CN102933707B - 稳定的α-半乳糖苷酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文公开了多聚蛋白质结构，包括通过连接部分彼此共价地连接的至少两个α-半乳糖苷酶单体，以及制备其的方法，和通过给予多聚蛋白质结构来治疗法布里病的方法。在溶酶体条件下和血清环境两者中，公开的多聚蛋白质结构在增强的活性和/或较长的持久活性方面表现出改进的性能。
Description
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及新的多聚蛋白质结构（多聚体蛋白结构），更具体地，但是非排他性地，涉及α-半乳糖苷酶的多聚蛋白质结构以及它在治疗法布里病（Fabry disease）中的应用。
背景技术
在大分子的分解代谢期间，溶酶体酶α-半乳糖苷酶-A（α-GAL或α-GalA；EC 3.2.1.22）催化半乳糖从低聚糖、糖蛋白类以及糖脂中的去除。溶酶体酶的缺乏导致它们的底物在组织中的积聚，被称为溶酶体贮藏病的条件。在人类中，功能性α-半乳糖苷酶-A的缺乏导致在组织中含有末端α-半乳糖残基的糖脂的积聚（主要是糖鞘脂（脂酰鞘氨醇三己糖苷，globotriaosylceramide），其也被称为“神经酰胺三己糖苷”（酰基鞘氨醇己三糖苷酶，ceramide trihexoside）、“CTH”或“Gb3”），从而导致法布里病。法布里病是X-连锁隐性疾病，首先在1 898年被描述，其特征在于慢性疼痛、眼浑浊（ocular opacities）、肝和肾损伤、皮肤损害、血管恶化和/或心脏缺陷。重组人类α-半乳糖苷酶-A具有恢复患者体内酶功能的能力，并且美国在2003年将利用α-GAL的酶替代疗法（ERT）批准用于治疗法布里病。在β-葡萄糖苷酶，用于戈谢病（Gaucher disease）的治疗之后，α-GAL成为被批准的用于治疗溶酶体贮藏病的第二种重组蛋白质。
在器官如肝、肾、脾、心脏等的细胞的溶酶体中，内源性的和重组的α-GAL催化末端半乳糖苷化的糖脂的水解。这种自然的作用位点的特征在于它的低pH，达到低至4.5。因此包含α-GAL的溶酶体酶被设计成在这些低的pH水平上发挥它们的最大活性。
目前的法布里ERT治疗是基于哺乳动物细胞来源的重组α-GAL，其被认为是效力有限的治疗。这些治疗仅减慢疾病的进展，但是不能终止它的进展，并且不能提供真实的和完全的解决方案。此外，在一些情况中，由于对治疗的免疫原性响应的发展，必需停止利用商业重组的α-GAL的ERT，并且在一些情况中，考虑到免疫原性问题，不能开始治疗。
X-射线结构分析显示，人类α-GAL是同型二聚体糖蛋白，其中每一个单体由两个结构域组成，含有活性位点的(β/α)8结构域和在β夹心中的两个片上含有8个反平行的β链的C-末端结构域[Garman & Garboczi,JMol Biol 2004,337:319-335]。以首-尾装配的形式来布置两个单体，并且二聚作用是非共价的。两个单体利用界面聚集在一起，其中所述界面延伸二聚体的宽度并埋置表面积的在二聚体界面中，来自每一个单体的30个残基有助于所述界面。将二聚体的两个活性部位分开大约
将α-Gal的晶体结构解释为非配体的蛋白质以及半乳糖-配体的蛋白质。这两种结构在配体的和非配体的结构之间表现很小的变化。然而，使用半乳糖代替天然的底物，糖鞘脂（Gb3）不会导致活性部位协同性的迹象，其中后者的特征在于长脂质链能够与一种单体的疏水结构域相互作用，而末端半乳糖能够与第二单体的活性部位相互作用。此外，生物化学迹象表明这样的协同性，其举例说明了同型二聚体四维结构的重要性[Bishop & Desnick,J Biol Chem 1981,256:1307-1316]。因此，研究了人类α-Gal的动力学性质，并且显示了同型二聚体酶的单体之间的协同性，每一个具有相互作用的催化部位。因此，认为酶活性和稳定性可能取决于二聚作用。
本发明的受让人的WO 2009/024977（如完全阐明的一样，将其全部内容结合于本文中作为参考）教导了糖类和生物分子的结合物（conjugates），它们之间是通过非疏水性连接子共价地连接，以及利用这样的结合物的医疗用途。
本发明的受让人的PCT国际专利申请号PCT/IL2010/000956教导利用α-半乳糖苷酶的方法论，所述半乳糖苷酶在比溶酶体pH高的pH水平下表现溶酶体活性。
另外的背景技术包括Bendele等人[Toxicological Sciences 1998,42:152-157]、美国专利号5,256804、5,580757和5,766,897，国际专利申请PCT/NL2007/050684（作为WO 2008/075957公开的），以及Seely &Richey[J Chromatography A 2001,908:235-241]。
发明内容
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了多聚蛋白质结构，其包括彼此通过连接部分共价地连接的至少两个α-半乳糖苷酶单体，该多聚蛋白质结构呈现选自由以下组成的组中的特性：
（a）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（b）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶活性减少的百分数低至少10％；
（c）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
（d）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1周后的α-半乳糖苷酶活性，比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件1周后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（e）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数，比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件1天后天然α-半乳糖苷酶的活性减少的百分数低至少10％；
（f）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
（g）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件之后即刻的α-半乳糖苷酶活性比在使蛋白质的天然形式经受溶酶体条件之后即刻的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（h）在使多聚蛋白质结构经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液之后即刻，α-半乳糖苷酶活性，比在使天然α-半乳糖苷酶经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液之后即刻天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；和
（i）在生理系统中的循环半衰期至少比天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期高20％。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了多聚蛋白质结构，其包括通过连接部分（linking moiety）彼此共价连接的至少两种α-半乳糖苷酶单体，其中连接部分不存在于天然α-半乳糖苷酶中。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了包括如本文描述的多聚蛋白质结构和药用载体的药物组合物。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了治疗法布里病的方法，该方法包括给予需要其的受试者治疗上有效量的如本文描述的多聚蛋白质结构，从而治疗法布里病。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了制备如本文描述的多聚蛋白质结构的方法，该方法包括使α-半乳糖苷酶与交联剂反应，所述交联剂包括本文描述的连接部分和至少两个反应基团。
根据本发明的某些实施方式，本文描述的连接部分不存在于天然α-半乳糖苷酶中。
根据本发明的某些实施方式，多聚蛋白质结构呈现选自由以下组成的组中的特征：
（a）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（b）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶活性减少的百分数低至少10％；
（c）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
（d）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1周后的α-半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件1周后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（e）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数，比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件1天后天然α-半乳糖苷酶的活性减少的百分数低至少10％；
（f）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
（g）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件后即刻的α-半乳糖苷酶活性，比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件后即刻的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（h）在使多聚蛋白质结构经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液后即刻的α-半乳糖苷酶活性，比在使天然α-半乳糖苷酶经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液后即刻的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；和
（i）在生理系统中的循环半衰期高于天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期。
根据本发明的某些实施方式，在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后，多聚蛋白质结构的α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变，进一步地，在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1周后，α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变。
根据本发明的某些实施方式，高于天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期的多聚蛋白质结构的循环半衰期比天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期高至少20％。
根据本发明的某些实施方式，高于天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期的多聚蛋白质结构的循环半衰期比天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期高至少50％。
根据本发明的某些实施方式，通过在将多聚蛋白质结构给予脊椎动物后在器官中的α-半乳糖苷酶活性来表征多聚蛋白质结构，该器官选自由脾、心脏和肾组成的组。
根据本发明的某些实施方式，多聚蛋白质结构包括两个α-半乳糖苷酶单体，该蛋白质结构是二聚蛋白质结构。
根据本发明的某些实施方式，α-半乳糖苷酶是人类α-半乳糖苷酶。
根据本发明的某些实施方式，α-半乳糖苷酶是植物重组的α-半乳糖苷酶。
根据本发明的某些实施方式，α-半乳糖苷酶具有选自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列。
根据本发明的某些实施方式，α-半乳糖苷酶是碱性α-半乳糖苷酶。
根据本发明的某些实施方式，α-半乳糖苷酶是酸性α-半乳糖苷酶。
根据本发明的某些实施方式，连接部分包括聚(亚烷基二醇)（聚(烷撑二醇)，poly(alkylene glycol)）。
根据本发明的某些实施方式，聚(亚烷基二醇)包括至少两个官能团，每一个官能团与α-半乳糖苷酶单体之一形成共价键。
根据本发明的某些实施方式，至少两个官能团是聚(亚烷基二醇)的末端基团。
根据本发明的某些实施方式，至少一个连接部分具有通式：
-X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2-
其中每个X1和X2是与至少一个α-半乳糖苷酶形成共价键的官能团；
Y是O、S或NR5；
n是从1至200的整数；并且
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自由氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代（氧基，oxo）、硫醇以及硫代烷氧基（thioalkoxy）组成的组。
根据本发明的某些实施方式，官能团中的至少一个与α-半乳糖苷酶单体形成酰胺键。
根据本发明的某些实施方式，n是从5至150的整数。
根据本发明的某些实施方式，n是从40至70的整数。
根据本发明的某些实施方式，药物组合物进一步包括半乳糖。
根据本发明的某些实施方式，多聚蛋白质结构被用作药物。
根据本发明的某些实施方式，该药物用于治疗法布里病。
根据本发明的某些实施方式，多聚蛋白质结构用于治疗法布里病。
根据本发明的某些实施方式，所述方法包括使二聚α-半乳糖苷酶与交联剂反应。
根据本发明的某些实施方式，反应基团包括离去基团（leaving group）。
根据本发明的某些实施方式，反应基团与胺基团反应以形成酰胺键。
根据本发明的某些实施方式，每一个反应基团能够在连接部分与至少一个α-半乳糖苷酶单体之间形成共价键。
根据本发明的某些实施方式，交联剂与α-半乳糖苷酶的单体的摩尔比在从5:1至500:1的范围内。
根据本发明的某些实施方式，摩尔比在从75:1至300:1的范围内。
除非另作限定，否则本文使用的所有技术术语和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等价于本文描述的那些的方法和材料可用于本发明的实施方式的实践或检验中，但是下面描述示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，将以包括定义的专利说明书为准。另外，材料、方法以及实例仅仅是说明性的并且不必是限制性的。
附图说明
专利或申请文件包括至少一个以彩色绘出的图。将在请求和必要的费用支付上通过官方提供具有彩图的该专利或专利申请公开的副本。
本文仅参照附图通过举例的方式描述了本发明的某些实施方式。在现在详细地具体参照附图的情况下，应该强调，示出的细节是为了举例说明并且用于本发明的实施方式的说明性的讨论的目的。在这点上，结合附图的描述使得本领域技术人员将显然如何可以实施本发明的实施方式。
在附图中：
图1是示出了在模拟的溶酶体条件（柠檬酸磷酸缓冲液，pH 4.6，37℃）下，以及植物重组人类α-GAL-I的活性作为孵育时间的函数的图；
图2是示出了在模拟的生理条件（pH 7.4，37℃）下， 植物重组人类α-GAL-I，以及具有半乳糖（100mg/mL）的植物重组α-GAL-I的活性作为孵育时间的函数的图；
图3是示出了在37℃下在人类血浆中， 以及植物重组人类α-GAL-I的活性作为孵育时间的函数的图；
图4是示出了在模拟的溶酶体条件（柠檬酸磷酸缓冲液，pH 4.6，37℃）下，植物重组人类α-GAL-I、和具有半乳糖（100mg/mL）的植物重组α-GAL-I的活性作为孵育时间的函数的图。
图5是示出了示例性的二-N-羟基琥珀酰亚胺-聚(乙二醇)（二-NHS-PEG）交联剂的分子结构的图解；
图6是示出了已经与二-NHS-PEG交联剂反应的二聚蛋白质的图解；
图7示出了SDS-PAGE凝胶的扫描，其示出了以50:1（泳道1、4和7）、100:1（泳道2、5和8）以及200:1（泳道3、6和9）二-NHS-PEG:α-GAL的摩尔比，与二-NHS-PEG5（泳道1-3）、二-NHS-PEG8（泳道7-9）、和二-NHS-PEG45（泳道4-6）反应的植物重组α-GAL-I，以及分子量标记（Mw）和未反应的植物重组α-GAL-I标准（Std）（箭头显示包括α-GAL二聚体的带）；
图8示出了等电子聚焦凝胶的扫描，其示出了以50:1（泳道1、4和7）、100:1（泳道2、5和8）以及200:1（泳道3、6和9）二-NHS-PEG:α-GAL的摩尔比，与二-NHS-PEG5（泳道1-3）、二-NHS-PEG8（泳道7-9）、和二-NHS-PEG45（泳道4-6）反应的植物重组α-GAL-I，以及pH标记（M）和未反应的植物重组α-GAL-I标准（Std）（箭头显示对于各种带的pH值）；
图9是通过二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的MALDI-TOF质谱分析谱（x-轴指示m/z值，并且示出了峰的m/z值）；
图10是通过二-NHS-PEG8交联的植物重组α-GAL-I的MALDI-TOF质谱分析谱（x-轴指示m/z值，并且示出了峰的m/z值）；
图11示出了照片，其示出了α-GAL底物N-十二烷酰基-硝基苯并噁二唑-神经酰胺三己糖苷（ceramide trihexoside）（Gb3-NBD）和α-GAL反应产物乳糖基神经酰胺-硝基苯并噁二唑（乳糖基神经酰胺-NBD），如通过在UV光（365nm）下照射，接着进行高效薄膜色谱，接着利用与二-NHS-PEG45（左边泳道）、（中间泳道）和没有α-GAL（右边泳道）交联的植物重组人类α-GAL-I孵育底物Gb3-NBD可视化的；
图12A、12B和12C是示出了在模拟的溶酶体条件（柠檬酸磷酸缓冲液，pH 4.6，37℃）下，在50:1（图12A中的“1”、图12B中的“7”以及图12C中的“4”）、100:1（图12A中的“2”、图12B中的“8”以及图12C中的“5”）以及200:1（图12A中的“3”、图12B中的“9”以及图12C中的“6”）二-NHS-PEG:α-GAL的摩尔比下，植物重组人类α-GAL-I、和利用二-NHS-PEG5（图12A）、二-NHS-PEG8（图12B）和二-NHS-PEG45（图12C）交联的植物重组人类α-GAL-I的活性作为孵育时间的函数的图；
图13是示出了在法布里病小鼠的血浆中，植物重组人类α-GAL-I、和利用二-NHS-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-I的药物代谢动力学分布的图；每一个α-GAL的残余活性表示为每一个α-GAL的最大残余活性的百分数，其作为在注射α-GAL之后的时间的函数；
图14A和14B示出了曲线图（图14A）和蛋白质印迹的照片（图14B），图图14A示出了植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、和利用二-NHS-PEG8（prh-α-GAL-I-CL8）或二-NHS-PEG45（prh-α-GAL-I-CL45）交联的植物重组人类α-GAL-I，在注射α-GAL之后2小时的法布里病小鼠（Fabry mice）的脾中的活性，图14B示出了 （泳道10-12和15）、植物重组人类α-GAL-I（泳道7-9和13），以及利用二-NHS-PEG8（泳道4-6）或二-NHS-PEG45（泳道1-3和14）交联的植物重组人类α-GAL-I在α-GAL的注射之后的法布里病小鼠的脾中（泳道1-12），或作为由50ngα-GAL组成的标准（泳道13-15）的蛋白质印迹的照片；
图15A和15B示出了曲线图（图15A）和蛋白质印迹的照片（图15B），图15A示出了植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG8（prh-α-GAL-I-CL8）或二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL后2小时的法布里病小鼠的肝中的活性，图15B示出了 （泳道10-12和15）、植物重组人类α-GAL-I（泳道7-9和13），和利用二-NHS-PEG8（泳道4-6）或二-NHS-PEG45（泳道1-3和14）交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL之后的法布里病小鼠的肝中（泳道1-12），或作为由50ng α-GAL组成的标准（泳道13-15）的蛋白质印迹的照片；
图16是示出了植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG8（prh-α-GAL-I-）或二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL后2小时的法布里病小鼠的心脏中的活性的图；
图17是示出了植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG8（prh-α-GAL-I-CL8）或二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL后2小时的法布里病小鼠的肾中的活性的图；
图18是示出了和植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I(prh-α-GAL-I)在注射α-GAL后2小时、24小时、3天和7天的法布里病小鼠的脾中的活性的图（示出了内源性野生型α-GAL（WT）作为标准）；
图19是示出了和植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL后2小时、24小时、3天和7天的法布里病小鼠的肝中的活性的图（示出了内源性野生型α-GAL（WT）作为标准）；
图20是示出了和植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL后2小时、24小时、3天和7天的法布里病小鼠的心脏中的活性的图（示出了内源性野生型α-GAL（WT）作为标准）；
图21是示出了和植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）、以及利用二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-I-CL45)交联的植物重组人类α-GAL-I在注射α-GAL后2小时、24小时、3天和7天的法布里病小鼠的肾中的活性的图（示出了内源性野生型α-GAL（WT）作为标准）；
图22示出了SDS-PAGE凝胶的图像的照片，其显示哺乳动物重组人类α-GAL（左边泳道）、和与二-NHS-PEG45反应的哺乳动物重组人类α-GAL（中间的泳道）、以及分子量标记（右边泳道；以KD单位指示标记的分子量）；
图23示出了等电子聚焦凝胶的照片，其显示哺乳动物重组人类α-GAL（左边泳道）、和与二-NHS-PEG45反应的哺乳动物重组人类α-GAL（中间泳道）、以及pH标记（右边泳道）；
图24A和24B是哺乳动物重组人类α-GAL（图24A）、和通过二-NHS-PEG45交联的哺乳动物重组人类α-GAL的MALDI-TOF质谱分析谱（x-轴指示m/z值，并且示出了峰的m/z值（以Da单位））；
图25是米-门氏曲线图，其示出了通过哺乳动物重组人类α-GAL（Replagal）和通过二-NHS-PEG45交联的哺乳动物重组人类α-GAL（Replagal CL45）水解p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（pNP-G）的速度（V）作为pNP-G浓度的函数；
图26A和26B是显示在模拟的溶酶体条件（柠檬酸磷酸缓冲液，pH4.6，37℃）（图26A）下或在37℃的人类血浆中（图26B），哺乳动物重组人类α-GAL（Replagal）、和通过二-NHS-PEG45交联的哺乳动物重组人类α-GAL（Replagal-CL45）的活性作为孵育时间的函数的图；
图27A-27D是示出了和利用二-NHS-PEG45交联的α-GAL（R-CL45）在注射α-GAL后2小时的法布里病小鼠的脾（图27A）、肝（图27B）、心脏（图27C）和肾（图27D）中的活性的图；
图28A-28D是示出了法布里病小鼠的心脏（图28A）、肾（图28B）、肝（图27C）和脾（图28D）中的Gb3水平作为在注射（R）或利用二-NHS-PEG45交联的（R-CL45）之后的时间的函数的图；
图29A和29B示出了SDS-PAGE凝胶的扫描，其显示植物重组人类α-GAL-Ⅱ（图29A和29B，泳道2），和与二-NHS-PEG21（图29A，泳道3）、二-NHS-PEG45（图29A，泳道4）或二-NHS-PEG68（图29B，泳道3）反应的植物重组人类α-GAL-Ⅱ，以及分子量标记（图29A和29B，泳道1；以KDa单位指示标记的分子量）；
图30A-30C是植物重组人类α-GAL-Ⅱ（图30A）、和通过二-NHS-PEG21（图30B）或二-NHS-PEG45（图30C）交联的植物重组人类α-GAL-Ⅱ的MALDI-TOF的质谱分析谱（x-轴指示m/z值，并且示出了峰的m/z值（以Da单位））；
图31A-31D是这样的图，其示出了在模拟的溶酶体条件（柠檬酸磷酸缓冲液，pH 4.6，37℃）下（图31A和31B）或在37℃的人类血浆中（图31C和31D）（图31C和31D中示出的数据来自不同的实验），哺乳动物重组人类α-GAL（Replagal）、和植物重组人类a-GAL-Ⅱ，以及通过二-NHS-PEG21(prh-α-GAL-II-CL21；图31A和31C）、二-NHS-PEG45（prh-α-GAL-II-CL45；图31A-31D）或二-NHS-PEG68（prh-α-GAL-II-CL68；图31B和31D）交联的植物重组人类α-GAL-Ⅱ的活性作为孵育时间的函数；
图32A和32B是示出了（Replagal）、植物重组人类α-GAL-Ⅱ（prh-α-GAL-II）、以及利用二-NHS-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-Ⅱ（prh-α-GAL-II-CL45）在法布里病小鼠的血浆中的药代动力学分布的图；每一个α-GAL的浓度表示为在注射α-GAL后的时间的函数（图32A和32B在不同的时间范围示出了相同的数据）；
图33A-33L是这样的图，其示出了（Replagal）、植物重组人类α-GAL-Ⅱ（prh-α-GAL-II）以及利用二-NHS-PEG45（prh-α-GAL-II-CL45；图33A-33L）或二-NHS-PEG21（prh-α-GAL-II-CL21；图33E-33L）交联的植物重组人类a-GAL-Ⅱ，在注射α-GAL后2小时（图33A-33H）、7天（图33A-33D和33I-33L）、14天（图33A-33D）和28天（图33A-33D）的法布里病小鼠的心脏（图33A、33E和33I）、肾（图33B、33F和33J）、肝（图33C、33G和33K）和脾（图33D、33H和33L）中的活性；
图34A-34C是示出了植物重组人类α-GAL-Ⅱ（prh-α-GAL-II）、以及利用二-NHS-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-Ⅱ（prh-α-GAL-II-CL45）的动力学参数Vmax（图34A）、KM（图34B）和Kcat（图34C）作为pH的函数的图；
图35示出了SDS-PAGE凝胶的扫描，其显示植物重组人类α-GAL-Ⅰ（prh-α-Gal-I）、和与具有分子量为2KDa（prh-α-Gal-I-PEG 2000）、5KDa（prh-α-Gal-I-PEG 5000）或100KDa（prh-α-Gal-I-PEG 10000）的甲氧基封端的NHS-PEG反应的植物重组人类α-GAL-Ⅰ，以及分子量标记（左边泳道；以KDa单位指示标记的分子量）；
图36A和36B是这样的图，其显示在模拟的溶酶体条件下（柠檬酸磷酸缓冲液，pH 4.6，37℃）（图36A）或在37℃的人类血浆中（图36B），哺乳动物重组人类α-GAL（Fabrazyme），哺乳动物重组人类α-GAL（Replagal），植物重组人类α-GAL-I以及与具有分子量为2KDa（α-Gal-I-PEG 2000）、5KDa（α-Gal-I-PEG 5000）或10KDa（α-Gal-I-PEG 10000）的甲氧基封端的NHS-PEG反应的植物重组人类α-GAL-Ⅰ的活性作为孵育时间的函数；
图37示出了SDS-PAGE凝胶的扫描，其显示在50:1（泳道1、4、7和10）、100:1（泳道2、5、8和11）和200:1（泳道3、6、9和12）二-NHS-PEG:α-GAL的摩尔比下，与二-NHS-PEG2（泳道1-3）、二-NHS-PEG4（泳道4-6）、二-NHS-PEG68（泳道7-9）、二-NHS-PEG150（泳道10-12）以及二-NHS-PEG45（CL45）反应的植物重组α-GAL-Ⅰ，以及分子量标记（MW）；
图38示出了SDS-PAGE凝胶的扫描，其显示在50:1（泳道1、4和7）、100:1（泳道2、5和8）和200:1（泳道3、6和9）二-NHS-PEG:α-GAL的摩尔比下，与二-COOH-PEG12（泳道1-3）、二-COOH-PEG28（泳道4-6）、二-COOH-PEG45（泳道7-9）、以及二-NHS-PEG45（CL45）反应的植物重组α-GAL-Ⅰ，以及分子量标记（MW），和作为对照（con）的非交联植物重组α-GAL-Ⅰ；
图39是示出了在模拟的溶酶体条件（柠檬酸磷酸缓冲液，pH4.6，37℃）下，植物重组人类α-GAL-Ⅰ（prh-α-GAL-I），以及利用二-NHS-PEG45（prh-α-GAL-I-CL45）、二-NHS-PEG4（prh-α-GAL-I-CL4）、二-NHS-PEG2（prh-α-GAL-I-CL2）、二-COOH-PEG45（prh-α-GAL-I-CLA45）、二-COOH-PEG28（prh-α-GAL-I-CLA28）或二-COOH-PEG12（prh-α-GAL-I-CLA12）交联的植物重组人类α-GAL-I的活性作为孵育时间的函数的图；
图40A和40B是示出了在模拟的溶酶体条件下（柠檬酸磷酸缓冲液，pH4.6，37℃）（图40A）或在37℃的人类血浆中（图40B）（图40B显示哺乳动物重组α-GAL和作为比较的非交联的植物重组人类α-GAL-II的活性），通过二-NHS-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-II的活性作为孵育时间的函数的图；
图41示出了SDS-PAGE凝胶的扫描，其显示来自3个不同批次的植物重组α-GAL-II（泳道1-3）和来自5个不同批次（泳道4-8）的与二-NHS-PEG45反应的植物重组α-GAL-II，以及分子量标记（MW）；
图42示出了等电子聚焦凝胶的扫描，其显示了来自3个不同批次（泳道1-3）的植物重组α-GAL-II和来自5个不同批次（泳道4-8）的与二-NHS-PEG45反应的植物重组α-GAL-II，以及pH标记（M）；
图43A-43F是植物重组人类α-GAL-II（图43A），和来自5个不同批次的通过二-NHS-PEG45交联的植物人类α-GAL-II（分别地是，图43B-43F）的MALDI-TOF质谱分析谱（x-轴指示m/z值，并且示出了峰的m/z值（以Da单位））；以及
图44是示出了作为底物（p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷）浓度的函数的来自5个不同批次的通过由二-NHS-PEG45交联的植物人类α-GAL-II呈现的α-GAL活性的催化速度（V）。
具体实施方式
本发明在其某些实施方式中涉及新的多聚蛋白质结构，更具体地，但是不是排他性地，涉及α-半乳糖苷酶的多聚蛋白质结构以及其在治疗法布里病中的应用。
在详细地说明本发明的至少一个实施方式之前，应该理解，本发明在其应用中不必限制于在下面的描述中阐明或通过实例例证的细节。本发明能够包括其他实施方式，或能够以各种方式实施或执行本发明。
溶酶体蛋白质的缺乏（例如，溶酶体蛋白质的不足或溶酶体蛋白质的缺乏）可对受试者的健康引起相当大的伤害（溶酶体贮藏病）。其中将缺乏的蛋白质给予患者的酶替代疗法（ERT）已经被用于尝试治疗溶酶体贮藏病。然而，缺乏的蛋白质的给予不一定导致体内所述蛋白质的活性的相当大的和/或持久的增加。
法布里病是X-连锁的隐性（遗传的）溶酶体贮藏病的实例，其可引起广泛的系统症状。由于突变导致的溶酶体酶α-半乳糖苷酶A的缺乏，引起被称为酰基鞘鞍醇三己糖（也被称为Gb3或神经酰胺三己糖苷）的糖脂在血管、其他组织、和器官内积聚。这种积聚导致其适当的功能的损害。两种酶替代疗法（ERT）可用于功能上地补偿α-半乳糖苷酶缺乏。α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶是人类α-半乳糖苷酶A酶的两种重组形式。这些酶是难以制备的，因此是昂贵的。最近，Genzyme's Allston,MA车间的污染引起全球性的β-半乳糖苷酶的缺乏，并且定量分配给患者推荐剂量的三分之一的供应品。
如本文示出的，α-半乳糖苷酶在溶酶体的低的pH水平特征上发挥它们的最大活性，而在较高的pH水平上它们的活性受到损害。因此，例如，用于ERT的α-半乳糖苷酶将几乎不能水解法布里患者的血清中的末端半乳糖苷化的糖脂。
此外，如本文进一步示出的，甚至在溶酶体条件下，逐渐地损害α-半乳糖苷酶的活性，尽管是以在比较高的pH水平上慢的速率。
通过需要解决α-半乳糖苷酶的受损害的活性启发的，本发明的发明人已经寻找到α-半乳糖苷酶（α-GAL）的稳定形式。更具体地，本发明的发明人已经预见，通常α-半乳糖苷酶的稳定形式将表现较长的持久的活性，包括血清中的较长的持久的活性。因此，本发明的发明人已经设计和成功地制备和实现天然的α-半乳糖苷酶的稳定形式，并且确实已经表明，这样的稳定的形式在溶酶体条件和在血清环境中，在增强的活性和/或较长的持久的活性方面，表现出改进的性能，其便于体内蛋白质的增强的活性。
本发明的发明人已经通过α-半乳糖苷酶单体之间的新的共价键的形成，证明了α-半乳糖苷酶的稳定形式的形成，其通过交联的天然α-半乳糖苷酶表现出改进的性能。
现在参考附图，图1和4示出了在溶酶体条件下，植物重组人类a-GALI（prh-a-GAL I）和和的酶活性的下降。图2和3示出了在模拟的生理条件下或在人类血浆中，相同的α-GAL变体的酶活性的下降。图2和4表明半乳糖减少α-GAL活性的下降的速度。
图5示出了根据本发明的可选实施方式的示例性PEG（聚乙二醇）交联剂。图6示出了根据本发明的可选实施方式的交联的α-GAL二聚体。
图7-10和37表明prh-α-GAL-I与包括N-羟基琥珀酰亚胺部分的典型的交联剂反应。图38表明在利用N-羟基琥珀酰亚胺的原位激活作用之后，prh-α-GAL-I与包括羧基基团的示例性交联剂反应。图7、37和38表明与交联剂的反应导致在变性的条件下，α-GAL主要地以二聚体形式而不是单体的形式出现，指示，通过共价交联维持α-GAL的四级结构。图11表明交联的α-GAL保留它的酶活性。
图12A-12C和39表明，在模拟的溶酶体条件下，交联的prhα-GAL-I比非交联的α-GAL表现出更长的持久的活性。PEG28和PEG45连接子比较短的PEG连接子的稳定性的增加更强。图13表明，在体内血浆中，交联的prh-α-GAL-I比非交联的a-GAL表现出更长的持久的活性。图14A-21表明，交联的prh-α-GAL-I在体内脾、肝、心脏和肾中表现增强的活性。PEG45连接子比较短的PEG连接子的α-GAL活性的增强更强。图15A、15B和19表明，尽管交联的prh-α-GAL-I在体内表现增强的活性，但该增强的活性不能如活性一样在肝中聚集。
上述结果表明交联的植物重组人类α-GAL-I导致具有改进的稳定性的二聚体，当体内给予时，其允许α-GAL活性更有效的增加。
类似地，图22-28D表明，交联的哺乳动物重组人类α-GAL导致共价连接的二聚体（图22-24B），其表现正常的酶活性（图25），以及在溶酶体条件下和在血浆中表现更长的持久的活性（图26A-26B），和在体内脾、肝、心脏和肾中表现增强的活性（图27A-28D）。
类似地，图29A-33L表明，交联的植物重组人类α-GAL II导致共价连接的二聚体（图29-30），其在溶酶体条件下和在血浆中表现更长的持久的活性（图31A-31B），和在体内血浆中和脾、肝、心脏和肾中表现增强的活性（图32A-33L）。如图33A-33L示出的，利用PEG45连接子的交联特别有效地增强体内活性。
这些结果表明交联的有利作用适用于多种α-GAL蛋白质。
图34A-34C表明，交联的α-GAL增强α-GAL酶催化的参数，扩大用于α-GAL活性的pH范围，并且在约7或更高的pH下允许α-GAL活性。
图35-36B表明，没有交联的聚乙二醇化对α-GAL没有显著的影响，指示，交联的有利影响特别是由于交联，而不是由于聚乙二醇化的影响。
图40-44表明根据本发明的实施方式的α-GAL的交联允许稳定性的良好再现性（图40A-40B），共价交联的程度（图41-43F）以及交联的α-GAL的酶性能（图44）。
本文呈现的结果表明，与α-半乳糖苷酶的天然形式相比，α-半乳糖苷酶的共价交联的多聚蛋白质结构的特征是在生理上相关的条件下，更高的稳定性和增强的活性。
因此，由于随着时间的过去，天然形式的活性的衰退比通过共价交联稳定的交联的多聚蛋白质结构的活性的衰退更迅速，共价连接的多聚蛋白质结构可表现出比α-半乳糖苷酶的天然形式的活性更高的活性。
同样由于更高的初始活性（例如，由于活性的不同参数），即，随着时间的过去，不取决于活性的任何衰退，共价交联的多聚蛋白质结构可表现出比a-半乳糖苷酶的天然形式的活性更高的活性。
因此，根据本发明的某些实施方式的方面，提供了多聚蛋白质结构，其包括彼此通过连接部分共价地连接的至少两个α-半乳糖苷酶单体。根据某些实施方式，如下面详细地描述的，多聚蛋白质结构展示比天然α-半乳糖苷酶的稳定性更高的稳定性，和/或比天然α-半乳糖苷酶的活性更高的初始活性。
本文，关于α-半乳糖苷酶的术语“单体”是指α-半乳糖苷酶的单独的多肽。该多肽可包括非-肽取代（例如，一个或更多个糖部分）。
本文，关于α-半乳糖苷酶的术语“天然的”包括这样的蛋白质，其包括基本上与天然存在的α-半乳糖苷酶蛋白质的氨基酸序列相同的氨基酸序列（例如，至少95％同源性，可选地至少99％同源性，和可选地100％）。天然α-半乳糖苷酶可以是从天然的来源分离的蛋白质，或重组生产的蛋白质（例如，来源于哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞）。
当使用关于α-半乳糖苷酶（例如，α-半乳糖苷酶二聚体）的四级结构时，术语“天然的”进一步包括基本上与天然地存在的蛋白质的四级结构相同的四级结构。
本文，相对于如果蛋白质是多聚形式的蛋白质，蛋白质的氨基酸序列，以及蛋白质的四级结构，短语“天然存在的蛋白质”是指自然界中（例如，在生物体中）存在形式的蛋白质。
