BR112017015348B1

BR112017015348B1 - Composição de proteína lisossomal, seu método para produção e seu uso, método in vitro para processamento da referida proteína lisossomal

Info

Publication number: BR112017015348B1
Application number: BR112017015348-3A
Authority: BR
Inventors: Paulina DABROWSKA-SCHLEPP; Fode BENJAMIN; Andreas Busch; Holger Niederkruger; Andreas Shaaf
Original assignee: eleva GmbH
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2024-01-30
Also published as: EP3271453B1; PL3271453T3; JP6936150B2; AU2016232149B2; CN107429257A; BR112017015348A2; SI3271453T1; US11401563B2; US20220380791A1; KR20170124549A; MX2017011510A; AU2016232149A1; US20180016648A1; EP3271453A1; CN107429257B; IL253297A; JP2018509906A; HUE056850T2; CA2974050A1; ES2899783T3

Abstract

composição de proteína lisossomal,seu método de produção e seu uso, e método in vitropara processamento da referida proteínalisossomal .a presente invenção refere-se a uma composição deproteína lisossomal que compreende um grande número de proteínaslisossomais que são potencialmente glicosiladas de forma diversa deacordo com um padrão de glicosilação, em que o dito padrão deglicosilação possui pelo menos 45% de n-glicanas paucimanosídicas;um processo de produção de composição de proteína lisossomal emuma planta ou uma célula de briófita e usos medicinais e não medicinaisda composição de proteína lisossomal. por exemplo, a proteínalisossomal pode ser a-galactosidase para o tratamento de doença defabry ou ß-glucoceramidase para o tratamento de doença de gaucher.a glicosilação única resulta em eficácia terapêutica aprimorada surpreendentemente mesmo sem manose-6-fosfato que é comum paraas proteínas lisossomais produzidas pelas células cho.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao campo da expressão recombinante de proteínas em plantas para a obtenção de uma glicosilação modificada quando comparadas aos sistemas de expressão de mamífero.

ANTECEDENTE

[002] As doenças de armazenamento lisossomal (LSDs) são um grupo de doenças hereditárias que ameaçam a vida; a maioria delas é causada pela deficiência de uma única enzima ou proteína lisossomal, que leva ao acúmulo anormal de substrato nas células. Atualmente, a terapia de reposição enzimática (TRE) é o único tratamento específico disponível para várias LSDs. Nestas doenças, o armazenamento lisossomal pode ser eliminado em muitos tecidos alvos através de infusão intravenosa da enzima que está faltando. Tradicionalmente, as enzimas recombinantes utilizadas na ERT são produzidas em células de mamífero em cultura. Por exemplo, a US 6.083.725 descreve uma α- galactosidase de células humanas. Recentemente, como uma abordagem alternativa, sistemas de expressão à base de plantas têm sido utilizados para produzir enzimas lisossomais para uso terapêutico (Shaaltiel e outros (2007) Plant Biotechnol J 5:579-590; Du e outros (2008) J Lipid Res 49:1646-1657; De Marchis e outros (2011) Plant Biotechnol J 9:1061-1073; He e outros (2012) Nat Commun 3:1062). Em relação aos sistemas à base de células de mamífero, sistemas à base de plantas possuem várias vantagens incluindo custos de produção menores, risco eliminado de contaminação por agentes patogênicos de mamíferos e, no caso de musgo, uma manipulação relativamente mais fácil da via de N-glicosilação. Entretanto, uma preocupação importante em relação às enzimas produzidas por células vegetais para ERT é suas estruturas de N-glicana que diferem das enzimas produzidas com células de mamíferos. Particularmente, as enzimas lisossomais expressas nas células vegetais tipicamente não adquirem modificação na manose 6-fosfato (M6P) nos resíduos de manose terminais sem fosforilação artificial adicional. As cadeias de açúcar exercem uma função fundamental na TER. As enzimas lisossomais administradas de forma intravenosa são captadas por tecidos através de receptores de superfície celular que reconhecem a estrutura de carboidrato das enzimas. O receptor de M6P (M6PR) e o receptor de manose (MR) representam dois contribuintes importantes para este sistema de captação.

[003] A maioria das enzimas lisossomais carrega resíduos de M6P. Acredita-se geralmente que na TRE para a maioria das LSDs a via endocítica mediada por M6PR seja crucial para fornecimento de enzima suficiente (Sly e outros (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15172-15177; Sands e outros (2001) J Biol Chem 276:4316043165). MR - ao contrário - está presente em macrófagos e acredita-se que facilite apenas o efeito terapêutico de TRE direcionada para a substituição de enzima nestas células.

[004] A WO 02/08404 e a WO 2012/098537 descrevem a produção de várias enzimas lisossomais no tabaco.

[005] A WO 03/073839 descreve a produção de enzimas lisossomais em sementes de plantas, especialmente em sementes de plantas de tabaco.

[006] A US 7.011.831 descreve a produção de enzimas lisossomais com glicosilação de N-glicana complexa em células de insetos.

[007] A WO 2008/132743 descreve a produção de enzimas lisossomais glicosiladas com alto teor de manose no tabaco utilizando uma construção de expressão com peptídeo sinal do RE e um sinal de direcionamento vacuolar.

[008] A EP 2 789 686 A1 descreve a modificação de vias de glicosilação em plantas para produzir glicanas fosforiladas do tipo de mamífero.

[009] A US 2006/040353 descreve a transferência da beta galactose para as glicanas ligadas a N. As glicoproteínas com manose- 6-fosfato são sugeridas para o tratamento de doenças lisossomais.

[0010] Chiba e outros produziram α-gal A humana partindo da levedura S. cerevisiae (Chiba e outros (2002) Glycobiology 12:821-828). Em tal caso, a M6P é coberta pela manose terminal e a remoção de resíduos de manose pela α-manosidase bacteriana leva à captação aprimorada dependente de M6PR da enzima em fibroblastos em cultura. Recentemente, α-gal A foi expressa em outra cepa de levedura que sofreu manipulação gênica, que superexpressa MNN4, um regulador positivo da manosilfosfato transferase (Tsukimura e outros (2012) Mol Med 18:76-82). O teor de N-glicana fosforilada nesta preparação de α- gal A era maior que aquele na agalsidase alfa (28,7% vs. 15,3%). A injeção repetida desta enzima em camundongos com Fabry resultou no decréscimo similar de Gb3 no coração e nos rins aquele nos camundongos que receberam injeção de agalsidase alfa. Mais recentemente, Kizhner e outros relataram a purificação e a caracterização de α-gal A humana produzida partindo da cultura de células de tabaco (Kizhner e outros (2015) Mol Genet Metab 114(2): 259-267). Assim como outras enzimas lisossomais produzidas por plantas, esta aGal é não fosforilada. Entretanto, esta proteína é reticulada quimicamente e PEGuilada. Estas modificações estão associadas com alterações significativas nas características das proteínas incluindo maior estabilidade in vitro e meia-vida de circulação bastante prolongada (~10 h) quando comparada com agalsidase alfa ou beta. O mecanismo de captação desta enzima ainda precisa ser elucidado. Entretanto, a eliminação do plasma notavelmente lenta sugere que a captação não ocorre através de endocitose mediada por M6PR ou MR.

[0011] A US 6.887.696 descreve um método para a expressão de duas proteínas lisossomais, isto é, alfa-glucocerebrosidase e alfa- galactosidase, em plantas de tabaco, uma planta superior. As proteínas lisossomais produzidas pelo tabaco tinham um padrão de glicosilação distinto, que possui grandes quantidades de N-glicanas complexas, especialmente GnMXF, MGnXF, GnGnXF, GnMx e MGnX.

[0012] O objetivo da invenção é fornecer uma fonte alternativa para a produção de proteínas lisossomais, que são ativas como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças de armazenamento lisossomal que requer uma glicosilação adequada.

Sumário da invenção

[0013] Este objetivo da presente invenção é resolvido pela presente invenção, que se baseia nas descobertas surpreendentes de que i) glicosilações paucimanosídicas nas proteínas lisossomais bestow adequabilidade para opções de tratamento e ii) que tais glicosilações paucimanosídicas podem ser facilmente obtidas em sistemas de expressão de briófitas.

[0014] A presente invenção fornece um método de produção de uma composição de proteína lisossomal que compreende a expressão de um transgene que codifica uma proteína lisossomal em uma planta ou uma célula de briófita, em que a dita proteína lisossomal é expressa com um sinal de secreção N-terminal, em que o dito sinal de secreção é opcionalmente removido durante o processamento intracelular, especialmente em que a proteína lisossomal não possui um sinal vacuolar C-terminal com a sequência VDTM (SEQ ID NO: 1) e o dito método compreende ainda a obtenção de uma proteína lisossomal expressa da dita planta ou célula. A invenção fornece ainda uma composição de proteína lisossomal que pode ser obtida através do método da invenção.

[0015] A invenção fornece ainda uma composição de proteína lisossomal que compreende um grande número de proteínas lisossomais que são potencialmente glicosiladas de forma diversa de acordo com um padrão de glicosilação, em que o dito padrão de glicosilação possui pelo menos 45 % de N-glicanas paucimanosídicas (% molar). Tal composição de proteína pode ser obtida através do método da invenção.

[0016] Também é fornecido um método de processamento de uma proteína lisossomal que compreende uma N-glicana complexa, o dito método compreendendo o fornecimento da proteína lisossomal em uma amostra e o contato da amostra com uma enzima HEXO de briófita, preferencialmente HEXO3, através do qual a HEXO de briófita enzima cliva os resíduos de GlcNAc terminais da proteína lisossomal produzindo assim uma N-glicana paucimanosídica. A enzima HEXO pode estar em uma célula, especialmente uma célula vegetal. As proteínas lisossomais podem ser fornecidas como um medicamento ou em uma composição farmacêutica.

[0017] A invenção fornece ainda uma célula ou uma planta briófita adequada para a realização do método da invenção que compreende o dito transgene que codifica uma proteína lisossomal.

[0018] A invenção refere-se ainda a um método de tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal que compreende a administração de uma composição de proteína lisossomal de acordo com a invenção a um paciente que necessita do tratamento.

[0019] Todos estes aspectos são inter-relacionados, igualmente fazem parte da invenção inteira apresentada aqui e modalidades preferidas da invenção em qualquer combinação podem ser referir a qualquer um destes aspectos, por exemplo, plantas ou células transformadas por certa construção ou método podem ser fornecidas ou utilizadas na produção de qualquer proteína lisossomal que será glicosilada de acordo com a invenção. A descrição detalhada a seguir sobre qualquer modalidade ou característica preferida refere-se a todos os aspectos igualmente. Por exemplo, uma característica do produto da proteína lisossomal significa que o método é selecionado para produzir esta proteína lisossomal com sua característica de produto. Uma descrição de etapas particulares do método é igualmente descritiva da proteína modificada por tal etapa do método. A célula da invenção é transformada para facilitar qualquer método da invenção de produção na célula. Todas as proteínas lisossomais podem ser utilizadas nos métodos da invenção de utilização (terapeuticamente ou não terapeuticamente) da proteína lisossomal. A presente invenção é adicionalmente definida nas reivindicações.

Descrição detalhada da invenção

[0020] As doenças de armazenamento lisossomal (LSD) são um grupo de aproximadamente 50 transtornos metabólicos hereditários raros que resultam de defeitos na função lisossomal. Os lisossomos são responsáveis pela digestão de várias moléculas que envolvem inúmeras enzimas críticas. Se uma destas enzimas for defeituosa, devido a uma mutação, as moléculas grandes se acumulam dentro da célula, eventualmente matando a mesma. Os transtornos de armazenamento lisossomal são causados por disfunção lisossomal geralmente como uma consequência da deficiência de uma única enzima necessária para o metabolismo de lipídeos, glicoproteínas ou mucopolissacarídeos.

[0021] O tratamento de doenças de armazenamento lisossomal é principalmente sintomático, com a terapia de reposição enzimática sendo mais comum. A TRE requer a administração de proteínas lisossomais ativas dentro das células através de uma rota de captação.

[0022] Tradicionalmente, as enzimas recombinantes utilizadas na TRE são produzidas nas células de mamífero em cultura. Recentemente, como uma abordagem alternativa, sistemas de expressão à base de plantas têm sido utilizados para produzir enzimas lisossomais para uso terapêutico. Em relação aos sistemas à base de células de mamífero, os sistemas à base de plantas possuem várias vantagens incluindo custos de produção menores, risco eliminado de contaminação por agentes patogênicos de mamíferos e, no caso do musgo, uma manipulação relativamente mais fácil da via de N- glicosilação. Entretanto, uma preocupação importante quando se considera a utilização de enzimas produzidas por células vegetais para TRE é suas estruturas de N-glicana que diferem das enzimas produzidas por células de mamíferos. Particularmente, as enzimas lisossomais expressas nas células vegetais tipicamente não adquirem modificação de manose 6-fosfato (M6P) nos resíduos de manose terminais.

[0023] A presente invenção fornece um novo método de produção de proteínas lisossomais transgênicas em células vegetais, especialmente em células de briófitas, que surpreendentemente levam à formação de glicoproteínas com um alto grau de glicosilação paucimanosídica, isto é, uma glicosilação que termina com poucos, por exemplo, 2 resíduos de manose, em uma estrutura de -Man<(Man)2 ramificada. Foi provado que estas estruturas são altamente eficientes para a captação, especialmente nas células afetadas pela doença de armazenamento lisossomal. Esta glicosilação alterada não é natural para as proteínas lisossomais e ainda surpreendentemente as proteínas alteradas são proteínas terapêuticas ainda bastante eficientes.

[0024] A proteína lisossomal utilizada no método da invenção é um transgene, por exemplo, de origem de mamífero, para uso na TRE em tal mamífero de origem. Estas proteínas lisossomais transgênicas produzidas em briófitas podem ser utilizadas como proteínas terapêuticas para o tratamento de doenças de armazenamento lisossomal. Dessa maneira, as proteínas lisossomais são enzimas ativas quando administradas, em particular ativas em condições que ocorrem em um lisossomo, tal como um pH de aproximadamente 5. Evidentemente são possíveis formas de armazenamento inativas, por exemplo, quando liofilizadas. A glicosilação paucimanosídica da invenção não interfere substancialmente com a atividade enzimática, mas medeia a captação e a estabilidade das proteínas lisossomais. Surpreendentemente, as N-glicanas da invenção sobre as proteínas lisossomais levam à alta eficácia que permite um uso terapêutico das mesmas especialmente no tratamento de doenças de armazenamento lisossomal.

[0025] A presente invenção pode se basear em métodos conhecidos para introdução de transgenes em briófitas. Foram desenvolvidos sistemas de transformação adequados para a exploração biotecnológica de briófitas para a produção de proteínas heterólogas. Por exemplo, transformações bem sucedidas foram realizadas através da transferência direta do DNA para dentro de um tecido de protonema utilizando pistolas de partículas. A transferência de DNA mediada por PEG para dentro de protoplastos de musgo também foi conseguida de forma bem sucedida. O método de transformação mediada por PEG foi descrito muitas vezes para Physcomitrella patens e leva tanto a transformantes transitórios quanto estáveis (K. Reutter e R. Reski, Pl. Tissue culture and Biotech., 2, 142-147 (1996)). Além disso, a transformação sem marcador também pode ser conseguida através do método de transformação mediada por PEG com briófitas (Stemmer C, Koch A e Gorr G (2004), Moss 2004, The 7th Annual Moss International Conference, Freiburg, Alemanha) e pode ser utilizada para a introdução subsequente de várias sequências de nucleotídeos.

[0026] Informação detalhada sobre a cultura de briófitas que são adequadas para uso na invenção, tais como Leptobryum piriforme e Sphagnum magellanicum em biorreatores, é conhecida na arte anterior (E. Wilbert, "Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism", Ph.D. thesis, University of Mainz (1991); H. Rudolph e S. Rasmussen, Crypt. Bot., 3, 67-73 (1992)). É especialmente preferencialmente para as finalidades da presente invenção o uso de Physcomitrella patens, uma vez que técnicas de biologia molecular são praticadas com este organismo (R. Reski Bot. Acta, 111, pp. 1-15 (1998)). Para o cultivo de briófitas podem ser utilizados meios com (Baur e outros (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340) ou sem suplementos como elementos traços (Weise e outros (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, 337-345).

