ES2348857T3 - Mejoras en o relacionadas con la produccion de proteinas. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una proteína de mamí-fero glucosilada exógena que comprende al menos un resto de ácido siálico en una célula briofítica transformada, 5 que comprende: i) introducir en una célula briofítica seis secuen-cias de ácido nucleico aisladas, que comprenden cada una una secuencia de ácido nucleico operablemente en-10 lazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que las dichas seis secuencias de ácido nucleico aisladas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célula briofítica, en el que las mencionadas seis proteínas 15 funcionales son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transporta-20 dor de ácido CMP-siálico de mamífero, una galactosil-transferasa, y una sialiltransferasa de mamífero; o usar una célula briofítica que ya se ha transformado y es capaz de expresar dichas seis proteínas funcio-nales; y 25 ii) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende una secuen-cia de ácido nucleico operablemente enlazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicha secuencia de ácido 30 nucleico codifica dicha proteína de mamífero exógena; o usar una célula briofítica que ya se ha transforma- do y es capaz de expresar dicha proteína de mamífero exógena; y, opcionalmente, iii) recuperar, purificar o aislar dicha proteína de mamífero glucosilada que comprende al menos un resto de ácido siálico a partir de dicha célula briofítica. 5

Description

Antecedentes

La presente invención se refiere a un método para 5 producir proteínas glucosiladas heterólogas en células briofíticas transformadas. En particular, el método se refiere a un método para producir proteínas glucosiladas, que comprende patrones de glucosilación animal – que com-prenden restos de ácido siálico -, tales como proteínas 10 farmacéuticas para uso en mamíferos, por ejemplo seres humanos, en células briofíticas tales como las de Physco-mitrella patens; al material genético requerido para ello, tal como ADN y ARN, vectores, células hospedantes; a métodos para introducir material genético allí dentro; 15 y a sus usos. Adicionalmente, la presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y proteínas obtenidos me-diante el método según la invención. Además, la presente invención proporciona un método para producir ácido siá-lico o CMP-ácido siálico en una célula briofítica, tejido 20 u organismo transformado.

Las plantas son organismos apropiados para la pro-ducción de un amplio intervalo de proteínas recombinantes (Ma et al. (2003) Nat Gen 4, 794-805). En términos de proteínas farmacéuticas para uso en mamíferos, incluyendo 25 seres humanos, a menudo se requieren modificaciones post-traduccionales, tales como la glucosilación. Sin embargo, un problema encontrado en sistemas de células eucariotas que se han transformado con genes heterólogos adecuados para la producción de secuencias proteicas destinadas pa-30 ra uso, por ejemplo, como fármacos en seres humanos, es que el patrón de glucosilación en tales proteínas adquie-

re a menudo un patrón nativo, esto es, el sistema de células eucariotas en el que se ha introducido la proteí-na: se producen proteínas glucosiladas que comprenden pa-trones de glucosilación no animales, es decir, por ejem-plo, no mamíferos, y estos a su vez pueden ser inmunogé-5 nicos y/o alergénicos si se aplica en animales, tales co-mo mamíferos, por ejemplo seres humanos.

Comparadas con las glucoproteínas derivadas de mamíferos, las glucoproteínas específicas de plantas con-tienen dos restos adicionales. En el pasado, el uso de 10 glucoproteínas recombinantes producidas por plantas esta-ba limitado por la N-glucosilación específica de plantas que se adquiere en tales proteínas. En el caso de briófi-tos, Koprivova et al. ((2004), Plant Biotechnol J 2, 517-523), y en el caso de semillas de plantas, Strasser et 15 al. ((2004) FEBS Lett. 561, 132-136)) tuvieron éxito en superar esta limitación usando diferentes enfoques. Las plantas generadas en los dos estudios mostraron una N-glucosilación compleja que carece de los dos restos de azúcar específicos de plantas mencionados anteriormente. 20

Además, en las plantas no se encuentran los restos de beta 1,4-galactosa terminales de glucoproteínas vege-tales, indicando que una beta 1,4-galactosiltransferasa no está presente en las plantas. Se ha descrito la inte-gración estable y expresión de esta enzima en plantas de 25 tabaco (Bakker et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 , 2899-2904), en células BY2 del tabaco (Palacpac et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4692-4697) así como en briófitos haploides gametofíticos (Huether et al. (2005) Plant Biol 7, 292-299). La beta 1,4-galactosiltransferasa 30 humana recombinante fue funcional, y las proteínas aisla-das del material transgénico mostraron restos de beta

1,4-galactosa terminales.

La presente invención se refiere a la mejora adi-cional de métodos existentes a fin de asegurar que se producen polipéptidos y proteínas con una funcionalidad aún más mejorada en animales, tales como mamíferos. 5

Las estructuras de N-glucano más complejas presen-tes en proteínas de mamíferos, incluyendo proteínas de seres humanos, contienen ácidos siálicos como restos de azúcar terminales. Aunque la presencia de glucoconjugados sialilados en células cultivadas en suspensión no trans-10 génicas de Arabidopsis thaliana fue descrita recientemen-te por Shah et al. ((2003) Nat Biotechnol 21, 1470-1471), estos resultados están bajo discusión (Seveno et al. (2004) Nat Biotechnol 11, 1351-1353).

Sin embargo, la técnica anterior no proporciona 15 ninguna información sobre si la sialilación también tiene lugar en briófitos y puede permitir la expresión recombi-nante de glucoproteínas heterólogas que tienen las carac-terísticas de N-glucano deseadas. Además, no existen da-tos en la técnica anterior en cuanto a la existencia pura 20 de ácido siálico en ningún briófito.

Un requisito previo para la sialilación en N-glucanos es la presencia de ácido neuroamínico activado (CMP NeuAc). En mamíferos, diferentes enzimas están im-plicadas en la síntesis de NeuAc (ácido siálico) – el 25 precursor de CMP NeuAc. La UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa (número de acceso Genbank: AF155663) es responsable de la generación de ManNAc-6P que es procesado por la ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (número de acceso Gen-30 bank: NM_018946) en NeuAc-9P. La enzima responsable del procesamiento de NeuAc-9P en NeuAc no se ha descrito has-

ta ahora. La activación de NeuAc tiene lugar en el núcleo de células de mamíferos. La enzima CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa (número de acceso Genbank: NM_018686) es la responsable de la generación del ácido siálico activado (CMP NeuAc). El producto activado se ha 5 de mover desde el núcleo al aparato de Golgi – en este proceso está implicado el transportador de CMP-ácido siá-lico (número de acceso Genbank: NM_006416). Finalmente, la sililación en N-glucanos tiene lugar mediante la transferencia de CMP NeuAc sobre restos de azúcar termi-10 nales - por ejemplo restos de galactosa enlazados 1,4. A este fin, se ha de asegurar la expresión de una sialil-transferasa (por ejemplo, alfa-2,6 sialiltransferasa; número de acceso NM_003032, Genebank). El briófito Phys-comitrella patens, una planta del suelo no vascular 15 haploide, es capaz de ser usado para la producción de proteínas recombinantes (documento WO 01/25456).

El ciclo de vida de los briófitos está dominado por la generación gametocítica fotoautotrófica. El ciclo de vida es completamente diferente del de las plantas supe-20 riores, en las que el esporofito es la generación domi-nante y hay notablemente muchas diferencias a observar entre plantas superiores y briófitos.

El gametofito de los briófitos se caracteriza por dos etapas de desarrollo distintas. El protonema, que se 25 desarrolla vía crecimiento apical, crece en una red fila-mentosa de sólo dos tipos celulares (células cloronémicas y caulonémicas). La segunda etapa, denominada gametoforo, se diferencia por el crecimiento caulinar a partir de un sistema apical simple. Ambas etapas son fotoautotrófica-30 mente activas. Se ha demostrado el cultivo de protonema sin diferenciación en el gametoforo más complejo para

cultivos en suspensión en matraces así como para cultivos en biorreactores (documento WO 01/25456). El cultivo de tejido multicelular completamente diferenciado y fotoau-totróficamente activo que contiene sólo unos pocos tipos de células no está descrito para plantas superiores. La 5 estabilidad genética del sistema celular briofítico pro-porciona una ventaja importante con respecto a los culti-vos de células vegetales. En cultivos celulares de plan-tas superiores, el metabolismo secundario está más dife-renciado, y esto da como resultado diferencias en los 10 perfiles de metabolitos secundarios.

Además hay algunas diferencias importantes entre briófitos y plantas superiores a nivel bioquímico. La asimilación de sulfato en Physcomitrella patens difiere de aquella en plantas superiores. La enzima clave de la 15 asimilación del sulfato en plantas superiores es adenosi-na 5’-fosfosulfato reductasa. En Physcomitrella patens, coexiste una ruta alternativa vía fosforadenosina 5’-fosfosulfato reductasa (Koprivova et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 32195-32201). Esta ruta no se ha caracterizado 20 en plantas superiores.

