取试剂盒进行克隆步骤的过程中，它们可大大提高产率，因为这些试剂盒对低于10kb的质粒最有效(数据未显示)。

pEAQ双元载体的模块性质使得在需要的时候可以将任何沉默抑制子和/或标记基因与一个或两个CPMV-HT表达盒共表达，从而为CPMV-HT的表达添加了功能性(functionality)。例如，在pEAQexpress-GFP-HT的AsiSI/MluI位点内插入含有异源序列的第二HT表达盒，可允许利用GFP荧光跟踪表达。

而且，由于载体的灵活性(flexibility)，仅需要渗透单个农杆菌构建体，从而可简化用于瞬时表达的系统，而且，通过降低与T-DNA内存在的表达盒的数目成比例的渗透物的需要量，可以提高效率。由于P19占据FseI位点，存在两个克隆位点来接受来自克隆载体(例如pM81-FSC2-U162C)的HT表达盒，这也为更加高效地表达多亚单位蛋白质例如全长抗体提供了可能。

P19对提高转基因的表达水平的影响已得到充分阐明(Voinnet et al.，2003)。然而，本研究第一次显示了P19在担载于同一TDNA上共投递给每个细胞时的效力。先前的研究已经报道了从同一农杆菌内与含转基因的T-DNA不同的T-DNA中共投递P19(Hellens et al.，2005)。然而，P19直到渗透6天之后才发挥效果，提示T-DNA的转移效率低。本研究还证明了第一次使用R43W突变体P19可提高转基因的表达。发现该突变体提高GFP表达的效率是wt P19的大约一半，这与该突变体已知的活性降低是相符的，这种活性降低损害了TBSV的感染性(Chu et al.，2000)和蛋白质结合较小类型的(21-22nt)短干扰RNA的能力(Omarov et al.，2006)。然而，这种特征有可能使R32W突变体更适合于涉及稳定转化的应用。与发育相关的微小RNA(micro RNA)也属于较小尺寸类型(Vaucheret，2006；Zhang et al.，2006)，因此，突变体P19的存在对发育过程的影响可能不像其wt型那样严重(Scholthof，2007)。而且，突变体可以提供一种控制潜在细胞毒外来蛋白质的瞬时表达的手段。

用单个农杆菌培养物渗透的植物组织表达抗体的已报道的最高抗体产率是从单个质粒表达2G12。除了使用3种农杆菌培养物进行CPMV-HT表达之外，唯一使用其他系统获得了相似水平的方法涉及渗透6种分离的培养物和病毒载体方法(Giritch et al.，2006)。而且，使用单个质粒降低了确保共投递多个表达盒所需的细菌的量，其可以在工业生产水平上提供显著的成本节省。用更稀的培养物实施渗透过程在实际操作上也是更容易的(physically easier)，因为对叶片组织的细胞间空间的阻塞更少。此外，稀释到总OD值为0.4可降低由于渗透带来的蛋白质污染的量。在每种OD下对9次单独的渗透进行分析显示，当培养物的OD从1.2降低到0.4时，提取物蛋白质浓度从2.7±0.2mg/ml降低到1.5±0.1mg/ml。因为使用pEAQexpress在OD 0.4条件下课产生与三培养物系统在OD 1.2渗透时所产生的相同量的2G12，所以纯化重组目标蛋白所必须分离的污染蛋白的量仅相当于使用pEAQexpress时的一半。这为下游处理提供了非常有用的而且是出乎预料的优点。2G12从pEAQexpress的表达还显示了表达盒在pEAQ载体T-DNA内的位置对所得的表达水平的影响。来自pEAQex-2G12LHE的游离轻链积累的增加提示该构建体表达的重链较少，这似乎导致组装完的抗体更少。这可能是由于表达盒在T-DNA上的配置(arrangement)造成的。或者，一部分T-DNA的左边界容易遭受核酸降解(susceptible to nucleolyticdegradation)(Rossi et al.，1996)。将NPTII表达盒重新插入在T-DNA内似乎对表达有显著影响，这依赖于其取向。在克隆操作过程中可发现，pEAQselectK-GFP-HT在大肠杆菌内达到的质粒拷贝数大约是pEAQselectK(rev)-GFP-HT的1.5倍(这是通过用QIAprep试剂盒，QIAGEN测量三种分离的质粒制备物的产量确定的)。这与观察到的两个载体之间的表达水平的差异关系不紧密。并不知道是什么导致拷贝数增加，也确实不知道当质粒被转移到农杆菌时，该差异是否也存在。然而，这些观察结果提示，质粒拷贝数对高效的农杆菌介导的瞬时表达可能是重要的。在这个问题上，使用RK2起点(图9中的oriV)的pBIN19及其衍生物成为了瞬时表达的良好选择，因为RK2质粒已知可以在农杆菌中积累到7-10个拷贝(Veluthambi et al.，1987)。这与pPZP使用的pVS1起点相似，比由存在于广泛使用的pGREEN双元载体中(Helens et al.，2000)的pSa起点产生的高大约2-5倍(Lee and Gelvin，2008)。含有复制起点、可产生更高拷贝数的质粒，如基于pRi的质粒(Lee and Gelvin，2008)，可能更加适合于瞬时表达。