[0027] O método da invenção de produção de uma composição de proteína lisossomal compreende preferencialmente a expressão de um transgene que codifica uma proteína lisossomal em uma planta ou uma célula de briófita, em que a dita proteína lisossomal é expressa com um sinal de secreção N-terminal e a proteína lisossomal não possui um sinal vacuolar C-terminal com a sequência VDTM (SEQ ID NO: 1). Isto evitaria o direcionamento vacuolar, que levaria ao armazenamento da proteína lisossomal no vacúolo (o contrário da excreção) e potencialmente ao processamento de glicol diferente no vacúolo, em que até mesmo glicoformas paucimanosídicas ainda são possíveis até alguma extensão. No golgi, sem direcionamento para os vacúolos, com base na interação de proteína recombinante específica para briófita, uma via de glicosilação diferente levou surpreendentemente a altas quantidades de glicosilação paucimanosídica independentemente do processamento nos vacúolos. Isto é muito surpreendente uma vez que no tabaco a via não vacuolar secretora levou à formação predominantemente de N-glicanas complexas ao invés da glicosilação paucimanosídica (US6887696). Aparentemente, as briófitas possuem um reconhecimento único de proteínas lisossomais que leva a esta modificação.

[0028] A SEQ ID NO: 1 é um sinal de direcionamento vacuolar de planta C-terminal que leva ao direcionamento eficiente para o vacúolo. Em algumas modalidades, outros sinais de direcionamento para o vacúolo podem estar presentes, especialmente sinais não vegetais, que levam ao direcionamento para o vacúolo menos eficiente e alguma expressão para baixo da via secretora evitando o vacúolo. Entretanto, na maioria das modalidades preferidas, nenhum sinal de direcionamento para o vacúolo está presente durante a expressão ou mesmo no produto final obtido. Os sinais vacuolares também podem ser removidos artificialmente após a obtenção da proteína partindo das células.

[0029] As N-glicanas paucimanosídicas se baseiam no corte de N- glicanas complexas. No golgi, a GlcNAc terminal é removida das glicanas complexas deixando uma manose terminal, no caso do sistema de briófita, isto é muito eficiente deixando uma manose terminal em ambas as ramificações da N-glicana (anteriormente complexa).

[0030] De acordo com a invenção, uma sequência sinal secretora é utilizada, geralmente no terminal N da sequência de aminoácidos. O sinal de secreção N-terminal também é referido como um peptídeo de trânsito ou uma sequência sinal do RE. Faz parte da sequência de aminoácidos codificada e expressa. O sinal de secreção leva a uma expressão diretamente dentro do RE de uma célula, ajustando as vias para secreção (ou para designação vacuolar se um sinal vascular estiver presente). O sinal de secreção é geralmente removido intrinsecamente da sequência de aminoácidos da proteína durante a expressão. Isto é um processo natural em uma célula vegetal. Para permitir a localização apropriada do produto de expressão dos transgenes, os genes para as proteínas lisossomais podem ser modificados para permitir a localização na célula vegetal. Preferencialmente sequências de ácido nucleico híbridas são utilizadas nas construções para a transformação das plantas ou das células vegetais. Os domínios relevantes para a localização, por exemplo, das enzimas de mamífero são substituídos por sequências de plantas para atingir a localização correta e o trânsito celular tal como no RE e/ou no Golgi na planta. Um exemplo de um sinal de secreção de planta é a SEQ ID NO: 5, mas qualquer outro sinal de secreção de planta pode ser utilizado. Este pode ser uma sequência endógena que será utilizada em espécies de briófita ou pode ser uma sequência de planta estranha, preferencialmente ainda uma sequência de briófita.

[0031] O método da invenção inclui a expressão da proteína lisossomal sem um sinal vacuolar de planta (briófita), que possui a sequência VDTM (SEQ ID NO: 1). Isto leva a uma via de expressão do RE para o Golgi e eventualmente à secreção, evitando a localização final em um vacúolo. Nas briófitas, a secreção pode ocorrer diretamente dentro do meio de cultura. Em outras plantas esta pode ocorrer em um compartimento apoplástico da célula vegetal. Surpreendentemente, mesmo sem colocação no vacúolo, um alto grau de glicosilação paucomanosídica poderia ser atingido através do método da invenção.

[0032] Como uma etapa final, é então obtida a proteína lisossomal expressa da dita planta ou célula. Para esta finalidade, a proteína lisossomal pode ser coletada partindo de um processo de extração das células, que pode ser com rompimento ou sem rompimento. Preferencialmente, a proteína lisossomal expressa é obtida da matéria secretada da planta ou da célula, por exemplo, do meio de cultura, preferencialmente sem romper as células ou a planta produtora. A proteína lisossomal obtida pode então ser purificada, por exemplo, a uma concentração de pelo menos 80% (m/v), preferencialmente pelo menos 90% (m/v), especialmente preferida de pelo menos 95% (m/v) ou pelo menos 98% (m/v) ou pelo menos 99% (m/v).

[0033] Preferencialmente a planta ou a célula de briófita é um musgo, preferencialmente uma planta ou uma célula de P. patens. A briófita pode ser qualquer briófita, mas é preferencialmente selecionada de musgo, hepática ou Anthocerotophyta, especialmente preferida da classe bryopsida ou dos gêneros Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantia e Sphaerocarpos. Physcomitrella patens é um sistema particularmente preferido uma vez que possui uma taxa alta de recombinação homóloga.

[0034] O assunto de objetivo da invenção são plantas e células vegetais. "Célula vegetal" como utilizado aqui pode se referir a uma célula isolada, uma célula individualizada, mas também uma célula dentro ou de um tecido vegetal, preferencialmente um tecido selecionado de calo, protonema, floema, xilema, mesófilo, tronco, folhas, talo, cloronema, caulonema, rizoide ou gametóforo ou uma célula em um organismo vegetal. A célula pode ser uma célula de protoplasto. Em modalidades preferidas, células vegetais isoladas ou até mesmo tecidos vegetais são transformados de acordo com a invenção e então crescidos em plantas ou tecidos vegetais ou permanecem culturas de células vegetais, tal como uma cultura em suspensão, por exemplo, um biorreator (Hohe & Reski, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81, 2005: 307-311).

[0035] Preferencialmente a proteína lisossomal adicionalmente não possui um sinal de retenção no RE C-terminal com a sequência KDEL (SEQ ID NO: 2). Os sinais de retenção no RE levam a uma retenção no RE ou no sistema de Golgi. Isto pode ter um impacto profundo sobre o padrão de glicosilação observado na proteína expressa uma vez que a glicosilação é um processo competitivo com várias enzimas de enzimas de glicosilação competindo pelas proteínas do substrato que serão modificadas. Embora possa se esperar que o corte paucimanosídico se beneficiasse da retenção no RE, surpreendentemente as proteínas lisossomais da invenção foram expressas com altas quantidades de N- glicanas paucimanosídicas sem este (ou qualquer) sinal de retenção no RE.

[0036] A SEQ ID NO: 2 é um sinal de retenção no RE C-terminal que leva à retenção eficiente no RE ou no Golgi. Ainda, é preferido que o motivo de dilisina C-terminal (KXKX), também responsável pela retenção no RE até alguma extensão, também esteja ausente. Em algumas modalidades, outros sinais de retenção no RE podem estar presentes, especialmente sinais que não são vegetais, levando à retenção menos eficiente no RE/Golgi e ao processamento mais rápido do compartimento em direção à secreção. Entretanto, na maioria das modalidades preferidas, nenhum sinal de retenção no RE está presente durante a expressão ou até mesmo no produto final obtido. Os sinais de retenção no RE também podem ser removidos artificialmente após a obtenção da proteína partindo das células.

[0037] Especialmente preferencialmente, para qualquer modalidade da presente invenção, que a proteína lisossomal não possua uma sequência sinal de retenção no RE C-terminal de planta e uma sequência sinal vacuolar C-terminal de planta, especialmente preferidas, que não possua qualquer sequência sinal de retenção no RE C-terminal e qualquer sequência sinal vacuolar C-terminal. Os sinais de plantas são de origem vegetal e são encontrados em plantas, especialmente briófitas. Estes são funcionais em briófitas. Como explicado anteriormente, a retenção no RE não é necessária e mesmo o processamento vacuolar não é requerido para a alta glicosilação paucimanosídica nos sistemas de expressão em briófitas da invenção.

[0038] Preferencialmente a proteína lisossomal compreende uma sequência de aminoácidos expressa que termina no terminal C com os aminoácidos de uma proteína lisossomal nativa ou um truncamento da mesma. Isto significa que nenhuma adição à sequência da proteína está presente. Os truncamentos são possíveis, mesmo se não preferidos. Evidentemente os truncamentos não afetam substancialmente a atividade da proteína lisossomal da invenção, que é ainda uma exigência que é explicada anteriormente. A atividade enzimática pode ser reduzida, por exemplo, em até 20% quando comparada com a proteína lisossomal nativa nas condições lisossomais em uma célula de mamífero, especialmente humana tal como em um pH de 5. Os truncamentos podem ser uma deleção de no máximo 50, preferencialmente no máximo 40, no máximo 30, no máximo 20, no máximo 10, no máximo 5 ou uma ou qualquer faixa entre estes valores (por exemplo, 1 até 10 etc.) de aminoácidos C-terminais da proteína lisossomal nativa. As alfa-galactosidases truncadas são conhecidas como sendo ativas com truncamentos tais como, por exemplo, os descritos na US 6.887.696 B2 (incorporada aqui como referência).

[0039] Preferencialmente a planta ou a célula de briófita compreende ou não um transgene de HEXO3. HEXO3 é uma enzima que é encontrada naturalmente nas plantas. Esta pode ser fornecida (ou não) na forma de um transgene para aumentar ainda mais a atividade de HEXO3. Introduções de transgenes podem ser facilitadas pelos mesmos métodos através dos quais o transgene da proteína lisossomal é incorporado na planta ou na célula, por exemplo, através de hibridização genômica recombinante ou introdução de plasmídeo. É dito que a HEXO3 é responsável por parte da glicosilação pauimanosídica na membrana plasmática que reveste o apoplasto de plantas (Liebminger e outros, J Biol Chem 2011, 286: 10793-10802; Bosch e outros, Curr Pharm Des. 2013;19(31):5503-12), entretanto a atividade de HEXO observada por Liebminger em Arabidopsis thaliana não pode explicar a alta glicosilação paucimanosídica encontradas nas briófitas. A enzima HEXO1 relacionada é responsável por parte da glicosilação paucimanosídica vacuolar e HEXO2 parece ter pouca atividade em Arabidopsis. Pode haver maior atividade ou melhor acessibilidade em briófitas.

[0040] Aparentemente a HEXO de briófita é particularmente altamente ativa sobre as proteínas lisossomais. Portanto, a presente invenção fornece um método de processamento in vitro de uma proteína lisossomal que compreende uma N-glicana complexa, o dito método compreendendo o fornecimento da proteína lisossomal em uma amostra e o contato da amostra com uma HEXO de briófita, preferencialmente a enzima HEXO3, em que a enzima HEXO de briófita cliva resíduos de GlcNAc terminais da proteína lisossomal produzindo assim uma N-glicana paucimanosídica. Essencialmente, a via de glicosilação da proteína lisossomal nativa encontrada nas briófitas também pode ser realizada fora de uma célula de briófita, especialmente in vitro com enzimas HEXO isoladas ou em outra célula, preferencialmente célula vegetal através da substituição em tal planta com uma enzima HEXO ativa de uma briófita, especialmente um musgo tal como P. patens. Esta planta pode não ser uma briófita, por exemplo, uma planta superior ou uma briófita para aumentar a carga gênica de um gene HEXO, preferencialmente de HEXO3 como é detalhado anteriormente.

[0041] Preferencialmente a planta ou a célula de briófita suprimiu ou eliminou a alfa1,3-fucosiltransferase e/ou a beta1,2-xilosiltransferase. Tais enzimas vegetais podem ter a atividade ou a concentração reduzida, pelo menos no local de sua atividade natural tal como no Golgi. As enzimas que são preferencialmente removidas são a alfa-1,3- fucosiltransferase e/ou a beta-1,2-xilosiltransferase que são descritas na WO 2004/057002. Assim, de acordo com a modalidade preferida, a dita célula vegetal possui ainda uma atividade reduzida, preferencialmente uma perda de função completa, da alfa-1,3- fucosiltransferase e/ou da beta-1,2-xilosiltransferase, em particular através do nocaute, especialmente preferencialmente através da interrupção do gene que codifica a alfa-1,3-fucosiltransferase e/ou a beta-1,2-xilosiltransferase da dita planta, preferencialmente através de um gene de qualquer uma das proteínas expressas de forma recombinante. Esta medida previne a formação de glicosilações do tipo vegetal que podem ser imunogênicas em um mamífero tal como um ser humano.

[0042] Também é fornecida uma célula ou uma planta briófita adequada para a realização deste método. A célula ou a planta compreende um transgene que codifica uma proteína lisossomal que é descrita para o método paratively e opcionalmente qualquer modificação ou transgene adicional que é descrito anteriormente.

[0043] A presente invenção fornece ainda uma composição de proteína lisossomal que pode ser obtida através de qualquer método de produção descrito aqui. A proteína lisossomal pode ter quaisquer características que são produzidas através de um método ou um variante ou uma modalidade preferida que é descrita anteriormente. A proteína lisossomal é geralmente obtida em um grande número de tais proteínas lisossomais, com o padrão de glicosilação lisossomal da invenção observado nas briófitas para proteínas lisossomais (transgênicas).

[0044] Especialmente, a invenção fornece uma composição de proteína lisossomal que compreende um grande número de proteínas lisossomais que são potencialmente glicosiladas de forma diversa de acordo com um padrão de glicosilação, em que o dito padrão de glicosilação possui pelo menos 45 %, preferencialmente pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65% ou pelo menos 70%, de N-glicanas paucimanosídicas.

[0045] Todos os valores em porcentagem fornecidos aqui são porcentagens molares, exceto quando indicado o contrário.

[0046] Um grande número refere-se à preparação das proteínas da invenção que compreendem, isto é, proteínas não individualizadas, mas uma preparação macroscópica de tais proteínas que são obtidas partindo das células ou das plantas, que compreende mais de uma proteína lisossomal quando expressa. A preparação pode ter pelo menos 1000 moléculas de proteína, especialmente preferencialmente pelo menos 100000 moléculas ou pelo menos 1 milhão de moléculas.

[0047] Preferencialmente a proteína lisossomal da composição ou produzida ou utilizada pelos ou nos métodos da invenção é qualquer uma selecionada de α-Galactosidase, preferencialmente α- Galactosidase A (GLA); β-Glucoceramidase, β-glucosidase (glucocerebrosidase); α-Manosidase; Aspartilglucosaminidase; β- Manosidase; Ceremidase Ácida; α-Fucosidase; β-Galactosidase, proteína ativadora da β-Hexosaminidase; Galactocerebrosidase, Galactoceramidase; lipase ácida lisossomal (LAL); α-Iduronidase; Iduronato-2-sulfatase; Glucosamina-N-sulfatase,Heparansulfatsulfamidase (SGSH); α-N-acetil-glucosaminidase (NAGLU); (Heparan)α-glucosaminida-N-acetiltransferase; N- Acetigalactosamina-6-sulfatase; β-Galactosidase; N-Acetigalactosamina-4-sulfatase; β-Glucoronidase; Neuraminidase; Esfingomielinase, Esfingomielina fosfodiesterase; Alfa-1,4-glucosidase ácida; β-Hexosaminidase ou sua subunidade α; Alfa-N- acetilgalactosaminidase (NAGA), α-Galactosaminidase; β-Hexosaminidase A; Galactose-6-sulfato sulfatase; Hialuronidase. É especialmente preferida em todas as modalidades da invenção a α- Galactosidase. Uma α-Galactosidase preferida é a α-Galactosidase humana, por exemplo, da SEQ ID NO: 3, que pode ser expressa partindo da sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou uma α- Galactosidase truncada partido da mesma. Também é preferida a glucocerebrosidase, por exemplo, glucocerebrosidase humana, por exemplo, da SEQ ID NO: 6, que pode ser expressa partindo da sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 7. Também é preferida a alfa-glucosidase, por exemplo, alfa-glucosidase humana, por exemplo, da SEQ ID NO: 8, que pode ser expressa partindo da sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 9. Em outras modalidades, a glucocerebrosidase e a alfa-glucosidase são excluídas do grupo de proteínas lisossomais de acordo com a invenção.

