JP5502328B2 - 植物体中でのシアル酸の合成 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、植物体におけるシアル酸の合成に関する。さらに、本発明はシアル酸を産生する方法及び植物体を提供し、これら植物体から産生されるシアル化タンパク質を提供する。

（発明の背景）
植物は、組換え医薬タンパク質を製造するための、コストの低い、且つ混入汚染について安全な製造現場となる可能性がある。アミノ酸配列、立体配置及び生物活性に関する限り、植物で産生された組換えタンパク質のほとんどは哺乳類で製造されたものと区別できない。さらに、哺乳類の糖タンパク質は、それらがトランスジェニック植物で発現された場合、効率的にグリコシル化される。しかしながら、植物は、動物の糖タンパク質で見い出されるものとは異なるＮ−グリカンを持つ分子を産生する（非特許文献１）。このことは、これらのタンパク質上の植物特異的な糖エピトープがヒトにおいて免疫応答を誘発する（非特許文献２）と共に、シアル化配列のような哺乳類型のエピトープが存在しないことが血流からのそれらの迅速なクリアランスを誘導する可能性があるので、植物で作製された医薬品の使用を限定する可能性がある。その結果、植物で作製された医薬のＮ−グリコシル化を制御することがヒトの治療法で使用することの前提条件となっている。

最近、植物体でのリモデリング戦略が出現し、ヒトと適合可能な糖質特性を持つ植物由来の抗体が得られている。作戦の一部には、小胞体におけるプランティボディの保持が関与し（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、他の作戦には、哺乳類のグリコシルトランスフェラーゼによる植物の形質転換が関与していた。たとえば、植物のＮ−グリコシル化は、ヒトのβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（非特許文献６；非特許文献７）による植物の形質転換によって部分的にヒト化することができる。形質転換された植物におけるマウスの抗体の発現は結果として、相当するマウスのＩｇＧで認められるものに類似するガラクトシル化特性を抱く植物由来の抗体を産生した（非特許文献７）。

哺乳類のＩｇＧは、Ｆｃドメインに位置するＮグリコシル化の保存された部位で二分岐Ｎ−グリカンを持つ。これらのオリゴ糖は弱くシアル化されており、末端Ｎｅｕ５Ａｃが存在しないので、抗体の機能や安定性を妨害することはない。対照的に、そのほかの循環性糖タンパク質はほとんどシアル化された２、３又は４分岐のＮ−グリカンを有する。これらグリカンにおける末端シアル酸の存在は、多数の生体機能に必要とされ、その第１は、循環系におけるタンパク質の半減期の制御である。末端シアル酸の非存在下では、糖タンパク質は肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体によって検出され、血清からクリアランスされ、これらのタンパク質の半減期を短く、無効なものにする（非特許文献８）。従って、非シアル化植物によって作製された医薬は、ヒトに注射された場合、血流から迅速に除かれる可能性があり、たとえば、タバコに由来するＥｐｏはｉｎ ｖｉｔｒｏでは生物学的に活性を持っていたが、赤血球造血組織に到達する前に循環から除かれるためにｉｎ ｖｉｖｏでは、非機能性だった（非特許文献９）。

プランティボディに連結するＮ−グリカンのヒト様Ｎ−グリカンへのリモデリングは、共基質として内因性ＵＤＰ−Ｇａｌを使用するトランスフェラーゼである、ヒトのβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（非特許文献６および７）の発現によって、植物ではすでに部分的に達成されている。哺乳類のシアリルトランスフェラーゼも植物に導入されており、機能性であり、正確にゴルジ装置を標的とすることが実証されている（非特許文献１０）。しかしながら、内因性オリゴ多糖類のシアル化は認められなかった。植物におけるシアル酸及びシアル化機構の存在は依然として議論のあることころである。しかしながら、ヒトに存在する主なシアル酸であるＮｅｕ５Ａｃ、同様にその前駆体、Ｎ−アセチルマンノサミン（Ｄ−ＭａｎＮＡｃ）は、検出可能な量で植物にて合成されるとは思われない（非特許文献１１）。その結果、植物のＮ−グリカンのシアル化オリゴ糖へのグリコ操作は、合成を触媒することが可能な内因性酵素の共発現、Ｎｅｕ５Ａｃの活性化及びゴルジ装置への移行を必要とする。

哺乳類及び細菌では、Ｎｅｕ５Ａｃの同化作用及び異化作用は、異なった経路を介して生じる（非特許文献１２）。主な部類の２つの酵素がＮｅｕ−５Ａｃを形成するのに必要とされる。Ｎ−アセチルノイラミネートリアーゼ（Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ）は、可逆的反応におけるＮｅｕ５ＡｃのＮ−アセチルマンノサミン（Ｄ−ＭａｎＮＡｃ）とピルビン酸塩への開裂を触媒することによってシアル酸の異化作用に関与する。高濃度のＤ−ＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩にて、平衡は、Ｎｅｕ５Ａｃの合成に移行しうる。グルコサミン２−エピメラーゼ活性に連動して、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＮｅｕ５ＡｃリアーゼをＤ−ＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕ５Ａｃの大量生産に利用した（非特許文献１３）。或いは、ＮｅｕＢのようなＮｅｕ５Ａｃシンターゼは、ピルビン酸ホルホエノール（ＰＥＰ）へのＭａｎＮＡｃの縮合を触媒し、シアル酸の生合成に直接関与する（非特許文献１４で概説された）。
Ｌｅｒｏｕｇｅ， Ｐ．， Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕ， Ｍ．， Ｒａｙｏｎ， Ｃ， Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−Ｌａｉｎｅ， Ａ．−Ｃ， Ｇｏｍｏｒｄ， Ｖ． ａｎｄ Ｆａｙｅ， Ｌ． （１９９８） Ｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， ３８， ３１−４８ Ｂａｒｄｏｒ Ｍ， Ｆａｖｅｅｕｗ Ｃ， Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ Ａ−Ｃ， Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｄ， Ｇａｌａｓ Ｌ， Ｔｒｏｔｔｅｉｎ Ｆ， Ｆａｙｅ Ｌ ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｇｅ Ｐ． （２００３） Ｉｍｍｕｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔｙｐｉｃａｌ ｐｌａｎｔ ｇｌｙｃｏ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ， ｃｏｒｅ−ａｌｐｈａ（ｌ，３）−ｆｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｃｏｒｅ−ｘｙｌｏｓｅ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， １３， ４２７−４３４ Ｋｏ， Ｋ．， Ｔｅｋｏａｈ， Ｙ．， Ｒｕｄｄ， Ｐ．Ｍ．， Ｈａｒｖｅｙ， Ｄ．Ｊ．， Ｄｗｅｋ， Ｒ．Ａ．， Ｓｐｉｔｓｉｎ， Ｓ．， Ｈａｎｌｏｎ， Ｃ．Ａ．， Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ Ｃ， Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ， Ｂ．， Ｇｏｌｏｖｋｉｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ， Ｈ． （２００３） Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ， １０１， ８０１３−８０１８ Ｓｒｉｒａｍａｎ， Ｒ．， Ｂａｒｄｏｒ， Ｍ．， Ｓａｃｋ， Ｍ．， Ｖａｑｕｅｒｏ， Ｃ， Ｆａｙｅ， Ｌ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｒ．， Ｆｉｎｎｅｒｎ Ｒ． ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｇｅ， Ｐ． （２００４） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉ−ｈＣＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｌａｃｋ ｃｏｒｅ ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｃｏｒｅ Ｄ（ｌ，３）−ｆｕｃｏｓｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｊ．， ２， ２７９−２８７ Ｔｒｉｇｕｅｒｏ， Ａ．， Ｃａｂｒｅｒａ， Ｇ．， Ｃｒｅｍａｔａ， Ｊ．， Ｙｕｅｎ， Ｃ−Ｔ．， Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｊ． ａｎｄ Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．Ｉ． （２００５） Ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ＫＤＥＬ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｓ ＴＶ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｗｉｔｈ ｍｏｓｔｌｙ ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｔｙｐｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｊ． ３， ４４９−４５７ Ｐａｌａｃｐａｃ， Ｎ． Ｑ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｓａｋａｉ， Ｈ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｙ．， Ｆｕｊｉｙａｍａ， Ｋ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｔ． ａｎｄ Ｓｅｋｉ， Ｔ． （１９９９） Ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ １，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｉｆｉｅｓ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， ４６９２− ４６９７ Ｂａｋｋｅｒ， Ｈ．， Ｂａｒｄｏｒ， Ｍ．， Ｍｏｌｈｏｆｆ， Ｊ．， Ｇｏｍｏｒｄ， Ｖ．， Ｅｌｂｅｒｓ， Ｉ．， Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｌ．， Ｊｏｒｄｉ， Ｗ．， Ｌｏｍｍｅｎ， Ａ．， Ｆａｙｅ， Ｌ．， Ｌｅｒｏｕｇｅ， Ｐ． ａｎｄ Ｂｏｓｃｈ Ｄ． （２００１） Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ， ９８， ２８９９−２９０４ Ｋｅｌｍ， Ｓ． Ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ， Ｒ． （１９９７） Ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １７５， １３７−２４０ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｓ．， Ｉｋｕｒａ， Ｋ．， Ｕｅｄａ， Ｍ． ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ， Ｒ． （１９９５） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ （ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ） ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ． Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．２７， １１６３−１１７２ Ｗｅｅ， Ｅ．Ｑ．， Ｓｈｅｒｒｉｅｒ， Ｄ．Ｊ．， Ｐｒｉｍｅ， Ｔ．Ａ． ａｎｄ Ｄｕｐｒｅｅ， Ｐ． （１９９８） Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １０， １７５９−１７６８ Ｓｅｖｅｎｏ， Ｍ．， Ｂａｒｄｏｒ， Ｍ．， Ｐａｃｃａｌｅｔ， Ｔ．， Ｇｏｍｏｒｄ， Ｖ．， Ｌｅｒｏｕｇｅ， Ｐ． ａｎｄ Ｆａｙｅ， Ｌ． （２００４）Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ？ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２２， ５−６ Ａｎｇａｔｔａ， Ｔ． ａｎｄ Ｖａｒｋｉ， Ａ． （２００２） Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａ−ｋｅｔｏ ａｃｉｄｓ： ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｅｒｓｐｅｒｔｉｖｅ． Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．， １０２， ４３９−４６９ Ｍａｒｕ， Ｉ．， Ｏｈｎｉｓｈｉ， Ｊ．， Ｏｈｔａ， Ｙ． ａｎｄ Ｔｓｕｋａｄａ， Ｙ． （１９９８） Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｕｓｉｎｇ Ｎ− ａｃｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ｌａｙｓｅ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．，３０６， ５７５−５７８ Ｔａｎｎｅｒ， Ｍ． Ｅ． （２００５） Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ３３， ２１６−２２８

