JP2018509906A - グリコシル化リソソームタンパク質、その製造方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の詳細な説明
α−ガラクトシダーゼ、好ましくはα−ガラクトシダーゼA(GLA);β−グルコセラミダーゼ(β-Glucoceramidase)、β−グルコシダーゼ(グルコセレブロシダーゼ);α−マンノシダーゼ;アスパルチルグルコサミニダーゼ;β−マンノシダーゼ;酸性セラミダーゼ(Acid Ceremidase);α−フコシダーゼ;β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ活性化タンパク質;ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトセラミダーゼ(Galactoceramidase);リソソーム酸リパーゼ(LAL);α−イズロニダーゼ;イズロン酸−2−スルファターゼ;グルコサミン−N−スルファターゼ、ヘパランスルファスルファミダーゼ(Heparansulfatsulfamidase)(SGSH);α−N−アセチル−グルコサミニダーゼ(NAGLU);(ヘパラン)α−グルコサミニド−N−アセチルトランスフェラーゼ;N−アセチルガラクトサミン−6−スルファターゼ;β−ガラクトシダーゼ;N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ;β−グルコロニダーゼ(β-Glucoronidase);ノイラミニダーゼ;スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ;酸性α−1,4−グルコシダーゼ;β−ヘキソサミニダーゼ、またはそのαサブユニット;α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGA)、α−ガラクトサミニダーゼ;β−ヘキソサミニダーゼA;ガラクトース−6−硫酸スルファターゼ;ヒアルロニダーゼ。本発明のすべての実施形態において特に好ましいのはα−ガラクトシダーゼである。好ましいα−ガラクトシダーゼは、ヒトα−ガラクトシダーゼ(例えば配列番号3が挙げられ、これは配列番号4の核酸配列から発現させることができる)またはそこからトランケーションされたα−ガラクトシダーゼである。グルコセレブロシダーゼ、例えばヒトグルコセレブロシダーゼ(例えば配列番号6、これは配列番号7の核酸配列から発現させることができる)も好ましい。α−グルコシダーゼ、例えばヒトα−グルコシダーゼ(例えば配列番号8、これは配列番号9の核酸配列から発現されることができる)も好ましい。他の実施形態において、グルコセレブロシダーゼおよびα−グルコシダーゼは本発明のリソソームタンパク質の群から除外される。
[式中、
四角はN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を表し、丸はマンノース(Man)を表し、T付きの丸は末端マンノースを表す]。この式1(本明細書において「MM」グリカンとも呼ばれる)は、さらに改変されていてもよいコア構造を表し、小マンノシド型(paucimannosidic)N−グリカンにおいては、このさらなる改変はまた当該T−マンノースが末端にある(すなわち該糖鎖の非還元末端にある)限り可能である。末端マンノースはメチル化されていてもよく、特にO−メチル化されていてもよい。一般的な改変は、GlcNAcまたはManサブユニットの1つ以上が、α1,3−フコシル化、α1,6−フコシル化、および/またはβ1,2−キシロシル化(β1,2-xylosylated)されている場合がある。α1,3−フコシル化およびα1,6−フコシル化(α1,6-fucosylatations)は、還元性GlcNAcに共通して見出される。β1,2−キシロシル化(xylosylation)は、通常、非末端マンノース(式1においてTを有さない円)で見られる。本発明によれば、α1,3−フコシル化および/またはβ1,2−キシロシル化は、上記のような生産間にそれぞれの酵素の阻害により防止または低減されることが好ましい。α1,6−フコシル化は存在してもしなくてもよい。植物では珍しいことであるが、それは発現細胞または発現植物体にα1,6−フコシルトランスフェラーゼを導入することで達成されうる。好ましくは、本発明の組成物のリソソームタンパク質のN−グリカンのうち、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%は、式1の構造を含むかまたはそれからなる(モル%)。
i) 0%〜35%、好ましくは0.5%〜30%、−GlcNAc2−(Man2メチル−Hex);