Otras diferencias se reflejan en la regeneración de la pared celular. Los protoplastos derivados de plantas superiores regeneran nuevas paredes celulares de manera rápida, independientemente del medio de cultivo. La 25 transferencia directa de ADN vía polietilenglicol (PEG) en protoplastos de plantas superiores requiere la prein-cubación a 4 a 10ºC para ralentizar el proceso de la re-generación de la pared celular (patente US 5.508.184). Por el contrario, la regeneración de la pared celular de 30 protoplastos derivados de protonema de Physcomitrella de-pende del medio de cultivo. Los protoplastos se pueden

cultivar sin regeneración de la pared celular durante largos períodos. Sin querer estar atados por la teoría, parece que la maquinaria de secreción del protoplasto, esencial para la regeneración de la pared celular y glu-cosilación de proteínas, difiere de la de plantas supe-5 riores. Además, Physcomitrella patens muestra una recom-binación homóloga muy eficiente en su AND nuclear, un rasgo único para plantas, lo que permite la interrupción génica dirigida (Girke et al. (1998) Plant J 15, 39-48; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4368-10 4373; Koprivova (2002) J Biol Chem 277, 32195-32201; re-visado por Reski (1999) Planta 208, 301-309; Schaefer y Zryd (2001) Plant Phys 127, 1430-1438; Schaefer (2002) Annu. Rev. Plant Biol.53, 477-501), ilustrando adicional-mente diferencias fundamentales con plantas superiores. 15

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método más eficaz para producir proteínas animales, que comprende patrones de glucosilación animal, y en par-ticular proteínas humanas glucosiladas que comprenden pa-trones de glucosilación humana allí – que contienen res-20 tos de ácido siálico. Es un objeto adicional proporcionar un procedimiento eficaz para la producción de proteínas animales heterólogas que comprenden patrones de glucosi-lación animal, particularmente proteínas humanas que com-prenden patrones de glucosilación humana – que contienen 25 restos de ácido siálico – en briófitos, tales como Phys-comitrella patens.

Estos y otros objetos serán manifiestos a partir de la siguiente descripción y ejemplos proporcionados aquí.

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Descripción Detallada

La célula briofítica de la invención es aquella se-leccionada del grupo que consiste en musgos y hepáticas, de la especie procedente de los géneros Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantia y Sphaerocarpos. La célula briofítica procede preferiblemente de Physcomi-5 trella patens.

La célula briofítica, tal como una célula de Phys-comitrella patens, puede ser cualquier célula adecuada para la transformación según los métodos de la invención como se describe aquí, y puede ser una célula protoplás-10 tica briofítica, una célula encontrada en tejido protoné-mico u otro tipo de célula. De hecho, el experto apre-ciará que el tejido vegetal briofítico que comprende po-blaciones de células briofíticas transformadas según la invención, tal como tejido de protonema transformado, 15 también forma un aspecto de la presente invención.

Según la presente invención, se proporciona una célula briofítica transformada, preferiblemente una célu-la de Physcomitrella patens, que comprende al menos seis secuencias nucleotídicas operablemente enlazadas a un 20 promotor exógeno que conduce la expresión en dicha célula briofítica, en la que las dichas al menos seis secuencias nucleotídicas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célula briofítica, en la que las di-chas seis proteínas funcionales son una UDP-N-25 acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sinta-sa de mamífero (ácido siálico sintasa), una CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transportador de CMP-ácido siálico de mamífero, una galactosiltransfe-30 rasa, y una sialiltransferasa de mamífero.

En consecuencia, la célula briofítica transformada

comprende al menos seis de las secuencias de ácido nu-cleico mencionadas aquí anteriormente en relación con la célula briofítica transformada, siendo tales secuencias capaces de codificar proteínas funcionales, en la que las dichas secuencias de ácido nucleico están cada una opera-5 blemente enlazada a un promotor exógeno. Típicamente, ta-les secuencias nucleotídicas son secuencias de mamíferos, y preferiblemente se seleccionan de secuencias de ácido nucleico humanas.

La célula briofítica transformada de la invención 10 comprende típicamente una beta-1,4 galactosiltransferasa, preferiblemente una secuencia nucleotídica de beta 1,4 galactosiltransferasa humana.

La sialiltransferasa usada en las células briofíti-cas transformadas de la invención se selecciona típica-15 mente de una alfa-2,6 o alfa 2,3 sialiltransferasa de mamífero, y es preferiblemente una secuencia nucleotídica de alfa-2,6 sialiltransferasa humana.

La célula briofítica transformada de la invención es una célula en la que la actividad de fucosiltransfera-20 sa y/o xilosiltransferasa está significativamente reduci-da o eliminada. Este efecto se puede lograr por ejemplo usando una célula briofítica transformada de la invención que comprende preferiblemente i) una secuencia nucleotí-dica de fucosiltransferasa disfuncional y/o ii) una se-25 cuencia nucleotídica de xilosiltransferasa disfuncional.

“Disfuncional”, como se usa aquí, significa que las secuencias nucleotídicas de transferasas nombradas de fu-cosiltransferasa (fucT) y xilosiltransferasa (xylT) son sustancialmente incapaces de codificar ARNm que codifica 30 proteínas fucT y xylT funcionales que son capaces de mo-dificar glucanos N-enlazados de plantas con patrones de

glucosilación semejantes a plantas que comprenden restos de fucosilo enlazados 1,3 y de xilosilo enlazados 1,2. Preferentemente, las secuencias nucleotídicas de transfe-rasas vegetales fucT y xylT disfuncionales comprenden in-serciones seleccionadas de secuencias nucleotídicas exó-5 genas en genes endógenos, esto es, genómicos, nativos, de fucT y xylT comprendidos en el genoma briofítico nuclear (ya sea un genoma briofítico verdaderamente nativo, esto es, en células briofíticas que no han sido transformadas previamente por el hombre con otras secuencias de ácidos 10 nucleicos, o en un genoma briofítico nuclear transformado en el que se han realizado previamente inserciones de se-cuencias de ácido nucleico de secuencias de ácido nuclei-co deseadas), que inhiben sustancialmente o reprimen la transcripción de ARNm que codifica la actividad de trans-15 ferasa fucT y xylT funcional.

Como conoce la persona experta, las células briofí-ticas que son deficientes con respecto a la actividad de fucosiltransferasa y/o xilosiltransferasa también se pue-den producir mediante otras técnicas incluyendo tecnolog-20 ía de ARNi y antisentido. Todos estos métodos conducen a una célula briofítica preferida en la que la actividad de fucosiltransferasa y/o xilosiltransferasa está significa-tivamente reducida o eliminada.

Las células briofíticas de la invención o sus an-25 cestros pueden ser cualesquiera que se han transformado previamente con genes heterólogos de interés que codifi-can secuencias primarias de proteínas de interés que están glucosiladas con patrones de glucosilación de mamí-feros como se describe aquí. Preferiblemente, los patro-30 nes de glucosilación son del tipo humano. Como alternati-va, la célula briofítica se puede transformar varias ve-

ces, es decir, simultáneamente o a lo largo del tiempo, con secuencias nucleotídicas que codifican al menos una secuencia proteica primaria de interés, típicamente al menos una proteína farmacéutica de interés para uso en seres humanos o animales tales como especies de ganado, 5 incluyendo especies bovinas, ovinas, equinas y porcinas, que requieren que se coloquen en ellas patrones de gluco-silación de mamíferos según los métodos de la invención como se describe aquí. Tales glucoproteínas farmacéuticas para uso en mamíferos, incluyendo el hombre, incluyen pe-10 ro no se limitan a proteínas, preferiblemente proteínas humanas, tales como VEGF, interferones tales como alfa-interferón, beta-interferón, gamma-interferón, factores de coagulación de la sangre seleccionados de Factor VII, VIII, IX, X, XI, y XII, hormonas de fertilidad que inclu-15 yen la hormona luteinizante, hormona estimulante de folí-culos, factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante de colonias granulocíticas, y similares, prolactina, oxitocina, hormona estimulante 20 del tiroides, hormona adrenocorticotrópica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas tales como beta-glucocerebrosidasa, pro-teínas de fusión tales como la proteína de fusión del do-minio de unión al ligando del receptor de TNF alfa con 25 una porción Fc de IgG y similares, receptores, proteínas de superficie, proteínas transmembránicas, y sus fragmen-tos fisiológicamente activos. Adicionalmente, el método de la invención se puede usar para la producción de anti-cuerpos tales como anticuerpos monoclonales específicos o 30 sus fragmentos fisiológicamente activos. Estos anticuer-pos o sus fragmentos pueden ser anticuerpos quiméricos,

humanizados o de seres humanos.

Preferiblemente, se proporciona una célula briofí-tica que comprende i) una secuencia nucleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expre-sión en la mencionada célula briofítica, en la que dicha 5 secuencia nucleotídica codifica una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica, ii) una secuencia nucleotídica enlazada ope-rablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión 10 en la mencionada célula briofítica, en la que dicha se-cuencia nucleotídica codifica una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica, iii) una secuencia nucleotídica enlazada ope-15 rablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofítica, en la que dicha se-cuencia nucleotídica codifica una CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica, iv) una secuencia nu-20 cleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofí-tica, en la que dicha secuencia nucleotídica codifica un transportador de CMP-ácido siálico de mamífero funcional que es expresado en la célula briofítica, v) una secuen-25 cia nucleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofítica, en la que dicha secuencia nucleotídica codi-fica una galactosiltransferasa de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica, y vi) una secuencia 30 nucleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofí-

tica, en la que dicha secuencia nucleotídica codifica una sialiltransferasa de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica.

Preferiblemente, se proporciona una célula briofí-tica transformada que comprende i) una secuencia nucle-5 otídica de fucosiltransferasa disfuncional, ii) una se-cuencia nucleotídica de xilosiltransferasa disfuncional, iii) una secuencia nucleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la men-cionada célula briofítica, en la que dicha secuencia nu-10 cleotídica codifica una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero funcio-nal que es expresada en la célula briofítica, iv) una se-cuencia nucleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula 15 briofítica, en la que dicha secuencia nucleotídica codi-fica una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica, v) una secuencia nucleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce 20 la expresión en la mencionada célula briofítica, en la que dicha secuencia nucleotídica codifica una CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica, vi) una secuencia nu-cleotídica enlazada operablemente a un promotor exógeno 25 que conduce la expresión en la mencionada célula briofí-tica, en la que dicha secuencia nucleotídica codifica un transportador de CMP-ácido siálico de mamífero funcional que es expresado en la célula briofítica, vii) una se-cuencia nucleotídica enlazada operablemente a un promotor 30 exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofítica, en la que dicha secuencia nucleotídica codi-

fica una galactosiltransferasa funcional que es expresada en la célula briofítica, y viii) una secuencia nucleotí-dica enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofítica, en la que dicha secuencia nucleotídica codifica una sia-5 liltransferasa de mamífero funcional que es expresada en la célula briofítica.

El experto apreciará que las secuencias nucleotídi-cas enzimáticas pueden ser secuencias de ADNc o pueden ser secuencias de ADN genómico, y pueden comprender se-10 cuencias nucleotídicas degenerativamente equivalentes en tanto que el patrón de glucosilación de N-glucano sobre cualquier proteína exógena glucosilada deseada producida en las células briofíticas transformadas o tejido briofí-tico de la invención sea sustancialmente un patrón mamí-15 fero – lo que significa que comprende restos de ácido siálico -, si no un patrón completamente de mamífero, y lo más preferible, cuando sea apropiado, un patrón huma-no.

La información detallada sobre el cultivo de brió-20 fitos que son adecuados para uso en la invención, tales como Leptobryum pyriforme y Sphagnum magellanicum en bio-rreactores, es conocida en la técnica anterior (véase, por ejemplo, E. Wilbert, “Biotechnological studies con-cerning the mass culture of mosses with particular consi-25 deration of the arachidonic acid metabolism”, tesis doc-toral, University of Mainz (1991); H. Rudolph y S. Ras-mussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cul-tivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3, 67-73 (1992)). Para los fines de la presente invención se prefiere espe-30 cialmente el uso de Physcomitrella patens, puesto que las técnicas de biología molecular se practican sobre este

organismo (para un repaso, véase R. Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, p. 1-15 (1998)). Para el cultivo de briófitos, se pueden usar medios con (Baur et al. (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340) o sin suplementos como oligoelementos (Weise et 5 al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, 337-345).

Se han desarrollado sistemas de transformación ade-cuados para la explotación biotecnológica de Physcomitre-lla para la producción de proteínas heterólogas. Por ejemplo, se han llevado a cabo transformaciones con éxito 10 mediante transferencia directa de ADN en tejido de proto-nema usando pistolas de partículas. También se ha logrado con éxito la transferencia de ADN mediada por PEG en pro-toplastos de musgo. El método de transformación mediado por PEG se ha descrito muchas veces para Physcomitrella 15 patens, y conduce a transformantes tanto transitorios co-mo estables (véase, por ejemplo, K. Reutter y R. Reski, Production of a heterologous protein in bioreactor cultu-res of fully differentiated moss plants, P1. Tissue cul-ture and Biotech., 2, 142-147 (1996)). Además, igualmente 20 se puede lograr la transformación libre de marcadores me-diante un método de transformación mediado por PEG con briófitos (Stemmer C, Koch A y Gorr G (2004), Marker-free transformation of Physcomitrella patens, Moss 2004, The 7th Annual Moss International Conference, Freiburg, Ale-25 mania), y se puede usar para la introducción subsiguiente de múltiples secuencias nucleotídicas.

En un aspecto adicional de la invención, se propor-ciona un método para producir al menos una proteína de mamífero glucosilada exógena que comprende al menos un 30 resto de ácido siálico en una célula briofítica transfor-mada, que comprende:

i) introducir en una célula briofítica seis secuen-cias de ácido nucleico aisladas, comprendiendo cada una una secuencia de ácido nucleico operablemente en-lazada a un promotor exógeno que conduce la expresión 5 en una célula briofítica, en el que las mencionadas seis secuencias de ácido nucleico aisladas codifican seis proteínas funcionales, preferiblemente proteínas humanas, que son expresadas en la célula briofítica, en el que las mencionadas seis proteínas funcionales 10 son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sin-tasa)de mamífero, una CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transportador de CMP-ácido 15 siálico de mamífero, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa de mamífero; o usando una célula briofítica que ya se ha transformado y es capaz de expresar dichas seis proteínas funcionales; y

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ii) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende una secuen-cia de ácido nucleico operablemente enlazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicho ácido nucleico co-25 difica dicha proteína de mamífero exógena; o usando una célula briofítica que ya se ha transformado y es capaz de expresar dicha proteína de mamífero exógena.

El método para transformar la célula briofítica 30 comprende transformar la mencionada célula con seis de las secuencias de ácido nucleico mencionadas aquí ante-

riormente en relación con la célula briofítica transfor-mada, siendo tales secuencias capaces de codificar pro-teínas funcionales, en el que las mencionadas secuencias de ácido nucleico están cada una operablemente enlazada a un promotor exógeno. Típicamente, tales secuencias nucle-5 otídicas son secuencias de mamífero, y preferiblemente se seleccionan de secuencias de ácido nucleico de ser huma-no.

El método de la invención comprende típicamente in-troducir una secuencia nucleotídica de galactosiltransfe-10 rasa funcional, por ejemplo una secuencia nucleotídica de beta-1,4 galactosiltransferasa de mamífero, preferible-mente una secuencia nucleotídica de beta 1,4 galactosil-transferasa de ser humano, en la célula briofítica trans-formada de la invención. 15

El método de la invención también emplea típicamen-te una sialiltransferasa usada en las células briofíticas transformadas de la invención, que es codificada típica-mente por un polinucleótido seleccionado de una secuencia nucleotídica de alfa-2,6 o alfa 2,3 sialiltransferasa de 20 mamífero, y es preferiblemente una secuencia nucleotídica de alfa-2,6 sialiltransferasa humana.

La célula briofítica transformada de la invención es típicamente una célula en la que la actividad de fuco-siltransferasa y/o xilosiltransferasa está significativa-25 mente reducida o eliminada.

En una realización preferida de la presente inven-ción, se proporciona un método para producir al menos una proteína de mamífero glucosilada heteróloga o exógena que comprende al menos un resto siálico en una célula briofí-30 tica transformada, que comprende:

i) introducir en dicha célula una primera secuencia de ácido nucleico aislada que comprende ácido nuclei-co enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicho ácido nucleico codifica al menos una UDP-N-5 acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa;

ii) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende ácido nu-10 cleico enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicho ácido nucleico codifica al menos una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siá-lico sintasa); 15

iii) introducir en dicha célula una secuencia de áci-do nucleico aislada adicional que comprende ácido nu-cleico enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en 20 el que dicho ácido nucleico codifica al menos una CMP-ácido N-acetilneuramínico sintasa;

iv) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende ácido nu-25 cleico enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicho ácido nucleico codifica al menos un po-lipéptido transportador de CMP-ácido siálico de mamí-fero; 30

v) introducir en dicha célula una secuencia de ácido

nucleico aislada adicional que comprende ácido nu-cleico enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicho ácido nucleico codifica al menos un po-lipéptido de galactosiltransferasa; 5

vi) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende ácido nu-cleico enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en 10 el que dicho ácido nucleico codifica al menos un po-lipéptido de sialiltransferasa de mamífero;

vii) introducir en dicha célula una secuencia de áci-do nucleico aislada adicional que comprende ácido nu-15 cleico enlazado operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicho ácido nucleico codifica al menos un po-lipéptido de mamífero glucosilado.

20

Como se alude aquí, el al menos un polipéptido de galactosiltransferasa es preferiblemente un polipéptido de beta-1,4 galactosiltransferasa (beta-1,4 galT) de mamífero, y lo más preferible es un polipéptido de beta-1,4 galactosiltransferasa humano, y el al menos un po-25 lipéptido de sialiltransferasa de mamífero es preferible-mente un polipéptido de alfa-2,3 o alfa-2,6 sialiltrans-ferasa, y lo más preferible es un polipéptido de alfa-2,6 sialiltransferasa humano.

En un preferencia adicional, el método anterior 30 comprende adicionalmente las siguientes etapas:

viii) una secuencia nucleotídica que hace a la se-cuencia nucleotídica de fucosiltransferasa endógena disfuncional;

ix) una secuencia nucleotídica que hace a la secuen-5 cia nucleotídica de xilosiltransferasa endógena dis-funcional.

Como alternativa, el método anterior hace uso de una célula briofítica en la que la actividad de fucosil-10 transferasa y/o xilosiltransferasa está significativamen-te reducida o eliminada.

Preferiblemente, todas las proteínas de mamífero glucosiladas mencionadas aquí anteriormente son del tipo humano. Otras proteínas que se contemplan para la produc-15 ción de la presente invención incluyen proteínas para uso en el cuidado veterinario, y pueden corresponder a homó-logos animales de las proteínas humanas mencionadas aquí.

