TWI642782B - 重組醣蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供具有改變(例如，增進)之醣基化譜(glycosylation profile)之重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)，及包含一或多種此等蛋白質之醫藥組成物與套組。本發明亦提供產生用於重組表現醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A)之哺乳動物細胞株之方法、生產重組醣蛋白之方法、及包括投予病患至少一種該等重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)之治療方法。

Description

重組醣蛋白及其用途 相關申請案之交叉參考
本申請案請求2013年10月23日提出申請之美國臨時專利申請案序號61/894,879及2013年11月8日提出申請之美國臨時專利申請案序號61/901,942之優先權，該等案之全部內容併入本文以資參考。
技術領域
本申請案係有關生物技術之領域，更具體而言，乃有關重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A)之生產及於溶酶體貯積症(例如，法布瑞氏症(Fabry disease))病患中之治療。
背景
溶酶體貯積症係一組超過40種之疾患，其為分解細胞溶酶體內醣脂質或多醣廢物之酵素編碼基因缺陷之結果。此等酵素產物，例如，糖類與脂質，接著再循環成為新產物。各個該等疾患係源自影響溶酶體中之酵素量之遺傳體染色體或X性聯隱 性表徵。一般而言，於受影響個體之細胞與組織中，此等酵素之生物或功能活性降低或喪失。例示之溶酶體貯積症與相關之酵素缺陷示於圖1及敘述於美國專利第6,066,626號之表1。於此類疾病中，酵素功能缺陷在體內細胞溶酶體中產生脂質或碳水化合物基質之進行性全身沉積，最後導致器官功能喪失及死亡。
法布瑞氏症係由溶酶體酵素α-半乳糖苷酶-A中之缺陷造成之溶酶體貯積症。此溶酶體水解酶缺陷導致身體大多數組織中醣神經鞘脂質球形三己糖苷腦醯胺(globotriaosylceramide，GL3)與相關脂質之進行性沉積。GL3之沉積主要在血管內皮細胞中發現。GL3之進行性內皮蓄積導致例如腎臟、心臟、或腦等器官之局部缺血與梗塞，引致難以忍受之疼痛、腎臟衰竭、及心臟與腦血管疾病。由於得自血管疾病之腎臟、心臟、及/或腦部併發症，未以酵素替代療法治療的法布瑞氏症病患之平均壽命男性為50歲，女性為70歲(Lidove et al.,Int.J.Clin.Pract.61：293-302,2007)。
供醫學治療用之重組蛋白常以細胞培養法生產，包括使用包含血液產物(例如，非人類動物血清或血漿)之液態培養基。含重組蛋白的醫藥產品之污染已為生物技術工業中之問題(Nims,BioProcessing J.10：4-10,2011；Plavsic et al.,BioProcessing J.9：6-12,2011；Plavsic et al.,Dev.Biol.Stand 99：95-109,1999)。舉例而言，於此類醫藥產品中，一些不同病毒之存在，在某些情形下，歸因於存在用以培養重組蛋白生產細胞之液態培養基中之血液產物(例如，非人類動物血清或血 漿)。本文中敘述已於重組蛋白生產細胞培養物中發現及被認為係由於使用動物性產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血清蛋白)而引起之污染物之實例。於重組蛋白生產細胞培養中使用無血清培養基或無動物性產物培養基是有利的，因為該培養基成分較明確且簡化、污染程度減少、排除或降低重組蛋白生產細胞培養中之污染風險或污染物量、導致使用細胞培養生產重組蛋白之成本較低。
概述
本發明，至少部分地，係基於發現使用本文所述之方法，可生產具改變(例如，增進)之醣基化譜之蛋白質(例如，酵素，如，α-半乳糖苷酶-A)。因此，本文係提供呈醣型具減少之變異性、具降低之污染風險或量(例如，降低之病毒污染風險或量)、及/或改變及增進之醣基化譜(例如，相較於用於酵素替代療法之先前製造之酵素)之α-半乳糖苷酶-A蛋白；包含一或多個此等α-半乳糖苷酶-A蛋白之醫藥組成物與套組(例如，呈醣型具減少之變異性及/或降低之污染風險或量(例如，降低之病毒污染風險或量))之醫藥組成物；生產用於重組表現醣蛋白(例如，α-半乳糖苷酶-A)之哺乳動物細胞之方法；生產重組醣蛋白(例如，α-半乳糖苷酶-A)之方法；治療法布瑞氏症之方法與降低病患之球形三己糖苷腦醯胺血清量之方法；及增加哺乳動物細胞(例如，活體外細胞或病患之細胞)溶酶體中之α-半乳糖苷酶-A量之方法。本發明亦提供包含編碼α-半乳糖苷酶-A蛋白 的序列之表現載體。
本文係提供具下述結構特徵之一或二者之重組人類α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白：介於約0.1%與約1.5%間之單唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣(total N-linked oligosaccharides)百分比；及大於約9%之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，如申請專利範圍第1項之rhAGA蛋白可具下述結構特徵：介於約0.1%與約1.5%間之單唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於約9%之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有介於約0.1%與約1.3%間(例如，約0.1%與約1.0%間，或約0.1%與約0.7%間)之單唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約8.5%(例如，大於約9.0%)之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
本文提供之rhAGA蛋白可進一步具有選自下述組群之一或多個結構特徵：大於約13.5%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於約2.0%之第2型(form 2)三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於約3.0之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。舉例而言，本文提供之rhAGA蛋白可進一步具有下述結構特徵：大於約13.5%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於約2.0%之第2型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於約3.0之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約13.8%(例如，大於約14.0%)之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約 4%(例如，大於約6%)之第2型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約3.2(例如，大於約3.4)之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。
本文提供之rhAGA蛋白可進一步具有選自下述組群之一或多個結構特徵：介於約0.1%與約3.9%間之電中性(neutrally-charged)寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約3.0%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約5.3%間之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約9.0%間之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約1%與約7.0%間之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於約14.8%之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於約4.9%之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於約8.2%之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文所述之rhAGA蛋白可具有選自下述組群之四個以上結構特徵：介於約0.1%與約3.9%間之電中性寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約3.0%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約5.3%間之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約9.0%間之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於約1%與約7.0%間之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於約14.8%之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於約4.9%之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於約8.2%之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例 中，該rhAGA蛋白具有介於約0.1%與約3.0%間(例如，約0.1%與約2.0%間)之電中性寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有介於約1.0%與約2.0%間(例如，約1.5%與約2.0%間)之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有介於約3.0%與約5.0%間(例如，約4.0%與約5.0%間)之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有介於約0.5%與約8.0%間(例如，約0.5%與約5.0%間)之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有介於約4%與約6.9%間(例如，約5%與約6.8%間)之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約15%(例如，大於約16%)之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約6%之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。於若干具體實例中，該rhAGA蛋白具有大於約8.5%(例如，大於約9.0%)之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
本文提供之rhAGA蛋白可具有下述性質之一或二者：(i)相較於Fabrazyme®，表現甘露糖-6-磷酸受體蛋白之哺乳動物細胞之胞吞作用增加；及(ii)相較於Fabrazyme®，對甘露糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加。舉例而言，本文提供之rhAGA蛋白可具有(i)相較於Fabrazyme®，表現甘露糖-6-磷酸受體蛋白之哺乳動物細胞之胞吞作用增加；及(ii)相較於Fabrazyme®，對甘露糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加。
本文提供之任何rhAGA蛋白可無或不具可檢測量之存在動物性產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血液產物)中之蛋白質、脂質、碳水化合物、核酸、與污染物(例如，本文所述之任何污染物)。
本文提供之任何rhAGA蛋白可為於只用選自無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養中生產之rhAGA蛋白。本文提供之任何rhAGA蛋白可為只用無蛋白質及/或化學成分確定培養基之細胞培養中生產之rhAGA蛋白。本文提供之任何rhAGA蛋白可為只用選自包括無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養中生產及使用整合與連續程序單離之rhAGA蛋白。於若干具體實例中，該整合與連續程序包括下述步驟：(a)提供包括實質上不含細胞之本文提供之rhAGA蛋白之液態培養基，其中係將液態培養基饋入第一個多層析系統(MCCS1)中；(b)使用該MCCS1捕獲液態培養基中之rhAGA蛋白，其中係將含該醫療用重組蛋白之MCCS1溶洗液持續饋入第二個多管柱層析系統(MCCS2)中；及(c)使用該MCCS2純化與精煉(polishing)該醫療用重組蛋白，其中得自MCCS2之溶洗液為rhAGA藥物物質，及其中從液態培養基至為rhAGA藥物物質之得自MCCS2之溶洗液之程序被整合且持續運行。於若干具體實例中，MCCS1及/或MCCS2進行兩種不同之單元操作。於若干具體實例中，使用MCCS1或MCCS2，或二者，涉及管柱切換。於若干具體實例中，MCCS1進行捕獲重組蛋白及使病毒失活之單元操作。於若干具體實例中，MCCS2進行純化與精煉該醫療用重組蛋白之單元操作。於 若干具體實例中，MCCS1及/或MCCS2使用至少兩個層析管柱。於若干具體實例中，MCCS1係第一個週期性逆流層析系統(PCCS1)，例如，包括四管柱PCCS之PCCS1。於若干具體實例中，四管柱PCCS(PCCS1之具體實例中)中四個管柱之三個進行從液態培養基捕獲醫療用重組蛋白之單元。於若干具體實例中，係將得自四管柱PCCS(PCCS1之具體實例中)四個管柱之三個之含有本文提供之rhAGA蛋白之溶洗液饋入四管柱PCCS之第四管柱中。於若干具體實例中，四管柱PCCS(於PCCS1之具體實例中)之第四管柱係進行利用保持含有醫療用重組蛋白之溶洗液於使病毒失活用之低pH使病毒失活之單元操作。於若干具體實例中，包括於得自四管柱PCCS第四管柱之溶洗液饋入PCCS2中之前，使用在線之緩衝液調整貯存器(in-line buffer adjustment reservoir)調整得自四管柱PCCS第四管柱溶洗液之pH。於若干具體實例中，PCCS2包含三個層析管柱及一層析膜。於若干具體實例中，PCCS2中之三個層析管柱係進行經由陽離子或陰離子交換層析法純化得自PCCS1溶洗液之本文提供之rhAGA之單元操作。於若干具體實例中，係將得自PCCS2三個層析管柱之溶洗液饋入PCCS2之層析膜中。於若干具體實例中，PCCS2中之層析膜進行經由陽離子或陰離子交換層析法精煉得自PCCS2三個層析管柱溶洗液之本文提供之rhAGA蛋白之單元操作。於若干具體實例中，PCCS2中之層析膜進行經由陽離子交換精煉之單元操作。於若干具體實例中，PCCS2中層析膜之流通液(flow through)與洗滌液為rhAGA藥物物質。
本文亦提供含有本文所述之任何rhAGA蛋白、及醫藥上可 接受之載劑之醫藥組成物。舉例而言，該醫藥組成物可經調配以用於靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內給藥。於若干具體實例中，該醫藥組成物包含濃度約4毫克/毫升至約6毫克/毫升(例如，約5毫克/毫升)之rhAGA。於若干實例中，該醫藥組成物係無菌、凍乾粉末。於若干具體實例中，該醫藥上可接受之載劑可為選自包括：甘露糖醇、磷酸二氫鈉一水合物、與磷酸氫二鈉七水合物之組群之一或多個製劑。
本文提供之任何醫藥組成物可不具可檢測量或無存在動物性產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血液產物)中之蛋白質、脂質、碳水化合物、核酸、與污染物(例如，本文所述之任何污染物)。
本文提供之任何醫藥組成物可包含只用選自無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基之組群之培養基之細胞培養中生產之本文提供之rhAGA蛋白。本文提供之任何醫藥組成物可包含只用無蛋白質培養基及/或化學成分確定培養基之細胞培養中生產之本文提供之rhAGA蛋白。本文提供之任何醫藥組成物可包含經由只用選自無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養生產，及使用整合與連續程序(例如，使用本文所述之任何例示之整合與連續程序)單離之本文提供之rhAGA蛋白。
本文亦提供表現載體，其含有：編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之序列；可操作地連接於編碼該人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列5’端之啟動子序列；可操作地連接於編碼該人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列5’端之具TTG起始密碼子之人類 CD52蛋白胜肽編碼序列；及可操作地連接於編碼該人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列3’端之多(A)辨識部位編碼序列。於若干具體實例中，該啟動子序列係選自包括：倉鼠rpS21啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子、與SV40早期啟動子之組群；及該編碼多(A)辨識部位係SV40早期多(A)辨識序列。於若干具體實例中，該表現載體進一步含有編碼人類或狗麩胺醯胺合成酶、或二氫葉酸還原酶之序列。於若干具體實例中，編碼該人類或狗麩胺醯胺合成酶的序列之5’端係可操作連接於SV40早期啟動子及編碼該人類或狗麩胺醯胺合成酶、或二氫葉酸還原酶的序列之3’端係可操作地連接於SV40早期內含子與多(A)訊息序列。
本文亦提供產生用於重組表現醣蛋白之哺乳動物細胞株之方法，該方法包括：(a)提供血清依賴性不朽哺乳動物細胞株；(b)循序培養該哺乳動物細胞株：(1)於含最初濃度(1X)動物血清之細胞培養基中培養約5天至約10天；(2)於含約0.2X至約0.3X濃度動物血清之細胞培養基中培養約5天至約10天；及(3)於含約0.01X至約0.08X動物血清之細胞培養基中培養約5天至約10天；(c)從(b)後之培養物中產生單一細胞次選殖培養物；(d)挑選具有可接受之轉染效率、於無血清培養基中細胞生長、及表現重組蛋白之(c)次選殖株；(d)於無蛋白質、無血清、化學成分確定之培養基中培養從(d)挑選之次選殖株約5天至約30天(例如，約5天至約25天、約5天至約20天、約5天至約15天、或約5天至約10天)；(e)從(d)後之培養物中產生單一細胞次選殖培養物；及(f)挑選具有可接受之轉染效率、最高細胞密度(peak cell density)、生長性質、容積生產力率(VPR)、與醣蛋白之醣基化譜之(e)次選殖株；其中該經挑選之(f)次選殖株係用於醣蛋白之重組表現。本文亦提供產生用於重組表現醣蛋白之哺乳動物細胞株之方法，該方法包括：(a)提供血清依賴性不朽哺乳動物細胞株；(b)循序培養該哺乳動物細胞株：(1)於含最初濃度(1X)動物血清之細胞培養基中培養約1天至約10天(例如，約3天)；(2)於含約0.2X至約0.6X(例如，0.5X)濃度動物血清之細胞培養基中培養約1天至約10天(例如，約3天)；及(3)於含約0X至約0.10X動物血清之細胞培養基中培養約5天至約10天(例如，約8天)；(c)從(b)後之培養物中產生單一細胞次選殖培養物；(d)挑選具有可接受之轉染效率、於無血清培養基中細胞生長、及表現重組蛋白之(c)次選殖株；(e)從(d)挑選之次選殖株產生單一細胞次選殖培養物；及(f)挑選具有可接受之轉染效率、最高細胞密度、生長性質、容積生產力率(VPR)、與重組蛋白表現之(e)次選殖株，其中該經挑選之(f)次選殖株係用於醣蛋白之重組表現。
於若干實例中，該血清依賴性不朽哺乳動物細胞株係中國倉鼠卵巢細胞株。於若干具體實例中，該血清依賴性不朽哺乳動物細胞株不內源表現二氫葉酸還原酶。於若干具體實例中，該經挑選之(f)次選殖株係懸浮生長。於若干具體實例中，該重組蛋白表現係抗體與酵素(例如，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)二者之一之表現。本文亦提供利用本文提供之任何方法生產之用於重組表現醣蛋白之哺乳動物細胞。
本文亦提供生產重組醣蛋白之方法，其包括：提供利用本 文提供之任何方法生產之用於重組表現醣蛋白之哺乳動物細胞；引入含醣蛋白編碼序列之表現載體至該細胞中；在足以生產該醣蛋白之條件下，於無血清生長培養基中培養該細胞；及從該細胞或生長培養基獲得醣蛋白。於若干實例中，該培養係使用懸浮細胞培養進行。於若干具體實例中，該培養係使用生物反應器進行。於若干具體實例中，該培養係使用無蛋白質、無血清、化學成分確定之培養基進行(例如，使用無蛋白質、無血清、化學成分確定之培養基培養中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。於若干具體實例中，該CHO細胞不內源表現二氫葉酸還原酶。於若干具體實例中，該重組醣蛋白係酵素(例如，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)。於若干具體實例中，該醣蛋白編碼序列與SEQ ID NO：1至少90%完全相同。於若干具體實例中，該表現載體進一步含有：可操作地連接於醣蛋白編碼序列5’端之啟動子序列；可操作地連接於醣蛋白編碼序列5’端之具TTG起始密碼子之人類CD52蛋白胜肽編碼序列；及可操作地連接於醣蛋白編碼序列3’端之多(A)辨識部位編碼序列。於若干具體實例中，該啟動子序列係選自下列組成之組群：倉鼠rpS21啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子、與SV40早期啟動子；及該多(A)辨識部位編碼序列係SV40早期多(A)辨識序列。於若干具體實例中，該表現載體進一步包含編碼人類或狗麩胺醯胺合成酶、或二氫葉酸還原酶之序列。於若干具體實例中，編碼該人類或狗麩胺醯胺合成酶、或二氫葉酸還原酶的序列之5’端係可操作地連接於SV40早期啟動子，及編碼該人類或狗麩胺醯胺合成酶、或二氫葉酸還原酶的序列之3’端係可操作地連接於SV40早期 內含子與多(A)訊息序列。於若干實例中，該醣蛋白係自細胞獲得。於若干實例中，該醣蛋白係自細胞培養基獲得。本文亦提供利用本文提供之任何方法生產之重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)。本文亦提供包含利用本文提供之任何方法生產之重組醣蛋白、及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。舉例而言，該醫藥組成物可調配以用於靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內給藥。於若干具體實例中，該醣蛋白係重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白及該醫藥組成物含有濃度約4毫克/毫升至約6毫克/毫升(例如，約5毫克/毫升)之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白。於若干具體實例中，該醫藥組成物係無菌、凍乾粉末。
本文亦提供治療法布瑞氏症病患之方法，其包括投予具有法布瑞氏症之病患有效治療量之本文提供之任何重組人類α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白。於若干具體實例中，該給與為全身性給藥(例如，靜脈內給藥)。於若干具體實例中，該病患係投予劑量約0.5毫克/公斤體重至約2.0毫克/公斤體重(例如，約1.0毫克/公斤體重)之rhAGA。於若干具體實例中，該病患係投予兩個或以上劑量之rhAGA蛋白。例如，該兩個或以上之至少兩個劑量rhAGA蛋白可約間隔兩週投予。若干具體實例進一步包括投予該病患一或多個選自：止痛劑、抗凝血劑、乙醯膽鹼酯酶抑制劑、β-阻斷劑、與葡萄糖苷腦醯胺合成酶抑制劑之組群之額外治療劑。於若干具體實例中，該病患係人類病患。於若干具體實例中，該病患已被診斷為具有法布瑞氏症。
本文亦提供增加哺乳動物細胞溶酶體中之α-半乳糖苷酶 -A蛋白量之方法，其包括使哺乳動物細胞與有效量之本文提供之任何重組人類α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白接觸。於若干具體實例中，該細胞係於活體外(例如，活體外之人類細胞)。於若干具體實例中，該細胞係於病患(例如，人類)中。於若干具體實例中，該病患已被診斷為具有法布瑞氏症。於若干實例中，該接觸係經由全身性地投予病患rhAGA而進行。例如，全身性給藥可為靜脈內給藥。於若干具體實例中，係投予病患劑量約0.5毫克/公斤體重至約2.0毫克/公斤體重(例如，約1.0毫克/公斤體重)之rhAGA。於若干具體實例中，係投予該病患兩個或以上劑量之rhAGA蛋白。例如，該兩個或以上之至少兩個劑量rhAGA蛋白係間隔約兩週投予。
本文亦提供降低病患之球形三脂醯基鞘胺醇血清量之方法，該方法包括投予有其需要之病患有效治療量之本文提供之任何重組人類α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白。該病患之球形三己糖苷腦醯胺血清量大於8微克/毫升。於若干實例中，該病患已被診斷為具有法布瑞氏症。於若干具體實例中，該投予為全身性給藥(例如，靜脈內給藥)。於若干具體實例中，係投予病患劑量約0.5毫克/公斤體重至約2.0毫克/公斤體重(例如，約1.0毫克/公斤體重)之rhAGA。於若干具體實例中，可投予病患兩個或以上劑量之rhAGA蛋白。例如，該兩個或以上之至少兩個劑量rhAGA蛋白可間隔約兩週投予。若干具體實例進一步包括投予該病患一或多個選自包括：止痛劑、抗凝血劑、乙醯膽鹼酯酶抑制劑、β-阻斷劑、與葡萄糖苷腦醯胺合成酶抑制劑之組群之額外治療劑。於若干具體實例中，該病患係人類。
術語“單離”意指從至少一種污染物(例如，蛋白質、核酸、脂質、或碳水化合物、或其組合物)中分離之分子。於非限制性實例中，單離之α-半乳糖苷酶-A蛋白或其他醣蛋白以重量計之純度為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。
“液態培養基”一詞意指包含足夠營養物以令哺乳動物細胞於活體外生長或增殖之液體。舉例而言，液態培養基可包含一或多個：胺基酸類(例如，20種胺基酸)、嘌呤類(例如，次黃嘌呤)、嘧啶類(例如，胸腺嘧啶核苷)、膽鹼、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、胸腺嘧啶核苷、氰鈷銨素、丙酮酸鹽、類脂酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、鐵、銅、鋅、與碳酸氫鈉。於若干具體實例中，液態培養基可包含哺乳動物血清。於若干具體實例中，液態培養基不包含哺乳動物之血清或其他萃取物(成分確定之液態培養基)。於若干具體實例中，液態培養基可包含微量金屬、哺乳動物生長激素、及/或哺乳動物生長因子。液態培養基之另一實例為基本培養基(例如，僅包含無機鹽、碳源、與水之培養基)。液態培養基之非限制性實例見述於本文。液態培養基之更多實例為此項技藝中已知且為市售可得。液態培養基可包含任何密度之哺乳動物細胞。舉例而言，如本文所用之取自生物反應器之大量液態培養基實質上可不含哺乳動物細胞。
“無血清液態培養基”一詞意指不包含哺乳動物血清之液態培養基。
“含血清液態培養基”一詞意指包含哺乳動物血清之液態 培養基。
“化學成分確定之液態培養基”一詞為此項技藝術語，意指所有化學成分為已知之液態培養基。舉例而言，化學成分確定之液態培養基不包含胎牛血清、牛血清白蛋白、或人類血清白蛋白，因此等製劑通常包含白蛋白與脂質之複雜混合物。
“無蛋白質液態培養基”一詞意指不包含任何蛋白質(例如，任何可檢測之蛋白質)之液態培養基。
“整合程序”一詞意指使用協同運作以達到特定效果之結構元件所進行之程序(例如，從液態培養基產生醫療用蛋白質藥物物質(例如，其包括重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白))。
“連續程序”一詞意指通過用於生產藥物物質(例如，含重組蛋白之藥物物質)之至少部分系統，從含有重組蛋白(例如，本文所述之任何重組蛋白)之培養基連續饋入流體之程序。舉例而言，包含醫療用重組蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)之液態培養基連續地饋入正在運行中之系統，醫療用藥物蛋白質則被送出系統。可用於進行連續程序之此類系統之非限制性實例見述於美國臨時專利申請案第61/856,930與61/775,060號中。
“多管柱層析系統”或“MCCS”一詞意指兩個或以上互相連接或切換之層析管柱及/或層析膜之系統。一例示之多管柱層析系統為包含兩個或以上互相連接或切換之層析管柱及/或層析膜之週期性逆流層析系統(PCC)。多管柱層析系統之更多實例為此項技藝中已知。
“分泌之蛋白質”或“分泌之重組蛋白”一詞為此項技藝中 悉知，意指至少部分從哺乳動物細胞至少分泌至細胞外空間(例如，分泌至液態培養基中)之蛋白質(例如，重組蛋白)。熟習之從業人員應理解，“經分泌之”蛋白質不需要從細胞完全解離以被認為係分泌之蛋白質。
“灌流培養”一詞意指於第一液態培養基中培養多元(a plurality of)細胞(例如，哺乳動物細胞)，其中該培養包括週期性地或連續地在添加大體上同量之第二液態培養基至容器(例如，生物反應器)之同時或之後立刻移出第一液態培養基。於若干實例中，於培養期之遞增期間(例如，約24小時期間、介於約1分鐘與約24小時期間、或大於24小時期間)，第一液態培養基移出與添加之容量具遞增變化(例如，增加或減少)(例如，每日之培養基再饋料速率)。每日移出與替換之培養基部分，可視經培養之特定細胞、初始接種密度、與特定時間之細胞密度而不同。“RV”或“反應器容量”意指在培養程序開始時存在之培養基容量(例如，接種後存在之培養基總容量)。可被用以進行灌流培養之生物反應器為此項技藝中已知。熟習之從業人員應理解的是，生物反應器可適於灌流培養之使用(例如，適於作為灌流式生物反應器)。
“饋料批次培養”一詞係此項技藝術語，意指為於第一液態培養基中培養多元細胞(例如，哺乳動物細胞)，其中存在容器(例如，生物反應器)中之細胞培養包括第一液態培養基或第二液態培養基無實質或顯著之從細胞培養中移出下，定期或連續添加第二液態培養基至第一液態培養基中。第二液態培養基可與第一液態培養基相同。於饋料批次培養之若干實例中，第二 液態培養基為第一液態培養基之濃縮形式。於饋料批次培養之若干實例中，第二液態培養基係呈乾燥粉末添加。熟習之從業人員應理解的是，生物反應器可適於饋料批次培養之使用(例如，適於作為饋料批次式生物反應器)。
“比生產力率”或“SPR”為此項技藝術語，用於本文係指每一哺乳動物細胞每天所生產醫療用重組蛋白之質量或酵素活性。醫療用重組抗體之SPR通常測量為質量/細胞/天。醫療用重組酵素之SPR通常測量為單位/細胞/天或(單位/質量)/細胞/天。
“容積生產力率”或“VPR”為此項技藝術語，用於本文係指每天每培養容量(例如，每公升之生物反應器、容器、或試管容量)所生產醫療用重組蛋白之質量或酵素活性。醫療用重組抗體之VPR通常測量為質量/公升/天。醫療用重組酵素之VPR通常測量為單位/公升/天或質量/公升/天。
除非另行界定，否則本文所用之所有技術與科學術語與一般熟習本發明所屬技藝者之通常了解具有相同意義。見述於本文之方法與材料係供本發明使用；亦可使用此項技藝中已知之其他適當方法與材料。材料、方法、與實施例係僅供說明而不擬構成侷限。本文述及之所有出版物、專利申請案、專利案、序列、資料庫條目、及其他參考文獻全部內容均併入本文以資參考。於衝突之情形下，以本說明書(包括界定)為準。
本發明一或多個具體實例之細節於下文附圖及說明中闡述。從說明與圖式及從申請專利範圍，本發明之其他特徵、目的、與優點將顯而易見。
詳細說明
本文係提供相較於Fabrazyme®，具有改變之醣基化譜之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白，及含有至少一個重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之組成物、醫藥組成物、與套組。含有本發明提供之重組醣蛋白之本發明提供之重組醣蛋白與組成物具有，例如，下述優點：呈醣型變異性較小及/或較低之污染風險或量(例如，較低之病毒污染風險或量)。相較於Fabrazyme®，本發明提供之重組醣蛋白亦可具有一或多個呈任何組合之下述非限制性優點：非特異性靶向肝臟減少(於投予病患，例如，人類病患該重組醣蛋白後，由於與在肝細胞表面表現之去唾液酸醣蛋白受體結合)、於其表面表現甘露糖-6-磷酸受體蛋白的哺乳動物細胞(例如，人類細胞)之重組醣蛋白胞吞速率增加、對甘露糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加、血清半衰期增長、與減少之有效劑量。本文亦提供生產用於重組表現重組醣蛋白(例如，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)的哺乳動物細胞之方法及生產重組醣蛋白(例如，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)之方法。本文亦提供治療法布瑞氏症之方法、降低病患之球形三己糖苷腦醯胺血清量之方法、及增加哺乳動物細胞(例如，活體外細胞或病患之細胞)溶酶體中之α-半乳糖苷酶-A量之方法。本文亦提供包含α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列之表現載體。
α-半乳糖苷酶-A
人類α-半乳糖苷酶-A(α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；α-gal A；EC 3.2.1.22)係由Xq22上之基因編碼之溶酶體外醣苷酶。成熟人類α-半乳糖苷酶-A係由具398個胺基酸，各包含一活性位 點及可能三個氮連結型醣基化位點(N139、N192、與N215)的兩個非共價連接之次單元構成之同源二聚體(大約51kD)。α-半乳糖苷酶-A蛋白之活性位點具有對催化活性具關鍵性的兩個天冬胺酸殘基(D170與D231)。α-半乳糖苷酶-A蛋白之三維晶體結構於1996年被發表(Munier-Lehmann et al.,J.Biol.Chem.271：15166-15174,1996)。α-半乳糖苷酶-A催化球形三己糖苷腦醯胺(GL-3)與其他α-半乳糖基(galactyl)末端之中性醣神經鞘脂質類，例如半乳二糖腦醯胺(galabiosylceramide)及B群血液(Blood Group B)物質至腦醯胺二己糖苷與半乳糖之水解。重組型α-半乳糖苷酶-A之比活性係使用合成基質，例如對硝苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(pNP)予以測試。
人類α-半乳糖苷酶-A蛋白醣基化容許其靶向人類細胞中之溶酶體。於下文提供用以糖基化人類α-半乳糖苷酶-A蛋白及其他人類醣蛋白的細胞途徑之簡短摘述。
人類α-半乳糖苷酶-A蛋白於內質網中合成。合成後，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之各單體於高基氏體中進行轉譯後修飾。如上所述，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之各單體具有三個可能之N-醣基化位點(N139、N192、與N215)。人類α-半乳糖苷酶-A蛋白有數個生理醣型。N139殘基連接複合碳水化合物，N192與N215殘基則連接富含甘露糖之寡醣，因此，涉及引導該酵素供溶酶體攝取。於內質網中合成後，溶酶體酵素之前驅物轉移至高基氏體。於順面高基氏體(cis-Golgi)中發生轉譯後修飾，特別是，添加甘露糖-6-磷酸(M6P)殘基。該M6P-酵素複合物與M6P受體結合，從反面高基氏體(trans-Golgi)網釋出，從該處被 輸送至前溶酶體/胞內體腔室。一旦在胞內體腔室內，酸性pH使該酵素與其受體解離；接著進行去磷酸化，生產成熟之功能性酵素。該受體則再循環至反面高基氏體招募其他酵素，或移至細胞膜，於該處可收集內源酵素(Sly et al.,J.Cell Biochem.18：67-85,1982；Helenius et al.,Ann.Rev.Biochem.32：1-100,1997)。
所有真核生物N-聚醣之生合成均從內質網(ER)膜之細胞質膜面開始，包括將GlcNAc-P從UDP-GlcNAc轉移至似脂質前驅物磷酸多萜醇(dolichol phosphate，Dol-P)，以產生焦磷酸多萜醇N-乙醯葡萄糖胺(Dol-P-P-GlcNAc)。在經由寡糖基轉移酶蛋白質將整個聚醣轉移至ER蛋白質中Asn-X-Ser/Thr序列之天冬醯胺前，14個糖循序地添加於Dol-P，得到Glc3Man9GlcNAc2聚醣。結合蛋白質之N-聚醣接著於ER與高基氏體中，經由膜結合之醣苷酶與醣基轉移酶所催化之一系列複雜反應重新塑造。於14糖寡甘露糖聚醣共價連結於Asn-X-Ser/Thr後，於ER中使用一系列反應以自Glc3Man9GlcNAc2移除三個糖。此等修整步驟保存在所有真核生物中。Glc3Man9GlcNAc2之修整，始於利用α-醣苷酶I與II循序地移除葡萄糖殘基。兩個葡萄糖苷酶均於ER腔中作用，α-醣苷酶I作用於末端α1-2Glc上，α-葡萄糖苷酶II則循序移除兩個內部α1-3Glc殘基。在離開ER之前，許多醣蛋白經由ERα-甘露糖苷酶I被作用，特異性地自Man9GlcNAc2中央臂(central arm)移除末端α1-2Man，得到Man8GlcNAc2異構物。離開ER運送至高基氏體之大部分醣蛋白為具8或9個甘露糖殘基之N-聚醣(視其是否已被ER α-甘露 糖苷酶I作用而定)。就多數醣蛋白而言，更多甘露糖殘基於高基氏體順面腔室中被移除，直到產生Man5GlcNAc2。
雜種(hybrid)及複合(complex)N-聚醣之生合成係於高基氏體中間膜囊中，經由所謂GlcNAcT-1之N-乙醯葡糖胺基轉移酶之作用開始。GlcNAcT-1添加N-乙醯葡萄糖胺殘基至Man5GlcNAc2核心甘露糖α1-3之C-2位置，開始N-聚醣之第一個分支。一旦發生此步驟，大部分N-聚醣即經由α-甘露糖苷酶II被修整，自GlcNAcMan5GlcNAc2移除末端α1-3Man與α1-6Man殘基，以形成GlcNAcMan3GlcNAc2。兩個甘露糖殘基一旦被移除，第二個N-乙醯葡萄糖胺即經由GlcNAcT-II被添加至甘露糖α1-6之C-2位置，得到所有雙觸角、複合N-聚醣之前驅物。所得聚醣具有兩個觸角或分支，即開始添加兩個末端N-乙醯葡萄糖胺殘基。於核心甘露糖α1-3之C-4位置(利用GlcNAcT-IV)與核心甘露糖α1-6之C-6位置(利用GlcNAcT-V)可啟動更多分支，得到三與四觸角之N-聚醣。另一酵素，被稱為GlyNAcT-IX或GlcNAcT-Vb，則於核心甘露糖α1-6之C-6位置上催化與GlcNAcT-V相同之反應，惟對照於GlcNAcT-V，GlnNAcT-IX/Vb亦可轉移N-乙醯葡萄糖胺至核心甘露糖α1-3之C-6位置。另一分支可於核心甘露糖α1-3之C-4位置由GlcNAcT-VI啟動。
雜種及複合N-聚醣可帶有利用GlcNAcT-III而附加於核心β-甘露糖之二等分(bisecting)N-乙醯葡萄糖胺殘基。當GlcNAcT-III接著α-甘露糖苷酶II之後作用，及利用GlcNAcT-II、GlcNAcT-IV、與GlcNAcT-V啟動分支後，則可合 成具二等分N-乙醯葡萄糖胺之二、三、與四觸角之複合N-聚醣。
進一步之糖添加，主要發生於反面高基氏體，係將雜種型及具分支之N-聚醣轉化為成熟之複合N-聚醣之廣泛陣列。糖可添加於核心，經由添加糖可延伸分支之N-乙醯葡萄糖胺殘基，經延伸之分支可被封端(capped)或修飾。舉例而言，GlcNAcT-II之產物雙觸角N-聚醣，係可經由添加海藻糖、半乳糖、與唾液酸被延伸產生具兩個分支之複合N-聚醣。複合N-聚醣可，例如，具有許多追加之糖(包括被附加於該N-聚醣核心者)、更多之分支(以聚-N-乙醯乳糖胺單元延伸之分支)、及不同之封端結構。複合寡醣係以含甘露糖-3之寡醣，例如，利用添加N-乙醯葡萄糖胺、半乳糖、與唾液酸等殘基，於高基氏體中合成。
核心修飾經常係使海藻糖以α1-6鍵結添加於與聚醣核心之天冬醯胺鄰接之N-乙醯葡萄糖胺。涉及轉移海藻糖至此核心N-乙醯葡萄糖胺之海藻糖基轉移酶需要GlcNAcT-1之居先作用。大部分複合與雜種型N-聚醣具有延伸之分支，其係利用添加β-連接之半乳糖殘基至起始N-乙醯葡萄糖胺，以生產被稱為第2型N-乙醯乳糖胺之普遍存在之建構單元Galβ1-4GlcNAc而製得。觸角可利用循序添加N-乙醯葡萄糖胺與半乳糖殘基，產生被稱為聚-N-乙醯乳糖胺之LacNAc(-3Galβ1-4GlcNAcβ1-)n串聯重複體，被進一步延伸。於另一實例中，係添加β-連接之半乳糖於N-乙醯葡萄糖胺之C-3，得到被稱為第1型N-乙醯乳糖胺序列之Galβ1-3GlcNAc。於若干蛋白質中，係以β-連接之N-乙醯半乳糖胺代替β-連接之半乳糖，添加於N-乙醯葡萄糖胺，產生具GalNAcβ1-4GlcNAc延伸之觸角。封端或修飾反應涉及 添加唾液酸、海藻糖、半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、與硫酸鹽於分支。封端糖類最常見為α-連接，因此從β-連接之似帶狀聚-N-乙醯乳糖胺分支向外延伸。
溶酶體酵素可於順面高基氏體中，使寡甘露糖N-聚醣之甘露糖殘基之C-6位置獲得GlcNAc-1-P。然後在反面高基氏體中，利用醣苷酶移除N-乙醯葡萄糖胺，從而暴露被Man-6-P受體辨識之Man-6-P殘基，並運送至酸化之前溶酶體腔室。
雜種寡醣係於高基氏體中，以甘露糖-3與甘露糖-5核心結構，利用添加，例如，N-乙醯葡萄糖胺、半乳糖、與唾液酸等殘基予以合成。若GlcNAcMan5GlcNAc2聚醣不被α-甘露糖苷酶II作用，於成熟醣蛋白中留下完整且未修飾之外圍α1-3Man與α1-6Man殘基，則形成雜種型N-聚醣。α-甘露糖苷酶II之不完全作用，可產生GlcNAcMan4GlcNAc2混合型。另一高基氏體甘露糖苷酶，α-甘露糖苷酶IIX，亦對由GlcNAcT-1產生之GlnNAcMan5GlcNAc2作用。
用以產生氮連結型聚醣(例如，高甘露糖型寡醣)之生合成途徑與酵素之詳細評論回顧，見述於Stanley等之“N-Glycans”in Essentials of Glycobiology,Ed.Varki,Cummings,and Eskho,Cold Spring Harbor Press,2009。如上述，重組人類α-半乳糖苷酶-A之轉譯後醣基化對於該蛋白質之適當運送(trafficking)很重要。舉例而言，於胺基酸位置215之絲胺酸殘基之置換造成酵素運送至溶酶體受損(Munier-Lehmann et al.,J.Biol.Chem.271：15166-15174,1996；Wildt et al.,Nat.Rev.Microbiol.3：119-128,2005)。說明在CHO細胞中表現之不同醣型人類α- 半乳糖苷酶-A蛋白之研究見述於Matsuura et al.,Glycobiology 8：329-339,1998。
人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之例示前驅物與成熟序列分別示於圖2(分別為SEQ ID NOS：1與2)。重組人類α-半乳糖苷酶蛋白，如本文所述，可包含與SEQ ID NO：1或2至少95%完全相同(例如，至少96%、97%、98%、99%、或100%完全相同)之序列。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有(例如，包含)與SEQ ID NO：1或2至少95%完全相同(例如，至少96%、97%、98%、99%、或100%完全相同)之序列。於其他實例中，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可包含從N端移除1至30個胺基酸(例如，1至25個胺基酸、1至20個胺基酸、1至15個胺基酸、1至10個胺基酸、1至5個胺基酸、1至3個胺基酸、1或2個胺基酸、20至25個胺基酸、15至25個胺基酸、10至25個胺基酸、1至10個胺基酸、1至8個胺基酸、與5至15個胺基酸)及/或從C端移除1至30個胺基酸(例如，1至25個胺基酸、1至20個胺基酸、1至15個胺基酸、1至10個胺基酸、1至5個胺基酸、1至3個胺基酸、1或2個胺基酸、20至25個胺基酸、15至25個胺基酸、10至25個胺基酸、1至10個胺基酸、1至8個胺基酸、與5至15個胺基酸)之SEQ ID NO：2序列。
重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可共價結合於異源之胺基酸序列或標記(tag)。可結合於重組人類α-半乳糖苷酶蛋白質之異源胺基酸序列之非限制性實例包括：多-His標記、幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、麩胱甘肽-S-轉移酶、與鏈黴抗生物素蛋白。任何類型之標記可共價結合於人類α-半乳糖苷酶-A蛋 白(例如，螢光基團、放射性核苷酸、與螢光蛋白)。可共價結合於人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之分子實例，包括聚合物，例如，聚乙二醇、聚乙烯、聚酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚己內酯、與其共聚物。
人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之例示前驅物與成熟序列分別示於圖2(分別為SEQ ID NOS：1與2)。重組人類α-半乳糖苷酶蛋白，如本文所述，可包含與SEQ ID NO：1或2至少95%完全相同(例如，至少96%、97%、98%、99%、或100%完全相同)之序列。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有(例如，包含)與SEQ ID NO：1或2至少95%完全相同(例如，至少96%、97%、98%、99%、或100%完全相同)之序列。於其他實例中，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可包含從N端移除1至30個胺基酸(例如，1至25個胺基酸、1至20個胺基酸、1至15個胺基酸、1至10個胺基酸、1至5個胺基酸、1至3個胺基酸、1或2個胺基酸、20至25個胺基酸、15至25個胺基酸、10至25個胺基酸、1至10個胺基酸、1至8個胺基酸、與5至15個胺基酸)及/或從C端移除1至30個胺基酸(例如，1至25個胺基酸、1至20個胺基酸、1至15個胺基酸、1至10個胺基酸、1至5個胺基酸、1至3個胺基酸、1或2個胺基酸、20至25個胺基酸、15至25個胺基酸、10至25個胺基酸、1至10個胺基酸、1至8個胺基酸、與5至15個胺基酸)之SEQ ID NO：2序列。
重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可共價結合於異源之胺基酸序列或標記(tag)。可結合於重組人類α-半乳糖苷酶蛋白質之異源胺基酸序列之非限制性實例包括：多-His標記、幾丁質結 合蛋白、麥芽糖結合蛋白、麩胱甘肽-S-轉移酶、與鏈黴抗生物素蛋白。任何類型之標記可共價結合於人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(例如，螢光基團、放射性核苷酸、與螢光蛋白)。可共價結合於人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之分子實例，包括聚合物，例如，聚乙二醇、聚乙烯、聚酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚己內酯、與其共聚物。
編碼人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之例示核酸(例如，cDNA)示於圖2(SEQ ID NO：1)。
於若干實例中，本文所述之任何核酸(例如，cDNAs)可共價結合於一或多個螢光標記與淬滅體(quencher)。於其他實例中，任何核酸(例如，cDNAs)可包含或進一步包含至少一種包含放射性同位素(例如，P32、P33、及/或S35)之核苷酸。
α-半乳糖苷酶-A蛋白之改變醣型
本說明書提供相較於Fabrayzme®具有改變(例如，增進)之醣基化之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)。本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白具有，例如，導致與甘露糖-6-磷酸受體結合增加之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比增加(相較於Fabrazyme®)，因而可增加於其表面表現甘露糖-6-磷酸受體蛋白的哺乳動物細胞(例如，人類細胞)之重組醣蛋白胞吞速率(相較於Fabrazyme®)。相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白亦可具有減少之單唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比與增加之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比之一或二者，其分別可導致降低重組蛋白之非特異性導向肝臟(由於投予病患，例如，人類病患，重組 人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之後，與於肝細胞表面表現之去唾液酸醣蛋白受體結合)及血清半衰期增長(相較於Fabrazyme®)。
本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白亦，例如，顯示其組成變異性較小(例如，醣型變異性較小)及/或為較安全之產物(例如，降低之一或多種噬菌體、細菌、分枝桿菌、與病毒(例如，腸病毒(例如，人類或動物腸病毒)、鼻病毒(例如，動物或人類鼻病毒)、動物或人類小雙節段RNA病毒(picobirnaviruses)、嵴病毒(kobuviruses)、牛傳染性鼻氣管炎(rhinotracheitis)、牛病毒性下痢病毒、牛里奧病毒(reovirus)-3、杯狀病毒科(caliciviridae)、伊科病毒(echovirus)、小兒麻痺病毒(polioviruses)、輪狀病毒(例如，動物或人類輪狀病毒)、牛泡沫病毒(spumaviruses)、豬內源性反轉錄病毒、牛免疫缺失症病毒、肝炎病毒、囊泡狀病毒(vesiviruses)(例如，囊泡狀病毒2117)、諾羅病毒(noroviruses)(例如，動物或人類諾羅病毒)、星狀病毒(astroviruses)(例如，人類或動物星狀病毒)、動物或人類副流行性感冒或間質肺炎病毒(metapneumoviruses)、指環病毒(anelloviruses)、冠狀病毒(coronaviruses)、白蛉病毒(phleboviruses)、牛施馬倫貝格(schmallenberg)病毒、杯狀病毒(calicivirus)、環形病毒(cycloviruses)、環狀病毒(circoviruses)(例如，豬或牛環狀病毒)、柯沙病毒(cosaviruses)、克沙奇病毒(coxsackievirus)、庫巴病毒(kubavirus)、瘟疫病毒(pestivirus)、多瘤(polyoma)病毒(例如，牛多瘤病毒)、牛乳突狀瘤病毒(papillomavirus)、新囓齒動物乳突狀瘤第2型SV40、小病毒(例如，豬、囓齒動物、人類、或牛小病毒)、心肌炎病毒 (cardioviruses)(例如，EMCV)、副黏液病毒(paramyxoviruses)、水泡性口炎(vesicular stomatitis)病毒、環轉病毒(gyroviruses)、柯沙病毒、矽尼卡谷(Seneca valley)病毒、冠狀病毒、馬傳染性貧血症(equine infectious anemia)、人類腺病毒、貓杯狀病毒、腺病毒第2型、牛腺病毒第3型、假性狂犬病(pseudorabies)病毒、牛病毒性下痢、副流行性感冒第3型、牛傳染性鼻氣管炎(rhinotracheitis)、藍舌病(bluetongue)病毒、貓白血病病毒、小鼠小病毒(minute virus)、牛細小病毒(parvovirus)、卡西谷(cache valley)病毒、里奧病毒(例如，動物或人類里奧病毒)、犬腺病毒、SV-40病毒、腦心肌炎(encephalomyocarditis)病毒、豬PRRSV、牛疱疹病毒4、或口蹄疫)之污染風險或量)。
相較於Replagal®，Fabrazyme®先前顯示具有顯著不同之醣基化譜(Lee et al.,Glycobiology 13：305-313,2003)。Fabrazyme®與Replagal®醣基化譜之顯著差異被認為部分係由於用以生產此等蛋白質之細胞株不同(例如，Fabrazyme®以CHO細胞株生產，而Replagal®以人類細胞株生產)。
Fabrazyme®係由Genzyme生產及販售之重組型人類α-半乳糖苷酶A蛋白。Fabrazyme®與製造Fabrazyme®之方法見述於，例如，美國專利案Nos.5,356,804。Replagal®係由Shire所生產及販售之重組型人類α-半乳糖苷酶A蛋白。Replagal®與製造Replagal®之方法見述於，例如，美國專利第6,083,725、6,458,574、6,395,884、與7,133,354號。
本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶蛋白(FZ2G)具有兩個或以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個)下 文所列舉(i)至(xii)之任何結構特徵(例如，任何組合)。每個從(i)至(xii)之一或多個參數之下文列舉之任何範圍之數值均可存在本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白中。此外，本文提供之任何重組人類α-半乳糖苷酶蛋白可具有一或多個(例如，一個、兩個、或三個)於本節中敘述之例示功能性質。本文所述重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之物理特徵及/或功能性質之組合可以任何方式組合。於下文敘述本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白結構特徵之例示組合。
此外，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有較小之結構變異性(例如，醣型變異性較小)及/或降低之污染風險或量(例如，降低之污染風險或量)。
本文提供之任何rhAGA蛋白可無或不具可檢測量之存在動物性產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血液產物)中之蛋白質、脂質、碳水化合物、核酸、與污染物(例如，本文所述之任何污染物)。本文提供之任何rhAGA蛋白可為於只用選自無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養中生產之rhAGA蛋白。本文提供之任何rhAGA蛋白可為只用無蛋白質及/或化學成分確定培養基之細胞培養中生產之rhAGA蛋白。本文提供之任何rhAGA蛋白可為只用選自包括無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養中生產及使用整合與連續程序(例如，本文或WO 14/137903中敘述之任何整合與連續製程)單離之rhAGA蛋白。相較於以包括使用含有動物產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血液因子或蛋白質)培養基之方法生產之本文提供之 rhAGA蛋白，本文提供之任何rhAGA蛋白可為具有增進之安全性(例如，降低之污染(例如，本文敘述或此項技藝中已知之任何例示污染物)風險)之rhAGA蛋白。
生物物理性質 I.氮連結型單唾液酸化寡醣
相較於Fabrazyme®，本文敘述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有減少之單唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。相較於Fabrazyme®，本文敘述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有約相同或稍微減少之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。由於單唾液酸化寡醣可能含有可與於肝臟肝細胞上表現之去唾液酸醣蛋白受體結合之暴露之半乳糖殘基，因此此特徵是有利的。肝臟不是重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之標靶組織，因此單唾液酸化寡醣量之減少被認為可減少人體中此酵素之無成效導向。
Fabrazyme®具有介於約1.7%至約3.2%間之單唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰3)之總氮連結型寡醣百分比。本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約0.1%與約1.6%間(例如，介於約0.1%與約1.5%間、約0.1%與約1.4%間、約0.1%與約1.3%間、約0.1%與約1.2%間、約0.1%與約1.1%間、介於約0.1%與約1.0%間、約0.1%與約0.9%間、約0.1%與約0.8%間、約0.1%與約0.7%間、約0.1%與約0.6%間、約0.1%與約0.5%間、約0.1%與約0.4%間、約0.2%與約1.4%間、約0.2%與約1.3%間、約0.2%與約1.2%間、約0.2%與約1.0%間、約0.2%與約0.9%間、約0.2%與約0.8%間、 約0.2%與約0.7%間、約0.3%與約1.4%間、約0.3%與約1.3%間、約0.3%與約1.3%間、約0.3%與約1.2%間、約0.3%與約1.2%間、約0.3%與約1.1%間、約0.3%與約1.0%間、約0.3%與約0.9%間、約0.3%與約0.8%間、約0.3%與約0.7%間、約0.4%與約1.4%間、約0.4%與約1.3%間、約0.4%與約1.2%間、約0.4%與約1.1%間、約0.4%與約1.0%間、約0.4%與約0.9%間、約0.4%與約0.8%間、約0.4%與約0.7%間、約0.5%與約1.4%間、約0.5%與約1.3%間、約0.5%與約1.2%間、約0.5%與約1.1%間、約0.5%與約1.0%間、約0.5%與約0.9%間、或約0.6%與約1.2%間)之單唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜之波峰3)之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約1.7%與約5.7%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰2)之總氮連結型寡醣百分比。本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約0.1%與3.0%間(例如，介於約0.1%與約2.9%間、約0.1%與約2.8%間、約0.1%與約2.7%間、約0.1%與約2.6%間、約0.1%與約2.5%間、約0.1%與約2.4%間、約0.1%與約2.3%間、約0.1%與約2.2%間、約0.1%與約2.1%間、約0.1%與約2.0%間、約0.1%與約1.9%間、約0.1%與約1.8%間、約0.1%與約1.7%間、約0.1%與約1.6%間、約0.1%與約1.5%間、約0.1%與約1.4%間、約0.1%與約1.3%間、約0.1%與約1.2%間、約0.3%與約3.0%間、約0.3%與約2.9%間、約0.3%與約2.8%間、約0.3%與約2.7%間、約0.3%與約2.6%間、約0.3%與約2.5%間、約0.3%與約2.4%間、約0.3%與約2.3%間、約0.3%與約2.2%間、 約0.3%與約2.1%間、約0.3%與約2.0間、約0.3%與約1.9%間、約0.3%與約1.8%間、約0.3%與約1.7%間、約0.3%與約1.6%間、約0.3%與約1.5%間、約0.3%與約1.4%間、約0.3%與約1.3%間、或約0.3%與約1.2%間)之含單唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰2)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定單唾液酸化寡醣或含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
II.氮連結型雙甘露糖-6-磷酸寡醣
相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具增加之雙甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。增加量之雙甘露糖-6-磷酸寡醣導致靶向於其細胞膜上表現甘露糖-6-磷酸受體之細胞增加。與甘露糖-6-磷酸受體之結合引發酵素之胞吞進入細胞及酵素之穿梭運送至細胞溶酶體。
Fabrazyme®具有介於約4.0%與約7.0%間之雙甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大於約7.5%(例如，大於約7.6%、大於約7.7%、大於約7.8%、大於約7.9%、大於約8.0%、大於約8.1%、大於約8.2%、大於約8.2%、大於約8.3%、大於約8.4%、大於約8.5%、大於約8.6%、大於約8.7%、大於約8.8%、大於約8.9%、大於約8.9%、大於約9.0%、大於約9.1%、大於 約9.2%、大於約9.3%、大於約9.4%、大於約9.5%、大於約9.6%、大於約9.7%、大於約9.8%、大於約9.9%、大於約10.0%、大於約10.1%、大於約10.2%、大於約10.3%、大於約10.4%、大於約10.5%、大於約10.6%、大於約10.7%、大於約10.8%、大於約10.9%、或大於約11%)之雙甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約7.0%與約13%間、約8.0%與約12.0%、或約9.0%與約11.0%間之雙甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
III.氮連結型雙唾液酸化寡糖與氮連結型含雙唾液酸化海藻糖寡醣
相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有約相同或增加之含雙唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰4)之總氮連結型寡醣百分比。相較於Fabrazyme®，所提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有減少之雙唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰5)之總氮連結型寡醣百分比。增加量之含雙唾液酸化海藻糖寡醣被認為可增長該蛋白質於活體內及/或活體外(例如，於病患血清或於醫藥組成物中)之半衰期。
Fabrazyme®具有介於約11.0%與約14.2%間之含雙唾液酸 化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰4)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大於約13.0%(例如，大於約13.1%、大於約13.2%、大於約13.3%、大於約13.4%、大於約13.5%、大於約13.6%、大於約13.7%、大於約13.8%、大於約13.9%、大於約14.0%、大於約14.1%、大於約14.2%、大於約14.3%、大於約14.4%、大於約14.5%、大於約14.6%、大於約14.7%、大於約14.8%、大於約14.9%、或大於15.0%)之含雙唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰4)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有介於約13.0%至約15.0%間、約13.5%至約15.5%間、約14.0%至約16.0%、或約14.5%與約16.5%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰4)之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約5.6%與約7.1%間之雙唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰5)之總氮連結型寡醣百分比。本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有介於約0.1%與約5.3%間(例如，介於約0.1%與約5.2%間、約0.1%與約5.1%間、約0.1%與約5.0%間、約0.1%與約4.9%間、約0.1%與約4.8%間、約0.1%與約4.7%間、約0.1%與約4.6%間、約0.1%與約4.5%間、約0.1%與約4.4%間、約0.1%與約4.3%間、約0.1%與約4.2%間、約0.1%與約4.1%間、約0.1%與約4.0%間、約0.1%與約3.9%間、約0.1%與約3.8%間、約0.1%與約3.7% 間、約0.1%與約3.6%間、約0.1%與約3.5%間、約0.1%與約3.4%間、約0.1%與約3.3%間、約0.1%與約3.2%間、約0.1%與約3.1%間、約0.1%與約3.0%間、約0.1%與約2.9%間、約0.1%與約2.8%間、約0.1%與約2.7%間、約0.1%與約2.6%間、約0.1%與約2.5%間、約0.3%與約5.2%間、約0.3%與約5.1%間、約0.3%與約5.0%間、約0.3%與約4.9%間、約0.3%與約4.8%間、約0.3%與約4.7%間、約0.3%與約4.6%間、約0.3%與約4.5%間、約0.3%與約4.4%間、約0.3%與約4.3%間、約0.3%與約4.2%間、約0.3%與約4.1%間、約0.3%與約4.0%間、約0.3%與約3.9%間、約0.3%與約3.8%間、約0.3%與約3.7%間、約0.3%與約3.6%間、約0.3%與約3.5%間、約0.3%與約3.5%間、約0.3%與約3.4%間、約0.3%與約3.3%間、約0.3%與約3.2%間、約0.3%與約3.1%間、約0.3%與約3.0%間、約0.3%與約2.9%間、約0.3%與約2.8%間、約0.3%與約2.7%間、約0.3%與約2.6%、或約0.3%與約2.5%間)之雙唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰5)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定雙唾液酸化寡醣與含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
IV.氮連結型三唾液酸化寡醣
相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加之第2型三觸角(triantennary)、三唾液酸化寡醣(亦即，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比。相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人 類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有減少之第1型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6)之總氮連結型寡醣百分比。圖10之插圖顯示兩個三觸角、三唾液酸化寡醣結構，於以2-AA衍生化之氮連結型寡醣之層析溶洗曲線中，兩個結構其中一個對應於波峰6(第1型)，另一個對應於波峰6’(第2型)。增加量之含三唾液酸化海藻糖寡醣被認為可增長該蛋白質於活體內及/或活體外(例如，於病患血清或於醫藥組成物中)之半衰期。
Fabrazyme®具有介於約0.5%與約1.2%間之第2型三觸角三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之車組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大於2.0%(例如，大於2.1%、大於2.2%、大於2.3%、大於2.4%、大於2.5%、大於2.6%、大於2.7%、大於2.8%、大於2.9%、大於3.0%、大於3.1%、大於3.2%、大於3.3%、大於3.4%、大於3.5%、大於3.6%、大於3.7%、大於3.8%、大於3.9%、大於4.0%、大於4.1%、大於4.2%、大於4.3%、大於4.4%、大於4.5%、大於4.6%、大於4.7%、大於4.8%、大於4.9%、大於5.0%、大於5.1%、大於5.2%、大於5.3%、大於5.4%、大於5.5%、大於5.6%、大於5.7%、大於5.8%、大於5.9%、大於6.0%、大於6.1%、大於6.2%、大於6.3%、大於6.4%、大於6.5%、大於6.7%、大於6.8%、大於6.9%、大於7.0%、或大於7.1%)之第2型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷 酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約5.0%與約9.0%間、約5.5%與約8.5%間、約6.0%與約8.0%、或約6.5%與約7.5%間之第2型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約9.5%與約13%間之第1型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有介於約0.1%與約9.0%間(例如，介於約0.1%與約8.9%間、約0.1%與約8.8%間、約0.1%與約8.7%間、約0.1%與約8.6%間、約0.1%與約8.5%間、約0.1%與約8.4%間、約0.1%與約8.3%間、約0.1%與約8.2%間、約0.1%與約8.1%間、約0.1%與約8.0%間、約0.1%與約7.9%間、約0.1%與約7.8%間、約0.1%與約7.7%間、約0.1%與約7.6%間、約0.1%與約7.5%間、約0.1%與約7.4%間、約0.1%與約7.3%間、約0.1%與約7.2%間、約0.1%與約7.1%間、約0.1%與約7.0%間、約0.1%與約6.9%間、約0.1%與約6.8%間、約0.1%與約6.7%間、約0.1%與約6.6%間、約0.1%與約6.5%間、約0.1%與約6.4%間、約0.1%與約6.3%間、約0.1%與約6.2%間、約0.1%與約6.1%間、約0.1%與約6.0%間、約0.1%與約5.9%間、約0.1%與約5.8%間、約0.1%與約5.7%間、約0.1%與約5.6%間、約0.1%與約5.5%間、約0.1%與約5.4%間、約0.1%與約5.3%間、約0.1%與約5.2%間、約0.1%與約5.1%間、約0.1%與約5.0%間、約0.1%與約4.9%間、約0.1%與約4.8%間、約0.1%與約4.7%間、約0.1%與約4.6%間、約0.1%與約4.5%間、約0.1%與約4.4%間、約0.1%與約4.3%間、約0.1% 與約4.2%間、約0.1%與約4.1%間、約0.1%與約4.0%間、約0.1%與約3.9%間、約0.1%與約3.8%間、約0.1%與約3.7%間、約0.1%與約3.6%間、約0.1%與約3.5%間、約0.1%與約3.4%間、約0.1%與約3.3%間、約0.1%與約3.2%間、約0.1%與約3.1%、或約0.1%與約3.0%間)之第1型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
V.唾液酸/蛋白質之莫耳/莫耳比
本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有約相同或大於Fabrazyme®之唾液酸對蛋白質之莫耳對莫耳比。增加存在寡醣中之唾液酸分子數被認為可增長該蛋白質於活體外及/或活體內(例如，於醫藥組成物中及於哺乳動物之血清中)之半衰期。
Fabrazyme®具有約2.6至約3.3之唾液酸對蛋白質之莫耳對莫耳比。Fabrazyme®亦具有大於1.5之唾液酸對甘露糖-6-磷酸之莫耳對莫耳比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大於3.0(例如，大於3.1、大於3.2、大於3.3、大於3.4、大於3.5、大於3.6、大於3.7、大於3.8、大於3.9、大於4.0、大於4.1、大於4.2、大於4.3、大於4.4、大於4.5、大於4.6、大於4.7、大於4.8、大於4.9、或大於5.0)之唾液酸對蛋白質之莫耳/莫耳比。
用於測定唾液酸對蛋白質之莫耳/莫耳比之例示方法見述 於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
VI.氮連結型電中性寡醣
相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有減少之電中性寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰1)之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約4.0%至約7.1%間之氮連結型電中性寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰1)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有介於約0.1%與約3.9%間(例如，介於約0.1%與約3.8%間、約0.1%與約3.7%間、約0.1%與約3.6%間、約0.1%與約3.5%間、約0.1%與約3.4%間、約0.1%與約3.3%間、約0.1%與約3.2%間、約0.1%與約3.1%間、約0.1%與約3.0%間、約0.1%與約2.9%間、約0.1%與約2.8%間、約0.1%與約2.7%間、約0.1%與約2.6%間、約0.1%與約2.5%間、約0.1%與約2.4%間、約0.1%與約2.3%間、約0.1%與約2.2%間、約0.1%與約2.1%間、約0.1%與約2.0%間、約0.1%與約1.9%間、約0.1%與約1.8%間、約0.1%與約1.7%間、約0.1%與約1.6%間、約0.1%與約1.5%間、約0.1%與約1.4%間、約0.1%與約1.3%間、約0.1%與約1.2%間、約0.1%與約1.1%間、約0.1% and 1.0%間、約0.3%與約3.9%間、約0.3%與約3.8%間、約0.3%與約3.7%間、約0.3%與約3.6%間、約0.3%與約3.5%間、約0.3%與約3.4%間、約0.3%與約3.3%間、約0.3%與約3.2%間、約0.3%與約3.1%間、約0.3%與約3.0%間、約0.3%與約2.9%間、約0.3%與約2.8%間、約0.3%與約2.7%間、約0.3%與約2.6%間、約0.3%與約2.5%間、約0.3%與約2.4% 間、約0.3%與約2.3%間、約0.3%與約2.2%間、約0.3%與約2.1%間、約0.3%與約2.0%間、約0.3%與約1.9%間、約0.3%與約1.8%間、約0.3%與約1.7%間、約0.3%與約1.6%間、約0.3%與約1.5%間、約0.3%與約1.4%間、約0.3%與約1.3%間、約0.3%與約1.2%間、約0.3%與約1.1%、或約0.3%與約1.0%間)之電中性寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰1)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定電中性寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰1)之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
VII.氮連結型甘露糖-6-磷酸寡醣
相較於Fabrazyme®，所提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有約相同或稍微減少之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約5.5%至約10.0%間之氮連結型甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰7)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約0.1%至約7.0%間(例如，介於約0.1%至約6.9%間、約0.1%至約6.8%間、約0.1%至約6.7%間、約0.1%至約6.6%間、約0.1%至約6.5%間、約0.1%至約6.4%間、約0.1%至約6.3%間、約0.1%至約6.2%間、約0.1%至約6.1%間、約0.1%至約6.0%間、約0.1%至約5.9%間、約0.1%至約5.8%間、約0.1%至約5.7%間、約0.1%至約5.6%間、約0.1%至約5.5%間、約0.1%至約5.4%間、約0.1%至約5.3%間、 約0.1%至約5.2%間、約0.1%至約5.1%、或約0.1%至約5.0%間)之甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰7)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約5.0%與約7.0%間之甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰7)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰7)之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
VIII.氮連結型單磷酸化寡醣
相較於Fabrazyme®，所提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約10.9%至約14.7%間之氮連結型單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰8)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大於約14.8%(例如，大於約14.9%、大於15.0%、大於約15.1%、大於約15.2%、大於約15.3%、大於約15.4%、大於約15.5%、大於約15.6%、大於約15.7%、大於約15.8%、大於約15.9%、大於約16.0%、大於約16.1%、大於約16.2%、大於約16.3%大於約16.4%、大於約16.5%、大於約16.6%、大於約16.7%、大於約16.8%、大於約16.9%、大於約17.0%、大於約17.1%、大於約17.2%、大於約17.3%、大於約17.4%、大於約17.5%、大於約17.6%、大於約17.7%、大於約17.8%、大於約17.9%、大於約18.0%、大於約 18.1%、大於約18.2%、大於約18.3%、大於約18.4%、大於約18.5%、大於約18.6%、大於約18.7%、大於約18.8%、大於約18.9%、大於約19.0%、大於約19.1%、大於約19.2%、大於約19.3%、大於約19.4%、大於約19.5%、大於約19.6%、大於約19.7%、大於約19.8%、大於約19.9%、大於約20.0%、大於約20.1%、大於約20.2%、大於約20.3%、大於約20.4%、大於約20.5%、大於約20.6%、大於約20.7%、大於約20.8%、大於約20.9%、大於約21.0%、大於約21.1%、大於約21.2%、大於約21.3%、大於約21.4%、大於約21.5%、大於約21.6%、大於約21.7%、大於約21.8%、大於約21.9%、大於約22.0%、大於約22.1%、大於約22.2%、大於約22.3%、大於約22.4%、大於約22.5%、大於約22.6%、大於約22.7%、大於約22.8%、大於約22.9%、或大於約23.0%)之單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰8)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約15.5%與約17.5%間、約16.0%與約18.0%、或約16.5%與約18.5%間之單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰8)之總氮連結型寡醣百分比。
用於測定單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰8)之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
IX.氮連結型四唾液酸化寡醣
相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A 蛋白可具有增加之四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比。增加量之四唾液酸化寡醣被認為可增長該蛋白質於活體內及/或活體外(例如，於病患血清或於醫藥組成物中)之半衰期。
Fabrazyme®具有介於約2.3%至約4.8%間之四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大於約4.9%(例如，大於約5.0%、大於約5.1%、大於約5.2%、大於約5.3%、大於約5.4%、大於約5.5%、大於約5.6%、大於約5.7%、大於約5.8%、大於約5.9%、大於約6.0%、大於約6.1%、大於約6.2%、大於約6.3%、大於約6.4%、大於約6.5%、大於約6.6%、大於約6.7%、大於約6.8%、大於約6.9%、大於約7.0%、大於約7.1%、大於約7.2%、大於約7.3%、大於約7.4%、大於約7.5%、大於約7.6%、大於約7.7%、大於約7.8%、大於約7.9%、或大於約8.0%)之四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約6.0%至約8.0%間、約6.5%至約8.5%間、約6.0%與約9.0%間、或約7.0%與約9.0%間之四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比。
用於進行與測定四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
X.單唾液酸化與單磷酸化之氮連結型雜種結構
相較於Fabrazyme®，所提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加之單唾液酸化、單磷酸化、雜種結構之總氮連結型寡醣百分比。
Fabrazyme®具有介於約6.0%至約8.1%間之單唾液酸化、單磷酸化雜種寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰10)之總氮連結型寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有大於約8.2%(例如，大於約8.3%、大於約8.4%、大於約8.5%、大於約8.6%、大於約8.7%、大於約8.8%、大於約8.9%、大於約9.0%、大於約9.1%、大於約9.2%、大於約9.3%、大於約9.4%、大於約9.5%、大於約9.6%、大於約9.7%、大於約9.8%、大於約9.9%、大於約10.0%、大於約10.1%、大於約10.2%、大於約10.3%、大於約10.4%、大於約10.5%、大於約10.6%、大於約10.7%、大於約10.8%、大於約10.9%、大於約11.0%、大於約11.1%、大於約11.2%、大於約11.3%、大於約11.4%、或大於約11.5%)之單唾液酸化、單磷酸化雜種寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰10)之總氮連結型雜種寡醣百分比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有介於約8.5%與10.5%間、約9.0%與約11.0%間、或約8.5%與約9.5%間之單唾液酸化、單磷酸化雜種寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰10)之總氮連結型雜種寡醣百分比。
用於測定單唾液酸化與單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸 標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰10)之總氮連結型寡醣百分比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
XI.等電點
相較於Fabrazyme®，於使用影像毛細管等電聚焦(icIEF)分析時，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白亦具有移位等電點(參見，實例3與表3)。
用於測定多肽等電點之例示方法見述於各實例中，用於測定多肽等電點之更多方法(例如，等電聚焦凝膠)為此項技藝中已知。
XII.甘露糖-6-磷酸/蛋白質之莫耳/莫耳比
本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有約相同或大於Fabrazyme®之甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳對莫耳比。增加甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳對莫耳比，被認為可增加蛋白質被細胞膜中表現甘露糖-6-磷酸受體細胞之細胞攝取。
Fabrazyme®具有約1.7至約3.1之甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳對莫耳比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有實質上與Fabrazyme®相同或大於1.7(例如，大於1.8、大於1.9、大於2.0、大於2.1、大於2.2、大於2.3、大於2.4、大於2.5、大於2.6、大於2.7、大於2.8、大於2.9、大於3.0、大於3.1、大於3.2、大於3.3、大於3.4、或大於3.5)之甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳/莫耳比。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有介於約1.8與約3.5間(例如，介於約1.8至約3.4間、約1.8至約3.3間、約1.8與約3.2間、約1.8與約3.1間、約1.8與約3.0間、約1.8與約2.9間、 約1.8與約2.8間、約1.8與約2.7間、約1.8與約2.6間、約1.8與約2.5間、1.8與約2.4間、約1.8與約2.3間、約1.8與約2.2間、約1.8與約2.1間、約1.8與約2.0間、約1.9與約3.5間、約1.9與約3.4間、約1.9與約3.3間、約1.9與約3.2間、約1.9與約3.1間、約1.9與約3.0間、約1.9與約2.9間、約1.9與約2.8間、約1.9與約2.7間、約1.9與約2.6間、約1.9與約2.5間、約1.9與約2.5間、約1.9與約2.4間、約1.9與約2.3間、約1.9與約2.2間、約1.9與約2.1間、約2.0與約3.5間、約2.0與約3.4間、約2.0與約3.3間、約2.0與約3.2間、約2.0與約3.1間、約2.0與約3.0間、約2.0與約2.9間、約2.0與約2.8間、約2.0與約2.7間、約2.0與約2.6間、約2.0與約2.5間、約2.0與約2.4間、約2.0與約2.3間、約2.0與約2.2間、約2.1與約3.5間、約2.1與約3.4間、約2.1與約3.3間、約2.1與約3.2間、約2.1與約3.1間、約2.1與約3.0間、約2.1與約2.9間、約2.1與約2.8間、約2.1與約2.7間、約2.1與約2.6間、約2.1與約2.5間、約2.1與約2.4間、約2.1與約2.3間、約2.2與約3.5間、約2.2與約3.4間、約2.2與約3.3間、約2.2與約3.2間、約2.2與約3.1間、約2.2與約3.0間、約2.2與約2.9間、約2.2與約2.8間、約2.2與約2.7間、約2.2與約2.6間、約2.2與約2.5間、約2.2與約2.4間、約2.3與約3.5間、約2.3與約3.4間、約2.3與約3.3間、約2.3與約3.2間、約2.3與約3.1間、約2.3與約3.0間、約2.3與約2.9間、約2.3與約2.8間、約2.3與約2.7間、約2.3與約2.6間、約2.3與約2.5間、約2.4與約3.5間、約2.4與約2.9間、約2.4與約2.8間、約2.4與約2.7間、約2.4與約2.6間、約2.5與約3.5間、約2.5與約3.4間、約2.5與約3.3間、約2.5與約3.2間、約2.5與約3.1間、約2.5與約3.0間、約2.5與約 2.9間、約2.5與約2.8間、約2.5與約2.7間、約2.6與約3.5間、約2.6與約3.4間、約2.6與約3.3間、約2.6與約3.2間、約2.6與約3.1間、約2.6與約3.0間、約2.6與約2.9間、約2.6與約2.8間、約2.7與約3.5間、約2.7與約3.4間、約2.7與約3.3間、約2.7與約3.2間、約2.7與約3.1間、約2.7與約3.0間、約2.7與約2.9間、約2.8與約3.5間、約2.8與約3.4間、約2.8與約3.3間、約2.8與約3.2間、約2.8與約3.1間、約2.8與約3.0間、約2.9與約3.5間、約2.9與約3.4間、約2.9與約3.3間、約2.9與約3.2間、約2.9與約3.1間、約3.0與約3.5間、約3.0與約3.4間、約3.0與約3.3間、約3.0與約3.2間、約3.1與約3.5間、約3.1與約3.4間、約3.1與約3.3間、約3.2與約3.5間、約3.4與約3.4、或約3.3與約3.5間)之甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳/莫耳比。
用於測定甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳/莫耳比之例示方法見述於各實例中；更多方法為此項技藝中已知。
功能性性質
本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有一或多個(例如，一個、兩個、或三個)下述功能性特徵：相較於Fabrazyme®，表現甘露糖-6-磷酸受體之哺乳動物細胞之胞吞作用增加(例如，胞吞作用速率增加)；相較於Fabrazyme®，與去唾液酸醣蛋白受體之結合減少；及相較於Fabrazyme®，對甘露糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加。
於表現甘露糖-6-磷酸之哺乳動物細胞中，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白胞吞作用(例如，胞吞作用速率)之測定方法為此項技藝中已知(例如，Osborne et al.,Curr.Protoc.Cell Biol., Chapter 11,Unit 11.18,2005)。表現甘露糖-6-磷酸受體之哺乳動物細胞之非限制性實例包括纖維母細胞與上皮細胞。如此項技藝中已知，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之胞吞作用可可由下述方法予以檢測：利用組織培養培養基(或哺乳動物血清)中之蛋白質量減少；表現甘露糖-6-磷酸受體哺乳動物細胞中溶酶體或細胞內之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白量增加；或間接地，例如，於接觸之(contacted)哺乳動物細胞中或組織培養培養基(或哺乳動物血清)中，具末端α-半乳糖基殘基醣神經鞘脂質(例如球形三己醣苷腦醯胺(GL-3))蓄積減少。舉例而言，組織培養培養基(或哺乳動物血清)中重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白量之減少，可使用抗體分析法(例如，酵素免疫分析法)或活性分析法(例如，使用pNP或4MU作為基質之活性分析法)測定。與重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白結合之抗體實例可得自Millipore,LifeSpan BioSciences,Inc.,Thermo Scientific Pierce Antibodies,Acris Antibodies GmbH,and R & D Systems。用於測定溶酶體或細胞內重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白量之方法可包括，例如，使用免疫螢光顯微鏡、細胞通透化與免疫墨漬法、及/或細胞或溶酶體溶解物之質譜測定法。球形三己醣苷腦醯胺(GL-3)蓄積上之減少可，例如，使用質譜測定法(例如，Kim et al.,Korean J.Intern.Med.25：415-421,2010)或抗體分析法(例如，美國專利申請公告案No.2012/0178105)經時檢測組織培養培養基或哺乳動物血清中之GL-3量予以測定。於各情況下，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之胞吞作用可與Fabrazyme®進行比較。
用於測定蛋白質(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)結合去唾液酸醣蛋白受體能力之方法為此項技藝中已知。舉例而言，測定重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之結合去唾液酸醣蛋白受體之分析，可包括接觸表現去唾液酸醣蛋白細胞(例如，肝細胞)之步驟。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之結合去唾液酸醣蛋白受體亦可使用表面電漿共振(例如，Biacore technology)(參見，例如，Stokmaier et al.,Bioorg.Med.Chem.17：7254-7264,2009)或見述於Kornilova et al.(Anal.Biochem.425：43-46,2012)之螢光偏極化去唾液酸醣蛋白受體結合分析予以測定。於任何情況下，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白與去唾液酸醣蛋白受體之結合可與Fabrazyme®進行比較。
用於測定重組α-半乳糖苷酶-A蛋白與甘露糖-6-磷酸受體結合之方法，可使用包括重組α-半乳糖苷酶-A蛋白與表現甘露糖-6-磷酸受體細胞(例如，纖維母細胞或內皮細胞)接觸步驟之分析法進行。於其他實例中，重組α-半乳糖苷酶-A蛋白與甘露糖-6-磷酸受體之結合，可使用使用表面電漿共振(例如，Biacore technology)或親和力層析法測定。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白與甘露糖-6-磷酸受體之結合可與Fabrazyme®進行比較。
例示之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白
本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有介於約0.1%與約1.6%間(例如，介於約0.1%與約1.3%間或約0.1%與約1.0%間)之單唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰3)之總氮連結型寡醣百分比；大於約7.5%(例如，大於約8.5%、大於約9.0%、或大於約9.5%)之雙甘露糖 -6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可進一步具有大於約13.0%(例如，大於約13.5%、大於約14.0%、大於約14.5%、大於約15.0%、大於約15.5%、或大於約16.0%)之含雙唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰4)之總氮連結型寡醣百分比；及大於約2.0%(例如，大於約2.5%、大於約3.0%、大於約3.5%、大於約4.0%、大於約4.5%、大於約5.0%、大於約5.5%、大於約6.0%、大於約6.5%、或大於約7.0%)之第2型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比。
重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可進一步具有一或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、或九個)下述物理特徵：介於約0.1%與約3.9%間(例如，介於約0.1%與約3.5%間、約0.1%與約3.0%間、約0.1%與約2.5%、或約0.1%與約2.0%間)之電中性寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰1)之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約3.0%間(例如，介於約0.1%與約2.5%、或約0.1%與約2.0%間)之含單唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰2)之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約5.3%間(例如，介於約0.1%與約5.0%間、約0.1%與約4.5%間、約0.1%與約4.0%間、約0.1%與約3.5%間、約0.1%與約3.0%、或約0.1%與約2.5%間)之雙唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰5)之總氮連結型寡醣 百分比；介於約0.1%與約9.0%間(例如，介於約0.1%與約8.5%間、約0.1%與約8.0%間、約0.1%與約7.5%間、約0.1%與約7.0%間、約0.1%與約6.5%間、約0.1%與約6.0%間、約0.1%與約5.5%間、約0.1%與約5.0%間、約0.1%與約4.5%間、約0.1%與約4.0%間、約0.1%與約3.5%間、約0.1%與約3.0%間、約0.1%與約2.5%、或約0.1%與約2.0%間)之第1型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6)之總氮連結型寡醣百分比；介於約0.1%與約7.0%間(例如，介於約0.1%與約6.5%間、約0.1%與約6.0%間、約0.1%與約5.5%間、約0.1%與約5.0%間、約0.1%與約4.5%、或約0.1%與約4.0%間)之甘露糖-6-磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰7)之總氮連結型寡醣百分比；大於約14.8%(例如，大於約15.0%、大於約15.5%、大於約16.0%、大於約16.5%、大於約17.0%、大於約17.5%、大於約18.0%、大於約18.5%、大於約19.0%、大於約19.5%、大於約20.0%、大於約20.5%、大於約21.0%、大於約21.5%、大於約22.0%、大於約22.5%、或大於約23.0%)之單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰8)之總氮連結型寡醣百分比；大於約4.9%(例如，大於約5.0%、大於約5.5%、大於約6.0%、大於約6.5%、大於約7.0%、大於約7.5%、或大於約8.0%)之四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比；及大於約8.2%(例如，大於約8.5%、大於約9.0%、大於約9.5%、或大於約10.0%)之單唾液酸化、單磷酸化雜種寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡 醣圖譜中之波峰10)之總氮連結型寡醣百分比。
重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白亦可具有一或多個下述功能性特徵：相較於Fabrazyme®，表現甘露糖-6-磷酸受體之哺乳動物細胞之胞吞作用增加(例如，胞吞作用速率增加)、與去唾液酸醣蛋白受體之結合減少、及對甘露糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加。
於其他實例中，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白具有小於Fabrazyme®之單唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰3)之總氮連結型寡醣百分比；及大於Fabrazyme®之雙甘露糖-6-磷酸寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白亦可具有約相同或大於Fabrazyme®之含雙唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰4)之總氮連結型寡醣百分比；及大於Fabrazyme®之第2型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比。
重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白亦可具有一或多個下述結構特徵：小於Fabrazyme®之電中性寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰1)之總氮連結型寡醣百分比；約相同或小於Fabrazyme®之含單唾液酸化海藻糖寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰2)之總氮連結型寡醣百分比；小於Fabrazyme®之雙唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰5)之總氮連結 型寡醣百分比；小於Fabrazyme®之第1型三觸角、三唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰6)之總氮連結型寡醣百分比；約相同或小於Fabrazyme®之甘露糖-6-磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰7)之總氮連結型寡醣百分比；大於Fabrazyme®之單磷酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰8)之總氮連結型寡醣百分比；大於Fabrazyme®之四唾液酸化寡醣(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰9)之總氮連結型寡醣百分比；及大於Fabrazyme®之單唾液酸化、單磷酸化雜種結構(例如，鄰胺苯甲酸標識之氮連結型寡醣圖譜中之波峰10)之總氮連結型寡醣百分比。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白亦可具有一或多個下述功能性特徵：相較於Fabrazyme®，表現甘露糖-6-磷酸受體之哺乳動物細胞之胞吞作用增加(例如，胞吞作用速率增加)、與去唾液酸醣蛋白受體之結合減少、及對甘露糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加。
表現載體
本文亦提供包含本發明重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)之表現載體。舉例而言，該表現載體可包含與SEQ ID NO：1至少90%完全相同(例如，至少90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%完全相同)之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)。除該序列外，該表現載體可包含可操作地連接於該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)5’端之啟動子(及視需要之一或多個增強子序列)。該表現載體可包含可操作地連接於該重組蛋白編碼 序列(例如，cDNA)5’端之具TTG起始密碼子之人類CD52蛋白質胜肽編碼序列，及可操作地連接於該重組蛋白編碼序列(例如，cDNA)3’端之多(A)辨識部位編碼序列。該表現載體可包含哺乳動物篩選標誌(marker)(例如，人類或狗合成酶蛋白質)之編碼序列(例如，cDNA)及可操作地連接於該哺乳動物篩選標誌編碼序列(例如，cDNA)5’端之啟動子序列；及視需要之SV40早期內含子序列與多(A)訊息序列，二者均可操作地連接於該哺乳動物篩選基因編碼序列(例如，cDNA)3’端。表現載體可包含一或多個(例如，兩個或三個)可操作地連接於該原核生物篩選基因(例如，抗安比西林基因)編碼序列5’端之原核生物啟動子序列、原核生物複製起始點序列、與真核生物複製起始點序列。
可操作地連接於該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)之啟動子序列(及視需要之一或多個增強子序列)之非限制性實例包括：猿猴病毒40型(SV40)早期啟動子、核糖體蛋白質21(rpS21)啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子、細胞巨大病毒(CMV)啟動子(例如，CMV瞬時早期啟動子(參見，例如，Teschendorf et al.,AnticancerRes.22：3325-3330,2002))、泛蛋白C(UBC)啟動子、延長因子1-α(EF1A)啟動子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)啟動子、小鼠CMV之IE2啟動子/增強子區(參見，例如，Chatellard et al.,Biotechnol.Bioeng.96：106-117,2007)、與雞β-肌動蛋白啟動子。可用於本文所述任何表現載體之人類基因啟動子之更多非限制性實例見述於哺乳動物啟動子資料庫(Wistar Institute website at mrpombdb.wister.upenn.edu)中。可用於表現載體之哺乳動物啟動子序列之更多實例為此項技藝中已知。可用於表現質體之啟動子與增強子之一非限制性實例為具CMV增強子之雞β-肌動蛋白啟動子(於此項技藝中所謂CAGG啟動子)。本文提供之表現載體可包括可操作地連接於人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)5’端之rpS21啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子、或SV40早期啟動子序列；可操作地連接於人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼核酸(例如，cDNA)5’端之具TTG起始密碼子之人類CD52蛋白質胜肽編碼序列(例如，本文所述之任何人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼核酸)；及含有可操作地連接於人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼核酸序列3’端之多(A)辨識部位之序列。
多(A)辨識部位序列之非限制性實例為牛生長激素多(A)辨識部位。人類多(A)辨識部位之結構特徵見述於Nunes et al.,EMBO J.29：1523-1536,2010中；更多之多(A)辨識部位為此項技藝中悉知。
於若干實例中，表現載體包含倉鼠β-肌動蛋白啟動子與具TTG起始密碼子之人類CD52胜肽編碼序列，二者均可操作地連接於重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)5’端；及可操作地連接於重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列(例如，cDNA)3’端之SV40早期內含子與多(A)辨識序列。
若干表現載體可包含哺乳動物篩選基因編碼序列。哺乳動物篩選基因之非限制性實例包括：二氫葉酸還原酶基因、抗潮黴素基因、抗新黴素基因、抗殺稻瘟菌素基因、抗吉歐黴素 (zeocin)基因、麩胺醯胺合成酶基因、抗二氫葉酸基因、與次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因。此等哺乳動物篩選基因編碼序列之實例為此項技藝中已知。該哺乳動物篩選基因編碼序列之5’端可操作地連接於啟動子(例如，本文所述或此項技藝中已知之任何例示之啟動子)。
若干表現載體(例如，本文所述之任何表現載體)可包含哺乳動物之複製起始點序列及/或原核生物之複製起始點序列。哺乳動物之複製起始點序列為此項技藝中已知(例如，Todorovic et al.,Front.Biosci.4：D859-D568,1999；Aladjem,Front.Biosci.9：2540-2547,2004；Hamlin,Bioessays 14：651-659,1992)，原核生物之複製起始點序列亦為此項技藝中已知(例如，Marczynski et al.,Curr.Opin.Genet.Dev.3：775-782,1993)。
載體之非限制性實例為質體。本文所提供質體之非限制性實例示於圖3與4。圖3描繪下述元件之編碼質體：重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之編碼核酸(例如，cDNA)、連接於人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼核酸5’端之啟動子(例如，倉鼠β-肌動蛋白啟動子)、可操作地連接於重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列5’端之具TTG起始密碼子之人類CD52胜肽編碼序列、可操作地連接於二次(the second)編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白3’端之多(A)辨識序列(例如，SV40早期多(A)辨識序列)、哺乳動物篩選基因(標誌)(例如，二氫葉酸還原酶基因或人類或狗麩胺醯胺合成酶基因)之編碼核酸序列、及可操作地連接於哺乳動物篩選基因(標誌)編碼核酸序列5’端之啟動子序列(例 如，SV40早期啟動子)。圖4描繪一種表現質體，其包含：重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之編碼序列、可操作地連接於該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列5’端之啟動子序列(例如，CMV啟動子與內含子)、可操作地連接於該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列3’端之多(A)辨識序列(例如，SV40早期多(A)辨識序列)、哺乳動物篩選基因(標誌)(例如，麩胺醯胺合成酶)之編碼序列、可操作地連接於該哺乳動物篩選基因(標誌)編碼序列5’端之啟動子序列(例如，SV40啟動子)、原核生物之複製起始點序列、原核生物篩選基因(標誌)(例如，抗安比西林基因)之編碼序列、可操作地連接於該原核生物篩選基因(標誌)5’端之原核生物啟動子序列、及真核生物之複製起始點序列。
表現載體可為病毒載體。病毒載體之非限制性實例包括腺病毒載體、疱疹病毒載體、桿狀病毒載體、與逆轉錄病毒載體。表現載體亦可為質體或黏接質體。
宿主細胞
本文亦提供包含本文所述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列之宿主細胞。該序列可操作地連接於啟動子序列(例如，本文所述之任何例示啟動子序列或此項技藝中已知之任何病毒或哺乳動物之啟動子序列)。舉例而言，該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列與可操作地連接於該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列5’端之啟動子序列之序列可整合入宿主細胞之染色體中。於其他實例中，該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列與可操作地連接於重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白編碼序列5’端之啟動子序列，係存在宿主細胞內之表 現載體(例如，本文所述之任何表現載體)中。
用於引入核酸(例如，本文所述之任何核酸或表現載體)至細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中之方法為此項技藝中已知。舉例而言，可使用脂質體轉染、電穿孔、磷酸鈣傳介之轉染、病毒(例如，逆轉錄病毒)轉導、DEAE-葡聚糖傳介之細胞轉染、樹枝狀聚合物傳介之轉染、超音波穿孔、光學轉染、穿刺轉染、流體動力遞送、磁性轉染、或彈道轉染，將核酸引入細胞中。
宿主細胞可為任何類型之哺乳動物細胞。舉例而言，宿主細胞可為細胞株，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如，CHO DG44細胞、CHO-K1細胞、C02.31選殖細胞、A14.13選殖細胞、C02.57選殖細胞、與F05.43選殖細胞)、Sp2.0骨髓癌細胞(例如，NS/0)、B細胞、融合瘤細胞、T細胞、人類胎腎(HEK)細胞(例如，HEK 293E與HEK 293F)、非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)細胞、或馬丁達比(Madin-Darby)犬(克卡犬)腎上皮細胞(MDCK)細胞。可使用本文所述方法培養之更多哺乳動物細胞為此項技藝中已知。宿主細胞可為，例如，上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、腎細胞、肺細胞、T細胞、骨髓癌細胞、或B細胞。若干宿主細胞可於懸浮細胞培養或黏附細胞培養中生長。
產生哺乳動物細胞株之方法
本文亦提供產生有用於重組表現醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、表1所列舉之任何其他酵素、或此項技藝中已知之任何其他醣蛋白)之哺乳動物細胞株之方法。圖5係顯示可用於產生可最適化以表現重組醣蛋白之親源細胞株之步 驟流程圖。此等方法可包括提供血清依賴性不朽細胞株及循序培養該哺乳動物細胞株於：(1)包含最初濃度(1X)動物血清之細胞培養基約5天至約30天(例如，約5天至約25天、約5天至約20天、約5天至約15天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、或約5天至約7天)；(2)於包含約0.2X至約0.4X(例如，約0.2X至約0.3X)濃度動物血清之細胞培養基約5天至約30天(例如，約5天至約25天、約5天至約20天、約5天至約15天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、或約5天至約7天)；及(3)於包含約0.01X至約0.25X(例如，約0.01X至約0.20X、約0.01X至約0.15X、或約0.01X至約0.08X)動物血清之細胞培養基約5天至約30天(例如，約5天至約25天、約5天至約20天、約5天至約15天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、或約5天至約7天)；從循序培養後之培養物中產生單一細胞次選殖培養，並挑選具有可接受之轉染效率、細胞可於無血清培養基中生長與表現重組蛋白之次選殖株，然後於無蛋白質、無血清、化學成分確定之培養基中培養所挑選之次選殖株約5天至約30天(例如，約5天至約25天、約5天至約20天、約5天至約15天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、或約5天至約7天)；從於無蛋白質、無血清、化學成分確定培養基中培養後之培養物中產生單一細胞次選殖培養株，並挑選具有可接受之轉染效率、最高細胞密度、生長性質、容積生產力率(VPR)、與醣蛋白之醣基化譜之次選殖 株，其中該挑選之次選殖株係用於醣蛋白之重組表現。
本文亦提供產生用於重組表現醣蛋白(例如，本文所述或此項技藝中已知之任何重組蛋白)之哺乳動物細胞株之方法，其包括：(a)提供血清依賴性不朽細胞株及循序培養該哺乳動物細胞株：(1)於包含最初濃度(1X)(例如，約5%)動物血清(例如，胎牛血清)之細胞培養基約1天至約30天(例如，約2天至約25天、約2天至約20天、約2天至約15天、約2天至約12天、約2天至約11天、約2天至約10天、約2天至約9天、約2天至約8天、或約2天至約7天)，(2)於包含約0.2X至約0.6X(例如，約0.2X至約0.5X)濃度動物血清(例如，胎牛血清)之細胞培養基約1天至約30天(例如，約2天至約25天、約2天至約20天、約2天至約15天、約2天至約12天、約2天至約11天、約2天至約10天、約2天至約9天、約2天至約8天、或約2天至約7天)，及(3)於包含約0X至約0.20X(例如，約0X至約0.15X、約0X至約0.10X、或約0X至約0.05X)動物血清(例如，胎牛血清)之細胞培養基約5天至約30天(例如，約5天至約25天、約5天至約20天、約5天至約15天、約5天至約12天、約5天至約11天、約5天至約10天、約5天至約9天、約5天至約8天、或約5天至約7天)；(b)從循序培養後之培養物中產生單一細胞次選殖培養株，並挑選具有可接受之轉染效率、細胞可於無血清培養基中生長與表現重組蛋白之次選殖株(例如，挑選相較於其他經測試之次選殖培養株物，具有最佳轉染效率、細胞生長、與重組蛋白表現之次選殖培養株)；(c)從(b)所挑選之次選殖培養株中產生單一細胞次選殖培養株；及(d)於(c)中挑選具有可接受之轉染效率、最高細胞密度(例如， 於無血清培養基中具最高細胞密度)、生長性質(例如，於無血清培養基中生長)、容積生產力率(VPR)、與重組蛋白表現之單一細胞次選殖，其中該(d)挑選之次選殖係有用於醣蛋白之重組表現(例如，相較於其他經測試之次選殖培養株，具有最佳轉染效率、最高細胞密度、生長性質、VPR、與重組蛋白表現之次選殖培養株)。
本文亦提供利用本文所述任何方法生產之哺乳動物細胞或哺乳動物細胞株。可用於本文所述任何方法之血清依賴性不朽細胞株之非限制性實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓癌細胞、B細胞、融合瘤細胞、T細胞、人類胎腎(HEK)細胞、非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)細胞、與馬丁達比犬(克卡犬)腎上皮細胞(MDCK)細胞。可用於本文所述任何方法之其他血清依賴性不朽細胞株為此項技藝中已知。舉例而言，該血清依賴性不朽細胞株可為上皮細胞株、內皮細胞株、淋巴細胞細胞株、腎細胞株、肺細胞株、T細胞株、骨髓癌細胞株、或B細胞株。於若干實例中，該血清依賴性不朽細胞株可懸浮生長。於其他實例中，該血清依賴性不朽細胞株係於黏附細胞培養中生長。
於若干實例中，血清依賴性不朽細胞株不內源表現二氫葉酸還原酶。所挑選之次選殖株(於方法中挑選之第一或第二選殖株)可懸浮生長。
用於培養不朽哺乳動物細胞株之方法為此項技藝中已知。用於測定轉染效率、於無血清培養基中之細胞生長、重組蛋白表現、最高細胞密度(例如，最高活細胞密度)、細胞生長性質、容積生產力率、與所生產重組蛋白之醣基化譜之方法為 此項技藝中悉知。舉例而言，轉染效率可利用檢測轉染至細胞之表現質體中報導基因之表現量測定(例如，此類報導基因之表現可使用螢光流式細胞分選檢測)。重組蛋白表現可，例如，經由使用特異性結合於重組蛋白之抗體檢測存在組織培養培養基中或細胞內之重組蛋白量予以測定。重組蛋白表現可為，例如，抗體或酵素(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或於圖1中列舉之任何酵素)之一或二者。最高細胞密度與細胞生長可，例如，利用經時測量細胞培養中之細胞密度(例如，活細胞密度)予以評估(例如，使用血球計或其他市售可得之自動化細胞計數器)。細胞之容積生產力率可使用此項技藝中已知之方法，利用經時評估存在細胞培養基中或細胞內之重組蛋白量予以測定。細胞所生產重組醣蛋白之醣基化譜可，例如，使用本說明書實施例中敘述之任何方法(例如，2-胺基苯甲酸(AA)-衍生化法與使用雷射誘發螢光檢測之毛細管電泳法)予以測定。
如此項技藝中所悉知，利用本文所述方法生產之哺乳動物細胞株可貯存於低溫度(例如，-20℃以下、-30℃以下、-40℃以下、-50℃以下、-60℃以下、-70℃以下、或-80℃以下)以供將來使用。用於製備哺乳動物細胞株儲備株以供低溫貯存之方法已見述於，例如，Hewitt,Methods Mol.Biol.640：83-105,2010及Phelan,Curr.Protoc.Hum.Genet.Apendix 3：3G,2006)。於若干實例中，利用本文所述方法生產之哺乳動物細胞株不暴露於含血清及/或含血清之培養基(例如，貯藏前及/或貯藏後)。於若干實例中，利用本文所述方法生產之哺乳動物細胞株僅培養 於無動物衍生成分(ADC)之培養基中。於若干實例中，利用本文所述方法生產之哺乳動物細胞株僅培養於無血清、無蛋白質、化學成分確定之生長培養基中。
生產重組醣蛋白之方法
本文亦提供生產重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、圖1所列舉之任何酵素、或此項技藝中已知之任何重組醣蛋白)之方法。此等方法包括提供利用本文所述任何方法生產之哺乳動物細胞，引入包含醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、圖1所述任何酵素、及此項技藝中已知之任何其他醣蛋白)編碼序列之核酸(例如，表現載體)至該細胞中，在足以生產該醣蛋白之條件下，於無血清生長培養基中培養該細胞、及從該細胞或生長培養基獲得該醣蛋白。亦提供利用本文所述任何方法生產之重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)。
在某些情形下，包含醣蛋白編碼序列之核酸係表現載體(例如，本文所述之任何表現載體)。於其他實例中，包含醣蛋白編碼序列之核酸係整合入哺乳動物細胞之染色體中。
於若干實例中，培養係使用懸浮細胞培養進行。於其他實例中，培養係使用具有容許哺乳動物細胞連結與生長之表面之多元微載體進行。該多元微載體可具有，例如，介於約20微米至約1毫米間(例如，介於約20微米與約250微米間、約100微米至約250微米間、約150微米至約250微米間、約250微米與500微米間、約200微米至約300微米間、約750微米與1毫米間、約200微米至約800微米間、約200微米與約500微米間、或約500 微米與約800微米間)之平均直徑，其中該微載體具有准許或促進哺乳動物細胞(例如，本文所述或此項技藝中已知之任何哺乳動物細胞)連結之表面。於若干實例中，微載體可包含一或多個細孔(例如，平均直徑為約10微米至約100微米之一或多個細孔)。在某些情形下，該微載體之表面及/或多元微載體中一或多個細孔之表面係塗覆促進哺乳動物細胞連結於微載體之製劑(例如，連結於微載體之外部表面及/或微載體中細孔表面)。微載體可為近似球形或橢圓形。於若干具體實例中，微載體具有帶正電荷之外部表面及/或微載體細孔表面(例如，由於N,N-二乙胺乙基存在而帶正電荷)。可於本文所述任何方法中使用之非限制性例示微載體包括CytoPoreTM 1與CytoPoreTM 2(可購自GE Healthcare，Life Sciences，Piscataway，New Jersey)。可用於培養之微載體之更多實例可公開取得及為此項技藝中已知。
於若干實例中，培養係使用生物反應器進行。該生物反應器之容量可為，例如，介於約1公升至約10,000公升間(例如，介於約1公升至約50公升間、約50公升至約500公升間、約500公升至約1000公升間、500公升至約5000公升間、約500公升至約10,000公升間、約5000公升至約10,000公升間、約1公升與約10,000公升間、約1公升與約8,000公升間、約1公升與約6,000公升間、約1公升與約5,000公升間、約100公升與約5,000公升間、約10公升與約100公升間、約10公升與約4,000公升間、約10公升與約3,000公升間、約10公升與約2,000公升間、或約10公升與約1,000公升間)。存在生物反應器中之液態培養基量可 為，例如，介於約0.5公升至約5,000公升間(例如，介於約0.5公升至約25公升間、約25公升至約250公升間、約250公升至約500公升間、250公升至約2500公升間、約250公升至約5,000公升間、約2500公升至約5,000公升間、約0.5公升與約5,000公升間、約0.5公升與約4,000公升間、約0.5公升與約3,000公升間、約0.5公升與約2,500公升間、約50公升與約2,500公升間、約5公升與約50公升間、約5公升與約2,000公升間、約5公升與約1,500公升間、約5公升與約1,000公升間、或約5公升與約500公升間)。培養細胞可，例如，使用饋料批次式生物反應器或灌流式生物反應器進行。培養可利用饋料批次培養或灌流培養(例如，於生物反應器中)進行。
本文所述任何生物反應器之內表面可具有至少一個塗層(例如，明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥胺酸、聚苯乙烯、與層連結蛋白(laminin)之至少一個塗層)，與如此項技藝中已知之用於噴O2、CO2、與N2入液態培養基中之一或多個通口，及用於攪動液態培養基之攪拌機制。生物反應器可於可調控濕潤氛圍下(例如，於濕度大於20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或濕度100%下)培育細胞培養。生物反應器亦可配備能從生物反應器移出大量液態培養基之機械裝置及視需要地，於機械裝置內配備過濾器，以於自生物反應器移出液態培養基過程期間，從液態培養基中移除細胞(例如，交互切向流(ATF)或切向流過濾(TFF)系統)。培養可包括使生物反應器中之液態培養基暴露於包含最多或約15% CO2(例如，最多或約14% CO2、12% CO2、10% CO2、8% CO2、6% CO2、5% CO2、4% CO2、3% CO2、2% CO2、或最多或約1% CO2)之氛圍中。
培養可於溫度約31℃至約40℃進行。熟習之從業人員應理解的是，於培養期間，溫度可於特定時間點改變，例如，以小時或日計。舉例而言，溫度可於以哺乳動物細胞初始接種於生物反應器後約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、或約20天以上，改變或移動(例如，增加或減少)。舉例而言，溫度可上移(例如，多達或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20℃之變化)。舉例而言，溫度可下移(例如，大於0.05℃或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20℃之變化)。
培養可使用無蛋白質、無血清、化學成分確定之培養基進行。此類培養基之非限制性實例係此項技藝中已知及為市售可得。有用之培養基之非限制性實例包括，例如，CD CHO、Opti CHO、與Forti CHO(全可購自Life Technologies，Grand Island，NY)，Hycell CHO培養基(Thermo Fisher Scientific,Inc.，Waltham，MA)，Ex-cell CD CHO Fusion培養基(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)，及PowerCHO培養基(Lonza Group,Ltd.，Basel，Switzerland)。
哺乳動物細胞可為本文所述之任何哺乳動物細胞。舉例而言，哺乳動物細胞可為CHO細胞。哺乳動物細胞可為不內源表現二氫葉酸還原酶之細胞(例如，不內源表現二氫葉酸還原酶之CHO細胞)。
重組醣蛋白可為酵素(例如，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、圖1中列舉之任何蛋白質、或此項技藝中已知之任何其他醣蛋白)或抗體或其抗原結合片段。於若干實例中，核酸(例如，表現載體)包含與SEQ ID NO：1至少90%(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%)完全相同之序列。核酸(例如，表現載體)可包含可操作地連接於醣蛋白編碼核酸5’端之啟動子序列、可操作地連接於醣蛋白編碼核酸5’端之具TTG起始密碼子之人類CD52蛋白胜肽編碼序列、及可操作地連接於醣蛋白編碼核酸3’端之多(A)辨識部位編碼序列。舉例而言，啟動子序列可選自包括：倉鼠rpS21啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子、與SV40早期啟動子之組群。編碼多(A)辨識部位之序列可為SV40之早期多(A)辨識序列。於若干實例中，啟動子序列可為倉鼠之β-肌動蛋白啟動子及多(A)辨識序列係為SV40之早期多(A)辨識序列。於若干實例中，核酸進一步包含人類或狗麩胺醯胺合成酶之編碼序列(例如，其中該人類或狗麩胺醯胺合成酶編碼核酸之5’端可操作地連接於SV40早期啟動子，及該人類或狗麩胺醯胺合成酶編碼核酸之3’端可操作地連接於SV40早期內含子與多(A)訊息序列)。於若干實例中，核酸進一步包含二氫葉酸還原酶(DHFR)(例如，人類或小鼠DHFR)之編碼序列(例如，其中該二氫葉酸還原酶編碼核酸 之5’端可操作地連接於SV40早期啟動子，及該二氫葉酸還原酶編碼核酸之3’端可操作地連接於SV40早期內含子與多(A)訊息序列)。
培養可使用灌流式生物反應器進行。灌流培養為此項技藝中悉知，包括從生物反應器移出第一容量之第一液態培養基(例如，其包含任何濃度之哺乳動物細胞；例如，第一容量之第一液態培養基為實質上不含細胞)，及添加第二容量之第二液態培養基至第一液態培養基。移出與添加可同時或循序或二者組合進行。再者，移出與添加可連續性(例如，於任何特定時段(time period)期間(例如，於24小時期間、約1小時至約24小時之遞增時段期間、或大於24小時之遞增時段期間)，以移出及替換生物反應器容量或第一液態培養基容量之介於0.1%至800%間容量(例如，介於1%與700%間、1%與600%間、1%與500%間、1%與400%間、1%與350%間、1%與300%間、1%與250%間、1%與100%間、100%與200%間、5%與150%間、10%與50%間、15%與40%間、8%與80%間、及4%與30%)之速率)或週期性(例如，每三天一次、每兩天一次、每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次、或每天五次)或其任何組合進行。於週期性進行時(例如，於約24小時期間內、約1小時至約24小時之遞增時段期間內、或大於24小時之遞增時段期間內)，移出或替換之容量可為，例如，生物反應器容量或第一液態培養基容量之介於0.1%至800%間(例如，介於1%與700%間、1%與600%間、1%與500%間、1%與400%間、1%與300%間、1%與200%間、1%與100%間、100%與200%間、5%與150%間、10% 與50%間、15%與40%間、8%與80%間、及4%與30%間)。在某些情形下，所移出第一容量之第一液態培養基與所添加第二容量之第二液態培養基，於整個或部分培養期間之各個24小時期間(或替代地，約1小時至約24小時之遞增時段期間或大於24小時之遞增時段期間)可保持大約相同。如此項技藝中已知，第一液態培養基第一容量之移出速率(容量/單位時間)與第二液態培養基第二容量之添加速率(容量/單位時間)可以不同。第一液態培養基第一容量之移出速率(容量/單位時間)與第二液態培養基第二容量之添加速率(容量/單位時間)可約相同或可不同。
替代地，於培養期間之各個24小時期段(或替代地，介於1小時與約24小時間之遞增時段期間或大於24小時之遞增時段期間)，移出與添加之容量可變化(例如，逐漸增加)。舉例而言，於培養期間之各個24小時期間(或替代地，介於約1小時與約24小時間之遞增時段期間或大於24小時之遞增時段期間)內，所移出第一液態培養基之容量與所添加第二液態培養基之容量，可於培養期間從介於0.5%至約20%間之生物反應器容量或第一液態培養基容量增加(例如，逐漸或經由交錯遞增)至約25%至約150%間之生物反應器容量或第一液態培養基容量。
熟習之從業人員應理解的是，第一液態培養基與第二液態培養基可為相同類型之培養基(例如，無血清、無蛋白質、化學成分確定之培養基)。於其他實例中，第一液態培養基與第二液態培養基可不同。
第一容量之第一液態培養基，例如，可使用機械系統及/ 或利用該容量經由具有排除存在該容量中之哺乳動物細胞截留分子量之無菌膜之滲出或重力流被移出。
第二容量之第二液態培養基可以自動化方式，例如，利用灌流式幫浦，添加至第一液態培養基。在某些情形下，移出第一容量之第一液態培養基(例如，實質上無哺乳動物細胞之第一液態培養基第一容量)及添加第二容量之第二液態培養基至第一液態培養基，於生物反應器接種哺乳動物細胞至少1小時內(例如，2小時內、3小時內、4小時內、5小時內、6小時內、7小時內、8小時內、9小時內、10小時內、12小時內、14小時內、16小時內、18小時內、24小時內、36小時內、48小時內、72小時內、96小時內、或96小時後)不會發生。
替代地或此外，可使用饋料批次式生物反應器進行培養。此類培養為此項技藝中已知，包括於大部分培養期間，添加(例如，週期性或連續性添加)第二容量之第二液態培養基至第一液態培養基。第二液態培養基之添加可連續性(例如，於任何特定時段期間(例如，於24小時期間、約1小時至約24小時之遞增時段期間、或大於24小時之遞增時段期間)，以添加生物反應器容量或第一液態培養基容量之介於0.1%至300%間容量(例如，介於1%與250%間、1%與100%間、100%與200%間、5%與150%間、10%與50%間、15%與40%間、8%與80%間、及介於4%與30%)之速率)或週期性(例如，每三天一次、每兩天一次、每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次、或每天五次)，或其任何組合進行。於週期性進行時(例如，於約24小時期間內、約1小時至約24小時之遞增時段期間內、或大於24小時之 遞增時段期間內)，添加之容量可為，例如，生物反應器容量或第一液態培養基容量之介於0.1%至300%間(例如，介於1%與200%間、1%與100%間、100%與200%間、5%與150%間、10%與50%間、15%與40%間、8%與80%間、及介於4%與30%)。在某些情形下，所添加第二容量之第二液態培養基，於整個或部分培養期間之各個24小時期間(或替代地，約1小時至約24小時之遞增時段期間或大於24小時之遞增時段期間)可保持大約相同。如此項技藝中已知，第二液態培養基第二容量之添加速率(容量/單位時間)於整個或部分培養期間可以不同。舉例而言，於培養期間之各個24小時期段(或替代地，介於1小時與約24小時間之遞增時段期間或大於24小時之遞增時段期間)，所添加之第二液態培養基容量可變化(例如，逐漸增加)。舉例而言，於培養期間之各個24小時期間(或替代地，介於約1小時與約24小時間之遞增時段期間或大於24小時之遞增時段期間)內，所添加第二液態培養基之容量，可於培養期間從介於0.5%至約20%間之生物反應器容量或第一液態培養基容量增加(例如，逐漸或經由交錯遞增)至約25%至約150%間之生物反應器容量或第一液態培養基容量。於整個或部分培養期間，第二液態培養基第二容量之添加速率(容量/單位時間)可約相同。
熟習之從業人員應理解的是，第一液態培養基與第二液態培養基可為相同類型之培養基(例如，無蛋白質培養基或無血清、無蛋白質、化學成分確定之培養基)。於其他情形下，第一液態培養基與第二液態培養基可為不同類型。第二液態培養基之容量可以自動化方式，例如，利用灌流式幫浦，添加於第 一液態培養基。
在某些情形下，添加第二容量之第二液態培養基於第一液態培養基，係於直到生物反應器接種哺乳動物細胞後至少1小時，惟不超過7天(例如，直到生物反應器接種哺乳動物細胞後至少2小時、3小時內、4小時內、5小時內、6小時內、7小時內、8小時內、9小時內、10小時內、12小時內、14小時內、16小時內、18小時內、24小時內、36小時內、48小時內、72小時內、96小時內、或96小時，惟不超過7天)才發生。饋料批次培養之細胞培養基通常在培養期結束時收獲，然而，饋料批次培養之細胞培養基亦可於培養期間之一或多個時間點時收獲。
熟習之從業人員應理解的是，本文詳述之用於培養之任何各種參數(例如，生物反應器、容量、替換培養容量之速率或頻率、攪拌、溫度、培養基、及/或CO2濃度)可於進行該等方法過程中，以任何組合使用。
有更多單離重組醣蛋白之步驟可進行。如此項技藝中悉知，此類方法根據醣蛋白之物理性質與活性而不同。舉例而言，於設計單離重組醣蛋白(例如，從培養基或從細胞)之步驟時，必須考慮例如醣蛋白之結合特異性(例如，基質或抗原結合活性)、淨電荷、及/或大小等參數。一或多個下述任何方法可用於單離重組醣蛋白(例如，使用本文所述任何方法生產之重組醣蛋白)：親和管柱層析法、離子(例如，陽離子或陰離子)交換管柱層析法、粒徑排阻管柱層析法、逆相管柱層析法、過濾、與沈澱法。單離重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之非限制性方法見述於實例施例中。
於若干實例中，從液態培養基單離重組醣蛋白，可使用整合、連續程序(例如，包括使用至少兩種多管柱層析系統(MCCS)之程序)進行。用於單離重組醣蛋白之整合、連續程序之非限制性實例見述於美國臨時專利申請案Nos.61/775,060與61/856,390、及WO 14/137903中。用於從液態培養基單離本文提供之rhAGA之整合與連續程序之非限制性實例敘述於下文。
本文所述之方法可進一步包括調配單離之重組醣蛋白成為醫藥上可接受之賦形劑或緩衝(例如，供投予病患用)。此等方法可進一步包括無菌過濾、病毒不活化、UV照射、及/或冷凍乾燥、或其任何組合。
用於單離rhAGA蛋白之整合與連續程序
本文提供之rhAGA可使用整合與連續程序單離。使用整合與連續程序單離重組蛋白之方法及關於此類程序步驟之細節為此項技藝中已知。參見WO 14/137903與美國專利申請公開案No.2014/0225994。此外，WO 14/137903亦敘述可用以進行此等整合與連續程序之系統與設備。
舉例而言，用於單離本文提供之rhAGA蛋白之整合與連續程序可包括：(a)提供包括實質上不含細胞之本文提供之rhAGA蛋白之液態培養基，其中係將液態培養基饋入第一個多層析系統(MCCS1)中；(b)使用該MCCS1捕獲液態培養基中本文提供之rhAGA蛋白，其中係將含本文提供之rhAGA蛋白之MCCS1溶洗液持續饋入第二個多管柱層析系統(MCCS2)中；及(c)使用該MCCS2純化與精煉本文提供之rhAGA蛋白，其中得自MCCS2之溶洗液為本文提供之單離rhAGA蛋白或為rhAGA蛋 白藥物物質，及從該液態培養基至得自MCCS2之為本文提供之單離rhAGA蛋白或為rhAGA蛋白藥物物質之溶洗液之程序被整合且持續運行。
MCCS1及/或MCCS2可，例如，進行至少兩個單元操作。於若干具體實例中，MCCS1或MCCS2，或二者，涉及管柱切換。於若干具體實例中，MCCS1進行捕獲本文提供之rhAGA蛋白與使病毒失活之單元操作。於若干具體實例中，MCCS2進行純化與精煉本文提供之rhAGA蛋白之單元操作。
MCCS1及/或MCCS2可利用，例如，至少兩個層析管柱。MCCS1及/或MCCS2可利用，例如，至少兩個層析膜。MCCS1及/或MCCS2可利用，例如，至少一個層析管柱與至少一個層析膜。
MCCS1可為，例如，週期性逆流層析系統(PCCS1)。PCCS1可為，例如，四管柱PCCS。於若干具體實例中，四管柱PCCS中之四個管柱，可進行捕獲液得自態培養基中之本文提供之rhAGA蛋白之單元操作。該捕獲可使用，例如，親和層析法、陽離子交換層析法、陰離子交換層析法、或分子篩層析法進行。親和層析法可以選自，例如，蛋白A-結合捕獲機制、基質-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段捕獲機制、適配體-結合捕獲機制、與輔因子-結合機制之捕獲機制進行。可將得自四管柱PCCS中四個管柱之三個之含有本文提供之rhAGA蛋白之溶洗液饋入四管柱PCCS之第四管柱中。四管柱PCCS之第四管柱可進行，例如，利用保持含本文提供之rhAGA蛋白之溶洗液於低pH下使病毒失活之單元操作。舉例而言，該四管柱PCCS之第 四管柱可保持含本文提供之rhAGA蛋白之溶洗液於低pH下為期約10分鐘至約1.5小時使病毒失活。
於若干具體實例中，MCCS2可為，例如，週期性逆流層析系統(PCCS2)。於若干實例中，該程序進一步包括於得自四管柱PCCS第四管柱之溶洗液饋入PCCS2中之前，使用在線之緩衝液調整貯存器調整得自四管柱PCCS第四管柱溶洗液pH之步驟。
PCCS2可，例如，包含三個層析管柱及一層析膜。該PCCS2中之三個層析管柱可進行，例如，純化本文提供之rhAGA蛋白之單元操作(例如，經由陽離子或陰離子交換層析法)。得自PCCS2三個管柱之溶洗液可饋入，例如，PCCS2之層析膜中。PCCS2中之層析膜可，例如，進行精煉PCCS2中三個層析管柱溶洗液中之本文提供之rhAGA蛋白之單元操作(例如，經由陽離子或陰離子交換層析法)。層析膜之流通液與洗滌液可為本文提供之單離之rhAGA蛋白或rhAGA蛋白藥物物質。
若干實例進一步包括於得自PCCS2三個管柱之溶洗液饋入PCCS2層析膜中之前，使用在線之緩衝液調整器調整得自PCCS2三個管柱溶洗液之離子濃度。若干具體實例進一步包括於PCCS1與PCCS2間使用斷流槽(break tank)。若干實例進一步包括於饋入PCCS2前，過濾得自PCCS1之溶洗液。若干具體實例進一步包括於饋入MCCS1前，過濾液態培養基。
醫藥組成物與套組
本文亦提供包含至少一種(例如，一種、兩種、三種、或四種)本文所提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之醫藥組成 物。兩種以上(例如，兩種、三種、或四種)本文所提供之任何重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可以任何組合存在醫藥組成物中。於此亦提供醫藥組成物，其包含、由或主要由本文所提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白及醫藥上可接受之載劑組成。
本文提供之任何醫藥組成物可無或不具可檢測量之存在動物性產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血液產物)中之蛋白質、脂質、碳水化合物、核酸、與污染物(例如，本文所述之任何污染物)。
本文提供之任何醫藥組成物可包含只用選自無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養中生產之本文提供之rhAGA蛋白。本文提供之任何醫藥組成物可包含只用無蛋白質培養基及/或化學成分確定培養基之細胞培養中生產之本文提供之rhAGA蛋白。本文提供之任何醫藥組成物可包含只用選自無蛋白質、無血清、與化學成分確定培養基組群之培養基之細胞培養中生產，及使用整合與連續程序(例如，於本文或WO 14/137903中敘述之任何例示之整合與連續程序)單離之本文提供之rhAGA蛋白。
相較於含有利用包括使用含動物性產物(例如，動物血清、動物血漿、或動物血液因子或蛋白質)之方法生產之rhAGA蛋白(例如，本文提供之任何rhAGA蛋白)之醫藥組成物，本文提供之任何醫藥組成物具有增進之安全性(例如，降低之污染(例如，本文所述或此項技藝中已知之任何例示污染物)風險)。
醫藥組成物可以此項技藝中已知之任何方式調配。本文所提供之醫藥組成物係有利的，因其具有降低之污染風險或量 (例如，降低之病毒污染風險或量)及/或降低之存在組成物中醣型之異質性。
醫藥組成物係經調配以與其意指給藥途徑(例如，靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內)相容。組成物可包含醫藥上可接受之載劑，例如，無菌稀釋劑(例如，無菌水或鹽水)、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶劑；抗細菌或抗真菌劑，例如苄醇或對羥苯甲酸甲酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉等；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如伸乙二胺四乙酸；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽；及等滲劑，例如糖類(例如，葡萄糖)、多元醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)、或鹽類(例如，氯化鈉)；或其任何組合物。脂質體懸浮劑亦可用為醫藥上可接受之載劑(參見，例如，美國專利第4,522,811號)。組成物之製備可經調配並裝入安瓿、拋棄式注射器、或多次劑量小瓶中。於需要時(例如，於注射用調配劑中)，可經由，例如，應用塗覆(例如卵磷脂、或界面活性劑)以維持適當流動性。重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之吸收可利用包含延緩吸收之製劑(例如，單硬脂酸鋁與明膠)予以延長。替代地，控制釋放可利用植入物與微膠囊化之遞送系統，其可包括生物可降解、生物相容性聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐類、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯類、與聚乳酸；Alza Corporation and Nova Pharmaceutical,Inc.)予以達成。
包含一或多個任何重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之組成物可呈單位劑量型(亦即，含活性蛋白預定量之物理各別單 元，以容易給藥及劑量均一)調配之非經腸(例如，靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內)給藥。
組成物之毒性與治療效力可利用細胞培養或實驗動物(例如，猴子)上之標準醫藥程序測定。例如，可測定LD50(50%族群之致死劑量)及ED50(50%族群之有效治療劑量)：治療指數為LD50：ED50之比。展現高治療指數之製劑較佳。展現不良副作用之製劑應謹慎小心以縮小潛在之損害(亦即，減少有害之副作用)。毒性與治療效力，可利用其他標準醫藥程序測定。
從細胞培養試驗與動物研究所得到之數據，可用於調配供病患(例如，人類)使用之適當劑量之任何特定重組醣蛋白(例如，本文所述之任何重組醣蛋白)。一或多種(例如，一種、兩種、三種、或四種)重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(例如，本文所述之任何重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)之有效治療量將為治療法布瑞氏症病患(例如，於病患(例如，經鑑定形成法布瑞氏症風險增加之人類病患)中降低形成法布瑞氏症之風險或預防其進展)；於病患(例如，人類)(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)中降低一或多個法布瑞氏症症狀之嚴重性、頻率、及/或持續時間；於具法布瑞氏症之病患(例如，人類)(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)中，降低具末端α-半乳糖基殘基之醣神經鞘脂質例如球形三己醣苷腦醯胺之蓄積量之量。本文所述任何重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之有效性與劑量，可由健康照護專業人員或獸醫 專業人員使用此項技藝中已知之方法，以及由觀察法布瑞氏症病患(例如，人類)一或多個症狀予以決定。特定因子可能影響有效治療病患所需之劑量與時機(例如，疾病或疾患之嚴重性、先前之治療、病患之總體健康及/或年齡、與其他疾病之存在)。
本文所述之任何醫藥組成物可進一步包含一或多種(例如，兩種、三種、四種、或五種)額外治療劑。可包含於本文所述之任何醫藥組成物之額外治療劑之非限制性實例包括：抗痙攣劑(例如，苯妥英(phenytoin)、卡巴馬平(carbamazepine)、苯巴比妥(phenobarbital)、甲基苯巴比妥、巴比沙隆(barbexaclone)、苯二氮平類(benzodiazepine)、氯巴占(clobozam)、可那氮平(clonazepam)、氯查配特(clorazepate)、二氮平(diazepam)、咪達唑侖(midazolam)、勞拉西泮(lorazepam)、硝西泮(nitrazepam)、替馬西泮(temazepam)、硝甲西泮(nimetazepam)、非爾氨酯(felbamate)、卡巴氮平(carbamazepine)、奧卡西平(oxcarbazepine)、乙酸艾司利卡西平(eslicarbazepine acetate)、維加巴因(vigabatrin)、普洛加比(progabide)、噻加賓(tiagabine)、托吡酯(topiramate)、加巴噴丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、乙基苯妥英(ethotoin)、苯妥英、美芬妥英(mephenytoin)、磷苯妥英(fosphenytoin)、甲乙雙酮(paramethadione)、三甲雙酮(trimethadione)、依沙雙酮(ethadione)、貝克拉胺(beclamide)、普里米酮(primidone)、布瓦西坦(brivaracetam)、左乙拉西坦(levetiracetam)、塞曲西坦(seletracetam)、乙琥胺(ethosuximide)、苯琥胺(phensuximide)、 甲琥胺(mesuximide)、乙醯唑胺(acetazolamide)、舒噻美(sultiame)、甲醋唑胺(methazolamide)、唑尼沙胺(zonisamide)、拉莫三嗪(lamotrigine)、苯丁醯脲(pheneturide)、苯乙醯脲(phenacemide)、丙戊醯胺(valpromide)、與甲乙基戊醯胺(valnoctamide))及止吐劑(例如，甲氧氯普胺(metoclopramide)、普氯苯噻肼(prochlorperazine)、阿立必利(alizapride)、多拉司瓊(dolasetron)、格拉司瓊(granisetron)、昂丹司瓊(ondansetron)、托烷司瓊(tropisetron)、帕洛諾司瓊(palonosetron)、米氮平(mirtazapine)、多潘立酮(domperidone)、奥氮平(olanzapine)、達哌啶醇(droperidol)、氟哌啶醇(haloperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)、普氯苯噻肼、阿瑞吡坦(aprepitant)、與卡索匹坦(casopitant))。
例示劑量包含每公斤病患體重本文所述任何重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之毫克或微克量(例如，約50微克/公斤至約3毫克/公斤、約100微克/公斤至約2.5毫克/公斤、約100微克/公斤至約2.0毫克/公斤、約500微克/公斤至約1.5毫克/公斤、約500微克/公斤至約1.5毫克/公斤、或約800微克/公斤至約1.2毫克/公斤)。例示劑量亦可能包括每公斤病患體重一或多種本文所述任何一或多種額外治療劑之毫克或微克量(例如，約1微克/公斤至約500毫克/公斤、約100微克/公斤至約500毫克/公斤、約100微克/公斤至約50毫克/公斤、約10微克/公斤至約5毫克/公斤、約10微克/公斤至約0.5毫克/公斤、或約1微克/公斤至約50微克/公斤之每一給藥之額外治療劑)。儘管此等劑量涵蓋寬廣範圍，惟一般熟習此項技藝者將理解包括本文所述之重組α- 半乳糖苷酶-A蛋白與額外治療劑等治療劑，其效價上不同，有效量可利用此項技藝中已知之方法決定。通常，先投予比較低之劑量，隨後參與之健康照護專業人員或獸醫專業人員(於治療用情形下)或研究人員(仍在開發階段作業時)可逐漸增加劑量至得到適當反應為止。此外，一般了解，任何特殊病患之特定劑量將視包括所用特定化合物之活性、病患年齡、體重、總體健康、性別、與飲食、給藥時間，給藥途徑、排出速率、及活體內重組醣蛋白(例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)或額外治療劑之半衰期等多項因素而不同。醫藥組成物可與給藥用法說明一起包含於容器、包裝、或分注器中。
舉例而言，一或多種本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白可呈凍乾粉末或塊狀物包裝於無菌小瓶中，以供之後再組成及給藥用。包含重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之凍乾粉末或塊狀物可包含一或多種安定劑(例如，甘露糖醇、磷酸二氫鈉一水合物、與磷酸氫二鈉七水合物之一或多者)。包含重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之凍乾粉末或塊狀物(cake)之實例包含：37毫克重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、222毫克甘露糖醇、20.4毫克磷酸二氫鈉一水合物、與59.2毫克磷酸氫二鈉七水合物。於使用或投予重組人類α-半乳糖苷酶蛋白之前，凍乾粉末或塊狀物利用注入7.2毫升注射用無菌水(USP)至小瓶中再組成，以得到每毫升5.0毫克重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之溶液。於以約1毫克/公斤劑量靜脈內投予病患之前，此再組成溶液可進一步以0.9%氯化鈉注射液(USP)稀釋至最終容量為500毫升。此外，本發明亦包括套組，其包含凍乾重組人類α-半乳 糖苷酶塊狀物或粉末(如本節中所述)之小瓶、再組成塊狀物或粉末(如本節中所述)之操作指南、及以約1.0毫克/公斤劑量之再組成溶液每兩週靜脈內投予病患用法說明
包含重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之凍乾粉末或塊狀物之另一實例包含：5.5毫克重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、33.0毫克甘露糖醇、3.0毫克磷酸二氫鈉一水合物、與8.8毫克磷酸氫二鈉七水合物。於使用或投予重組人類α-半乳糖苷酶蛋白之前，凍乾粉末或塊狀物利用注入1.1毫升注射用無菌水(USP)至小瓶中再組成，以得到每毫升5.0毫克重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之溶液。於以約1毫克/公斤劑量靜脈內投予病患之前，此再組成溶液可進一步以0.9%氯化鈉注射液(USP)稀釋至最終容量為500毫升。本發明亦包括套組，其包含凍乾重組人類α-半乳糖苷酶塊狀物或粉末(如本節中所述)之小瓶、再組成塊狀物或粉末(如本節中所述)之操作指南、及以約1.0毫克/公斤劑量之再組成溶液每兩週靜脈內投予病患用法說明。
本文亦提供包含至少一個劑量之本文所述任何醫藥組成物之套組。於若干具體實例中，該套組可進一步包含用於投予哺乳動物(例如，人類)醫藥組成物(例如，本文所述之任何醫藥組成物)之品目(item)(例如，注射器，例如，預裝填之注射器)。套組之若干實例包含一或多個劑量(例如，至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、二十個、三十個、或四十個劑量)(例如，靜脈內、皮下、或腹膜內劑量)之本文所述之任何醫藥組成物。於若干實例中，套組進一步包含投予哺乳動物(例如之具有法 布瑞氏症之人類)醫藥組成物(或醫藥組成物之劑量)之用法說明。
於若干具體實例中，套組包括包含至少一種本文所述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之組成物，及含有至少一種額外治療劑(例如，本文所述一或多種額外治療劑之任何組合)之組成物。於若干具體實例中，套組進一步含有進行本文所述任何方法之操作指南。
法布瑞氏症
法布瑞氏症係X性聯隱性溶酶體貯積症，其特徵為α-半乳糖苷酶-A(所謂腦醯胺三己糖苷酶)之缺陷，經由具末端α-半乳糖基殘基之醣神經鞘脂質例如球形三己醣苷腦醯胺(GL-3)之蓄積導致血管及其他疾病表現。法布瑞氏症之非限制性症狀包括無汗、手指疼痛、左心室肥大、腎臟癥候、與缺血性中風。症狀之嚴重性有很大差異(參見，Grewal et al.,J.Neurol.241：153-156,1994)。其表現限制於心臟之變異型已被認定，其發病率可能較昔日所設想更為普遍(參見，Nakao,N.Eng.J.Med.333：288-293,1995)。雖然由於臨床上之警覺，於童年時期之診斷是可能的，惟不常見變異型之認定可能延遲至生命之較晚期(Ko et al.,Arch.Pathol.Lab.Med.120：86-89,1996；Mendez et al.,Dement.Geriatr.Cogn.Disord.8：252-257,1997；Shelley et al.,Pediatric Derm.12：215-219,1995)。法布瑞氏症診斷之平均年齡為29歲。
治療法布瑞氏症、增加哺乳動物細胞溶酶體中之α-半乳糖苷酶量、及降低病患之球形三己糖苷腦醯胺量之方法
本文亦提供治療病患(例如，人類)之法布瑞氏症之方法，該方法包括投予該病患包含有效治療量之至少一種本文所述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物之組成物。本文所述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白經由增加病患哺乳動物細胞溶酶體中α-半乳糖苷酶-A之濃度而傳介法布瑞氏症之治療。於病患中成功之法布瑞氏症治療可由健康專業人員(例如，護理師、醫師、或醫師助理)決定。舉例而言，成功之治療可導致病患一或多個法布瑞氏症症狀(例如，無汗、手指疼痛、左心室肥大、腎臟癥候、缺血性中風、及病患之球形三己糖苷腦醯胺血清量增加)數量、嚴重性、及/或頻率之減少(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)。此外，成功之治療可由觀察病患隨著時間血清或組織(例如，腎臟)中球形三己糖苷腦醯胺量之減少(例如，相較於接受不同治療、接受安慰劑、或未接受治療之具法布瑞氏症之病患，或相較於治療之前之相同病患)予以確定。用於確定病患法布瑞氏症治療成功之更多方法見述於本文敘述且為此項技藝中已知。
本文亦提供增加哺乳動物細胞(例如，活體外細胞或哺乳動物例如人類之細胞)溶酶體中之α-半乳糖苷酶-A蛋白量之方法，該方法包括使該細胞以足以增加細胞溶酶體中之α-半乳糖苷酶-A蛋白量之量，與至少一種本文所述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一種本文所述之醫藥組成物之接觸。該哺乳動物細胞可為表現甘露糖-6-磷酸受體之細胞。哺乳動物細胞溶酶體中α-半乳糖苷酶-A之量可使用採用特異性地結合人類α- 半乳糖苷酶蛋白-A之抗體之免疫螢光顯微鏡予以測定。哺乳動物細胞溶酶體中α-半乳糖苷酶-A蛋白之量亦可利用從哺乳動物細胞中單離出溶酶體，測定單離溶酶體中之α-半乳糖苷酶-A蛋白量，例如，經由使用特異性地結合人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之抗體，或藉由使用得自單離溶酶體之溶解物進行α-半乳糖苷酶蛋白-A活性試驗予以測定。α-半乳糖苷酶-A蛋白試驗之實例係使用O-硝苯基α-D-半乳糖苷作為基質之試驗。於此試驗中，使O-硝苯基α-D-半乳糖苷轉化為產物鄰硝苯酚與D-半乳糖。用於檢測α-半乳糖苷酶-A蛋白活性之另一試驗例使用螢光基質，α-D-半乳吡喃糖苷(Shi et al.,Anal.Bioanal.Chem.394：1903-1909,2009)。病患細胞溶酶體中α-半乳糖苷酶-A蛋白量(例如，人類)之增加可利用觀察病患體驗之法布瑞氏症症狀數之減少(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)、於病患中所觀察之新法布瑞氏症症狀發作率減少(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)、病患中一或多個法布瑞氏症症狀之嚴重性降低(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)、或病患中一或多個法布瑞氏症症狀之惡化減少(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)間接檢測。替代地或此外，細胞溶酶體中α-半乳糖苷酶-A蛋白量之增加可，例如，利用觀察 病患球形三己糖苷腦醯胺血清量之減少(例如，相較於具有相同疾病惟，例如，未接受治療、接受不同治療、或接受安慰劑之對照病患、或治療之前之相同病患)予以檢測。以本文所述重組蛋白治療後之哺乳動物細胞溶酶體中α-半乳糖苷酶-A蛋白之量，可與未治療之哺乳動物細胞(例如，相同類型細胞)溶酶體中α-半乳糖苷酶-A之量進行比較。
本文亦提供降低病患(例如，人類)血清或組織(例如，腎臟)中球形三己糖苷腦醯胺量之方法，該方法包括投予病患至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一種本文所述之醫藥組成物。病患之球形三己糖苷腦醯胺血清量可，例如，使用質譜分析(Kim et al.,Korean J.Intern.Med.25：415-421,2010)或抗體三明治試驗(例如，美國專利申請公告案No.2012/0178105中敘述之試驗)予以測定。投予本文提供之至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物後，病患血清或組織中之球形三己糖苷腦醯胺量，可與具有法布瑞氏症惟未接受治療或不同治療之病患血清或組織中之球形三己糖苷腦醯胺量，或投予本文提供之至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物之前，病患中球形三己糖苷腦醯胺之量進行比較。
於若干具體實例中，該病患(例如，人類)先前已被診斷或懷疑具有法布瑞氏症。於若干具體實例中，該哺乳動物已被鑑定為具有形成法布瑞氏症之增加風險(例如，增加之形成法布瑞氏症之遺傳風險)。該哺乳動物可為女性或男性，及可為成人或少年(例如，嬰兒或幼童)。在某些情形下，該病患為人類。於該哺乳動物為少年時，其可能介於1天與18歲間，包括例如， 介於1天與17歲間、1天與16歲間、1天與15歲間、1天與14歲間、1天與13歲間、1天與12歲間、1天與11歲間、1天與10歲間、1天與9歲間、1天與8歲間、1天與7歲間、1天與6歲間、1天與5歲間、1天與4歲間、1天與3歲間、1天與2歲間、1天與1歲間、1天與6個月大間、6個月與4歲間、1個月與5歲間、3歲與13歲間、或13歲與18歲間。於哺乳動物為成人時，該哺乳動物可為，例如，介於18至20歲間，包括，或至少或約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95歲、或至少或約100歲。
病患可由健康照護專業人員觀察其一或多個症狀(例如，本文所述或此項技藝中已知之一或多個任何法布瑞氏症症狀)而診斷為具有法布瑞氏症。於若干實例中，病患可能已經接受法布瑞氏症之治療。其他情況下，先前之法布瑞氏症治療並未成功。
本文所述之重組蛋白或醫藥組成物可經由靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、淋巴內、肌內、眼部、或脊髓腔內給藥投予。另外，該等重組蛋白及醫藥組成物可使用任何技藝已知及/或如本文所述之技術調配(例如，調配以供皮下、靜脈內、動脈內、淋巴內、肌內、肌周、或脊髓腔內給藥用，及/或於脂質體或奈米微粒中調配)。
本文所述之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物可由醫療專業人員(例如，醫師、醫師助理、護理師、護理師助理、或實驗室技師)或獸醫專業人員進行投予。替代地或此外，重組蛋白或醫藥組成物可由人類例如病患本身自行投予。 該投予可發生於例如醫院、診所、或初級護理機構(例如，療養院)、或其任何組合。
於若干具體實例中，該哺乳動物所投予本文所述任何重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或本文所述任何醫藥組成物之劑量係介於1毫克至400毫克間(例如，介於1毫克至300毫克間、1毫克至250毫克間、1毫克與200毫克間、1毫克與150毫克間、1毫克與100毫克間、1毫克與80毫克間、1毫克與70毫克間、1毫克與60毫克間、1毫克與50毫克間、1毫克與40毫克間、1毫克與30毫克間、1毫克與20毫克間、1毫克與10毫克間、20毫克與120毫克間、30毫克與90毫克間、或40毫克與80毫克間)。於若干實例中，病患所投予重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之劑量為約0.1毫克/公斤至約4.0毫克/公斤(例如，介於約0.1毫克/公斤與約3.5毫克/公斤間、約0.1毫克/公斤與約3.0毫克/公斤間、約0.1毫克/公斤與約2.5毫克/公斤間、約0.1毫克/公斤與約2.0毫克/公斤間、約0.1毫克/公斤與約1.5毫克/公斤間、約0.5毫克/公斤與約1.5毫克/公斤間、或約0.7毫克/公斤與約1.3毫克/公斤間)。
於若干具體實例中，病患係進一步投予額外治療劑(例如，本文所述之任何額外治療劑)。額外治療劑可於與投予重組蛋白或醫藥組成物實質上相同時間及/或於一或多個其他時間點投予病患。於若干具體實例中，額外治療劑係與至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白一起調配(例如，使用本文所述調配劑及組成物之任何實例)。
於若干具體實例中，額外治療劑係調配於第一劑量型中，至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白係調配於第二劑量型 中。當額外治療劑調配於第一劑量型中，至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白調配於第二劑量型中時，該第一劑量型與第二劑量型可調配以，例如，供相同給藥途徑(例如，經口、皮下、肌內、靜脈內、動脈內、脊髓腔內、淋巴內、或腹膜內給藥)或供不同給藥途徑(例如，第一劑量型經調配供經口給藥及第二劑量型經調配供皮下、靜脈內、動脈內、或肌內給藥)用。此類治療法組合顯然涵蓋於本發明之中。
如上述，所投予至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(及視需要之額外治療劑)之量將視給藥係局部(例如，肌內)或全身性而定。於若干具體實例中，病患(例如，人類)係投予一個以上劑量之至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一種醫藥組成物。於若干具體實例中，病患(例如，人類)係投予一個以上劑量(例如，兩個或以上劑量)之本文所述之任何組成物。於若干具體實例中，病患至少每個月一次(例如，至少每個月兩次、至少每個月三次、至少每個月四次、至少每週一次、至少每週兩次、每週三次、每天一次、或每天兩次)投予至少一種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一種醫藥組成物劑量。舉例而言，病患可以至少每兩個月一個劑量(例如，至少每個月一個劑量、至少每週一個劑量、至少每兩週一個劑量、或至少每天一個劑量)之頻率投予兩個以上劑量之任何該該醫藥組成物或一或多種重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白。
該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物可長期投予病患。長期治療包括較長時期之任何形式之重複給藥，例如重複給藥一個月以上、一個月與一年之間、一年以上、超過五 年、超過10年、超過15年、超過20年、超過25年、超過30年、超過35年、超過40年、超過45年、或更久。替代地或此外，可施用長期治療。長期治療可包含規則給藥，例如每天一或多次、每週一或多次、或每個月一或多次。舉例而言，長期治療可包含大約每兩週(例如，大約每10至18天)之給藥(例如，靜脈內給藥)。適當劑量可為有效產生期望治療效果之最低劑量之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之量。此類有效劑量通常視本文所述之因素而定。若需要，則重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物之有效日劑量可，視需要，以單位劑量型呈二、三、四、五、或六或更多次劑量，於一整天之適當間隔分開投予。
該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物可經調配以供持續釋放(例如，於生物可降解聚合物或奈米微粒中調配)，且在某些情形下，可直接投予至病患之肌肉組織、皮下組織、或腹膜腔中(分別為肌內、腹膜內、或皮下儲存(depot)給藥)。替代地或此外，持續釋放調配劑可全身投予(例如，經口、靜脈內、動脈內、腹膜內、淋巴內、或皮下給藥)。於若干情形下，該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或醫藥組成物可調配以供經口、腺內、腺周(periglandular)、皮下、管內、肌內、肌周、腹膜內、肌內、動脈內、經皮、淋巴內、或靜脈內給藥。
圖1係溶酶體貯積症及針對各疾病對應酵素缺陷之列表。
圖2係人類α-半乳糖苷酶-A蛋白前驅物之cDNA編碼序列與人類α-半乳糖苷酶-A蛋白前驅物之胺基酸序列(分別為SEQ ID NOS： 1與2)、及成熟人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：3)。
圖3係包含重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白cDNA編碼序列(2GFZ)之pGZ629-2GFZ載體圖譜。
圖4係可用以表現重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之載體圖譜。
圖5係顯示用以產生最適化以供表現重組醣蛋白之親源細胞株之步驟流程圖。
圖6係顯示自粒徑排阻管柱溶洗Fabrazyme®與Replagal®之層析圖。
圖7A係Fabrazyme®之質量對電荷基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)曲線。
圖7B係Replagal®之MALTI-TOF MS質譜分析曲線。
圖8係Fabrazyme®(上圖)及本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)(中間與下圖)之三個質量對電荷MALDI-TOF質譜分析曲線組。
圖9係Fabrazyme®與Replagal®之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠圖。
圖10係顯示對應於各波峰之氮連結型寡醣(類)結構之以2-鄰胺苯甲酸衍生化(經AA標識)之氮連結型寡醣之例示層析溶洗曲線。插圖顯示兩個三觸角、三唾液酸化寡醣結構，於以2-AA衍生化之氮連結型寡醣之層析溶洗曲線中，兩個結構其中一個對應於波峰6(第1型)，另一個對應於波峰6’(第2型)。
圖11係得自Fabrazyme®(藍色)與Replagal®(紅色)之經AA-標識之氮連結型寡醣之層析溶洗曲線。
圖12係顯示於Fabrazyme®(每組兩柱之左柱)與Replagal®(每組兩柱之右柱)中，電中性寡醣(波峰1)、含單唾液酸化海藻糖寡醣(波峰2)、單唾液酸化寡醣(波峰3)、含雙唾液酸化海藻糖寡醣(波峰4)、雙唾液酸化寡醣(波峰5)、三觸角、三唾液酸化寡醣(第1型；波峰6)、三觸角、三唾液酸化寡醣(第2型；波峰6’)、甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰7)、單磷酸化寡醣(波峰8)、四唾液酸化寡醣(波峰9)、單唾液酸化與單磷酸化寡醣(波峰10)、及雙甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰11)(由左至右)之總氮連結型寡醣百分比之圖表。
圖13係顯示利用各個酵素分解蛋白之LCMS分析所測定，存在Fabrazyme®與Replagal®中之胺基酸殘基Asn108處之氮連結型寡醣之分佈圖。
圖14係顯示利用各個酵素分解蛋白之LCMS分析所測定，存在Fabrazyme®與Replagal®中之胺基酸殘基Asn161處之氮連結型寡醣之分佈圖。
圖15係顯示利用各個酵素分解蛋白之LCMS分析所測定，存在Fabrazyme®與Replagal®中之胺基酸殘基Asn184處之氮連結型寡醣之分佈圖。。
圖16係顯示利用各個酵素分解蛋白之LCMS分析所測定，存在Fabrazyme®與FZ2G中之胺基酸殘基Asn108處之氮連結型寡醣之分佈圖。
圖17係顯示存在Fabrazyme®與FZ2G中之胺基酸殘基Asn108處之氮連結型寡醣經LCMS分析後，出現於各波峰之氮連結型寡醣結構之例示圖表。
圖18係顯示利用各個酵素分解蛋白之LCMS分析所測定，存在 Fabrazyme®與FZ2G中之胺基酸殘基Asn161處之氮連結型寡醣之分佈圖。
圖19係顯示利用各個酵素分解蛋白之LCMS分析所測定，存在Fabrazyme®與FZ2G中之胺基酸殘基Asn184處之氮連結型寡醣之分佈圖。
圖20係得自Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之經AA-標識氮連結型寡醣之層析溶洗曲線。
圖21A係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，電中性寡醣(波峰1)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖21B係顯示經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，單唾液酸化、不含海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖21C係顯示經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，含單唾液酸化海藻糖寡醣(波峰2)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖22A係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，含雙唾液酸化海藻糖寡醣(波峰4)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖22B係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A 蛋白(FZ2G)中，雙唾液酸化寡醣(波峰5)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖22C係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，三觸角、三唾液酸化寡醣(第1型；波峰6)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖23A係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，三觸角、三唾液酸化寡醣(第2型；波峰6’)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖23B係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰7)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖23C係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，單磷酸化寡醣(波峰8)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖24A係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，四唾液酸化寡醣(波峰9)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖24B係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，單磷酸化寡醣(波峰10)之總氮連結型寡醣百分比 圖。
圖24C係顯示利用經AA-標識之氮連結型寡醣之LCMS分析所測定，於Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中，雙甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰11)之總氮連結型寡醣百分比圖。
圖25A係顯示Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之甘露糖-6-磷酸對蛋白質(上方)之莫耳-對-莫耳比之圖表。
圖25B係圖表顯示Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之N-乙醯神經胺酸(NANA)對蛋白質之莫耳-對-莫耳比之圖表。
圖26係顯示Fabrazyme®(FZ)(紅色)與Replagal®(綠色)之表面電漿共振(Biacore)可溶性非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體-結合數據之圖表。
圖27係顯示Fabrazyme®(FZ)(紅色)與Replagal®(綠色)之表面電漿共振(Biacore)可溶性非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體-結合數據之圖表。
圖28係顯示利用表面電漿共振(Biacore)所測定，Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之相對可溶性非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體結合之圖。
圖29係顯示以漸增濃度之甘露糖-6-磷酸溶洗甘露糖-6-磷酸受體親和力管柱所得Fabrazyme®(FZ)與Replagal®相對百分比之圖表。
圖30係顯示以漸增濃度之甘露糖-6-磷酸溶洗甘露糖-6-磷酸 受體親和力管柱所得Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)相對百分比之圖表。
圖31係Fabrazyme®與Replagal®之影像毛細管等電聚焦(icIEF)波峰之圖譜。
圖32A係顯示Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)存在ciIEF波峰1-5中之百分比之圖表。
圖32B係顯示Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)存在ciIEF波峰6-11中之百分比之圖表。
圖32C係顯示Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)存在ciIEF波峰12-14中之百分比之圖表。
圖33係使用合成pNP基質測定Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之Km之圖表。
圖34係使用合成pNP基質測定Fabrazyme®(FZ)與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之Vmax之圖表。
圖35係Fabrazyme®(藍色)與Replagal®(green)從逆相高壓液相層析(RP-HPLC)管柱之溶洗圖。
圖36係顯示於法布瑞氏小鼠模式中，以單一0.1毫克/公斤Fabrazyme®靜脈內投予3天或14天後，或以單一0.1毫克/公斤本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白質(FZ2G)靜脈內投予3天或14天後，或於法布瑞氏小鼠模式中，靜脈內投予單一劑量載劑後，肝臟組織中GL3量(奈克GL3/毫克肝臟組織)之圖表。因根據格魯布斯檢驗(Grubbs’test)被計算為離群值(p<0.01)，一組試樣從分析中排除(圖中以“a”指示之組)。
圖37係顯示於法布瑞氏小鼠模式中，以單一0.1毫克/公斤 Fabrazyme®靜脈內投予3天或14天後，或以單一0.1毫克/公斤本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白質(FZ2G)靜脈內投予3天或14天後，或於法布瑞氏小鼠模式中，靜脈內投予單一劑量載劑後，脾臟組織中GL3量(奈克GL3/毫克肝臟組織)之圖表。
圖38係顯示於法布瑞氏小鼠模式中，以單一1.0毫克/公斤Fabrazyme®靜脈內投予3天或14天後，或以單一1.0毫克/公斤本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白質(FZ2G)靜脈內投予3天或14天後，或於法布瑞氏小鼠模式中，靜脈內投予單一劑量載劑後，心臟組織中GL3量(奈克GL3/毫克肝臟組織)之圖表。
圖39係顯示於法布瑞氏小鼠模式中，以單一1.0毫克/公斤Fabrazyme®靜脈內投予3天或14天後，或以單一1.0毫克/公斤本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白質(FZ2G)靜脈內投予3天或14天後，或於法布瑞氏小鼠模式中，靜脈內投予單一劑量載劑後，腎臟組織中GL3量(奈克GL3/毫克肝臟組織)之圖表。
圖40係顯示於法布瑞氏小鼠模式中，以單一1毫克/公斤Fabrazyme®(圓圈，各時間點5隻小鼠)或1毫克/公斤本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶A蛋白(方格，各時間點8隻小鼠)靜脈內投予後，經時之酵素活性圖表。
實施例
於下述實施例中進一步說明本發明，其不對申請專利範圍中敘述之本發明範圍構成侷限。
實例1. 用於生產醣蛋白之重組細胞株之製造
進行實驗以開發用於重組生產醣蛋白之細胞株。於此等實驗中，將起始之血清依賴性CHO細胞株(DXB11)連續地：於含5%胎牛血清之組織培養培養基中生長3天；於含2.5%胎牛血清之組織培養培養基中生長3天；及於不含胎牛血清之組織培養培養基中生長8天。此培養期結束時，稀釋並等分(aliquoted)所得CHO細胞培養物以產生無血清亞群、或匯集物(pool)、懸浮培養物。擴增(expansion)及生長評估後，將無血清匯集物等分以產生單一細胞選殖培養物。測試各個單一細胞選殖株於無血清培養基中之細胞生長，然後在倉鼠β-肌動蛋白啟動子控制下，利用編碼紅色螢光蛋白(RFP)表現載體之電穿孔，測試選殖株子集之轉染效率；轉染2天後，利用流式細胞測量術分析RFP表現。於以在倉鼠β-肌動蛋白啟動子控制下編碼所關注基因及在SV40啟動子控制下編碼DHFR基因等表現載體穩定轉染後，評估符合倍增時間(<35小時)與轉染效率(>30%之RFP陽性與>75%之培養存活率)標準之選殖株之重組蛋白表現。轉染後，使用胺甲喋呤(MTX)挑選穩定轉染之匯集物，挑選後，利用接種細胞至未饋料(unfed)批次培養及分析澄清培養基重組蛋白之收穫量，評估匯集物之重組蛋白生產力。根據穩定轉染匯集物之MTX挑選存活量與重組蛋白生產量，鑑定領先之無血清親源選殖株。
次選殖該領先之親源選殖株，進一步於無蛋白質、無動物衍生成分(ADC)、化學成分確定之培養基(Invitrogen之CD DG44培養基)中培養，將次選殖株存於庫中。從單一細胞次選殖步驟至初始冷凍細胞庫，於無ADC培養基中大約經過27個細 胞世代。測試該等單一細胞選殖株之下述內容：轉染效率(利用上述RFP編碼載體之電穿孔)、細胞生長性質(於Invitrogen之CD DG44培養基中)、及欲生產重組蛋白之穩定轉形。穩定轉染匯集物之評估(使用Invitrogen之CD CHO培養基)包括MTX挑選、最高細胞密度、生長性質、及容積生產率(VPR)之評估。如上文所述測試重組蛋白之生產力。
經上述所有培養步驟後，鑑定出具有最佳之轉染效率與最佳MTX挑選、最高細胞密度、細胞生長性質、及穩定轉染匯集物容積生產率(VPR)之單一選殖親源細胞株。增殖此親源細胞株並冷凍成等分試樣以供進一步實驗之用。
實例2. 重組人類α-半乳糖苷酶-A之生產
將生產(及分泌)重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白細胞之小瓶融解至搖瓶中之化學成分確定及無動物衍生成分(ADC)之細胞培養基中。增殖該混合物，至細胞量足夠用於接種至灌流式生物反應器為止。令培養物生長直至達到高活細胞密度之標的，並於此點啟動細胞密度控制。接種一天後，開始連續灌流，然後於該灌流式生物反應器中，針對標的之高細胞密度，逐漸升高至固定灌流速率。使用整合連續式捕獲層析系統，將澄清之收穫液體(含有重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)直接裝填至捕獲管柱上。然後將捕獲之溶洗液(含有重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)進一步通過陰離子交換層析樹脂(ANX)予以純化，以移除DNA、宿主細胞蛋白質、及其他雜質。該ANX溶洗液(含有重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白)進一步通過固定化金屬親和層析樹脂予以純化。將金屬親和層析溶洗液(含有重組人類α-半乳糖 苷酶-A蛋白)濃縮至重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之標的濃度，然後使用切向流動濾膜將緩衝液調換成藥物物質之緩衝液。接著使該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白藥物物質進行特性分析(如實施例中所述)。於準備用於動物PK/PD研究時(實例5)，接著添加甘露糖醇，調配該重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白藥物物質，然後通過0.22平方厘米絕對濾器予以過濾。
實例3. 重組人類α-半乳糖苷酶-A之物理特性分析
使用各種生物物理技術進行實例2中所生產及純化之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之物理特性分析，並與Fabrazyme®及Replagal®比較。於下文中討論重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之各個經研究之結構性與功能性特徵，以及用於測定各個結構性與功能性特徵之方法。
分子大小
使用粒徑排阻層析法、MALDI-TOF MS、與凝膠電泳法，評估Fabrazyme®、Replagal®、與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之分子大小。
SEC
粒徑排阻層析法(SEC)分析係利用Agilent 1200 HPLC，使用TSK-Gel G3000SWXL管柱(Tosoh，7.8毫米x 30厘米)進行。注入50微升試樣並以0.5毫升/分鐘之流速進行管柱層析。於280奈米檢測溶洗出之蛋白質。
MALDI-TOF MS
進行MALDI-TOF MS時，首先於0.1%甲酸水溶液中稀釋試樣(5：1)。於0.1%甲酸水溶液中稀釋BSA至2毫克/毫升。經稀釋 之試樣與比率1微升/1微升之飽和芥子酸之0.1% TFA水溶液、50%乙腈一起，三重複點於不銹鋼MALDI靶(target)上。從不同部位及具不同雷射強度之各個點產生10個圖譜(spectra)，然後予以平均。儀器設定列示於表1。將圖譜校準成為BSA之單與雙電荷m/z波峰。使用系統內校平常規(default smoothing routine)於波峰解析度200校平原始數據。平均三重複測量之波峰數值，並決定標準偏差。
SDS-PAGE
將10微克溶於試樣裝填緩衝液中之各試樣與二硫蘇糖醇(DTT)一起裝填於4-20% Tris甘胺酸凝膠(Invitrogen)上。施加150電壓於該凝膠1小時又25分鐘。完成後，以考馬斯(Coomassie)R-250染色液進行凝膠染色30分鐘。使用去染色液移除過量染劑30分鐘。
結果
粒徑排阻層析法(SEC)分析顯示，相較於Replagal®，Fabrazyme®較早溶洗出並帶有拖尾肩(圖6)。此等結果暗示， Fabrazyme®具異源性，相較於Replagal®，可能具較高之分子量。圖7A-7B中之MALDI-TOF MS圖譜顯示，於Fabrazyme®與Replagal®中觀察到之主要物種之m/z比具比較性。Fabrazyme®亦含有未於Replagal®中觀察到之重組人類α-半乳糖苷酶-A之較低分子量物種。圖8中之MALDI-TOF MS圖譜顯示，於Fabrazyme®與FZ2G中觀察到之主要物種之m/z比具比較性。Fabrazyme®含有未於FZ2G MALDI-TOF MS圖譜中觀察到之較低分子量物種。Fabrazyme®與Replagal®之SDS-PAGE泳動率(mobility)具比較性。於Fabrazyme®中可觀察到具較高泳動率(較低表觀分子量)之次要物種，於Replagal®中則無(圖9)。
醣基化譜
如Kamoda et al.,J.Chromatography A 1133：332-339,2006中之概括性敘述，使用2-鄰胺苯甲酸(AA)-衍生化及以螢光檢測之正相液相層析法測定Fabrazyme®、Replagal®、與FZ2G之氮連結型醣基化譜。
定位(Site-Specific)聚醣分析
Fabrazyme®、Replagal®、與FZ2G之定位醣基化分析係使用與液相層析法系統(nanoAcquity LC，Waters)偶合之串聯式(hybid)線性離子阱-軌道式離子阱(Orbitrap)質譜儀(LTQ-Orbitrap，Thermo Fisher Scientific)進行。於此過程中，利用以二硫蘇糖醇先還原100微克蛋白質，然後以碘乙酸烷基化，以製備酵素分解物。接著使用Biospin30管柱(Bio-Rad)，將試樣交換至Tris-Cl(pH 8.0)中，隨後用蛋白質內切酶Lys-C分解18小時及以胰蛋白酶分解2小時。接著以甲酸稀釋平息分解 後，將200奈克各試樣分解物注入75微米x10厘米之C-18管柱(Picofrit，New Objectives)中。以溶於0.1%甲酸中之2-95%乙腈之階段梯度溶洗胜肽。於具最高5個強度數據依賴性CID掃描之60,000解析度(resolution)，利用FTMS掃描325-1800之m/z範圍。整合MS數據並使用RefinerMS V 7.6軟體(Genedata)處理供定量用，收集CID圖譜用以確認醣型組成物。
結果
圖10顯示Fabrazyme® AA-衍生化氮連結型寡醣之代表性層析圖，顯示存在各波峰之氮連結型寡醣之特定類型。利用LCMS分析決定經AA-標識之聚醣譜中觀察到之聚醣物種之身分。顯示Fabrazyme®與Replagal®中不同類型之AA-衍生化氮連結型寡醣溶析之層析圖示於圖11。對應於Fabrazyme®與Replagal®各類型氮連結型寡醣之總氮連結型寡醣百分比示於圖12。於Fabrazyme®與Replagal®之Asn108、Asn161、與Asn184觀察到之各聚醣物種之相對百分比分別示於圖13、14、與15。於Fabrazyme®與FZ2G之Asn108、Asn161、與Asn184觀察到各聚醣物種之相對百分比分別示於圖16與17、18及19。
Fabrazyme®與FZ2G之經AA-標識之醣譜(profiles)示於圖20。Fabrazyme®與FZ2G中對應於電中性寡醣(波峰1)、含單唾液酸化海藻糖寡醣(波峰2)、與單唾液酸化寡醣(波峰3)之總氮連結型寡醣百分比示於圖21A-C。Fabrazyme®與FZ2G中對應於含雙唾液酸化海藻糖寡醣(波峰4)、雙唾液酸化寡醣(波峰5)、與第1型三觸角、三唾液酸化寡醣(波峰6)之總氮連結型寡醣百分比示於圖22A-C。Fabrazyme®與FZ2G中對應於第2型三觸 角、三唾液酸化寡醣(波峰6’)、甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰7)、與單磷酸化寡醣(波峰8)總氮連結型寡醣之百分比示於圖23A-C。Fabrazyme®與FZ2G中對應於四唾液酸化寡醣(波峰9)、單唾液酸化或單磷酸化寡醣(波峰10)、與雙甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰11)總氮連結型寡醣之百分比示於圖24A-C。
此等數據顯現，目前提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)，相較於Fabrazyme®，具有實質上不同之醣基化譜。舉例而言，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有：低於Fabrazyme®之電中性寡醣(波峰1)之總氮連結型寡醣百分比；低於Fabrazyme®之含單唾液酸化海藻糖寡醣(波峰2)之總氮連結型寡醣百分比；約相同或低於Fabrazyme®之甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰7)之總氮連結型寡醣百分比；大於Fabrazyme®之單磷酸化寡醣(波峰8)之總氮連結型寡醣百分比；大於Fabrazyme®之四唾液酸化寡醣(波峰9)之總氮連結型寡醣百分比；大於Fabrazyme®之單唾液酸化與單磷酸化(波峰10)之總氮連結型寡醣百分比；及大於Fabrazyme®之雙甘露糖-6-磷酸寡醣(波峰11)之總氮連結型寡醣百分比。本文所述改變醣基化譜之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)(例如，相較於Fabrazyme®)可提供數項優點，舉例而言，下述一或多者：重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之非特異性導向肝臟減少(由於投予病患，例如，人類病患，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白之後，與於肝細胞表面表現之去唾液酸醣蛋白受體結合)、重組人類α-半乳糖苷酶蛋白被於其表面表現甘露糖-6-磷酸受體蛋白的哺乳動物細胞(例如，人類細胞)胞吞之速率增加、對甘露 糖-6-磷酸受體蛋白之親和力增加、及相較於Fabrazyme®之血清半衰期增長。
甘露糖-6-磷酸與N-乙醯神經胺酸對蛋白質之比率
進行追加組實驗，以測定本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)與Fabrazyme®中，甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳比及N-乙醯神經胺酸對蛋白質之莫耳比。
數據顯示，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有與Fabrazyme®約相同之甘露糖-6-磷酸對蛋白質之莫耳比；及相較於Fabrazyme®，具有升高之N-乙醯神經胺酸對蛋白質之莫耳比(圖25A-B)。
等電點
使用影像毛細管等電聚焦(icIEF)，以評估各測試蛋白質之蛋白質電荷。Fabrazyme®與Replagal®之電泳圖示於圖31。針對本文提供之重組α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)與Fabrazyme®，測定電泳圖之低、中、與高pI範圍之相對百分比，並示於圖32A-C。
逆相色層分析法
於另一組實驗中，使用逆相高壓液相層析法(RP-HPLC)分析Fabrazyme®與Replagal®。將試樣注入YMC Octyl管柱(Waters，2.0 x 100毫米)上，使用線性TFA/乙腈梯度，以流速0.25毫升/分鐘溶洗。於波長
數據顯示，Replagal®較Fabrazyme®於更早之時間點從RP-HPLC管柱溶洗出來(圖35)。
實例4. 重組人類α-半乳糖苷酶-A之功能特性分析 非陽離子依賴性之甘露糖-6-磷酸受體之結合活性
進行一組Biacore實驗，以測試本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白、Fabrazyme®、與Replagal結合非陽離子依賴性之甘露糖-6-磷酸受體(CIMPR)之能力。
Fabrazyme®與Replagal®之Biacore感應圖示於圖26。得自此等Fabrazyme®與Replagal®感應圖之結合曲線示於圖27。總結本文提供之重組α-半乳糖苷酶-A蛋白與Fabrazyme®之CIMPR結合活性之圖示於圖28。對照此等數據顯示，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白，相較於Fabrazyme®，具有增強之CIMPR結合活性。
使用親和管柱層析法，亦測試本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)、Fabrazyme®、與Replagal結合甘露糖-6-磷酸受體之能力。以甘露糖-6-磷酸階段溶洗甘露糖-6-磷酸受體管柱，各溶洗區分中，自管柱溶洗之總裝填重組蛋白之百分比示於圖29與30。數據指出，相較於Fabrazyme®與Replagal®，本文提供之重組α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有未結合之相對較低百分比及高親和力物種之較高百分比。
K m 與V max
亦測定本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)與Fabrazyme®之Km與Vmax。
數據顯示，相較於Fabrazyme®，本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有降低或約相同之Km(圖33)及約相同或輕微降低之Vmax(圖34)。
總之，本文提供之數據顯示，本文提供之重組人類α-半乳 糖苷酶-A蛋白(FZ2G)，相較於Fabrazyme®，具有改變之醣基化譜及增進之甘露糖-6-磷酸受體結合活性。
實例5. 動物研究
進行兩種動物模式研究，以評估本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白對GL-3廓清率與藥物動力學參數之影響。
進行第一項研究以探討於0.1毫克/公斤與1毫克/公斤單一靜脈內(IV)投予法布瑞氏小鼠後，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(相較於Fabrazyme®)對組織GL-3廓清率之影響。此研究中，將90隻法布瑞氏小鼠(46M/44F)分成5組(參見下表2)。第1組動物(n=10，6M/4F)投予載劑之單一IV給藥。第2與3組動物(每組n=20，10M/10F)分別投予0.1毫克/公斤與1.0毫克/公斤Fabrazyme®之單一IV給藥。第4與5組動物(每組n=20，10M/10F)分別投予0.1毫克/公斤與1.0毫克/公斤本文提供之人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之單一IV給藥。第6組野生型動物(n=1M)未處理，作為GL-3校準之對照組。給藥3天後(第2-5組，n=10，每組5M/5F)及給藥14天後(第1組與第2-5組，n=10，每組5M/5F)使動物安樂死。對下述組織進行GL-3分析：心臟與腎臟(第1、3、與5組)，及脾臟與肝臟(第1、2、與4組)。
下文表3中提供本實例所述動物研究中投予法布瑞氏小鼠之本文提供之重組α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之若干功能性與結構性特徵。
數據顯示，於靜脈內投予單一劑量Fabrazyme®或單一劑量本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)後，法布瑞氏症小鼠模式之肝臟、脾臟、心臟、與腎臟中之GL-3蓄積達到相似之降低(分別參見圖36、37、38、與39)。總之，該等數據顯示，在Fabrazyme®之單一靜脈內給藥劑量或本文所提供重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之單一靜脈內給藥劑量後，於法布瑞氏症小鼠模式之GL-3廓清率中，無統計上之顯著差異。
進行第二項研究，投予法布瑞氏小鼠單一1毫克/公斤Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)(IV)後，進行藥物動力學參數之特性分析與比較。研究中，將20隻法布瑞氏小鼠(12M/8F)分成2組(參見下文表4)。第1與2組動物(每組n=10，6M/4F)分別以1.0毫克/公斤Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)進行單一IV給藥。給藥後2、15、30、60、120、240、與480分鐘，收集血液試樣，於乾燥血斑上進行酵素分析。藥物動力學分析係使用Phoenix WinNonlin®(Pharsight Corporation，Mountain View，CA)進行。
數據顯示，於分析之時間點，Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之藥物動力學相似(圖40)。由於試樣呈乾血斑收集，因此在各個時間點係計算酵素活性而非濃度。總之，該等數據顯示，於分析之時間點，在Fabrazyme®與本文提供之重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)之單一靜脈內給藥後，酵素間之酵素活性相近。
其他具體實例
應了解的是，雖然本發明已結合其詳細說明予以敘述，惟前述敘述意欲說明而不對由附加申請專利範圍界定之本發明範圍構成侷限。其他方面、優點、與修飾均隸屬下述申請專利範圍之內。
<110> Genzyme Corporation
<120> 重組醣蛋白及其用途
<130> 37488-0005WO1
<150> 61/894,879
<151> 2013-10-23
<150> 61/901,942
<151> 2013-11-08
<160> 3
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1287
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 429
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 398
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3

Claims (57)

  1. 一種重組人類α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白，其具有大於9%之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣(total N-linked oligosaccharides)百分比；及選擇地介於0.1%與1.5%間之單唾液酸化不含海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  2. 如申請專利範圍第1項之rhAGA蛋白，其具下述：介於0.1%與1.5%間之單唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於9%之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.1%與1.3%間之單唾液酸化不含海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  4. 如申請專利範圍第3項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.1%與1.0%間之單唾液酸化不含海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  5. 如申請專利範圍第4項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.1%與0.7%間之單唾液酸化不含海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於9.5%之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  7. 如申請專利範圍第6項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於10.0%之雙甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  8. 如申請專利範圍第1項之rhAGA蛋白，其進一步具有：大於13.5%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於2.0%之第2型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於3.0之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。
  9. 如申請專利範圍第8項之rhAGA蛋白，其進一步具有：大於13.5%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於2.0%之第2型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於3.0之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。
  10. 如申請專利範圍第8或9項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於13.8%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  11. 如申請專利範圍第10項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於14.0%之含雙唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  12. 如申請專利範圍第8或9項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於4%之第2型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  13. 如申請專利範圍第12項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於6%之第2型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  14. 如申請專利範圍第第8或9項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於3.2之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。
  15. 如申請專利範圍第14項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於3.4之唾液酸/蛋白質莫耳/莫耳比。
  16. 如申請專利範圍第8項之rhAGA蛋白，其具有下述之一或多個：介於0.1%與3.9%間之電中性(neutrally-charged)寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於0.1%與3.0%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於0.1%與5.3%間之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於0.1%與9.0%間之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於1%與7.0%間之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於14.8%之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於4.9%之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於8.2%之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  17. 如申請專利範圍第16項之rhAGA蛋白，其具有下述之四個或以上：介於0.1%與3.9%間之電中性寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於0.1%與3.0%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於0.1%與5.3%間之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於0.1%與9.0%間之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；介於1%與7.0%間之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於14.8%之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；大於4.9%之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比；及大於8.2%之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  18. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.1%與3.0%間之電中性寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  19. 如申請專利範圍第18項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.1%與2.0%間之電中性寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  20. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於1.0%與2.0%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  21. 如申請專利範圍第20項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於1.5%與2.0%間之含單唾液酸化海藻糖寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  22. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於3.0%與5.0%間之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  23. 如申請專利範圍第22項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於4.0%與5.0%間之雙唾液酸化寡醣之總氮連結型寡之百分比。
  24. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.5%與8.0%間之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  25. 如申請專利範圍第24項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於0.5%與5.0%間之第1型三唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  26. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於4%與6.9%間之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  27. 如申請專利範圍第26項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有介於5%與6.8%間之甘露糖-6-磷酸寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  28. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於15%之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  29. 如申請專利範圍第28項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於16%之單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  30. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於6%之四唾液酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  31. 如申請專利範圍第16或17項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於8.5%之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  32. 如申請專利範圍第31項之rhAGA蛋白，其中該rhAGA蛋白具有大於9.0%之單唾液酸化與單磷酸化寡醣之總氮連結型寡醣百分比。
  33. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至32項中任一項之rhAGA蛋白及醫藥上可接受之載劑。
  34. 如申請專利範圍第33項之醫藥組成物，其中該組成物係經調配以用於靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下、或腹膜內給藥。
  35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含濃度4毫克/毫升至6毫克/毫升之rhAGA。
  36. 如申請專利範圍第35項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含濃度5毫克/毫升之rhAGA。
  37. 如申請專利範圍第36項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係無菌、凍乾粉末。
  38. 如申請專利範圍第37項之醫藥組成物，其中該醫藥上可接受之載劑係選自下述組成的組群之一或多個製劑：甘露糖醇、磷酸二氫鈉一水合物、與磷酸氫二鈉七水合物。
  39. 一種如申請專利範圍第1至32項中任一項之rhAGA蛋白之用途，其用於製造於病患中治療法布瑞氏症(Fabry disease)之藥物。
  40. 如申請專利範圍第39項之用途，其中該藥物係調配為全身性給藥。
  41. 如申請專利範圍第39項之用途，其中該藥物係調配為靜脈內給藥。
  42. 如申請專利範圍第39項之用途，其中該病患係人類病患。
  43. 如申請專利範圍第39項之用途，其中該病患已被診斷為具有法布瑞氏症。
  44. 一種如申請專利範圍第1至32項中任一項之rhAGA蛋白之用途，其用於製造增加哺乳動物細胞溶酶體中之α-半乳糖苷酶-A蛋白量之藥物。
  45. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該細胞係於活體外。
  46. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該細胞係人類細胞。
  47. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該細胞係於病患中。
  48. 如申請專利範圍第47項之用途，其中該病患係人類。
  49. 如申請專利範圍第47項之用途，其中該病患已被診斷為具有法布瑞氏症。
  50. 如申請專利範圍第47項之用途，其中該藥物係調配為全身性給藥。
  51. 如申請專利範圍第47項之用途，其中該全身性給藥為靜脈內給藥。
  52. 一種如申請專利範圍第1至32項中任一項之rhAGA蛋白之用途，其用於製造降低病患之球形三己糖苷腦醯胺(globotriaosylceramide)血清量之藥物。
  53. 如申請專利範圍第52項之用途，其中該病患之球形三己糖苷腦醯胺血清量大於8微克/毫升。
  54. 如申請專利範圍第52項之用途，其中該病患已被診斷為具有法布瑞氏症。
  55. 如申請專利範圍第52項之用途，其中該藥物係調配為全身性給藥。
  56. 如申請專利範圍第52項之用途，其中該藥物係調配為靜脈內給藥。
  57. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該病患係人類。
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