[0048] Preferencialmente as proteínas lisossomais possuem uma ou mais N-glicanas paucimanosídicas que compreendem a estrutura da fórmula 1:em que um quadrado representa N-Acetilglucosamina (GlcNAc), um círculo representa manose (Man) e um círculo com um T representa uma manose terminal. Esta fórmula 1, também referida aqui como "MM" glicana, representa uma estrutura central que pode ser adicionalmente modificada - em N-glicanas paucimanosídicas esta modificação adicional também é possível contanto que as T-manoses permaneçam terminais, isto é, fiquem nas extremidades não redutoras das cadeias de açúcar. As manoses terminais podem ser metiladas, especialmente O-metiladas. Modificações comuns ocorrem onde uma ou mais das subunidades de GlcNAc ou Man podem ser α1,3- fucosiladas, α1,6-fucosiladas e/ou β1,2-xilosiladas. a1,3-fucosilações e a1,6-fucosilações são comumente encontradas na GlcNAc redutora. Uma ei,2-xilosilação é geralmente encontrada na manose não terminal (círculo sem T na fórmula 1). De acordo com a invenção, preferencialmente uma a1,3-fucosilação e/ou uma ei,2-xilosilação é impedida ou reduzida devido à inibição das respectivas enzimas durante a produção como é mencionado anteriormente. A a1,6-fucosilação pode ou não estar presente. Esta é incomum em plantas, mas pode ser conseguida através da introdução de uma α1,6-fucosiltransferase na célula ou na planta de expressão. Preferencialmente pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %, das N-glicanas das proteínas lisossomais das composições da invenção compreendem ou consistem da estrutura da fórmula 1 (% molar).

[0049] Uma estrutura de N-glicana paucimanosídica da invenção também pode ser representada pela fórmula (2):

[0050] A Fórmula 2 mostra ainda o tipo de conectividade das subunidades de carboidrato. A GlcNAc à direita fica ligada à sequência de aminoácidos da proteína lisossomal. As extremidades redutoras e não redutoras de um oligossacarídeo são convencionalmente desenhadas com o resíduo de monossacarídeo da extremidade redutora mais à direita e a extremidade não redutora mais à esquerda (como, por exemplo, na fórmula 2). Observar que a GlcNAc redutora é mostrada à esquerda nas fórmulas curtas fornecidas aqui, tal como - GlcNAc2-Man3. Em uma N-glicana, a -GlcNAc redutora fica ligada a uma Asparagina na cadeia de aminoácido da proteína lisossomal. Isto é indicado pela "-" à esquerda que é uma ligação com o resíduo de Asn. Nas glicoformas paucimanosídicas, há dois terminais de manose não redutora (à esquerda na fórmula 2, em cima na fórmula 1).

[0051] A Fórmula (2) é o núcleo comum da maioria das N-glicanas, incluindo N-glicanas com alto teor de manose e complexas (ver Rayon e outros, J Exp. Botany, 1998, 49(326): 1463-1472). No caso de estruturas paucimanosídicas, tanto a Man superior quanto a inferior à esquerda que são mostradas na fórmula (2) são terminais, enquanto que nas N-glicanas com alto teor de manose e complexas pelo menos uma Man contém uma ligação adicional com outra Man ou GlcNAc. A a1,3-fucosilação, a a1,6-fucosilação e/ou a ei,2-xilosilação deste núcleo são opcionais. A a1,3-fucosilação e a ei,2-xilosilação são comuns em plantas a não ser que as respectivas enzimas sejam inibidas (por exemplo, como é mostrado na WO 2004/057002 ou em Cox e outros, Nature Biotechnology 24(12), 2006: 1591-7).

[0052] Se as proteínas lisossomais expressas tiverem quantidades de MGn glicanas (uma N-acetilglucosamina terminal adicional em uma Man terminal como é mostrado na fórmula 2) ou GG glicanas (uma N- acetilglucosamina terminal adicional em cada Man terminal como é mostrado na fórmula 2), estas MGn e GG glicanas podem ser convertidas nas estruturas da fórmula 1 ou 2 através do tratamento com beta-N-Acetilglucosaminidase. O tratamento com Beta-N- Acetilglucosaminidase pode ser realizado com qualquer proteína lisossomal produzida por musgo para aumentar as glicanas paucimanosídicas. A α-Galactosidase A expressa por musgo geralmente não precisa de beta-N-Acetilglucosaminidase uma vez que as glicanas paucimanosídicas estão naturalmente em concentrações altas. Dependendo das condições de cultura, a glucocerebrosidase e a alfa-glucosidase produzidas por musgo podem algumas vezes necessitar de tratamento com beta-N-Acetilglucosaminidase. Outros métodos para criar as proteínas lisossomais glicosiladas da invenção incluem a expressão em insetos ou células de insetos, tais como células Sf9, a expressão em células de levedura glico engenheiradas e a expressão no musgo com um sinal de direcionamento vacuolar (embora seja menos preferida uma vez que o sinal pode ser imunogênico em um paciente mamífero). Qualquer descrição apresentada aqui de proteínas lisossomais "produzidas por musgo" ou "produzidas por briófitas" refere- se aos produtos que podem ser obtidos através da produção no musgo, isto é, que possui as N-glicanas paucimanosídicas da invenção em altas quantidades como é descrito aqui, independentemente do método real de produção. Qualquer método de produção pode ser selecionado para a obtenção dos produtos da invenção e "produzidos por musgo" ou "produzidos por briófitas" também se refere a estes produtos nos métodos de produção sem ser com musgo. "Produzido por musgo" ou "produzido por briófitas" é utilizado para expressar o padrão de glicosilação único, que foi encontrado no musgo e é definido aqui particularmente, por exemplo, nas reivindicações do produto e na descrição de tais produtos aqui.

[0053] Uma característica única da N-glicosilação das proteínas lisossomais de briófita de acordo com o método da invenção é a presença de hexoses metiladas (Hex), preferencialmente manose (Man) metilada nas N-glicanas da invenção. Estas manoses metiladas, se terminais, não interferem na captação das proteínas lisossomais da invenção e podem até mesmo aumenta-la. Preferencialmente o padrão de glicosilação da composição da invenção possui pelo menos 1%, mais preferencialmente pelo menos 2%, pelo menos 3% ou pelo menos 4%, de N-glicanas da fórmula GlcNAc2-Hex2-metil-Hex, com Hex sendo preferencialmente manose (% molar). De acordo com o método da invenção, a metilação é geralmente uma metilação de um oxigênio da manose, em particular uma 2-O-metilação. Estas são as metilações preferidas das proteínas lisossomais da invenção da composição. Preferencialmente, pelo menos 1 %, mais preferencialmente pelo menos 2%, pelo menos 3% ou pelo menos 4%, das N-glicanas da composição possuem uma metilação, especialmente uma O-, por exemplo, 2-O-metilação (% molar). Preferencialmente nestas N- glicanas metiladas, apena um das pelo menos duas manoses (não redutoras) terminais é metilada.

[0054] Preferencialmente o padrão de glicosilação compreende as N-glicanas a seguir: i) 0% até 35%, preferencialmente 0,5% até 30% de - GlcNAc2-(Man2metil-Hex); ii) 30% até 80%, preferencialmente 40% até 70%, especialmente preferencialmente 45% até 60% de -GlcNAc2-Man3; iii) 0% até 30%, preferencialmente 4% até 22% de - GlcNAc2-Man3-GlcNAc; iv) 0% até 15%, preferencialmente 2% até 12% de - GlcNAc2-Man3-GlcNAc2; v) 0% até 5%, preferencialmente 0% até 3% de -GlcNAc2- Man3-Hex2; vi) 0% até 11%, preferencialmente 1% até 8% de -GlcNAc2- Man3-Hex3; vii) 0% até 10%, preferencialmente 1% até 7% de - GlcNAc2-Man3-Hex4; viii) 0% até 10%, preferencialmente 1% até 7% de - GlcNAc2-Man3-Hex5; em que todos estes compostos juntos equivalem a 100% ou menos de 100%, o que é evidente (toda % está em % molar). Menos de 100% é possível uma vez que outras N-glicanas, não especificadas na lista anterior, podem estar presentes. Tais outras N-glicanas podem ficar entre 0% e 30%, preferencialmente entre 0,01% e 20%, especialmente preferencialmente entre 0,1% e 10%. Qualquer uma das N-glicanas i) até viii) especificadas pode estar em uma quantidade de pelo menos 0,01% ao invés de 0%. GlcNAc é uma subunidade de N- Acetilglucosamina, Man é uma subunidade de manose, Hex é uma subunidade de hexose, metil-Hex é uma subunidade de hexose metilada, preferencialmente 2-O metil hexose. Neste padrão de glicosilação -GlcNAc2-(Man2metil-Hex) e -GlcNAc2-Man3 juntas equivalem a pelo menos 45% (% molar), isto é, estas são N-glicanas paucimanosídicas que contribuem para esta quantidade que é mencionada no sumário da invenção. Especialmente preferencialmente Hex é Man em qualquer uma das N-glicanas i) até viii) anteriores. A GlcNAc na extremidade redutora da glicana pode ser fucosilada ou não ser fucosilada em qualquer uma das N-glicanas i) até viii) anteriores. Uma Man em um ponto de ramificação é xilosilada ou não xilosiladas em qualquer uma das N-glicanas i) até viii) anteriores.

[0055] Em uma modalidade preferida particular, todas as N-glicanas 1) até viii) listadas anteriormente estão na quantidade preferida que é fornecida no parágrafo anterior.

[0056] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana i), -GlcNAc2-(Man2metil-Hex), em uma quantidade de pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 2% ou pelo menos 3%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 30%, no máximo 25%, no máximo 20% ou no máximo 15%. Sua quantidade pode estar na faixa de 0,5% até 30%, 1% até 25% ou 2% até 20%.

[0057] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana ii), -GlcNAc2-Man3, em uma quantidade de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 80%, no máximo 75%, no máximo 70% ou no máximo 65%.Sua quantidade pode estar na faixa de 30% até 80%, 40% até 70% ou 45% até 60%. Esta é a N-glicana mais importante de acordo com a invenção e pode estar presente nestas quantidades em qualquer modalidade da invenção.

[0058] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana iii), -GlcNAc2-Man3-GlcNAc, em uma quantidade de pelo menos 0,5%, pelo menos 2%, pelo menos 4% ou pelo menos 6%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 30%, no máximo 25%, no máximo 20% ou no máximo 15%. Sua quantidade pode estar na faixa de 0,5% até 30%, 1% até 25% ou 2% até 20%.

[0059] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana iv), -GlcNAc2-Man3-GlcNAc2, em uma quantidade de pelo menos 0,2%, pelo menos 0,5%, pelo menos 1% ou pelo menos 2%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 20%, no máximo 15%, no máximo 12% ou no máximo 10%. Sua quantidade pode estar na faixa de 0,5% até 15%, 1% até 12,5% ou 2% até 10%.

[0060] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana v), -GlcNAc2-Man3-Hex2, em uma quantidade de pelo menos 0,01%, pelo menos 0,05%, pelo menos 0,1% ou pelo menos 0,5%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3% ou no máximo 2%. Sua quantidade pode estar na faixa de 0,1% até 5%, 0,2% até 4% ou 0,5% até 3%.

[0061] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana vi), -GlcNAc2-Man3-Hex3, em uma quantidade de pelo menos 0,1%, pelo menos 0,2%, pelo menos 0,75% ou pelo menos 1%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 11%, no máximo 10%, no máximo 8% ou no máximo 6%.Sua quantidade pode estar na faixa de 0,5% até 11%, 1% até 10% ou 2% até 9%.

[0062] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana vii), -GlcNAc2-Man3-Hex4, em uma quantidade de pelo menos 0,1%, pelo menos 0,2%, pelo menos 0,3% ou pelo menos 0,4%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6,5% ou no máximo 5%. Sua quantidade pode estar na faixa de 0,1% até 10%, 0,2% até 8,5% ou 0,3% até 7%.

[0063] Ainda preferencialmente, o padrão de glicosilação compreende a N-glicana viii), -GlcNAc2-Man3-Hex5, em uma quantidade de pelo menos 0,1%, pelo menos 0,2%, pelo menos 0,3% ou pelo menos 0,4%. Especialmente preferencialmente, está em uma quantidade de no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6,5% ou no máximo 5%. Sua quantidade pode estar na faixa de 0,1% até 10%, 0,2% até 8,5% ou 0,3% até 7%.

[0064] As proteínas lisossomais da invenção podem ter qualquer origem, preferencialmente de um animal mamífero, especialmente humano ou não humano, tal como um roedor, um cachorro, um gato, um equino, um bovino, um camelo, um suíno.

[0065] As glicoproteínas produzidas por plantas, incluindo as proteínas lisossomais produzidas por briófitas da invenção geralmente não são fosforiladas na manose. Ainda de acordo com a invenção, as N-glicanas podem não ser fosforiladas na manose, especialmente não fosforiladas de forma alguma. A fosforilação pode ser feita artificialmente através da introdução de uma enzima de fosforilação na célula de expressão ou através da fosforilação após o isolamento da proteína das células. Assim, a composição de proteína lisossomal de acordo com a invenção compreende proteínas lisossomais não fosforiladas ou fosforiladas. Preferencialmente a quantidade de N- glicanas fosforiladas das proteínas lisossomais da composição é menor que 20%, especialmente preferencialmente menor que 15%, menor que 10%, menor que 5%, menor que 2%, menor que 1% ou ainda menor que 0,5%, por exemplo, 0% (% molar).

[0066] As proteínas lisossomais da invenção podem ser PEGuiladas não PEGuiladas. A PEGuilação pode modificar a solubilidade, a disponibilidade biológica e a meia-vida in vivo quando administradas a um paciente. Devido ao fato de que a meia-vida das proteínas lisossomais glicosiladas paucimanosídicamente da invenção é reduzida por causa da estrutura de N-glicana menor quando comparadas com as proteínas lisossomais produzidas por mamíferos, a PEGuilação é especialmente preferencialmente para compensar esta desvantagem. Especialmente preferencialmente é uma Peguilação reversível, levando a uma perda pelo menos parcial da Peguilação in vivo, por exemplo, através da introdução de uma ligação hidrolisável, tal como uma base de Schiff, de forma a não interferir na captação celular. Ainda como uma medida para reduzir a interferência na captação celular, a Peguilação pode ser de cadeias de PEG curtas, tal como PEG com 4 até 1000, preferencialmente 8 até 100 ou 10 até 50 subunidades. Ao invés de PEG, qualquer polímero hidrofílico curto pode ser utilizado para aumentar a meia-vida, preferencialmente com um peso molecular menor que 100 kDa, menor que 10kDa ou menor que 1 kDa. Preferencialmente PEG possui 2-200, preferencialmente 3 até 100 ou 4 até 50, subunidades de glicol. A proteína lisossomática pode ser PEGuilada através de um grupamento de ligação como um meio para a ligação indireta da molécula de PEG. Alternativamente, também é possível uma ligação direta.

[0067] Preferencialmente as proteínas lisossomais da invenção não são reticuladas. A reticulação pode interferir na captação e na estabilidade celular e é menos preferida. Preferencialmente a reticulação é combinada com a Peguilação. Por exemplo, PEG pode ser utilizado como agente de reticulação, especialmente no caso de PEG bi- ou multifuncional que possui pelo menos dois grupos funcionais para ligação a uma proteína, tal como bis-COOH-PEG ou bis-NHS-PEG. A peguilação pode mascarar os aspectos negativos da reticulação que causam interferência na captação e na estabilidade celular.

[0068] A reticulação pode levar à formação de proteínas lisossomais multiméricas, especialmente preferencialmente proteínas lisossomais diméricas, como, por exemplo, é descrito para alfa- galactosidase na WO 2011/107990 (incorporada aqui como referência). Nas proteínas reticuladas, pelo menos duas proteínas lisossomais são conectadas diretamente ou indiretamente através de um grupamento ligante.

[0069] A reticulação e/ou a peguilação pode ocorrer através do grupamento ligante. Por exemplo, o grupamento ligante é opcionalmente um grupamento que está covalentemente ligado a uma cadeia lateral, um terminal N ou um terminal C ou um grupamento relacionado a modificações pós-tradução (por exemplo, um grupamento sacarídico) de um monômero de proteína lisossomal, bem como a uma cadeia lateral, um terminal N ou um terminal C ou um grupamento relacionado a modificações pós-tradução (por exemplo, um grupamento sacarídico) de outro monômero de proteína lisossomal. Os exemplos de tais grupamentos ligantes são descritos em detalhes aqui abaixo.