（発明の要旨）
本発明は、植物体におけるシアル酸の合成に関する。さらに、本発明は、シアル酸を産生する方法及び植物体、並びにこれら植物体から産生されるシアル化タンパク質に関する。

本発明の目的は、植物体においてシアル酸を産生する改良された方法を提供することである。

本発明によれば、
ｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）シンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列である、植物体で活性のある調節領域と作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む植物体を提供することと、
ｉｉ）植物体を生育させ、ヌクレオチド配列を発現させ、それによってシアル酸を合成することを含む、シアル酸、たとえば、Ｎｅｕ５Ａｃの合成方法が提供される。

さらに、生育させる工程の後、シアル酸を植物体から回収してもよい。調節領域は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び発育プロモーターからなる群より選択されてもよい。

本発明はまた、上記で定義された方法（方法Ａ）に関するものであり、その際、提供する工程では、植物体はさらに、植物体内で活性がある１又は１を超えた第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。第２のヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列の発現と共に共発現される。さらに第２の調節領域は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び発育プロモーターからなる群より選択されてもよい。

本発明はまた、上述の方法（方法Ａ）に関するものであり、その際、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ若しくはＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ若しくはＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの１若しくは１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列、又は目的のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列の両方は、植物体内での発現のためにコドンが最適化されている。

本発明は、
ｉ）Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、並びに目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を発現する植物体を提供することと、
ｉｉ）植物体を生育させ、第１及び第２のヌクレオチド配列を発現させ、それによって目的のタンパク質を産生し、その際、目的のタンパク質がシアル化されることを含む、
目的のタンパク質を産生する方法（Ｂ）を提供する。

好ましくは、シアル化される目的のタンパク質は、ジ−、トリ−又はテトラ−分岐Ｎ−グリカンを含む。

本発明はまた、上述の方法（方法Ｂ）に関するものであり、その際、シアル化タンパク質は植物体から抽出される。さらに、シアル化タンパク質は単離され、精製されてもよい。

本発明は、植物体で活性のある調節領域に作動可能に連結されたＮｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子を提供する。植物体、植物細胞又は種子は、植物内で活性のある１又は１を超える第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。さらに、調節領域及び第２の調節領域は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び発育プロモーターからなる群より選択されてもよい。

本発明はまた、上述の方法（方法Ｂ）に関するものであり、その際、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は第１の配列及び第２の配列の両方は、植物体、植物細胞内又は種子内で発現させるためにコドンが最適化されている。

本発明は、植物体で活性のある調節領域と作動可能に連結されたＮｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子を包含する。植物体、植物細胞又は種子はさらに、植物体内で活性がある１又は１を超えた第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列を含んでもよい。さらに、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ若しくはＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列、又は目的の配列及び第２の配列の両方は、植物体、植物細胞内又は種子内で発現させるためにコドンが最適化されている。

本発明はまた、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子を提供するものであり、第１及び第２のヌクレオチド配列は、植物体で活性がある１又は１を超える調節領域に作動可能に連結される。１又は１を超える調節領域は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び発育プロモーターからなる群より選択されてもよい。さらに、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は第１の配列及び第２の配列の両方は、植物体、植物細胞内又は種子内で発現させるためにコドンが最適化されている。

本発明はまた、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）シンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列である、植物体で活性がある調節領域と作動可能に連結されたヌクレオチド配列によって植物体又は植物体の一部を一過性に形質転換することと、ヌクレオチド配列を発現させ、それによってシアル酸を合成することを含むシアル酸の合成方法（方法Ｃ）も提供する。さらに、Ｎｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼは、植物体又は植物体の一部から回収されてもよい。

本発明はまた、上述の方法（方法Ｃ）に関するものであり、その際、植物体又は植物体の一部を一過性に形質転換する工程はさらに、植物体内で活性がある１又は１を超える第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、第２のヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列の発現と共に共発現される。

本発明は、
ｉ）Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、及び目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を発現する構築物によって植物体又は植物体の一部を一過性に形質転換することと、
ｉｉ）目的のタンパク質を産生し、その際目的のタンパク質がシアル化されることを含む
目的のタンパク質を産生する方法（方法Ｄ）を提供する。

シアル化される目的のタンパク質は、ジ−、トリ−又はテトラ−分岐Ｎ−グリカンを含んでもよい。さらに、シアル化タンパク質は植物体又は植物体の一部から抽出されてもよい。シアル化目的のタンパク質はまた単離され、精製されてもよい。

本発明はまた、上述の方法（方法Ｄ）に関するものであり、その際、産生する工程の後、シアル化目的のタンパク質を含む植物物質は、被験体に経口投与される。たとえば、産生する工程の後、植物体又は植物体の一部を最小限に加工して最小限に加工された植物物質を作製してもよく、シアル化された目的のタンパク質を含む最小限に加工された植物物質を被験体に経口投与してもよい。

本明細書で記載されるように、植物体におけるＮｅｕ５Ａｃ合成酵素、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕＢ２の発現は結果的に植物組織内に機能的酵素の蓄積を生じる。Ｎｅｕ５Ａｃ合成酵素は、任意の植物体、たとえば、タバコ及びＭｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、分子農法に関する幾つかの農業的利点から恩恵を受ける多年生のマメ科作物で発現されてもよいが、これらに限定されない（Ｂｕｓｓｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００１）。

本発明の要約は、本発明の特徴を必ずしもすべて記載するわけではない。

本発明のこれらの特徴及びそのほかの特徴は、添付の図面を参照する説明からさらに明らかになるであろう。

（詳細な説明）
本発明は、植物体におけるシアル酸の合成に関する。さらに、本発明は、シアル酸を発現する方法及び植物体、並びにこれら植物体から産生されるシアル化タンパク質を提供する。

以下の記載が、好ましい実施態様である。

本発明は、植物体内でＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を合成する方法を提供する。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼは、可逆的反応においてＮｅｕ５ＡｃをＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩に切断するのを触媒することによって細菌にてシアル酸を異化する。この反応は可逆的なので、適切な前駆体の存在下でＮｅｕ５Ａｃを合成するのにＮｅｕ５Ａｃリアーゼを使用してもよい。Ｎｅｕ５Ａｃの産生に関する代替方法には、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼの使用が関与する。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼは、Ｄ−ＭａｎＮＡｃとＰＥＰとの縮合によってＮｅｕ５Ａｃを形成するのを触媒する。

従って、本発明は、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列であって、植物体で活性のある調節領域と作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む植物体を提供することと、植物体を生育させ、ヌクレオチド配列を発現させてＮｅｕ５Ａｃを合成することを含むＮｅｕ５Ａｃを合成する方法を提供する。或いは、方法には、植物体又は植物体の一部の内部におけるＮｅｕ５Ａｃの一過性の産生が関与してもよい。

そのように産生されるＮｅｕ５Ａｃは、植物体から回収され、当該技術で既知の方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質のシアル化に使用されてもよい。或いは、Ｎｅｕ５Ａｃは、植物体内で共発現される目的のタンパク質のシアル化のための内因性基質として使用されてもよい。

所望であれば、植物体内でＮｅｕ５Ａｃを合成するための、Ｎ−アセチルマンノサミン（Ｄ−ＭａｎＮＡｃ）を含むが、これに限定されない基質のレベルは、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの１又は１を超えるものをコードする１又は１を超える追加のヌクレオチド配列を植物体内で共発現させることによって高められてもよい。たとえば、植物体内で、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ、たとえば、細菌のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ、又は内因性のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎＮＡｃに変換するそのほかの供給源からのエピメラーゼを発現させることによってＭａｎＮＡｃを合成してもよい。或いは、ＭａｎＮＡｃ−６−リン酸を製造し、その後、ホスファターゼによって加水分解してもよい。このアプローチによって、ＧｌｃＮＡｃ−６リン酸２−エピメラーゼ、たとえば、細菌のＧｌｃＮＡｃ−６リン酸２−エピメラーゼ、又は哺乳類のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼが植物体内で発現される。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列の発現と共にこの第２のヌクレオチド配列を共発現させることによって、高いレベルのＮｅｕ５Ａｃが産生される。しかしながら、１以上のこれら酵素の内因性の活性が植物体の内部に存在してもよいので、１以上の上記ヌクレオチド配列の共発現の必要性は、選択される宿主に依存する。

細胞質のシアル酸からのＮ−グリカンのシアル化を確実にするには、細菌又は哺乳類のＣＭＰ−Ｎｕｅ５Ａｃシンターゼ、哺乳類のＣＭＰ−Ｎｕｅ５Ａｃトランスポーター、哺乳類のガラクトシルトランスフェラーゼ（シアル酸をＮ−グリカンに変換する前のガラクトースの添加にために）及び哺乳類のシアリルトランスフェラーゼを植物体内で共発現させてもよい。本発明に従って植物体内で産生されたＮｅｕ５Ａｃは、ＣＭＰ−Ｎｕｅ５Ａｃシンターゼを介したＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｕｅ５Ａｃ）の合成のための基質として使用されてもよく、ＣＭＰ−Ｎｕｅ５Ａｃは次いで、植物体内で共発現される目的のタンパク質のシアル化のための基質として使用される。この場合、植物体は、シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。哺乳類のシアリルトランスフェラーゼ及び哺乳類のＣＭＰ−Ｎｕｅ５Ａｃシンターゼの植物体における発現は実証されている（参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｍｉｓａｋｉ Ｒ，． ｅｔ ａｌ．， ２００６）。しかしながら、１以上のこれら酵素の内因性の活性が植物体内で存在してもよいので、１以上の上記ヌクレオチド配列を共発現する必要性は、選択される宿主植物体に依存してもよい。

ヌクレオチド配列が植物体内で共発現する場合、標準の形質転換手法である、一過性の形質転換手法を用いて所望のヌクレオチド配列のそれぞれを植物体に導入してもよいし、又は１以上の所望のヌクレオチド配列をそれぞれ発現する２種の植物体を交配してヌクレオチド配列の必要とされる組み合わせを共発現する植物体を得てもよい。

従って、本発明はまた、シアル化された目的のタンパク質の産生のための基盤として使用されてもよい植物体を作製する方法も提供する。本方法は、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列を発現する植物体を提供することと、１以上のヌクレオチド配列を発現することを含む。目的のタンパク質を産生するために、標準技法、たとえば、形質転換法を用いて、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を基盤植物体に導入し、第２のヌクレオチド配列を発現させるか、又は交配された植物体の子孫の中で産生された目的のタンパク質がシアル化されるように目的のタンパク質を発現している植物体と基盤植物体を交配させる。

本発明はまた、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列並びに目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を発現する植物体を提供することと、植物体を生育させ、第１及び第２のヌクレオチド配列を発現させ、それによって目的のタンパク質を産生し、その際目的のタンパク質がシアル化されることを含む、目的のタンパク質を産生する方法にも関する。好ましくは、シアル化される目的のタンパク質は、ジ−、トリ−又はテトラ−分岐Ｎ−グリカンを含む。シアル化タンパク質は植物体から抽出してもよく、所望であれば、シアル化タンパク質は、常法を用いて単離及び精製してもよい。再び、所望の構築物によって植物体を安定的に形質転換してもよいし、又は、所望の構築物によって植物体又は植物体の一部を一過性に形質転換してもよい。

Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、コドンを最適化して植物体内での発現レベルを高めてもよい。コドンの最適化によって、植物体内でのコドン使用法にアプローチするために、構造遺伝子又はその断片のオリゴヌクレオチド基本単位の合成及びそれに続く酵素の集合のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。

植物体内での外来配列の発現を最適化するために、野生型であっても合成配列であってもよいヌクレオチド配列が使用されてもよく、又は、相当するタンパク質、たとえば、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼ、目的のタンパク質、若しくはそれらの組み合わせが、非修飾ヌクレオチド配列によってコードされる場合に産生されるよりも高いレベルで産生される。たとえば、限定について考慮しないが、配列は、合成配列であってもよく、たとえば、ＢＬＡＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋを介して利用可能；初期設定パラメーターを用いて）のような、しかし、これに限定されない配列比較法を用いて決定されるように、野生型配列と少なくとも８０％の相同性を含んで、植物体内でのコドン利用について配列が最適化されてもよい。たとえば、抗原特性のような、しかし、これに限定されない有用な生物特性を示す目的のタンパク質又はその誘導体をコードする配列の断片又は一部が植物組織の中で発現されてもよいことも企図される。

Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及び目的のタンパク質の発現レベル及び導入遺伝子のタンパク質産生をできるだけ多くするために、核酸配列を調べて、Ｓａｒｄａｎａ ａｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １５：６７７−６８１， １９９６）が概説したものに類似する手順を用いてコーディング領域を修飾し、植物体における遺伝子の発現のために最適化してもよい。双子葉植物において高度に発現される遺伝子のコドン利用の表は、Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ （Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：４７７−４９８， １９８９）を含めて幾つかの供給元から利用可能である。

従って、本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）シンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列であって、植物体で活性のある調節領域と作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む植物体を提供することと、植物体を生育させ、ヌクレオチド配列を発現させ、それによってシアル酸を合成することを含むシアル酸を合成する方法を提供する。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列は、植物体内での発現のためにコドンが最適化されてもよい。さらに、提供する工程では、植物体はさらに、植物体内で活性がある１又は１を超えた第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、第２のヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列の発現と共に共発現される。エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列は、植物体内で発現されるためにコドンが最適化されてもよい。

さらに、本発明は、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、及び目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を発現する植物体を提供することと、植物体を生育させ、第１及び第２のヌクレオチド配列を発現させ、それによって目的のタンパク質を産生する目的のタンパク質を産生する方法を提供する。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は第１ヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列の両方は、植物体内で発現されるためにコドンが最適化されてもよい。

さらに、本発明は、植物体で活性のある調節領域に作動可能に連結されたＮｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子に関する。植物体、植物細胞又は種子は、植物内で活性のある１又は１を超える第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列の両方は、植物体、植物細胞又は種子内で発現されるためにコドンが最適化されてもよい。

本発明はまた、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子を含み、第１及び第２のヌクレオチド配列は、植物体で活性がある１又は１を超える調節領域に作動可能に連結される。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列の両方は、植物体内で発現されるためにコドンが最適化されてもよい。

「作動可能に連結する」によって、特定の配列が直接又は間接的に相互作用し、たとえば、遺伝子発現の介在又は修飾のような意図される機能を実行することを意味する。作動可能に連結された配列の相互作用は、たとえば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質が介在してもよい。転写調節領域が介在する又はそれによって修飾されるべき目的の配列の転写を行えるように配列が機能的に接続される場合、転写調節領域と目的の配列は作動可能に連結される。

用語「植物物体」によって、植物体に由来する任意の物質を意味する。植物物体は、植物体全体、その組織、細胞又は任意の分画を含んでもよい。さらに、植物物体は、植物体の細胞内植物成分、細胞外植物成分、液体、又は固形抽出物、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。さらに、植物物体は、植物体の葉、茎、果実、根、又はそれらの組み合わせからの植物体、植物細胞、組織、液体抽出物又はそれらの組み合わせを含んでもよい。植物物体は、加工工程の対象とされていない植物体又はその一部を含んでもよい。しかしながら、植物物体は、以下で定義するような最小限の加工工程、又はクロマトグラフィ、電気泳動などを含むが、これらに限定されない当該技術で共通して知られる技法を用いた部分的な又は実質的なタンパク質精製を含む綿密な工程の対象とされてもよいことも企図される。

用語「最小限の加工」によって、植物抽出物、ホモジネート、ホモジネートの分画などを得るために部分的に精製される目的のタンパク質を含む植物物体、たとえば、植物体又はその一部を意味する。部分精製は、植物体の細胞構造を破壊し、それによって可溶性の植物成分、及びたとえば、それらに限定されないが、遠心分離、濾過又はそれらの組み合わせによって分離されてもよい不溶性の植物成分を含む組成物を創製することを含んでもよいが、これらに限定されない。この点で、葉又はそのほかの組織の細胞外空間に分泌されたタンパク質は、吸引又は遠心抽出を用いて容易に得ればよく、加圧下でローラーを通過させる又は粉砕するなどによって組織を抽出し、細胞外空間から離れたタンパク質を圧搾する又は遊離させればよい。最小限の加工には、可溶性タンパク質の粗抽出物の調製が関与すればよく、これらの調製物は、二次的な植物生成物からの混入が無視できるほどだからである。さらに、最小限の加工には、可溶性タンパク質の葉からの水性抽出、その後の好適な塩による沈殿が関与してもよい。そのほかの方法には、抽出物の直接的な使用を可能にするための大規模浸漬及び分泌液抽出が挙げられる。

植物物質又は組織の形態での植物物体は、経口にて被験体に送達されてもよい。植物物体は、栄養補助食品の一部として他の食物とともに投与されてもよく、カプセルに内包されてもよい。植物物体又は組織は、濃縮して美味しさを改善する又は高めてもよく、必要に応じてそのほかの物質、成分又は医薬賦形剤とともに提供されてもよい。

不均質な目的のタンパク質を含む植物体を、必要性と状況に応じて様々な方法で、被験体、たとえば、動物又はヒトに投与してもよいことが企図される。たとえば、タンパク質が経口で投与されるのであれば、植物体を収穫し、直接被験体に与えてもよいし、与える前に収穫した組織を乾燥してもよいし、収穫を行わずに動物が植物体を食べられるようにしてもよい。収穫された植物体組織に関する本発明の範囲内で、動物の餌の中に食品補助として提供されることも考慮される。植物体組織がほとんど又は全くさらに加工することなく動物に与えられるのであれば、投与される植物体組織は食用であることが好ましい。さらに、植物体から得られる目的のタンパク質は、食品補助として使用する前に、加工しない形態、部分精製した形態、又は生成した形態に抽出されてもよい。この後者の場合、タンパク質は食用又は非食用の植物体のいずれかから産生されればよい。

さらに詳細には実施例で記載されるように、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧ（形質転換体で組換えタンパク質を免疫的に検出するためにＣ末端にてＦＬＡＧエピトープをタグとして付けたＮｅｕ５Ａｃリアーゼ）を植物体に導入した。抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット分析によって、形質転換された細胞にＭＷ_ｒ３２ｋＤａのタンパク質が存在することが明らかにされた（図１ａ）。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧのいずれかを発現している植物体から得られた抽出物にて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でリアーゼ活性が検出可能だった。非形質転換植物体にて内因性のリアーゼ活性は検出されなかった。しかしながら、Ｄ−ＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩の存在下にて組換え産生されたＮｅｕ５Ａｃリアーゼを用いたＮｅｕ５Ａｃの合成は認められた（図２ｂを参照のこと）。従って、組換え的に発現されたＮｅｕ５Ａｃリアーゼは、植物体にて生物学的に活性がある。

Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（たとえば、ＮｅｕＢ２、しかし、これに限定されない）及びＮｅｕ５Ａｃシンターゼ−ＦＬＡＧ（形質転換体で組換えタンパク質を免疫的に検出するためにＣ末端にてＦＬＡＧエピトープをタグとして付けたＮｅｕ５Ａｃシンターゼ）を植物に導入した。抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット分析によって、形質転換された細胞にＭＷ_ｒ３７ｋＤａのタンパク質が存在することが明らかにされた。Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃシンターゼ−ＦＬＡＧのいずれかを発現している植物体から得られた抽出物にて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でシンターゼ活性が検出可能だった。非形質転換植物体にて内因性のシンターゼ活性は検出されなかった。しかしながら、Ｄ−ＭａｎＮＡｃとＰＥＰの存在下にて組換え産生されたＮｅｕ５Ａｃシンターゼを用いたＮｅｕ５Ａｃの合成は認められた（図３ｂ、ｃを参照のこと）。従って、組換え的に発現されたＮｅｕ５Ａｃシンターゼは、植物体にて生物学的に活性がある。

「類縁体」又は「誘導体」は、ヌクレオチド配列が、標的遺伝子又は配列の発現を停止する、標的配列の発現を低下させる、又は標的配列にコードされるタンパク質の合成又は活性を低下させる特性を保持するという条件で、サイレンシングヌクレオチド配列への置換、欠失又は付加を含む。たとえば、核酸配列の誘導体及び類縁体は通常、サイレンシング核酸配列に８０％を超える類似性を示す。配列の類似性は、初期設定プログラム（プログラム：ｂｌａｓｔｎ、データベース：ｎｒ、Ｅｘｐｅｃｔ１０、フィルター：低複雑性、アライメント：ペアで、ワールドサイズ：ＩＩ）を用いたＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＧｅｎＢａｎｋ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）の使用によって決定されてもよい。その類縁体又は誘導体はまた、厳密なハイブリッド形成の条件下で（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８２， ｐ． ３８７−３８９， 又はＡｕｓｕｂｅｌ ａｔ ａｌ．， （ｅｄｓ）， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｌｋ ｐ．２．１０．３を参照のこと）配列が標的遺伝子の発現を停止する特性を示すという条件で本明細書に記載される配列の１つにハイブリッド形成するヌクレオチド配列も含む。そのような厳密なハイブリッド形成条件の例の１つは、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２中で６５ＥＣにて１６〜２０時間、たとえば、［γ−^３２Ｐ］ｄＡＴＰ標識されたプローブのような、しかし、これに限定されない好適なプローブとのハイブリッド形成であってもよい。続いて、５％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２で３０分間洗浄し、続いて１％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２で３０分間洗浄すること。この緩衝液での洗浄を繰り返してバックグランドを低減させてもよい。

「調節領域」、「調節要素」または「プロモーター」によって、常とは限らないが、通常、遺伝子のタンパク質コーディング領域の上流にある核酸の部分を意味し、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方で構成されてもよい。調節領域が目的の遺伝子によって活性を持つ場合、目的の遺伝子と作動関係にある場合、目的の遺伝子と作動可能に連結される場合、これが、結果として目的の遺伝子の発現を生じてもよい。調節要素は、臓器特異性又は発生上の若しくは一時的な遺伝子の活性化の制御に介在することが可能である。「調節領域」には、プロモーター要素、基本のプロモーター活性を示すコアプロモーター要素、外部刺激に反応して誘導可能である要素、たとえば、負の調節要素又は転写エンハンサーのようなプロモーター活性に介在する要素が含まれる。本明細書で使用されるとき、「調節領域」には、転写に続いて活性を持つ要素、たとえば、翻訳及び転写のエンハンサー、翻訳及び転写のリプレッサー、上流活性化配列並びにｍＲＮＡ不安定性決定基のような遺伝子発現を調節する調節要素が挙げられる。これら後者の要素の幾つかは、コーディング領域の近傍に位置してもよい。

この開示の背景で、用語「調節要素」又は「調節領域」は通常、常とは限らないが、普通、構造遺伝子の上流（５’）のＤＮＡの配列を言い、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は特定の部位で開始する転写に必要とされるそのほかの因子に対して認識を提供することによってコーディング領域の発現を制御する。しかしながら、配列のイントロン又は３’の中に位置するそのほかのヌクレオチド配列も目的のコーディング領域の発現の調節に寄与してもよいことが理解されるべきである。ＲＮＡポリメラーゼ又は特定の部位からの開始を確実にするそのほかの転写因子に対して認識を提供する調節因子の例は、プロモーター要素である。すべてとは限らないが、ほとんどの真核生物のプロモーター要素は、普通、転写開始部位のおよそ２５塩基対上流に位置するアデノシンとチミジンのヌクレオチド塩基対から構成される保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含有する。プロモーター要素は、転写の開始に反応性である基本のプロモーター要素、同様に、遺伝子発現を加減するほかの調節要素（上記で列記したような）を含む。

発育上調節されるもの、誘導可能なもの又は構成的なものを含めて幾つかの種類の調節領域が存在する。発育上調節される、又はその制御下で遺伝子の差次的発現を制御する調節領域は、特定の臓器又は組織の発育中、特定の時間でその臓器又は組織の中で活性化される。しかしながら、一部の発育上調節される調節領域は、特定の発育段階で特定の臓器又は組織で優先的に活性化されてもよく、それらは、発育調節的に活性を持ってもよいし、又は植物体内で同様に他の臓器又は組織における基本的なレベルで活性を持ってもよい。組織特異的な調節領域の例は、たとえば、具体的に見た調節領域には、ナピンプロモーター及びクルシフェリンプロモーターが挙げられる（Ｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １５２：５９５−５９９； Ｂｉｌｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１２５−１３０）。

誘導可能な調節領域は、誘導因子に反応して１以上のＤＮＡ配列又は遺伝子の転写を直接又は間接的に活性化することが可能であるものである。誘導因子の非存在下では、ＤＮＡ配列又は遺伝子は転写されない。通常、誘導可能な調節領域に特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活性の形態で存在してもよく、次いで直接又は間接的に誘導因子によって活性形態に変換される。しかしながら、タンパク質因子は不在であってもよい。誘導因子は、たとえば、タンパク質、代謝産物、増殖調節剤、除草剤若しくはフェノール化合物のような化学物質、熱、寒冷、塩によって直接強いられる生理的ストレス、又は毒性要素又はウイルスのような病原体又は病原剤の作用を間接的に介したものであることができる。たとえば、噴霧する、水で薄める、加熱することによって又は類似の方法によって細胞又は植物体に誘導因子を外から適用することによって、誘導可能な調節領域を含有する植物細胞を誘導因子に暴露してもよい。誘導可能な調節領域は、植物遺伝子又は非植物遺伝子のいずれかに由来してもよい（たとえば、Ｇａｒｚ Ｃ ａｎｄ Ｌｅｎｋ Ｉ．Ｒ．Ｐ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．， ３：３５２−３５８， １９９８）。強力な誘導性プロモーターの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（参照によって組み入れられるＣｒａｔｚ Ｃ．， １９９７， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：８９−１０８）、ステロイド誘導性プロモーター（参照によって組み入れられるＡｏｙａｍａ Ｔ． ａｎｄ Ｃｈｕａ， Ｎ．Ｈ．， １９９７， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２：３９７−４０４）、及びエタノール誘導性プロモーター（参照によって組み入れられるＳａｌｔｅｒ Ｍ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６：１２７−１３２； Ｃａｄｄｉｃｋ Ｍ． Ｘ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １６：１７７−１８０）、サイトキニン誘導性ＩＢ６及びＣＫＩＩ遺伝子（参照によって組み入れられるＢｒａｎｄｓｔａｔｅｒ Ｉ． ａｎｄ Ｋｉｅｂｅｒ， Ｊ．Ｊ．， １９９８， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０： １００９−１０１９； Ｋａｋｉｍｏｔｏ Ｔ．， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４：９８２−９８５）及びオーキシン誘導性要素ＤＲ５（参照によって組み入れられるＵｌｍａｓｏｖ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ９：１９６３−１９７１）が挙げられるが、これらに限定されない。

構成的な調節領域は、植物体の種々の部分の全体にわたって、且つ植物体の生育全体にわたって継続して遺伝子の発現を指向する。既知の構成的な調節要素の例には、ＣａＭＶ３５Ｓ転写物（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：８１０−８１２）、コメのアクチン１（Ｚｈａｎｇ ａｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ３：１１５５−１１６５）、アクチン２（Ａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １０：１０７−１２１）、又はｔｍｓ（参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，４２８，１４７号）、及びトリオセホスフェートイソメラーゼ１（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０６：４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシのユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２９：６３７−６４６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのユビキチン１及び６の遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２９：６３７−６４６）、及びタバコの翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２９：９９５−１００４）に関連するプロモーターが挙げられる。用語「構成的な」は、本明細書で使用されるとき、構成的な調節領域の制御下にある遺伝子があらゆる種類の細胞にて同一レベルで発現されるが、該遺伝子は、多量の変異が認められることが多いにもかかわらず、広い範囲の細胞種で発現されることを必ずしも指し示さない。

本発明の１又は１を超えるヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、又は構築物又はベクターで形質転換される好適な植物体宿主で発現されてもよい。好適な宿主の例には、アルファルファ、カノーラ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、ジャガイモ、朝鮮ニンジン、エンドウ豆、カラスムギ、コメ、大豆、小麦、大麦、ヒマワリ、及び綿を含む農作物が挙げられるが、これらに限定されない。

従って、本発明は、植物体で活性のある調節領域と作動可能に連結された、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子も提供する。さらに植物体、植物細胞又は種子は、植物体内で活性がある１又は１を超えた第２の調節領域に作動可能に連結された、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの１又は１を超えるものをコードする第２のヌクレオチド配列を含んでもよい。

本発明はまた、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ、エピメラーゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをコードする１又は１を超える第１のヌクレオチド配列、目的のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む植物体、植物細胞又は種子を提供するものであり、第１及び第２のヌクレオチド配列は、植物体で活性がある１又は１を超える調節領域に作動可能に連結される。

本発明の１以上のキメラ遺伝構築物は、さらに３’非翻訳領域を含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡのプロセッシング又は遺伝子発現を達成することが可能であるそのほかの調節シグナルを含有するＤＮＡ断片を含む遺伝子の部分を言う。ポリアデニル化シグナルは普通、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸のトラックの付加を達成することを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、変異が珍しくはないが、標準形態５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって一般に認識される。本発明の１以上のキメラ遺伝構築物は、必要に応じてさらに、エンハンサー、翻訳エンハンサー又は転写エンハンサーのいずれかを含むことができる。これらのエンハンサーは当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンと隣接する配列を含むことができる。開始コドンは、配列全体の翻訳を確実にするようにコーディング配列の読み取りフレームに同調しなければならない。

好適な３’領域の非限定例は、たとえば、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）のような（Ｔｉ）プラスミド遺伝子並びに大豆保存タンパク質遺伝子及びリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小型サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子のような植物遺伝子を誘導するアグロバクテリウム腫瘍のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域である。

形質転換した植物細胞での同定に役立つように、本発明の構築物は、植物体で選抜可能なマーカーを含むようにさらに操作してもよい。有用な選抜可能なマーカーには、たとえば、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンのような抗生剤、又はホスホノトリシン、グリホサート、クロロスルフロンなどのような除草剤のような化学物質に耐性を提供する酵素が挙げられる。同様に、たとえば、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）のような色変化によって同定可能な化合物の産生、又はたとえば、ルシフェラーゼ若しくはＧＦＰのような発光を提供する酵素を使用してもよい。

また、本発明の考慮される部分は、本発明のキメラ遺伝構築物を含有するトランスジェニック植物体、植物細胞又は種子である。植物細胞から植物体全体を再生させる方法も当該技術では既知である。一般に、形質転換された植物細胞は適切な培地で培養され、培地は、抗生剤のような選抜剤を含有してもよく、その際、選抜可能なマーカーを使用して形質転換した植物細胞の同定を円滑にする。いったん、カルスが形成されると、既知の方法に準じて適切な植物ホルモンを用いることによって芽形成を促し、芽を植物再生用の発根培地に移す。次いで、種子から、又は栄養繁殖技法を用いて、該植物体を使用して繰り返し世代を確立してもよい。組織培養を用いることなくトランスジェニック植物体を生成することもできる。

形質転換又は一時的な発現の影響を受け易い宿主生物の範囲内での発現のために、本発明の調節要素を目的のコーディング領域と組み合わせてもよい。そのような生物には、単子葉植物及び双子葉植物両方の植物が挙げられるが、これらに限定されず、たとえば、トウモロコシ、シリアル植物、小麦、大麦、タバコ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、大豆、豆、エンドウ豆、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、朝鮮ニンジン及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

これら生物の一時的な発現、形質転換及び再生の方法は、当該技術で確立され、当業者に既知である。形質転換された植物体及び再生された植物体を入手する方法は本発明に決定的ではない。

「形質転換」によって、遺伝子型として、表現型として、又はその両方で明らかにされる遺伝情報の種間の移転を意味する。キメラ遺伝構築物から宿主への遺伝情報の種間移転は、遺伝性であってもよく、遺伝情報の移転は安定であるとみなされてもよく、又は移転は、一時的であってもよく、遺伝情報の移転は遺伝性ではない。本発明はさらに、安定な発現系又は一時的な発現系のいずれかと共に使用するのに好適なキメラ遺伝子構築物を含む好適なベクターをさらに含む。

Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクターを用いて、直接的なＤＮＡ形質転換、微量注入、エレクトロポレーションによって本発明の構築物を植物細胞に導入することができる。そのような技法の概説については、たとえば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｌｋ， ＶＩＩＩ， ｐｐ ４２１−４６３， １９８８； Ｇｅｉｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｄ， Ｅｄ（１９８８），；及びＭＩｋｉ ａｎｄ ｌｙｅｒ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． ２ｄＥｄ， ＤＴ， Ｄｅｎｎｉｓ， ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ， ＤＤ Ｌｅｆｅｂｒｖｅ， ＤＢ， Ｌａｙｚｅｌｌ （ｅｄｓ）， Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ， （Ｌａｎｇｍａｎｓ社， Ｌｏｎｄｏｎ ｐｐ５６１−５７９（１９９７）を参照のこと。そのほかの方法には、直接的なＤＮＡの取り込み、リポソームの使用、エレクトロポレーション、たとえば、プロトプラストの使用、微量注入、微量発射若しくはウイスカー、及び真空浸透が挙げられる。たとえば、Ｂｉｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （Ｇｅｎｅ， １００：２４７−２５０， １９９１）， Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， （Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，２２８：１０４−１１２， １９９１）， ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， （Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１−１１６， １９８７）， Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， （Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． ｇｅｎｅｔ．， ７５：３０−３６， １９８７）， Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３， １９８７； Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０８：１２６５， １９８０）， Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， （Ｓｃｅｉｎｅｃ ２２７：１２２９−１２３１， １９８５）； ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１：６９４−７０１， １９８９； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｋ， ｅｄｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９８８； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｃｈｅｌｅｒ ａｎｄ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９８９）； Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ （Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １０５：３４３−３４８， ２００２）； 米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，０３６，００６号及び同第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日出願の米国特許出願出願番号第０８／４３８，６６６号、及び１９９２年９月２５日出願の同第０７／９５１，７１５号（すべて参照によって本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

以下に記載されるように、一過性の発現方法を用いて本発明の構築物を発現させてもよい（参照によって本明細書に組み入れられるＬｉｕ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｄｄ， ２００２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０５：３４３−３４８を参照のこと）。これらの方法には、たとえば、アグロ−植菌又はアグロ−浸潤が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、上で述べたように他の一過性の方法も使用してもよい。アグロ−植菌又はアグロ−浸潤のいずれかによって、所望の核酸を含むアグロバクテリウムの混合物は、組織、たとえば、葉の細胞間間隙、植物体（茎、葉及び花を含む）の空間、植物体（茎、根、花）のそのほかの部分、又は植物体全体に入る。上皮を越境させた後、アグロバクテリウムが感染し、細胞内にＤＮＡのコピーを転移させる。ｔ−ＤＮＡは、エピソームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染した細胞における目的のタンパク質の産生をもたらす。しかしながら、ｔ−ＤＮＡの核への継代は一過性である。

「目的の遺伝子」、「目的のヌクレオチド配列」又は「目的のコーディング領域」によって、宿主生物、たとえば、植物体の中で発現されるべき遺伝子、ヌクレオチド配列、又はコーディング領域を意味する。これらの用語は相互交換可能に使用される。そのような目的のヌクレオチド配列には、その産物が工業用の酵素、タンパク質、サプリメント、餌、食品又は餌と食品両方の用途での中立的な付加価値のある産物、又はその断片である遺伝子又はコーディング領域が挙げられるが、これらに限定されない。目的のヌクレオチド配列又は目的のコーディング領域はまた、薬学上活性のあるタンパク質、たとえば、増殖因子、増殖調節剤、免疫若しくはワクチン植菌に有用な抗体、抗原及びその断片、又はその誘導体をコードする遺伝子を含んでもよい。そのようなタンパク質には、ＩＬ−１〜ＩＬ−２４、ＩＬ−２６及びＩＬ−２７、サイトカイン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又はこれらの組み合わせ、インターフェロン、たとえば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、血液凝固因子、たとえば、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、又はｔＰＡｈＧＨ、受容体、受容体作動薬、抗体、神経ポリペプチド、インスリン、ワクチン、たとえば、上皮増殖因子、角化細胞増殖因子、形質転換増殖因子、増殖調節剤のような、しかし、これらに限定されない増殖因子、抗原、自己抗原、その断片、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

目的の遺伝子が、植物体にとって直接又は間接的に毒性である産物をコードするのであれば、本発明の方法を使用することによって、目的の遺伝子を指向された組織内又は植物体の生育の所望の段階で選択的に発現させることによって、植物体全体にわたってそのような毒性を低減してもよい。

目的のコーディング領域又は目的のヌクレオチド配列は、形質転換される、又は本発明のヌクレオチド配列、核酸分子、又は遺伝構築物を含む好適な植物体宿主で発現されてもよい。好適な宿主の例には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、並びにカノーラ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、ジャガイモ、朝鮮ニンジン、エンドウ豆、カラスムギ、コメ、大豆、小麦、大麦、ヒマワリ、及び綿を含む農作物が挙げられるが、これらに限定されない。

植物体におけるシアル酸の合成、たとえば、Ｎｅｕ５Ａｃの合成は、組み換えＮｅｕ５Ａｃリアーゼ又はＮｅｕ５Ａｃシンターゼを発現させることによって実証された。Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＮｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＣ．ｊｅｊｕｎｉに由来するＮｅｕＢ２はそれぞれ、アグロバクテリウムが介在した形質転換によって、又は植物細胞で一過性に発現させた場合、タバコＢＹ２細胞、アルファルファ植物体の細胞質で発現された。組換えタンパク質の分解が認められなかったということは、この区分で酵素が安定であることを示している。ＢＹ２細胞で発現されたＮｅｕ５Ａｃリアーゼは、可逆的反応にてＮｅｕ５ＡｃのＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩への開裂を触媒することができた。ピルビン酸塩とＭａｎＮＡｃの存在下でＮｅｕ５Ａｃの合成も認められた。植物体の細胞質のｐＨ及び最も重要な作物の温度に一致するｐＨ７及び２５〜３７℃にてＮｅｕ５Ａｃリアーゼは生物学的に活性があった。さらに、外因性Ｎｅｕ５Ａｃの存在下で行われた供給実験によって酵素が植物体で機能的であることが明らかにされた。

Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼである、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＮｅｕＢ２は、タバコＢＹ２で発現された場合、Ｄ−ＭａｎＮＡｃとＰＥＰの存在下でＮｅｕ５Ａｃを合成することが認められた。アルファルファ植物体でのＮｅｕＢ２の発現によって結果として機能的酵素の蓄積が生じた。従って、植物体における微生物のＮｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕ５Ａｃシンターゼの発現は結果として、Ｎｅｕ５Ａｃを合成できる酵素の細胞質での産生を生じる。

適切なアミノ糖基質と共にＮｅｕ５Ａｃリアーゼ又はＮｅｕ５Ａｃシンターゼを供給するために、内因性ＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃに変換することができるエピメラーゼを植物体で共発現させてもよい。この点で、タバコＢＹ２細胞における機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターの発現が報告されている（Ｍｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。ＮｅｕＢ２と共にＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、又はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ及びＮｅｕ５Ａｃトランスポーターの両方を共発現させることによって、Ｎｅｕ５Ａｃの産生を高めてもよい。Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の植物体内での合成は幾つかの方法によって達成されてもよい。たとえば、不可逆的反応にてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃに変換するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２エピメラーゼ、たとえば、細菌のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２エピメラーゼを植物体内で発現させることによってＭａｎＮＡｃを合成してもよい。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−グリカン合成経路を供給するので細胞質に存在する。そのほかの供給元からのＧｌｃＮＡｃ２エピメラーゼを発現させることによってＭａｎＮＡｃの合成を達成してもよい。或いは、ＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートを形成し、その後、ホスファターゼで加水分解してもよい（トランスジェニック植物体中で）。このアプローチによって、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェート２エピメラーゼ、たとえば、微生物のＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェート２エピメラーゼ又は哺乳類のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃキナーゼが植物体内で発現される。

細胞質のシアル酸からのＮ−グリカンのシアル化を確実にするには、細菌又は哺乳類のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ、哺乳類のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーター、哺乳類のガラクトシルトランスフェラーゼ及び哺乳類のシアリルトランスフェラーゼを植物体内で共発現してもよい（Ｍｉｓａｋｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ２００６）。

以下の実施例にて本発明をさらに説明する。

方法
合成ＦＬＡＧ配列ポリペプチド（Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：配列番号１）に対するポリクローナル抗体をＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）のウサギで調製した。Ｃ_１８Ｂｏｎｄ−ＥｌｕｔカートリッジはＶａｒｉａｎ（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ， ＴＸ）から得た。タバコ細胞及びＭ．ｓａｔｉｖａのクローニング実験及び形質転換には、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＤＨ−５α及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４を用いた。Ｇｏｍｏｒｄら（１９９８）で記載されたように、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ２（ＢＹ２）細胞を増殖させた。

（Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕＢ２の遺伝子のクローニング及び植物体の発現ベクターの構築）
Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕＢ２の遺伝子をＰＣＲで増幅した。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼの遺伝子は、以下のプライマーを用いたＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉのＫ１ゲノムＤＮＡから増幅させた：
リアーゼＰ１：
５’−ＡＡＴＡＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＡＣＧＴＧＧ−３’（配列番号６）、および
リアーゼＰ２：
５’−ＡＡＴＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴ−３’（配列番号７）。
ｎｅｕＢ２遺伝子については、以下のプライマーを用いてＤＮＡ断片を得た：
ｎｅｕＢ２−Ｐ１：
５’−ＡＡＴＡＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣ−３’（配列番号８）、および
ｎｅｕＢ２−Ｐ２：
５’−ＡＡＴＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＡＣＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号９）。

これら増幅したＤＮＡを、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ遺伝子用のプラスミドベクターｐＤＮＲ−ＬＩＢ及びｎｅｕＢ２遺伝子用のバイナリープラスミドベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの下に置いた。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）ターミネーターの発現カセットをカナマイシン耐性遺伝子と共に植物発現ベクターｐＢＬＴＩ１２１（Ｐａｇｎｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に導入した。

ｐＢＬＴＩＮｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧ及びｐＢＬＴＩｎｅｕＢ２−ＦＬＡＧプラスミドを生成するために、タンパク質のＣ末端にコードされたＦＬＡＧペプチドで遺伝子を増幅するように設計された以下の４つのプライマーを用いた：
リアーゼ−ＦＬＡＧ−Ｐ１：
５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＡＣＧＴＧＧＣ−３’（配列番号２）、および
リアーゼ−ＦＬＡＧ−Ｐ２：
５’−ＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＣＣＣＧＣＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号３）、
ｎｅｕＢ２−ＦＬＡＧ−Ｐ１：
５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号４）、および
ｎｅｕＢ２−ＦＬＡＧ−Ｐ２：
５’−ＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号５）。

以下のプログラム：９４℃にて１分間の変性、５８℃にて１分間のアニーリング及び７２℃にて３分間の重合を３０サイクルによるＰＣＲによってこれらの増幅された配列を生成した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢＬＵＮＴＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてクローニングした。植物細胞で組換えタンパク質を発現する前に、我々は、配列決定によって修飾したｃＤＮＡ構築物すべてを確認した。その後、挿入物をＫｐｎＩとＳａｃＩで消化し、ＫｐｎＩ−ＳａｃＩで消化したｐＢＬＴＩ１２１にクローニングした。熱ショック形質転換を介して、各ベクター（ｐＢＬＴＩ１２１又はｐＣＡＭＢＩＡ２３００）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＬＢＡ４４０４株に導入した。

（ＢＹ２細胞における発現）
タバコＢＹ２細胞は、ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇ（１９６２）の培地で維持し、形質転換に用いた。ｐＢＬＴＩ１２１に由来する構築物をアグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）（Ｈｏｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， １９８８）に移入した。１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＹＥＢ培地にてトランスジェニックアグロバクテリウム細胞を選抜し、Ｇｒｏｍｏｒｄら（１９９８）で記載されているように浮遊培養しているタバコの細胞を形質転換するのに用いた。抗生剤（カナマイシン１００μｇ／ｍＬ及びセフォタキシム２５０μｇ／ｍＬ）を含有するＭＳ培地にて形質転換体を選抜し、維持した。各形質転換体からゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲによって目的の遺伝子がタバコの浮遊培養細胞に挿入され、そこで発現されていることを確認した。免疫スクリーニングの後、組換えタンパク質を産生している微小カルスを用いてトランスジェニック細胞の浮遊培養を開始した（Ｇｏｍｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。

（アルファルファ植物体における発現）
以下の改変と共に、Ｔｉａｎら（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）に記載されるように本質的に、アルファルファの形質転換を行った。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡＧＬ１を用いて、アルファルファ遺伝子型Ｒ２３３６を形質転換した。共培養の工程は、０．８〜１のＯＤで未稀釈の培養物と共に行い、１．５％スクロースの代わりに３％のスクロースをＳｈ２Ｋ培地で使用した。

（Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕＢ２の活性をアッセイするための細胞抽出物の調製）
４日間培養したＢＹ２浮遊培養細胞１ｇ又はＭ．ｓａｔｉｖａの新鮮な葉６００ｎｇを回収して、プロテイナーゼ阻害剤（ペプスタチン１μｇ／ｍＬ、Ｅ６４：１μｇ／ｍＬ及びＰＭＳＦ：１ｍＭ、シグマ）を含有する溶液Ａ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）にて粉砕した。細胞抽出物を４℃にて１００００ｇで１０分間遠心し、硫酸アンモニウム（最終濃度８０％）でタンパク質を沈殿させ、スペクトラ／Ｐｏｒ（１００００Ｄａで切り捨て）と共に、溶液Ｂ（Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼアッセイ用には１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）又はＮｅｕＢ２用にはｐＨ＝８．５、及び１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）に対して透析した。次いで、タンパク質を酵素アッセイ又は免疫検出に利用した。

（Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧ及びＮｅｕＢ２−ＦＬＡＧの免疫検出）
変性緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３％のβ−メルカプトエタノール、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール及び１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）にてタンパク質を可溶化し、５分間煮沸して、１５％ポリアクリルアミドゲル中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した。免疫検出のために、ＦＬＡＧエピトープに対して生成したウサギ抗血清によって膜を探査した。西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、続いて４−クロロナフトールを用いた顕色又は化学発光反応によってタンパク質を検出した。

（Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びシンターゼのアッセイ）
可溶性の酵素活性は、４ｍＭのＰＥＰ、４ｍＭのＮＡＤＨ、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３及び１０ｍＭのＤＴＥと共に細胞抽出物をインキュベートすることによって測定される。１０分後、３４０ｎｍでの吸収の減少によってＮＡＤＨの酸化を測定した。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼのリアーゼ活性は、形質転換体細胞抽出物をＮｅｕ５Ａｃと共にインキュベートした後、ＭａｎＮＡｃの形成を測定することによってアッセイした。プロテイナーゼ阻害剤（ペプスタチン１μｇ／ｍＬ、Ｅ６４：１μｇ／ｍＬ及びＰＭＳＦ：１ｍＭ、シグマ）及び４０ｍＭのＮｅｕ５Ａｃを含有する溶液Ｂ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）にて３７℃で細胞抽出物を２時間インキュベートした。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼのシンターゼ活性は、形質転換体細胞抽出物をＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩と共にインキュベートした後、Ｎｅｕ５Ａｃの形成を測定することによってアッセイした。プロテイナーゼ阻害剤（ペプスタチン１μｇ／ｍＬ、Ｅ６４：１μｇ／ｍＬ及びＰＭＳＦ：１ｍＭ、シグマ）及び２０ｍＭのＭａｎＮＡｃと４０ｍＭのピルビン酸塩を含有する溶液Ｂ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）にて３７℃で細胞抽出物を２時間インキュベートした。ＮｅｕＢ２のシンターゼ活性は、形質転換体細胞抽出物をＭａｎＮＡｃとＰＥＰと共にインキュベートした後、Ｎｅｕ５Ａｃの形成を測定することによってアッセイした。プロテイナーゼ阻害剤（ペプスタチン１μｇ／ｍＬ、Ｅ６４：１μｇ／ｍＬ及びＰＭＳＦ：１ｍＭ、シグマ）及び１０ｍＭのＭａｎＮＡｃと１０ｍＭのＰＥＰを含有する溶液Ｂ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）にて３７℃で細胞抽出物を２時間インキュベートした。８０℃にて５分間加熱することによって反応を停止し、Ｃ_１８Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｎｔカートリッジにて水による連続溶出によって精製し、ＧＣ−ＥＩ−ＭＳ分析用に凍結乾燥して得た。

（供給実験）
４日間培養したタバコＢＹ２細胞を１０ｍＭのＮｅｕ５Ａｃ又は３０ｍＭのＭａｎＮＡｃと共にＢＹ２培地中で３７℃にて２日間インキュベートし、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ又はＮｅｕ５Ａｃシンターゼのｉｎ ｖｉｖｏでの活性をアッセイした。２日後、Ｎｅｕ５Ａｃ又はＭａｎＮＡｃを含まないＢＹ２培地でＢＹ２細胞を洗浄し、回収した。７０％エタノール中にて７０℃で１５分間加熱し、酵素を不活化し、次いで陶器のホモゲナイザーで粉砕した。７０℃にて７０％エタノールで２回、ホモジネートを洗浄した。残ったペレット及び上清をそれぞれ、細胞壁及び細胞質の遊離の単糖類の代表とみなした。次いで、ガスクロマトグラフィによって上清分画の単糖類を分析した。

（ＧＣ分析）
酵素のアッセイについては、反応混合物を先ずＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジにおける精製工程に提示した。単糖類は１００％の水中に溶出された。凍結乾燥の後、５００μＬの２Ｍの無水メタノール−ＨＣｌによる８０℃での１６時間の加メタノール分解に試料を提示した。メタノールを蒸発した後、２０μＬの無水酢酸及び２０μＬのピリジンを添加することによって試料を再びアセチル化した。得られたＮ−アセチルメチルグリコシド（メチルエステル）を乾燥し、次いでそのＴＭＳ−誘導体に変換し、ガスクロマトグラフィで分離した。ガスクロマトグラフは、水素炎イオン化検出器、固定相としてのＣＰ−Ｓｉｌ５ＣＰを伴ったＷＣＯＴ溶融石英のキャピラリーカラム（長さ２５ｍ、ｉ．ｄ．０．２５ｍｍ）及びガスベクターとしてのヘリウムを備えていた。オーブンの温度プログラムは、１２０℃にて２分間、１分間当たり１０℃で１６０℃まで、１分間当たり１．５℃で２２０℃まで、次いで１分間当たり２０℃にて２８０℃までであった。ピークの積分及び標準の単糖類によって確立された反応因子を用いた相当する分子の値の決定によって糖の定量を行った。

（植物における一過性発現）
（アグロバクテリウムの増殖）
上述の所望のＤＮＡ構築物を担うバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムのクローンは、それぞれ２５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及びカナマイシンを含有する２ｍＬのＹＥＢ培地又はＬＢ培地にて２８℃で２４時間増殖させた。これら培養物１０μＬを出発植菌として用いて、２５ｍＬのＹＥＢ誘導培地（ＹＥＢ培地、ｐＨを５．６に調整した１０ｍＭの２（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２０μＭのカナマイシン）の培養を生成した。回転振盪器（２２０ｒｐｍ）インキュベーターにて２８℃で１８時間、又は６００ｎｍでの光学密度が０．８〜１に達するまで後者を増殖させた。

（非トランスジェニックタバコの生育）
温室にてＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの植物体を泥炭系基材中で種子から生育させた。苗木は当初苗床で育て、その後ポットに移した。植物体には一日２回水を与え、各散布にて１８０ｐｐｍの窒素を与えた。温室の条件は、植物体のレベルで２０ワット／ｍ^２の人工照明にて長日条件（１６時間明／８時間暗のサイクル）のもと、昼間２５℃及び夜間２１℃に保持された。様々な生育段階で植物体を利用することができるが、５〜８週の生育にて優先的に選択された。

（タバコにおける構築物の一過性の発現）
本発明では２つの一過性の発現の方法：アグロ−植菌又はアグロ浸潤が使用された。両方の方法では、目的の転移ＤＮＡ（ｔ−ＤＮＡ）を担う２つ又は３つのアグロバクテリウムの培養物の混合物が、葉の細胞間間隙に入ることが強いられる。上皮の物理的障壁をいったん越境すると、アグロバクテリウムは近隣の細胞に感染し、植物細胞にｔ−ＤＮＡのコピーを転移させる。この方法によって、核内のｔ−ＤＮＡの継代は一過性であり、ｔ−ＤＮＡに存在する遺伝子はエピソームに転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞における目的のタンパク質の産生がもたらされる。アグロ浸潤が制御された減圧を用いるのに対して、アグロ植菌法は、シリンジによる加圧を用いてアグロバクテリウム混合物を植物体の内部に挿入する。

前に記載されたように調製されたアグロバクテリウムの培養物を、１００００ｇにて８分間遠心し、同一容量の植菌培地（ｐＨ５．６に調整され、１００μＭのアセトシリンゴンで補完された１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭＥＳ）に再浮遊し、植菌に先立って室温（ＲＴ、２３℃）にて１時間保持した。或いは、植菌に先立って４℃にて２４時間、浮遊物を保持した。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＮ．ｔａｂａｃｕｍの一過性の形質転換は、以下の改変と共に、Ｌｉｕ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０５：３４３−３４８）に記載されたように本質的に行った。上述の構築物の発現のために、２種のアグロバクテリウム株の混合物を植菌した。第１の株は上述のクローンの１つを含有し、第２の株は、３５Ｓプロモーターの制御のもとでジャガイモウイルスＹからのサイレンシングのＨｃＰｒｏサプレッサーを含有した。植菌後、植物体を温室でインキュベートした。温度は、昼間、最低２３℃及び夜間２１℃に保持された。植物体には一日２回水を与え、各散布にて１８０ｐｐｍの窒素を与えた。バイオマスの回収は、４〜８日後に行った。

（形質転換されたバイオマスからの可溶性タンパク質抽出物の調製）
バイオマスを回収した後、又は−８０℃にて凍結した後、葉を直接分析した。約０．１〜１ｇのアグロ−植菌された又はアグロ−浸潤させた葉のバイオマスを秤量し、総タンパク液抽出物の生成に使用した。

幾つかの抽出方法を用いて、乳鉢と乳棒によって植物組織を粉砕することによって、ポリトロンを用いることによって、又はＲｅｔｓｃｈ製のＭｉｘｅｒＭｉｌｌ３００（ＭＭ３００）にて粉砕することによって総タンパク抽出物を生成した。０．１〜１ｇの植物バイオマスを清浄で予備冷却した乳鉢に移した。冷却した抽出緩衝液（２ｍＭのＣａＣｌ_２及び４％のブタノールを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を１：３（ｗ／ｖ）の定量にて加え、同様に最終濃度、それぞれ１ｍＭ及び１０μＭのＰＭＳＦ及びキモスタチンを加えた。均質な調製物が得られるまで、乳棒で葉を粉砕した。次いで植物抽出物を１．５ｍＬの微量チューブに移し、４℃にて２０，０００ｇで２０分間遠心した。或いは、０．１ｇの植物組織を０．３ｍＬの抽出緩衝液と共に非滅菌の１．５ｍＬの微量チューブに導入した。各チューブにタングステンビーズを加えた。３０Ｈｚでの３分間の撹拌サイクルにボックスを提示した。サイクルを２回繰り返した。次いで、植物抽出物を上述のように遠心した。或いは、ポリトロンを用いて、１ｇのバイオマスを３ｍＬの抽出緩衝液と共に粉砕した。

遠心に続いて、上清を清浄な微量チューブに移し、氷上に保持した。最終的に、ＢＳＡを参照タンパク質として用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法によって個々のタンパク抽出物の総タンパク質含量を測定した。

（実施例１）
（タバコＢＹ２細胞におけるＥ．ｃｏｌｉのＮｅｕ５Ａｃリアーゼの発現）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ１（受入番号：Ｄ０００６７）由来のＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードする遺伝子をタバコＢＹ２細胞に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１のＮｅｕ５Ａｃリアーゼを含有するプラスミドｐＢＬＴＩ１２１によるアグロバクテリウムを介在させた形質転換の後、トランスジェニックＢＹ２のカルスを生成した。別の構築物はそのＣ末端にＦＬＡＧエピトープでタグを付け、形質転換体における組換えタンパク質を免疫的に検出できるようにした。カナマイシン耐性によって選抜された形質転換体をｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ転写物を発現している４８形質転換体から３６及びＮｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧ転写物を発現している５０形質転換体から３０が得られた。さらに高いｍＲＮＡの発現レベルを抱くカルスを、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ活性の性状分析用の浮遊培養に移した。Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧの存在は、ウエスタンブロット分析によって、形質転換されたＢＹ２細胞の細胞質タンパク質抽出物にて割り出された。抗ＦＬＡＧ抗体を用いて形質転換した細胞にて３２ｋＤａの見かけのＭＷを持つ単一のタンパク質バンドが特異的に免疫検出された（図１ａ）。

Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼ及びＮｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧを発現している浮遊培養されたＢＹ２細胞の可溶性タンパク抽出物にて酵素的分析を行った。抽出物は両方共にリアーゼ活性を示した。タグの付いていないリアーゼを発現している細胞から単離されたタンパク抽出物にてさらなる分析を実施した。先ず、これらの抽出物をＮｅｕ５Ａｃの存在下でインキュベートしてリアーゼ活性を調べた。図１ｂ及び１ｃは、ｐＨ７及び３７℃にてＮｅｕ５Ａｃの非存在下（図１ｂ）又は存在下（図１ｃ）にてＮｅｕ５Ａｃリアーゼタンパク質抽出物をインキュベートすることによって形成された最終産物のＧＣ特性を示す。抽出物をＮｅｕ５Ａｃと共にインキュベートした場合、３つのシグナル（ピーク１は内因性シグナルの肩部である）が明瞭に検出された。これらのシグナルは、標準のＭａｎＮＡｃのピラノース型（ピーク１）及びフラノース型（ピーク２及び３）に類似する保持時間で溶出した。試料の電子衝撃質量分析（ＧＣ−ＥＩ ＭＳ）と併せたガスクロマトグラフィによって、これらシグナルがＭａｎＮＡｃｐ（図１ｅ）及びＭａｎＮＡｃｆ（図１ｆ）の１−Ｏ−メチルペルシリル誘導体に対するシグナルに割り振られることが確認された。ｍ／ｚ＝１７３及び１８６での特徴的なイオンは、普通、アミノ糖について認められるような窒素原子を含有する断片に割り振られた。

同様の条件で野生型のタバコＢＹ２細胞に由来する細胞質のタンパク抽出物をＮｅｕ５Ａｃとインキュベートしても、ＭａｎＮＡｃを形成しなかった（データを示さず）ということは、植物体において内因性のリアーゼが存在しないことを実証している。このデータは、Ｅ．ｃｏｌｉのＮｅｕ５Ａｃリアーゼ遺伝子によって形質転換されたＢＹ２細胞が、Ｎｅｕ５ＡｃをＤ−ＭａｎＮＡｃに開裂できる機能的な酵素を発現したことを示している。

組換え酵素の最適ｐＨは、４〜１０のｐＨの範囲で実施されたアッセイにおいて生成されたＤ−ＭａｎＮＡｃのＧＣの定量化に基づいて約７であることが明らかにされた（データは示さず）。さらに、組換え酵素は、２５〜３７℃の範囲で見られる高いリアーゼ活性を持つ温度依存性の活性を示した。ｐＨ７及び３７℃にて、形質転換細胞に由来する可溶性タンパク質抽出物は１時間で、１０μＭのＮｅｕ５Ａｃから０．５μＭのＭａｎＮＡｃを形成した。１５℃未満では、残留する活性のみが検出された。

ｐＨ７及び３７℃にてＤ−ＭａｎＮＡｃ及びピルビン酸塩と共に、形質転換されたタバコＢＹ２細胞のタンパク抽出物をインキュベートすることによってＮｅｕ５Ａｃを合成する組換えＮｅｕ５Ａｃリアーゼの能力が割り出された。図２ａ及び図２ｂはそれぞれ、基質の非存在下又は存在下でインキュベートした後の最終産物のＧＣ特性を示す。対照の特性（図２ａ）と比べた場合、Ｄ−ＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩の存在下で行った反応のＧＣ特性は、Ｎｅｕ５Ａｃについて予測される保持時間でシグナルを示した（図２ｂでの四角）。このシグナルの電子衝撃質量スペクトル（ＥＩ−ＭＳ）（図２ｃ）は、窒素含有断片に割り当てられたｍ／ｚ＝１８６でのイオンと同様にＮｅｕ５Ａｃ断片に特異的なｍ／ｚ＝２９８及び４２０での特徴的なイオンを示した。このデータは、組換えリアーゼがＤ−ＭａｎＮＡｃとピルビン酸塩の存在下でＮｅｕ５Ａｃを合成することができることを示している。

１０ｍＭのＮｅｕ５ＡｃをタバコＢＹ２細胞に供給することによってＮｅｕ５Ａｃリアーゼの植物体での活性を測定した。Ｎｅｕ５ＡｃのタバコＢＹ２細胞に対する毒性を調べたところ、ヨウ化プロピジウム及びフルオレセインジアセテートを用いて細胞の生存率を調べることによって４８時間にわたって毒性効果は認められなかった。２３℃〜３７℃の範囲の温度で４８時間後のＧＣにより細胞質の単糖類を分析することによってＤ−ＭａｎＮＡｃの形成を測定した。Ｄ−ＭａｎＮＡｃはあらゆる処理で検出された（図１ｄ）。ＧＣによるＤ−ＭａｎＮＡｃの定量は、２３℃に比べて３７℃にてこのアミノ糖の含量で２５倍の増加を示した。これらｉｎ ｖｉｖｏの実験は、Ｎｅｕ５Ａｃリアーゼが植物体で生物学的に活性を持ち、外因的に供給された基質に作用することができることを明らかにしている。

（タバコＢＹ２及びアルファルファ植物体におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｏｒ ｊｅｊｕｎｉのＮｅｕＢ２の発現）
Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼである、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｏｒ ｊｅｊｕｎｉに由来するＮｅｕＢ２（受入番号：ＮＣ００２１６３）は、ＭａｎＮＡｃとＰＥＰの縮合によるＮｅｕ５Ａｃの形成を触媒する。ｎｅｕＢ２のＤＮＡを含有するプラスミドｐＢＬＴＩ１２１によるアグロバクテリウムが介在する形質転換の後、トランスジェニックＢＹ２カルスを生成した。タンパク質の免疫的検出のために、第２の構築物にはそのＣ末端にＦＬＡＧエピトープによるタグを付けた。カナマイシン耐性について選抜した形質転換体をＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで分析した。最も高いｍＲＮＡ発現レベルを抱くカルスを分析用の浮遊培養に移した。次いで、ＮｅｕＢ２−ＦＬＡＧの配列によって形質転換されたＢＹ２細胞から単離した可溶性タンパク抽出物のウエスタンブロット分析によって形質転換されたＢＹ２細胞におけるＮｅｕＢ２の蓄積を測定した。図３ａで説明されるように、抗ＦＬＡＧ抗体は、シンターゼの予測分子量と一致するＭＷ＝３７ｋＤａにて単一タンパク質バンドを特異的に認識した。ｎｅｕＢ２はまた、アグロバクテリウムが介在する形質転換及びｉｎ ｖｉｔｒｏの植物体の再生によってアルファルファ植物体にも導入された（Ｔｉａｎ ａｔ ａｌ．， ２００２）。３４の形質転換された植物体から、２９がｎｅｕＢ２の転写物を発現していることが明らかにされた。

細菌のＮｅｕ５Ａｃシンターゼを発現している、形質転換された細胞及び植物体を分析する前に、内因性のＮｅｕ５Ａｃシンターゼ活性の存在を調べた。野生型のタバコＢＹ２細胞及びアルファルファ植物体から得た可溶性タンパク抽出物をＤ−ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰと共にインキュベートした。アッセイで形成された単糖類をＧＣによって分離し、ＧＣ−ＥＩ−ＭＳによって性状分析した。Ｎｅｕ５Ａｃに割り当てられたピーク及びＥＩ−ＭＳでの特徴的なイオンが検出されなかったということは、植物体がＰＥＰとＭａｎＮＡｃを縮合してＮｅｕ５Ａｃを形成することができる内因性の酵素を発現していないことを示している。

ｎｅｕＢ２遺伝子によって形質転換されたタバコＢＹ２細胞及びアルファルファ植物体から単離した可溶性タンパク抽出物と共にＤ−ＭａｎＮＡｃとＰＥＰをインキュベートすることによって植物体で発現された組換えＮｅｕＢ２のシンターゼ活性を測定した。図３ｂ及び３ｃは、ｐＨ８及び３７℃にてＤ−ＭａｎＮＡｃとＰＥＰの非存在下（図３ｂ）又は存在下（図３ｃ）で形質転換されたアルファルファ抽出物をインキュベートすることによって得たＧＣ特性を示す。シンターゼの基質と共にインキュベートした後、Ｎｅｕ５Ａｃについて予測される保持時間にて溶出されたピークが特異的に検出された。このピークのＥＩ−ＭＳは、ｍ／ｚ＝２９８及び４２０で特徴的なイオンと共に、標準のＮｅｕ５Ａｃの１つに類似する断片化パターンを示した。Ｄ−ＭａｎＮａｃの非存在下でインキュベートした後のＧＣ特性の相当する領域のＥＩ−ＭＳスペクトルにはそれらのイオンは検出されなかった（図３ｂ）。

Ｎｅｕ２Ｂ又はＮｅｕ２Ｂ−ＦＬＡＧ配列を発現しているタバコＢＹ２細胞の分析によって同じ結果が得られた。

従って、タバコＢＹ２細胞及びアルファルファ植物体両方におけるｎｅｕＢ２の発現は、結果として機能的なＮｅｕ５Ａｃシンターゼの産生を生じる。

引用はすべて参照によって本明細書に援用される。

１以上の実施態様に関して本発明を説明してきた。しかしながら、クレームで定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく多数の変化及び改変が可能であることが、当業者に明らかになるであろう。

図１ａは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた、野生型（ライン１）又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼ−ＦＬＡＧを発現しているトランスジェニックタバコＢＹ２細胞（ライン２）から抽出した可溶性タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。図１ｂ及び図１ｃは、Ｎｅｕ５Ａｃを発現しているタバコＢＹ２から単離された細胞質タンパク質を単独で（図１ｂ）又はＮｅｕ５Ａｃと共に（図１ｃ）ｐＨ７にて３７℃でインキュベートした後、得られた最終産物のガスクロマトグラフィの特性を示す。図１ｄは、１０ｍＭの外因性Ｎｅｕ５Ａｃと共に３７℃にて４８時間養ったＮｕｅ５Ａｃを発現しているタバコＢＹ２細胞の細胞質単糖類のＧＣ特性を示す。図１ｅ及び図１ｆは、特性（図１ｃ）で検出されたピーク１（図１ｅ）並びにピーク２及び３（図１ｆ）の電子衝撃質量スペクトルを示す。Ｄ−ＭａｎＮＡｃの１−Ｏ−メチルペルシリル誘導体の主要な断片イオンが示される。 図２ａ及び図２ｂは、Ｎｅｕ５Ａｃを発現しているタバコＢＹ２から単離された細胞質タンパク質を単独で（図２ａ）又はＤ−ＭａｎＮＡｃ及びピルビン酸塩と共に（図２ｂ）ｐＨ７にて３７℃でインキュベートした後、得られた最終産物のガスクロマトグラフィの特性を示す。図２ｃは、特性（図２ｂ）で現れているピークの電子衝撃質量スペクトルを示す。Ｎ−アセチルノイラミン酸の１−Ｏ−メチルメチルエステルペルシリル誘導体の主要断片イオンが示される。 図３ａは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた、野生型（ライン１）又はＮｅｕＢ２−ＦＬＡＧを発現しているトランスジェニックタバコＢＹ２細胞（ライン２）から抽出した可溶性タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。図３ｂ及び図３ｃは、ＮｅｕＢ２を発現しているアルファルファ植物体の葉から単離された可溶性タンパク質を単独で（図３ｂ）又はＤ−ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰと共に（図３ｃ）ｐＨ８にて３７℃でインキュベートした後、得られた最終産物のガスクロマトグラフィの特性を示す。図３ｄは、特性（図３ｃ）で現れているピークの電子衝撃質量スペクトルを示す。Ｎ−アセチルノイラミン酸の１−Ｏ−メチルメチルエステルペルシリル誘導体の主要断片イオンが示される。

Claims (5)

1. シアル酸を合成する方法であって、
   ｉ）細菌のＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）シンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードする核酸配列からなるヌクレオチド配列を含む形質転換植物体を提供する工程であって、該ヌクレオチド配列は、該植物体中で活性のある調節領域と作動可能に連結されている、工程、
   ｉｉ）該形質転換植物体を生育させ、該ヌクレオチド配列を発現させ、それによってシアル酸を合成する工程
   を包含する、方法。
2. 前記シアル酸がＮｅｕ５Ａｃであり、前記生育させる工程の後、該Ｎｅｕ５Ａｃが前記形質転換植物体から回収される、請求項１に記載の方法。
3. 前記調節領域が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び発育プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. シアル酸を合成する方法であって、
   細菌のＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）シンターゼ又はＮｅｕ５Ａｃリアーゼをコードする核酸配列からなるヌクレオチド配列によって植物体又は該植物体の一部を一過性に形質転換する工程であって、該ヌクレオチド配列は、該植物体で活性のある調節領域と作動可能に連結されている、工程と、
   該ヌクレオチド配列を発現させ、それによってシアル酸を合成する工程と
   を包含する、方法。
5. 前記シアル酸がＮｅｕ５Ａｃであり、前記発現する工程の後、前記Ｎｅｕ５Ａｃが前記植物体又は前記植物体の一部から回収される、請求項４に記載の方法。

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