ES2606532T3 - Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma - Google Patents
Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma Download PDFInfo
- Publication number
- ES2606532T3 ES2606532T3 ES14195875.1T ES14195875T ES2606532T3 ES 2606532 T3 ES2606532 T3 ES 2606532T3 ES 14195875 T ES14195875 T ES 14195875T ES 2606532 T3 ES2606532 T3 ES 2606532T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- galactosidase
- gal
- protein structure
- activity
- multimeric protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 347
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 title claims abstract description 346
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 281
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 279
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 88
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 claims abstract description 62
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 300
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 238
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims description 101
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 57
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 48
- -1 poly (alkylene glycol Chemical compound 0.000 claims description 45
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 32
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 25
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 16
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 15
- 108010056760 agalsidase beta Proteins 0.000 claims description 14
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000005309 thioalkoxy group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 11
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 229960004470 agalsidase beta Drugs 0.000 claims description 2
- KUBARPMUNHKBIQ-VTHUDJRQSA-N eliglustat tartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C([C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H](O)C=1C=C2OCCOC2=CC=1)N1CCCC1.C([C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H](O)C=1C=C2OCCOC2=CC=1)N1CCCC1 KUBARPMUNHKBIQ-VTHUDJRQSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 claims 1
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 278
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 278
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 124
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 85
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 82
- 108010049936 agalsidase alfa Proteins 0.000 description 75
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 description 53
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 49
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 34
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 34
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 33
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 30
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 27
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 27
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 24
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 20
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 19
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 14
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 12
- 229940014516 fabrazyme Drugs 0.000 description 12
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 12
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 11
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 11
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 11
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 11
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 9
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 8
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 8
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 8
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 8
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 7
- 125000005296 thioaryloxy group Chemical group 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 125000005328 phosphinyl group Chemical group [PH2](=O)* 0.000 description 6
- 125000005499 phosphonyl group Chemical group 0.000 description 6
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 6
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 6
- 125000005190 thiohydroxy group Chemical group 0.000 description 6
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YUDPTGPSBJVHCN-CHUNWDLHSA-N 4-methylumbelliferyl alpha-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-CHUNWDLHSA-N 0.000 description 5
- IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 4-nitrophenyl-α-d-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 5
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- DYMRYCZRMAHYKE-UHFFFAOYSA-N n-diazonitramide Chemical compound [O-][N+](=O)N=[N+]=[N-] DYMRYCZRMAHYKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 5
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 125000005420 sulfonamido group Chemical group S(=O)(=O)(N*)* 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 4
- 235000009842 Cucumis melo Nutrition 0.000 description 4
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 4
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YDIKCZBMBPOGFT-PWUSVEHZSA-N Malvidin 3-galactoside Chemical compound [Cl-].COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)=C1 YDIKCZBMBPOGFT-PWUSVEHZSA-N 0.000 description 4
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 4
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 4
- PXUQTDZNOHRWLI-QOPOCTTISA-O Primulin Natural products O(C)c1c(O)c(OC)cc(-c2c(O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)cc3c(O)cc(O)cc3[o+]2)c1 PXUQTDZNOHRWLI-QOPOCTTISA-O 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 4
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 3
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 3
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 3
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 3
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N Cyclopentane Chemical compound C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000718525 Homo sapiens Alpha-galactosidase A Proteins 0.000 description 3
- 101000860415 Homo sapiens Galanin peptides Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 241000207923 Lamiaceae Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000043404 human GLA Human genes 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108010045758 lysosomal proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241001519271 Ajuga Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 2
- 235000007460 Coffea arabica Nutrition 0.000 description 2
- 241000219104 Cucurbitaceae Species 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000604197 Homo sapiens Neuronatin Proteins 0.000 description 2
- 101000999322 Homo sapiens Putative insulin-like growth factor 2 antisense gene protein Proteins 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100038816 Neuronatin Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 102100036485 Putative insulin-like growth factor 2 antisense gene protein Human genes 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- 125000005631 S-sulfonamido group Chemical group 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000294947 Tetragonia tetragonoides Species 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNVMUORYQLCPJZ-UHFFFAOYSA-M Thiocarbamate Chemical group NC([S-])=O GNVMUORYQLCPJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical group N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 229960001239 agalsidase alfa Drugs 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- MGNZXYYWBUKAII-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,3-diene Chemical compound C1CC=CC=C1 MGNZXYYWBUKAII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPIQUOYDBNQMRZ-UHFFFAOYSA-N cyclopentene Chemical compound C1CC=CC1 LPIQUOYDBNQMRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002812 neutral glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 2
- GLZWNFNQMJAZGY-UHFFFAOYSA-N octaethylene glycol Chemical group OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO GLZWNFNQMJAZGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 2
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 1H-pyrrole Natural products C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHMUMDLGQBRJIW-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO ZHMUMDLGQBRJIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxynonadecane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)(C(O)=O)CC(O)=O HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100026277 Alpha-galactosidase A Human genes 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 235000021508 Coleus Nutrition 0.000 description 1
- 244000061182 Coleus blumei Species 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N Cyclobutane Chemical compound C1CCC1 PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 208000031969 Eye Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N N'-hexadecylthiophene-2-carbohydrazide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCNNC(=O)c1cccs1 HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ICWGMOFDULMCFL-UHFFFAOYSA-N N-heptadecanoylceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)NC(CO)C(O)C=CCCCCCCCCCCCCC ICWGMOFDULMCFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 241001639734 Oruza Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000721490 Peperomia Species 0.000 description 1
- 244000010815 Phlomis lychnitis Species 0.000 description 1
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 240000002299 Symphytum officinale Species 0.000 description 1
- 235000005865 Symphytum officinale Nutrition 0.000 description 1
- 235000004472 Tetragonia tetragonoides Nutrition 0.000 description 1
- DHXVGJBLRPWPCS-UHFFFAOYSA-N Tetrahydropyran Chemical compound C1CCOCC1 DHXVGJBLRPWPCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N adamantane Chemical group C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229940040563 agaric acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002178 anthracenyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- CHVJITGCYZJHLR-UHFFFAOYSA-N cyclohepta-1,3,5-triene Chemical compound C1C=CC=CC=C1 CHVJITGCYZJHLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000007337 electrophilic addition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007336 electrophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008202 granule composition Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000050963 human GAL Human genes 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005935 nucleophilic addition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000006053 organic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012439 solid excipient Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005300 thiocarboxy group Chemical group C(=S)(O)* 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Abstract
Una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa que están unidos de forma covalente entre sí a través de un radical de unión, donde dicho radical de unión no está presente en la α-galactosidasa nativa, siendo la estructura de proteína multimérica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
Description
α-galactosidasa estabilizada y usos de la misma
Campo y Antecedentes de la Invención
La presente invención, en algunas de sus realizaciones, se refiere a nuevas estructuras de proteína multimérica y, más particularmente, aunque no exclusivamente, a estructuras de proteína multiméricas de α-galactosidasa y a usos de las mismas en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
La enzima lisosómica α-galactosidasa-A (α-GAL o α-Gal A; EC 3.2.1.22) cataliza la retirada de galactosa de los oligosacáridos, glucoproteínas y glucolípidos durante el catabolismo de macromoléculas. Los déficits en enzimas lisosómicas conducen a la acumulación de sus sustratos en los tejidos, afecciones conocidas como enfermedades de almacenamiento lisosómico. En los seres humanos, la ausencia de α-galactosidasa-A funcional conduce a la acumulación de glucolípidos que contienen restos de α-galactosa terminales (principalmente globotriaosilceramida, que también recibe el nombre de "trihexósido ceramida", "CTH" o "Gb3") en los tejidos, lo que conduce a la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Fabry es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, descrito por primera vez en 1898, caracterizado por dolor crónico, opacidades oculares, disfunción hepática y renal, lesiones en la piel, deterioro vascular y/o insuficiencia cardíaca. La α-galactosidasa-A humana recombinante tiene la capacidad de restaurar la función enzimática en pacientes, y la terapia de reemplazo enzimático (ERT, del inglés) usando α-GAL se aprobó en los Estados Unidos en el año 2003 como un tratamiento para la enfermedad de Fabry. α-GAL se convirtió en la segunda proteína recombinante aprobada para el tratamiento de un trastorno de almacenamiento lisosómico después de la β-glucosidasa, un tratamiento para la enfermedad de Gaucher.
Las α-GAL endógena y recombinante catalizan la hidrólisis de glucolípidos galactosilados terminales en los lisosomas de células de órganos tales como el hígado, riñones, bazo, corazón, etc. Este sitio natural de acción se caracteriza por su bajo pH, que llega a ser tan bajo como de 4,5. Las enzimas lisosómicas, incluyendo α-GAL, están por tanto diseñadas para ejercer su actividad máxima a estos niveles de pH bajos.
Los tratamientos actuales de la enfermedad de Fabry con ERT se basan en la α-GAL recombinante procedente de células de mamífero que se considera un tratamiento eficaz limitado. Estos tratamientos únicamente desaceleran el avance de la enfermedad, pero no pueden detenerlo y no ofrecen una solución verdadera y completa. Adicionalmente, en algunos casos, debe interrumpirse la ERT con α-GAL recombinantes comerciales debido al desarrollo de una respuesta inmunogénica al tratamiento y, en algunos casos, el tratamiento no puede iniciarse en vista de los problemas de inmunogenicidad.
El análisis de la estructura de rayos X revela que la α-GAL humana es una glucoproteína homodimérica estando cada monómero compuesto de dos dominios, el dominio a (β/α)8 que contiene el sitio activo y el dominio C-terminal que contiene ocho cadenas β antiparalelas en dos láminas en un sándwich P [Garman & Garboczi, J Mol Biol 2004, 337:319-335]. Los dos monómeros están dispuestos en un ensamblaje cabeza a cola y la dimerización es no covalente. Los dos monómeros se empaquetan con una interfaz que extiende la anchura de 75 Å del dímero y oculta
2.200 Å2 de área superficial. En la interfaz del dímero, 30 restos de cada monómero contribuyen a la interfaz. Los dos sitios activos del dímero están separados por aproximadamente 50 Å.
Se resolvió la estructura cristalina de α-Gal para una proteína no ligada, así como para una proteína ligada a galactosa. Estas dos estructuras exhiben pocos cambios entre las estructuras ligada y no ligada. No obstante, el uso de galactosa en lugar del sustrato natural, la globotriaosilceramida (Gb3), estando esta última caracterizada por cadenas lipídicas largas capaces de interactuar con el dominio hidrófobo de un monómero mientras que la galactosa terminal interacciona con el sitio activo del segundo monómero, puede no demostrar la cooperatividad de sitio activo. Adicionalmente, las pruebas bioquímicas sugieren dicha cooperatividad, ilustrando la importancia de la estructura cuaternaria homodimérica [Bishop & Desnick, J Biol Chem 1981, 256:1307-1316]. Por lo tanto, se estudiaron las propiedades cinéticas de la α-Gal humana y se observó la cooperatividad entre los monómeros de la enzima homodimérica, cada uno con un sitio de interacción catalítico. Por lo tanto, se sugirió que la actividad y estabilidad enzimática podían depender de la dimerización.
El documento WO 2009/024977, del cesionario del presente documento, enseña conjugados de un sacárido y una biomolécula, unidos entre sí de manera covalente mediante un enlazador no hidrófobo, así como usos médicos que utilizan dichos conjugados.
La Solicitud de Patente Internacional PCT N.º PCT/IL2010/000956, del cesionario del presente documento, enseña metodologías que utilizan α-galactosidasa, que exhibe una actividad lisosómica a niveles de pH mayores que el pH lisosómico.
Adicionalmente, la técnica anterior incluye Bendele et al. [Toxicological Sciences 1998, 42:152-157], las Patentes de Estados Unidos N.º 5.256804, 5.580757 y 5.766.897, la Solicitud de Patente Internacional PCT/NL2007/050684 (publicada como WO 2008/075957) y Seely & Richey [J ChromatographyA 2001.908: 235-241].
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa que están ligados de manera covalente entre sí mediante un radical de unión, presentando la estructura de proteína multimérica una característica seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones de plasma humano durante una hora, que es al menos un 10 % superior que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a condiciones de plasma humano durante una hora;
- (b)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de la proteína multimérica a condiciones de plasma humano durante una hora, en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye la actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α -galactosidasa nativa a condiciones de plasma humano durante una hora;
- (c)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter a la estructura de proteína multimérica a condiciones de plasma humano durante una hora;
- (d)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a condiciones lisosómicas durante una semana;
- (e)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye la actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a condiciones lisosómicas durante un día;
- (f)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día;
- (g)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter la forma nativa de la proteína a condiciones lisosómicas;
- (h)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter la α-galactosidasa nativa a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC; y
- (i)
- una semivida en circulación en un sistema fisiológico que es al menos un 20 % mayor que la semivida en circulación de la α-galactosidasa nativa.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa que están ligados de manera covalentemente entre sí mediante un radical de unión, en la que el radical de unión no está presente en la αgalactosidasa nativa.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una estructura de proteína multimérica como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Fabry, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una estructura de proteína multimérica como se describe en el presente documento, tratando de esta manera la enfermedad de Fabry.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención se proporciona un proceso para la preparación de una estructura de proteína multimérica como se describe en el presente documento, comprendiendo el proceso hacer reaccionar la α-galactosidasa con un agente de reticulación que comprende el radical de unión descrito en el presente documento y al menos dos grupos reactivos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el radical de unión descrito en el presente documento no está presente en la α-galactosidasa nativa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la estructura de la proteína multimérica presenta una característica del grupo que consiste en:
- (a)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones de plasma humano durante una hora, que es al menos un 10 % superior que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a condiciones de plasma humano durante una hora;
- (b)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de la proteína multimérica a condiciones de plasma humano durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye la actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α -galactosidasa nativa
a condiciones de plasma humano durante una hora;
- (c)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones de plasma humano durante una hora;
- (d)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a condiciones lisosómicas durante una semana;
- (e)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye la actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a condiciones lisosómicas durante un día;
- (f)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día;
- (g)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter la forma nativa de la proteína a condiciones lisosómicas;
- (h)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteica multimérica a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter la α-galactosidasa nativa a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC; y
- (i)
- una semivida en circulación en un sistema fisiológico que es mayor que la semivida en circulación de la αgalactosidasa nativa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la actividad α-galactosidasa de la estructura de proteína multimérica que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día, adicionalmente permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la semivida en circulación de la estructura de proteína multimérica que es mayor que una semivida en circulación de la α-galactosidasa nativa, es mayor en al menos un 20 % que la semivida en circulación de la α-galactosidasa nativa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la semivida en circulación de la estructura de proteína multimérica que es mayor que una semivida en circulación de la α-galactosidasa nativa, es mayor en al menos un 50 % que la semivida en circulación de la α-galactosidasa nativa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por una actividad α-galactosidasa en un órgano después de la administración de la estructura de proteína multimérica a un vertebrado, seleccionándose el órgano del grupo que consiste en bazo, corazón y riñón.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la estructura de proteína multimérica comprende dos monómeros de α-galactosidasa, siendo la estructura de proteína una estructura de proteína dimérica.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa humana.
De acuerdo algunas realizaciones de la invención, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa recombinante de planta.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la α-galactosidasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2 y SEQ ID Nº 3.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa alcalina.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa ácida.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el radical de unión comprende un poli(alquilenglicol).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el poli(alquilenglicol) comprende al menos dos grupos funcionales, formando cada grupo funcional un enlace covalente con uno de los monómeros de α-galactosidasa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los al menos dos grupos funcionales son grupos terminales del poli(alquilenglicol).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el al menos un radical de unión tiene una fórmula general:
- -
- X1(CR1R2-CR3R4-Y)n-X25
en la que cada uno de X1 y X2 es un grupo funcional que forma un enlace covalente con al menos un monómero
de α-galactosidasa;
Y es O, S o NR5;
n es un número entero de 1 a 200; y
cada uno de R3, R2, R3, R4 y R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo,
cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, al menos uno de los grupos funcionales forma un enlace amida con un monómero de α-galactosidasa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, n es un número entero de 5 a 150.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, n es un número entero de 40 a 70.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la composición farmacéutica comprende adicionalmente una galactosa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la estructura de proteína multimérica es para su uso como un medicamento.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la estructura de proteína multimérica es para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el proceso comprende hacer reaccionar la α-galactosidasa dimérica con el agente de reticulación.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los grupos reactivos comprenden un grupo saliente.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el grupo reactivo reacciona con un grupo amina para formar un enlace amida.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, cada uno de los grupos reactivos puede formar un enlace covalente entre el radical de unión y al menos un monómero de α-galactosidasa
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la proporción molar entre el agente de reticulación y los monómeros de α-galactosidasa se encuentra en un intervalo de 5:1 a 500:1.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la proporción molar se encuentra en un intervalo de 75:1 a
300:1.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y/o científicos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado entendido normalmente por un experto habitual en la materia a la cual pertenece la invención. Aunque en la práctica o ensayo de las realizaciones de la invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no deben considerarse necesariamente limitantes.
Breve descripción de los dibujos
La patente o archivo de solicitud contiene al menos un dibujo a color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color se proporcionarán por la oficina tras solicitarlas y pagar la tasa necesaria.
Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo referencia específica ahora a los dibujos con detalle, cabe destacar que las particularidades mostradas se ofrecen como ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de las realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada junto con los dibujos pone de manifiesto a los expertos en la materia cómo pueden llevarse a la práctica las realizaciones de la invención.
En los dibujos:
La FIG. 1 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal® y α-GAL-I humana recombinante vegetal, en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón
fosfato citrato, pH 4,6, 37°C); La FIG. 2 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal y α-GAL-I recombinante vegetal con galactosa (100 mg/ml), en función del tiempo de incubación en condiciones fisiológicas simuladas (pH 7,4, 37 ºC); La FIG. 3 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal® y α-GAL-I humana recombinante vegetal, en función del tiempo de incubación en plasma humano a 37°C; La FIG. 4 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal y α-GAL-I recombinante vegetal con galactosa (100 mg/ml), en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37 ºC); La FIG. 5 es un esquema que representa las estructuras moleculares de agentes de reticulación de bis-Mhidroxisuccinimida-poli (etilenglicol) (bis-NHS-PEG) ejemplares; La FIG. 6 es un esquema que representa una proteína dimérica que ha reaccionado con agentes de reticulación de bis-NHS-PEG; La FIG. 7 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra α-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG5 (carriles 1-3), bis-NHS-PEG8 (carriles 7-9) y bis-NHS-PEG45 (carriles 4-6), a una relación molar de 50:1 (carriles 1, 4 y 7), 100:1 (carriles 2, 5 y 8) y 200:1 (carriles 3, 6 y 9) de bis-NHS-PEG:α-GAL, así como marcadores de peso molecular (Pm) y patrón de α-GAL-I (Estd) recombinante vegetal que no ha reaccionado (las flechas muestran la banda que comprende un dímero de α-GAL). La FIG. 8 presenta un barrido de un gel de isoelectroenfoque que muestra un α-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG5 (carriles 1-3), bis-NHS-PEG8 (carriles 7-9) y bis-NHS-PEG45 (carriles 4-6), a una proporción molar de 50:1 (carriles 1, 4 y 7), 100:1 (carriles 2, 5 y 8) y 200:1 (carriles 3, 6 y 9) de bis-NHS-PEG:α-GAL, así como marcadores (M) de pH y patrón de α-GAL-I (Estd) recombinante vegetal que no ha reaccionado (las flechas muestran valores de pH para varias bandas); La FIG. 9 es un espectro de espectroscopia de masas MALDI-TOF de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 (el eje x indica valores m/z, y se muestran los valores m/z de los picos); La FIG. 10 es un espectro de espectroscopia de masas MALDI-TOF de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG8 (el eje x indica valores m/z, y se muestran los valores m/z de picos); La FIG. 11 presenta una fotografía que muestra el sustrato α-GAL trihexósido de N-dodecanoilnitrobenzoxadiazol-ceramida (Gb3-NBH) y el producto de reacción de α-GAL lactosil ceramida-nitrobenzoxadiazol (lactosil ceramida-NBH), y visualizado con radiación con luz UV (365 nm), después de cromatografía de capa fina de alto rendimiento, seguido de incubación del sustrato Gb3-NBD con α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (carril izquierdo), α-GAL Replagal® (carril central) y sin α-GAL (carril derecho); Las FIG. 12A, 12B y 12C, son gráficos que muestran la actividad de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG5 (FIG. 12A), bis-NHS-PEG8 (FIG. 12B) y bis-NHS-PEG45 (FIG. 12C) a una relación molar de 50:1 ("1" en FIG. 12A, "7" en FIG. 12B y "4" en FIG. 12C), 100:1 ("2" en FIG. 12A, "8" en FIG. 12B y "5" en FIG. 12C) y 200:1 ("3" en FIG. 12, “9” en FIG. 12B y “6” en FIG. 12C) de bis-NHS-PEG:α-GAL en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37°C); La FIG. 13 es un gráfico que muestra el perfil farmacocinético de α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 en el plasma de ratones con la enfermedad de Fabry; la actividad residual de cada α-GAL se presenta como un porcentaje de la actividad residual máxima de cada α-GAL, en función del tiempo que después de la inyección de las α-GAL. Las FIG. 14A y 14B presentan un gráfico (FIG. 14A) que muestra la actividad de α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (prh-alfa-GAL-I-CL8) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry dos horas después de la inyección de α-GAL, y una fotografía de una transferencia de Western (FIG. 14B) que muestra α-GAL Replagal® (carriles 10-12 y 15), α-GAL-I humana recombinante vegetal (carriles 7-9 y 13), y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (carriles 4-6) o bis-NHS-PEG45 (carriles 1-3 y 14) en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry después de inyección de α-GAL (carriles 1-12) o como un patrón que consiste en 50 ng de α-GAL (carriles 13-15); Las FIG. 15A y 15B presentan un gráfico (FIG. 15A) que muestra la actividad de α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (prh-alfa-GAL-I-CL8) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) en los hígados de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección de α-GAL, y una fotografía de una transferencia de Western (FIG. 15B) que muestra α-GAL Replagal® (carriles 10-12 y 15), α-GAL-I humana recombinante vegetal (carriles 7-9 y 13) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (carriles 4-6) o bis-NHS-PEG45 (carriles 1-3 y 14) en los hígados de ratones con la enfermedad de Fabry después de inyección de α-GAL (carriles 1-12) o como un patrón que consiste en 50 ng de α-GAL (carriles 13-15); La FIG. 16 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (Prh-alfa-GAL-I-) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) en los corazones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección de α-GAL; La FIG. 17 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (Prh-alfa-GAL-I-CL8) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) en los riñones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección de α-GAL;
La FIG. 18 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal® y α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-I-CL45) en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 días y 7 días después de la inyección de α-GAL (como patrón, se muestra α-GAL de tipo silvestre (WT) endógena; La FIG. 19 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal® y α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I), y α-GAL I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-I-CL45) en los hígados de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 días y 7 días después de inyección de α-GAL (como patrón, se muestra α-GAL de tipo silvestre (WT) endógena); La FIG. 20 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal® y α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I), y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-I-CL45) en los corazones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 días y 7 días después de la inyección de α-GAL (como patrón, se muestra α-GAL de tipo silvestre (WT) endógena); La FIG. 21 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal® y α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-I), y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-I-CL45) en los riñones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 días y 7 días después de la inyección de α-GAL (como patrón, se muestra α-GAL de tipo silvestre (WT) endógena); La FIG. 22 presenta una fotografía de una imagen de un gel de SDS-PAGE que muestra la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (carril izquierdo), y la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® que se hizo reaccionar con bis-NHS-PEG45 (carril central), así como marcadores de peso molecular (carril derecho; los pesos moleculares de los marcadores se indican en unidades kDa); La FIG. 23 presenta una fotografía de un gel de isoelectroenfoque que muestra α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (carril izquierdo), y α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® que reaccionó con bis-NHS-PEG45 (carril central), así como marcadores de pH (carril derecho); Las FIG. 24A y 24B son espectros de espectroscopia de masas MALDI-TOF de la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (FIG. 24A), y α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (el eje x indica valores m/z, y se muestran los valores m/z (en unidades Da) de los picos); La FIG. 25 es una representación gráfica de Michaelis-Menten que muestra la velocidad (V) de la hidrólisis de pnitrofenil-α-D-galactopiranósido (pNP-G) por la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (Replagal) y la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (Replagal CL45), en función de la concentración de pNP-G; Las FIG. 26A y 26B son gráficos que muestran la actividad de la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (Replagal) y la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® reticulada por bis-NHS-PEG45 (Replagal-CL45) en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37 ºC) (FIG. 26A) o en plasma humano a 37 ºC (FIG. 26B); Las FIG. 27A-27D son gráficos que muestran la actividad de α-GAL Replagal® (R) y α-GAL Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (R-CL45) en los bazos (FIG. 27A), hígados (Fig. 27B), corazones (FIG. 27C) y riñones (FIG. 27D) de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección de α-GAL; Las FIG. 28A-28D son gráficos que muestran los niveles de Gb3 en los corazones (FIG. 28A), riñones (FIG. 28B), hígados (FIG. 28C) y bazos (FIG. 28D) de ratones con la enfermedad de Fabry, en función del tiempo después de la inyección de α-GAL Replagal® o α-GAL Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (R-CL45); Las FIG. 29A y 29B presentan barridos de geles de SDS-PAGE que muestran la α-GAL-II humana recombinante vegetal (FIGS. 29A y 29B, carril 2) y la α-GAL-II humana recombinante vegetal que reaccionó con bis-NHS-PEG21 (FIG. 29A, carril 3), bis-NHS-PEG45 (FIG. 29A, carril 4) o bis-NHS-PEG68 (FIG. 29B, carril 3), así como marcadores de peso molecular (FIG. 29A y 29B, carril 1; los pesos moleculares de los marcadores se indican en unidades KDa); Las FIG. 30A-30C son espectros de espectroscopia de masas MALDI-TOF de α-GAL-II humana recombinante vegetal (FIG. 30A), y α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG21 (FIG. 30B) o bis-NHS-PEG45 (FIG. 30C) (el eje x indica valores de m/z y se muestran los valores de m/z (en unidades Da) de los picos); Las FIG. 31A-31D son gráficos que muestran la actividad de α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (Replagal), α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG21 (prh-alfa-GAL-II-CL21, FIG. 31A y 31C), bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45, FIG. 31A-31D) o bis-NHS-PEG68 (prh-alfa-GAL-II-CL68; FIG. 31B y 31D) en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37 ºC) (FIG. 31A y 31B) o en plasma humano a 37 ºC (FIG. 31C y 31D) (los datos mostrados en las FIG. 31C y 31D son de experimentos diferentes); Las FIG. 32A y 32B son gráficos que muestran los perfiles farmacocinéticos de α-GAL Replagal® (Replagal), αGAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45) en el plasma de ratones con la enfermedad de Fabry; la concentración de cada α-GAL se presenta en función del tiempo después de la inyección de α-GAL (las FIG. 32A y 32B presentan los mismos datos a diferentes intervalos); Las FIG. 33A-33L son gráficos que muestran la actividad de α-GAL Replagal® (Replagal), α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45, FIG. 33A-33L) o bis-NHS-PEG21 (prh-alfa-GAL-II-CL21; FIG. 33E-33L) en los corazones (FIG. 33A, 33E y 33I), riñones (FIG. 33B, 33F y 33J), hígados (FIG. 33C, 33G y 33K) y bazos (FIG. 33D, 33H y 33L) de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas (FIG. 33A-33H), 7 días (FIG. 33A-33D y 33I-33L), 14 días
(FIG. 33A-33D) y 28 días (FIG. 33A-33D) después de inyección de α-GAL; Las FIG. 34A-34C son gráficos que muestran los parámetros cinéticos Vmáx (FIG. 34A), KM (FIG. 34B) y kcat (FIG. 34C) para la α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y la α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45) en función del pH; La FIG. 35 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra la α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-Gal-I) y la α-GAL-I humana recombinante vegetal que ha reaccionado con NHS-PEG protegido terminalmente con metoxi que tiene un peso molecular de 2 KDa (prh-alfa-Gal-I-PEG 2.000), 5 KDa (prh-alfa-Gal-I-PEG 5.000) o 10 KDa (prh-alfa-Gal-I-PEG 10.000), así como marcadores de peso molecular (carril izquierdo; los marcadores de peso molecular se indican en unidades KDa); Las FIG. 36A y 36B son gráficos que muestran la actividad de α-GAL humana recombinante de mamífero Fabrazyme® (Fabrazyme), α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® (Replagal), α-GAL-I humana recombinante vegetal y α-GAL-I humana recombinante vegetal que ha reaccionado con NHS-PEG protegido terminalmente con epoxi que tiene un peso molecular de 2 KDa (α-Gal-I-PEG 2.000), 5 KDa (α-Gal-I-PEG 5.000)
o 10 KDa (α-Gal-I-PEG 10.000), en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37 ºC) (FIG. 36A) o en plasma humano a 37 ºC (FIG. 36B); La FIG. 37 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra α-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG2 (carriles 1-3), bis-NHS-PEG4 (carriles 4-6), bis-NHS-PEG68 (carriles 7-9), bisNHS-PEG150 (carriles 10-12) y bis-NHS-PEG45 (CL45), a una proporción molar de 50:1 (carriles 1, 4, 7 y 10),
100:1 (carriles 2, 5, 8 y 11) y 200:1 (carriles 3, 6, 9 y 12) de bis-NHS-PEG:α-GAL, así como marcadores de peso molecular (PM); La FIG. 38 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra α-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-COOH-PEG12 (carriles 1-3), bis-COOH-PEG28 (carriles 4-6), bis-COOH-PEG45 (carriles 7-9) y bis-NHS-PEG45 (CL45), a una proporción molar de 50:1 (carriles 1, 4 y 7), 100:1 (carriles 2, 5 y 8) y 200:1 (carriles 3, 6 y 9) de bis-NHS-PEG:α-GAL, así como marcadores de peso molecular (PM) y α-GAL-I recombinante vegetal no reticulada como control (con); La FIG. 39 es un gráfico que muestra la actividad de α-GAL Replagal®, α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-I) y α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-α-GAL-I-CLA5), bis-NHS-PEG4 (prh-α-GAL-I-CL4), bis-NHS-PEG2 (Prh-α-GAL-I-CL2), bis-COOH-PEG45 (prh-α-GAL-I-CLA45), bis-COOH-PEG28 (prh-α-GAL-I-CLA28) o bis-COOH-PEG12 (prh-α-GAL-1-CLA12) en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37 ºC); Las FIG. 40A y 40B son gráficos que muestran la actividad de la α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 en función del tiempo de incubación en condiciones lisosómicas simuladas (tampón fosfato citrato, pH 4,6, 37 ºC) (FIG. 40A) o en plasma humano a 37 ºC (FIG. 40B). (La FIG. 40B muestra la actividad de la α-GAL recombinante de mamífero Replagal® y α-GAL-II humana recombinante vegetal no reticulada para comparación); La FIG. 41 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra α-GAL-II recombinante vegetal de 3 lotes diferentes (carriles 1-3) y α-GAL-II recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (carriles 4-8), así como marcadores de peso molecular (PM); La FIG. 42 presenta un barrido de un gel de isoelectroenfoque que muestra la α-GAL-II recombinante vegetal de 3 lotes diferentes (carriles 1-3) y α-GAL-II recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (carriles 4-8), así como marcadores de pH (M); Las FIG. 43A-43F son espectros de espectroscopia de masas MALDI-TOF de α-GAL-II humana recombinante vegetal (FIG. 43A) y α-GAL-II humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (FIG. 43B-43F, respectivamente) (el eje x indica valores de m/z, y se muestran los valores de m/z (en unidades Da) de los picos); y La FIG. 44 es un gráfico que muestra la velocidad catalítica (V) de la actividad α-GAL exhibida por la α-GAL-II humana vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes, en función de la concentración del sustrato (p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido).
Descripción de realizaciones específicas de la invención
La presente invención, en algunas de sus realizaciones, se refiere a nuevas estructuras de proteína multimérica y, más particularmente, aunque no exclusivamente, a estructuras de proteína multimérica de α-galactosidasa y a sus usos en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
Antes de explicar al menos una realización de la invención con detalle, debe entenderse que la invención no se limita necesariamente en su solicitud a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados por los ejemplos. La invención puede tener otras realizaciones o llevarse a la práctica o realizarse de distintas maneras.
Los déficits de una proteína lisosómica (por ejemplo, defectos en una proteína lisosómica o ausencia de una proteína lisosómica) pueden causar un daño considerable a la salud de un sujeto (una enfermedad de almacenamiento lisosómico). La terapia de reemplazo enzimático (ERT), en la que se administra a un paciente la proteína deficiente, se ha usado en intentos de tratar enfermedades de almacenamiento lisosómico. Sin embargo, la administración de la proteína deficiente no da como resultado necesariamente un aumento considerable y/o persistente en la actividad de la proteína in vivo.
La enfermedad de Fabry es un ejemplo de una enfermedad de almacenamiento lisosómico (heredada) recesiva ligada al cromosoma X que puede causar una amplia gama de síntomas sistémicos. Un déficit de la enzima lisosómica α-galactosidasa A debido a una mutación hace que un glucolípido conocido como globotriaosilceramida (conocido también como Gb3 o trihexósido de ceramida) se acumule dentro de los vasos sanguíneos, otros tejidos y órganos. Esta acumulación conduce a una alteración de su función adecuada. Se dispone de dos terapias de reemplazo enzimático (ERT) para compensar funcionalmente el déficit de la α-galactosidasa. Tanto la agalsidasa alfa (Replagal®, Shire) como la agalsidasa beta (Fabrazyme®, Genzyme) son formas recombinantes de la enzima αgalactosidasa A humana. Estas enzimas son difíciles de fabricar y, por lo tanto, son caras. Recientemente, la contaminación en la planta de Allston de Genzyme, MA, causó una escasez a nivel mundial de agalsidasa beta, y los suministros a los pacientes se racionaron a un tercio de la dosis recomendada.
Como se muestra en el presente documento, las α-galactosidasas ejercen su actividad máxima a los niveles de pH bajos característicos de los lisosomas, mientras que su actividad a niveles de pH más altos se ve comprometida. Por lo tanto, por ejemplo, la α-galactosidasa usada en ERT tendría poca capacidad de hidrolizar glucolípidos galactosilados terminales en el suero de pacientes con la enfermedad de Fabry.
Además, como se muestra adicionalmente en el presente documento, incluso en condiciones lisosómicas, la actividad de las α-galactosidasas se ve comprometida gradualmente, aunque a una tasa más baja que a niveles de pH más altos.
Motivados por la necesidad de resolver la actividad comprometida de las α-galactosidasas, los autores de la presente invención han investigado formas estabilizadas de α-galactosidasa (α-GAL). Más específicamente, los autores de la presente invención han contemplado que una forma estabilizada de la α-galactosidasa podría exhibir una actividad más duradera en general, incluyendo una actividad más duradera en suero. Por lo tanto, los autores de la presente invención han diseñado y preparado con éxito y llevado a la práctica formas estabilizadas de αgalactosidasa nativa y, de hecho, han demostrado que dichas formas estabilizadas exhiben un comportamiento mejorado en cuanto a una mayor actividad y/o una mayor duración de la actividad en condiciones tanto lisosómicas como en un entorno de suero, lo cual proporciona una actividad mejorada de la proteína in vivo.
Los autores de la presente invención han demostrado una formación de formas estabilizadas de la α-galactosidasa que exhiben un comportamiento mejorado mediante la reticulación de la α-galactosidasa nativa, a través de la formación de un nuevo enlace covalente entre los monómeros de α-galactosidasa.
Haciendo referencia ahora a los dibujos, las Figuras 1 y 4 muestran la disminución de la actividad enzimática en condiciones lisosómicas para la α-GAL-I humana recombinante vegetal (phr-α-GAL I) y la α-GAL Fabrazyme® y Replagal®. Las Figuras 2 y 3 muestran la disminución de la actividad enzimática en condiciones fisiológicas simuladas o en plasma humano, para las mismas variedades de α-GAL. Las Figuras 2 y 4 muestran que la galactosa disminuye la tasa de disminución de la actividad de la α-GAL.
La Figura 5 muestra agentes de reticulación ejemplares de PEG (polietilenglicol), de acuerdo con realizaciones opcionales de la invención. La Figura 6 representa un dímero de α-GAL reticulado de acuerdo con realizaciones opcionales de la invención.
Las Figuras 7-10 y 37 muestran que phr-α-GAL-I reaccionó con agentes de reticulación ejemplares que comprendían radicales de N-hidroxisuccinimida. La Figura 38 muestra que phr-α-GAL-I reaccionó con agentes de reticulación ejemplares que comprendían grupos carboxilo, después de la activación in situ con N-hidroxisuccinimida. Las Figuras 7, 37 y 38 muestran que la reacción con el agente de reticulación dio como resultado la aparición de α-GAL principalmente en una forma dimérica en lugar de en una forma monomérica en condiciones desnaturalizantes, lo que indica que la estructura cuaternaria de la α-GAL se mantenía por reticulación covalente. La FIG. 11 muestra que la α-GAL reticulada conservaba su actividad enzimática.
Las Figuras 12A-12C y 39 muestran que la phr α-GAL-I reticulada exhibe una actividad más duradera que la α-GAL no reticulada en condiciones lisosómicas simuladas. El aumento de la estabilidad es más fuerte para los enlazadores PEG28 y PEG45 que para los enlazadores de PEG más cortos. La Figura 13 muestra que la phr-α-GAL-I reticulada exhibe una actividad más duradera que la α-GAL no reticulada en plasma in vivo. Las Figuras 14A-21 muestran que la phr-α-GAL-I reticulada exhibe una actividad potenciada in vivo en el bazo, hígado, corazón y riñones. La potenciación de la actividad de α-GAL es más fuerte para los enlazadores de PEG45 que para los enlazadores de PEG más cortos. Las Figuras 15A, 15B y 19 muestran que, aunque la phr-α-GAL-I reticulada exhibe una actividad potenciada in vivo, la actividad potenciada no está tan concentrada en el hígado como lo está la actividad de α-GAL Replagal®.
Los resultados anteriores indican que la reticulación de la α-GAL-I humana recombinante vegetal da como resultado un dímero con mejor estabilidad, lo que permite un aumento más eficaz de la actividad de α-GAL cuando se administra in vivo.
De manera similar, las Figuras 22-28D muestran que la reticulación de la α-GAL humana recombinante de mamífero da como resultado un dímero ligado de manera covalente (Figuras 22-24B), que exhibe actividad enzimática normal (Figura 25), así como una actividad más duradera en condiciones tanto lisosómicas como en plasma (Figuras 26A26B) y una mayor actividad in vivo en el bazo, hígado, corazón y riñones (Figuras 27A-28D).
De manera similar, las Figuras 29A-33L muestran que la reticulación de la α-GAL II humana recombinante vegetal da como resultado un dímero ligado de manera covalente (Figuras 29-30), que exhibe una actividad más duradera en condiciones tanto lisosómicas como en plasma (Figuras 31A-31B), y una mayor actividad in vivo en plasma y en el bazo, hígado, corazón y riñones (Figuras 32A-33L). Como se muestra en las Figuras 33A-33L, la reticulación con un enlazador de PEG45 fue particularmente eficaz para aumentar la actividad in vivo.
Estos resultados indican que los efectos ventajosos de la reticulación son aplicables a una diversidad de proteínas -GAL.
Las Figuras 34A-34C muestran que la reticulación de -GAL aumenta parámetros de catálisis enzimática de -GAL, ensancha el intervalo de pH de la actividad de -GAL y permite la actividad de -GAL a un pH de aproximadamente 7 o mayor.
Las Figuras 35-36B muestran que la PEGilación sin reticulación no tiene efectos significativos sobre la actividad de -GAL, lo que indica que los efectos ventajosos de la reticulación se deben específicamente a la reticulación, en lugar de a un efecto de la PEGilación.
Las Figuras 40-44 muestran que la reticulación de -GAL de acuerdo con las realizaciones de la invención permite una buena reproducibilidad de la estabilidad (Figuras 40A-40B), grado de reticulación covalente (Figuras 41-43F) y propiedades enzimáticas (Figura 44) de la -GAL reticulada.
Los resultados presentados en el presente documento muestran que las estructuras de proteína multiméricas reticuladas de manera covalente de la -galactosidasa se caracterizan por una mayor estabilidad y mayor actividad en condiciones fisiológicamente relevantes, en comparación con las formas nativas de la -galactosidasa.
Por lo tanto, la estructura de proteína multimérica unida de manera covalente puede exhibir una actividad que es mayor que la actividad de una forma nativa de la -galactosidasa, como resultado de que la actividad de la forma nativa se degrada más rápidamente a lo largo del tiempo que la actividad de la estructura de proteína multimérica reticulada, que se estabiliza mediante la reticulación covalente.
La estructura de proteína multimérica reticulada de manera covalente puede exhibir una actividad que es mayor que la actividad de la forma nativa de la -galactosidasa, también debido a una mayor actividad inicial (por ejemplo, debido a diferentes parámetros de actividad), es decir, independientemente de cualquier deterioro de la actividad a lo largo del tiempo.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención se proporciona una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de -galactosidasa que están ligados de manera covalente entre sí a través de un radical de unión. De acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de proteína multimérica presenta una estabilidad mayor que la de una -galactosidasa nativa y/o una actividad inicial mayor que la de una -galactosidasa nativa, como se describe más adelante con detalle.
En el presente documento, el término “monómero” con respecto a la -galactosidasa se refiere a un polipéptido individual de la -galactosidasa. El polipéptido puede incluir sustituyentes no peptídicos (por ejemplo, uno o más restos de sacárido).
En el presente documento, el término “nativa” con respecto a la -galactosidasa incluye proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica (es decir, al menos una homología del 95 %, opcionalmente al menos una homología del 99 % y opcionalmente del 100 %) con una secuencia de aminoácidos de una proteína -galactosidasa de origen natural. Una -galactosidasa nativa puede ser una proteína aislada de una fuente natural,
o una proteína producida de manera recombinante (por ejemplo, procedente de células de mamífero, células de plantas, células de levadura, células bacterianas o células de insecto).
El término “nativa”, cuando se usa en referencia a una estructura cuaternaria de -galactosidasa (por ejemplo, un dímero de -galactosidasa) comprende adicionalmente una estructura cuaternaria sustancialmente idéntica a la de una proteína de origen natural.
En el presente documento, la frase “proteína de origen natural” se refiere a una proteína en una forma que se produce en la naturaleza (por ejemplo, en un organismo), con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína, así como la estructura cuaternaria de la proteína si la proteína está en una forma multimérica.
Las modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glucosilación) de las proteínas -galactosidasa de origen natural (por ejemplo, en un organismo que expresa la proteína -galactosidasa de origen natural) pueden estar presentes, ausentes o modificadas en la forma nativa de la -galactosidasa a la que se hace referencia en el presente documento. Una forma nativa de la -galactosidasa (por ejemplo, una -galactosidasa producida de manera recombinante) puede comprender opcionalmente modificaciones postraduccionales diferentes a las de la galactosidasa de origen natural, siempre que la forma nativa de la -galactosidasa conserve una secuencia de aminoácidos y estructura sustancialmente similar a la de la -galactosidasa de origen natural, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
En el presente documento, la forma nativa de una proteína puede referirse a una estructura monomérica (por ejemplo, un monómero de -galactosidasa) y/o una estructura multimérica (por ejemplo, un dímero de galactosidasa). Por ejemplo, una proteína dimérica puede describirse como una forma nativa de -galactosidasa, y un polipéptido monomérico en una proteína dimérica puede describirse como una forma nativa del monómero de galactosidasa.
Opcionalmente, la estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento es una estructura dimérica, como lo es la forma nativa de la -galactosidasa.
Como alternativa, la estructura de proteína multimérica comprende más de dos monómeros de -galactosidasa. Por ejemplo, la estructura de proteína multimérica puede ser un tetrámero, un hexámero o un octámero que comprende monómeros de -galactosidasa.
Las estructuras de proteína multimérica descritas en el presente documento comprenden enlaces covalentes que unen los monómeros de -galactosidasa entre sí, y que no existen en la forma nativa de la -galactosidasa.
Opcionalmente, el radical de unión que une los monómeros de -galactosidasa es un radical que no está presente en una forma nativa de -galactosidasa (por ejemplo, un radical de unión sintético).
Por lo tanto, por ejemplo, el radical de unión es opcionalmente un radical que se une de manera covalente a una cadena lateral, a un extremo N o a un extremo C, o un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacárido) de un monómero de -galactosidasa, así como a una cadena lateral, a un extremo N o a un extremo C, o a un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacárido) de otro monómero de -galactosidasa. A continuación, se describen con detalle en el presente documento ejemplos de dichos radicales de unión.
Como alternativa, el radical de unión forma una parte de los monómeros de -galactosidasa que se están uniendo (por ejemplo, una parte de una cadena lateral, extremo N o extremo C, o un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacárido) de un monómero de -galactosidasa, así como de una cadena lateral, un extremo N o un extremo C, o un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacárido) de otro monómero de -galactosidasa).
Por lo tanto, por ejemplo, el radical de unión puede ser un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida) entre un grupo funcional de una cadena lateral, extremo N, extremo C o radical relacionado con modificaciones postraduccionales de un monómero (por ejemplo, una amina) y un grupo funcional complementario de una cadena lateral, extremo N, extremo C o radical relacionado con modificaciones postraduccionales de otro monómero (por ejemplo, carboxilo), donde dicho enlace covalente está ausente de la forma nativa de la -galactosidasa. También se contemplan otros enlaces covalentes, tales como, por ejemplo, un enlace éster (entre un grupo hidroxi y un carboxilo); un enlace tioéster; un enlace éter (entre dos grupos hidroxi); un enlace tioéter; un enlace anhídrido (entre dos carboxilos); un enlace tioamida; un enlace carbamato o tiocarbamato.
Opcionalmente, el radical de unión está desprovisto de un enlace disulfuro. Sin embargo, dentro del alcance de esta realización de la invención se encuentra un radical de unión que incluye un enlace disulfuro en una posición que no forma un enlace entre monómeros (por ejemplo, la escisión de los enlaces disulfuro no escinde la unión entre los monómeros). Una posible ventaja del radical de unión desprovisto de un enlace disulfuro es que no es susceptible de escisión en condiciones reductoras suaves, como lo son los enlaces disulfuro.
Opcionalmente, el radical de unión es un radical no peptídico (por ejemplo, el radical de unión no consiste en un enlace amida, un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un oligopéptido o un polipéptido).
Como alternativa, el radical de unión puede ser, o puede comprender, un radical peptídico (por ejemplo, un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un oligopéptido o un polipéptido).
Opcionalmente, el radical de unión no es simplemente una extensión lineal de cualquiera de los monómeros de galactosidasa unidos (es decir, el extremo N y extremo C del radical peptídico no están unidos directamente al
extremo C o extremo N de cualquiera de los monómeros de -galactosidasa).
Como alternativa, el radical de unión está formado por unión covalente directa de un extremo N de un monómero de -galactosidasa con un extremo C de otro monómero de -galactosidasa, para producir un polipéptido fusionado. 5 Dicho polipéptido no será una forma nativa de -galactosidasa, aunque puede comprender dos monómeros de galactosidasa esencialmente en su forma nativa.
Sin embargo, la unión covalente de los monómeros de -galactosidasa descritos en el presente documento está preferentemente en una forma distinta de la unión directa de un extremo N a un extremo C.
10 El radical de unión también se denomina en el presente documento radical de reticulación. En el presente documento, la unión de monómeros de -galactosidasa mediante un radical de unión se denomina “reticulación”.
El radical de reticulación puede ser un enlace covalente, un grupo o átomo químico (por ejemplo, un grupo C(=O)-O15 , -O-, -S-, NR-, -N=N-, -NH-C(=O)-NH-, y similar) o un radical puente (compuesto de una cadena de grupos químicos).
Un radical puente puede ser, por ejemplo, un grupo polimérico u oligomérico.
20 El radical puente es un radical multifuncional (por ejemplo, birradical, trirradical, etc.) que está unido a cadenas laterales, radicales relacionados con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, radicales de sacárido) y/o extremos (es decir, extremo N, extremo C) de dos o más de los monómeros.
Como se ilustra en el presente documento en la sección de Ejemplos, los radicales de unión relativamente cortos 25 (por ejemplo, PEG2, PEG4, PEG5) pueden ser menos eficaces que los radicales de unión más largos (por ejemplo, PEG28, PEG45) en las reticulaciones entre diferente monómeros de -galactosidasa.
Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, el radical de unión no es un enlace covalente, un átomo o grupo químico, sino que más bien es un radical puente.
30 Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, el radical de unión tiene una longitud de al menos 10 átomos, opcionalmente una longitud de al menos 20 átomos, opcionalmente una longitud de al menos 30 átomos, opcionalmente una longitud de al menos 50 átomos, opcionalmente una longitud de al menos 100 átomos y opcionalmente una longitud de al menos 200 átomos.
35 En el presente documento, la longitud de un radical de unión (cuando se expresa como un número de átomos) se refiere a la longitud de la estructura del radical de unión, es decir, el número de átomos que forman una cadena lineal entre los restos de cada uno de dos monómeros unidos a través del radical de unión.
40 Opcionalmente, el radical de unión está por debajo de un determinado tamaño, para impedir una parte del radical de unión innecesariamente excesiva en la proteína reticulada formada, que podría interferir con la función de la proteína.
Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, cada radical de unión se caracteriza por un peso molecular de 45 menos de 20 KDa, opcionalmente menos de 10 KDa, opcionalmente menos de 5 KDa y opcionalmente menos de 3 KDa.
Para facilitar la reticulación, el radical de unión es de manera opcional sustancialmente flexible, siendo los enlaces en la estructura del radical de unión en su mayor parte rotacionalmente libres, por ejemplo, enlaces sencillos que no
50 están acoplados a un doble enlace (por ejemplo, a diferencia de un enlace amida) y no estando la rotación impedida estéricamente. Opcionalmente al menos el 70 %, opcionalmente al menos el 80 % y opcionalmente al menos el 90 % (por ejemplo, el 100 %) de los enlaces en la estructura del radical de unión es rotacionalmente libre.
En algunas realizaciones, el radical de unión comprende una cadena de poli(alquilenglicol).
55 La frase “poli(alquilenglicol)”, como se usa en el presente documento, incluye una familia de polímeros de poliéter que comparte la siguiente fórmula general: -O-[(CH2)m-O-]n-, en la que m representa el número de grupos metileno presente en cada unidad de alquilenglicol, y n representa el número de unidades de repetición y, por lo tanto, representa el tamaño o la longitud del polímero. Por ejemplo, cuando m = 2, el polímero se denomina polietilenglicol
60 y cuando m = 3, el polímero se denomina polipropilenglicol.
En algunas realizaciones, m es un número entero mayor que 1 (por ejemplo, m = 2, 3, 4, etc.).
Opcionalmente, m varía entre las unidades de la cadena de poli(alquilenglicol). Por ejemplo, una cadena de 65 poli(alquilenglicol) puede comprender tanto unidades de etilenglicol (m = 2) como de propilenglicol (m = 3) unidas
entre sí.
Opcionalmente, el poli(alquilenglicol) comprende al menos dos grupos funcionales (por ejemplo, como se describe en el presente documento), formando cada grupo funcional un enlace covalente con uno de los monómeros de galactosidasa. Los grupos funcionales son opcionalmente grupos terminales del poli(alquilenglicol), de tal manera que toda la longitud del poli(alquilenglicol) se encuentra entre los dos grupos funcionales.
La frase “poli(alquilenglicol)” también incluye análogos del mismo, en los que el átomo de oxígeno se reemplaza por otro heteroátomo tal como, por ejemplo, S, -NH-y similares. Este término incluye adicionalmente derivados de los anteriores en los que se han sustituido uno o más de los grupos metileno que componen el polímero. Los sustituyentes ejemplares en los grupos metileno incluyen, pero sin limitación, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi y similares.
La frase “unidad de alquilenglicol”, como se usa en el presente documento, incluye un grupo -(CH2)m-O-o un análogo del mismo, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, que forma la cadena estructural del poli(alquilenglicol), en el que el (CH2)m (o su análogo) está unido a un heteroátomo que pertenece a otra unidad de alquilenglicol o a un radical monomérico de -galactosidasa (en casos de una unidad terminal), y el O (o un análogo de heteroátomo del mismo) está unido al (CH2)m (o su análogo) de otra unidad de alquilenglicol, o a un grupo funcional que forma un enlace con un monómero de -galactosidasa.
Una unidad de alquilenglicol puede estar ramificada, de tal manera que está ligada a tres o más unidades de alquilenglicol adyacentes, donde cada una de las 3 o más unidades de alquilenglicol adyacentes son parte de una cadena de poli(alquilenglicol). Dicha unidad ramificada de alquilenglicol está ligada a través del heteroátomo de la misma a una unidad de alquilenglicol adyacente, y cada uno de los heteroátomos de las unidades de alquilenglicol adyacentes restantes está ligado a un átomo de carbono de la unidad de alquilenglicol ramificada. Además, un heteroátomo (por ejemplo, nitrógeno) puede unirse a más de un átomo de carbono de una unidad de alquilenglicol de la que forma parte, formando de este modo una unidad de alquilenglicol ramificada (por ejemplo, [(-CH2)m]2N-y similares).
En realizaciones ejemplares, al menos el 50 % de las unidades de alquilenglicol son idénticas, por ejemplo, comprenden los mismos heteroátomos y los mismos valores de m unas que otras. Opcionalmente al menos el 70 %, opcionalmente al menos el 90 % y opcionalmente el 100 % de las unidades de alquilenglicol son idénticas. En realizaciones ejemplares, los heteroátomos unidos a las unidades idénticas de alquilenglicol son átomos de oxígeno. En realizaciones ejemplares adicionales, m es 2 para las unidades idénticas.
En una realización, el enlazador es un enlazador de cadena lineal, sencilla, siendo preferentemente polietilenglicol (PEG).
Como se usa en el presente documento, la expresión “poli(etilenglicol)” describe un poli(alquilenglicol), como se define anteriormente en el presente documento, en el que al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 90 % y preferentemente el 100 % de las unidades de alquilenglicol son -CH2CH2-O-. De manera similar, la frase “unidades de etilenglicol” se define en el presente documento como unidades de -CH2CH2-O-.
De acuerdo con realizaciones opcionales, el radical de unión comprende un poli(etilenglicol) o análogo del mismo, que tienen una fórmula general:
- -
- X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2
en la que cada uno de X1 y X2 es un grupo funcional (por ejemplo, como se describe en el presente documento)
que forma un enlace covalente con al menos un monómero de -galactosidasa;
Y es O, S o NR5 (opcionalmente O);
n es un número entero, opcionalmente de 1 a 200 (opcionalmente de 5 a 150 y opcionalmente de 40 a 70),
aunque también se contemplan valores mayores de n; y
cada uno de R1, R2, R3, R4 y R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo,
cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi.
En algunas realizaciones, n es al menos 5, opcionalmente al menos 8, opcionalmente al menos 15 y opcionalmente al menos 25 y opcionalmente al menos 40.
En algunas realizaciones, n no es más de 200, opcionalmente no más de 150 y opcionalmente no más de 70.
El poli(etilenglicol) o análogo del mismo puede comprender opcionalmente un copolímero, por ejemplo, en el que las unidades CR1R2-CR3R4-Y en la fórmula anterior no son todas idénticas entre sí.
En algunas realizaciones, al menos el 50 % de las unidades CR1R2-CR3R4-Y son idénticas. Opcionalmente, al menos el 70 %, opcionalmente al menos el 90 % y opcionalmente el 100 % de las unidades CR1R2-CR3R4-Y son
idénticas.
Opcionalmente, el radical de unión está ramificado, por ejemplo, de tal manera que para una o más unidades CR1R2CR3R4-Y en la fórmula anterior, al menos de uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es –(CR1R2-CR3R4-Y)pX3-, donde R1-R4 e Y son como se define anteriormente en el presente documento, p es un número entero como se define en el presente documento para n (por ejemplo, de 1 a 200) y X3 es como se define en el presente documento para X1 y X2.
Los grupos funcionales pueden formar opcionalmente un enlace tal como, pero sin limitación, un enlace amina, un enlace amida, un enlace éster y/o un enlace éter.
Por ejemplo, el grupo funcional puede comprender opcionalmente un grupo carbonilo que forma un enlace amida con un átomo de nitrógeno en un polipéptido (por ejemplo, en un resto de lisina o extremo N) o un enlace éster con un átomo de oxígeno en un polipéptido (por ejemplo, en un resto de serina, treonina o tirosina).
Como alternativa o adicionalmente, el grupo funcional opcionalmente puede comprender un heteroátomo (por ejemplo, N, S, O) que forma un enlace amida, enlace éster o enlace tioéster con un grupo carbonilo en un polipéptido (por ejemplo, en un resto de glutamato o aspartato o en un extremo C).
Como alternativa o de manera adicional, el grupo funcional puede comprender un grupo alquilo o arilo unido a un polipéptido (por ejemplo, a un heteroátomo en el polipéptido).
De manera alternativa o adicional, el grupo funcional puede comprender opcionalmente un átomo de nitrógeno que forma un enlace amina con un grupo alquilo en un monómero de -galactosidasa, o un monómero de galactosidasa que opcionalmente comprende un átomo de nitrógeno que forma un enlace amina con un grupo alquilo en el grupo funcional. Dicho enlace amina puede formarse por aminación reductora (por ejemplo, como se describe más adelante en el presente documento).
En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos funcionales forma un enlace amida con un polipéptido (por ejemplo, con un resto de lisina en su interior).
Los grupos funcionales pueden ser idénticos entre sí o diferentes.
En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos funcionales está unido a una funcionalidad de un polipéptido (por ejemplo, un grupo amino de un resto de lisina o extremo N), y al menos uno de los grupos funcionales está unido a una funcionalidad diferente de un polipéptido (por ejemplo, un grupo tiol de un resto de cisteína).
De acuerdo con realizaciones opcionales, la estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento exhibe una alta estabilidad en condiciones plasmáticas humanas y/o en condiciones lisosómicas.
Como se usa en el presente documento, la frase “condiciones plasmáticas humanas” se refiere a plasma humano como medio, a una temperatura de 37 ºC.
Como se usa en el presente documento, la frase “condiciones lisosómicas” se refiere a una solución acuosa que tiene un pH de 4,6 como medio (por ejemplo, un tampón fosfato citrato descrito en el presente documento), a una temperatura de 37 ºC.
La mejor estabilidad en condiciones lisosómicas es ventajosa debido a que el lisosoma es una diana para la terapia de reemplazo para la -galactosidasa, ya que los lisosomas son la localización normal de la actividad galactosidasa en el cuerpo, y las condiciones lisosómicas (por ejemplo, pH ácido) representan condiciones óptimas para la actividad de la -galactosidasa.
Sin querer ligarse a ninguna teoría particular, se piensa que la mejor estabilidad en condiciones similares al suero (por ejemplo, las condiciones plasmáticas humanas descritas en el presente documento) es también ventajosa porque la -galactosidasa estable en la sangre puede actuar sobre metabolitos (por ejemplo, Gb3) presentes en la sangre como consecuencia de la salida desde las células. Una estructura de proteína multimérica activa en suero podría opcionalmente ser eficaz en la eliminación y prevención de los depósitos de glucoesfingolípidos dentro de las paredes de los vasos sanguíneos que promueven la inflamación [Bodary et al., TCM 17(4): 129-133]. Por ejemplo, en la enfermedad de Fabry, la patogénesis principal resulta de la acumulación de Gb3 en el endotelio vascular, lo que conduce a una oclusión vascular de los vasos pequeños, isquemia e infarto de estos vasos e isquemia e infarto del riñón, corazón y cerebro [Desnick et al., 2003, Annals of Internal Medicine, 138(4): 338-346]. Adicionalmente, la mayor estabilidad en suero puede anular la necesidad de tráfico lisosómico. ERT puede, por lo tanto, volverse mucho más accesible, ya que pueden emplearse sistemas de hospedadores rentables fuertes, por ejemplo, plantas.
De acuerdo con realizaciones opcionales, la alta estabilidad de la estructura de proteína multimérica en condiciones plasmáticas humanas es tal que la estructura de proteína multimérica exhibe, después de someterse a condiciones
plasmáticas humanas durante una hora, una actividad -galactosidasa que es al menos un 10 % mayor, opcionalmente un 20 % mayor, opcionalmente el 50 % mayor, y opcionalmente un 100 % mayor, que una actividad -galactosidasa de la -galactosidasa nativa después de someter la -galactosidasa nativa a las condiciones plasmáticas humanas durante una hora.
De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de proteína multimérica en condiciones plasmáticas humanas es tal que la actividad α-galactosidasa de la estructura de proteína multimérica disminuye más lentamente en condiciones plasmáticas humanas que la actividad correspondiente de la α-galactosidasa nativa. Opcionalmente, la estructura de proteína multimérica exhibe una actividad que disminuye después de someter la estructura de proteína a condiciones plasmáticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor, opcionalmente un 20 % menor, opcionalmente un 50 % menor y opcionalmente un 80 % menor, que el porcentaje que disminuye la actividad correspondiente de la α-galactosidasa nativa después de someter la αgalactosidasa nativa a condiciones plasmáticas humanas durante una hora.
Debe entenderse que, en el presente documento, una disminución que es un “10 % menor” que una disminución del 50 % se refiere a una disminución del 45 % (siendo 45 un 10 % menor que 50), y no a una disminución del 40 % (50 %-10 %).
De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de proteína multimérica en condiciones plasmáticas humanas es tal que la actividad α-galactosidasa de la estructura de proteína multimérica permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora, y opcionalmente durante 2, 4 o incluso 6 horas.
Como se usa en el presente documento, la frase “sustancialmente sin cambios” se refiere a un nivel (por ejemplo, de actividad) que permanece en un intervalo del 50 % al 150 % del nivel inicial, y opcionalmente un nivel que permanece al menos en un 60 %, opcionalmente al menos en un 70 %, opcionalmente al menos en un 80 % y opcionalmente al menos en un 90 % del nivel inicial.
Opcionalmente, la alta estabilidad de la estructura de proteína multimérica en condiciones lisosómicas es tal que la estructura de proteína multimérica exhibe, después de someterse a condiciones lisosómicas durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, un día, dos días, tres días, una semana), una actividad α-galactosidasa que es al menos un 10 % mayor, opcionalmente un 20 % mayor, opcionalmente un 50 % mayor y opcionalmente un 100 % mayor que la actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter la α-galactosidasa nativa a las condiciones lisosómicas durante el mismo periodo de tiempo predeterminado.
De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de proteína multimérica en condiciones lisosómicas es tal que una actividad α-galactosidasa de la estructura de proteína multimérica disminuye más lentamente en condiciones lisosómicas que una actividad correspondiente de la α-galactosidasa nativa. Opcionalmente, la estructura de proteína multimérica exhibe una actividad que disminuye después de someter la estructura de proteína a condiciones lisosómicas durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo un día, 2 días, 3 días, una semana), en un porcentaje que es al menos un 10 % menor, opcionalmente un 20 % menor, opcionalmente un 50 % menor y opcionalmente un 80 % menor, que el porcentaje que disminuye la actividad correspondiente de la alfa-galactosidasa nativa después de someter la alfa-galactosidasa nativa a condiciones lisosómicas durante el mismo periodo de tiempo.
De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de proteína multimérica en condiciones lisosómicas es tal que una actividad α-galactosidasa de la estructura de proteína multimérica permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día, durante 2 días, durante 3 días, durante una semana, durante dos semanas y/o durante un mes.
Como se ilustra en la sección de Ejemplos del presente documento, además de exhibir más estabilidad a lo largo del tiempo, la estructura de proteína multimérica puede exhibir parámetros de actividad α-galactosidasa que son diferentes de los de la α-galactosidasa nativa.
Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones opcionales, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por exhibir, independientemente de cualquier degradación de actividad a lo largo del tiempo, una actividad αgalactosidasa que es mayor que una actividad α-galactosidasa de una forma nativa de la proteína. Opcionalmente, la actividad es un 10 % mayor y, opcionalmente, un 20 % mayor, que la actividad correspondiente de la forma nativa.
Para caracterizar dicha actividad, la actividad se determina preferentemente de manera inmediata (por ejemplo, antes de que haya transcurrido 1 hora, antes de que hayan transcurrido 15 minutos) después de someter la αgalactosidasa nativa o la estructura de proteína multimérica a condiciones (por ejemplo, como se describe en el presente documento) en las cuales la actividad disminuye sustancialmente, de tal manera que la actividad medida reflejará la actividad por sí misma y no un grado de estabilidad.
Opcionalmente, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por exhibir una actividad α-galactosidasa en condiciones lisosómicas que es mayor que una actividad correspondiente de la α-galactosidasa nativa.
De manera alternativa o adicional, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por exhibir una actividad αgalactosidasa en condiciones fisiológicas simuladas a un pH neutro que es mayor que una actividad correspondiente de la α-galactosidasa nativa. Las condiciones fisiológicas simuladas comprenden una solución acuosa (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) a una temperatura de 37 ºC. El pH es opcionalmente 7. Como alternativa, el pH es de 7,4.
La actividad α-galactosidasa descrita en el presente documento es una actividad biológica que es característica de la α-galactosidasa (por ejemplo, una actividad catalítica característica de la α-galactosidasa, tal como hidrólisis de un radical α-galactosil terminal de un sustrato).
En algunas realizaciones, la actividad catalítica de la α-galactosidasa se caracteriza por una velocidad de catálisis a saturación (es decir, un valor Vmáx).
De manera alternativa, la actividad α-galactosidasa es una actividad terapéutica (por ejemplo, una actividad enzimática que tiene un efecto terapéutico), tal como una actividad terapéutica en el contexto de la enfermedad de Fabry. Opcionalmente, la actividad terapéutica se determina en animales experimentales (por ejemplo, ratones con enfermedad de Fabry) y, opcionalmente, en pacientes humanos con enfermedad de Fabry.
Un experto en la materia conocerá técnicas para determinar la actividad α-galactosidasa. Típicamente, la αgalactosidasa (es decir, la forma nativa o una estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento) se pone en contacto con un compuesto reconocido en la técnica como sustrato de la α-galactosidasa, y después se determina el grado de actividad de un modo cuantitativo. En la técnica se conocen compuestos que permiten la detección particularmente conveniente de la actividad α-galactosidasa y se encuentran disponibles en el mercado.
En algunas realizaciones, la actividad α-galactosidasa se determina ensayando la hidrólisis de 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranósido (por ejemplo, como se describe en la sección de Ejemplos del presente documento).
En algunas realizaciones, la actividad α-galactosidasa se determina ensayando la hidrólisis de p-nitrofenil-α-Dgalactopiranósido (por ejemplo, como se describe en la sección de Ejemplos del presente documento).
Cuando se compara una actividad de una estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento con una actividad de la α-galactosidasa nativa, la α-galactosidasa nativa comprende preferentemente monómeros de αgalactosidasa sustancialmente idénticos (por ejemplo, con respecto a la secuencia de aminoácidos y el patrón de glucosilación) a los monómeros de α-galactosidasa de la estructura multimérica.
De acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por una semivida en circulación en un sistema fisiológico (por ejemplo, sangre, suero y/o plasma de un ser humano o animal de laboratorio) que es mayor (por ejemplo, al menos un 20 %, al menos un 50 % mayor, al menos un 100 % mayor, al menos un 400 % mayor o al menos un 900 % mayor) que una semivida en circulación de la α-galactosidasa nativa.
Una semivida en circulación aumentada puede asociarse opcionalmente con una mayor estabilidad in vitro (por ejemplo, como se describe en el presente documento), una mayor estabilidad in vivo (por ejemplo, resistencia al metabolismo) y/o junto con otros factores (por ejemplo, eliminación renal reducida).
Las semividas de circulación pueden determinarse cogiendo muestras (por ejemplo, muestras sanguíneas, muestras tisulares) de sistemas fisiológicos (por ejemplo, seres humanos, animales de laboratorio) a diversos intervalos y determinando el nivel de α-galactosidasa en la muestra, usando técnicas conocidas en este campo.
Opcionalmente, la semivida se calcula como una semivida terminal (por ejemplo, como se describe en la sección de Ejemplos), donde la semivida es el tiempo necesario para que una concentración (por ejemplo, una concentración sanguínea) disminuya en un 50 % después de haber alcanzado el seudoequilibrio de distribución. La semivida terminal puede calcularse a partir de una parte lineal terminal de una curva de tiempo frente al log de la concentración, por regresión lineal de la curva de tiempo frente al log de la concentración (véase, por ejemplo, Toutain y Bousquet-Melou [J Vet Pharmacol Ther 2004, 27: 427-39]). Por lo tanto, la semivida terminal es una medida de la disminución de la concentración plasmática de fármaco debida a la eliminación del fármaco y no de la disminución debida a otras razones, y no es necesariamente el tiempo necesario para que la cantidad del fármaco administrado se reduzca a la mitad.
La determinación del nivel de α-galactosidasa (por ejemplo, la estructura de proteína multimérica o la αgalactosidasa nativa) puede comprender la detección de la presencia física de α-galactosidasa (por ejemplo, mediante un anticuerpo contra α-galactosidasa) y/o la detección del nivel de una actividad α-galactosidasa (por ejemplo, como se describe en el presente documento).
De acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por una actividad αgalactosidasa en un órgano (por ejemplo, bazo, corazón, riñón, cerebro, hígado) después de la administración (por ejemplo, administración intravenosa) de la estructura de proteína a un vertebrado (por ejemplo, un ser humano, un ratón), por ejemplo, un vertebrado con un déficit de α-galactosidasa (por ejemplo, un paciente humano con la enfermedad de Fabry, un ratón con la enfermedad de Fabry). Opcionalmente, la actividad α-galactosidasa en el órgano es mayor que la actividad α-galactosidasa de la α-galactosidasa nativa en el órgano, después de una administración equivalente a un vertebrado.
La actividad en un órgano puede ser una función de la captación de la α-galactosidasa y/o la retención de la actividad α-galactosidasa después de la captación.
Opcionalmente, la actividad α-galactosidasa en el órgano se determina 2 horas después de la administración, y opcionalmente 24 horas, opcionalmente 3 días, opcionalmente 7 días y opcionalmente 14 días después de la administración.
Un aumento de la actividad de la α-galactosidasa en el hígado en algunos casos puede estar asociada con una menor actividad en otras partes del cuerpo y, por lo tanto, con un efecto biológico reducido de la α-galactosidasa.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por una mayor actividad α-galactosidasa en un órgano distinto del hígado. Como ejemplos de órganos incluyen el bazo, el corazón y los riñones.
En algunas realizaciones, la estructura de proteína multimérica se caracteriza por una mayor actividad αgalactosidasa en un órgano después de la administración (como se describe en el presente documento) que es al menos un 20 % mayor, opcionalmente al menos un 50 % mayor, opcionalmente al menos un 100 % mayor, y opcionalmente al menos un 300 % mayor, que la actividad de la α-galactosidasa nativa después de una administración equivalente. Como se ha indicado anteriormente en el presente documento, los autores de la presente invención han contemplado y preparado satisfactoriamente y llevado a la práctica formas estabilizadas de α-galactosidasa mediante estructuras multiméricas de monómeros de α-galactosidasa reticulados.
Opcionalmente, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa humana (por ejemplo, una α-galactosidasa humana recombinante), por ejemplo, para facilitar la biocompatibilidad óptima para la administración a sujetos humanos. La α-galactosidasa humana se encuentra disponible en el mercado, por ejemplo, como Replagal® (agalsidasa alfa, Shire) y Fabrazyme® (agalsidasa beta, Genzyme).
En el presente documento, “α-galactosidasa humana” se refiere a una α-galactosidasa que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica (por ejemplo, como se describe anteriormente en el presente documento) a una secuencia de aminoácidos de una proteína α-galactosidasa que se produce de manera natural en seres humanos.
En algunas realizaciones, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa recombinante vegetal. Las α-galactosidasas ejemplares incluyen α-galactosidasas humanas recombinantes vegetales.
Como ejemplos de α-GAL se incluyen, sin limitación, α-GAL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Opcionalmente, la α-GAL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
Como se usa en el presente documento, “α-galactosidasa” se refiere a cualquier proteína que exhibe una actividad enzimática (por ejemplo, hidrólisis) hacia radicales de galactosa en Gb3 (por ejemplo, α-galactosidasa A). Opcionalmente, “α-galactosidasa” se refiere a E.C. 3.2.1.22.
La α-galactosidasa de las realizaciones de la invención puede purificarse (por ejemplo, de tejido de plantas o animales) o generarse mediante tecnología de ADN recombinante.
Como se describe en el presente documento, la actividad de α-galactosidasa en suero puede ser muy ventajosa, por ejemplo, para reducir niveles de Gb3 en suero.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa alcalina.
Como se usa en el presente documento, la frase “α-galactosidasa alcalina” se refiere a α-GAL caracterizada por la capacidad de hidrolizar los radicales de α-galactosa ligados al extremo de oligosacáridos que contienen galactosa en condiciones de pH neutro a básico (por ejemplo, a aproximadamente pH 7-7,5), particularmente a un pH en suero normal (por ejemplo, aproximadamente 7,35-7,45).
Se apreciará que una α-GAL alcalina de algunas realizaciones de la invención puede ser activa en condiciones de pH neutras a básicas, pero también puede presentar actividad en condiciones de pH ácidas (es decir, a
aproximadamente 4,6).
En una realización específica, la enzima es activa en condiciones de pH de ácido a básico (es decir, aproximadamente pH 4,2-7,5).
En otra realización específica más, la enzima es activa a un pH de aproximadamente 6,5-7,5.
En la Solicitud de Patente US 20070036883, documento WO03/097791 y en PCT/IL2010/000956, se proporcionan ejemplos específicos de α-galactosidasas alcalinas que pueden usarse de acuerdo con las presentes enseñanzas.
Por lo tanto, la α-galactosidasa alcalina puede ser un miembro de la familia de plantas seleccionada del grupo que consiste en las familias Cucurbitaceae, Lamiaceae, Piperaceae, Solanaceae, Leguminosae, Cruciferae y Gramineae.
De acuerdo con una realización específica, la α-galactosidasa alcalina es de melón.
P.-R. Gaudreault y JA Webb han descrito en diversas publicaciones (tales como “Alkaline alpha-galactosidase in leaves of Cucurbita pepo”, Plant Sci. Lett. 24, 281-288, 1982, “Partial purification and properties of an alkaline alphagalactosidase from mature leaves of Cucurbita pepo”, Plant Physiol., 71, 662-668, 1983, y “Alkaline alphagalactosidase activity and galactose metabolism in the family Cucurbitaceae”, Plant Science, 45, 71-75, 1986), una nueva α-galactosidasa purificada de plantas jóvenes de Cucurbita pepo, que tiene una actividad óptima en condiciones alcalinas (pH 7,5). Además de la α-galactosidasa alcalina, también pueden indicarse tres formas ácidas de la enzima, y se descubrieron preferencias de sustrato distintas para las formas ácida y alcalina.
Se ha observado actividad α-galactosidasa a pH alcalino en otros tejidos de cucurbitáceas, tales como los pedicelos del fruto del pepino, fruto joven de calabaza y fruto joven de melón (“Melons: Biochemical and Physiological Control of Sugar Accumulation”, En: Encyclopedia of Agricultural Science, vol. 3, págs. 25-37, Arntzen, C. J., et al., eds. Academic Press, Nueva York, 1994).
Bachmann et al. (“Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptens L.”, Plant Physiology 105: 1335-1345, 1994) afirman que en las plantas de Ajuga reptens (consuelda común), un translocador de estaquiosa de la familia Lamiaceae no relacionada también contiene una α-galactosidasa alcalina. Esta enzima se caracterizó parcialmente y se descubrió que tenía alta afinidad por estaquiosa. Además, las hojas de la planta Peperomia camptotricha L., de la familia Piperaceae, muestran actividad α-galactosidasa a pH alcalino, lo que sugiere que también contienen una enzima α-galactosidasa alcalina (Madore, M., “Catabolism of raffinose family oligosaccharides by vegetative sink tissues”, En: Carbon Partitioning and Source-Sink Interactions in Plants, Madore,
M. and Lucas, W. J. (eds.) págs. 204-214, 1995, American Society of Plant Physiologists, Maryland). De manera similar, Gao y Schaffer (Plant Physiol. 1999; 119: 979-88) han descrito una actividad α-galactosidasa con un pH alcalino óptimo en extractos brutos de tejidos de una variedad de especies que incluyen miembros de las familias Cucurbit y Coleus (Lamiaceae).
Se proporcionan ejemplos específicos de secuencias de α-galactosidasa alcalina de plantas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 13 (Cucumis melo), 6 (T. tetragonioides), 7 y 12 (Cucumis sativus), 8 y 9 (Zea mays), 10 (Oruza sativa), 11 (Pisum sativum) y 14 (Coffea arabica).
En algunas realizaciones, la α-galactosidasa es una α-galactosidasa ácida.
Como se usa en el presente documento, “α-galactosidasa ácida” se refiere a una α-galactosidasa caracterizada por una capacidad de hidrolizar radicales de α-galactosidasa unidos al extremo de oligosacáridos que contienen galactosa en condiciones de pH ácidas (por ejemplo, a aproximadamente pH 4,2-5), tales como las que existen en un lisosoma.
La α-galactosidasa de realizaciones de la invención puede ser de cualquier fuente humana, animal o vegetal, siempre que después de la administración in vivo no se induzca una reacción inmunológica excesivamente adversa (por ejemplo, planta contra ser humano).
Para reducir la reacción inmunológica, puede coadministrarse una preparación de α-galactosidasa no humana (por ejemplo, de α-galactosidasa vegetal) con una α-galactosidasa humana (es decir, α-galactosidasa humana ácida).
Opcionalmente, la estructura de proteína multimérica comprende adicionalmente al menos un radical de manosa-6fosfato (M6P). El radical (o radicales) de M6P puede ligarse a uno o más de los monómeros de α-galactosidasa de la estructura de proteína multimérica (por ejemplo, mediante un enlazador).
En el documento WO 2009/024977 se describen técnicas y reactivos para introducir radicales que contienen M6P en una biomolécula (por ejemplo, un polipéptido).
Como se ilustra en la sección de Ejemplos del presente documento, una estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento puede prepararse convenientemente haciendo reaccionar la α-galactosidasa con un agente de reticulación.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de las realizaciones de la invención, se proporciona un proceso para la preparación de una estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento. El proceso comprende hacer reaccionar la α-galactosidasa para introducir al menos un radical de unión que une de manera covalente al menos dos monómeros de α-galactosidasa.
Opcionalmente, el radical de unión es un enlace (por ejemplo, un enlace amida, un enlace disulfuro) que une un monómero de α-galactosidasa con otro monómero de α-galactosidasa. Opcionalmente, el enlace se introduce usando condiciones y/o reactivos adecuados. Por ejemplo, en la técnica se conocen reactivos que son adecuados para la formación de un enlace amida a partir de un grupo de ácido carboxílico y un grupo amina.
Opcionalmente, el radical de unión es un radical que no procede de una parte de la α-galactosidasa. Por ejemplo, el radical de unión puede ser un oligómero, un polímero, un resto de una molécula pequeña (por ejemplo, un aminoácido).
En algunas realizaciones, el radical de unión se introduce haciendo reaccionar la α-galactosidasa con un agente de reticulación que comprende el radical de unión (por ejemplo, como se describe en el presente documento) y al menos dos grupos reactivos.
Opcionalmente, la α-galactosidasa reacciona en condiciones en las que la α-galactosidasa nativa está en una forma dimérica.
En algunas realizaciones, el agente de reticulación reacciona con la α-galactosidasa a una proporción molar en un intervalo de 5:1 a 500:1 (agente de reticulación:monómero de α-galactosidasa), opcionalmente en un intervalo de
50:1 a 400:1, y opcionalmente en un intervalo de 75:1 a 300:1 (por ejemplo, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1).
El proceso comprende opcionalmente además purificar la proteína reticulada, por ejemplo, retirando el exceso de agente de reticulación. Pueden usarse métodos de purificación comunes, tales como diálisis y/o ultrafiltración, usando membranas de corte apropiado y/o etapas cromatográficas adicionales, incluyendo cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba y similares.
El grupo reactivo se selecciona para que sea adecuado para someterse a una reacción química que conduzca a la formación de un enlace con una funcionalidad complementaria en el monómero de α-galactosidasa. Opcionalmente, cada grupo reactivo es capaz de formar un enlace covalente entre el radical de unión descrito en el presente documento y al menos un polipéptido (por ejemplo, para formar un grupo funcional unido al polipéptido, como se describe en el presente documento).
Los grupos reactivos de un agente de reticulación pueden ser idénticos o diferentes entre sí.
Como se usa en el presente documento, la frase “grupo reactivo” describe un grupo químico que es capaz de someterse a una reacción química que típicamente conduce a la formación de un enlace. El enlace, de acuerdo con las presentes realizaciones, es preferentemente un enlace covalente (por ejemplo, para cada uno de los grupos reactivos). Las reacciones químicas que conducen a la formación de un enlace incluyen, por ejemplo, sustituciones nucleófilas y electrófilas, reacciones de adición nucleófilas y electrófilas, alquilaciones, reacciones de adicióneliminación, reacciones de cicloadición, reacciones de transposición y cualquier otra reacción orgánica conocida que implique un grupo funcional, así como combinaciones de las mismas.
El grupo reactivo puede comprender opcionalmente una parte no reactiva (por ejemplo, un alquilo) que puede servir, por ejemplo, para unir una parte reactiva del grupo reactivo a un radical de unión (por ejemplo, poli(alquilenglicol) o análogo del mismo) descrito en el presente documento.
El grupo reactivo se selecciona preferentemente para permitir su conjugación con la α-galactosidasa. Los grupos reactivos ejemplares incluyen, pero sin limitación, carboxilato (por ejemplo, -CO2H), tiol (-SH), amina (-NH2), halo, azida (-N3), isocianato (-NCO), isotiocianato (-N = C = S), hidroxi (-OH), carbonilo (por ejemplo, aldehído), maleimida, sulfato, fosfato, sulfonilo (por ejemplo, mesilo, tosilo), etc., así como grupos activados, tales como Nhidroxisuccinimida (NHS) (por ejemplo, ésteres de NHS), sulfo-N-hidroxisuccinimida, anhídrido, haluro de acilo (C(=O)-halógeno), etc.
En algunas realizaciones, el grupo reactivo comprende un grupo saliente, tal como un grupo saliente susceptible a la sustitución nucleófila (por ejemplo, halo, sulfato, fosfato, carboxilato, N-hidroxisuccinimida).
Opcionalmente, el grupo reactivo puede estar en una forma activada del mismo.
Como se usa en el presente documento, la frase “forma activada” describe un derivado de un grupo químico (por ejemplo, un grupo reactivo) que es más reactivo que el grupo químico y que, por lo tanto, es capaz de someterse a una reacción química que conduzca a la formación de un enlace. La forma activada puede comprender un grupo saliente particularmente adecuado, facilitando de este modo las reacciones de sustitución. Por ejemplo, un grupo -C(=O)-NHS (éster de N-hidroxisuccinimida o -C(=O)-O-succinimida) es una forma activada bien conocida de -C(=O)OH, ya que la NHS (N-hidroxisuccinimida) puede reaccionar con un -C(=O)OH para formar -C(=O)-NHS, que reacciona fácilmente para formar productos característicos de reacciones que implican grupos -C(=O)OH, tales como amidas y ésteres.
El grupo reactivo puede unirse al resto del radical de unión (por ejemplo, un poli(alquilenglicol) o análogo del mismo) a través de grupos, átomos o enlaces diferentes. Estos pueden incluir un enlace éter [por ejemplo, -O-alquilo], un enlace éster [por ejemplo, -OC(=O)-alquilo], un carbamato [por ejemplo OC(=O)-NH-alquilo], etc. Por lo tanto, pueden emplearse una variedad de grupos terminales.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de los diferentes grupos que pueden constituir un grupo reactivo como se describe en el presente documento: -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2CH2SH, -CH2CH2NH2, -CH2CH2N3, -CH2CH2NCO, -CH2-C(=O)-NHS, -CH2CH2-C(=O)-NHS, -C(=O)-CH2-C(=O)-NHS, -CH2CH2-NHC(=O)CH2CH2maleimida, etc.
El número de grupos metileno en cada uno de los grupos reactivos anteriores es meramente ejemplar, y puede variarse.
El grupo reactivo también puede comprender el heteroátomo en el extremo de una cadena de poli(alquilenglicol) (por ejemplo, -OH).
En realizaciones ejemplares de la presente invención, el grupo reactivo comprende un carboxilato (por ejemplo, un carboxilato activado tal como un éster de N-hidroxisuccinimida).
Opcionalmente, el grupo reactivo reacciona con un grupo amina en la α-galactosidasa (por ejemplo, en un resto de lisina y/o un extremo N) para formar un enlace amida.
En algunas realizaciones, la reacción del grupo reactivo comprende aminación reductora, en la que un grupo amino reacciona con un grupo aldehído para formar una imina y la imina se reduce (por ejemplo, por la adición de un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio) para formar un enlace amina. El grupo reactivo puede ser un grupo amina que reacciona con un grupo aldehído de la α-galactosidasa (por ejemplo, en un radical de sacárido unido al polipéptido de la proteína) o el grupo reactivo puede ser un grupo aldehído que reacciona con un grupo amina de la α-galactosidasa (por ejemplo, en un resto de lisina). Opcionalmente, un radical de sacárido de αgalactosidasa se oxida con un agente oxidante para formar un grupo aldehído, antes de la reacción del grupo reactivo con la α-galactosidasa. Por ejemplo, puede usarse la reacción de un sacárido con peryodato de sodio para producir un par de grupos aldehído en un radical de sacárido.
En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos reactivos se selecciona para que reaccione con una funcionalidad de un monómero de α-galactosidasa (por ejemplo, un grupo amino de un resto de lisina o extremo N) y al menos uno de los grupos reactivos se selecciona para que reaccione con una funcionalidad diferente de un monómero de α-galactosidasa (por ejemplo, un grupo tiol de un resto de cisteína).
Opcionalmente, uno o más polipéptidos descritos en el presente documento se hacen reaccionar con un reactivo de glucosilación para la introducción de uno o más radicales de M6P, para obtener una estructura de proteína multimérica que contenga M6P (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Se describen reactivos de glucosilación que contienen M6P adecuados y su uso, por ejemplo, en el documento WO 2009/024977.
Como se usan en el presente documento, los términos “amina” y “amino” se refieren a un grupo –NR’R”, en el que R’ y R” se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalicíclico (unido a través de un anillo de carbono), arilo y heteroarilo (unido a través de un anillo de carbono). R’ y R” están unidos a través de un átomo de carbono de los mismos. Opcionalmente, R’ y R” se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo que comprende de 1 a 4 átomos de carbono. Opcionalmente, R’ y R” son hidrógeno.
Como se usa a lo largo del presente documento, el término “alquilo” se refiere a un hidrato de carbono alifático saturado que incluye grupos de cadena lineal y ramificada. Preferentemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono. Cuando en el presente documento se indica un intervalo numérico; por ejemplo, “1-20”, esto implica que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 20 átomos de carbono. Más preferentemente, el alquilo es un alquilo de tamaño medio que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Más preferentemente, a menos que se indique otra cosa, el alquilo es un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido o no. Cuando está
sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, Ntiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, de la manera en que estos términos se definen en el presente documento.
Un grupo “cicloalquilo” se refiere a un anillo compuesto totalmente de carbono, monocíclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par adyacente de átomos de carbono), en el que uno o más de los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Son ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido o no. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, de la manera en que estos términos se definen en el presente documento.
Un grupo “alquenilo” se refiere a un grupo alquilo que consta de al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono.
Un grupo “alquinilo” se refiere a un grupo alquilo que consta de al menos dos átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono.
Un grupo “arilo” se refiere a grupos compuestos totalmente de carbono, monocíclicos o policíclicos de anillo condensado (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrón pi completamente conjugado. Son ejemplos, sin limitación, de grupos arilo fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, Ocarbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos términos en el presente documento.
Un grupo “heteroarilo” se refiere a un anillo monocíclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el anillo o los anillos uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Como ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo se incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede estar o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como estos términos se definen en el presente documento.
Un grupo “heteroalicíclico” se refiere a un grupo de anillo monocíclico o condensado que tiene en el anillo o los anillos uno o más átomos tales como nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugados. El heteroalicíclico puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituido puede ser, por ejemplo, un par de electrones, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como estos términos se definen en el presente documento. Son ejemplos representativos piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolina y similares.
Un grupo “hidroxi” se refiere a un grupo -OH.
Un grupo “azida” se refiere a un grupo -N=N+=N-.
Un grupo “alcoxi” se refiere tanto a un -O-alquilo como a un grupo -O-cicloalquilo, como se define en el presente documento.
Un grupo “ariloxi” se refiere tanto a un -O-arilo como a un grupo -O-heteroarilo, como se define en el presente documento.
Un “éter” se refiere tanto a un alcoxi como a un grupo un ariloxi, en el que el grupo está unido a un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heteroalicíclico.
Un enlace éter describe un enlace -O-.
Un grupo “tiohidroxi” o “tiol” se refiere a un grupo -SH.
Un grupo “tioalcoxi” se refiere tanto a un grupo -S-alquilo como a un grupo -S-cicloalquilo, como se define en el presente documento. Un grupo “tioariloxi” se refiere tanto a un grupo -S-arilo como a un grupo -S-heteroarilo, como se define en el
presente documento.
Un “tioéter” se refiere tanto a un grupo tioalcoxi como a un grupo tioariloxi, en el que el grupo está unido a un grupo
alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heteroalicíclico.
Un enlace tioéter describe un enlace -S-.
Un grupo “disulfuro” se refiere tanto a un grupo -S-tioalcoxi como a un grupo -S-tioariloxi.
Un enlace disulfuro describe un enlace -S-S-.
Un grupo “carbonilo” se refiere a un grupo -C(=O)-R’, en el que R’ es como se define en el presente documento
anteriormente.
Un grupo “tiocarbonilo” se refiere a un grupo -C(=S)-R’, en el que R’ es como se define en el presente documento.
Un “carboxilo” se refiere tanto a un “C-carboxi” como a un O-carboxi”.
Un grupo “C-carboxi” se refiere a grupos -C(=O)-O-R’, donde R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “O-carboxi” se refiere a un grupo R’C(=O)-O-, donde R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “oxo” se refiere a un grupo =O.
Un “carboxilato” o “carboxilo” incluye grupos tanto C-carboxi como O-carboxi, como se definen en el presente
documento.
Un grupo “ácido carboxílico” se refiere a un grupo C-carboxi en el que R’ es hidrógeno.
Un grupo “tiocarboxi” o “tiocarboxilato” se refiere a grupos tanto -C(=S)-O-R’ como -O-C(=S)R’.
Un “éster” se refiere a un grupo C-carboxi en el que R’ no es hidrógeno.
Un enlace éster se refiere a un enlace -O-C(=O)-.
Un enlace tioéster se refiere a un enlace -O-C(=S)-o a un enlace -S-C(=O).
Un grupo “halo” se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
Un grupo “sulfinilo” se refiere a un grupo -S(=O)-R’, en el que R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “sulfonilo” se refiere a un grupo -S(=O)2-R’, en el que R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “sulfonato” se refiere a un grupo -S(=O)2-O-R’, en el que R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “sulfato” se refiere a un grupo -O-S(=O)2-O-R’, en el que R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “sulfonamida” o “sulfonamido” incluye grupos tanto S-sulfonamido como N-sulfonamido, como se define en
el presente documento.
Un grupo “S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(=O)2-NR’R”, en el que R’ y R” son como se definen en el presente documento. Un grupo “N-sulfonamido” se refiere a un grupo R’S(=O)2-NR”, en el que cada R’ y R" es como se define en el
presente documento.
Un grupo “O-carbamilo” se refiere a un grupo -OC(=O)-NR’R”, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en el presente documento. Un grupo “N-carbamilo” se refiere a un grupo R’OC(=O)-NR”-, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en el
presente documento.
Un grupo “carbamilo” o “carbamato” incluye grupos tanto O-carbamilo como N-carbamilo.
Un enlace carbamato describe un enlace -O-C(=O)-NR’-, en el que R es como se describe en el presente
documento.
Un grupo “O-tiocarbamilo” se refiere a un grupo -OC(=S)-NR’R”, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en
el presente documento.
Un grupo “N-tiocarbamilo” se refiere a un grupo R’OC(=S)NR”-, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en
el presente documento.
Un grupo “tiocarbamilo” o “tiocarbamato” incluye grupos tanto O-tiocarbamilo como N-tiocarbamilo.
Un enlace tiocarbamato describe un enlace -O-C(=S)-NR’-, en el que R’ es como se describe en el presente
documento.
Un grupo “C-amido” se refiere a un grupo -C(=O)-NR’R”, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en el presente documento. Un grupo “N-amido” se refiere a un grupo R’C(=O)-NR”-, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en el
presente documento.
Un grupo “amida” incluye grupos tanto C-amido como N-amido.
Un enlace amida describe un enlace -NR’-C(=O)-, en el que R’ como se define en el presente documento.
Un enlace amina describe un enlace entre un átomo de nitrógeno en un grupo amina (como se define en el presente
documento) y un grupo R’ en el grupo amina.
Un enlace tioamida describe un enlace -NR’-C(=S)-, en el que R’ es como se define en el presente documento.
Un grupo “urea” se refiere a un grupo -N(R’)-C(=O)-NR”R”’, en el que cada uno de R’ y R” es como se define en el
presente documento y R’” se define como R’ y R” como se definen en el presente documento.
Un grupo “nitro” se refiere a un grupo –NO2.
Un grupo “ciano” se refiere a un grupo -C≡N.
El término “fosfonilo” o “fosfonato” describe un grupo -P(=O)(OR’)(OR”), siendo R’ y R” como se definen
anteriormente en el presente documento.
El término “fosfato” describe un grupo -O-P(=O)(OR’)(OR”), siendo cada uno de R’ y R” como se definen en el
presente documento anteriormente.
Un “ácido fosfórico” es un grupo fosfato en el que cada uno de R es hidrógeno.
El término “fosfinilo” describe un grupo -PR’R”, siendo cada uno de R’ y R” como se definen anteriormente en el
presente documento.
El término “tiourea” describe un grupo -N(R’)-C(=S)-NR”-, siendo cada uno de R’ y R” como se definen anteriormente en el presente documento. Como se describe en el presente documento, las estructuras de proteína multimérica descritas en el presente
documento pueden exhibir una estabilidad mejorada y una actividad α-galactosidasa más fuerte y/o más duradera en sitios terapéuticamente importantes in vivo. Dichas estructuras de proteína multimérica son, por lo tanto, muy beneficiosas para su uso en diversas aplicaciones médicas en las que es deseable la actividad α-galactosidasa, incluyendo aplicaciones terapéuticas y de investigación.
Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento es para su uso como un medicamento, por ejemplo, un medicamento para tratar la enfermedad de Fabry.
De acuerdo con otro aspecto de realizaciones de la invención, se proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Fabry, comprendiendo el método la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad
terapéuticamente eficaz de una estructura de proteína multimérica descrita en el presente documento.
De acuerdo con otro aspecto de las realizaciones de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una estructura de proteína multimérica como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” se refiere a la preparación de una o más de las estructuras de proteína multimérica descritas en el presente documento, con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables y adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En lo sucesivo en el presente documento, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo o a un diluyente que no ocasiona irritación significativa en un organismo y no anula la actividad y propiedades biológicas del compuesto administrado. Son ejemplos, sin limitaciones, de vehículos: propilenglicol, solución salina, emulsiones y mezclas de disolventes orgánicos con agua, así como vehículos sólidos (por ejemplo, en polvo) y gaseosos.
En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un compuesto. Como ejemplos, sin limitación, de excipientes se incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
La composición farmacéutica comprende opcionalmente un ingrediente adicional que también estabiliza la αgalactosidasa de la estructura de proteína multimérica. Opcionalmente, el ingrediente adicional es galactosa.
Como alternativa, puede usarse un derivado de galactosa (por ejemplo, un glucósido que contenga galactosa) en lugar de galactosa. Opcionalmente, se usa un derivado de galactosa no reductor.
Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de fármacos en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden, por lo tanto, formularse de una manera convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares, que facilitan el procesamiento de la estructura de proteína multimérica en las preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración que se seleccione.
Para la inyección o infusión, las estructuras de proteína multimérica de las realizaciones de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico con o sin disolventes orgánicos tales como propilenglicol o polietilenglicol.
Para la administración transmucosa, se usan penetrantes en la formulación. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Para la administración oral, las estructuras de proteína multimérica de la invención pueden formularse combinando fácilmente las estructuras de proteína multimérica con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que las estructuras de proteína multimérica descritas en el presente documento se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares para la ingestión oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral pueden prepararse usando un excipiente sólido, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, y después añadiendo auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de comprimidos o grageas. Como excipientes adecuados se incluyen, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Los núcleos de las grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para esta finalidad, pueden usarse soluciones de azúcar concentrado que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes orgánicos
adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o grageas para ayudar a la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de la estructura de proteína multimérica activa.
Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, las estructuras de proteína multimérica pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la vía de administración seleccionada.
Para la administración bucal, las composiciones pueden estar en formas de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de una manera convencional.
Para la administración por inhalación, las estructuras de proteína multimérica para su uso de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol (que típicamente incluye vehículos en polvo, licuados y/o gaseosos) a partir de un envase presurizado o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo de las estructuras de proteína multimérica y una base en polvo adecuada tal como, pero sin limitación, lactosa o almidón.
Las estructuras de proteína multimérica descritas en el presente documento pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección o infusión pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, opcionalmente, con un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación de estructura de proteína multimérica en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de las estructuras de proteína multimérica pueden prepararse como suspensiones y emulsiones de inyección oleaginosas apropiadas (por ejemplo, emulsiones de agua en aceite, aceite en agua o agua en aceite en aceite). Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados, que aumentan la solubilidad de las estructuras de proteína multimérica para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Como alternativa, las estructuras de proteína multimérica pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril apirógena, antes de su uso.
La estructura de proteína multimérica de las realizaciones de la presente invención también puede formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden comprender excipientes o vehículos sólidos adecuados de fase gel. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitación, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en las cuales los ingredientes activos están incluidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito que se pretende. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de estructuras de proteína multimérica eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se esté tratando.
Para cualquiera de las estructuras de proteína multimérica usadas en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de actividad en animales. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluya la CI50 determinada por ensayos de actividad (por ejemplo, la concentración de las
estructuras de proteína de ensayo que consigue un aumento semi-máximo en una actividad biológica de la estructura de la proteína multimérica). Dicha información puede usarse para determinar de un modo más preciso las dosis útiles en seres humanos.
Como se demuestra en la sección de Ejemplos que se proporciona a continuación, una cantidad terapéuticamente eficaz para las estructuras de proteína multimérica de las realizaciones de la presente invención puede variar entre aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal.
La toxicidad y eficacia terapéutica de las estructuras de proteína multimérica descritas en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en animales experimentales, por ejemplo, determinando la CE50, la CI50 y la DL50 (dosis letal que causa la muerte en el 50 % de los animales ensayados) para una estructura de proteína dada. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de actividad y estudios en animales pueden usarse en la formulación de una serie de dosificaciones para uso en seres humanos.
La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración que se utilice. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden seleccionarse por el médico individual en vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p.1).
La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma del radical activo que son suficientes para mantener los efectos deseados, denominados concentración mínima eficaz (CME). La CME variará en cada preparación, pero puede estimarse a partir de datos in vitro, por ejemplo, la concentración necesaria para conseguir el nivel de actividad deseado in vitro. Las dosificaciones necesarias para conseguir la CME dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Pueden usarse ensayos de HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones plasmáticas.
También pueden determinarse intervalos de dosificación usando el valor de CME. Las preparaciones deben administrarse usando un régimen que mantenga los niveles plasmáticos por encima de la CME durante el 10-90 % del tiempo, preferentemente entre el 30-90 % y más preferentemente entre el 50-90 %.
Dependiendo de la gravedad y de la respuesta de la afección que vaya a tratarse, la dosificación también puede ser una sola administración de una composición de liberación lenta descrita en el presente documento anteriormente, con un ciclo de tratamiento que dura de varios días a varias semanas o hasta que se efectúe la cura o se consiga la disminución de la patología.
La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que vaya a tratarse, de la gravedad de la dolencia, de la forma de administración, del criterio del médico a cargo del tratamiento, etc.
Las composiciones de la presente invención pueden estar presentes, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA (la administración de alimentos y fármacos de Estados Unidos), que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina de metal o plástico, tal como, pero sin limitación, un blíster o un envase presurizado (para inhalación). El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dispensador también puede ir acompañado de un aviso asociado en el recipiente en una forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso y venta de agentes farmacéuticos, reflejando dicho aviso la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones para administración humana o veterinaria. Dicho aviso, por ejemplo, puede ser una etiqueta aprobada por la administración de alimentos y fármacos de Estados Unidos para fármacos de prescripción o un prospecto aprobado. También pueden prepararse composiciones que comprenden una estructura de proteína multimérica de realizaciones de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible, colocarse en un envase apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección o diagnóstico indicado, como se detalla en el presente documento.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización de la presente invención, dependiendo de las estructuras de proteína multimérica seleccionadas, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se envasa en un material de envasado y se identifica en forma impresa en o sobre el material de envasado, para su uso en el tratamiento de una afección en la que es beneficiosa la actividad de la estructura de la proteína multimérica, como se describe anteriormente en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.
Las expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye, pero sin limitación”.
La expresión “consiste en” significa “que incluye y limitado a”.
La palabra “ejemplar” se usa en el presente documento para indicar “que sirve como un ejemplo, caso o ilustración”. Cualquier realización descrita como “ejemplar” no debe considerarse necesariamente preferida o ventajosa sobre otras realizaciones y/o excluir la incorporación de características de otras realizaciones.
La palabra “opcionalmente” se usa en el presente documento para indicar “se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones. Cualquier realización particular de la invención puede incluir una pluralidad de características “opcionales” a menos que esto represente un conflicto.
Como se usa en el presente documento, la forma singular “uno”, “una”, “un” y “el”, “la” incluyen referencias en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo sus mezclas.
A lo largo de esta solicitud, varias realizaciones de la presente invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por comodidad y brevedad y no debe considerarse una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo desvela específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos desvelados específicamente tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Cuando se indica un intervalo numérico en el presente documento, este pretende incluir cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las frases “que varía/varía entre” un primer número indicado y un segundo número indicado y “que varía/varía de” un primer número indicado “a” un segundo número indicado se usan indistintamente en el presente documento y significa que incluyen el primer y segundo números indicados y todos los números fraccionales e integrales entre los mismos.
Como se usa en el presente documento, la expresión “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada incluyendo, pero sin limitación, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos o fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicos y procedimientos conocidos por los expertos en las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
Como se usa en el presente documento, el término “tratar” incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.
Se aprecia que determinadas características de la invención, que por claridad se describen en el contexto de realizaciones distintas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención, que por brevedad se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de estas realizaciones, a menos que la realización sea inoperativa sin estos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se indican en el presente documento anteriormente y como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de una manera no limitante.
Materiales y métodos
Materiales:
Se obtuvo bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG) en Iris Biotech GmbH en formas PEG8 y PEG de
2000 Dalton (PEG45) y en Pierce en forma PEG5, y se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración
de 25 mg/ml;
El ácido cítrico se obtuvo en Sigma;
El Azul de Coomassie G250 se obtuvo en Bio-Rad;
El dimetilsulfóxido se obtuvo en Sigma;
La D-(+)-galactosa se obtuvo en Sigma;
El plasma humano (K3 EDTA) se obtuvo en Bioreclamation Inc.;
La 4-metilumbeliferona se obtuvo en Sigma;
La 4-metilbeliferil-α-D-galactopiranósido se obtuvo en Sigma;
N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida trihexósido (Gb3-NBD) se obtuvo en Matreya;
El ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico se obtuvo en Merck;
La solución salina tamponada con fosfato se obtuvo en Sigma;
El p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido se obtuvo en Sigma;
La primulina se obtuvo en Sigma; el reactivo de pulverizado de primulina se preparó disolviendo 12,5 mg de
primulina en 200 ml de acetona:agua (relación de volumen 8:2);
La piridina se obtuvo en Sigma;
El ácido sinapínico se obtuvo en Sigma;
El carbonato de sodio se obtuvo en Sigma;
El fosfato de sodio se obtuvo en Sigma;
El taurocolato de sodio se obtuvo en Sigma;
El ácido trifluoroacético se obtuvo en Sigma.
α-GAL-I humana recombinante vegetal:
La α-GAL humana recombinante vegetal (prh-α-GAL) que tiene la SEQ ID NO: 1, se refiere en el presente documento a la α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-I), se preparó como se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/IL2008/000576 (publicada como documento WO 2008/132743).
El material vegetal transgénico se generó usando plantas de Nicotiana benthamiana infiltrada con la construcción genética que contenía el casete de expresión para α-GAL-A, para expresar la proteína α-GAL-A humana. Esto se realizó en una cámara de cultivo en condiciones controladas. Después de esto, se recogió el material vegetal y se realizó la extracción de proteínas solubles de las células vegetales. Después, la prh-α-GAL-A se purificó mediante un proceso de purificación que implicaba métodos convencionales para la purificación de proteínas seguido de una etapa de modificación química para fabricar la proteína reticulada. La presente prh-α-GAL-A se extrajo de material vegetal usando homogeneizadores. Los desechos vegetales se retiraron por centrifugación y la proteína se purificó adicionalmente usando etapas de precipitación con sulfato de amonio y de acidificación. El sobrenadante se filtró y se cargó en una columna hidrófoba, seguido de desalinización y carga en una columna de intercambio catiónico. El conjunto de la columna de intercambio catiónico se concentró.
α-GAL-II humana recombinante vegetal:
La α-GAL humana recombinante vegetal que comprende una mezcla de α-GAL que tiene la SEQ ID NO: 2 y α-GAL que tiene la SEQ ID NO: 3 (sin los aminoácidos EF N-terminales presentes en la SEQ ID NO: 1), denominada en el presente documento prh-α-GAL-II, se preparó mediante un proceso similar al descrito anteriormente para prh-α-GAL-I, usando una construcción genética diferente.
El ADNc que codifica la proteína α-galactosidasa humana (EC 3.2.1-22 GenBank: X05790) se optimizó y se sintetizó en GENEART AG (Regensburg, Alemania). El uso de codones sin el péptido líder (péptido señal que se dirige al retículo endoplasmático) se adaptó al sesgo de codones de los genes de Nicotiana tabaccum. Durante el proceso de optimización se evitaron los siguientes motivos de secuencia que actúan en cis: cajas internas TATA, sitios chi y sitios de entrada al ribosoma, tramos de secuencias ricos en AT o ricos en GC, elementos de inestabilidad de ARN (“motivos killer”), secuencias de repetición y estructuras secundarias de ARN, sitios donantes (crípticos) y aceptores de corte y empalme y puntos de ramificación. Además, se evitaron regiones de muy alto (> 80 %) o muy bajo (<30 %) contenido de GC.
La secuencia de nucleótidos del péptido líder de α-galactosidasa humana nativa (péptido señal que se dirige al retículo endoplasmático) de la proteína α-galactosidasa humana de longitud completa (GenBank: X05790) se reemplazó por una secuencia de nucleótidos que codificaba el péptido señal que se dirige al retículo endoplasmático (péptido líder) de 33 aminoácidos de la proteína ABPI de Arabidopsis. Este péptido señal proporciona un direccionamiento eficaz de la α-galactosidasa a la ruta secretora y se escinde del polipéptido por la peptidasa señal, una vez que la proteína se ha translocado al interior del retículo endoplasmático. Se añadió una secuencia de nucleótidos que codifica la señal de retención del retículo endoplasmático SEKDEL a la secuencia de ADNc en el extremo 3’, lo que permitió la recuperación de la proteína expresada del aparato de Golgi, manteniendo de un modo eficaz la proteína en el retículo endoplasmático.
La proteína de interés se expresó a partir de un promotor de virus subgenómico fuerte de la proteína de recubrimiento. El sistema se basa en la amplificación transitoria (por agroinfección) de vectores de virus suministrados a una planta por Agrobacterium. En la agroinfección, un promotor funcional de planta y el ADNc que codifica un replicón de virus se transfieren como ADN-T desde Agrobacterium al interior de células vegetales. El ADN-T se transcribe en la planta por el promotor de plantas para generar ARN de virus biológicamente activo que inicia la autorreplicación.
Para la expresión transitoria se usó un sistema de recombinación de 3 vectores basado en el sistema previamente desarrollado como se describe [Gleba et al., Vaccine 2005, 23: 2042-2048]. En uno de los vectores se insertó ADNc de α-galactosidasa y los otros dos vectores contenían los genes para la construcción de todo el replicón de virus (RdRp e Integrasa), generándose de esta manera el ARN vírico biológicamente activo que puede iniciar la autorreplicación.
Las plantas de N. benthamiana se dejaron germinar y se cultivaron en un sustrato mixto comercial (Givaat Ada, IL) complementado con fertilizante de liberación lenta granular (Scott Marysville, OH) en un régimen de luz de un día de duración (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) a 24-25 ºC.
Las agrobacterias se transformaron con el sistema del vector replicón basado en pICH20866-alfa-GAL usando electroporación (2500 V, 5 milisegundos) [den Dulk-Ra y Hooykaas, Methods Mol Biol 1995, 55: 63-72]. Las plantas se infiltraron con Agrobacterias que contenían los 3 plásmidos ICON por infiltración al vacío con métodos convencionales conocidos en la técnica. En resumen, plantas de N. benthamiana, de 5-6 semanas de edad, se infiltraron sumergiendo todos los órganos aéreos de la planta en una suspensión bacteriana y se colocaron en una cámara de vacío. Se aplicó un vacío de menos (-) 0,8 bares durante 1 minuto, seguido de un rápido retorno a presión atmosférica. Las plantas volvieron a llevarse al invernadero durante 5-7 días más en las mismas condiciones de cultivo.
Se recogieron muestras de hojas de Nicotiana benthamiana 5 días después de la infiltración y se extrajeron en tampón de Laemmli para SDS-PAGE, o en tampón de ensayo de actividad (ácido cítrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, albúmina de suero bovino al 0,1 % y etanol al 0,67 %, pH 4,6) para ensayar la actividad catalítica de la proteína expresada en la planta.
La proteína α-galactosidasa humana de extractos vegetales se purificó mediante una precipitación diferencial de sulfato de amonio de dos etapas (“precipitación con sal” (“salting out”): 1ª etapa 0,57 M, 2ª etapa 2,27 M), seguido por cromatografía de interacción hidrófoba (resina Phenil 650 M) y cromatografía de intercambio catiónico.
Se obtuvieron dos secuencias (es decir, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3), que diferían en la presencia o ausencia de una glicina N terminal, debido a un procesamiento diferente de la secuencia líder.
Ensayo con 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido de actividad α-GAL:
La actividad α-GAL se midió usando 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido como sustrato de hidrólisis. El ensayo se realizó en tampón citrato-fosfato (ácido cítrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, pH 4,6). Se incubaron 10 μl de una muestra que contenía la α-GAL ensayada con 40 μl de tampón de ensayo que contenía 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranósido 5 mM. La mezcla de reacción se incubó a 37 ºC durante 60 minutos. Se transfirieron 10 μl de la mezcla de reacción a una placa negra de 96 pocillos (Greiner), se añadieron 90 μl de solución de detención (carbonato de sodio 2 M) y se midió la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. La fluorescencia se tradujo a concentración de producto, y adicionalmente a actividad, usando una curva de calibrado de 4-metilumbeliferona, el producto de reacción.
Ensayo con trihexósido de N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida (Gb3-NBD) de actividad α-GAL
El sustrato marcado con fluorescencia trihexósido de N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida (Gb3-NBD) es menos lipófilo que Gb3, lo que facilita su uso en reacciones enzimáticas in vitro.
Se añadieron 10 μl de Gb3-NBD 0,1 μg/μl (en agua con etanol al 10 %) y 5 μl de α-GAL 0,2 mg/ml se añadieron a 85 μl de tampón citrato-fosfato a un pH de 4,6. La concentración final de α-GAL fue de 10 μg/ml. La reacción de fondo o no catalizada, sin α-GAL, se componía de 90 μl de tampón citrato-fosfato a un pH de 4,6 con 10 μl de Gb3-NBD 0,1 μg/μl (en agua con etanol al 10 %). Las mezclas de reacción se incubaron durante 60 minutos a 37 ºC. Después de la incubación, se añadieron 50 μl de metanol a la mezcla de reacción y las soluciones se agitaron vorticialmente durante 1 minuto. Después se añadieron 100 μl de cloroformo y las soluciones volvieron a agitarse vorticialmente durante 1 minuto. El agua y los disolventes orgánicos se retiraron al vacío usando un sistema Speed Vac. Los residuos se disolvieron en 80 μl de cloroformo:metanol (1:1). Se cargaron 30 μl de cada muestra en 60 placas de Gel de Sílice HPTLC (cromatografía de capa fina de alto rendimiento) (Merck) usando un sistema Linomat V (CAMAG). Las placas de HPTLC se revelaron usando una solución de cloroformo:metanol:H2O a una relación de 100:42:6 como un sistema disolvente. Después, las placas se dejaron secar y el sustrato y las manchas de producto se visualizaron por irradiación con luz UV a una longitud de onda de 365 nm.
Ensayo con p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido (p-NP-G) de actividad α-GAL:
Se usó p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido como un sustrato de hidrólisis para ensayos de actividad α-GAL. El tampón de ensayo contenía ácido cítrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, BSA (albúmina de suero bovino) al 0,1 % y etanol al 0,67 % a pH 4,6. El ensayo se realizó en placas ELISA de 96 pocillos (Greiner). Se incubaron 50 μl de muestra con 150 μl de tampón de ensayo y se añadieron 30 μl de sustrato para obtener una concentración final de p
nitrofenil-α-D-galactopiranósido 8 mM. La mezcla de reacción se incubó a 37 ºC durante 90 minutos. Después de 90 minutos, se añadieron 100 μl de carbonato de sodio 1,98 M a cada pocillo para finalizar la reacción. La cantidad de producto de reacción se determinó midiendo la absorbancia a 405 nm.
Medición de la estabilidad de α-GAL in vitro:
La estabilidad de α-GAL de diversas fuentes se determinó añadiendo α-GAL a una de las siguientes condiciones:
1) condiciones lisosómicas simuladas: tampón citrato-fosfato (ácido cítrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM), pH
4,6, 37 ºC;
2) condiciones fisiológicas simuladas: solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, 37 ºC;
3) plasma humano a 37 ºC.
Se añadió α-GAL a una concentración de 1 μg/ml, según se determina por la actividad de α-GAL en la solución, y la solución se incubó a 37 ºC. Se extrajeron muestras de cada solución a puntos de tiempo predeterminados y la actividad α-GAL se midió como se ha descrito anteriormente en el presente documento. El valor de la actividad enzimática inmediatamente después de la adición de α-GAL ensayada a cada entorno se definió como 100 %, y los resultados de actividad adicionales en los puntos de tiempo ensayados se calcularon como porcentaje de esa actividad inicial.
Farmacocinética de α-GAL:
Se colocaron ratones con enfermedad de Fabry individuales (α-Gal-A-/0) en un dispositivo de retención de plexiglás iluminado y se inyectó la enzima en la vena de la cola. Se obtuvieron muestras de sangre en los tiempos indicados después de la inyección mediante sangrado de la cola o sangrado ocular retroorbital, usando tubos de microhematocrito heparinizados. El plasma se diluyó en tampón de actividad 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranósido. Se realizó un ensayo de 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido como se ha descrito anteriormente.
Se calculó la semivida de eliminación terminal (T1/2) en función de los resultados de la actividad en plasma. La semivida terminal (semivida de eliminación) es el tiempo necesario para que la concentración de plasma disminuya en un 50 % después de haber alcanzado el pseudo-equilibrio de distribución. La semivida terminal se calculó a partir de la porción terminal (logaritmo lineal) de la curva, mediante regresión lineal del tiempo frente a la concentración log [Toutain y Bousquet-Melou, J Vet Pharmacol Ther 2004, 27: 427-39].
Biodistribución de α-GAL:
Ratones con la enfermedad de Fabry (α-Gal-A-/0) recibieron una inyección intravenosa (en la vena de la cola) de α-GAL a una dosis de 2 mg/kg. Se recogieron los tejidos (hígados, riñones, corazones y bazos) 2 horas, 24 horas, 3 días, 7 días, 14 días o 28 días después de la inyección de la enzima. Los niveles de α-GAL en ratones de control normales y en ratones con enfermedad de Fabry a los que se administró solución salina (no tratados) se compararon con los niveles en ratones con enfermedad de Fabry que recibieron α-GAL exógena. Para determinar la actividad α-GAL en tejidos, se colocaron muestras de tejido descongelado en tubos de polipropileno de 2 ml que contenían tampón de lisis (ácido cítrico 28 mM, fosfato sódico dibásico 44 mM, taurocolato de sodio 0,5 %, pH 4,4) como se describe en Oshima et al. [PNAS 1997, 94: 2540-2544]. Las muestras se homogeneizaron usando un Tissuelyzer (Retsch MM400) durante 10 minutos. Los residuos se sedimentaron por centrifugación a 4 ºC y los sobrenadantes resultantes se sometieron a ensayo con respecto a la actividad de α-GAL mediante un ensayo con 4-metilumbeliferilα-D-galactopiranósido, como se ha descrito anteriormente. Estas mismas muestras también se sometieron a análisis de transferencia de Western.
Ensayo in vivo con Gb3:
El criterio de valoración de eficacia de la α-GAL inyectada se midió por ensayo de los niveles de Gb3 de los tejidos animales, para determinar si los niveles de Gb3 habían disminuido por la actividad α-GAL.
Para medir la hidrólisis de Gb3, se extrajeron glicoesfingolípidos neutros de órganos diana (por ejemplo, hígado, riñón, corazón y bazo). Se homogeneizaron muestras de tejido de 100 mg en 1 ml de cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y se centrifugaron durante 20 minutos a 13.500 rpm. Se añadieron 62 μl de agua a un homogeneizado de 1 ml para dar una solución de cloroformo:metanol:agua de 20:10:2. Se añadieron 10 μl de piridina al homogeneizado para dar una concentración final de piridina de 1 %. La muestra se agitó durante 24 horas a 48 ºC. Los disolventes y el agua se retiraron al vacío usando un sistema SpeedVac. La muestra se resuspendió en 2,5 ml de metanol y después se añadieron 250 μl de KOH 1 M en metanol. Después, la mezcla se agitó durante 2 horas a 37 ºC. La reacción de saponificación se detuvo por la adición de 10 μl de ácido acético. Después se añadieron 2,5 ml de cloroformo a la muestra, seguido por la adición de 2,5 ml de agua fría. La muestra se agitó intensamente durante 5 minutos y se dejó reposar durante 5 minutos para permitir la separación de fases. La fase superior, compuesta de metanol y agua, se descartó, y la fase inferior, compuesta de cloroformo y metanol, se evaporó al vacío (SpeedVac), y el
residuo se resuspendió en 300 μl de cloroformo:metanol 1:1 (v/v) para el análisis de los glucoesfingolípidos por HPTLC.
Se realizaron análisis cualitativos y semicuantitativos de glucolípidos tisulares por cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) (CAMAG, Suiza). El análisis de HPTLC se realizó en 60 placas recubiertas de vidrio con gel de sílice HPTLC (Merck). Las muestras se cargaron en las placas usando un sistema Linomat 5 (CAMAG, Suiza). Las placas se revelaron usando cloroformo-metanol-agua (60:35:4) como sistema disolvente. Los glucoesfingolípidos neutros se detectaron con reactivo de pulverización de primulina. Se identificó Gb3 usando Gb3 de eritrocito porcino (Matreya) como patrón, y se cuantificó usando una curva de calibración de trihexósido de N-heptadecanoil ceramida (Matreya), un patrón semisintético. Las placas se visualizaron y las manchas relevantes se cuantificaron usando un Scanner III TLC (CAMAG, Suiza) soportado por el programa informático winCATS (CAMAG, Suiza).
SDS-PAGE:
Se realizó SDS-PAGE en condiciones reductoras usando un sistema Bio-Rad Criterion™ y gel de acrilamida al 12 % diseñado internamente. El gel se tiñó con tinción Azul de Coomassie G250.
IEF (isoelectroenfoque):
Se realizó IEF usando mini-cell Novex® de Invitrogen y geles IEF previamente diseñados que tenían un intervalo de pH de 3-7 (Invitrogen). El gel se tiñó con Azul de Coomassie G250.
Espectrometría de masas (MALDI-TOF):
Se realizó MALDI-TOF usando un sistema de espectrómetro de masas MALDI-ToF Bruker Reflex IV (Bruker-Franzen Analytik GmbH, Alemania) y una solución matriz saturada con ácido sinapínico/ácido trifluoroacético (TFA) (TFA/acetonitrilo al 0,1 % (2:1, v/v)).
Ejemplo I
Estabilidad in vitro de α-GAL recombinante
Se midió la estabilidad in vitro de α-GAL recombinante en diversas afecciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento en la Sección de Materiales y Métodos. Se ensayaron la α-GAL-I humana recombinante vegetal, así como la α-GAL humana recombinante comercial Fabrazyme® y Replagal®.
Como se muestra en la Figura 1, todos los tipos ensayados de α-GAL exhibieron una pérdida de actividad en condiciones lisosómicas simuladas.
Además, como se muestra en la Figura 2, todos los tipos ensayados de α-GAL exhibieron una pérdida de actividad en condiciones fisiológicas simuladas. Como se muestra en el presente documento adicionalmente, la presencia de galactosa 100 mg/ml protegió parcialmente la actividad de α-GAL-I recombinante vegetal en dichas condiciones.
De manera similar, como se muestra en la Figura 3, todos los tipos ensayados de α-GAL exhibieron una pérdida de actividad en plasma humano a 37 ºC.
Como se muestra en la Figura 4, la presencia de 100 mg/ml de galactosa protegió parcialmente la actividad de α-GAL-I recombinante vegetal en condiciones lisosómicas simuladas.
Los experimentos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) a niveles de pH lisosómicos y neutros demostraron cambios en la estructura de la proteína (datos no mostrados), mientras que análisis SDS-PAGE y transferencia de Western no exhibieron ninguna degradación de la secuencia de aminoácidos primaria (datos no mostrados).
Estos resultados indican que α-GAL pierde actividad en condiciones lisosómicas y condiciones fisiológicas debido a la alteración de la estructura de la proteína α-GAL, y que la galactosa impide parcialmente esta pérdida de actividad.
Ejemplo II
Reticulación de α-GAL-I humana recombinante vegetal con agentes de bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG)
La α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-I) se reticuló a proporciones molares de 50:1, 100:1 y 200:1 con bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG) de diversos pesos moleculares, concretamente bis-NHS-PEG5, bis-NHS-PEG8 o bis-NHS-PEG45 (bis-NHS-PEG con PEG de 2.000 Dalton), cuyas estructuras se muestran en la Figura 5.
El bis-NHS-PEG puede unirse a la proteína en dos sitios en una proteína (por ejemplo, restos de lisina), formando de este modo la reticulación, o en un sitio en una proteína. En la Figura 6 se representan estas dos formas de unión.
Se añadieron 100 μg de α-GAL-I en 28,5 μl de tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) (25 mM, pH 6) a 13,5 μl de tampón fosfato (100 mM, pH 8) que contenía galactosa 100 mg/ml.
Se reticuló α-GAL-I con bis-NHS-PEG5 a proporciones molares de reactivo:proteína 1:50, 1:100 y 1:200, añadiendo bis-NHS-PEG5 en 8 μl de DMSO a la solución de α-GAL-I (27,4 μg de solución α-GAL-I para una proporción molar de 1:50, 54,8 μg de solución de α-GAL-I para una proporción molar de 1:100 y 109,7 μg de solución de α-GAL-I para una proporción molar de 1:200).
La α-GAL-I se reticuló con bis-NHS-PEG45 a proporciones molares de proteína:reactivo de 1:50, 1:100 y 1:200 añadiendo bis-NHS-PEG45 en 8 μl de DMSO a la solución de α-GAL-I (103 μg de solución de α-GAL-I para una proporción molar 1:50, 206 μg de solución de α-GAL-1 para una proporción molar de 1:100 y 412 μg de solución de α-GAL-I para una proporción molar de 1:200). La α-GAL-I se reticuló con bis-NHS-PEG8 a proporciones molares de proteína:reactivo de 1:50, 1:100 y 1:200, añadiendo bis-NHS-PEG8 en 11,5 μl de DMSO a la solución de α-GAL-I (37 μg de α-GAL-I para una proporción molar de 1:50, 73 μg de solución de α-GAL-1 para una proporción molar de
1:100 y 146 μg de solución de α-GAL-I para una proporción molar de 1:200).
Después de añadir el agente bis-NHS-PEG a la α-GAL-I, las reacciones se pipetearon y agitaron en un agitador orbital durante 2 horas a temperatura ambiente.
En todas las reacciones, el exceso de reactivo de reticulación bis-NHS-PEG se retiró por diálisis frente a solución salina (límite de 50 KDa).
La producción de dímero aumentó con el aumento de la concentración de proteína y concentración de DMSO, alcanzando hasta un 30 %.
Los productos de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), IEF (isoelectroenfoque), transferencia de Western y espectrometría de masas MALDI-TOF, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Como se muestra en la Figura 7, se observó la prh-α-GAL-I nativa patrón como un monómero (que tenía un peso molecular de 48 KDa) después de la electroforesis en gel, mientras que después de la reacción de prh-α-GAL-I con bis-NHS-PEG, la prh-α-GAL-I apareció principalmente en forma de un dímero (con algo de monómero presente), indicando que los dos monómeros estaban ligados de manera covalente mediante reticulación con bis-NHS-PEG.
Como también se muestra en la Figura 7, se observó una mayor proporción de prh-α-GAL-I monomérica con los agentes de reticulación más cortos, bis-NHS-PEG5 y bis-NHS-PEG8, que con el agente de reticulación más largo bis-NHS-PEG45. El bis-NHS-PEG45 produjo una proporción más alta de proteína reticulada. Estos resultados indican que los agentes de reticulación más cortos son menos eficaces para unir covalentemente los monómeros.
Como también se muestra en la Figura 7, para cada uno de los agentes de reticulación ensayados, el peso molecular de la parte monomérica de prh-α-GAL-I aumentó después de la reacción con el agente de reticulación. El aumento en el peso molecular fue mayor cuando se usó una mayor proporción de agente de reticulación con respecto a proteína (por ejemplo, 200:1), y cuando el peso molecular del agente de reticulación fue mayor (por ejemplo, bis-NHS-PEG45). Estos resultados indican que los monómeros de proteína que no dimerizaron por reticulación, estaban unidos de manera covalente con el agente de reticulación bis-NHS-PEG, es decir las proteínas estaban PEGiladas.
Los resultados anteriores indican que el uso de un mayor exceso molar de agente de reticulación con respecto a proteína produce niveles más altos de modificación de α-GAL, incluyendo tanto la reticulación para formar un dímero como la PEGilación de las proteínas. Sin embargo, una proporción molar de 100:1 proporcionó un alto nivel de reticulación, especialmente en las reacciones que utilizaban el reactivo bis-NHS-PEG45, de tal manera que una proporción molar de 200:1 proporcionó únicamente una adición marginal a la eficacia del agente de reticulación.
Como se muestra en la Figura 8, la reacción de prh-α-GAL-1 con bis-NHS-PEG redujo el punto isoeléctrico (pI) de prh-α-GAL-I, confirmando por lo tanto que el bis-NHS-PEG está unido covalentemente a la prh-α-GAL-I. La unión de bis-NHS-PEG con prh-α-GAL-I convierte los grupos amina básicos de restos de lisina en grupos amida neutros, reduciendo de este modo el pI. La reducción del pI era más pronunciada cuando se usaba un exceso molar más alto (por ejemplo, 200:1) de bis-NHS-PEG, confirmando los resultados anteriores obtenidos por SDS-PAGE.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 8, el pI se redujo más con bis-NHS-PEG5 y bis-NHS-PEG8 que con bis-NHS-PEG45.
Este resultado indica que bis-NHS-PEG5 y bis-NHS-PEG8 tienen más probabilidad que bis-NHS-PEG45 de producir una PEGilación en la que solo un extremo del agente de reticulación esté unido a α-GAL. Un agente de reticulación unido a α-GAL en un solo extremo es más eficaz para reducir el pI porque dicho agente de reticulación comprende un grupo de ácido carboxílico (-CO2H) en el extremo no unido, además de convertir un grupo amino de lisina en un
5 grupo amida en el extremo unido.
Como se muestra en la Figura 9, la reacción de prh-α-GAL-I con el agente de reticulación bis-NHS-PEG45 aumentó el peso molecular del dímero de prh-α-GAL-I de 97 KDa a 113 KDa, determinado por espectrometría de masas MALDI-TOF. El aumento en el peso molecular indica una adición de aproximadamente 8 moléculas de bis-NHS
10 PEG45 en el dímero de prh-α-GAL-I.
Como se muestra en la Figura 10, la reacción de prh-α-GAL-I con el agente de reticulación bis-NHS-PEG8 aumentó el peso molecular del dímero de prh-α-GAL-I de 97 KDa a 104 KDa, determinado por espectrometría de masas MALDI-TOF. El aumento en el peso molecular indica una adición de aproximadamente 10 moléculas de bis-NHS
15 PEG8 en el dímero de prh-α-GAL-I.
Ejemplo III
Actividad de α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
20 Para determinar si la α-GAL-I recombinante vegetal (prh-α-GAL-I) reticulada descrita en el Ejemplo II conservaba la actividad enzimática, la prh-α-GAL-I reticulada se sometió a ensayo para determinar su actividad enzimática usando el ensayo de 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido descrito anteriormente.
25 Como se muestra en la siguiente Tabla 1, prh-α-GAL-I que reaccionó con el reactivo bis-NHS-PEG, bis-NHS-PEG5, bis-NHS-PEG8 o bis-NHS-PEG45 a un exceso molar de 50:1, 100:1 y 200:1, en todos los casos mostró un nivel de actividad enzimática similar al de la prh-α-GAL-I nativa. Como se muestra en el presente documento, en algunos casos se observaron disminuciones moderadas y aumentos moderados en la actividad, lo cual puede ser el resultado de efectos de formulación. Estos resultados indican que la reticulación no reducía la actividad de prh-α
Tabla 1: resultados de actividad de α-GAL I humana recombinante vegetal reticulada
- Muestra
- Reactivo Exceso molar Actividad mg/ml
- patrón
- - - 2
- 1
- Bis-NHS-PEG5 50:1 2,25
- 2
- Bis-NHS-PEG5 100:1 1,30
- 3
- Bis-NHS-PEG5 200:1 1,24
- 4
- Bis-NHS-PEG45 50:1 2,82
- 5
- Bis-NHS-PEG45 100:1 2,76
- 6
- Bis-NHS-PEG45 200:1 3,48
- 7
- Bis-NHS-PEG8 50:1 2,18
- 8
- Bis-NHS-PEG8 100:1 2,43
- 9
- Bis-NHS-PEG8 200:1 1,82
La actividad de la prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 se verificó adicionalmente usando el ensayo de
35 trihexósido de N-dodecanoil-NBD-ceramida descrito en el presente documento anteriormente, que ensaya la actividad de α-GAL hacia su sustrato natural, trihexósido de ceramida (Gb3). La α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® se ensayó con fines comparativos.
Como se muestra en la Figura 11, después de la incubación de la α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
40 con el sustrato fluorescente, casi todo el sustrato se transformó en el producto, N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazollactosil ceramida, de forma similar a la reacción catalizada por la α-GAL recombinante de mamífero (Replagal®). Este resultado confirma que la reticulación no alteraba la eficacia hidrolítica enzimática de la prh-α-GAL-I, usando un análogo próximo del sustrato natural.
Ejemplo IV
Estabilidad in vitro de la α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
5 La estabilidad in vitro de la α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-I) reticulada, obtenida como se describe en el Ejemplo II, se midió a diversas concentraciones como se describe en el presente documento anteriormente en la Sección de Materiales y Métodos. La estabilidad de las α-GAL humanas recombinantes comerciales Fabrazyme® y Replagal® se midió con fines comparativos.
10 Como se muestra en las Figuras 12A-12C, la estabilidad de la α-GAL-I humana recombinante vegetal en condiciones lisosómicas simuladas se potenció reticulando con bis-NHS-PEG5 (Figura 12A), bis-NHS-PEG8 (Figura 12B) y bis-NHS-PEG45 (Figura 12C). Como también se muestra en el presente documento, la estabilidad de la prh-α-GAL-I reticulada durante el transcurso de una semana se comparaba favorablemente con la estabilidad de la α-GAL humana recombinante comercial. Después de una pequeña disminución en la actividad residual durante las primeras
15 24 horas, la prh-α-GAL-I reticulada mantuvo la actividad, incluso después de 10 días. La disminución inicial en la actividad, observada durante las 24 primeras horas, puede reflejar la parte de α-GAL-I humana recombinante vegetal que no experimentaba reticulación.
Como se muestra adicionalmente en las Figuras 12A-12C, prh-α-GAL-I reticulada por bis-NHS-PEG45 mostró la 20 mayor estabilidad en condiciones lisosómicas simuladas.
La estabilidad de la α-GAL-I humana recombinante vegetal en plasma humano a 37 ºC también se potenció reticulando con bis-NHS-PEG45 (datos no mostrados).
25 Estos resultados indican que la reticulación de α-GAL como se describe en el presente documento puede aumentar la eficacia de α-GAL in vivo aumentando la estabilidad de α-GAL en los lisosomas, permitiéndose de este modo que la α-GAL actúe durante un período de tiempo más prolongado en los lisosomas, y aumentando la estabilidad de la α-GAL en la sangre, aumentando de este modo la semivida en circulación de α-GAL.
30 Ejemplo V
Farmacocinética in vivo y biodistribución de α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
La farmacocinética y biodistribución de la α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-I) reticulada con bis
35 NHS-PEG45 o bis-NHS-PEG8 como se describe en el Ejemplo II se determinó en ratones con la enfermedad de Fabry a los que se inyectaron 2 mg/kg de α-GAL, como se describe en el presente documento anteriormente en la Sección de Materiales y Métodos. La farmacocinética y biodistribución de la α-GAL-I humana recombinante vegetal no reticulada y la α-GAL humana recombinante Replagal® se determinó con fines comparativos. Se recogieron muestras de sangre para análisis farmacocinético 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 60 y 120 minutos después de la inyección.
40 Para cada tipo de α-GAL, el grupo de tratamiento consistió en seis ratones.
Como se muestra en la Tabla 2 presentada a continuación, la prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8 y con bis-NHS-PEG45 aumentó la semivida terminal en circulación de la α-GAL-I humana recombinante vegetal, exhibiendo la última un efecto más pronunciado.
45 Tabla 2: semividas terminales en circulación de la α-GAL recombinante
- Muestra de α-GAL
- t1/2 (minutos)
- α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal®
- 8,1
- α-GAL-I humana recombinante vegetal
- 4,8
- α-GAL I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8
- 6,2
- α-GAL I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45
- 90
Como se muestra en la Figura 13 y en la Tabla 2, la semivida terminal de prh α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 era considerablemente mayor que la semivida terminal de α-GAL Replagal®.
50 Como se muestra adicionalmente en la Figura 13, la actividad de α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 al cabo de 20 minutos fue de aproximadamente 40 % de la actividad a 1 minuto. Adicionalmente, la prh-α-GAL-I reticulada mostró una presencia activa en plasma incluso 4 horas después de la inyección.
55 Estos resultados indican que la prh-α-GAL-I reticulada permanece activa in vivo durante un tiempo relativamente prolongado, lo que permite que la enzima alcance tejidos y órganos adicionales.
Como se muestra en las Figuras 14A y 14B, los niveles de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de inyección fue considerablemente mayor que los de la α-GAL-I recombinante vegetal no reticulada, así como los de la α-GAL recombinante de mamífero Replagal®. Como adicionalmente se muestra en el presente documento, los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 eran mayores que los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8. Los análisis de transferencia de Western (Figura 14B) son coherentes con los resultados de biodistribución obtenidos mediante el ensayo de la actividad enzimática α-GAL (Figura 14A).
Como se muestra en las Figuras 15A y 15B, los niveles de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los hígados de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección eran considerablemente más altos que los de α-GAL-I recombinante vegetal no reticulada, pero menores que los niveles de α-GAL recombinante de mamífero Replagal® en el hígado. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 eran ligeramente mayores que los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8. Los análisis de transferencia de Western (Figura 15B) son coherentes con los resultados de biodistribución obtenidos ensayando la actividad enzimática de α-GAL (Figura 15A).
Pueden ser terapéuticamente ventajosos niveles más bajos de α-GAL en el hígado, ya que aproximadamente el 95 % de la enzima recuperada en la terapia de reemplazo enzimático se encuentra típicamente en el hígado, y por lo tanto altos niveles de recombinación de α-GAL en el hígado indican niveles más bajos de α-GAL exógena en órganos diana tales como corazón y riñones.
Como se muestra en la Figura 16, los niveles de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los corazones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección eran mayores que los de la α-GAL-I recombinante vegetal no reticulada. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 fueron mayores que los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8, así como los niveles de la α-GAL recombinante de mamífero Replagal®.
Como se muestra en la Figura 17, los niveles de la α-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los riñones de ratones con enfermedad de Fabry 2 horas después de la inyección, eran mayores que los niveles de la α-GAL-I recombinante vegetal no reticulada. Como adicionalmente se muestra en el presente documento, los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 fueron mayores que los niveles de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8, así como los niveles de α-GAL recombinante de mamífero Replagal®.
De manera similar, como se muestra en las Figuras 18-21, los niveles de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 eran mayores que los niveles de la α-GAL-I recombinante vegetal no reticulada en el bazo (Figura 18), hígado (Figura 19), corazón (Figura 20) y riñones (Figura 21) de ratones con enfermedad de Fabry, durante hasta 7 días después de la inyección. Como adicionalmente se muestra en el presente documento, los niveles de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 eran mayores que los niveles de la α-GAL recombinante de mamífero Replagal® en el bazo, corazón y riñones.
Estos resultados indican que α-GAL reticulada con bis-NHS-PEG, particularmente bis-NHS-PEG45, exhibe una captación potenciada en órganos, incluyendo riñones y corazón, que son órganos diana principales en el tratamiento del trastorno de Fabry. Estos resultados coinciden con una semivida en circulación aumentada y una estabilidad aumentada de la α-GAL reticulada.
Ejemplo VI
Reticulación de α-GAL humana recombinante de mamífero con bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG)
Para confirmar los efectos ventajosos de la reticulación descrita en el presente documento anteriormente, se reticuló la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal®, que se produce en la línea de fibrosarcoma humana HT1080.
Se añadieron 333 μl de tampón fosfato (100 mM, pH 8) con D-(+)-galactosa 100 mg/ml a 3,8 mg de bis-NHS-PEG45 en 151 μl de solución de DMSO (25 mg/ml) y 1,8 mg de α-GAL humana recombinante Replagal® en 130 μl de tampón citrato (25 mM, pH 6). La concentración de α-GAL Replagal® se determinó mediante un ensayo de actividad. La mezcla de reacción se agitó usando un agitador orbital durante 2 horas a temperatura ambiente. El exceso de reactivo de reticulación bis-NHS-PEG45 se retiró por diálisis frente a solución salina usando un concentrador Vivaspin 6 con un límite de 50 KDa. La actividad α-GAL de la α-GAL Replagal® reticulada indicó que la concentración de α-GAL era de 3 mg/ml.
Los productos de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), IEF (isoelectroenfoque) y espectrometría de masas MALDI-TOF, como se ha descrito en el presente documento anteriormente.
Como se muestra en la Figura 22, la α-GAL Replagal® nativa patrón se observó como un monómero después de electroforesis en gel, mientras que después de la reacción de α-GAL Replagal® con bis-NHS-PEG45, la α-GAL apareció en forma de un dímero, lo que indicaba que los dos monómeros estaban ligados covalentemente por reticulación con bis-NHS-PEG.
Como se muestra en la Figura 23, la reacción de α-GAL Replagal® con bis-NHS-PEG45 redujo el punto isoeléctrico (pI) de α-GAL, confirmando de este modo que bis-NHS-PEG está unido covalentemente a la α-GAL.
Como se muestra en la Figura 24, la reacción de α-GAL Replagal® con el agente de reticulación bis-NHS-PEG45 aumentó el peso molecular del dímero de α-GAL Replagal® de 103,0 KDa a 121,3 KDa, determinado por espectrometría de masas MALDI-TOF. El aumento del peso molecular indica una adición de aproximadamente 9-10 moléculas de bis-NHS-PEG45 al dímero α-GAL, que es similar a los resultados descritos anteriormente en el presente documento para prh-α-GAL-I.
Ejemplo VII
Actividad de α-GAL humana recombinante de mamífero reticulada
Para determinar si la reticulación de α-GAL recombinante de mamífero descrita en el Ejemplo VI afectaba a la actividad enzimática, la α-GAL reticulada se ensayó con respecto a su actividad enzimática usando un ensayo de pnitrofenil-α-D-galactopiranósido (PNP-G), de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en el presente documento.
Como se muestra en la Figura 25 y en la Tabla 3 mostrada a continuación, la α-GAL humana recombinante de mamífero que se reticuló con bis-NHS-PEG45 exhibió parámetros de actividad enzimática que eran muy similares a los de la α-GAL humana recombinante de mamífero nativa. Estos resultados indican que la reticulación no afectaba significativamente a la actividad o a la maquinaria catalítica y mecanismo de la α-GAL humana recombinante de mamífero.
Tabla 3: resultados de actividad de la α-GAL humana recombinante de mamífero reticulada
- Muestra
- KM (μM) Vmáx (μM/minuto) kcat (segundo-1) kcat/KM (segundo-1*μM-1)
- α-GAL Replagal®
- 3212±98 4,20±0,05 67,2±1 0,0209±0,001
- α-GAL Replagal® reticulada
- 3419±162 4,43±0,07 70,9±1 0,0210±0,001
Ejemplo VIII
Estabilidad in vitro de la α-GAL humana recombinante de mamífero reticulada
La estabilidad in vitro de la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® reticulada, obtenida como se describe en el Ejemplo VI, se midió en diversas condiciones como se describe anteriormente en el presente documento en la Sección de Materiales y Métodos. La estabilidad de α-GAL Replagal® no reticulada se midió con fines comparativos, para evaluar el efecto de la reticulación.
Como se muestra en las Figuras 26A y 26B, la estabilidad de α-GAL humana recombinante de mamífero en condiciones lisosómicas simuladas (Figura 26A) y en plasma humano (Figura 26B) se potenció considerablemente por reticulación con bis-NHS-PEG45. La α-GAL humana recombinante de mamífero reticulada exhibió una mayor estabilidad en condiciones lisosómicas estimuladas que en plasma.
Estos resultados indican que la reticulación de α-GAL como se describe en el presente documento puede estabilizar la α-GAL recombinante de múltiples fuentes y plataformas de expresión.
Ejemplo IX
Farmacocinética in vivo y biodistribución de la α-GAL humana recombinante de mamífero reticulada
La farmacocinética y biodistribución de la α-GAL humana recombinante de mamífero reticulada descrita en el Ejemplo VI se determinó midiendo la actividad α-GAL en el bazo, hígado, corazón y riñones de ratones con enfermedad Fabry 2 horas, 7, 14 y 28 días después de inyección, así como los niveles de Gb3 en estos órganos, como se describe anteriormente en el presente documento en la Sección de Materiales y Métodos. La biodistribución de la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® no reticulada se determinó para fines comparativos.
Como se muestra en las Figuras 27A-27D, los niveles de la α-GAL recombinante de mamífero reticulada en los bazos (Figura 27A), hígado (Figura 27B), corazón (Figura 27C) y riñones (Figura 27D) de ratones con enfermedad de Fabry fueron considerablemente superiores que los de la α-GAL recombinante de mamífero no reticulada.
Como se muestra en las Figuras 28A-28D, la α-GAL recombinante de mamífero reticulada disminuyó los niveles de Gb3 en el corazón (Figura 28A), riñones (Figura 28B), hígado (Figura 28C) y bazo (Figura 28D) de ratones con enfermedad de Fabry, durante el transcurso de 28 días después de inyección. La α-GAL recombinante de mamífero reticulada disminuyó los niveles de Gb3 en un grado mayor que la α-GAL recombinante no reticulada en el riñón (Figura 28B) y bazo (Figura 28D) de ratones con la enfermedad de Fabry, y a aproximadamente el mismo grado que la α-GAL recombinante de mamífero no reticulada en el corazón (Figura 28A) e hígado (Figura 28C).
Estos resultados indican que la reticulación con bis-NHS-PEG da como resultado una captación considerablemente potenciada de la α-GAL recombinante desde una variedad de fuentes y plataformas de expresión en órganos, incluyendo el riñón y corazón, que son órganos diana principales en el tratamiento del trastorno de Fabry. Adicionalmente, estos resultados indican que la reticulación con bis-NHS-PEG da como resultado una disminución más sustancial de los niveles de Gb3 en órganos.
Ejemplo X
Reticulación de α-GAL-II humana recombinante vegetal con bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG)
La α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-II), que carece de los aminoácidos EF presentes en el extremo N de prh-α-GAL-I, se reticuló con bis-NHS-PEG45, bis-NHS-PEG21 o bis-NHS-PEG68 a una proporción molar de 200:1 de bis-NHS-PEG a α-GAL, de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo II.
La prh-α-GAL-II conservó su actividad biológica después de la reticulación con bis-NHS-PEG (datos no mostrados).
Los productos de reacción se analizaron por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico) y espectrometría de masas MALDI-TOF como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Como se muestra en las Figuras 29A-29B, la prh-α-GAL-II nativa patrón se observó como un monómero después de la electroforesis en gel, mientras que después de la reacción de prh-α-GAL-II con bis-NHS-PEG45 o bis-NHS-PEG21 (Figura 29A), o con bis-NHS-PEG68 (Figura 29B), prh-α-GAL-II apareció principalmente en forma de un dímero (con algún monómero presente), indicando que los dos monómeros estaban ligados de manera covalente por reticulación con un agente de reticulación bis-NHS-PEG.
Como se observa adicionalmente en las Figuras 29A-29B, para cada uno de los agentes de reticulación ensayados, el peso molecular de la parte monomérica de prh-α-GAL-II aumentó después de la reacción con el agente de reticulación. El aumento del peso molecular fue mayor para bis-NHS-PEG45 que para bis-NHS-PEG21 (Figura 29A) y fue más elevado para bis-NHS-PEG68 (compárese la Figura 29A con la Figura 29B). Estos resultados indican que los monómeros que no dimerizaron por reticulación, estaban unidos de manera covalente al agente de reticulación bis-NHS-PEG, es decir, las proteínas estaban PEGiladas.
Como se muestra en las Figuras 30A-30C, la reacción de prh-α-GAL-II con el agente de reticulación bis-NHS-PEG21 aumentó el peso molecular del dímero prh-α-GAL-II de 95 KDa (Figura 30A) a 109 KDa (Figura 30B), aunque la reacción de prh-α-GAL-II con el agente de reticulación bis-NHS-PEG45 aumentó el peso molecular del dímero prh-αGAL-II a 114 KDa (Figura 30C), determinado por espectrometría de masas MALDI-TOF. El aumento del peso molecular indica una adición de aproximadamente 13 moléculas de bis-NHS-PEG21, o de aproximadamente 9 moléculas de bis-NHS-PEG45 al dímero prh-α-GAL-II.
Ejemplo XI
Estabilidad in vitro de la α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada
La estabilidad in vitro de la α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-II) reticulada obtenida como se describe en el Ejemplo X se midió en diversas condiciones como se describe en el presente documento anteriormente en la Sección de Materiales y Métodos. La estabilidad de la α-GAL humana recombinante comercial Replagal® se midió con fines comparativos.
Como se muestra en las Figuras 31A-31D, la estabilidad de la α-GAL-II humana recombinante vegetal se potenció reticulando con bis-NHS-PEG68 (Figuras 31B y 31D), bis-NHS-PEG45 (Figuras 31A -31D) o bis-NHS-PEG21 (Figuras 31A y 31C), tanto en condiciones lisosómicas simuladas (Figuras 31A y 31B) como en plasma humano (Figuras 31C y 31D). Los diferentes agentes de reticulación potenciaron la estabilidad de prh-α-GAL-II en grados comparables. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, la estabilidad de la prh-α-GAL-II reticulada fue mayor que la estabilidad de la α-GAL humana recombinante Replagal®. La prh-α-GAL-II reticulada exhibió una mayor estabilidad en condiciones lisosómicas simuladas, así como en condiciones plasmáticas.
Como se muestra adicionalmente en las Figuras 31A-31D, la prh-α-GAL-II no reticulada es considerablemente más estable que la prh-α-GAL-I no reticulada (véanse las Figuras 1 y 3 para comparación), tanto en condiciones
lisosómicas simuladas (Figuras 1 y 31A-31B) como en plasma humano (Figuras 3 y 31C-31D), aunque prh-α-GAL-II aún presenta alguna inestabilidad.
Estos resultados indican que la reticulación de α-GAL como se describe en el presente documento puede estabilizar diferentes tipos de α-GAL.
Ejemplo XII
Farmacocinética y biodistribución in vivo de la α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada
La farmacocinética y biodistribución de α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-II) reticulada con PEG45 y reticulada con PEG21, descrita en el Ejemplo X, se determinó midiendo la actividad α-GAL en plasma y en órganos como se ha descrito anteriormente en el presente documento en la Sección de Materiales y Métodos. La farmacocinética y biodistribución de la α-GAL humana recombinante de mamífero Replagal® no reticulada se determinó con fines comparativos.
Se recogieron muestras de sangre para análisis farmacocinéticos a 1, 5, 10, 30, 60, 120, 240, 480 y 1440 minutos después de inyección de ratones con enfermedad de Fabry con 1 mg/kg de α-GAL.
La biodistribución de α-GAL se determinó recogiendo el hígado, riñones, corazón y bazo de ratones con enfermedad de Fabry 2 horas, 7 días, 14 días y 28 días después de la inyección con 2 mg/kg de α-GAL.
Como se muestra en las Figuras 32A y 32B y en la Tabla 4, la reticulación de prh-α-GAL-II con bis-NHS-PEG45 aumentó considerablemente la semivida terminal en circulación de prh-α-GAL-II, dando lugar a una semivida en circulación considerablemente mayor que la de la α-GAL recombinante de mamífero o prh-α-GAL-II no reticulada.
Tabla 4: semivida terminal en circulación de α-GAL recombinante
- Artículo de ensayo
- t1/2 (min)
- α-GAL Replagal®
- 13,3
- alfa-GAL-II recombinante vegetal
- 4,8
- alfa-GAL-II recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45
- 581,6
Como se muestra en las Figuras 33A-33L, la reticulación de prh-α-GAL-II con bis-NHS-PEG45 aumentó la captación de prh-α-GAL-II en corazón (Figura 33A), riñón (Figura 33B), hígado (Figura 33C) y bazo (Figura 33D) de ratones con enfermedad de Fabry, aunque en un menor grado en el hígado.
Como se muestra en las Figuras 33E-33L, la reticulación de prh-α-GAL-II con bis-NHS-PEG21 también aumentó la captación de prh-α-GAL-II en corazón (Figuras 33E y 33I), riñón (Figuras 33F y 33J), hígado (Figuras 33G y 33K) y bazo (Figuras 33H y 33L) de ratones con enfermedad de Fabry, aunque dicho aumento no era siempre evidente después de solo 2 horas.
Como adicionalmente se ha observado en el presente documento, los niveles de prh-α-GAL-II reticulada fueron mayores que los niveles de α-GAL recombinante de mamífero en el corazón (Figuras 33A, 33E y 33I), riñón (Figuras 33B, 33F Y 33J) y bazo (Figuras 33D, 33H y 33L) de ratones con enfermedad de Fabry, y menores que los niveles de α-GAL recombinante de mamífero en el hígado (Figuras 33C, 33G y 33K).
Estos resultados indican que la prh-α-GAL-II reticulada exhibe una actividad considerablemente potenciada de α-GAL en plasma y en diversos órganos, particularmente en órganos distintos de hígado.
Ejemplo XIII
Efecto del pH sobre la actividad de α-GAL humana recombinante vegetal
El pH del entorno tiene un efecto significativo sobre la estabilidad y cinética de enzimas lisosómicas tales como α-GAL. El pH puede afectar a la unión del sustrato con la enzima. El pH también puede afectar a la protonación o desprotonación de grupos catalíticos, tales como grupos carboxilo o amino, que forman parte del sitio activo enzimático y, por lo tanto, afectan al comportamiento cinético de la enzima. La estabilidad de la estructura terciaria o cuaternaria de las enzimas también es dependiente del pH, y afecta a la velocidad de la reacción enzimática, especialmente a valores de pH extremadamente ácidos o alcalinos.
La actividad de α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con PEG45 y no reticulada se determinó a diversos valores de pH usando un sustrato pNP-G, para examinar la dependencia del pH de la actividad α-GAL, y el efecto de la reticulación en el mismo. Las mediciones se realizaron en soluciones de citrato 20 mM y de fosfato de sodio 30
mM.
Los parámetros cinéticos que caracterizan la actividad α-GAL a diversos valores de pH se resumen en la Tabla 5 a continuación y en las Figuras 34A-34C.
Como se observa en las Figuras 34A-34C, la reticulación del α-GAL-II aumentó los parámetros de Vmáx (Figura 34A) y kcat (Figura 34C) y no tuvo un efecto significativo sobre el parámetro KM (Figura 34B).
Tabla 5: resultados de actividad de la α-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-II) no reticulada y α-GAL II humana recombinante vegetal reticulada con PEG45 (prh-α-GAL-II-CL45) a diversos valores de pH.
- pH
- Muestra KM (μM) Vmáx (μM/minuto) kcat (segundo-1) kcat/KM (segundo-1* μM-1)
- 2,8
- prh-a-GAL-II 15216 0,57 9,04 0,0006
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 13618 0,90 14,37 0,0011
- 3,2
- prh-a-GAL-II 11476 0,55 8,85 0,0008
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 8489 1,34 21,44 0,0025
- 3,6
- prh-a-GAL-TI 11147 1,76 28,16 0,0025
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 4699 2,23 35,68 0,0076
- 4,04
- prh-a-GAL-II 5709 1,98 31,68 0,0055
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 3207 2,74 43,76 0,0136
- 4,4
- prh-a-GAL-II 4596 2,40 38,40 0,0084
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 3122 3,22 51,57 0,0165
- 4,8
- prh-a-GAL-II 4531 2,32 37,12 0,0082
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 3345 2,95 47,23 0,0141
- 5,29
- prh-a-GAL-II 6793 2,06 32,99 0,0049
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 3973 2,78 44,48 0,0112
- 5,66
- prh-a-GAL-II 10396 1,75 28,05 0,0027
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 4883 2,70 43,20 0,0088
- 6,09
- prh-a-GAL-II 11357 1,44 23,04 0,0020
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 8336 1,54 24,59 0,0030
- 6,4
- prh-a-GAL-II 21046 1,32 21,12 0,0010
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 16844 1,46 23,36 0,0014
- 6,76
- prh-a-GAL-II 25188 1,12 17,92 0,0007
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 18313 1,14 18,24 0,0010
- 7,36
- prh-a-GAL-II - - - -
- prh-a-GAL-I I-CL45
- 32692 0,52 8,37 0,0003
La potenciación de los parámetros Vmáx y kcat indica un aumento en la actividad catalítica. Este aumento es particularmente significativo a valores de pH de al menos aproximadamente 7, donde la actividad catalítica de la αGAL-II no reticulada es insignificante.
KM es un parámetro cinético asociado con la afinidad enzima/sustrato. La ausencia de un efecto significativo de reticulación sobre los valores de KM indica que la reticulación no tiene un efecto significativo sobre la afinidad de α-GAL con respecto al sustrato pNP-G.
Ejemplo XIV
Efecto de la PEGilación sobre la estabilidad de α-GAL
Se determinó el efecto de la PEGilación por sí mismo sobre la estabilidad de α-GAL, para determinar si el efecto estabilizante de los agentes de reticulación de PEG es debido a las propiedades del PEG o es debido a la reticulación.
Se hizo reaccionar α-GAL-I humana recombinante vegetal con PEG protegidos terminalmente con metoxi activado con N-hidroxisuccinimida (NHS) con diferentes pesos moleculares (2, 5 y 10 KDa). Dichos reactivos PEG tienen un solo grupo NHS y, por consiguiente, PEGilan la proteína sin formar reticulación. Los productos de reacción se analizaron por SDS-PAGE.
Como se muestra en la Figura 35, los agentes de PEGilación protegidos con metoxi PEGilaron la α-GAL (visible como un aumento en el peso molecular de α-GAL), pero no generaron sustancialmente dímeros de α-GAL, lo que indicaba que α-GAL no estaba reticulada.
5 Como se muestra en las Figuras 36A y 36B, la PEGilación de la α-GAL-I humana recombinante vegetal sin formar reticulación no aumentó sustancialmente la estabilidad de la α-GAL recombinante vegetal, en condiciones lisosómicas simuladas (Figura 36A) o en plasma humano (Figura 36B).
Estos resultados indican que el efecto estabilizante de la reticulación descrita en el presente documento 10 anteriormente no es un resultado de la PEGilación por sí misma.
Ejemplo XV
Efecto de la longitud de la cadena de PEG sobre la actividad de α-GAL reticulada
15 Para evaluar el efecto de la longitud de la cadena de los agentes de reticulación PEG sobre la actividad α-GAL, la α-GAL-I humana recombinante vegetal se reticuló con agentes bis-NHS-PEG2, bis-NHS-PEG4, bis-NHS-PEG68 y bisNHS-PEG150, usando esencialmente los mismos procedimientos que se han descrito en el Ejemplo II (PEG68 y PEG150 tienen longitudes de cadena aproximadas). La α-GAL-I se reticuló a proporciones molares de 50:1, 100:1 y
20 200:1 de bis-NHS-PEG:α-GAL. Los productos de reacción se analizaron por SDS-PAGE, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. También se analizó la α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 como se describe en el Ejemplo II con fines comparativos.
Como se muestra en la Figura 37, el análisis de SDS-PAGE mostró que todos los agentes de bis-NHS-PEG 25 reticularon la α-GAL para dar como resultado un dímero reticulado covalentemente, y que la reticulación era más eficaz cuando se usaba una proporción molar de 200:1.
La actividad enzimática de α-GAL-I reticulada se determinó después como se describe en el Ejemplo III. Los resultados se resumen en la Tabla 6 mostrada a continuación. 30 Tabla 6: resultados de actividad de la α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
- Reactivo
- Proporción molar (reactivo: α-GAL-I) Actividad α-GAL esperada [mg/ml] Actividad α-GAL medida [mg/ml]
- bis-NHS-PEG2
- 50:1 2 1,159
- 100:1
- 2 1,001
- 200:1
- 2 0,970
- bis-NHS-PEG4
- 50:1 2 1,399
- 100:1
- 2 1,333
- 200:1
- 2 1,048
- bis-NHS-PEG68
- 50:1 2 1,822
- 100:1
- 2 2,252
- 200:1
- 2 2,425
- bis-NHS-PEG150
- 50:1 2 1,804
- 100:1
- 2 2,031
- 200:1
- 2 1,825
Como se muestra en la Tabla 6, la reticulación con PEG2 y PEG4 redujo moderadamente la actividad α-GAL (aproximadamente un 30-50 %), mientras que la reticulación con cadenas de PEG más largas no afectó 35 significativamente a la actividad α-GAL.
Estos resultados indican que la reticulación con cadenas de PEG más largas que PEG4 es ventajosa en términos de preservar la actividad de la α-GAL reticulada.
Ejemplo XVI
Reticulación de α-GAL usando agentes bis-COOH-PEG
5 Como una alternativa a la reticulación anteriormente descrita de α-GAL usando agentes previamente preparados de bis-NHS-PEG (por ejemplo, disponibles en el mercado), α-GAL se reticuló con agentes bis-COOH-PEG activando los grupos carboxilo (es decir, COOH) in situ inmediatamente antes de efectuar la reacción de reticulación.
Cada uno de bis-COOH-PEG12, bis-COOH-PEG28 y bis-COOH-PEG45 se activaron reaccionando con 1,1
10 equivalentes molares por grupo carboxilo (es decir, 2,2 equivalentes molares por bis-COOH-PEG) de NHS (Nhidroxisuccinimida) y EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida). La mezcla de reacción se agitó después en DMSO durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se hizo reaccionar bis-COOH-PEG activado, que es esencialmente bis-NHS-PEG, con α-GAL-I humana recombinante vegetal a proporciones molares de 50:1, 100:1 y 200:1, como se describe en el Ejemplo II. Los productos de reacción se analizaron por SDS-PAGE, como se
15 describe anteriormente en el presente documento. La α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 como se describe en el Ejemplo II también se analizó con fines comparativos.
Como se muestra en la Figura 38, el análisis de SDS-PAGE mostró que todos los agentes bis-COOH-PEG reticulaban la α-GAL en algún grado, pero que la reticulación era más eficaz cuando se usaba una proporción molar
20 de 200:1.
Después se determinó la actividad enzimática de la α-GAL-I reticulada como se describe en el Ejemplo III. En la Tabla 7 a continuación se resumen los resultados.
25 Tabla 7: resultados de actividad de α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
- Reactivo
- Proporción molar (reactivo: α-GAL-I) Actividad α-GAL esperada [mg/ml) Actividad α-GAL medida [mg/ml]
- Bis-HOOC-PEG12
- 50:1 1,5 1,236
- 100:1
- 1,5 1,304
- 200:1
- 1,5 1,404
- Bis-HOOC-PEG28
- 50:1 1,5 1,326
- 100:1
- 1,5 1,371
- 200:1
- 1,5 1,460
- Bis-HOOC-PEG45
- 50:1 1,5 1,349
- 100:1
- 1,5 1,541
- 200:1
- 1,5 1,628
Como se muestra en la Tabla 7, la reticulación con cada uno de los agentes ensayados bis-COOH-PEG dio como resultado α-GAL con aproximadamente la actividad esperada.
30 Estos resultados indican que los agentes de reticulación bis-COOH-PEG no reducen la actividad α-GAL en comparación con la reticulación con agentes bis-NHS-PEG.
Estos resultados también confirman los hallazgos anteriormente descritos de que la reticulación con cadenas de PEG más largas que PEG4 no reduce significativamente la actividad de la α-GAL reticulada.
35 Ejemplo XVII
Efecto de la longitud y tipo de agentes de reticulación sobre la estabilidad in vitro de α-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada
40 Para caracterizar adicionalmente el efecto de la longitud de la cadena sobre la estabilidad de la α-GAL reticulada y para comparar la estabilidad de la α-GAL reticulada con agentes bis-COOH-PEG (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo XVI), con la de α-GAL reticulada con agentes bis-NHS-PEG, se midió la estabilidad in vitro de α-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-α-GAL-I) reticulada con bis-NHS-PEG2, bis-NHS-PEG4, bis-COOH-PEG12, bis
45 COOH28 y bis-COOH-PEG45, obtenidos como se describe en los Ejemplos XV y XVI, en diversas condiciones como se describe anteriormente en el presente documento en la Sección de Materiales y Métodos, y se comparó con la estabilidad de prh-α-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 como se describe en el Ejemplo II. La estabilidad de α
GAL humana recombinante comercial Replagal® y prh-GAL-I no reticulada se midió con fines comparativos.
Como se muestra en la Figura 39, la estabilidad de la α-GAL-I humana recombinante vegetal en condiciones lisosómicas simuladas se potenció reticulando con cada uno de los agentes bis-NHS-PEG y bis-COOH-PEG.
5 Como se muestra adicionalmente en el presente documento, la estabilidad de prh-α-GAL-I reticulado se correlacionó con la longitud de la cadena del agente de reticulación PEG, proporcionando bis-NHS-PEG45 y bis-COOH-PEG45 la mayor estabilidad, y proporcionando bis-NHS-PEG2 la menor estabilidad. Sin embargo, la reticulación con bis-COOH-PEG45 proporcionó solo marginalmente más estabilidad que la reticulación con bis-COOH-PEG45, lo que
10 sugería que, por encima de una determinada longitud, la estabilidad no se veía afectada por la longitud de la cadena de PEG.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 39, la reticulación con bis-NHS-PEG45 proporcionó ligeramente más estabilidad que la reticulación con bis-COOH-PEG45. Esto puede ser el resultado de una activación incompleta del 15 agente bis-COOH-PEG. Sin embargo, la diferencia en la estabilidad fue ligera.
Además, la reticulación con cada uno de los agentes bis-NHS-PEG y bis-COOH-PEG potenció la estabilidad de la α-GAL-I humana recombinante vegetal en plasma humano a 37 ºC (datos no mostrados).
20 Estos resultados proporcionan pruebas adicionales de que la reticulación de α-GAL como se describe en el presente documento puede aumentar la eficacia de α-GAL in vivo aumentando la estabilidad de α-GAL en lisosomas y en la sangre, y que las cadenas de PEG de aproximadamente 28-45 unidades de longitud son más eficaces estabilizando la α-GAL mediante la reticulación que las cadenas de PEG más cortas.
25 Ejemplo XVIII
Parámetros cinéticos de α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada
Los parámetros cinéticos de α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada, obtenidos como se describe en el
30 Ejemplo X, así como de α-GAL-II humana recombinante vegetal no reticulada, se determinaron usando un sustrato pNP-G y el análisis de Michaelis-Menten para examinar el efecto de la reticulación sobre la misma. Las mediciones se realizaron en una solución de citrato 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, albúmina de suero bovino al 0,1 % y etanol al 0,67 %, a un pH de 4,6. Los parámetros cinéticos se calcularon usando valores de contenido de proteína basándose en un ensayo de actividad.
35 Como se muestra en la Tabla 8 a continuación, la reticulación de α-GAL-II dio como resultado propiedades cinéticas mejoradas, en comparación con la α-GAL-II no reticulada. La constante de Michaelis (KM) se redujo, indicando una mayor afinidad de la enzima por el sustrato. Además, la kcat/KM, que significa la eficiencia catalítica total de la enzima con su sustrato en las condiciones descritas, se potenció para especies reticuladas.
40 Tabla 8: parámetros de Michaelis-Menten de α-GAL-II humana recombinante vegetal no reticulada (prh-α-GAL-II) y α-GAL II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG21 (prh-α-GAL-II-CL21), bis-NHS-PEG45 (prh-α-
GAL-II-CL45) o bis-NHS-PEG68 (prh-α-GAL-II-CL68)
- Muestra
- Km (μM) Vmáx (μM/min) kcat (s-1) kcat /Km (s-1 μM-1)
- prh-α-GAL-II
- 4801 4,59 73,49 0,015
- prh-α-GAL-II-CL21
- 2661 4,85 77,55 0,029
- prh-α-GAL-II-CL45
- 2583 4,87 77,87 0,030
- prh-α-GAL-II-CL68
- 2556 4,12 65,97 0,026
45 Ejemplo XIX Reproducibilidad de la reticulación de α-GAL-II humana recombinante vegetal
La reproducibilidad lote a lote de la reticulación se evaluó después de preparar 5 lotes de α-GAL-II humana 50 recombinante vegetal (prh-α-GAL-II) reticulada con bis-NHS-PEG45 a una proporción de 200:1, usando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo II.
En los lotes 1, 2, 4 y 5, se hizo reaccionar 1 mg de prh-α-GAL-II con 3,98 mg de bis-NHS-PEG.
55 En el lote 3, se hicieron reaccionar 20,5 mg de prh-α-GAL-II con 80,7 mg de bis-NHS-PEG.
La actividad enzimática de prh-α-GAL-II reticulada se determinó como se describe en el Ejemplo III. Los resultados se resumen en la Tabla 9 mostrada a continuación.
Tabla 9: resultados de actividad de α-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada de diferentes lotes
- Lote n.º
- Actividad α-GAL esperada [mg/ml] Actividad α-GAL medida [mg/ml]
- 1
- 1,25 1,38
- 2
- 1,25 1,23
- 3
- 1,43 1,4
- 4
- 1,25 0,85
- 5
- 1,25 1,11
5 Como se muestra en la Tabla 9, la actividad medida estaba próxima a la actividad esperada en los 5 lotes. En 4 de los 5 lotes, la actividad medida difirió de la actividad esperada aproximadamente un 10 % o menos.
Estos resultados indican que la actividad obtenida de la prh-α-GAL-II reticulada es relativamente predecible y 10 reproducible.
La estabilidad de prh-α-GAL-II reticulada en condiciones lisosómicas y en plasma humano se determinó como se describe anteriormente en el presente documento.
15 Como se muestra en las Figuras 40A y 40B, la estabilidad de prh-α-GAL-II reticulada exhibió una buena reproducibilidad tanto en condiciones lisosómicas simuladas como en plasma humano.
La reticulación también se analizó por análisis SDS-PAGE, análisis IEF (isoelectroenfoque) y espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe anteriormente en el presente documento. Se analizó prh-α-GAL-II no 20 reticulada para la comparación.
Como se muestra en la Figura 41, la prh-α-GAL-II reticulada de los diferentes lotes exhibió el mismo grado de dimerización covalente en análisis SDS-PAGE.
25 Como se muestra en la Figura 42, la prh-α-GAL-II reticulada de los diferentes lotes exhibió los mismos puntos isoeléctricos con análisis IEF.
Como se muestra en las Figuras 43A-43F, las prh-α-GAL-II reticuladas de los lotes 1-5 (FIG. 43B-43F, respectivamente) mostraron, todas ellas, un aumento de aproximadamente 20-21 KDa en la forma de dímero, en
30 comparación con la prh-α-GAL-II no reticulada (FIG. 43A). Dicho aumento corresponde a aproximadamente 10 moléculas de PEG por dímero de α-GAL. Como adicionalmente se muestra en las FIG. 43B-43F, las prh-α-GAL-II reticuladas de los diferentes lotes exhibieron similares proporciones de monómero frente a dímero.
Estos resultados indican adicionalmente la buena reproducibilidad en la reticulación de α-GAL.
35 Los parámetros cinéticos de la prh-α-GAL-II reticulada se determinaron usando un sustrato pNP-G y el análisis de Michaelis-Menten para examinar la reproducibilidad de la actividad enzimática. Las mediciones se realizaron en una solución de citrato 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, albúmina de suero bovino al 0,1 % y etanol al 0,67 %, a un pH de 4,6. Los parámetros cinéticos se calcularon usando valores de contenido de proteína basándose en la densidad
40 óptica a 280 nm.
Como se muestra en la Figura 44, la prh-α-GAL-II reticulada de diferentes lotes exhibió perfiles similares de velocidad catalítica frente a la concentración de sustrato.
45 Como se muestra en la Tabla 10 presentada a continuación, la prh-α-GAL-II reticulada de los diferentes lotes exhibió una buena reproducibilidad de los parámetros Vmáx y kcat. El parámetro Km varió más entre lotes, aunque esto puede ser un artefacto de la cuantificación de la proteína.
Los resultados anteriores indican una buena reproducibilidad en las propiedades enzimáticas de α-GAL reticulada. 50
Tabla 10: parámetros de Michaelis-Menten de la α-GAL II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 en diferentes lotes
- Lote n.º
- Km (μM) Vmáx (μM/min) kcat (s-1) kcat /Km (s-1μM-1)
- 1
- 4939 3,87 61,92 0,0125
- 2
- 2215 3,30 52,86 0,0239
- 3
- 4470 3,95 63,12 0,0141
- 4
- 3285 3,72 59,53 0,018
- 5
- 2243 3,91 62,60 0,028
Aunque la invención se ha descrito junto con sus realizaciones específicas, será evidente para los expertos en la materia que pueden realizarse muchas alternativas, modificaciones y variaciones. Las citas o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no deben considerarse una admisión de que dicha referencia esté disponible como técnica anterior a la presente invención. En la medida en que se usen los encabezados de sección, no deben considerarse necesariamente limitantes.
La invención comprende adicionalmente los siguientes puntos:
1. Una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa que están unidos de forma covalente entre sí a través de un radical de unión, representando la estructura de proteína multimérica una característica seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- una actividad α-galactosidasa después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la αgalactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (b)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha αgalactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (c)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (d)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante una semana;
- (e)
- una actividad de α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante un día;
- (f)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día;
- (g)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha forma nativa de dicha proteína a dichas condiciones lisosómicas;
- (h)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dicha solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC; y
- (i)
- una semivida en circulación en un sistema fisiológico que es mayor en al menos un 20 % que dicha semivida en circulación de dicha α-galactosidasa nativa.
- 2.
- La estructura de proteína multimérica del punto 1, en la que dicha actividad α-galactosidasa de dicha estructura de proteína multimérica que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día, continúa adicionalmente sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana.
- 3.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 2, en la que dicho radical de unión no está presente en α-galactosidasa nativa.
- 4.
- Una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa ligados por enlace covalente entre sí mediante un radical de unión, en la que dicho radical de unión no está presente en la α-galactosidasa nativa.
- 5.
- La estructura de proteína multimérica del punto 4, que representa una característica seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- una actividad α-galactosidasa después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la αgalactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (b)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha αgalactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (c)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (d)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante una semana;
- (e)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante un día;
- (f)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día;
- (g)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas;
- (h)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dicha solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC; y
- (i)
- una semivida en circulación en un sistema fisiológico que es mayor que una semivida en circulación de dicha α-galactosidasa nativa.
- 6.
- La estructura de proteína multimérica del punto 5, en la que dicha actividad α-galactosidasa de dicha estructura de proteína multimérica que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día, continua adicionalmente sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana.
- 7.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 5 y 6, en la que dicha semivida en circulación de la estructura de proteína multimérica que es mayor que una semivida en circulación de dicha αgalactosidasa nativa es mayor en al menos un 20 % que dicha semivida en circulación de dicha α-galactosidasa nativa.
- 8.
- La estructura de proteína multimérica del punto 7, en el que dicha semivida en circulación de la estructura de proteína multimérica que es mayor que una semivida en circulación de dicha α-galactosidasa nativa es mayor en al menos un 50 % que dicha semivida en circulación de dicha α-galactosidasa nativa.
- 9.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 8, caracterizada por una actividad αgalactosidasa en un órgano después de la administración de dicha estructura de proteína multimérica a un vertebrado, seleccionándose dicho órgano del grupo que consiste en bazo, corazón y riñón.
- 10.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 9, que comprende dos monómeros de α-galactosidasa, siendo la estructura de la proteína una estructura de proteína dimérica.
- 11.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 10, en la que dicha α-galactosidasa es una α-galactosidasa humana.
- 12.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 11, en la que dicha α-galactosidasa es una α-galactosidasa recombinante vegetal.
- 13.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 12, en la que dicha α-galactosidasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
- 14.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 12, en la que dicha α-galactosidasa es una α-galactosidasa alcalina.
- 15.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 12, en la que dicha α-galactosidasa es una α-galactosidasa ácida.
- 16.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 15, en la que dicho radical de unión comprende un poli(alquilenglicol).
- 17.
- La estructura de proteína multimérica del punto 16, en el que dicho poli(alquilenglicol) comprende al menos dos grupos funcionales, formando cada grupo funcional un enlace covalente con uno de los monómeros de αgalactosidasa.
- 18.
- La estructura de proteína multimérica del punto 17, en el que dichos al menos dos grupos funcionales son grupos terminales de dicho poli(alquilenglicol).
- 19.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 15, en el que dicho al menos un radical de unión tiene una fórmula general:
- -
- X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2
en la que cada uno de X1 y X2 es un grupo funcional que forma un enlace covalente con al menos un
monómero de α-galactosidasa;
Y es O, S o NR5;
n es un número entero de 1 a 200; y
cada uno de R1, R2, R3, R4 y R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno,
alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi.
- 20.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 17 a 19, en la que al menos uno de dichos grupos funcionales forma un enlace amida con un monómero de α-galactosidasa.
- 21.
- La estructura de proteína multimérica del punto 19, en la que n es un número entero de 5 a 150.
- 22.
- La estructura de proteína multimérica del punto 19, en el que n es un número entero de 40 a 70.
- 23.
- Una composición farmacéutica que comprende la estructura de proteína multimérica de cualquiera de 1 a 22 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
- 24.
- La composición farmacéutica del punto 23, que adicionalmente comprende una galactosa.
- 25.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 22, para su uso como un medicamento.
- 26.
- La estructura de proteína multimérica del punto 25, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
- 27.
- La estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 22, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
- 28.
- Un método de tratamiento de la enfermedad de Fabry, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 22, tratándose de esta manera la enfermedad de Fabry.
- 29.
- Un proceso de preparación de la estructura de proteína multimérica de cualquiera de los puntos 1 a 22, comprendiendo el proceso hacer reaccionar la α-galactosidasa con un agente de reticulación que comprende dicho radical de unión y al menos dos grupos reactivos.
- 30.
- El proceso del punto 29, que comprende hacer reaccionar la α-galactosidasa dimérica con dicho agente de reticulación.
- 31.
- El proceso de cualquiera de los puntos 29 a 30, en el que dichos grupos reactivos comprenden un grupo saliente.
32. El proceso de cualquiera de los puntos 29 a 31, en el que dicho grupo reactivo reacciona con un grupo amina para formar un enlace amida.
33. El proceso de cualquiera de los puntos 29 a 32, en el que cada uno de dichos grupos reactivos es capaz de 5 formar un enlace covalente entre dicho radical de unión y al menos un monómero de α-galactosidasa.
34. El proceso de cualquiera de los puntos 29 a 33, en el que la proporción molar de dicho agente de reticulación con respecto a los monómeros de dicha α-galactosidasa está en un intervalo de 5:1 a 500:1.
10 35. El proceso del punto 34, en el que dicha proporción molar está en un intervalo de 75:1 a 300:1. LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Protalix Ltd. Shulman, Avidor Ruderfer, Ilya Ben-Moshe, Tehila Shekhter, Talia Azulay, Yaniv Shaaltiel, 15 Yoseph Kizhner, Tali
<120> ALFA-GALACTOSIDASA ESTABILIZADA Y USOS DE LA MISMA
<130> W3080 EP/1 20
<150> US 61/309.487
<151>
<150> US 61/434.499 25 <151>
<150> PCT/IL2010/000956
<151> 30 <150> US 61/434.503
<151>
<160> 14 35 <170> Patent In versión 3.5
<210> 1
<211> 405
<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Alfa-GAL humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL) 45 <400> 1
<210> 2
<211> 404
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Alfa-GAL humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL) 10
<400> 2
<210> 3
<211> 405
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Alfa-GAL humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL) 10
<400> 3
<210> 4
<211> 753
<212> PRT
<213> Cucumis melo
<400> 4
<210> 5
<211> 772
<212> PRT
<213> Cucumis melo
<400> 5
<210> 6
<211> 767
<212> PRT
<213> Tetragonia tetragonioides
<400> 6
<210> 7
<211> 772
<212> PRT
<213> Cucumis sativus
<400> 7
<210> 8
<211> 211
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 8
<210> 9
<211> 747
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 9
<210> 10
<211> 753
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 10
<210> 11
<211> 777
<212> PRT
<213> Pisum sativum
<400> 11
<210> 12
<211> 753
<212> PRT
<213> Cucumis sativus
<400> 12
<210> 13
<211> 772
<212> PRT
<213> Cucumis melo
<400> 13
<210> 14
<211> 378
<212> PRT
<213> Coffea arabica
<400> 14
Claims (16)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa que están unidos de forma covalente entre sí a través de un radical de unión, donde dicho radical de unión no está presente en la α-galactosidasa nativa, siendo la estructura de proteína multimérica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
-
- 2.
- La estructura de proteína multimérica para su uso en la reivindicación 1, donde dicha estructura de proteína multimérica presenta una característica seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (b)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha αgalactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (c)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (d)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante una semana;
- (e)
- una actividad de α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante un día;
- (f)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día;
- (g)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas;
- (h)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dicha solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC; y
- (i)
- una semivida en circulación en un sistema fisiológico que es mayor que dicha semivida en circulación de dicha α-galactosidasa nativa.
-
- 3.
- La estructura de proteína multimérica para uso de la reivindicación 2, en la que dicha actividad α-galactosidasa de dicha estructura de proteína multimérica que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día, continúa adicionalmente sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana.
-
- 4.
- La estructura de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha estructura de proteína multimérica comprende dos monómeros de α-galactosidasa, siendo la estructura de la proteína una estructura de proteína dimérica.
-
- 5.
- La estructura de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha αgalactosidasa es una α-galactosidasa generada por tecnología recombinante.
-
- 6.
- La estructura de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha αgalactosidasa es una α-galactosidasa humana seleccionada del grupo que consiste en agalsidasa alfa y agalsidasa beta.
-
- 7.
- La estructura de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha αgalactosidasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
-
- 8.
- La estructura de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho radical de unión tiene una longitud de al menos 20 átomos.
-
- 9.
- La estructura de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho radical de unión comprende un poli(alquilenglicol).
-
- 10.
- Las estructuras de proteína multimérica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en las que dicho radical de unión tiene la fórmula general:
- -
- X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2
5 en la que cada uno de X1 y X2 es un grupo funcional que forma un enlace covalente con al menos un monómero de α-galactosidasa; Y es O, S o NR5; n es un número entero de 1 a 200; y cada uno de R1, R2, R3, R4 y R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi. - 11. La estructura de proteína multimérica para uso de la reivindicación 10, en la que n es al menos 25.15 12. La estructura de proteína multimérica para uso de la reivindicación 10, en la que dicha estructura de proteína multimérica comprende dos monómeros de α-galactosidasa, siendo la estructura de la proteína una estructura de proteína dimérica, en la que dicha α-galactosidasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, cada uno de dichos grupos funcionales forma un enlace amida con un monómero de α-galactosidasa y n es un número entero de 40 a 70.
- 13. La estructura de proteína multimérica para uso de la reivindicación 7, en la que dicha estructura de proteína multimérica comprende dos monómeros de α-galactosidasa, siendo la estructura de la proteína una estructura de proteína dimérica, en la que dicho resto de unión tiene la fórmula:en la que el peso molecular del polietilenglicol en dicho radical de unión es 2 kDa y cada uno de los grupos terminales de dicho radical de unión forma un enlace amida con un monómero de α-galactosidasa.
- 14. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry mediante administración parenteral, comprendiendo la composición la estructura de proteína multimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
- 15. La composición para uso de la reivindicación 14, en la que dicha administración parenteral es infusión 35 intravenosa.
-
- 16.
- La composición para uso de la reivindicación 14 o 15, en la que la concentración de dicha estructura de proteína multimérica es 2 mg/ml.
-
- 17.
- Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry mediante administración parenteral, comprendiendo la composición
(i) una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa queestán unidos covalentemente entre sí a través de un radical de unión; y 45 (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable,donde dicha estructura de proteína multimérica presenta una característica seleccionada del grupo que consiste en:- (a)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (b)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el
55 porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha αgalactosidasa nativa a dichas condiciones plasmáticas humanas durante una hora;- (c)
- una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones plasmáticas humanas durante una hora;
- (d)
- una actividad α-galactosidasa, después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante una semana, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante una semana;
- (e)
- una actividad α-galactosidasa que disminuye después de someter la estructura de proteína multimérica a
condiciones lisosómicas durante un día en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha α-galactosidasa nativa después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas durante un día;(f) una actividad α-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios después de someter la estructura 5 de proteína multimérica a condiciones lisosómicas durante un día;- (g)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a condiciones lisosómicas, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dichas condiciones lisosómicas;
- (h)
- una actividad α-galactosidasa, inmediatamente después de someter la estructura de proteína multimérica a
10 una solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de la α-galactosidasa nativa inmediatamente después de someter dicha α-galactosidasa nativa a dicha solución acuosa que tiene un pH de 7 y una temperatura de 37 ºC; y(i) una semivida en circulación en un sistema fisiológico que es mayor en al menos un 20% que dicha semividaen circulación de dicha α-galactosidasa nativa. 15
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US30948710P | 2010-03-02 | 2010-03-02 | |
US309487P | 2010-03-02 | ||
PCT/IL2010/000956 WO2011061736A1 (en) | 2009-11-17 | 2010-11-17 | Alkaline alpha galactosidase for the treatment of fabry disease |
WOPCT/IL2010/000956 | 2010-11-17 | ||
US201161434499P | 2011-01-20 | 2011-01-20 | |
US201161434503P | 2011-01-20 | 2011-01-20 | |
US201161434503P | 2011-01-20 | ||
US201161434499P | 2011-01-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2606532T3 true ES2606532T3 (es) | 2017-03-24 |
Family
ID=44121635
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16173953T Active ES2708843T3 (es) | 2010-03-02 | 2011-03-02 | Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma |
ES14195875.1T Active ES2606532T3 (es) | 2010-03-02 | 2011-03-02 | Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16173953T Active ES2708843T3 (es) | 2010-03-02 | 2011-03-02 | Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP3088514B1 (es) |
JP (2) | JP5758920B2 (es) |
KR (1) | KR101928403B1 (es) |
CN (1) | CN102933707B (es) |
AU (1) | AU2011222452B2 (es) |
BR (2) | BR112012022029B1 (es) |
CA (1) | CA2791461C (es) |
DK (1) | DK2865751T3 (es) |
ES (2) | ES2708843T3 (es) |
FI (1) | FIC20230032I1 (es) |
HK (1) | HK1180720A1 (es) |
HR (1) | HRP20200428T1 (es) |
HU (2) | HUE030959T2 (es) |
IL (2) | IL221741A (es) |
IN (1) | IN2012MN02262A (es) |
NL (1) | NL301249I2 (es) |
NO (1) | NO2023041I1 (es) |
NZ (2) | NZ623294A (es) |
PL (1) | PL2865751T3 (es) |
RU (1) | RU2604795C2 (es) |
SG (2) | SG10201502609QA (es) |
SI (1) | SI2865751T1 (es) |
WO (1) | WO2011107990A1 (es) |
ZA (1) | ZA201206725B (es) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9194011B2 (en) | 2009-11-17 | 2015-11-24 | Protalix Ltd. | Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof |
NZ623294A (en) * | 2010-03-02 | 2015-10-30 | Protalix Ltd | Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof |
LT3272861T (lt) * | 2011-01-20 | 2020-03-25 | Protalix Ltd. | Alfa-galaktozidazės kompozicijos |
TWI793159B (zh) * | 2013-10-23 | 2023-02-21 | 美商健臻公司 | 重組醣蛋白及其用途 |
PT3237621T (pt) * | 2014-12-22 | 2023-07-20 | Codexis Inc | Variantes da alfa-galactosidase humana |
WO2016116966A1 (en) * | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins |
HUE056850T2 (hu) | 2015-03-17 | 2022-03-28 | eleva GmbH | Glikozilezett lizoszómális fehérjék, elõállítási eljárás és alkalmazások |
GB201508025D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Fabry disease gene therapy |
CN117959455A (zh) * | 2017-01-05 | 2024-05-03 | 波塔力克斯有限公司 | 植物重组人类α-半乳糖苷酶制备治疗法布里病的药品的用途 |
CN110651043A (zh) * | 2017-06-07 | 2020-01-03 | 天野酶制品株式会社 | 乳糖酶原料粉末和乳糖酶制剂 |
US11427813B2 (en) | 2018-12-20 | 2022-08-30 | Codexis, Inc. | Human alpha-galactosidase variants |
WO2022097141A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Protalix Ltd. | Modified uricase and uses thereof |
CN112176026A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-01-05 | 诺道中科(北京)生物科技有限公司 | 一种α-半乳糖苷酶活性的检测试剂盒 |
CN116254287B (zh) * | 2022-11-24 | 2024-06-04 | 西北农林科技大学 | 玉米ZmAGA3基因用于提高植物耐旱性的应用 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5766897A (en) | 1990-06-21 | 1998-06-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cysteine-pegylated proteins |
US5401650A (en) | 1990-10-24 | 1995-03-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A |
CA2052728A1 (en) | 1991-10-03 | 1993-04-04 | Guy Ampleman | Glycidyl azide polymer |
US6329191B1 (en) * | 1993-08-30 | 2001-12-11 | Hawaii Biotechnology Group, Inc. | DNA encoding recombinant coffee bean alpha-galactosidase |
US6458574B1 (en) * | 1996-09-12 | 2002-10-01 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Treatment of a α-galactosidase a deficiency |
US20050032211A1 (en) * | 1996-09-26 | 2005-02-10 | Metabogal Ltd. | Cell/tissue culturing device, system and method |
ATE397013T1 (de) * | 1997-09-05 | 2008-06-15 | Altus Pharmaceuticals Inc | Kohlenhydrat-vernetzte glykoproteinkristalle |
IL125423A (en) | 1998-07-20 | 2004-08-31 | Israel State | Alkaline alpha-galactosidase having broad substrate specificity |
JP5183836B2 (ja) * | 1998-08-06 | 2013-04-17 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | Peg−尿酸酸化酵素結合体およびその使用 |
DE60022336T2 (de) | 1999-04-02 | 2006-06-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Vefahren zur herstellung von peptiduntereinheiten aus polymer-proteinen |
WO2003097791A2 (en) | 2002-05-15 | 2003-11-27 | Agricultural Research Organization, The Volcani Center | Polynucleotide sequences encoding alkaline a-galactosidases and methods of using same |
US7951557B2 (en) * | 2003-04-27 | 2011-05-31 | Protalix Ltd. | Human lysosomal proteins from plant cell culture |
EP1877099B1 (en) * | 2005-04-06 | 2012-09-19 | Genzyme Corporation | Therapeutic conjugates comprising a lysosomal enzyme, polysialic acid and a targeting moiety |
ES2547726T3 (es) * | 2005-11-18 | 2015-10-08 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | Nueva enzima altamente funcional que tiene especificidad de sustrato modificada |
WO2008075957A1 (en) | 2006-12-21 | 2008-06-26 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Treatment of fabry disease |
JP2008169195A (ja) * | 2007-01-05 | 2008-07-24 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体 |
EP1955712A1 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | Scil proteins GmbH | Multimeric conjugate |
AU2008290217B2 (en) * | 2007-08-20 | 2013-09-05 | Protalix Ltd. | Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof |
NZ623294A (en) * | 2010-03-02 | 2015-10-30 | Protalix Ltd | Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof |
-
2011
- 2011-03-02 NZ NZ623294A patent/NZ623294A/en unknown
- 2011-03-02 WO PCT/IL2011/000209 patent/WO2011107990A1/en active Application Filing
- 2011-03-02 SI SI201131048A patent/SI2865751T1/sl unknown
- 2011-03-02 BR BR112012022029-2A patent/BR112012022029B1/pt active IP Right Grant
- 2011-03-02 SG SG10201502609QA patent/SG10201502609QA/en unknown
- 2011-03-02 AU AU2011222452A patent/AU2011222452B2/en active Active
- 2011-03-02 RU RU2012141651/10A patent/RU2604795C2/ru active
- 2011-03-02 EP EP16173953.7A patent/EP3088514B1/en active Active
- 2011-03-02 PL PL14195875T patent/PL2865751T3/pl unknown
- 2011-03-02 BR BR122014021216-0A patent/BR122014021216A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-03-02 HU HUE14195875A patent/HUE030959T2/en unknown
- 2011-03-02 JP JP2012555542A patent/JP5758920B2/ja active Active
- 2011-03-02 NZ NZ602317A patent/NZ602317A/en unknown
- 2011-03-02 IN IN2262MUN2012 patent/IN2012MN02262A/en unknown
- 2011-03-02 KR KR1020127025725A patent/KR101928403B1/ko active IP Right Grant
- 2011-03-02 ES ES16173953T patent/ES2708843T3/es active Active
- 2011-03-02 CN CN201180022145.6A patent/CN102933707B/zh active Active
- 2011-03-02 SG SG2012064580A patent/SG183558A1/en unknown
- 2011-03-02 EP EP11712340.6A patent/EP2542675B1/en active Active
- 2011-03-02 DK DK14195875.1T patent/DK2865751T3/en active
- 2011-03-02 ES ES14195875.1T patent/ES2606532T3/es active Active
- 2011-03-02 EP EP14195875.1A patent/EP2865751B1/en active Active
- 2011-03-02 CA CA2791461A patent/CA2791461C/en active Active
-
2012
- 2012-09-02 IL IL221741A patent/IL221741A/en active IP Right Grant
- 2012-09-07 ZA ZA2012/06725A patent/ZA201206725B/en unknown
-
2013
- 2013-07-05 HK HK13107909.0A patent/HK1180720A1/xx unknown
-
2014
- 2014-08-06 JP JP2014160449A patent/JP5871999B2/ja active Active
-
2017
- 2017-06-29 IL IL253249A patent/IL253249B/en active IP Right Grant
-
2020
- 2020-03-16 HR HRP20200428TT patent/HRP20200428T1/hr unknown
-
2023
- 2023-10-31 HU HUS2300038C patent/HUS2300038I1/hu unknown
- 2023-11-01 NO NO2023041C patent/NO2023041I1/no unknown
- 2023-11-01 NL NL301249C patent/NL301249I2/nl unknown
- 2023-11-02 FI FIC20230032C patent/FIC20230032I1/fi unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2606532T3 (es) | Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma | |
US20230074255A1 (en) | Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof | |
US20220204963A1 (en) | Oligosaccharides comprising an aminooxy group and conjugates thereof | |
EP2542674B1 (en) | Glucocerebrosidase multimers and uses thereof |