ES2899783T3 - Proteínas lisosómicas glucosiladas, método de producción y utilizaciones - Google Patents

Abstract

Método de fabricación de una composición de proteína lisosómica, que comprende expresar un transgén que codifica una proteína lisosómica en una planta o célula de briófita, en el que dicha proteína lisosómica se expresa con una señal secretora N-terminal, en el que dicha señal secretora se elimina opcionalmente durante el procesamiento intracelular, y en el que la proteína lisosómica carece de una señal vacuolar C-terminal con la secuencia VDTM (SEC ID nº 1) y carece de una señal de retención de ER C-terminal con la secuencia KDEL (SEC ID nº 2), y dicho método comprende además obtener una proteína lisosómica expresada a partir de dicha planta o célula.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas lisosómicas glucosiladas, método de producción y utilizaciones

La presente invención se refiere al campo de la expresión de proteínas recombinantes en plantas para la obtención de una glucosilación modificada en comparación con los sistemas de expresión de mamíferos.

Antecedentes

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) son un grupo de trastornos hereditarios potencialmente letales; la mayoría de ellos está causada por la deficiencia de un único enzima o proteína lisosómico, que conduce a la acumulación anormal de sustrato en las células. Actualmente, la terapia de sustitución enzimática (ERT) es el único tratamiento específico disponible para varias LSD. En estas enfermedades, el almacenamiento lisosómico puede eliminarse en muchos tejidos diana mediante infusión intravenosa del enzima faltante. Tradicionalmente, los enzimas recombinantes utilizados en la ERT se producen en células de mamífero en cultivo. Por ejemplo la patente US n° 6.083.725 describe una a-galactosidasa de células humanas. Recientemente, como enfoque alternativo, se han utilizado sistemas de expresión vegetales para producir enzimas lisosómicos para el uso terapéutico (Shaaltiel et al., Plant Biotechnol. J. 5:579-590, 2007; Du et al., J. Lipid Res. 49:1646-1657, 2008; De Marchis et al., Plant Biotechnol. J. 9:1061-1073, 2011; He et al., Nat. Commun. 3:1062, 2012). Respecto a los sistemas basados en células de mamífero, los sistemas vegetales presentan varias ventajas, entre ellas los costes de producción más bajos, la eliminación del riesgo de contaminación por patógenos de mamífero y, en el caso de los musgos, una manipulación relativamente más fácil de la ruta de N-glucosilación. Sin embargo, una cuestión importante de los enzimas producidos en células vegetales para ERT es que sus estructuras de N-glicano difieren de los enzimas producidos en células de mamífero. Particularmente, los enzimas lisosómicos expresados en células vegetales típicamente no adquieren la modificación de manosa 6-fosfato (M6P) en los residuos de manosa terminal sin una fosforilación artificial adicional. Las cadenas de sacáridos ejercen un papel fundamental en la ERT. Los enzimas lisosómicos administrados por vía intravenosa son asimilados por los tejidos mediante receptores de superficie celular que reconocen la estructura de carbohidrato de los enzimas. El receptor de M6P (M6PR) y el receptor de manosa (RM) representan dos contribuyentes importantes para este sistema de asimilación.

La mayoría de enzimas lisosómicos portan residuos de M6P. Se cree generalmente que en la ERT para la mayoría de LSD, la ruta endocítica mediada por M6PR resulta crucial para un suministro suficiente de enzima (Sly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15172-15177, 2006; Sands et al., J. Biol. Chem. 276:43160-43165, 2001). Por el contrario, el RM se encuentra presente sobre los macrófagos y se cree que facilita únicamente el efecto terapéutico de la ERT dirigida a sustituir el enzima en dichas células.

Los documentos WO 02/08404 y WO 2012/098537 describen la producción de diversos enzimas lisosómicos en el tabaco.

El documento WO 03/073839 describe la producción de enzimas lisosómicos en semillas de plantas, especialmente en semillas de plantas del tabaco.

La patente US n° 7.011.831 describe la producción de enzimas lisosómicos con una compleja glucosilación de N-glicanos en las células de insecto.

El documento WO 2008/132743 describe la producción de enzimas lisosómicos glucosilados de alto contenido de manosa en el tabaco mediante la utilización de un constructo de expresión con péptido de señal de ER y una señal de reconocimiento vacuolar.

El documento EP 2 789 686 A1 describe la modificación de las rutas de glucosilación vegetales para producir glicanos fosforilados de tipo mamífero.

El documento US 2006/040353 describe la transferencia de beta-galactosa a glicanos unidos mediante N. Se sugieren glucoproteínas con manosa-6-fosfato para el tratamiento de enfermedades lisosómicas.

Chiba et al. han producido a-gal A humana a partir de la levadura S. cerevisiae (Chiba et al., Glycobiology 12:821-828, 2002). En ese caso, M6P está cubierta por manosa terminal y la eliminación de los residuos de manosa por la a-manosidasa bacteriana condujo a una incorporación dependiente de M6PR mejorada del enzima en fibroblastos en cultivo. Recientemente, se ha expresado a-gal A en otra cepa de levadura de genes manipulados, que sobreexpresa MNN4, un regulador positivo de la manosilfosfato transferasa (Tsukimura et al., Mol. Med. 18:76-82, 2012). El contenido de N-glicano fosforilado en dicha preparación de a-gal A era más elevado que en agalsidasa alfa (28,7% frente a 15,3%). La inyección repetida de dicho enzima en ratones Fabry dio como resultado una reducción similar de Gb3 cardiaca y renal a la observada en ratones inyectados con agalsidasa alfa. Más recientemente, Kizhner et al. han informado de la purificación y caracterización de a-gal A humana producida a partir de un cultivo de células del tabaco (Kizhner et al., Mol. Genet. Metab. 114(2):259-267, 2015). Al igual que otros enzimas lisosómicos artificiales, dicho aGal no está fosforilado. Sin embargo, esta proteína se encuentra químicamente entrecruzada y PEGilada. Estas modificaciones están asociadas a cambios significativos en las características de la proteína, entre ellas una estabilidad in vitro incrementada y una semivida en circulación drásticamente prolongada (~10 h) en comparación con la agalsidasa alfa o beta. El mecanismo de asimilación de dicho enzima sigue siendo desconocido. Sin embargo, una eliminación plasmática notablemente lenta sugiere que la asimilación no se produce mediante endocitosis mediada por M6PR o RM.

La patente US n° 6.887.696 describe un método para la expresión de dos proteínas lisosómicas: la alfaglucocerebrosidasa y la alfa-galactosidasa, en plantas del tabaco, una planta superior. Las proteínas lisosómicas producidas en tabaco presentaban un patrón de glucosilación diverso, con cantidades elevadas de N-glicanos complejos, especialmente GnMXF, MGnXF, GnGnXF, GnMx y MGnX.

El objetivo de la invención es proporcionar una fuente alternativa para la producción de proteínas lisosómicas, que son activas como terapéuticos para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico que requieren una glucosilación adecuada.

Sumario de la invención

Dicho objetivo de la presente invención resulta resuelto por la presente invención, que se basa en los inesperados resultados de que: i) las glucosilaciones paucimanosídicas en proteínas lisosómicas permiten que resulten adecuadas para opciones de tratamiento, y ii) que dichas glucosilaciones paucimanosídicas pueden obtenerse fácilmente en sistemas de expresión de briofitos.

La presente invención proporciona un método de preparación de una composición de proteína lisosómica que comprende la expresión de un transgén codificante de una proteína lisosómica en una planta o célula de briófita (“bryophyte plant or cell”), en la que dicha proteína lisosómica se expresa con una señal secretora N-terminal, en la que dicha señal secretora se elimina opcionalmente durante el procesamiento intracelular, y en la que la proteína lisosómica no presenta una señal vacuolar C-terminal con la secuencia VDTM (SEC ID n° 1) y no presenta una señal de retención de ER C-terminal con la secuencia KDEL (SEC ID n° 2), y dicho método comprende además la obtención de una proteína lisosómica expresada a partir de dicha planta o célula. La invención proporciona, además, una composición de proteína lisosómica obtenible mediante el método inventivo.

La invención proporciona, además, una composición de proteína lisosómica que comprende una pluralidad de proteínas lisosómicas que están glucosiladas de manera diversa según un patrón de glucosilación, en la que dicho patrón de glucosilación presenta por lo menos 45% de N-glicanos paucimanosídicos (% molar). Dicha composición de proteína puede obtenerse mediante el método inventivo.

Se proporciona además un método de procesamiento de una proteína lisosómica que comprende un N-glicano complejo, en el que dicho método comprende proporcionar la proteína lisosómica en una muestra y poner en contacto la muestra con un enzima HEXO de briófito, preferentemente HEXO3, de manera que el enzima HEXO de briófito escinde los residuos de GlcNAc terminales respecto de la proteína lisosómica, produciendo de esta manera un N-glicano paucimanosídico. El enzima HEXO puede encontrarse en una célula, especialmente una célula vegetal. Las proteínas lisosómicas pueden proporcionarse en forma de un medicamento o en una composición farmacéutica.

La invención proporciona además una planta o célula de briófita que resulta adecuada para llevar a cabo el método inventivo que comprende dicho transgén codificante de una proteína lisosómica.

La invención se refiere además a una composición de proteína lisosómica según la invención para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómica que comprende administrar una composición de proteína lisosómica según la invención en un paciente en necesidad de tratamiento.

La totalidad de dichos aspectos están interrelacionados, forman igualmente parte de la totalidad de la invención proporcionada en la presente memoria y formas de realización preferidas de la invención en cualquier combinación puede estar relacionadas con cualquiera de dichos aspectos, por ejemplo, pueden proporcionarse o utilizarse plantas o células transformadas con un constructo o método dado para la producción de cualquier proteína lisosómica que debe glucosilarse según la invención. La descripción detallada siguiente de cualquier forma de realización o característica preferida se refiere a todos los aspectos igualmente. Por ejemplo, una característica de producto de la proteína lisosómica se refiere a que el método se selecciona para producir dicha proteína lisosómica con su característica de producto. Una descripción de etapas particulares del método es igualmente descriptiva de la proteína modificada mediante dichas etapas del método. La célula inventiva se transforma a fin de facilitar cualquier método inventivo de preparación en la célula. Todas las proteínas lisosómicas pueden utilizarse en los métodos inventivos de utilización (terapéutica o no terapéutica) de la proteína lisosómica. La presente invención se define adicionalmente en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) son un grupo de aproximadamente 50 trastornos metabólicos hereditarios que resultan de defectos en el funcionamiento lisosómico. Los lisosomas son responsables de la digestión de diversas moléculas, en la que participan varios enzimas cruciales. En el caso de que uno de estos enzimas sea defectuoso, debido a una mutación, las moléculas grandes se acumulan dentro de la célula, eventualmente matándola. Los trastornos de almacenamiento lisosómico están causados por una disfunción lisosómica, habitualmente como consecuencia de la deficiencia en un único enzima necesario para el metabolismo de los lípidos, glucoproteínas o mucopolisacáridos.

El tratamiento de las enfermedades de almacenamiento lisosómico es principalmente sintomático, y la terapia de sustitución enzimática es la más común. La ERT requiere la administración de proteínas lisosómicas activas en las células mediante una ruta de incorporación.

Tradicionalmente, los enzimas recombinantes utilizados en la ERT se producen en células de mamífero en cultivo. Recientemente, como enfoque alternativo, se han utilizado sistemas de expresión vegetales para producir enzimas lisosómicos para la utilización terapéutica. Respecto a los sistemas de células de mamífero, los sistemas vegetales poseen varias ventajas, entre ellas los menores costes de producción, la eliminación del riesgo de contaminación por patógenos de mamífero y, en el caso de los musgos, una manipulación relativamente más sencilla de la ruta de N-glucosilación. Sin embargo, una cuestión importante al considerar la utilización de enzimas producidos por células vegetales para la ERT son sus estructuras de N-glicano, que difieren de los enzimas producidos por las células de mamífero. Particularmente, los enzimas lisosómicos expresados en las células vegetales típicamente no adquieren la modificación de manosa 6-fosfato (M6P) en los residuos de manosa terminales.

La presente invención proporciona un nuevo método de producción de proteínas lisosómicas transgénicas en células vegetales, especialmente en células de briófito, que inesperadamente ha conducido a la formación de glucoproteínas con un grado elevado de glucosilación paucimanosídica, es decir, una glucosilación que termina con unos cuantos, por ejemplo, 2 residuos de manosa, en una estructura ramificada -Man<(Man)2. Se ha demostrado que estas estructuras resultan altamente eficaces para la incorporación, especialmente en células afectadas por una enfermedad de almacenamiento lisosómico. Esta glucosilación alterada no es natural para las proteínas lisosómicas, aunque inesperadamente las proteínas alteradas todavía resultan ser proteínas terapéuticas muy eficaces.

La proteína lisosómica utilizada en el método inventivo es un transgén, por ejemplo, de origen de mamífero, para la utilización en la ERT en ese mamífero de origen. Estas proteínas lisosómicas transgénicas producidas en briófitos pueden utilizarse como proteínas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico. De esta manera, las proteínas lisosómicas son enzimas activas una vez administradas, en particular son activas bajo condiciones presentes en un lisosoma, tales como un pH de aproximadamente 5. Evidentemente resultan posibles formas de almacenamiento inactivas, por ejemplo, liofilizadas. La glucosilación paucimanosídicas inventivas no interfiere sustancialmente con la actividad enzimática, aunque media en la incorporación y estabilidad de las proteínas lisosómicas. Inesperadamente, los N-glicanos inventivos en las proteínas lisosómicas conducen a una eficacia elevada, permitiendo un uso terapéutico de las mismas, especialmente en el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico.

La presente invención puede basarse en métodos conocidos de introducción de transgenes en briófitos. Se han desarrollado sistemas de transformación adecuados para el aprovechamiento biotecnológico de los briófitos para la producción de proteínas heterólogas. Por ejemplo, se han llevado a cabo transformaciones con éxito mediante trasferencia de ADN directa en tejido de protonema mediante la utilización de pistolas génicas. Asimismo se ha conseguido la transferencia de a Dn mediada por PEG en protoplastos de musgo. El método de transformación mediada por PEG se ha descrito muchas veces para Physcomitrella patens y conduce tanto a transformantes transitorios como estables (K. Reutter y R. Reski, Pl. Tissue culture and Biotech. 2:142-147, 1996). Además, puede llevarse a cabo la transformación sin marcadores mediante un método de transformación mediada por PEG asimismo con briófitos (Stemmer C., Koch A. y Gorr G., 2004, Moss 2004, The 7th Annual Moss International Conference, Freiburg, Alemania) y puede utilizarse para la introducción posterior de múltiples secuencias de nucleótidos.

Se conoce a partir de la técnica anterior información detallada sobre el cultivo de briófitos que resultan adecuados para la utilización en la invención, tales como Leptobryum pyriforme y Sphagnum magellanicum, en biorreactores (E. Wilbert, “Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism”, tesis de doctorado, University of Mainz, 1991; H. Rudolph y S. Rasmussen, Crypt. Bot. 3:67-73, 1992). Resulta especialmente preferida en el contexto de la presente invención la utilización de Physcomitrella patens, ya que las técnicas de biología molecular se aplican en este organismo (R. Reski Bot. Acta, 111, páginas 1 a 15, 1998). Para el cultivo de briófitos, pueden utilizarse medios con complementos (Baur et al., Plant Biotechnol. J. 3:331-340, 2005) o sin complementos, tales como elementos traza (Weise et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 70:337-345, 2006).

El método inventivo de preparación de una composición de proteína lisosómica preferentemente comprende expresar un transgén codificante de una proteína lisosómica en una planta o célula de briófita, en la que dicha proteína lisosómica se expresa con una señal secretora N-terminal y la proteína lisosómica no presenta una señal vacuolar C-terminal con la secuencia VDTM (SEC ID n° 1). Lo anterior evitaría el transporte dirigido a vacuolas, que conduciría al almacenamiento de la proteína lisosómica en vacuolas (en lugar de la excreción) y potencialmente a un procesamiento diferente del glicol en la vacuola, en la que todavía son posible en cierta medida las glucoformas paucimanosídicas. En el Golgi, sin transporte dirigido a vacuolas, basándose en la interacción de proteínas recombinantes específica de los briófitos, una ruta de glucosilación diferente inesperadamente condujo a cantidades elevadas de glucosilación paucimanosídica independiente del procesamiento vacuolar. Lo anterior resulta muy inesperado, ya que en el tabaco la ruta no vacuolar secretora condujo a la formación de N-glicanos predominantemente complejos en lugar de a glucosilación paucimanosídica (documento US6887696). Aparentemente, los briofitos presentan un reconocimiento único de las proteínas lisosómicas que conduce a dicha modificación.