Un promotor exógeno es aquel que representa un pro-motor que es introducido al frente de una secuencia de 20 ácido nucleico de interés y está asociado operablemente con ella. De este modo, un promotor exógeno es aquel que se ha colocado al frente de un componente de ácido nu-cleico seleccionado como se define aquí y no consiste en el promotor natural o nativo asociado habitualmente con 25 el componente de ácido nucleico de interés como se en-cuentra en circunstancias de tipo salvaje. De este modo, un promotor puede ser nativo para una célula briofítica de interés pero puede no estar operablemente asociado con el ácido nucleico de interés al frente en células briofí-30 ticas de tipo salvaje. Típicamente, un promotor exógeno es aquel que es transferido a una célula briofítica hos-

pedante procedente de una fuente distinta de la célula hospedante.

Los ADNc que codifican las enzimas (de mamífero) y las proteínas de mamífero glucosiladas como se describe aquí contienen al menos un tipo de promotor que es opera-5 ble en una célula briofítica, por ejemplo un promotor in-ducible o constitutivo operablemente enlazado a una se-cuencia de ácido nucleico que codifica una enzima (de mamífero) y/o a una segunda secuencia de ácido nucleico para una proteína de mamífero glucosilada como se define 10 aquí y como se proporciona por la presente invención. Co-mo se explica, esto permite el control de la expresión de los genes.

El término “inducible”, según se aplica a un promo-tor, es bien entendido por los expertos en la técnica. En 15 esencia, la expresión bajo el control de un promotor in-ducible se “enciente” o aumenta en respuesta a un estímu-lo aplicado (que puede ser generado en una célula o se puede proporcionar exógenamente). La naturaleza del estí-mulo varía entre promotores. Algunos promotores induci-20 bles provocan niveles bajos o indetectables de expresión (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan una expresión cons-titutiva detectable en ausencia del estímulo. Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, 25 la expresión a partir de cualquier promotor inducible au-menta en presencia del estímulo correcto. La situación preferible es cuando el nivel de expresión aumenta con la aplicación del estímulo pertinente en una cantidad eficaz para alterar una característica fenotípica. De este modo, 30 se puede usar un promotor inducible (o “encendible”) que provoque un nivel básico de expresión en ausencia del

estímulo, nivel el cual es demasiado bajo para provocar un fenotipo deseado (y de hecho puede ser cero). Al apli-car el estímulo, la expresión aumenta (o se enciende) hasta un nivel, el cual provoca el fenotipo deseado.

Como se alude aquí, los sistemas de expresión 5 briofíticos también son conocidos por el experto en la técnica. Un promotor briofítico, en particular un promo-tor de Physcomitrella patens, es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa dependiente de ADN hospedante e iniciar la transcripción en dirección 3’ 10 de una secuencia codificante (por ejemplo gen estructu-ral) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transición que habitualmente está situada próxima al extremo 5’ de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción incluye habitualmente un 15 sitio de unión a ARN polimerasa (la “caja TATA”) y un si-tio de iniciación de la transcripción. Un promotor briofítico también puede tener un segundo dominio denomi-nado una secuencia activadora en dirección 5’ (UAS), la cual, si está presente, está habitualmente distante del 20 gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en au-sencia de una UAS. La expresión regulada puede ser posi-tiva o negativa, potenciando o reduciendo de ese modo la transcripción. 25

El experto apreciará que las secuencias promotoras briofíticas que codifican enzimas en rutas metabólicas de briófitos pueden proporcionar secuencias promotoras par-ticularmente útiles.

Además, los promotores sintéticos que no se produ-30 cen en la naturaleza también pueden funcionar como promo-tores briofíticos. Por ejemplo, las secuencias UAS de un

promotor briofítico se pueden unir con la región de acti-vación de la transcripción de otro promotor briofítico, creando un promotor híbrido sintético. Un ejemplo de un promotor adecuado es el usado en el sistema de expresión TOP 10 para Physcomitrella patens por Zeidler et al. 5 (1996) Plant. Mol. Biol. 30, 199-205). Además, un promo-tor briofítico puede incluir promotores que aparecen de forma natural de origen no briofítico que tienen la capa-cidad de unirse a ARN polimerasa dependiente de ADN de briófitos e iniciar la transcripción. Los ejemplos de ta-10 les promotores incluyen los descritos, entre otros, el promotor de P-actina 1 del arroz y el promotor de Chlamy-domonas RbcS (Zeidler et al. (1999) J. Plant Physiol. 154, 641-650), Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1078, 1980; Henikoff et al., Nature, 283: 835, 1981; 15 Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96: 119, 1981; Hollenberg et al., “The Expression of Bacteri-al Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae”, en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K. N. Timms y A. Puhler), 20 1979; Mercerau-Puigalon et al., Gene, 1 1: 163, 1980; Panthier et al., Curr. Genet., 2: 109, 1980.

Una molécula de ADN se puede expresar intracelular-mente en briófitos. Una secuencia promotora puede estar directamente enlazada con la molécula de ADN, en cuyo ca-25 so el primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que es codifica-da por el codón de partida AUG en el ARNm. Si se desea, la metionina en el término N se puede escindir de la pro-teína mediante incubación in vitro con bromuro de cianó-30 geno.

Como alternativa, también se pueden segregar pro-

teínas extrañas a partir de la célula briofítica en el medio de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción al interior o al exterior de las células briofíticas de 5 la proteína extraña. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden escindir ya sea in vivo o in vitro. El fragmento de la secuencia líder codifica habi-tualmente un péptido señal compuesto de aminoácidos 10 hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a par-tir de la célula.

Las secuencias señal adecuadas que codifican ADN pueden derivar de genes para proteínas de briófitos que son dirigidas hacia la ruta secretora, de forma que exis-15 ten líderes de origen no briofítico, tales como un líder de VEGF, que también pueden proporcionar secreción en células briofíticas.

Las secuencias de terminación de la transcripción que son reconocidas por y funcionales en células briofí-20 ticas son regiones reguladoras localizadas 3’ con respec-to al codón de parada de la traducción, y de este modo, junto con el promotor, flanquean la secuencia codifican-te. Esta secuencia dirige la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el 25 ADN. Un ejemplo de una secuencia de terminación adecuada que funciona en Physcomitrella patens es la región de terminación del virus del mosaico de la coliflor.

Típicamente, los componentes, que comprenden un promotor, un líder (si se desea), la secuencia codifican-30 te de interés, y la secuencia de terminación de la trans-cripción, se juntan en constructos de expresión de la in-

vención. Los constructos de expresión a menudo se mantie-nen en un plásmido de ADN, que es un elemento extracro-mosómico capaz de mantenerse de forma estable en un hos-pedante, tal como una bacteria. El plásmido de ADN puede tener dos orígenes de replicación, permitiendo así que se 5 mantenga, por ejemplo, en un briófito para la expresión y en un hospedante procariota para la clonación y amplifi-cación. Hablando de forma general, es suficiente si el plásmido tiene un origen de replicación para la clonación y amplificación en una célula hospedante procariota. 10 Además, un plásmido de ADN puede ser un plásmido de un número de copias elevado o bajo. Un plásmido de número elevado de copias tendrá generalmente un número de copias que oscila desde alrededor de 5 hasta alrededor de 200, y habitualmente alrededor de 10 a alrededor de 150. Un hos-15 pedante que contiene un plásmido de número elevado de co-pias tendrá preferiblemente al menos alrededor de 10, y más preferiblemente al menos alrededor de 20. Se puede seleccionar un vector con un número elevado o bajo de co-pias, dependiendo del efecto del vector y la proteína ex-20 traña en el hospedante (véase, por ejemplo, Brake et al., más arriba).

Como alternativa, los constructos de expresión se pueden integrar en el genoma briofítico con un vector in-tegrante. Los vectores integrantes contienen habitualmen-25 te al menos una secuencia homóloga a un cromosoma briofí-tico que permite que el vector se integre, y preferible-mente contienen dos secuencias homólogas que flanquean al constructo de expresión. Un vector integrante se puede dirigir hacia un locus específico en el musgo seleccio-30 nando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector como se describe y ejemplifica aquí. Se pue-

de integrar uno o más constructos de expresión. Las se-cuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden apa-recer como un solo segmento en el vector, lo que da como resultado la integración de todo el vector, o como dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromoso-5 ma que flanquean el constructo de expresión en el vector, lo que puede dar como resultado la integración estable de sólo el constructo de expresión.

Habitualmente, los constructos de expresión extra-cromosómicos e integrantes pueden contener marcadores se-10 leccionables para permitir la selección de células briofíticas que se han transformado. Además, se pueden usar métodos de transformación libres de marcadores.

Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en el hospedante del 15 musgo, tales como los genes de resistencia a G418 o higromicina B, que confieren resistencia en células briofíticas a G418 e higromicina B, respectivamente. Además, un marcador seleccionable adecuado puede propor-cionar también células briofíticas con la capacidad para 20 crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como me-tal.

Como alternativa, algunos de los componentes des-critos anteriormente se pueden juntar en vectores de transformación. Los vectores de transformación comprenden 25 habitualmente un marcador seleccionable que se mantiene en un plásmido de ADN o se desarrolla en un vector inte-grante, como se describe anteriormente.