ii) 30%〜80%、好ましくは40%〜70%、特に好ましくは45%〜60%、−GlcNAc2−Man3;
iii)0%〜30%、好ましくは4%〜22%、−GlcNAc2−Man3−GlcNAc;
iv) 0%〜15%、好ましくは2%〜12%、−GlcNAc2−Man3−GlcNAc2;
v) 0%〜5%、好ましくは0%〜3%、−GlcNAc2−Man3−Hex2;
vi)0%〜11%、好ましくは1%〜8%、−GlcNAc2−Man3−Hex3;
vii)0%〜10%、好ましくは1%〜7%、−GlcNAc2−Man3−Hex4;
viii)0%〜10%、好ましくは1%〜7%、−GlcNAc2−Man3−Hex5;
ここで、これらの化合物は全て合わせて合計100%または100%未満であり、これは明かである(全ての%はモル%である)。上記のリストに特定されていない他のN−グリカンが存在しうるので、100%未満が可能である。このような他のN−グリカンは、0%〜30%、好都合には0.01%〜20%、特に好ましくは0.1%〜10%であり得る。該特定されたN−グリカンi)〜viii)のいずれか1つは、0%の代わりに少なくとも0.01%の量であり得る。GlcNAcはN−アセチルグルコサミンサブユニットであり、Manはマンノースサブユニットであり、Hexは六炭糖サブユニットであり、メチル−Hexはメチル化六炭糖サブユニット(好ましくは2−Oメチル六炭糖)である。このグリコシル化パターンにおいて、−GlcNAc2−(Man2メチル−Hex)および−GlcNAc2−Man3は合わせて少なくとも45%(モル%)に達する。すなわち、これらは本発明の概要で述べたようこの量に寄与する小マンノシド型(paucimannosidic)N−グリカンである。上記N−グリカンi)〜viii)のいずれか1つにおいて特に好ましいHexはManである。上記N−グリカンi)〜viii)のいずれか1つにおいて、グリカンの還元末端のGlcNAcはフコシル化されていてもよいし、フコシル化されていなくてもよい。上記のN−グリカンi)〜viii)のいずれかにおいて、分岐点のManがキシロシル化されているか、またはキシロシル化されていない。
天然のシグナル配列の無いα−ガラクトシダーゼA(α−galA)(配列番号3)をコードするヒトGLA遺伝子(NCBI Reference Sequence:NM_000169.2)のDNA配列をコドン最適化バージョン(配列番号4)として合成し、GeneArt / Thermo Fisher Scientific(GENEART AG, Regensburg, Germany)によって蘚類発現ベクター中へサブクローニングした。α−galA発現コンストラクトおよびネオマイシン耐性付与遺伝子(npt II)コンストラクトを有する配列を、制限酵素を用いて該プラスミドからリニアーな発現カセット(図1)として切り取った。
該α−galA産生株をWave(商標)Reactor Rocker(BioWave 20 SPS, Wave Biotech AG, Switzerland)に設置された20L容使い捨てバック(Cellbag 20, GE Healthcare, Germany)中で4週間(27日)培養した。培養パラメータは以下の通りであった:振とう速度25〜30rpm、8°角度、SM07−培地(100mM NaCl、6.6mM KCL、2.0mM MgSO4×7H2O、1.8mM KH2PO4、20.4mM Ca(NO3)2×4H2O、0.05mM FeNa−EDTA、4.9mM MES、0.1%(w/v)PEG4000、100.26μM H3BO3、0.11μM CoCl2×6H2O、0.1μM CuSO4×5H2O、5μM KI、85.39μM MnCl2×4H2O、1.03μM Na2MoO4×2H2O、0.11mM NiCl2×6H2O、0.04μM Na2SeO3×5H2O、0.039μM Zn−酢酸×2H2O)、25℃、0.3L×min−1加圧エアー(2%〜4%CO2補充)、および130〜310μE×m−2×s−1での照明、24時間明るい/日、Osram FQ 24W 840 HO, Lumilux Cool White装備の照明パネルから供給。さらに、1000×Nitschビタミン混合物(Nitsch vitamin mixture, Duchefa, Netherlands)をメーカーの指示に従って添加した。発酵のpHは、WAVEPOD I(GE Healthcare)をPump20(GE Healthcare)と組み合わせて使って、0.5M H2SO4および0.5M NaOHによる滴定によってpH5〜6で自動的に制御した。
1)Zetaplus(01SP B3002, 3M, Germany)を装着したカスタマイズされたPPろ過ハウジング(Grosse et al. (2014) WO 2014/013045 A1)ケーキろ過による蘚類の収集;
2)二重層スケールアップカプセル(E0340FSA60SP03A, 3M, Germany)による深層ろ過;および
3)最終の無菌ろ過工程(Millipore ExpressTM Plus, 0,22 μm, Millipore, Germany)。
α−galA活性を、5mM 4−メチルウンベリフェリル−α−D−ガラクトピラノシドを用いる蛍光分析により、pH4.4で0.1M N−アセチルガラクトサミン(α−ガラクトシダーゼBの特異的阻害剤)の存在下で測定した。タンパク質濃度を、供給者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて測定した。該活性はμmol/mgタンパク質/時間として表した。結果を図5cにまとめた。
試料を、還元剤(Invitrogen)を添加したSDSサンプルバッファー中、95℃で5分間変性させた。NuPAGEビス−トリス4〜12%ゲル(Invitrogen)をタンパク質分離に使用した。SilverQuest(商標)染色キット(Invitrogen)を使用して、供給業者のマニュアルに従って銀染色を行った。
精製されたα−galAにおける残存するHCPレベルを定量するために、新規なHCP ELISAが開発された(Biogenes GmbH, Germany)。手短に言えば、それぞれの野生型とのモック発酵を行い、培地を収集し、濃縮した。濃縮されたタンパク質溶液をウサギの免疫化に使用した。総IgGを用いて、HCP定量のためのサンドイッチELISAを作成した。結果は、精製プロセスにわたり、HCPの10000倍の代表的な減少を示す。
蘚類aGalの生産を光独立栄養的発酵法にてwave(商標)-rockerに設置された10L単回使用使い捨てバック中で行った。抗生物質の不在下で培養された該蘚類は、蘚類aGalを純粋なミネラル培養培地中に分泌した。培養バッグの照明は、200μmol/m2sの平均光子束で外部から行った。最終の培養密度に達した後、蘚類をケーキろ過により培地から分離し、後者を二重層深層フィルターシステムおよび最終の無菌ろ過により浄化した。得られた浄化培地を濃縮し、接線流ろ過で再緩衝化(rebuffered)した。
実施例2.1:酵素生産および活性アッセイ:
小マンノシド型(paucimannosidic)蘚類aGalを実施例1に記載したようにして得た。この産生株を、高mann aGal産生株を得るために、唯一のヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子(Gnt I)を標的とするノックアウトコンストラクトでさらに形質転換した。酵素の細胞取り込みに対する末端マンノシル基の増加の影響を試験するために、遺伝的にβ−1,2−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(GNT−I)活性が減らされた株中でもα−galAを産生させた。このノックアウト改変は、その後の酵素工程の基質を欠くため、蘚類の複合型グリカンプロセシングを不能にする。したがって、シス−ゴルジにおけるα−マンノシダーゼI媒介トリミングが最後のプロセシング工程であり、それ故、この株の全てのN−グリカンは高マンノース型である。この株で生産されたヒトα−ガラクトシダーゼを高mann aGalと呼ぶ。生産および精製は実施例1と同じスキームに従った。
HILIC−UPLC−MSを用いてProtagen protein Services(Dortmund, Germany)によって、蘚類aGalおよびアガルシダーゼアルファのグリカン分析を行った。手短に言えば、N−グリカンをPNGase Fを用いて酵素的に該タンパク質から放出した。清浄化および脱塩後、単離したグリカンを2−アミノベンズアミド(2−AB)を用いて標識した。標識されたグリカンをリニアグラジエント78%〜55.9%B(バッファーA:100mMギ酸アンモニウムpH4.5、バッファーB:アセトニトリル)を用いるACQUITY UPLC BEH グリカン(2.1x100mm)カラムで38.5分、60℃、流量0.5ml/分で分離した。溶出するグリカンのシグナルを、蛍光検出器(330nm励起、420nm発光)で記録した。それぞれのグリカンへの蛍光ピークの割り当てを記録されたm/z値(Xevo-QTOF MS, Waters)およびMasLynx software(Version 4.1, Waters)を用いて行った。
酵素を健常人から得た血漿で希釈し、37℃で指示の時間加熱した。中性のpHを維持するために、HEPESを最終濃度20mMで該血漿に加えた。加熱後、α−galA活性を測定した。
蘚類aGalは、主な構造としてコア型Man3GlcNAc2を持つ非常に均一なN−グリカンを有した(図5)。蘚類aGalの糖鎖はほとんど独占的にマンノースおよびGlcNAcによって構成されており、その〜85%はマンノース末端、〜10%がマンノースとGlcNAcの両方の末端残基を有し、そして〜4%はGlcNAc末端であった(テーブル1)。これに対し、高mann aGalにおいてMan5GlcNAc2は最も量の多いグリカン構造であり(テーブル1)、Man4、Man6、およびMan7は少量であった。予想どおり、リン酸化グリカンは蘚類aGalにも高mann aGalにも無かった。アガルシダーゼアルファは高度に不均質なグリカン構造を示し、その〜24%はリン酸化グリカンであり、〜7%がマンノース末端グリカンであり、そして63%が様々な構造であった(テーブル1)。
実施例3.1発現株構築
ヒトGBA遺伝子(Uniprot identifier P04062- GLCM_HUMAN, NCBI Reference Sequence: NM_000157.3)のcDNA配列を合成し、GeneArt(商標)(Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Germany)で蘚類発現ベクターにサブクローニングした。使用された配列(配列番号7)は、天然のアノテートされたシグナルペプチド(SP)の無い(これは26aa植物SPで置き換えられた)(シグナルP4.1 web-toolによれば、正確な切断はスコア0.522で予測される)ヒトGBA(配列番号6)をコードした。クローニングを促進(HindIII制限サイトを避けながら)するために、GBA配列を、アミノ酸リジンの代替のコドンを用いて、1つの単独塩基内(配列番号7の塩基21位、AAA→AAG)で改変した。GBA発現コンストラクトおよびネオマイシン耐性付与遺伝子(npt II)コンストラクトを有する配列をリニアーな発現カセットとして、プラスミドから制限酵素を用いて切り出した。
実施例1.2および実施例2について記載したのと同じ条件および工程を生産のために使用した。グルコセレブロシダーゼを、10kDaセルロースカセット、陽イオン交換クロマトグラフィー(CaptoS)(捕獲)、およびゲルろ過(Sephadex)(仕上げ)を用いて、接線流ろ過により精製した。精製/濃縮グルコセレブロシダーゼをウエスタンブロッティング、クーマシー/銀染色SDSページ、および酵素活性アッセイによって分析する。精製した酵素は、その後の使用まで−20℃で保存した。精製工程を図3に示す。同様に高マンノースリッチグリコシル化を得た。戻って、MGnおよびGnGnの形態のより高いGlucNac末端グリカンが見られた。β−N−アセチルグルコサミニダーゼによる処置で、高量の小マンノシド型(paucimmanosidic)グリカン体の分布を回復した。
精製したグルコセレブロシダーゼの活性をインビトロ酵素活性アッセイによって評価する。グルコセレブロシダーゼを60mM Na−Citrat、1.3mM EDTA、0.15% Triton−X100、0.125%タウロコール酸ナトリウム、1mM DTT、2mM 4−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシド中、pH6、37℃でインキュベートした。1M NaOHで反応を停止させ、生成物の形成を分光学的に405nmで測定した。
実施例4.1 発現株の構築
ヒトGAA遺伝子のcDNA配列(Uniprot identifier P10253 (LYAG_HUMAN), NCBI Reference Sequence: NM_000152.4)を合成し、GeneArt(商標)(Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Germany)によって蘚類発現ベクターにサブクローニングした。使用した配列(配列番号9)は、天然のアノテートされたシグナルペプチド(SP)の無い(これは26aa植物SP(シグナルP4.1 web-toolによれば、正確な切断はスコア0.847で予想された)およびトランケートされるプロペプチドで置き換えられた)ヒトGAA前駆体(配列番号8)をコードする。(PvuI制限サイトを回避して)クローニングを促進するために、アミノ酸スレオニンの代替コドンを用いることとし、GAA配列を1塩基改変した(配列番号9の2484位の塩基、ACG→ACA)。GAA発現コンストラクトおよびネオマイシン耐性付与遺伝子(npt II)コンストラクトを有する配列をリニアーな発現カセットとしてプラスミドから制限酵素を用いて切り出した。
実施例1.2および実施例2について記載したのと同じ条件および工程を生産のために使用した。α−グルコシダーゼを、Con A Sepharose 4Bを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。α−グルコシダーゼ含有培地を同量の50mM酢酸ナトリウム、1M NaCl pH5.2と混合して、適切な結合条件に調整し、クロマトグラフィーカラムに充填した。溶出は、α−D−メチルグルコシドの濃度を段階的に増加することによって達成した。精製/濃縮されたα−グルコシダーゼをウエスタンブロッティング、クーマシー/銀染色SDSページおよび酵素活性アッセイによって分析する。精製された酵素は、さらに使用するまで4℃または−20℃で保存した。濃縮された蘚類GAAのSDS−PAGE分析を図4に示す。MS分析により、蘚類GAAを含むバンドを同定した。
実施例5.1:インビトロ取り込み試験:
ファブリー病患者由来の皮膚線維芽細胞(DMN96.125)および内皮細胞株(IMFE1)を、10% FBSのDMEMおよびEGM−2MV(Lonza)中でそれぞれ培養した。両方の細胞株は非常に低いα−galA活性を有し、免疫染色によって検出可能なリソソームGb3蓄積を有する(Shen et al. (2008) Mol Genet Metab 95:163-168)。該細胞をα−galA調製物(最終濃度10μg/ml)と共に5mM M6Pまたは2mg/ml酵母マンナンの存在下または不存在下で指示された時間インキュベートした。その後、細胞を細胞外α−galAも除去するトリプシン処理(0.25%トリプシン/EDTA、37℃)によって収集した。PBSで洗浄した後、細胞ペレットを酵素アッセイまたはウエスタンブロット用に溶解した。
マルチウェルプレート中のIMFE1細胞を5mM M6Pまたは2mg/mlマンナンの存在下または不存在下、4℃でα−galA酵素(10 μg/ml)とともにインキュベートした。培養培地EGM−2MV(25mM HEPES補充)を使用した。3時間後、細胞を氷冷PBSで4回洗浄し、4℃で0.2%Tritonで直接溶解した。該ライセートをタンパク質アッセイおよびα−galA酵素アッセイに使用した。
サンプルを、2.5%2−メルカプトエタノールを含むLDSサンプル緩衝液(Invitrogen)中、70℃で10分間変性させた。NuPAGEビス−トリス4−12%または10%ゲル(Invitrogen)をタンパク質分離のために使用した。これまでに記載されたように(Shen et al. (2008) Biochem Biophys Res Commun 369:1071-1075)、ウエスタンブロットを行った。使用した一次抗体は、ヒトα−galAに対するウサギポリクローナル抗体(Shire Human Genetic Therapies, Cambridge, MA)、マンノース受容体に対するマウスモノクローナル抗体(clone 15-2, Abcam, Cambridge, MA)、およびGAPDHに対するヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)であった。α−galAタンパク質レベルをImageJ softwareを用いてデンシトメトリーにより定量化した。
これまでに記載されたように(Shen et al. (2008) Mol Genet Metab 95:163-168)、蛍光免疫染色を行った。使用した一次抗体は、Gb3に対するマウスモノクローナル抗体(Seikagaku、東京、日本)、およびマンノース受容体(clone 15-2, Abcam)であった。細胞をDAPIで対比染色した。
ファブリー病マウスをヘミ接合性雄およびホモ接合性雌のペアの交配によって作成した。成体(3〜6月齢)の雌ファブリー病マウスを試験を通して使用した。各実験について、同じ月齢の動物を使用した。Gb3クリアランス研究に関し、雌ファブリー病マウスは雄ファブリー病マウスよりも研究される。なぜなら雄マウスはテストステロン誘導Gb3合成を腎臓に有し、蓄積したGb3の分解における注入酵素の影響を混乱させるからである。全ての注射に関し、酵素調製物は生理食塩水に希釈して総量200μl/マウスとし、尾静脈を介してファブリー病マウスに注入した。
酵素調製物を1mg/kg体重の用量で注射した(各n=5)。血液試料をヘパリン処置されたキャピラリーを用いて尾の出血によって注射後1、5、10、20および30分に採取した。血漿を分離し、血漿中のα−galA酵素活性を測定した。
酵素調製物を1mg/kg体重の用量で注射した(各n=5)。注射2時間後、マウスに生理食塩水を灌流し(血液を除くために)、心臓、腎臓、脾臓および肝臓を採取した。当該臓器全体をホモジナイズし、α−galA活性を測定した。腎臓については、両方の腎臓を合わせてホモジナイズした。
蘚類aGalまたはアガルシダーゼアルファを尾静脈から1mg/kg体重の用量で注射した(各n=2)。酵素注射1日後に心臓および腎臓を採取した。無処理雌ファブリー病マウス組織をネガティブコントロールとして使用した。組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、5ミクロン切片を作製した。免疫組織化学は、ジョージタウン大学(ワシントンD.C.)のHistopathology and Tissue Shared Resourceで行なった。手短に言えば、クエン酸緩衝液中での熱誘導エピトープ賦活化の後、切片を3%過酸化水素および10%正常ヤギ血清で処理し、ヒトα−galAに対するウサギポリクローナル抗体(Shire)と共にインキュベートした。HRP標識二次抗体とのインキュベーション後、DAB色素原によりシグナルを検出し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。シグナル特異性は、一次抗体インキュベーションを省略した対照染色で検証した。無処理のコントロールにおける明るくおよび拡散した非特異的染色と比較して、特異的なシグナルは顆粒状細胞質パターンを示した。
蘚類aGalまたはアガルシダーゼアルファを尾静脈から1mg/kg体重の用量で注射した。注射24、48および96時間後にマウス(n=4〜5/群)を灌流し、臓器を採取して、生体内分布で記載されているようにホモジナイズした。
単回静脈内注射の後に、種々の臓器における蘚類aGalおよびアガルシダーゼアルファのインビボ動態学を調べた。注射の2時間後および24時間後に、アガルシダーゼアルファ注入マウスと比較して蘚類aGal注入マウスの腎臓は有意に高い酵素活性を有した。しかしながら、活性は48時間と96時間で同じであった(図10a)。心臓では、2および24時間で酵素の2つの形態間に有意な差は無かった;しかしながら、注射後48時間および96時間で蘚類aGalの活性はアガルシダーゼアルファと比べて低かった(図10b)。アガルシダーゼアルファ注入マウスと比較して、蘚類aGal注入マウスは、分析した全ての時点で、脾臓において同レベルの活性を、肝臓においては有意に低い活性を有した(図10c,d)。腎臓および心臓における蘚類aGalおよびアガルシダーゼアルファの半減期は2〜3日であった。蘚類aGalは両方の臓器で〜25%短い半減期を有した。肝臓における蘚類aGalの半減期はアガルシダーゼアルファに比べて有意に短かった(24 vs. 57時間)。脾臓における両方の酵素形態の半減期は同様であった(〜30時間)。
6ヶ月の雌ファブリー病マウスを用いた。蘚類aGalまたはアガルシダーゼアルファを0.3、1および3mg/kg体重の用量で尾静脈を介して注射した(各n=4〜5)。心臓、腎臓、および肝臓を単回注射1週間後に採取した。年齢および性別が一致した無処理のファブリー病およびWTマウスを対照として使用した(n=5)。これまでに記載されたように(Durant et al. (2011) J Lipid Res 52:1742-1746)、組織をホモジナイズし、スフィンゴ糖脂質抽出し、その後、質量分析によるGb3の分析に供した。8つのアイソフォームを分析し、示された結果はこれらのアイソフォームの合計である。Gb3含有量はμg/mg総タンパク質として表した。
これらの実験の目的は、マウスモデルにおける組織を標的とする蘚類αGalの送達における、非静脈内経路の潜在的有用性を試験することである。
実施例1に記載の蘚類aGalを0.69mg/mlの濃度で使用した。成体(8〜11ヶ月)雄ファブリー病マウスを用いた。蘚類aGalを腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、または皮下(s.c.)経路で注射した。後ろ2つの経路では、大腿筋(両側)中および肩の間の緩んだ皮膚の下に酵素をそれぞれ注射した。1、3または10mg/kg体重の用量で試験した。注射後0.5、1、2、4、6および24時間に血液を採取し、24時間で臓器を解剖した。サンプルは使用するまで−80℃で保存した。無処理ファブリー病マウスの血漿(n=5)をベースライン活性として使用した。血漿および組織中のα−GalA活性を標準な4MU方法を用いて測定した。
i.p.経路(図12):血漿活性は注射後0.5〜2時間にピークに達し、その後減少し、6時間でベースライン値に戻った。活性は用量依存的であった。心臓、腎臓、肝臓および脾臓における活性は用量依存的に増加した。
酵素送達効率はi.p.>s.c.>(または同様)i.m.の順である。
タンパク質の特性と計画されている用途に応じて、異なる発現宿主が選択される。工業的および食品/飼料用のバルクタンパク質は大部分が大腸菌のような原核生物宿主で発現されるのに対して、医薬品タンパク質産生はしばしば、例えばCHO−(チャイニーズ−ハムスター−卵巣)または植物細胞のような高等真核細胞細胞での発現に依存する。後者の選択肢は、医薬タンパク質(大抵ヒトオリジン)は、例えばN−グリコシル化のような複雑な翻訳後修飾(PTM)を必要とするという事実に主に基づいている。したがって、異なる真核生物発現系における同一のタンパク質のパラレルな組換え発現は、PTMに関し異なる生成物品質を生み出す。例えば、N−グリコシル化の場合、哺乳動物細胞発現系は、同じタンパク質生成物上に数十から数百の異なるN−グリカン種を持つ非常に不均一な生成物混合物を生じる傾向がある。対照的に植物ベースの発現系は、産生されたタンパク質に少数(典型的には10以下)の異なるグリカン種しか存在しない非常に均質なN−グリコシル化パターンを特徴とする。
Claims (15)
- リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子をコケ植物植物体またはコケ植物細胞中で発現させることを含むリソソームタンパク質組成物を製造する方法であって、該リソソームタンパク質はN−末端分泌シグナルを有して発現し、該分泌シグナルは細胞内プロセシングの間に任意に除去されてもよく、該方法はさらに発現したリソソームタンパク質を該植物体または細胞から得ることをさらに含む、該方法。
- 該発現したリソソームタンパク質が該植物体または細胞の分泌物から、好ましくは該生産細胞または植物体を破壊すること無く、得られる、請求項1に記載の方法。
- 該リソソームタンパク質が、配列VDTM(配列番号1)を有するC−末端液胞シグナルを欠き、および/または配列KDEL(配列番号2)を有するC−末端ER保留シグナルを欠く、請求項1または2に記載の方法。
- 該リソソームタンパク質が、C−末端ER保留シグナル配列を欠き、および/またはC−末端液胞シグナル配列を欠く、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 該リソソームタンパク質が、天然のリソソームタンパク質またはそのトランケーションのアミノ酸のC−末端で終了する発現したアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 該コケ植物植物体またはコケ植物細胞が蘚類(好ましくはP. patens)植物体または細胞であり、および/または該コケ植物植物体またはコケ植物細胞がα1,3−フコシルトランスフェラーゼおよび/またはβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼを抑制しているか、または除去している、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれかの方法によって得られるリソソームタンパク質組成物。
- グリコシル化パターンに従って潜在的に多様にグリコシル化された複数のリソソームタンパク質を含むリソソームタンパク質組成物であって、該グリコシル化パターンは少なくとも45%の小マンノシド型(paucimannosidic)N−グリカン(モル%)を有する、リソソームタンパク質組成物。
- 該リソソームタンパク質が、
α−ガラクトシダーゼ、好ましくはα−ガラクトシダーゼA(GLA);β−グルコセラミダーゼ(β-Glucoceramidase)、β−グルコシダーゼ(グルコセレブロシダーゼ);α−マンノシダーゼ;アスパルチルグルコサミニダーゼ;β−マンノシダーゼ;酸性セラミダーゼ(Acid Ceremidase);α−フコシダーゼ;β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ活性化タンパク質;ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトセラミダーゼ(Galactoceramidase);リソソーム酸リパーゼ(LAL);α−イズロニダーゼ;イズロン酸−2−スルファターゼ;グルコサミン−N−スルファターゼ、ヘパランスルファスルファミダーゼ(Heparansulfatsulfamidase)(SGSH);α−N−アセチル−グルコサミニダーゼ(NAGLU);α−グルコサミニド−N−アセチルトランスフェラーゼ;N−アセチルガラクトサミン−6−スルファターゼ;β−ガラクトシダーゼ;N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ;β−グルコロニダーゼ(β-Glucoronidase);ノイラミニダーゼ;スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ;酸性α−1,4−グルコシダーゼ;β−ヘキソサミニダーゼ、またはそのαサブユニット;α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGA)、α−ガラクトサミニダーゼ;β−ヘキソサミニダーゼA;ガラクトース−6−硫酸スルファターゼ;ヒアルロニダーゼ;
から選択されるいずれか1つである、請求項7または8に記載のリソソームタンパク質組成物。 - 該リソソームタンパク質が式1:
[式中、
四角はN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を表し、
丸はマンノース(Man)を表し、および
T付きの丸は末端マンノースを表す]
の構造を含む小マンノシド型(paucimannosidic)N−グリカンを1または複数有し、
1または複数の該GlcNAcまたはManサブユニットがα1,3−フコシル化、α1,6−フコシル化および/またはβ1,2−キシロシル化されていても良く、
好ましくは該組成物のリソソームタンパク質のN−グリカンの少なくとも10%(モル%)が式1の構造を含むかまたは該構造からなる、
請求項7〜9のいずれか1項に記載のリソソームタンパク質組成物。 - 該グリコシル化パターンは式GlcNAc2−Hex2−メチル−HexのN−グリカンを少なくとも1%有し;および/または
該グリコシル化パターンは下記のN−グリカンを含み:
0%〜35%、好ましくは1%〜30%、−GlcNAc2−(Man2メチル−Hex);
30%〜80%、好ましくは40%〜70%、−GlcNAc2−Man3;
0%〜30%、好ましくは4%〜22%、−GlcNAc2−Man3−GlcNAc;
0%〜15%、好ましくは2%〜12%、−GlcNAc2−Man3−GlcNAc2;
0%〜5%、好ましくは0%〜3%、−GlcNAc2−Man3−Hex2;
0%〜11%、好ましくは1%〜8%、−GlcNAc2−Man3−Hex3;
0%〜10%、好ましくは1%〜7%、−GlcNAc2−Man3−Hex4;
0%〜10%、好ましくは1%〜7%、−GlcNAc2−Man3−Hex5;
ここで、これらの化合物の全ては合わせて合計100%であるか、または100%未満であり;
式中、GlcNAcはN−アセチルグルコサミンサブユニットであり、Manはマンノースサブユニットであり、Hexは六炭糖サブユニットであり、メチル−Hexはメチル化六炭糖サブユニット(好ましくは2−Oメチル六炭糖)であり;
ただし−GlcNAc2−(Man2メチル−Hex)と−GlcNAc2−Man3は合わせて少なくとも45%であり(全ての%はモル%である)、
特に好ましくは、上記N−グリカンのいずれか1つにおいてHexはManであり;
該グリカンの還元末端の該GlcNAcは、上記N−グリカンのいずれか1つにおいて、フコシル化されていてもよく、またはフコシル化されていなくても良く;
分岐点のManは、上記N−グリカンのいずれか1つにおいて、キシロシル化されているか、またはキシロシル化されていない、
請求項10に記載のリソソームタンパク質組成物。 - 非リン酸化リソソームタンパク質を含む、請求項7〜11のいずれか1項に記載のリソソームタンパク質組成物。
- 請求項1に定義される(好ましくは請求項2〜6のいずれか1つにさらに定義される)リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法を実施するのに適したコケ植物細胞またはコケ植物植物体。
- 複合型N−グリカンを含むリソソームタンパク質をプロセシングするためのインビトロの方法であって、該方法は、請求項7〜12のいずれか1項に記載のリソソームタンパク質を試料中に提供し、該試料をコケ植物HEXO(好ましくはHEXO3)酵素と接触させ、これにより該コケ植物HEXO酵素は末端GlcNAc残基を該リソソームタンパク質から切断して、小マンノシド型(paucimannosidic)N−グリカンが生産されることを含む、該方法。
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