可以存在、不存在天然存在的α-半乳糖苷酶蛋白质的翻译后修饰（例如，糖基化）（例如，在表达天然存在的α-半乳糖苷酶蛋白质的有机体中）或者在本文提及的α-半乳糖苷酶的天然形式中修饰。如上文描述的，假如α-半乳糖苷酶的天然形式保留基本上相似于天然存在的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列和结构，与天然存在的α-半乳糖苷酶的修饰相比，α-半乳糖苷酶的天然形式（例如，重组生产的α-半乳糖苷酶）可以可选地包括不同的翻译后修饰。
本文，蛋白质的天然形式可指单体结构（例如，α-半乳糖苷酶单体）和/或多聚体结构（例如，α-半乳糖苷酶二聚体）。例如，二聚蛋白质可被描述为α-半乳糖苷酶的天然形式，并且二聚蛋白质中的单体多肽可被描述为α-半乳糖苷酶单体的天然形式。
可选地，本文描述的多聚蛋白质结构是二聚结构，如是α-半乳糖苷酶的天然形式。
可替换地，多聚蛋白质结构包括多于两个α-半乳糖苷酶单体。例如，多聚蛋白质可以是由α-半乳糖苷酶单体组成的四聚体、六聚体、或八聚体。
本文描述的多聚蛋白质结构包括共价键，其连接其中的α-半乳糖苷酶单体，并且其是α-半乳糖苷酶的天然形式所缺少的。
可选地，连接α-半乳糖苷酶单体的连接部分是不在α-半乳糖苷酶的天然形式中存在的部分（例如，合成的连接部分）。
因此，例如，可选地，连接部分是共价地连接到侧链、N-末端或C-末端上的部分，或与α-半乳糖苷酶单体的翻译后修饰（例如，糖部分）有关以及连接到侧链、N-末端或C-末端上的的部分，或与另一α-半乳糖苷酶单体的翻译后修饰（例如，糖部分）有关的部分。在下文中详细地描述示例性的这样的连接部分。
可替换地，连接部分形成被连接的α-半乳糖苷酶单体的一部分（例如，侧链、N-末端或C-末端的一部分或与α-半乳糖苷酶单体和侧链、N-末端或C-末端的翻译后修饰（例如，糖部分）有关的部分，或与另一α-半乳糖苷酶单体的翻译后修饰（例如，糖部分）有关的部分）。
因此，例如，连接部分可以是在侧链、N-末端、C-末端或与单体（例如，胺）的翻译后修饰有关的部分的官能团，与侧链、N-末端、C-末端或与另一个单体（例如，羧基）的翻译后修饰有关的部分的互补官能团之间的共价键（例如，酰胺键），其中这样的共价键是a-半乳糖苷酶的天然形式所缺少的。也可以预期其他的共价键，例如，如酯键（在羟基和羧基之间）；硫酯键；醚键（在两个羟基基团之间）；硫醚键；酸酐键（在两个羧基之间）；硫代酰胺键；氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯键。
可选地，连接部分缺少二硫键。然而，在单体之间不形成连接的位置上包括二硫键的连接部分（例如，二硫键的断裂并不断开单体之间的连接）在本发明的该实施方式的范围内。缺少二硫键的连接部分的潜在的优势是，其对通过温和的还原条件，如二硫键的断裂，是不敏感的。
可选地，连接部分是非肽部分（例如，连接部分不由酰胺键、氨基酸、二肽、三肽、低聚肽或多肽组成。）
可替换地，连接部分可以是，或可包括，肽部分（例如，氨基酸、二肽、三肽、低聚肽或多肽）。
可选地，连接部分不仅仅是连接至其上的任何α-半乳糖苷酶单体的线性延伸（例如，不直接地将肽部分的N-末端和C-末端连接到任何α-半乳糖苷酶单体的C-末端或N-末端上）。
可替换地，通过α-半乳糖苷酶单体的N-末端与另一个α-半乳糖苷酶单体的C-末端的直接共价连接，形成连接部分，以便生产熔合的多肽。尽管在它们的天然形式中，它本质上可包括两个α-半乳糖苷酶单体，但是这样的多肽可能不会是α-半乳糖苷酶的天然形式。
然而，本文描述的α-半乳糖苷酶单体的共价连接优选是除了N-末端与C-末端的直接连接之外的形式。
连接部分也被称为交联部分。α-半乳糖苷酶单体通过连接部分的连接本文被称为“交联”。
交联部分可以是共价键、化学原子或基团（例如，C(=O)-O-基团、-O-、-S-、NR-、-N=N-、-NH-C(=O)-NH-等）或桥连部分（由化学基团的链组成）。
桥连部分可以是，例如，多聚基团或寡聚基团。
桥连部分是连接到侧链上的多官能部分（例如，二价自由基、三价自由基等），与翻译后修饰有关的部分（例如，糖部分）和/或两个或更多单体的末端（即，N-末端、C-末端）。
如本文在实施例部分中例证的，在不同的α-半乳糖苷酶单体之间，相对地短的连接部分（例如，PEG2、PEG4、PEG5）在交联上不如较长的连接部分（例如，PEG28、PEG45）有效。
因此，根据某些实施方式，连接部分不是共价键、化学原子或基团，但是为更合适的桥连部分。
因此，根据某些实施方式，连接部分是至少10个原子长，可选地至少20个原子长，可选地至少30个原子长，可选地至少50个原子长，可选地至少100个原子长，和可选地至少200个原子长。
本文，连接部分的长度（当以原子的数目表示时）是指连接部分的骨架的长度，即，许多原子在通过连接部分连接的两个单体的每一个的残基之间形成直链。
可选地，连接部分在某一尺寸之下，从而在形成的交联蛋白质中避免不必要的过多部分的连接部分，其可干扰蛋白质的功能。
因此，根据某些实施方式，每一个连接部分的特征在于分子量小于20KDa，可选地小于10KDa，可选地小于5KDa，和可选地小于3KDa。
为了促进交联，可选地，连接部分是基本上柔性的（灵活的），其中，主要旋转地释放连接部分的骨架中的键，例如，不能连接到双键上的单键（例如，和酰胺键不同），并且其中空间上不能阻碍旋转。可选地，旋转地释放至少70％，可选地至少80％、和可选地至少90％（例如，100％）的连接部分的骨架中的键。
在某些实施方式中，连接部分包括聚(亚烷基二醇)链。
如本文使用的，短语“聚(亚烷基二醇)”包括聚醚聚合物家族，其共有下列通式：-O-[(CH2)m-O-]n-，其中，m代表在每一个亚烷基二醇单元中存在的亚甲基基团的数目，并且n代表重复单元的数目，因此代表聚合物的大小或长度。例如，当m＝2时，聚合物被称为聚乙二醇，并且当m＝3时，聚合物被称为聚丙二醇。
在某些实施方式中，m是大于1的整数（例如，m＝2、3、4等）。
可选地，在聚(亚烷基二醇)链的单元中m值是可变化的。例如，聚(亚烷基二醇)链可以包括连接在一起的乙二醇（m=2）和丙二醇（m＝3）单元。
可选地，聚(亚烷基二醇)包括至少两个官能团（例如，如本文中描述的），每一个官能团与一个α-半乳糖苷酶单体形成共价键。可选地，官能团是聚(亚烷基二醇)的末端基团，使得聚(亚烷基二醇)的整个长度位于两个官能团之间。
短语“聚(亚烷基二醇)”也包括其类似物，其中用另一个杂原子例如如S、-NH-等代替氧原子。该术语进一步包括上述的衍生物，其中取代构成聚合物的一个或更多亚甲基基团。亚甲基基团上的示例性取代基包括但不限于，烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代、硫醇和硫代烷氧基等。
如本文中使用的，短语“亚烷基二醇单元”包含如上文描述的-(CH2)m-O-基团或其类似物，其形成聚(亚烷基二醇)的主链，其中(CH2)m（或其类似物）连接至属于另一个亚烷基二醇单元或属于α-半乳糖苷酶单体部分（在末端单元的情况下）的杂原子上，并且O（或其杂原子类似物）连接至另一个亚烷基二醇单元的(CH2)m（或其类似物）上，或连接到与α-半乳糖苷酶单体形成键的官能团上。
亚烷基二醇（烷撑二醇）单元可以是支链的，使得其可连接到3个或更多个邻近的亚烷基二醇单元上，其中，3个或更多个邻近的亚烷基二醇单元的每一个都是聚(亚烷基二醇)链的一部分。这样的支链亚烷基二醇单元通过其杂原子连接至一个邻近的亚烷基二醇单元，并且剩下的邻近的亚烷基二醇单元的杂原子各自连接至支链亚烷基二醇单元的碳原子。另外，杂原子（例如，氮）可结合亚烷基二醇单元的多于一个的碳原子，其中所述亚烷基二醇单元是聚(亚烷基二醇)的一部分，由此形成支链的亚烷基二醇单元（例如，[(-CH2)m]2N-等）。
在示例性实施方式中，至少50％的亚烷基二醇单元是相同的，例如，它们彼此之间包括相同的杂原子和相同的m值。可选地，至少70％、可选地至少90％、并且可选地100％的亚烷基二醇单元是相同的。在示例性实施方式中，连接至相同的亚烷基二醇单元上的杂原子是氧原子。在另外的示例性实施方式中，相同的单元的m是2。
在一个实施方式中，连接子是单一的、直链连接子，优选地是聚乙二醇（PEG）。
如本文中使用的，术语“聚（乙二醇）”描述如上文定义的聚(亚烷基二醇)，其中，至少50％、至少70％、至少90％、和优选地100％的亚烷基二醇单元是-CH2CH2-O-。类似地，本文将短语“乙二醇单元”定义为-CH2CH2O-的单元。
根据可选的实施方式，连接部分包括聚（乙二醇）或其类似物，其具有通式：
-X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2-
其中每一个X1和X2是与至少一个α-半乳糖苷酶单体形成共价键的官能团（例如，如本文描述的）；
Y是O、S或NR5（可选地O）；
可选地，n是从1至200的整数（可选地从5至150，并且可选地从40至70），尽管也可预期更高的n值；并且
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自由氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代、硫醇和硫代烷氧基组成的组。
在某些实施方式中，n至少是5，可选地至少是8，可选地至少是15，可选地至少是25，并且可选地至少是40。
在某些实施方式中，n不超过200，可选地不超过150，和可选地不超过70。
可选地，聚（乙二醇）或其类似物可包括共聚物，例如，其中，上述式中的CR1R2-CR3R4-Y单元彼此之间不是完全相同的。
在某些实施方式中，至少50％的CR1R2-CR3R4-Y单元是相同的。可选地，至少70％，可选地至少90％，和可选地100％的CR1R2-CR3R4-Y单元是相同的。
可选地，连接部分是支化的，例如，使得对于上述式中的一个或更多个CR1R2-CR3R4-Y单元，至少R1、R2、R3、R4和R5中的一个是-(CR1R2-CR3R4-Y)p-X3-，其中R1-R4和Y如上文定义，p是如本文中针对n定义的整数（例如，从1至200），并且X3是如本文中针对X1和X2定义的。
可选地，官能团可形成键，如，但不限于，酰胺键、酰胺键、酯键、和/或醚键。
例如，官能团可以可选地包括羰基基团，其与多肽中（例如，赖氨酸残基或N-末端中）的氮原子形成酰胺键，或与多肽中（例如，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基中）的氧原子形成酯键。
可替换地或另外地，官能团可以可选地包括杂原子（例如，N、S、O），其与多肽中（例如，谷氨酸或天冬氨酸残基中或C-末端中）的羰基基团形成酰胺键、酯键或硫酯键。
可替换的或另外，官能团可包括连接到多肽上的（例如，连接到多肽中的杂原子上的）烷基或芳基基团。
可替换地或另外，官能团可以可选地包括氮原子，其与α-半乳糖苷酶单体中的烷基形成胺键，或α-半乳糖苷酶单体可选地包括与官能团中的烷基基团形成酰胺键的氮原子。可通过还原的胺化作用形成这样的酰胺键（例如，如下文描述的）。
在某些实施方式中，至少一个官能团与多肽形成酰胺键（例如，与那里的赖氨酸残基形成酰胺键）。
官能团可以是彼此相同的或不同的。
在某些实施方式中，至少一个官能团连接到多肽的一个官能团上（例如，赖氨酸残基或N-末端的胺基团），并且至少一个官能团连接到多肽的不同官能团上（例如，半光氨酸残基的硫醇基团）。
根据可选的实施方式，本文描述的多聚蛋白质结构在人类血浆条件中和/或在溶酶体条件中表现高的稳定性。
如本文中使用的，短语“人类血浆条件”是指在37℃的温度下作为介质的人类血浆。
如本文中使用的，短语“溶酶体条件”是指在37℃的温度下作为介质的具有4.6的pH的水溶液（例如，本文描述的柠檬酸磷酸缓冲液）。
在溶酶体条件下的增强的稳定性是有利的，因为溶酶体是α-半乳糖苷酶的替代疗法的靶，因为溶酶体是体内α-半乳糖苷酶活性的标准的场所，并且溶酶体条件（例如，酸性pH）代表用于α-半乳糖苷酶的活性的最佳条件。
不受任何特定理论的约束，拒信血清样条件中增强的稳定性（例如，本文描述的人类血浆条件）也是有利的，因为由于来自细胞的流出物，血液中稳定的α-半乳糖苷酶可作用于在血液中存在的代谢物（例如，Gb3）。可选地，血清-活性的多聚蛋白质结构可有效地去除和预防血管壁内沉积的加速发炎的糖鞘脂（glycosphingolipids）[Bodary et al.,TCM 17(4):129-133]。例如，在法布里病中，由血管内皮中的Gb3的积聚产生的主要的发病机理导致小血管的血管闭塞，这些血管的局部缺血和梗塞以及肾、心脏和脑的局部缺血和梗塞[Desnick et al.,2003,Annals of InternalMedicine,138(4):338-346]。另外，血清中增强的稳定性不需要溶酶体运输。因此，ERT可变得更加容易获得，如可采用强大的成本有效的宿主系统，例如植物。
根据可选的实施方式，多聚蛋白质结构在人类血浆条件中的高稳定性是这样的，使得在经受人类血浆条件1小时后多聚蛋白质结构表现出至少比，在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时上后天然α-半乳糖苷酶的α-半乳糖苷酶的活性高10％、可选地高20％、可选地高50％、和可选地高100％的α-半乳糖苷酶活性。
可替换地或另外地，多聚蛋白质结构在人类血浆条件中的高稳定性是这样的，使得在人类血浆条件中，多聚蛋白质结构的α-半乳糖苷酶活性的减少比天然α-半乳糖苷酶的相应活性的减少更加缓慢。可选地，多聚蛋白质结构表现出在使蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的活性减少百分数，至少比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶的相应活性的减少百分数，低10％，可选地低20％，可选地低50％，和可选地低80％。
应该理解，本文比50％的减少“低10％”的减少是指45％的减少（45比50小10％），但是不是指40％的减少（50％-10％）。
可替换地或另外地，多聚蛋白质结构在人类血浆条件中的高稳定性是这样的，使得在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时，和可选地2、4或甚至6小时后，多聚蛋白质结构的α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变。
如本文中使用的，短语“基本上不变”是指保持在初始水平的50％至150％范围内的水平（例如活性），和可选地保持在初始水平的至少60％、可选地至少70％、可选地至少80％，和可选地至少90％的水平。
可选地，多聚蛋白质结构在溶酶体条件中的高稳定性是这样的，使得多聚蛋白质结构在经受溶酶体条件预定的时间段（例如，1天、2天、3天、1周）后，表现出至少比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件相同的预定时间段之后的天然α-半乳糖苷酶的活性高10％、可选地高20％、可选地高50％、和可选地高100％的α-半乳糖苷酶活性。
可替换地或另外地，多聚蛋白质结构在溶酶体条件中的高稳定性是这样的，使得在溶酶体条件中，多聚蛋白质结构的α-半乳糖苷酶活性的减少比天然α-半乳糖苷酶的相应活性减少更加缓慢。可选地，在使蛋白质结构经受溶酶体条件预定的时间段（例如，1天、2天、3天、1周）之后，多聚蛋白质结构表现出至少比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件相同的时间段之后，天然α-半乳糖苷酶的相应活性减少的百分数低10％、可选地低20％、可选地低50％、和可选地低80％的活性减少百分数。
可替换地或另外地，多聚蛋白质结构在溶酶体条件中的高稳定性是这样的，使得在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天、2天、3天、1周、2周、和/或1个月之后，多聚蛋白质结构的α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变。
如在本文实施例部分中例证的，除了随着时间的过去表现更多的稳定性之外，多聚蛋白质结构可表现出不同于天然α-半乳糖苷酶的参数的α-半乳糖苷酶活性的参数。
因此，根据可选的实施方式，独立于随着时间的过去活性的任何衰退，多聚蛋白质结构的特征是表现比蛋白质的天然形式的α-半乳糖苷酶活性高的α-半乳糖苷酶活性。可选地，活性比天然形式的相应活性高10％，和可选地高20％。
为了表征这样的活性，优选地，在使天然α-半乳糖苷酶或多聚蛋白质结构经受活性基本上减少的条件（例如，如本文描述的）之后（例如，在1小时内，在15分钟内）立即确定活性，使得测量的活性在本质上反映活性，而不是稳定性的程度。
可选地，多聚蛋白质结构被表征为在溶酶体条件中，表现出比天然α-半乳糖苷酶的相应活性高的α-半乳糖苷酶活性。
可替换地或另外地，多聚蛋白质结构的特征是，在中性pH的模拟的生理条件中，表现出比天然α-半乳糖苷酶的相应活性高的α-半乳糖苷酶活性。模拟的生理条件包括37℃的温度的水溶液（例如，磷酸盐缓冲盐水）。pH可选地是7。可替换地，pH是7.4。
本文描述的α-半乳糖苷酶活性是生物活性，其是α-半乳糖苷酶的特征（例如，α-半乳糖苷酶的催化活性特征，如底物的末端α-半乳糖基部分的水解）。
在某些实施方式中，通过在饱和状态下催化作用的速率（例如，Vmax值）来表征α-半乳糖苷酶的催化活性。
可替换地，α-半乳糖苷酶活性是治疗活性（例如，具有治疗作用的酶活性），如在法布里病的背景中的治疗活性。可选地，在实验室动物中（例如，法布里病小鼠），和可选地在人类法布里病患者中确定治疗活性。
技术人员将已知用于确定α-半乳糖苷酶的活性的技术。通常，α-半乳糖苷酶（例如，本文描述的天然形式或多聚蛋白质结构）与本领域识别的化合物接触，如α-半乳糖苷酶的底物，然后，定量地确定活性的程度。特别允许α-半乳糖苷酶活性的方便检测的化合物在本领域中是已知的并且是商业上可获得的。
在某些实施方式中，通过分析（测定）4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃葡糖酸苷（4-methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside）的水解来确定α-半乳糖苷酶活性（例如，如本文在实施例部分中描述的）。
在某些实施方式中，通过分析p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的水解来确定α-半乳糖苷酶活性（例如，如本文在实施例部分中描述的）。
当将本文描述的多聚蛋白质结构的活性与天然α-半乳糖苷酶的活性比较时，天然α-半乳糖苷酶优选地包括与多聚结构的α-半乳糖苷酶单体基本上相同（例如，关于氨基酸序列和糖基化模式）的α-半乳糖苷酶单体。
根据某些实施方式，通过在生理系统中（例如，人类或实验动物的血液、血清和/或血浆），比天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期高（例如，至少高20％、至少高50％、至少高100％、至少高400％、至少高900％）的循环半衰期来表征多聚蛋白质结构。
可选地，增加的循环半衰期可与较高的体外稳定性（例如，如本文描述的），较高的体内稳定性（例如，抗代谢）和/或其他因素（例如，减少的肾清除率）相关。
可通过在不同的时间间隔从生理系统中（例如，人类、实验动物）采取样品（例如，血液样品、组织样品），并且利用本领域已知的技术确定样品中的α-半乳糖苷酶的水平来确定循环半衰期。
可选地，根据终端半衰期（terminal half-life）来计算半衰期（例如，如实施例部分中描述的），其中，半衰期是在已经达到分布的准平衡之后，浓度（例如，血液浓度）减少50％需要的时间。可通过时间相对于对数浓度的线性回归，从时间与对数浓度的终端线性部分来计算终端半衰期（参考，例如，Toutain & Bousquet-Melou [J Vet Pharmacol Ther 2004,27:427-39]）。因此，由于药物排除，终端半衰期是药物血浆浓度减少的度量且不是由于其他原因的减少，并且不一定是给予的药物的量下降一半需要的时间。