Los métodos para introducir ADN exógeno en células briofíticas son bien conocidos en la técnica, y se des-30 criben entre otros por Schaefer D. G. “Principles and protocols for the moss Physcomitrella patens”, (mayo

2001) Institute of Ecology, Laboratory of Plant Cell Ge-netics, University of Lausanne Didier.Schaefer@ie-pc.unil.ch; Reutter K. y Reski R., Plant Tissue Culture and Biotechnology septiembre 1996, Vol. 2, No. 3; Zeidler M et al., (1996), Plant Molecular Biology 30:199-205. 5

Los expertos en la técnica serán capaces perfecta-mente de construir vectores y diseñar protocolos para la expresión génica o de secuencias de ácidos nucleicos re-combinantes como se describe anteriormente. Se pueden es-coger o construir vectores adecuados, que contienen se-10 cuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de polia-denilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Ma-15 nual: 2ª edición, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Har-bor Laboratory Press. En Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, se describen con detalle muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nu-20 cleico, por ejemplo en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de pro-teínas. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. se incorporan aquí como referencia. 25

Naturalmente, el experto apreciará que cada secuen-cia de ácido nucleico que codifica las enzimas y polipép-tidos (humanos) apropiados a glucosilar, e incluyendo aquellos a sialilar, estarán bajo el control regulador de su propio promotor y terminador exógenos. Cuando dos o 30 más proteínas diana son destinadas a ser producidas a partir de un único ARN portador, es preferible que sean

capaces de ser separadas fácilmente, por ejemplo mediante unión a diferentes anticuerpos (monoclonales o policlona-les) específicos de proteínas en la fase de cosecha del sistema de cultivo de las células briofíticas.

Como se describe anteriormente, los marcadores 5 genéticos seleccionables pueden facilitar la selección de células briofíticas transgénicas, y estos pueden consis-tir en genes quiméricos que confieren fenotipos seleccio-nables como se alude aquí.

Cuando se introducen secuencias de ácido nucleico y 10 secuencias polipeptídicas enzimáticas humanas selecciona-das para la glucosilación y/o sialilación en una célula briofítica, se debe tener en cuenta ciertas consideracio-nes, bien conocidas por los expertos en la técnica. El ácido o ácidos nucleicos a insertar se debería de ensam-15 blar en un constructo, que contiene elementos reguladores eficaces, que llevarán a cabo la transcripción. Debe existir un método para transportar el constructo al in-terior de la célula. Una vez que el constructo está de-ntro de la membrana celular, se producirá o no la inte-20 gración en el material cromosómico endógeno.

La presente invención proporciona un vector de áci-do nucleico adecuado para la transformación de una célula briofítica y que incluye al menos una secuencia polinu-cleotídica aislada que codifica al menos un polipéptido 25 funcional seleccionado de una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transportador de ácido CMP-30 siálico de mamífero, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa de mamífero. El experto apreciará que

la invención también proporciona un conjunto de vectores de ácido nucleico adecuados para la transformación de una célula briofítica, en el que dicho conjunto comprende al menos dos vectores que incluyen cada uno al menos una se-cuencia polinucleotídica aislada como se define aquí an-5 teriormente. Igualmente, la invención proporciona este conjunto de vectores de ácido nucleico para uso en un método para producir una célula briofítica transformada como se define aquí anteriormente.

La invención engloba además una célula hospedante 10 briofítica transformada con vectores o constructos como se expone anteriormente. De este modo, se proporciona una célula hospedante briofítica que incluye secuencias nu-cleotídicas de la invención como se indica aquí. Dentro de la célula, la secuencia nucleotídica se puede incorpo-15 rar en el cromosoma.

También según la invención se proporciona una célu-la briofítica que incorpora en su genoma al menos una se-cuencia nucleotídica, particularmente secuencias nucle-otídicas heterólogas, como se proporciona por la presente 20 invención bajo el control operativo de secuencias regula-doras para el control de la expresión como se describe aquí. La secuencia codificante puede estar enlazada ope-rablemente a una o más secuencias reguladoras que pueden ser heterólogas o extrañas a las secuencias de ácido nu-25 cleico empleadas en la invención, tales como asociadas no naturalmente a la secuencia o secuencias de ácido nuclei-co para su expresión. La secuencia nucleotídica según la invención se puede colocar bajo el control de un promotor externamente inducible, para colocar la expresión bajo el 30 control del usuario. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para obtener tal célula

briofítica, particularmente una célula de Physcomitrella patens, que implica la introducción de una secuencia o secuencias de ácido nucleico contempladas para uso en la invención o al menos un vector adecuado o conjunto de vectores que incluye la secuencia o secuencias contempla-5 das para uso en la invención en una célula briofítica, y provocar o permitir la recombinación entre el vector o vectores y el genoma de la célula briofítica para intro-ducir las mencionadas secuencias en el genoma. La inven-ción se extiende a células briofíticas, particularmente 10 células de Physcomitrella patens que contienen una se-cuencia nucleotídica de GalT y/o una secuencia nucleotí-dica que codifica una secuencia polipeptídica destinada para la adición de un patrón de glucosilación de mamífero a la misma y adecuada para uso en la presente invención 15 como resultado de la introducción de la secuencia nucle-otídica en una célula antecesora.

El término “heterólogo” se puede usar para indicar que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión se ha in-troducido en células briocíticas o un ancestro de las 20 mismas usando ingeniería genética, es decir mediante in-tervención humana. Se puede proporcionar una célula briofítica transgénica, es decir, transgénica para la se-cuencia o secuencias nucleotídicas en cuestión. El transgén puede estar en un vector extragenómico, o se 25 puede incorporar, preferiblemente de forma estable, en el genoma. Un gen heterólogo puede sustituir a un gen equi-valente endógeno, es decir, uno que normalmente realiza la misma función o una similar, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endógeno u otra secuencia. Una 30 ventaja de introducir un gen heterólogo es la capacidad para colocar la expresión de una secuencia bajo el con-

trol de un promotor de elección, a fin de ser capaces de influir sobre la expresión según preferencia. Las secuen-cias nucleotídicas heterólogas, o exógenas o extrañas, a una célula briofítica pueden ser de origen no natural en células de ese tipo, cepa o especie. De este modo, una 5 secuencia nucleotídica puede incluir una secuencia codi-ficante de o que deriva de un tipo particular de célula briofítica, tal como una célula de Physcomitrella patens, colocada en el contexto de una célula briofítica de un tipo o especie diferente. Una posibilidad adicional es 10 colocar una secuencia nucleotídica en una célula briofí-tica en la que ella o un homólogo se encuentra de forma natural, pero en la que la secuencia nucleotídica está enlazada y/o es adyacente a ácido nucleico que no es de origen natural en la célula, o células de ese tipo o es-15 pecie o cepa, tal como operablemente enlazada a una o más secuencias reguladoras, tal como una secuencia promotora, para el control de la expresión. Una secuencia en un briófito u otra célula hospedante puede ser identifica-blemente heteróloga, exógena o extraña. 20

La presente invención también engloba el producto de expresión polipeptídico deseado de la combinación de moléculas de ácido nucleico según la invención como se describe aquí u obtenible según la información y sugeren-cias aquí. También se proporcionan métodos para obtener 25 tal producto de expresión mediante expresión a partir de secuencias nucleotídicas codificantes por lo tanto bajo condiciones adecuadas en células hospedantes adecuadas, por ejemplo E. coli. Los expertos en la técnica serán ca-paces perfectamente de construir vectores y diseñar pro-30 tocolos y sistemas para la expresión y recuperación de productos de la expresión génica recombinante.

La presente invención también contempla el uso de seis secuencias polinucleotídicas que codifican una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido 5 CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transpor-tador de ácido CMP-siálico de mamífero, una galactosil-transferasa, y una sialiltransferasa de mamífero en la producción de una célula briofítica transgénica.

En una preferencia adicional, la célula hospedante 10 de la invención está comprendida en un briófito, o una parte de briófito, o un extracto o derivado de un briófi-to o en un cultivo celular de briófito.

Adicionalmente, se proporciona una planta briofíti-ca o tejido briofítico que comprende una célula briofíti-15 ca como se define aquí anteriormente.

La presente invención también proporciona un método para producir una planta briofítica transformada, inclu-yendo el método incorporar al menos un vector de ácido nucleico o un conjunto de vectores de ácido nucleico como 20 se define aquí anteriormente en una célula briofítica, y regenerar un briófito a partir de dicha célula.

Además, la presente invención proporciona un método para producir ácido siálico o ácido CMP-siálico en una célula, tejido u organismo briofítico transformado, que 25 comprende:

i) transformar dicha célula, tejido u organismo briofítico con tres secuencias polinucleotídicas que codifican tres polipéptidos que son una UDP-N-30 acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico

fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, y una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamí-fero; o

ii) usar una célula, tejido u organismo briofítico ya 5 transformado que comprende tres secuencias polinucle-otídicas que codifican tres polipéptidos que son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sin-10 tasa) de mamífero, y una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero; y, opcional-mente,

iii) recuperar, purificar o aislar el ácido siálico o 15 ácido CMP-siálico de la célula, tejido u organismo como se trata o define en i) y/o ii).