为了使以往基本没有从事基于CPMV的表达或者普通基于植物的表达的经验的实验室能够更容易地掌握pEAQ载体高水平表达，我们创造了一种直接克隆型pEAQ。这是通过将多接头插入到位于T-DNA上的CPMVHT表达盒的5’前导序列和3’UTR之间而实现的，其中所述T-DNA还含有P19和NPTII盒。包含NPTII盒是因为它的存在似乎可显著提高表达(见上文)。多接头还编码两组6x组氨酸残基，其允许融合N-或C-端His标签以便于蛋白质提纯。所得的构建体还受益于5’前导序列中的第二突变，该突变可提高相对于HT的表达。

这些增强的表达盒还可以从克隆载体pM81-FSC-POW亚克隆到任何pEAQ质粒中。使用pEAQHT的GFP表达比仅含有单个突变(U162C)的pEAQspecialK的GFP表达更高。而且，多接头设计还允许用一步克隆程序表达带His标签的变体。本文提供的模块化双元载体被特别地设计用于，但不仅限于，CPMV-HT表达。将极高的表达水平与克隆效率的提高和使用的便利结合了起来。该系统提供了用于在植物内瞬时表达有价值(value-added)蛋白质的最有效并且直接的方法，而不会有病毒扩增的问题。它允许任何有植物生长设施的分子生物学实验室在序列鉴定的2周内产生毫克量的重组蛋白质。因此，可以预期，它将在学术和工业界中提供一种极其有价值的工具。

实施例5

用pEAQ质粒稳定整合和转基因植物

尽管pEAQ载体系列是考虑到瞬时表达而设计的，但将NTPII盒重新插入到T-DNA内提供了用于基因组整合的选择标记。这可能允许这些较小并且更有用的双元载体用于稳定的植物和植物细胞培养物转化。当用于转化本氏烟草叶盘时，在T-DNA内含有NPTII盒的pEAQ载体能够在选择条件下诱导愈伤形成，其效率与基于pBINPLUS构建体相同。而且，在紫外光下，这些组织中可以检测到GFP表达(数据未显示)。这证明源自pEAQ载体的多盒(multi-cassette)T-DNA分子可稳定整合到植物基因组中，并驱动外来基因的表达。

还再生了发荧光植物。初级转化体(T₀)的叶子在uv光下有荧光，表明有高水平的GFP表达。来自自交(self-fertilized)T₀植物的种子有活力，并且得到的带有转基因的T₁苗也有荧光(结果未显示)。

实施例6

使用具有杆状病毒载体的基于CPMV的HT系统

图15显示了一种构建体，其适用于在昆虫细胞中使用基于CPMV的HT系统和杆状病毒载体。在p10启动子的控制下，HyperTrans CPMV RNA-2UTR也提高了GFP在昆虫细胞中使用杆状病毒表达载体的表达。通过流式细胞术测量，与没有CPMV-HT盒的构建体相比，在杆状病毒感染的sf21细胞中荧光水平提高了大约5倍。

参考文献

Alamillo，J.M.，Monger，W.，Sola，I.，García，B.，Perrin，Y.，Bestagno，M.，Burrone，O.R.，Plana-Duran，J.，Enjuanes，L.，Lomonossoff，P.G.and García，J.A.(2006)Use of virus vectors for the expression in plants of active full-length andsingle chain anticoronavirus antibodies.Biotechnol.J.1，1103-1111.

Brigneti，G.，Voinnet，O.，Li，W.X.，Ji，L.H.，Ding，S.W and Baulcombe，D.C.(1998)Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing inNicotiana benthamiana EMBO Journal 17：6739-6746

M.C.，Liu，L.，Perrin，Y.，Tsakiris，E.and Lomonossoff，G.P.(2006).A bipartite system for the constitutive and inducible expression of highlevels of foreign proteins in plants.Plant Biotechnol.J.4，183-193.

Gopinath，K.，Wellink，J.，Porta，C.，Taylor，K.M.，Lomonossoff，G.P.andvan Kammen，A.(2000)Engineering cowpea mosaic virus RNA-2into avector to express heterologous proteins in plants.Virology 267：159-173.

Holness，C.L.，Lomonossoff，G.P.，Evans，D.and Maule，A.J.(1989).Identification of the initiation codons for translation of cowpea mosaic virusmiddle component RNA using site directed mutagenesis of an infectious cDNAclone.Virology 172，311320.

Liu，L.and Lomonossoff，G.P.(2002)Agroinfection as a rapid method forpropagating Cowpea mosaic virus-based constructs.J.Virol.Methods 105，343-348.

Liu，L.and Lomonossoff，G.P.(2006)A site-directed mutagenesis methodutilising large double-stranded DNA templates for the simultaneous introductionof multiple changes and sequential multiple rounds of mutation：Application tothe study of whole viral genomes.J.Virol.Methods 137，63-71.