确定α-半乳糖苷酶的水平（例如，多聚蛋白质结构或天然α-半乳糖苷酶）可以包括检测α-半乳糖苷酶的物理存在（例如，通过针对α-半乳糖苷酶的抗体）和/或检测α-半乳糖苷酶活性的水平（例如，如本文描述的）。
根据某些实施方式，通过将所述蛋白质结构给予脊椎动物（例如，人类、老鼠）之后在器官中（例如，脾、心脏、肾、大脑、肝脏）的α-半乳糖苷酶活性来表征多聚蛋白质结构，例如，患有α-半乳糖苷酶缺乏的脊椎动物（例如，人类法布里病患者，法布里病小鼠）。可选地，在脊椎动物的等价给予之后，器官中的α-半乳糖苷酶活性比器官中的天然α-半乳糖苷酶的α-半乳糖苷酶活性高。
器官中的活性可以是摄取α-半乳糖苷酶的功能和/或在摄取之后α-半乳糖苷酶活性的保持。
可选地，在给药之后2小时，和可选地在给药之后24小时，可选地3天，可选地7天，和可选地14天确定器官中的α-半乳糖苷酶活性。
在某些情形中，肝中α-半乳糖苷酶的增加的活性可与身体的其他部分中的较低的活性相关，因此，与α-半乳糖苷酶的减少的生物活性相关。
因此，在某些实施方式中，通过在除了肝之外的器官中的增强的α-半乳糖苷酶活性来表征多聚蛋白质结构。示例性的器官包括脾、心脏和肾。
在某些实施方式中，通过在给药（如本文描述的）之后，至少比在等价给药之后天然α-半乳糖苷酶的活性高20％，可选地至少高50％，可选地至少高100％，和可选地至少高300％的器官中增强的α-半乳糖苷酶活性来表征多聚蛋白质结构。如上文中注意到的，本发明的发明人已经通过交联的α-半乳糖苷酶单体的多聚结构，设计和成功地制备并实施了α-半乳糖苷酶的稳定形式。
可选地，例如，为了促进给予人类受试者的最佳的生物适应性，α-半乳糖苷酶是人类α-半乳糖苷酶（例如，重组人类α-半乳糖苷酶）。人类α-半乳糖苷酶是商业上可获得的，例如，(α-半乳糖苷酶，Shire)和(β-半乳糖苷酶，Genzyme)。
此处，“人类α-半乳糖苷酶”是指这样的α-半乳糖苷酶，其包括与在人类中天然存在的α-半乳糖苷酶蛋白质的氨基酸序列基本上相同（例如，如上文中描述的）的氨基酸序列。
在某些实施方式中，α-半乳糖苷酶是植物重组α-半乳糖苷酶。示例性的α-半乳糖苷酶包含植物重组人类α-半乳糖苷酶。
α-GAL的实例包括但不限于具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3组成的组中的氨基酸序列的α-GAL。可选地，α-GAL具有选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列。
如本文中使用的，“α-半乳糖苷酶”是指对Gb3中的半乳糖部分（例如，α-半乳糖苷酶A）表现出酶活性（例如，水解）的任何蛋白质。可选地，“α-半乳糖苷酶”是指E.C.3.2.1.22。
可通过重组DNA技术来纯化（例如，从植物或动物组织中）或生产本发明的实施方式的α-半乳糖苷酶。
如本文描述的，血清中的α-半乳糖苷酶的活性例如对于减少血清中的Gb3水平可以是高度有利的。
因此，在某些实施方式中，α-半乳糖苷酶是碱性α-半乳糖苷酶。
如本文中使用的，短语“碱性α-半乳糖苷酶”是指通过在中性至碱性pH条件下（例如，约pH 7-7.5），特别地在中性血清pH（例如，约7.35-7.45），从含有半乳糖的低聚糖中水解终端连接的α-半乳糖部分的能力表征的α-GAL。
应该理解，本发明的某些实施方式的碱性α-GAL可以在中性至碱性pH条件下是活性的，但是在酸性pH条件下（即，约4.6）仍然可显示活性。
在具体实施方式中，酶在酸性至碱性pH条件下（即，约pH 4.2-7.5）是活性的。
在还有的另一个具体实施方式中，酶在约6.5-7.5的pH下是活性的。
在美国专利申请20070036883、WO03/097791和在PCT/IL2010/000956中提供了可以按照本教导使用的碱性α-半乳糖苷酶的具体实例，将其每一个的全部内容通过引用并入本文中。
因此，碱性α-半乳糖苷酶可以是选自由葫芦科、唇形科（Lamiaceae）、胡椒科（Piperaceae）、茄科（Solanaceae）、豆科、十字花科和禾本科组成的组的植物家族的成员。
根据具体实施方式，碱性α-半乳糖苷酶来自瓜。
P.-R.Gaudreault和J.A.Webb已经在几个出版物中（如"Alkalinealpha-galactosidase in leaves of Cucurbita pepo",Plant Sci.Lett.24,281-288,1982,"Partial purification and properties of an alkaline alpha-galactosidasefrom mature leaves of Cucurbita pepo",Plant Physiol.,71,662-668,1983,and"Alkaline alpha-galactosidase activity and galactose metabolism in thefamily Cucurbitaceae",Plant Science,45,71-75,1986）描述了从葫芦瓜果的嫩叶中纯化的新的α-半乳糖苷酶，其在碱性条件下（pH 7.5）具有最佳的活性。除了碱性α-半乳糖苷酶之外，他们也报道了酶的三种酸形式，并且发现了酸性和碱性形式的不同的底物偏好。
已经在其他葫芦科组织中观察到了α-半乳糖苷酶在碱性pH下的活性，如黄瓜花梗、嫩南瓜果实和嫩瓜果（"Melons:Biochemical andPhysiological Control of Sugar Accumulation",In:Encyclopedia ofAgricultural Science,vol.3,pp.25-37,Arntzen,C.J.,et al.,eds.AcademicPress,New York,1994）。
Bachmann等人（"Metabolism of the raffinose family oligosaccharides inleaves of Ajuga reptens L.",Plant Physiology 105:1335-1345,1994）发现，来自不相关的唇形科家族的匍匐筋骨草（常见的喇叭花）、水苏糖转运体（stachyose translocator）也含有碱性α-半乳糖苷酶。部分地表征和发现该酶对水苏糖具有高亲和力。同样，来自胡椒科的红背椒草（Peperomiacamptotricha L.）植物的叶，在碱性pH下显示α-半乳糖苷酶活性，表明，它们也含有碱性α-半乳糖苷酶（Madore,M.,"Catabolism of raffinosefamily oligosaccharides by vegetative sink tissues",In:Carbon Partitioningand Source-Sink Interactions in Plants,Madore,M.and Lucas,W.J.(eds.)pp.204-214,1995,American Society of Plant Physiologists,Maryland）。类似地，Gao和Schaffer（Plant Physiol.1999;119:979-88，将其全部内容通过引用并入本文）已经报道了，α-半乳糖苷酶活性在来自许多物种的组织的天然提取物中具有碱性pH最佳值，其中所述物种包括葫芦和锦紫苏（唇形科）家族的成员。
在SEQ ID NOs:4、5和13(甜瓜（Cucumis melo）)、6(番杏（T.tetragonioides）)、7和12(黄瓜（Cucumis sativus）)、8和9(玉米（Zea mays）)、10(水稻（Oruza sativa）)、11(豌豆（Pisum sativum）)和14(小果咖啡(小粒咖啡，阿拉伯咖啡，Coffea arabica）)中提供了植物碱性α-半乳糖苷酶序列的具体实例。
在某些实施方式中，α-半乳糖苷酶是酸性α-半乳糖苷酶。
如本文中使用的，“酸性α-半乳糖苷酶”是指通过在酸性pH条件下（例如，约pH 4.2-5），如在溶酶体中出现的条件下，从含有半乳糖的低聚糖中水解末端-连接的α-半乳糖部分的能力表征的α-半乳糖苷酶。
本发明的实施方式的α-半乳糖苷酶可以是任何人类、动物或植物来源的α-半乳糖苷酶，只要在体内给予（例如将植物给予人）之后，没有过分地诱导有害的免疫学反应。
为了减少免疫学反应，可联合给予非人类α-半乳糖苷酶制剂（例如，植物α-半乳糖苷酶制剂）与人类α-半乳糖苷酶（例如，酸性人类α-半乳糖苷酶）。
可选地，多聚蛋白质结构进一步包括至少一个甘露糖-6-磷酸（M6P）部分。可将M6P部分（或多个部分）连接到多聚蛋白质结构的一个或更多α-半乳糖苷酶单体上（例如，通过连接子）。
在WO 2009/024977中描述了用于将含有M6P的部分引入到生物分子（例如，多肽）中的技术和试剂。
如本文在实施例部分中例证的，可通过使α-半乳糖苷酶与交联剂反应而方便地制备本文描述的多聚蛋白质结构。
因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了制备本文描述的多聚蛋白质结构的方法。该方法包括使α-半乳糖苷酶反应，从而引入至少一个连接部分，其共价地连接至少两个α-半乳糖苷酶单体。
可选地，连接部分是连接一个α-半乳糖苷酶单体和另一个α-半乳糖苷酶单体的键（例如，酰胺键、二硫键）。可选地，通过利用适当的条件和/或试剂来引入键。例如，适于由羧酸基团和胺基团形成酰胺键的试剂是本领域中已知的。
可选地，连接部分是分子，其不是来源于α-半乳糖苷酶的部分。例如，连接部分可以是低聚物、聚合物、小分子的残基（例如，氨基酸）。
在某些实施方式中，通过使α-半乳糖苷酶与交联剂反应而引入连接部分，其中所述交联剂包括连接部分（例如，如本文描述的）和至少两个反应基团。
可选地，α-半乳糖苷酶在其中天然α-半乳糖苷酶是二聚体形式的条件下反应。
在某些实施方式中，交联剂与α-半乳糖苷酶以在从5:1至500:1（交联剂:α-半乳糖苷酶单体）范围，可选地在从50:1至400:1的范围，和可选地在从75:1至300:1（例如，约100:1，约200:1）范围内的摩尔比反应。
所述方法可选地进一步包括纯化交联的蛋白质，例如，除去过多的交联剂。可使用常见的纯化方法，如利用适当的分离膜（cut-off membranes）的透析和/或超滤，和/或另外的色谱分析步骤，包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱等。
选择适合于经历化学反应的反应基团，其中所述化学反应导致在α-半乳糖苷酶单体中形成具有互补官能团的键。可选地，每一个反应基团能够在本文描述的连接部分和至少一个多肽之间形成共价键（例如，如本文描述的，从而形成与多肽连接的官能团）。
交联剂的反应基团可以是彼此相同的或不同的。
如本文中使用的，短语“反应基团”描述能够经历通常导致键形成的化学反应的化学基团。根据本实施方式，键优选地是共价键（例如，对于每一个反应基团）。导致键形成的化学反应包括，例如，亲核的和亲电子的取代、亲核的和亲电子的加成反应、烷化、加成-消除反应（addition-elimination reactions）、环化加成反应、重排反应和涉及官能团的任何其他已知的有机反应、以及它们的组合。
反应基团可以可选地包括非反应的部分（例如，烷基），例如，其可用于将反应基团的反应部分连接至本文描述的连接部分（例如，聚(亚烷基二醇)或其类似物）。
优先选择反应基团，使得能够使它与α-半乳糖苷酶结合。示例性的反应基团包括，但不限于，羧酸酯（羧化物）（例如，-CO2H）、硫醇（-SH）、氨基（胺）（-NH2）、卤素、叠氮化物（-N3）、异氰酸酯（异氰酸根）（-NCO）、异硫氰酸酯（-N=C=S）、羟基（-OH）、羰基（例如，醛基）、马来酰亚胺、硫酸酯、磷酸酯、磺酰基（例如，甲磺酰基、甲苯磺酰基）等，以及活化的基团，如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（例如，NHS酯）、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺、酸酐、酰基卤（-C(=O)-卤素）等。
在某些实施方式中，反应基团包括离去基团，如易于亲核取代的离去基团（例如，卤素、硫酸酯、磷酸酯、羧酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺）。
可选地，反应基团可以为它的活化形式。
如本文中使用的，短语“活化形式”描述比化学基团更易起反应的化学基团的衍生物（例如，反应基），因此，其能容易地经历导致键形成的化学反应。活化形式可包括特别合适的离去基团，由此促进取代反应。例如，-C(=O)-NHS基团（N-羟基琥珀酰亚胺酯，或-C(＝O)-O-琥珀酰亚胺）是众所周知的-C(=O)OH的活化形式，如可使NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）与-C(=O)OH反应，从而形成-C(＝O)-NHS，其容易地反应从而形成包括-C(=O)OH基团的反应的产物特征，如酰胺和酯。
可通过不同的基团、原子或键将反应基团与其余的连接部分连接（例如，聚(亚烷基二醇)或其类似物）。这些可包括醚键[例如，-O-烷基-]、酯键[例如，-O-C(=O)-烷基-]、氨基甲酸酯[例如，O-C(=O)-NH-烷基-]等。因此，可采用多种末端基团。
下列是可构成本文描述的反应基团的不同的基团的非限制性实例：-CH2CO2H、-CH2CH2CO2H、-CH2CH2SH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2N3、-CH2CH2NCO、-CH2-C(=O)-NHS、-CH2CH2-C(=O)-NHS、-C(=O)-CH2-C(=O)-NHS、-CH2CH2-NHC(=O)CH2CH2-马来酰亚胺等。
每一个上述反应基团中的亚甲基基团的数目仅仅是示例性的，并且可进行改变。
反应基团也可以包括在聚(亚烷基二醇)链（例如，-OH）的末端上的杂原子。
在本发明的示例性实施方式中，反应基团包括羧酸酯（例如，活化的羧酸酯如N-羟基琥珀酰亚胺酯）。
可选地，使反应基团与α-半乳糖苷酶中（例如，赖氨酸残基和/或N-末端）的胺基团反应，从而形成酰胺键。
在某些实施方式中，反应基团的反应包括还原胺化，其中胺基团与醛基团反应，从而形成亚胺，并且还原亚胺（例如，通过还原剂的添加，如氰基硼氢化钠（sodium cyanoborohydride））以形成酰胺键。反应基团可以是与α-半乳糖苷酶的醛基反应的胺基团（例如，连接到蛋白质的多肽上的糖部分），或反应基团可以是与α-半乳糖苷酶的胺基团反应的醛基基团（例如，在赖氨酸残基上）。可选地，在反应基团与α-半乳糖苷酶的反应之前，通过氧化剂来氧化α-半乳糖苷酶的糖部分，从而形成醛基团。例如，具有高碘酸钠的糖的反应可用于在糖部分中产生一对醛基团。
在某些实施方式中，选择至少一个反应基团，从而与α-半乳糖苷酶单体的一个官能团反应（例如，赖氨酸残基或N-末端的胺基团），并且选择至少一个反应基团从而与α-半乳糖苷酶单体的不同的官能团反应（例如，半光氨酸残基的硫醇基团）。
可选地，为了获得含有M6P的多聚蛋白质结构（例如，如本文描述的），使得本文描述的一个或更多个多肽与糖基化试剂反应，从而引入一个或更多M6P部分。例如，在WO 2009/024977中描述了适当的含有M6P的糖基化试剂及其应用。
如本文中使用的，术语“胺”和“氨基”是指任一种-NR’R”基团，其中R’和R”选自由氢、烷基、环烷基、杂脂环族（通过环碳连接的）、芳基和杂芳基（通过环碳连接的）组成的组。通过它的碳原子连接R’和R”。可选地，R’和R”选自由氢和包括1至4个碳原子的烷基组成的组。可选地，R’和R”是氢。
如在整个本文中使用的，术语“烷基”是指包括直链和支链基团的饱和脂肪族烃。优选地，烷基基团具有1至20个碳原子。当在数字范围内时，例如，本文规定“1-20”，这暗示，在烷基基团的这种情况中，基团可含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，可达且包括20个碳原子。更优选地，烷基是具有1至10个碳原子的中等大小的烷基。最优选地，除非另外指明，否则烷基是具有1至4个碳原子的较小的烷基。烷基基团可以是取代的或未取代的。当被取代时，如根据本文定义的这些术语，取代基团可以是，例如，环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫醇基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基（phosphonyl）、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、G-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基、和氨基。
“环烷基”基团是指全部碳单环的或稠合环（例如，共有邻近的一对碳原子的环）基团，其中一个或更多环不具有完全共轭的π电子系统。环烷基基团的非限制性的实例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己胺、环己二烯、环庚烷、环庚三烯（cycloheptatriene）、和金刚烷。环烷基基团可被取代或未被取代。当被取代时，如根据本文定义的这些术语，取代基团可以是，例如，烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫醇基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基、和氨基。
“烯基”基团是指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的烷基基团。
“炔基”基团是指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的烷基基团。
“芳基”基团是指具有完全共轭的π电子系统的完全-碳单环的或稠合的多环的（例如，共有邻近的一对碳原子的环）基团。芳基基团的非限制性的实例是苯基、萘基和蒽基。芳基基团可以被取代或未被取代。当被取代时，如根据本文定义的这些术语，取代基团可以是，例如，烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫醇基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基、和氨基。
“杂芳基”基团是指在一个或多个环中具有一个或更多个原子如，例如，氮、氧和硫，和另外，具有完全共轭的π电子系统的单环的或稠合的环（例如，共有邻近的一对原子的环）基团。杂芳基基团的非限制性的实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基基团可以被取代或未被取代。当被取代时，如根据本文定义的这些术语，取代基团可以是，例如，烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫醇基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基、和氨基。
“杂脂环族”基团是指在一个或多个环中具有一个或更多个原子如氮、氧和硫的单环或稠合环基团。所述环也可具有一个或更多个双键。然而，所述环不具有完全共轭的π电子系统。杂脂环族可以被取代或未被取代。当被取代时，取代的基团可以是，例如，孤对电子，烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫醇基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺基、N-酰胺基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基、和氨基，如本文定义的这些术语。代表性的实例是哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。
“羟基”基团是指-OH基团。
“叠氮化物”基团是指-N=N+=N-基团。
如本文定义的，“烷氧基”基团是指-O-烷基和-O-环烷基基团两者。
如本文定义的，“芳氧基”基团是指-O-芳基和-O-杂芳基基团两者。
“醚”是指烷氧基和芳氧基基团两者，其中该基团连接至烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环肪族基团。
醚键描述-O-键。
“硫代羟基”或“硫醇（硫羟）”基团是指-SH基团。
如本文定义的，“硫代烷氧基”基团是指-S-烷基基团和-S-环烷基基团两者。
如本文定义的，“硫代芳氧基”基团是指-S-芳基和-S-杂芳基基团两者。
“硫醚”是指硫代烷氧基和硫代芳氧基基团两者，其中该基团连接至烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂脂环族基团。
硫醚键描述-S-键。
“二硫化物”基团是指-S-硫代烷氧基和-S-硫代芳氧基基团两者。
二硫键描述-S-S-键。
“羰基”基团是指-C(=O)-R’基团，其中R’是如在上文中定义。
“硫代羰基”基团是指-C(=S)-R'基团，其中R’如在本文中定义。
“羧基”是指“C-羧基”和“O-羧基”两者。
“C-羧基”基团是指-C(=O)-O-R’基团，其中R’如在本文中定义。
“O-羧基”基团是指R’C(=O)-O-基团，其中R’如在本文中定义。
“氧代”基团是指＝O基团。
“羧酸酯”或“羧基”包括如本文定义的C-羧基和O-羧基两者。
“羧酸”基团是指C-羧酸基团，其中R’是氢。
“硫代羧基”或“硫代羧酸酯”基团是指-C(=S)-O-R’和-O-C(=S)R’基团两者。
“酯”是指C-羧基基团，其中R’不是氢。
酯键是指-O-C(=O)-键。
硫酯键是指-O-C(=S)-键或指-S-C(=O)键。
“卤素”基团是指氟、氯、溴或碘。
“亚磺酰基”基团是指-S(=O)-R’基团，其中R’如在本文中定义。
“磺酰基”基团是指-S(=O)2-R’基团，其中R’如在本文中定义。
“磺酸酯”基团是指-S(=O)2-O-R’基团，其中R’如在本文中定义。
“硫酸酯”基团是指-O-S(=O)2-O-R’基团，其中R’如在本文中定义。
如本文定义的，“磺酰胺”或“亚磺酰氨基（sulfoamido）”基团包括S-亚磺酰氨基和N-亚磺酰氨基基团两者。
“S-亚磺酰氨基”基团是指-S(=O)2-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“N-亚磺酰氨基”基团是指R’S(=O)2-NR”基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“O-氨基甲酰”基团是指-OC(=O)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“N-氨基甲酰”基团是指R’OC(＝O)-NR”-基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“氨基甲酰”或“氨基甲酸酯”基团包括O-氨基甲酰和N-氨基甲酰基团。
氨基甲酸酯键描述-O-C(＝O)-NR’-键，其中R’如本文中定义的。
“O-硫代氨基甲酰”基团是指-OC(=S)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“N-硫代氨基甲酰”基团是指R’OC(=S)NR”-基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“硫代氨基甲酰”或“硫代氨基甲酸酯”基团包括O-硫代氨基甲酰和N-硫代氨基甲酰基团。
硫代氨基甲酸酯键描述-O-C(=S)-NR’-键，其中R’如本文描述。
“C-酰胺基”基团是指-C(=O)-NR’R”基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“N-酰胺基”基团是指R’C(=O)-NR’’-基团，其中R’和R”各自如本文中定义的。
“酰胺”基团包括C-酰胺基和N-酰胺基基团两者。
酰胺键描述-NR’-C(=O)-键，其中R’如在本文中定义。
胺键描述胺基团（如本文定义的）中的氮原子和胺基团中的R’基团之间的键。
硫代酰胺键描述-NR’-C(=S)-键，其中R’如在本文中定义。
“脲”基团是指-N(R’)-C(=O)-NR’’R”’基团，其中R’和R”各自如本文中定义，并与本文定义的R’和R”一样定义R”’。
“硝基”基团是指-NO2基团。
“氰基”基团是指-C≡N基团。
术语“膦酰基”或“膦酸酯”描述-P(=O)(OR’)(OR”)基团，其中R’和R”如上文中定义的。
术语“磷酸酯”描述-O-P(=O)(OR’)(OR”)基团，其中R’和R”各自如上文中定义。
“磷酸”是其中每一个R是氢的磷酸酯基团。
术语“氧膦基”描述-PR’R”基团，其中R’和R”各自如上文中定义。
术语“硫脲”描述-N(R’)-C(=S)-NR”-基团，其中R’和R”各自如上文中定义。
如本文描述的，本文描述的多聚蛋白质结构在体内治疗重要的部位上，可表现出改进的稳定性和更强的和/或更长的持久的α-半乳糖苷酶活性。因此，这样的多聚蛋白质结构非常有利于在其中期望α-半乳糖苷酶活性的各种医学应用中使用，包括治疗和研究应用。
因此，根据某些实施方式，本文描述的多聚蛋白质结构被用作药物，例如，用于治疗法布里病的药物。
根据本发明实施方式的另一个方面，提供了治疗法布里病的方法，该方法包括给予需要其的受试者治疗有效量的本文描述的多聚蛋白质结构。
根据本发明实施方式的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包括如本文描述的多聚蛋白质结构和药用载体。
如本文中使用的，“药物组合物”是指一个或更多本文描述的多聚蛋白质结构与其他化学成分，如药用的和适当的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的用途是便于将化合物给予生物体。
在下文中，术语“药用载体”是指不对生物体引起显著的刺激和不取消给予的化合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。载体的非限制性的实例是：丙二醇、盐水、有机溶剂与水的乳剂和混合物、以及固体（例如，粉末状的）和气体载体。
此处，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中从而进一步促进化合物的给予的惰性物质。赋形剂的非限制性的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉的类型、纤维素衍生物、凝胶、植物油和聚乙二醇。
可选地，药物组合物包括另外的成分，其进一步稳定多聚蛋白质结构的α-半乳糖苷酶。可选地，另外的成分是半乳糖。
可替换地，可使用半乳糖衍生物（例如，含有半乳糖的糖苷）代替半乳糖。可选地，使用非还原的半乳糖衍生物。
可在最新版本的“Remington's Pharmaceutical Sciences”MackPublishing Co.,Easton,PA中发现药物的配方和给药的技术，将其通过引用并入本文中。
可通过本领域已知的方法来制造本发明的药物组合物，例如，通过传统的混合、溶解、粒化、糖衣丸-制造、磨细、乳化、包封、俘获或冻干方法。
因此，可以以传统的方式，利用包括赋形剂和辅助剂的一种或更多种药用载体，配制根据本发明使用的药物组合物，其促进将多聚蛋白质结构加工成药物学上可使用的制剂。正确的配方取决于选择的给药的途径。
关于注射或输注，可以在水溶液中配制本发明实施方式的多聚蛋白质结构，优选地在生理学上兼容的缓冲液中，如汉克斯溶液、林格氏溶液、或含有或没有有机溶剂如丙二醇、聚乙二醇的生理学上的盐水缓冲液。
关于经粘膜给药，在配方中使用渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
关于给药，可容易地通过使多聚蛋白质结构与本领域众所周知的药用载体结合来配制本发明的多聚蛋白质结构。这样的载体能够将本文描述的多聚蛋白质结构配制成适于患者口服摄取的药片、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等。可利用固体赋形剂，可选地研磨合成的混合物，和加工颗粒的混合物，之后如果需要加入适当的辅助剂，从而获得药片或糖衣丸核来制造用于口服使用的药物制剂。特别地，这样的赋形剂是，填充物如糖，包含乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、凝胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。如果需要，可加入崩解剂（，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或褐藻酸或其盐如褐藻酸钠。
提供具有适当包衣的糖衣丸核。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可选地可含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶（carbopolgel）、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到药片或糖衣丸包衣中，以便识别或表征活性的多聚蛋白质结构的剂量的不同组合。
可口服使用的药物组合物包含由凝胶制造的推入配合胶囊，和由凝胶和增塑剂制造的软的、密封的胶囊，如甘油或山梨糖醇。推入配合胶囊可在具有装填物如乳糖，粘合剂如淀粉，润滑剂如滑石或硬脂酸镁和，可选地，稳定剂的混合物中含有活性成分。在软胶囊中，可在适当的液体中溶解或悬浮多聚蛋白质结构，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。用于口服给药的所有配方（剂型）应该在适于选择的给药途径的剂量中。
对于口腔给药，组合物可采取以传统的方式配制的药片或锭剂的形式。
对于通过吸入给药，根据本发明的实施方式使用的多聚蛋白质结构，可容易地从加压的包装或喷雾器中以气雾剂呈现（其一般包含粉末状的、液化的和/或气态的载体）的形式递送，其中使用适当的推进物，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压的气溶胶的情况中，可通过提供阀门确定剂量单元，以便递送定量供给的量。可配制含有多聚蛋白质结构和适当的粉末基质如，但不限于，乳糖或淀粉的粉末混合物的凝胶的胶囊或药包，其用于例如吸入器或吹药器。
本文描述的多聚蛋白质结构可配制例如，通过大药丸注射或连续输注用于肠胃外给药。可在单位剂型中呈现用于注射或输注的配方，例如，在安瓿中或在可选地具有加入的防腐剂的多剂量容器中。组合物可以是悬浮液、油或含水介质中的溶液或乳剂，并且可含有配方剂（formulatoryagents）如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水可溶形式中的多聚蛋白质结构制剂的水溶液。另外，可将多聚蛋白质结构的悬浮液制备成适当的油注射悬浮液和乳剂（例如，油包水、水包油或油乳剂中的油包水）。适当的亲脂性溶剂或载体包含脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水注射悬浮液可含有增加悬浮液的粘度的物质，如羧甲酸纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬浮液也可含有适当的稳定剂或药剂，其增加多聚蛋白质结构的溶解性，以便于制备高度浓缩的溶液。
可替换地，多聚蛋白质结构可以是粉末形式，以便与适当的介质形成结构体，例如，在使用之前，消过毒的无制热原水。
也可利用，例如，传统的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯，在直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂中配制本发明的实施方式的多聚蛋白质结构。
本文描述的药物组合物也可包括凝胶相载体或赋形剂的适当的固体。这样的载体或赋形剂的实例包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、凝胶和聚合物如聚乙二醇。
适用于本发明的背景中的药物组合物包含其中含有实现预期用途的效果的有效量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意味着有效预防、减轻或改善疾病的症状或延长正在被治疗的受试者的生存的多聚蛋白质结构的量。
关于本发明的方法中使用的任何多聚蛋白质结构，最初可从动物活性测定中估计治疗有效量或剂量。例如，可在动物模型中配制剂量，以便达到循环浓度范围，其包含如通过活性测定确定的IC50（例如，检验蛋白质结构的浓度，其在多聚蛋白质结构的生物活性中达到最大的增加的一半）。这样的信息可用于更加精确地确定人类中有用的剂量。
如在下列实施例部分中证明的，用于本发明实施方式的多聚蛋白质结构的治疗有效量的范围可在约1μg/kg体重到约500mg/kg体重之间。
可在实验动物中，通过标准的药物学程序来确定本文描述的多聚蛋白质结构的毒性和治疗效力，例如，通过确定用于受试者蛋白质结构的EC50、IC50和LD50（引起检验动物的50％死亡的致死剂量）。从这些活性测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量的范围。
可取决于采用的剂量形式和利用的给药途径来改变剂量。考虑到患者的情况，可通过个体医师选择精确的配方、给药途径和剂量（参见，例如，Fingl et al.,1975,in“The Pharmacological Basis of Therapeutics”,Ch.1p.l）。
可单独地调整剂量总量和时间间隔，以便提供足以维持期望的效果的活性部分的血浆水平，称为最小有效浓度（MEC）。每一个制剂的MEC将不同，但是可从体外数据中估计MEC；例如，达到期望的体外活性的水平所需要的浓度。达到MEC所需要的剂量将取决于个体的特征和给药的途径。HPLC测定或生物测定可用于确定血浆浓度。
也可利用MEC值来确定剂量时间间隔。应该利用治疗方案来给予制剂，其在10-90％的时间，优选在30-90％之间和更优选地50-90％的时间维持高于MEC的血浆水平。
取决于要治疗的病症的严重性和反应性，剂量给药也可以是上文描述的缓慢释放组合物的单一给药，具有从几天到几周持久的疗程，或直到实现治愈或达到疾病状态的减小。
当然，要给予的组合物的量将取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性、给药的方式、处方医师的判断等。
如果期望，可在包装或分配器设备中提供本发明的组合物，如FDA（美国食品和药物管理）批准的试剂盒，其可含有一个或更多个单位剂量形式，其含有活性成分。例如，包装可包括金属或塑料箔，如，但不限于吸塑包装或压力容器（用于吸入）。给药的用法说明可伴随包装或分配器设备。包装或分配器也可伴随容器关联的提示，其中所述容器在通过调节医药品的制造、使用或出售的政府机构规定的形式中，其中所述提示是由于人类或兽医给药的组合物的形式的作用批准的反射。例如，这样的提示可以是美国食品和药物管理批准的处方药物标记的提示，或批准的产物插入物的提示。如本文详细地描述的，也可制备包括本发明实施方式的多聚蛋白质结构的组合物、将其放置在适当的容器中，和标注指示的病症的治疗或诊断，其中在兼容的药物学载体中配制所述多聚蛋白质结构。
因此，如上文中描述的，根据本发明的实施方式，取决于选择的多聚蛋白质结构，在包装材料中包装本文描述的药物组合物，并且在包装材料中或上的印刷中识别所述药物组合物，用于其中多聚蛋白质结构的活性是有益的病症的治疗。
如本文中使用的，术语“约”是指±10%。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”以及它们的变化是指“包括但不限于”。
术语“由...组成”是指“包含且限于”。
单词“示例性的”本文用于指“用作实例、例子或说明”。不一定将描述为“示例性的”任何实施方式解释为相对于其他实施方式优选的或有利的实施方式，和/或解释为排除其他实施方式特征的结合。
单词“可选地”本文用于指“在某些实施方式中提供但是在其他实施方式中不提供”。除非这样的特征冲突，否则本发明的任何具体实施方式可包括多个“可选的”特征。
如本文中使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该（所述）”包括复数的参考。例如，术语“化合物”或“至少一个化合物”可包括多个化合物，包含其混合物。
在整个本申请中，可以以范围格式（range format）来提供本发明的各种实施方式。应该理解，范围格式中的描述仅仅用于方便和简短，且不应该被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述具体地公开了所有可能的子范围，以及在所述范围内的单独的数值。例如，应该认为，从1至6的范围的描述具体地公开了例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及所述范围内的单独的数字，例如，1、2、3、4、5和6。该应用不拘于所述范围的宽度。
只要本文指示数字范围，其是指包括指示的范围内的任何引用的数字（份数或整数）。本文可互地使用在第一指示数字和第二指示数字之间的短语“排列/范围”，和从第一指示数字“至”第二指示数字的“排列/范围”，并且是指包括首先和第二指示的数字以及其间的所有的份数和整数。
如本文中使用的，术语“方法”是指用于完成给定的任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于，已知的，或通过化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者容易地从已知的方式、手段、技术和程序发展的那些方式、手段、技术和程序。
如本文中使用的，术语“治疗”包含消除、基本上抑制、减慢或反转病症的进展，基本上改善病症的临床或审美的症状，或基本上预防病症的临床或审美的症状的出现。
应该理解，也可结合单个实施方式提供本发明的某些特征，为了清楚起见，在单独的实施方式的背景中描述本发明的某些特征。相反地，也可单独地或以任何适当的亚组合的形式或在本发明的任何其他描述的实施方式中适当的组合中提供本发明的各种特征，为了清楚起见，在单个实施方式的背景中描述本发明的某些特征。不能认为在各种实施方式的背景中描述的某些特征是那些实施方式的必要特征，除非在没有那些要素的情况下，所述实施方式不起作用。
在下列实施例中发现，如上文描写的和如下面权利要求中要求的本发明的各种实施方式和方面的实验支持。
实施例
现在参考下列实施例，其与上面描述一起以非限制性的方式来说明本发明的某些实施方式。
材料和方法
材料：
从Iris Biotech GmbH的PEG8和2000道尔顿（PEG45）PEG形式中，以及从Pierce的PEG5形式中获得二-N-琥珀酰亚胺-聚(乙二醇)（二-NHS-PEG），并且将其溶解在25mg/ml浓度的二甲基亚砜（DMSO）中；
从Sigma获得柠檬酸；
从Bio-Rad获得考马斯蓝G250；
从Sigma获得二甲基亚砜；
从Sigma获得D-(+)-半乳糖；
从Bioreclamation Inc.获得人类血浆（K3 EDTA）；
从Sigma获得4-甲基伞形酮；
从Sigma获得4-甲基伞形酮-A-D-吡喃半乳糖苷；
从Matreya获得N-十二烷酰基-硝基苯并噁二唑-神经酰胺三己糖苷（Gb3-NBD）；
从Merck获得2-(N-吗啡基)乙磺酸；
从Sigma获得磷酸盐缓冲盐水；
从Sigma获得p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷；
从Sigma获得报春花灵；通过将12.5mg报春花灵溶解在200ml丙酮：水（8:2体积比）中来制备报春花灵喷显剂；
从Sigma获得吡啶；
从Sigma获得芥子酸；
从Sigma获得碳酸钠；
从Sigma获得磷酸钠；
从Sigma获得牛磺胆酸钠；
从Sigma获得三氟乙酸。
植物重组人类α-GAL-I：
如在国际专利申请PCT/IL2008/000576（作为WO 2008/132743公开的）中描述的，制备具有SEQ ID NO:1的植物重组人类α-GAL(prh-α-GAL)，本文称为植物重组人类α-GAL-I(prh-α-GAL-I)。
利用用含有α-GAL-A表达盒的基因构建物渗透的烟草本塞姆氏（Nicotiana Benthamiana）植物来生产转基因植物材料，用于表达人类α-GAL-A蛋白质。在控制的条件下，在生长室中进行这种实验。这之后是植物材料的收获和从植物细胞提取可溶解的蛋白质。然后通过纯化方法纯化prh-α-GAL-A，之后是化学修饰步骤，以便制造交联的蛋白质，其中所述纯化方法涉及用于蛋白质纯化的标准方法。目前利用均化器从植物材料中提取prh-α-GAL-A。通过离心来去除植物碎片，并且进一步利用硫酸铵沉淀和酸化步骤来纯化蛋白质。过滤上清液，且将其加载到疏水柱上，之后脱盐并且将其加载到阳离子交换柱上。浓缩阳离子交换柱的集合。
植物重组人类α-GAL-Ⅱ：
通过类似于上述描述的prh-α-GAL-I的方法，利用不同的基因构建物，制备植物重组人类α-GAL，其包括具有SEQ ID NO:2的α-GAL和具有SEQ ID NO:3的α-GAL（没有在SEQ ID NO:1中存在的N-末端氨基酸EF）的混合物，本文称为prh-α-GAL-II。
通过GENEART AG（Regensburg，Germany）来优化和合成编码人类α-半乳糖苷酶蛋白质的cDNA（EC 3.2.1-22 GenBank:X05790）。没有前导肽（内质网靶信号肽）的密码子使用适于烟草基因的密码子偏爱。在优化方法期间，避免下列顺式作用序列基序：内部TATA-盒、chi-位点和核糖体进入位点序列、富含AT或富含GC的序列延伸、RNA不稳定元件（“杀伤基序”）、重复序列和RNA二级结构、剪切体（隐蔽的）和受体位点、分支点。另外，已经避免了非常高的（>80％）或非常低的（<30％）GC含量的区域。
利用编码Arabidopsis ABPI蛋白质的33氨基酸内质网靶向信号肽（前导肽）的核苷酸序列取代全长的人类α-半乳糖苷酶蛋白质（GenBank:X05790）的天然的人类α-半乳糖苷酶前导肽（内质网靶信号肽）的核苷酸序列。这个信号肽为α-半乳糖苷酶到分泌途径提供有效的靶向，且一旦将蛋白质转移到内质网中，通过信号肽酶将其从多肽上断裂。将编码内质网保留信号SEKDEL的核苷酸序列在3’末端上加入到cDNA序列上，允许表达的蛋白质从高尔基体的恢复，有效地维持内质网中的蛋白质。
从外壳蛋白的强大的亚基因组病毒启动子中表达感兴趣的蛋白质。系统依靠通过土壤杆菌递送到植物的病毒载体的瞬间扩增（通过土壤感染法（agroinfection））。在土壤感染法中，将植物功能性启动子和编码病毒复制子的cDNA作为T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中。通过植物启动子原位转录T-DNA，以便产生生物学上活性的病毒RNA，其开始自我复制。
对于瞬时表达，3载体重组系统基于如描述的先前发展的系统[Glebaet al.,Vaccine 2005,23:2042-2048]。以α-半乳糖苷酶cDNA插入到一个载体中，和两个其他载体含有全病毒复制子（RdRp和整合酶）的构建物的基因，因此产生可以开始自我复制的生物学上活性的病毒RNA。
在补充有粒状缓释肥料（Scott Marysville,OH）的商业混合土壤（Givaat Ada,IL）中，在长日照（16小时光/8小时黑暗）光管理下，在24-25℃下使烟草本塞姆氏植物发芽和生长。
利用电穿孔（2500V，5毫秒），以基于复制子载体系统的pICH20866-α-GAL转化土壤杆菌[den Dulk-Ra and Hooykaas,MethodsMol Biol 1995,55:63-72]。利用本领域中已知的标准方法，通过真空渗透，用含有3 ICON质粒的土壤杆菌渗透植物。简要地，通过将所有的气生植物器官浸入到细菌悬浮液中，渗透5-6周大的烟草本塞姆氏植物，并且放置在真空室中。应用负的（-）0.8巴真空1分钟，之后迅速返回到大气压力中。将植物返回到温室中，在相同的生长条件下生长另外的5-7天。
在渗透之后5天收获烟草本塞姆氏叶片的样品，且在蛋白分离的缓冲液（Laemmli buffer）中提取样品，用于SDA-PAGE，或在活性测定缓冲液中（20mM柠檬酸、30mM磷酸钠、0.1％牛血清白蛋白和0.67％乙醇，pH4.6），用于植物表达的蛋白质的催化活性的测定。
通过两-步骤硫酸铵微分沉淀（“盐析”：第一步骤0.57M；第二步骤2.27M），之后是疏水相互作用层析（苯基650M树脂）和阳离子交换层析来纯化来自植物提取物的人类α-半乳糖苷酶蛋白。
由于不同的前导序列处理，获得两个序列（例如，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3），其在存在或缺少N-末端甘氨酸上不同。
α-GAL活性的4-甲基伞形酮-α-D吡喃半乳糖苷测定
利用作为水解底物的4-甲基伞形酮-α-D吡喃半乳糖苷测量α-GAL活性。在柠檬酸-磷酸盐缓冲液（20mM柠檬酸、30mM磷酸钠，pH4.6）中进行测定。利用含有5mM 4-甲基伞形酮-α-D吡喃半乳糖苷的40μl测定缓冲液来孵育含有检验的α-GAL的10μl样品。将反应混合物在37℃下孵育60分钟。将10μl的反应混合物转移到空白的96-孔板（Greiner）中，加入90μl的终止液（2M碳酸钠），并且在365nm的激发波长和450nm的发射波长下测量荧光。利用4-甲基伞形酮，反应产物的标准曲线，将荧光转化成产物浓度，并进一步转化成活性。
α-GAL活性的N-十二烷酰基-硝基苯并噁二唑-神经酰胺三己糖苷（Gb3-NBD）测定
荧光标记的底物N-十二烷酰基-硝基苯并噁二唑-神经酰胺三己糖苷（Gb3-NBD）的亲脂性小于Gb3，促进它在体外酶反应中的应用。
将10μl的0.1μg/μl Gb3-NBD（在具有10％乙醇的水中），和5μl的0.2mg/mlα-GAL加入到85μl的pH值为4.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中。最终的α-GAL浓度是10μg/ml。没有α-GAL的背景或非催化反应由pH值为4.6的90μl柠檬酸-磷酸盐缓冲液和10μl的0.1μg/μl的Gb3-NBD组成（在具有10％乙醇的水中）。将反应混合物在37℃下孵育60分钟。在孵育之后，将50μl甲醇加入到反应混合物中，并且将溶液涡旋1分钟。然后加入100μl氯仿，并且进一步将溶液涡旋1分钟。在真空下，利用真空离心浓缩系统（Speed Vac system）去除水和有机溶剂。将残渣溶解在80μl的氯仿:甲醇（1:1）中。利用Linomat V系统（CAMAG），将30μl的每一个样品装载到HPTLC（高效薄膜色谱）硅胶60板上（Merck）。利用作为溶剂系统的比率为100:42:6的氯仿:甲醇:H2O溶液来显影HPTLC板。然后允许干燥板，并在365nm的波长在UV光下通过照射显现底物和产物点。
α-GAL活性的4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（p-NP-G）测定：
p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷被用作用于α-GAL活性测定的水解底物。pH为4.6的测定缓冲液含有20mM柠檬酸、30mM磷酸钠、0.1％BSA（牛血清白蛋白）和0.67％乙醇。在96孔ELISA板（Greiner）中进行测定。利用150μl测定缓冲液孵育50μl样品，且加入30μl底物，以便获得8mM p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的最终浓度。将反应混合物在37℃下孵育90分钟。在90分钟之后，为了终止反应，将100μl的1.98M的碳酸铵加入到每一个孔中。在405nm处通过测量吸光度来确定反应产物的量。
体外α-GAL稳定性的测量：
通过将α-GAL加入到下列条件之一中来确定来自各种来源的α-GAL的稳定性：
1）模拟的溶酶体条件：柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（20mM柠檬酸，30mM磷酸钠），pH 4.6，37℃；
2）模拟的生理学条件：磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.4，37℃；
3）37℃的人类血浆。
如通过溶液中α-GAL的活性确定的，加入1μg/ml浓度的α-GAL，且在37℃孵育溶液。在预定的时间点上提取每一个溶液的样品，且如上文中描述的测量α-GAL活性。将在检验的α-GAL加入到每一个环境中之后即刻的酶活性的值定义为100％，并且根据最初的活性的百分数来计算在检验的时间点上的另外的活性结果。
α-GAL的药物动力学：
将单独的法布里（α-Gal-A-/0）小鼠放置在照明树脂玻璃抑制装置中，并且将酶注射到尾静脉中。在注射之后，利用肝素化的微分血器管，通过尾部采血或摘除眼球采血，在指定的时间获得血液样品。在4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃半乳糖苷活性缓冲液中稀释血浆。如上述描述的进行4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃半乳糖苷测定。
基于血浆活性结果来计算末端清除半衰期（T1/2）。末端半衰期（清除半衰期）是在已经达到分配准平衡之后，血浆浓度减少50％需要的时间。通过时间与对数浓度的线性回归，从曲线的末端（线性-对数）部分计算末端半衰期[Toutain & Bousquet-Melou,J Vet Pharmacol Ther 2004,27:427-39]。
α-GAL的生物分布：
以2mg/kg的剂量，用α-GAL静脉（在尾静脉中）地注射法布里病（α-Gal-A-/0）小鼠。在酶注射后2小时、24小时、3天、7天、14天或28天收获组织（肝、肾、心脏、和脾）。将正常的对照小鼠和盐-给予的（未处理的）法布里病小鼠中的α-GAL水平与接收外源的α-GAL的法布里病小鼠中的水平进行比较。为了确定组织中的α-GAL活性，如Oshima等人[PNAS 1997,94:2540-2544]描述的，将解冻的组织样品放置在含有溶解缓冲液（28mM柠檬酸、44mM磷酸二氢钠、0.5％牛磺胆酸钠，pH 4.4）的2ml聚丙烯管中。通过使用组织研磨仪（Retsch MM400）使样品均匀化10分钟。在4℃通过离心法使碎片压成球，并且如上面描述的，通过4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃半乳糖苷测定来分析所得的上清液的α-GAL活性。相同的样品也经受蛋白质印迹分析。
体内Gb3测定：
为了通过α-GAL活性来确定Gb3水平是否减少，通过动物组织的Gb3水平的测定来测量注射的α-GAL的终点效力。
为了测量Gb3水解，从靶器官（例如，肝、肾、心和脾）中提取中性的鞘糖脂。在1ml的2:1（v/v）氯仿:甲醇中使100mg组织样品均匀化，且以13500rpm离心20分钟。将62μl的水加入到1ml的均浆中，从而产生20:10:2比率的氯仿:甲醇:水的溶液。将10μl的吡啶加入到均浆中，从而产生最终的1％吡啶浓度。在48℃下将样品搅拌24小时。在真空下使用SpeedVac系统除去溶剂和水。在2.5ml甲醇中重悬样品，然后加入在甲醇中的250μl的1M KOH。然后在37℃下将样品摇动2小时。通过加入10μl的乙酸来终止皂化反应。然后将2.5ml氯仿加入到样品中，之后加入2.5ml冷水。将样品剧烈地摇晃5分钟，且允许静置5分钟，以便允许相位分离。丢弃由甲醇和水组成的上面的相，并且在真空下（SpeedVac）蒸发由氯仿和甲醇组成的下面的相，然后在300μl的1:1（v/v）氯仿:甲醇中重悬残留物，以便通过HPTLC进行鞘糖脂的分析。
通过高效薄层色谱法（HPTLC）（CAMAG，Switzerland）进行组织糖脂的定性和半定量分析。在HPTLC硅胶60玻璃被覆板（Merck）上进行HPTLC分析。利用Linomat 5系统（CAMAG，Switzerland）将样品装载到板上。利用氯仿-甲醇-水（60:35:4）作为溶剂系统使板显影。利用报春花灵喷显剂来检测中性的鞘糖脂。利用猪红血球Gb3（Matreya）作为标准来识别Gb3，并且利用半合成的标准的N-十七酰神经酰胺三己糖苷（Matreya）的校准曲线量化Gb3。显现板并利用由winCATS软件（CAMAG，Switzerland）支持的TLC S canner III（CAMAG，Switzerland）量化相关的点。
SDS-PAGE：
在还原的条件下，利用Bio-Rad CriterionTM系统和内部等级的12％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。通过考马斯蓝G250染色剂来染色凝胶。
IEF（等电子聚焦）：
利用Invitrogen小细胞和pH范围为3-7的预制的IEF凝胶（Invitrogen）进行IEF。通过考马斯蓝G250染色凝胶。
质谱分析（MALDI-TOF）：
利用Bruker Reflex IV MALDI-ToF质谱系统（Bruker-Franzen AnalytikGmbH,Germany）和芥子酸/四氟酸（TFA）（0.1％TFA/乙腈（2:1，v/v））饱和的基质溶液进行MALDI-TOF。
实施例I
重组α-GAL的体外稳定性
如在上文中在材料和方法部分中描述的各种条件下测量重组α-GAL的体外稳定性。检验植物重组人类α-GAL-I，以及和商业重组人类α-GAL。
如图1示出的，在模拟的溶酶体条件下，所有α-GAL的检验类型都显示活性的损失。
另外，如图2中示出的，在模拟的生理条件下，所有α-GAL的检验类型都显示活性的损失。如那里进一步示出的，在这样的条件下，100mg/ml半乳糖的存在部分地保护了植物重组α-GAL-I的活性。
类似地，如图3中示出的，在37℃的人类血浆中，所有α-GAL的检验类型都显示活性的损失。
如图4示出的，在模拟的溶酶体条件下，100mg/ml半乳糖的存在部分地保护了植物重组α-GAL-I的活性。
在溶酶体和中性pH水平的尺寸排阻色谱（SEC）实验证明蛋白质结构的改变（没有示出数据），而SDS-PAGE和蛋白质印迹分析没有表现初级氨基酸序列的任何降解（没有示出数据）。
这些结果表明，由于α-GAL蛋白质结构的改变，α-GAL在溶酶体条件和生理条件下损失活性，并且表明半乳糖部分地防止活性的这种损失。
实施例II
植物重组人类α-GAL-I与二-N-羟基琥珀酰亚胺-聚(乙二醇)（二-NHS-PEG）试剂的交联
在50:1、100:1和200:1摩尔比下，将植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）与各种分子量的二-N-羟基琥珀酰亚胺-聚(乙二醇)（二-NHS-PEG），即二-NHS-PEG5、二-NHS-PEG8或二-NHS-PEG45（具有2000道尔顿PEG的二-NHS-PEG）交联，在图5中示出了其结构。
二-NHS-PEG可在蛋白质的两个位点上，或在蛋白质的一个位点上连接到蛋白质上（例如，赖氨酸残基），因此形成交联。在图6中描述了连接的这两种形式。
将在28.5μl的2-（N-吗啡基）乙磺酸（MES）缓冲液（25mM，pH6）中的100μg α-GAL-I的加入到含有100mg/ml半乳糖的13.5μl的磷酸缓冲液（100mM，pH 8）中。
通过将在8μl DMSO中的二-NHS-PEG5加入到α-GAL-I溶液（1:50摩尔比的27.4μg的α-GAL-I溶液，1:100摩尔比的54.8μg的α-GAL-I溶液，和1:200摩尔比的109.7μg的α-GAL-I溶液）中，使α-GAL-I与二-NHS-PEG5以1:50、1:100和1:200的蛋白质:试剂的摩尔比进行交联。
通过将在8μl DMSO中的二-NHS-PEG45加入到α-GAL-I溶液（1:50摩尔比的103μg的α-GAL-I溶液，1:100摩尔比的206μg的α-GAL-I溶液，以及1:200摩尔比的412μg的α-GAL-I溶液）中，使α-GAL-I以1:50、1:100和1:200的蛋白质:试剂摩尔比与二-NHS-PEG45交联。通过将在11.5μl DMSO中的二-NHS-PEG8加入到α-GAL-I溶液（1:50摩尔比的37μg的α-GAL-I溶液，1:100摩尔比的73μg的α-GAL-I溶液，以及1:200摩尔比的146μg的α-GAL-I溶液），使α-GAL-I以1:50、1:100和1:200的蛋白质:试剂摩尔比与二-NHS-PEG8交联。
在将二-NHS-PEG试剂加入到α-GAL-I中之后，用滴管吸取反应且在轨道摇床上在室温下振动2小时。
在所有的反应中，通过盐透析（50KDa穿透）来去除过量的二-NHS-PEG交联剂。
二聚体的产量随着蛋白质浓度和DMSO浓度的增加而增加，达到30％。
如上文中描述的，通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）、IEF（等电子聚焦）、蛋白质印迹、和MALDI-TOF质谱分析来分析反应产物。
如图7中示出的，在凝胶电泳之后，观察到作为单体（具有48KDa的分子量）的标准的天然prh-α-GAL-I，而在prh-α-GAL-I与二-NHS-PEG的反应之后，prh-α-GAL-I主要以二聚体的形式出现（具有一些单体出现），表明，两个单体通过与二-NHS-PEG的交联而共价地连接。
如图7中进一步示出的，与具有较长的交联剂二-NHS-PEG45比较，观察到更高比例的单体prh-α-GAL-I具有较短的交联剂、二-NHS-PEG5和二-NHS-PEG8。二-NHS-PEG45产生高比例的交联的蛋白质。这些结果指示，较短的交联剂在共价连接单体上是较少有效的。
如图7中进一步示出的，对于每一个检验的交联剂，在与交联剂反应之后，增加了prh-α-GAL-I单体部分的分子量。当使用更高的交联剂与蛋白质的比率时（例如，200:1），和当交联剂的分子量更大时（例如，二-NHS-PEG45），分子量的增加更大。这些结果指示，不能通过交联二聚化的蛋白质单体共价地连接至二-NHS-PEG交联剂，即，聚乙二醇化蛋白质。
上述结果指示，更高的交联剂与蛋白质的摩尔过量的使用产生更高水平的α-GAL修饰，包括形成二聚体的交联和蛋白质的聚乙二醇化。然而，100:1的摩尔比提供高水平的交联，特别是在利用二-NHS-PEG45试剂的反应中，使得200:1的摩尔比对交联效果仅提供微小的增加。
如图8中示出的，prh-α-GAL-I与二-NHS-PEG的反应减少了prh-α-GAL-I的等电点（pI），由此证实了，二-NHS-PEG共价地连接至prh-α-GAL-I。二-NHS-PEG与prh-α-GAL-I的连接将赖氨酸残基中的碱性胺基团转变成中性的酰胺基团，由此减少了pI。当使用更大摩尔过量的（例如，200：1）二-NHS-PEG时，pI的减少更显著，证实了利用SDS-PAGE获得的上述的结果。
如图8中进一步示出的，通过二-NHS-PEG5和二-NHS-PEG8减少的pI比通过二-NHS-PEG45减少的多。
该结果表明，二-NHS-PEG5和二-NHS-PEG8比二-NHS-PEG45更可能导致聚乙二醇化，其中仅交联剂的一个末端连接到α-GAL上。交联剂只在一个末端上连接到α-GAL上在减少pI方面是更有效的，因为除了在连接的末端上将赖氨酸胺基团转变成酰胺基团之外，这样的交联剂包括非连接的末端上的酸性的羧酸（CO2H）基团。
如图9中示出的，如通过MALDI-TOF质谱分析确定的，prh-α-GAL-I与二-NHS-PEG45交联剂的反应将prh-α-GAL-I二聚体的分子量从97KDa增加到113KDa。分子量的增加指示大约有8个二-NHS-PEG45分子添加到prh-α-GAL-I二聚体上。
如图10中示出的，如通过MALDI-TOF质谱分析确定的，prh-α-GAL-I与二-NHS-PEG8交联剂的反应将prh-α-GAL-I二聚体的分子量从97KDa增加到104KDa。分子量的增加指示大约10个二-NHS-PEG8分子添加到prh-α-GAL-I二聚体上。
实施例Ⅲ
交联的植物重组人类α-GAL-I的活性
为了确定实施例II中描述的交联的植物重组α-GAL-I（prh-α-GAL-I）是否保留酶活性，利用在上文中描述的4-甲基伞形酮酰-a-D吡喃半乳糖苷测定，测定交联的prh-α-GAL-I的酶活性。
如下面表1中示出的，以50:1、100:1和200:1二-NHS-PEG试剂的摩尔过量，与二-NHS-PEG5、二-NHS-PEG8或二-NHS-PEG45反应的prh-α-GAL-I，在所有的情形中表现类似于天然prh-α-GAL-I的酶活性的水平。如这里示出的，在某些情形中观察到活性的适度的减少和适度的增加，其可能是配方作用的结果。这些结果指示，交联不减少prh-α-GAL-I的活性。
表1：交联的植物重组人类α-GAL-I的活性结果
| 样品 | 试剂 | 摩尔过量 | 活性mg/ml |
| 标准 | - | - | 2 |
| 1 | 二-NHS-PEG5 | 50:1 | 2.25 |
| 2 | 二-NHS-PEG5 | 100:1 | 1.30 |
| 3 | 二-NHS-PEG5 | 200:1 | 1.24 |
| 4 | 二-NHS-PEG45 | 50:1 | 2.82 |
| 5 | 二-NHS-PEG45 | 100:1 | 2.76 |
| 6 | 二-NHS-PEG45 | 200:1 | 3.48 |
| 7 | 二-NHS-PEG8 | 50:1 | 2.18 |
| 8 | 二-NHS-PEG8 | 100:1 | 2.43 |
| 9 | 二-NHS-PEG8 | 200:1 | 1.82 |
利用上文中描述的N-十二烷酰基-NBD-神经酰胺三己糖苷测定来进一步检验二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的活性，其测定α-GAL对它的天然底物，神经酰胺三己糖苷（Gb3）的活性。测定哺乳动物重组人类α-GAL作为比较。
如图11中示出的，在利用荧光底物孵育交联的植物重组人类α-GAL-I之后，类似于通过哺乳动物重组α-GAL催化的反应，将几乎所有的底物都转变成产物，N-十二烷酰基-硝基苯并噁二唑-乳糖酰基神经酰胺。该结果证实了，利用天然底物的相近类似物，交联不削弱prh-α-GAL-I的酶水解效力。
实施例IV
交联的植物重组人类α-GAL-I的体外稳定性
在如上文在材料和方法部分中描述的各种条件中测量如在实施例II中描述获得的，交联的植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）的体外稳定性。测量和商业重组人类α-GAL的稳定性作为比较。
如图12A-12C示出的，通过与二-NHS-PEG5（图12A）、二-NHS-PEG8（图12B）和二-NHS-PEG45（图12C）的交联，增强植物重组人类α-GAL-I在模拟的溶酶体条件下的稳定性。如这里进一步示出的，在一周时期交联的prh-α-GAL-I的稳定性可相当于商业重组人类α-GAL的稳定性。在第一个24小时期间内剩余的活性的小的减少之后，交联的prh-α-GAL-I甚至在10天之后仍然维持活性。在第一个24小时期间内观察的，活性的最初减少可反映没有经历交联的植物重组人类α-GAL-I的部分。
如图12A-12C中进一步示出的，在模拟的溶酶体条件下，通过二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I表现出最高的稳定性。
通过与二-NHS-PEG45的交联也增强了植物重组人类α-GAL-I在37℃的人类血浆中的稳定性（数据未示出）。
这些结果表明，通过增加α-GAL在溶酶体中的稳定性，如本文描述的交联的α-GAL可增加α-GAL的体内效力，由此允许α-GAL在溶酶体中产生较长时期的作用，并且通过增加血液中α-GAL的稳定性，由此增加α-GAL的循环半衰期。
实施例V
交联的植物重组人类α-GAL-I的体内药物动力学和生物分布
如上文在材料和方法部分中描述的，在用2mg/kg的α-GAL注射的法布里病小鼠中确定，如实施例II中描述的，用二-NHS-PEG45或二-NHS-PEG8交联的植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）的药物动力学和生物分布。确定非交联的植物重组人类α-GAL-I和重组人类α-GAL的药物动力学和生物分布作为比较。在注射后1、3、5、10、20、30、40、60和120分钟收集血液样品，用于药物动力学分析。对于α-GAL的每一个类型，处理组由六只小鼠组成。
如下面表2中示出的，prh-α-GAL-I与二-NHS-PEG8和二-NHS-PEG45的交联增加了植物重组人类α-GAL-I的循环末端半衰期，其中后者表现出更显著的作用。
表2：重组α-GAL的循环末端半衰期
如图13和表2中示出的，通过二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的末端半衰期显著地大于的末端半衰期。
如图13中进一步示出的，与二-NHS-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-I在20分钟时的活性是在1分钟时的活性的约40％。此外，交联的prh-α-GAL-I甚至在注射后4小时仍然表现活性的血浆存在。
这些结果指示，交联的prh-α-GAL-I在体内保留相对长时间的活性，其可允许酶到达另外的组织和器官。
如图14A和14B中示出的，在注射后2小时的法布里病小鼠的脾中，与二-NHS-PEG8和二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的水平显著地高于非交联的植物重组α-GAL-I的水平以及哺乳动物重组α-GAL的水平。如那里进一步示出的，与二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的水平比与二-NHS-PEG8交联的prh-α-GAL-I的水平高。蛋白质印迹分析（图14B）与通过测定α-GAL酶活性获得的生物分布结果（图14A）一致。
如图15A和15B中示出的，在注射后2小时的法布里病小鼠的肝中，与二-NHS-PEG8和二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的水平显著高于非交联的植物重组α-GAL-I的水平，但是低于哺乳动物重组α-GAL在肝中的水平。如那里进一步示出的，与二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的水平稍微地比与二-NHS-PEG8交联的prh-α-GAL-I的水平高。蛋白质印迹分析（图15B）与通过测定α-GAL酶活性获得的生物分布结果（图15A）一致。
肝中α-GAL的较低水平在治疗上可能是有利的，因为一般在肝中发现在酶替代疗法中约95％的重获的酶，因此肝中重组α-GAL的高水平指示靶器官中外源性α-GAL的较低水平，如心脏和肾。
如图16中示出的，在注射后2小时的法布里病小鼠的心脏中，与二-NHS-PEG8和二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的水平高于非交联的植物重组α-GAL-I的水平。如那里进一步示出的，与二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的水平比利用二-NHS-PEG8交联的prh-α-GAL-I以及哺乳动物重组α-GAL的水平高。
如图17中示出的，在注射后2小时的法布里病小鼠的肾中，与二-NHS-PEG8和二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的水平高于非交联的植物重组α-GAL-I的水平。如那里进一步示出的，与二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的水平比与二-NHS-PEG8交联的prh-α-GAL-I以及哺乳动物重组α-GAL的水平高。
类似地，如图18-21中示出的，关于注射后可达7天，在法布里病小鼠的脾（图18）、肝（图19）、心脏（图20）和肾（图21）中，利用二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的水平高于非交联的植物重组α-GAL-I的水平。如那里进一步示出的，在脾、心脏和肾中，利用二-NHS-PEG45交联的植物重组α-GAL-I的水平比哺乳动物重组α-GAL的水平高。
这些结果指示，与二-NHS-PEG交联的，特别是与二-NHS-PEG45交联的α-GAL表现增强的器官吸收，包括肾和心脏，其是法布里病的治疗中主要的靶器官。这些结果与交联的α-GAL的增加的循环半衰期和增强的稳定性一致。
实施例VI
哺乳动物重组人类α-GAL与二-N-羟基琥珀酰亚胺-聚(乙二醇)（二-NHS-PEG）的交联
为了证实上文描述的交联的有利作用，交联从人类纤维肉瘤系HT-1080产生的哺乳动物重组人类α-GAL。
将具有100mg/ml的D-(+)-半乳糖的333μl的磷酸盐缓冲液（100mM，pH 8）加入到在151μl的DMSO溶液（25mg/ml）中的3.8mg二-NHS-PEG45和在130μl的柠檬酸缓冲液（25mM，pH6）中的1.8mg的哺乳动物重组人类α-GAL。通过活性测定来确定浓度。利用轨道摇床将反应混合物在室温下摇动2小时。利用具有50KD分离点的Vivaspin 6浓缩器通过盐透析来去除过量的二-NHS-PEG45交联试剂。交联的的α-GAL活性表明α-GAL浓度是3mg/ml。
通过如上文描述的SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）、IEF（等电子聚焦）、和MALDI-TOF质谱分析来分析反应产物。如图22中示出的，在凝胶电泳之后，观察到标准的天然 是单体，然而在Replagal α-GAL与二-NHS-PEG45反应之后，α-GAL以二聚体的形式出现，表明两个单体通过与二-NHS-PEG的交联而共价地连接。
如图23中示出的，与二-NHS-PEG45的反应减少α-GAL的等电点（pI），因此证实，二-NHS-PEG共价地连接至α-GAL。
如图24中示出的，如通过MALDI-TOF质谱分析确定的， 与二-NHS-PEG45交联剂的反应将二聚体的分子量从103.0KDa增加到121.3KDa。分子量的增加指示大约9-10个二-NHS-PEG45的分子添加到α-GAL二聚体上，其类似于上文描述的prh-α-GAL-I的结果。
实施例VII
交联的哺乳动物重组人类α-GAL的活性
为了确定实施例VI中描述的哺乳动物重组α-GAL的交联是否影响酶活性，根据上文描述的程序，利用p-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（pNP-G）测定来测定交联的α-GAL的酶活性。
如图25和下面的表3中示出的，与二-NHS-PEG45交联的哺乳动物重组人类α-GAL表现出非常类似于天然哺乳动物重组人类α-GAL的那些的酶活性的参数。这些结果指示，交联不显著地影响哺乳动物重组人类α-GAL的活性或催化系统和机制。
表3：交联的哺乳动物重组人类α-GAL的活性结果
实施例VIII
交联的哺乳动物重组人类α-GAL的体外稳定性
在如上文在材料和方法部分中描述的各种条件中测量如在实施例VI中描述获得的，交联的哺乳动物重组人类α-GAL的体外稳定性。为了评价交联的作用，测量非交联的的稳定性作为对比。
如图26A和26B中示出的，通过与二-NHS-PEG45的交联，显著地增强了哺乳动物重组人类α-GAL在模拟的溶酶体条件下（图26A）和在人类血浆中（图26B）中的稳定性。交联的哺乳动物重组人类α-GAL在模拟的溶酶体条件下比在血浆中表现出更高的稳定性。
这些结果指示，如本文描述的α-GAL的交联可稳定来自多种来源和表达平台的重组α-GAL。
实施例IX
交联的哺乳动物重组人类α-GAL的体内药物动力学和生物分布
如上文在材料和方法部分中描述的，通过测量注射后2小时、7、14和28天的法布里病小鼠的脾、肝、心脏和肾中α-GAL活性，来确定在实施例VI中描述的交联的哺乳动物重组人类α-GAL的药物动力学和生物分布。确定非交联的哺乳动物重组人类α-GAL的生物分布作为比较。
如图27A-27D中示出的，在法布里病小鼠的脾（图27A）、肝（图27B）、心脏（图27C）和肾（图27D）中，交联的哺乳动物重组人类α-GAL的水平显著地高于非交联的哺乳动物重组人类α-GAL的水平。
如图28A-28D中示出的，在注射后28天时期，交联的哺乳动物重组α-GAL减少法布里病小鼠的心脏（图28A）、肾（图28B）、肝（图28C）和脾（图28D）中的Gb3水平。交联的哺乳动物重组α-GAL将Gb3水平减少到比法布里病小鼠的肾（图28C）和脾（图28D）中的非交联的重组α-GAL更大的程度，并且减少到大约与心脏（图28A）和肝（28C）中非交联的哺乳动物重组α-GAL相同的程度。
这些结果表明，与二-NHS-PEG的交联导致器官，包括肾和心脏的来自多种来源和表达平台的重组α-GAL的吸收显著的增强，其中所述器官是法布里病的治疗的主要的靶器官。这些结果进一步指示，与二-NHS-PEG的交联导致器官中Gb3水平的更显著的减少。
实施例Ⅹ
植物重组人类α-GAL-II与二-N-羟基琥珀酰亚胺-聚(乙二醇)（二-NHS-PEG）的交联
根据实施例II中描述的方案，使植物重组人类α-GAL-II（prh-α-GAL-II）与二-NHS-PEG45、二-NHS-PEG21、或二-NHS-PEG68以二-NHS-PEG与α-GAL的200:1的摩尔比交联，所述植物重组人类α-GAL-II缺少在prh-α-GAL-I的N-末端中存在的氨基酸EF。
在与二-NHS-PEG交联之后，prh-α-GAL-II仍然保留其生物活性（数据没有示出）。
通过如上文描述的SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MALDI-TOF质谱分析来分析反应产物。
如图29Α-29B中示出的，在凝胶电泳之后，观察到标准的天然prh-α-GAL-II仍然是单体，然而在prh-α-GAL-II与二-NHS-PEG45或二-NHS-PEG21（图29A），或与二-NHS-PEG68（图29B）反应之后，prh-α-GAL-II主要以二聚体的形式出现（具有某些单体存在），指示两个单体通过与二-NHS-PEG交联剂的交联而共价地连接。
如图29A-29B中进一步示出的，对于每一个检验的交联剂，在与交联剂反应之后增加了prh-α-GAL-II的单体部分的分子量。二-NHS-PEG45的分子量的增加比二-NHS-PEG21（图29A）大，并且二-NHS-PEG68的分子量的增加最大（将图29A和29B比较）。这些结果指示，未通过交联二聚化的单体共价地连接至二-NHS-PEG交联剂，即，聚乙二醇化蛋白质。
如图30A-30C中示出的，如通过MALDI-TOF质谱分析确定的，prh-α-GAL-II与二-NHS-PEG21交联剂的反应将prh-α-GAL-II二聚体的分子量从95KDa（图30A）增加到109KDa（图30B），而prh-α-GAL-II与二-NHS-PEG45交联剂的反应将prh-α-GAL-II二聚体的分子量增加到114KDa（图30C）。分子量的增加指示，大约13个分子的二-NHS-PEG21，或大约9个分子的二-NHS-PEG45添加到prh-α-GAL-II二聚体上。
实施例XI
交联的植物重组人类α-GAL-II的体外稳定性
在如上文在材料和方法部分中描述的各种条件中测量如实施例X中描述获得的交联的植物重组人类α-GAL-II（prh-α-GAL-II）的体外稳定性。测量商业重组人类α-GAL的稳定性作为对比。
如图31A-31D中示出的，通过与二-NHS-PEG68（图31B和31D）、二-NHS-PEG45（图31A-31D）或二-NHS-PEG21（图31A和31C）的交联，增强了植物重组人类α-GAL-II在模拟的溶酶体条件（图31A和31B）和人类血浆（图31C和31D）中的稳定性。不同的交联剂将prh-α-GAL-II的稳定性增强到可比的程度。如那里进一步示出的，交联的prh-α-GAL-II的稳定性比重组人类α-GAL的稳定性大。交联的prh-α-GAL-II在模拟的溶酶体条件下以及在血浆条件下表现更高的稳定性。
如图31Α-31D中示出的，尽管prh-α-GAL-II仍然表现某些不稳定性，但是在模拟的溶酶体条件下（图1和31Α-31B）和在人类血浆中（图3和31C-31D），非交联的prh-α-GAL-II显著地比非交联的prh-α-GAL-I更稳定（参见作为对比的图1和3）。
这些结果指示，如本文描述的α-GAL的交联可稳定不同类型的α-GAL。
实施例XII
交联的植物重组人类α-GAL-II的体内药物动力学和生物分布
通过如上文在材料和方法部分中描述的测量血浆和器官中的α-GAL活性，来确定在实施例X中描述的PEG45交联的和PEG21交联的植物重组人类α-GAL-II（prh-α-GAL-II）的药物动力学和生物分布。确定非交联的哺乳动物重组人类α-GAL的药物动力学和生物分布作为对比。
在用1mg/kg的α-GAL注射法布里病小鼠之后，在1、5、10、30、60、120、240、480和1440分钟收集用于药物动力学分析的血液样品。
通过收获用2mg/kg α-GAL注射后2小时、7天、14天和28天的法布里病小鼠的肝、肾、心脏和脾来确定α-GAL的生物分布。
如图31A和32B和表4中示出的，prh-α-GAL-II与二-NHS-PEG45的交联显著地增加了prh-α-GAL-II的循环末端半衰期，产生显著地比哺乳动物重组α-GAL或非交联的prh-α-GAL-II大的循环半衰期。
表4：重组α-GAL的循环末端半衰期
如图33A-33L中示出的，尽管相对于肝中较小的程度，但prh-α-GAL-II与二-NHS-PEG45的交联增加了法布里病小鼠的心脏（图33A）、肾（图33B）、肝（图33C）和脾（图33D）中的prh-α-GAL-II的吸收。
如图33E-33L中示出的，尽管在只有2小时之后这样的增加不一定是明显的，当prh-α-GAL-II与二-NHS-PEG45的交联也增加了法布里病小鼠的心脏（图33E和33I）、肾（图33F和33J）、肝（图33G和33K）和脾（图33H和33L）中的prh-α-GAL-II的吸收。
如那里进一步示出的，在法布里病小鼠的心脏（图33A、33E和33I）、肾（图33B、33F和33J）、和脾（图33D、33H和33L）中，交联的prh-α-GAL-II的水平比哺乳动物重组α-GAL的水平高，但是在肝中（图33C、33G和33K），比哺乳动物重组α-GAL的水平低。
这些结果指示，交联的prh-α-GAL-II在血浆和各种器官中表现显著增强的α-GAL的活性，特别是在除了肝之外的器官中。
实施例XIII
pH对植物重组人类α-GAL的活性的影响
环境的pH对溶酶体酶如α-GAL的稳定性和动力学具有重要的影响。pH可影响底物与酶的结合。pH也可以影响催化基团的质子化作用或去质子化作用，如羧基或氨基基团，其是酶的活性部位的部分，因此影响酶的动力学行为。酶的三级结构或四级结构的稳定性也是pH依赖性的，并且影响酶反应的速度，特别是在极端的酸性或碱性pH值下。
为了检查α-GAL活性的pH-依赖性，和与其交联的作用，在各种pH值下，利用pNP-G底物来确定PEG45-交联的和非交联的植物重组人类α-GAL-II的活性。在20mM柠檬酸盐和30mM磷酸钠的溶液中进行测量。
在下列表5中，和在图34A-34C中总结了在各种pH值下的表征α-GAL活性的动力学参数。
如图34A-34C中示出的，α-GAL-II的交联增加了Vmax（图34A）和Kcat（图34C）参数，但是对KM参数没有显著的影响（图34B）。
表5：在各种pH值下，非交联的植物重组人类α-GAL-II（prh-α-GAL-II）和PEG45-交联的植物重组人类α-GAL-II（prh-α-GAL-II-CL45）的活性结果
Vmax和Kcat参数的增加指示催化活性的增加。在至少约7的pH值下这种增加是特别重要的，其中非交联的α-GAL-II的催化活性是可以忽略的。
KM是与酶/底物亲和力关联的动力学参数。交联对KM值没有显著影响表明，交联对α-GAL与pNP-G底物的亲和力没有显著影响。
实施例XIV
聚乙二醇化对α-GAL的稳定性的影响
为了确定PEG交联剂的稳定影响是由于PEG的性能或由于交联引起的，确定了聚乙二醇化本身对α-GAL稳定性的影响。
将植物重组人类α-GAL-I与具有不同分子量的（2、5和10KDa）的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-活化的甲氧基-封端的PEG反应。这样的PEG试剂具有单一的NHS基团，因此聚乙二醇化蛋白质而没有形成交联。通过SDS-PAGE来分析反应产物。
如图35中示出的，甲氧基-封端的聚乙二醇化试剂聚乙二醇化α-GAL（如α-GAL的分子量的明显的增加），但是基本上不能产生α-GAL二聚体，指示α-GAL没有交联。
如图36A和36B中示出的，在模拟的溶酶体条件下（图36A）或在人类血浆中（图36B），没有形成交联的聚乙二醇化植物重组人类α-GAL-I基本上不增加植物重组α-GAL的稳定性。
这些结果表明，上文描述的交联的稳定化作用本质上不是聚乙二醇化的结果。
实施例XV
PEG链长度对交联的α-GAL的活性的影响
为了评价PEG交联剂的链长度对α-GAL活性的影响，利用基本上与实施例Ⅱ中描述相同的程序，将植物重组人类α-GAL-I与二-NHS-PEG2、二-NHS-PEG4、二-NHS-PEG68和二-NHS-PEG150试剂交联（PEG68和PEG150的链长度近似）。以50:1、100:1和200:1二-NHS-PEG:α-GAL-I摩尔比来交联α-GAL-I。如上文描述的，通过SDS-PAGE来分析反应产物。也分析如实施例Ⅱ中描述的与二-NHS-PEG45交联的α-GAL-I作为对比。
如图37中示出的，SDS-PAGE分析表明，所有的二-NHS-PEG试剂交联α-GAL，从而导致共价交联的二聚体，并且表明，当使用200:1的摩尔比时，交联更加有效。
然后如实施例III中描述的来确定交联的α-GAL-I的酶活性。在下面的表6中总结了结果。
表6：交联的植物重组人类α-GAL-I的活性结果
如表6中示出的，与PEG2和PEG4的交联适度地减少α-GAL活性（减少大约30-50％），然而与较长的PEG链的交联基本上不影响α-GAL活性。
这些结果表明，与比PEG4长的PEG链的交联在保留交联的α-GAL的活性方面是有利的。
实施例XVI
利用二-COOH-PEG试剂交联α-GAL
作为上面描述的利用预制备的（例如，商业上可用的）二-NHS-PEG试剂交联α-GAL的备选方案，立即在影响交联反应之前，利用通过原位活化羧基（即，COOH）基团的二-COOH-PEG试剂交联α-GAL。
通过与NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的每个羧基基团1.1摩尔当量（即，每二-COOH-PEG为2.2摩尔当量）反应使二-COOH-PEG12、二-COOH-PEG28和二-COOH-PEG45活化。然后在室温下，在DMSO中摇动反应混合物30分钟。如实施例Ⅱ中描述的，然后将活化的二-COOH-PEG（其基本上是二-NHS-PEG）与植物重组人类α-GAL-I以50:1、100:1和200:1的摩尔比反应。如上文描述的通过SDS-PAGE来分析反应产物。也分析如在实施例Ⅱ中描述的与二-NHS-PEG45交联的α-GAL-I作为对比。
如图38中示出的，SDS-PAGE分析显示，所有的二-COOH-PEG试剂在某种程度上交联α-GAL，但是当使用200:1摩尔比时，交联更加有效。
然后如实施例III中描述的来确定交联的α-GAL-I的酶活性。在下面的表7中总结了结果。
表7：交联的植物重组人类α-GAL-I的活性结果
如表7中示出的，利用每一个检验的二-COOH-PEG试剂的交联导致具有约期望活性的α-GAL。
这些结果表明，与利用二-NHS-PEG试剂的交联相比，交联二-COOH-PEG试剂不减少α-GAL的活性。
这些结果进一步证实上述描述的发现，即，利用比PEG4长的PEG链的交联不能显著地减少交联的α-GAL的活性。
实施例XVII
交联剂的长度和类型对交联的植物重组人类α-GAL-I的体外稳定性的影响
为了进一步表征链长度对交联的α-GAL稳定性的影响，并且为了将利用二-COOH-PEG试剂（例如，如实施例XVI中描述的）交联的α-GAL的稳定性与利用二-NHS-PEG试剂交联的α-GAL的稳定性进行比较，在如上文在材料和方法部分中描述的各种条件下，测量利用如实施例XV和XVI描述获得的二-NHS-PEG2、二-NHS-PEG4、二-COOH-PEG12、二-COOH28和二-COOH-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-I（prh-α-GAL-I）的体外稳定性，并且与利用如在实施例Ⅱ中描述的二-NHS-PEG45交联的prh-α-GAL-I的稳定性进行比较。测量商业重组人类α-GAL和非交联的prh-α-GAL-I的稳定性作为对比。
如图39中示出的，通过与每一个二-NHS-PEG和二-COOH-PEG试剂的交联来增强植物重组人类α-GAL-I在模拟的溶酶体条件下的稳定性。
如那里进一步示出的，交联的prh-α-GAL-I的稳定性与交联的PEG链的长度，与提供最大的稳定性的二-NHS-PEG45和二-COOH-PEG45，和与提供最小的稳定性的二-NHS-PEG2有关系。然而，利用二-COOH-PEG45的交联只比利用二-COOH-PEG45的交联提供稍微更多的稳定性，表明超过某些长度，PEG链长度不影响稳定性。
如图39中进一步示出的，利用二-NHS-PEG45的交联比利用二-COOH-PEG45的交联提供稍微更多的稳定性。这可能是二-COOH-PEG试剂的不完全活化的结果。然而，稳定性的差异是微小的。
另外，利用二-NHS-PEG和二-COOH-PEG试剂中的每一个的交联增强了植物重组人类α-GAL-I在37℃的人类血浆中的稳定性（没有示出数据）。
这些结果提供另外的证据，即，如本文描述的交联α-GAL可通过增加α-GAL在溶酶体和血液中的稳定性来增加体内α-GAL的效力，并且长度为约28-45单元的PEG链通过交联比较短的PEG链更加有效的稳定α-GAL。
实施例XVIII
交联的植物重组人类α-GAL-II的动力学参数
为了检查其上交联的影响，利用pNP-G底物和米-门氏分析来确定如实施例X中描述获得的交联的植物重组人类α-GAL-II的动力学参数，以及非交联的植物重组人类α-GAL-II的动力学参数。在4.6的pH下在20mM柠檬酸盐、30mM磷酸钠、0.1％牛血清白蛋白和0.67％乙醇的溶液中进行测量。利用基于活性测定的蛋白质含量值来计算动力学参数。
如下面的表8中示出的，与非交联的α-GAL-II相比，α-GAL-II的交联导致改进的动力学性质。减少了米氏常数（KM），表明酶对底物的更高的亲和力。此外，增强了交联的物质的Kcat/KM，其表示在描述的条件下的，酶对这种底物的总体的催化效力。
表8：非交联的植物重组人类α-GAL-II(prh-α-GAL-II)和利用二-NHS-PEG21(prh-α-GAL-II-CL21)、二-NHS-PEG45(prh-α-GAL-II-CL45)或二-NHS-PEG68(prh-α-GAL-II-CL68)交联的植物重组人类α-GAL-II的米-门氏参数
实施例XIX
植物重组人类α-GAL-II交联的再现性
以200:1的比率，制备利用二-NHS-PEG45交联的5批植物重组人类α-GAL-II（prh-α-GAL-II）之后，利用类似于实施例II中描述的那些的程序来评价交联的逐批的再现性。
在1、2、4和5批次中，将1mg的prh-α-GAL-II与3.98mg的二-NHS-PEG反应。
在3批次中，将20.5mg的prh-α-GAL-II与80.7mg的二-NHS-PEG反应。
如实施例Ⅲ中描述的来确定交联的prh-α-GAL-II的酶活性。在下面的表9中总结了结果。
表9：来自不同批次的交联的植物重组人类α-GAL-II的活性结果
如表9中示出的，在所有的5个批次中，测量的活性接近预期的活性。在5个批次的4个中，测量的活性有约10%或更少不同于预期的活性。
这些结果表明，交联的prh-α-GAL-II的获得的活性是相对可预见和可再现的。
如上文中描述的来确定交联的prh-α-GAL-II在溶酶体条件下和在人类血浆中的稳定性。
如图40A和40B中示出的，交联的prh-α-GAL-II的稳定性在模拟的溶酶体条件下和在人类血浆中表现出良好的再现性。
也如上文描述的通过SDS-PAGE分析、IEF（等电子聚焦）分析、和MALDI-TOF质谱分析来分析交联。分析非交联的prh-α-GAL-II作为对照。
如图41中示出的，来自不同批次的交联的prh-α-GAL-II在SDS-PAGE分析中表现出相同程度的共价二聚作用。
如图42中示出的，来自不同批次的交联的prh-α-GAL-II在IEF分析中表现出相同的等电点。
如图43Α-43F中示出的，与非交联的prh-α-GAL-II（图43A）相比，在二聚体形式中，来自1-5批次的所有交联的prh-α-GAL-II（分别是图43B-43F）都表现出大约20-21KDa的增加。这样的增加相当于每个α-GAL二聚体增加约10个PEG分子。如图43B-43F中示出的，来自不同批次的交联的prh-α-GAL-II表现出相似的单体对二聚体的比例。
这些结果进一步表明，α-GAL交联的良好再现性。
为了检查酶活性的再现性，利用pNP-G底物和米-门氏分析来确定交联的prh-α-GAL-II的动力学参数。在4.6的pH下在20mM柠檬酸盐、30mM磷酸纳、0.1%牛血清白蛋白和0.67%乙醇的溶液中进行测量。利用基于280nm的光密度的蛋白质含量值来计算动力学参数。
如图44中示出的，来自不同批次的交联的prh-α-GAL-II表现出相似的催化速度对底物浓度的分布。
如下面的表10中示出的，来自不同批次的交联的prh-α-GAL-II表现良好的Vmax和Kcat参数的再现性。尽管这可能是蛋白质量化的伪像，但批次之间的Km参数更加不同。
上述结果表明交联的α-GAL的酶性能的良好的再现性。
表10：利用二-NHS-PEG45交联的植物重组人类α-GAL-II在不同批次中的米-门氏参数
尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是很显然，很多替换、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显然的。因此，在所附权利要求的精神和广泛的范围内，其倾向于包括所有这样的替换、修改和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部的内容都以引用方式并入到本说明书中，其程度如特别和单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均以引用方式并入到本文中一样。另外，本说明书中的任何参考文献的引用或标识不能认为承认这样的参考文献是本发明的现有技术。就使用部分标题来说，它们不应该将其解释为必须限制性的。
Claims (26)
1.一种多聚蛋白质，包括通过连接部分彼此共价连接的至少两个α-半乳糖苷酶单体，其中所述连接部分具有通式：
-X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2-
其中X1和X2各自是与至少一个α-半乳糖苷酶单体形成共价酰胺键的官能团；
Y是O、S或NR5；
n是从8至150的整数；
R5是氢；并且
R1、R2、R3和R4各自独立地选自由氢、烷基和氧代组成的组。
2.根据权利要求1所述的多聚蛋白质，呈现选自由以下组成的组中的特征：
(a)在使所述多聚蛋白质经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受所述人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
(b)在使所述多聚蛋白质经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述人类血浆条件1小时后的所述天然α-半乳糖苷酶活性减少的百分数低至少10％；
(c)在使所述多聚蛋白质经受人类血浆条件1小时后α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
(d)在使所述多聚蛋白质经受溶酶体条件1周后α-半乳糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶酶体条件1周后所述天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
(e)在使所述多聚蛋白质经受溶酶体条件1天后α-半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶酶体条件1天后所述天然α-半乳糖苷酶的活性减少的百分数低至少10％；
(f)在使所述多聚蛋白质经受溶酶体条件1天后α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
(g)在使所述多聚蛋白质经受溶酶体条件后即刻α-半乳糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶酶体条件后即刻天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
(h)在使所述多聚蛋白质经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液后即刻α-半乳糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受具有7的pH和37℃的温度的所述水溶液后即刻天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；以及
(i)在生理系统中的循环半衰期高于所述天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期。
3.根据权利要求2所述的多聚蛋白质，其中，在使所述多聚蛋白质经受溶酶体条件1天后，所述多聚蛋白质的所述α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变，进一步地在使多聚蛋白质经受溶酶体条件1周后，所述多聚蛋白质的所述α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变。
4.根据权利要求2所述的多聚蛋白质，其中，高于所述天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期的多聚蛋白质的所述循环半衰期比所述天然α-半乳糖苷酶的所述循环半衰期高至少20％。
5.根据权利要求4所述的多聚蛋白质，其中，高于所述天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期的多聚蛋白质的所述循环半衰期比所述天然α-半乳糖苷酶的所述循环半衰期高至少50％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，通过在将所述多聚蛋白质给予脊椎动物之后在器官中的α-半乳糖苷酶活性来表征所述多聚蛋白质，所述器官选自由脾、心脏和肾组成的组。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，包括两个α-半乳糖苷酶单体，所述蛋白质是二聚蛋白质。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶是人类α-半乳糖苷酶。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶是植物重组α-半乳糖苷酶。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3组成的组。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶是碱性α-半乳糖苷酶。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶是酸性α-半乳糖苷酶。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的多聚蛋白质，其中，n是从40至70的整数。
14.根据权利要求1所述的多聚蛋白质，其中，n是至少25。
15.根据权利要求7所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组，并且n是从40至70的整数。
16.根据权利要求7所述的多聚蛋白质，其中，所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组，并且所述连接部分具有通式：
其中，所述连接部分中聚乙二醇的分子量为2kDa，并且所述连接部分的端基各自与α-半乳糖苷酶单体形成酰胺键。
17.一种用于在治疗法布里病中使用的药物组合物，所述组合物包括根据权利要求1至16中任一项所述的多聚蛋白质和药用载体。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，进一步包括半乳糖。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的多聚蛋白质在制备用于治疗法布里病的药物中的应用。
20.一种制备权利要求1至16中任一项所述的多聚蛋白质的方法，所述方法包括使α-半乳糖苷酶与交联剂反应，其中所述交联剂包括所述连接部分和至少两个反应基团。
21.根据权利要求20所述的方法，包括使二聚α-半乳糖苷酶与所述交联剂反应。
22.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中，所述反应基团包括离去基团。
23.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中，所述反应基团与胺基团反应，从而形成酰胺键。
24.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中，所述反应基团中的每一个能够在所述连接部分与至少一个α-半乳糖苷酶单体之间形成共价键。
25.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中，所述交联剂与所述α-半乳糖苷酶的单体的摩尔比在5:1至500:1的范围内。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述摩尔比在75:1至300:1的范围内。
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