La SEC ID n° 1 es una señal de transporte dirigido a vacuolas vegetal C-terminal que conduce a un transporte dirigido a vacuolas eficiente. En algunas formas de realización, pueden encontrarse presentes otras señales de transporte dirigido a vacuolas, especialmente señales no vegetales, que conducen a un transporte dirigido a vacuolar menos eficiente y a algo de expresión posteriormente en la ruta secretora que evita las vacuolas. Sin embargo, en las formas de realización más preferidas, no se encuentra presente ninguna señal de transporte dirigido a vacuolas durante la expresión o ni siquiera en el producto obtenido final. Las señales vacuolares asimismo pueden eliminarse artificialmente después de obtener la proteína a partir de las células.

Los N-glicanos paucimanosídicos están basados en el recorte de los N-glicanos complejos. En el Golgi, la GlcNAc terminal se elimina de los glicanos complejos, dejando una manosa terminal; en el caso del sistema de briófito, lo anterior resulta muy eficiente, dejando una manosa terminal en ambas ramas del N-glicano (anteriormente complejo).

Según la invención, se utiliza una secuencia de señal secretora, habitualmente en el extremo N de la secuencia de aminoácidos. La señal secretora N-terminal asimismo se denomina péptido de tráfico o secuencia de señal del RE. Es parte de la secuencia de aminoácidos codificada y expresada. La señal secretora conduce a la expresión directamente en RE de la célula, fijando las rutas para la secreción (o a un destino vacuolar en el caso de que se encuentre presente una señal vacuolar). La señal secretora habitualmente resulta eliminada intrínsecamente de la secuencia de aminoácidos de la proteína durante la expresión. Éste es un proceso natural en la célula vegetal. Para permitir la localización apropiada del producto de expresión de los transgenes, los genes de las proteínas lisosómicas pueden modificarse para permitir la localización en la célula vegetal. Preferentemente se utilizan secuencias de ácidos nucleicos híbridas en los constructos para la transformación de las plantas o células vegetales. Los dominios relevantes para la localización de, por ejemplo, los enzimas de mamífero, se sustituyen por secuencias vegetales a fin de conseguir la localización y tráfico celular correctos, tal como en el RE y/o Golgi en la planta. Un ejemplo de una señal secretora vegetal es la SEC ID n° 5, aunque puede utilizarse cualquier otra señal secretora vegetal. Puede ser una secuencia endógena a la especie de briófito utilizada o puede ser una secuencia vegetal foránea, aunque preferentemente es una secuencia de briófito.

El método inventivo incluye la expresión de la proteína lisosómica sin una señal vacuolar vegetal (de briófito), que presenta la secuencia VDTM (SEC ID n° 1). Lo anterior conduce a una ruta de expresión desde el RE hasta el Golgi y eventualmente a la secreción, evitando la localización terminal en una vacuola. En los briófitos, la secreción puede ser directamente al medio de cultivo. En otras plantas puede ser un compartimiento apoplástico de la célula vegetal. Inesperadamente, incluso sin la localización vacuolar, pudo conseguirse un grado elevado de glucosilación paucimanosídico mediante el método inventivo.

Como etapa final, a continuación, se obtiene la proteína lisosómica expresada a partir de dicha planta o célula. Con este fin, la proteína lisosómica puede recogerse de un procedimiento de extracción a partir de las células, que puede ser disruptivo o no disruptivo. Preferentemente, la proteína lisosómica expresada se obtiene a partir de materia secretada de la planta o célula, por ejemplo a partir del medio de cultivo, preferentemente sin disrupción de las células o plantas productoras. A continuación, la proteína lisosómica obtenida puede purificarse, por ejemplo, hasta una concentración de por lo menos 80% (m/v), preferentemente de por lo menos 90% (p/v), especialmente preferentemente de por lo menos 95% (m/v) o de por lo menos 98% (m/v) o de por lo menos 99% (m/v).

Preferentemente, la planta o célula de briófita es un musgo, preferentemente P. patens, planta o célula. El briófito puede ser cualquier briófito, aunque preferentemente se selecciona de entre musgo, hepática o antocerota, especialmente preferentemente de la clase Bryopsida o de los géneros Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantía y Sphaerocarpos. Physcomitrella patens es un sistema particularmente preferido, ya que presenta una frecuencia elevada de recombinación homóloga.

La materia objeto de la invención son plantas y células vegetales. La expresión “célula vegetal” tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a una célula aislada, a una célula singularizada, aunque asimismo a una célula en un tejido vegetal o de un tejido vegetal, preferentemente un tejido seleccionado de entre callo, protonema, floema, xilema, mesófilo, tronco, hojas, talo, cloronema, caulonema, rizoide o gametóforo, o una célula en un organismo vegetal. La célula puede ser una célula de protoplasto. En formas de realización preferidas, las células vegetales aisladas o incluso los tejidos vegetales se transforman según la invención y después crecen hasta formar plantas o tejidos vegetales, o siguen siendo cultivos de células vegetales, tales como un cultivo en suspensión, por ejemplo, un biorreactor (Hohe y Reski, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81:307-311,2005).

La proteína lisosómica además no presenta una señal C-terminal de retención de ER con la secuencia KDEL (SEC ID n° 2). Las señales de retención de ER conducen a una retención en RE o en el sistema de Golgi. Lo anterior puede presentar un profundo impacto sobre el patrón de glucosilación observado en la proteína expresada, ya que la glucosilación es un proceso competitivo con varios enzimas glucosilantes que compiten por las proteínas de sustrato que deben modificarse. Aunque se esperaría que el recorte paucimanosídico beneficiase la retención de ER, inesperadamente las proteínas lisosómicas inventivas se expresaron con cantidades elevadas de N-glicanos paucimanosídicos sin dicha (o ninguna) señal de retención de ER.

La SEC ID n° 2 es una señal C-terminal de retención de ER que conduce a una retención eficiente en el RE o en el Golgi. Además, el motivo dilisina (KXKX) C-terminal preferido, asimismo responsable de la retención de ER en cierta medida, asimismo falta. En algunas formas de realización, pueden encontrarse presentes otras señales de retención de ER, especialmente señales no vegetales, que conducen a una retención menos eficiente en RE/Golgi y a un procesamiento de compartimiento a compartimiento hacia la secreción. Sin embargo, en formas de realización más preferidas, no se encuentra presente ninguna señal de retención de ER durante la expresión o incluso en el producto obtenido final. Las señales de retención de ER asimismo pueden eliminarse artificialmente después de la obtención de la proteína a partir de las células.

Resulta especialmente preferido para cualquier forma de realización de la presente invención, que la proteína lisosómica no presente una secuencia de señal de retención de ER C-terminal vegetal y una secuencia de señal vacuolar C-terminal vegetal; resulta especialmente preferido que no presente cualquier secuencia de señal C-terminal de retención de ER y cualquier secuencia de señal C-terminal vacuolar. Las señales vegetales son de origen vegetal y se encuentran en plantas, especialmente briófitos. Son funcionales en los briófitos. Tal como se ha explicado anteriormente, la retención de ER no resulta necesaria e incluso el procesamiento vacuolar no resulta necesario para la elevada glucosilación paucimanosídica en los sistemas de expresión de briófito inventivos.

Preferentemente, la proteína lisosómica comprende una secuencia de aminoácidos expresada que termina en el extremo C con los aminoácidos de una proteína lisosómica nativa o un truncamiento de la misma. Lo anterior significa que no se encuentran presentes adiciones en la secuencia de las proteínas. Son posibles los truncamientos, aunque no resultan preferidos. Evidentemente, los truncamientos no afectan sustancialmente la actividad de la proteína lisosómica inventiva, que todavía es un requisito tal como se ha explicado anteriormente. La actividad enzimática puede reducirse, por ejemplo hasta en 20% en comparación con la proteína lisosómica nativa bajo condiciones lisosómicas en una célula de mamífero, especialmente humana, tal como a un pH de 5. Los truncamientos pueden ser una deleción de como máximo 50, preferentemente de como máximo 40, como máximo 30, como máximo 20, como máximo 10, como máximo 5 o uno, o cualquier intervalo entre dichos valores (por ejemplo, 1 a 10, etc.) aminoácidos C-terminales de la proteína lisosómica nativa. Es conocido que las alfagalactosidasas truncadas son activas con dichos truncamientos, tal como se indica, por ejemplo, en el documento US 6.887.696 B2.

Preferentemente, la planta o célula de briófita comprende o no comprende un transgén de HEXO3. HEXO3 es un enzima que se encuentra naturalmente en las plantas. Puede proporcionarse (o no) en forma de un transgén para incrementar todavía adicionalmente la actividad de HEXO3. Las introducciones de transgenes pueden resultar facilitadas por los mismos métodos mediante los que el transgén de proteína lisosómica resulta incorporado en la planta o célula, por ejemplo, mediante hibridación recombinante genómica o la introducción de un plásmido. Se afirma que HEXO3 es responsable de algo de glucosilación paucimanosídica en el apoplasto de recubrimiento de la membrana plasmática de las plantas (Liebminger et al., J. Biol. Chem. 286:10793-10802, 2011; Bosch et al., Curr. Pharm. Des. 19(31):5503-12, 2013); sin embargo, la actividad de HEXO observada por Liebminger en Arabidopsis thaliana no puede explicar la elevada glucosilación paucimanosídica observada en briófitos. El enzima relacionado, HEXO1, es responsable de algo de glucosilación paucimanosídica vacuolar y HEXO2 aparentemente presenta poca actividad en Arabidopsis. Puede observarse una actividad más elevada o una mejor accesibilidad en los briófitos.

Aparentemente, HEXO de briófitos presenta una actividad particularmente alta sobre las proteínas lisosómicas. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método in vitro de procesamiento de una proteína lisosómica que comprende un N-glicano complejo, en el que dicho método comprende proporcionar la proteína lisosómica en una muestra y poner en contacto la muestra con un enzima HEXO de briófito, preferentemente HEXO3, de manera que el enzima HEXO de briófito escinde los residuos de GlcNAc terminales respecto de la proteína lisosómica, produciendo de esta manera un N-glicano paucimanosídico. Esencialmente, la ruta de glucosilación de la proteína lisosómica nativa presente en los briofitos asimismo puede llevarse a cabo fuera de la célula de briófita, especialmente in vitro con enzimas HEXO aislados, o en otra célula, preferentemente una célula vegetal mediante la sustitución en dicha planta de un enzima HEXO activo procedente de un briófito, especialmente un musgo, tal como P. patens. Esta planta puede ser un no briófito, por ejemplo, una planta superior, o un briófito, para incrementar la carga génica de HEXO, preferentemente de HEXO3, tal como se ha detallado anteriormente.

Preferentemente, la planta o célula de briófita tiene suprimida o eliminada la alfa1,3-fucosiltransferasa y/o la beta-1,2-xilosiltransferasa. Dichos enzimas vegetales pueden presentar una actividad o concentración reducida, por lo menos en el sitio de su actividad natural, tal como el Golgi. Los enzimas que preferentemente se eliminan son la alfa-1,3-fucosiltransferasa y/o la beta-1,2-xilosiltransferasa, tal como se indica en el documento WO 2004/057002. De esta manera, según una forma de realización preferida, dicha célula vegetal además presenta una actividad reducida, preferentemente una pérdida completa de función, de alfa-1,3-fucosiltransferasa y/o de beta-1,2-xilosiltransferasa, en particular mediante inactivación, de manera especialmente preferida mediante interrupción del gen codificante de alfa-1,3-fucosiltransferasa y/o de beta-1,2-xilosiltransferasa, preferentemente por un gen de entre cualquiera de las proteínas expresadas recombinantemente. Esta medida impide la formación de glucosilaciones de tipo vegetal que pueden ser inmunogénicas en un mamífero, tal como un ser humano.

Se proporciona además una célula o planta de briófito adecuada para llevar a cabo dicho método. La célula o planta comprende un transgén codificante de una proteína lisosómica tal como se ha indicado para el método alternativo y opcionalmente cualquier modificación o transgén adicional tal como se ha indicado anteriormente.

La presente invención proporciona además una composición de proteína lisosómica obtenible mediante cualquier método de preparación indicado en la presente memoria. La proteína lisosómica puede presentar cualesquiera características tales como las producidas mediante un método o variante preferidos o forma de realización tal como se ha indicado anteriormente. La proteína lisosómica habitualmente se obtiene en una pluralidad de dichas proteínas lisosómicas, con el patrón de glucosilación lisosómica inventivo observado en briófitos en las proteínas lisosómicas (transgénicas).

Especialmente, la invención proporciona una composición de proteína lisosómica que comprende una pluralidad de proteínas lisosómicas que potencialmente se encuentran glucosilados diversamente según un patrón de glucosilación, en la que dicho patrón de glucosilación presenta por lo menos 45%, preferentemente por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65% o por lo menos 70% de N-glicanos paucimanosídicos.

Todos los valores de porcentaje proporcionados en la presente memoria son porcentajes molares, excepto cuando se indique lo contrario.

Una pluralidad se refiere a una preparación que comprende proteínas inventivas, es decir, no proteínas individualizadas, sino una preparación macroscópica de dichas proteínas tal como se obtiene a partir de células o plantas, que comprende más de una proteína lisosómica al expresarse. La preparación puede presentar por lo menos 1000 moléculas de proteína, resultan especialmente preferidas por lo menos 100.000 moléculas o por lo menos 1 millón de moléculas.

Preferentemente, la proteína lisosómica de la composición o producida o utilizada mediante los métodos inventivos o en los métodos inventivos es una seleccionada de entre a-galactosidasa, preferentemente a-galactosidasa A (GLA), p-glucoceramidasa, p-glucosidasa (glucocerebrosidasa), a-manosidasa, aspartilglcuosaminidasa, pmanosidasa, ceremidasa ácida, a-fucosidasa, p-galactosidasa, proteína activadora de p-hexosaminidasa, galactocerebrosidasa, galactoceramidasa, lipasa ácida lisosómica (LAL), a-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, glucosamina-N-sulfatasa, heparán-sulfatosulfamidasa (SGSH), a-N-acetil-glucosaminidasa (NAGLU), (heparán)aglucosaminida-N-acetiltransferasa, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa, p-galactosidasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, p-glucuronidasa, neuraminadasa, esfingomielinasa, esfingomielina fosfodiesterasa, ácido alfa-1,4-glucosidasa, p-hexosaminidasa o su subunidad a, alfa-N-acetilgalactosaminidasa (NAGA), a-galactosaminidasa, p-hexosaminidasa A, galactosa-6-sulfato sulfatasa e hialuronidasa. Resulta especialmente preferido en todas las formas de realización de la invención es a-galactosidasa. Una a-galactosidasa preferida es la a-galactosidasa humana, por ejemplo, de SEC ID n° 3, que puede expresarse a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID n° 3, que puede expresarse a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID n° 4, o una a-galactosidasa truncada de las mismas. Asimismo resulta preferida una glucocerebrosidasa, por ejemplo, glucocerebrosidasa humana, por ejemplo, de SEC ID n° 6, que puede expresarse a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID n° 7. Asimismo resulta preferida la alfa-glucosidasa, por ejemplo, alfa-glucosidasa humana, por ejemplo, de SEC ID n° 8, que puede expresarse a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID n° 9. En otras formas de realización, la glucocerebrosidasa y la alfa-glucosidasa están excluidas del grupo de proteínas lisosómicas según la invención.

Preferentemente, las proteínas lisosómicas presentan uno o más N-glicanos paucimanosídicos que comprenden la estructura de fórmula 1:

(fórmula 1)

en la que un cuadrado representa N-acetilglucosamina (GlcNAc), un círculo representa manosa (Man) y un círculo con una T representa una manosa terminal. Dicha fórmula 1, asimismo denominada en la presente memoria, glicano “MM”, representa una estructura nuclear que puede modificarse adicionalmente: en los N-glicanos paucimanosídicos dicha modificación adicional asimismo resulta posible con la condición de que las T-manosas sigan siendo terminales, es decir, se encuentren en los extremos no reductores de las cadenas sacáridas. Las manosas terminales pueden estar metiladas, especialmente O-metiladas. Son modificaciones comunes aquellas en las que una o más de las subunidades de GlcNAc o Man pueden encontrarse a1,3-fucosiladas, a1,6-fucosiladas y/o p1,2-xilosiladas. Las a1,3-fucosilaciones y a1,6-fucosilaciones se observan comúnmente en la GlcNAc reductora. Habitualmente se observa una p1,2-xilosilación en la manosa no terminal (círculo sin T en la fórmula 1). Según la invención, preferentemente una a1,3-fucosilación y/o p1,2-xilosilación se evita o se reduce debido a la inhibición de los enzimas respectivos durante la preparación, tal como se ha indicado anteriormente. Puede encontrarse presente o no a1,6-fucosilación. No es habitual en plantas, aunque puede llevarse a cabo mediante la introducción de una a1,6-fucosiltransferasa en la célula o planta expresante. Preferentemente, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de los N-glicanos de las proteínas lisosómicas de las composiciones inventivas comprenden o consisten en la estructura de fórmula 1 (% molar).