[0070] Alternativamente, o grupamento ligante faz parte dos monômeros de proteína lisossomal que estão ligados (por exemplo, parte de uma cadeia lateral, um terminal N ou um terminal C ou um grupamento relacionado a modificações pós-tradução (por exemplo, um grupamento sacarídico) de um monômero de proteína lisossomal, bem como de uma cadeia lateral, um terminal N ou um terminal C ou um grupamento relacionado a modificações pós-tradução (por exemplo, um grupamento sacarídico) de outro monômero de proteína lisossomal). Assim, por exemplo, o grupamento ligante pode ser uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação amida) entre um grupo funcional de uma cadeia lateral, um terminal N ou um terminal C ou um grupamento relacionado a modificações pós-tradução de um monômero (por exemplo, uma amina) e um grupo funcional complementar de uma cadeia lateral, um terminal N ou um terminal C ou um grupamento relacionado a modificações pós-tradução de outro monômero (por exemplo, carboxila), em que tal ligação covalente está ausente da forma nativa da α-galactosidase. Outras ligações covalentes, tal como, por exemplo, uma ligação éster (entre um grupo hidróxi e um carboxila); uma ligação tioéster; uma ligação éter (entre dois grupos hidróxi); uma ligação tioéter; uma ligação anidrido (entre dois carboxilas); uma ligação tioamida; uma ligação carbamato ou tiocarbamato, também são consideradas. Opcionalmente, o grupamento ligante é desprovido de uma ligação dissulfeto. Entretanto, um grupamento ligante que inclui uma ligação dissulfeto em uma posição que não forma um ligante entre os monômeros (por exemplo, a clivagem da ligação dissulfeto não rompe a ligação entre os monômeros) está dentro do âmbito desta modalidade da invenção. Uma vantagem potencial do grupamento ligante desprovido de uma ligação dissulfeto é que este não é suscetível à clivagem com condições suavemente redutoras, como são as ligações dissulfeto. Opcionalmente, o grupamento ligante é um grupamento não peptídico (por exemplo, o grupamento ligante não consiste de uma ligação amida, um aminoácido, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um oligopeptídeo ou um polipeptídeo). Alternativamente, o grupamento ligante pode ser ou pode compreender um grupamento peptídico (por exemplo, um aminoácido, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um oligopeptídeo ou um polipeptídeo). Opcionalmente, o grupamento ligante não é meramente uma extensão linear de qualquer um dos monômeros de proteína lisossomal ligados ao mesmo (isto é, o terminal N e o terminal C do grupamento peptídico não estão ligados diretamente ao terminal C ou ao terminal N de qualquer um dos monômeros de proteína lisossomal). Alternativamente, o grupamento ligante é formado através da ligação covalente direta de um terminal N de um monômero de proteína lisossomal com um terminal C de outro monômero de proteína lisossomal, de forma a produzir um polipeptídeo fundido. Tal polipeptídeo não será uma forma nativa da α-galactosidase, embora possa compreender dois monômeros de proteína lisossomal essencialmente em sua forma nativa. Entretanto, a ligação covalente dos monômeros de α-galactosidase descritos aqui está preferencialmente em uma forma sem ser a ligação direta de um terminal N com um terminal C. O grupamento ligante é preferencialmente um grupamento pequeno de 10 até 1000 Da, preferencialmente 20 até 500 Da.

[0071] Na reticulação e/ou na Peguilação, o grupamento ligante pode compreender um ou mais grupos reativos para ligação com a proteína lisossomal. Tais grupos reativos podem reagir, por exemplo, com um grupo tiol ou reagir com um grupo amina para formar uma ligação amida. Como utilizado aqui, a expressão "grupo reativo" descreve um grupo químico que é capaz de sofrer uma reação química que leva tipicamente à formação de uma ligação. A ligação, de acordo com as presentes modalidades, é preferencialmente uma ligação covalente (por exemplo, para cada um dos grupos reativos). As reações químicas que levam à formação de uma ligação incluem, por exemplo, substituições nucleofílicas e eletrofílicas, reações de adição nucleofílica e eletrofílica, alquilações, reações de adição-eliminação, reações de cicloadição, reações de rearranjo e quaisquer outras reações orgânicas conhecidas que envolvam um grupo funcional, bem como combinações das mesmas. O grupo reativo pode opcionalmente compreender uma porção não reativa (por exemplo, um alquila) que pode servir, por exemplo, para ligar uma porção reativa do grupo reativo a um grupamento ligante (por exemplo, poli(alquileno glicol) ou análogo do mesmo) descrito aqui. O grupo reativo é preferencialmente selecionado de forma que possibilite sua conjugação com a proteína lisossomal. Os exemplos de grupos reativos incluem, mas não são limitados a, carboxilato (por exemplo, -CO2H), tiol (-SH), amina (-NH2), halo, azida (-N3), isocianato (-NCO), isotiocianato (-N=C=S), hidróxi (-OH), carbonila (por exemplo, aldeído), maleimida, sulfato, fosfato, sulfonila (por exemplo, mesil, tosil) etc. bem como grupos ativados, tais como N- hidroxissuccinimida (NHS) (por exemplo, ésteres de NHS), sulfo-N- hidroxissuccinimida, anidrido, haleto ácido (-C(=O)-halogênio) etc. Em algumas modalidades, o grupo reativo compreende um grupo de partida, tal como um grupo de partida suscetível à substituição nucleofílica (por exemplo, halo, sulfato, fosfato, carboxilato, N- hidroxissuccinimida).

[0072] A invenção fornece ainda a proteína lisossomal ou a composição da invenção como um medicamento. É adicionalmente fornecido um método de tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal que compreende a administração de uma composição de proteína lisossomal a um paciente, por exemplo, um mamífero. Em relação a isso, a invenção fornece a proteína lisossomal da invenção para uso no tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal. O paciente pode ser um mamífero, especialmente um ser humano ou um animal não humano, tal como um roedor, um cachorro, um gato, um equino, um bovino, um camelo, um suíno. Preferencialmente a proteína lisossomal é da mesma espécie do paciente para prevenir reações imunológicas contra as cadeias de aminoácidos da proteína.

[0073] Preferencialmente a doença e a proteína lisossomal são selecionadas da tabela a seguir:

[0074] A dose para administração é preferencialmente uma dose de 0,05 até 100 mg/kg de peso corporal, preferencialmente de 0,1 até 50 mg/kg de peso corporal, especialmente preferencialmente de 0,3 até 10 mg/kg de peso corporal, tal como 0,3, 1 ou 3 mg/kg de peso corporal.

[0075] Uma vez que não há cura para as doenças de armazenamento lisossomal é necessário um tratamento crônico com administrações repetidas da reposição enzimática em intervalos regulares. Preferencialmente a proteína lisossomal da invenção é administrada em um intervalo de 1 até 30 dias, preferencialmente de 2 até 25 dias, mais preferencialmente de 3 até 23 ou até mesmo de 4 até 22 dias, de 5 até 21 dias, de 6 até 20 dias, de 7 até 19 dias, de 8 até 18 dias, de 9 até 17 dias, de 10 até 16 dias ou de 11 até 15 dias. Especialmente preferencialmente são intervalos de 14 dias. A administração em tais intervalos permite atividade enzimática constante nos lisossomos das células, agindo contra a eliminação de proteína.

[0076] As proteínas lisossomais podem ser administradas através de qualquer rota que faça com que uma enzima funcional atinja o sistema vascular, especialmente a corrente sanguínea. É preferida a infusão intravenosa (i.v.). Rotas de administração adicionais incluem administração intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) e subcutânea (s.c.). As rotas de administração i.p., i.m. e s.c. podem levar à distribuição reduzida da proteína lisossomal no tecido alvo (como coração, rim, fígado e baço) e ainda quantidades suficientes podem ser administradas a estes tecidos através destas rotas. Estas rotas não i.v., em particular i.p., i.m. e s.c., se beneficiam da melhora aceitação do paciente e geralmente o benefício supera a distribuição reduzida no tecido alvo. Além disso, os perfis farmacocinéticos das administrações não i.v. são benéficos uma vez que a enzima terapêutica fica disponível no plasma dos pacientes ao longo de um período de tempo prolongado.

[0077] Em modalidades preferidas, o tratamento médico da invenção com uma proteína lisossomal da invenção (produzida por briófitas) ocorre em combinação com uma proteína lisossomal do mesmo tipo e atividade enzimática qualitativa, mas produzida em células que não são vegetais, especialmente de mamífero ou de fungo. A proteína lisossomal que não é produzida por planta pode ter manose fosforilada para o reconhecimento pelo receptor da manose-6-fosfato (M6PR) e captação celular. Ainda, uma proteína lisossomal com manose fosforilada (artificialmente) de qualquer origem pode ser utilizada em combinação com a proteína lisossomal da invenção. Tais proteínas lisossomais fosforiladas ou que não são de briófitas já estão em uso, tais como Agalsidase alfa (Replagal®) e Agalsidase beta (Fabrazyme®) no caso de alfa-galactosidase adequada para tratamento da Doença de Fabry; Alglucerase (Ceredase®), Imiglucerase, Velaglucerase alfa (VPRIV), como β-glucocerebrosidases, adequadas para tratamento de Doença de Gaucher; Alglucosidase alfa (Myozyme®) adequada para o tratamento de Doença de Pompe; Idursulfase (Elaprase®), uma enzima lisossomal iduronato-2-sulfatase adequada para tratamento de síndrome de Hunter (MPS-II). Também é possível que outras proteínas lisossomais produzidas por plantas sejam utilizadas em combinação, tal como Taliglucerase alfa (Elelyso®), uma glucocerebrosidase. A proteína lisossomal fosforilada e/ou que não é produzida por briófitas pode ser reticulada com a proteína lisossomal paucimanosídica. O di- ou multímero reticulado é preferencialmente adicionalmente peguilado. Isto aumenta a estabilidade, a meia-vida e a captação.

[0078] A proteína lisossomal da invenção com glicosilação paucimanosídica também pode ser combinada com uma chaperona, em particular uma chaperona específica ou não específica da proteína lisossomal do mesmo tipo e atividade enzimática qualitativa. Uma chaperona farmacológica de proteínas lisossomais é, por exemplo, 1- Desoxigalactonojirimicina (Migalastat). A chaperona é capaz de modificar o restabelecimento de parte da atividade de uma proteína lisossomal endógena disfuncional em uma doença de armazenamento lisossomal. A proteína lisossomal endógena pode e geralmente é, uma proteína lisossomal fosforilada e pode complementar a interação do receptor da proteína lisossomal paucimanosídica da invenção - como é descrito anteriormente para terapias de combinação para administrações da proteína fosforilada ou que não é produzida por briófitas. Sim ficar limitado a uma terapia específica, parece que a chaperona pode restaurar ou aumentar a atividade enzimática da proteína lisossomal, que possui atividade defeituosa devido a uma mutação que causa a doença de armazenamento lisossomal. Especialmente preferencialmente, Migalastat é utilizado em combinação com uma alfa-galactosidase paucimanosídica ou produzida por briófitas da invenção e/ou é utilizado no tratamento de Doença de Fabry.

[0079] A combinação com enzimas lisossomais fosforiladas ou que não são produzidas por briófitas, especialmente aquelas com reconhecimento através de M6PR devido à fosforilação, complementa a atividade de captação das enzimas da invenção, permitindo atingir todas as células terapeuticamente relevantes com maior eficiência e um âmbito de aplicação terapêutica mais amplo.

[0080] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras e os exemplos a seguir sem ficar limitada a estas modalidades da presente invenção. Qualquer elemento dos exemplos pode ser combinado com os conceitos da invenção que são descritos anteriormente.

Figuras:

[0081] Fig. 1: Cassete de expressão linearizado para expressão de proteína lisossomal (sequência da proteína: GLA)

[0082] Fig. 2: Resultados intermediários e finais de uma purificação típica de α-gal A (SDS-PAGE corado com prata)

[0083] Fig. 3: Purificação de glucocerebrosidase do sobrenadante de cultura (SDS-PAGE corado com Coomassie)

[0084] Fig. 4: Purificação de alfa-glucosidase do sobrenadante de cultura. SDS-PAGE corado com Coomassie do eluato concentrado da cromatografia ConA. A) eluato de musgo-GAA versus alglucosidase alfa (Myozyme). B) eluato de musgo-GAA versus Padrão de Peso Molecular.

[0085] Fig. 5: Caracterização in vitro das enzimas. (a) Preparações de enzimas separadas em SDS-PAGE e coradas com Coomassie Blue. Faixas 1 e 2 são moss-aGal e agalsidase alfa respectivamente. Faixas 3 e 4 são moss-aGal e agalsidase alfa digeridas com PNGase F. Seta, enzimas α-gal A após a digestão; ponta de seta, PNGase F (36 KDa). O padrão de proteína e os pesos moleculares são mostrados à esquerda. (b) moss-aGal e agalsidase alfa (1 ng cada) detectadas por Western blot utilizando um anticorpo policlonal específico para α-gal A humana. Foram mostrados os dados representativos de 3 experimentos independentes. (c) Atividades específicas de α-gal A de preparações de enzimas determinadas utilizando o substrato artificial 4-MU-α-D- galactopiranosídeo. As concentrações de proteína foram medidas através do ensaio de BCA. (d) Estabilidade das enzimas diluídas em plasma humano tamponado e aquecido a 37°C (os dados são médias de triplicatas). High-mann: aGal com alto teor de manose; moss-aGal: α-galactosidase do musgo; Agal-alfa: agalsidase alfa; Agal-beta: agalsidase beta.

[0086] Fig. 6: Estudo de captação in vitro. (a) Atividades de α-gal A intracelular de fibroblastos de pacientes com Fabry (DMN96.125) após incubação durante toda a noite com enzimas diferentes na presença ou na ausência de 5 mM de M6P ou 2 mg/mL de manana de levedura. (b) A coloração por imunofluorescência com Gb3 mostra acúmulo lisossomal massivo de Gb3 nos fibroblastos de pacientes com Fabry não tratados (superior) e Gb3 significativamente reduzida nas células que foram tratadas com moss-aGal (inferior). (c e d) Expressão de MR em fibroblastos de pacientes com Fabry e células endoteliais microvasculares IMFE1. As células IMFE1 eram positivas para MR como determinado por Western blot (c) e coloração por imunofluorescência (d), enquanto que os fibroblastos eram negativos para MR. (e) Atividades de α-gal A intracelular de células IMFE1 após incubação durante toda a noite com enzimas diferentes na presença ou na ausência de 5 mM de M6P ou 2 mg/mL de manana de levedura. (f) Taxas de captação de enzimas diferentes nas células IMFE1. As células foram coletadas nos pontos de tempo indicados e as atividades intracelulares foram medidas. ***P < 0,001, moss-aGal vs. high-mann aGal ou agalsidase alfa. (g) Análise de Western blot de α-gal A internalizada nas células IMFE1 após 3 horas de incubação com preparações de enzimas diferentes. (h) Ligação de enzimas diferentes com célula IMFE1. Após 3 horas de incubação a 4°C, as enzimas ligadas à superfície da célula foram determinadas através de ensaio enzimático. A linha tracejada indica o nível de atividade de células IMFE1 com tratamento simulado neste ensaio (isto é, nível de fundo). *P < 0,05, ***P < 0,001. Todos os dados nos gráficos são apresentados como média ± SEM (n = 3-4).

[0087] Fig. 7: Farmacocinética no plasma. (a) Eliminação do plasma de moss-aGal e agalsidase alfa infundidas analisada pelas atividades enzimáticas. (b) Western blot para α-gal A no plasma 10 min após a infusão. (c) quantidades da proteína α-gal A no plasma 5 e 10 min após a infusão; as intensidades das bandas de Western blot foram analisadas por densitometria. (d) Correlação entre as quantidades da proteína α-gal A e as atividades enzimáticas no plasma 10 min após a injeção. Os dados em (a) e (c) são apresentados como média ± SEM (n = 4-5). *P < 0,05, **P < 0,01.

[0088] Fig. 8: Distribuição nos tecidos das enzimas infundidas. As preparações de enzimas foram injetadas em camundongos com Fabry e as atividades de α-gal A nos rins, no coração, no baço e no fígado foram medidas 2 horas após a injeção. (a) Atividades específicas nos órgãos. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01. (b) As atividades em órgãos inteiros foram calculadas e os dados são apresentados como a % de atividade total recuperada de 4 órgãos. (c) proteína α-gal A em homogenados provenientes dos rins detectada por Western blot. Seta, banda de α-gal A específica em camundongos injetados com moss-aGal. Nenhuma banda específica detectável foi observada em camundongos injetados com agalsidase alfa. Ponta de seta, posição aproximada para onde a banda de agalsidase alfa pode migrar (com base nas descobertas mostradas nas Figuras 2b, 4b).

[0089] Fig. 9: Localização celular de moss-aGal e agalsidase alfa infundidas. A distribuição celular de enzimas infundidas no coração e nos rins foi determinada por imunohistoquímica (n = 2). Foram mostradas fotografias representativas. (a) Coração. Os asteriscos indicam os vasos sanguíneos com células positivas para imunocoloração (mais provavelmente células endoteliais) e setas indicam células perivasculares positivas (presumivelmente macrófagos). (b) Rim. Setas indicam células epiteliais tubulares positivas para imunocoloração. Barra de escala: 25 μm. Aumento original: 400x.

[0090] Fig. 10: Cinética nos tecidos de enzimas infundidas. Preparações de enzimas foram injetadas em camundongos com Fabry e as atividades de α-gal A nos rins (a), no coração (b), no baço (c) e no fígado (d) foram medidas em 2, 24, 48 e 96 horas após a injeção. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 4-5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

[0091] Fig. 11: Eficácia de moss-aGal na eliminação de Gb3 acumulada nos tecidos. O conteúdo de Gb3 nos rins (a), no coração (b) e o fígado (c) foi analisado 7 dias após uma única infusão de moss-aGal ou agalsidase alfa em várias doses. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 4-5). *P < 0,05, ***P < 0,001. A significância estatística mostrada na parte de cima de cada grupo injetado com agalsidase alfa indica diferença entre agalsidase alfa e a mesma dose de moss-aGal.

[0092] Fig. 12-14: Atividades no plasma e nos tecidos para administração i.p. (Fig. 12), i.m. (Fig. 13) e s.c. (Fig. 14).

Exemplos: Exemplo 1: Produção de alfa-galactosidase humana no musgo Exemplo 1.1: Construção da cepa de expressão

[0093] A sequência da DNA do gene GLA humano (NCBI Reference Sequence: NM_000169.2) que codifica alfa-galactosidase A (α-gal A) sem sequência sinal nativa (SEQ ID NO: 3) foi sintetizada na forma de uma versão com códons otimizados (SEQ ID NO: 4) e subclonada em um vetor de expressão de musgo pela GeneArt / Thermo Fisher Scientific (GENEART AG, Regensburg, Alemanha). As sequências que carregam a construção de expressão de α-gal A e uma construção do gene que confere resistência à neomicina (npt II) foram cortadas como cassetes de expressão lineares (Fig. 1) dos plasmídeos utilizando enzimas de restrição.

[0094] Para gerar linhagens de células de musgo que produzem α- gal A estáveis, protoplastos de uma linhagem de musgo com nocaute duplo desprovida de resíduos de α-1,3-fucose e β-1,2-xilose específicos para planta em suas N-glicanas (Koprivova e outros (2004) Plant Biotechnol. J. 2, 517-523; Weise e outros (2007) Plant Biotechnol. J. 5(3), 389-401; WO 2004/057002) foram transformados com os cassetes de expressão purificados em um procedimento de transformação à base de PEG (Strepp e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 4368). As células de musgo transformadas foram regeneradas e selecionadas em relação à resistência contra o antibiótico G418. 2000 plantas jovens de musgo resistentes foram verificadas em duas rodadas consecutivas em relação ao acúmulo de α-gal A total por biomassa com a melhor cepa se tornando a cepa de produção padrão.

[0095] O cassete de expressão linearizado compreende os elementos genéticos a seguir: promotor da actina de Physcomitrella (P Actin) e 5’ UTR, peptídeo sinal de planta (SP), sequência de cDNA de α-gal humana sem sequência sinal nativa (GLA), 3’ UTR da tubulina de Physcomitrella, Promotor 35S do vírus mosaico de couve-flor (P 35S), gene de fosfotransferase da neomicina (nptII) e terminador 35S do vírus mosaico de couve-flor (T 35S) (Fig.1). O peptídeo sinal de planta continha a sequência MAFYKISSVFFIFCFFLIALPFHSYA (SEQ ID NO: 5).

[0096] A cepa de expressão é uma planta de musgo completamente regenerada que possui o transgene da aGal estavelmente integrado em seu genoma sob o controle genético dos elementos reguladores derivados do musgo.

Exemplo 1.2: Produção de enzima:

[0097] A cepa de produção de α-gal A foi cultivada durante 4 semanas (27d) em um saco descartável de 20 L (Cellbag 20, GE Healthcare, Alemanha) colocado em um Wave™ Reactor Rocker (BioWave 20 SPS, Wave Biotech AG, Suíça). Os parâmetros de cultivo eram: 25-30rpm velocidade de rotação, ângulo 8°, meio SM07 (100 mM de NaCl, 6,6 mM de KCl, 2,0 mM de MgSO4 x 7H2O, 1,8 mM de KH2PO4, 20,4 mM de Ca(NO3)2 x 4H2O, 0,05 mM de FeNa-EDTA, 4,9 mM de MES, 0,1% (p/v) de PEG4000, 100,26 μM de H3BO3, 0,11 μM de C0CI2 x 6H2O, 0,1 μM de CuSO4 x 5H2O, 5 μM de KI, 85,39 μM de MnCh x 4H2O, 1,03 μM de Na2MoO4 x 2H2O, 0,11 mM de NiCl2 x 6H2O, 0,04 μM de Na2SeO3 x 5H2O, 0,039 μM de acetato de Zn x 2H2O), 25°C, 0,3 L x min-1 de ar pressurizado suplementado com 2% até 4% de CO2 e iluminação a 130 até 310 μE x m-2 x s-1, 24 h de luz por dia, fornecida por painéis de luz equipados com Osram FQ 24W 840 HO, Lumilux Cool White. O meio foi adicionalmente suplementado com 1000x mistura de vitamina de Nitsch (mistura de vitamina de Nitsch, Duchefa, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. O pH da fermentação foi controlado automaticamente em pH5-6 através de titulação com 0,5 M de H2SO4 e 0,5 M de NaOH com auxílio de WAVEPOD I (GE Healthcare) em combinação com Pump20 (GE Healthcare).

[0098] Após o final do cultivo o meio de cultura passou pela cascata de filtração de três etapas a seguir para produzir um filtrado esterilizado clarificado sem musgo: 1) coleta de musgo através da filtração da torta na câmara de filtração PP customizada (Grosse e outros (2014) WO 2014/013045 A1) equipada com Zetaplus (01SP B3002, 3M,Alemanha), 2) filtração de profundidade através de uma Scale-Up Capsule de camada dupla (E0340FSA60SP03A, 3M, Alemanha e 3) uma etapa de esterilização por filtração final (Millipore ExpressTM Plus, 0,22 μm, Millipore, Alemanha).

[0099] Subsequentemente o filtrado esterilizado foi concentrado e o tampão foi trocado utilizando filtração de fluxo tangencial (TFF) (Pall Centramate 500S, membrana de celulose com faixa de 30kDa). Após uma série das três etapas cromatográficas (Butil-650M, DEAE, S) a α- gal A isolada e a high-mann α-gal A, respectivamente, foram concentradas até aproximadamente 0,5 mg/mL, transferidas para dentro do tampão de formulação e foram caracterizadas. A enzima foi armazenada a <-65°C até uso posterior. Os resultados de um processo de purificação típico são representados na Fig. 2.

Medidas da atividade enzimática:

[00100] A atividade de α-gal A foi medida através de um ensaio fluorimétrico utilizando 5 mM de 4-metilumbeliferil-α-D- galactopiranosídeo em pH 4,4 na presença de 0,1 M de N- acetilgalactosamina, um inibidor específico de α-galactosidase B. A concentração de proteína foi medida utilizando kit de ensaio de proteína com BCA (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. A atividade foi expressa na forma de μmol/mg de proteína/hora. Os resultados estão resumidos na Fig. 5c.

Coloração com prata de SDS-PAGE:

[00101] As amostras foram desnaturadas em tampão de amostra de SDS suplementado com agente redutor (Invitrogen) a 95°C durante 5 min. Géis de NuPAGE Bis-Tris a 4-12% (Invitrogen) foram utilizados para separação de proteína. A coloração com prata foi realizada utilizando o kit de coloração SilverQuest™ (Invitrogen) de acordo com o manual do fabricante.

ELISA de proteína da célula hospedeira (HCP)

[00102] Para quantificar os níveis de HCP remanescentes na α-gal A purificada foi desenvolvido um novo HCP ELISA (Biogenes GmbH, Alemanha). Resumidamente, foi realizada uma fermentação simulada com o respectivo tipo selvagem, o meio foi coletado e concentrado. A solução de proteína concentrada foi utilizada para imunização de coelho. A IgG total foi utilizada para gerar um ELISA em sanduíche para quantificação de HCP. Os resultados mostram uma eliminação típica das HCPs ao longo de todo o processo de purificação em um fator de 10000.

Exemplo 1.4: Sumário da produção

[00103] A produção de moss-aGal foi realizada em um processo de fermentação fotoautotrófica em um saco descartável de uso único de 10 L instalado dentro de um Wave™-rocker. O musgo, crescido na ausência de quaisquer antibióticos, secretou moss-aGal em um meio de cultura puramente mineral. A iluminação dos sacos de cultura vinha de fora a um fluxo médio de fótons de 200 μmoles/m2s. Após atingir sua densidade de cultura final, o musgo foi separado por filtração na torta do meio e o último foi clarificado através de um sistema de filtração de profundidade de camada dupla e esterilização por filtração final. O meio clarificado resultante foi concentrado e novamente tamponado através de filtração de fluxo tangencial.

[00104] Partindo desta coleta concentrada, a enzima foi purificada através de uma abordagem cromatográfica de três etapas, utilizando consecutivamente uma coluna de interação hidrofóbica (HIC), uma de troca aniônica (AIE) e uma de troca catiônica (CIE). Finalmente, o eluato da última coluna foi novamente tamponado e concentrado em 0,5 mg/mL.

[00105] O esquema de purificação forneceu moss-aGal pura (nível de proteína de célula hospedeira (HCP) ~100ppm, banda única no SDS- Page com Coomassie, pureza de 99% na SE-HPLC) com um rendimento típico de 30%.

Exemplo 2: Comparação de α-galactosidase A Exemplo 2.1: Produção de enzima e ensaio de atividade:

[00106] A aGal paucimanosídica de musgo foi obtida como é descrito no exemplo 1. Esta cepa de produção foi adicionalmente transformada com uma construção de nocaute direcionada para o único gene da N- acetilglucosaminiltransferase I (Gnt I) de Physcomitrella patens para a obtenção de cepas de produção para high-mann aGal. Para testar o efeito do número maior de resíduos de manosil terminais sobre a captação celular da enzima, α-gal A também foi produzida em uma cepa que sofreu eliminação genética de sua atividade de beta-1,2-N- acetilglucosaminiltransferase (GNT-I). A modificação de nocaute resulta em uma incapacidade do musgo de realizar qualquer processamento de glicana do tipo complexo uma vez que todas as etapas enzimáticas posteriores não possuem seu substrato. Assim, o corte mediado pela alfa-manosidase I no cis-Golgi é a última etapa de processamento e, portanto, todas as N-glicanas desta cepa são do tipo que contém alto teor de manose. A alfa-galactosidase humana produzida nesta cepa é referida como high-mann aGal. A produção e a purificação seguiram o mesmo esquema que no exemplo 1.

[00107] A Agalsidase alfa (Shire, Replagal®) e a Agalsidase beta (Genzyme, Fabrazyme®) produzidas por células de mamífero foram obtidas para teste comparativo.

[00108] Pelotas de células ou tecidos de camundongo foram lisados em 0,2% de Triton X-100 gelado em solução salina. Os lisados foram centrifugados a 14.000 rpm durante 15 min a 4°C e os sobrenadantes foram utilizados para ensaio enzimático. A atividade de α-gal A foi medida através do ensaio fluorimétrico utilizando 5 mM de 4- metilumbeliferil-α-D-galactopiranosideo em pH 4,4 na presença de 0,1 M de N-acetilgalactosamina, um inibidor específico de α-galactosidase B. A concentração de proteína foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína com BCA (Pierce). A atividade foi expressa na forma de nmol/mg de proteína/hora.

Exemplo 2.2: Análise de glicana:

[00109] A análise de glicana de moss-aGal e Agalsidase alfa foi realizada por Protagen Protein Services (Dortmund, Alemanha) utilizando HILIC-UPLC-MS. Resumidamente, as N-glicanas foram liberadas da proteína enzimaticamente utilizando PNGase F. Após a limpeza e a dessalinização as glicanas isoladas foram marcadas utilizando 2-aminiobenzamida (2-AB). As glicanas marcadas foram separadas em uma coluna ACQUITY UPLC BEH Glycan (2,1x100 mm) utilizando um gradiente linear de 78% até 55,9% de B (tampão A: 100 mM de formato de amônio pH4,5, tampão B: acetonitrila) em 38,5 min a 60°C com uma vazão de 0,5 mL/min. Os sinais de eluição das glicanas foram registrados por um detector de fluorescência (excitação em 330 nm, emissão em 420 nm). A designação de picos de fluorescência às respectivas glicanas foi realizada utilizando os valores de m/z registrados (Xevo-QTOF MS, Waters) e MasLynx software (Versão 4.1, Waters).

[00110] A análise de glicana de high-mann aGal foi realizada como a seguir. Aproximadamente 25 μg de a-Gal foram reduzidos (15 mM de DTT), carbamidometilados (55 mM de iodoacetamida) e precipitados com acetona (acetona:fase aquosa 4:1). A pelota foi redissolvida em 0,1 M de tampão de bicarbonato de amônio e digerida durante 12 h com tripsina a 37°C ou quimiotripsina (ambas proteases de grau de sequenciamento, Roche, Mannheim).

[00111] Aproximadamente 3 μg de cada produto da digestão foram carregados em uma coluna BioBasic C18 (BioBasic-18, 150 x 0,32 mm, 5 μm, Thermo Scientific) utilizando 60 mM de tampão de formato de amônio como o solvente aquoso. Um gradiente de 3 até 75 % de acetonitrila foi desenvolvido ao longo de 25 min a uma vazão de 6 μL/min. A detecção foi realizada com um espectrômetro de massa Waters Q-TOF Ultima equipado com a fonte de ESI padrão no modo de íon positivo. A análise dos dados foi realizada manualmente com MassLynx4.0.Tabela 1: Resultados da análise de N-glicana de Musgo aGal e enzimas comparativas

[00112] Em vista da bioquímica da glicana, pode-se assumir que HexNAc é N-acetilglucosamina e Hex é Manose. As linhas 1 e 2 de musgo aGal, Man3 e Man3+Metil representam glicosilação paucimanosídica. Surpreendentemente esta fração produziu aproximadamente 80%. High mann e Agalsidase alfa representam produtos comparativos.

[00113] Quando comparada com a Agalsidase alfa, musgo aGal possui uma composição estrutural muito homogênea, com alta uniformidade de batelada. A alta uniformidade de batelada para batelada é uma propriedade desejada para garantir reprodutividade e expectativa de função.Tabela 2: Homogeneidade de glicanas / estabilidade de batelada para batelada

Exemplo 2.3: Estabilidade térmica in vitro:

[00114] As enzimas foram diluídas no plasma obtido de um indivíduo saudável e foram aquecidas a 37°C ao longo de períodos de tempo indicados. Para manter o pH neutro, foi adicionado HEPES no plasma na concentração final de 20 mM. Após o aquecimento, foram medidas as atividades de α-gal A.

Exemplo 2.4: Caracterização in vitro

[00115] Moss-aGal tinha N-glicanas muito uniformes com Man3GlcNAc2 do tipo núcleo como estrutura dominante (Fig. 5). As cadeias de carboidrato de moss-aGal eram quase exclusivamente constituídas por manose e GlcNAc, das quais ~85% eram terminadas com manose, ~10% tinham tanto resíduos terminais de manose quanto de GlcNAc e ~4% eram terminadas com GlcNAc (Tabela. 1). Em comparação, Man5GlcNAc2 era a estrutura de glicana mais abundante na high-mann aGal (Tabela. 1) com alguma pequena parte de Man4, Man6 e Man7. Como esperado, não havia glicanas fosforiladas tanto em moss-aGal quanto em high-mann aGal. A agalsidase alfa mostrou estruturas de glicana altamente heterogêneas, das quais ~24% eram glicanas fosforiladas, ~7% eram glicanas terminadas com manose e 63% eram estruturas diversas (Tabela. 1).