Un polipéptido producido según la presente inven-ción puede ser un alelo, variante, fragmento, derivado, 20 mutante u homólogo de los (a) polipéptidos como se men-ciona aquí. El alelo, variante, fragmento, derivado, mu-tante u homólogo puede tener sustancialmente la misma función de los polipéptidos aludida anteriormente y mos-trada aquí, o puede ser un mutante funcional del mismo. 25 En el contexto de proteínas farmacéuticas como se descri-be aquí para uso en seres humanos, el experto apreciará que la secuencia primaria de tales proteínas, y su patrón de glucosilación, imitarán o preferiblemente serán idén-ticos a lo encontrado en seres humanos. 30

“Homología”, en relación con una secuencia de ami-noácidos de la invención, se puede usar para referirse a

identidad o similitud, preferiblemente identidad. Como se señala ya anteriormente, el nivel elevado de identidad de aminoácidos se puede limitar a dominios o regiones fun-cionalmente significativas, por ejemplo cualquiera de los dominios identificados aquí. En particular, se proporcio-5 nan mediante la presente invención homólogos de las se-cuencias polipeptídicas derivadas de briófitos particula-res proporcionadas aquí, como también mutantes, varian-tes, fragmentos y derivados de tales homólogos. Tales homólogos son fácilmente obtenibles mediante uso de las 10 descripciones hechas aquí. Naturalmente, el experto apre-ciará que los homólogos de las secuencias proteicas glu-cosiladas per se, distintos de aquellos homólogos que de-bido a la degeneración del código genético dan lugar a secuencias de aminoácidos que son copias verdaderas (es 15 decir, 100% idénticas) de las proteínas de mamífero de interés, y especialmente de proteínas humanas de interés, están englobados dentro de la presente invención. De este modo, la presente invención también se extiende a po-lipéptidos que incluyen secuencias de aminoácidos con 20 función de enzimas humanas como se define aquí y como son obtenibles usando la información de secuencias como se proporciona aquí. Los homólogos pueden tener homología, esto es, identidad, a nivel de aminoácidos con las se-cuencias de aminoácidos descritas en la técnica anterior 25 como se describe aquí, es decir, bajo los números de ac-ceso de bases de datos proporcionados en la sección de ejemplos, preferiblemente al menos alrededor de 50%, o al menos 55%, o al menos alrededor de 60%, o al menos alre-dedor de 65%, o al menos alrededor de 70%, o al menos al-30 rededor de 75%, o al menos alrededor de 80% de homología, o al menos alrededor de 85%, o al menos alrededor de 88%

de homología, o al menos alrededor de 90% de homología y lo más preferible al menos alrededor de 95% o más de homología, con la condición de que tales proteínas tengan una actividad que se ajuste al contexto de la presente invención. 5

En ciertas realizaciones, un alelo, variante, deri-vado, derivado mutante, mutante u homólogo de la secuen-cia específica puede mostrar una pequeña homología glo-bal, digamos alrededor de 20%, o alrededor de 25%, o al-rededor de 30%, o alrededor de 35%, o alrededor de 40% o 10 alrededor de 45%, con la secuencia específica. Sin embar-go, en dominios o regiones funcionalmente significativas, la homología de aminoácidos puede ser mucho mayor. Los dominios o regiones funcionalmente significativos putati-vos se pueden identificar usando procesos de bioinformá-15 tica, incluyendo comparación de las secuencias de homólo-gos.

Los dominios o regiones funcionalmente significati-vos de diferentes polipéptidos se pueden combinar para la expresión a partir de ácido nucleico codificante como una 20 proteína de fusión. Por ejemplo, las propiedades particu-larmente ventajosas o deseables de diferentes homólogos se pueden combinar en una proteína híbrida, de forma que los productos de expresión resultantes, con actividad en-zimática, pueden incluir fragmentos de diversas proteínas 25 progenitoras, si es apropiado.

La similitud de las secuencias de aminoácidos puede ser como se define y determina por el programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que es de uso estándar en la técnica. En particular, se puede 30 usar TBLASTN 2.0 con las penalizaciones de Matrix BLOSUM62 y GAP: existencia: 11, extensión: 1. Otro pro-

grama estándar que se puede usar es BestFit, que es parte del paquete Wisconsin, Versión 8, septiembre 1994, (Gene-tics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wiscon-sin, USA, Wisconsin 53711). BestFit obtiene un alinea-miento óptimo del mejor segmento de similitud entre dos 5 secuencias. Los alineamientos óptimos se encuentran in-sertando saltos para maximizar el número de emparejamien-tos usando el algoritmo de homología local de Smith y Wa-terman (Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482-489). Otros algo-ritmos incluyen GAP, que usa el algoritmo de Needleman y 10 Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximi-zan el número de emparejamientos y minimiza el número de saltos. En cuanto a cualquier algoritmo, generalmente se usan los parámetros por defecto, que para GAP son una pe-nalización de creación de saltos = 12 y una penalización 15 de extensión de saltos = 4. Como alternativa, se puede usar una penalización de creación de salto de 3 y una pe-nalización de extensión de salto de 0,1. Otra alternativa es el algoritmo FASTA (que usa el método de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448). 20

El uso tanto de los términos “homología” como “homólogo” aquí no implica ninguna relación evolutiva ne-cesaria entre secuencias comparadas, al mantenerlo por ejemplo con uso estándar de términos tales como “recombi-nación homóloga”, que requiere simplemente que dos se-25 cuencias nucleotídicas sean suficientemente similares pa-ra recombinarse en las condiciones apropiadas.

Se entenderá que la enseñanza de todas las referen-cias citadas aquí se incorporan en la enseñanza de la me-moria descriptiva. 30

Ejemplos

Métodos y materiales

Material vegetal

5

Se usó la cepa de tipo salvaje de Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. caracterizada por Reski et al. ((1994) Genome analysis of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.. Mol Gen Genet 244, 352-359)). Es un sub-cultivo de la cepa 16/14 que se recogió por H.L.K. White-10 house en Gransden Wood, Huntingdonshire, UK y se propagó por Engel ((1968) Am J Bot 55, 43B-446)). También se usa-ron las cepas de Physcomitrella transgénicas glucomanipu-ladas que carecen de los dos restos de azúcar específicos de plantas en la estructura central de N-glucanos (Kopri-15 vova et al. (2004) Plant Biotechnol J 2, 517-523) y/o que contienen 1,4 galactosiltransferasa humana (Huether et al. (2005) Plant Biol 7, 292-299).

Condiciones de cultivo estándar 20

Las plantas se hicieron crecer axénicamente en con-diciones estériles en medio de Knop modificado líquido inorgánico completo (1000 mg/l de Ca(NO3)2 x 4H2O, 250 mg/l de KCl, 250 mg/l de KH2PO4, 250 mg/l de MgSO4 x 7 H2O 25 y 12,5 mg/l de FeSO4 x 7 H2O; pH 5,8 (Reski y Abel (1985) Planta 165, 354-358). Las condiciones de cultivo se pue-den variar, por ejemplo, como se describe por Baur et al. (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340 o Weise et al. (2006) Appl Microbiol Biotechnol, 70, 337-345). Las plan-30 tas se hicieron crecer en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contienen 200 ml de medio de cultivo, y los matraces

se agitaron en un agitador Certomat R (B. Braun Biotech International, Alemania) ajustado a 120 rpm. Las condi-ciones en la cámara de crecimiento fueron 25 +/- 3ºC y un régimen de luz-oscuridad de 16:8 h. Los matraces se ilu-minaron desde la parte superior mediante dos tubos fluo-5 rescentes (Osram L 58 W/25) que proporcionan 35 micromo-les-1m-2. Los cultivos se subcultivaron una vez a la sema-na mediante desintegración usando un homogeneizador Ul-tra-Turrax (IKA, Staufen, Alemania) e inoculación de dos nuevos matraces Erlenmeyer de 500 ml que contienen 100 ml 10 de medio de Knop reciente.

Aislamiento y transformación de protoplasto

El aislamiento del protoplasto se realizó como se 15 describió previamente (Baur et al. (2005) J Biotechnol, 119, 332-342). Para contar los protoplastos, se transfi-rió un pequeño volumen de la suspensión a una cámara de Fuchs-Rosenthal. La transformación se llevó a cabo me-diante transferencia de ADN directa mediada por PEG en 20 protoplastos con marcadores de selección (Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4368-4373) o libre de marcadores (Stemmer C, Koch A y Gorr G (2004) Marker-free transformation of Physcomitrella patens. Moss 2004, The 7th Annual Moss International Conference, Freiburg, Ale-25 mania). Las cotransformaciones se llevaron a cabo intro-duciendo los constructos de AND pertinentes simultánea-mente en los protoplastos mediante transferencia de ADN mediada por PEG.

30

Identificación mediante PCR

La introducción de los constructos de ADN heterólo-gos se analizó mediante PCR usando cebadores apropiados (véase más abajo).

Análisis de ácidos siálicos (Neu5Ac) 5

Para el aislamiento de glucoproteínas, se suspendió tejido en 15 ml de tampón Tris/HCl 25 mM de pH 7,5 – que contiene 2 mM de ditiotreitol y 1 g/ml de leupeptina -, y se homogeneizó con un Ultraturrax. A la suspensión se 10 añadió Tritón X-100 (0,25%, p/v), y la mezcla se agitó durante 60 minutos a 4ºC. La suspensión se centrifugó, y el material soluble se hizo pasar a través de un filtro de 0,45 m. Los extractos se dializaron intensamente frente a acetato de amonio 25 mM de pH 6,0. El dializado 15 resultante se mezcló con un volumen igual de ácido acéti-co 4 M, y se mantuvo durante 3 h a 80ºC. Las muestras se ultrafiltraron entonces usando un dispositivo Centriprep YM-3 (Amicon) de 3 kDa de corte. El filtrado se concentró a vacío. 20

Se derivatizaron alícuotas de 50 l con DMB (Alt-mann Y Lomonossoff (2000), J. Gen. Virol. 81, 1111-1114; Hara et al. (1987), Anal. Biochem. 164, 138-145). Los ácidos de cetoazúcares marcados con DMB se separaron en una columna de fase inversa (Thermo Hypersil ODS, 250 x 4 25 mm, 5 m) eluida con acetato de amonio 50 mM, pH 5,5, a un caudal de 1,2 ml/min. Los analitos se eluyeron con un gradiente bajo de 7,6 a 11,4% de acetonitrilo en 20 minu-tos, y se detectaron fluorimétricamente (Hara et al. (1987), Anal. Biochem. 164, 138-145). 30

Las fracciones aisladas que contienen DMB-Neu5Ac se analizaron mediante análisis espectrométrico de masas con

ESI (ESI-MS). El ácido siálico activado (CMP-Neu5Ac) se analizó mediante ESI-MS en el modo MSMS.

Ejemplos

5

1.1 Clonación de UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana

El ADNc que codifica UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana (número de 10 acceso: AF155663) se clonó en el vector de expresión ve-getal pRT101 (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). En el constructo resultante, la UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa estaba bajo regulación del promotor 35S y del terminador 15 35S – juntos denominados como constructo de expresión. Para el procedimiento de transformación, se cortó el constructo de expresión. Para la transformación de las cepas de Physcomitrella patens, se usó el fragmento li-nealizado que contiene UDP-N-acetilglucosamina-2-20 epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa bajo regulación del promotor 35S y del terminador 35S.

En un enfoque paralelo, el ADNc que codifica UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana (número de acceso: AF155663) se clonó en el 25 plásmido pBS bajo regulación del promotor tub3 (número de acceso: AY724471) y el terminador del gen de alfa 1,3 fu-cosiltransferasa de Physcomitrella patens (Pp). Antes de clonar el ADNc de UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana en pBS, el terminador 30 del gen de alfa 1,3 fucosiltransferasa (5’- CGGTGATCCCGTTTTCATATCAGTGTATTA-

TCATCAGTGACTGGATATTGACACCCAATTCTGATGATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTT TTGGTATGGTTACATGCTTTTCAGAGGTTTCTATGCCGCTGAGTATTTTCCTGAATCGCGAGGT GTGACAGGTTATCTGCGCCGTCCACCCAATATTTTATGATGAGTCGATGATTCGTGA5 GACTAAT CTAGCTTAACCTTTTTCTTACTGGCAAGTCAAAATTGAGTTTAAAATATTTCAGTATCCTGTTA GTAATTTCAGACACATGTATTCTATGTCTCATACTCTTTACGTGAAAGTTCAACTGACTTATAT 10 TTTGTCGTTTTTCTGTAGATCACTGTTTTAGCGCATACAAAGACAATTGTCTAAATATTTTTAA AGAAGGTGATATTTTATTATAAGATAGAAGTCAATATGTTTTTTTGTTATGCACATGACTTGAA TAAAATAAATTTTTTTGTTAGATTTAAATACTTTTTGAATTATAGGTTTGTTGAAAT15 TAAGGAA TTTATATTCATAAGAAGCTACTCGAACAAATTTACAAAGAGAACATTTGATAAGTAAAAGTAAT TAAAAGTTTTTTTTAATTTAAAAAGATTAATTTTTATTAATAAGAAGAACTTGGAAAGTTAGAA 20 AAATATTTAACTTTAAAAATTAAGAAAACAAGGCAAAACTTTAATTTACAAATACTTAATGTAG ATTAATTTTCTTATTATATATTAGCACAAATTATCATTATGTGATATTTTATGTTATTGT-3’) (SEC ID NO 1) de Physcomitrella patens se ampli-ficó mediante PCR usando el cebador MoB558 (5’-25 GTTCCGCGGTGATCCCGTTTTCATATCAGTGTATT-3’) (SEC ID NO 2) y el cebador MoB557 (5’-TTTGAGCTCTACGTAACAATAACAT-AAAATATCACA-3’) (SEC ID NO 3). El fragmento amplificado se cortó con SacII y SacI y se ligó en pBS, que también se cortó con SacII y SacI. 30

El ADNc que codifica UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana (número de

acceso: AF155663) se ligó con el promotor tub3 de Pp y 5’UTR (número de acceso: AY724471) y se amplificó median-te PCR solapante usando los cebadores MOB1108 (5’-GATGGATCCATTGCCAATGTATTGATTGGC-3’) (SEC ID NO 4); MOB1124 (5’-GTTATTTCCATTCTTCTCCATCTTCGCTAAGGATGATCTAC-3’) (SEC ID 5 NO 5) y MOB1125 (5’-GTCTCTAGACTAGTAGATCCTGCGTGT-3’) (SEC ID NO 6). El fragmento resultante se cortó con BamHI y XbaI y se ligó en pBS que contiene el terminador del gen de alfa 1,3 fucosiltransferasa de Pp y se cortó con BamHI y XbaI. Para la transformación de Physcomitrella patens, 10 se usó el constructo de expresión cortado con KpnI y Sna-BI, que comprende el promotor tub3 de Pp, ADNc de UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana y el terminador del gen de alfa 1,3 fucosiltrans-ferasa de Pp. 15

1.2 Clonación de ácido N-acetilneuramínico fosfato sinta-sa humana

El ADNc que codifica ácido N-acetilneuramínico fos-20 fato sintasa humana (número de acceso: NM_018946) se clonó en el vector de expresión vegetal pRT101 (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). El ADNc que codi-fica ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa humana se amplificó mediante PCR usando el cebador MOB785 (5’-25 GGCCTGCAGATGCCGCTGGAGCTGGAGCTG-3’) (SEC ID NO 7) y el ce-bador MOB786 (5’-GCCGGATCCTTAAGACTTGATTTTTTTGCCATGA-3’) (SEC ID NO 8). El producto de la amplificación se cortó con PstI y BamHI, y se clonó en pRT101. En el constructo resultante, la ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa 30 estaba bajo la regulación del promotor 35S y del termina-dor 35S – juntos denominados como constructo de expre-

sión. Para el procedimiento de transformación, el cons-tructo de expresión se cortó con SphI. Para la transfor-mación de cepas de Physcomitrella patens, se usó el frag-mento linealizado que contiene ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa bajo la regulación del promotor 35S y del 5 terminador 35S.

1.3 Clonación de ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa humana

10

El ADNc que codifica ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa humana (número de acceso: NM_018686) se clonó en el vector de expresión vegetal pRT101 (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). El ADNc que codifica ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa humana se amplificó 15 mediante PCR usando el cebador MOB835 (5’-ATCGAATTCATGGACTCGGTGGAGAAGGG-3’) (SEC ID NO 9) y el ce-bador MOB836 (5’-TGAGGATCCCTATTTTTGGCATGAATTATTAACCT-3’) (SEQ NO ID 10). El producto de la amplificación se cortó con EcoRI y BamHI, y se clonó en pRT101. En el constructo 20 resultante, la ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa es-taba bajo la regulación del promotor 35S y del terminador 35S – juntos denominados como constructo de expresión. Para el procedimiento de transformación, el constructo de expresión se cortó con SphI. Para la transformación de 25 cepas de Physcomitrella patens, se usó el fragmento li-nealizado que contiene ácido CMP-N-acetilneuramínico sin-tasa bajo la regulación del promotor 35S y del terminador 35S.

30

1.4 Clonación del transportador de ácido CMP-siálico humano

El ADNc que codifica el transportador de ácido CMP-siálico humano (número de acceso: NM_006416) se clonó en el vector de expresión vegetal pRT101 (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). El ADNc que codifica el 5 transportador de ácido CMP-siálico humano se amplificó mediante PCR usando el cebador MOB638 (5’-GTCGAGCTCGGAACCATGGCTGCCCCGA-3’) (SEC ID NO 11) y el ce-bador MOB639 (5’-ATCGGATCCTCACACACC-AATAACTCTC-3’) (SEC ID NO 12). El fragmento resultante se cortó con SacI y 10 BamHI, y se clonó en pRT101. En el constructo resultante, el transportador de ácido CMP-siálico estaba bajo la re-gulación del promotor 35S y del terminador 35S – juntos denominados como constructo de expresión. Para el proce-dimiento de transformación, el constructo de expresión se 15 cortó con Hind III. Para la transformación de cepas de Physcomitrella patens, se usó el fragmento linealizado que contiene el transportador de ácido CMP-siálico bajo la regulación del promotor 35S y del terminador 35S.

20

1.5 Clonación de beta-1,4 galactosiltransferasa humana

La clonación de beta-1,4 galactosiltransferasa humana se llevó a cabo como se describe por Huether et al. ((2005) Plant Biol 7, 292-299). En el constructo re-25 sultante, la beta-1,4 galactosiltransferasa estaba bajo la regulación del promotor 35S y del terminador 35S – juntos denominados como constructo de expresión. Para el procedimiento de transformación, se cortó el constructo de expresión. Para la transformación de cepas de Physco-30 mitrella patens, se usó el fragmento linealizado que con-tiene beta-1,4 galactosiltransferasa bajo la regulación

del promotor 35S y del terminador 35S.

1.6 Clonación de alfa-2,6 sialiltransferasa humana

El ADNc que codifica alfa-2,6 sialiltransferasa 5 humana (número de acceso: NM_003032) se clonó en el vec-tor de expresión vegetal pRT101 (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). El ADNc que codifica alfa-2,6 sialiltransferasa humana se amplificó mediante PCR usando el cebador MOB 636 (5’-GCTGAGCTCGAACACATCTTCATTATG-3’) 10 (SEC ID NO 13) y el cebador MOB637 (5’-GATGGATCCTTAGCAGT-GAATGGTCCG-3’) (SEC ID NO 14). El producto de la amplifi-cación se cortó con SacI y BamHI, y se clonó en pRT101. En el constructo resultante, la alfa-2,6 sialiltransfera-sa estaba bajo la regulación del promotor 35S y del ter-15 minador 35S – juntos denominados como constructo de ex-presión. Para el procedimiento de transformación, el constructo de expresión se cortó con Hind III. Para la transformación de cepas de Physcomitrella patens, se usó el fragmento linealizado que contiene alfa-2,6 sialil-20 transferasa bajo la regulación del promotor 35S y del terminador 35S.

1.7 Identificación y análisis de la transformación

25

La transformación de diferentes cepas de Physcomi-trella se llevó a cabo mediante transferencia directa de ADN mediada por PEG mediante cotransformación simultánea de los constructos descritos en 1.1-1.6.

Usando los cebadores apropiados para cada construc-30 to (1.1: UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa humana bajo la regulación del

promotor tub3 de Pp y el terminador de alfa 1,3 fucosil-transferasa de Pp con el cebador MOB1214 (5’-GCAGGCTGCCCTTCCTAT-3’) (SEC ID NO 15) y el cebador MOB1196 (5’-AGAGATATTCTCCTTCAC-3’) (SEC ID NO 16); 1.2: ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa humana bajo la 5 regulación del promotor 35S y del terminador 35S con el cebador MOB1213 (5’-ATGCCGCTGGAGCTGGAG-3’) (SEC ID NO 17) y el cebador MOB1212 (5’-GTGTCTCCAGATCCAAC-3’) (SEC ID NO 18); 1.3: ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa humana bajo la regulación del promotor 35S y del terminador 35S 10 con el cebador MOB835 (5’-ATCGAATTCATGG-ACTCGGTGGAGAAGGG-3’) (SEC ID NO 9) y el cebador MOB1153 (5’-TCGGTCACTTCACGAACT-3’) (SEC ID NO 19); 1.4: transportador de ácido CMP-siálico humano bajo la regulación del promo-tor 35S y del terminador 35S con el cebador MOB638 (5’-15 GTCGAGCTCGGAACCATGGCTGCCCCGA-3’) (SEC ID NO 11) y MOB1151 (5’-CAGATCGGAGCCAAGTTCTG-3’) (SEC ID NO 20); 1.5: beta-1,4 galactosiltransferasa humana como se describe por Huether et al. ((2005) Plant Biol 7, 292-299); 1.6: alfa-2,6 sialiltransferasa humana bajo la regulación del pro-20 motor 35S y del terminador 35S con el cebador MOB 636 (5’-GCTGAGCTCGAACACATCTTCATTATG-3’) (SEC ID NO 13) y el cebador MOB1149 (5’-CGCTGACAGCACAACAGC-3’) (SEC ID NO 21)), respectivamente, se identificaron cepas transgéni-cas mediante PCR en ADN genómico. 25

Las cepas transgénicas para todos los constructos (1.1-1.6) se analizaron en términos de ácidos siálicos enlazados a N-glucanos en glucoproteínas, así como para ácido siálico libre (NeuAc5) y ácido CMP-siálico (CMP-NeuAc5). 30

Las cepas briofíticas analizadas transgénicas para todos los constructos (1.1-1.6) mostraron un contenido

significativo de ácidos siálicos derivados de N-glucanos de glucoproteínas.

Se detectaron cantidades elevadas (hasta 100 nmo-les/g) de ácido siálico libre. El ácido siálico en los briófitos transgénicos se confirmó mediante análisis de 5 MSMS, que muestra el espectro idéntico comparado con el estándar, y no se detectó en el tipo salvaje de Physcomi-trella patens.

Se detectaron rendimientos elevados de ácido siáli-co activado (CMP-NeuAc5) en los briófitos transgénicos. 10 Por el contrario, CMP-NeuAc5 no se pudo detectar en el tipo salvaje de Physcomitrella patens.

Claims (16)

1. Reivindicaciones

   1.- Un método para producir una proteína de mamí-fero glucosilada exógena que comprende al menos un resto de ácido siálico en una célula briofítica transformada, 5 que comprende:

   i) introducir en una célula briofítica seis secuen-cias de ácido nucleico aisladas, que comprenden cada una una secuencia de ácido nucleico operablemente en-10 lazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que las dichas seis secuencias de ácido nucleico aisladas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célula briofítica, en el que las mencionadas seis proteínas 15 funcionales son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transporta-20 dor de ácido CMP-siálico de mamífero, una galactosil-transferasa, y una sialiltransferasa de mamífero; o usar una célula briofítica que ya se ha transformado y es capaz de expresar dichas seis proteínas funcio-nales; y 25

   ii) introducir en dicha célula una secuencia de ácido nucleico aislada adicional que comprende una secuen-cia de ácido nucleico operablemente enlazada a un promotor exógeno que conduce la expresión en una célula briofítica, en el que dicha secuencia de ácido 30 nucleico codifica dicha proteína de mamífero exógena; o usar una célula briofítica que ya se ha transforma-

   do y es capaz de expresar dicha proteína de mamífero exógena; y, opcionalmente,

   iii) recuperar, purificar o aislar dicha proteína de mamífero glucosilada que comprende al menos un resto de ácido siálico a partir de dicha célula briofítica. 5
2. 2.- El método según la reivindicación 1, en el que la galactosiltransferasa es una beta-1,4 galactosil-transferasa, preferiblemente una beta 1,4 galactosil-transferasa humana. 10
3. 3.- El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la sialiltransferasa es una alfa-2,6 o alfa-2,3 sialiltransferasa.
4. 4.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 3, en el que se usa una célula briofítica 15 en la que la actividad de fucosiltransferasa y/o xilosil-transferasa está significativamente reducida o eliminada.
5. 5.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 4, en el que la célula briofítica trans-formada es una célula de Physcomitrella patens. 20
6. 6.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 5, en el que la célula briofítica trans-formada está comprendida en un briófito, o una parte de briófito, o un extracto o derivado de un briófito, o en un cultivo celular de briófito. 25
7. 7.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 6, en el que la proteína de mamífero glu-cosilada es una proteína humana.
8. 8.- El método según la reivindicación 7, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en 30 VEGF, interferones tales como alfa-interferón, beta-interferón, gamma-interferón, factores de coagulación de

   la sangre seleccionados de Factor VII, VIII, IX, X, XI, y XII, hormonas de la fertilidad, incluyendo hormona lutei-nizante, hormona estimuladora de folículo, factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidér-mico, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el 5 factor estimulador de colonias granulocíticas, prolacti-na, oxitocina, hormona estimuladora del tiroides, hormona adrenocorticotrópica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas, tales como beta-glucocerebrosidasa, proteínas de fusión, tales como 10 la proteína de fusión del dominio de unión al ligando del receptor de TNF alfa con la porción Fc de IgG, recepto-res, proteínas de superficie, proteínas transmembránicas, anticuerpos monoclonales, y fragmentos fisiológicamente activos de los mismos. 15
9. 9.- Un método para producir ácido siálico o ácido CMP-siálico en una célula, tejido u organismo briofítico transformado, que comprende

   i) transformar dicha célula, tejido u organismo 20 briofítico con tres secuencias polinucleotídicas que codifican tres polipéptidos que son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, 25 y una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamí-fero; o

   ii) usar una célula, tejido u organismo briofítico ya transformado que comprende tres secuencias polinucle-otídicas que codifican tres polipéptidos que son una 30 UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-

   acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sin-tasa) de mamífero, y una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero; y, opcional-mente,

   iii) recuperar, purificar o aislar el ácido siálico o 5 ácido CMP-siálico de la célula, tejido u organismo como se trata o define en i) y/o ii).
10. 10.- Una célula briofítica transformada que com-prende seis secuencias nucleotídicas heterólogas cada una 10 enlazada operablemente a un promotor exógeno que conduce la expresión en la mencionada célula briofítica en la que las mencionadas seis secuencias nucleotídicas codifican seis proteínas funcionales que son expresadas en la célu-la briofítica, en la que dichas seis proteínas funciona-15 les son una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina-6-cinasa de mamífero, una ácido N-acetilneuramínico fosfato sintasa (ácido siálico sintasa) de mamífero, una ácido CMP-N-acetilneuramínico sintasa de mamífero, un transportador de ácido CMP-siálico de mamí-20 fero, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa de mamífero.
11. 11.- Una célula briofítica transformada según la reivindicación 10, en la que las mencionadas secuencias de ácido nucleico son secuencias de mamífero, preferible-25 mente secuencias de ácido nucleico de ser humano.
12. 12.- Una célula briofítica transformada según la reivindicación 10 u 11, en la que la galactosiltransfera-sa es una beta-1,4 galactosiltransferasa, preferiblemente una secuencia nucleotídica de beta 1,4 galactosiltransfe-30 rasa humana.
13. 13.- Una célula briofítica transformada según una

    cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la sialiltransferasa se selecciona de una alfa-2,6 o alfa 2,3 sialiltransferasa, y es preferiblemente una secuencia nucleotídica de alfa-2,6 sialiltransferasa humana.
14. 14.- Una célula briofítica transformada según una 5 cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que la actividad de fucosiltransferasa y/o xilosiltransferasa está significativamente reducida o eliminada.
15. 15.- Una célula briofítica transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que es una 10 célula de Physcomitrella patens.
16. 16.- Una célula briofítica transformada según la reivindicación 15, que está compuesta de tejido de proto-nema de Physcomitrella patens.