Liu，L.，Canizares，M.C.，Monger，W.，Perrin，Y.，Tsakiris，E.，Porta，C.，Shariat，N.，Nicholson，L.and Lomonossoff，G.P.(2005).Cowpea mosaicvirus-based systems for the production of antigens and antibodies in plants.Vaccine 23，1788-1792.

Lomonossoff，G.P.& Shanks，M.(1983).The nucleotide sequence ofcowpea mosaic virus B RNA.EMBO Journal 2，2253-2258.

Mechtcheriakova，I.A.，Eldarov，M.A.，Nicholson，L.，Shanks，M.，Skryabin，K.G.and Lomonossoff，G.P.(2006)The use of viral vectors to produce hepatitisB virus core particles in plants.J.Virol.Methods 131，10-15.

Monger，W.，Alamillo，J.M.，Sola，I.，Perrin，Y.，Bestagno，M.，Burrone，O.R.，Sabella，P.，Plana-Duran，J.，Enjuanes，L.，Garcia，J.A.and Lomonossoff，G.P.(2006)An antibody derivative expressed from viral vectors passivelyimmunizes pigs against transmissible gastroenteritis virus infection whensupplied orally in crude plant extracts.Plant Biotechnol.J.4，623-631.

Rohll，J.B.，Holness，C.L.，Lomonossoff，G.P.and Maule，A.J.(1993).3′terminal nucleotide sequences important for the accumulation of cowpea mosaicvirus M-RNA.Virology 193，672-679.

Sainsbury，F.，Lavoie，P-O.，D’Aoust，M-A.，Vezina，L-P.and Lomonossoff，G.P.(2008).Expression of Multiple Proteins Using Full-Length and DeletedVersions of Cowpea Mosaic Virus RNA-2.Plant Biotechnology Journal，6：82-92.

Sainsbury，F.，

M.C.and Lomonossoff，G.P.(2007)Cowpeamosaic virus-based expression vectors.In：Virus Expression Vectors(Hefferon，K.ed)，pp.339-555.Kerala，India：Transworld Research Network.

Sainsbury，F.and Lomonossoff，G.P.(2008).Extremely high-level and rapidtransient protein production in plants without the use of viral replication.PlantPhysiology 148，1212-1218.

Sainsbury，F.，Liu，L.and Lomonossoff G.P.(2009)Cowpea mosaicvirus-based expression of antigens and antibodies in plants.In：Methods inMolecular Biology Vol.483：Recombinant Pharmaceutical Proteins from Plants(Faye，L.and Gomord，V.eds)，pp25-39，NY：Humana Press.

van Bokhoven，H.，Le Gall，O，Kasteel，D.，Verver，J.，Wellink，J.andvan Kammen，A.(1993).Cis-and Trans-acting Elements in Cowpea MosaicVirus RNA Replication.Virology 195，377-386.

Wellink J，Verver J，van Kammen A.(1993).Mutational analysis of AUGcodons of cowpea mosaic virus M RNA.Biochimie.75(8)：741-7.

附加参考文献：

Lee LY，Gelvin SB(2008)T-DNA binary vectors and systems.PlantPhysiology 146：325-332

Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The small，versatile pPZP familyof Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant MolecularBiology 25：989-994

Hellens R，Mullineaux P，Klee H(2000b)A guide to Agrobacterium binaryTi vectors.Trends in Plant Science 5：446-451

Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T(1994)Efficient transformation ofrice(Oryza-sativa L)mediated by Agrobacterium and sequence-analysis of theboundaries of the T-DNA.Plant Journal 6：271-282

Veluthambi K，Jayaswal RK，Gelvin SB(1987)Virulence genes-a，gene-G，and gene-D mediate the double-stranded border cleavage of T-DNA from theAgrobacterium Ti plasmid.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 84：1881-1885

Thole V，Worland B，Snape JW，Vain P(2007)The pCLEAN dual binaryvector system for Agrobacterium-Mediated plant transformation.PlantPhysiology 145：1211-1219

Johansen LK，Carrington JC(2001)Silencing on the spot.Induction andsuppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transientexpression system.Plant Physiology 126：930-938

Janssen BJ，Gardner RC(1989)Localized transient expression of Gus inleaf-disks following cocultivation with Agrobacterium.Plant Molecular Biology14：61-72

Narasimhulu SB，Deng X，Sarria R，Gelvin SB(1996)Early transcription ofAgrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize.Plant Cell 8：873-886

Hellens RP，Edwards EA，Leyland NR，Bean S，Mullineaux PM(2000a)pGreen：a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediatedplant transformation.Plant Molecular Biology 42：819-832

Tzfira T，Tian GW，Lacroix B，Vyas S，Li JX，Leitner-Dagan Y，KrichevskyA，Taylor T，Vainstein A，Citovsky V(2005)pSAT vectors：a modular series ofplasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes inplants.Plant Molecular Biology 57：503-516

Voinnet O，Rivas S，Mestre P，Baulcombe D(2003)An enhanced transientexpression system in plants based on suppression of gene silencing by the p 19protein of tomato bushy stunt virus.Plant Journal 33：949-956

Frisch DA，Harrishaller LW，Yokubaitis NT，Thomas TL，Hardin SH，HallTC(1995)Complete sequence of the binary vector BIN-19.Plant MolecularBiology 27：405-409

Trieu-cuot P，Courvalin P(1983)Nucleotide-sequence of theStreptococcus-faecalis plasmid gene encoding the 3′5″-Aminoglycosidephosphotransferase type-III.Gene 23：331-341

Bevan M(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Research 12：8711-8721

Silhavy D，Burgyan J(2004)Effects and side-effects of viral RNA silencingsuppressors on short RNAs.Trends in Plant Science 9：76-83

Scholthof HB(2007)Heterologous expression of viral RNA interferencesuppressors：RISC management.Plant Physiology 145：1110-1117

van Engelen FA，Molthoff JW，Conner AJ，Nap JP，Pereira A，Stiekema WJ(1995)pBINPLUS-an improved plant transformation vector based on pBIN19.Transgenic Research 4：288-290

Rossi L，Hohn B，Tinland B(1996)Integration of complete transferredDNA units is dependent on the activity of virulence E2protein of Agrobacteriumtumefaciens.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 93：126-130

Xiang CB，Han P，Lutziger I，Wang K，Oliver DJ(1999)A mini binaryvector series for plant transforrmation.Plant Molecular Biology 40：711-717

Hellens RP，Allan AC，Friel EN，Bolitho K，Grafton K，Templeton MD，Karunairetnam S，Gleave AP，Laing WA(2005)Transient expression vectors forfunctional genomics，quantification of promoter activity and RNA silencing inplants.Plant Methods 1：13

Chu M，Desvoyes B，Turina M，Noad R，Scholthof HB(2000)Geneticdissection of tomato bushy stunt virus p19-protein-mediated host-dependentsymptom induction and systemic invasion.Virology 266：79-87

Omarov R，Sparks K，Smith L，Zindovic J，Scholthof HB(2006)Biologicalrelevance of a stable biochemical interaction between the tombusvirus-encodedP19and short interfering RNAs.Journal of Virology 80：3000-3008

Vaucheret H(2006)Post-transcriptional small RNA pathways in plants：mechanisms and regulations.Genes & Development 20：759-771

Zhang BH，Pan XP，Cobb GP，Anderson TA(2006)Plant microRNA：Asmall regulatory molecule with big impact.Developmental Biology 289：3-16

Giritch A，Marillonnet S，Engler C，van Eldik G，Botterman J，Klimyuk V，Gleba Y(2006)Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plantscoinfected with noncompeting viral vectors.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States ofAmerica 103：14701-14706

表1

完整CPMV RNA-2基因组节段

(核苷酸1-3481)

CPMV RNA-2基因组节段的第115，161，512和524位的起始密码子用粗体和下划线显示。

表2

pM81-FSC-2克隆的5’区的诱变中使用的寡核苷酸

pM81-FSC-2克隆5’区域的诱变中时使用的寡核苷酸的突变核苷酸用粗体显示。

表3

pM81-FSC-1和pM81-FSC-2载体的序列与源自表1的CPMV wt序列之间的核苷酸差异用大写字母显示。

                              pM81-FSC-1的核苷酸序列

座位    pM81-FSC1                   7732bp    DNA     环状        10-OCT-2007

特征             位置/限定词

    5′UTR       342..501

                 /vntifkey＝″52″

                 /label＝CPMV\RNA2\5′UTR

    promoter     27..341

                 /vntifkey＝″29″

                 /label＝CaMV\35S\promoter

    terminator   4669..4921

                 /vntifkey＝″43″

                 /label＝Nos\Terminator

    mat_peptide  3712..4422

                 /vntifkey＝″84″

                 /label＝GFP

    3′UTR       4432..4615

                 /vntifkey＝″50″

                 /label＝CPMV\RNA2\3′UTR

    CDS          complement(5944..6804)

                 /vntifkey＝″4″

                 /label＝AmpR

    misc_feature complement(7391..7546)

                 /vntifkey＝″21″

                 /label＝lacZ_a

    promoter     complement(6846..6874)

                 /vntifkey＝″30″

                 /label＝AmpR\promoter

    rep_origin   complement(7067..7373)

                 /vntifkey＝″33″

                 /label＝f1_origin

    rep_origin   complement(5170..5789)

                /vntifkey＝″33″

                /label＝pBR322_origin

mat_peptide     502..1878

                /vntifkey＝″84″

                /label＝CPMV\Movement\Protein

mat_peptide     1879..2999

                /vntifkey＝″84″

                /label＝CPMV\Lg.\Coat\Protein

mat_peptide     3000..3638

                /vntifkey＝″84″

                /label＝CPMV\Sm.\Coat\Protein

碱基数    2105a    1682c    1770g    2175t

来源

   1  ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct

  61  gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg

 121  ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc

 181  cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg

 241  attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag

 301  acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt

 361  tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc

 421  tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcatgag cgatcttcaa cgttgtcaga

 481  tcgtgcttcg gcaccagtac aatgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg

 541  tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt

 601  cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat

 661  tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg

 721  tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa

 781  acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg

 841  cccaaatttg tcatgaaaag cattatgagc cgtggtattc cttcaggaat tttggaggaa

 901  aaagctattc agttcaaacg tgccaaagaa gggaataaac ccttgaagga tgagattccc

 961  aagcctgagg atatgtatgt gtctcacact tctaaatgga atgtgctcag aaaaatgagc

1021  caaaagactg tggatctttc caaagcagct gctgggatgg gattcatcaa taagcatatg

1081  cttacgggca acatcttggc acaaccaaca acagtcttgg atattcccgt cacaaaggat

1141  aaaacacttg cgatggccag tgattttatt cgtaaggaga atctcaagac ttctgccatt

1201  cacattggag caattgagat tattatccag agctttgctt cccctgaaag tgatttgatg

1261  ggaggctttt tgcttgtgga ttctttacac actgatacag ctaatgctat tcgtagcatt

1321  tttgttgctc caatgcgggg aggaagacca gtcagagtgg tgaccttccc aaatacactg

1381  gcacctgtat tatgtgatct gaacaataga ttcaagctca tttgctcatt gccaaactgt

1441  gatattgtcc agggtagcca agtagcagaa gtgagtgtaa atgttgcagg atgtgctact

1501  tccatagaga aatctcacac cccttcccaa ttgtatacag aggaatttga aaaggagggt

1561  gctgttgttg tagaatactt aggcagacag acctattgtg ctcagcctag caatttaccc

1621  acagaagaaa aacttcggtc ccttaagttt gactttcatg ttgaacaacc aagtgtcctg

1681  aagttatcca attcctgcaa tgcgcacttt gtcaagggaa aaagtttgaa atactctatt

1741  tctggcaaag aagcagaaaa ccatgcagtt catgctactg tggtctctcg agaaggggct

1801  tctgcggcac ccaagcaata tgatcctatt ttgggacggg tgctggatcc acgaaatggg

1861  aatgtggctt ttccacaaat ggagcaaaac ttgtttgccc tttctttgga tgatacaagc

1921  tcagttcgtg gttctttgct tgacacaaaa ttcgcacaaa ctcgagtttt gttgtccaag

1981  gctatggctg gtggtgatgt gttattggat gagtatctct atgatgtggt caatggacaa

2041  gattttagag ctactgtcgc ttttttgcgc acccatgtta taacaggcaa aataaaggtg

2101  acagctacca ccaacatttc tgacaactcg ggttgttgtt tgatgttggc cataaatagt

2161  ggtgtgaggg gtaagtatag tactgatgtt tatactatct gctctcaaga ctccatgacg

2221  tggaacccag ggtgcaaaaa gaacttctcg ttcacattta atccaaaccc ttgtggggat

2281  tcttggtctg ctgagatgat aagtcgaagc agagttagga tgacagttat ttgtgtttcg

2341  ggatggacct tatctcctac cacagatgtg attgccaagc tagactggtc aattgtcaat

2401  gagaaatgtg agcccaccat ttaccacttg gctgattgtc agaattggtt accccttaat

2461  cgttggatgg gaaaattgac ttttccccag ggtgtgacaa gtgaggttcg aaggatgcct

2521  ctttctatag gaggcggtgc tggtgcgact caagctttct tggccaatat gcccaattca

2581  tggatatcaa tgtggagata ttttagaggt gaacttcact ttgaagttac taaaatgagc

2641  tctccatata ttaaagccac tgttacattt ctcatagctt ttggtaatct tagtgatgcc

2701  tttggttttt atgagagttt tcctcataga attgttcaat ttgctgaggt tgaggaaaaa

2761  tgtactttgg ttttctccca acaagagttt gtcactgctt ggtcaacaca agtaaacccc

2821  agaaccacac ttgaagcaga tggttgtccc tacctatatg caattattca tgatagtaca

2881  acaggtacaa tctccggaga ttttatcttg gggtcaagct tgttggcatt aaggattttt

2941  gtggtatagg ttctaatccg ggtattgatg gttcccgctt gcttggagct atagcacaag

3001  gacctgtttg tgctgaagcc tcagatgtgt atagcccatg tatgatagct agcactcctc

3061  ctgctccatt ttcagacgtc acagcagtaa acttttgact taatcaacgg caaaataact

3121  cctgttggtg atgacaattg gaatacgcac atttataatc ctccaattat gaatgtcttg

3181  cgtactgctg cttggaaatc tggaactatt catgttcaac ttaatgttag gggtgctggt

3241  gtcaaaagag cagattggga tggtcaagtc tttgtttacc tgcgccagtc catgaaccct

3301  gaaagttatg atgcgcggac atttgtgatc tcacaacctg gttctgccat gttgaacttc

3361  tcttttgata tcatagggcc gaatagcgga tttgaatttg ccgaaagccc atgggccaat

3421  cagaccacct ggtatcttga atgtgttgct accaatccca gacaaataca gcaatttgag

3481  gtcaacatgc gcttcgatcc taatttcagg gttgccggca atatcctgat gcccccattt

3541  ccactgtcaa cggaaactcc accgttatta aagtttaggt ttcgggatat tgaacgctcc

3601  aagcgtagtg ttatggttgg acacactgct actgctgcag cgcctgcaaa acagctctta

3661  aactttgacc tacttaagtt agcaggtgac gttgagtcca accctgggcc cagtaaagga

3721  gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga tgttaatggg

3781  cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa catacggaaa acttaccctt

3841  aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccatggc caacacttgt cactactttc

3901  tcttatggtg ttcaatgctt ttcaagatac ccagatcata tgaaacggca tgactttttc

3961  aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag gaaagaacta tatttttcaa ggatgacggg

4021  aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt gaaggtgata cccttgttaa tagaatcgag

4081  ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga aacattcttg gacacaaatt ggaatacaac

4141  tataactcac acaatgtata catcatggca gacaaacaaa agaatggaat caaagttaac

4201  ttcaaaatta gacacaacat tgaagatgga agcgttcaac tagcagacca ttatcaacaa

4261  aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca accattacct gtccacacaa

4321  tctgcccttt cgaaagatcc caacgaaaag agagaccaca tggtccttct tgagtttgta

4381  acagctgctg ggattacaca tggcatggat gaactataca aataaaggcc tttaactctg

4441  gtttcattaa attttcttta gtttgaattt actgttattc ggtgtgcatt tctatgtttg

4501  gtgagcggtt ttctgtgctc agagtgtgtt tattttatgt aatttaattt ctttgtgagc

4561  tcctgtttag caggtcgtcc cttcagcaag gacacaaaaa gattttaatt ttattaaaaa

4621  aaaaaaaaaa aaagaccggg aattcgatat caagcttatc gacctgcaga tcgttcaaac

4681  atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata

4741  taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt

4801  atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac

4861  aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat

4921  ctctagagtc tcaagcttgg cgcgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag

4981  aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt

5041  cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga

5101  atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg

5161  taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa

5221  aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt

5281  tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct

5341  gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct

5401  cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc

5461  cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt

5521  atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc

5581  tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat

5641  ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa

5701  acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa

5761  aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga

5821  aaactcacgt taagggattt tggttatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct

5881  tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga

5941  cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc

6001  catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg

6061  ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat

6121  aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat

6181  ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg

6241  caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc

6301  attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa

6361  agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc

6421  actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt

6481  ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag

6541  ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt

6601  gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag

6661  atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac

6721  cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc

6781  gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca

6841  gggttattgt cttatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg

6901  ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctaaattg taagcgttaa tattttgtta

6961  aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc

7021  aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg

7081  aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat

7141  cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc

7201  cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag

7261  ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg

7321  gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta

7381  cagggcgcgt cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg

7441  gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg

7501  gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga gtactttggc

7561  gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa

7621  catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac

7681  attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctggcgc gc

//

                             pM81-FSC-2的核苷酸序列

座位      pM81-FSC2                   4173bp     DNA    环状         10-OCT-2007

特征                位置/限定词

     rep_origin     complement(1271..1890)

                    /vntifkey＝″33″

                    /label＝pBR322_origin

     rep_origin     complement(3168..3474)

                    /vntifkey＝″33″

                    /label＝f1_origin

     promoter       complement(2947..2975)

                    /vntifkey＝″30″

                    /label＝AmpR\promoter

     misc_feature   complement(3492..3647)

                    /vntifkey＝″21″

                    /label＝lacZ_a

     CDS            complement(2045..2905)

                    /vntifkey＝″4″

                    /label＝AmpR

     3′UTR         533..716

                    /vntifkey＝″50″

                    /label＝CPMV\RNA2\3′UTR

     terminator     770..1022

                    /vntifkey＝″43″

                    /label＝Nos\Terminator

     promoter       3859..4173

                    /vntifkey＝″29″

                    /label＝CaMV\35S\promoter

     5′UTR         1..160

                    /vntifkey＝″52″

                    /label＝CPMV\RNA2\5′UTR

     misc_feature   507..532

                 /vntifkey＝″21″

                 /label＝FSC-2\MCS

碱基数    1090a    969c    982g    1132t

来源

   1  tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc

  61  ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcatgagc

 121  gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca atgttttctt tcactgaagc

 181  gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc

 241  ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc

 301  atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt

 361  gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa

 421  atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt

 481  taagcttctg tatattctgc ccaaattcgc gacgatcgta ctctcgaggc ctttaactct

 541  ggtttcatta aattttcttt agtttgaatt tactgttatt cggtgtgcat ttctatgttt

 601  ggtgagcggt tttctgtgct cagagtgtgt ttattttatg taatttaatt tctttgtgag

 661  ctcctgttta gcaggtcgtc ccttcagcaa ggacacaaaa agattttaat tttattaaaa

 721  aaaaaaaaaa aaaagaccgg gaattcgata tcaagcttat cgacctgcag atcgttcaaa

 781  catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat

 841  ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt

 901  tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa

 961  caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga

1021  tctctagagt ctcaagcttg gcgcgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga

1081  gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg

1141  tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag

1201  aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc

1261  gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca

1321  aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt

1381  ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc

1441  tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc

1501  tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc

1561  ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact

1621  tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg

1681  ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta

1741  tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca

1801  aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa

1861  aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg

1921  aaaactcacg ttaagggatt ttggttatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc

1981  ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg

2041  acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat

2101  ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg

2161  gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa

2221  taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca

2281  tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc

2341  gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt

2401  cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa

2461  aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat

2521  cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct

2581  tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga

2641  gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag

2701  tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga

2761  gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca

2821  ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg

2881  cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc

2941  agggttattg tcttatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag

3001  gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt

3061  aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg

3121  caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg

3181  gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta

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3301  ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa

3361  gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct

3421  ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct

3481  acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg

3541  ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg

3601  ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg agtactttgg

3661  cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca

3721  acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca

3781  cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctggcc gcttaattaa

3841  gaattcgagc tccaccgcgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt

3901  attgagaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga

3961  aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg

4021  aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt

4081  gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc

4141  tctatataag gaagttcatt tcatttggag agg

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Claims (20)

1.一种基因表达构建体，其包括 

(a)源自豇豆花叶病毒科(Comoviridae)二分体RNA病毒RNA-2基因组节段的表达增强子序列，其中所述RNA-2基因组节段中的起始位点已突变， 

其中所述豇豆花叶病毒科病毒的RNA2基因组节段通过位于相同的三联阅读框内的两个不同的翻译起始位点编码两种共羧基端蛋白质， 

其中该突变的起始位点是这两个起始位点之中的第一个，并且对应于野生型豌豆花叶病毒RNA-2节段中第161位处的起始位点， 

其中所述表达增强子序列包括所述豇豆花叶科病毒科病毒RNA-2基因组节段的至少100个核苷酸的区域，该区域包括所述突变的起始位点；和 

(b)用于辅助将编码目的蛋白的基因插入到基因表达系统的异源序列，其中该异源序列位于增强子序列中突变的起始位点的下游；和任选地 

(c)3’UTR； 

其中所述二分体RNA病毒是豇豆花叶病毒属病毒。 

2.一种基因表达系统，其包括根据权利要求1的表达构建体。 

3.一种基因表达系统，包括 

(a)源自豇豆花叶病毒科二分体RNA病毒RNA-2基因组节段的表达增强子序列，其中所述RNA-2基因组节段中的起始位点已突变， 

其中所述豇豆花叶病毒科病毒的RNA2基因组节段通过位于相同的三联阅读框内的两个不同的翻译起始位点编码两种共羧基端蛋白质， 

其中该突变的起始位点是这两个起始位点之中的第一个，并且对应于野生型豌豆花叶病毒RNA-2节段中第161位处的起始位点， 

其中所述表达增强子序列包括所述豇豆花叶病毒病毒科RNA-2基因组节段的至少100个核苷酸的区域，该区域包括所述突变的起始位点；和 

b)编码目的蛋白的异源基因，其中该编码目的蛋白的基因位于所述增强子序列的下游，其中所述编码目的蛋白的基因与启动子和终止子序列可操作地连接， 

其中所述二分体RNA病毒是豇豆花叶病毒属病毒。 

4.根据权利要求2-3任一项的基因表达系统，其包括或进一步包括3'UTR，所述3'UTR任选地源自相同的二分体RNA病毒。 

5.根据权利要求4的基因表达系统，其中所述豇豆花叶病毒属病毒是豇豆花叶病毒。 

6.根据权利要求2-5中任一项的基因表达系统，其中所述增强子序列由包含所述突变的起始位点的豇豆花叶病毒属病毒RNA-2基因组节段序列的至少核苷酸10-512，20-512，30-512，40-512，50-512，100-512，150-512，1-514，10-514，20-514，30-514，40-514，50-514，100-514，150-514，1-511，10-511，20-511，30-511，40-511，50-511，100-511，150-511，1-509，10-509，20-509，30-509，40-509，50-509，100-509，150-509，1-507，10-507，20-507，30-507，40-507，50-507，100-507，或150-507组成。 

7.根据权利要求6的基因表达系统，其中所述增强子序列由表1中所示的豇豆花叶病毒RNA-2基因组节段序列的核苷酸10-512，20-512，30-512，40-512，50-512，100-512，150-512，1-514，10-514，20-514，30-514，40-514，50-514，100-514，150-514，1-511，10-511，20-511，30-511，40-511，50-511，100-511，150-511，1-509，10-509，20-509，30-509，40-509，50-509，100-509，150-509，1-507，10-507，20-507，30-507，40-507，50-507，100-507，或150-507组成，其中野生型豇豆花叶病毒RNA-2基因组节段中第161位的起始位点已突变。 

8.一种基因表达系统，其包括： 

(a)启动子； 

(b)位于所述启动子下游的如下所示的豇豆花叶病毒RNA-2基因组节段序列的核苷酸1-507，其中AUG已突变： 

(c)位于(b)中定义的序列下游的编码目的蛋白质的基因； 

(d)位于所述编码目的蛋白质的基因下游的如下所示的豇豆花叶病毒RNA-2基因组节段序列的核苷酸3302-3481： 

t；和 

(e)位于(d)中定义的序列下游的胭脂氨酸合酶终止子。 

9.如权利要求7要求保护的基因表达系统，其中所述二分体RNA病毒是豇豆花叶病毒，且第115位的AUG也被突变。 

10.一种用于提高源自豇豆花叶病毒科二分体RNA病毒RNA-2基因组节段的序列的表达或其翻译增强活性的方法，包括突变其中的起始位点， 

其中所述豇豆花叶病毒科病毒的RNA2基因组节段通过位于相同的三联阅读框内的两个不同的翻译起始位点编码两种共羧基端蛋白质， 

其中该突变的起始位点是这两个起始位点之中的第一个，并且对应于野生型豇豆花叶病毒RNA-2节段中第161位处的起始位点， 

其中所述突变增强所述序列所连接的异源ORF的表达，其中所述二分体RNA病毒是豇豆花叶病毒属病毒， 

其中所述突变是通过 

(i)所述起始位点中的点突变，或 

(ii)包含所述起始位点的长度最多50个核苷酸的删除 

而进行的。 

11.根据权利要求10的方法，其中所述豇豆花叶病毒属病毒是豇豆花叶病毒。 

12.一种用于在宿主生物体内表达目的蛋白的方法，其使用根据权利要求2-8任一项的基因表达系统，其中该宿主生物体是真核宿主，所述真核宿主是植物或昆虫。 

13.一种增强从与源自豇豆花叶病毒科二分体病毒RNA-2基因组节段的序列可操作地连接的编码异源蛋白的可读框或基因翻译该异源蛋白的方法， 

其中所述豇豆花叶病毒科病毒的RNA2基因组节段通过位于相同的三联阅读框内的两个不同的翻译起始位点编码两种共羧基端蛋白质， 

包括突变该源自RNA-2的序列内的所述两个起始位点中的第一个，其中该突变起始位点对应于野生型豇豆花叶病毒RNA-2节段中第161位处的起始位点，其中所述二分体RNA病毒是豇豆花叶病毒属病毒， 

其中所述突变是通过 

(i)所述起始位点中的点突变，或 

(ii)包含所述起始位点的长度最多50个核苷酸的删除 

而进行的， 

其中所述突变增强所述序列所连接的异源可读框的表达。 

14.如权利要求1-9中任一项所述的基因表达系统，还编码与启动子和终止子序列可操作地连接的异源基因沉默抑制子。 

15.一种基因表达系统，其包括： 

(a)第一基因构建体，该构建体包括源自经截短的豇豆花叶病毒科二分体病毒基因组RNA-2的序列，其携带至少一个与启动子或终止子序列可操作地连接的编码目的异源蛋白的外来基因，其中该基因构建体包括位于外来基因上游的突变的起始位点， 

其中所述豇豆花叶病毒科病毒的RNA2基因组节段通过位于相同的三联阅读框内的两个不同的翻译起始位点编码两种共羧基端蛋白质， 

其中该突变的起始位点是这两个起始位点之中的第一个，并且对应于野生型豇豆花叶病毒RNA-2节段中第161位处的起始位点；和任选地 

(b)第二基因构建体，其任选地整合在所述第一基因构建体内，包括与 启动子和终止子序列可操作地连接的异源基因沉默抑制子， 

其中所述二分体RNA病毒是豇豆花叶病毒属病毒。 

16.权利要求2-8或权利要求14或权利要求15中任一项要求保护的基因表达系统，其是DNA双元载体。 

17.一种在植物中表达蛋白质的方法，包括如下步骤： 

(a)向植物细胞内导入基因表达构建体，其包括第一基因构建体，该第一基因构建体包含源自经截短的豇豆花叶病毒科二分体病毒基因组RNA-2的序列，其携带至少一个与启动子或终止子序列可操作地连接的编码目的异源蛋白的外来基因，其中该基因构建体包括位于所述外来基因上游的突变的起始位点； 

其中所述豇豆花叶病毒科病毒的RNA2基因组节段通过位于相同的三联阅读框内的两个不同的翻译起始位点编码两种共羧基端蛋白质， 

其中该突变的起始位点是这两个起始位点之中的第一个，并且对应于野生型豇豆花叶病毒RNA-2节段中第161位处的起始位点；和任选地 

(b)向植物细胞内导入第二基因构建体，其任选地整合在所述第一基因构建体内，包括与启动子和终止子序列可操作地连接的异源基因沉默抑制子。 

18.根据权利要求12-14任一项的方法，包括向宿主生物体内引入该基因表达系统的步骤。 

19.用根据权利要求3-8中任一项的基因表达系统瞬时转染的宿主生物体，其中该宿主生物体是昆虫细胞或植物细胞。 

20.一种产生目的蛋白质的方法，包括使用用根据权利要求3-8中任一项的基因表达系统瞬时或稳定转染的宿主生物体，和收集已经自所述基因表达系统表达目的蛋白质的组织并从该组织分离目的蛋白质，其中所述宿主生物体是植物。 

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