[00116] No SDS-PAGE, a moss-aGal foi detectada como uma única banda principal com uma mobilidade mais rápida que a agalsidase alfa (Fig. 5a), refletindo o conteúdo de carboidrato menor em moss-aGal. Após a remoção das N-glicanas pela PNGase F, tanto a moss-aGal quanto a agalsidase alfa migraram para a mesma posição (Fig. 5a). High-mann aGal tinha mobilidade similar àquela de moss-aGal. Na análise de Western blot, tanto moss-aGal quanto agalsidase alfa foram detectadas por um anticorpo policlonal para α-gal A humana (Fig. 5b). Com a mesma quantidade de proteína carregada, a intensidade da banda de moss-aGal no Western blot era 2,14 ± 0,58 vezes (n = 3) aquela da agalsidase alfa, provavelmente devido às cadeias de açúcar mais curtas em moss-aGal que poderiam facilitar a acessibilidade do anticorpo ao(s) epítopo(s).

[00117] As atividades específicas de moss-aGal e high-mann aGal eram similares àquelas de agalsidase alfa e agalsidase beta (Fig. 5c).

[00118] Moss-aGal e moss-aGal com alto teor de manose tinham quase a mesma estabilidade com agalsidase alfa ou agalsidase beta quando diluídas no plasma humano e aquecidas a 37°C (Fig. 2d).

Exemplo 3: Produção de glucocerebrosidase humana no musgo, adequada para o tratamento de Doença de Gaucher Exemplo 3.1 Construção da cepa de expressão

[00119] A sequência de cDNA do gene GBA humano (Uniprot identifier P04062- GLCM_HUMAN, NCBI Reference Sequence: NM_000157.3) foi sintetizada e subclonada em um vetor de expressão de musgo pela GeneArt™ (Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Alemanha). A sequência utilizada (SEQ ID NO: 7) é codificadora da GBA humana (SEQ ID NO: 6) sem o peptídeo sinal (SP) anotado nativo, que foi substituído por um SP de planta de 26 aa (a clivagem acurada é prevista com um escore de 0,522 de acordo com a ferramenta da web SignalP4.1). A sequência de GBA foi modificada em uma única base (posição de base 21 na SEQ ID 7, AAA ^ AAG) utilizando um códon alternativo para o aminoácido lisina para facilitar a clonagem (evitando um sítio de restrição de HindIII). As sequências que carregam a construção de expressão de GBA e a construção do gene que confere resistência à neomicina (npt II) foram cortadas como cassetes de expressão lineares dos plasmídeos utilizando enzimas de restrição.

[00120] Foi utilizada uma linhagem de células de musgo baseada em uma linhagem com nocaute duplo desprovida de resíduos de α-1,3- fucose e β-1,2-xilose específicos de plantas em suas N-glicanas como é descrito no exemplo 1.1. Para gerar linhagens de células de musgo produtoras de glucocerebrosidase estáveis, os protoplastos provenientes desta linhagem de células básica glico engenheirada foram transformados com os cassetes de expressão purificados (Fig. 1) em um procedimento de transformação à base de PEG que é descrito no exemplo 1.1. O cassete de expressão linearizado compreende os mesmos elementos genéticos que são descritos no exemplo 1.1 e na Fig. 1, com a exceção da utilização de uma sequência da GBA humana ao invés da sequência de α-gal (GLA). As células de musgo transformadas foram regeneradas e selecionadas em relação à resistência contra o antibiótico G418. Aproximadamente 700 plantas jovens de musgo resistentes foram verificadas em duas rodadas consecutivas em relação ao acúmulo de glucocerebrosidase total por biomassa com a melhor cepa se tornando a cepa de produção padrão. A glucocerebrosidase humana produzida nesta cepa é referida como moss-GBA.

Exemplo 3.2: Produção e caracterização da enzima

[00121] As mesmas condições e etapas que são descritas para o exemplo 1.2 e para o exemplo 2 foram utilizadas para produção. A glucocerebrosidase foi purificada por filtração de fluxo tangencial com cromatografia de troca catiônica (CaptoS) com um cassete de celulose de 10kDa para captura e filtração em gel (Sephadex) para refinamento. A glucocerebrosidase purificada/enriquecida é analisada por Western Blotting, SDS Page corado com Coomassie/Prata e ensaio de atividade enzimática. A enzima purificada foi armazenada a -20°C até uso adicional. As etapas de purificação são mostradas na Fig. 3. Glicosilações altas ricas em manose similares foram obtidas. Em uma repetição de corrida, foram observadas glicanas terminadas com GlucNac superiores da forma MGn e GnGn. O tratamento com beta-N- Acetilglucosaminidase restaurou a distribuição da alta quantidade da forma de glicana paucimanosídica.

Exemplo 3.3: Ensaio enzimático

[00122] A atividade da glucocerebrosidase purificada é avaliada através do ensaio de atividade enzimática in vitro. A glucocerebrosidase foi incubada em 60 mM de Na-Citrato, 1,3 mM de EDTA, 0,15% de Triton-X100, 0,125% de taurocolato de sódio, 1 mM de DTT, 2 mM de 4-Nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo, pH 6 a 37°C. A reação foi interrompida com 1 M de NaOH e a formação de produto foi medida espectroscopicamente em 405 nm.

Exemplo 4: Produção de alfa-glucosidase lisossomal humana no musgo, adequada para o tratamento de Doença de Pompe Exemplo 4.1 Construção da cepa de expressão

[00123] A sequência de cDNA do gene da GAA humana (Uniprot identifier P10253 (LYAG_HUMAN), NCBI Reference Sequence: NM_000152.4) foi sintetizada e subclonada em um vetor de expressão de musgo pela GeneArt™ (Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Alemanha). A sequência utilizada (SEQ ID NO: 9) é codificadora do precursor da GAA humana (SEQ ID NO: 8) sem o peptídeo sinal (SP) anotado nativo, que foi substituído por um SP de planta de 26 aa (a clivagem acurada é prevista com um escore de 0,847 de acordo com a ferramenta da web SignalP4.1) e um pró-peptídeo truncado. A sequência de GAA foi modificada em uma única base (posição de base 2484 na SEQ ID 9, ACG ■> ACA) utilizando um códon alternativo para o aminoácido treonina para facilitar a clonagem (evitando um sítio de restrição de PvuI). As sequências que carregam a construção de expressão de GAA e a construção do gene que confere resistência à neomicina (npt II) foram cortadas como cassetes de expressão lineares dos plasmídeos utilizando enzimas de restrição.

[00124] Foi utilizada uma linhagem de células de musgo com base em uma linhagem com nocaute duplo desprovida de resíduos de α-1,3- fucose e β-1,2-xilose específicos de plantas em suas N-glicanas que é descrita no exemplo 1.1. Para gerar linhagens de células de musgo produtoras de alfa-glucosidase estáveis, os protoplastos provenientes desta linhagem de células básica glico-engenheirada foram transformados com os cassetes de expressão purificados (Fig. 1) em um procedimento de transformação à base de PEG que é descrito no exemplo 1.1. O cassete de expressão linearizado compreende os mesmos elementos genéticos que são descritos no exemplo 1.1 e na Fig. 1, com a exceção de utilizar uma sequência da GAA humana (SEQ ID 9) ao invés da sequência de α-gal (GLA) e um promotor de musgo diferente. As células de musgo transformadas foram regeneradas e selecionadas em relação à resistência contra o antibiótico G418.Aproximadamente 600 plantas jovens de musgo resistentes foram verificadas em duas rodadas consecutivas em relação ao acúmulo do precursor da alfa-glucosidase total por biomassa com a melhor cepa se tornando a cepa de produção padrão. A alfa-glucosidase lisossomal humana produzida nesta cepa é referida como moss-GAA.

Exemplo 4.2: Produção e caracterização da enzima

[00125] As mesmas condições e etapas que são descritas para o exemplo 1.2 e o exemplo 2 foram utilizadas para produção. A alfa- glucosidase foi purificada por cromatografia por afinidade utilizando Con A Sepharose 4B. O meio contendo alfa-glucosidase foi misturado com o mesmo volume de 50 mM de acetato de sódio, 1 M de NaCl pH 5,2 para ajustar em relação a condições de ligação apropriadas e carregado na coluna de cromatografia. A eluição foi realizada através do aumento em etapas da concentração de a-D-metilglucosídeo. A alfa-glucosidase purificada/enriquecida é analisada por Western Blotting, SDS Page corado com Coomassie/Prata e ensaio de atividade enzimática. A enzima purificada foi armazenada a 4°C ou -20°C até uso adicional. A análise de SDS-PAGE de moss-GAA enriquecida é mostrada na Fig. 4. A identidade da banda que contém moss-GAA foi confirmada através da análise de MS.

[00126] A alfa-glucosidase possui 7 sítios de glicosilação, denominados G1-G7. As glicoformas para cada sítio foram detectadas com MS/MS. O pico mais intenso para a maioria dos sítios (exceto GS2 - GnM com 73%) foi observado como sendo aquele da glicoforma GnGn. Portanto, a preparação da enzima foi tratada com beta-N- Acetilglucosaminidase para clivar a GlcNac terminal para converter GnM e GnGn em glicanas paucimanosídicas.

Exemplo 5: O fornecimento mediado pelo receptor de manose da α-galactosidase A produzida pelo musgo corrige eficientemente a deficiência da enzima na Doença de Fabry Exemplo 5.1: Estudo de captação in vitro:

[00127] Os fibroblastos da pele derivados de pacientes com Fabry (DMN96.125) e a linhagem de célula endotelial (IMFE1) foram cultivados em 10% de FBS em DMEM e EGM-2MV (Lonza) respectivamente. Ambas as linhagens de células possuem atividades muito baixas de α-gal A e possuem acúmulo de Gb3 lisossomal que é detectável por imunocoloração (Shen e outros (2008) Mol Genet Metab 95:163-168). As células foram incubadas com preparações de α-gal A (a uma concentração final de 10 μg/mL) na presença ou na ausência de 5 mM de M6P ou 2 mg/mL de manana de levedura ao longo de períodos de tempo indicados. Depois disso, as células foram coletadas através do tratamento com tripsina (0,25% de tripsina/EDTA, 37°C) que também elimina α-gal A extracelular. Após a lavagem com PBS, as pelotas de células foram lisadas para ensaio enzimático ou Western blot.

[00128] Para testar a capacidade das enzimas do musgo de degradação da Gb3 acumulada, as células DNN96.125 foram incubadas com preparações de α-gal A (10 μg/mL) durante 4 dias com o meio substituído a cada 1-2 dias. As células que receberam tratamento simulado foram utilizadas como controles não tratados. A Gb3 foi detectada por imunocoloração como é descrito a seguir.

[00129] O estudo de captação de enzima foi realizado em fibroblastos derivados de pacientes com Fabry com enzimas exógenas a uma concentração final de 10 μg/mL. Após 18 horas de incubação, os fibroblastos que foram carregados com agalsidase alfa ou agalsidase beta tinham as atividades de α-gal A intracelular notavelmente aumentadas (116 e 134 vezes de atividade de células não tratadas respectivamente) (Fig. 6a). A captação destas enzimas era quase completamente inibida pela M6P e era parcialmente inibida pela manana de levedura, confirmando que esta captação ocorria predominantemente através do M6PR. Os fibroblastos incubados com moss-aGal ou high-mann aGal tinham um incremento significativamente menor de atividades de α-gal A intracelular (6,4 e 4,8 vezes de células não tratadas respectivamente) (Fig. 6a). A captação tanto de moss-aGal quanto de high-mann aGal não era inibida pela M6P ou pela manana. Isto era coerente com pouca ou nenhuma expressão de MR nestas células (Fig. 6c,d). Apesar da baixa captação, o acúmulo lisossomal de Gb3 nos fibroblastos de pacientes com Fabry era significativamente reduzido após o tratamento com moss-aGal ou high-mann aGal durante 4 dias (Fig. 6b), sugerindo que as enzimas α-gal A de musgo são capazes de degradar os substratos acumulados nos lisossomos.

[00130] A enzima infundida de forma intravenosa na TRE é captada melhor pelo endotélio vascular, que forma uma primeira barreira entre o sangue e o resto dos tecidos. Além disso, as células endoteliais são um tipo principal de célula relevante para doença em algumas LSD tal como a Doença de Fabry. Portanto, foi testada a captação enzimática nas células endoteliais microvasculares derivadas de pacientes com Fabry (IMFE1). As células IMFE1 eram positivas para MR quando determinado por Western blot e imunocoloração (Fig. 6c,d). Após uma incubação durante toda a noite, as enzimas α-gal A de musgo foram captadas eficientemente pelas células IMFE1 (Fig. 6e). A captação de moss-aGal ou high-mann aGal pelas células IMFE1 foi predominantemente bloqueada pela manana de levedura (~60-80% de inibição) e foi inibida pela M6P até uma extensão menor (~2-10%), sugerindo que MR contribui principalmente para esta captação. A captação de agalsidase alfa ou agalsidase beta pelas células IMFE1 foi principalmente inibida pela M6P (~75-82%), mas também pela manana.

[00131] A captação in vitro tipicamente atinge uma fase de platô após incubação durante toda a noite. Para comparar as taxas de captação de preparações de α-gal A diferentes em uma fase dinâmica, as células IMFE1 foram incubadas com as enzimas (10 μg/mL) durante um período de tempo mais curto. A captação de high-mann aGal e agalsidase alfa era aproximadamente linear durante até 3 horas, com taxa de captação de high-mann aGal significativamente mais alta que de agalsidase alfa (Fig. 6f). A captação de moss-aGal era notavelmente mais alta que de high-mann aGal e agalsidase alfa após incubação durante 1 hora e atingiu um platô em 1-3 horas (Fig. 6f). Resultados similares foram obtidos em experimentos repetidos incluindo um com quantidade maior de enzima (40 μg/mL). O Western blot confirmou adicionalmente estes resultados no nível de proteína (Fig. 6g).

[00132] Para avaliar as eficiências de ligação à enzima, as células IMFE1 foram incubadas com preparações de enzimas diferentes (10 μg/mL) a 4°C na presença ou na ausência de M6P ou manana. Três horas depois, a α-gal A ligada à superfície foi medida através do ensaio de atividade enzimática. Sob esta condição experimental, não foi detectada qualquer atividade de α-gal A acima do nível basal (atividade de células não tratadas) nas células incubadas com high-mann aGal ou agalsidase alfa (Fig. 6h). A moss-aGal tinha ligação celular significativamente mais alta que a high-mann aGal ou a agalsidase alfa (Fig. 6h). A ligação de moss-aGal foi significativamente bloqueada pela manana, mas não pela M6P.

[00133] Estes resultados mostraram que em um sistema de ensaio que utiliza células endoteliais microvasculares cultivadas, que provavelmente é mais relevante para TRE in vivo que fibroblastos cultivados, a ligação e a captação de enzimas α-gal A de musgo são mais eficientes que a da agalsidase alfa e esta ligação/captação ocorre através de MR. Estes dados in vitro também sugeriram que as enzimas produzidas por musgo poderiam ser adequadas para TRE in vivo. Uma vez que a ligação/captação de moss-aGal era mais eficiente que a da high-mann aGal, a última foi selecionada para estudos subsequentes com animais.

Exemplo 5.2: Estudo de ligação in vitro:

[00134] As células IMFE1 na placa de múltiplos poços foram incubadas com enzimas α-gal A (10 μg/mL) a 4°C na presença ou na ausência de 5 mM de M6P ou 2 mg/mL de manana. Foi utilizado o meio de cultura EGM-2MV suplementado com 25 mM de HEPES. Três horas depois, as células foram lavadas com PBS gelado 4 vezes e foram lisadas diretamente em 0,2% de Triton a 4°C. Os lisados foram utilizados para ensaio de proteína e ensaio enzimático de α-gal A.

Exemplo 5.3: SDS-PAGE e Western blot:

[00135] As amostras foram desnaturadas em tampão de amostra LDS (Invitrogen) com 2,5% de 2-mercaptoetanol a 70°C durante 10 min. Géis de 4-12% ou 10% de NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) foram utilizados para separação de proteína. O Western blot foi realizado como descrito anteriormente (Shen e outros (2008) Biochem Biophys Res Commun 369:1071-1075). Os anticorpos primários utilizados eram anticorpo policlonal de coelho para α-gal A humana (Shire Human Genetic Therapies, Cambridge, MA), anticorpo monoclonal de camundongo para receptor de manose (clone 15-2, Abcam, Cambridge, MA) e anticorpo policlonal caprino para GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Os níveis da proteína α-gal A foram quantificados por densitometria utilizando o software ImageJ.

Exemplo 5.4: Imunofluorescência:

[00136] A imunocoloração por fluorescência foi realizada como descrito anteriormente (Shen e outros (2008) Mol Genet Metab 95:163168). Os anticorpos primários utilizados eram anticorpos monoclonais de camundongo para Gb3 (Seikagaku, Tóquio, Japão) e receptor de manose (clone 15-2, Abcam). As células foram contracoradas com DAPI.

Exemplo 5.5: Animais e procedimentos:

[00137] Os camundongos com Fabry foram produzidos através do cruzamento de pares de machos hemizigotos e fêmeas homozigotas. Fêmeas adultas (3-6 meses de idade) de camundongos com Fabry foram utilizadas ao longo de todo o estudo. Para cada experimento, foram utilizados animais com a mesma idade. Para estudos de eliminação de Gb3, as fêmeas de camundongos com Fabry são mais adequadas que os machos de camundongos com Fabry, porque os camundongos machos possuem síntese de Gb3 induzida por testosterona nos rins que confunde o efeito da enzima infundida na degradação da Gb3 acumulada. Para todas as injeções, as preparações de enzimas foram diluídas em solução salina até um volume total de 200 μL por camundongo e foram injetadas em camundongos com Fabry através da veia caudal.

Exemplo 5.6: Farmacocinética no plasma:

[00138] As preparações de enzimas foram injetadas a uma dose de 1 mg/kg de peso corporal (n = 5 cada). Amostras de sangue foram coletadas através da retirada de sangue da cauda utilizando capilares heparinizados em 1, 5, 10, 20 e 30 min após a injeção. O plasma foi separado e a atividade enzimática de α-gal A no plasma foi medida.

[00139] Moss-aGal ou agalsidase alfa foi injetada nos camundongos com Fabry através da veia caudal a uma dose de 1 mg/kg de peso corporal (PC) e a eliminação do plasma foi analisada através de um ensaio enzimático de α-gal A in vitro. Moss-aGal foi mais rapidamente eliminada da circulação que a agalsidase alfa (Fig. 7a). Para verificar se a meia-vida de moss-aGal no plasma mais curta é devida à captação mais robusta pelos tecidos ao invés da inativação mais rápida da enzima (desnaturação) na circulação, as enzimas no plasma dos camundongos foram analisadas por Western blot (Fig. 7b). De acordo com a reatividade maior do anticorpo para moss-aGal (Fig. 5b), as intensidades das bandas de moss-aGal foram corrigidas com um fator de 2,14. Os resultados revelaram que os níveis da proteína α-gal A nos camundongos que receberam infusão de moss-aGal em 5 e 10 min após a infusão eram significativamente menores que nos camundongos que receberam injeção de agalsidase alfa (Fig. 7c). Os níveis de proteína de moss-aGal no plasma em 5 e 10 min eram 37% e 28% daqueles da agalsidase alfa respectivamente, que eram em termos gerais coerentes com os dados de atividade enzimática (as atividades específicas no plasma de camundongos que receberam injeção de moss-aGal nestes 2 pontos de tempo eram 49% e 28% daquelas nos camundongos que receberam injeção de agalsidase alfa). Além disso, havia uma correlação forte entre os níveis de proteína e as atividades enzimáticas no plasma (Fig. 7d). Junto com as descobertas do estudo de captação in vitro (Fig. 6f-h), estes dados sugeriram que a moss-aGal administrada de forma intravenosa é mais eficientemente captação pelas células endoteliais vasculares e outros tipos de células nos tecidos quando comparada com a agalsidase alfa.

Exemplo 5.7: Biodistribuição:

[00140] As preparações de enzimas foram injetadas a uma dose de 1 mg/kg de peso corporal (n = 5 cada). Duas horas após a injeção, os camundongos sofreram perfusão com solução salina (para remover o sangue) e o coração, os rins, o baço e o fígado foram coletados. Os órgãos inteiros foram homogeneizados e a atividade de α-gal A foi medida. Para o rim, ambos os rins foram combinados e homogeneizados.

[00141] Duas horas após a injeção intravenosa de moss-aGal ou agalsidase alfa nos camundongos com Fabry (1 mg/kg de peso corporal), foi avaliada a distribuição nos tecidos de cada preparação de enzima. Os rins de camundongos que receberam injeção de moss-aGal tinham atividades enzimáticas significativamente mais altas que a agalsidase alfa (Fig. 8a). Os níveis de moss-aGal e agalsidase alfa no coração e no baço eram comparáveis (Fig. 8a). O nível de moss-aGal no fígado era significativamente menor que da agalsidase alfa (Fig. 8a). As atividades por órgãos inteiros foram calculadas e as proporções entre órgãos diferentes foram comparadas (Fig. 8b). Dentre as atividades totais recuperadas, 94,9% de moss-aGal e 97,5% de agalsidase alfa foram fornecidos para os fígados (P < 0,05). Os rins de camundongos que receberam injeção de moss-aGal tinham 1,96% de atividade total, que é significativamente maior (P < 0,05) que a dos camundongos que receberam injeção de agalsidase alfa (0,58%). A análise de Western blot confirmou a captação maior de moss-aGal nos rins comparada à da agalsidase alfa (Fig. 8c).

[00142] Para investigar a distribuição celular das enzimas infundidas, a imunohistoquímica foi realizada em tecidos de camundongos com Fabry 24 horas após a injeção de moss-aGal ou agalsidase alfa a 1 mg/kg de PC. Sinais específicos exibiam padrão citoplasmático granular, presumivelmente refletindo a localização lisossomal da enzima. A localização celular destas 2 enzimas no coração e nos rins era essencialmente idêntica. Nos corações, tanto moss-aGal quanto agalsidase alfa foram detectadas nos capilares e nas células perivasculares, mas não nos miócitos (Fig. 9a). A coloração específica foi observada apenas nas células epiteliais tubulares corticais renais para qualquer enzima (Fig. 9b). Estes resultados são coerentes com a distribuição celular de agalsidase alfa.

Exemplo 5.8: Imunohistoquímica:

[00143] Moss-aGal ou agalsidase alfa foi injetada através da veia caudal a uma dose de 1 mg/kg de peso corporal (n = 2 cada). O coração e os rins foram coletados 1 dia após a infusão da enzima. Os tecidos de fêmeas de camundongos com Fabry não tratados foram utilizados como controles negativos. Os tecidos foram fixados em formalina, incrustados em parafina e foram produzidas seções de 5 microns. A imunohistoquímica foi realizada por Histopathology and Tissue Shared Resource na Georgetown University (Washington, D.C.). Sucintamente, após a recuperação de epítopos induzida por calor em tampão citrato, as seções foram tratadas com 3% de peróxido de hidrogênio e 10% de soro caprino normal e foram incubados com anticorpo policlonal de coelho para α-gal A humana (Shire). Após a incubação com anticorpo secundário marcado com HRP, os sinais foram detectados pelo cromógeno DAB e as seções foram contracoradas com hematoxilina. A especificidade de sinal foi verificada com coloração de controle, na qual a incubação com o anticorpo primário foi omitida. Comparado à luz e à coloração não específica difusa nos controles não tratados, o sinal específico exibia padrão citoplasmático granular.

Exemplo 5.9: Estabilidade nos tecidos:

[00144] Moss-aGal ou agalsidase alfa foi injetada através da veia caudal a uma dose de 1 mg/kg de peso corporal. Em 24, 48 e 96 horas após a injeção, os camundongos (n = 4-5 por grupo) sofreram perfusão e os órgãos foram coletados e homogeneizados como é descrito na Biodistribuição acima.

Exemplo 5.10: Cinética nos tecidos

[00145] A cinética in vivo de moss-aGal e agalsidase alfa em vários órgãos foi investigada após uma única injeção intravenosa. Em 2 e 24 horas após a injeção, os rins dos camundongos que receberam injeção de moss-aGal tinham atividades enzimáticas significativamente mais altas comparadas com aqueles dos camundongos que receberam injeção de agalsidase alfa (Fig. 10a). Entretanto, as atividades eram similares em 48 e 96 horas (Fig. 10a). No coração, não havia diferença significativa entre as duas formas de enzimas em 2 e 24 horas; entretanto, as atividades de moss-aGal menores que as da agalsidase alfa em 48 e 96 horas após a injeção (Fig. 10b). Em comparação aos camundongos que receberam injeção de agalsidase alfa, os camundongos que receberam injeção de moss-aGal tinham nível de atividades similar no baço e atividades significativamente mais baixas no fígado em todos os pontos de tempo analisados (Fig. 10c,d). As meias-vidas de moss-aGal e agalsidase alfa nos rins e no coração variavam de 2 até 3 dias. Moss-aGal tinham uma meia-vida ~25% mais curta em ambos os órgãos. A meia-vida de moss-aGal no fígado era significativamente mais curta comparada à da agalsidase alfa (24 vs. 57 horas). As meias-vidas de ambas as formas de enzima no baço eram similares (~30 horas).

Exemplo 5.11: Eliminação de Gb3 dos tecidos:

[00146] Foram utilizadas fêmeas de camundongos com Fabry de seis meses de idade. Moss-aGal ou agalsidase alfa foi injetada através da veia caudal em doses de 0,3, 1 e 3 mg/kg de peso corporal (n = 4-5 cada). O coração, os rins e o fígado foram coletados 1 semana após uma única injeção. Camundongos com Fabry e do tipo selvagem combinados em relação à idade e ao sexo foram utilizados como controles (n = 5). Os tecidos foram homogeneizados e foram submetidos à extração dos glicoesfingolipídeos e à análise subsequente de Gb3 por espectrometria de massa como descrito anteriormente (Durant e outros (2011) J Lipid Res 52:1742-1746). Oito isoformas foram analisadas e os resultados mostrados são a soma destas isoformas. O conteúdo de Gb3 foi expresso na forma de μg/mg de proteína total.

[00147] As eficácias de moss-aGal e agalsidase alfa na degradação da Gb3 acumulada foram comparadas em 7 dias após uma única injeção intravenosa de qualquer uma das enzimas em camundongos com Fabry de 6 meses de idade. Foram testadas três doses diferentes (0,3, 1 e 3 mg/kg de PC). Os camundongos com Fabry não tratados tinham níveis de Gb3 significativamente aumentados nos rins, no coração e no fígado comparados com os controles do tipo selvagem (WT) (Fig. 11a-c). Ambas as formas de enzimas reduziam a Gb3 nestes órgãos de uma maneira dependente da dose (Fig. 11a-c). Moss-aGal e agalsidase alfa tinham eficácia comparável na eliminação de Gb3 nos rins e no coração (Fig. 11a,b), exceto por uma melhor eliminação de Gb3 no coração da agalsidase alfa na dose mais alta (3 mg/kg). Na eliminação da Gb3 no fígado, a agalsidase alfa era muito mais eficiente que a moss-aGal nas doses de 0,3 e 1 mg/kg (Fig. 11c). Em uma dose mais alta (3 mg/kg), estas 2 enzimas levaram a níveis similares de Gb3 no fígado. Exemplo 6: Fornecimento de α-galactosidase A humana recombinante produzida por musgo ao modelo de camundongo de Doença de Fabry através de rotas não intravenosas

[00148] A finalidade destes experimentos é testar a utilidade potencial de rotas não intravenosas no fornecimento de αGal de musgo aos tecidos alvos no modelo de camundongo.

Exemplo 6.1: Métodos

[00149] A moss-aGal que é descrita no exemplo 1 foi utilizada em uma concentração de 0,69 mg/mL. Foram utilizados machos de camundongos com Fabry adultos (8-11 meses). A aGal de musgo foi injetada através das rotas intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) ou subcutânea (s.c.). Para as duas últimas rotas, a enzima foi injetada nos músculos da coxa (ambos os lados) e sob a pele frouxa entre os ombros, respectivamente. Foram testadas doses de 1, 3 ou 10 mg/kg de peso corporal. O sangue foi coletado em 0,5, 1, 2, 4, 6 e 24 horas após a injeção e os órgãos foram dissecados em 24 horas. As amostras foram armazenadas a -80C até o uso. O plasma de camundongos com Fabry não tratados (n=5) foi utilizado para a atividade de linha de base. As atividades de α-gal A no plasma e nos tecidos foram medidas utilizando o método de 4MU padronizado.

[00150] Espectrometria: Após as reações das enzimas, a intensidade de fluorescência de 4MU liberada foi medida utilizando SpectroMax M5 (Molecular Devices). Este equipamento foi utilizado para análise de amostras de camundongos que receberam injeção i.p. e i.m. (e todas as amostras que foram testadas nos últimos 5 anos). Entretanto, devido ao problema mecânico que ocorreu recentemente, para amostras de camundongos que receberam injeção s.c. a fluorescência foi medida utilizando SpectroMax Paradigm (Molecular Devices). A curva padrão de 4MU no SpectroMax Paradigm mostrou linearidade excelente e as atividades de α-gal A de tecidos e plasma de camundongos analisados eram muito próximas daquelas medidas anteriormente utilizando SpectroMax M5 (testou as mesmas amostras). Portanto, a variação de dados através da utilização de 2 espectrometrias diferentes neste estudo seria muito pequena.

Exemplo 6.2: Resultados e discussões:

[00151] rota i.p. (Fig. 12): As atividades no plasma atingiram o pico em 0,5-2 horas após a injeção, diminuíram depois disso e voltaram para o nível da linha de base em 6 horas. As atividades eram dependentes da dose. As atividades no coração, nos rins, no fígado e no baço aumentavam de uma maneira dependente da dose.

[00152] rota i.m. (Fig. 13): As atividades no plasma atingiram o pico em 0,5 hora após a injeção, diminuíram rapidamente depois disso e voltaram para o nível da linha de base em 4 horas. As atividades no coração, nos rins, no fígado e no baço aumentavam de uma maneira dependente da dose. Um camundongo (#14, com dose de 10 mg/kg) teve atividades nos tecidos notavelmente mais altas que os outros no mesmo grupo; esta amostra foi removido da análise de dados.

[00153] rota s.c. (Fig. 14): As atividades no plasma exibiam padrão similar ao da administração i.m.. De forma geral, as atividades nos tecidos aumentavam de uma maneira dependente da dose. Entretanto, não havia diferença substancial nas atividades no coração e nos rins entre as doses de 1 e 3 mg/kg; isto pode ser devido à taxa de absorção relativamente limitada desta rota. Na dose de 10 mg/kg, as atividades nos tecidos exibiam grandes variações; 2 de 5 camundongos tinham atividades dramaticamente mais altas que o resto.

Exemplo 6.3: Comparações

[00154] A eficiência de fornecimento de enzima ocorre na ordem de i.p. > s.c. > (ou similar) i.m.

[00155] i.p. vs. i.v.: As atividades de α-gal A no coração, nos rins, no fígado e no baço nos camundongos que receberam injeção i.p. (1 mg/kg) eram 16%, 49%, 17% e 35% daquelas dos camundongos que receberam injeção i.v. (dados do estudo de Estabilidade nos Tecidos, 1 mg/kg, 24 horas após a injeção).

[00156] s.c. vs. i.p./i.v.: Embora a injeção s.c. levasse ao menor fornecimento de enzima para os tecidos que a injeção i.p., a proporção de redução em órgãos diferentes não era proporcional. Na dose de 1 mg/kg, as atividades de α-gal A no coração, nos rins, no fígado e no baço nos camundongos que receberam injeção s.c. eram 67%, 43%, 22% e 24% daquelas dos camundongos que receberam injeção i.p.. Isto sugere que a rota s.c. tende a fornecer mais enzima para o coração e os rins em relação ao fígado e ao baço. Um padrão similar foi observado quando comparado com a administração i.v.. As atividades nos órgãos anteriores de camundongos que receberam injeção de s.c. eram 11%, 21%, 4% e 9% daquelas nos camundongos que receberam injeção i.v..

[00157] As rotas não iv são uma abordagem alternativa para TRE. I.p. parece ser um bom método. Considerando o uso em humanos, s.c. pode ser uma boa candidata. Embora as quantidades nos tecidos sejam menores que na administração i.v., quantidades suficientes podem ser administradas uma vez que apenas pequenas quantidades são necessárias nos tecidos. Se atividades baixas nos tecidos (por exemplo, s.c. vs i.v.) de uma única administração forem insuficientes para degradar a Gb3 acumulada no coração e nos rins, injeções repetidas podem resolver esse problema. em resumo, os aspectos positivos das administrações i.p., i.m. e s.c. como maior aceitação do paciente superam a distribuição reduzida nos tecidos alvos.

Exemplo 7: Discussão

[00158] Dependendo das características das proteínas bem como de sua aplicação planejada, são escolhidos hospedeiros de expressão diferentes. Enquanto as proteínas em massa para aplicações industriais e alimentar/alimentícias são principalmente expressas em hospedeiros procarióticos como Escherichia coli, a produção de proteína farmacêutica frequentemente se baseia na expressão em células eucarióticas superiores como, por exemplo, células CHO (ovário de hamster chinês) ou de plantas. As últimas escolhas ocorrem principalmente com base no fato de que as proteínas farmacêuticas, em sua maioria de origem humana, requerem modificações pós-tradução complexas (PTMs) tais como, por exemplo, N-glicosilações. Portanto, a expressão recombinante paralela da mesma proteína em sistemas de expressão eucarióticos diferentes produz qualidades de produtos diferentes em relação a PTM. Por exemplo, no caso de N-glicosilação, os sistemas de expressão em células de mamífero tendem a produzir uma mistura de produtos muito heterogênea com várias dezenas até centenas de espécies de N-glicanas diferentes no mesmo produto de proteína. Os sistemas de expressão à base de plantas em contraste apresentam um padrão de N-glicosilação muito homogêneo com apenas algumas espécies de glicanas diferentes (tipicamente menos de dez) presentes na proteína produzida.

[00159] No caso da produção de proteínas farmacêuticas, a escolha do sistema de produção é frequentemente provocada pelas demandas estruturais e de qualidade do produto. A presente invenção foi conduzida pela necessidade de produzir uma proteína lisossomal recombinante para tratar pacientes que sofrem de LSD. Como estes pacientes não possuem uma versão funcional desta enzima devido à mutação genética hereditária, o produto recombinante é utilizado como um substituto através de terapia de reposição enzimática regular (por exemplo, infusão intravenosa). Para a captação eficiente da corrente sanguínea através da ligação ao receptor de manose na superfície das células alvos, a enzima precisa ser decorada com N-glicanas que carregam resíduos terminais de manose.

[00160] Para produzir uma versão de aGal com N-glicanas terminadas com manose em um sistema de expressão de planta, o método de rotina teria utilizado direcionamento vacuolar da proteína através da adição de um sinal de secreção ao terminal N e um sinal de direcionamento vacuolar ao terminal C. Nesta abordagem, o sinal de secreção direciona a proteína nascente para dentro do retículo endoplasmático (ER) ondem é decorada com glicanas precursoras. Após a via de secreção padronizada, a proteína é enviada para o complexo de Golgi e suas glicanas serão adicionalmente aparadas e processadas em uma forma de N-glicana de planta complexa típica. Estas glicanas terminam com dois resíduos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) terminais que cobrem ambas as extremidades de manoses possíveis de tal glicana.

[00161] A exposição destas duas manoses nas duas últimas posições dos dois braços de glicana e então conseguida pelo segundo peptídeo de direcionamento, o sinal de direcionamento vacuolar no terminal C. Este peptídeo se liga aos receptores de separação vacuolar na rede trans-Golgi (TGN) e inicia o direcionamento da proteína ligada para o vacúolo. Ali, a beta-N-Acetilhexosaminidase tira por clivagem as GlcNAcs terminais e expõe assim os resíduos de manose. As glicanas resultantes são classificadas como "paucimanosídicas" e são típicas para proteínas vacuolares de plantas.

[00162] A presente invenção, em contraste, omite a etapa de incorporação de um sinal vacuolar C-terminal na sequência de proteína. Portanto, o produto recombinante não é selecionado para o vacúolo na TGN, mas segue adicionalmente a via de secreção padrão. Nesta abordagem, o corte das N-glicanas complexas e a exposição associada das manoses terminais não são esperados, uma vez que é designado que as estruturas paucimanosídicas são específicas para o vacúolo (Castilho & Steinkellner, 2012, Biotechnology Journal, 7(9), 1088-1098).

[00163] A presente invenção conseguiu o corte de N-glicanas em briófitas para gerar uma versão recombinante de proteínas lisossomais com manoses terminais expostas sobre suas N-glicanas sem um sinal vacuolar. Isto leva a uma via de secreção que, não obstante, independentemente do processamento de glicol vacuolar levou a um produto com altas quantidades de glicoproteínas paucimanosídicas no caso de proteínas lisossomais.

[00164] Moss-aGal foi eficientemente captada pelas células endoteliais que expressam MR e esta captação foi bloqueada pela manana de levedura, um inibidor específico da endocitose mediada por MR. Moss-aGal não foi eficientemente captada pelos fibroblastos epiteliais humanos que não expressavam MR. Estas descobertas indicam que a captação de moss-aGal é mediada por MR. Em contraste, a captação de agalsidase alfa envolvia tanto MR quanto M6PR. Estudos com animais revelaram que a atividade enzimática e a capacidade de eliminação do armazenamento de moss-aGal nos corações e nos rins de camundongo são como um todo comparáveis àquelas da agalsidase alfa. Estes resultados sugerem que as enzimas terminadas com manoses podem ser tão eficientes quanto as enzimas que carregam M6P no tratamento de Doença de Fabry e em outras LSDs.

[00165] Esta moss-aGal testada é idêntica ao seu correspondente humano em relação à sequência e à estrutura da proteína. A N- glicosilação homogênea e predominantemente terminada com manose é conseguida através da expressão em uma cepa de musgo customizada. Além disso, para a produção de high-mann aGal, a GNT- I (N-acetiltransferase-glicosaminiltransferase I) foi nocauteada. A transferência de uma N-acetilglucosamina para a glicana nascente por esta enzima forma um substrato essencial para seu processamento adicional em formas complexas. Portanto, o processamento de glicanas complexas é bloqueado neste nocaute e todas as glicoformas são do tipo high-mann.

[00166] O estudo dos presentes inventores mostrou que o musgo é uma plataforma útil para expressar α-gal A e outras enzimas lisossomais. Em um aspecto, o musgo per se apresenta uma N- glicosilação notavelmente homogênea, isto é, quando comparado, por exemplo, às células de mamífero, suas proteínas exibem um número drasticamente reduzido de glicoformas com uma distribuição percentual altamente reproduzível. Em relação à produção farmacêutica isto é altamente vantajoso em casos em que as qualidades das N-glicanas são decisivas para a eficácia terapêutica de uma proteína.

[00167] A captação de moss-aGal pelas células endoteliais era muito mais eficiente que a da agalsidase alfa. Isto era coerente com a eliminação mais rápida de moss-aGal infundida da circulação in vivo. Devido ao fato de que as células endoteliais podem desempenhar uma função importante na patofisiologia da vasculopatia e outras manifestações na Doença de Fabry, o fornecimento eficiente para as células endoteliais é vantajoso na prevenção e na correção da patologia da doença. O estudo dos presentes inventores também mostrou que, apesar do aumento dos resíduos de manose terminais, a ligação/captação de high-mann aGal pelas células endoteliais era significativamente menos eficiente que da moss-aGal paucimanosídica. Isto sugeria que a eficiência de ligação de MR possivelmente depende mais da conformação das glicanas, do que do número absoluto de resíduos de manose expostos.

[00168] Através da imunohistoquímica, a moss-aGal foi detectada no endotélio vascular e nas células perivasculares no coração, que é de forma geral coerente com o padrão de distribuição de MR. É sabido que os cardiomiócitos endocitam ligantes manosilados através de MR ou receptores similares a MR. Embora a enzima não tenha sido detectada nas células musculares, a Gb3 cardíaca significativamente reduzida (~45% de redução nos camundongos com Fabry que receberam 1,0 ou 3,0 mg/kg de moss-aGal) sugere que uma pequena quantidade de enzima que fica abaixo do limite de detecção do método de imunocoloração dos presentes inventores poderia ser fornecidas para os cardiomiócitos. Nos rins, a moss-aGal foi detectada apenas nas células epiteliais tubulares. O mecanismo para esta captação não está claro uma vez que não foi relatado se os túbulos renais expressam MR. Uma interpretação potencial é que as células tubulares expressam outro(s) receptor(es) que medeia(m) a endocitose de glicoproteínas terminadas com manose. A presença de tal(is) receptor(es) não identificado(s) que possui(em) atividade de ligação similar à do MR foi relatada no baço e nos nódulos linfáticos de camundongos. A reabsorção de enzimas filtradas pelas células tubulares através da endocitose mediada por megalin é outra possibilidade.

[00169] Moss-aGal e agalsidase alfa exibiam distribuições nos tecidos diferentes quando analisadas 2 horas após a infusão. Em relação à agalsidase alfa, o direcionamento de moss-aGal para os rins era significativamente melhorado e o fornecimento para o fígado era significativamente reduzido. Este padrão de distribuição de moss-aGal é vantajoso, uma vez que o rim é um dos órgãos principais afetados nesta doença. No fígado, a agalsidase alfa infundida é fornecida tanto para os hepatócitos quanto para as células que revestem a cavidade (endotélio e/ou células de Kupffer) presumivelmente através de M6PR, receptores da asialoglicoproteína e MR. A maior parte de M6PR acessível pela enzima fosforilada infundida fica contida no fígado. Em contraste, moss-aGal será preferencialmente fornecida para o endotélio e as células de Kupffer através de MR.

[00170] A meia-vida da moss-aGal internalizada no coração e nos rins era mais curta que a da agalsidase alfa. Isto é provavelmente relacionado ao menor conteúdo de carboidratos na moss-aGal que pode levar à maior suscetibilidade da enzima à degradação proteolítica nos lisossomos. Devido à circulação mais rápida, a atividade de moss-aGal nos rins 4 dias após a infusão era similar àquela da agalsidase alfa. A redução do armazenamento de Gb3 nos rins e no coração refletia as atividades enzimáticas residuais 4 dias após a injeção.

[00171] A comparação de moss-aGal e agalsidase alfa pode servir como um modelo útil para estudar as funções de M6PR e MR na captação de agalsidase alfa nos tecidos. Como mencionado, tanto M6PR quanto MR medeiam o fornecimento da agalsidase alfa in vitro, assim é difícil determinar qual via de receptor é mais responsável pela biodistribuição e pela resposta terapêutica desta enzima em certos órgãos alvos. Apesar das cadeias de açúcar notavelmente diferentes, a localização celular da agalsidase alfa e da moss-aGal no coração e nos rins era surpreendentemente similar. A eficácia de eliminação do armazenamento nestes órgãos também era similar. Em outras palavras, comparados a uma enzima completamente não fosforilada, os resíduos de M6P na agalsidase alfa não levavam a uma distribuição mais ampla e uma eliminação de Gb3 mais completa como se poderia esperar. Estas descobertas sugeriam que a via de MR poderia desempenhar uma função mais importante que M6PR no direcionamento da agalsidase alfa para o coração e os rins.

Claims

1. Método de produção de uma composição de proteína lisossomal, caracterizado pelo fato de que compreende a expressão de um transgene que codifica uma proteína lisossomal em uma planta ou uma célula de briófita, em que a dita proteína lisossomal é expressa com um sinal de secreção N-terminal, em que o dito sinal de secreção é opcionalmente removido durante o processamento intracelular e em que a proteína lisossomal não possui um sinal vacuolar C-terminal com a sequência VDTM (SEQ ID NO: 1) e não possui um sinal de retenção no RE no C-terminal com a sequência KDEL (SEQ ID NO: 2) e o dito processo compreende ainda a obtenção de uma proteína lisossomal expressa da dita planta ou célula.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína lisossomal expressa é obtida da matéria secretada da planta ou da célula.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína lisossomal expressa é obtida da matéria secretada da planta ou da célula sem romper as células ou a planta produtoras.

4. Método, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína lisossomal não possui qualquer sequência sinal de retenção no RE C- terminal e/ou não possui qualquer sequência sinal vacuolar C-terminal.

5. Método, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína lisossomal compreende uma sequência de aminoácidos expressa que termina no C-terminal com os aminoácidos de uma proteína lisossomal nativa ou um truncamento da mesma.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a planta ou a célula de briófita é um musgo, preferencialmente planta ou célula de P. patens e/ou em que a planta ou a célula de briófita suprimiu ou eliminou a alfa1,3- fucosiltransferase e/ou a beta1,2-xilosiltransferase.

7. Composição de proteína lisossomal, caracterizada pelo fato de que compreende um grande número de proteínas lisossomais que são glicosiladas de acordo com um padrão de glicosilação, em que o dito padrão de glicosilação possui pelo menos 45% de N-glicanas paucimanosídicas (% molar).

8. Composição de proteína lisossomal, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que pode ser obtida através de um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Composição de proteína lisossomal, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a proteína lisossomal é qualquer uma selecionada dentre α-Galactosidase, preferencialmente α-Galactosidase A (GLA); β-Glucoceramidase, β- glucosidase (glucocerebrosidase); α-Manosidase; Aspartilglucosaminidase; β-Manosidase; Ceremidase Ácida; α- Fucosidase; β-Galactosidase, proteína ativadora da β-Hexosaminidase; Galactocerebrosidase, Galactoceramidase; lipase ácida lisossomal (LAL); α-Iduronidase; Iduronato-2-sulfatase; Glucosamina-N-sulfatase, Heparansulfatsulfamidase (SGSH); α-N-acetil-glucosaminidase (NAGLU); α-glucosaminida-N-acetiltransferase; N-Acetigalactosamina- 6-sulfatase; β-Galactosidase; N-Acetigalactosamina-4-sulfatase; β- Glucoronidase; Neuraminidase; Esfingomielinase, Esfingomielina fosfodiesterase; Alfa-1,4-glucosidase ácida; β-Hexosaminidase ou sua subunidade α; Alfa-N-acetilgalactosaminidase (NAGA), α- Galactosaminidase; β-Hexosaminidase A; Galactose-6-sulfato sulfatase; Hialuronidase.

10. Composição de proteína lisossomal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que as proteínas lisossomais possuem uma ou mais N-glicanas paucimanosídicas que compreendem a estrutura da fórmula 1: em que um quadrado representa N-Acetilglucosamina (GlcNAc), um círculo representa manose (Man) e um círculo com um T representa uma manose terminal, em que uma ou mais das subunidades de GlcNAc ou Man podem ser α1,3-fucosiladas, α1,6- fucosiladas e/ou β1,2-xilosiladas, preferencialmente em que pelo menos 10 % das N-glicanas das proteínas lisossomais da composição compreendem ou consistem da estrutura da fórmula 1 (% molar).

11. Composição de proteína lisossomal, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o padrão de glicosilação possui pelo menos 1% de N-glicanas da fórmula GlcNAc2-Hex2-metil- Hex; e/ou em que o padrão de glicosilação compreende as N-glicanas a seguir: 0% até 35%, preferencialmente 1% até 30%, -GlcNAc2- (Man2metil-Hex); 30% até 80%, preferencialmente 40% até 70%, -GlcNAc2- Man3; 0% até 30%, preferencialmente 4% até 22%, -GlcNAc2- Man3-GlcNAc; 0% até 15%, preferencialmente 2% até 12%, -GlcNAc2- Man3-GlcNAc2; 0% até 5%, preferencialmente 0% até 3%, -GlcNAc2-Man3- Hex2; 0% até 11%, preferencialmente 1% até 8%, -GlcNAc2-Man3- Hex3; 0% até 10%, preferencialmente 1% até 7%, -GlcNAc2-Man3- Hex4; 0% até 10%, preferencialmente 1% até 7%, -GlcNAc2-Man3- Hex5; em que todos estes compostos juntos equivalem a 100% ou menos que 100%, em que GlcNAc é uma subunidade de N-Acetilglucosamina, Man é uma subunidade de manose, Hex é uma subunidade de hexose, metil-Hex é uma subunidade de hexose metilada, preferencialmente 2- O metil hexose; com a condição de que -GlcNAc2-(Man2metil-Hex) e - GlcNAc2-Man3 juntas equivalem a pelo menos 45%, (toda % está em % molar), especialmente preferencialmente em que Hex é Man em qualquer uma das N-glicanas acima; em que a GlcNAc na extremidade redutora da glicana pode estar fucosilada ou não estar fucosilada em qualquer uma das N- glicanas acima; em que uma Man em um ponto de ramificação, está xilosilada ou não está xilosilada em qualquer uma das N-glicanas acima.

12. Composição de proteína lisossomal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende proteínas lisossomais não-fosforiladas.

13. Método in vitro para processamento de uma proteína lisossomal que compreende uma N-glicana complexa, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento da proteína lisossomal, como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 12, em uma amostra e o contato da amostra com uma HEXO de briófita, preferencialmente a enzima HEXO3, em que a enzima HEXO de briófita cliva resíduos de GlcNAc terminais da proteína lisossomal produzindo assim uma N-glicana paucimanosídica.

14. Uso de uma composição de proteína lisossomal, como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento ou composição farmacêutica para o tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a doença de armazenamento lisossomal e a proteína lisossomal são selecionadas da tabela a seguir: