JP5758920B2 - 安定化α−ガラクトシダーゼおよびその使用 - Google Patents

安定化α−ガラクトシダーゼおよびその使用 Download PDF

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Description

本発明は、そのいくつかの実施形態において、新規な多量体型タンパク質構造体に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、α−ガラクトシダーゼの多量体型タンパク質構造体およびファブリー病の処置におけるその使用に関連する。
リソソーム酵素のα−ガラクトシダーゼ−Ａ（α−ＧＡＬまたはα−ＧａｌＡ；ＥＣ３．２．１．２２）は、ガラクトースを高分子の異化時においてオリゴ糖、糖タンパク質および糖脂質から除去することを触媒する。リソソーム酵素の欠損は、それらの基質が組織に蓄積すること、すなわち、リソソーム蓄積症として知られている状態をもたらす。ヒトにおいては、機能的α−ガラクトシダーゼ−Ａが存在しない場合、末端α−ガラクトース残基を含有する糖脂質（主にグロボトリアオシルセラミド、これはまた、「セラミドトリヘキソシド」、「ＣＴＨ」または「Ｇｂ３」とも呼ばれる）が組織に蓄積することが引き起こされ、その結果、ファブリー病に至る。ファブリー病は、Ｘ連鎖劣性障害であり、１８９８年に初めて記述された、慢性痛、眼の混濁、肝障害および腎障害、皮膚病変、血管の衰退ならびに／または心臓の運動障害を特徴とする障害である。組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａは、酵素機能を患者において回復させることができ、α−ＧＡＬを使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）が、合衆国において２００３年に、ファブリー病に対する処置として承認された。α−ＧＡＬが、β−グルコシダーゼの後のリソソーム蓄積病を処置するために、すなわち、ゴーシェ病に対する処置のために承認された第２の組換えタンパク質となった。
内因性α−ＧＡＬおよび組換えα−ＧＡＬは、末端ガラクトシル化糖脂質の加水分解を様々な器官（例えば、肝臓、腎臓、脾臓、心臓など）の細胞のリソソームにおいて触媒する。この正常な作用部位は、その低いｐＨ、すなわち、４．５にも低くなるｐＨによって特徴づけられる。したがって、α−ＧＡＬを含めて、リソソーム酵素は、それらの最大活性をこのような低いｐＨレベルで発揮するように設計されている。
現在のファブリー病ＥＲＴ処置は、処置効力が限定されていると見なされる哺乳動物細胞由来の組換えα−ＧＡＬに基づいている。これらの処置は疾患の進行を遅らせるだけであり、その進行を停止させることができず、また、真の完全な解決をもたらしていない。さらには、場合により、市販の組換えα−ＧＡＬを用いたＥＲＴは、処置に対する免疫原性応答の発症のために中断しなければならず、また、場合により、免疫原性の問題を考慮すると、処置を開始することができない。
Ｘ線構造解析により、ヒトα−ＧＡＬがホモダイマーの糖タンパク質であり、それぞれのモノマーが２つのドメインから、すなわち、活性部位を含有する（β／α）８ドメインと、８個の逆平行β鎖をβサンドイッチで２つのシートの表面に含有するＣ末端ドメインとから構成されることが解明されている［Ｇａｒｍａｎ＆Ｇａｒｂｏｃｚｉ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００４、３３７：３１９〜３３５］。これら２つのモノマーは頭尾型の組立てで配置され、ダイマー化は非共有結合である。これら２つのモノマーは、ダイマーの７５Åの幅を広げ、２２００Å２の表面積を埋める境界部分を伴って詰まる。ダイマー境界部分において、それぞれのモノマーからの３０残基が境界部分に寄与する。ダイマーの２つの活性部位はおよそ５０Å離れている。
α−Ｇａｌの結晶構造が、リガンドを含まないタンパク質について、同様にまた、ガラクトースをリガンドとするタンパク質について解明された。それら２つの構造は、リガンド含有構造と、リガンド非含有構造との間において変化をほとんど示していない。それにもかかわらず、ガラクトースを天然基質のグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の代わりに使用することでは、この場合、後者は、一方のモノマーの疎水性ドメインと相互作用することができる長い脂質鎖によって特徴づけられ、一方で、末端ガラクトースが第２のモノマーの活性部位と相互作用するので、活性部位の協同性の証拠をもたらしていないかもしれない。さらには、生化学的証拠はそのような協同性を示唆しておらず、このことはホモダイマーの四次構造の重要性を例証していない［Ｂｉｓｈｏｐ＆Ｄｅｓｎｉｃｋ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９８１、２５６：１３０７〜１３１６］。したがって、ヒトα−Ｇａｌの動力学的性質が調べられ、ホモダイマー酵素のモノマー（それぞれのモノマーが、相互作用する触媒部位を有する）の間における協同性が示された。したがって、酵素の活性および安定性がダイマー化に依存しているかもしれないことが示唆された。
国際公開ＷＯ２００９／０２４９７７（これは本譲受人によるものであり、全体が本明細書中に示されるかのように参照によって組み込まれる）は、糖類と、生体分子とのコンジュゲートで、非疎水性リンカーを介して両者間が共有結合で連結されるコンジュゲート、ならびに、そのようなコンジュゲートを利用する医療使用を教示する。
ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００９５６（これは本譲受人によるものである）は、リソソーム活性をリソソームのｐＨよりも高いｐＨレベルにおいて示すα−ガラクトシダーゼを利用する方法論を教示する。
さらなる背景技術には、Ｂｅｎｄｅｌｅ他［Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９８、４２：１５２〜１５７］、米国特許第５２５６８０４号、同第５５８０７５７号および同第５７６６８９７号、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０６８４（国際公開ＷＯ２００８／０７５９５７として公開）、ならびに、Ｓｅｅｌｙ＆Ｒｉｃｈｅｙ［Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、２００１、９０８：２３５〜２４１］が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、連結成分を介して互いに共有結合で連結された少なくとも２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む多量体型タンパク質構造体であって、下記の特性からなる群から選択される特性を特徴とする多量体型タンパク質構造体が提供される：
（ａ）天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｂ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｃ）多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたとき、実質的に変化しないままであるα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｄ）天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１週間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１週間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｅ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１日間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｆ）多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたとき、実質的に変化しないままであるα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｇ）多量体型タンパク質の天然型形態をリソソーム条件にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｈ）天然型α−ガラクトシダーゼを、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体を、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；および
（ｉ）天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも少なくとも２０％大きい生理学的システムにおける循環半減期。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、連結成分を介して互いに共有結合で連結された少なくとも２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む多量体型タンパク質構造体であって、連結成分が天然型α−ガラクトシダーゼにおいて存在しない多量体型タンパク質構造体が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるような多量体型タンパク質構造体と、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ファブリー病を処置する方法であって、本明細書中に記載されるような多量体型タンパク質構造体の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与し、それにより、当該ファブリー病を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるような多量体型タンパク質構造体を調製するプロセスであって、α−ガラクトシダーゼを、本明細書中に記載される連結成分と、少なくとも２つの反応基とを含む架橋剤と反応させることを含むプロセスが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書中に記載される連結成分は天然型α−ガラクトシダーゼにおいて存在しない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は、下記の特性からなる群から選択される特性を特徴とする：
（ａ）天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｂ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｃ）多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたとき、実質的に変化しないままであるα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｄ）天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１週間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１週間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｅ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１日間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｆ）多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたとき、実質的に変化しないままであるα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｇ）天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；
（ｈ）天然型α−ガラクトシダーゼを、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体を、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；および
（ｉ）天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも大きい生理学的システムにおける循環半減期。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたとき、実質的に変化しないままである多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼ活性はさらに、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１週間さらしたとき、実質的に変化しないままである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも大きい多量体型タンパク質構造体の循環半減期は、天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも少なくとも２０％大きい。
本発明のいくつかの実施形態によれば、天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも大きい多量体型タンパク質構造体の循環半減期は、天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも少なくとも５０％大きい。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は、多量体型タンパク質構造体を脊椎動物に投与したときの器官におけるα−ガラクトシダーゼ活性によって特徴づけられ、器官は、脾臓、心臓および腎臓からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含み、当該タンパク質構造体はダイマー型タンパク質構造体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−ガラクトシダーゼはヒトα−ガラクトシダーゼである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−ガラクトシダーゼは植物組換えα−ガラクトシダーゼである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−ガラクトシダーゼは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−ガラクトシダーゼはアルカリ性α−ガラクトシダーゼである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−ガラクトシダーゼは酸性α−ガラクトシダーゼである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記連結成分はポリ（アルキレングリコール）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリ（アルキレングリコール）は少なくとも２つの官能基を含み、それぞれの官能基が上記α−ガラクトシダーゼモノマーの１つとの共有結合を形成する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも２つの官能基は上記ポリ（アルキレングリコール）の末端基である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの連結成分は下記一般式を有する：
−Ｘ１−（ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙ）ｎ−Ｘ２−
式中、Ｘ１およびＸ２の各々は、少なくとも１つのα−ガラクトシダーゼモノマーとの共有結合を形成する官能基であり；
ＹはＯ，ＳまたはＮＲ５であり；
ｎは１〜２００の整数であり：および
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５の各々は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、オキソ、チオールおよびチオアルコキシからなる群から独立して選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記官能基の少なくとも１つがα−ガラクトシダーゼモノマーとのアミド結合を形成する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｎは５〜１５０の整数である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｎは４０〜７０の整数である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医薬組成物はさらに、ガラクトースを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記多量体型タンパク質構造体は、医薬品として使用されるためのものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医薬品は、ファブリー病を処置するためのものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記多量体型タンパク質構造体は、ファブリー病を処置する際に使用されるためのものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記プロセスは、ダイマー型α−ガラクトシダーゼを上記架橋剤と反応させることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記反応基は脱離基を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記反応基はアミノ基と反応して、アミド結合を形成する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記反応基のそれぞれが、共有結合を、上記連結成分と、少なくとも１つのα−ガラクトシダーゼモノマーとの間で形成することができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、α−ガラクトシダーゼのモノマーに対する上記架橋剤のモル比が５：１〜５００：１の範囲にある。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記モル比は７５：１〜３００：１の範囲にある。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
特許出願のファイルはカラーで描かれた少なくとも一枚の図面を含む。このカラー図面を有する特許出願公開物は要求および必要な費用の支払いにより特許庁により提供されるだろう。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１は、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬ、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬおよび植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの活性を模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）下でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図２は、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬ、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、および、ガラクトース（１００ｍｇ／ｍｌ）を伴う植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの活性を模擬生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃）下でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図３は、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬ、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬおよび植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの活性をヒト血漿の３７℃でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図４は、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬ、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、および、ガラクトース（１００ｍｇ／ｍｌ）を伴う植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの活性を模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）下でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図５は、例示的なビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリ（エチレングリコール）（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）架橋剤の分子構造を示す図である。
図６は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ架橋剤と反応したダイマー型タンパク質を示す図である。
図７は、植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５（レーン１〜３）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８（レーン７〜９）およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（レーン４〜６）と、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比が５０：１（レーン１、４および７）、１００：１（レーン２、５および８）および２００：１（レーン３、６および９）で反応させたもの）、ならびに、分子量マーカー（Ｍｗ）および非反応の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ標準物（Ｓｔｄ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査したものを示す（矢印は、α−ＧＡＬダイマーを含むバンドを示す）。
図８は、植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５（レーン１〜３）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８（レーン７〜９）およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（レーン４〜６）と、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比が５０：１（レーン１、４および７）、１００：１（レーン２、５および８）および２００：１（レーン３、６および９）で反応させたもの）、ならびに、ｐＨマーカー（Ｍ）および非反応の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ標準物（Ｓｔｄ）を示す等電点フォーカシングゲルを走査したものを示す（矢印は様々なバンドについてｐＨ値を示す）。
図９は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−ＩのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法スペクトルである（ｘ軸はｍ／ｚ値を示し、ピークのｍ／ｚ値が示される）。
図１０は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８によって架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−ＩのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法スペクトルである（ｘ軸はｍ／ｚ値を示し、ピークのｍ／ｚ値が示される）。
図１１は、α−ＧＡＬ基質のＮ−ドデカノイル−ニトロベンゾオキサジアゾール−セラミドトリヘキソシド（Ｇｂ３−ＮＢＤ）およびα−ＧＡＬ反応生成物のラクトシルセラミド−ニトロベンゾオキサジアゾール（ラクトシルセラミド−ＮＢＤ）を示す写真で、基質Ｇｂ３−ＮＢＤを、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（左レーン）、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（中央レーン）、および、α−ＧＡＬ非存在（右レーン）とインキュベーションした後、高性能薄層クロマトグラフィー後のＵＶ光（３６５ｎｍ）下での照射によって可視化されるときの写真を示す。
図１２Ａ−１２Ｂは、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬ、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５（図１２Ａ）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８（図１２Ｂ）およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（図１２Ｃ）により、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比が５０：１（図１２Ａにおける「１」、図１２Ｂにおける「７」および図１２Ｃにおける「４」）、１００：１（図１２Ａにおける「２」、図１２Ｂにおける「８」および図１２における「５」）および２００：１（図１２Ａにおける「３」、図１２Ｂにおける「９」および図１２Ｃにおける「６」）で架橋されるもの）の活性を模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）下でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。 図１２Ｃは、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬ、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５（図１２Ａ）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８（図１２Ｂ）およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（図１２Ｃ）により、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比が５０：１（図１２Ａにおける「１」、図１２Ｂにおける「７」および図１２Ｃにおける「４」）、１００：１（図１２Ａにおける「２」、図１２Ｂにおける「８」および図１２における「５」）および２００：１（図１２Ａにおける「３」、図１２Ｂにおける「９」および図１２Ｃにおける「６」）で架橋されるもの）の活性を模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）下でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図１３は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩのＦａｂｒｙマウスの血漿における薬物動態学プロフィルを示すグラフである；それぞれのα−ＧＡＬの残存活性が、α−ＧＡＬ注入後の時間の関数として、それぞれのα−ＧＡＬの最大残存活性の百分率として示される。
図１４Ａ−１４Ｂは、α−ＧＡＬ注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの脾臓におけるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ８）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５））の活性を示すグラフ（図１４Ａ）、ならびに、α−ＧＡＬ注入後のＦａｂｒｙマウスの脾臓におけるα−ＧＡＬ（レーン１〜１２）、または、５０ｎｇのα−ＧＡＬからなる標準物（レーン１３〜１５）としての、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（レーン１０〜１２および１５）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（レーン７〜９および１３）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋（レーン４〜６）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（レーン１〜３および１４））を示すウエスタンブロットの写真（図１４Ｂ）を示す。
図１５Ａ−１５Ｂは、α−ＧＡＬ注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの肝臓におけるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ８）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５））の活性を示すグラフ（図１５Ａ）、ならびに、α−ＧＡＬ注入後のＦａｂｒｙマウスの肝臓におけるα−ＧＡＬ（レーン１〜１２）、または、５０ｎｇのα−ＧＡＬからなる標準物（レーン１３〜１５）としての、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（レーン１０〜１２および１５）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（レーン７〜９および１３）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋（レーン４〜６）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（レーン１〜３および１４））を示すウエスタンブロットの写真（図１５Ｂ）を示す。
図１６は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ８）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５））の活性をα−ＧＡＬ注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの心臓において示すグラフである。
図１７は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ８）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５））の活性をα−ＧＡＬ注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの腎臓において示すグラフである。
図１８は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５）の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間、２４時間、３日および７日でのＦａｂｒｙマウスの脾臓において示すグラフである（内因性の野生型α−ＧＡＬ（ＷＴ）が標準物として示される）。
図１９は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５）の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間、２４時間、３日および７日でのＦａｂｒｙマウスの肝臓において示すグラフである（内因性の野生型α−ＧＡＬ（ＷＴ）が標準物として示される）。
図２０は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５）の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間、２４時間、３日および７日でのＦａｂｒｙマウスの心臓において示すグラフである（内因性の野生型α−ＧＡＬ（ＷＴ）が標準物として示される）。
図２１は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５）の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間、２４時間、３日および７日でのＦａｂｒｙマウスの腎臓において示すグラフである（内因性の野生型α−ＧＡＬ（ＷＴ）が標準物として示される）。
図２２は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（左レーン）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応させたＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（中央レーン）、ならびに、分子量マーカー（右レーン）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像の写真を示す（マーカーの分子量がＫＤａ単位で示される）。
図２３は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（左レーン）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応させたＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（中央レーン）、ならびに、ｐＨマーカー（右レーン）を示す等電点フォーカシングゲルの写真を示す。
図２４Ａ−２４Ｂは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（図２４Ａ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法スペクトルである（ｘ軸はｍ／ｚ値を示し、ピークのｍ／ｚ値（Ｄａ単位）が示される）。
図２５は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ ＣＬ４５）によるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＰ−Ｇ）の加水分解の速度（Ｖ）をｐＮＰ−Ｇ濃度の関数として示すミカエリス−メンテン・プロットである。
図２６Ａ−２６Ｂは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ−ＣＬ４５）の活性を、模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）のもと（図２６Ａ）または３７℃でのヒト血漿（図２６Ｂ）におけるインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図２７Ａ−２７Ｂは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ−ＣＬ４５）の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの脾臓（図２７Ａ）、肝臓（図２７Ｂ）、心臓（図２７Ｃ）および腎臓（図２７Ｄ）において示すグラフである。 図２７Ｃ−２７Ｄは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ−ＣＬ４５）の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの脾臓（図２７Ａ）、肝臓（図２７Ｂ）、心臓（図２７Ｃ）および腎臓（図２７Ｄ）において示すグラフである。
図２８Ａ−２８Ｂは、Ｆａｂｒｙマウスの心臓（図２８Ａ）、腎臓（図２８Ｂ）、肝臓（図２８Ｃ）および脾臓（図２８Ｄ）におけるＧｂ３レベルを、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ）、または、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ−ＣＬ４５）の注入後の時間の関数として示すグラフである。 図２８Ｃ−２８Ｄは、Ｆａｂｒｙマウスの心臓（図２８Ａ）、腎臓（図２８Ｂ）、肝臓（図２８Ｃ）および脾臓（図２８Ｄ）におけるＧｂ３レベルを、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ）、または、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒ−ＣＬ４５）の注入後の時間の関数として示すグラフである。
図２９Ａ−２９Ｂは、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図２９Ａおよび２９Ｂ、レーン２）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１と反応させた植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図２９Ａ、レーン３）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応させた植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図２９Ａ、レーン４）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８と反応させた植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図２９Ｂ、レーン３）、ならびに、分子量マーカー（図２９Ａおよび２９Ｂ、レーン１）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像のスキャンを示す（マーカーの分子量がＫＤａ単位で示される）。
図３０Ａ−３０Ｃは、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図３０Ａ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１によって架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図３０Ｂ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図３０Ｃ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法スペクトルである（ｘ軸はｍ／ｚ値を示し、ピークのｍ／ｚ値（Ｄａ単位）が示される）。
図３１Ａ−３１Ｂは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３１Ａおよび図３１Ｃ）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３１Ａ〜図３１Ｄ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ６８；図３１Ｂおよび図３１Ｄ））の活性を、模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）のもと（図３１Ａおよび図３１Ｂ）または３７℃でのヒト血漿（図３１Ｃおよび図３１Ｄ）におけるインキュベーション時間の関数として示すグラフである（図３１Ｃおよび図３１Ｄに示されるデータは異なる実験からのものである）。 図３１Ｃ−３１Ｄは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３１Ａおよび図３１Ｃ）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３１Ａ〜図３１Ｄ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ６８；図３１Ｂおよび図３１Ｄ））の活性を、模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）のもと（図３１Ａおよび図３１Ｂ）または３７℃でのヒト血漿（図３１Ｃおよび図３１Ｄ）におけるインキュベーション時間の関数として示すグラフである（図３１Ｃおよび図３１Ｄに示されるデータは異なる実験からのものである）。
図３２Ａ−３２Ｂは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５））のＦａｂｒｙマウスの血漿における薬物動態学プロフィルを示すグラフである；それぞれのα−ＧＡＬの濃度がα−ＧＡＬ注入後の時間の関数として示される（図３２Ａおよび図３２Ｂは、同じデータを異なる時間枠で示す）。
図３３Ａ−３３Ｂは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３３Ａ〜図３３Ｌ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３３Ｅ〜図３３Ｌ））の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間（図３３Ａ〜図３３Ｈ）、７日（図３３Ａ〜図３３Ｄおよび図３３Ｉ〜図３３Ｌ）、１４日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）および２８日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）でのＦａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において示すグラフである。 図３３Ｃ−３３Ｄは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３３Ａ〜図３３Ｌ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３３Ｅ〜図３３Ｌ））の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間（図３３Ａ〜図３３Ｈ）、７日（図３３Ａ〜図３３Ｄおよび図３３Ｉ〜図３３Ｌ）、１４日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）および２８日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）でのＦａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において示すグラフである。 図３３Ｅ−３３Ｆは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３３Ａ〜図３３Ｌ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３３Ｅ〜図３３Ｌ））の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間（図３３Ａ〜図３３Ｈ）、７日（図３３Ａ〜図３３Ｄおよび図３３Ｉ〜図３３Ｌ）、１４日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）および２８日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）でのＦａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において示すグラフである。 図３３Ｇ−３３Ｈは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３３Ａ〜図３３Ｌ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３３Ｅ〜図３３Ｌ））の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間（図３３Ａ〜図３３Ｈ）、７日（図３３Ａ〜図３３Ｄおよび図３３Ｉ〜図３３Ｌ）、１４日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）および２８日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）でのＦａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において示すグラフである。 図３３Ｉ−３３Ｊは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３３Ａ〜図３３Ｌ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３３Ｅ〜図３３Ｌ））の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間（図３３Ａ〜図３３Ｈ）、７日（図３３Ａ〜図３３Ｄおよび図３３Ｉ〜図３３Ｌ）、１４日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）および２８日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）でのＦａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において示すグラフである。 図３３Ｋ−３３Ｌは、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５；図３３Ａ〜図３３Ｌ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ２１；図３３Ｅ〜図３３Ｌ））の活性を、α−ＧＡＬ注入後２時間（図３３Ａ〜図３３Ｈ）、７日（図３３Ａ〜図３３Ｄおよび図３３Ｉ〜図３３Ｌ）、１４日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）および２８日（図３３Ａ〜図３３Ｄ）でのＦａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において示すグラフである。
図３４Ａ−３４Ｂは、動力学的パラメーターのＶｍａｘ（図３４Ａ）、ＫＭ（図３４Ｂ）およびｋｃａｔ（図３４Ｃ）を、ｐＨの関数として、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５）について示すグラフである。 図３４Ｃは、動力学的パラメーターのＶｍａｘ（図３４Ａ）、ＫＭ（図３４Ｂ）およびｋｃａｔ（図３４Ｃ）を、ｐＨの関数として、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−ａｌｐｈａ−ＧＡＬ−ＩＩ−ＣＬ４５）について示すグラフである。
図３５は、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−Ｇａｌ−Ｉ）、および、メトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧと反応させた植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（分子量が２ＫＤａであるメトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧ（ｐｒｈ−α−Ｇａｌ−Ｉ−ＰＥＧ２０００）、分子量が５ＫＤａであるメトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧ（ｐｒｈ−α−Ｇａｌ−Ｉ−ＰＥＧ５０００）、または、分子量が１０ＫＤａであるメトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧ（ｐｒｈ−α−Ｇａｌ−Ｉ−ＰＥＧ１００００））、ならびに、分子量マーカー（左レーン）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査したものを示す（マーカーの分子量がＫＤａ単位で示される）。
図３６Ａ−３６Ｂは、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、および、メトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧと反応させた植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（分子量が２ＫＤａであるメトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧ（α−Ｇａｌ−Ｉ−ＰＥＧ２０００）、分子量が５ＫＤａであるメトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧ（α−Ｇａｌ−Ｉ−ＰＥＧ５０００）、または、分子量が１０ＫＤａであるメトキシキャップ化ＮＨＳ−ＰＥＧ（α−Ｇａｌ−Ｉ−ＰＥＧ１００００））の活性を、模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）のもと（図３６Ａ）または３７℃でのヒト血漿（図３６Ｂ）におけるインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図３７は、植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２（レーン１〜３）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４（レーン４〜６）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８（レーン７〜９）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ１５０（レーン１０〜１２）およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（ＣＬ４５）と、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比が５０：１（レーン１、４、７および１０）、１００：１（レーン２、５、８および１１）および２００：１（レーン３、６、９および１２）で反応させたもの）、ならびに、分子量マーカー（ＭＷ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査したものを示す。
図３８は、植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ１２（レーン１〜３）、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ２８（レーン４〜６）、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５（レーン７〜９）、および、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（ＣＬ４５）と、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比が５０：１（レーン１、４および７）、１００：１（レーン２、５および８）および２００：１（レーン３、６および９）で反応させたもの）、ならびに、分子量マーカー（ＭＷ）、および、コントロールとしての非架橋の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ（ｃｏｎ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査したものを示す。
図３９は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）、および、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４５）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４架橋（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ４）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２架橋（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬ２）、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５架橋（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬＡ４５）、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ２８架橋（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬＡ２８）またはビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ１２架橋（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ−ＣＬＡ１２））の活性を模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）下でのインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
図４０Ａ−４０Ｂは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの活性を、模擬リソソーム条件（クエン酸塩リン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６、３７℃）のもと（図４０Ａ）または３７℃でのヒト血漿（図４０Ｂ）におけるインキュベーション時間の関数として示すグラフである（図４０ＢはＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬおよび非架橋の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩを比較のために示す）。
図４１は、３回の異なる回分処理から得られる植物組換えα−ＧＡＬ−ＩＩ（レーン１〜３）、および、５回の異なる回分処理から得られる、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応させた植物組換えα−ＧＡＬ−ＩＩ（レーン４〜８）、ならびに、分子量マーカー（ＭＷ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査したものである。
図４２は、３回の異なる回分処理から得られる植物組換えα−ＧＡＬ−ＩＩ（レーン１〜３）、および、５回の異なる回分処理から得られる、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応させた植物組換えα−ＧＡＬ−ＩＩ（レーン４〜８）、ならびに、ｐＨマーカー（Ｍ）を示す等電点フォーカシングゲルを走査したものである。
図４３Ａ−４３Ｃは、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図４３Ａ）、および、５回の異なる回分処理から得られる、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋される植物ヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（それぞれ、図４３Ｂ〜図４３Ｆ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法スペクトルである（ｘ軸はｍ／ｚ値を示し、ピークのｍ／ｚ値（Ｄａ単位）が示される）。 図４３Ｄ−４３Ｆは、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（図４３Ａ）、および、５回の異なる回分処理から得られる、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋される植物ヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（それぞれ、図４３Ｂ〜図４３Ｆ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法スペクトルである（ｘ軸はｍ／ｚ値を示し、ピークのｍ／ｚ値（Ｄａ単位）が示される）。
図４４は、５回の異なる回分処理から得られる、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋される植物ヒトα−ＧＡＬ−ＩＩにより示されるα−ＧＡＬ活性の触媒作用速度（Ｖ）を基質（ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）濃度の関数として示すグラフである。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、新規な多量体型タンパク質構造体に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、α−ガラクトシダーゼの多量体型タンパク質構造体およびファブリー病の処置におけるその使用に関連する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
リソソームタンパク質の欠乏（例えば、リソソームタンパク質における欠陥またはリソソームタンパク質の非存在）は、対象の健康に対する相当の害（リソソーム蓄積症）を生じさせ得る。欠乏しているタンパク質が患者に投与される酵素補充療法（ＥＲＴ）がこれまで、リソソーム蓄積症を処置する試みにおいて使用されている。しかしながら、欠乏タンパク質の投与は、当該タンパク質の活性における相当かつ／または持続的な増大をインビボにおいて必ずしももたらしていない。
ファブリー病は、広範囲の様々な全身性症状を引き起こし得るＸ連鎖の劣性（遺伝性）リソソーム蓄積症の一例である。変異に起因するリソソーム酵素α−ガラクトシダーゼＡの欠乏により、グロボトリアオシルセラミド（これはまた、Ｇｂ３またはセラミドトリヘキソシドとして知られている）として知られている糖脂質が血管、他の組織および器官の内部に蓄積することが生じる。この蓄積はそれらの適正な機能の障害を引き起こす。２つの酵素補充療法（ＥＲＴ）が、α−ガラクトシダーゼ欠乏症を機能的に補償するために利用可能である。アガルシダーゼアルファ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ）およびアガルシダーゼベータ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ）はともに、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ酵素の組換え形態である。これらの酵素は製造が困難であり、そのようなものとして高価である。近年、ＧｅｎｚｙｍｅのＡｌｌｓｔｏｎ（ＭＡ）工場での汚染はアガルシダーゼベータの世界的不足を生じさせ、供給量が推奨用量の１／３で患者に対して制限された。
本明細書中で示されるように、様々なα−ガラクトシダーゼがそれらの最大活性をリソソームに特徴的な低いｐＨレベルにおいて発揮し、一方で、より高いｐＨレベルにおけるそれらの活性が損なわれている。したがって、例えば、ＥＲＴで使用されるα−ガラクトシダーゼは、末端ガラクトシル化糖脂質をファブリー病患者の血清において加水分解することがほとんどできないであろう。
そのうえ、本明細書中においてさらに示されるように、リソソーム条件下でさえ、α−ガラクトシダーゼの活性が、より高いｐＨレベルでの場合よりも遅い速度ではあるが、徐々に損なわれる。
α−ガラクトシダーゼの損なわれた活性を解決する必要性によって動機づけられて、本発明者らは、α−ガラクトシダーゼ（α−ＧＡＬ）の安定化形態について探索を行ってきた。より具体的には、本発明者らは、α−ガラクトシダーゼの安定化形態は、血清中でのより長く持続する活性を含めて、より長く持続する活性を一般に示すであろうと想定している。したがって、本発明者らは天然型α−ガラクトシダーゼの安定化形態を設計し、その調製および実施に成功し、そして、そのような安定化形態が、リソソーム条件下および血清環境中の両方における高まった活性および／またはより長く持続する活性の点で、改善された成績を示し、これにより、インビボにおけるこのタンパク質の高まった活性が可能となることを実際に示している。
本発明者らは、α−ガラクトシダーゼモノマー間の新しい共有結合性連結の形成を介して天然型α−ガラクトシダーゼを架橋することによる、改善された成績を示すα−ガラクトシダーゼの安定化形態の形成を明らかにしている。
次に図面を参照して、図１および図４は、リソソーム条件下における酵素活性の低下を植物組換えヒトα−ＧＡＬ Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ Ｉ）ならびにＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）α−ＧＡＬおよびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬについて示す。図２および図３は、模擬生理学的条件下またはヒト血漿中における酵素活性の低下を同じα−ＧＡＬ変化体について示す。図２および図４は、ガラクトースがα−ＧＡＬ活性における低下の割合を減少させることを示す。
図５は、本発明の選択可能な実施形態によるものであるが、例示的なＰＥＧ（ポリエチレングリコール）架橋剤を示す。図６は、本発明の選択可能な実施形態による架橋されたα−ＧＡＬダイマーを示す。
図７〜図１０および図３７は、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド成分を含む例示的な架橋剤と反応したことを示す。図３８は、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるインサイチュー活性化の後、カルボキシル基を含む例示的な架橋剤と反応したことを示す。図７、図３７および図３８は、架橋剤との反応により、変性条件下において、モノマー型形態ではなく、むしろ、ダイマー型形態で主として現るα−ＧＡＬが生じたことを示す。このことは、α−ＧＡＬの四次構造が共有結合による架橋によって維持されたことを示している。図１１は、架橋されたα−ＧＡＬがその酵素活性を保持したことを示す。
図１２Ａ〜図１２Ｃおよび図３９は、架橋されたｐｒｈ α−ＧＡＬ−Ｉが、模擬リソソーム条件下において非架橋のα−ＧＡＬよりも長く持続する活性を示すことを示す。安定性における増大が、ＰＥＧ２８リンカーおよびＰＥＧ４５リンカーについては、より短いＰＥＧリンカーの場合よりも強い。図１３は、架橋されたｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、インビボにおける血漿中において非架橋のα−ＧＡＬよりも長く持続する活性を示すことを示す。図１４Ａ〜図２１は、架橋されたｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、高まった活性を、脾臓、肝臓、心臓および腎臓でのインビボにおいて示すことを示す。α−ＧＡＬ活性の高まりが、ＰＥＧ４５リンカーについては、より短いＰＥＧリンカーの場合よりも強い。図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１９は、架橋されたｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、高まった活性をインビボにおいて示すが、高まった活性が、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬ活性が集中するほど、肝臓に集中していないことを示す。
上記の結果は、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉを架橋することにより、インビボ投与されたとき、α−ＧＡＬ活性のより効果的な増大を可能にする改善された安定性を有するダイマーがもたらされることを示している。