Una estructura de N-glicano pacumanosídico de la invención asimismo puede representarse mediante la fórmula (2):

Mana!

6

ManpMGkNAcPMGIcNAc

₃

Mana!'’’

(fórmula 2)

La fórmula 2 muestra además el tipo de conectividad de las subunidades de carbohidrato. La GlcNAc a la derecha está unida a la secuencia de aminoácidos de la proteína lisosómica. Los extremos reductor y no reductor de un oligosacárido convencionalmente se representan con el residuo monosacárido de extremo reductor más a la derecha y el extremo no reductor más a la izquierda (tal como en, por ejemplo, la fórmula 2). Debe observarse que la GlcNAc reductora se muestra a la izquierda en las fórmulas cortas proporcionadas en la presente memoria, tal como -GlcNAc2-Man3. En un N-glicano, la -GlcNAc reductora está unida a una asparagina en la cadena de aminoácidos de la proteína lisosómica. Lo anterior se indica mediante el símbolo “-“ a la izquierda, que es un enlace con el residuo de Asn. En las glucoformas paucimanosídicas, hay dos extremos de manosa no reductores (izquierda en la fórmula 2, arriba en la fórmula 1).

La fórmula (2) es el núcleo común de la mayoría de N-glicanos, incluyendo los N-glicanos ricos en manosa y los N-glicanos complejos (ver Rayon et al., J. Exp. Botany 49(326):1463-1472, 1998). En el caso de las estructuras paucimanosídicas, tanto la Man superior como la inferior a la izquierda tal como se muestran en la fórmula (2) son terminales, mientras que en los N-glicanos ricos en manosa y complejos por lo menos una Man contiene un enlace adicional a otra Man o GlcNAc. La a1,3-gucosilación, a1,6-fucosilación y/o p1,2-xilosilación de dicho núcleo son opcionales. La a1,3-fucosilación y la p1,2-xilosilación son comunes en plantas, a menos que los enzimas respectivos se encuentren inhibidos (por ejemplo, tal como se muestra en el documento WO 2004/057002 o en Cox et al., Nature Biotechnology 24(12):1591-7, 2006).

En el caso de que las proteínas lisosómicas expresadas presenten un contenido en glicanos MGn (una N-acetilglucosamina terminal adicional en una Man terminal, tal como se muestra en la fórmula 2) o glicanos GG (una N-acetilglucosamina terminal adicional en cada Man terminal, tal como se muestra en la fórmula 2), dichos glicanos MGn o GG pueden convertirse en las estructuras de la fórmula 1 o 2 mediante el tratamiento con beta-N-acetilglucosaminidasa. El tratamiento de beta-N-acetilglucosaminidasa puede llevarse a cabo mediante cualquier proteína lisosómica producida por un musgo, a fin de incrementar los glicanos paucimanosídicos. La agalactosidasa A expresada en musgo habitualmente no requiere beta-N-acetilglucosaminidasa, ya que los glicanos paucimanosídicos se encuentran naturalmente en concentraciones elevadas. Según las condiciones de cultivo, la glucocerebrosidasa y alfa-glucosidasa producidas por musgo en ocasiones requieren el tratamiento con beta-N-acetilglucosaminidasa. Entre otros métodos para crear las proteínas lisosómicas glucosiladas inventivas se incluyen la expresión en insectos o células de insecto, tales como las células Sf9, la expresión en células de levadura glucomanipuladas y la expresión en un musgo con una señal de transporte dirigido vacuolar (aunque resulta menos preferido, ya que la señal puede ser inmunógena en un paciente mamífero). Cualquier referencia en la presente memoria a proteínas lisosómicas “producidas en un musgo” o “producidas en un briófito” se refieren a los productos obtenibles mediante la producción en un musgo, es decir, que presentan los N-glicanos paucimanosídicos inventivos en cantidades elevadas tal como se indica en la presente memoria, con independencia del método de preparación utilizado. Puede seleccionarse cualquier método de preparación para producir los productos inventivos y “producido en un musgo” o “producido en un briófito” asimismo se refiere a dichos productos en métodos de producción no en un musgo. La expresión “producido en un musgo” o “producido en un briófito” se utiliza para expresar el patrón de glucosilación único, que se ha observado en los musgos y se define en la presente memoria particularmente, por ejemplo, en las reivindicaciones de producto y en la descripción de dichos productos en la presente memoria.

Una característica única de la N-glucosilación en briófitos de las proteínas lisosómicas según el método inventivo es la presencia de hexosas metiladas (Hex), preferentemente manosa metilada (Man) en los N-glicanos inventivos. Dichas manosas metiladas, en caso de ser terminales, no interfieren en la incorporación de las proteínas lisosómicas inventivas e incluso pueden potenciarla. Preferentemente, el patrón de glucosilación de la composición inventiva presenta por lo menos 1%, más preferentemente por lo menos 2%, por lo menos 3% o por lo menos 4% de N-glicanos de fórmula GlcNAc2-Hex2-metil-Hex, en la que Hex preferentemente es manosa (% molar). Según el método inventivo, la metilación habitualmente es una metilación de un oxígeno de la manosa, en particular una 2-O-metilación. Estas son metilaciones preferidas de las proteínas lisosómicas inventivas de la composición. Preferentemente, por lo menos 1%, más preferentemente por lo menos 2%, por lo menos 3% o por lo menos 4% de los N-glicanos de la composición presentan una metilación, especialmente una O-metilación, por ejemplo, 2-O-metilación (% molar). Preferentemente, en dichos N-glicanos metilados, únicamente uno de las por lo menos dos manosas terminales (no reductoras) se encuentra metilado.

Preferentemente, el patrón de glucosilación comprende los N-glicanos siguientes:

i) 0% a 35%, preferentemente 0.5% a 30%, -GlcNAc2-(Man2metil-Hex),

ii) 30% a 80%, preferentemente 40% a 70%, especialmente preferentemente 45% a 60%, -GlcNAc2-Man3, iii) 0% a 30%, preferentemente 4% a 22%, -GlcNAc2-Man3-GlcNAc,

iv) 0% a 15%, preferentemente 2% a 12%, -GlcNAc2-Man3-GlcNAc2,

v) 0% a 5%, preferentemente 0% a 3%, -GlcNAc2-Man3-Hex2,

vi) 0% a 11%, preferentemente 1% a 8%, -GlcNAc2-Man3-Hex3,

vii) 0% a 10%, preferentemente 1% a 7%, -GlcNAc2-Man3-Hex4,

viii) 0% a 10%, preferentemente 1% a 7%, -GlcNAc2-Man3-Hex5,

en los que la totalidad de dichos compuestos juntos constituyen 100% o menos de 100%, lo que resulta evidente por sí mismo (todos los % son % molares). Resulta posible menos de 100% ya que pueden encontrarse presentes otros N-glicanos, no especificados en el listado anterior. Dichos otros N-glicanos puede constituir entre 0% y 30%, preferentemente entre 0.01% y 20%, especialmente preferentemente entre 0.1% y 10%. Cualquiera de los N-glicanos especificados, i) a viii), puede encontrarse en una cantidad de por lo menos 0,01%, en lugar de 0%. GlcNAc es una subunidad de N-acetilglucosamina; Man es una subunidad de manosa; Hex es una subunidad de hexosa; metil-Hex es una subunidad de hexosa metilada, preferentemente 2-O-metil-hexosa. En dicho patrón de glucosilación, -GlcNAc2-(Man2metil-Hex) y -GlcNAc2-Man3 juntos constituyen por lo menos 45% (% molar), es decir, son N-glicanos paucimanosídicos que contribuyen a dicha cantidad tal como se indica en el sumario de la invención. Una Hex especialmente preferida es Man en cualquiera de los N-glicanos anteriormente indicados i) a viii). La GlcNAc en el extremo reductor del glicano puede encontrarse fucosilada o no fucosilada en cualquiera de los N-glicanos anteriormente indicados i) a viii). Una Man en un punto de ramificación se encuentra xilosilada o no xilosilada en cualquiera de los N-glicanos anteriormente indicados i) a viii).

En una forma de realización particularmente preferida, todos los N-glicanos indicados en la lista anterior, i) a viii), se encuentran en la cantidad preferida según se proporciona en el párrafo anterior.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprende el N-glicano i), -GlcNAc2-(Man2metil-Hex), en una cantidad de por lo menos 0.5%, por lo menos 1%, por lo menos 2% o por lo menos 3%. Especialmente preferentemente se encuentra en una cantidad de como máximo 30%, como máximo 25%, como máximo 20% o como máximo 15%. La cantidad del mismo se encuentra comprendida en el intervalo de 0.5% a 30%, de 1% a 25% o de 2% a 20%.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprende el N-glicano ii), -GlcNAc2-Man3, en una cantidad de por lo menos 30%, de por lo menos 40%, de por lo menos 45% o de por lo menos 50%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 80%, como máximo 75%, como máximo 70% o como máximo 65%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 30% a 80%, 40% a 70% o 45% a 60%. Éste es el N-glicano más importante según la invención y puede encontrarse presente en dichas cantidades en cualquier forma de realización de la invención.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprenda el N-glicano iii), -GlcNAc2-Man3-GlcNAc, en una cantidad de por lo menos 0.5%, por lo menos 2%, por lo menos 4% o por lo menos 6%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 30%, como máximo 25%, como máximo 20% o como máximo 15%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 0.5% a 30%, 1% a 25% o 2% a 20%.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprenda el N-glicano iv), -GlcNAc2-Man3-GlcNAc2, en una cantidad de por lo menos 0.2%, por lo menos 0.5%, por lo menos 1% o por lo menos 2%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 20%, como máximo 15%, como máximo 12% o como máximo 10%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 0.5% a 15%, 1% a 12.5% o 2% a 10%.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprenda el N-glicano v), -GlcNAc2-Man3-Hex2, en una cantidad de por lo menos 0.01%, por lo menos 0.05%, por lo menos 0.1% o por lo menos 0.5%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 5%, como máximo 4%, como máximo 3% o como máximo 2%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 0.1% a 5%, 0.2% a 4% o 0.5% a 3%.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprenda el N-glicano vi), -GlcNAc2-Man3-Hex3, en una cantidad de por lo menos 0.1%, por lo menos 0.2%, por lo menos 0.75% o por lo menos 1%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 11%, como máximo 10%, como máximo 8% o como máximo 6%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 0.5% a 11%, 1% a 10% o 2% a 9%.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprenda el N-glicano vii), -GlcNAc2-Man3-Hex4, en una cantidad de por lo menos 0.1%, por lo menos 0.2%, por lo menos 0.3% o por lo menos 0.4%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 10%, como máximo 8%, como máximo 6.5% o como máximo 5%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 0.1% a 10%, 0.2% a 8.5% o 0.3% a 7%.

Asimismo resulta preferido que el patrón de glucosilación comprenda el N-glicano viii), -GlcNAc2-Man3-Hex5, en una cantidad de por lo menos 0.1%, por lo menos 0.2%, por lo menos 0.3% o por lo menos 0.4%. Especialmente preferentemente, se encuentra en una cantidad de como máximo 10%, como máximo 8%, como máximo 6.5% o como máximo 5%. La cantidad del mismo puede encontrarse comprendida en el intervalo de 0.1% a 10%, 0.2% a 8.5% o 0.3% a 7%.

Las proteínas lisosómicas inventivas pueden ser de cualquier origen, preferentemente de mamífero, especialmente humanas o de un animal no humano, tal como un roedor, un perro, gato, caballo, vaca, camello o cerdo.

Las glucoproteínas producidas por plantas, incluyendo las proteínas lisosómicas producidas por briófitos inventivas habitualmente no presentan manosas fosforiladas. Asimismo según la invención, los N-glicanos pueden presentar manosas no fosforiladas, especialmente no fosforiladas en absoluto. La fosforilación puede llevarse a cabo artificialmente mediante la introducción de un enzima fosforilante en la célula de expresión o mediante fosforilación después del aislamiento de la proteína a partir de las células. De esta manera, la composición de proteína lisosómica según la invención comprende proteínas lisosómicas no fosforiladas o fosforiladas. Preferentemente, la cantidad de N-glicanos fosforilados de las proteínas lisosómicas de la composición es inferior a 20%, especialmente preferentemente inferior a 15%, inferior a 10%, inferior a 5%, inferior a 2%, inferior a 1% o incluso inferior a 0.5%, por ejemplo, de 0% (% molar).

Las proteínas lisosómicas inventivas pueden encontrarse PEGiladas o no PEGiladas. La PEGilación puede modificar la solubilidad, la biodisponibilidad y la semivida in vivo al administrarlas en un paciente. Dado que la semivida de las proteínas lisosómicas glucosiladas paucimanosídicamente de la invención se encuentra reducida debido a la estructura de N-glicano más pequeña en comparación con las proteínas lisosómicas producidas en mamíferos, la PEGilación resulta especialmente preferida para compensar esta desventaja. Resulta especialmente preferida una PEGilación reversible, que conduzca a una pérdida por lo menos parcial de la PEGilación in vivo, por ejemplo, mediante la introducción de un enlace hidrolizable, tal como una base de Schiff, de manera que no interfiera con la incorporación celular. Además, como medida para reducir la interferencia en la incorporación celular, la PEGilación puede ser de las cadenas de PEG cortas, tales como PEG con 4 a 1000, preferentemente 8 a 100 o 10 a 50 subunidades. En lugar de PEG, puede utilizarse cualquier polímero hidrofílico corto para incrementar la semivida, preferentemente con un peso molecular inferior a 100 kDa, inferior a 10 kDa o inferior a 1 kDa. El PEG preferentemente presenta 2 a 200, preferentemente 3 a 100 o 4 a 50 subunidades de glicol. La proteína lisosómica puede PEGilarse mediante una fracción de enlace como medio para la unión indirecta de la molécula de PEG. Alternativamente, asimismo resulta posible la unión directa.

Preferentemente, las proteínas lisosómicas inventivas no se encuentran entrecruzadas. El entrecruzamiento puede interferir con la incorporación y estabilidad celulares y resulta menos preferente. Preferentemente, el entrecruzamiento se combina con la PEGilación. Por ejemplo, puede utilizarse PEG como agente entrecruzante, especialmente en el caso de PEG bifuncional o multifuncional que presenta por lo menos dos grupos funcionales para la unión a una proteína, tal como bis-COOH-PEG o bis-NHS-PEG. La PEGilación puede enmascarar los aspectos negativos del entrecruzamiento que causan interferencia con la incorporación y estabilidad celulares.

El entrecruzamiento puede conducir a la formación de proteínas lisosómicas multiméricas, especialmente proteínas lisosómicas diméricas preferidas, tales como, por ejemplo, las indicadas para la alfa-galactosidasa en el documento WO 2011/107990. En las proteínas entrecruzadas, por lo menos dos proteínas lisosómicas están conectadas directa o indirectamente mediante una fracción de enlace.

El entrecruzamiento y/o PEGilación puede realizarse mediante una fracción de enlace. Por ejemplo, la fracción de enlace es opcionalmente una fracción que se une covalentemente a una cadena lateral, un extremo N-terminal o C-terminal, o una fracción relacionada con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, una fracción sacárida) de un monómero de proteína lisosómica, así como a una cadena lateral, un extremo N o un extremo C, o una fracción relacionada con las modificaciones postraduccionales (por ejemplo, una fracción sacárida) de otro monómero de proteína lisosómica. Se describen en detalle posteriormente en la presente memoria fracciones de enlace ejemplificativas similares.

