ES2708843T3

ES2708843T3 - Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma

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Publication number: ES2708843T3
Application number: ES16173953T
Authority: ES
Inventors: Avidor Shulman; Ilya Ruderfer; Tehila Ben-Moshe; Talia Shekhter; Yaniv Azulay; Yoseph Shaaltiel; Tali Kizhner
Original assignee: Protalix Ltd
Current assignee: Protalix Ltd
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2019-04-11
Anticipated expiration: 2031-03-02
Also published as: PL2865751T3; CA2791461C; IN2012MN02262A; KR20130056216A; HUE030959T2; IL221741A; NZ623294A; NL301249I1; EP2542675B1; AU2011222452B2; SI2865751T1; CA2791461A1; BR112012022029B1; NO2023041I1; JP5871999B2; FIC20230032I1; JP5758920B2; JP2014237694A; EP2865751B1; BR112012022029A2

Abstract

Un proceso para la preparación de una estructura de proteína multimérica que comprende al menos dos monómeros de α-galactosidasa que están unidos de forma covalente entre sí a través de un radical de unión, en donde dicho radical de unión no está presente en la α-galactosidasa nativa, comprendiendo el proceso hacer reaccionar la α-galactosidasa con un agente de reticulación que comprende dicho radical de unión y al menos dos grupos reactivos.

Description

DESCRIPCION

Alfa-galactosidasa estabilizada y usos de la misma

Campo y Antecedentes de la Invencion

La presente invencion, en algunas de sus realizaciones, se refiere a nuevas estructuras de protema multimerica y, mas particularmente, aunque no exclusivamente, a estructuras de protema multimericas de a-galactosidasa y a usos de las mismas en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

La enzima lisosomica a-galactosidasa-A (a-GAL o a-Gal A; EC 3.2.1.22) cataliza la retirada de galactosa de los oligosacaridos, glucoprotemas y glucolfpidos durante el catabolismo de macromoleculas. Los deficits en enzimas lisosomicas conducen a la acumulacion de sus sustratos en los tejidos, afecciones conocidas como enfermedades de almacenamiento lisosomico. En los seres humanos, la ausencia de a-galactosidasa-A funcional conduce a la acumulacion de glucolfpidos que contienen restos de a-galactosa terminales (principalmente globotriaosilceramida, que tambien recibe el nombre de "trihexosido ceramida", "CTH" o "Gb3") en los tejidos, lo que conduce a la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Fabry es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X, descrito por primera vez en 1898, caracterizado por dolor cronico, opacidades oculares, disfuncion hepatica y renal, lesiones en la piel, deterioro vascular y/o insuficiencia cardfaca. La a-galactosidasa-A humana recombinante tiene la capacidad de restaurar la funcion enzimatica en pacientes, y la terapia de reemplazo enzimatico (ERT, del ingles) usando a-GAL se aprobo en los Estados Unidos en el ano 2003 como un tratamiento para la enfermedad de Fabry. a-GAL se convirtio en la segunda protema recombinante aprobada para el tratamiento de un trastorno de almacenamiento lisosomico despues de la p-glucosidasa, un tratamiento para la enfermedad de Gaucher.

Las a-GAL endogena y recombinante catalizan la hidrolisis de glucolfpidos galactosilados terminales en los lisosomas de celulas de organos tales como el hngado, rinones, bazo, corazon, etc. Este sitio natural de accion se caracteriza por su bajo pH, que llega a ser tan bajo como de 4,5. Las enzimas lisosomicas, incluyendo a-GAL, estan por tanto disenadas para ejercer su actividad maxima a estos niveles de pH bajos.

Los tratamientos actuales de la enfermedad de Fabry con ERT se basan en la a-GAL recombinante procedente de celulas de mairnfero que se considera un tratamiento eficaz limitado. Estos tratamientos unicamente desaceleran el avance de la enfermedad, pero no pueden detenerlo y no ofrecen una solucion verdadera y completa. Adicionalmente, en algunos casos, debe interrumpirse la ERT con a-GAL recombinantes comerciales debido al desarrollo de una respuesta inmunogenica al tratamiento y, en algunos casos, el tratamiento no puede iniciarse en vista de los problemas de inmunogenicidad.

El analisis de la estructura de rayos X revela que la a-GAL humana es una glucoprotema homodimerica estando cada monomero compuesto de dos dominios, el dominio a (p/a)s que contiene el sitio activo y el dominio C-terminal que contiene ocho cadenas p antiparalelas en dos laminas en un sandwich p [Garman & Garboczi, J Mol Biol 2004, 337:319-335]. Los dos monomeros estan dispuestos en un ensamblaje cabeza a cola y la dimerizacion es no covalente. Los dos monomeros se empaquetan con una interfaz que extiende la anchura de 75 A del dfmero y oculta 2.200 A2 de area superficial. En la interfaz del dfmero, 30 restos de cada monomero contribuyen a la interfaz. Los dos sitios activos del dfmero estan separados por aproximadamente 50 A.

Se resolvio la estructura cristalina de a-Gal para una protema no ligada, asf como para una protema ligada a galactosa. Estas dos estructuras exhiben pocos cambios entre las estructuras ligada y no ligada. No obstante, el uso de galactosa en lugar del sustrato natural, la globotriaosilceramida (Gb3), estando esta ultima caracterizada por cadenas lipfdicas largas capaces de interactuar con el dominio hidrofobo de un monomero mientras que la galactosa terminal interacciona con el sitio activo del segundo monomero, puede no demostrar la cooperatividad de sitio activo. Adicionalmente, las pruebas bioqmmicas sugieren dicha cooperatividad, ilustrando la importancia de la estructura cuaternaria homodimerica [Bishop & Desnick, J Biol Chem 1981, 256:1307-1316]. Por lo tanto, se estudiaron las propiedades cineticas de la a-Gal humana y se observo la cooperatividad entre los monomeros de la enzima homodimerica, cada uno con un sitio de interaccion catalftico. Por lo tanto, se sugirio que la actividad y estabilidad enzimatica podfan depender de la dimerizacion.

El documento WO 2009/024977, del cesionario del presente documento, ensena conjugados de un sacarido y una biomolecula, unidos entre sf de manera covalente mediante un enlazador no hidrofobo, asf como usos medicos que utilizan dichos conjugados.

La Solicitud de Patente Internacional PCT N.° PCT/IL2010/000956, del cesionario del presente documento, ensena metodologfas que utilizan a-galactosidasa, que exhibe una actividad lisosomica a niveles de pH mayores que el pH lisosomico.

Adicionalmente, la tecnica anterior incluye Bendele et al. [Toxicological Sciences 1998, 42:152-157], las Patentes de Estados Unidos N.° 5.256804, 5.580757 y 5.766.897, la Solicitud de Patente Internacional PCT/NL2007/050684 (publicada como WO 2008/075957) y Seely & Richey [J Chromatography A 2001.908: 235-241].

Sumario de la invencion

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona una estructura de protema multimerica que comprende al menos dos monomeros de a-galactosidasa que estan ligados de manera covalente entre s^ mediante un radical de union, presentando la estructura de protema multimerica una caractenstica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una actividad a-galactosidasa, despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones de plasma humano durante una hora, que es al menos un 10 % superior que una actividad de la a-galactosidasa nativa despues de someter la a-galactosidasa nativa a condiciones de plasma humano durante una hora;

(b) una actividad a-galactosidasa que disminuye despues de someter la estructura de la protema multimerica a condiciones de plasma humano durante una hora, en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye la actividad de la a-galactosidasa nativa despues de someter la a -galactosidasa nativa a condiciones de plasma humano durante una hora;

(c) una actividad a-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios despues de someter a la estructura de protema multimerica a condiciones de plasma humano durante una hora.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona una estructura de protema multimerica que comprende al menos dos monomeros de a-galactosidasa que estan ligados de manera covalentemente entre sf mediante un radical de union, en la que el radical de union no esta presente en la agalactosidasa nativa.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una estructura de protema multimerica como se describe en el presente documento y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo de tratamiento de la enfermedad de Fabry, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente eficaz de una estructura de protema multimerica como se describe en el presente documento, tratando de esta manera la enfermedad de Fabry.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un proceso para la preparacion de una estructura de protema multimerica como se describe en el presente documento, comprendiendo el proceso hacer reaccionar la a-galactosidasa con un agente de reticulacion que comprende el radical de union descrito en el presente documento y al menos dos grupos reactivos.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el radical de union descrito en el presente documento no esta presente en la a-galactosidasa nativa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la estructura de la protema multimerica presenta una caractenstica del grupo que consiste en:

(b) una actividad a-galactosidasa que disminuye despues de someter la estructura de la protema multimerica a condiciones de plasma humano durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye la actividad de la a-galactosidasa nativa despues de someter la a -galactosidasa nativa a condiciones de plasma humano durante una hora;

(c) una actividad a-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones de plasma humano durante una hora.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la actividad a-galactosidasa de la estructura de protema multimerica que permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones lisosomicas durante un dfa, adicionalmente permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones lisosomicas durante una semana.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la semivida en circulacion de la estructura de protema multimerica que es mayor que una semivida en circulacion de la a-galactosidasa nativa, es mayor en al menos un 20 % que la semivida en circulacion de la a-galactosidasa nativa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la semivida en circulacion de la estructura de protema multimerica que es mayor que una semivida en circulacion de la a-galactosidasa nativa, es mayor en al menos un 50 % que la semivida en circulacion de la a-galactosidasa nativa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la estructura de protema multimerica se caracteriza por una actividad a-galactosidasa en un organo despues de la administracion de la estructura de protema multimerica a un vertebrado, seleccionandose el organo del grupo que consiste en bazo, corazon y rinon.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la estructura de protema multimerica comprende dos monomeros de a-galactosidasa, siendo la estructura de protema una estructura de protema dimerica.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa humana.

De acuerdo algunas realizaciones de la invencion, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa recombinante de planta.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la a-galactosidasa tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa alcalina.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa acida.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el radical de union comprende un poli(alquilenglicol).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el poli(alquilenglicol) comprende al menos dos grupos funcionales, formando cada grupo funcional un enlace covalente con uno de los monomeros de a-galactosidasa. De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los al menos dos grupos funcionales son grupos terminales del poli(alquilenglicol).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el al menos un radical de union tiene una formula general:

-Xi-(CRiR²-CR³R⁴-Y)n-X²-en la que cada uno de Xi y X²es un grupo funcional que forma un enlace covalente con al menos un monomero de a-galactosidasa;

Y es O, S o NR⁵;

n es un numero entero de ¹a ^{2 00}; y

cada uno de Ri, R², R³, R⁴y R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, al menos uno de los grupos funcionales forma un enlace amida con un monomero de a-galactosidasa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, n es un numero entero de 5 a 150.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, n es un numero entero de 40 a 70.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la composicion farmaceutica comprende adicionalmente una galactosa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la estructura de protema multimerica es para su uso como un medicamento.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la estructura de protema multimerica es para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el proceso comprende hacer reaccionar la a-galactosidasa dimerica con el agente de reticulacion.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los grupos reactivos comprenden un grupo saliente.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el grupo reactivo reacciona con un grupo amina para formar un enlace amida.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, cada uno de los grupos reactivos puede formar un enlace covalente entre el radical de union y al menos un monomero de a-galactosidasa

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la proporcion molar entre el agente de reticulacion y los monomeros de a-galactosidasa se encuentra en un intervalo de 5:1 a 500:1.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la proporcion molar se encuentra en un intervalo de 75:1 a 300:1.

A menos que se definan de otra manera, todos los terminos tecnicos y/o cientfficos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado entendido normalmente por un experto habitual en la materia a la cual pertenece la invencion. Aunque en la practica o ensayo de las realizaciones de la invencion pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuacion se describen metodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecera la memoria descriptiva de patente, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no deben considerarse necesariamente limitantes.

Breve descripcion de los dibujos

La patente o archivo de solicitud contiene al menos un dibujo a color. Las copias de esta patente o publicacion de solicitud de patente con dibujos a color se proporcionaran por la oficina tras solicitarlas y pagar la tasa necesaria.

Algunas realizaciones de la invencion se describen en el presente documento, unicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo referencia espedfica ahora a los dibujos con detalle, cabe destacar que las particularidades mostradas se ofrecen como ejemplo y con fines de analisis ilustrativo de las realizaciones de la invencion. En este sentido, la descripcion tomada junto con los dibujos pone de manifiesto a los expertos en la materia como pueden llevarse a la practica las realizaciones de la invencion.

En los dibujos:

La FIG. 1 es un grafico que muestra la actividad de or-GAL Fabrazyme®, or-GAL Replagal® y or-GAL-I humana recombinante vegetal, en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C);

La FIG. 2 es un grafico que muestra la actividad de or-GAL Fabrazyme®, or-GAL Replagal®, or-GAL-I humana recombinante vegetal y or-GAL-I recombinante vegetal con galactosa (100 mg/ml), en funcion del tiempo de incubacion en condiciones fisiologicas simuladas (pH 7,4, 37 °C);

La FIG. 3 es un grafico que muestra la actividad de or-GAL Fabrazyme®, or-GAL Replagal® y or-GAL-I humana recombinante vegetal, en funcion del tiempo de incubacion en plasma humano a 37 °C;

La FIG. 4 es un grafico que muestra la actividad de or-GAL Fabrazyme®, or-GAL Replagal®, or-GAL-I humana recombinante vegetal y or-GAL-I recombinante vegetal con galactosa (100 mg/ml), en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C);

La FIG. 5 es un esquema que representa las estructuras moleculares de agentes de reticulacion de bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG) ejemplares;

La FIG. 6 es un esquema que representa una protema dimerica que ha reaccionado con agentes de reticulacion de bis-NHS-PEG;

La FIG. 7 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra or-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG5 (carriles 1-3), bis-NHS-PEG8 (carriles 7-9) y bis-NHS-PEG45 (carriles 4-6), a una relacion molar de 50:1 (carriles 1, 4 y 7), 100:1 (carriles 2, 5 y 8) y 200:1 (carriles 3, 6 y 9) de bis-NHS-PEG:a-GAL, asf como marcadores de peso molecular (Pm) y patron de or-GAL-I (Estd) recombinante vegetal que no ha reaccionado (las flechas muestran la banda que comprende un dfmero de or-GAL).

La FIG. 8 presenta un barrido de un gel de isoelectroenfoque que muestra un or-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG5 (carriles 1-3), bis-NHS-PEG8 (carriles 7-9) y bis-NHS-PEG45 (carriles 4-6), a una proporcion molar de 50:1 (carriles 1, 4 y 7), 100:1 (carriles 2, 5 y 8) y 200:1 (carriles 3, 6 y 9) de bis-NHs-PEG:a-GAL, asf como marcadores (M) de pH y patron de or-GAL-I (Estd) recombinante vegetal que no ha reaccionado (las flechas muestran valores de pH para varias bandas);

La FIG. 9 es un espectro de espectroscopia de masas MALDI-TOF de or-GAL-I recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 (el eje x indica valores m/z, y se muestran los valores m/z de los picos);

La FIG. 10 es un espectro de espectroscopia de masas MALDI-TOF de or-GAL-I recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG8 (el eje x indica valores m/z, y se muestran los valores m/z de picos);

La FIG. 11 presenta una fotograffa que muestra el sustrato or-GAL trihexosido de W-dodecanoilnitrobenzoxadiazol-ceramida (Gb3-NBH) y el producto de reaccion de or-GAL lactosil ceramida-nitrobenzoxadiazol (lactosil ceramida-NBH), y visualizado con radiacion con luz UV (365 nm), despues de cromatograffa de capa fina de alto rendimiento, seguido de incubacion del sustrato Gb3-NBD con or-GALI humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (carril izquierdo), or-GAL Replagal® (carril central) y sin or-GAL (carril derecho); Las FIG. 12A, 12B y 12C, son graficos que muestran la actividad de or-GAL Fabrazyme®, or-GAL Replagal®, or-GAL-I humana recombinante vegetal y or-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG5 (FIG. 12A), bis-NHS-PEG8 (FIG. 12B) y bis-NHS-PEG45 (FIG. 12C) a una relacion molar de 50:1 ("1" en FIG.

12A, "7" en FIG. 12B y "4" en FIG. 12C), 100:1 ("2" en FIG. 12A, "8" en FIG. 12B y "5" en FIG. 12C) y 200:1 ("3" en FIG. 12, “9” en FⁱG. 12B y “6” en FIG. 12C) de bis-NHS-PEG:a-GAL en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37°C);

La FIG. 13 es un grafico que muestra el perfil farmacocinetico de or-GAL Replagal®, or-GAL-I humana recombinante vegetal y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 en el plasma de ratones con la enfermedad de Fabry; la actividad residual de cada ^g-GAL se presenta como un porcentaje de la actividad residual maxima de cada a-GAL, en funcion del tiempo que despues de la inyeccion de las a-GAL. Las FIG. 14A y 14B presentan un grafico (FIG. 14A) que muestra la actividad de a-GAL Replagal®, ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l) y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (prh-alfa-GAL-l-CL8) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-l-CL45) en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry dos horas despues de la inyeccion de a-GAL, y una fotograffa de una transferencia de Western (FIG.

14B) que muestra a-GAL Replagal® (carriles 10-12 y 15), ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (carriles 7-9 y 13), y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (carriles 4-6) o bis-NHS-PEG45 (carriles 1-3 y 14) en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry despues de inyeccion de a-GAL (carriles 1-12) o como un patron que consiste en 50 ng de a-GAL (carriles 13-15);

Las FIG. 15A y 15B presentan un grafico (FIG. 15A) que muestra la actividad de a-GAL Replagal®, ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l) y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (prh-alfa-GAL-l-CL8) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-l-CL45) en los hffgados de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion de a-GAL, y una fotograffa de una transferencia de Western (FIG. 15B) que muestra a-GAL Replagal® (carriles 10-12 y 15), ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (carriles 7-9 y 13) y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (carriles 4-6) o bis-NHS-PEG45 (carriles 1-3 y 14) en los hfgados de ratones con la enfermedad de Fabry despues de inyeccion de a-GAL (carriles 1- 12) o como un patron que consiste en 50 ng de a-GAL (carriles 13-15);

La FIG. 16 es un grafico que muestra la actividad de a-GAL Replagal®, ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l) y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (Prh-alfa-GAL-l-) o bis-NHS-PEG⁴⁵(prh-alfa-GAL-l-CL45) en los corazones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion de a-GAL;

La FIG. 17 es un grafico que muestra la actividad de a-GAL Replagal®, ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l) y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 (Prh-alfa-GAL-l-CL8) o bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-l-CL45) en los rinones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion de a-GAL;

La FIG. 18 es un grafico que muestra la actividad de a-GAL Replagal® y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l) y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-l-CL45) en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dfas y 7 dfas despues de la inyeccion de ^g-GAL (como patron, se muestra a-GAL de tipo silvestre (WT) endogena;

La FIG. 19 es un grafico que muestra la actividad de ^g-GAL Replagal® y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l), y ^g-GAL l humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-l-CL45) en los hffgados de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dfas y 7 dfas despues de inyeccion de ^g-GAL (como patron, se muestra ^g-GAL de tipo silvestre (WT) endogena);

La FIG. 20 es un grafico que muestra la actividad de ^g-GAL Replagal® y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l), y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-l-CL45) en los corazones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dfas y 7 dfas despues de la inyeccion de ^g-GAL (como patron, se muestra ^g-GAL de tipo silvestre (WT) endogena);

La FIG. 21 es un grafico que muestra la actividad de ^g-GAL Replagal® y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-l), y ^g-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (Prh-alfa-GAL-l-CL45) en los rinones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dfas y 7 dfas despues de la inyeccion de ^g-GAL (como patron, se muestra ^g-GAL de tipo silvestre (WT) endogena);

La FIG. 22 presenta una fotograffa de una imagen de un gel de SDS-PAGE que muestra la ^g-GAL humana recombinante de mairfffero Replagal® (carril izquierdo), y la ^g-GAL humana recombinante de mairfffero Replagal® que se hizo reaccionar con bis-NHS-PEG45 (carril central), asf como marcadores de peso molecular (carril derecho; los pesos moleculares de los marcadores se indican en unidades kDa);

La FIG. 23 presenta una fotograffa de un gel de isoelectroenfoque que muestra ^g-GAL humana recombinante de mair fffero Replagal® (carril izquierdo), y ^g-GAL humana recombinante de mair fffero Replagal® que reacciono con bis-NHS-PEG45 (carril central), asf como marcadores de pH (carril derecho);

Las FIG. 24A y 24B son espectros de espectroscopia de masas MALDl-TOF de la ^g-GAL humana recombinante de mair fffero Replagal® (FIG. 24A), y ^g-GAL humana recombinante de mair fffero Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG⁴⁵(el eje x indica valores m/z, y se muestran los valores m/z (en unidades Da) de los picos);

La FIG. 25 es una representacion grafica de Michaelis-Menten que muestra la velocidad (V) de la hidrolisis de pnitrofenil-a-D-galactopiranosido (pNP-G) por la ^g-GAL humana recombinante de mairfffero Replagal® (Replagal) y la ^g-GAL humana recombinante de mairfffero Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (Replagal CL45), en funcion de la concentracion de pNP-G;

Las FIG. 26A y 26B son graficos que muestran la actividad de la ^g-GAL humana recombinante de mairfffero Replagal® (Replagal) y la ^g-GAL humana recombinante de mairfffero Replagal® reticulada por bis-NHS-PEG45 (Replagal-CL45) en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C) (FIG. 26A) o en plasma humano a 37 °C (FIG. 26B);

Las FIG. 27A-27D son graficos que muestran la actividad de a-GAL Replagal® (R) y a-GAL Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (R-CL45) en los bazos (FIG. 27A), hngados (Fig. 27^b), corazones (FIG. 27C) y rinones (FIG.

27D) de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion de a-GAL;

Las FIG. 28A-28D son graficos que muestran los niveles de Gb3 en los corazones (FIG. 28A), rinones (FIG. 28B), hngados (FIG. 28C) y bazos (FIG. 28D) de ratones con la enfermedad de Fabry, en funcion del tiempo despues de la inyeccion de a-GAL Replagal® o a-GAL Replagal® reticulada con bis-NHS-PEG45 (R-CL45);

Las FIG. 29A y 29B presentan barridos de geles de SDS-PAGE que muestran la a-GAL-II humana recombinante vegetal (FIGS. 29A y 29B, carril 2) y la a-GAL-II humana recombinante vegetal que reacciono con bis-NHS-PEG²¹(FIG. 29A, carril 3), bis-NHS-PEG45 (FIG. 29A, carril 4) o bis-NHS-PEG68 (FIG. 29B, carril 3), asf como marcadores de peso molecular (FIG. 29A y 29B, carril 1; los pesos moleculares de los marcadores se indican en unidades KDa);

Las FIG. 30A-30C son espectros de espectroscopia de masas MALDI-TOF de a-GAL-II humana recombinante vegetal (FIG. 30A), y a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG²¹(FIG. 30B) o bis-NHS-PEG⁴⁵(FIG. 30C) (el eje x indica valores de m/z y se muestran los valores de m/z (en unidades Da) de los picos);

Las FIG. 31A-31D son graficos que muestran la actividad de a-GAL humana recombinante de mairnfero Replagal® (Replagal), a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG²¹(prh-alfa-GAL-II-CL21, FIG. 31A y 31C), bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45, FIG. 31A-31D) o bis-NHS-PEG68 (prh-alfa-GAL-II-CL68; FIG. 31B y 31D) en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C) (FIG. 31A y 31B) o en plasma humano a 37 °C (FIG. 31C y 31D) (los datos mostrados en las FIG. 31C y 31D son de experimentos diferentes);

Las FIG. 32A y 32B son graficos que muestran los perfiles farmacocineticos de a-GAL Replagal® (Replagal), a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45) en el plasma de ratones con la enfermedad de Fabry; la concentracion de cada a-GAL se presenta en funcion del tiempo despues de la inyeccion de a-GAL (las FIG. 32A y 32B presentan los mismos datos a diferentes intervalos);

Las FIG. 33A-33L son graficos que muestran la actividad de a-GAL Replagal® (Replagal), a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45, FIG. 33A-33L) o bis-NHS-PEG²¹(prh-alfa-GAL-II-CL21; FIG. 33E-33L) en los corazones (FIG. 33A, 33E y 33I), rinones (FIG. 33B, 33F y 33J), Mgados (FIG. 33C, 33G y 33K) y bazos (FIG. 33D, 33H y 33L) de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas (FIG. 33A-33H), 7 dfas (F^ig. 33A-33D y 33I-33L), 14 dfas (FIG. 33A-33D) y 28 dfas (FIG. 33A-33D) despues de inyeccion de a-GAL;

Las FIG. 34A-34C son graficos que muestran los parametros cineticos Vmax (FIG. 34A), K^m (FIG. 34B) y kcat (FIG.

34C) para la a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-alfa-GAL-II) y la a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45) en funcion del pH;

La FIG. 35 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra la a-GAL-1 humana recombinante vegetal (prh-a-Gal-I) y la a-GAL-I humana recombinante vegetal que ha reaccionado con NHS-PEG protegido terminalmente con metoxi que tiene un peso molecular de 2 KDa (prh-a-Gal-I-PEG 2.000), 5 KDa (prh-a-Gal-I-PEG 5.000) o 10 KDa (prh-a-Gal-I-PEG 10.000), asf como marcadores de peso molecular (carril izquierdo; los marcadores de peso molecular se indican en unidades KDa);

Las FIG. 36A y 36B son graficos que muestran la actividad de a-GAL humana recombinante de mai^ero Fabrazyme® (Fabrazyme), a-GAL humana recombinante de mai^ero Replagal® (Replagal), a-GAL-I humana recombinante vegetal y a-GAL-I humana recombinante vegetal que ha reaccionado con NHS-PEG protegido terminalmente con epoxi que tiene un peso molecular de 2 KDa (a-Gal-I-PEG 2.000), 5 KDa (a-Gal-I-PEG 5.000) o 10 KDa (a-Gal-I-PEG 10.000), en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C) (FIG. 36A) o en plasma humano a 37 °C (FIG. 36B);

La FIG. 37 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra a-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG²(carriles 1-3), bis-NHS-PEG4 (carriles 4-6), bis-NHS-PEG68 (carriles 7-9), bis-NHS-PEG¹⁵⁰(carriles 10-12) y bis-NHS-PEG45 (CL45), a una proporcion molar de 50:1 (carriles 1, 4, 7 y 10), 100:1 (carriles 2, 5, 8 y 11) y 200:1 (carriles 3, 6, 9 y 12) de bis-NHS-PEG:a-GAL, asf como marcadores de peso molecular (PM);

La FIG. 38 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra a-GAL-I recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-COOH-PEG¹²(carriles 1-3), bis-COOH-PEG²⁸(carriles 4-6), bis-COOH-PEG45 (carriles 7-9) y bis-NHS-PEG45 (CL45), a una proporcion molar de 50:1 (carriles 1, 4 y 7), 100:1 (carriles 2, 5 y 8) y 200:1 (carriles 3, 6 y 9) de bis-NHS-PEG:a-GAL, asf como marcadores de peso molecular (PM) y a-GAL-I recombinante vegetal no reticulada como control (con);

La FIG. 39 es un grafico que muestra la actividad de a-GAL Replagal®, a-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-I) y a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 (prh-a-GAL-I-CLA45), bis-NHS-PEG⁴(prh-a-GAL-I-CL4), bis-NHS-PEG²(prh-a-GAL-I-CL2), bis-COOH-PEG45 (prh-a-GAL-I-CLA45), bis-COOH-PEG²⁸(prh-a-GAL-I-CLA28) o bis-COOH-PEG¹²(prh-a-GAL-I-CLA12) en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C);

Las FIG. 40A y 40B son graficos que muestran la actividad de la a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 en funcion del tiempo de incubacion en condiciones lisosomicas simuladas (tampon fosfato citrato, pH 4,6, 37 °C) (FIG. 40A) o en plasma humano a 37 °C (FIG. 40B). (La FIG. 40B muestra la actividad de la or-GAL recombinante de mairnfero Replagal® y or-GAL-II humana recombinante vegetal no reticulada para comparacion);

La FIG. 41 presenta un barrido de un gel de SDS-PAGE que muestra or-GAL-II recombinante vegetal de 3 lotes diferentes (carriles 1-3) y or-GAL-II recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (carriles 4-8), asf como marcadores de peso molecular (PM);

La FIG. 42 presenta un barrido de un gel de isoelectroenfoque que muestra la or-GAL-II recombinante vegetal de 3 lotes diferentes (carriles 1-3) y or-GAL-II recombinante vegetal que ha reaccionado con bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (carriles 4-8), asf como marcadores de pH (M);

Las FIG. 43A-43F son espectros de espectroscopia de masas MALDI-TOF de or-GAL-II humana recombinante vegetal (FIG. 43A) y or-GAL-II humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (FIG. 43B-43F, respectivamente) (el eje x indica valores de m/z, y se muestran los valores de m/z (en unidades Da) de los picos); y

La FIG. 44 es un grafico que muestra la velocidad catalftica (V) de la actividad or-GAL exhibida por la or-GAL-II humana vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes, en funcion de la concentracion del sustrato (p-nitrofenil-or-D-galactopiranosido).

Descripcion de realizaciones espedficas de la invencion

La presente invencion, en algunas de sus realizaciones, se refiere a nuevas estructuras de protema multimerica y, mas particularmente, aunque no exclusivamente, a estructuras de protema multimerica de or-galactosidasa y a sus usos en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

Antes de explicar al menos una realizacion de la invencion con detalle, debe entenderse que la invencion no se limita necesariamente en su solicitud a los detalles expuestos en la siguiente descripcion o ilustrados por los ejemplos. La invencion puede tener otras realizaciones o llevarse a la practica o realizarse de distintas maneras. Los deficits de una protema lisosomica (por ejemplo, defectos en una protema lisosomica o ausencia de una protema lisosomica) pueden causar un dano considerable a la salud de un sujeto (una enfermedad de almacenamiento lisosomico). La terapia de reemplazo enzimatico (ERT), en la que se administra a un paciente la protema deficiente, se ha usado en intentos de tratar enfermedades de almacenamiento lisosomico. Sin embargo, la administracion de la protema deficiente no da como resultado necesariamente un aumento considerable y/o persistente en la actividad de la protema in vivo.

La enfermedad de Fabry es un ejemplo de una enfermedad de almacenamiento lisosomico (heredada) recesiva ligada al cromosoma X que puede causar una amplia gama de smtomas sistemicos. Un deficit de la enzima lisosomica or-galactosidasa A debido a una mutacion hace que un glucolfpido conocido como globotriaosilceramida (conocido tambien como Gb3 o trihexosido de ceramida) se acumule dentro de los vasos sangumeos, otros tejidos y organos. Esta acumulacion conduce a una alteracion de su funcion adecuada. Se dispone de dos terapias de reemplazo enzimatico (ERT) para compensar funcionalmente el deficit de la or-galactosidasa. Tanto la agalsidasa alfa (Replagal®, Shire) como la agalsidasa beta (Fabrazyme®, Genzyme) son formas recombinantes de la enzima orgalactosidasa A humana. Estas enzimas son diffciles de fabricar y, por lo tanto, son caras. Recientemente, la contaminacion en la planta de Allston de Genzyme, MA, causo una escasez a nivel mundial de agalsidasa beta, y los suministros a los pacientes se racionaron a un tercio de la dosis recomendada.

Como se muestra en el presente documento, las or-galactosidasas ejercen su actividad maxima a los niveles de pH bajos caractensticos de los lisosomas, mientras que su actividad a niveles de pH mas altos se ve comprometida. Por lo tanto, por ejemplo, la or-galactosidasa usada en ERT tendna poca capacidad de hidrolizar glucolfpidos galactosilados terminales en el suero de pacientes con la enfermedad de Fabry.

Ademas, como se muestra adicionalmente en el presente documento, incluso en condiciones lisosomicas, la actividad de las or-galactosidasas se ve comprometida gradualmente, aunque a una tasa mas baja que a niveles de pH mas altos.

Motivados por la necesidad de resolver la actividad comprometida de las or-galactosidasas, los autores de la presente invencion han investigado formas estabilizadas de or-galactosidasa (or-GAL). Mas espedficamente, los autores de la presente invencion han contemplado que una forma estabilizada de la or-galactosidasa podna exhibir una actividad mas duradera en general, incluyendo una actividad mas duradera en suero. Por lo tanto, los autores de la presente invencion han disenado y preparado con exito y llevado a la practica formas estabilizadas de orgalactosidasa nativa y, de hecho, han demostrado que dichas formas estabilizadas exhiben un comportamiento mejorado en cuanto a una mayor actividad y/o una mayor duracion de la actividad en condiciones tanto lisosomicas como en un entorno de suero, lo cual proporciona una actividad mejorada de la protema in vivo.

Los autores de la presente invencion han demostrado una formacion de formas estabilizadas de la or-galactosidasa que exhiben un comportamiento mejorado mediante la reticulacion de la or-galactosidasa nativa, a traves de la formacion de un nuevo enlace covalente entre los monomeros de or-galactosidasa.

Haciendo referencia ahora a los dibujos, las Figuras 1 y 4 muestran la disminucion de la actividad enzimatica en condiciones lisosomicas para la a-GAL-I humana recombinante vegetal (phr-a-GAL I) y la a-GAL Fabrazyme® y Replagal®. Las Figuras 2 y 3 muestran la disminucion de la actividad enzimatica en condiciones fisiologicas simuladas o en plasma humano, para las mismas variedades de a-GAL. Las Figuras 2 y 4 muestran que la galactosa disminuye la tasa de disminucion de la actividad de la a-GAL.

La Figura 5 muestra agentes de reticulacion ejemplares de PEG (polietilenglicol), de acuerdo con realizaciones opcionales de la invencion. La Figura 6 representa un dfmero de a-GAL reticulado de acuerdo con realizaciones opcionales de la invencion.

Las Figuras 7-10 y 37 muestran que phr-a-GAL-I reacciono con agentes de reticulacion ejemplares que comprendfan radicales de N-hidroxisuccinimida. La Figura 38 muestra que phr-a-GAL-I reacciono con agentes de reticulacion ejemplares que comprendfan grupos carboxilo, despues de la activacion in situ con N-hidroxisuccinimida. Las Figuras 7, 37 y 38 muestran que la reaccion con el agente de reticulacion dio como resultado la aparicion de a-GAL principalmente en una forma dimerica en lugar de en una forma monomerica en condiciones desnaturalizantes, lo que indica que la estructura cuaternaria de la a-GAL se mantema por reticulacion covalente. La FIG. 11 muestra que la a-GAL reticulada conservaba su actividad enzimatica.

Las Figuras 12A-12C y 39 muestran que la phr a-GAL-I reticulada exhibe una actividad mas duradera que la a-GAL no reticulada en condiciones lisosomicas simuladas. El aumento de la estabilidad es mas fuerte para los enlazadores PEG²⁸y PEG⁴⁵que para los enlazadores de PEG mas cortos. La Figura 13 muestra que la phr-a-GAL-I reticulada exhibe una actividad mas duradera que la a-GAL no reticulada en plasma in vivo. Las Figuras 14A-21 muestran que la phr-a-GAL-I reticulada exhibe una actividad potenciada in vivo en el bazo, hngado, corazon y rinones. La potenciacion de la actividad de a-GAL es mas fuerte para los enlazadores de PEG⁴⁵que para los enlazadores de PEG mas cortos. Las Figuras 15A, 15B y 19 muestran que, aunque la phr-a-GAL-I reticulada exhibe una actividad potenciada in vivo, la actividad potenciada no esta tan concentrada en el hngado como lo esta la actividad de a-GAL Replagal®.

Los resultados anteriores indican que la reticulacion de la a-GAL-I humana recombinante vegetal da como resultado un dfmero con mejor estabilidad, lo que permite un aumento mas eficaz de la actividad de a-GAL cuando se administra in vivo.

De manera similar, las Figuras 22-28D muestran que la reticulacion de la a-GAL humana recombinante de mairnfero da como resultado un dfmero ligado de manera covalente (Figuras 22-24B), que exhibe actividad enzimatica normal (Figura 25), asf como una actividad mas duradera en condiciones tanto lisosomicas como en plasma (Figuras 26A-26B) y una mayor actividad in vivo en el bazo, hngado, corazon y rinones (Figuras 27A-28D).

De manera similar, las Figuras 29A-33L muestran que la reticulacion de la a-GAL II humana recombinante vegetal da como resultado un dfmero ligado de manera covalente (Figuras 29-30), que exhibe una actividad mas duradera en condiciones tanto lisosomicas como en plasma (Figuras 31A-31B), y una mayor actividad in vivo en plasma y en el bazo, hngado, corazon y rinones (Figuras 32A-33L). Como se muestra en las Figuras 33A-33L, la reticulacion con un enlazador de PEG⁴⁵fue particularmente eficaz para aumentar la actividad in vivo.

Estos resultados indican que los efectos ventajosos de la reticulacion son aplicables a una diversidad de protemas a-GAL.

Las Figuras 34A-34C muestran que la reticulacion de a-GAL aumenta parametros de catalisis enzimatica de a-GAL, ensancha el intervalo de pH de la actividad de a-GAL y permite la actividad de a-GAL a un pH de aproximadamente 7 o mayor.

Las Figuras 35-36B muestran que la PEGilacion sin reticulacion no tiene efectos significativos sobre la actividad de a-GAL, lo que indica que los efectos ventajosos de la reticulacion se deben espedficamente a la reticulacion, en lugar de a un efecto de la PEGilacion.

Las Figuras 40-44 muestran que la reticulacion de a-GAL de acuerdo con las realizaciones de la invencion permite una buena reproducibilidad de la estabilidad (Figuras 40A-40B), grado de reticulacion covalente (Figuras 41-43F) y propiedades enzimaticas (Figura 44) de la a-GAL reticulada.

Los resultados presentados en el presente documento muestran que las estructuras de protema multimericas reticuladas de manera covalente de la a-galactosidasa se caracterizan por una mayor estabilidad y mayor actividad en condiciones fisiologicamente relevantes, en comparacion con las formas nativas de la a-galactosidasa.

Por lo tanto, la estructura de protema multimerica unida de manera covalente puede exhibir una actividad que es mayor que la actividad de una forma nativa de la a-galactosidasa, como resultado de que la actividad de la forma nativa se degrada mas rapidamente a lo largo del tiempo que la actividad de la estructura de protema multimerica reticulada, que se estabiliza mediante la reticulacion covalente.

La estructura de protema multimerica reticulada de manera covalente puede exhibir una actividad que es mayor que la actividad de la forma nativa de la a-galactosidasa, tambien debido a una mayor actividad inicial (por ejemplo, debido a diferentes parametros de actividad), es decir, independientemente de cualquier deterioro de la actividad a lo largo del tiempo.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una estructura de protema multimerica que comprende al menos dos monomeros de a-galactosidasa que estan ligados de manera covalente entre sf a traves de un radical de union. De acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de protema multimerica presenta una estabilidad mayor que la de una a-galactosidasa nativa y/o una actividad inicial mayor que la de una a-galactosidasa nativa, como se describe mas adelante con detalle.

En el presente documento, el termino “monomero” con respecto a la a-galactosidasa se refiere a un polipeptido individual de la a-galactosidasa. El polipeptido puede incluir sustituyentes no peptfdicos (por ejemplo, uno o mas restos de sacarido).

En el presente documento, el termino “nativa” con respecto a la a-galactosidasa incluye protemas que comprenden una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica (es decir, al menos una homologfa del 95 %, opcionalmente al menos una homologfa del 99 % y opcionalmente del 100 %) con una secuencia de aminoacidos de una protema a-galactosidasa de origen natural. Una a-galactosidasa nativa puede ser una protema aislada de una fuente natural, o una protema producida de manera recombinante (por ejemplo, procedente de celulas de mairnfero, celulas de plantas, celulas de levadura, celulas bacterianas o celulas de insecto).

El termino “nativa”, cuando se usa en referencia a una estructura cuaternaria de a-galactosidasa (por ejemplo, un dfmero de a-galactosidasa) comprende adicionalmente una estructura cuaternaria sustancialmente identica a la de una protema de origen natural.

En el presente documento, la frase “protema de origen natural” se refiere a una protema en una forma que se produce en la naturaleza (por ejemplo, en un organismo), con respecto a la secuencia de aminoacidos de la protema, asf como la estructura cuaternaria de la protema si la protema esta en una forma multimerica.

Las modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glucosilacion) de las protemas a-galactosidasa de origen natural (por ejemplo, en un organismo que expresa la protema a-galactosidasa de origen natural) pueden estar presentes, ausentes o modificadas en la forma nativa de la a-galactosidasa a la que se hace referencia en el presente documento. Una forma nativa de la a-galactosidasa (por ejemplo, una a-galactosidasa producida de manera recombinante) puede comprender opcionalmente modificaciones postraduccionales diferentes a las de la agalactosidasa de origen natural, siempre que la forma nativa de la a-galactosidasa conserve una secuencia de aminoacidos y estructura sustancialmente similar a la de la a-galactosidasa de origen natural, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

En el presente documento, la forma nativa de una protema puede referirse a una estructura monomerica (por ejemplo, un monomero de a-galactosidasa) y/o una estructura multimerica (por ejemplo, un dfmero de agalactosidasa). Por ejemplo, una protema dimerica puede describirse como una forma nativa de a-galactosidasa, y un polipeptido monomerico en una protema dimerica puede describirse como una forma nativa del monomero de agalactosidasa.

Opcionalmente, la estructura de protema multimerica descrita en el presente documento es una estructura dimerica, como lo es la forma nativa de la a-galactosidasa.

Como alternativa, la estructura de protema multimerica comprende mas de dos monomeros de a-galactosidasa. Por ejemplo, la estructura de protema multimerica puede ser un tetramero, un hexamero o un octamero que comprende monomeros de a-galactosidasa.

Las estructuras de protema multimerica descritas en el presente documento comprenden enlaces covalentes que unen los monomeros de a-galactosidasa entre sf, y que no existen en la forma nativa de la a-galactosidasa.

Opcionalmente, el radical de union que une los monomeros de a-galactosidasa es un radical que no esta presente en una forma nativa de a-galactosidasa (por ejemplo, un radical de union sintetico).

Por lo tanto, por ejemplo, el radical de union es opcionalmente un radical que se une de manera covalente a una cadena lateral, a un extremo N o a un extremo C, o un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacarido) de un monomero de a-galactosidasa, asf como a una cadena lateral, a un extremo N o a un extremo C, o a un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacarido) de otro monomero de a-galactosidasa. A continuacion, se describen con detalle en el presente documento ejemplos de dichos radicales de union.

Como alternativa, el radical de union forma una parte de los monomeros de a-galactosidasa que se estan uniendo (por ejemplo, una parte de una cadena lateral, extremo N o extremo C, o un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacarido) de un monomero de a-galactosidasa, asf como de una cadena lateral, un extremo N o un extremo C, o un radical relacionado con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, un radical de sacarido) de otro monomero de a-galactosidasa).

Por lo tanto, por ejemplo, el radical de union puede ser un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida) entre un grupo funcional de una cadena lateral, extremo N, extremo C o radical relacionado con modificaciones postraduccionales de un monomero (por ejemplo, una amina) y un grupo funcional complementario de una cadena lateral, extremo N, extremo C o radical relacionado con modificaciones postraduccionales de otro monomero (por ejemplo, carboxilo), donde dicho enlace covalente esta ausente de la forma nativa de la a-galactosidasa. Tambien se contemplan otros enlaces covalentes, tales como, por ejemplo, un enlace ester (entre un grupo hidroxi y un carboxilo); un enlace tioester; un enlace eter (entre dos grupos hidroxi); un enlace tioeter; un enlace anhndrido (entre dos carboxilos); un enlace tioamida; un enlace carbamato o tiocarbamato.

Opcionalmente, el radical de union esta desprovisto de un enlace disulfuro. Sin embargo, dentro del alcance de esta realizacion de la invencion se encuentra un radical de union que incluye un enlace disulfuro en una posicion que no forma un enlace entre monomeros (por ejemplo, la escision de los enlaces disulfuro no escinde la union entre los monomeros). Una posible ventaja del radical de union desprovisto de un enlace disulfuro es que no es susceptible de escision en condiciones reductoras suaves, como lo son los enlaces disulfuro.

Opcionalmente, el radical de union es un radical no peptfdico (por ejemplo, el radical de union no consiste en un enlace amida, un aminoacido, un dipeptido, un tripeptido, un oligopeptido o un polipeptido).

Como alternativa, el radical de union puede ser, o puede comprender, un radical peptfdico (por ejemplo, un aminoacido, un dipeptido, un tripeptido, un oligopeptido o un polipeptido).

Opcionalmente, el radical de union no es simplemente una extension lineal de cualquiera de los monomeros de agalactosidasa unidos (es decir, el extremo N y extremo C del radical peptfdico no estan unidos directamente al extremo C o extremo N de cualquiera de los monomeros de a-galactosidasa).

Como alternativa, el radical de union esta formado por union covalente directa de un extremo N de un monomero de a-galactosidasa con un extremo C de otro monomero de a-galactosidasa, para producir un polipeptido fusionado. Dicho polipeptido no sera una forma nativa de a-galactosidasa, aunque puede comprender dos monomeros de agalactosidasa esencialmente en su forma nativa.

Sin embargo, la union covalente de los monomeros de a-galactosidasa descritos en el presente documento esta preferentemente en una forma distinta de la union directa de un extremo N a un extremo C.

El radical de union tambien se denomina en el presente documento radical de reticulacion. En el presente documento, la union de monomeros de a-galactosidasa mediante un radical de union se denomina “reticulacion”. El radical de reticulacion puede ser un enlace covalente, un grupo o atomo qmmico (por ejemplo, un grupo C(=O)-O-, -O-, -S-, NR-, -N=N-, -NH-C(=O)-NH-, y similar) o un radical puente (compuesto de una cadena de grupos qmmicos).

Un radical puente puede ser, por ejemplo, un grupo polimerico u oligomerico.

El radical puente es un radical multifuncional (por ejemplo, birradical, trirradical, etc.) que esta unido a cadenas laterales, radicales relacionados con modificaciones postraduccionales (por ejemplo, radicales de sacarido) y/o extremos (es decir, extremo N, extremo C) de dos o mas de los monomeros.

Como se ilustra en el presente documento en la seccion de Ejemplos, los radicales de union relativamente cortos (por ejemplo, PEG², PEG⁴, PEG⁵) pueden ser menos eficaces que los radicales de union mas largos (por ejemplo, PEG²⁸, PEG⁴⁵) en las reticulaciones entre diferente monomeros de a-galactosidasa.

Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, el radical de union no es un enlace covalente, un atomo o grupo qmmico, sino que mas bien es un radical puente.

Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, el radical de union tiene una longitud de al menos 10 atomos, opcionalmente una longitud de al menos 20 atomos, opcionalmente una longitud de al menos 30 atomos, opcionalmente una longitud de al menos 50 atomos, opcionalmente una longitud de al menos 100 atomos y opcionalmente una longitud de al menos 200 atomos.

En el presente documento, la longitud de un radical de union (cuando se expresa como un numero de atomos) se refiere a la longitud de la estructura del radical de union, es decir, el numero de atomos que forman una cadena lineal entre los restos de cada uno de dos monomeros unidos a traves del radical de union.

Opcionalmente, el radical de union esta por debajo de un determinado tamano, para impedir una parte del radical de union innecesariamente excesiva en la protema reticulada formada, que podna interferir con la funcion de la protema.

Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, cada radical de union se caracteriza por un peso molecular de menos de 20 KDa, opcionalmente menos de 10 KDa, opcionalmente menos de 5 KDa y opcionalmente menos de 3 KDa.

Para facilitar la reticulacion, el radical de union es de manera opcional sustancialmente flexible, siendo los enlaces en la estructura del radical de union en su mayor parte rotacionalmente libres, por ejemplo, enlaces sencillos que no estan acoplados a un doble enlace (por ejemplo, a diferencia de un enlace amida) y no estando la rotacion impedida estericamente. Opcionalmente al menos el 70 %, opcionalmente al menos el 80 % y opcionalmente al menos el 90 % (por ejemplo, el 100 %) de los enlaces en la estructura del radical de union es rotacionalmente libre.

En algunas realizaciones, el radical de union comprende una cadena de poli(alquilenglicol).

La frase “poli(alquilenglicol)”, como se usa en el presente documento, incluye una familia de polfmeros de polieter que comparte la siguiente formula general: -O-[(CH²)m-O-]n-, en la que m representa el numero de grupos metileno presente en cada unidad de alquilenglicol, y n representa el numero de unidades de repeticion y, por lo tanto, representa el tamano o la longitud del polfmero. Por ejemplo, cuando m = 2, el polfmero se denomina polietilenglicol y cuando m = 3, el polfmero se denomina polipropilenglicol.

En algunas realizaciones, m es un numero entero mayor que 1 (por ejemplo, m = 2, 3, 4, etc.).

Opcionalmente, m vana entre las unidades de la cadena de poli(alquilenglicol). Por ejemplo, una cadena de poli(alquilenglicol) puede comprender tanto unidades de etilenglicol (m = 2) como de propilenglicol (m = 3) unidas entre su

Opcionalmente, el poli(alquilenglicol) comprende al menos dos grupos funcionales (por ejemplo, como se describe en el presente documento), formando cada grupo funcional un enlace covalente con uno de los monomeros de agalactosidasa. Los grupos funcionales son opcionalmente grupos terminales del poli(alquilenglicol), de tal manera que toda la longitud del poli(alquilenglicol) se encuentra entre los dos grupos funcionales.

La frase “poli(alquilenglicol)” tambien incluye analogos del mismo, en los que el atomo de oxfgeno se reemplaza por otro heteroatomo tal como, por ejemplo, S, -NH- y similares. Este termino incluye adicionalmente derivados de los anteriores en los que se han sustituido uno o mas de los grupos metileno que componen el polfmero. Los sustituyentes ejemplares en los grupos metileno incluyen, pero sin limitacion, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi y similares.

La frase “unidad de alquilenglicol”, como se usa en el presente documento, incluye un grupo -(CH²)m-O- o un analogo del mismo, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, que forma la cadena estructural del poli(alquilenglicol), en el que el (CH²)m (o su analogo) esta unido a un heteroatomo que pertenece a otra unidad de alquilenglicol o a un radical monomerico de a-galactosidasa (en casos de una unidad terminal), y el O (o un analogo de heteroatomo del mismo) esta unido al (CH²)m (o su analogo) de otra unidad de alquilenglicol, o a un grupo funcional que forma un enlace con un monomero de a-galactosidasa.

Una unidad de alquilenglicol puede estar ramificada, de tal manera que esta ligada a tres o mas unidades de alquilenglicol adyacentes, donde cada una de las 3 o mas unidades de alquilenglicol adyacentes son parte de una cadena de poli(alquilenglicol). Dicha unidad ramificada de alquilenglicol esta ligada a traves del heteroatomo de la misma a una unidad de alquilenglicol adyacente, y cada uno de los heteroatomos de las unidades de alquilenglicol adyacentes restantes esta ligado a un atomo de carbono de la unidad de alquilenglicol ramificada. Ademas, un heteroatomo (por ejemplo, nitrogeno) puede unirse a mas de un atomo de carbono de una unidad de alquilenglicol de la que forma parte, formando de este modo una unidad de alquilenglicol ramificada (por ejemplo, [(-CH²)m]²N- y similares).

En realizaciones ejemplares, al menos el 50 % de las unidades de alquilenglicol son identicas, por ejemplo, comprenden los mismos heteroatomos y los mismos valores de m unas que otras. Opcionalmente al menos el 70 %, opcionalmente al menos el 90 % y opcionalmente el 100 % de las unidades de alquilenglicol son identicas. En realizaciones ejemplares, los heteroatomos unidos a las unidades identicas de alquilenglicol son atomos de ox^geno. En realizaciones ejemplares adicionales, m es 2 para las unidades identicas.

En una realizacion, el enlazador es un enlazador de cadena lineal, sencilla, siendo preferentemente polietilenglicol (PEG).

Como se usa en el presente documento, la expresion “poli(etilenglicol)” describe un poli(alquilenglicol), como se define anteriormente en el presente documento, en el que al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 90 % y preferentemente el 100 % de las unidades de alquilenglicol son -CH₂CH₂-O-. De manera similar, la frase “unidades de etilenglicol” se define en el presente documento como unidades de -CH₂CH₂-O-.

De acuerdo con realizaciones opcionales, el radical de union comprende un poli(etilenglicol) o analogo del mismo, que tienen una formula general:

-Xi-(CRiR2-CRaR4-Y)n-X2-en la que cada uno de Xi y X²es un grupo funcional (por ejemplo, como se describe en el presente documento) que forma un enlace covalente con al menos un monomero de a-galactosidasa;

Y es O, S o NR⁵(opcionalmente O);

n es un numero entero, opcionalmente de 1 a 200 (opcionalmente de 5 a 150 y opcionalmente de 40 a 70), aunque tambien se contemplan valores mayores de n; y

En algunas realizaciones, n es al menos 5, opcionalmente al menos 8, opcionalmente al menos 15 y opcionalmente al menos 25 y opcionalmente al menos 40.

En algunas realizaciones, n no es mas de 200, opcionalmente no mas de 150 y opcionalmente no mas de 70.

El poli(etilenglicol) o analogo del mismo puede comprender opcionalmente un copolfmero, por ejemplo, en el que las unidades CR¹R²-CR³R⁴-Y en la formula anterior no son todas identicas entre sf.

En algunas realizaciones, al menos el 50 % de las unidades CR¹R²-CR³R⁴-Y son identicas. Opcionalmente, al menos el 70 %, opcionalmente al menos el 90 % y opcionalmente el 100 % de las unidades CR¹R²-CR³R⁴-Y son identicas.

Opcionalmente, el radical de union esta ramificado, por ejemplo, de tal manera que para una o mas unidades CR¹R²-CR³R⁴-Y en la formula anterior, al menos de uno de R¹, R², R³, R⁴y R⁵es -(CR1R2-CR3R4-Y)p-X3-, donde R¹-R⁴e Y son como se define anteriormente en el presente documento, p es un numero entero como se define en el presente documento para n (por ejemplo, de 1 a 200) y X³es como se define en el presente documento para X¹y X².

Los grupos funcionales pueden formar opcionalmente un enlace tal como, pero sin limitacion, un enlace amina, un enlace amida, un enlace ester y/o un enlace eter.

Por ejemplo, el grupo funcional puede comprender opcionalmente un grupo carbonilo que forma un enlace amida con un atomo de nitrogeno en un polipeptido (por ejemplo, en un resto de lisina o extremo N) o un enlace ester con un atomo de oxfgeno en un polipeptido (por ejemplo, en un resto de serina, treonina o tirosina).

Como alternativa o adicionalmente, el grupo funcional opcionalmente puede comprender un heteroatomo (por ejemplo, N, S, O) que forma un enlace amida, enlace ester o enlace tioester con un grupo carbonilo en un polipeptido (por ejemplo, en un resto de glutamato o aspartato o en un extremo C).

Como alternativa o de manera adicional, el grupo funcional puede comprender un grupo alquilo o arilo unido a un polipeptido (por ejemplo, a un heteroatomo en el polipeptido).

De manera alternativa o adicional, el grupo funcional puede comprender opcionalmente un atomo de nitrogeno que forma un enlace amina con un grupo alquilo en un monomero de a-galactosidasa, o un monomero de agalactosidasa puede opcionalmente comprender un atomo de nitrogeno que forma un enlace amina con un grupo alquilo en el grupo funcional. Dicho enlace amina puede formarse por aminacion reductora (por ejemplo, como se describe mas adelante en el presente documento).

En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos funcionales forma un enlace amida con un polipeptido (por ejemplo, con un resto de lisina en su interior).

Los grupos funcionales pueden ser identicos entre sf o diferentes.

En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos funcionales esta unido a una funcionalidad de un polipeptido (por ejemplo, un grupo amino de un resto de lisina o extremo N), y al menos uno de los grupos funcionales esta unido a una funcionalidad diferente de un polipeptido (por ejemplo, un grupo tiol de un resto de cistema).

De acuerdo con realizaciones opcionales, la estructura de protema multimerica descrita en el presente documento exhibe una alta estabilidad en condiciones plasmaticas humanas y/o en condiciones lisosomicas.

Como se usa en el presente documento, la frase “condiciones plasmaticas humanas” se refiere a plasma humano como medio, a una temperatura de 37 °C.

Como se usa en el presente documento, la frase “condiciones lisosomicas” se refiere a una solucion acuosa que tiene un pH de 4,6 como medio (por ejemplo, un tampon fosfato citrato descrito en el presente documento), a una temperatura de 37 °C.

La mejor estabilidad en condiciones lisosomicas es ventajosa debido a que el lisosoma es una diana para la terapia de reemplazo para la a-galactosidasa, ya que los lisosomas son la localizacion normal de la actividad agalactosidasa en el cuerpo, y las condiciones lisosomicas (por ejemplo, pH acido) representan condiciones optimas para la actividad de la a-galactosidasa.

Sin querer ligarse a ninguna teona particular, se piensa que la mejor estabilidad en condiciones similares al suero (por ejemplo, las condiciones plasmaticas humanas descritas en el presente documento) es tambien ventajosa porque la a-galactosidasa estable en la sangre puede actuar sobre metabolitos (por ejemplo, Gb3) presentes en la sangre como consecuencia de la salida desde las celulas. Una estructura de protema multimerica activa en suero podna opcionalmente ser eficaz en la eliminacion y prevencion de los depositos de glucoesfingolfpidos dentro de las paredes de los vasos sangumeos que promueven la inflamacion [Bodary et al., TCM 17(4): 129-133]. Por ejemplo, en la enfermedad de Fabry, la patogenesis principal resulta de la acumulacion de Gb3 en el endotelio vascular, lo que conduce a una oclusion vascular de los vasos pequenos, isquemia e infarto de estos vasos e isquemia e infarto del rinon, corazon y cerebro [Desnick et al., 2003, Annals of Internal Medicine, 138(4): 338-346]. Adicionalmente, la mayor estabilidad en suero puede anular la necesidad de trafico lisosomico. ERT puede, por lo tanto, volverse mucho mas accesible, ya que pueden emplearse sistemas de hospedadores rentables fuertes, por ejemplo, plantas. De acuerdo con realizaciones opcionales, la alta estabilidad de la estructura de protema multimerica en condiciones plasmaticas humanas es tal que la estructura de protema multimerica exhibe, despues de someterse a condiciones plasmaticas humanas durante una hora, una actividad a-galactosidasa que es al menos un 10 % mayor, opcionalmente un 20 % mayor, opcionalmente el 50 % mayor, y opcionalmente un 100 % mayor, que una actividad a-galactosidasa de la a-galactosidasa nativa despues de someter la a-galactosidasa nativa a las condiciones plasmaticas humanas durante una hora.

De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de protema multimerica en condiciones plasmaticas humanas es tal que la actividad a-galactosidasa de la estructura de protema multimerica disminuye mas lentamente en condiciones plasmaticas humanas que la actividad correspondiente de la a-galactosidasa nativa. Opcionalmente, la estructura de protema multimerica exhibe una actividad que disminuye despues de someter la estructura de protema a condiciones plasmaticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor, opcionalmente un 20 % menor, opcionalmente un 50 % menor y opcionalmente un 80 % menor, que el porcentaje que disminuye la actividad correspondiente de la a-galactosidasa nativa despues de someter la agalactosidasa nativa a condiciones plasmaticas humanas durante una hora.

Debe entenderse que, en el presente documento, una disminucion que es un “10 % menor” que una disminucion del 50 % se refiere a una disminucion del 45 % (siendo 45 un 10 % menor que 50), y no a una disminucion del 40 % (50 %-10 %).

De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de protema multimerica en condiciones plasmaticas humanas es tal que la actividad a-galactosidasa de la estructura de protema multimerica permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones plasmaticas humanas durante una hora, y opcionalmente durante 2, 4 o incluso 6 horas.

Como se usa en el presente documento, la frase “sustancialmente sin cambios” se refiere a un nivel (por ejemplo, de actividad) que permanece en un intervalo del 50 % al 150 % del nivel inicial, y opcionalmente un nivel que permanece al menos en un 60 %, opcionalmente al menos en un 70 %, opcionalmente al menos en un 80 % y opcionalmente al menos en un 90 % del nivel inicial.

Opcionalmente, la alta estabilidad de la estructura de protema multimerica en condiciones lisosomicas es tal que la estructura de protema multimerica exhibe, despues de someterse a condiciones lisosomicas durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, un dfa, dos dfas, tres dfas, una semana), una actividad a-galactosidasa que es al menos un 10 % mayor, opcionalmente un 20 % mayor, opcionalmente un 50 % mayor y opcionalmente un 100 % mayor que la actividad de la a-galactosidasa nativa despues de someter la a-galactosidasa nativa a las condiciones lisosomicas durante el mismo periodo de tiempo predeterminado.

De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de protema multimerica en condiciones lisosomicas es tal que una actividad a-galactosidasa de la estructura de protema multimerica disminuye mas lentamente en condiciones lisosomicas que una actividad correspondiente de la a-galactosidasa nativa. Opcionalmente, la estructura de protema multimerica exhibe una actividad que disminuye despues de someter la estructura de protema a condiciones lisosomicas durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo un dfa, 2 dfas, 3 dfas, una semana), en un porcentaje que es al menos un 10 % menor, opcionalmente un 20 % menor, opcionalmente un 50 % menor y opcionalmente un 80 % menor, que el porcentaje que disminuye la actividad correspondiente de la alfa-galactosidasa nativa despues de someter la alfa-galactosidasa nativa a condiciones lisosomicas durante el mismo periodo de tiempo.

De manera alternativa o adicional, la alta estabilidad de la estructura de protema multimerica en condiciones lisosomicas es tal que una actividad a-galactosidasa de la estructura de protema multimerica permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones lisosomicas durante un dfa, durante 2 dfas, durante 3 dfas, durante una semana, durante dos semanas y/o durante un mes. Como se ilustra en la seccion de Ejemplos del presente documento, ademas de exhibir mas estabilidad a lo largo del tiempo, la estructura de protema multimerica puede exhibir parametros de actividad a-galactosidasa que son diferentes de los de la a-galactosidasa nativa.

Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones opcionales, la estructura de protema multimerica se caracteriza por exhibir, independientemente de cualquier degradacion de actividad a lo largo del tiempo, una actividad agalactosidasa que es mayor que una actividad a-galactosidasa de una forma nativa de la protema. Opcionalmente, la actividad es un 10 % mayor y, opcionalmente, un 20 % mayor, que la actividad correspondiente de la forma nativa. Para caracterizar dicha actividad, la actividad se determina preferentemente de manera inmediata (por ejemplo, antes de que haya transcurrido 1 hora, antes de que hayan transcurrido 15 minutos) despues de someter la agalactosidasa nativa o la estructura de protema multimerica a condiciones (por ejemplo, como se describe en el presente documento) en las cuales la actividad disminuye sustancialmente, de tal manera que la actividad medida reflejara la actividad por sf misma y no un grado de estabilidad.

Opcionalmente, la estructura de protema multimerica se caracteriza por exhibir una actividad a-galactosidasa en condiciones lisosomicas que es mayor que una actividad correspondiente de la a-galactosidasa nativa.

De manera alternativa o adicional, la estructura de protema multimerica se caracteriza por exhibir una actividad agalactosidasa en condiciones fisiologicas simuladas a un pH neutro que es mayor que una actividad correspondiente de la a-galactosidasa nativa. Las condiciones fisiologicas simuladas comprenden una solucion acuosa (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato) a una temperatura de 37 °C. El pH es opcionalmente 7. Como alternativa, el pH es de 7,4.

La actividad a-galactosidasa descrita en el presente documento es una actividad biologica que es caractenstica de la a-galactosidasa (por ejemplo, una actividad catalftica caractenstica de la a-galactosidasa, tal como hidrolisis de un radical a-galactosil terminal de un sustrato).

En algunas realizaciones, la actividad catalftica de la a-galactosidasa se caracteriza por una velocidad de catalisis a saturacion (es decir, un valor Vmax).

De manera alternativa, la actividad a-galactosidasa es una actividad terapeutica (por ejemplo, una actividad enzimatica que tiene un efecto terapeutico), tal como una actividad terapeutica en el contexto de la enfermedad de Fabry. Opcionalmente, la actividad terapeutica se determina en animales experimentales (por ejemplo, ratones con enfermedad de Fabry) y, opcionalmente, en pacientes humanos con enfermedad de Fabry.

Un experto en la materia conocera tecnicas para determinar la actividad a-galactosidasa. Tfpicamente, la agalactosidasa (es decir, la forma nativa o una estructura de protema multimerica descrita en el presente documento) se pone en contacto con un compuesto reconocido en la tecnica como sustrato de la a-galactosidasa, y despues se determina el grado de actividad de un modo cuantitativo. En la tecnica se conocen compuestos que permiten la deteccion particularmente conveniente de la actividad a-galactosidasa y se encuentran disponibles en el mercado. En algunas realizaciones, la actividad a-galactosidasa se determina ensayando la hidrolisis de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido (por ejemplo, como se describe en la seccion de Ejemplos del presente documento).

En algunas realizaciones, la actividad a-galactosidasa se determina ensayando la hidrolisis de p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido (por ejemplo, como se describe en la seccion de Ejemplos del presente documento).

Cuando se compara una actividad de una estructura de protema multimerica descrita en el presente documento con una actividad de la a-galactosidasa nativa, la a-galactosidasa nativa comprende preferentemente monomeros de agalactosidasa sustancialmente identicos (por ejemplo, con respecto a la secuencia de aminoacidos y el patron de glucosilacion) a los monomeros de a-galactosidasa de la estructura multimerica.

De acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de protema multimerica se caracteriza por una semivida en circulacion en un sistema fisiologico (por ejemplo, sangre, suero y/o plasma de un ser humano o animal de laboratorio) que es mayor (por ejemplo, al menos un 20 %, al menos un 50 % mayor, al menos un 100 % mayor, al menos un 400 % mayor o al menos un 900 % mayor) que una semivida en circulacion de la a-galactosidasa nativa. Una semivida en circulacion aumentada puede asociarse opcionalmente con una mayor estabilidad in vitro (por ejemplo, como se describe en el presente documento), una mayor estabilidad in vivo (por ejemplo, resistencia al metabolismo) y/o junto con otros factores (por ejemplo, eliminacion renal reducida).

Las semividas de circulacion pueden determinarse cogiendo muestras (por ejemplo, muestras sangumeas, muestras tisulares) de sistemas fisiologicos (por ejemplo, seres humanos, animales de laboratorio) a diversos intervalos y determinando el nivel de a-galactosidasa en la muestra, usando tecnicas conocidas en este campo.

Opcionalmente, la semivida se calcula como una semivida terminal (por ejemplo, como se describe en la seccion de Ejemplos), donde la semivida es el tiempo necesario para que una concentracion (por ejemplo, una concentracion sangumea) disminuya en un 50 % despues de haber alcanzado el seudoequilibrio de distribucion. La semivida terminal puede calcularse a partir de una parte lineal terminal de una curva de tiempo frente al log de la concentracion, por regresion lineal de la curva de tiempo frente al log de la concentracion (vease, por ejemplo, Toutain y Bousquet-Melou [J Vet Pharmacol Ther 2004, 27: 427-39]). Por lo tanto, la semivida terminal es una medida de la disminucion de la concentracion plasmatica de farmaco debida a la eliminacion del farmaco y no de la disminucion debida a otras razones, y no es necesariamente el tiempo necesario para que la cantidad del farmaco administrado se reduzca a la mitad.

La determinacion del nivel de a-galactosidasa (por ejemplo, la estructura de protema multimerica o la agalactosidasa nativa) puede comprender la deteccion de la presencia ffsica de a-galactosidasa (por ejemplo, mediante un anticuerpo contra a-galactosidasa) y/o la deteccion del nivel de una actividad a-galactosidasa (por ejemplo, como se describe en el presente documento).

De acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de protema multimerica se caracteriza por una actividad agalactosidasa en un organo (por ejemplo, bazo, corazon, rinon, cerebro, hngado) despues de la administracion (por ejemplo, administracion intravenosa) de la estructura de protema a un vertebrado (por ejemplo, un ser humano, un raton), por ejemplo, un vertebrado con un deficit de a-galactosidasa (por ejemplo, un paciente humano con la enfermedad de Fabry, un raton con la enfermedad de Fabry). Opcionalmente, la actividad a-galactosidasa en el organo es mayor que la actividad a-galactosidasa de la a-galactosidasa nativa en el organo, despues de una administracion equivalente a un vertebrado.

La actividad en un organo puede ser una funcion de la captacion de la a-galactosidasa y/o la retencion de la actividad a-galactosidasa despues de la captacion.

Opcionalmente, la actividad a-galactosidasa en el organo se determina 2 horas despues de la administracion, y opcionalmente 24 horas, opcionalmente 3 dfas, opcionalmente 7 dfas y opcionalmente 14 dfas despues de la administracion.

Un aumento de la actividad de la a-galactosidasa en el tngado en algunos casos puede estar asociada con una menor actividad en otras partes del cuerpo y, por lo tanto, con un efecto biologico reducido de la a-galactosidasa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la estructura de protema multimerica se caracteriza por una mayor actividad a-galactosidasa en un organo distinto del hngado. Como ejemplos de organos incluyen el bazo, el corazon y los rinones.

En algunas realizaciones, la estructura de protema multimerica se caracteriza por una mayor actividad agalactosidasa en un organo despues de la administracion (como se describe en el presente documento) que es al menos un 20 % mayor, opcionalmente al menos un 50 % mayor, opcionalmente al menos un 100 % mayor, y opcionalmente al menos un 300 % mayor, que la actividad de la a-galactosidasa nativa despues de una administracion equivalente. Como se ha indicado anteriormente en el presente documento, los autores de la presente invencion han contemplado y preparado satisfactoriamente y llevado a la practica formas estabilizadas de a-galactosidasa mediante estructuras multimericas de monomeros de a-galactosidasa reticulados.

Opcionalmente, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa humana (por ejemplo, una a-galactosidasa humana recombinante), por ejemplo, para facilitar la biocompatibilidad optima para la administracion a sujetos humanos. La a-galactosidasa humana se encuentra disponible en el mercado, por ejemplo, como Replagal® (agalsidasa alfa, Shire) y Fabrazyme® (agalsidasa beta, Genzyme).

En el presente documento, “a-galactosidasa humana” se refiere a una a-galactosidasa que comprende una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica (por ejemplo, como se describe anteriormente en el presente documento) a una secuencia de aminoacidos de una protema a-galactosidasa que se produce de manera natural en seres humanos.

En algunas realizaciones, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa recombinante vegetal. Las a-galactosidasas ejemplares incluyen a-galactosidasas humanas recombinantes vegetales.

Como ejemplos de a-GAL se incluyen, sin limitacion, a-GAL que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Opcionalmente, la a-GAL tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Como se usa en el presente documento, “a-galactosidasa” se refiere a cualquier protema que exhibe una actividad enzimatica (por ejemplo, hidrolisis) hacia radicales de galactosa en Gb3 (por ejemplo, a-galactosidasa A). Opcionalmente, “a-galactosidasa” se refiere a E.C. 3.2.1.22.

La a-galactosidasa de las realizaciones de la invencion puede purificarse (por ejemplo, de tejido de plantas o animales) o generarse mediante tecnologfa de ADN recombinante.

Como se describe en el presente documento, la actividad de a-galactosidasa en suero puede ser muy ventajosa, por ejemplo, para reducir niveles de Gb3 en suero.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa alcalina.

Como se usa en el presente documento, la frase “a-galactosidasa alcalina” se refiere a a-GAL caracterizada por la capacidad de hidrolizar los radicales de a-galactosa ligados al extremo de oligosacaridos que contienen galactosa en condiciones de pH neutro a basico (por ejemplo, a aproximadamente pH 7-7,5), particularmente a un pH en suero normal (por ejemplo, aproximadamente 7,35-7,45).

Se apreciara que una a-GAL alcalina de algunas realizaciones de la invencion puede ser activa en condiciones de pH neutras a basicas, pero tambien puede presentar actividad en condiciones de pH acidas (es decir, a aproximadamente 4,6).

En una realizacion espedfica, la enzima es activa en condiciones de pH de acido a basico (es decir, aproximadamente pH 4,2-7,5).

En otra realizacion espedfica mas, la enzima es activa a un pH de aproximadamente 6,5-7,5.

En la Solicitud de Patente US 20070036883, documento WO03/097791 y en PCT/IL2010/000956, se proporcionan ejemplos espedficos de a-galactosidasas alcalinas que pueden usarse de acuerdo con las presentes ensenanzas. Por lo tanto, la a-galactosidasa alcalina puede ser un miembro de la familia de plantas seleccionada del grupo que consiste en las familias Cucurbitaceae, Lamiaceae, Piperaceae, Solanaceae, Leguminosae, Cruciferae y Gramineae. De acuerdo con una realizacion espedfica, la a-galactosidasa alcalina es de melon.

P.-R. Gaudreault y JA Webb han descrito en diversas publicaciones (tales como “Alkaline alpha-galactosidase in leaves of Cucurbita pepo”, Plant Sci. Lett. 24, 281-288, 1982, “Partial purification and properties of an alkaline alphagalactosidase from mature leaves of Cucurbita pepo”, Plant Physiol., 71, 662-668, 1983, y “Alkaline alphagalactosidase activity and galactose metabolism in the family Cucurbitaceae”, Plant Science, 45, 71-75, 1986), una nueva a-galactosidasa purificada de plantas jovenes de Cucurbita pepo, que tiene una actividad optima en condiciones alcalinas (pH 7,5). Ademas de la a-galactosidasa alcalina, tambien pueden indicarse tres formas acidas de la enzima, y se descubrieron preferencias de sustrato distintas para las formas acida y alcalina.

Se ha observado actividad a-galactosidasa a pH alcalino en otros tejidos de cucurbitaceas, tales como los pedicelos del fruto del pepino, fruto joven de calabaza y fruto joven de melon (“Melons: Biochemical and Physiological Control of Sugar Accumulation”, En: Encyclopedia of Agricultural Science, vol. 3, pags. 25-37, Arntzen, C. J., et al., eds. Academic Press, Nueva York, 1994).

Bachmann et al. (“Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptens L.”, Plant Physiology 105: 1335-1345, 1994) afirman que en las plantas de Ajuga reptens (consuelda comun), un translocador de estaquiosa de la familia Lamiaceae no relacionada tambien contiene una a-galactosidasa alcalina. Esta enzima se caracterizo parcialmente y se descubrio que tema alta afinidad por estaquiosa. Ademas, las hojas de la planta Peperomia camptotricha L., de la familia Piperaceae, muestran actividad a-galactosidasa a pH alcalino, lo que sugiere que tambien contienen una enzima a-galactosidasa alcalina (Madore, M., “Catabolism of raffinose family oligosaccharides by vegetative sink tissues”, En: Carbon Partitioning and Source-Sink Interactions in Plants, Madore, M. and Lucas, W. J. (eds.) pags. 204-214, 1995, American Society of Plant Physiologists, Maryland). De manera similar, Gao y Schaffer (Plant Physiol. 1999; 119: 979-88) han descrito una actividad a-galactosidasa con un pH alcalino optimo en extractos brutos de tejidos de una variedad de especies que incluyen miembros de las familias Cucurbit y Coleus (Lamiaceae).

Se proporcionan ejemplos espedficos de secuencias de a-galactosidasa alcalina de plantas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 13 (Cucumis melo), 6 (T. tetragonioides), 7 y 12 (Cucumis sativus), 8 y 9 (Zea mays), 10 (Oruza sativa), 11 (Pisum sativum) y 14 (Coffea arabica).

En algunas realizaciones, la a-galactosidasa es una a-galactosidasa acida.

Como se usa en el presente documento, “a-galactosidasa acida” se refiere a una a-galactosidasa caracterizada por una capacidad de hidrolizar radicales de a-galactosidasa unidos al extremo de oligosacaridos que contienen galactosa en condiciones de pH acidas (por ejemplo, a aproximadamente pH 4,2-5), tales como las que existen en un lisosoma.

La a-galactosidasa de realizaciones de la invencion puede ser de cualquier fuente humana, animal o vegetal, siempre que despues de la administracion in vivo no se induzca una reaccion inmunologica excesivamente adversa (por ejemplo, planta contra ser humano).

Para reducir la reaccion inmunologica, puede coadministrarse una preparacion de a-galactosidasa no humana (por ejemplo, de a-galactosidasa vegetal) con una a-galactosidasa humana (es decir, a-galactosidasa humana acida). Opcionalmente, la estructura de protema multimerica comprende adicionalmente al menos un radical de manosa-6-fosfato (M6P). El radical (o radicales) de M6P puede ligarse a uno o mas de los monomeros de a-galactosidasa de la estructura de protema multimerica (por ejemplo, mediante un enlazador).

En el documento WO 2009/024977 se describen tecnicas y reactivos para introducir radicales que contienen M6P en una biomolecula (por ejemplo, un polipeptido).

Como se ilustra en la seccion de Ejemplos del presente documento, una estructura de protema multimerica descrita en el presente documento puede prepararse convenientemente haciendo reaccionar la a-galactosidasa con un agente de reticulacion.

Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un proceso para la preparacion de una estructura de protema multimerica descrita en el presente documento. El proceso comprende hacer reaccionar la a-galactosidasa para introducir al menos un radical de union que une de manera covalente al menos dos monomeros de a-galactosidasa.

Opcionalmente, el radical de union es un enlace (por ejemplo, un enlace amida, un enlace disulfuro) que une un monomero de a-galactosidasa con otro monomero de a-galactosidasa. Opcionalmente, el enlace se introduce usando condiciones y/o reactivos adecuados. Por ejemplo, en la tecnica se conocen reactivos que son adecuados para la formacion de un enlace amida a partir de un grupo de acido carboxflico y un grupo amina.

Opcionalmente, el radical de union es un radical que no procede de una parte de la a-galactosidasa. Por ejemplo, el radical de union puede ser un oligomero, un polfmero, un resto de una molecula pequena (por ejemplo, un aminoacido).

En algunas realizaciones, el radical de union se introduce haciendo reaccionar la a-galactosidasa con un agente de reticulacion que comprende el radical de union (por ejemplo, como se describe en el presente documento) y al menos dos grupos reactivos.

Opcionalmente, la a-galactosidasa reacciona en condiciones en las que la a-galactosidasa nativa esta en una forma dimerica.

En algunas realizaciones, el agente de reticulacion reacciona con la a-galactosidasa a una proporcion molar en un intervalo de 5:1 a 500:1 (agente de reticulacion:monomero de a-galactosidasa), opcionalmente en un intervalo de 50:1 a 400:1, y opcionalmente en un intervalo de 75:1 a 300:1 (por ejemplo, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1).

El proceso comprende opcionalmente ademas purificar la protema reticulada, por ejemplo, retirando el exceso de agente de reticulacion. Pueden usarse metodos de purificacion comunes, tales como dialisis y/o ultrafiltracion, usando membranas de corte apropiado y/o etapas cromatograficas adicionales, incluyendo cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba y similares.

El grupo reactivo se selecciona para que sea adecuado para someterse a una reaccion qmmica que conduzca a la formacion de un enlace con una funcionalidad complementaria en el monomero de a-galactosidasa. Opcionalmente, cada grupo reactivo es capaz de formar un enlace covalente entre el radical de union descrito en el presente documento y al menos un polipeptido (por ejemplo, para formar un grupo funcional unido al polipeptido, como se describe en el presente documento).

Los grupos reactivos de un agente de reticulacion pueden ser identicos o diferentes entre st

Como se usa en el presente documento, la frase “grupo reactivo” describe un grupo qrnmico que es capaz de someterse a una reaccion qmmica que tfpicamente conduce a la formacion de un enlace. El enlace, de acuerdo con las presentes realizaciones, es preferentemente un enlace covalente (por ejemplo, para cada uno de los grupos reactivos). Las reacciones qmmicas que conducen a la formacion de un enlace incluyen, por ejemplo, sustituciones nucleofilas y electrofilas, reacciones de adicion nucleofilas y electrofilas, alquilaciones, reacciones de adicioneliminacion, reacciones de cicloadicion, reacciones de transposicion y cualquier otra reaccion organica conocida que implique un grupo funcional, asf como combinaciones de las mismas.

El grupo reactivo puede comprender opcionalmente una parte no reactiva (por ejemplo, un alquilo) que puede servir, por ejemplo, para unir una parte reactiva del grupo reactivo a un radical de union (por ejemplo, poli(alquilenglicol) o analogo del mismo) descrito en el presente documento.

El grupo reactivo se selecciona preferentemente para permitir su conjugacion con la a-galactosidasa. Los grupos reactivos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, carboxilato (por ejemplo, -CO²H), tiol (-SH), amina (-NH²), halo, azida (-N³), isocianato (-NCO), isotiocianato (-N = C = S), hidroxi (-OH), carbonilo (por ejemplo, aldehfdo), maleimida, sulfato, fosfato, sulfonilo (por ejemplo, mesilo, tosilo), etc., asf como grupos activados, tales como N-hidroxisuccinimida (NHS) (por ejemplo, esteres de NHS), sulfo-N-hidroxisuccinimida, anhfdrido, haluro de acilo (-C(=O)-halogeno), etc.

En algunas realizaciones, el grupo reactivo comprende un grupo saliente, tal como un grupo saliente susceptible a la sustitucion nucleofila (por ejemplo, halo, sulfato, fosfato, carboxilato, N-hidroxisuccinimida).

Opcionalmente, el grupo reactivo puede estar en una forma activada del mismo.

Como se usa en el presente documento, la frase “forma activada” describe un derivado de un grupo qrnmico (por ejemplo, un grupo reactivo) que es mas reactivo que el grupo qrnmico y que, por lo tanto, es capaz de someterse a una reaccion qmmica que conduzca a la formacion de un enlace. La forma activada puede comprender un grupo saliente particularmente adecuado, facilitando de este modo las reacciones de sustitucion. Por ejemplo, un grupo -C(=O)-NHS (ester de N-hidroxisuccinimida o -C(=O)-O-succinimida) es una forma activada bien conocida de -C(=O)OH, ya que la NHS (N-hidroxisuccinimida) puede reaccionar con un -C(=O)OH para formar -C(=O)-NHS, que reacciona facilmente para formar productos caractensticos de reacciones que implican grupos -C(=O)OH, tales como amidas y esteres.

El grupo reactivo puede unirse al resto del radical de union (por ejemplo, un poli(alquilenglicol) o analogo del mismo) a traves de grupos, atomos o enlaces diferentes. Estos pueden incluir un enlace eter [por ejemplo, -O-alquilo], un enlace ester [por ejemplo, -OC(=O)-alquilo], un carbamato [por ejemplo OC(=O)-NH-alquilo], etc. Por lo tanto, pueden emplearse una variedad de grupos terminales.

Los siguientes son ejemplos no limitantes de los diferentes grupos que pueden constituir un grupo reactivo como se describe en el presente documento: -CH²CO²H, -CH₂CH₂CO²H, -CH₂CH₂SH, -CH₂CH₂NH², -CH₂CH₂N³, -CH₂CH₂NCO, -CH²-C(=O)-NHS, -CH₂CH₂-C(=O)-NHS, -C(=O)-CH²-C(=O)-NHS, -CH₂CH₂-NHC(=O)CH₂CH₂-maleimida, etc.

El numero de grupos metileno en cada uno de los grupos reactivos anteriores es meramente ejemplar, y puede variarse.

El grupo reactivo tambien puede comprender el heteroatomo en el extremo de una cadena de poli(alquilenglicol) (por ejemplo, -OH).

En realizaciones ejemplares de la presente invencion, el grupo reactivo comprende un carboxilato (por ejemplo, un carboxilato activado tal como un ester de N-hidroxisuccinimida).

Opcionalmente, el grupo reactivo reacciona con un grupo amina en la a-galactosidasa (por ejemplo, en un resto de lisina y/o un extremo N) para formar un enlace amida.

En algunas realizaciones, la reaccion del grupo reactivo comprende aminacion reductora, en la que un grupo amino reacciona con un grupo aldehfdo para formar una imina y la imina se reduce (por ejemplo, por la adicion de un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio) para formar un enlace amina. El grupo reactivo puede ser un grupo amina que reacciona con un grupo aldehndo de la a-galactosidasa (por ejemplo, en un radical de sacarido unido al polipeptido de la protema) o el grupo reactivo puede ser un grupo aldehndo que reacciona con un grupo amina de la a-galactosidasa (por ejemplo, en un resto de lisina). Opcionalmente, un radical de sacarido de agalactosidasa se oxida con un agente oxidante para formar un grupo aldehndo, antes de la reaccion del grupo reactivo con la a-galactosidasa. Por ejemplo, puede usarse la reaccion de un sacarido con peryodato de sodio para producir un par de grupos aldehndo en un radical de sacarido.

En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos reactivos se selecciona para que reaccione con una funcionalidad de un monomero de a-galactosidasa (por ejemplo, un grupo amino de un resto de lisina o extremo N) y al menos uno de los grupos reactivos se selecciona para que reaccione con una funcionalidad diferente de un monomero de a-galactosidasa (por ejemplo, un grupo tiol de un resto de cistema).

Opcionalmente, uno o mas polipeptidos descritos en el presente documento se hacen reaccionar con un reactivo de glucosilacion para la introduccion de uno o mas radicales de M6P, para obtener una estructura de protema multimerica que contenga M6P (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Se describen reactivos de glucosilacion que contienen M6P adecuados y su uso, por ejemplo, en el documento WO 2009/024977.

Como se usan en el presente documento, los terminos “amina” y “amino” se refieren a un grupo -NR'R”, en el que R' y R” se seleccionan del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalidclico (unido a traves de un anillo de carbono), arilo y heteroarilo (unido a traves de un anillo de carbono). R' y R” estan unidos a traves de un atomo de carbono de los mismos. Opcionalmente, R' y R” se seleccionan del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo que comprende de 1 a 4 atomos de carbono. Opcionalmente, R' y R” son hidrogeno.

Como se usa a lo largo del presente documento, el termino “alquilo” se refiere a un hidrato de carbono alifatico saturado que incluye grupos de cadena lineal y ramificada. Preferentemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 atomos de carbono. Cuando en el presente documento se indica un intervalo numerico; por ejemplo, “1-20”, esto implica que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 atomo de carbono, 2 atomos de carbono, 3 atomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 20 atomos de carbono. Mas preferentemente, el alquilo es un alquilo de tamano medio que tiene de 1 a 10 atomos de carbono. Mas preferentemente, a menos que se indique otra cosa, el alquilo es un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 atomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido o no. Cuando esta sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalidclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, de la manera en que estos terminos se definen en el presente documento.

Un grupo “cicloalquilo” se refiere a un anillo compuesto totalmente de carbono, monodclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par adyacente de atomos de carbono), en el que uno o mas de los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Son ejemplos, sin limitacion, de grupos cicloalquilo ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido o no. Cuando esta sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalidclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, de la manera en que estos terminos se definen en el presente documento.

Un grupo “alquenilo” se refiere a un grupo alquilo que consta de al menos dos atomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono.

Un grupo “alquinilo” se refiere a un grupo alquilo que consta de al menos dos atomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono.

Un grupo “arilo” se refiere a grupos compuestos totalmente de carbono, monodclicos o polidclicos de anillo condensado (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de atomos de carbono) que tienen un sistema de electron pi completamente conjugado. Son ejemplos, sin limitacion, de grupos arilo fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar o no sustituido. Cuando esta sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalidclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como se definen estos terminos en el presente documento.

Un grupo “heteroarilo” se refiere a un anillo monodclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par de atomos adyacentes) que tiene en el anillo o los anillos uno o mas atomos, tales como, por ejemplo, nitrogeno, oxfgeno y azufre y, ademas, tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Como ejemplos, sin limitacion, de grupos heteroarilo se incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede estar o no sustituido. Cuando esta sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalidclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como estos terminos se definen en el presente documento.

Un grupo “heteroalidclico” se refiere a un grupo de anillo monodclico o condensado que tiene en el anillo o los anillos uno o mas atomos tales como nitrogeno, oxfgeno y azufre. Los anillos tambien pueden tener uno o mas dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugados. El heteroalidclico puede estar sustituido o no sustituido. Cuando esta sustituido, el grupo sustituido puede ser, por ejemplo, un par de electrones, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalidclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, azida, fosfonilo, fosfinilo, oxo, carbonilo, tiocarbonilo, urea, tiourea, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido y amino, como estos terminos se definen en el presente documento. Son ejemplos representativos piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolina y similares.

Un grupo “hidroxi” se refiere a un grupo -OH.

Un grupo “azida” se refiere a un grupo -N=N+=N'.

Un grupo “alcoxi” se refiere tanto a un -O-alquilo como a un grupo -O-cicloalquilo, como se define en el presente documento.

Un grupo “ariloxi” se refiere tanto a un -O-arilo como a un grupo -O-heteroarilo, como se define en el presente documento.

Un “eter” se refiere tanto a un alcoxi como a un grupo un ariloxi, en el que el grupo esta unido a un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heteroalidclico.

Un enlace eter describe un enlace -O-.

Un grupo “tiohidroxi” o “tiol” se refiere a un grupo -SH.

Un grupo “tioalcoxi” se refiere tanto a un grupo -S-alquilo como a un grupo -S-cicloalquilo, como se define en el presente documento.

Un grupo “tioariloxi” se refiere tanto a un grupo -S-arilo como a un grupo -S-heteroarilo, como se define en el presente documento.

Un “tioeter” se refiere tanto a un grupo tioalcoxi como a un grupo tioariloxi, en el que el grupo esta unido a un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heteroalidclico.

Un enlace tioeter describe un enlace -S-.

Un grupo “disulfuro” se refiere tanto a un grupo -S-tioalcoxi como a un grupo -S-tioariloxi.

Un enlace disulfuro describe un enlace -S-S-.

Un grupo “carbonilo” se refiere a un grupo -C(=O)-R', en el que R' es como se define en el presente documento anteriormente.

Un grupo “tiocarbonilo” se refiere a un grupo -C(=S)-R', en el que R' es como se define en el presente documento. Un “carboxilo” se refiere tanto a un “C-carboxi” como a un O-carboxi”.

Un grupo “C-carboxi” se refiere a grupos -C(=O)-O-R', donde R' es como se define en el presente documento.

Un grupo “O-carboxi” se refiere a un grupo R'C(=O)-O-, donde R' es como se define en el presente documento. Un grupo “oxo” se refiere a un grupo =O.

Un “carboxilato” o “carboxilo” incluye grupos tanto C-carboxi como O-carboxi, como se definen en el presente documento.

Un grupo “acido carboxflico” se refiere a un grupo C-carboxi en el que R' es hidrogeno.

Un grupo “tiocarboxi” o “tiocarboxilato” se refiere a grupos tanto -C(=S)-O-R' como -O-C(=S)R'.

Un “ester” se refiere a un grupo C-carboxi en el que R' no es hidrogeno.

Un enlace ester se refiere a un enlace -O-C(=O)-.

Un enlace tioester se refiere a un enlace -O-C(=S)- o a un enlace -S-C(=O).

Un grupo “halo” se refiere a fluor, cloro, bromo o yodo.

Un grupo “sulfinilo” se refiere a un grupo -S(=O)-R', en el que R' es como se define en el presente documento.

Un grupo “sulfonilo” se refiere a un grupo -S(=O)²-R', en el que R' es como se define en el presente documento. Un grupo “sulfonato” se refiere a un grupo -S(=O)²-O-R', en el que R' es como se define en el presente documento. Un grupo “sulfato” se refiere a un grupo -O-S(=O)²-O-R', en el que R' es como se define en el presente documento. Un grupo “sulfonamida” o “sulfonamido” incluye grupos tanto S-sulfonamido como N-sulfonamido, como se define en el presente documento.

Un grupo “S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(=O)²-NR'R”, en el que R' y R” son como se definen en el presente documento.

Un grupo “N-sulfonamido” se refiere a un grupo R'S(=O)²-NR”, en el que cada R' y R" es como se define en el presente documento.

Un grupo “O-carbamilo” se refiere a un grupo -OC(=O)-NR'R”, en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento.

Un grupo “N-carbamilo” se refiere a un grupo R'OC(=O)-NR”-, en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento.

Un grupo “carbamilo” o “carbamato” incluye grupos tanto O-carbamilo como N-carbamilo.

Un enlace carbamato describe un enlace -O-C(=O)-NR'-, en el que R es como se describe en el presente documento.

Un grupo “O-tiocarbamilo” se refiere a un grupo -OC(=S)-NR'R”, en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento.

Un grupo “N-tiocarbamilo” se refiere a un grupo R'OC(=S)NR”-, en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento.

Un grupo “tiocarbamilo” o “tiocarbamato” incluye grupos tanto O-tiocarbamilo como N-tiocarbamilo.

Un enlace tiocarbamato describe un enlace -O-C(=S)-NR'-, en el que R' es como se describe en el presente documento.

Un grupo “C-amido” se refiere a un grupo -C(=O)-NRR”, en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento.

Un grupo “N-amido” se refiere a un grupo R'C(=O)-NR”-, en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento.

Un grupo “amida” incluye grupos tanto C-amido como N-amido.

Un enlace amida describe un enlace -NR'-C(=O)-, en el que R' como se define en el presente documento.

Un enlace amina describe un enlace entre un atomo de nitrogeno en un grupo amina (como se define en el presente documento) y un grupo R' en el grupo amina.

Un enlace tioamida describe un enlace -NR'-C(=S)-, en el que R' es como se define en el presente documento.

Un grupo “urea” se refiere a un grupo -N(R')-C(=O)-NR”R”', en el que cada uno de R' y R” es como se define en el presente documento y R "' se define como R' y R” como se definen en el presente documento.

Un grupo “nitro” se refiere a un grupo -NO².

Un grupo “ciano” se refiere a un grupo -C^eN.

El termino “fosfonilo” o “fosfonato” describe un grupo -P(=O)(OR')(OR”), siendo R' y R” como se definen anteriormente en el presente documento.

El termino “fosfato” describe un grupo -O-P(=O)(OR')(OR”), siendo cada uno de R' y R” como se definen en el presente documento anteriormente.

Un “acido fosforico” es un grupo fosfato en el que cada uno de R es hidrogeno.

El termino “fosfinilo” describe un grupo -PR'R”, siendo cada uno de R' y R” como se definen anteriormente en el presente documento.

El termino “tiourea” describe un grupo -N(R')-C(=S)-NR”-, siendo cada uno de R' y R” como se definen anteriormente en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, las estructuras de protema multimerica descritas en el presente documento pueden exhibir una estabilidad mejorada y una actividad a-galactosidasa mas fuerte y/o mas duradera en sitios terapeuticamente importantes in vivo. Dichas estructuras de protema multimerica son, por lo tanto, muy beneficiosas para su uso en diversas aplicaciones medicas en las que es deseable la actividad a-galactosidasa, incluyendo aplicaciones terapeuticas y de investigacion.

Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones, la estructura de protema multimerica descrita en el presente documento es para su uso como un medicamento, por ejemplo, un medicamento para tratar la enfermedad de Fabry.

De acuerdo con otro aspecto de realizaciones de la invencion, se proporciona un metodo de tratamiento de la enfermedad de Fabry, comprendiendo el metodo la administracion a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapeuticamente eficaz de una estructura de protema multimerica descrita en el presente documento.

De acuerdo con otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una estructura de protema multimerica como se describe en el presente documento y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, una “composicion farmaceutica” se refiere a la preparacion de una o mas de las estructuras de protema multimerica descritas en el presente documento, con otros componentes qmmicos tales como vehmulos y excipientes farmaceuticamente aceptables y adecuados. El proposito de una composicion farmaceutica es facilitar la administracion de un compuesto a un organismo.

En lo sucesivo en el presente documento, la expresion “vehmulo farmaceuticamente aceptable” se refiere a un vehmulo o a un diluyente que no ocasiona irritacion significativa en un organismo y no anula la actividad y propiedades biologicas del compuesto administrado. Son ejemplos, sin limitaciones, de vehmulos: propilenglicol, solucion salina, emulsiones y mezclas de disolventes organicos con agua, asf como vehmulos solidos (por ejemplo, en polvo) y gaseosos.

En el presente documento, el termino “excipiente” se refiere a una sustancia inerte anadida a una composicion farmaceutica para facilitar adicionalmente la administracion de un compuesto. Como ejemplos, sin limitacion, de excipientes se incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azucares y tipos de almidon, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

La composicion farmaceutica comprende opcionalmente un ingrediente adicional que tambien estabiliza la agalactosidasa de la estructura de protema multimerica. Opcionalmente, el ingrediente adicional es galactosa.

Como alternativa, puede usarse un derivado de galactosa (por ejemplo, un glucosido que contenga galactosa) en lugar de galactosa. Opcionalmente, se usa un derivado de galactosa no reductor.

Pueden encontrarse tecnicas para la formulacion y administracion de farmacos en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, ultima edicion, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden fabricarse por procedimientos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, disolucion, granulacion, elaboracion de grageas, levigacion, emulsion, encapsulacion, atrapamiento o liofilizacion convencionales.

Las composiciones farmaceuticas para su uso de acuerdo con la presente invencion pueden, por lo tanto, formularse de una manera convencional usando uno o mas vehmulos farmaceuticamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares, que facilitan el procesamiento de la estructura de protema multimerica en las preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente. La formulacion apropiada depende de la via de administracion que se seleccione.

Para la inyeccion o infusion, las estructuras de protema multimerica de las realizaciones de la invencion pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles tales como solucion de Hank, solucion de Ringer o tampon salino fisiologico con o sin disolventes organicos tales como propilenglicol o polietilenglicol.

Para la administracion transmucosa, se usan penetrantes en la formulacion. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica.

Para la administracion oral, las estructuras de protema multimerica de la invencion pueden formularse combinando facilmente las estructuras de protema multimerica con vehmulos farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica. Dichos vehmulos permiten que las estructuras de protema multimerica descritas en el presente documento se formulen como comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares para la ingestion oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacologicas para uso oral pueden prepararse usando un excipiente solido, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de granulos, y despues anadiendo auxiliares adecuados, si se desea, para obtener nucleos de comprimidos o grageas. Como excipientes adecuados se incluyen, en particular, cargas tales como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidon de mafz, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio; y/o polfmeros fisiologicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden anadirse agentes disgregantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o acido algmico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Los nucleos de las grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para esta finalidad, pueden usarse soluciones de azucar concentrado que opcionalmente pueden contener goma arabiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dioxido de titanio, soluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes organicos adecuados. Pueden anadirse colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o grageas para ayudar a la identificacion o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de la estructura de protema multimerica activa.

Las composiciones farmaceuticas que pueden usarse por via oral incluyen capsulas duras fabricadas de gelatina, asf como capsulas blandas selladas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las capsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las capsulas blandas, las estructuras de protema multimerica pueden disolverse o suspenderse en lfquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina lfquida o polietilenglicoles lfquidos. Ademas, pueden anadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administracion oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la via de administracion seleccionada.

Para la administracion bucal, las composiciones pueden estar en formas de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de una manera convencional.

Para la administracion por inhalacion, las estructuras de protema multimerica para su uso de acuerdo con las realizaciones de la presente invencion se administran convenientemente en forma de una presentacion de pulverizacion en aerosol (que tfpicamente incluye vehmulos en polvo, licuados y/o gaseosos) a partir de un envase presurizado o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dioxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse capsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo de las estructuras de protema multimerica y una base en polvo adecuada tal como, pero sin limitacion, lactosa o almidon.

Las estructuras de protema multimerica descritas en el presente documento pueden formularse para administracion parenteral, por ejemplo, mediante inyeccion en embolada o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion o infusion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, opcionalmente, con un conservante anadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehmulos oleaginosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones farmaceuticas para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparacion de estructura de protema multimerica en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de las estructuras de protema multimerica pueden prepararse como suspensiones y emulsiones de inyeccion oleaginosas apropiadas (por ejemplo, emulsiones de agua en aceite, aceite en agua o agua en aceite en aceite). Los disolventes o vehmulos lipofilos adecuados incluyen acidos grasos tales como aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos tales como oleato de etilo, trigliceridos o liposomas. Las suspensiones de inyeccion acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetil celulosa sodica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados, que aumentan la solubilidad de las estructuras de protema multimerica para permitir la preparacion de soluciones altamente concentradas.

Como alternativa, las estructuras de protema multimerica pueden estar en forma de polvo para su constitucion con un vehmulo adecuado, por ejemplo, agua esteril apirogena, antes de su uso.

La estructura de protema multimerica de las realizaciones de la presente invencion tambien puede formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retencion usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros gliceridos.

Las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento tambien pueden comprender excipientes o vehmulos solidos adecuados de fase gel. Los ejemplos de dichos vehmulos o excipientes incluyen, pero sin limitacion, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polfmeros tales como polietilenglicoles.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invencion incluyen composiciones en las cuales los ingredientes activos estan incluidos en una cantidad eficaz para conseguir el proposito que se pretende. Mas espedficamente, una cantidad terapeuticamente eficaz significa una cantidad de estructuras de protema multimerica eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los smtomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se este tratando.

Para cualquiera de las estructuras de protema multimerica usadas en los metodos de la invencion, la cantidad o dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de actividad en animales. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentracion en circulacion que incluya la CI⁵⁰determinada por ensayos de actividad (por ejemplo, la concentracion de las estructuras de protema de ensayo que consigue un aumento semi-maximo en una actividad biologica de la estructura de la protema multimerica). Dicha informacion puede usarse para determinar de un modo mas preciso las dosis utiles en seres humanos.

Como se demuestra en la seccion de Ejemplos que se proporciona a continuacion, una cantidad terapeuticamente eficaz para las estructuras de protema multimerica de las realizaciones de la presente invencion puede variar entre aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal.

La toxicidad y eficacia terapeutica de las estructuras de protema multimerica descritas en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en animales experimentales, por ejemplo, determinando la CE⁵⁰, la CI⁵⁰y la DL⁵⁰(dosis letal que causa la muerte en el 50 % de los animales ensayados) para una estructura de protema dada. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de actividad y estudios en animales pueden usarse en la formulacion de una serie de dosificaciones para uso en seres humanos. La dosificacion puede variar dependiendo de la forma de dosificacion empleada y de la via de administracion que se utilice. La formulacion exacta, la via de administracion y la dosificacion pueden seleccionarse por el medico individual en vista del estado del paciente. (Vease, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1p.1).

La cantidad y el intervalo de dosificacion pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma del radical activo que son suficientes para mantener los efectos deseados, denominados concentracion minima eficaz (CME). La CME variara en cada preparacion, pero puede estimarse a partir de datos in vitro, por ejemplo, la concentracion necesaria para conseguir el nivel de actividad deseado in vitro. Las dosificaciones necesarias para conseguir la CME dependeran de las caractensticas individuales y de la via de administracion. Pueden usarse ensayos de HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones plasmaticas.

Tambien pueden determinarse intervalos de dosificacion usando el valor de CME. Las preparaciones deben administrarse usando un regimen que mantenga los niveles plasmaticos por encima de la CME durante el 10-90 % del tiempo, preferentemente entre el 30-90 % y mas preferentemente entre el 50-90 %.

Dependiendo de la gravedad y de la respuesta de la afeccion que vaya a tratarse, la dosificacion tambien puede ser una sola administracion de una composicion de liberacion lenta descrita en el presente documento anteriormente, con un ciclo de tratamiento que dura de varios dfas a varias semanas o hasta que se efectue la cura o se consiga la disminucion de la patologfa.

La cantidad de una composicion a administrar dependera, por supuesto, del sujeto que vaya a tratarse, de la gravedad de la dolencia, de la forma de administracion, del criterio del medico a cargo del tratamiento, etc.

Las composiciones de la presente invencion pueden estar presentes, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA (la administracion de alimentos y farmacos de Estados Unidos), que puede contener una o mas formas de dosificacion unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lamina de metal o plastico, tal como, pero sin limitacion, un blister o un envase presurizado (para inhalacion). El envase o dispositivo dispensador puede ir acompanado de instrucciones para la administracion. El envase o dispensador tambien puede ir acompanado de un aviso asociado en el recipiente en una forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso y venta de agentes farmaceuticos, reflejando dicho aviso la aprobacion por parte de la agencia de la forma de las composiciones para administracion humana o veterinaria. Dicho aviso, por ejemplo, puede ser una etiqueta aprobada por la administracion de alimentos y farmacos de Estados Unidos para farmacos de prescripcion o un prospecto aprobado. Tambien pueden prepararse composiciones que comprenden una estructura de protema multimerica de realizaciones de la invencion formuladas en un vehmulo farmaceutico compatible, colocarse en un envase apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afeccion o diagnostico indicado, como se detalla en el presente documento.

Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion, dependiendo de las estructuras de protema multimerica seleccionadas, la composicion farmaceutica descrita en el presente documento se envasa en un material de envasado y se identifica en forma impresa en o sobre el material de envasado, para su uso en el tratamiento de una afeccion en la que es beneficiosa la actividad de la estructura de la protema multimerica, como se describe anteriormente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.

Las expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye, pero sin limitacion”.

La expresion “que consiste en” significa “que incluye y limitado a”.

La palabra “ejemplar” se usa en el presente documento para indicar “que sirve como un ejemplo, caso o ilustracion”. Cualquier realizacion descrita como “ejemplar” no debe considerarse necesariamente preferida o ventajosa sobre otras realizaciones y/o excluir la incorporacion de caractensticas de otras realizaciones.

La palabra “opcionalmente” se usa en el presente documento para indicar “se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones. Cualquier realizacion particular de la invencion puede incluir una pluralidad de caractensticas “opcionales” a menos que esto represente un conflicto.

Como se usa en el presente documento, la forma singular “uno”, “una”, “un” y “el”, “la” incluyen referencias en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresion “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo sus mezclas.

A lo largo de esta solicitud, varias realizaciones de la presente invencion pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripcion en formato de intervalo es meramente por comodidad y brevedad y no debe considerarse una limitacion inflexible del alcance de la invencion. Por consiguiente, debe considerarse que la descripcion de un intervalo desvela espedficamente todos los posibles subintervalos, asf como los valores numericos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos desvelados espedficamente tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., asf como numeros individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Cuando se indica un intervalo numerico en el presente documento, este pretende incluir cualquier numero citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las frases “que vana/vana entre” un primer numero indicado y un segundo numero indicado y “que vana/vana de” un primer numero indicado “a” un segundo numero indicado se usan indistintamente en el presente documento y significa que incluyen el primer y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionales e integrales entre los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresion “metodo” se refiere a maneras, medios, tecnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada incluyendo, pero sin limitacion, aquellas maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos o facilmente desarrollados a partir de maneras, medios, tecnicos y procedimientos conocidos por los expertos en las tecnicas qmmicas, farmacologicas, biologicas, bioqmmicas y medicas.

Como se usa en el presente documento, el termino “tratar” incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresion de una afeccion, mejorar sustancialmente los smtomas clmicos o esteticos de una afeccion o prevenir sustancialmente la aparicion de smtomas clmicos o esteticos de una afeccion.

Se aprecia que determinadas caractensticas de la invencion, que por claridad se describen en el contexto de realizaciones distintas, tambien pueden proporcionarse en combinacion en una sola realizacion. A la inversa, diversas caractensticas de la invencion, que por brevedad se describen en el contexto de una sola realizacion, tambien pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinacion adecuada o como sea adecuado en cualquier otra realizacion descrita de la invencion. Determinadas caractensticas descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse caractensticas esenciales de estas realizaciones, a menos que la realizacion sea inoperativa sin estos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion como se indican en el presente documento anteriormente y como se reivindican en la seccion de reivindicaciones a continuacion encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invencion de una manera no limitante.

Materiales y metodos

Materiales:

Se obtuvo bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG) en Iris Biotech GmbH en formas PEG8 y PEG de 2000 Dalton (PEG⁴⁵) y en Pierce en forma PEG⁵, y se disolvieron en dimetilsulfoxido (DMSO) a una concentracion de 25 mg/ml;

El acido cttrico se obtuvo en Sigma;

El Azul de Coomassie G250 se obtuvo en Bio-Rad;

El dimetilsulfoxido se obtuvo en Sigma;

La D-(+)-galactosa se obtuvo en Sigma;

El plasma humano (K3 EDTA) se obtuvo en Bioreclamation Inc.;

La 4-metilumbeliferona se obtuvo en Sigma;

La 4-metilbeliferil-a-D-galactopiranosido se obtuvo en Sigma;

N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida trihexosido (Gb3-NBD) se obtuvo en Matreya;

El acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico se obtuvo en Merck;

La solucion salina tamponada con fosfato se obtuvo en Sigma;

El p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido se obtuvo en Sigma;

La primulina se obtuvo en Sigma; el reactivo de pulverizado de primulina se preparo disolviendo 12,5 mg de primulina en 200 ml de acetona:agua (relacion de volumen 8:2);

La piridina se obtuvo en Sigma;

El acido sinapmico se obtuvo en Sigma;

El carbonato de sodio se obtuvo en Sigma;

El fosfato de sodio se obtuvo en Sigma;

El taurocolato de sodio se obtuvo en Sigma;

El acido trifluoroacetico se obtuvo en Sigma.

a-GAL-I humana recombinante vegetal:

La a-GAL humana recombinante vegetal (prh-a-GAL) que tiene la SEQ ID NO: 1, se refiere en el presente documento a la a-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-I), se preparo como se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/IL2008/000576 (publicada como documento WO 2008/132743).

El material vegetal transgenico se genero usando plantas de Nicotiana benthamiana infiltrada con la construccion genetica que contema el casete de expresion para a-GAL-A, para expresar la protema a-GAL-A humana. Esto se realizo en una camara de cultivo en condiciones controladas. Despues de esto, se recogio el material vegetal y se realizo la extraccion de protemas solubles de las celulas vegetales. Despues, la prh-a-GAL-A se purifico mediante un proceso de purificacion que implicaba metodos convencionales para la purificacion de protemas seguido de una etapa de modificacion qmmica para fabricar la protema reticulada. La presente prh-a-GAL-A se extrajo de material vegetal usando homogeneizadores. Los desechos vegetales se retiraron por centrifugacion y la protema se purifico adicionalmente usando etapas de precipitacion con sulfato de amonio y de acidificacion. El sobrenadante se filtro y se cargo en una columna hidrofoba, seguido de desalinizacion y carga en una columna de intercambio cationico. El conjunto de la columna de intercambio cationico se concentro.

a-GAL-II humana recombinante vegetal:

La a-GAL humana recombinante vegetal que comprende una mezcla de a-GAL que tiene la SEQ ID NO: 2 y a-GAL que tiene la SEQ ID NO: 3 (sin los aminoacidos EF N-terminales presentes en la SEQ ID NO: 1), denominada en el presente documento prh-a-GAL-II, se preparo mediante un proceso similar al descrito anteriormente para prh-a-GAL-I, usando una construccion genetica diferente.

El ADNc que codifica la protema a-galactosidasa humana (EC 3.2.1-22 GenBank: X05790) se optimizo y se sintetizo en GENEART AG (Regensburg, Alemania). El uso de codones sin el peptido lfder (peptido senal que se dirige al retmulo endoplasmatico) se adapto al sesgo de codones de los genes de Nicotiana tabaccum. Durante el proceso de optimizacion se evitaron los siguientes motivos de secuencia que actuan en cis: cajas internas TATA, sitios chi y sitios de entrada al ribosoma, tramos de secuencias ricos en AT o ricos en GC, elementos de inestabilidad de ARN (“motivos killer’), secuencias de repeticion y estructuras secundarias de ARN, sitios donantes (cnpticos) y aceptores de corte y empalme y puntos de ramificacion. Ademas, se evitaron regiones de muy alto (> 80 %) o muy bajo (<30 %) contenido de g C.

La secuencia de nucleotidos del peptido lfder de a-galactosidasa humana nativa (peptido senal que se dirige al retmulo endoplasmatico) de la protema a-galactosidasa humana de longitud completa (GenBank: X05790) se reemplazo por una secuencia de nucleotidos que codificaba el peptido senal que se dirige al retmulo endoplasmatico (peptido lfder) de 33 aminoacidos de la protema ABPI de Arabidopsis. Este peptido senal proporciona un direccionamiento eficaz de la a-galactosidasa a la ruta secretora y se escinde del polipeptido por la peptidasa senal, una vez que la protema se ha translocado al interior del retmulo endoplasmatico. Se anadio una secuencia de nucleotidos que codifica la senal de retencion del retmulo endoplasmatico SEKDEL a la secuencia de ADNc en el extremo 3', lo que permitio la recuperacion de la protema expresada del aparato de Golgi, manteniendo de un modo eficaz la protema en el retmulo endoplasmatico.

La protema de interes se expreso a partir de un promotor de virus subgenomico fuerte de la protema de recubrimiento. El sistema se basa en la amplificacion transitoria (por agroinfeccion) de vectores de virus suministrados a una planta por Agrobacterium. En la agroinfeccion, un promotor funcional de planta y el ADNc que codifica un replicon de virus se transfieren como ADN-T desde Agrobacterium al interior de celulas vegetales. El ADN-T se transcribe en la planta por el promotor de plantas para generar ARN de virus biologicamente activo que inicia la autorreplicacion.

Para la expresion transitoria se uso un sistema de recombinacion de 3 vectores basado en el sistema previamente desarrollado como se describe [Gleba et al., Vaccine 2005, 23: 2042-2048]. En uno de los vectores se inserto ADNc de a-galactosidasa y los otros dos vectores conteman los genes para la construccion de todo el replicon de virus (RdRp e Integrasa), generandose de esta manera el ARN vmco biologicamente activo que puede iniciar la autorreplicacion.

Las plantas de N. benthamiana se dejaron germinar y se cultivaron en un sustrato mixto comercial (Givaat Ada, IL) complementado con fertilizante de liberacion lenta granular (Scott Marysville, OH) en un regimen de luz de un dfa de duracion (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) a 24-25 °C.

Las agrobacterias se transformaron con el sistema del vector replicon basado en pICH20866-alfa-GAL usando electroporacion (2500 V, 5 milisegundos) [den Dulk-Ra y Hooykaas, Methods Mol Biol 1995, 55: 63-72]. Las plantas se infiltraron con Agrobacterias que conteman los 3 plasmidos ICON por infiltracion al vado con metodos convencionales conocidos en la tecnica. En resumen, plantas de N. benthamiana, de 5-6 semanas de edad, se infiltraron sumergiendo todos los organos aereos de la planta en una suspension bacteriana y se colocaron en una camara de vado. Se aplico un vado de menos (-) 0,8 bares durante 1 minuto, seguido de un rapido retorno a presion atmosferica. Las plantas volvieron a llevarse al invernadero durante 5-7 dfas mas en las mismas condiciones de cultivo.

Se recogieron muestras de hojas de Nicotiana benthamiana 5 dfas despues de la infiltracion y se extrajeron en tampon de Laemmli para SDS-PAGE, o en tampon de ensayo de actividad (acido dtrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, albumina de suero bovino al 0,1 % y etanol al 0,67 %, pH 4,6) para ensayar la actividad catalftica de la protema expresada en la planta.

La protema a-galactosidasa humana de extractos vegetales se purifico mediante una precipitacion diferencial de sulfato de amonio de dos etapas (“precipitacion con sal” (“salting out’’): 1a etapa 0,57 M, 2a etapa 2,27 M), seguido por cromatograffa de interaccion hidrofoba (resina Phenil 650 M) y cromatograffa de intercambio cationico.

Se obtuvieron dos secuencias (es decir, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3), que difenan en la presencia o ausencia de una glicina N terminal, debido a un procesamiento diferente de la secuencia ffder.

Ensayo con 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiran6sido de actividad a-GAL:

La actividad a-GAL se midio usando 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido como sustrato de hidrolisis. El ensayo se realizo en tampon citrato-fosfato (acido dtrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, pH 4,6). Se incubaron 10 |jl de una muestra que contema la a-GAL ensayada con 40 j l de tampon de ensayo que contema 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido 5 mM. La mezcla de reaccion se incubo a 37 °C durante 60 minutos. Se transfirieron 10 j l de la mezcla de reaccion a una placa negra de 96 pocillos (Greiner), se anadieron 90 j l de solucion de detencion (carbonato de sodio 2 M) y se midio la fluorescencia a una longitud de onda de excitacion de 365 nm y una longitud de onda de emision de 450 nm. La fluorescencia se tradujo a concentracion de producto, y adicionalmente a actividad, usando una curva de calibrado de 4-metilumbeliferona, el producto de reaccion.

Ensayo con trihex6sido de N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida (Gb3-NBD) de actividad a-GAL

El sustrato marcado con fluorescencia trihexosido de N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida (Gb3-NBD) es menos lipofilo que Gb3, lo que facilita su uso en reacciones enzimaticas in vitro.

Se anadieron 10 j l de Gb3-NBD 0,1 jg / j l (en agua con etanol al 10 %) y 5 j l de a-GAL 0,2 mg/ml se anadieron a 85 j l de tampon citrato-fosfato a un pH de 4,6. La concentracion final de a-GAL fue de 10 jg/ml. La reaccion de fondo o no catalizada, sin a-GAL, se compoma de 90 j l de tampon citrato-fosfato a un pH de 4,6 con 10 j l de Gb3-NBD 0,1 jg / j l (en agua con etanol al 10 %). Las mezclas de reaccion se incubaron durante 60 minutos a 37 °C. Despues de la incubacion, se anadieron 50 j l de metanol a la mezcla de reaccion y las soluciones se agitaron vorticialmente durante 1 minuto. Despues se anadieron 100 j l de cloroformo y las soluciones volvieron a agitarse vorticialmente durante 1 minuto. El agua y los disolventes organicos se retiraron al vado usando un sistema Speed Vac. Los residuos se disolvieron en 80 j l de cloroformo:metanol (1:1). Se cargaron 30 j l de cada muestra en 60 placas de Gel de Sflice HPTLC (cromatografta de capa fina de alto rendimiento) (Merck) usando un sistema Linomat V (CAMAG). Las placas de HPTLC se revelaron usando una solucion de cloroformo:metanol:H²O a una relacion de 100:42:6 como un sistema disolvente. Despues, las placas se dejaron secar y el sustrato y las manchas de producto se visualizaron por irradiacion con luz UV a una longitud de onda de 365 nm.

Ensayo con p-nitrofenil-a-D-galactopiran6sido (p-NP-G) de actividad a-GAL:

Se uso p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido como un sustrato de hidrolisis para ensayos de actividad a-GAL. El tampon de ensayo contema acido dtrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, BSA (albumina de suero bovino) al 0,1 % y etanol al 0,67 % a pH 4,6. El ensayo se realizo en placas ELISA de 96 pocillos (Greiner). Se incubaron 50 j l de muestra con 150 j l de tampon de ensayo y se anadieron 30 j l de sustrato para obtener una concentracion final de pnitrofenil-a-D-galactopiranosido 8 mM. La mezcla de reaccion se incubo a 37 °C durante 90 minutos. Despues de 90 minutos, se anadieron 100 j l de carbonato de sodio 1,98 M a cada pocillo para finalizar la reaccion. La cantidad de producto de reaccion se determino midiendo la absorbancia a 405 nm.

Medici6n de la estabilidad de a-GAL in vitro:

La estabilidad de a-GAL de diversas fuentes se determino anadiendo a-GAL a una de las siguientes condiciones: 1) condiciones lisosomicas simuladas: tampon citrato-fosfato (acido cftrico 20 mM, fosfato de sodio 30 mM), pH 4,6, 37 °C;

2) condiciones fisiologicas simuladas: solucion salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, 37 °C;

3) plasma humano a 37 °C.

Se anadio a-GAL a una concentracion de 1 jg/ml, segun se determina por la actividad de a-GAL en la solucion, y la solucion se incubo a 37 °C. Se extrajeron muestras de cada solucion a puntos de tiempo predeterminados y la actividad a-GAL se midio como se ha descrito anteriormente en el presente documento. El valor de la actividad enzimatica inmediatamente despues de la adicion de a-GAL ensayada a cada entorno se definio como 100 %, y los resultados de actividad adicionales en los puntos de tiempo ensayados se calcularon como porcentaje de esa actividad inicial.

Farmacocinetica de a-GAL:

Se colocaron ratones con enfermedad de Fabry individuales (a-Gal-A-/0) en un dispositivo de retencion de plexiglas iluminado y se inyecto la enzima en la vena de la cola. Se obtuvieron muestras de sangre en los tiempos indicados despues de la inyeccion mediante sangrado de la cola o sangrado ocular retroorbital, usando tubos de microhematocrito heparinizados. El plasma se diluyo en tampon de actividad 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido. Se realizo un ensayo de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido como se ha descrito anteriormente.

Se calculo la semivida de eliminacion terminal (T^1/2) en funcion de los resultados de la actividad en plasma. La semivida terminal (semivida de eliminacion) es el tiempo necesario para que la concentracion de plasma disminuya en un 50 % despues de haber alcanzado el pseudo-equilibrio de distribucion. La semivida terminal se calculo a partir de la porcion terminal (logaritmo lineal) de la curva, mediante regresion lineal del tiempo frente a la concentracion log [Toutain y Bousquet-Melou, J Vet Pharmacol Ther 2004, 27: 427-39].

Biodistribucidn de a-GAL:

Ratones con la enfermedad de Fabry (a-Gal-A-/0) recibieron una inyeccion intravenosa (en la vena de la cola) de a-GAL a una dosis de 2 mg/kg. Se recogieron los tejidos (Idgados, rinones, corazones y bazos) 2 horas, 24 horas, 3 dfas, 7 dfas, 14 dfas o 28 dfas despues de la inyeccion de la enzima. Los niveles de a-GAL en ratones de control normales y en ratones con enfermedad de Fabry a los que se administro solucion salina (no tratados) se compararon con los niveles en ratones con enfermedad de Fabry que recibieron a-GAL exogena. Para determinar la actividad a-GAL en tejidos, se colocaron muestras de tejido descongelado en tubos de polipropileno de 2 ml que conteman tampon de lisis (acido dtrico 28 mM, fosfato sodico dibasico 44 mM, taurocolato de sodio 0,5 %, pH 4,4) como se describe en Oshima et al. [PNAS 1997, 94: 2540-2544]. Las muestras se homogeneizaron usando un Tissuelyzer (Retsch MM400) durante 10 minutos. Los residuos se sedimentaron por centrifugacion a 4 °C y los sobrenadantes resultantes se sometieron a ensayo con respecto a la actividad de a-GAL mediante un ensayo con 4-metilumbeliferila-D-galactopiranosido, como se ha descrito anteriormente. Estas mismas muestras tambien se sometieron a analisis de transferencia de Western.

Ensayo in vivo con Gb3:

El criterio de valoracion de eficacia de la a-GAL inyectada se midio por ensayo de los niveles de Gb3 de los tejidos animales, para determinar si los niveles de Gb3 habfan disminuido por la actividad a-GAL.

Para medir la hidrolisis de Gb3, se extrajeron glicoesfingolfpidos neutros de organos diana (por ejemplo, hngado, rinon, corazon y bazo). Se homogeneizaron muestras de tejido de 100 mg en 1 ml de cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y se centrifugaron durante 20 minutos a 13.500 rpm. Se anadieron 62 |jl de agua a un homogeneizado de 1 ml para dar una solucion de cloroformo:metanol:agua de 20:10:2. Se anadieron 10 j l de piridina al homogeneizado para dar una concentracion final de piridina de 1 %. La muestra se agito durante 24 horas a 48 °C. Los disolventes y el agua se retiraron al vacfo usando un sistema SpeedVac. La muestra se resuspendio en 2,5 ml de metanol y despues se anadieron 250 j l de KOH 1 M en metanol. Despues, la mezcla se agito durante 2 horas a 37 °C. La reaccion de saponificacion se detuvo por la adicion de 10 j l de acido acetico. Despues se anadieron 2,5 ml de cloroformo a la muestra, seguido por la adicion de 2,5 ml de agua fna. La muestra se agito intensamente durante 5 minutos y se dejo reposar durante 5 minutos para permitir la separacion de fases. La fase superior, compuesta de metanol y agua, se descarto, y la fase inferior, compuesta de cloroformo y metanol, se evaporo al vacfo (SpeedVac), y el residuo se resuspendio en 300 j l de cloroformo:metanol 1:1 (v/v) para el analisis de los glucoesfingolfpidos por HPTLC.

Se realizaron analisis cualitativos y semicuantitativos de glucolfpidos tisulares por cromatograffa en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) (CAMAG, Suiza). El analisis de HPTLC se realizo en 60 placas recubiertas de vidrio con gel de sflice HPTLC (Merck). Las muestras se cargaron en las placas usando un sistema Linomat 5 (CAMAG, Suiza). Las placas se revelaron usando cloroformo-metanol-agua (60:35:4) como sistema disolvente. Los glucoesfingolfpidos neutros se detectaron con reactivo de pulverizacion de primulina. Se identifico Gb3 usando Gb3 de eritrocito porcino (Matreya) como patron, y se cuantifico usando una curva de calibracion de trihexosido de W-heptadecanoil ceramida (Matreya), un patron semisintetico. Las placas se visualizaron y las manchas relevantes se cuantificaron usando un Scanner III TLC (CAMAG, Suiza) soportado por el programa informatico winCATS (CAMAG, Suiza).

SDS-PAGE:

Se realizo SDS-PAGE en condiciones reductoras usando un sistema Bio-Rad Criterion™ y gel de acrilamida al 12 % disenado internamente. El gel se tino con tincion Azul de Coomassie G250.

IEF (isoelectroenfoque):

Se realizo IEF usando mini-cell Novex® de Invitrogen y geles IEF previamente disenados que teman un intervalo de pH de 3-7 (Invitrogen). El gel se tino con Azul de Coomassie G250.

Espectrometna de masas (MALDI-TOF):

Se realizo MALDI-TOF usando un sistema de espectrometro de masas MALDI-ToF Bruker Reflex IV (Bruker-Franzen Analytik GmbH, Alemania) y una solucion matriz saturada con acido sinapmico/acido trifluoroacetico (TFA) (TFA/acetonitrilo al 0,1 % (2:1, v/v)).

Ejemplo I

Estabilidad in vitro de a-GAL recombinante

Se midio la estabilidad in vitro de a-GAL recombinante en diversas afecciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento en la Seccion de Materiales y Metodos. Se ensayaron la a-GAL-I humana recombinante vegetal, asf como la a-GAL humana recombinante comercial Fabrazyme® y Replagal®.

Como se muestra en la Figura 1, todos los tipos ensayados de a-GAL exhibieron una perdida de actividad en condiciones lisosomicas simuladas.

Ademas, como se muestra en la Figura 2, todos los tipos ensayados de a-GAL exhibieron una perdida de actividad en condiciones fisiologicas simuladas. Como se muestra en el presente documento adicionalmente, la presencia de galactosa 100 mg/ml protegio parcialmente la actividad de a-GAL-I recombinante vegetal en dichas condiciones. De manera similar, como se muestra en la Figura 3, todos los tipos ensayados de a-GAL exhibieron una perdida de actividad en plasma humano a 37 °C.

Como se muestra en la Figura 4, la presencia de 100 mg/ml de galactosa protegio parcialmente la actividad de a-GAL-I recombinante vegetal en condiciones lisosomicas simuladas.

Los experimentos de cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) a niveles de pH lisosomicos y neutros demostraron cambios en la estructura de la protema (datos no mostrados), mientras que analisis SDS-PAGE y transferencia de Western no exhibieron ninguna degradacion de la secuencia de aminoacidos primaria (datos no mostrados).

Estos resultados indican que a-GAL pierde actividad en condiciones lisosomicas y condiciones fisiologicas debido a la alteracion de la estructura de la protema a-GAL, y que la galactosa impide parcialmente esta perdida de actividad. Ejemplo II

Reticulacion de a-GAL-I humana recombinante vegetal con agentes de bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG)

La a-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-I) se reticulo a proporciones molares de 50:1, 100:1 y 200:1 con bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG) de diversos pesos moleculares, concretamente bis-NHS-PEG⁵, bis-NHS-PEG8 o bis-NHS-PEG45 (bis-NHS-PEG con PEG de 2.000 Dalton), cuyas estructuras se muestran en la Figura 5.

El bis-NHS-PEG puede unirse a la protema en dos sitios en una protema (por ejemplo, restos de lisina), formando de este modo la reticulacion, o en un sitio en una protema. En la Figura 6 se representan estas dos formas de union. Se anadieron 100 |jg de a-GAL-I en 28,5 j l de tampon de acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES) (25 mM, pH 6) a 13,5 j l de tampon fosfato (100 mM, pH 8) que contema galactosa 100 mg/ml.

Se reticulo a-GAL-I con bis-NHS-PEG5 a proporciones molares de reactivo:protema 1:50, 1:100 y 1:200, anadiendo bis-NHS-PEG5 en 8 j l de DMSO a la solucion de a-GAL-I (27,4 jg de solucion a-GAL-I para una proporcion molar de 1:50, 54,8 jg de solucion de a-GAL-I para una proporcion molar de 1:100 y 109,7 jg de solucion de a-GAL-I para una proporcion molar de 1:200).

La a-GAL-I se reticulo con bis-NHS-PEG45 a proporciones molares de protema:reactivo de 1:50, 1:100 y 1:200 anadiendo bis-NHS-PEG45 en 8 j l de DMSO a la solucion de a-GAL-I (103 jg de solucion de a-GAL-I para una proporcion molar 1:50, 206 jg de solucion de a-GAL-1 para una proporcion molar de 1:100 y 412 jg de solucion de a-GAL-I para una proporcion molar de 1:200). La a-GAL-I se reticulo con bis-NHS-PEG8 a proporciones molares de protema:reactivo de 1:50, 1:100 y 1:200, anadiendo bis-NHS-PEG8 en 11,5 j l de DMSO a la solucion de a-GAL-I (37 jg de a-GAL-I para una proporcion molar de 1:50, 73 jg de solucion de a-GAL-1 para una proporcion molar de 1:100 y 146 jg de solucion de a-GAL-I para una proporcion molar de 1:200).

Despues de anadir el agente bis-NHS-PEG a la a-GAL-I, las reacciones se pipetearon y agitaron en un agitador orbital durante 2 horas a temperatura ambiente.

En todas las reacciones, el exceso de reactivo de reticulacion bis-NHS-PEG se retiro por dialisis frente a solucion salina (lfmite de 50 KDa).

La produccion de dfmero aumento con el aumento de la concentracion de protema y concentracion de DMSO, alcanzando hasta un 30 %.

Los productos de reaccion se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico), IEF (isoelectroenfoque), transferencia de Western y espectrometna de masas MALDI-TOF, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Como se muestra en la Figura 7, se observo la prh-a-GAL-I nativa patron como un monomero (que tema un peso molecular de 48 KDa) despues de la electroforesis en gel, mientras que despues de la reaccion de prh-a-GAL-I con bis-NHS-PEG, la prh-a-GAL-I aparecio principalmente en forma de un dfmero (con algo de monomero presente), indicando que los dos monomeros estaban ligados de manera covalente mediante reticulacion con bis-NHS-PEG. Como tambien se muestra en la Figura 7, se observo una mayor proporcion de prh-a-GAL-I monomerica con los agentes de reticulacion mas cortos, bis-NHS-PEG5 y bis-NHS-PEGs, que con el agente de reticulacion mas largo bis-NHS-PEG⁴⁵. El bis-NHS-PEG45 produjo una proporcion mas alta de protema reticulada. Estos resultados indican que los agentes de reticulacion mas cortos son menos eficaces para unir covalentemente los monomeros.

Como tambien se muestra en la Figura 7, para cada uno de los agentes de reticulacion ensayados, el peso molecular de la parte monomerica de prh-a-GAL-I aumento despues de la reaccion con el agente de reticulacion. El aumento en el peso molecular fue mayor cuando se uso una mayor proporcion de agente de reticulacion con respecto a protema (por ejemplo, 200:1), y cuando el peso molecular del agente de reticulacion fue mayor (por ejemplo, bis-NHS-PEG45). Estos resultados indican que los monomeros de protema que no dimerizaron por reticulacion, estaban unidos de manera covalente con el agente de reticulacion bis-NHS-PEG, es decir las protemas estaban PEGiladas.

Los resultados anteriores indican que el uso de un mayor exceso molar de agente de reticulacion con respecto a protema produce niveles mas altos de modificacion de a-GAL, incluyendo tanto la reticulacion para formar un dfmero como la PEGilacion de las protemas. Sin embargo, una proporcion molar de 100:1 proporciono un alto nivel de reticulacion, especialmente en las reacciones que utilizaban el reactivo bis-NHS-PEG45, de tal manera que una proporcion molar de 200:1 proporciono unicamente una adicion marginal a la eficacia del agente de reticulacion. Como se muestra en la Figura 8, la reaccion de prh-a-GAL-I con bis-NHS-PEG redujo el punto isoelectrico (pI) de prh-a-GAL-I, confirmando por lo tanto que el bis-NHS-PEG esta unido covalentemente a la prh-a-GAL-I. La union de bis-NHS-PEG con prh-a-GAL-I convierte los grupos amina basicos de restos de lisina en grupos amida neutros, reduciendo de este modo el pI. La reduccion del pI era mas pronunciada cuando se usaba un exceso molar mas alto (por ejemplo, 200:1) de bis-NHS-PEG, confirmando los resultados anteriores obtenidos por SDS-PAGE.

Como se muestra adicionalmente en la Figura 8, el pI se redujo mas con bis-NHS-PEG5 y bis-NHS-PEGs que con bis-NHS-PEG45.

Este resultado indica que bis-NHS-PEG5 y bis-NHS-PEGs tienen mas probabilidad que bis-NHS-PEG45 de producir una PEGilacion en la que solo un extremo del agente de reticulacion este unido a a-GAL. Un agente de reticulacion unido a a-GAL en un solo extremo es mas eficaz para reducir el pI porque dicho agente de reticulacion comprende un grupo de acido carboxflico (-CO²H) en el extremo no unido, ademas de convertir un grupo amino de lisina en un grupo amida en el extremo unido.

Como se muestra en la Figura 9, la reaccion de prh-a-GAL-I con el agente de reticulacion bis-NHS-PEG45 aumento el peso molecular del dfmero de prh-a-GAL-I de 97 KDa a 113 KDa, determinado por espectrometna de masas MALDI-TOF. El aumento en el peso molecular indica una adicion de aproximadamente 8 moleculas de bis-NHS-PEG⁴⁵en el dfmero de prh-a-GAL-I.

Como se muestra en la Figura 10, la reaccion de prh-a-GAL-I con el agente de reticulacion bis-NHS-PEG8 aumento el peso molecular del dfmero de prh-a-GAL-I de 97 KDa a 104 KDa, determinado por espectrometna de masas MALDI-TOF. El aumento en el peso molecular indica una adicion de aproximadamente 10 moleculas de bis-NHS-PEGg en el dfmero de prh-a-GAL-I.

Ejemplo III

Actividad de a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada

Para determinar si la a-GAL-I recombinante vegetal (prh-a-GAL-I) reticulada descrita en el Ejemplo II conservaba la actividad enzimatica, la prh-a-GAL-I reticulada se sometio a ensayo para determinar su actividad enzimatica usando el ensayo de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido descrito anteriormente.

Como se muestra en la siguiente Tabla 1, prh-a-GAL-I que reacciono con el reactivo bis-NHS-PEG, bis-NHS-PEG5, bis-NHS-PEG8 o bis-NHS-PEG45 a un exceso molar de 50:1, 100:1 y 200:1, en todos los casos mostro un nivel de actividad enzimatica similar al de la prh-a-GAL-I nativa. Como se muestra en el presente documento, en algunos casos se observaron disminuciones moderadas y aumentos moderados en la actividad, lo cual puede ser el resultado de efectos de formulacion. Estos resultados indican que la reticulacion no reduda la actividad de prh-a-GAL-I.

Tabla 1: resultados de actividad de a-GAL I humana recombinante ve etal reticulada

La actividad de la prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 se verifico adicionalmente usando el ensayo de trihexosido de W-dodecanoil-NBD-ceramida descrito en el presente documento anteriormente, que ensaya la actividad de a-GAL hacia su sustrato natural, trihexosido de ceramida (Gb3). La a-GAL humana recombinante de mairnfero Replagal® se ensayo con fines comparativos.

Como se muestra en la Figura 11, despues de la incubacion de la a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con el sustrato fluorescente, casi todo el sustrato se transformo en el producto, W-dodecanoil-nitrobenzoxadiazollactosil ceramida, de forma similar a la reaccion catalizada por la a-GAL recombinante de mai^ero (Replagal®). Este resultado confirma que la reticulacion no alteraba la eficacia hidrolftica enzimatica de la prh-a-GAL-I, usando un analogo proximo del sustrato natural.

Ejemplo IV

Estabilidad in vitro de la a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada

La estabilidad in vitro de la a-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-I) reticulada, obtenida como se describe en el Ejemplo II, se midio a diversas concentraciones como se describe en el presente documento anteriormente en la Seccion de Materiales y Metodos. La estabilidad de las a-GAL humanas recombinantes comerciales Fabrazyme® y Replagal® se midio con fines comparativos.

Como se muestra en las Figuras 12A-12C, la estabilidad de la a-GAL-I humana recombinante vegetal en condiciones lisosomicas simuladas se potencio reticulando con bis-NHS-PEG5 (Figura 12A), bis-NHS-PEG8 (Figura 12B) y bis-NHS-PEG45 (Figura 12C). Como tambien se muestra en el presente documento, la estabilidad de la prh-a-GAL-I reticulada durante el transcurso de una semana se comparaba favorablemente con la estabilidad de la a-GAL humana recombinante comercial. Despues de una pequena disminucion en la actividad residual durante las primeras 24 horas, la prh-a-GAL-I reticulada mantuvo la actividad, incluso despues de 10 dfas. La disminucion inicial en la actividad, observada durante las 24 primeras horas, puede reflejar la parte de a-GAL-I humana recombinante vegetal que no experimentaba reticulacion.

Como se muestra adicionalmente en las Figuras 12A-12C, prh-a-GAL-I reticulada por bis-NHS-PEG45 mostro la mayor estabilidad en condiciones lisosomicas simuladas.

La estabilidad de la a-GAL-I humana recombinante vegetal en plasma humano a 37 °C tambien se potencio reticulando con bis-NHS-PEG45 (datos no mostrados).

Estos resultados indican que la reticulacion de a-GAL como se describe en el presente documento puede aumentar la eficacia de a-GAL in vivo aumentando la estabilidad de a-GAL en los lisosomas, permitiendose de este modo que la a-GAL actue durante un penodo de tiempo mas prolongado en los lisosomas, y aumentando la estabilidad de la a-GAL en la sangre, aumentando de este modo la semivida en circulacion de a-GAL.

Ejemplo V

Farmacocinetica in vivo y biodistribucion de a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada

La farmacocinetica y biodistribucion de la a-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-I) reticulada con bis-NHS-PEG⁴⁵o bis-NHS-PEG8 como se describe en el Ejemplo II se determino en ratones con la enfermedad de Fabry a los que se inyectaron 2 mg/kg de a-GAL, como se describe en el presente documento anteriormente en la Seccion de Materiales y Metodos. La farmacocinetica y biodistribucion de la a-GAL-I humana recombinante vegetal no reticulada y la a-GAL humana recombinante Replagal® se determino con fines comparativos. Se recogieron muestras de sangre para analisis farmacocinetico 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 60 y 120 minutes despues de la inyeccion. Para cada tipo de a-GAL, el grupo de tratamiento consistio en seis ratones.

Como se muestra en la Tabla 2 presentada a continuacion, la prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8 y con bis-NHS-PEG⁴⁵aumento la semivida terminal en circulacion de la a-GAL-I humana recombinante vegetal, exhibiendo la ultima un efecto mas pronunciado.

Tabla 2: semividas terminales en circulacion de la a-GAL recombinante

Como se muestra en la Figura 13 y en la Tabla 2, la semivida terminal de prh a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 era considerablemente mayor que la semivida terminal de a-GAL Replagal®.

Como se muestra adicionalmente en la Figura 13, la actividad de a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 al cabo de 20 minutos fue de aproximadamente 40 % de la actividad a 1 minuto. Adicionalmente, la prh-a-GAL-I reticulada mostro una presencia activa en plasma incluso 4 horas despues de la inyeccion.

Estos resultados indican que la prh-a-GAL-I reticulada permanece activa in vivo durante un tiempo relativamente prolongado, lo que permite que la enzima alcance tejidos y organos adicionales.

Como se muestra en las Figuras 14A y 14B, los niveles de a-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los bazos de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de inyeccion fue considerablemente mayor que los de la a-GAL-I recombinante vegetal no reticulada, asf como los de la a-GAL recombinante de mairnfero Replagal®. Como adicionalmente se muestra en el presente documento, los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 eran mayores que los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8. Los analisis de transferencia de Western (Figura 14B) son coherentes con los resultados de biodistribucion obtenidos mediante el ensayo de la actividad enzimatica a-GAL (Figura 14A).

Como se muestra en las Figuras 15A y 15B, los niveles de a-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los hfgados de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion eran considerablemente mas altos que los de a-GAL-I recombinante vegetal no reticulada, pero menores que los niveles de a-GAL recombinante de mam^fero Replagal® en el tegado. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 eran ligeramente mayores que los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8. Los analisis de transferencia de Western (Figura 15B) son coherentes con los resultados de biodistribucion obtenidos ensayando la actividad enzimatica de a-GAL (Figura 15A).

Pueden ser terapeuticamente ventajosos niveles mas bajos de a-GAL en el tegado, ya que aproximadamente el 95 % de la enzima recuperada en la terapia de reemplazo enzimatico se encuentra tfpicamente en el hfgado, y por lo tanto altos niveles de recombinacion de a-GAL en el hfgado indican niveles mas bajos de a-GAL exogena en organos diana tales como corazon y rinones.

Como se muestra en la Figura 16, los niveles de a-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG⁴⁵en los corazones de ratones con la enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion eran mayores que los de la a-GAL-I recombinante vegetal no reticulada. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 fueron mayores que los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8, asf como los niveles de la a-GAL recombinante de mai^ero Replagal®.

Como se muestra en la Figura 17, los niveles de la a-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG8 y bis-NHS-PEG45 en los rinones de ratones con enfermedad de Fabry 2 horas despues de la inyeccion, eran mayores que los niveles de la a-GAL-I recombinante vegetal no reticulada. Como adicionalmente se muestra en el presente documento, los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 fueron mayores que los niveles de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG8, asf como los niveles de a-GAL recombinante de mamnfero Replagal®.

De manera similar, como se muestra en las Figuras 18-21, los niveles de a-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 eran mayores que los niveles de la a-GAL-I recombinante vegetal no reticulada en el bazo (Figura 18), hfgado (Figura 19), corazon (Figura 20) y rinones (Figura 21) de ratones con enfermedad de Fabry, durante hasta 7 dfas despues de la inyeccion. Como adicionalmente se muestra en el presente documento, los niveles de a-GAL-I recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG45 eran mayores que los niveles de la a-GAL recombinante de mamnfero Replagal® en el bazo, corazon y rinones.

Estos resultados indican que a-GAL reticulada con bis-NHS-PEG, particularmente bis-NHS-PEG45, exhibe una captacion potenciada en organos, incluyendo rinones y corazon, que son organos diana principales en el tratamiento del trastorno de Fabry. Estos resultados coinciden con una semivida en circulacion aumentada y una estabilidad aumentada de la a-GAL reticulada.

Ejemplo VI

Reticulacidn de a-GAL humana recombinante de mamffero con bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG)

Para confirmar los efectos ventajosos de la reticulacion descrita en el presente documento anteriormente, se reticulo la a-GAL humana recombinante de mairnfero Replagal®, que se produce en la lmea de fibrosarcoma humana HT-1080.

Se anadieron 333 pl de tampon fosfato (100 mM, pH 8) con D-(+)-galactosa 100 mg/ml a 3,8 mg de bis-NHS-PEG45 en 151 pl de solucion de DMSO (25 mg/ml) y 1,8 mg de a-GAL humana recombinante Replagal® en 130 pl de tampon citrato (25 mM, pH 6). La concentracion de a-GAL Replagal® se determino mediante un ensayo de actividad. La mezcla de reaccion se agito usando un agitador orbital durante 2 horas a temperatura ambiente. El exceso de reactivo de reticulacion bis-NHS-PEG45 se retiro por dialisis frente a solucion salina usando un concentrador Vivaspin 6 con un lfmite de 50 KDa. La actividad a-GAL de la a-GAL Replagal® reticulada indico que la concentracion de a-GAL era de 3 mg/ml.

Los productos de reaccion se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico), IEF (isoelectroenfoque) y espectrometna de masas MALDI-TOF, como se ha descrito en el presente documento anteriormente.

Como se muestra en la Figura 22, la a-GAL Replagal® nativa patron se observo como un monomero despues de electroforesis en gel, mientras que despues de la reaccion de a-GAL Replagal® con bis-NHS-PEG45, la a-GAL aparecio en forma de un dfmero, lo que indicaba que los dos monomeros estaban ligados covalentemente por reticulacion con bis-NHS-PEG.

Como se muestra en la Figura 23, la reaccion de a-GAL Replagal® con bis-NHS-PEG45 redujo el punto isoelectrico (pi) de a-GAL, confirmando de este modo que bis-NHS-PEG esta unido covalentemente a la a-GAL.

Como se muestra en la Figura 24, la reaccion de a-GAL Replagal® con el agente de reticulacion bis-NHS-PEG45 aumento el peso molecular del dfmero de a-GAL Replagal® de 103,0 KDa a 121,3 KDa, determinado por espectrometna de masas MALDI-TOF. El aumento del peso molecular indica una adicion de aproximadamente 9-10 moleculas de bis-NHS-PEG45 al dfmero a-GAL, que es similar a los resultados descritos anteriormente en el presente documento para prh-a-GAL-I.

Ejemplo VII

Actividad de a-GAL humana recombinante de mamffero reticulada

Para determinar si la reticulacion de a-GAL recombinante de mai^ero descrita en el Ejemplo VI afectaba a la actividad enzimatica, la a-GAL reticulada se ensayo con respecto a su actividad enzimatica usando un ensayo de pnitrofenil-a-D-galactopiranosido (pNP-G), de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en el presente documento.

Como se muestra en la Figura 25 y en la Tabla 3 mostrada a continuacion, la a-GAL humana recombinante de m ai^ero que se reticulo con bis-NHS-PEG45 exhibio parametros de actividad enzimatica que eran muy similares a los de la a-GAL humana recombinante de m ai^ero nativa. Estos resultados indican que la reticulacion no afectaba significativamente a la actividad o a la maquinaria catalftica y mecanismo de la a-GAL humana recombinante de mai^ero.

Tabla 3: resultados de actividad de la a-GAL humana recombinante de mai^ero reticulada

Ejemplo VIII

Estabilidad in vitro de la a-GAL humana recombinante de mamffero reticulada

La estabilidad in vitro de la a-GAL humana recombinante de mairnfero Replagal® reticulada, obtenida como se describe en el Ejemplo VI, se midio en diversas condiciones como se describe anteriormente en el presente documento en la Seccion de Materiales y Metodos. La estabilidad de a-GAL Replagal® no reticulada se midio con fines comparativos, para evaluar el efecto de la reticulacion.

Como se muestra en las Figuras 26A y 26B, la estabilidad de a-GAL humana recombinante de mamnfero en condiciones lisosomicas simuladas (Figura 26A) y en plasma humano (Figura 26B) se potencio considerablemente por reticulacion con bis-NHS-PEG45. La a-GAL humana recombinante de mam^fero reticulada exhibio una mayor estabilidad en condiciones lisosomicas estimuladas que en plasma.

Estos resultados indican que la reticulacion de a-GAL como se describe en el presente documento puede estabilizar la a-GAL recombinante de multiples fuentes y plataformas de expresion.

Ejemplo IX

Farmacocinetica in vivo y biodistribucion de la a-GAL humana recombinante de mamifero reticulada

La farmacocinetica y biodistribucion de la a-GAL humana recombinante de mamnfero reticulada descrita en el Ejemplo VI se determino midiendo la actividad a-GAL en el bazo, tngado, corazon y rinones de ratones con enfermedad Fabry 2 horas, 7, 14 y 28 dfas despues de inyeccion, asf como los niveles de Gb3 en estos organos, como se describe anteriormente en el presente documento en la Seccion de Materiales y Metodos. La biodistribucion de la a-GAL humana recombinante de mamnfero Replagal® no reticulada se determino para fines comparativos. Como se muestra en las Figuras 27A-27D, los niveles de la a-GAL recombinante de mamffero reticulada en los bazos (Figura 27A), tngado (Figura 27B), corazon (Figura 27C) y rinones (Figura 27D) de ratones con enfermedad de Fabry fueron considerablemente superiores que los de la a-GAL recombinante de mamffero no reticulada.

Como se muestra en las Figuras 28A-28D, la a-GAL recombinante de mamffero reticulada disminuyo los niveles de Gb3 en el corazon (Figura 28A), rinones (Figura 28B), tngado (Figura 28C) y bazo (Figura 28D) de ratones con enfermedad de Fabry, durante el transcurso de 28 dfas despues de inyeccion. La a-GAL recombinante de mamnfero reticulada disminuyo los niveles de Gb3 en un grado mayor que la a-GAL recombinante no reticulada en el rinon (Figura 28B) y bazo (Figura 28D) de ratones con la enfermedad de Fabry, y a aproximadamente el mismo grado que la a-GAL recombinante de mamnfero no reticulada en el corazon (Figura 28A) e tngado (Figura 28C).

Estos resultados indican que la reticulacion con bis-NHS-PEG da como resultado una captacion considerablemente potenciada de la a-GAL recombinante desde una variedad de fuentes y plataformas de expresion en organos, incluyendo el rinon y corazon, que son organos diana principales en el tratamiento del trastorno de Fabry. Adicionalmente, estos resultados indican que la reticulacion con bis-NHS-PEG da como resultado una disminucion mas sustancial de los niveles de Gb3 en organos.

Ejemplo X

Reticulacion de a-GAL-II humana recombinante vegetal con bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol) (bis-NHS-PEG)

La a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-II), que carece de los aminoacidos EF presentes en el extremo N de prh-a-GAL-I, se reticulo con bis-NHS-PEG45, bis-NHS-PEG²i o bis-NHS-PEG68 a una proporcion molar de 200:1 de bis-NHS-PEG a a-GAL, de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo II.

La prh-a-GAL-II conservo su actividad biologica despues de la reticulacion con bis-NHS-PEG (datos no mostrados). Los productos de reaccion se analizaron por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sodico) y espectrometna de masas MALDI-TOF como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Como se muestra en las Figuras 29A-29B, la prh-a-GAL-II nativa patron se observo como un monomero despues de la electroforesis en gel, mientras que despues de la reaccion de prh-a-GAL-II con bis-NHS-PEG45 o bis-NHS-PEG²i (Figura 29A), o con bis-NHS-PEG68 (Figura 29B), prh-a-GAL-II aparecio principalmente en forma de un dfmero (con algun monomero presente), indicando que los dos monomeros estaban ligados de manera covalente por reticulacion con un agente de reticulacion bis-NHS-PEG.

Como se observa adicionalmente en las Figuras 29A-29B, para cada uno de los agentes de reticulacion ensayados, el peso molecular de la parte monomerica de prh-a-GAL-II aumento despues de la reaccion con el agente de reticulacion. El aumento del peso molecular fue mayor para bis-NHS-PEG45 que para bis-NHS-PEG²i (Figura 29A) y fue mas elevado para bis-NHS-PEG68 (comparese la Figura 29A con la Figura 29B). Estos resultados indican que los monomeros que no dimerizaron por reticulacion, estaban unidos de manera covalente al agente de reticulacion bis-NHS-PEG, es decir, las protemas estaban PEGiladas.

Como se muestra en las Figuras 30A-30C, la reaccion de prh-a-GAL-II con el agente de reticulacion bis-NHS-PEG²¹aumento el peso molecular del dfmero prh-a-GAL-II de 95 KDa (Figura 30A) a 109 KDa (Figura 30B), aunque la reaccion de prh-a-GAL-II con el agente de reticulacion bis-NHS-PEG45 aumento el peso molecular del dfmero prh-a-GAL-II a 114 KDa (Figura 30C), determinado por espectrometna de masas mAlDI-TOF. El aumento del peso molecular indica una adicion de aproximadamente l3 moleculas de bis-NHS-PEG²i, o de aproximadamente 9 moleculas de bis-NHS-PEG45 al dfmero prh-a-GAL-II.

Ejemplo XI

Estabilidad in vitro de la a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada

La estabilidad in vitro de la a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-II) reticulada obtenida como se describe en el Ejemplo X se midio en diversas condiciones como se describe en el presente documento anteriormente en la Seccion de Materiales y Metodos. La estabilidad de la a-GAL humana recombinante comercial Replagal® se midio con fines comparativos.

Como se muestra en las Figuras 31A-31D, la estabilidad de la a-GAL-II humana recombinante vegetal se potencio reticulando con bis-NHS-PEG68 (Figuras 31B y 31D), bis-NHS-PEG45 (Figuras 31A -31D) o bis-NHS-PEG²i (Figuras 31A y 31C), tanto en condiciones lisosomicas simuladas (Figuras 31A y 31B) como en plasma humano (Figuras 31C y 31D). Los diferentes agentes de reticulacion potenciaron la estabilidad de prh-a-GAL-II en grados comparables. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, la estabilidad de la prh-a-GAL-II reticulada fue mayor que la estabilidad de la a-GAL humana recombinante Replagal®. La prh-a-GAL-II reticulada exhibio una mayor estabilidad en condiciones lisosomicas simuladas, asf como en condiciones plasmaticas.

Como se muestra adicionalmente en las Figuras 31A-31D, la prh-a-GAL-II no reticulada es considerablemente mas estable que la prh-a-GAL-I no reticulada (veanse las Figuras 1 y 3 para comparacion), tanto en condiciones lisosomicas simuladas (Figuras 1 y 31A-31B) como en plasma humano (Figuras 3 y 31C-31D), aunque prh-a-GAL-II aun presenta alguna inestabilidad.

Estos resultados indican que la reticulacion de a-GAL como se describe en el presente documento puede estabilizar diferentes tipos de a-GAL.

Ejemplo XII

Farmacocinetica y biodistribucion in vivo de la a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada

La farmacocinetica y biodistribucion de a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-II) reticulada con PEG⁴⁵y reticulada con PEG²¹, descrita en el Ejemplo X, se determino midiendo la actividad a-GAL en plasma y en organos como se ha descrito anteriormente en el presente documento en la Seccion de Materiales y Metodos. La farmacocinetica y biodistribucion de la a-GAL humana recombinante de mairnfero Replagal® no reticulada se determino con fines comparativos.

Se recogieron muestras de sangre para analisis farmacocineticos a 1, 5, 10, 30, 60, 120, 240, 480 y 1440 minutos despues de inyeccion de ratones con enfermedad de Fabry con 1 mg/kg de a-GAL.

La biodistribucion de a-GAL se determino recogiendo el Mgado, rinones, corazon y bazo de ratones con enfermedad de Fabry 2 horas, 7 dfas, 14 dfas y 28 dfas despues de la inyeccion con 2 mg/kg de a-GAL.

Como se muestra en las Figuras 32A y 32B y en la Tabla 4, la reticulacion de prh-a-GAL-II con bis-NHS-PEG45 aumento considerablemente la semivida terminal en circulacion de prh-a-GAL-II, dando lugar a una semivida en circulacion considerablemente mayor que la de la a-GAL recombinante de mai^ero o prh-a-GAL-II no reticulada.

Tabla 4: semivida terminal en circulacion de a-GAL recombinante

Como se muestra en las Figuras 33A-33L, la reticulacion de prh-a-GAL-II con bis-NHS-PEG45 aumento la captacion de prh-a-GAL-II en corazon (Figura 33A), rinon (Figura 33B), hngado (Figura 33C) y bazo (Figura 33D) de ratones con enfermedad de Fabry, aunque en un menor grado en el hfgado.

Como se muestra en las Figuras 33E-33L, la reticulacion de prh-a-GAL-II con bis-NHS-PEG²¹tambien aumento la captacion de prh-a-GAL-II en corazon (Figuras 33E y 33I), rinon (Figuras 33F y 33J), hfgado (Figuras 33G y 33K) y bazo (Figuras 33H y 33L) de ratones con enfermedad de Fabry, aunque dicho aumento no era siempre evidente despues de solo 2 horas.

Como adicionalmente se ha observado en el presente documento, los niveles de prh-a-GAL-II reticulada fueron mayores que los niveles de a-GAL recombinante de mairnfero en el corazon (Figuras 33A, 33E y 33I), rinon (Figuras 33B, 33F Y 33J) y bazo (Figuras 33D, 33H y 33L) de ratones con enfermedad de Fabry, y menores que los niveles de a-GAL recombinante de mai^ero en el hngado (Figuras 33C, 33G y 33K).

Estos resultados indican que la prh-a-GAL-II reticulada exhibe una actividad considerablemente potenciada de a-GAL en plasma y en diversos organos, particularmente en organos distintos de hngado.

Ejemplo XIII

Efecto del pH sobre la actividad de a-GAL humana recombinante vegetal

El pH del entorno tiene un efecto significativo sobre la estabilidad y cinetica de enzimas lisosomicas tales como a-GAL. El pH puede afectar a la union del sustrato con la enzima. El pH tambien puede afectar a la protonacion o desprotonacion de grupos catalfticos, tales como grupos carboxilo o amino, que forman parte del sitio activo enzimatico y, por lo tanto, afectan al comportamiento cinetico de la enzima. La estabilidad de la estructura terciaria o cuaternaria de las enzimas tambien es dependiente del pH, y afecta a la velocidad de la reaccion enzimatica, especialmente a valores de pH extremadamente acidos o alcalinos.

La actividad de a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada con PEG^{4 5}y no reticulada se determino a diversos valores de pH usando un sustrato pNP-G, para examinar la dependencia del pH de la actividad a-GAL, y el efecto de la reticulacion en el mismo. Las mediciones se realizaron en soluciones de citrato 20 mM y de fosfato de sodio 30 mM.

Los parametros cineticos que caracterizan la actividad a-GAL a diversos valores de pH se resumen en la Tabla 5 a continuacion y en las Figuras 34A-34C.

Como se observa en las Figuras 34A-34C, la reticulacion del a-GAL-II aumento los parametros de V^{m a x}(Figura 34A) y fe^{a t}(Figura 34C) y no tuvo un efecto significativo sobre el parametro K^m (Figura 34B).

Tabla 5: resultados de actividad de la a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-II) no reticulada y a-GAL II humana recombinante vegetal reticulada con PEG^{4 5}(prh-a-GAL-II-CL45) a diversos valores de pH. pH Muestra K^m(^mM) Vmax (MM/minuto) k^{c a t}(segundo-1) k^{c a t}/K^m(segundo’1* ^mM’1) 2,8 prh-a-GAL-II 15216 0,57 9,04 0,0006 prh-a-GAL-I I-CL45 13618 0,90 14,37 0,0011 3,2 prh-a-GAL-II 11476 0,55 8,85 0,0008 prh-a-GAL-I I-CL45 8489 1,34 21,44 0,0025 3,6 prh-a-GAL-TI 11147 1,76 28,16 0,0025 prh-a-GAL-I I-CL45 4699 2,23 35,68 0,0076 4,04 prh-a-GAL-II 5709 1,98 31,68 0,0055 prh-a-GAL-I I-CL45 3207 2,74 43,76 0,0136 4,4 prh-a-GAL-II 4596 2,40 38,40 0,0084 prh-a-GAL-I I-CL45 3122 3,22 51,57 0,0165 4,8 prh-a-GAL-II 4531 2,32 37,12 0,0082 prh-a-GAL-I I-CL45 3345 2,95 47,23 0,0141 5,29 prh-a-GAL-II 6793 2,06 32,99 0,0049 prh-a-GAL-I I-CL45 3973 2,78 44,48 0,0112 5,66 prh-a-GAL-II 10396 1,75 28,05 0,0027 prh-a-GAL-I I-CL45 4883 2,70 43,20 0,0088 6,09 prh-a-GAL-II 11357 1,44 23,04 0,0020 prh-a-GAL-I I-CL45 8336 1,54 24,59 0,0030 6,4 prh-a-GAL-II 21046 1,32 21,12 0,0010 prh-a-GAL-I I-CL45 16844 1,46 23,36 0,0014 6,76 prh-a-GAL-II 25188 1,12 17,92 0,0007 prh-a-GAL-I I-CL45 18313 1,14 18,24 0,0010 7,36 prh-a-GAL-II - - - -prh-a-GAL-I I-CL45 32692 0,52 8,37 0,0003 La potenciacion de los parametros V^{m a x}y k^{c a t}indica un aumento en la actividad catalftica. Este aumento es particularmente significativo a valores de pH de al menos aproximadamente 7, donde la actividad catalftica de la a-GAL-II no reticulada es insignificante.

K^m es un parametro cinetico asociado con la afinidad enzima/sustrato. La ausencia de un efecto significativo de reticulacion sobre los valores de K^mindica que la reticulacion no tiene un efecto significativo sobre la afinidad de a-GAL con respecto al sustrato pNP-G.

Ejemplo XIV

Efecto de la PEGilacion sobre la estabilidad de a-GAL

Se determino el efecto de la PEGilacion por sf mismo sobre la estabilidad de a-GAL, para determinar si el efecto estabilizante de los agentes de reticulacion de PEG es debido a las propiedades del PEG o es debido a la reticulacion.

Se hizo reaccionar a-GAL-I humana recombinante vegetal con PEG protegidos terminalmente con metoxi activado con W-hidroxisuccinimida (NHS) con diferentes pesos moleculares (2, 5 y 10 KDa). Dichos reactivos PEG tienen un solo grupo NHS y, por consiguiente, PEGilan la protema sin formar reticulacion. Los productos de reaccion se analizaron por SDS-Pa GE.

Como se muestra en la Figura 35, los agentes de PEGilacion protegidos con metoxi PEGilaron la a-GAL (visible como un aumento en el peso molecular de a-GAL), pero no generaron sustancialmente dfmeros de a-GAL, lo que indicaba que a-GAL no estaba reticulada.

Como se muestra en las Figuras 36A y 36B, la PEGilacion de la a-GAL-I humana recombinante vegetal sin formar reticulacion no aumento sustancialmente la estabilidad de la a-GAL recombinante vegetal, en condiciones lisosomicas simuladas (Figura 36A) o en plasma humano (Figura 36B).

Estos resultados indican que el efecto estabilizante de la reticulacion descrita en el presente documento anteriormente no es un resultado de la PEGilacion por sf misma.

Ejemplo XV

Efecto de la longitud de la cadena de PEG sobre la actividad de a-GAL reticulada

Para evaluar el efecto de la longitud de la cadena de los agentes de reticulacion PEG sobre la actividad a-GAL, la a-GAL-I humana recombinante vegetal se reticulo con agentes bis-NHS-PEG², bis-NHS-PEG4, bis-NHS-PEG68 y bis-NHS-PEG¹⁵⁰, usando esencialmente los mismos procedimientos que se han descrito en el Ejemplo II (PEG68 y PEG¹⁵⁰tienen longitudes de cadena aproximadas). La a-GAL-I se reticulo a proporciones molares de 50:1, 100:1 y 200:1 de bis-NHS-PEG:a-GAL. Los productos de reaccion se analizaron por SDS-PAGE, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Tambien se analizo la a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 como se describe en el Ejemplo II con fines comparativos.

Como se muestra en la Figura 37, el analisis de SDS-PAGE mostro que todos los agentes de bis-NHS-PEG reticularon la a-GAL para dar como resultado un dfmero reticulado covalentemente, y que la reticulacion era mas eficaz cuando se usaba una proporcion molar de 200:1.

La actividad enzimatica de a-GAL-I reticulada se determino despues como se describe en el Ejemplo III. Los resultados se resumen en la Tabla 6 mostrada a continuacion.

Tabla 6: resultados de actividad de la a-GAL-I humana recombinante ve etal reticulada

Como se muestra en la Tabla 6, la reticulacion con PEG²y PEG⁴redujo moderadamente la actividad a-GAL (aproximadamente un 30-50 %), mientras que la reticulacion con cadenas de PEG mas largas no afecto significativamente a la actividad a-GAL.

Estos resultados indican que la reticulacion con cadenas de PEG mas largas que PEG⁴es ventajosa en terminos de preservar la actividad de la a-GAL reticulada.

Ejemplo XVI

Reticulacidn de a-GAL usando agentes bis-COOH-PEG

Como una alternativa a la reticulacion anteriormente descrita de a-GAL usando agentes previamente preparados de bis-NHS-PEG (por ejemplo, disponibles en el mercado), a-GAL se reticulo con agentes bis-COOH-PEG activando los grupos carboxilo (es decir, COOH) in situ inmediatamente antes de efectuar la reaccion de reticulacion.

Cada uno de bis-COOH-PEGi², bis-COOH-PEG²⁸y bis-COOH-PEG45 se activaron reaccionando con 1,1 equivalentes molares por grupo carboxilo (es decir, 2,2 equivalentes molares por bis-COOH-PEG) de NHS (N-hidroxisuccinimida) y EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida). La mezcla de reaccion se agito despues en DMSO durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues se hizo reaccionar bis-COOH-PEG activado, que es esencialmente bis-NHS-PEG, con a-GAL-I humana recombinante vegetal a proporciones molares de 50:1, 100:1 y 200:1, como se describe en el Ejemplo II. Los productos de reaccion se analizaron por SDS-PAGE, como se describe anteriormente en el presente documento. La a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 como se describe en el Ejemplo II tambien se analizo con fines comparativos.

Como se muestra en la Figura 38, el analisis de SDS-PAGE mostro que todos los agentes bis-COOH-PEG reticulaban la a-GAL en algun grado, pero que la reticulacion era mas eficaz cuando se usaba una proporcion molar de 200:1.

Despues se determino la actividad enzimatica de la a-GAL-I reticulada como se describe en el Ejemplo III. En la Tabla 7 a continuacion se resumen los resultados.

Tabla 7: resultados de actividad de a-GAL-I humana recombinante ve etal reticulada

Como se muestra en la Tabla 7, la reticulacion con cada uno de los agentes ensayados bis-COOH-PEG dio como resultado a-GAL con aproximadamente la actividad esperada.

Estos resultados indican que los agentes de reticulacion bis-COOH-PEG no reducen la actividad a-GAL en comparacion con la reticulacion con agentes bis-NHS-PEG.

Estos resultados tambien confirman los hallazgos anteriormente descritos de que la reticulacion con cadenas de PEG mas largas que PEG⁴no reduce significativamente la actividad de la a-GAL reticulada.

Ejemplo XVII

Efecto de la longitud y tipo de agentes de reticulacion sobre la estabilidad in vitro de a-GAL-I humana recombinante vegetal reticulada

Para caracterizar adicionalmente el efecto de la longitud de la cadena sobre la estabilidad de la a-GAL reticulada y para comparar la estabilidad de la a-GAL reticulada con agentes bis-COOH-PEG (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo XVI), con la de a-GAL reticulada con agentes bis-NHS-PEG, se midio la estabilidad in vitro de a-GAL-I humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-I) reticulada con bis-NHS-PEG², bis-NHS-PEG4, bis-COOH-PEG¹², bis-COOH²⁸y bis-COOH-PEG45, obtenidos como se describe en los Ejemplos XV y XVI, en diversas condiciones como se describe anteriormente en el presente documento en la Seccion de Materiales y Metodos, y se comparo con la estabilidad de prh-a-GAL-I reticulada con bis-NHS-PEG45 como se describe en el Ejemplo II. La estabilidad de a-GAL humana recombinante comercial Replagal® y prh-GAL-I no reticulada se midio con fines comparativos.

Como se muestra en la Figura 39, la estabilidad de la a-GAL-I humana recombinante vegetal en condiciones lisosomicas simuladas se potencio reticulando con cada uno de los agentes bis-NHS-PEG y bis-COOH-PEG.

Como se muestra adicionalmente en el presente documento, la estabilidad de prh-a-GAL-I reticulado se correlaciono con la longitud de la cadena del agente de reticulacion PEG, proporcionando bis-NHS-PEG45 y bis-COOH-PEG45 la mayor estabilidad, y proporcionando bis-NHS-PEG²la menor estabilidad. Sin embargo, la reticulacion con bis-COOH-PEG⁴⁵proporciono solo marginalmente mas estabilidad que la reticulacion con bis-COOH-PEG45, lo que sugena que, por encima de una determinada longitud, la estabilidad no se vefa afectada por la longitud de la cadena de PEG.

Como se muestra adicionalmente en la Figura 39, la reticulacion con bis-NHS-PEG45 proporciono ligeramente mas estabilidad que la reticulacion con bis-COOH-PEG45. Esto puede ser el resultado de una activacion incompleta del agente bis-COOH-PEG. Sin embargo, la diferencia en la estabilidad fue ligera.

Ademas, la reticulacion con cada uno de los agentes bis-NHS-PEG y bis-COOH-PEG potencio la estabilidad de la a-GAL-I humana recombinante vegetal en plasma humano a 37 °C (datos no mostrados).

Estos resultados proporcionan pruebas adicionales de que la reticulacion de a-GAL como se describe en el presente documento puede aumentar la eficacia de a-GAL in vivo aumentando la estabilidad de a-GAL en lisosomas y en la sangre, y que las cadenas de PEG de aproximadamente 28-45 unidades de longitud son mas eficaces estabilizando la a-GAL mediante la reticulacion que las cadenas de PEG mas cortas.

Ejemplo XVIII

Parametros cineticos de a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada

Los parametros cineticos de a-GAL-II humana recombinante vegetal reticulada, obtenidos como se describe en el Ejemplo X, asf como de a-GAL-II humana recombinante vegetal no reticulada, se determinaron usando un sustrato pNP-G y el analisis de Michaelis-Menten para examinar el efecto de la reticulacion sobre la misma. Las mediciones se realizaron en una solucion de citrato 20 mM, fosfato de sodio 30 mM, albumina de suero bovino al 0,1 % y etanol al 0,67 %, a un pH de 4,6. Los parametros cineticos se calcularon usando valores de contenido de protema basandose en un ensayo de actividad.

Como se muestra en la Tabla 8 a continuacion, la reticulacion de a-GAL-II dio como resultado propiedades cineticas mejoradas, en comparacion con la a-GAL-II no reticulada. La constante de Michaelis (K^m) se redujo, indicando una mayor afinidad de la enzima por el sustrato. Ademas, la kcat/KM, que significa la eficiencia catalttica total de la enzima con su sustrato en las condiciones descritas, se potencio para especies reticuladas.

Tabla 8: parametros de Michaelis-Menten de a-GAL-II humana recombinante vegetal no reticulada (prh-a-GAL-II) y a-GAL II humana recombinante vegetal reticulada con bis-NHS-PEG²¹(prh-a-GAL-II-CL21), bis-NHS-PEG45 (prh-a-GAL-II-CL45 o bis-NHS-PEG68 rh-a-GAL-II-CL68

Ejemplo XIX

Reproducibilidad de la reticulacion de a-GAL-II humana recombinante vegetal

La reproducibilidad lote a lote de la reticulacion se evaluo despues de preparar 5 lotes de a-GAL-II humana recombinante vegetal (prh-a-GAL-II) reticulada con bis-NHS-PEG45 a una proporcion de 200:1, usando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo II.

En los lotes 1, 2, 4 y 5, se hizo reaccionar 1 mg de prh-a-GAL-II con 3,98 mg de bis-NHS-PEG.

En el lote 3, se hicieron reaccionar 20,5 mg de prh-a-GAL-II con 80,7 mg de bis-NHS-PEG.

La actividad enzimatica de prh-a-GAL-II reticulada se determino como se describe en el Ejemplo III. Los resultados se resumen en la Tabla 9 mostrada a continuacion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la preparacion de una estructura de protema multimerica que comprende al menos dos monomeros de a-galactosidasa que estan unidos de forma covalente entre sf a traves de un radical de union, en donde dicho radical de union no esta presente en la a-galactosidasa nativa, comprendiendo el proceso hacer reaccionar la a-galactosidasa con un agente de reticulacion que comprende dicho radical de union y al menos dos grupos reactivos.

2. El proceso de la reivindicacion 1, en donde dicha reaccion se efectua en condiciones en las que la a-galactosidasa nativa esta en una forma dimerica.

3. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde cada uno de dichos grupos reactivos es capaz de formar un enlace covalente entre dicho radical de union y al menos un monomero de a-galactosidasa.

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada uno de dichos grupos reactivos comprende un grupo saliente.

5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho radical de union comprende un poli(alquilenglicol).

6. El proceso de la reivindicacion 5, en donde dichos al menos dos grupos reactivos son grupos terminales de dicho poli(alquilenglicol).

7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha a-galactosidasa que reacciona con dicho agente de reticulacion da como resultado al menos un radical de union que tiene una formula general:

X1-(CR1R2-CRaR4-Y)n-X2-en donde cada uno de X¹y X²es un grupo funcional que forma un enlace covalente con al menos un monomero de a-galactosidasa, formandose cada uno de dicho grupo funcional tras la reaccion de uno de dichos grupos reactivos con dicho al menos un monomero de a-galactosidasa;

Y es O, S o NR⁵;

n es un numero entero de 1 a 200; y

cada uno de R¹, R², R³, R⁴y R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol y tioalcoxi.

8. El proceso de la reivindicacion 7, en donde n es al menos 5.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho radical de union tiene una longitud de al menos 30 atomos.

10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho grupo reactivo reacciona con un grupo amina para formar un enlace amida.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha a-galactosidasa es una agalactosidasa humana.

12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha a-galactosidasa es una agalactosidasa recombinante vegetal.

13. Una estructura de protema multimerica que comprende al menos dos monomeros de a-galactosidasa que estan unidos de forma covalente entre sf a traves de un radical de union, que se prepara de acuerdo con el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la estructura de protema multimerica presenta una caractenstica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una actividad de a-galactosidasa, despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones plasmaticas humanas durante una hora, que es al menos un 10 % mayor que una actividad de a-galactosidasa nativa despues de someter dicha a-galactosidasa nativa a dichas condiciones plasmaticas humanas durante una hora;

(b) una actividad de a-galactosidasa que disminuye despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones plasmaticas humanas durante una hora en un porcentaje que es al menos un 10 % menor que el porcentaje que disminuye una actividad de dicha a-galactosidasa nativa despues de someter dicha a-galactosidasa nativa a dichas condiciones plasmaticas humanas durante una hora; y

(c) una actividad de a-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones plasmaticas humanas durante una hora.

14. La estructura de protema multimerica de la reivindicacion 13, que presenta una actividad a-galactosidasa que permanece sustancialmente sin cambios despues de someter la estructura de protema multimerica a condiciones lisosomicas durante una semana.

15. La estructura de protema multimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.