同様に、図２２〜図２８Ｄは、哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬを架橋することにより、共有結合で連結されたダイマーがもたらされ（図２２〜図２４Ｂ）、この共有結合連結ダイマーは、正常な酵素活性（図２５）、同様にまた、リソソーム条件下および血漿中の両方でのより長く持続する活性（図２６Ａ〜図２６Ｂ）、そして、脾臓、肝臓、心臓および腎臓でのインビボにおける高まった活性（図２７Ａ〜図２８Ｄ）を示すことを示す。
同様に、図２９Ａ〜図３３Ｌは、植物組換えヒトα−ＧＡＬ ＩＩを架橋することにより、共有結合で連結されたダイマーがもたらされ（図２９〜図３０）、この共有結合連結ダイマーは、リソソーム条件下および血漿中の両方でのより長く持続する活性（図３１Ａ〜図３１Ｂ）、ならびに、血漿中、そして、脾臓、肝臓、心臓および腎臓でのインビボにおける高まった活性（図３２Ａ〜図３３Ｌ）を示すことを示す。図３３Ａ〜図３３Ｌに示されるように、ＰＥＧ４５リンカーにより架橋することが、インビボ活性を高めることにおいて特に効果的であった。
これらの結果は、架橋することの好都合な効果が様々なα−ＧＡＬタンパク質に対して適用可能であることを示している。
図３４Ａ〜図３４Ｃは、α−ＧＡＬを架橋することにより、α−ＧＡＬの酵素触媒作用のパラメーターが強化され、α−ＧＡＬ活性のためのｐＨ範囲が広がり、かつ、α−ＧＡＬ活性が約７以上のｐＨで可能となることを示す。
図３５〜図３６Ｂは、架橋を伴わないＰＥＧ化はα−ＧＡＬ活性に対する著しい影響を何ら有していないことを示す。このことは、架橋することの好都合な効果が具体的には、ＰＥＧ化の効果に起因するのではなく、むしろ、架橋に起因することを示している。
図４０〜図４４は、α−ＧＡＬを本発明の実施形態に従って架橋することにより、架橋されたα−ＧＡＬの安定性（図４０Ａ〜図４０Ｂ）、共有結合架橋度（図４１〜図４３Ｆ）および酵素特性（図４４）の良好な再現性が可能となることを示す。
本明細書中に示される結果は、共有結合で連結されたα−ガラクトシダーゼの多量体型タンパク質構造体が、α−ガラクトシダーゼの天然型形態と比較した場合、生理学的に妥当な条件のもとでのより大きい安定性および高まった活性によって特徴づけられることを示す。
したがって、共有結合で連結された多量体型タンパク質構造体は、天然型形態の活性が、共有結合による架橋によって安定化される架橋された多量体型タンパク質構造体の活性よりも速く時間とともに低下することの結果として、α−ガラクトシダーゼの天然型形態の活性よりも大きい活性を示すかもしれない。
共有結合で連結された多量体型タンパク質構造体は、同様にまた、より大きい初期活性のために（例えば、活性の異なるパラメーターのために）、すなわち、時間の経過に伴う活性の何らかの低下とは無関係に、α−ガラクトシダーゼの天然型形態の活性よりも大きい活性を示すかもしれない。
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、連結成分を介して互いに共有結合で連結された少なくとも２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む多量体型タンパク質構造体が提供される。いくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は、下記で詳しく記載されるように、天然型α−ガラクトシダーゼの安定性よりも大きい安定性、および／または、天然型α−ガラクトシダーゼの初期活性よりも大きい初期活性を特徴とする。
本明細書中において、α−ガラクトシダーゼに関する用語「モノマー」は、α−ガラクトシダーゼの個々のポリペプチドを示す。前記ポリペプチドは非ペプチド置換基（例えば、１つまたは複数の糖類成分）を含むことができる。
本明細書中において、α−ガラクトシダーゼに関する用語「天然型」は、天然に存在するα−ガラクトシダーゼタンパク質のアミノ酸配列に対して実質的に同一である（すなわち、少なくとも９５％相同性、場合により少なくとも９９％相同性、また、場合により１００％である）アミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。天然型α−ガラクトシダーゼは、天然の供給源から単離されるタンパク質、または、組換え産生されたタンパク質（例えば、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞に由来するもの）であってもよい。
用語「天然型」は、α−ガラクトシダーゼ（例えば、α−ガラクトシダーゼダイマー）の四次構造に関して使用されるときには、天然に存在するタンパク質の四次構造と実質的に同一である四次構造をさらに含む。
本明細書中において、表現「天然に存在するタンパク質」は、タンパク質が多量体型形態であるならば、タンパク質のアミノ酸配列、同様にまた、タンパク質の四次構造に関して、自然界に（例えば、生物において）存在する形態でのタンパク質を示す。
天然に存在するα−ガラクトシダーゼタンパク質の、（例えば、天然に存在するα−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する生物における）翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）が、本明細書中で参照されるα−ガラクトシダーゼの天然型形態において存在してもよく、存在しなくてもよく、または、改変されてもよい。α−ガラクトシダーゼの天然型形態（例えば、組換え産生されたα−ガラクトシダーゼ）は、α−ガラクトシダーゼの天然型形態が、本明細書中上記で記載されるように、天然に存在するα−ガラクトシダーゼと実質的に類似するアミノ酸配列および構造を保持するならば、天然に存在するα−ガラクトシダーゼの翻訳後修飾とは異なる翻訳後修飾を場合により含むことができる。
本明細書中において、タンパク質の天然型形態はモノマー型構造体（例えば、α−ガラクトシダーゼモノマー）および／または多量体型構造体（例えば、α−ガラクトシダーゼダイマー）を示すことがある。例えば、ダイマー型タンパク質をα−ガラクトシダーゼの天然型形態として記載することができ、また、ダイマー型タンパク質におけるモノマーポリペプチドをα−ガラクトシダーゼモノマーの天然型形態として記載することができる。
場合により、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、α−ガラクトシダーゼの天然型形態がダイマー型構造体であるように、ダイマー型構造体である。
代替において、多量体型タンパク質構造体は３つ以上のα−ガラクトシダーゼモノマーを含む。例えば、多量体型タンパク質構造体は、α−ガラクトシダーゼモノマーから構成されるテトラマー、ヘキサマーまたはオクタマーであってもよい。
本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、その中のα−ガラクトシダーゼモノマーを連結し、かつ、α−ガラクトシダーゼの天然型形態には存在しない共有結合性の結合を含む。
場合により、α−ガラクトシダーゼモノマーを連結する連結成分は、α−ガラクトシダーゼの天然型形態には存在しない成分（例えば、合成された連結成分）である。
したがって、例えば、連結成分は場合により、α−ガラクトシダーゼモノマーの翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、Ｎ末端またはＣ末端、あるいは、成分（例えば、糖類成分）、同様にまた、別のα−ガラクトシダーゼモノマーの翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、Ｎ末端またはＣ末端、あるいは、成分（例えば、糖類成分）に共有結合で結合する成分である。例示的なそのような連結成分が本明細書中下記で詳しく記載される。
代替において、連結成分は、連結されているα−ガラクトシダーゼモノマーの一部を形成する（例えば、α−ガラクトシダーゼモノマーの翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、Ｎ末端またはＣ末端、あるいは、成分（例えば、糖類成分）の一部、同様にまた、別のα−ガラクトシダーゼモノマーの翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、Ｎ末端またはＣ末端、あるいは、成分（例えば、糖類成分）の一部）。
したがって、例えば、連結成分は、モノマーの翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端または成分の官能基（例えば、アミン）と、別のモノマーの翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端または成分の相補的な官能基（例えば、カルボキシル）との間における共有結合性の結合（例えば、アミド結合）が可能である（そのような共有結合性の結合はα−ガラクトシダーゼの天然型形態には存在しない）。他の共有結合性の結合、例えば、エステル結合（ヒドロキシ基と、カルボキシルとの間）、チオエステル結合、エーテル結合（２つのヒドロキシ基の間）、チオエーテル結合、無水物結合（２つのカルボキシルの間）、チオアミド結合、カルバマート結合またはチオカルバマート結合などもまた意図される。
場合により、連結成分はジスルフィド結合を有しない。しかしながら、ジスルフィド結合を、モノマー間の連結を形成しない位置に含む連結成分（例えば、このようなジスルフィド結合の切断はモノマー間の連結を切断しない）は、本発明のこの実施形態の範囲内である。ジスルフィド結合を有しない連結成分の潜在的利点が、ジスルフィド結合を有しない連結成分は、ジスルフィド結合が感受性であるような穏和な還元条件による切断に対して感受性がないことである。
場合により、連結成分は非ペプチド成分である（例えば、連結成分は、アミド結合、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドからならない）。
代替において、連結成分は、ペプチド成分（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド）であってもよく、または、ペプチド成分（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド）を含んでもよい。
場合により、連結成分は単に、それに結合するα−ガラクトシダーゼモノマーのいずれかの線状伸長物ではない（すなわち、ペプチド成分のＮ末端またはＣ末端がα−ガラクトシダーゼモノマーのいずれかのＣ末端またはＮ末端に直接に結合しない）。
代替において、連結成分が、融合ポリペプチドを生じさせるように、α−ガラクトシダーゼモノマーのＮ末端が別のα−ガラクトシダーゼモノマーのＣ末端と直接に共有結合で結合することによって形成される。そのようなポリペプチドはα−ガラクトシダーゼの天然型形態ではないであろう。だが、そのようなポリペプチドは２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを本質的にはそれらの天然型形態で含むことができる。
しかしながら、本明細書中に記載されるα−ガラクトシダーゼモノマーの共有結合性連結は好ましくは、Ｃ末端へのＮ末端の直接的連結とは異なる形態である。
連結成分はまた、本明細書中では架橋成分として示される。α−ガラクトシダーゼモノマーを連結成分によって連結することは、本明細書中では「架橋する」として示される。
架橋成分は、共有結合性の結合、化学的な原子または基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基、−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＲ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−など）、または、橋かけ成分（化学的な基の鎖から構成される）が可能である。
橋かけ成分は、例えば、ポリマー基又はオリゴマー基が可能である。
橋かけ成分は、翻訳後修飾に関連づけられる側鎖、成分（例えば、糖類成分）、および／または、モノマーの２つ以上の末端（すなわち、Ｎ末端、Ｃ末端）に結合する多官能性成分（例えば、二価基、三価基など）である。
本明細書中、実施例の節において例示されるように、比較的短い連結成分（例えば、ＰＥＧ２、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５）は、種々のα−ガラクトシダーゼモノマーの間を架橋することにおいて、より長い連結成分（例えば、ＰＥＧ２８、ＰＥＧ４５）よりも効果的でないかもしれない。
したがって、いくつかの実施形態によれば、連結成分は、共有結合性の結合、化学的な原子または基ではなく、むしろ、橋かけ成分である。
したがって、いくつかの実施形態によれば、連結成分は、少なくとも１０原子の長さであり、場合により少なくとも２０原子の長さであり、場合により少なくとも３０原子の長さであり、場合により少なくとも５０原子の長さであり、場合により少なくとも１００原子の長さであり、場合により少なくとも２００原子の長さである。
本明細書中において、連結成分の長さは（原子の数として表されるとき）、連結成分の骨格の長さ、すなわち、連結成分を介して連結される２つのモノマーのそれぞれの残基の間の線状鎖を形成する原子の数を示す。
場合により、連結成分は、形成された架橋タンパク質における連結成分の不必要に過度な部分（この部分は当該タンパク質の機能を妨害するかもしれない）を避けるように、特定のサイズよりも小さくされる。
したがって、いくつかの実施形態によれば、それぞれの連結成分は、２０ＫＤａ未満の分子量、場合により１０ＫＤａ未満の分子量、場合により５ＫＤａ未満の分子量、場合により３ＫＤａ未満の分子量によって特徴づけられる。
架橋を容易にするために、連結成分は場合により実質的に柔軟であり、この場合、連結成分の骨格における結合は、ほとんどが回転において自由であり、例えば、（例えば、アミド結合とは異なり）二重結合に結合せず、かつ、回転が立体的に妨げられない単結合である。場合により、連結成分の骨格における結合の少なくとも７０％、場合により少なくとも８０％、場合により少なくとも９０％（例えば、１００％）が回転において自由である。
いくつかの実施形態において、連結成分はポリ（アルキレングリコール）鎖を含む。
表現「ポリ（アルキレングリコール）」は、本明細書中で使用される場合、下記の一般式をともに有するポリエーテルポリマーの一群を包含する：−Ｏ−［（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−］ｎ−、式中、ｍは、それぞれのアルキレングリコールユニットに存在するメチレン基の数を表し、ｎは反復ユニットの数を表し、したがって、ポリマーのサイズまたは長さを表す。例えば、ｍ＝２であるとき、ポリマーはポリエチレングリコールとして示され、ｍ＝３であるとき、ポリマーはプロピレングリコールとして示される。
いくつかの実施形態において、ｍは、１よりも大きい整数である（例えば、ｍ＝２、３、４など）。
場合により、ｍはポリ（アルキレングリコール）鎖のユニットの中で変化する。例えば、ポリ（アルキレングリコール）鎖は、一緒に連結されるエチレングリコールユニット（ｍ＝２）およびプロピレングリコールユニット（ｍ＝３）の両方を含むことができる。
ポリ（アルキレングリコール）は場合により、少なくとも２つの官能基（例えば、本明細書中に記載されるような官能基）を含み、この場合、それぞれの官能基がα−ガラクトシダーゼモノマーの１つとの共有結合性の結合を形成する。そのような官能基は場合により、ポリ（アルキレングリコール）の末端基であり、その結果、ポリ（アルキレングリコール）の全長がこれら２つの官能基の間にある。
表現「ポリ（アルキレングリコール）」はまた、酸素原子が別のヘテロ原子（例えば、Ｓおよび−ＮＨ−など）によって置換されるそのアナログを包含する。この用語はさらに、ポリマーを構成するメチレン基の１つまたは複数が置換される上記の誘導体を包含する。メチレン基における例示的な置換基には、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、オキソ、チオールおよびチオアルコキシなどが含まれるが、これらに限定されない。
表現「アルキレングリコールユニット」は、本明細書中で使用される場合、ポリ（アルキレングリコール）の骨格鎖を形成する本明細書中上記で記載されるような−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−基またはそのアナログを包含し、この場合、（ＣＨ２）ｍ（またはそのアナログ）が、別のアルキレングリコールユニットに属するヘテロ原子に結合するか、または、（末端ユニットの場合には）α−ガラクトシダーゼモノマー成分に結合し、かつ、Ｏ（またはそのヘテロ原子アナログ）が別のアルキレングリコールユニットの（ＣＨ２）ｍ（またはそのアナログ）に結合するか、または、α−ガラクトシダーゼモノマーとの結合を形成する官能基に結合する。
アルキレングリコールユニットは、アルキレングリコールユニットが３つ以上の隣接アルキレングリコールユニットに連結されるように分岐していてもよく、この場合、これら３つ以上の隣接するアルキレングリコールユニットのそれぞれがポリ（アルキレングリコール）鎖の一部分である。そのような分岐したアルキレングリコールユニットは、１つの隣接するアルキレングリコールユニットにそのヘテロ原子を介して連結され、残る隣接するアルキレングリコールユニットのヘテロ原子がそれぞれ、分岐したアルキレングリコールユニットの炭素原子に連結される。加えて、ヘテロ原子（例えば、窒素）は、ヘテロ原子がその一部分であるアルキレングリコールユニットの２つ以上の炭素原子と結合することができ、それにより、分岐したアルキレングリコールユニット（例えば、［（−ＣＨ２）ｍ］２Ｎ−など）を形成する。
例示的な実施形態において、アルキレングリコールユニットの少なくとも５０％が同一であり、例えば、それらは、互いに同じヘテロ原子および同じｍ値を含む。場合により、アルキレングリコールユニットの少なくとも７０％、場合により少なくとも９０％、場合により１００％が同一である。例示的な実施形態において、同一のアルキレングリコールユニットに結合するヘテロ原子は酸素原子である。さらなる例示的な実施形態において、ｍは、同一ユニットについては２である。
１つの実施形態において、リンカーは単一の直鎖リンカーであり、これは好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリ（エチレングリコール）」は、アルキレングリコールユニットの少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、好ましくは１００％が−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−である本明細書中上記で定義されるようなポリ（アルキレングリコール）を表す。同様に、表現「エチレングリコールユニット」は、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−のユニットとして本明細書中では定義される。
選択可能な実施形態によれば、連結成分は、下記の一般式を有するポリ（エチレングリコール）またはそのアナログを含む：
−Ｘ１−（ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙ）ｎ−Ｘ２−
式中、Ｘ１およびＸ２のそれぞれが、少なくとも１つのα−ガラクトシダーゼモノマーとの共有結合性の結合を形成する官能基（例えば、本明細書中に記載されるような官能基）である；
Ｙは、Ｏ、ＳまたはＮＲ５（場合によりＯ）である；
ｎは整数であり、場合により１〜２００（場合により５〜１５０、場合により４０〜７０）であり、だが、ｎのより大きい値もまた意図される；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれが独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、オキソ、チオールおよびチオアルコキシからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ｎは少なくとも５であり、場合により少なくとも８であり、場合により少なくとも１５であり、場合により少なくとも２５であり、場合により少なくとも４０である。
いくつかの実施形態において、ｎは最大でも２００であり、場合により最大でも１５０であり、場合により最大でも７０である。
ポリ（エチレングリコール）またはそのアナログは場合により、例えば、上記式におけるＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙユニットが互いに同一ではないコポリマーを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙユニットの少なくとも５０％が同一である。場合により、ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙユニットの少なくとも７０％、少なくとも９０％、場合により１００％が同一である。
場合により、連結成分は、例えば、上記式における１つまたは複数のＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙユニットについて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つが−（ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙ）ｐ−Ｘ３−（式中、Ｒ１〜Ｒ４およびＹは本明細書中上記で定義される通りであり、ｐは、ｎについて本明細書中で定義されるような整数（例えば、１〜２００）であり、Ｘ３は、Ｘ１およびＸ２について本明細書中で定義される通りである）であるように分岐している。
官能基は場合により、結合、例えば、アミド結合、エステル結合および／またはエーテル結合（これらに限定されない）を形成することができる。
例えば、官能基は場合により、ポリペプチドにおける窒素原子（例えば、リシン残基またはＮ末端における窒素原子）とのアミド結合、または、ポリペプチドにおける酸素原子（例えば、セリン残基、トレオニン残基またはチロシン残基における酸素原子）とのエステル結合を形成するカルボニル基を含むことができる。
代替において、または、加えて、官能基は場合により、ポリペプチドにおけるカルボニル基（例えば、グルタマート残基もしくはアスパルタート残基またはＣ末端におけるカルボニル基）とのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合を形成するヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｏ）を含むことができる。
代替において、または、加えて、官能基は、ポリペプチドに結合する（例えば、ポリペプチドにおけるヘテロ原子に結合する）アルキル基またはアリール基を含むことができる。
代替において、または、加えて、官能基は場合により、α−ガラクトシダーゼモノマーにおけるアルキル基とのアミン結合を形成する窒素原子を含むことができ、または、α−ガラクトシダーゼモノマーは場合により、官能基におけるアルキル基とのアミン結合を形成する窒素原子を含むことができる。そのようなアミン結合は、（例えば、本明細書中下記で記載されるような）還元的アミン化によって形成させることができる。
いくつかの実施形態において、官能基の少なくとも１つがポリペプチドとのアミド結合（例えば、ポリペプチドにおけるリシン残基とのアミド結合）を形成する。
官能基は互いに同一であってもよく、または、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、官能基の少なくとも１つがポリペプチドの１つの官能性（例えば、リシン残基またはＮ末端のアミン基）に結合し、官能基の少なくとも１つがポリペプチドの異なる官能性（例えば、システイン残基のチオール基）に結合する。
選択可能な実施形態によれば、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、大きい安定性をヒト血漿条件および／またはリソソーム条件において示す。
本明細書中で使用される場合、表現「ヒト血漿条件」は、３７℃の温度における、媒体としてのヒト血漿を示す。
本明細書中で使用される場合、表現「リソソーム条件」は、３７℃の温度における、媒体としての４．６のｐＨを有する水溶液（例えば、本明細書中に記載されるクエン酸塩リン酸塩緩衝液）を示す。
リソソーム条件下での高まった安定性は好都合である。これは、リソソームが身体におけるα−ガラクトシダーゼ活性のための正常な場所であるように、リソソームがα−ガラクトシダーゼに対する補充療法のための標的であり、また、リソソーム条件（例えば、酸性ｐＨ）がα−ガラクトシダーゼの活性のための最適な条件を表すからである。
何らかの特定の理論によってとらわれることはないが、血清様条件（例えば、本明細書中に記載されるヒト血漿条件）における高まった安定性もまた好都合であると考えられる。これは、血中における安定なα−ガラクトシダーゼが、細胞からの流出のために血液中に存在する代謝産物（例えば、Ｇｂ３）に作用することができるからである。血清活性な多量体型タンパク質構造体は場合により、炎症を促進させる血管壁内に沈着するスフィンゴ糖脂質の除去および防止において効率的であり得ると考えられる［Ｂｏｄａｒｙ他、ＴＣＭ、１７（４）：１２９〜１３３］。例えば、ファブリー病では、主要な病理発生が、Ｇｂ３が血管内皮に蓄積することから生じ、その結果、小血管の血管閉塞、これらの血管の虚血および梗塞、ならびに、腎臓、心臓および脳における虚血および梗塞がもたらされる［Ｄｅｓｎｉｃｋ他、２００３、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１３８（４）：３３８〜３４６］。加えて、血清における高まった安定性は、リソソーム輸送が必要であることをなくすことができる。したがって、ＥＲＴをはるかにより利用しやくすることができる。これは、影響を受けにくい費用効果的な宿主システム、例えば、植物を用いることができるからである。
選択可能な実施形態によれば、ヒト血漿条件における多量体型タンパク質構造体の大きい安定性は、多量体型タンパク質構造体が、ヒト血漿条件に１時間さらされたとき、天然型α−ガラクトシダーゼをそのヒト血漿条件に１時間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼのα−ガラクトシダーゼ活性よりも少なくとも１０％大きい、場合により２０％大きい、場合により５０％大きい、場合により１００％大きいα−ガラクトシダーゼ活性を示すような安定性である。
代替において、または、加えて、ヒト血漿条件における多量体型タンパク質構造体の大きい安定性は、多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼ活性が、ヒト血漿条件において、天然型α−ガラクトシダーゼの対応する活性よりも遅く低下するような安定性である。場合により、多量体型タンパク質構造体は、タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたとき、天然型α−ガラクトシダーゼの対応する活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい、場合により２０％小さい、場合により５０％小さい、場合により８０％小さい割合で低下する活性を示す。
本明細書中では、５０％の低下よりも「１０％小さい」低下は、４５％（４５は５０よりも１０％小さい）の低下を示し、４０％（５０％〜１０％）の低下を示さないことを理解しなければならない。
代替において、または、加えて、ヒト血漿条件における多量体型タンパク質構造体の大きい安定性は、多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼ活性が、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間（場合により、２時間、４時間、または、それどころか６時間）さらしたとき、実質的に変化しないままであるような安定性である。
本明細書中で使用される場合、表現「実質的に変化しない」は、初期レベルの５０％〜１５０％の範囲に留まるレベル（例えば、活性のレベル）を示し、また、場合により、初期レベルの少なくとも６０％、場合により少なくとも７０％、場合により少なくとも８０％、場合により少なくとも９０％のままであるレベルを示す。
場合により、リソソーム条件における多量体型タンパク質構造体の大きい安定性は、多量体型タンパク質構造体が、リソソーム条件に所定の期間（例えば、１日間、２日間、３日間、１週間）さらされたとき、天然型α−ガラクトシダーゼをそのリソソーム条件に同じ所定の期間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、場合により２０％大きい、場合により５０％大きい、場合により１００％大きいα−ガラクトシダーゼ活性を示すような安定性である。
代替において、または、加えて、リソソーム条件における多量体型タンパク質構造体の大きい安定性は、多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼ活性が、リソソーム条件において、天然型α−ガラクトシダーゼの対応する活性よりも遅く低下するような安定性である。場合により、多量体型タンパク質構造体は、タンパク質構造体をリソソーム条件に所定の期間（例えば、１日間、２日間、３日間、１週間）さらしたとき、天然型α−ガラクトシダーゼの対応する活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に同じ期間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい、場合により２０％小さい、場合により５０％小さい、場合により８０％小さい割合で低下する活性を示す。
代替において、または、加えて、リソソーム条件における多量体型タンパク質構造体の大きい安定性は、多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼ活性が、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間、２日間、３日間、１週間、２週間および／または１ヶ月間さらしたとき、実質的に変化しないままであるような安定性である。
本明細書中の実施例の節において例示されるように、より大きい安定性を長期間にわたって示すことに加えて、多量体型タンパク質構造体は、天然型α−ガラクトシダーゼのパラメーターとは異なるα−ガラクトシダーゼ活性のパラメーターを示すことができる。
したがって、選択可能な実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は、時間の経過に伴う活性の何らかの低下とは無関係に、本タンパク質の天然型形態のα−ガラクトシダーゼ活性よりも大きいα−ガラクトシダーゼ活性を示すとして特徴づけられる。場合により、活性は天然型形態の対応する活性よりも１０％大きく、場合により２０％大きい。
そのような活性を特徴づけるために、活性は好ましくは、天然型α−ガラクトシダーゼまたは多量体型タンパク質構造体を、活性が実質的に低下する条件（例えば、本明細書中に記載されるような条件）にさらした直後（例えば、１時間以内、１５分以内）に求められ、その結果、測定された活性は、安定性の程度ではなく、活性自体を反映するであろう。
場合により、多量体型タンパク質構造体は、リソソーム条件において、天然型α−ガラクトシダーゼの対応する活性よりも大きいα−ガラクトシダーゼ活性を示すとして特徴づけられる。
代替において、または、加えて、多量体型タンパク質構造体は、中性ｐＨでの模擬生理学的条件において、天然型α−ガラクトシダーゼの対応する活性よりも大きいα−ガラクトシダーゼ活性を示すとして特徴づけられる。模擬生理学的条件は、３７℃の温度での水溶液（例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水）を含む。ｐＨは場合により７である。代替において、ｐＨは７．４である。
本明細書中に記載されるα−ガラクトシダーゼ活性は、α−ガラクトシダーゼに特徴的である生物学的活性（例えば、α−ガラクトシダーゼに特徴的な触媒活性、例えば、基質の末端α−ガラクトシル成分の加水分解など）である。
いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼの触媒活性が、飽和における触媒作用の速度（すなわち、Ｖｍａｘ値）によって特徴づけられる。
代替において、α−ガラクトシダーゼ活性は、治療活性（例えば、治療効果を有する酵素活性）、例えば、ファブリー病の関連での治療活性などである。場合により、治療活性は実験動物（例えば、Ｆａｂｒｙマウス）において求められ、また、場合によりヒトのファブリー病患者において求められる。
α−ガラクトシダーゼの活性を求めるための技術が当業者には知られているであろう。典型的には、α−ガラクトシダーゼ（すなわち、天然型形態または本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体）が、α−ガラクトシダーゼの基質としてこの技術分野において認識される化合物と接触させられ、その後、活性の程度が定量的に求められる。α−ガラクトシダーゼ活性の特に便利な検出を可能にする化合物がこの技術分野では知られており、また、市販されている。
いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼ活性が、（例えば、本明細書中の実施例の節において記載されるように）４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解をアッセイすることによって求められる。
いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼ活性が、（例えば、本明細書中の実施例の節において記載されるように）ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解をアッセイすることによって求められる。
本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体の活性を天然型α−ガラクトシダーゼの活性と比較するとき、天然型α−ガラクトシダーゼは好ましくは、多量体構造体のα−ガラクトシダーゼモノマーと（例えば、アミノ酸配列およびグリコシル化パターンに関して）実質的に同一であるα−ガラクトシダーゼモノマーを含む。
いくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は、生理学的システム（例えば、ヒトまたは実験動物の血液、血清および／または血漿）において、天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも大きい（例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも４００％大きい、少なくとも９００％大きい）循環半減期によって特徴づけられる。
増大した循環半減期には場合により、より大きいインビトロ安定性（例えば、本明細書中に記載されるようなインビトロ安定性）、より大きいインビボ安定性（例えば、代謝に対する抵抗性）、および／または、他の要因（例えば、低下した腎クリアランス）が伴い得る。
循環半減期は、サンプル（例えば、血液サンプル、組織サンプル）を生理学的システム（例えば、ヒト、実験動物）から様々な間隔で採取し、サンプル中のα−ガラクトシダーゼのレベルを、この技術分野で知られている技術を使用して求めることによって求めることができる。
一般に、半減期は、（例えば、実施例の節において記載されるように）消失期半減期として計算され、この場合、半減期は、濃度（例えば、血中濃度）が、分布の偽平衡に達した後で５０％低下するために必要とされる時間である。消失期半減期は、時間対ｌｏｇ濃度の線形回帰によって、時間対ｌｏｇ濃度の消失期の直線部分から計算することができる（例えば、Ｔｏｕｔａｉｎ＆Ｂｏｕｓｑｕｅｔ−Ｍｅｌｏｕ［Ｊ Ｖｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ、２００４、２７：４２７〜３９］を参照のこと）。したがって、消失期半減期は、薬物排出に起因する薬物の血漿濃度における低下の尺度であり、他の理由に起因する低下の尺度ではなく、投与薬物の量が１／２に低下するために必要な時間であるとは限らない。
α−ガラクトシダーゼ（例えば、多量体型タンパク質構造体または天然型α−ガラクトシダーゼ）のレベルを求めることは、（例えば、α−ガラクトシダーゼに対する抗体を介して）α−ガラクトシダーゼの物理的存在を検出すること、および／または、（例えば、本明細書中に記載されるように）α−ガラクトシダーゼ活性のレベルを検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態によれば、多量体型タンパク質構造体は、タンパク質構造体を脊椎動物（例えば、ヒト、マウス）に、例えば、α−ガラクトシダーゼ欠乏症の脊椎動物（例えば、ヒトのファブリー病患者、Ｆａｂｒｙマウス）に投与したときの器官（例えば、脾臓、心臓、腎臓、脳、肝臓）におけるα−ガラクトシダーゼ活性によって特徴づけられる。場合により、そのような器官におけるα−ガラクトシダーゼ活性は、脊椎動物への同等な投与を行ったとき、そのような器官における天然型α−ガラクトシダーゼのα−ガラクトシダーゼ活性よりも大きい。
器官における活性は、α−ガラクトシダーゼの取り込みおよび／または取り込み後のα−ガラクトシダーゼ活性の保持の関数であるかもしれない。
場合により、器官におけるα−ガラクトシダーゼ活性は、投与後２時間、ならびに、投与後の場合により２４時間、場合により３日、場合により７日、および、場合により１４日において求められる。
肝臓におけるα−ガラクトシダーゼの増大した活性には、一部の場合には、身体の他の部分におけるより低い活性が伴うことがあり、したがって、α−ガラクトシダーゼの低下した生物学的効果が伴うことがある。
したがって、いくつかの実施形態において、多量体型タンパク質構造体は、肝臓以外の器官における高まったα−ガラクトシダーゼ活性によって特徴づけられる。例示的な器官には、脾臓、心臓および腎臓が含まれる。
いくつかの実施形態において、多量体型タンパク質構造体は、同等な投与の後における天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも２０％大きい、場合により少なくとも５０％大きい、場合により少なくとも１００％大きい、場合により少なくとも３００％大きい（本明細書中に記載されるような）投与後の器官における高まったα−ガラクトシダーゼ活性によって特徴づけられる。本明細書中上記で記されるように、本発明者らは、架橋されたα−ガラクトシダーゼモノマーの多量体型構造体によるα−ガラクトシダーゼの安定化形態を考案し、その調製および実施に成功している。
場合により、α−ガラクトシダーゼは、例えば、ヒト対象への投与のための最適な生体適合性を容易にするために、ヒトα−ガラクトシダーゼ（例えば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ）である。ヒトα−ガラクトシダーゼが、例えば、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）（アガルシダーゼアルファ、Ｓｈｉｒｅ）およびＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（アガルシダーゼベータ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）として市販されている。
本明細書中において、「ヒトα−ガラクトシダーゼ」は、ヒトにおいて生まれながらに存在するα−ガラクトシダーゼタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一な（例えば、本明細書中上記で記載されるような）アミノ酸配列を含むα−ガラクトシダーゼを示す。
いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼは植物組換えα−ガラクトシダーゼである。例示的なα−ガラクトシダーゼには、植物組換えヒトα−ガラクトシダーゼが含まれる。
α−ＧＡＬの例には、限定されないが、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するα−ＧＡＬが含まれる。場合により、α−ＧＡＬは、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本明細書中で使用される場合、「α−ガラクトシダーゼ」は、Ｇｂ３におけるガラクトース成分に対する酵素活性（例えば、加水分解）を示すどのようなタンパク質をも示す（例えば、α−ガラクトシダーゼＡ）。場合により、「α−ガラクトシダーゼ」はＥ．Ｃ．３．２．１．２２を示す。
本発明の実施形態のα−ガラクトシダーゼは、（例えば、植物組織または動物組織から）精製することができ、または、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
本明細書中に記載されるように、血清中におけるα−ガラクトシダーゼの活性は、例えば、血清中のＧｂ３レベルを低下させるために非常に好都合であるかもしれない。
したがって、いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼはアルカリ性α−ガラクトシダーゼである。
本明細書中で使用される場合、表現「アルカリ性α−ガラクトシダーゼ」は、末端連結のα−ガラクトース成分を中性〜塩基性のｐＨ条件（例えば、約ｐＨ７〜７．５）のもとで、特に、正常な血清ｐＨ（例えば、約７．３５〜７．４５）のもとでガラクトース含有オリゴ糖から加水分解できることによって特徴づけられるα−ＧＡＬを示す。
本発明のいくつかの実施形態のアルカリ性α−ＧＡＬは中性〜塩基性のｐＨ条件のもとで活性であり得るが、酸性のｐＨ条件（すなわち、約４．６）のもとで活性を依然として示し得ることが理解されるであろう。
具体的な実施形態において、上記酵素は酸性〜塩基性のｐＨ条件（すなわち、約ｐＨ４．２〜７．５）のもとで活性である。
さらに別の具体的な実施形態において、上記酵素は約６．５〜７．５のｐＨのもとで活性である。
本教示に従って使用することができるアルカリ性α−ガラクトシダーゼの具体的な例が、米国特許出願公開第２００７００３６８８３号、国際公開ＷＯ０３／０９７７９１および国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００９５６において提供される（これらのそれぞれが本明細書によりその全体において参照によって組み込まれる）。
したがって、アルカリ性α−ガラクトシダーゼは、ウリ科、シソ科、コショウ科、ナス科、マメ科、アブラナ科およびイネ科からなる群から選択される植物科の１つに含まれ得る。
具体的な実施形態によれば、上記アルカリ性α−ガラクトシダーゼがメロンから得られる。
Ｐ．−Ｒ．ＧａｕｄｒｅａｕｌｔおよびＪ．Ａ．Ｗｅｂｂは、いくつかの刊行物（例えば、「Ａｌｋａｌｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ」、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２４、２８１〜２８８、１９８２；「Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７１、６６２〜６６８、１９８３；および、「Ａｌｋａｌｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ」、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４５、７１〜７５、１９８６）において、至適活性をアルカリ性条件（ｐＨ７．５）において有する、ペポカボチャの若い葉から精製される新規なα−ガラクトシダーゼを記載している。このアルカリ性α−ガラクトシダーゼに加えて、彼らはまた、この酵素の３つの酸性形態を報告し、異なった基質選択性がこれらの酸性形態およびアルカリ性形態について見出された。
アルカリ性ｐＨにおけるα−ガラクトシダーゼ活性が、他のウリ科植物組織において、例えば、キュウリ果実の小花柄、若いカボチャ果実および若いメロン果実などにおいて認められている（「Ｍｅｌｏｎｓ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３巻、２５頁〜３７頁、Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）。
Ｂａｃｈｍａｎｎ他（「Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ａｊｕｇａ ｒｅｐｔｅｎｓ Ｌ．」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１０５：１３３５〜１３４５、１９９４）は、アジュガ・レプテンス植物（コモンビューグル）、無関係なシソ科から得られるスタキオース輸送体もまたアルカリ性α−ガラクトシダーゼを含有することを開示する。この酵素は、部分的な特徴づけが行われ、スタキオースに対する大きい親和性を有することが見出された。また、コショウ科由来のペペロミア・カンプトトリカ・エル（Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ ｃａｍｐｔｏｔｒｉｃｈａ Ｌ．）植物の葉がα−ガラクトシダーゼ活性をアルカリ性ｐＨにおいて示す。このことは、その葉がアルカリ性α−ガラクトシダーゼ酵素をも含有することを示唆する（Ｍａｄｏｒｅ，Ｍ．、「Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｉｎｋ ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｃａｒｂｏｎ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｕｒｃｅ−Ｓｉｎｋ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ、Ｍａｄｏｒｅ，Ｍ．およびＬｕｃａｓ，Ｗ．Ｊ．（編）、２０４頁〜２１４頁、１９９５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）。同様に、ＧａｏおよびＳｃｈａｆｆｅｒ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９９、１１９：９７９〜８８、これは参照によって全体が組み込まれる）は、アルカリ性のｐＨ至適を有するα−ガラクトシダーゼ活性を、ウリ科およびコレウス属（シソ科）のメンバーを含む様々な植物種から得られる組織の粗抽出物において報告している。
植物のアルカリ性α−ガラクトシダーゼ配列の具体的な例が、配列番号４、配列番号５および配列番号１３（メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏｎ））、配列番号６（ツルナ（Ｔ．ｔｅｔｒａｇｏｎｉｏｉｄｅｓ））、配列番号７および配列番号１２（キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））、配列番号８および配列番号９（トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、配列番号１０（イネ（Ｏｒｕｚａ ｓａｔｉｖａ））、配列番号１１（エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ））、ならびに、配列番号１４（アラビアコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ））において提供される。
いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼは酸性α−ガラクトシダーゼである。
本明細書中で使用される場合、「酸性α−ガラクトシダーゼ」は、末端連結のα−ガラクトース成分を酸性ｐＨ条件（例えば、約ｐＨ４．２〜５）のもとで、例えば、リソソームに存在する条件などのもとでガラクトース含有オリゴ糖から加水分解できることによって特徴づけられるα−ガラクトシダーゼを示す。
本発明の実施形態のα−ガラクトシダーゼは、過度な有害な免疫学的反応（例えば、植物対ヒト）がインビボ投与のときに誘導されないならば、ヒト、動物または植物のどのような供給源のものでも可能である。
免疫学的反応を軽減するために、非ヒトα−ガラクトシダーゼの調製物（例えば、植物α−ガラクトシダーゼの調製物）をヒトα−ガラクトシダーゼ（すなわち、酸性ヒトα−ガラクトシダーゼ）と同時投与することができる。
場合により、多量体型タンパク質構造体はさらに、少なくとも１つのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）成分を含む。そのようなＭ６Ｐ成分（１つまたは複数）は（例えば、リンカーを介して）多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼモノマーの１つまたは複数に連結することができる。
Ｍ６Ｐ含有成分を生体分子（例えば、ポリペプチド）に導入するための技術および試薬が国際公開ＷＯ２００９／０２４９７７に記載される。
本明細書中の実施例の節において例示されるように、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、α−ガラクトシダーゼを架橋剤と反応させることによって都合よく調製することができる。
したがって、本発明の実施形態の別の局面によれば、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体を調製するプロセスが提供される。このプロセスは、少なくとも２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを共有結合で連結する少なくとも１つの連結成分を導入するように、α−ガラクトシダーゼを反応させることを含む。
場合により、連結成分は、１つのα−ガラクトシダーゼモノマーを別のα−ガラクトシダーゼモノマーに連結する結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合）である。場合により、そのような結合は、好適な条件および／または試薬を使用することによって導入される。例えば、アミド結合をカルボン酸基およびアミン基から形成するために好適である試薬がこの技術分野では知られている。
場合により、連結成分は、α−ガラクトシダーゼの一部分に由来しない成分である。例えば、連結成分は、小分子（例えば、アミノ酸）のオリゴマー、ポリマー、残基であってもよい。
いくつかの実施形態において、連結成分は、α−ガラクトシダーゼを、連結成分（例えば、本明細書中に記載されるような連結成分）および少なくとも２つの反応基を含む架橋剤と反応させることによって導入される。
場合により、α−ガラクトシダーゼは、天然型α−ガラクトシダーゼがダイマー型形態である条件のもとで反応させられる。
いくつかの実施形態において、架橋剤は、５：１〜５００：１（架橋剤：α−ガラクトシダーゼモノマー）の範囲でのモル比で、場合により５０：１〜４００：１の範囲でのモル比で、場合により７５：１〜３００：１の範囲でのモル比（例えば、約１００：１、約２００：１）でα−ガラクトシダーゼと反応させられる。
上記プロセスは場合によりさらに、架橋されたタンパク質を精製すること、例えば、過剰な架橋剤を除くことを含む。一般的な精製方法を使用することができる（例えば、適切なカットオフ・メンブランを使用する透析および限外ろ過、ならびに／または、さらなるクロマトグラフィー工程、これには、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれる）。
反応基は、α−ガラクトシダーゼモノマーにおける相補的な官能性との結合形成をもたらす化学反応を受けるために好適な反応基が選択される。場合により、それぞれの反応基が、共有結合性の結合を、（例えば、本明細書中に記載されるように、ポリペプチドに結合する官能基を形成するように）、本明細書中に記載される連結成分と、少なくとも１つのポリペプチドとの間で形成することができる。
架橋剤の反応基は互いに同一であってもよく、または、異なっていてもよい。
本明細書中で使用される場合、表現「反応基」は、典型的には結合形成をもたらす化学反応を受けることができる化学基を表す。結合は、本実施形態によれば、好ましくは、（例えば、反応基のそれぞれについて）共有結合性の結合である。結合形成をもたらす化学反応には、例えば、求核置換および求電子置換、求核付加反応および求電子付加反応、アルキル化、付加脱離反応、付加環化反応、転移反応、ならびに、官能基を伴う何らかの他の知られている有機反応、同様にまた、それらの組合せが含まれる。
反応基は場合により、例えば、反応基の反応性部分を本明細書中に記載される連結成分（例えば、ポリ（アルキレングリコール）またはそのアナログ）に結合するために役立ち得る非反応性部分（例えば、アルキル）を含むことができる。
反応基は好ましくは、α−ガラクトシダーゼへのそのコンジュゲート化を可能にするように選択される。例示的な反応基には、カルボキシラート（例えば、−ＣＯ２Ｈ）、チオール（−ＳＨ）、アミン（−ＮＨ２）、ハロ、アジド（−Ｎ３）、イソシアナート（−ＮＣＯ）、イソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボニル（例えば、アルデヒド）、マレイミド、スルファート、ホスファート、スルホニル（例えば、メシル、トシル）など、ならびに、活性化された基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（例えば、ＮＨＳエステル）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、無水物、アシルハリド（−Ｃ（＝Ｏ）−ハロゲン）などが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、反応基は脱離基を含み、例えば、求核置換を受けやすい脱離基（例えば、ハロ、スルファート、ホスファート、カルボキシラート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）などを含む。
場合により、反応基はその活性化形態であってもよい。
本明細書中で使用される場合、表現「活性化形態」は、化学基（例えば、反応基）の誘導体で、当該化学基よりも反応性が大きく、したがって、結合形成をもたらす化学反応を受けることが容易に可能であるものを表す。活性化形態は、特に好適な脱離基を含むことができ、それにより、置換反応を容易にする。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−スクシンイミド）は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨの広く知られている活性化形態である。これは、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨと反応して、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳを形成することができ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基を伴う反応に特徴的な生成物（例えば、アミドおよびエステル）を形成するために容易に反応するからである。
反応基は、種々の基、原子または結合を介して連結成分（例えば、ポリ（アルキレングリコール）またはそのアナログ）の残部に結合することができる。これらには、エーテル結合［例えば、−Ｏ−アルキル−］、エステル結合［例えば、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル−］、カルバマート結合［例えば、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−アルキル−］などが含まれ得る。したがって、様々な末端基を用いることができる。
下記は、本明細書中に記載されるような反応基を構成し得る種々の基の限定されない例である：−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＣＯ、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−マレイミドなど。
上記反応基のそれぞれにおけるメチレン基の数は単に例示にすぎず、変化し得る。
反応基はまた、ポリ（アルキレングリコール）鎖の末端におけるヘテロ原子（例えば、−ＯＨ）を含むことができる。
本発明の例示的な実施形態において、反応基はカルボキシラート（例えば、活性化カルボキシラート、例えば、Ｎ−ヒドキシスクシンイミドエステルなど）を含む。
場合により、反応基はα−ガラクトシダーゼにおけるアミン基（例えば、リシン残基および／またはＮ末端におけるアミン基）と反応して、アミド結合を形成する。
いくつかの実施形態において、反応基の反応は還元的アミン化を含み、この場合、アミン基がアルデヒド基と反応して、イミンを形成し、このイミンが（例えば、還元剤（例えば、シアノホウ水素化ナトリウムなど）の添加によって）還元されて、アミン結合を形成する。反応基は、α−ガラクトシダーゼのアルデヒド基（例えば、タンパク質のポリペプチドに結合する糖類成分におけるアルデヒド基）と反応するアミン基であってもよく、または、反応基は、α−ガラクトシダーゼのアミン基（例えば、リシン残基におけるアミン基）と反応するアルデヒド基であってもよい。場合により、α−ガラクトシダーゼの糖類成分は、反応基と、α−ガラクトシダーゼとの反応の前に、酸化剤によって酸化されて、アルデヒド基を形成する。例えば、糖類と、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応を、１対のアルデヒド基を糖類成分において生じさせるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、反応基の少なくとも１つが、α−ガラクトシダーゼモノマーの１つの官能性（例えば、リシン残基またはＮ末端のアミン基）と反応するように選択され、かつ、反応基の少なくとも１つが、α−ガラクトシダーゼモノマーの異なる官能性（例えば、システイン残基のチオール基）と反応するように選択される。
場合により、本明細書中に記載される１つまたは複数のポリペプチドは、（例えば、本明細書中に記載されるような）Ｍ６Ｐ含有の多量体型タンパク質構造体を得るために、１つまたは複数のＭ６Ｐ成分を導入するためのグリコシル化試薬と反応させられる。好適なＭ６Ｐ含有グルコシル化試薬およびそれらの使用が、例えば、国際公開ＷＯ２００９／０２４９７７に記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「アミン」および用語「アミノ」は、−ＮＲ’Ｒ’’基（式中、Ｒ’およびＲ’’は、水素、アルキル、シクロアルキル、複素脂環式（これは環炭素を介して結合する）、アリールおよびヘテロアリール（これらは環炭素を介して結合する）からなる群から選択される）を示す。Ｒ’およびＲ’’はその炭素原子を介して結合する。場合により、Ｒ’およびＲ’’は、水素、および、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルからなる群から選択される。場合により、Ｒ’およびＲ’’は水素である。
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、直鎖基および分枝鎖基を含む飽和した脂肪族炭化水素を示す。好ましくは、アルキル基は１個〜２０個の炭素原子を有する。数値範囲、例えば「１個〜２０個」が本明細書で述べられる場合は常に、それは基（この場合はアルキル基）が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などの２０個までの炭素原子を含むということを意味する。さらに好ましくは、アルキル基は、１個〜１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルである。最も好ましくは、他に示さない限り、アルキル基は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキルである。アルキル基は、置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アジド、スルフォンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、オキソ、カルボニル、チオカルボニル、尿素、チオ尿素、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルホンアミドおよびアミノであり得る（これらの用語は本明細書中で定義される）。
本明細書中で使用される用語「シクロアルキル」基は、環の１つまたは複数が完全共役のπ電子系を有しない、すべて炭素からなる単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を示す。シクロアルキル基の非限定な例には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンがある。シクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アジド、スルフォンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、オキソ、カルボニル、チオカルボニル、尿素、チオ尿素、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルホンアミドおよびアミノであり得る（これらの用語は本明細書中で定義される）。
「アルケニル」基は、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素二重結合からなるアルキル基を示す。
「アルキニル」基は、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素三重結合からなるアルキル基を示す。
「アリール」は、完全共役のπ電子系を有する、すべて炭素からなる単環基または縮合多環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を示す。アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルがある。アリール基は、置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アジド、スルフォンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、オキソ、カルボニル、チオカルボニル、尿素、チオ尿素、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルホンアミドおよびアミノであり得る（これらの用語は本明細書中で定義される）。
用語「ヘテロアリール」基には、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの１個または複数個の原子を環（１つまたは複数）に有し、さらには完全共役のπ電子系を有する単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基が含まれる。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。ヘテロアリール基は、置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アジド、スルフォンアミドホスホニル、ホスフィニル、オキソ、カルボニル、チオカルボニル、尿素、チオ尿素、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルホンアミドおよびアミノであり得る（これらの用語は本明細書中で定義される）。
「複素脂環」基は、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの１個または複数個の原子を環（１つまたは複数）に有する単環基または縮合環基を示す。環はまた、１つまたは複数の二重結合を有することができる。しかしながら、環は完全共役のπ電子系を有しない。複素脂環基は、置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、アジド、スルフォンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、オキソ、カルボニル、チオカルボニル、尿素、チオ尿素、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルホンアミドおよびアミノであり得る（これらの用語は本明細書中で定義される）。
「ヒドロキシ」基は−ＯＨ基を示す。
「アジド」基は−Ｎ＝Ｎ基を示す。
「アルコキシ」基は、本明細書中で定義されるように、−Ｏ−アルキル基および−Ｏ−シクロアルキル基の両方を示す。
「アリールオキシ」基は、本明細書中で定義されるように、−Ｏ−アリール基および−Ｏ−ヘテロアリール基の両方を示す。
「エーテル」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素脂環基に結合されたアルコキシ基およびアリールオキシ基の両方を示す。
エーテル結合は、−Ｏ−結合を記述する。
「チオヒドロキシ」または「チオール」基は−ＳＨ基を示す。
「チオアルコキシ」基は、本明細書中で定義されるように、−Ｓ−アルキル基および−Ｓ−シクロアルキル基の両方を示す。
「チオアリールオキシ」基は、本明細書中で定義されるように、−Ｓ−アリール基および−Ｓ−ヘテロアリール基の両方を示す。
「チオエーテル」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素脂環基に結合されたチオアルコキシ基およびチオアリールオキシ基の両方を示す。
チオエーテル結合は、−Ｓ−結合を記述する。
「ジスルフィド」基は、−Ｓ−チオアルコキシ基および−Ｓ−チオアリールオキシ基の両方を示す。
ジスルフィド結合は、−Ｓ−Ｓ−結合を記述する。
「カルボニル」基は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ′基（式中、Ｒ′は、上述のように定義される）を示す。
「チオカルボニル」基は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ′基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「カルボキシル」は、「Ｃ−カルボキシ」および「Ｏ−カルボキシ」の両方を示す。
「Ｃ−カルボキシ」基は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ′基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「Ｏ−カルボキシ」基はＲ′Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「オキソ」基は＝Ｏ基を示す。
「カルボキシレート」または「カルボキシル」は、本明細書中で定義される通り、Ｃ−カルボキシおよびＯ−カルボキシの両方を包含する。
「カルボン酸」基は、Ｒ′が水素であるＣ−カルボキシ基を示す。
「チオカルボキシ」基または「チオカルボキシレート」基は、−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｒ′基および−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′基の両方を示す。
「エステル」は、Ｒ′が水素でないＣ−カルボキシ基を示す。
エステル結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−結合を示す。
チオエステル結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−結合または−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）結合を示す。
「ハロ」基は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を示す。
「スルフィニル」基は−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ′基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「スルホニル」基は−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ′基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「スルホネート」基は−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−Ｒ′基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「スルフェート」基は、−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−Ｒ′基（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を示す。
「スルホンアミド」基は、本明細書中で定義される通り、Ｓ−スルホンアミド基およびＮ−スルホンアミド基の両方を包含する。
「Ｓ−スルホンアミド」基は−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ′Ｒ′′基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「Ｎ−スルホンアミド」基はＲ′Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ′′基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「Ｏ−カルバミル」基は−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ′Ｒ′′−基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「Ｎ−カルバミル」基はＲ′ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ′′−基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「カルバミル」基または「カルバメート」基は、Ｏ−カルバミル基およびＮ−カルバミル基を包含する。
カルバメート結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ′−結合（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を記述する。
「Ｏ−チオカルバミル」基は−ＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ′Ｒ′′基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「Ｎ−チオカルバミル」基はＲ′ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ′′−基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「チオカルバミル」基または「チオカルバメート」基は、Ｏ−チオカルバミル基およびＮ−チオカルバミル基を包含する。
チオカルバメート結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ′−結合（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を記述する。
「Ｃ−アミド」基は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ′Ｒ′′基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「Ｎ−アミド」基はＲ′Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ′′−基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りである）を示す。
「アミド」基はＣ−アミド基およびＮ−アミド基の両方を包含する。
アミド結合は−ＮＲ′−Ｃ（＝Ｏ）−結合（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を記述する。
アミン結合は、（本明細書中で定義される通りの）アミン基中の窒素原子と、アミン基中のＲ′基との間の結合を記述する。
チオアミド結合は−ＮＲ′−Ｃ（＝Ｓ）−結合（式中、Ｒ′は本明細書中で定義される通りである）を記述する。
「尿素」基は−Ｎ（Ｒ′）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ′′Ｒ′′′基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々本明細書中で定義される通りであり、Ｒ′′′はＲ′およびＲ′′が本明細書中で定義される通りに定義される）を示す。
「ニトロ」基は−ＮＯ２基を示す。
「シアノ」基は−Ｃ≡Ｎ基を示す。
用語「ホスホニル」または「ホスホネート」は−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ′）（ＯＲ′′）基を示し、式中、Ｒ′およびＲ′′は上述の通り定義される。
用語「ホスフェート」は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ′）（ＯＲ′′）基を示し、式中、Ｒ′およびＲ′′は各々上述の通り定義される。
「リン酸」は、各々のＲが水素であるホスフェート基を示す。
用語「ホスフィニル」は−ＰＲ′Ｒ′′基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々上述の通り定義される）を示す。
用語「チオ尿素」は、−Ｎ（Ｒ′）−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ′′−基（式中、Ｒ′およびＲ′′は各々上述の通り定義される）を示す。
本明細書中に記載されるように、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、改善された安定性、ならびに、より強いおよび／またはより長く持続するα−ガラクトシダーゼ活性をインビボにおいて治療的重要な部位で示すことができる。したがって、そのような多量体型タンパク質構造体は、治療適用および研究適用を含めて、α−ガラクトシダーゼ活性が望ましい様々な医療適用における使用のために非常に有益である。
したがって、いくつかの実施形態によれば、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、医薬品として、例えば、ファブリー病を処置するための医薬品として使用されるためのものである。
本発明の実施形態の別の局面によれば、ファブリー病を処置する方法であって、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与することを含む方法が提供される。
本発明の実施形態の別の局面によれば、本明細書中に記載されるような多量体型タンパク質構造体と、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、医薬的に許容され得る好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
本明細書中以降、用語「医薬的に許容され得る担体」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。医薬的に許容され得る担体の例は、プロピレングリコール、生理的食塩水、有機溶媒と水とのエマルジョンおよび混合物、並びに固型（例えば粉末）および気体状担体であるが、これらに限定されない。
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
医薬組成物は、多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼをさらに安定にする追加の成分を任意選択的に含むことができる。任意選択的に、追加の成分はガラクトースである。
代替的に、ガラクトース誘導体（例えばガラクトース含有グリコシド）がガラクトースの代わりに使用されることができる。任意選択的に、非還元ガラクトース誘導体が使用される。
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への多量体型タンパク質構造体の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
注射または注入の場合、本発明の実施形態の多量体型タンパク質構造体は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどの有機溶媒と共に、またはこれらの有機溶媒なしで、配合されることができる。
経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
経口投与の場合、本発明の多量体型タンパク質構造体は、多量体型タンパク質構造体をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、本明細書中に記載された多量体型タンパク質構造体が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性多量体型タンパク質構造体の投与量を明らかにするために、または活性多量体型タンパク質構造体の投与量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、多量体型タンパク質構造体は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
鼻吸入による投与の場合、本発明の実施形態による使用のための多量体型タンパク質構造体は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物（これは典型的には、粉末状、液状および／または気体状の担体を含む）の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、多量体型タンパク質構造体および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなどであるが、これらに限定されない）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射または注入用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の多量体型タンパク質構造体調製物の水溶液が含まれる。さらに、多量体型タンパク質構造体の懸濁物は、適切な油性の注射用懸濁物およびエマルジョン（例えば、油中水型、水中油型、または油中の油中水型エマルジョン）として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、多量体型タンパク質構造体の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
あるいは、多量体型タンパク質構造体は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
本発明の実施形態の多量体型タンパク質構造体はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
本明細書で記載される医薬組成物は、ゲル相担体または賦形剤の好適な固体も含むことができる。かかる担体または賦形剤の例は、炭化カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを含むが、これらに限定されない。
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、多量体型タンパク質構造体の量を意味する。
本発明の方法において使用されるいかなる多量体型タンパク質構造体についても、投与量または治療有効量は、動物での活性アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、活性アッセイによって決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲（例えば、多量体型タンパク質構造体の生物学的活性における最大の半分の増大を達成する試験タンパク質構造体の濃度）を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
以下の実施例において示されるように、本発明の実施形態の多量体型タンパク質構造体の治療効果的な量は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約５００ｍｇの範囲であることができる。
本明細書中に記載される多量体型タンパク質構造体の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば対象タンパク質構造体についてＥＣ５０，ＩＣ５０およびＬＤ５０（試験された動物の５０％の死を生ずる致死量）を測定することによって明らかにすることができる。これらの活性アッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。
投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
投薬量および投薬間隔を、所望の効果を維持するために十分である活性な成分の血漿中レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができ、例えば、インビトロでの活性の所望のレベルを達成するために必要な濃度を、本明細書中に記載されるアッセイを使用して求めることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、時間の１０％〜９０％について、好ましくは３０％〜９０％の間、最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを越える血漿中レベルを維持する治療法を使用して投与されなければならない。
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、上述の低速放出組成物の単回投与で行われることもでき、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、限定されないが、ブリスターパックまたは加圧容器（吸入用）など）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の実施形態の多量体型タンパク質構造体を含む組成物もまた、本明細書中で詳述されたように、示された症状を処置するためにまたは診断のために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
従って、本発明の実施態様によれば、選択された多量体型タンパク質構造体に応じて、本明細書中に記載された医薬組成物は、本明細書中上記において記載されるように、多量体型タンパク質構造体の活性が有益である症状の治療における使用のために、包装材に充填され、前記包装材内または前記包装材の表面において活字で識別される。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
材料および方法
材料：
ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリ（エチレングリコール）（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）を、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨからＰＥＧ８形態および２０００ダルトン（ＰＥＧ４５）ＰＥＧ形態で、また、ＰｉｅｒｃｅからＰＥＧ５形態で得て、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した；
クエン酸をＳｉｇｍａから得た；
クーマシーブルーＧ２５０をＢｉｏ−Ｒａｄから得た；
ジメチルスルホキシドをＳｉｇｍａから得た；
Ｄ−（＋）−ガラクトースをＳｉｇｍａから得た；
ヒト血清（Ｋ３ＥＤＴＡ）をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．から得た；
４−メチルウンベリフェロンをＳｉｇｍａから得た；
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドをＳｉｇｍａから得た；
Ｎ−ドデカノイル−ニトロベンゾオキサジアゾール−セラミドトリヘキソシド（Ｇｂ３−ＮＢＤ）をＭａｔｒｅｙａから得た；
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸をＭｅｒｃｋから得た；
リン酸塩緩衝化生理的食塩水をＳｉｇｍａから得た；
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドをＳｉｇｍａから得た；
プリムリンをＳｉｇｍａから得た；プリムリン噴霧試薬を、１２．５ｍｇのプリムリンを２００ｍｌのアセトン：水（８：２の体積比）に溶解することによって調製した；
ピリジンをＳｉｇｍａから得た；
シナピン酸をＳｉｇｍａから得た；
炭酸ナトリウムをＳｉｇｍａから得た；
リン酸ナトリウムをＳｉｇｍａから得た；
タウロコール酸ナトリウムをＳｉｇｍａから得た；
トリフルオロ酢酸をＳｉｇｍａから得た。
植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ：
配列番号１を有する植物組換えヒトα−ＧＡＬ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ）（これは本明細書中では植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）として示される）を国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００８／０００５７６（これは国際公開ＷＯ２００８／１３２７４３として公開された）に記載されるように調製した。
トランスジェニック植物材料を、ヒトα−ＧＡＬ−Ａタンパク質を発現するために、α−ＧＡＬ−Ａのための発現カセットを含有する遺伝子構築物を浸透させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を使用して作製した。これを、制御された条件のもとでの生育チャンバーにおいて行った。この後、植物材料を集め、可溶性タンパク質を植物細胞から抽出した。その後、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ａを、タンパク質精製のための標準的方法を伴う精製プロセスによって精製し、その後、架橋タンパク質を製造するために化学的修飾工程を行った。本ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ａを、ホモジナイザーを使用して植物材料から抽出した。植物破片を遠心分離によって除き、タンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿工程および酸性化工程を使用してさらに精製した。上清をろ過し、疎水性カラムに負荷し、その後、脱塩し、カチオン交換カラムに負荷した。カチオン交換カラムのプールを濃縮した。
植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ：
配列番号２を有するα−ＧＡＬと、（配列番号１に存在するＮ末端アミノ酸ＥＦを有しない）配列番号３を有するα−ＧＡＬ（これは本明細書中ではｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩとして示される）との混合物を含む植物組換えヒトα−ＧＡＬを、異なる遺伝子構築物を使用して、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉについて上記で記載されるプロセスと類似するプロセスによって調製した。
ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（ＥＣ３．２．１−２２、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０５７９０）をコードするｃＤＮＡが、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって最適化され、合成された。リーダーペプチド（小胞体標的シグナルペプチド）を含まないコドン使用法を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ）遺伝子のコドンバイアスに合わせた。最適化プロセスのとき、下記のシス作用配列モチーフを避けた：内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位およびリボソーム進入部位、ＡＴリッチ配列領域またはＧＣリッチ配列領域、ＲＮＡ不安定性エレメント（「キラーモチーフ」）、反復配列およびＲＮＡ二次構造部、スプライスドナー（潜在性）部位およびスプライスアクセプター部位、分岐点。加えて、ＧＣ含量が非常に大きい（８０％超）領域または非常に低い領域（３０％未満）が避けられている。
全長型ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０５７９０）の天然型ヒトα−ガラクトシダーゼリーダーペプチド（小胞体標的シグナルペプチド）のヌクレオチド配列を、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＢＰＩタンパク質の３３アミノ酸の小胞体標的化シグナルペプチド（リーダーペプチド）をコードするヌクレオチド配列により置き換えた。このシグナルペプチドは、分泌経路へのα−ガラクトシダーゼの効率的な標的化をもたらし、タンパク質が小胞体内に輸送されると、シグナルペプチダーゼによってポリペプチドから切断される。小胞体保持シグナルＳＥＫＤＥＬをコードするヌクレオチド配列を３’末端においてｃＤＮＡ配列に加え、これにより、タンパク質を小胞体内に効果的に維持しながら、ゴルジ装置からの発現タンパク質の回収を可能にした。
目的とするタンパク質をコートタンパク質の強力なサブゲノムウイルスプロモーターから発現させた。このシステムは、アグロバクテリウムによって植物に送達されるウイルスベクターの（アグロインフェクションによる）一過性の増幅に依拠する。アグロインフェクションにおいて、植物機能性プロモーターと、ウイルスレプリコンをコードするｃＤＮＡとが、Ｔ−ＤＮＡとして、アグロバクテリウムから植物細胞内に移される。Ｔ−ＤＮＡが植物プロモーターによって植物内で転写されて、自己複製を開始する生物学的に活性なウイルスＲＮＡを生じさせる。
一過性発現のために、以前に開発されたシステムに基づく３−ベクター組換えシステムが、記載［Ｇｌｅｂａ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００５、２３：２０４２〜２０４８］通りに調製された。ベクターの１つにはα−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡが挿入され、それ以外の２つのベクターは、ウイルスレプリコン全体を構築するための遺伝子（ＲｄＲｐおよびインテグラーゼ）を含有し、したがって、自己複製を開始することができる生物学的に活性なウイルスＲＮＡを生じさせた。
タバコ（Ｎ．Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を、２４℃〜２５℃での長日（１６時間照明／８時間消灯）照明法のもと、顆粒状緩行肥料（Ｓｃｏｔｔ Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ）が補充された市販のミックス土壌（Ｇｉｖａａｔ Ａｄａ、ＩＬ）で発芽させ、成長させた。
アグロバクテリアを、エレクトロポレーション（２５００Ｖ、５ミリ秒）を使用して、ｐＩＣＨ２０８６６−ａｌｐｈａ−ＧＡＬに基づくレプリコンベクターシステムにより形質転換した［ｄｅｎ Ｄｕｌｋ−ＲａおよびＨｏｏｙｋａａｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９５、５５：６３〜７２］。植物に、３つのＩＣＯＮプラスミドを含有するアグロバクテリアをこの技術分野で知られている標準的方法による真空浸透によって浸透させた。簡単に記載すると、タバコ（Ｎ．Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物（５週齢〜６週齢）への浸透を、すべての地上部植物器官を細菌懸濁物に浸けることによって行い、植物を真空チャンバーに入れた。マイナス（−）０．８ｂａｒの真空を１分間加え、その後、直ちに大気圧に戻した。植物を温室に戻し、同じ生育条件のもとでさらに５日間〜７日間置いた。
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉のサンプルを浸透後５日で集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにＬａｅｍｍｌｉ緩衝液において、または、植物発現タンパク質の触媒活性をアッセイするために活性アッセイ緩衝液（２０ｍＭクエン酸、３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．６７％エタノール、ｐＨ４．６）において抽出した。
植物抽出物から得られるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を、２工程の硫酸アンモニウム示差的沈殿化（「塩析」：第１工程、０．５７Ｍ；第２工程、２．２７Ｍ）、それに続く、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ樹脂）およびカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
２つの配列（すなわち、配列番号２および配列番号３）（これらはＮ末端グリシンの有無において異なる）が、異なるリーダー配列プロセシングのために得られた。
α−ＧＡＬ活性の４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドアッセイ：
α−ＧＡＬ活性を、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解基質として使用して測定した。このアッセイをクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（２０ｍＭクエン酸、３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．６）において行った。試験α−ＧＡＬを含有する１０μＬのサンプルを、５ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する４０μＬのアッセイ緩衝液とインキュベーションした。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベーションした。反応混合物の１０μＬを黒色９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、９０μＬの停止液（２Ｍ炭酸ナトリウム）を加え、蛍光を３６５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの放射波長で測定した。蛍光を、４−メチルウンベリフェロン（反応生成物）の較正曲線を使用して生成物濃度に変換し、さらに活性に変換した。
α−ＧＡＬ活性のＮ−ドデカノイル−ニトロベンゾオキサジアゾール−セラミドトリヘキソシド（Ｇｂ３−ＮＢＤ）アッセイ
蛍光標識基質のＮ−ドデカノイル−ニトロベンゾオキサジアゾール−セラミドトリヘキソシド（Ｇｂ３−ＮＢＤ）は、Ｇｂ３よりも親油性が小さく、インビトロ酵素反応におけるその使用を容易にする。
１０μＬの０．１μｇ／μＬ Ｇｂ３−ＮＢＤ（１０％エタノールを含む水において）と、５μＬの０．２ｍｇ／ｍＬ α−ＧＡＬとを、ｐＨが４．６であるクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の８５μＬに加えた。最終的α−ＧＡＬ濃度が１０μｇ／ｍＬであった。α−ＧＡＬを含まないバックグラウンドまたは非触媒反応が、ｐＨが４．６であるクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の９０μＬと、１０μＬの０．１μｇ／μＬ Ｇｂ３−ＮＢＤ（１０％エタノールを含む水において）とから構成された。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベーションした。インキュベーション後、５０μＬのメタノールを反応混合物に加え、溶液を１分間ボルテックス撹拌した。その後、１００μＬのクロロホルムを加え、溶液をさらに、１分間ボルテックス撹拌した。水および有機溶媒を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃシステムを使用して真空下で除いた。残渣を８０μＬのクロロホルム：メタノール（１：１）に溶解した。各サンプルの３０μＬを、Ｌｉｎｏｍａｔ Ｖシステム（ＣＡＭＡＧ）を使用してＨＰＴＬＣ（高性能薄層クロマトグラフィー）シリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ）に負荷した。ＨＰＴＬＣプレートを、１００：４２：６の比率でのクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ溶液を溶媒システムとして使用して展開した。その後、プレートを乾燥させ、基質および生成物のスポットを３６５ｎｍの波長でのＵＶ光のもとでの照射によって可視化した。
α−ＧＡＬ活性のｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐ−ＮＰ−Ｇ）アッセイ：
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドをα−ＧＡＬ活性アッセイのための加水分解基質として使用した。アッセイ緩衝液は、ｐＨ４．６において、２０ｍＭクエン酸、３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．６７％エタノールを含有した。アッセイを９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で行った。５０μＬのサンプルを１５０μＬのアッセイ緩衝液とインキュベーションし、３０μＬの基質を加えて、８ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの最終濃度を得た。反応混合物を３７℃で９０分間インキュベーションした。９０分後、１００μＬの１．９８Ｍ炭酸ナトリウムを、反応を停止させるためにそれぞれのウエルに加えた。反応生成物の量を、吸光度を４０５ｎｍで測定することによって求めた。
インビトロにおけるα−ＧＡＬ安定性の測定：
様々な供給源から得られるα−ＧＡＬの安定性を、α−ＧＡＬを下記の条件の１つに加えることによって求めた：
１）模擬リソソーム条件：クエン酸塩−リン酸塩緩衝液（２０ｍＭクエン酸、３０ｍＭリン酸ナトリウム）、ｐＨ４．６、３７℃；
２）模擬生理学的条件：リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４、３７℃；
３）ヒト血漿、３７℃。
α−ＧＡＬを、溶液におけるα−ＧＡＬ活性によって求められる場合、１μｇ／ｍＬの濃度で加え、溶液を３７℃でインキュベーションした。各溶液のサンプルを所定の時点で抜き取り、α−ＧＡＬ活性を本明細書中上記のように測定した。試験α−ＧＡＬをそれぞれの環境に加えた直後の酵素活性の値を１００％として定義し、さらに、試験された時点での活性結果をその初期活性の百分率として計算した。
α−ＧＡＬの薬物動態学：
個々のＦａｂｒｙ（α−ＧＡＬ−Ａ −／０）マウスを、照明されたプレキシガラス製拘束具に入れ、酵素を尾静脈に注入した。血液サンプルを、ヘパリン添加ミクロヘマトクリットチューブを使用して尾採血または後眼窩での眼採血のどちらかによって注入後の示された時間で得た。血漿を４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド活性緩衝液で希釈した。４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドアッセイを上記のように行った。
消失期排出半減期（Ｔ１／２）を血漿活性結果に基づいて計算した。消失期半減期（排出半減期）は、血漿中の濃度が、分布の偽平衡に達した後で５０％低下するために必要とされる時間である。消失期半減期を時間対ｌｏｇ濃度の線形回帰によって曲線の消失期（ｌｏｇ−直線）部分から計算した［Ｔｏｕｔａｉｎ＆Ｂｏｕｓｑｕｅｔ−Ｍｅｌｏｕ、Ｊ Ｖｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ、２００４、２７：４２７〜３９］。
α−ＧＡＬの体内分布：
Ｆａｂｒｙ（α−ＧＡＬ−Ａ −／０）マウスにα−ＧＡＬを２ｍｇ／Ｋｇの用量で（尾静脈に）静脈内注入した。組織（肝臓、腎臓、心臓および脾臓）を、酵素注入後２時間、２４時間、３日、７日、１４日または２８日で回収した。正常なコントロールマウスおよび生理的食塩水投与（非処置）Ｆａｂｒｙマウスにおけるα−ＧＡＬレベルを、外因性α−ＧＡＬを受けたＦａｂｒｙマウスにおけるレベルと比較した。組織におけるα−ＧＡＬ活性を求めるために、解凍した組織サンプルを、Ｏｓｈｉｍａ他［ＰＮＡＳ、１９９７、９４：２５４０〜２５４４］に記載されるような溶解緩衝液（２８ｍＭクエン酸、４４ｍＭ第二リン酸ナトリウム、０．５％タウロコール酸ナトリウム、ｐＨ４．４）を含有する２ｍＬポリプロピレンチューブに入れた。サンプルを、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ（Ｒｅｔｓｃｈ ＭＭ４００）の使用によって１０分間ホモジネートした。破片を４℃での遠心分離によってペレット化し、得られた上清を上記のように４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドアッセイによってα−ＧＡＬ活性についてアッセイした。同じサンプルはまた、ウエスタンブロット分析にも供された。
インビボＧｂ３アッセイ：
注入されたα−ＧＡＬの終点効力を、Ｇｂ３レベルがα−ＧＡＬ活性によって低下するかどうかを明らかにするために、動物組織のＧｂ３レベルのアッセイによって測定した。
Ｇｂ３の加水分解を測定するために、中性スフィンゴ糖脂質を標的器官（例えば、肝臓、腎臓、心臓および脾臓）から抽出した。１００ｍｇの組織サンプルを２：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノールの１ｍＬにおいてホモジネートし、１３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。６２μＬの水を１ｍＬのホモジネートに加えて、２０：１０：２のクロロホルム：メタノール：水の溶液を得た。１０μＬのピリジンをホモジネートに加えて、１％の最終ピリジン濃度を得た。サンプルを４８℃で２４時間撹拌した。溶媒および水を、ＳｐｅｅｄＶａｃシステムを使用して真空下で除いた。サンプルを２．５ｍＬのメタノールに再懸濁し、その後、メタノールにおける１Ｍ ＫＯＨの２５０μＬを加えた。その後、サンプルを３７℃で２時間振とうした。けん化反応を１０μＬの酢酸の添加によって停止させた。その後、２．５ｍＬのクロロホルムをサンプルに加え、続いて、２．５ｍＬの冷水を加えた。サンプルを５分間激しく振とうし、５分間静置させて、相分離させた。上部相（メタノールおよび水から構成される）を捨て、下部相（クロロホルムおよびメタノールから構成される）を真空下でエバポレーションし（ＳｐｅｅｄＶａｃ）、残渣をＨＰＴＬＣによるスフィンゴ糖脂質の分析のために１：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノールの３００μＬに再懸濁した。
組織の糖脂質の定性分析および半定量分析を高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）（ＣＡＭＡＧ、スイス）によって行った。ＨＰＴＬＣ分析をＨＰＴＬＣシリカゲル６０ガラス被覆プレート（Ｍｅｒｃｋ）で行った。サンプルを、Ｌｉｎｏｍａｔ５システム（ＣＡＭＡＧ、スイス）を使用してプレートに負荷した。プレートを、クロロホルム−メタノール−水（６０：３５：４）を溶媒システムとして使用して展開した。中性スフィンゴ糖脂質をプリムリン噴霧試薬により検出した。Ｇｂ３を、ブタ赤血球Ｇｂ３（Ｍａｔｒｅｙａ）を標準物として使用して特定し、Ｎ−ヘプタデカノイルセラミドトリヘキソシド（Ｍａｔｒｅｙａ）（半合成標準物）の較正曲線を使用して定量した。プレートを可視化し、関連スポットを、ｗｉｎＣＡＴＳソフトウエア（ＣＡＭＡＧ、スイス）によって支援されるＴＬＣ Ｓｃａｎｎｅｒ ＩＩＩ（ＣＡＭＡＧ、スイス）を使用して定量した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）システムおよび自家製注入の１２％アクリルアルミゲルを使用して還元条件下で行った。ゲルをクーマシーブルーＧ２５０染色によって染色した。
ＩＥＦ（等電点フォーカシング）：
ＩＥＦを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ミニセル、および、３〜７のｐＨ範囲を有する注入済みＩＥＦゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ゲルをクーマシーブルーＧ２５０によって染色した。
質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｒｅｆｌｅｘ ＩＶ ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計システム（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｆｒａｎｚｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｋ ＧｍｂＨ、ドイツ）およびシナピン酸／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（２：１、ｖ／ｖ））飽和マトリックス溶液を使用して行った。
実施例Ｉ
組換えα−ＧＡＬのインビトロ安定性
組換えα−ＧＡＬのインビトロ安定性を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるような様々な条件で測定した。植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ、ならびに、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）およびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）の市販されている組換えヒトα−ＧＡＬを試験した。
図１に示されるように、α−ＧＡＬの試験されたタイプのすべてが活性の喪失を模擬リソソーム条件のもとで示した。
加えて、図２に示されるように、α−ＧＡＬの試験されたタイプのすべてが活性の喪失を模擬生理学的条件のもとで示した。図２においてさらに示されるように、１００ｍｇ／ｍＬのガラクトースの存在は植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの活性をそのような条件のもとで部分的に保護した。
同様に、図３に示されるように、α−ＧＡＬの試験されたタイプのすべてが活性の喪失を３７℃でのヒト血清において示した。
図４に示されるように、１００ｍｇ／ｍＬのガラクトースの存在は植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの活性を模擬リソソーム条件のもとで部分的に保護した。
リソソームｐＨレベルおよび中性ｐＨレベルでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実験では、タンパク質構造における変化が明らかにされ（データは示されず）、一方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット分析では、一次アミノ酸配列の減成が何ら示されなかった（データは示されず）。
これらの結果は、α−ＧＡＬがα−ＧＡＬタンパク質構造の変化のためにリソソーム条件および生理学的条件のもとでは活性を失うこと、また、ガラクトースにより、この活性喪失が部分的に防止されることを示している。
実施例ＩＩ
ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリ（エチレングリコール）（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）剤による植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの架橋
植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）を、５０：１、１００：１および２００：１のモル比で、様々な分子量のビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリ（エチレングリコール）（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）により、すなわち、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５（２０００ダルトンのＰＥＧを有するビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）（それらの構造が図５に示される）により架橋した。
ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧはタンパク質上の２個所（例えば、リシン残基）でタンパク質に結合し、これにより、架橋を形成することができ、または、タンパク質上の１個所でタンパク質に結合することができる。これら２つの結合形態が図６に示される。
２８．５μＬの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６）における１００μｇのα−ＧＡＬ−Ｉを、１００ｍｇ／ｍｌのガラクトースを含有する１３．５μＬのリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８）に加えた。
α−ＧＡＬ−Ｉを、８μＬのＤＭＳＯにおけるビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５をα−ＧＡＬ−Ｉ溶液（１：５０のモル比については２７．４μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液、１：１００のモル比については５４．８μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液、１：２００のモル比については１０９．７μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液）を加えることによって、１：５０、１：１００および１：２００のタンパク質：試薬のモル比でビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５により架橋した。
α−ＧＡＬ−Ｉを、８μＬのＤＭＳＯにおけるビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５をα−ＧＡＬ−Ｉ溶液（１：５０のモル比については１０３μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液、１：１００のモル比については２０６μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液、１：２００のモル比については４１２μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液）を加えることによって、１：５０、１：１００および１：２００のタンパク質：試薬のモル比でビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋した。α−ＧＡＬ−Ｉを、１１．５μＬのＤＭＳＯにおけるビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８をα−ＧＡＬ−Ｉ溶液（１：５０のモル比については３７μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液、１：１００のモル比については７３μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液、１：２００のモル比については１４６μｇのα−ＧＡＬ−Ｉの溶液）を加えることによって、１：５０、１：１００および１：２００のタンパク質：試薬のモル比でビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８により架橋した。
ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤をα−ＧＡＬ−Ｉに加えた後、反応液をピペッティングし、室温で２時間、回旋式振とう機で撹拌した。
すべての反応液において、過剰なビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ架橋剤を生理的食塩水に対する透析（５０ＫＤａカットオフ）によって除いた。
ダイマーの収率がタンパク質濃度およびＤＭＳＯ濃度の増大とともに増大し、３０％にまで達した。
反応生成物を、本明細書中上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動）、ＩＥＦ（等電点フォーカシング）、ウエスタンブロットおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。
図７に示されるように、標準物の天然型ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、ゲル電気泳動後、（４８ＫＤａの分子量を有する）モノマーとして認められ、これに対して、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧと反応させた後では、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、（若干のモノマーが存在するが）主にダイマーの形態で現れた。このことは、２つのモノマーがビス−ＮＨＳ−ＰＥＧによる架橋によって共有結合で連結されたことを示している。
図７においてさらに示されるように、より大きい割合のモノマー型ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉが、より長い架橋剤（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５）による場合に比べて、より短い架橋剤（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８）により認められた。ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５は大きい割合の架橋タンパク質をもたらした。これらの結果は、より短い架橋剤は、モノマーを共有結合で架橋することにおいてあまり効果的でないことを示している。
図７においてさらに示されるように、試験された架橋剤のそれぞれについて、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのモノマー部分の分子量が架橋剤との反応の後で増大した。この分子量増大は、架橋剤対タンパク質のより大きい比率が使用されたとき（例えば、２００：１）、および、架橋剤の分子量が大きくなったとき（例えば、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５）、より大きくなった。これらの結果は、架橋によってダイマー化されないタンパク質モノマーがビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ架橋剤に共有結合で結合したこと、すなわち、タンパク質がＰＥＧ化されたことを示している。
上記の結果は、架橋剤対タンパク質のより大きいモル過剰の使用により、ダイマーを形成するための架橋およびタンパク質のＰＥＧ化の両方を含めて、より大きいレベルのα−ＧＡＬ修飾がもたらされることを示している。しかしながら、１００：１のモル比は、大きいレベルの架橋を、とりわけ、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５試薬を使用する反応においてもたらし、その結果、２００：１のモル比は架橋効率に対するほんのわずかな増加をもたらしただけであった。
図８に示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧと反応させることにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの等電点（ｐＩ）が低下した。これにより、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧがｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉに共有結合で結合していることが確認される。ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧがｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉに結合することにより、リシン残基における塩基性アミン基が中性のアミド基に変換され、したがって、ｐＩが低下する。ｐＩにおける低下は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧのより大きいモル過剰（例えば、２００：１）が使用されたとき、より顕著であった。このことから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られる上記の結果が確認される。
図８においてさらに示されるように、ｐＩは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８による方がビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によるよりも大きく低下する。
この結果は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８の方が、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５よりも、架橋剤の一方の末端のみがα−ＧＡＬに結合するＰＥＧ化を生じさせやすいことを示している。一方の末端のみでα−ＧＡＬに結合する架橋剤は、ｐＩを低下させることにおいてより効果的である。これは、そのような架橋剤は、リシンのアミン基を結合末端においてアミド基に変換することに加えて、酸性のカルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）基を非結合末端において含むからである。
図９に示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋剤と反応させることにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉダイマーの分子量が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって求められるように、９７ＫＤａから１１３ＫＤａに増大した。この分子量増大は、およそ８分子のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５がｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉダイマーに付加したことを示している。
図１０に示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８架橋剤と反応させることにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉダイマーの分子量が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって求められるように、９７ＫＤａから１０４ＫＤａに増大した。この分子量増大は、およそ１０分子のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８がｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉダイマーに付加したことを示している。
実施例ＩＩＩ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの活性
実施例ＩＩに記載される架橋された植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）が酵素活性を保持するかどうかを明らかにするために、架橋されたｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉを、本明細書中上記で記載される４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドアッセイを使用してその酵素活性についてアッセイした。
下記の表１に示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と、５０：１、１００：１および２００：１のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ試薬のモル過剰で反応させたｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉはすべての場合で、天然型ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの活性と類似するレベルの酵素活性を示した。表１に示されるように、活性における適度な増大および適度な低下の両方がいくつかの場合において認められた。これは配合効果の結果であるかもしれない。これらの結果は、架橋がｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの活性を低下させなかったことを示している。
ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの活性を、本明細書中上記で記載されるＮ−ドデカノイル−ＮＢＤ−セラミドトリヘキソシドアッセイを使用してさらに確認した。このアッセイはα−ＧＡＬの活性をその天然基質のセラミドトリヘキソシド（Ｇｂ３）に対してアッセイする。Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬを比較のためにアッセイした。
図１１に示されるように、架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉを蛍光性基質とインキュベーションした後、ほとんどすべての基質が、哺乳動物組換えα−ＧＡＬ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））によって触媒される反応と同様に、生成物のＮ−ドデカノイル−ニトロベンゾオキサジアゾール−ラクトシルセラミドに変換された。この結果から、架橋により、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの酵素加水分解効率が、天然基質の近縁アナログを使用した場合、損なわれていなかったことが確認される。
実施例ＩＶ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉのインビトロ安定性
実施例ＩＩに記載されるように得られる架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）のインビトロ安定性を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるような様々な条件で測定した。Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）およびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）の市販の組換えヒトα−ＧＡＬの安定性を比較のために測定した。
図１２Ａ〜図１２Ｃに示されるように、模擬リソソーム条件下での植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの安定性が、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ５による架橋（図１２Ａ）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８による架橋（図１２Ｂ）およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５による架橋（図１２Ｃ）によって高まった。これらの図においてさらに示されるように、１週間の経過にわたる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの安定性は、市販の組換えヒトα−ＧＡＬの安定性と比べて遜色がなかった。最初の２４時間の期間中での残存活性における小さい低下の後では、架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉは、１０日後でさえ、活性を維持した。活性におけるこの初期低下は、最初の２４時間の期間中に認められるので、架橋を受けていない部分の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉを反映しているかもしれない。
図１２Ａ〜図１２Ｃにおいてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉは、模擬リソソーム条件下で、最も大きい安定性を示した。
３７℃でのヒト血漿における植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの安定性もまた、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５による架橋によって高まった（データは示されず）。
これらの結果は、α−ＧＡＬを本明細書中に記載されるように架橋することにより、インビボでのα−ＧＡＬの効力が、リソソームにおけるα−ＧＡＬの安定性を増大させ、それにより、α−ＧＡＬがリソソームにおいてより長期間にわたって作用することを可能にすることによって、また、血液におけるα−ＧＡＬの安定性を増大させ、それにより、α−ＧＡＬの循環半減期を増大させることによって増大し得ることを示している。
実施例Ｖ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉのインビボでの薬物動態学および体内分布
実施例ＩＩに記載されるようにビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）の薬物動態学および体内分布を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるように、２ｍｇ／Ｋｇのα−ＧＡＬが注入されたＦａｂｒｙマウスにおいて求めた。非架橋の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩおよびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）組換えヒトα−ＧＡＬの薬物動態学および体内分布を比較のために求めた。血液サンプルを、注入後１分、３分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、６０分および１２０分で薬物動態学分析のために採取した。α−ＧＡＬのそれぞれのタイプについて、処置群は６匹のマウスからなった。
下記の表２に示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋することにより、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの循環消失期半減期が増大し、この場合、後者がより顕著な効果を示した。
図１３および表２に示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５によって架橋されるｐｒｈ α−ＧＡＬ−Ｉの消失期半減期は、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬの消失期半減期よりもかなり大きかった。
図１３においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの２０分での活性は１分での活性の約４０％であった。さらには、この架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉは、注入後４時間でさえ、血漿における活性な存在を示した。
これらの結果は、この架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉは比較的長期間にわたってインビボで相変わらず活性であり、このことは、この酵素がさらなる組織および器官に達することを可能にし得ることを示している。
図１４Ａおよび図１４Ｂに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの、注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの脾臓におけるレベルは、非架橋の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベル、ならびに、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりもかなり高かった。これらの図においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベルは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベルよりも高かった。ウエスタンブロット分析（図１４Ｂ）は、α−ＧＡＬの酵素活性をアッセイすることによって得られる体内分布の結果（図１４Ａ）と一致している。
図１５Ａおよび図１５Ｂに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの、注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの肝臓におけるレベルは、非架橋の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベルよりもかなり高かったが、肝臓におけるＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりも低かった。これらの図においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベルは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベルよりもわずかに高かった。ウエスタンブロット分析（図１５Ｂ）は、α−ＧＡＬの酵素活性をアッセイすることによって得られる体内分布の結果（図１５Ａ）と一致している。
肝臓におけるα−ＧＡＬのレベルがより低いことは、治療的に好都合であるかもしれない。これは、酵素補充療法における回復酵素の約９５％が典型的には肝臓に見出され、したがって、肝臓における組換えα−ＧＡＬのレベルが高いことは、標的器官（例えば、心臓および腎臓など）における外因性α−ＧＡＬのレベルがより低いことを示しているからである。
図１６に示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの、注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの心臓におけるレベルは、非架橋の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベルよりも高かった。この図においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベルは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベル、ならびに、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりも高かった。
図１７に示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉの、注入後２時間でのＦａｂｒｙマウスの腎臓におけるレベルは、非架橋の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベルよりも高かった。この図においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベルは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ８により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉのレベル、ならびに、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりも高かった。
同様に、図１８〜図２１に示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベルは、注入後７日までの間、Ｆａｂｒｙマウスの脾臓（図１８）、肝臓（図１９）、心臓（図２０）および腎臓（図２１）において非架橋の植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベルよりも高かった。これらの図においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えα−ＧＡＬ−Ｉのレベルは、脾臓、心臓および腎臓においてＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりも高かった。
これらの結果は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ（特に、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５）により架橋されるα−ＧＡＬが、腎臓および心臓（これらはファブリー障害の処置における主要な標的器官である）を含めて、様々な器官への高まった取り込みを示すことを示している。これらの結果は、架橋α−ＧＡＬの増大した循環半減期および高まった安定性と一致している。
実施例ＶＩ
ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリ（エチレングリコール）（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）による哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの架橋
本明細書中上記で記載される架橋の好都合な効果を確認するために、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬ（これはヒト線維肉腫株ＨＴ−１０８０から製造される）を架橋した。
１００ｍｇ／ｍｌのＤ−（＋）−ガラクトースを含むリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８）の３３３μＬを、１５１μＬのＤＭＳＯ溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）における３．８ｍｇのビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５、および、１３０μＬのクエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６）における１．８ｍｇのＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）組換えヒトα−ＧＡＬに加えた。Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬの濃度を活性アッセイによって求めた。反応混合物を、室温で２時間、回旋式振とう機を使用して撹拌した。過剰なビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋試薬を、５０ＫＤａのカットオフを有するＶｉｖａｓｐｉｎ６濃縮器を使用して、生理的食塩水に対する透析によって除いた。架橋されたＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬのα−ＧＡＬ活性は、α−ＧＡＬ濃度が３ｍｇ／ｍＬであることを示した。
反応生成物を、本明細書中上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＩＥＦ（等電点フォーカシング）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。
図２２に示されるように、標準物の天然型Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬが、ゲル電気泳動後、モノマーとして認められ、これに対して、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応した後では、α−ＧＡＬがダイマーの形態で現れた。このことは、２つのモノマーがビス−ＮＨＳ−ＰＥＧによる架橋によって共有結合で連結されたことを示している。
図２３に示されるように、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５と反応させることにより、α−ＧＡＬの等電点（ｐＩ）が低下した。これにより、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧがα−ＧＡＬに共有結合で結合していることが確認される。
図２４に示されるように、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋剤と反応させることにより、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬダイマーの分子量が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって求められるように、１０３．０ＫＤａから１２１．３ＫＤａに増大した。この分子量増大は、およそ９分子〜１０分子のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５がα−ＧＡＬダイマーに付加したことを示しており、このことは、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉについて本明細書中上記で記載される結果と類似している。
実施例ＶＩＩ
架橋された哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの活性
実施例ＶＩに記載される哺乳動物組換えα−ＧＡＬの架橋が酵素活性に影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、架橋α−ＧＡＬを、本明細書中上記の手順に従って、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＰ−Ｇ）アッセイを使用してその酵素活性についてアッセイした。
図２５および下記の表３に示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋された哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬは、天然型の哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの酵素活性パラメーターと非常に類似する酵素活性パラメーターを示した。これらの結果は、架橋がこの哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの活性または触媒装置および触媒機能に著しい影響を及ぼさなかったことを示している。
実施例ＶＩＩＩ
架橋された哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬのインビトロ安定性
実施例ＶＩに記載されるように得られる架橋されたＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬのインビトロ安定性を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるような様々な条件で測定した。架橋の影響を評価するために、非架橋のＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）α−ＧＡＬの安定性を比較のために測定した。
図２６Ａおよび図２６Ｂに示されるように、模擬リソソーム条件下（図２６Ａ）およびヒト血漿中（図２６Ｂ）の両方における哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの安定性が、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５による架橋によってかなり高まった。架橋された哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬは、模擬リソソーム条件下において、血漿中よりも大きい安定性を示した。
これらの結果は、α−ＧＡＬを本明細書中に記載されるように架橋することにより、多数の供給源および発現プラットフォームから得られる組換えα−ＧＡＬが安定化され得ることを示している。
実施例ＩＸ
架橋された哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬのインビボでの薬物動態学および体内分布
実施例ＶＩに記載される架橋された哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの薬物動態学および体内分布を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるように、注入後２時間、７日、１４日および２８日でのＦａｂｒｙマウスの脾臓、肝臓、心臓および腎臓におけるα−ＧＡＬ活性、ならびに、これらの器官におけるＧｂ３レベルを測定することによって求めた。非架橋のＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの体内分布を比較のために求めた。
図２７Ａ〜図２７Ｄに示されるように、Ｆａｂｒｙマウスの脾臓（図２７Ａ）、肝臓（図２７Ｂ）、心臓（図２７Ｃ）および腎臓（図２７Ｄ）における架橋された哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルは、非架橋の哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりもかなり高かった。
図２８Ａ〜図２８Ｄに示されるように、架橋された哺乳動物組換えα−ＧＡＬは、Ｇｂ３レベルを、注入後２８日の経過にわたって、Ｆａｂｒｙマウスの心臓（図２８Ａ）、腎臓（図２８Ｂ）、肝臓（図２８Ｃ）および脾臓（図２８Ｄ）において低下させた。架橋された哺乳動物組換えα−ＧＡＬは、Ｇｂ３レベルを、Ｆａｂｒｙマウスの腎臓（図２８Ｂ）および脾臓（図２８Ｄ）において、非架橋の哺乳動物組換えα−ＧＡＬが低下させたよりも大きな程度に低下させ、心臓（図２８Ａ）および肝臓（図２８Ｃ）においては非架橋の哺乳動物組換えα−ＧＡＬとほぼ同じ程度に低下させた。
これらの結果は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧによる架橋により、様々な供給源および発現プラットフォームから得られる組換えα−ＧＡＬが、腎臓および心臓（これらはファブリー障害の処置における主要な標的器官である）を含めて、様々な器官に取り込まれることがかなり高まることを示している。これらの結果はさらに、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧによる架橋により、様々な器官におけるＧｂ３レベルのより大きい実質的低下がもたらされることを示している。
実施例Ｘ
ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリ（エチレングリコール）（ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）による植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの架橋
植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩ）（これは、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩのＮ末端に存在するアミノ酸ＥＦを有しない）を、実施例ＩＩに記載されるプロトコルに従って、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ対α−ＧＡＬの２００：１のモル比で、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８により架橋した。
ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧによる架橋の後、その生物学的活性を保持していた（データは示されず）。
反応生成物を、本明細書中上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。
図２９Ａ〜図２９Ｂに示されるように、標準物の天然型ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩが、ゲル電気泳動後、モノマーとして認められ、これに対して、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１と反応させた後（図２９Ａ）、あるいは、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８と反応させた後（図２９Ｂ）では、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩが、（若干のモノマーが存在するが）主にダイマーの形態で現れた。このことは、２つのモノマーがビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ架橋剤による架橋によって共有結合で連結されたことを示している。
図２９Ａ〜図２９Ｂにおいてさらに示されるように、試験された架橋剤のそれぞれについて、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩのモノマー部分の分子量が架橋剤との反応の後で増大した。この分子量増大は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５についてはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１よりも大きく（図２９Ａ）、また、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８については最も大きかった（図２９Ａを図２９Ｂと比較せよ）。これらの結果は、架橋によってダイマー化されないモノマーがビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ架橋剤に共有結合で結合したこと、すなわち、タンパク質がＰＥＧ化されたことを示している。
図３０Ａ〜図３０Ｃに示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１架橋剤と反応させることにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩダイマーの分子量が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって求められるように、９５ＫＤａ（図３０Ａ）から１０９ＫＤａ（図３０Ｂ）に増大し、一方、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５架橋剤と反応させることにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩダイマーの分子量が１１４ＫＤａ（図３０Ｃ）に増大した。この分子量増大は、およそ１３分子のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１またはおよそ９分子のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５がｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩダイマーに付加したことを示している。
実施例ＸＩ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩのインビトロ安定性
実施例Ｘに記載されるように得られる架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩ）のインビトロ安定性を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるような様々な条件で測定した。Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）の市販の組換えヒトα−ＧＡＬの安定性を比較のために測定した。
図３１Ａ〜図３１Ｄに示されるように、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの安定性が、模擬リソソーム条件下（図３１Ａおよび図３１Ｂ）およびヒト血漿中（図３１Ｃおよび図３１Ｄ）の両方において、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８による架橋（図３１Ｂおよび図３１Ｄ）、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５による架橋（図３１Ａ〜図３１Ｄ）またはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１による架橋（図３１Ａおよび図３１Ｃ）のいずれによっても高まった。これらの異なる架橋剤はｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの安定性を同等程度に高めた。これらの図においてさらに示されるように、架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの安定性はＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）組換えヒトα−ＧＡＬの安定性よりも大きかった。架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、より大きい安定性を、模擬リソソーム条件下、ならびに、血漿条件下において示した。
図３１Ａ〜図３１Ｄにおいてさらに示されるように、非架橋のｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、模擬リソソーム条件下（図１および図３１Ａ〜図３１Ｂ）およびヒト血漿中（図３および図３１Ｃ〜図３１Ｄ）の両方において、非架橋のｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉよりもかなり安定である（比較のために図１および図３を参照のこと）。だが、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは依然として、若干の不安定性を示す。
これらの結果は、α−ＧＡＬを本明細書中に記載されるように架橋することにより、種々のタイプのα−ＧＡＬが安定化され得ることを示している。
実施例ＸＩＩ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩのインビボでの薬物動態学および体内分布
実施例Ｘに記載されるＰＥＧ４５架橋およびＰＥＧ２１架橋の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩ）の薬物動態学および体内分布を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるように、α−ＧＡＬ活性を血漿および器官において測定することによって求めた。非架橋のＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）哺乳動物組換えヒトα−ＧＡＬの薬物動態学および体内分布を比較のために求めた。
血液サンプルを、１ｍｇ／Ｋｇのα−ＧＡＬをＦａｂｒｙマウスに注入した後１分、５分、１０分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、４８０分および１４４０分で薬物動態学分析のために採取した。
α−ＧＡＬの体内分布を、２ｍｇ／Ｋｇのα−ＧＡＬを注入した後２時間、７日、１４日および２８日でのＦａｂｒｙマウスの肝臓、腎臓、心臓および脾臓を回収することによって求めた。
図３２Ａおよび図３２Ｂならびに表４に示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋することにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの循環消失期半減期がかなり増大し、これにより、哺乳動物組換えα−ＧＡＬまたは非架橋のｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの循環半減期よりもかなり大きい循環半減期がもたらされた。
図３３Ａ〜図３３Ｌに示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋することにより、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの取り込みが、Ｆａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ）、腎臓（図３３Ｂ）、肝臓（図３３Ｃ）および脾臓（図３３Ｄ）において増大した。だが、肝臓においてはより小さい程度であった。
図３３Ｅ〜図３３Ｌに示されるように、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩをビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２１により架橋することによってもまた、ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの取り込みが、Ｆａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｆおよび図３３Ｊ）、肝臓（図３３Ｇおよび図３３Ｋ）および脾臓（図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において増大した。だが、そのような増大は、ほんの２時間の後では必ずしも明白ではなかった。
それらの図においてさらに示されるように、架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩのレベルが、Ｆａｂｒｙマウスの心臓（図３３Ａ、図３３Ｅおよび図３３Ｉ）、腎臓（図３３Ｂ、図３３Ｆおよび図３３Ｊ）および脾臓（図３３Ｄ、図３３Ｈおよび図３３Ｌ）において哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりも大きく、肝臓（図３３Ｃ、図３３Ｇおよび図３３Ｋ）においては哺乳動物組換えα−ＧＡＬのレベルよりも低かった。
これらの結果は、架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩが血漿中および様々な器官（特に、肝臓以外の器官）においてα−ＧＡＬのかなり高まった活性を示すことを示している。
実施例ＸＩＩＩ
植物組換えヒトα−ＧＡＬの活性に対するｐＨの影響
環境のｐＨは、リソソーム酵素（例えば、α−ＧＡＬなど）の安定性および速度論に対する著しい影響を有する。ｐＨは、基質の酵素への結合に影響を及ぼすかもしれない。ｐＨはまた、酵素の活性部位の一部である触媒作用基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基など）のプロトン化または脱プロトン化に影響を与えることができ、したがって、酵素の速度論的挙動に影響を与えることができる。酵素の三次構造または四次構造の安定性もまたｐＨ依存的であり、とりわけ、極端に酸性またはアルカリ性のｐＨ値では、酵素反応の速度に影響を与える。
ＰＥＧ４５架橋の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩおよび非架橋の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの活性を、α−ＧＡＬ活性のｐＨ依存性およびそれに対する架橋の影響を調べるために、ｐＮＰ−Ｇ基質を使用して様々なｐＨ値において求めた。測定を、２０ｍＭクエン酸塩および３０ｍＭリン酸ナトリウムの溶液において行った。
様々なｐＨ値におけるα−ＧＡＬ活性を特徴づける速度論的パラメーターが下記の表５および図３４Ａ〜図３４Ｃにまとめられる。
図３４Ａ〜図３４Ｃに示されるように、α−ＧＡＬ−ＩＩの架橋はＶｍａｘパラメーター（図３４Ａ）およびｋｃａｔパラメーター（図３４Ｃ）を増大させたが、ＫＭパラメーター（図３４Ｂ）に対する著しい影響を有していなかった。
Ｖｍａｘおよびｋｃａｔの両パラメーターの高まりは触媒活性における増大を示している。この増大は、非架橋のα−ＧＡＬ−ＩＩの触媒活性が無視できるほどである少なくとも約７のｐＨ値では特に著しい。
ＫＭは、酵素／基質親和性に関連する速度論的パラメーターである。ＫＭ値に対する架橋の著しい影響がないことは、架橋はｐＮＰ−Ｇ基質へのα−ＧＡＬ親和性に対する著しい影響がないことを示している。
実施例ＸＩＶ
α−ＧＡＬの安定性に対するＰＥＧ化の影響
α−ＧＡＬ安定性に対するＰＥＧ化自体の影響を、ＰＥＧ架橋剤の安定化効果がＰＥＧの性質に起因するか、または、架橋に起因するかを明らかにするために確認した。
植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉを、異なる分子量（２ＫＤａ、５ＫＤａおよび１０ＫＤａ）を有するＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化メトキシ−キャップ化ＰＥＧと反応させた。そのようなＰＥＧ試薬はただ１つだけのＮＨＳ基を有しており、その結果、タンパク質を、架橋を形成することなくＰＥＧ化する。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
図３５に示されるように、メトキシ−キャップ化されたＰＥＧ化剤はα−ＧＡＬをＰＥＧ化し（これはα−ＧＡＬの分子量における増大として視認された）、しかし、α−ＧＡＬダイマーを実質的に生じさせなかった。このことは、α−ＧＡＬが架橋されなかったことを示している。
図３６Ａおよび図３６Ｂに示されるように、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉを、架橋を形成することなくＰＥＧ化することにより、植物組換えα−ＧＡＬの安定性が模擬リソソーム条件下（図３６Ａ）またはヒト血漿中（図３６Ｂ）のどちらにおいても実質的に増大しなかった。
これらの結果は、本明細書中上記で記載される架橋の安定化効果がＰＥＧ化自体の結果でないことを示している。
実施例ＸＶ
架橋α−ＧＡＬの活性に対するＰＥＧ鎖長の影響
α−ＧＡＬ活性に対するＰＥＧ架橋剤の鎖長の影響を評価するために、植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉを、実施例ＩＩに記載されるのと本質的に同じ手順を使用して、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２剤、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４剤、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ６８剤およびビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ１５０剤により架橋した（ＰＥＧ６８およびＰＥＧ１５０はほぼ等しい鎖長である）。α−ＧＡＬ−Ｉを、５０：１、１００：１および２００：１のビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ：α−ＧＡＬのモル比で架橋した。反応生成物を、本明細書中上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。実施例ＩＩに記載されるようにビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるα−ＧＡＬ−Ｉもまた、比較のために分析した。
図３７に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤のすべてが、共有結合で架橋されたダイマーをもたらすようにα−ＧＡＬを架橋したこと、および、架橋は、２００：１のモル比が使用されたとき、より効率的であったことが示された。
その後、架橋α−ＧＡＬ−Ｉの酵素活性を、実施例ＩＩＩに記載されるように求めた。結果が下記の表６にまとめられる。
表６に示されるように、ＰＥＧ２およびＰＥＧ４による架橋はα−ＧＡＬ活性を中程度に（およそ３０％〜５０％）低下させ、これに対して、より長いＰＥＧ鎖による架橋はα−ＧＡＬ活性に著しい影響を与えなかった。
これらの結果は、ＰＥＧ４よりも長いＰＥＧ鎖による架橋が、架橋α−ＧＡＬの活性を保つという点で好都合であることを示している。
実施例ＸＶＩ
ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤を使用するα−ＧＡＬの架橋
事前に調製された（例えば、市販の）ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤を使用するα−ＧＡＬの上記架橋の代替として、α−ＧＡＬを、架橋反応が行われる直前にカルボキシル（すなわち、ＣＯＯＨ）基をその場で活性化することによってビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤により架橋した。
ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ１２、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ２８およびビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５をそれぞれ、カルボキシル基あたり１．１モル当量（すなわち、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧあたり２．２モル当量）のＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）およびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの両方と反応させることによって活性化した。その後、反応混合物を、室温で３０分間、ＤＭＳＯ中で振とうした。活性化されたビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ（これは本質的にはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧである）をその後、実施例ＩＩに記載されるように、５０：１、１００：１および２００：１のモル比で植物組換えヒトα−ＧＡＬと反応させた。反応生成物を、本明細書中上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。実施例ＩＩに記載されるようにビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるα−ＧＡＬ−Ｉもまた、比較のために分析した。
図３８に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤のすべてが、ある程度にα−ＧＡＬを架橋したが、架橋は、２００：１のモル比が使用されたとき、より効率的であったことが示された。
その後、架橋α−ＧＡＬ−Ｉの酵素活性を、実施例ＩＩＩに記載されるように求めた。結果が下記の表７にまとめられる。
表７に示されるように、試験されたビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤のそれぞれによる架橋は、ほぼ予想された活性を有するα−ＧＡＬをもたらした。
これらの結果は、架橋するビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤は、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤による架橋と比較した場合、α−ＧＡＬ活性を低下させないことを示している。
これらの結果からさらに、ＰＥＧ４よりも長いＰＥＧ鎖による架橋は架橋α−ＧＡＬの活性を著しく低下させないという上記の発見が確認される。
実施例ＸＶＩＩ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉのインビトロ安定性に対する架橋剤の長さおよびタイプの影響
架橋α−ＧＡＬの安定性に対する鎖長の影響をさらに特徴づけるために、また、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤（例えば、実施例ＸＶＩに記載されるようなビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤）により架橋されるα−ＧＡＬの安定性を、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤により架橋されるα−ＧＡＬの安定性と比較するために、実施例ＸＶおよび実施例ＸＶＩに記載されるように得られる、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ１２、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ２８およびビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５により架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉ）のインビトロ安定性を、材料および方法の節において本明細書中上記で記載されるような様々な条件で測定し、実施例ＩＩに記載されるようにビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により架橋されるｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの安定性と比較した。Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）の市販の組換えヒトα−ＧＡＬおよび非架橋のｐｒｈ−ＧＡＬ−Ｉの安定性を比較のために測定した。
図３９に示されるように、模擬リソソーム条件下での植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの安定性が、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤およびビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤のそれぞれによる架橋によって高まった。
この図においてさらに示されるように、架橋されたｐｒｈ−α−ＧＡＬ−Ｉの安定性が、架橋するＰＥＧ鎖の長さと相関し、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５およびビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５が最大の安定性をもたらし、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ２が最小の安定性をもたらした。しかしながら、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５による架橋は、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５による架橋がもたらしたよりもほんのわずかに大きい安定性をもたらしただけであった。このことは、ある特定の長さを超えると、安定性がＰＥＧ鎖長によって影響を受けないことを示唆する。
図３９においてさらに示されるように、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５による架橋は、ビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ４５による架橋がもたらしたよりもわずかに大きい安定性をもたらした。これは、このビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤の不完全な活性化の結果であるかもしれない。しかしながら、安定性における差はわずかであった。
加えて、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ剤およびビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧ剤のそれぞれによる架橋は植物組換えヒトα−ＧＡＬ−Ｉの安定性を３７℃でのヒト血漿中において高めた（データは示されず）。
これらの結果は、α−ＧＡＬを本明細書中に記載されるように架橋することにより、インビボでのα−ＧＡＬの効力が、リソソーム中および血液中におけるα−ＧＡＬの安定性を増大させることによって増大し得るという証拠、そして、長さが約２８ユニット〜４５ユニットであるＰＥＧ鎖が、α−ＧＡＬを架橋によって安定化することにおいて、より短いＰＥＧ鎖よりも効果的であるという証拠をさらに提供する。
実施例ＸＶＩＩＩ
架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの速度論的パラメーター
実施例Ｘに記載されるように得られる架橋された植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの速度論的パラメーター、ならびに、非架橋の植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの速度論的パラメーターを、それらに対する架橋の影響を調べるために、ｐＮＰ−Ｇ基質およびミカエリス−メンテン分析を使用して求めた。測定を、２０ｍＭクエン酸塩、３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．６７％エタノールの溶液において、４．６のｐＨで行った。速度論的パラメーターを、活性アッセイに基づくタンパク質含有値を使用して計算した。
下記の表８に示されるように、α−ＧＡＬ−ＩＩの架橋は、非架橋のα−ＧＡＬ−ＩＩと比較して、改善された速度論的性質をもたらした。ミカエリス定数（ＫＭ）が低下した。このことは、基質に対する酵素の親和性がより大きいことを示している。さらには、ｋｃａｔ／ＫＭ（これは、記載された条件のもとでのこの基質に関する酵素の全体的な触媒効率を意味する）が、架橋された化学種について高まった。
実施例ＸＩＸ
植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩの架橋の再現性
架橋の回分処理毎の再現性を、実施例ＩＩに記載される手順と類似する手順を使用して、ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ４５により２００：１の比率で架橋される植物組換えヒトα−ＧＡＬ−ＩＩ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩ）の５つの回分処理物を調製した後で評価した。
第１、第２、第４および第５の回分処理において、１ｍｇのｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩを３．９８ｍｇのビス−ＮＨＳ−ＰＥＧと反応させた。
第３の回分処理において、２０．５ｍｇのｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩを８０．７ｍｇのビス−ＮＨＳ−ＰＥＧと反応させた。
架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの酵素活性を実施例ＩＩＩに記載されるように求めた。結果が下記の表９にまとめられる。
表９に示されるように、測定された活性は、５つすべての回分処理物において、予想された活性に近かった。５つの回分処理物のうちの４つにおいて、測定された活性が、予想された活性と約１０％以下で異なった。
これらの結果は、架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの得られた活性が比較的予測可能かつ再現可能であることを示している。
リソソーム条件下およびヒト血漿中における架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの安定性を本明細書中上記のように求めた。
図４０Ａおよび図４０Ｂに示されるように、架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの安定性は、良好な再現性を模擬リソソーム条件下およびヒト血漿中の両方において示した。
架橋はまた、本明細書中上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＩＥＦ（等電点フォーカシング）分析およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析された。非架橋のｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩを比較のために分析した。
図４１に示されるように、これらの異なる回分処理から得られる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、同じ程度の共有結合ダイマー化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のもとで示した。
図４２に示されるように、これらの異なる回分処理から得られる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、同じ等電点をＩＥＦ分析のもとで示した。
図４３Ａ〜図４３Ｆに示されるように、回分処理１〜５から得られる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩ（それぞれ、図４３Ｂ〜図４３Ｆ）はすべて、非架橋のｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩ（図４３Ａ）と比較して、ダイマー型形態でのおよそ２０ＫＤａ〜２１ＫＤａの増大を示した。そのような増大は、α−ＧＡＬダイマーあたり約１０個のＰＥＧ分子に対応する。図４３Ｂ〜図４３Ｆにおいてさらに示されるように、これらの異なる回分処理から得られる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩはモノマー対ダイマーの類似する割合を示した。
これらの結果はさらに、α−ＧＡＬの架橋における良好な再現性を示している。
架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩの速度論的パラメーターを、酵素活性の再現性を調べるために、ｐＮＰ−Ｇ基質およびミカエリス−メンテン分析を使用して求めた。測定を、２０ｍＭクエン酸塩、３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．６７％エタノールの溶液において、４．６のｐＨで行った。速度論的パラメーターを、２８０ｎｍでの光学密度に基づくタンパク質含有値を使用して計算した。
図４４に示されるように、これらの異なる回分処理から得られる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、基質濃度に対する触媒作用速度の類似するプロフィルを示した。
下記の表１０に示されるように、これらの異なる回分処理から得られる架橋ｐｒｈ−α−ＧＡＬ−ＩＩは、Ｖｍａｘおよびｋｃａｔのパラメーターの良好な再現性を示した。Ｋｍパラメーターが回分処理間ではより大きく変化した。だが、これはタンパク質定量の人為的影響であるかもしれない。
上記の結果は、架橋α−ＧＡＬの酵素性質における良好な再現性を示している。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
配列番号１〜３は、植物組換えヒトα−ＧＡＬ（ｐｒｈ−α−ＧＡＬ）の配列である。

Claims (17)

  1. 連結成分を介して互いに共有結合で連結された少なくとも２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む多量体型タンパク質構造体であって、下記の特性からなる群から選択される特性を特徴とする多量体型タンパク質構造体：
    （ａ）天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｂ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｃ）多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたとき、初期活性の５０％〜１５０％の範囲に留まるα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｄ）天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１週間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１週間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｅ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１日間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｆ）多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたとき、初期活性の５０％〜１５０％の範囲に留まるα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｇ）多量体型タンパク質の天然型形態をリソソーム条件にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｈ）天然型α−ガラクトシダーゼを、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体を、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；および
    （ｉ）天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも少なくとも２０％大きい生理学的システムにおける循環半減期。
  2. 連結成分を介して互いに共有結合で連結された少なくとも２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む多量体型タンパク質構造体であって、連結成分が天然型α−ガラクトシダーゼにおいて存在しない多量体型タンパク質構造体。
  3. 下記の特性からなる群から選択される特性を特徴とする、請求項２に記載の多量体型タンパク質構造体：
    （ａ）天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｂ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｃ）多量体型タンパク質構造体をヒト血漿条件に１時間さらしたとき、初期活性の５０％〜１５０％の範囲に留まるα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｄ）天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１週間さらしたときの天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１週間さらしたときのα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｅ）天然型α−ガラクトシダーゼの活性が、天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件に１日間さらしたときに低下する割合よりも少なくとも１０％小さい割合で、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたときに低下するα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｆ）多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたとき、初期活性の５０％〜１５０％の範囲に留まるα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｇ）天然型α−ガラクトシダーゼをリソソーム条件にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；
    （ｈ）天然型α−ガラクトシダーゼを、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後の天然型α−ガラクトシダーゼの活性よりも少なくとも１０％大きい、多量体型タンパク質構造体を、７のｐＨおよび３７℃の温度を有する水溶液にさらした直後のα−ガラクトシダーゼ活性；および
    （ｉ）天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも大きい生理学的システムにおける循環半減期。
  4. 天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも大きい多量体型タンパク質構造体の循環半減期は、天然型α−ガラクトシダーゼの循環半減期よりも少なくとも２０％大きい、請求項３に記載の多量体型タンパク質構造体。
  5. 多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１日間さらしたとき、初期活性の５０％〜１５０％の範囲に留まる多量体型タンパク質構造体のα−ガラクトシダーゼ活性はさらに、多量体型タンパク質構造体をリソソーム条件に１週間さらしたとき、初期活性の５０％〜１５０％の範囲に留まる、請求項３または４に記載の多量体型タンパク質構造体。
  6. 多量体型タンパク質構造体は、多量体型タンパク質構造体を脊椎動物に投与したときの器官におけるα−ガラクトシダーゼ活性によって特徴づけられ、器官は、脾臓、心臓および腎臓からなる群から選択される、請求項２〜５のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体。
  7. 多量体型タンパク質構造体は２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含み、タンパク質構造体はダイマー型タンパク質構造体である、請求項２〜６のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体。
  8. α−ガラクトシダーゼは、組換えα−ガラクトシダーゼである、請求項２〜７のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体。
  9. α−ガラクトシダーゼは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２〜８のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体。
  10. 連結成分は、少なくとも２０原子の長さである、請求項２〜９のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体。
  11. 連結成分はポリ（アルキレングリコール）を含む、請求項２〜１０のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体。
  12. 前記連結成分は下記一般式を有する、請求項２〜９のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体：
    −Ｘ１−（ＣＲ１Ｒ２−ＣＲ３Ｒ４−Ｙ）ｎ−Ｘ２−
    式中、Ｘ１およびＸ２の各々は、少なくとも１つのα−ガラクトシダーゼモノマーとの共有結合を形成する官能基であり；
    ＹはＯ，ＳまたはＮＲ５であり；
    ｎは１〜２００の整数であり：および
    Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５の各々は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、オキソ、チオールおよびチオアルコキシからなる群から独立して選択される。
  13. ｎは少なくとも２５である、請求項１２に記載の多量体型タンパク質構造体。
  14. ２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む、請求項１２に記載の多量体型タンパク質構造体であって、タンパク質構造体がダイマー型タンパク質構造体であり、前記α−ガラクトシダーゼが配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記官能基の各々がα−ガラクトシダーゼモノマーとアミド結合を形成し、ｎが４０〜７０の整数である、多量体型タンパク質構造体。
  15. ２つのα−ガラクトシダーゼモノマーを含む、請求項９に記載の多量体型タンパク質構造体であって、タンパク質構造体がダイマー型タンパク質構造体であり、前記連結部分が下記一般式を有する、多量体型タンパク質構造体：
    ただし、前記連結部分におけるポリエチレングリコールの分子量は２ｋＤａであり、前記連結部分の末端基はそれぞれα−ガラクトシダーゼモノマーとアミド結合を形成する。
  16. 請求項２〜１５のいずれかに記載の多量体型タンパク質構造体を調製するプロセスであって、α−ガラクトシダーゼを、連結成分と、少なくとも２つの反応基とを含む架橋剤と反応させることを含むプロセス。
  17. α−ガラクトシダーゼのモノマーに対する架橋剤のモル比が５：１〜５００：１の範囲にある、請求項１６に記載のプロセス。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9194011B2 (en) 2009-11-17 2015-11-24 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
NZ623294A (en) * 2010-03-02 2015-10-30 Protalix Ltd Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
LT3272861T (lt) * 2011-01-20 2020-03-25 Protalix Ltd. Alfa-galaktozidazės kompozicijos
TWI793159B (zh) * 2013-10-23 2023-02-21 美商健臻公司 重組醣蛋白及其用途
PT3237621T (pt) * 2014-12-22 2023-07-20 Codexis Inc Variantes da alfa-galactosidase humana
WO2016116966A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
HUE056850T2 (hu) 2015-03-17 2022-03-28 eleva GmbH Glikozilezett lizoszómális fehérjék, elõállítási eljárás és alkalmazások
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
CN117959455A (zh) * 2017-01-05 2024-05-03 波塔力克斯有限公司 植物重组人类α-半乳糖苷酶制备治疗法布里病的药品的用途
CN110651043A (zh) * 2017-06-07 2020-01-03 天野酶制品株式会社 乳糖酶原料粉末和乳糖酶制剂
US11427813B2 (en) 2018-12-20 2022-08-30 Codexis, Inc. Human alpha-galactosidase variants
WO2022097141A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Protalix Ltd. Modified uricase and uses thereof
CN112176026A (zh) * 2020-11-06 2021-01-05 诺道中科(北京)生物科技有限公司 一种α-半乳糖苷酶活性的检测试剂盒
CN116254287B (zh) * 2022-11-24 2024-06-04 西北农林科技大学 玉米ZmAGA3基因用于提高植物耐旱性的应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5401650A (en) 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
CA2052728A1 (en) 1991-10-03 1993-04-04 Guy Ampleman Glycidyl azide polymer
US6329191B1 (en) * 1993-08-30 2001-12-11 Hawaii Biotechnology Group, Inc. DNA encoding recombinant coffee bean alpha-galactosidase
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US20050032211A1 (en) * 1996-09-26 2005-02-10 Metabogal Ltd. Cell/tissue culturing device, system and method
ATE397013T1 (de) * 1997-09-05 2008-06-15 Altus Pharmaceuticals Inc Kohlenhydrat-vernetzte glykoproteinkristalle
IL125423A (en) 1998-07-20 2004-08-31 Israel State Alkaline alpha-galactosidase having broad substrate specificity
JP5183836B2 (ja) * 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
DE60022336T2 (de) 1999-04-02 2006-06-22 Ajinomoto Co., Inc. Vefahren zur herstellung von peptiduntereinheiten aus polymer-proteinen
WO2003097791A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Agricultural Research Organization, The Volcani Center Polynucleotide sequences encoding alkaline a-galactosidases and methods of using same
US7951557B2 (en) * 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
EP1877099B1 (en) * 2005-04-06 2012-09-19 Genzyme Corporation Therapeutic conjugates comprising a lysosomal enzyme, polysialic acid and a targeting moiety
ES2547726T3 (es) * 2005-11-18 2015-10-08 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science Nueva enzima altamente funcional que tiene especificidad de sustrato modificada
WO2008075957A1 (en) 2006-12-21 2008-06-26 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Treatment of fabry disease
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
EP1955712A1 (en) * 2007-02-09 2008-08-13 Scil proteins GmbH Multimeric conjugate
AU2008290217B2 (en) * 2007-08-20 2013-09-05 Protalix Ltd. Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof
NZ623294A (en) * 2010-03-02 2015-10-30 Protalix Ltd Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof

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