Alternativamente, la fracción de enlace forma una parte de los monómeros de proteína lisosómica que se unen (por ejemplo, una parte de una cadena lateral, extremo N-terminal o C-terminal, o una fracción relacionada con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, una fracción sacárida) de un monómero de proteína lisosómica, así como una fracción relacionada con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, una fracción sacárida) de otro monómero de proteína lisosómica. De esta manera, por ejemplo, la fracción de enlace puede ser un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida) entre un grupo funcional de una cadena lateral, extremo N, extremo C o fracción relacionada con modificaciones postraduccionales de un monómero (por ejemplo, una amina) y un grupo funcional complementario de una cadena lateral, extremo N, extremo C o fracción relacionada con modificaciones postraduccionales de otro monómero (por ejemplo, carboxilo), en el que dicho enlace covalente se encuentra ausente de la forma nativa de la a-galactosidasa. Asimismo se encuentran contemplados otros enlaces covalentes, tales como, por ejemplo, un enlace éster (entre un grupo hidroxi y un carboxilo), un enlace tioéster, un enlace éter (entre dos grupos hidroxi), un enlace tioéter, un enlace anhídrido (entre dos carboxilos), un enlace tioamida, un enlace carbamato o tiocarbamato. Opcionalmente, la fracción de enlace se encuentra libre de un enlace disulfuro. Sin embargo, una fracción de enlace que incluye un enlace disulfuro en una posición que no forma un enlace entre monómeros (por ejemplo, el corte del enlace disulfuro no corta el enlace entre los monómeros) se encuentra comprendida en el alcance de la presente forma de realización de la invención. Una ventaja potencial de la fracción de enlace que no presenta un enlace disulfuro es que no es susceptible de corte bajo condiciones suavemente reductoras, como sí ocurre con los enlaces disulfuro. Opcionalmente, la fracción de enlace es una fracción no peptídica (por ejemplo, la fracción de enlace no consiste en un enlace amida, un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un oligopéptido o un polipéptido). Alternativamente, la fracción de enlace puede ser, o puede comprender, una fracción peptídica (por ejemplo, un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un oligopéptido o un polipéptido). Opcionalmente, la fracción de enlace no es meramente una extensión lineal de cualquiera de los monómeros de proteína lisosómica unidos al mismo (es decir, el extremo N y el extremo C de la fracción peptídica no se encuentra unido directamente al extremo C o N de cualquiera del os monómeros de proteína lisosómica). Alternativamente, la fracción de enlace está formada por la unión covalente directa de un extremo N de un monómero de proteína lisosómica a un extremo C de otro monómero de proteína lisosómica, de manera que se produce un polipéptido fusionado. Dicho polipéptido no será una forma nativa de a-galactosidasa, aunque puede comprender dos monómeros de proteína lisosómica esencialmente en su forma nativa. Sin embargo, la unión covalente de monómeros de a-galactosidasa indicada en la presente memoria preferentemente es en una forma diferente del enlace directo de un extremo N a un extremo C. La fracción de enlace es preferentemente una fracción pequeña, de 10 a 1000 Da, preferentemente de 20 a 500 Da.

En el entrecruzamiento y/o la PEGilación, la fracción de enlace puede comprender uno o más grupos reactivos para la unión a la proteína lisosómica. Dichos grupos reactivos pueden reaccionar, por ejemplo, con un grupo tiol o reaccionar con un grupo amina para formar un enlace amida. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “grupo reactivo” describe un grupo químico que es capaz de experimentar una reacción química que típicamente conduce a la formación de un enlace. El enlace, según las presentes formas de realización, es preferentemente un enlace covalente (por ejemplo, para cada uno de los grupos reactivos). Entre las reacciones químicas que conducen a la formación de un enlace se incluyen, por ejemplo, sustituciones nucleofílicas y electrofílicas, reacciones de adición nucleofílicas y electrofílicas, alquilaciones, reacciones de adición-eliminación, reacciones de cicloadición, reacciones de reorganización y cualesquiera otras reacciones orgánicas conocidas que implican un grupo funcional, así como combinaciones de los mismos. El grupo reactivo puede comprender opcionalmente una parte no reactiva (por ejemplo, un alquilo) que puede servir, por ejemplo, para unir una parte reactiva del grupo reactivo a una fracción de enlace (por ejemplo, poli(alquilenglicol) o análogo del mismo) indicada en la presente memoria. El grupo reactivo preferentemente se selecciona de manera que permita su conjugación a la proteína lisosómica. Entre los grupos reactivos ejemplificativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carboxilato (por ejemplo, -CO2H), tiol (-SH), amina (-NH2), halo, azida (-N3), isocianato (-NCO), isotiocianato (-N=C=S), hidroxi (-OH), carbonilo (por ejemplo, aldehído), maleimida, sulfato, fosfato, sulfonilo (por ejemplo, mesilo o tosilo), etc., así como grupos activados, tales como N-hidroxisuccinimida (NHS) (por ejemplo, ésteres de NHS), sulfo-N-hidroxisuccinimida, anhídrido, haluro de acilo (-C(=O)-halógeno), etc. En algunas formas de realización, el grupo reactivo comprende un grupo saliente, tal como un grupo saliente susceptible de sustitución nucleófila (por ejemplo, halo, sulfato, fosfato, carboxilato o N-hidroxisuccinimdia).

La invención proporciona, además, la proteína lisosómica o composición inventiva a modo de un medicamento. Se proporciona, además, una composición de proteína lisosómica según la invención para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómica, que comprende la administración de una composición de proteína lisosómica en un paciente, por ejemplo, un mamífero. Con relación a lo anterior, la invención proporciona la proteína lisosómica inventiva para la utilización en el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómica. El paciente puede ser un mamífero, especialmente un ser humano o un animal no humano, tal como un roedor, un perro, gato, caballo, vaca, camello o cerdo. Preferentemente, la proteína lisosómica es de la misma especie que el paciente, a fin de evitar reacciones inmunitarias contra la cadena de aminoácidos de la proteína.

Preferentemente, la enfermedad y proteína lisosómica se seleccionan de la tabla a continuación:

La dosis para la administración es preferentemente una dosis de 0.05 a 100 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0.1 a 50 mg/kg de peso corporal, especialmente preferentemente de 0.3 a 10 mg/kg de peso corporal, tal como de 0.3, 1 o 3 mg/kg de peso corporal.

Debido a que no existe cura para las enfermedades de almacenamiento lisosómica, se requiere un tratamiento crónico con administraciones repetidas de sustitución enzimática a intervalos regulares. Preferentemente, la proteína lisosómica inventiva se administra en un intervalo de 1 a 30 días, preferentemente de 2 a 25 días, más preferentemente de 3 a 23, o incluso de 4 a 22 días, de 5 a 21 días, de 6 a 20 días, de 7 a 19 días, de 8 a 18 días, de 9 a 17 días, de 10 a 16 días o de 11 a 15 días. Resultan especialmente preferidos los intervalos de 14 días. La administración en dichos intervalos permite una actividad enzimática constante en los lisosomas de las células, contrarrestando la eliminación de la proteína.

Las proteínas lisosómicas pueden administrarse por cualquier vía que conduce a que un enzima funcional alcance el sistema vascular, especialmente el torrente sanguíneo. Resulta preferida la infusión intravenosa (i.v.). Entre las vías adicionales de administración se incluyen la administración intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) y subcutánea (s.c.). Las vías de administración i.p., i.m. y s.c. pueden conducir a una distribución reducida de la proteína lisosómica en el tejido diana (tal como corazón, riñón, hígado y bazo), todavía pueden administrarse cantidades suficientes en dichos tejidos por dichas vías. Estas vías no i.v., en particular i.p., i.m. y s.c., se benefician de una mejor aceptación por el paciente y habitualmente el beneficio supera la distribución reducida en los tejidos diana. Además, los perfiles farmacocinéticos de las administraciones no i.v. resultan beneficiosos, ya que el enzima terapéutico se encuentra disponible en el plasma de los pacientes durante un periodo de tiempo prolongado.

En formas de realización preferidas, el tratamiento médico inventivo con una proteína lisosómica de la invención (producida en un briófito) es en combinación con una proteína lisosómica del mismo tipo y actividad enzimática cualitativa, aunque producido en una especie no vegetal, especialmente células de mamífero o fúngicas. La proteína lisosómica producida en una especie no vegetal puede presentar una manosa fosforilada para el reconocimiento del receptor de manosa-6-fosfato (M6PR) y la incorporación celular. Además, puede utilizarse una proteína lisosómica con manosa (artificialmente) fosforilada de cualquier origen en combinación con la proteína lisosómica inventiva. Dichas proteínas lisosómicas fosforiladas o de especie no briófito ya se están utilizando, tal como Agalsidasa alfa (Replagal®) y Agalsidasa beta (Fabrazyme®) en el caso de la alfa-galactosidasa adecuada para el tratamiento de la enfermedad de Fabry; Alglucerasa (Ceredase®), Imiglucerasa, Velaglucerasa alfa (VPRIV), como p-glucocerebrosidasas, adecuadas para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher; A1-glucosidasa alfa (Myozyme®) adecuada para el tratamiento de la enfermedad de Pompe; Idursulfasa (Elaprase®), el enzima lisosómica iduronato-2-sulfatasa adecuado para el tratamiento del síndrome de Hunter (MPS-II). Asimismo resultan posibles otras proteínas lisosómicas producidas en plantas para la utilización en combinación, tal como Taliglucerasa alfa (Elelyso®), una glucocerebrosidasa. La proteína lisosómica fosforilada y/o no de briófito puede entrecruzarse con la proteína lisosómica paucimanosídica. El dímero o multímero entrecruzado preferentemente se encuentra adicionalmente PEGilado. Lo anterior mejora la estabilidad, semivida e incorporación.

La proteína lisosómica inventiva con glucosilación paucimanosídica asimismo puede combinarse con un chaperón, en particular un chaperón específico o no específico de la proteína lisosómica del mismo tipo y actividad enzimática cualitativa. Un chaperón farmacológico de proteínas lisosómicos es, por ejemplo, 1-desoxigalactonojirimicina (Migalastat). El chaperón es capaz de modificar, reestableciendo alguna actividad de una proteína lisosómica endógena disfuncional en una enfermedad de almacenamiento lisosómico. La proteína lisosómica endógena puede, y habitualmente es, una proteína lisosómica fosforilada y puede complementar la interacción de receptores de la proteína lisosómica paucimanosídica inventiva (tal como se ha indicado anteriormente para las terapias de combinación para administraciones de la proteína fosforilada o de no briófito. Sin limitación a una terapia específica, aparentemente el chaperón puede restaurar o incrementar la actividad enzimática de la proteína lisosómica, que presenta una actividad alterada debido a una mutación que causa la enfermedad de almacenamiento lisosómico. Resulta especialmente preferido, se utiliza Migalastat en combinación con una alfa-galactosidasa paucimanosídica o producida en un briófito inventiva y/o se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

La combinación con enzimas lisosómicos fosforilados o no de briófito, especialmente aquellos con reconocimiento de M6PR debido a la fosforilación, complementa la actividad de incorporación de los enzimas inventivos, permitiendo que alcance todas las células terapéuticamente relevantes con una eficiencia incrementada y un alcance terapéutico más amplio de aplicación.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las figuras y ejemplos siguientes, sin limitarse a dichas formas de realización de la presente invención. Cualquier elemento de los ejemplos puede combinarse con los conceptos inventivos tal como se ha indicado anteriormente.

Figuras:

Figura 1: casete de expresión linealizado para la expresión de proteína lisosómica (secuencia de proteína: GLA).

Figura 2: resultados intermedios y finales de una purificación típica de a-gal A (SDS-PAGE con tinción de plata).

Figura 3: purificación de glucocerebrosidasa a partir de sobrenadante de cultivo (SDS-PAGE con tinción de Coomassie).

Figura 4: purificación de alfa-glucosidasa a partir de sobrenadante de cultivo. SDS-PAGE con tinción de Coomassie de eluido concentrado de cromatografía-ConA. A) Eluido de GAA de musgo frente a alglucosidasa alfa (Myozyme). B) Eluido de GAA de musgo frente a Estándar de peso molecular.

Figura 5: caracterización in vitro de los enzimas. (a) Preparaciones enzimáticas separadas en SDS-PAGE y teñidas con azul de Coomassie. Los carriles 1 y 2 son aGal de musgo y agalsidasa alfa, respectivamente. Los carriles 3 y 4 son aGal de musgo y agalsidasa alfa digerido con PNGasa F. Flecha, enzimas a-gal A después de la digestión; cabeza de flecha, PGNasa F (36 KDa). El estándar de proteína y los pesos moleculares se muestran a la izquierda. (b) aGal de musgo y agalsidasa alfa (1 ng cada uno) detectados mediante transferencia western mediante la utilización de un anticuerpo policlonal específico de a-gal A humano. Se muestran datos representativos de 3 experimentos independientes. (c) Actividades de a-gal A específicas de preparaciones enzimáticas determinadas mediante la utilización de sustrato 4-MU-a-D-galactopiranósido artificial. Se midieron las concentraciones de proteína mediante ensayo de BCA. (d) Estabilidad de los enzimas diluidos en plasma humano tamponado y calentado a 37°C (los datos son medias de muestras por triplicado). Rico en man: aGal rico en manosa; aGal de musgo: a-galactosidasa de musgo; Agal-alfa: agalsidasa alfa; Agal-beta: agalsidasa beta.

Figura 6: estudio de incorporación in vitro. (a) Actividades de a-gal A intracelular de fibroblastos de pacientes de enfermedad de Fabry (DMN96.125) después de la incubación durante la noche con diferentes enzimas en presencia o en ausencia de M6P 5 mM o 2 mg/ml de manano de levadura. (b) La tinción de inmunofluorescencia de Gb3 mostró una acumulación lisosómica masiva de Gb3 en fibroblastos de pacientes de enfermedad de Fabry no tratados (arriba) y una reducción significativa de Gb3 en células que habían sido tratadas con aGal de musgo (abajo). (c y d) Expresión del RM en fibroblastos de pacientes de enfermedad de Fabry y en células endoteliales microvasculares IMFE1. Las células IMFE1 eran positivas para RM, según determinación mediante transferencia Western (c) y tinción de inmunofluorescencia (d), mientras que los fibroblastos eran negativos para RM. (e) Actividades de a-gal A intracelulares de células IMFE1 después de la incubación durante la noche con diferentes enzimas en presencia o en ausencia de M6P 5 mM o 2 mg/ml de manano de levadura. (f) Tasas de incorporación de diferentes enzimas en células IMFE1. Las células se recolectaron en los puntos temporales indicados y se midieron las actividades intracelulares. ***P<0.001, aGal de musgo vs. aGal rico en man o agalsidasa alfa. (g) Análisis de transferencia Western de a-gal A internalizado en células IMFE1 tras 3 horas de incubación con diferentes preparaciones enzimáticas. (h) Unión de diferentes enzimas a células IMFE1. Tras 3 horas de incubación a 4°C, se determinaron los enzimas unidos a superficie celular mediante ensayo enzimático. La línea de puntos indica el nivel de actividad de células IMFE1 tratadas simuladamente en dicho ensayo (es decir, el nivel de fondo). *P<0.05, ***P<0.001. Todos los datos en los gráficos se presentan como medias ± SEM (n=3-4).

Figura 7: farmacocinética plasmática. (a) Eliminación plasmática de aGal de musgo infusionada y agalsidasa alfa analizada por actividades enzimáticas. (b) Transferencia western de a-gal A en plasma 10 min después de la infusión. (c) Cantidades de proteína a-gal A en plasma 5 y 10 min después de la infusión; se analizaron las intensidades de las bandas de transferencia western mediante densitometría. (d) Correlación entre las cantidades de proteína a-gal A y las actividades enzimáticas en plasma 10 min después de la inyección. Los datos en (a) y (c) se presentan como medias ± SEM (n=4-5). *P<0.05, **P<0.01.

Figura 8: distribución en tejidos de los enzimas infusionados. Las preparaciones de enzima se inyectaron en ratones Fabry y se midieron las actividades de a-gal A en riñón, corazón, bazo e hígado 2 horas después de la inyección. (a) Actividades específicas en órganos. Los datos se presentan como medias ± SEM (n=5). *P<0.05, **P<0.01. (b) Se calcularon las actividades en órganos completos y se presentan los datos en % de actividad total recuperada de 4 órganos. (c) Proteína a-gal A en homogeneizados de riñón detectados mediante transferencia Western. Flecha, banda específica de a-gal A en ratones inyectados con aGal de musgo. No se observó ninguna banda específica detectable en ratones inyectados con agalsidasa alfa. Cabeza de flecha, posición aproximada a la que puede migrar la banda de agalsidasa alfa (basándose en los resultados mostrados en las figuras 2b, 4b).

Figura 9: localización celular de aGal de musgo y agalsidasa alfa infusionadas. La distribución celular de enzimas infusionados en el corazón y riñón se determinó mediante inmunohistoquímica (n=2). Se muestran fotografías representativas. (a) Corazón. Los asteriscos indican los vasos sanguíneos con células positivas para inmunotinción (muy probablemente, células endoteliales) y las flechas indican las células perivasculares positivas (presumiblemente macrófagos). (b) Riñón. Las flechas indican las células epiteliales tubulares de inmunotinción positiva. Barra de escala: 25 pm. Ampliación original: 400x.

Figura 10: cinética en los tejidos de los enzimas infusionados. Las preparaciones enzimáticas se inyectaron en ratones Fabry y se midieron las actividades de a-gal A en riñón (A), corazón (b), bazo (c) e hígado (d) a las 2, 24, 48 y 96 horas de la inyección. Los datos se expresan como medias ± SEM (n=4-5). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figura 11: eficacia de aGal de musgo en la eliminación de Gb3 acumulado en tejidos. El contenido de Gb3 en riñón (a), corazón (b) e hígado (c) se analizó 7 días después de una única infusión de aGal de musgo o agalsidasa alfa a diversas dosis. Los datos se expresan como medias ± SEM (n=4-5). *P<0.05, ***P<0.001. La significancia estadística mostrada sobre cada grupo inyectado con agalsidasa alfa indica la diferencia entre agalsidasa alfa y la misma dosis de aGal de musgo.

Figuras 12 a 14: actividades plasmática y tisular para la administración i.p. (figura 12), i.m. (figura 13) y s.c. (figura 14).

Ejemplos

Ejemplo 1: producción de alfa-galactosidasa humana en musgo.

Ejemplo 1.1: construcción de cepa de expresión

La secuencia de ADN del gen GLA humano (secuencia de referencia de NCBI: NM_000169.2) codificante de la alfa-galactosidasa A (a-gal A) sin la secuencia de señal nativa (SEC ID n° 3) se sintetizó en forma de una versión de codones optimizados (SEC ID n° 4) y se subclonó en un vector de expresión musgo en GeneArt / Thermo Fisher Scientific (GENEART AG, Regensburg, Alemania). Las secuencias que alojaban el constructo de expresión de a­ gal A y un constructo génico que proporciona resistencia a la neomicina (npt II) se extrajeron en forma de casetes de expresión lineal (figura 1) de los plásmidos mediante la utilización de enzimas de restricción.

Con el fin de generar líneas celulares de musgo productoras de a-gal A estables, se transformaron protoplastos de una línea de musgo de doble inactivación sin residuos de a-1,3-fucosa y p-1,2-xilosa específicamente vegetales en sus N-glicanos (Koprivova et al., Plant Biotechnol. J. 2:517-523, 2004; Weise et al., Plant Biotechnol. J. 5(3):389-401, 2007; documento WO 2004/057002) con los casetes de expresión purificados en un procedimiento de transformación basado en PEG (Strepp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:4368, 1998). Las células de musgo transformadas se regeneraron y se seleccionaron para la resistencia al antibiótico G418. Se cribaron 2000 plántulas de musgo resistentes en dos rondas consecutivas para la acumulación de a-gal A total por biomasa, en donde la mejor cepa se convirtió en la cepa de producción estándar.

El casete de expresión linealizado comprende los elementos genéticos siguientes: promotor actina de Physcomitrella (actina P) y 5' UTR, péptido de señal vegetal (PS), secuencia de ADNc de a-gal humana sin secuencia de señal nativa (GLA), 3' UTR de tubulina de Physcomitrella, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (P 35S), gen de neomicina fosfotransferasa (nptII) y terminador 35S de virus del mosaico de la coliflor (T 35S) (figura 1). El péptido de señal vegetal contenía la secuencia MAFYKISSVFFIFCFFLIALPFHSYA (SEC ID n° 5).

La cepa de expresión es una planta de musgo totalmente regenerada que presenta el transgén aGal establemente integrado en su genoma bajo el control genético de los elementos reguladores derivados del musgo.

Ejemplo 1.2: producción de enzima

La cepa de producción de a-Gal A se cultivó durante 4 semanas (27 d) en una bolsa desechable de 20 l (Cellbag 20, GE Healthcare, Alemania) en un agitador de balanceo Rocker WaveTM (BioWave 20 SPS, Wave Biotech AG, Suiza). Los parámetros de cultivo eran: tasa de balanceo de 25 a 30 rpm, ángulo de 8°, medio SM07 (NaCl 100 mM, KCl 6.6 mM, MgSO4 x 7H2O 2.0 mM, KH2PO41.8 mM, Ca(NOa)2 x 4H2O 20.4 mM, FeNa-EDTA 0.05 mM, MES 4.9 mM, PEG4000 al 0.1% (p/v), H3BO3100.26 pM, CoCh x 6H2O 0.11 pM, CuSO4 x 5H2O 0.1 pM, KI 5 pM, MnCl2 x 4H2O 85.39 pM, Na2MoO4 x 2H2O 1.03 pM, NiCh x 6 H2O 0.1 mM, Na2SeO3 x 5H2O 0.04 pM, acetato de Zn x 2H2O 0.039 pM), 25°C, 0.3 l x min_1 de aire presurizado complementado con 2% a 4% de CO2 e iluminación a 130 a 310 pE x itt2 x s-1, 24 h de luz al día, administrados por paneles de luz dotados de Osram FQ 24W 840 HO, Lumilux Cool White. El medio se complementó adicionalmente con 1000x mezcla de vitaminas Nitsch (mezcla de vitaminas Nitsch, Duchefa, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante. El pH de la fermentación se controló automáticamente a pH 5-6 mediante titulación con H2SO4 0.5 M y NaOH 0.5 M con ayuda de WAVEPOD I (GE Healthcare) en combinación con Pump20 (GE Healthcare).

Después del final del cultivo, el caldo de cultivo se sometió a la cascada de filtración en tres etapas siguientes para proporcionar un filtrado estéril clarificado libre de musgo: 1) recolección de musgo mediante filtración de torta en carcasa de filtración de PP personalizada (Grosse et al., documento WO 2014/013045 A1, 2014) dotada de Zetaplus (01SP B3002, 3M, Alemania), 2) filtración de lecho profundo por una cápsula Scale-Up de doble capa (E0340FSA60SP03A, 3M, Alemania) y 3) una etapa de filtración estéril final (Millipore Express™ Plus, 0,22 pm, Millipore, Alemania).

Posteriormente, el filtrado estéril se concentró y se intercambió el tampón mediante la utilización de filtración de flujo tangencial (TFF) (Pall Centramate 500S, membrana de celulosa de 30 kDa de corte). Después de una serie de tres etapas cromatográficas (Butyl-650M, DEAE, S), a-gal A y a-gal A rico en man aislados, respectivamente, se concentraron a aprox. 0,5 mg/ml transferidos al tampón de formulación y se caracterizaron. El enzima se almacenó a < -65°C hasta la utilización posterior. Los resultados de un procedimiento típico de purificación se ilustran en la figura 2.

Mediciones de la actividad enzimática:

Se midió la actividad de a-gal A mediante un ensayo fluorimétrico mediante la utilización de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido 5 mM a pH 4,4 en presencia de N-acetilgalactosamina 0.1 M, un inhibidor específico de agalactosidasa B. Se midió la concentración de la proteína mediante la utilización del kit de ensayo de proteína BCA (Pierce) siguiendo las instrucciones del proveedor. La actividad se expresó en |jmoles/mg de proteína/hora. Los resultados se resumen en la figura 5c.

SDS-PAGE con tinción de plata:

Las muestras se desnaturalizaron en tampón para muestras de SDS complementado con agente reductor (Invitrogen) a 95°C durante 5 min. Se utilizaron geles NuPAGE Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) para la separación de la proteína. Se llevó a cabo la tinción con plata mediante la utilización del kit de tinción SilverQuest™ (Invitrogen) siguiendo el manual del proveedor.

ELISA de proteína de célula huésped (HCP)

Con el fin de cuantificar los niveles de HCP remanente en la a-gal A purificada, se desarrolló un nuevo ELISA de HCP (Biogenes GmbH, Alemania). Brevemente, se llevó a cabo una fermentación simulada con el tipo salvaje respectivo, se recolectó el medio y se concentró. La solución de proteína concentrada se utilizó para la inmunización de conejos. Se utilizaron las IgG totales para generar un ELISA de tipo sándwich para la cuantificación de la HCP. Los resultados mostraron un agotamiento típico de las HCP durante todo el procedimiento de purificación en un factor de 10000.

Ejemplo 1.4: resumen de producción

La producción de aGal de musgo se llevó a cabo en un procedimiento de fermentación fotoautrófica en una bolsa desechable de un solo uso de 10 l instalada en un agitador de balanceo WaveTM. El musgo, cultivado en ausencia de ningún antibiótico, secretó aGal de musgo al medio de cultivo puramente mineral. La iluminación de las bolsas de cultivo era del exterior a un flujo fotónico medio de 200 pmoles/m2s. Tras alcanzar su densidad de cultivo final, se separó el musgo mediante filtración de torta respecto del medio y éste se clarificó mediante un sistema de filtro profundo de doble capa y filtración estéril final. El medio clarificado resultante se concentró y tamponó nuevamente mediante filtración de flujo tangencial.

A partir de dicha recolección concentrada, se purificó el enzima mediante un enfoque cromatográfico en tres etapas, utilizando consecutivamente una columna de interacción hidrófoba (CIH), una columna de intercambio aniónico (CIA) y una columna de intercambio catiónico (CIC). Finalmente, el eluido de la última columna se tamponó nuevamente y se concentró hasta 0.5 mg/ml.

El esquema de purificación proporcionó aGal de musgo puro (nivel de proteína de célula huésped (HCP) ~100 ppm, banda única de SDS-PAGE Coomassie, pureza de SE-HPLC: 99%) con un rendimiento típico de 30%.

Ejemplo 2: comparación de a-galactosidasa A

Ejemplo 2.1: producción de enzima y ensayo de actividad

Se obtuvo aGal de musgo paucimanosídica tal como se indica en el ejemplo 1. Esta cepa de producción se transformó adicionalmente con un constructo de inactivación con diana en el gen único de N-acetilglucosaminiltransferasa I (GntI) de Physcomitrella patens a fin de obtener cepas de producción de aGal rica en man. Con el fin de someter a ensayo el efecto del número incrementado de residuos manosilo terminales sobre la incorporación celular del enzima, asimismo se produjo a-gal A en una cepa de la que se había eliminado genéticamente su actividad de beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (GNT-I). La modificación de inactivación resulta en una incapacidad del musgo de llevar a cabo ningún procesamiento de glicano de tipo complejo, ya que todas las últimas etapas enzimáticas carecen de su sustrato. Por lo tanto, el recorte mediado por alfa-manosidasa I en el cis-Golgi es la última etapa de procesamiento y, por lo tanto, todos los N-glicanos de dicha cepa son del tipo rico en manosa. La alfa-galactosidasa humana producida en dicha cepa se denomina aGal rica en man. La producción y purificación siguió el mismo esquema que en el ejemplo 1.

Se obtuvieron agalsidasa alfa (Shire, Replagal®) y agalsidasa beta (Genzyme, Fabrazyme®) de células de mamífero para los ensayos comparativos.

Los sedimentos celulares o tejidos de ratón se lisaron en Triton X-100 al 0.2% helado en solución salina. Los lisados se centrifugaron a 14,000 rpm durante 15 min a 4°C, y los sobrenadantes se utilizaron para el ensayo enzimático. Se midió la actividad de a-gal A mediante el ensayo fluorimétrico mediante la utilización de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido 5 mM a pH 4.5 en presencia de N-acetilgalactosamina 0.1 M, un inhibidor específico de la a-galactosidasa B. Se midió la concentración de proteína mediante la utilización del kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). La actividad se expresó en nmoles/mg de proteína/hora.

Ejemplo 2.2: análisis de glicanos

El análisis de glicanos de aGal de musgo y agalsidasa alfa fue llevado a cabo por Protagen Protein Services (Dortmund, Alemania) mediante la utilización de HILIC-UPLC-MS. Brevemente, los N-glicanos se liberaron de la proteína enzimáticamente utilizando PNGasa F. Tras el lavado y desalado, los glicanos aislados se marcaron con 2-aminobenzamida (2-AB). Los glicanos marcados se separaron en una columna ACQUITY UPLC BEH Glycan (2.1x100 mm) mediante la utilización de un gradiente lineal de 78% a 55.9% de B (tampón A: formato amónico 100 mM, pH 4.5; tampón B: acetonitrilo) en 38.5 min a 60°C con un caudal de 0.5 ml/min. Las señales de glicanos eluyentes se registraron mediante un detector de fluorescencia (excitación a 330 nm, emisión a 420 nm). La asignación de los picos de fluorescencia a los glicanos respectivos se llevó a cabo mediante la utilización de los valores de m/z registrados (Xevo-QTOF MS, Waters) y software MasLynx (versión 4.1, Waters).

El análisis de glicanos de aGal rico en man se llevó a cabo de la manera siguiente. Se redujeron aproximadamente 25 |jg de a-Gal (DTT 15 mM), se carbamidometilaron (yodoacetamida 55 mM) y se precipitaron con acetona (acetona:fase acuosa, 4:1). El sedimento se redisolvió en tampón de bicarbonato amónico 0.1 M y se digirió durante 12 h con tripsina a 37°C o quimiotripsina (ambas proteasas de grado de secuenciación, Roche, Mannheim).

Se cargaron aproximadamente 3 jg de cada digerido en una columna BioBasic C18 (BioBasic-18, 150 x 0.32 mm, 5 jm , Thermo Scientific) mediante la utilización de tampón de formato amónico 60 mM como el solvente acuoso. Se desarrolló un gradiente de 3% a 75% de acetonitrilo durante 25 min a un caudal de 6 jl/min. La detección se llevó a cabo con un espectrómetro de masas Waters Q-TOF Ultima dotado de la fuente ESI estándar en el modo de iones positivos. El análisis de los datos se llevó a cabo manualmente con MassLynx4.0.

Tabla 1: resultados del análisis de N-glicanos de aGal de musgo y enzimas comparativos.

A partir de la bioquímica de los glicanos, puede suponerse que HexNAc es N-acetilglucosamina y Hex es manosa. Las líneas 1 y 2 de aGal de musgo, Man3 y Man3+Metilo representan glucosilación paucimanosídica. Inesperadamente, dicha fracción rindió aproximadamente 80%. Rico en man y agalsidasa alfa representan productos comparativos.

En comparación con agalsidasa alfa, aGal de musgo presenta una composición de estructura muy homogénea, con elevada consistencia de los lotes. Una consistencia lote a lote elevada es una propiedad deseada para garantizar la reproducibilidad y expectativas de función.

Tabla 2: homogeneidad / estabilidad lote a lote de glicanos.

Ejemplo 2.3: termoestabilidad in vitro

Los enzimas se diluyeron en plasma obtenido de un individuo sano y se calentaron a 37°C durante los periodos de tiempo indicados. A fin de mantener un pH neutro, se añadió HEPES al plasma a una concentración final de 20mM. Tras el calentamiento, se midieron las actividades de a-gal A.

Ejemplo 2.4: caracterización in vitro

La aGal de musgo presentaba N-glicanos muy uniformes con Man3GlcNAc2 de tipo nuclear como estructura dominante (figura 5). Las cadenas de carbohidrato de aGal de musgo estaban constituidas prácticamente de modo exclusivo por manosa y GlcNAc, de los que ~85% terminaba en manosa, ~10% presentaba residuos terminales tanto de manosa como de GlcNAc y ~4% terminaba en GlcNAc (tabla 1). En comparación, MansGlcNAc2 era la estructura de glicano más abundante en aGal rico en man (tabla 1) con una pequeña cantidad de Man4, Man6 y Man7. Tal como se esperaba, no había glicanos fosforilados tanto en aGal de musgo como en aGal rico en man. La agalsidasa alfa mostraba estructuras de glicano altamente heterogéneas, de las que ~24% eran glicanos fosforilados, ~7% eran glicanos terminados en manosa y 63% eran estructuras diversas (tabla 1).

En la SDS-PAGE, se detectó aGal de musgo como una sola banda principal con una movilidad mayor que la agalsidasa alfa (figura 5a), lo que refleja el menor contenido de carbohidratos de aGal de musgo. Tras la eliminación de los N-glilcanos por PNGasa F, tanto aGal de musgo como agalsidasa alfa migraron a la misma posición (figura 5a). aGal rico en man presentaba una movilidad similar a la de aGal de musgo. En el análisis de transferencia western, tanto aGal de musgo como agalsidasa alfa fueron detectados por un anticuerpo policlonal de a-gal A humana (figura 5b). Con la misma cantidad de proteína cargada, la intensidad de la banda de aGal de musgo en la transferencia Western era 2.14 ± 0.58 veces (n=3) la de la agalsidasa alfa, probablemente debido a que las cadenas sacáridas más cortas en aGal de musgo podrían facilitar la accesibilidad del anticuerpo al epítopo o epítopos.

Las actividades específicas de aGal de musgo y aGal rico en man eran similares a las de la agalsidasa alfa y agalsidasa beta (figura 5c).

La aGal de musgo y la aGal de musgo rica en manosa presentaban prácticamente la misma estabilidad que la agalsidasa alfa y la agalsidasa beta una vez diluidas en plasma humano y calentadas a 37°C (figura 2d).

Ejemplo 3: producción de glucocerebrosidasa humana en musgo, adecuada para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher

Ejemplo 3.1: construcción de cepa de expresión

La secuencia de ADNc del gen GBA humano (identificador de Uniprot P04062- GLCM_HUMAN, secuencia de referencia de NCBI: NM_000157.3) fue sintetizada y subclonada en un vector de expresión de musgo por GeneArt™ (Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Alemania). La secuencia utilizada (SEC ID n° 7) era codificante de la GBA humana (SEC ID n° 6) sin el péptido de señal (PS) anotado nativo, que se había sustituido por un PS vegetal de 26 aa (se predice un corte preciso con una puntuación de 0.522 según la herramienta en internet SignalP4.1). La secuencia de GBA se modificó en una única base (posición de base 21 en SEC ID n° 7, AAA ^ AAG) utilizando un codón alternativo para el aminoácido lisina para facilitar la clonación (evitando un sitio de restricción HindlII). Las secuencias que incluían el constructo de expresión de GBA y un constructo génico que confería resistencia a la neomicina (nptlI) se extrajeron en forma de casetes de expresión lineales a partir de los plásmidos mediante la utilización de enzimas de restricción.

Se utilizó una línea celular de musgo basada en una línea de doble inactivación que no presentaba residuos a-1,3-fucosa y p-1,2-xilosa específicamente vegetales en sus N-glicanos, tal como se indica en el ejemplo 1.1. Con el fin de generar líneas celulares de musgo productoras de glucocerebrosidasa estables, se transformaron protoplastos de dicha línea celular básica glucomanipulada con los casetes de expresión purificados (figura 1) en un procedimiento de transformación basado en PEG tal como se indica en el ejemplo 1.1. El casete de expresión linealizado comprendía los mismos elementos genéticos indicados en el ejemplo 1.1 y en la figura 1, con la excepción de la utilización de una secuencia de GBA humana en lugar de la secuencia de a-gal (GLA). Las células de musgo transformadas se regeneraron y se seleccionaron para resistencia al antibiótico G418. Se cribaron aproximadamente 700 plántulas de musgo resistentes en dos rondas consecutivas para la acumulación de glucocerebrosidasa total por biomasa, en donde la mejor cepa se convirtió en la cepa de producción estándar. La glucocerebrosidasa humana producida en esta cepa se denominó GBA de musgo.

Ejemplo 3.2: producción y caracterización de enzimas

Para la producción se utilizaron las mismas condiciones y etapas que las indicadas para el ejemplo 1.2 y el ejemplo 2. La glucocerebrosidasa se purificó mediante filtración de flujo tangencial con un casete de celulosa de 10 kDa, cromatografía de intercambio catiónico (CaptoS) para la captura y filtración en gel (Sephadex) para el pulido. La glucoerebrosidasa purificada/enriquecida se analizó mediante transferencia Western, SDS-PAGe con tinción de Coomassie/plata y ensayo de actividad enzimática. El enzima purificado se almacenó a -20°C hasta la utilización posterior. Las etapas de purificación se muestran en la figura 3. Se obtuvieron glucosilaciones ricas en manosa similares. En una nueva tanda, se encontraron niveles más elevados de glicanos terminados en GlucNac de la forma MGn y GnGn. El tratamiento con beta-N-acetiglucosaminidasa restauró la distribución con una cantidad elevada de la forma de glicano paucimanosídica.

Ejemplo 3.3: ensayo de enzimas

La actividad de la glucocerebrosidasa purificada se evaluó mediante ensayo de actividad enzimática in vitro. Se incubó la glucocerebrosidasa en citrato de Na 60 mM, EDTA 1.3 mM, Triton-X100 al 0.15%, taurocolato sódico 0.125%, DTT 1 mM, 4-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido 2 mM, pH 6 a 37°C. La reacción se detuvo con NaOH 1 M y se midió la formación de producto espectroscópicamente a 405 nm.

Ejemplo 4: producción de alfa-glucosidasa lisosómica humana en el musgo, adecuada para el tratamiento de la enfermedad de Pompe

Ejemplo 4.1: construcción de cepas de expresión

La secuencia de ADNc del gen de GAA humano (identificador de Uniprot P10253 (LYAG_HUMAN), secuencia de referencia de NCBI: NM_000152.4), fue sintetizada y subclonada en un vector de expresión de musgo mediante GeneArt™ (Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Alemania). La secuencia utilizada (SEC ID n° 9) es codificante del precursor de GAA humano (SEC ID n° 8) sin el péptido de señal (PS) anotado nativo, que se sustituyó por un PS vegetal de 26 aa (se predice un corte preciso con una puntuación de 0.847 según la herramienta web SignalP4.1) y un propéptido truncado. La secuencia de GAA se modificó en una única base (posición de base 2484 en la SEC ID n° 9, ACG ^ ACA) mediante la utilización de un codón alternativo al aminoácido treonina para facilitar la clonación (evitando un sitio de restricción Pvul). Las secuencias que alojaban el constructo de expresión de GAA y un constructo génico que confiere resistencia a la neomicina (nptlI) se extrajeron en forma de casetes de expresión lineales a partir de los plásmidos mediante la utilización de enzimas de restricción.

Se utilizó una línea celular de musgo basada en una línea con doble inactivación que no presenta residuos específicamente vegetales de a-1,3-fucosa y p-1,2-xilosa en sus N-glicanos tal como se indica en el ejemplo 1.1. Con el fin de generar líneas celulares productoras de alfa-glucosidasa estables, se transformaron protoplastos de dicha línea celular básica glucomanipulada con los casetes de expresión purificados (figura 1) en un procedimiento de transformación basado en PG tal como se indica en el ejemplo 1.1. El casete de expresión linealizado comprende los mismos elementos genéticos indicados en el ejemplo 1.1 y en la figura 1, con la excepción de la utilización de una secuencia de GAA humana (SEC ID n° 9) en lugar de la secuencia de a-gal (GLA) y un promotor de musgo diferente. Las células de musgo transformadas se regeneraron y se seleccionaron para resistencia frente al antibiótico G418. Se cribaron aproximadamente 600 plántulas de musgo resistentes en dos rondas consecutivas para acumulación de precursor de alfa-glucosidasa total por biomasa, en donde la mejor cepa se convirtió en la cepa de producción estándar. La alfa-glucosidasa lisosómica humana producida en dicha cepa se denomina GAA de musgo.

Ejemplo 4.2: producción y caracterización de enzimas

Para la producción se utilizaron las mismas condiciones y etapas que las indicadas para el ejemplo 1.2 y el ejemplo 2. La alfa-glucosidasa se purificó mediante cromatografía de afinidad mediante la utilización de Con A sefarosa 4B. Se mezcló medio que contenía alfa-glucosidasa con el mismo volumen de acetato sódico 50 mM, NaCl 1 M, pH 5.2, para ajustar para las condiciones de unión apropiadas y se cargó en la columna de cromatografía. La elución se llevó a cabo mediante incrementado escalonado de la concentración de a-D-metilglucósido. La alfaglucosidasa purificada/enriquecida se analizó mediante transferencia Western, SDS-PAGE con tinción de Coomassie/plata y ensayo de actividad enzimática. El enzima purificado se almacenó a 4°C o -20°C hasta la utilización posterior. El análisis de SDS-PAGE de GAA de musgo enriquecido se muestra en la figura 4. La identidad de la banda que contenía GAA de musgo se confirmó mediante análisis de EM.

La alfa-glucosidasa presenta 7 sitios de glucosilación, denominados G1 a G7. Las glucoformas de cada sitio se detectaron mediante EM/EM. El pico más intenso para la mayoría de sitios (excepto GS2 - GnM con 73%) se encontró que era la glucoforma GnGn. Por lo tanto, la preparación de enzima se trató con beta-N-acetilglucosaminidasa para cortar la GlcNAc terminal para convertir GnM y GnGn en glicanos paucimanosídicos.

Ejemplo 5: la administración mediada por receptor de mañosa de a-galactosidasa A generada por musgo corrige eficientemente la deficiencia de enzima en la enfermedad de Fabry

Ejemplo 5.1: estudio de incorporación in vitro:

Se cultivaron fibroblastos cutáneos derivado de pacientes de enfermedad de Fabry (DMN96.125) y línea celular endotelial (IMFE1) en FBS al 10% en DMEM y EGM-2MV (Lonza), respectivamente. Ambas líneas celulares presentan actividades de a-gal A muy bajas y presentan una acumulación de Gb3 lisosómica que es detectable mediante inmunotinción (Shen et al., Mol. Genet. Metab. 95:163-168, 2008). Las células se incubaron con preparaciones de a-gal A (a una concentración final de 10 |jg/ml9 en presencia o en ausencia de M6P 5 mM o 2 mg/ml de manano de levadura mediante tratamiento con tripsina (tripsina al 0.25%/EDTA, 37°C) que asimismo elimina la a-gala A extracelular. Tras el lavado con PBS, los sedimentos celulares se lisaron para el ensayo enzimático o la transferencia Western.

Con el fin de someter a ensayo la capacidad de los enzimas de musgo en la degradación de Gb3 acumulado, se incubaron las células DNN96.125 con preparaciones de a-gal A (10 jg/m l) durante 4 días, sustituyendo el medio cada 1 a 2 días. Se utilizaron células falsamente tratadas a modo de controles sin tratamiento. Se detectó Gb3 mediante inmunotinción tal como se indica posteriormente.

Se llevó a cabo el estudio de incorporación de enzima en fibroblastos derivados de pacientes de enfermedad de Fabry con enzimas exógenos a una concentración final de 10 jg/ml. Tras 18 horas de incubación, los fibroblastos que se habían cargado con agalsidasa alfa o algasidasa beta presentaban actividades de a-gal A intracelulares marcadamente incrementadas (116 y 134 veces la actividad de las células no tratadas, respectivamente) (figura 6a). La incorporación de dichos enzimas resultó inhibida prácticamente por completo por M6P y resultó parcialmente inhibida por manano de levadura, confirmando que dicha incorporación era predominantemente a través de M6PR. Los fibroblastos se incubaron con aGal de musgo o aGal rica en man presentaban un incremento significativamente inferior de actividades de a-gal A intracelulares (6.4 y 4.8 veces las de células no tratadas, respectivamente) (figura 6a). La incorporación de tanto aGal de musgo como aGal rica en man no resultó inhibida por M6P o por manano. Lo anterior es consistente con la expresión reducida o nula de RM en dichas células (figura 6c, d). A pesar de la baja incorporación, la acumulación lisosómica de Gb3 en fibroblastos de pacientes de enfermedad de Fabry se redujo significativamente después del tratamiento con aGal de musgo o aGal rico en man durante 4 días (figura 6b), sugiriendo que los enzimas a-gal A de musgo son capaces de degradar los sustratos acumulados en los lisosomas.

El enzima infusionado por vía intravenosa en ERT es mejor incorporado por el endotelio vascular, que forma la primera barrera entre la sangre y el resto de los tejidos. Además, las células endoteliales son un tipo celular relevante para la enfermedad principal en algunas LSD, tales como la enfermedad de Fabry. Por lo tanto, los presentes inventores sometieron a ensayo la incorporación enzimática en células endoteliales microvasculares derivadas de pacientes de enfermedad de Fabry (IMFE1). Las células IMFE1 eran positivas para el RM según determinación mediante transferencia Western e inmunotinción (figura 6c, d). Tras la incubación durante un anoche, los enzimas a-gal A de musgo fueron eficientemente incorporados por las células IMFE1 (figura 6e). La incorporación de aGal de musgo o aGal rico en man por las células IMFE1 resultó bloqueada predominantemente por manano de levadura (inhibición ~60-80%) y resultó inhibida por M6P en un grado menor (~2-10%), sugiriendo que el RM contribuye principalmente a dicha incorporación. La incorporación de agalsidasa alfa o agalsidasa beta por las células IMFE1 resultó inhibida principalmente por M6P (~75-82%), aunque asimismo por manano.

La incorporación in vitro típicamente alcanza una etapa de meseta después de la incubación durante la noche. Con el fin de comparar las tasas de incorporación de diferentes preparaciones de a-gal A en una etapa adinámica, se incubaron células IMFE1 con los enzimas (10 jg/m l) durante un tiempo más corto. La incorporación de aGal rica en man y agalsidasa alfa era aproximadamente lineal durante un máximo de 3 horas, con una tasa de incorporación significativamente más elevada de aGal rico en man que de agalsidasa alfa (figura 6f). La incorporación de aGal de musgo era notablemente más elevada que de aGal rico en man y agalsidasa alfa después de la incubación durante 1 hora y alcanzó una meseta en 1 a 3 horas (figura 6f). Se obtuvieron resultados similares en experimentos repetidos, incluyendo uno con una cantidad más elevada de enzima (40 jg/ml). La transferencia Western confirmó adicionalmente dichos resultados al nivel de la proteína (figura 6g).

Con el fin de evaluar las eficiencias de unión enzimática, las células IMFE1 se incubaron con diferentes preparaciones de enzima (10 jg/m l) a 4°C en presencia o en ausencia de M6P o manano. Tres horas después, se midió la a-gal A unida a la superficie celular mediante ensayo de la actividad enzimática. Bajo estas condiciones experimentales, no se detectó actividad de a-gal A superior al nivel de fondo (actividad de células no tratadas) en las células incubadas con aGal rico en man o agalsidasa alfa (figura 6h). La aGal de musgo presentaba una unión celular significativamente más elevada que aGal rico en man o agalsidasa alfa (figura 6h). La unión de aGal de musgo resultó significativamente bloqueada por el manano, pero no por M6P.

Dichos resultados mostraron que un sistema de ensayo con células endoteliales microvasculares en cultivo probablemente resulta más relevante a la ERT in vivo que los fibroblastos en cultivo; la unión e incorporación de enzimas a-gal A de musgo resulta más eficiente que la agalsidasa alfa y esta unión/incorporación se produce mediante el RM. Estos datos in vitro sugieren además que los enzimas producidos en el musgo podrían resultar adecuados para la ERT in vivo. Debido a que la unión/incorporación de aGal de musgo resultaba más eficiente que la aGal rica en man, los presentes inventores seleccionaron el primero para los estudios animales posteriores.

Ejemplo 5.2: estudio de unión in vitro

Se incubaron células IMFE1 en placas multipocillo con enzimas a-gal A (10 pg/ml) a 4°C en presencia o en ausencia de M6P 5 mM o 2 mg/ml de manano. Se utilizó el medio de cultivo EGM-2MV complementado con HEPES 25 mM. Tres horas después, las células se lavaron con PBS helado 4 veces y se lisaron directamente en Triton al 0.2% a 4°C. Se utilizaron los lisados para el ensayo de proteínas y el ensayo del enzima a-gal A.

Ejemplo 5.3: SDS-PAGE y transferencia Western:

Las muestras se desnaturalizaron en tampón para muestras de LDS (Invitrogen) con 2-mercaptoetanol al 2.5% a 70°C durante 10 min. Se utilizaron geles NuPAGE Bis-Tris al 4-12% o al 10% (Invitrogen) para la separación de las proteínas. Se llevó a cabo transferencia Western tal como se ha descrito anteriormente (Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 369:1071-1075, 2008). Los anticuerpos primarios utilizados eran anticuerpo policlonal de conejo de a-gal A humana (Shire Human Genetic Therapies, Cambridge, MA), anticuerpo monoclonal de ratón de receptor de manosa (clon 15-2, Abcam, Cambridge, MA) y anticuerpo policlonal de cabra de GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Se cuantificaron los niveles de proteína a-gal A mediante densitometría utilizando el software ImageJ.

Ejemplo 5.4: inmunofluorescencia

Se llevó a cabo inmunotinción de fluorescencia tal como se ha descrito anteriormente (Shen et al., Mol. Genet. Metab. 95:163-168, 2008). Los anticuerpos primarios utilizados eran anticuerpos monoclonales de ratón de Gb3 (Seikagaku, Tokyo, Japón) y receptor de manosa (clon 15-2, Abcam). Las células se contratiñeron con DAPI.

Ejemplo 5.5: animales y procedimientos

Se produjeron ratones Fabry mediante cría de pares de machos hemicigóticos y hembras homocigóticas. Se utilizaron ratones Fabry hembra adultas (3 a 6 meses de edad) durante todo el estudio. Para cada experimento, los ratones Fabry hembra resultaron más adecuados que los ratones Fabry macho debido a que los ratones macho presentan síntesis de Gb3 inducida por testosterona en los riñones que confundía el efecto del enzima infusionado en la degradación de Gb3 acumulado. Para todas las inyecciones, se diluyeron las preparaciones de enzima en solución salina hasta un volumen total de 200 pl por cada ratón y se inyectaron en ratones Fabry por la vena de la cola.

Ejemplo 5.6: farmacocinética plasmática

Las preparaciones enzimáticas se inyectaron a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal (n= 5 cada uno). Las muestras sanguíneas se recogieron mediante sangrado de cola utilizando capilares heparinizados a 1, 5, 10, 20 y 30 minutos después de la inyección. Se separó el plasma y se midió la actividad de enzima a-gal A en el plasma.

Se inyectó aGal de musgo o agalsidasa alfa en ratones Fabry a través de una vena de la cola a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal (BW), y se analizó la depuración de plasma mediante un ensayo de enzima a-gal A in vitro. La aGal de musgo se depuró más rápidamente de la circulación que la agalsidasa alfa (figura 7a). Para verificar que la vida media del plasma más corta de la aGal de musgo es debida a la recaptación más fuerte por tejidos en lugar de por la inactivación de enzima más rápida (desnaturación) en la circulación, se analizan los enzimas en plasma de ratón mediante transferencia western (figura 7b). De acuerdo con la reactividad superior del anticuerpo a agal de musgo (figura 5b), se corrigieron las intensidades de las bandas de aGal de musgo mediante un factor de 2.14. Los resultados revelaron que los niveles de proteína a-gal A en ratones infusionados con aGal de musgo a 5 y 10 minutos tras la infusión son significativamente inferiores a los ratones inyectados con agalsidasa alfa (figura 7c). Los niveles de proteína de aGal de musgo a 5 y 10 minutos son 37% y 28% de los de la agalsidasa alfa respectivamente, que están de acuerdo aproximadamente con los datos de actividad de enzima (las actividades específicas en plasma de ratón inyectado con aGal de musgo en estos 2 puntos temporales son 49% y 28% de las de en los ratones inyectados con agalsidasa alfa). Además, existe una fuerte correlación entre los niveles de proteína y las actividades de enzima en el plasma (figura 7d). Junto con los hallazgos de estudio de captación in vitro (figuras 6f-h), estos datos sugieren que la aGal de musgo administrada intravenosamente es absorbida de manera eficaz por las células endoteliales vasculares y otros tipos de células en los tejidos cuando se compara con la agalsidasa alfa.

Ejemplo 5.7: Biodistribución

Las preparaciones de enzima se inyectaron a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal (n=5 cada uno). Dos horas después de la inyección, los ratones se infusionaron con solución salina (para extraer sangre) y se recolectaron corazón, riñones, bazo e hígado. Se homogeneizaron los órganos completos y se midió la actividad de a-gal A. Para el riñón, se agruparon ambos riñones y se homogeneizaron.

Dos horas después de la inyección intravenosa de aGal de musgo o agalsidasa alfa en ratones Fabry (1 mg/kg de peso corporal (BW)), se evaluó la distribución en los tejidos de cada preparación de enzima. Los riñones procedentes de ratones inyectados con aGal de musgo presentaban actividades enzimáticas significativamente más elevadas que agalsidasa alfa (figura 8a). Los niveles de aGal de musgo y de agalsidasa alfa en el corazón y en el bazo era comparables (figura 8a). El nivel de aGal de musgo en el hígado era significativamente inferior que el nivel de agalsidasa alfa (figura 8a). Se calcularon las actividades en órganos completos y se compararon las proporciones entre los diferentes órganos (figura 8b). Entre las actividades recuperadas totales, 94.9% de aGal de musgo y 97.5% de agalsidasa alfa fueron administradas en los hígados (P<0.05). Los riñones de los ratones inyectados con aGal de musgo presentaban 1.96% de la actividad total, que es significativamente más elevada (P<0.05) que la observada en ratones inyectados con agalsidasa alfa (0.58%). El análisis de transferencia Western confirmó la mayor incorporación de aGal de musgo en el riñón que agalsidasa alfa (figura 8c).

Con el fin de investigar la distribución celular de los enzimas infusionados, se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico de los ratones Fabry 24 horas después de la inyección de aGal de musgo o agalsidasa alfa a razón de 1 mg/kg BW. Las señales específicas mostraron un patrón citoplasmático granular, reflejando presumiblemente la localización lisosómica del enzima. La localización celular de dichos 2 enzimas en el corazón y en el riñón era esencialmente idéntica. En los corazones, tanto aGal de musgo como agalsidasa alfa fueron detectados en capilares y en células perivasculares, aunque no en miocitos (figura 9a). La tinción específica sólo se observó en células epiteliales tubulares corticales del riñón para cualquiera de los dos enzimas (figura 9b). Estos resultados son consistentes con la distribución celular de la agalsidasa alfa.

Ejemplo 5.8: inmunohistoquímica

Se inyectó aGal de musgo o agalsidasa alfa por la vena de la cola a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal (n=2 cada uno). Se recolectó corazón y riñones 1 día después de la infusión enzimática. Se utilizaron tejidos de ratón Fabry hembra no tratados a modo de controles negativos. Los tejidos se fijaron en formalina, se incluyeron en parafina y se llevaron a cabo secciones de 5 micrómetros. La inmunohistoquímica fue realizada por Histopathology and Tissue Shared Resource in Georgetown University (Washington, D.C.). Brevemente, tras la recuperación de epítopos inducida por calor en tampón de citrato, las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% y suero de cabra normal al 10% y se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo de a-gal A humano (Shire). Tras la incubación con anticuerpo secundario marcado con HRP, se detectaron las señales mediante cromógeno DAB y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Se verificó la especificidad de la señal con tinción de control, en la que se omitió la incubación con el anticuerpo primario. En comparación con la tinción ligera y difusa no específica en los controles no tratados, la señal específica mostró un patrón citoplasmático granular.

Ejemplo 5.9: estabilidad del tejido

Se inyectó aGal de musgo o agalsidasa alfa por la vena de la cola a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal. A las 24, 48 y 96 horas de la inyección, los ratones (n=4-5 en cada grupo) se perfundieron y se recolectaron los órganos y se homogeneizaron tal como se indica en la sección Biodistribución, anteriormente.

Ejemplo 5.10: cinética en los tejidos

Se investigó la cinética in vivo de aGal de musgo y agalsidasa alfa en diversos órganos después de una única inyección intravenosa. A las 2 y 24 horas de la inyección, los riñones de los ratones inyectados con aGal de musgo presentaban actividades enzimáticamente significativamente superiores a las de los ratones inyectados con agalsidasa alfa (figura 10a). Sin embargo, las actividades eran similares a las 48 y 96 horas (figura 10a). En el corazón, no se observaron diferencias significativas entre las dos formas de enzima a las 2 y 24 horas; sin embargo, las actividades de aGal de musgo eran inferiores a las de agalsidasa alfa 48 y 96 horas después de la inyección (figura 10b). En comparación con los ratones inyectados con agalsidasa alfa, los ratones inyectados con aGal de musgo presentaban un nivel similar de actividades en el bazo y actividades significativamente inferiores en el hígado en todos los puntos temporales analizados (figura 10c, d). Las semividas de aGal de musgo y agalsidasa alfa en el riñón y en el corazón eran de entre 2 y 3 días. aGal de musgo presentaba una semivida ~25% más corta en ambos órganos. La semivida de aGal de musgo en el hígado era significativamente más corta que la de la agalsidasa alfa (24 vs. 57 horas). Las semividas de ambas formas enzimáticas en el bazo eran similares (~30 horas).

Ejemplo 5.11: eliminación de Gb3 tisular

Se utilizaron ratones Fabry hembra de seis meses de edad. Se inyectó aGal de musgo o agalsidasa alfa por la vena de la cola a dosis de 0.3, 1 y 3 mg/kg de peso corporal (n=4-5 cada uno). Se recolectó corazón, riñón e hígado 1 semana después de una única inyección. Se utilizaron ratones Fabry no tratados y WT de edades y sexos correspondientes a modo de controles (n=5). Los tejidos se homogenizaron y se sometieron a extracción de glucoesfingolípidos y posterior análisis de Gb3 mediante espectrometría de masas tal como se ha indicado anteriormente (Durant et al., J. Lipid Res. 52:1742-1746, 2011). Se analizaron ocho isoformas y los resultados mostrados son la suma de dichas isoformas. El contenido de Gb3 se expresó en pg/mg de proteína total.

Se compararon las eficacias de aGal de musgo y agalsidasa alfa en la degradación de Gb3 acumulado 7 días después de una única inyección intravenosa de cualquiera de los dos enzimas en ratones Fabry de 6 meses de edad. Se sometieron a ensayo tres dosis diferentes (0.3, 1 y 3 mg/kg de BW). Los ratones Fabry no tratados presentaban niveles de Gb3 significativamente incrementados en riñón, corazón e hígado en comparación con los controles WT no tratados (figura 11a-c). Ambas formas enzimáticas redujeron Gb3 en dichos órganos de una manera dependiente de la dosis (figura 11a-c). La aGal de musgo y la agalsidasa alfa presentaron una eficacia comparable en la eliminación de Gb3 en riñones y corazón (figura 11a, b), excepto por una mejor eliminación de Gb3 cardiaca de la agalsidasa alfa a la dosis más alta (3 mg/kg). En la eliminación de la Gb3 hepática, la agalsidasa alfa resultó mucho más eficaz que aGal de musgo a las dosis de 0.3 y 1 mg/kg (figura 11c). A la dosis más elevada (3 mg/kg), dichos dos enzimas condujeron a niveles de G3 hepático similares.

Ejemplo 6: administración de a-galactosidasa A humana recombinante producida por musgo en modelo de ratón de enfermedad de Fabry mediante vías no intravenosas

El objetivo de los presentes experimentos era someter a ensayo la potencial utilidad de las vías no intravenosas en la administración de aGal de musgo en los tejidos diana en el modelo de ratón.

Ejemplo 6.1: métodos

Se utilizó aGal de musgo tal como se indica en el ejemplo 1, a una concentración de 0.69 mg/ml. Se utilizaron ratones Fabry macho adultos (8 a 11 meses). Se inyectó aGal de musgo por las vías intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) o subcutánea (s.c.). Para las últimas dos vías, se inyectó enzima en los músculos de los muslos (ambos lados) y bajo la piel laxa entre los hombros, respectivamente. Se sometieron a ensayo dosis de 1, 3 o 10 mg/kg de peso corporal. Se extrajo sangre 0.5, 1, 2, 4, 6 y 24 horas después de la inyección y se diseccionaron los órganos a las 24 horas. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta la utilización. Se utilizó plasma de ratones Fabry no tratados (n=5) para la actividad de línea base. Se midieron las actividades de a-Gal A en plasma y tejidos mediante la utilización del método 4MU estándar.

Espectrometría: tras las reacciones enzimáticas, se midió la intensidad de fluorescencia de 4MU liberado mediante la utilización de SpectroMax M5 (Molecular Devices). Dicho equipo se utilizó para el análisis de muestras de ratones inyectados por las vías i.p. e i.m. (y todas las muestras sometidas a ensayo por los presentes inventores en los últimos 5 años). Sin embargo, debido a que se produjo recientemente un problema mecánico, para las muestras de ratones inyectados por vía s.c. la fluorescencia se midió mediante la utilización de SpectroMax Paradigm (Molecular Devices). La curva patrón de 4MU en SpectroMax Paradigm mostró una excelente linealidad y las actividades de a-gal A de tejidos y plasma de ratón analizados eran muy próximas a las medidas previamente mediante la utilización de SpectroMax M5 (analizando las mismas muestras). Por lo tanto, la variación de los datos mediante la utilización de 2 espectrometrías diferentes en el presente estudio debería ser muy pequeña.

Ejemplo 6.2: resultados y comentarios:

Vía i.p. (figura 12): las actividades plasmáticas alcanzaron un pico en 0.5 a 2 horas después de la inyección, se redujeron a continuación y volvieron al nivel de base a las 6 horas. Las actividades eran dependientes de la dosis. Las actividades en corazón, riñón, hígado y bazo se incrementaron de una manera dependiente de la dosis.

Vía i.m. (figura 13): las actividades plasmáticas alcanzaron un pico 0.5 horas después de la inyección, se redujeron rápidamente después y volvieron al nivel de línea base a las 4 horas. Las actividades en corazón, riñón, hígado y bazo se incrementaron de una manera dependiente de la dosis. Un ratón (n° 14, con una dosis de 10 mg/kg) presentó actividades tisulares marcadamente más elevadas que otros en el mismo grupo; esta muestra fue descartada del análisis de los datos.

Vía s.c. (figura 14): las actividades plasmáticas mostraron un patrón similar a la administración i.m. Globalmente, las actividades tisulares se incrementaron de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia sustancial en las actividades de corazón y riñón entre las dosis de 1 y 3 mg/kg; ello podría deberse a una tasa de absorción relativamente limitada de dicha vía. A la dosis de 10 mg/kg, las actividades tisulares mostraron variaciones elevadas; 2 de cada 5 ratones presentó actividades drásticamente más elevadas que el resto.

Ejemplo 6.3: comparaciones

La eficiencia de administración del enzima se observó que presentaba el orden siguiente: i.p. > s.c. > (o similar) i.m.

i.p. vs. i.v.: las actividades de a-Gal en corazón, riñón, hígado y bazo en ratones inyectados por vía i.p. (1 mg/kg) fueron de 16%, 49%, 17% y 35% las de los ratones inyectados por vía i.v. (datos del estudio de estabilidad en los tejidos, 1 mg/kg, 24 horas después de la inyección).

s.c. vs. i.p./i.v.: aunque la inyección s.c. condujo a menor administración de enzima en los tejidos que la inyección i.p., la proporción de reducción en los diferentes órganos no fue proporcional. A la dosis de 1 mg/kg, las actividades de a-gal A en corazón, riñón, hígado y bazo en ratones inyectados por vía s.c. era 67%, 43%, 22% y 24% las de los ratones inyectados por vía i.p. Lo anterior sugiere que la vía s.c. tiende a administrar más enzima en corazón y riñones que en hígado y bazo. Se observó un patrón similar en comparación con la administración i.v. Las actividades en los órganos anteriormente indicados de la inyección s.c. fueron 11%, 21%, 4% y 9% las de los ratones inyectados por vía i.v.

Las vías no i.v. son un enfoque alternativo para la ERT. La vía i.p. aparentemente es un buen método. Al considerar la utilización en seres humanos, la vía s.c. podría ser un buen candidato. Aunque las cantidades tisulares son menores que en la administración i.v., pueden administrarse cantidades suficientes ya que sólo se requieren cantidades bajas en los tejidos. En el caso de que las actividades tisulares (por ejemplo, s.c. vs. i.v.) de una única administración resulten insuficientes para degradar la G3 acumulada en corazón y riñones, las inyecciones repetidas podrían superar este problema. En resumen, los aspectos positivos de la administración i.p., i.m. y s.c. probablemente tales como la aceptación mejorada del paciente superan la distribución reducida en los tejidos diana.

Ejemplo 7: comentario

Según las características de las proteínas, así como su aplicación planificada, se seleccionan diferentes huéspedes de expresión. Mientras que las proteínas en masa para aplicaciones industriales y alimentarias/piensos se expresan mayoritariamente en huéspedes procarióticos, tales como Escherichia coli, la producción de proteínas farmacéuticas con frecuencia se basa en la expresión en células eucarióticas superiores, tales como, por ejemplo, células CHO (ovario de hámster chino) o células vegetales. Las últimas selecciones se basan principalmente en el hecho de que las proteínas farmacéuticas, al ser la mayoría de origen humano, requieren modificaciones postraduccionales (MPT) complejas, tales como, por ejemplo, N-glucosilaciones. Por lo tanto, la expresión recombinante en paralelo de las mismas proteínas en diferentes sistemas de expresión eucariótica rinde diferentes calidades de producto con respecto a las MPT. Por ejemplo, en el caso de la N-glucosilación, los sistemas de expresión de células de mamífero tienden a rendir una mezcla de productos muy heterogénea, con varias decenas a centenares de diferentes especies de N-glicano en el mismo producto de proteína. Los sistemas de expresión vegetales, en contraste, muestran un patrón de N-glucosilación muy homogéneo, con la presencia de únicamente unas cuantas (típicamente menos de diez) especies de glicano diferentes en la proteína producida.

En el caso de la producción de proteínas farmacéuticas, la selección del sistema de producción con frecuencia resulta inducida por las exigencias estructurales y de calidad del producto. La presente invención se ha visto motivada por la necesidad de producir una proteína lisosómica recombinante para tratar pacientes que sufren de LSD. Debido a que estos pacientes no disponen de la versión funcional de dicho enzima debido a la mutación génica hereditaria, se utiliza el producto recombinante como sustitución mediante terapia de sustitución enzimática periódica (por ejemplo, infusión intravenosa). Para la incorporación eficiente a partir del torrente sanguíneo mediante unión al receptor de manosa sobre la superficie de las células diana, el enzima necesita encontrarse decorado con N-glicanos que portan residuos de manosa terminales.

Con el fin de producir una versión de aGal con N-glicanos terminados en manosa en un sistema de expresión vegetal, el método rutinario utilizará la administración dirigida a vacuolas de la proteína mediante la adición de una señal de secreción al extremo N-terminal y una señal de administración dirigida vacuolar al extremo C. En este enfoque, la señal de secreción dirige la proteína naciente al retículo endoplasmático (RE), donde es decorada con los glicanos precursores. Tras la ruta secretora por defecto, la proteína es transportada al aparato de Golgi y sus glicanos son recortados adicionalmente y procesados hasta una forma de N-glicano vegetal compleja típica. Estos glicanos terminan en dos residuos terminales de N-acetilglucosamina (GlcNAc) que cubre ambos extremos posibles de manosa de dicho glicano.

La exposición de dichas dos manosas en las posiciones penúltimas de los dos brazos de glicano seguidamente se consigue con el segundo péptido de administración dirigida, la señal de administración dirigida vacuolar en el extremo C. Este péptido se une a receptores de clasificación vacuolar en la red del trans-Golgi (RTG) e inicia la administración dirigida de la proteína unida a la vacuola. En ésta, la beta-N-acetilhexosaminidasa escinde los GlcNAc terminales y de esta manera expone los residuos de manosa. Los glicanos resultantes se clasifican como “paucimanosídicos” y son típicos de las proteínas vacuolares vegetales.

La presente invención, en contraste, omite la etapa de incorporar una señal vacuolar C-terminal en la secuencia de las proteínas. Por lo tanto, el producto recombinante no se clasifica hacia la vacuola en la RTG, aunque además sigue la ruta secretora por defecto. En este enfoque, no se prevé el recorte de los N-glicanos complejos y la exposición asociada de las manosas terminales, ya que las estructuras paucimanosídicas se asignan a ser específicas vacuolares (Castilho y Steinkellner, Biotechnology Journal 7(9):1088-1098, 2012).

La presente invención consiguió el recorte de los N-glicanos en los briófitos, generando una versión recombinante de proteínas lisosómicas con manosas terminales expuestas en sus N-glicanos sin una señal vacuolar. Lo anterior condujo a una ruta secretora que, aunque es independiente del procesamiento vacuolar de glicoles, condujo a un producto con cantidades elevadas de glucoproteínas paucimanosídicas en el caso de las proteínas lisosómicas.

La aGal de musgo resultó eficientemente incorporada por las células endoteliales que expresaban RM, y esta incorporación resultó bloqueada por manano de levadura, un inhibidor específico de endocitosis mediada por RM. La aGal de musgo no resultó eficazmente incorporada por los fibroblastos de piel humana, que no expresan RM. Estos resultados indican que la incorporación de aGal de musgo está mediada por RM. En contraste, la incorporación de agalsidasa alfa implicaba tanto RM como M6PR. Los estudios animales revelaron que la actividad enzimática y la capacidad de eliminación del almacenamiento de aGal de musgo en corazones y riñones de ratón son globalmente comparables a los de la agalsidasa alfa. Estos resultados sugieren que los enzimas terminados en manosa pueden resultar tan eficaces como los enzimas que alojan M6P en el tratamiento de la enfermedad de Fabry y en otras LSD.

La aGal de musgo sometida a ensayo resulta idéntica a su contrapartida humana con respecto a la secuencia y estructura de la proteína. La N-glcuosilación homogénea y predominantemente terminada en manosa se consigue mediante la expresión en una cepa de musgo personalizada. Además, para la producción de aGal rica en man, se ha inactivado la GNT-I (N-acetiltransferasa-glucosaminiltransferasa I). La transferencia de una N-acetilglucosamina al glicano naciente por este enzima forma un sustrato esencial para su procesamiento adicional en formas complejas. Por lo tanto, el procesamiento de glicanos complejos resulta bloqueado en esta forma inactivada y todas las glicoformas son del tipo rico en man.

El estudio de los presentes inventores mostró que el musgo es una plataforma útil para expresar a-gal A y otros enzimas lisosómicos. En un aspecto, el musgo por sí mismo muestra una N-glucosilación extraordinariamente homogénea, es decir, en comparación con, por ejemplo, células de mamífero, sus proteínas muestran un número drásticamente reducido de glucoformas con una distribución porcentual altamente reproducible. Con respecto a la producción farmacéutica, lo anterior resulta altamente ventajoso en casos en los que las calidades de los N-glicanos son decisivas para la eficacia terapéutica de una proteína.

La incorporación de aGal de musgo por las células endoteliales resultó mucho más eficiente que la de agalsidasa alfa. Lo anterior fue consistente con la eliminación más rápida de aGal de musgo infusionada respecto de la circulación in vivo. Dado que las células endoteliales desempeñan un papel importante en la fisiopatología de la vasculopatía y otras manifestaciones en la enfermedad de Fabry, la administración eficaz en las células endoteliales resulta ventajosa para prevenir y corregir la patología de la enfermedad. El estudio de los presentes inventores mostró además que, a pesar de los residuos de manosa terminal incrementados, la unión/incorporación de aGal rica en man a células endoteliales resultó significativamente menos eficiente que aGal de musgo paucimanosídica. Lo anterior sugiere que la eficiencia de unión de RM posiblemente depende más de la conformación de los glicanos, en lugar del número absoluto de residuos de manosa expuestos.

Mediante inmunohistoquímica, se detectó aGal de musgo en endotelio vascular y células perivasculares en el corazón, que es globalmente consistente con el patrón de distribución de RM. Es conocido que los cardiomiocitos endocitan ligandos manosilados mediante receptores RM o de tipo RM. Aunque no se detectó el enzima en las células musculares, la Gb3 cardíaca significativamente reducida (decremento de ~45% en ratones Fabry que habían recibido 1.0 o 3.0 mg/kg de aGal de musgo) sugiere que la pequeña cantidad de enzima que se encuentra bajo el límite de detección del método de inmunotinción de los presentes inventores podría haberse administrado en los cardiomiocitos. En el riñón, aGal de musgo sólo se detectó en las células epiteliales tubulares. No se conoce cuál es el mecanismo de incorporación, ya que no se ha informado de que los túbulos renales expresen RM. Una interpretación potencial es que las células tubulares expresan otro u otros receptores que median en la endocitosis de glucoproteínas terminados en manosa. La presencia de dicho receptor o receptores no identificados que presenta actividad e unión de tipo RM se ha informado en bazo murino y ganglio linfático. La reabsorción de enzimas filtrados por las células tubulares mediante endocitosis mediada por megalina es otra posibilidad.

La aGal de musgo y la agalsidasa alfa mostraban diferentes distribuciones en los tejidos en el análisis de 2 horas después de la infusión. Respecto a la agalsidasa alfa, la administración dirigida de aGal de musgo en el riñón resultó significativamente potenciada y la administración en el hígado, significativamente reducida. Dicho patrón de distribución de aGal de musgo resulta ventajosa, ya que el riñón es uno de los órganos principalmente afectados en dicha enfermedad. En el hígado, la agalsidasa alfa infusionada se administra tanto en hepatocitos como en células de revestimiento de seno (células del endotelio y/o de Kupffer), presumiblemente mediante M6PR, receptores de asialoglucoproteína y RM. La mayor parte de M6PR accesible al enzima fosforilado infusionado se encuentra contenido en el hígado. En contraste, aGal de musgo se administra preferentemente en células endoteliales y de Kupffer mediante el RM.

La semivida de aGal de musgo internalizado en el corazón y riñón fue más corta que la agalsidasa alfa. Lo anterior probablemente está relacionado con que el menor contenido de carbohidratos en aGal de musgo puede conducir a una mayor susceptibilidad del enzima a la degradación proteolítica en los lisosomas. Debido a la más rápida renovación, la actividad de aGal de musgo en el riñón 4 días después de la infusión era similar a la de la agalsidasa alfa. La reducción del almacenamiento de Gb3 en el riñón y corazón era paralela a las actividades enzimáticas residuales 4 días después de la inyección.

La comparación de aGal de musgo y agalsidasa alfa puede servir como un modelo útil para el estudio de las funciones de M6PR y MR en la incorporación en tejidos de la agalsidasa alfa. Tal como se ha mencionado, tanto M6PR como RM median en la administración de agalsidasa alfa in vitro; de esta manera, resulta difícil determinar qué ruta de receptores es más responsable de la biodistribución y de la respuesta terapéutica de dicho enzima en determinados órganos diana. A pesar de las cadenas sacáridas marcadamente diferentes, la localización celular de la agalsidasa alfa y la aGal de musgo en el corazón y riñón asimismo eran inesperadamente similares. En otras palabras, en comparación con un enzima completamente no fosforilado, los residuos M6P en la agalsidasa alfa no condujeron a una distribución más amplia y a una eliminación más completa de Gb3, tal como se esperaría. Estos resultados sugieren que la ruta de RM podría desempeñar un papel más importante que M6PR en la administración dirigida de la agalsidasa alfa al corazón y a los riñones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método de fabricación de una composición de proteína lisosómica, que comprende expresar un transgén que codifica una proteína lisosómica en una planta o célula de briófita, en el que dicha proteína lisosómica se expresa con una señal secretora N-terminal, en el que dicha señal secretora se elimina opcionalmente durante el procesamiento intracelular, y en el que la proteína lisosómica carece de una señal vacuolar C-terminal con la secuencia VDTM (SEC ID n° 1) y carece de una señal de retención de ER C-terminal con la secuencia KDEL (SEC ID n° 2), y dicho método comprende además obtener una proteína lisosómica expresada a partir de dicha planta o célula.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína lisosómica expresada se obtiene a partir de la materia secretada de la planta o célula.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la proteína lisosómica expresada se obtiene a partir de materia secretada de la planta o célula sin disrupción de las células o la planta productoras.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína lisosómica carece de cualquier secuencia de señal de retención de ER C-terminal y/o carece de cualquier secuencia de señal vacuolar C-terminal.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína lisosómica comprende una secuencia de aminoácidos expresada que termina en el extremo C con los aminoácidos de una proteína lisosómica nativa o un truncamiento de la misma.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la planta o célula de briófita es un musgo, preferentemente P. patens, planta o célula, y/o en el que la planta o célula de briófita tiene suprimida o eliminada la alfa-1,3-fucosiltransferasa y/o beta-1,2-xilosiltransferasa.

7. Composición de proteína lisosómica que comprende una pluralidad de proteínas lisosómicas que están glucosiladas según un patrón de glucosilación, en la que dicho patrón de glucosilación presenta por lo menos 45% de N-glicanos paucimanosídicos (% molar).

8. Composición de proteína lisosómica según la reivindicación 7 obtenible mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Composición de proteína lisosómica según la reivindicación 7 u 8, en la que la proteína lisosómica es una cualquiera seleccionada de entre a-galactosidasa, preferentemente a-galactosidasa A (GLA); p-glucoceramidasa, p-glucosidasa (glucocerebrosidasa); a-manosidasa; aspartilglucosaminidasa; p-manosidasa; ceremidasa ácida; afucosidasa; p-galactosidasa, proteína activadora de p-hexosaminidasa; galactocerebrosidasa, galactoceramidasa; lipasa ácida lisosómica (LAL); a-iduronidasa; iduronato-2-sulfatasa; glucosamina-N-sulfatasa, heparansulfatosulfamidasa (SGSH); a-N-acetil-glucosaminidasa (NAGLU); a-glucosaminida-N-acetiltransferasa; N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa; p-galactosidasa; N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa; p-glucuronidasa; neuraminidasa; esfingomielinasa, esfingomielina fosfodiesterasa; alfa-1,4-glucosidasa ácida; p-hexosaminidasa, o su subunidad a; alfa-N-acetilgalactosaminidasa (NAGA), a-galactosaminidasa; p-hexosaminidasa A; galactosassulfato sulfatasa; hialuronidasa.

10. Composición de proteína lisosómica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que las proteínas lisosómicas presentan uno o más N-glicanos paucimanosídicos que comprenden la estructura de fórmula 1:

(fórmula 1)

en la que un cuadrado representa N-acetilglucosamina (GlcNAc), un círculo representa manosa (Man) y un círculo con una T representa una manosa terminal, en la que una o más de las subunidades de GlcNAc o Man pueden estar a1,3-fucosiladas, a1,6-fucosiladas y/o p1,2-xilosiladas, preferentemente en la que por lo menos 10% de los N-glicanos de las proteínas lisosómicas de la composición comprende o consiste en la estructura de fórmula 1 (% molar).

11. Composición de proteína lisosómica según la reivindicación 10, en la que el patrón de glucosilación presenta por lo menos 1% de N-glicanos de la fórmula GlcNAc2-Hex2-metil-Hex; y/o en la que el patrón de glucosilación comprende los N-glicanos siguientes:

0% a 35%, preferentemente 1% a 30%, -GlcNAc2-(Man2metil-Hex);

30% a 80%, preferentemente 40% a 70%, -GlcNAc2-Man3;

0% a 30%, preferentemente 4% a 22%, -GlcNAc2-Man3-GlcNAc;

0% a 15%, preferentemente 2% a 12%, -GlcNAc2-Man3-GlcNAc2;

0% a 5%, preferentemente 0% a 3%, -GlcNAc2-Man3-Hex2;

0% a 11%, preferentemente 1% a 8%, -GlcNAc2-Man3-Hex3;

0% a 10%, preferentemente 1% a 7%, -GlcNAc2-Man3-Hex4;

0% a 10%, preferentemente 1% a 7%, -GlcNAc2-Man3-Hex5;

en la que la totalidad de estos compuestos juntos ascienden a 100% o menos de 100%,

en la que GlcNAc es una subunidad de N-acetilglucosamina, Man es una subunidad de manosa, Hex es una subunidad de hexosa, metil-Hex es una subunidad de hexosa metilada, preferentemente 2-O-metil hexosa; con la condición de que -GlcNAc2-(Man2metil-Hex) y -GlcNAc2-Man3 juntos ascienden a por lo menos 45%, (todos los % son % molares),

especialmente se prefiere en la que Hex es Man en cualquiera de los N-glicanos anteriores;

en la que GlcNAc en el extremo reductor del glicano puede estar fucosilada o no está fucosilada en cualquiera de los N-glicanos anteriores; en la que una Man en un punto de ramificación, está xilosilada o no está xilosilada en cualquiera de los N-glicanos anteriores.

12. Composición de proteína lisosómica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 que comprende proteínas lisosómicas no fosforiladas.

13. Célula de o planta briófita adecuada para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende un transgén que codifica una proteína lisosómica tal como se define en la reivindicación 1, preferentemente tal como se define asimismo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

14. Método in vitro de procesamiento de una proteína lisosómica que comprende un N-glicano complejo, comprendiendo dicho método proporcionar la proteína lisosómica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en una muestra y poner en contacto la muestra con un enzima HEXO de briófita, preferentemente HEXO3, escindiendo así el enzima HEXO de briófita los residuos de Glc-NAc terminales de la proteína lisosómica, produciendo de esta manera un N-glicano paucimanosídico.

15. Composición de proteína lisosómica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico que comprende administrar la composición de proteína lisosómica a un paciente, preferentemente en la que la enfermedad y la proteína lisosómica se selecciona de la tabla siguiente: