UA119857C2

UA119857C2 - РЕКОМБІНАНТНИЙ БІЛОК АЛЬФА-ГАЛАКТОЗИДАЗИ-А ЛЮДИНИ (rhAGA)

Info

Publication number: UA119857C2
Application number: UAA201605455A
Authority: UA
Inventors: Карен Лі; Карэн Ли; Кристофер Хванг; Кристин Демарія; Кристин Демария
Original assignee: Джензайм Корпорейшн; Джензайм Корпорэйшн
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2019-08-27
Also published as: EP3060660B1; JP6837334B2; TWI642782B; BR112016008086A2; CN114606217A; KR20160066550A; EA034515B1; EP3778884A1; EP3060660A2; AU2014340152A1; HRP20211197T1; US20220064617A1; SG10201803366PA; JP2020089379A; SI3060660T1; PE20160723A1; DOP2016000079A; IL272609A; TW202332774A; EA201690826A1

Abstract

Винахід стосується рекомбінантного білка α-галактозидази-А людини (rhAGA), що має певний відсотковий вміст N-зв’язаних олігосахаридів, а саме певний відсотковий вміст: моносіалільованих олігосахаридів, біс-манозо-6-фосфатвмісних олігосахаридів, бісіалільованих фукозовмісних олігосахаридів, трирозгалужених трисіалільованих олігосахаридів форми 2, нейтрально заряджених олігосахаридів, моносіалільованих фукозовмісних олігосахаридів, бісіалільованих олігосахаридів, трирозгалужених трисіалільованих олігосахаридів форми 1, манозо-6-фосфатвмісних олігосахаридів, монофосфорилованих олігосахаридів, тетрасіалільованих олігосахаридів, моносіалільованих та монофосфорилованих олігосахаридів. Також винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить вказаний рекомбінантний білок, способу лікування хвороби Фабрі та способу зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб’єкта.

Description

моносіалільованих олігосахаридів, біс-манозо-6-фосфатвмісних олігосахаридів, бісіалільованих фукозовмісних олігосахаридів, трирозгалужених трисіалільованих олігосахаридів форми 2, нейтрально заряджених олігосахаридів, моносіалільованих фукозовмісних олігосахаридів, бісіалільованих олігосахаридів, трирозгалужених трисіалільованих олігосахаридів форми 1, манозо-6-фосфатвмісних олігосахаридів, монофосфорилованих олігосахаридів, тетрасіалільованих олігосахаридів, моносіалільованих та монофосфорилованих олігосахаридів.

Також винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить вказаний рекомбінантний білок, способу лікування хвороби Фабрі та способу зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта.

Е В мим 4 ЩЖ де мокко х т -. З Едімазутв ГКІ дв - Кк х її ЧІ й і зх і і ж ШОН Ек ясне ші щ : ват м кт каст М нести ке ї

З КЕ Н ї З | 5 ї ї ! : ! , ви Досбеня У унктненн денттн унннннтти Кок епнсннт М Мій тт МА еко нини а . х со куд ук дих :

Що ЕКО : ф

Е хх х ; їЯ КЗ В Е

М Ха В хі ЕЕ ЕЕ

З - жо ни ойнняй с. й Клен менваннннння г хв

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка заявляє пріоритет відносно попередньої заявки на патент США Мо 61/894879, поданої 23 жовтня 2013 р., і попередньої заявки на патент США Мо 61/901942, поданої 8 листопада 2013 р.; повний зміст яких включено до даного документа шляхом посилання.

Галузь техніки

Дана заявка відноситься до галузі біотехнології та, більш конкретно, до отримання рекомбінантних глікопротеїнів (наприклад, рекомбінантної а-галактозидази-А) і до лікування лізосомних хвороб накопичення (наприклад, хвороби Фавбрі) у суб'єкта.

Передумови винаходу

Лізосомні хвороби накопичення складають групу з понад 40 порушень, які є результатом дефектів у генах, що кодують ферменти, які руйнують гліколіпідні або полісахаридні продукти виділення в ліпосомах клітин. Ферментативні продукти, наприклад, цукри й ліпіди, потім переробляються на нові продукти. Кожне з цих порушень є результатом спадкової аутосомальної або пов'язаної з хромосомою Х рецесивної ознаки, яка впливає на рівні ферментів у ліпосомах. Звичайно, біологічна або функціональна активність цих ферментів знижена або відсутня в клітинах і тканинах вражених індивідуумів. Перелік типових лізосомних хвороб накопичення й асоційованих дефіцитів ферментів показаний на фігурі 1 та описаний у таблиці 1 патенту США Мо 6066626. При таких хворобах дефіцит ферментної функції створює прогресувальне системне відкладення ліпідного або вуглеводного субстрату в ліпосомах клітин в організмі, що з часом призводить до втрати функції органу та смерті.

Хвороба Фабрі являє собою лізосомну хворобу накопичення, спричинену дефіцитом лізосомного ферменту а-галактозидази-А. Дефіцит цієї лізосомної гідролази призводить до прогресувального відкладення глікосфінголіпідглоботриазилцераміду (С 3) і споріднених ліпідів у більшості тканин організму. Відкладення Сі З у першу чергу знаходять в ендотелії судин.

Прогресувальне ендотеліальне накопичення (ІЗ призводить до ішемії та інфаркту в органах, таких як нирка, серце або головний мозок, спричиняючи нестерпний біль, ниркову недостатність і серцеву та цереброваскулярну хворобу. Середня тривалість життя хворих на хворобу Фабрі, яких не лікували ферментнозамісною терапією, через ниркові, серцеві й/"або церебральні ускладнення судинної хвороби складає 50 років для чоловіків і 70 років для жінок (І ідоме 6ї аї.,

Зо ІЙ. У. Сіїп. Ргасі. 61:293-302, 2007).

Рекомбінантні білки для застосування у медичному лікуванні часто отримують методами клітинних культур, що передбачають застосування рідкого середовища, яке містить продукти крові (наприклад, сироватку крові відмінних від людини тварин). Забруднення фармацевтичних продуктів, що містять рекомбінантні білки, стало проблемою біотехнологічної індустрії (Мітв,

ВіоРгосевзвіпа у. 10:4-10, 2011; Ріамвіс єї а!ї., ВіоРгосев5іпа у. 9:6-12, 2011; Ріамвіс еї а!., Овєм. Віо!.

Зіапа 99:95- 109, 1999). Наприклад, присутність ряду різних вірусів в таких фармацевтичних продуктах, пояснюється, в деяких випадках, продуктом крові (наприклад, сироваткою крові відмінних від людини тварин), присутнім у рідкому середовищі, яке застосовують для культивування клітин, що продукують рекомбінантний білок. Приклади контамінантів, що були знайдені у культурах клітин з продукуванням рекомбінантного білка та які, як вважають, спричинені використанням продуктів тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин, або білки сироватки тварин), описані в даному документі.

Застосування безсироваткового середовища або середовища без продуктів тваринного походження у культурі клітин з продукуванням рекомбінантного білка є корисним, оскільки таке середовище для культивування є краще визначеним і спрощеним, має знижений ступінь контамінантів, усуває або знижує ризик забруднення або рівень контамінантів у культурі клітин з продукуванням рекомбінантного білка й призводить до більш низької вартості продукування рекомбінантного білка із застосуванням культури клітин.

Короткий опис винаходу

Даний винахід грунтується, щонайменше частково, на відкритті того, що білки (наприклад, ферменти, наприклад, с-галактозидаза-А) зі зміненим (наприклад, поліпшеним) профілем глікозилювання можуть бути отримані із застосуванням способів, описаних в даному документі.

Таким чином, в даному документі представлені білки са-галактозидази-А зі зниженою варіабельністю у глікоформах, зі зниженим ризиком або рівнем забруднення (наприклад, зниженим ризиком або рівнем вірусного забруднення) і/або зі зміненими та поліпшеними профілями глікозилювання (наприклад, у порівнянні з раніше виготовленими ферментами для ферментнозамісної терапії), фармацевтичні композиції і набори, що містять один або декілька з цих білків а-галактозидази-А (наприклад, фармацевтичні композиції що мають знижену варіабельність у глікоформах і/або знижений ризик або рівень забруднення (наприклад, 60 знижений ризик або рівень вірусного забруднення)), способи створення клітини ссавця,

застосовної для рекомбінантної експресії глікопротеїну (наприклад, а-галактозидази-А), способи отримання рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, а-галактозидази-А), способи лікування хвороби Фабрі й способи зниження рівня в сироватці крові глоботриаозилцераміду у суб'єкта, а також способи підвищення рівня а-галактозидази-А у лізосомі в клітині ссавця (наприклад, в клітині іп міо або в клітині у суб'єкта). Також представлені вектори експресії, що включають послідовність, яка кодує білки а-галактозидази-А.

В даному документі представлені рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини (ПАСА), що мають одну або обидві зі структурних ознак: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 1,595; і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6- фосфат-вмісні олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 995. Наприклад, білок ГНАСА за п. 1 може мати структурні ознаки: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 1,595; і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6б-фосфатні олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 995. За деякими варіантами здійснення білок "(ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 1,395 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 1,095, або від приблизно 0,195 до приблизно 0,795). За деякими варіантами здійснення білок

ІПАСАА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс- манозо-6б-фосфат-вмісні олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 8,595 (наприклад, більш ніж приблизно 9,095).

Білки птАСА, представлені в даному документі, можуть додатково мати одну або декілька зі структурних ознак, вибраних з групи: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 13,595; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 2, який становить більш ніж приблизно 2,095; і відношення моль/моль сіалової кислоти/білка, яке становить більш ніж приблизно 3,0.

Наприклад, білок "пАСА, представлений в даному документі, може додатково мати

Зо структурні ознаки: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 13,5905; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 2, який становить більш ніж приблизно 2,095; і відношення моль/моль сіалової кислоти/білка, яке становить більш ніж приблизно 3,0). За деякими варіантами здійснення білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 13,895 (наприклад, більш ніж приблизно 14,095). За деякими варіантами здійснення білок "ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 2, який становить більш ніж приблизно 495 (наприклад, більш ніж приблизно 695). За деякими варіантами здійснення білок гпПАСА має відношення моль/моль сіалової кислоти/білка, яке становить більш ніж приблизно 3,2 (наприклад, більш ніж приблизно 3,4).

Білки гпАСА, представлені в даному документі, можуть додатково мати одну або декілька структурних ознак, вибраних з групи: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 3,995; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 3,095; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 5,390; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 1, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 9,095; відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо- 6б-фосфат-вмісні олігосахариди, який становить від приблизно 195 до приблизно 7,095; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфосфорильовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 14,895; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 4,995; і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані й монофосфорильовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 8,295. Наприклад, білок ГПАСА, описаний в даному документі, може мати чотири або більше зі структурних ознак, бо вибраних з групи: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 3,995; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 3,095; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 5,395; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 1, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 9,095; відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-б-фосфат-вмісні олігосахариди, який становить від приблизно 195 до приблизно 7,095; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфосфорильовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 14,895; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 4,990; і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані й монофосфорильовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 8,295. За деякими варіантами здійснення білок "ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди, який становить від приблизно 0,195 до приблизно 3,095 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 2,095). За деякими варіантами здійснення білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, який становить від приблизно 1,095 до приблизно 2,095 (наприклад, від приблизно 1,595 до приблизно 2,095). За деякими варіантами здійснення білок "ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди, який становить від приблизно 3,095 до приблизно 5,095 (наприклад, від приблизно 4,095 до приблизно 5,095). За деякими варіантами здійснення білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 1, який становить від приблизно 0,595 до приблизно 8,095 (наприклад, від приблизно 0,595 до приблизно 5,095). За деякими варіантами здійснення білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6б-фосфат-вмісні олігосахариди, який становить від приблизно 495 до приблизно 6,995 (наприклад, від приблизно 595 до приблизно 6,895). За деякими варіантами здійснення білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфосфорильовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 1595 (наприклад, більш ніж приблизно 1695). За деякими варіантами здійснення білок ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 695. За деякими варіантами здійснення білок ГПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані й монофосфорильовані олігосахариди, який становить більш ніж приблизно 8,595 (наприклад, більш ніж приблизно 9,096).

Білки ПАСА, представлені в даному документі, можуть мати одну або обидві з наступних властивостей: (ї) підвищений ендоцитоз в клітині ссавця, що експресує білок-рецептор манозо- б-фосфату, у порівнянні з Рабгаггутеф і (ії) підвищену афінність до білка-рецептора манозо-6- фосфату, у порівнянні з РабгалутеФ. Наприклад, білки (АСА, представлені в даному документі, можуть мати (ї) підвищений ендоцитоз в клітині ссавця, що експресує білок-рецептор манозо-б-фосфату, у порівнянні з Рабгалгутеф і (її) підвищену афінність до білка- рецептора манозо-6-фосфату, у порівнянні з Габргагутеф)

Будь-який з білків "ПАСА, представлених у даному документі, можуть не мати детектований рівень або не мати білок, ліпід, вуглевод, нуклеїнову кислоту та контамінант (наприклад, будь- який з контамінантів, описаних у даному документі), присутні у продукті тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин або продукт крові тварин).

Будь-який з білків ГПАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок

ПАСА, продукований у культурі клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи безбілкового, безсироваткового та середовища з визначеним хімічним складом. Будь-який з білків ІПАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок ПАСА, продукований у культурі клітин, у якій використовували тільки безбілкове й/"або середовище з визначеним хімічним складом. Будь-який з білків ГПАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок гПАСА, продукований у культурі клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи, що складається з безбілкового, безсироваткового середовища з визначеним хімічним складом, та який виділяють із застосуванням інтегрованого та безперервного процесу. У деяких варіантах здійснення інтегрований та безперервний процес включає стадії: (а) забезпечення рідкого середовища для бо культивування, що містить білок ПАСА, представлений у даному документі, що практично не містить клітин, де рідке середовище для культивування подають у першу хроматографічну систему з кількома колонками (МСС51); (р) захоплення білка ПАСА у рідкому середовищі із застосуванням МСОС51, де елюат МСОСО1, що містить рекомбінантний терапевтичний білок, безперервно подають у другу хроматографічну систему з кількома колонками (МОО52); і (с) очищення та доочищення рекомбінантного терапевтичного білка із застосуванням МОС52, де елюат з МОС52 являє собою лікарську речовину ПАСА і де процес є інтегрованим та протікає безперервно з рідкого середовища для культивування у елюат з МСОС52, який являє собою лікарську речовину ПАСА. У деяких варіантах здійснення МОС51 і/або МОС52 виконують дві різні елементарні операції. У деяких варіантах здійснення застосування МОС51, або МСС52, або обох, передбачає перемикання колонок. У деяких варіантах здійснення МСОС51 виконує елементарні операції захоплення рекомбінантного білка та інактивації вірусів. У деяких варіантах здійснення МОС52 виконує елементарні операції очищення й доочищення рекомбінантного терапевтичного білка. У деяких варіантах здійснення у МСОС51 і/або МСС52 використовують щонайменше дві хроматографічні колонки. У деяких варіантах здійснення

МОС51 є першою періодичною протиточною хроматографічною системою (РСС5БІ), наприклад,

РОС51, що включає РОС5 з чотирма колонками. У деяких варіантах здійснення три з чотирьох колонок у РОС5 з чотирма колонками (у варіанті здійснення РОС5І1І) виконують елементарну операцію захоплення рекомбінантного терапевтичного білка з рідкого середовища для культивування. У деяких варіантах здійснення елюат, що містить білок ТАСА, представлений у даному документі, із трьох з чотирьох колонок з чотирма колонками РОСТІ (у варіанті здійснення

РОС5БІ) подають у четверту колонку РОС5 з чотирма колонками. У деяких варіантах здійснення четверта колонка РОС5 з чотирма колонками (у варіанті здійснення РОС51) виконує елементарну операцію інактивації вірусів шляхом утримування елюату, що містить рекомбінантний терапевтичний білок, при низькому рН для інактивації вірусів. У деяких варіантах здійснення передбачають регулювання рН елюату з четвертої колонки РОС з чотирма колонками із застосуванням поточного резервуару для регулювання буфера до того, як елюат з четвертої колонки РОС5 з чотирма колонками подають у РОС52. У деяких варіантах здійснення РОС52 містить хроматографічні колонки та хроматографічну мембрану. У деяких варіантах здійснення три хроматографічні колонки у РОС52 виконують елементарну операцію

Ко) очищення ПАСА, представленого у даному документі, з елюату РОС51 за допомогою катіон- або аніонобмінної хроматографії. У деяких варіантах здійснення елюат з трьох хроматографічних колонок у РОС52 подають на хроматографічну мембрану у РОС52. У деяких варіантах здійснення хроматографічна мембрана у РОС52 виконує елементарну операцію доочищення білка гпАСА, представленого у данному документі в елюаті з трьох хроматографічних колонок у РОС52, за допомогою катіон- або аніонобмінної хроматографії. У деяких варіантах здійснення хроматографічна мембрана у РОС52 виконує елементарну операцію доочищення шляхом катіонного обміну. У деяких варіантах здійснення потік крізь хроматографічну мембрану у РСОС52 та омивання її може виконувати лікарська речовина

ПАСА.

Також представлені фармацевтичні композиції, що містять будь-який білок ПАСА, описаний в даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. Наприклад, фармацевтична композиція може бути складена для внутрішньовенного, внутрішньоартеріального, внутрішньом'язового, внутрішньошкірного, підшкірного або внутрішньоперитонеального введення. За деякими варіантами здійснення фармацевтична композиція має концентрацію ПАСА від приблизно 4 мг/мл до приблизно б мг/мл (наприклад, приблизно 5 мг/мл). У деяких прикладах фармацевтична композиція є стерильним, ліофілізованим порошком. За деякими варіантами здійснення фармацевтично прийнятний носій може являти собою один або декілька засобів, вибраних з групи маніту, натрію фосфату одноосновного, моногідрату, натрію фосфату двохосновного й гептагідрату.

Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може не мати детектований рівень або не мати білок, ліпід, вуглевод, нуклеїнову кислоту та контамінант (наприклад, будь-який з контамінантів, описаних у даному документі), присутні у продукті тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин або продукт крові тварин).

Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може включати білок ТАСА, який продукується у культурі клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи безбілкового, безсироваткового і середовища з визначеним хімічним складом. Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може включати білок ПТтАСА, представлений у даному документі, який продукується у культурі бо клітин, у якій використовували тільки безбілююве середовище для культивування та/або середовище для культивування з визначеним хімічним складом. Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може містити білок "ПАСА, представлений у даному документі, який продукується культурою клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи середовищ для культивування: безбілкового, безсироваткового та з визначеним хімічним складом, та який виділяють із застосуванням інтегрованого і безперервного процесу (наприклад, із застосуванням будь-якого з ілюстративних інтегрованого та безперервного процесів, описаних у даному документі).

Також представлені вектори експресії, що містять послідовність, яка кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини; промоторну послідовність, функціонально пов'язану з 5'-кінцем послідовності, що кодує білок а-галактозидази-А людини; послідовність, що кодує пептид білка

СОр52 людини зі стартовим кодоном ТТИ, функціонально пов'язаним з 5'-кінцем послідовності, що кодує білок а-галактозидази-А людини; і послідовність, що кодує полі(А) сайт розпізнавання, функціонально пов'язаний з 3'-кінцем послідовності, що кодує білок с-галактозидази-А людини.

За деякими варіантами здійснення промоторна послідовність вибрана з групи промотора гроза хом'яка, промотора В-актину хом'яка й раннього промотора 5М40; і послідовністю, що кодує полі(А) сайт розпізнавання, є послідовність полі(А) сайта розпізнавання раннього 5У40. За деякими варіантами здійснення вектор експресії додатково містить послідовність, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки чи дигідрофолатредуктазу. За деякими варіантами здійснення 5-кінець послідовності що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки, функціонально пов'язаний з раннім промотором 5М40, а 3"-кінець послідовності, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки чи дигідрофолатредуктазу, функціонально пов'язаний з раннім інтроном 5М40 і полі (А) сигнальною послідовністю.

Також представлені способи створення лінії клітин ссавця, застосовної для рекомбінантної експресії глікопротеїну, що передбачають (а) забезпечення лінії залежних від сироватки крові іморталізованих клітин ссавця; (Б) послідовне культивування лінії клітин ссавця в: (1) середовищі для культивування клітин, що має першу концентрацію (1Х) сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів; (2) середовищі для культивування клітин, що має від приблизно 0,2Х до приблизно 0,3Х концентрацію сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів; і (3) середовищі для культивування клітин, що має від приблизно 0,01Х до приблизно 0,08Х сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів; (с) створення культур одноклітинних субклонів з культури після (Б); (а) відбір субклону з (с), що має прийнятні трансфекційну ефективність, клітинний ріст у безсироватковому середовищі для культур і рекомбінантну експресію білка; (4) культивування відібраного субклону з (а) у безбілюовому, безсироватковому середовищі з визначеним хімічним складом протягом від приблизно 5 днів до приблизно 30 днів (наприклад, від приблизно 5 днів до приблизно 25 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 20 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 15 днів або від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів); (е) створення культур одноклітинних субклонів з культури після (4) і () відбір субклону з (є), що має прийнятні трансфекційну ефективність, пікову щільність клітин, ростові властивості, об'ємну продуктивність (УРА) і профіль глікозилювання для глікопротеїну, де відібраний субклон з (ї) є застосовним для рекомбінантної експресії глікопротеїну. Також представлені способи створення лінії клітин ссавця, застосовної для рекомбінантної експресії глікопротеїну, що передбачають (а) одержання лінії залежних від сироватки крові іморталізованих клітин ссавця; (Б) послідовне культивування лінії клітин ссавця в: (1) середовищі для культивування клітин, що має першу концентрацію (1Х) сироватки крові тварин, протягом від приблизно 1 дня до приблизно 10 днів (наприклад, приблизно З дні); (2) середовищі для культивування клітин, що має від приблизно 0,2Х до приблизно 0,6Х концентрацію (наприклад, 0,5Х) сироватки крові тварин, протягом від приблизно 1 дня до приблизно 10 днів (наприклад, приблизно З дні); і (3) середовищі для культивування клітин, що має від ОХ до приблизно 0,10Х сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів (наприклад, приблизно 8 днів); (с) створення культур одноклітинних субклонів з культури після (Б); (4) відбір субклону з (с), що має прийнятні трансфекційну ефективність, клітинний ріст у безсироватковому середовищі для культивування і рекомбінантну експресію білка; (є) створення культур одноклітинних субклонів з відібраного субклону з (а); і (І) відбір субклону з (є), що має прийнятні трансфекційну ефективність, пікову щільність клітин, ростові властивості, об'ємну продуктивність (УРЕ) і рекомбінантну експресію білка, де відібраний субклон з (Її) є застосовним для рекомбінантної експресії глікопротеїну.

У деяких прикладах залежною від сироватки крові лінією іморталізованих клітин ссавця є лінія клітин яєчника китайського хом'ячка. За деякими варіантами здійснення залежна від сироватки крові лінія іморталізованих клітин ссавця ендогенно не експресує бо дигідрофолатредуктазу. За деякими варіантами здійснення відібраний субклон з (Її) зростає у суспензії. За деякими варіантами здійснення рекомбінантною експресією білка є експресія одного або обох з антитіла й ферменту (наприклад, білка а-галактозидази-А людини). Також представлені клітини ссавця, застосовні для рекомбінантної експресії глікопротеїну, отримані будь-яким із способів, представлених в даному документі.

Також представлені способи отримання рекомбінантного глікопротеїну, що передбачають забезпечення клітини ссавця, застосовної для рекомбінантної експресії глікопротеїну, отриманої будь-яким із способів, представлених в даному документі; введення в клітину вектора експресії, що містить послідовність, яка кодує глікопротеїн; культивування клітини у безсироватковому ростовому середовищі для для культивування в умовах, достатніх для продукування глікопротеїну; і збирання глікопротеїну з клітини або з ростового середовища для культивування. У деяких прикладах культивування здійснюють із застосуванням суспензійної культури клітин. За деякими варіантами здійснення культивування здійснюють із застосуванням біореактора. За деякими варіантами здійснення культивування здійснюють із застосуванням безбілкового, безсироваткового середовища з визначеним хімічним складом (наприклад, культивування клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) із застосуванням безбілкового, безсироваткового середовища з визначеним хімічним складом). За деякими варіантами здійснення клітина СНО оендогенно не експресує дигідрофолатредуктазу. За деякими варіантами здійснення рекомбінантним глікопротеїном є фермент (наприклад, білок а- галактозидази-А людини). За деякими варіантами здійснення послідовність, що кодує глікопротеїн, щонайменше на 9095 ідентична 5ЕО ІО МО: 1. За деякими варіантами здійснення вектор експресії додатково містить промоторну послідовність, функціонально пов'язану з 5'- кінцем послідовності, що кодує глікопротеїн; послідовність, яка кодує пептид білка СО52 людини зі стартовим кодоном ТТ, функціонально пов'язаним з 5'-кінцем послідовності, що кодує глікопротеїн; і послідовність, яка кодує полі (А) сайт розпізнавання, функціонально пов'язаний з 3'-кінцем послідовності, що кодує глікопротеїн. За деякими варіантами здійснення промоторна послідовність вибрана з групи, що складається з промотора гр521 хом'яка, промотора В-актину хом'яка й раннього промотора 5М40; і послідовністю, що кодує полі (А) сайт розпізнавання, є полі (А) сайт розпізнавання раннього 5У40. За деякими варіантами здійснення вектор експресії додатково містить послідовність, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки чи

Зо дигідрофолатредуктазу. За деякими варіантами здійснення 5'-кінець послідовності, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки чи дигідрофолатредуктазу, функціонально пов'язаний з раннім промотором 5М40, а 3'-кінець послідовності, яка кодує глутамінсинтетазу людини або собаки чи дигідрофолатредуктазу, функціонально пов'язаний з раннім інтроном 5М40 і полі(А) сигнальною послідовністю. У деяких прикладах глікопротеїн збирають з клітини. У деяких прикладах глікопротеїн збирають з середовища для культивування клітин. Також представлені рекомбінантні глікопротеїни (наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини), отримані будь-яким із способів, представлених в даному документі. Також представлені фармацевтичні композиції, що містять рекомбінантний глікопротеїн, отриманий будь-яким із способів, представлених в даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. Наприклад, фармацевтична композиція може бути складена для внутрішньовенного, внутрішньоартеріального, внутрішньом'язового, внутрішньошкірного, підшкірного або внутрішньоперитонеального введення. За деякими варіантами здійснення глікопротеїном є рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, і фармацевтична композиція містить концентрацію від приблизно 4 мг/мл до приблизно 6 мг/мл (наприклад, приблизно 5 мг/мл) рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини. За деякими варіантами здійснення фармацевтична композиція є стерильним, ліофілізованим порошком.

Також представлені способи лікування хвороби Фабрі у суб'єкта. що передбачають введення суб'єкту з хворобою Фабрі терапевтично ефективної кількості будь-якого з рекомбінантних білків а-галактозидази-А людини (гППАСА), представлених в даному документі.

За деякими варіантами здійснення введенням є системне введення (наприклад, внутрішньовенне введення). За деякими варіантами здійснення суб'єкту вводять (ПАСА у дозі від приблизно 0,5 мг/кг ваги тіла до приблизно 2,0 мг/кг ваги тіла (наприклад, приблизно 1,0 мг/кг ваги тіла). За деякими варіантами здійснення суб'єкту вводять дві або більше доз білка

ІПАСА. Наприклад, щонайменше дві або більше доз білка ПАСА можуть бути введені з інтервалом приблизно два тижні. Деякі варіанти здійснення додатково передбачають введення суб'єкту одного або декількох додаткових терапевтичних засобів, вибраних з групи анальгетиків, антикоагулянтів, інгібіторів ацетилхолінестерази, В-блокаторів та інгібіторів глюкозилцерамідсинтази. За деякими варіантами здійснення суб'єктом є суб'єкт-людина. За деякими варіантами здійснення у суб'єкта було діагностовано хворобу Фабрі. бо Також представлені способи підвищення рівня білка а-галактозидази-А у лізосомі в клітині ссавця, що передбачають введення у контакт клітини ссавця з ефективною кількістю будь-якого з рекомбінантних білків а-галактозидази-А людини (ПАСА), представлених в даному документі.

За деякими варіантами здійснення клітина знаходиться іп мік (наприклад, клітина людини іп міо). За деякими варіантами здійснення клітина знаходиться в суб'єкті (наприклад, в людині).

За деякими варіантами здійснення у суб'єкта було діагностовано хворобу Фабрі. У деяких прикладах введення у контакт здійснюють шляхом системного введення ПАСА суб'єкту.

Наприклад, системним введенням може бути внутрішньовенне введення. За деякими варіантами здійснення суб'єкту вводять (ПАСА у дозі від приблизно 0,5 мг/кг ваги тіла до приблизно 2,0 мг/кг ваги тіла (наприклад, приблизно 1,0 мг/кг ваги тіла). За деякими варіантами здійснення суб'єкту вводять дві або більше доз білка ППАСА. Наприклад, щонайменше дві з двох або більше доз білка ПАСА можуть бути введені з інтервалом приблизно два тижні.

Також представлені способи зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта, що передбачають введення суб'єкту, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості будь-якого з рекомбінантних білків с-галактозидази-А людини (ПАСА), представлених в даному документі. За деякими варіантами здійснення суб'єкт має рівень глоботриаозилцераміду в сироватці крові більш ніж 8 мкг/мл. У деяких прикладах у суб'єкта було діагностовано хворобу Фабрі. За деякими варіантами здійснення введенням є системне введення (наприклад, внутрішньовенне введення). За деякими варіантами здійснення суб'єкту вводять ПАСА у дозі від приблизно 0,5 мг/кг ваги тіла до приблизно 2,0 мг/кг ваги тіла (наприклад, приблизно 1,0 мг/кг ваги тіла). За деякими варіантами здійснення суб'єкту можуть бути введені дві або більше доз білка ІПАСА. Наприклад, щонайменше дві з двох або більше доз білка ПАСА можуть бути введені з інтервалом приблизно два тижні. Деякі варіанти здійснення додатково передбачають введення суб'єкту одного або декількох додаткових терапевтичних засобів, вибраних з групи анальгетиків, антикоагулянтів, інгібіторів ацетилхолінестерази, В-блокаторів та інгібіторів глюкозилцерамідсинтази. За деякими варіантами здійснення суб'єктом є людина.

Термін "виділений" відноситься до молекули, яку відділяють щонайменше від одного контамінанта (наприклад, білка, нуклеїнової кислоти, ліпіду чи вуглеводу або їх комбінації). В необмежувальних прикладах виділений білок са-галактозидази-А або інший глікопротеїн є

Зо чистим щонайменше на 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 за вагою.

Термін "рідке середовище для культивування" означає рідину, що містить достатні поживні речовини для забезпечення росту або проліферації клітини ссавця іп міг. Наприклад, рідке середовище для культивування може містити одне або декілька з амінокислот (наприклад, 20 амінокислот), пурину (наприклад, гіпоксантину), піримідину (наприклад, тимідину), холіну, інозитолу, тіаміну, фолієвої кислоти, біотину, кальцію, ніацинаміду, піридоксину, рибофлавіну, тимідину, ціанокобаламіну, пірувату, ліпоєвої кислоти, магнію, глюкози, натрію, калію, заліза, міді, цинку й натрію бікарбонату. За деякими варіантами здійснення рідке середовище для культивування може містити сироватку крові ссавця. За деякими варіантами здійснення рідке середовище для культивування не містить сироватку крові або іншій екстракт з ссавця (визначене рідке середовище для культивування). За деякими варіантами здійснення рідке середовище для культивування може містити слідові метали, гормон росту ссавця, і/або фактор росту ссавця. Іншим прикладом рідкого середовища для культивування є мінімальне середовище (наприклад, середовище, що включає лише неорганічні солі, джерело вуглецю й воду). Необмежувальні приклади рідкого середовища для культивування описані в даному документі. З рівня техніки відомі й комерційно доступні додаткові приклади рідкого середовища для культивування. Рідке середовище для культивування може мати будь-яку щільність клітин ссавця. Наприклад, як застосовується в даному документі, об'єм рідкого середовища для культивування, видаленого з біореактора, може практично не містити клітин ссавця.

Термін "безсироваткове рідке середовище для культивування" означає рідке середовище для культивування, що не містить сироватку крові ссавця.

Термін "рідке середовище для культивування, що містить сироватку крові" означає рідке середовище для культивування, що включає сироватку крові ссавця.

Термін "середовище для культивування з визначеним хімічним складом" є терміном з рівня техніки й означає рідке середовище для культивування, у якому всі з хімічних компонентів відомі. Наприклад, середовище для культивування з визначеним хімічним складом не містить фетальну бичачу сироватку крові, бичачий сироватковий альбумін або сироватковий альбумін людини, оскільки ці препарати зазвичай містять комплексну суміш альбумінів і ліпідів.

Термін "безбілкове рідке середовище для культивування" означає рідке середовище для бо культивування, що не містить ніякого білка (наприклад, будь-якого виявлюваного білка).

Термін "Інтегрований процес" означає процес, здійснений із застосуванням структурних елементів, які функціонують спільно з досягненням певного результату (наприклад, створення терапевтичної білкової лікарської речовини (наприклад, що містить рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини) з рідкого середовища для культивування).

Термін "безперервний процес" означає процес, при якому безперервно подається рідина крізь щонайменше частину системи для отримання лікарської речовини (наприклад, лікарської речовини, що містить рекомбінантний білок) з середовища для культивування, що містять рекомбінантний білок (наприклад, будь-який з рекомбінантних білків, описаних в даному документі). Наприклад, рідке середовище для культивування, що містить рекомбінантний терапевтичний білок (наприклад, рекомбінантний білок са-галактозидази-А людини), безперервно подають до системи, доки вона функціонує, а терапевтичну білкову лікарську речовину вилучають з системи. Необмежувальні приклади таких систем, які можуть бути застосовані для здійснення безперервного процесу, описані в попередніх заявках на патенти

США Мо 61/856930 і 61/775060.

Термін "хроматографічна система с кількома колонками" або "МСОС5" означає систему з двох або більше взаємоз'єднаних або перемикних хроматографічних колонок і/або хроматографічних мембран. Однією типовою хроматографічною системою с кількома колонками є періодична протиструминна хроматографічна система (РОСС), що містить дві або більше взаємоз'єднаних або перемикних хроматографічних колонки й/або хроматографічних мембрани. З рівня техніки відомі додаткові приклади хроматографічної системи с кількома колонками. Термін "секретований білок" або "секретований рекомбінантний білок" відомий з рівня техніки й означає білок (наприклад, рекомбінантний білок), який секретується, щонайменше частково, з клітини ссавця у щонайменше міжклітинний простір (наприклад, у рідке середовище для культивування). Фахівцям буде зрозуміло, що "секретований" білок не повинен повністю дісоціювати з клітини, щоб вважатися секретованим білком.

Термін "перфузійне культивування" означає культивування великої кількості клітин (наприклад, клітин ссавця) у першому рідкому середовищі для культивування, де культивування передбачає періодичне або безперервне вилучення першого рідкого середовища для культивування й у той самий час або невдовзі після додавання практично того самого об'єму другого рідкого середовища для культивування до контейнера (наприклад, біореактора).. У деяких прикладах передбачається покрокова заміна (наприклад, з підвищенням або зниженням) об'єму першого рідкого середовища для культивування, вилученого й доданого протягом покрокових періодів (наприклад, приблизно 24-годинний період, період від приблизно 1 хвилини до приблизно 24 годин або період більш ніж 24 години) протягом періоду культивування (наприклад, частота повторного подавання середовища для культивування на щоденній основі).

Фракція середовища, що вилучається й заміщується кожен день, може варіювати в залежності від конкретних клітин, що підлягають культивуванню, щільності початкового висівання й щільності клітин на конкретний момент часу. "НМ" або "реакторний об'єм" означає об'єм середовища для культивування, наявного на початок процесу культивування (наприклад, загальний об'єм середовища для культивування, наявного після висівання). Біореактори, які можуть бути застосовані для здійснення перфузійного культивування відомі з рівня техніки.

Фахівцю буде зрозуміло, що біореактор може бути пристосований для застосування при перфузійному культивуванні (наприклад, пристосований як перфузійний біореактор).

Термін "культивування з підживленням" є терміном з рівня техніки й означає культивування великої кількості клітин (наприклад, клітин ссавця) у першому рідкому середовищі для культивування, де культивування клітин, присутніх у контейнері (наприклад, біореакторі) передбачає періодичне або безперервне додавання другого рідкого середовища для культивування до першого рідкого середовища для культивування без суттєвого або значного вилучення першого рідкого середовища для культивування або другого рідкого середовища для культивування з культури клітин. Друге рідке середовище для культивування може бути таким самим, що і перше рідке середовище для культивування. У деяких прикладах культури з підживленням другим рідким середовищем для культивування є концентрована форма першого рідкого середовища для культивування. У деяких прикладах культури з підживленням друге рідке середовище для культивування додають у вигляді сухого порошку. Фахівцю буде зрозуміло, що біореактор може бути пристосований для застосування при культивуванні з підживленням (наприклад, пристосований як біореактор з підживленням). "Питома продуктивність" або "ЗРА" є терміном з рівня техніки та, як застосовується в даному документі, відноситься до маси або ферментативної активності рекомбінантного терапевтичного білка, отриманого на клітину ссавця на добу. З5РА для рекомбінантного бо терапевтичного антитіла зазвичай вимірюють як масу/клітина/доба. 5РА для рекомбінантного терапевтичного ферменту зазвичай вимірюють як одиниці/клітина/доба або (одиниці/маса)/клітина/доба. "Об'ємна продуктивність" або "МРА" є терміном з рівня техніки та, як застосовується в даному документі, відноситься до маси або ферментативної активності рекомбінантного терапевтичного білка, отриманого на об'єм культури (наприклад, на л об'єму біореактора, посудини або пробірки) на добу. МРА для рекомбінантного терапевтичного антитіла зазвичай вимірюють як масу/л/доба. МРА для рекомбінантного терапевтичного ферменту зазвичай вимірюють як одиниці/л/доба або маса/л/доба.

Якщо не визначено інше, усі технічні й наукові терміни, застосовувані в даному документі, мають те саме значення, що і загально зрозумілі пересічному фахівцеві в даній галузі, до якої належить даний винахід. В даному документі описані способи й матеріали для застосування у даному винаході; інші придатні способи й матеріали, відомі з рівня техніки, також можуть бути застосовані. Матеріали, способи й приклади є лише ілюстративними та не призначені для обмежування. Усі публікації, патенті заявки, патенти, переліки послідовностей, значення з баз даних та інші посилання, згадані в даному документі, включені шляхом посилання в усій своїй повноті. У випадку конфлікту контролем буде даний опис, у тому числі визначення.

Подробиці одного або декількох варіантів здійснення даного винаходу викладені у прикладених графічних матеріалах і нижченаведеному описі. Інші ознаки, цілі й переваги даного винаходу стануть зрозумілі з даного опису, графічних матеріалів і з формули винаходу.

Опис графічних матеріалів

На фігурі 1 представлений перелік лізосомних хвороб накопичення й відповідний ферментний дефект для кожної хвороби.

На фігурі 2 представлена послідовність КДНК, що кодує білок-попередник а-галактозидази-А людини та амінокислотна послідовність білка-попередника а-галактозидази-А людини (5ЕО ІЮ

МО: 1 і 2, відповідно), і амінокислотна послідовність зрілого білка с-галактозидази-А людини (ЗЕО ІО МО: 3).

На фігурі З представлена мапа вектора ра7629-2а17, що включає послідовність КДНК, яка кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини (20Е2).

На фігурі 4 представлена мапа вектора, який можна застосовувати для експресії

Ко) рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини.

На фігурі 5 представлена блок-схема, що показує стадії, застосовні для створення батьківської лінії клітин, оптимізованої для експресії рекомбінантного глікопротеїну.

На фігурі 6 представлена хроматограма, що показує елюювання ЕРабгагутеф і Неріада!є з колонки вилучення за розміром.

На фігурі 7А представлений профіль час-пролітної мас-спектрометрії з лазерною іонізацією й десорбцією з рідкої матриці для відношення маси до заряду (МАГ0І-ТОЕЄ М5) для

Еабгагутеф)

На фігурі 7В представлений профіль мас-спектрометрії МА! ТІ-ТОЕ М5 для Веріада!ю.

На фігурі 8 представлений ряд з трьох профілів мас-спектрометрії МАГ 0І-ТОЕ для відношення маси до заряду для Рабгагутеф (верхня частина) і для рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Б2201) (середня й нижня частини).

На фігурі 9 представлене зображення поліакриламідного гелю з додецил-сульфатом натрію для Рабгагутеф і Неріада.

На фігурі 10 представлений типовий профіль хроматографічного елюювання М-зв'язаних олігосахаридів, дериватизованих 2-антраніловою кислотою (АА- мічених), що демонструє структури М-зв'язаного олігосахариду(ів), що відповідають кожному піку. На вставці показані дві структури трьохрозгалуженого трисіалільованого олігосахариду, де одна з двох структур відповідає піку б (форма 1), а інша з двох структур відповідає піку 6" (форма 2) у профілі хроматографічного елюювання М-зв'язаних олігосахаридів, дериватизованих з 2-АА.

На фігурі 11 представлений профіль хроматографічного елюювання АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів з Раргагутеф (блакитний) і Веріада!Ф (червоний).

На фігурі 12 представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (пік 1), моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (пік 2), моносіалільовані олігосахариди (пік 3), бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (пік 4), бісіалільовані олігосахариди (пік 5), трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди (форма 1; пік 6), трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди (форма 2; пік 6), манозо-б-фосфат-вмісні олігосахариди (пік 7), монофосфорильовані олігосахариди (пік 8), тетрасіалільовані олігосахариди (пік 9), моносіалільовані й бо монофосфорильовані олігосахариди (пік 10) і біс-манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (пік 11)

(зліва на право) у РабгагутеФ (лівий стовпчик у кожній групі з двох стовпчиків) і Неріаданю (правий стовпчик у кожній групі з двох стовпчиків).

На фігурі 13 представлений графік, що демонструє розподілення /М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку Абзп108 у РабгагутеФф і Неріада!Ф, як визначено аналізом | СМ5 кожного ферментативно розщепленого білка.

На фігурі 14 представлений графік, що демонструє розподілення /М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку А5п161 у РабгагутеФф і Неріада!Ф, як визначено аналізом | СМ5 кожного ферментативно розщепленого білка.

На фігурі 15 представлений графік, що демонструє розподілення /М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку А5п184 у РабгагутеФф і Неріада!Ф, як визначено аналізом | СМ5 кожного ферментативно розщепленого білка.

На фігурі 16 представлений графік, що демонструє розподілення /М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку Азп108 у БРабгалутеФ і Е720, як визначено аналізом ЇСМ5 кожного ферментативно розщепленого білка. На фігурі 17 представлений типовий графік, що демонструє структуру М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх у кожному піку згідно з аналізом ІСМ5 М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку Азп108 у Рабгагутеф і Е72а.

На фігурі 18 представлений графік, що демонструє розподілення /М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку Азп1і61 у ЕРабгалутеФ і Е720, як визначено аналізом | СМ5 кожного ферментативно розщепленого білка.

На фігурі 19 представлений графік, що демонструє розподілення /М-зв'язаних олігосахаридів, присутніх на амінокислотному залишку Азп184 у БРабгалутеФ і Е720, як визначено аналізом | СМ5 кожного ферментативно розщепленого білка.

На фігурі 20 представлений профіль хроматографічного елюювання АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів з ЕРабгалутефФ і рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е220).

На фігурі 21А представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (пік 1), у

ЕабгагутеФ й у рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному

Зо документі (БЕ220), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 218 представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою моносіалільовані безфукозні олігосахариди, у

ЕабгагутеФф й у рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Б220), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 210 представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою моносіалільовані фукозо- вмісні олігосахариди (пік 2), у Габга7гутеф (Е2) й у рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2722), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 22А представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою бісіалільовані фукозо- вмісні олігосахариди (пік 4), у Рабгагутеф (Е/7) й у рекомбінантного білка с- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2722), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 228 представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою бісіалільовані фукозо- вмісні олігосахариди (пік 5), у Рабгаултеф (Е/7) й у рекомбінантного білка с- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2722), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 22С представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди (форма 1; пік 6), у РабгаултефФ (Е7) й у рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в данному документі (Е222), як визначено хроматографічним аналізом АА- мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 23А представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди (форма 2; пік Є), у РабгаултефФ (Е7) й у рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, бо представленого в даному документі (Е2201), як визначено хроматографічним аналізом АА-

мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 238 представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (пік 7), у

ЕабгаултеФ (Б) й у рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2722), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 23С представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою монофосфорильовані олігосахариди (пік 8), у

На фігурі 24А представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (пік 9), у

На фігурі 248 представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою моносіалільовані й монофосфорильовані олігосахариди (пік 10), у Рабгаултеф (Е7) та у рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2201), як визначено хроматографічним аналізом АА- мічених М- зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 24С представлений графік, що демонструє відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють собою біс-манозо-6-фосфат- вмісні олігосахариди (пік 11), у ЕРабгаултефФ (Б) й у рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2722), як визначено хроматографічним аналізом АА-мічених М-зв'язаних олігосахаридів.

На фігурі 25А представлений графік, що демонструє відношення моль/моль манозо-6- фосфату до білка (верхня частина) для РабгалутетФ (БЕ) і рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е220).

Зо На фігурі 258 представлений графік, що демонструє відношення моль/моль М- ацетилнейрамінової кислоти (МАМА) до білка для Рабгагутеф (Е7) і рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в данному документі (Е272С).

На фігурі 26 представлений графік, що демонструє отримані за допомогою поверхневого плазмонного резонанса (Віасогє) незалежного від розчинних катіонів зв'язування манозо-6- фосфатного рецептора для Рабгалгутеф (ГЕ) (червоний) і Неріада!ю (зелений).

На фігурі 27 представлений графік, що демонструє отримані за допомогою поверхневого плазмонного резонанса (Віасогє) незалежного від розчинних катіонів зв'язування манозо-6- фосфатного рецептора для Рабгалгутеф (ГЕ) (червоний) і Неріада!ю (зелений).

На фігурі 28 представлений графік, що демонструє відносне незалежне від розчинних катіонів зв'язування манозо-б6-фосфатного рецептора Рабгалгутеф (ГЕ) і рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Б220), як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонанса (Віасоге).

На фігурі 29 представлений графік, що демонструє відносний відсотковий вміст для

ЕабгагутетФ (БЕ) і Веріадак, елюйованих з афінної колонки з манозо-6- фосфатним рецептором, з підвищеними концентраціями манозо-б-фосфату.

На фігурі 30 представлений графік, що демонструє відносний відсотковий вміст для

Еабгагутеф (ГЕ) і рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2201), елюйованих з афінної колонки з манозо-б6-фосфатним рецептором, з підвищеними концентраціями манозо-6- фосфату.

На фігурі 31 представлено профіль піків зображення капілярного ізоелектричного фокусування (ісІЕЕ) для Рабгагутеф і Неріада!Ф).

На фігурі З2А представлений графік, що демонструє відсоток для РабгагутеФ (ЕД) і рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е22С), що присутній у піках 1-5 сПЕР.

На фігурі 328 представлений графік, що демонструє відсоток для РабгагутеФ (ЕД) і рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е22С), що присутній у піках 6-11 сіїТЕРЕ.

На фігурі 32С представлений графік, що демонструє відсоток для РабгагутефФ (ЕЛ) і рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е22С), бо що присутній у піках 12-14 сПЕР.

На фігурі 33 представлено графік Кт для РабгалутеФ (Е7) і рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (БЕ220), визначений (із застосуванням синтетичного субстрату рМР.

На фігурі 34 представлено графік Мтах для Рабгалутеф (Е7) і рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (БЕ220), визначений (із застосуванням синтетичного субстрату рМР.

На фігурі 35 представлено профіль елюювання для ЕРабгалутеФ (блакитний) і Веріада!(Фф (зелений) з колонки зворотно-фазової високо ефективної рідинної хроматографії (АР-НРІ С).

На фігурі 36 представлений графік, що демонструє кількість СІ З у тканині печінки (нг СІ З/мг тканини печінки) на моделі миші Еабгу через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 0,1 мг/кг Рабгалгуте?бФ або через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 0,1 мг/кг рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2202), або на моделі миші Раргу з внутрішньовенним введенням одноразової дози носія. Один зразок вилучали з аналізу, оскільки його вважали випадним згідно критерію Граббса (р « 0,01) (група позначена як "а" на графіку).

На фігурі 37 представлений графік, що демонструє кількість (3! З в тканині селезінки (нг

СІ З/мг тканини селезінки) на моделі миші Рабгу через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 0,1 мг/кг РабргалутетбФ або через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 0,1 мг/кг рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2202), або на моделі миші Раргу з внутрішньовенним введенням одноразової дози носія.

На фігурі 38 представлений графік, що демонструє кількість СІ З в тканині серця (нг СІ З/мг тканини серця) на моделі миші Раргу через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 1,0 мг/кг РабгалутетбФ або через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 1,0 мг/кг рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2202), або на моделі миші Раргу з внутрішньовенним введенням одноразової дози носія.

На фігурі 39 представлений графік, що демонструє кількість СІ З на тканині нирки (нг СІ З/мг тканини нирки) на моделі миші Еабгу через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 1,0 мг/кг РабгалгутетбФ або через З дні або 14 днів після одноразового внутрішньовенного введення 1,0 мг/кг рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е2202), або на моделі миші Раргу з внутрішньовенним введенням одноразової дози носія.

На фігурі 40 представлений графік, що демонструє ферментну активність в залежності від часу на моделі миші Рабгу після одноразового внутрішньовенного введення 1 мг/кг Рабгагутет (кружки; 5 мишей на кожну точку часу) або 1 мг/кг рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в данному документі (квадратики; 8 мишей на кожну точку часу).

Докладний опис

В даному документі представлені рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, що має змінений профіль глікозилювання у порівнянні з РабгагутеФф), і композиції, фармацевтичні композиції й набори, що містять щонайменше один з рекомбінантних білків а-галактозидази-А людини. В даному винаході представлені рекомбінантні глікопротеїни й композиції, що містять представлені в даному винаході рекомбінантні глікопротеїни, що мають, наприклад, наступні вигідні якості: меншу варіабельність у глікоформах і більш низький ризик або рівень забруднення (наприклад, більш низький ризик або рівень вірусного забруднення). Представлені в даному винаході рекомбінантні глікопротеїни також можуть мати одну або декілька з наступних необмежувальних переваг: знижене неспецифічне націлювання на печінку (шляхом зв'язування з асіалоглікопротеїновим рецептором, експресованим на поверхні гепатоцитів після введення рекомбінантного глікопротеїну суб'єкту, наприклад, суб'єкту-людині), підвищена швидкість ендоцитозу рекомбінантного глікопротеїну в клітині ссавця (наприклад, клітині людини), що експресує білок- рецептор манозо-б6-фосфату на своїй поверхні, підвищена афінність до білка- рецептора манозо-6-фосфату, підвищений період напіввиведення сироватки крові й знижена ефективна доза, у будь-якій комбінації, у порівнянні з РабгагутефФ. Також представлені способи створення клітини ссавця, застосовної для рекомбінантної експресії рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, білка а-галактозидази-А людини), і способи отримання рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, білка с-галактозидази-А людини). Також представлені способи лікування хвороби Фабрі, способи зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта й способи підвищення рівня с-галактозидази-

А в лізосомі в клітині ссавця (наприклад, в клітині іп міо або в клітині у суб'єкта). Також 60 представлені вектори експресії, що включають послідовність, яка кодує білок а-галактозидази-А людини.

Альфа-галактозидаза-А а-галактозидаза-А людини (а-О-галактозидгалактогідролаза; а-гал-А; ЕС 3.2.1.22) являє собою лізосомну екзоглікозидазу, що кодується геном на Хд22. Зріла с-галактозидаза-А людини являє собою гомодимер, що складається з двох нековалентно зв'язаних субодиниць з 398 амінокислот (близько 51 КО), кожна з яких містить активний сайт і можливих три М-зв'язаних сайта глікозилювання (М139, М192 і М215). Активний сайт білка а-галактозидази-А має два залишки аспарагінової кислоти (0170 ї 0231), що є важливими для каталітичної активності.

Тривимірна кристалічна структура білка а-галактозидази-А була опублікована у 1996 р. (Мипіег-

І ентапп 6ї аї., у. Віої. Спет. 271:15166-15174, 1996). Альфа-галактозидаза-А каталізує гідроліз глоботриаозилцераміду (СІ -3) та інших нейтральних глікосфінголіпідів з кінцевим а-галактилом, таких як галабіозилцерамід і речовини крові групи В, до цераміддигексодзилу й галактози.

Специфічна активність рекомбінантної форми а-галактозидази-А може бути протестована із застосуванням синтетичного субстрату, наприклад, р-нітрофеніл-4-Ю-галактопіранозиду (рМР).

Глікозилювання білка с-галактозидази-А людини забезпечує можливість його націлювання на лізосому у клітинах людини. Короткий опис клітинних шляхів, застосовуваних для глікозилювання білка а-галактозидази-А людини та інших глікопротеїнів людини, представлений нижче.

Білок а-галактгозидаза-А людини синтезується у ендоплазматичному ретикулумі. Після синтезу кожний мономер білка са-галактозидази-А людини підлягає післятрансляційній модифікації в апараті Гольджи. Як відмічено вище, кожний мономер білка а-галактозидази-А людини має три можливих сайта М-глікозилювання (М139, М192 і М215). Існує декілька фізіологічних глікоформ білка а- галактозидази-А людини. Залишок М139 з'єднує комплексні вуглеводи, тоді як залишки М192 ії М215 з'єднують олігосахариди, багаті на манозу й через це залучені до націлювання ферменту для поглинання ліпосомою. Після синтезу в ендоплазматичному ретикулумі попередники лізосомних ферментів переносяться до апарату

Гольджи. Післятрансляційні модифікації та, зокрема, додавання залишків манозо-6-фосфату (МбР), відбувається в цис-Гольджи. Комплекс МбР-фермент зв'язується з рецептором МбР і вивільняється із сітки транс-Гольджи, З якої він транспортується до

Зо прелізосомних/ендосомальних компартментів. При потраплянні в ендосомний компартмент кислотний рН спричиняє дисоціацію ферменту від його рецептора. Потім він піддається дефосфорилюванню з утворенням зрілого й функціонального ферменту. Потім рецептор повертається до трано-Гольджи для залучення інших ферментів або переміщується до плазматичної мембрани, де він може збирати ендогенний фермент (51у єї аї., у). СеїЇ Віоспет. 18:67-85, 1982; НеїІепішз єї а!., Апп. Нем. Віоспет. 32:1-100, 1997).

Біосинтез усіх еукаріотичних М-гліканів починається на цитоплазматичній зовнішній поверхні мембрани ендоплазматичного ретикулуму (ЕК) з перенесенням СісМАс-Р від ООР-СІСМАс до ліпід-подібного попередника доліхолфосфат (ОоІ-Р) зі створенням доліхолпірофосфат-М- ацетилглюкозаміну (ОоІ-Р-Р-СІсМАс). Чотирнадцять цукрів послідовно додаються до ЮоІ-Р для отримання глікану СісзМапосісМАс2 перед перенесенням повного глікану до аспарагіну в послідовності Авп-Х-5ег/ТНг у білку в ЕВ за допомогою білка олігосахарилтрансферази. Потім зв'язаний з білком М-глікан ремоделюється в ЕК і апараті Гольджи за допомогою складних серій реакцій, каталізованих зв'язаними з мембраною глікозидазами й глікозилтрансферазами. Після ковалентного приєднання 14-цукрових олігоманозогліканів до Авп-Х-бег/ТНг серії реакцій застосовуються для вилучення трьох цукрів з С1ісзМапеосісМАсг в ЕВ. Такі стадії обрізання зберігаються в усіх еукаріот. Обрізання СісзМапесісМАсг починається з послідовного вилучення глюкозних залишків а-глікозидазами І і Ії. Обидві глюкозидази функціонують у просвіті ЕН, при цьому а-глікозидаза І діє на кінцевий «1-2СдіІс, а с-глюкозидаза ІІ потім вилучає два внутрішніх залишки а1-3С1Ісє. Перед виходом з ЕК багато глікопротеїнів піддаються дії «-манозидази | ЕВ, яка специфічно вилучає кінцевий а1-2Мап з центрального плеча МапосісМАсг з утворенням ізомеру МапевсІсМАс». Більшість глікопротеїнів, що виходять з ЕН, на шляху до апарата Гольджи мають М-глікани з вісьма або дев'ятьма залишками манози (в залежності від того, чи піддаються вони дії ос-манозидази | ЕН). Для більшості глікопротеїнів додаткові залишки манози вилучаються в цис-компартменти апарата Гольджи, доки не створиться МапосісМАс».

Біосинтез гібридних і комплексних М-гліканів ініціюється в середній частині апарата Гольджи за допомогою дії М-ацетилглюкозамінілтрансферази, яку називають СИіСМАстТ-1. СісМАст-1 додає М-ацетил-глюкозаміновий залишок до С-2 манози а1-3 у ядрі Мап5СіІсМАсг, яка запускає першу партію М-глікану. Як тільки відбувається ця стадія, більша частина М-гліканів обрізується а-манозидазою ІІ, яка вилучає кінцеві залишки «1-3Мап і а1-6Мап з СсісМАсМапосісМАсе» з 60 утворенням СісМАсМапзсісМАс». Після вилучення двох залишків манози другий /-М-

ацетилглюкозамін додається до (0-2 манози «а1-6 за допомогою СіІСМАстТ-ІІ з утворенням попередника для усіх дворозгалужених комплексних М-гліканів. Отриманий глікан має два виступи або гілки, що утворилися через додавання кінцевих залишків М-ацетилглюкозаміну.

Додаткові гілки можуть бути утворені на 0-4 манозі а1-3 ядра (за допомогою СісСМАСТ-ІМ) і 0-6 манозі «1-6 ядра (за допомогою СІСМАсСТтТ-У) з утворенням три- і тетрарозгалужених М-гліканів.

Інший фермент, кінцевий СІУМАст-ІХ або СсісМАст-Ур, каталізує ту саму реакцію, що ї СІСМАст-

М в 0-6 манозі «1-6 ядра, але на відміну від СІСМАстТ-М СпіпМАстТ-ІХ//Ь також може переносити

М-ацетилглюкозамін до С-6 манози а1-3 ядра. Інша гілка може бути створена на 0-4 манозі «1-3 ядра за допомогою СісМАст-МіІ.

Комплексні й гібридні М-глікани можуть нести розгалужувальний залишок М- ацетилглюкозаміну, що приєднується до ВД-манози ядра за допомогою СИіСМАсСтТ-П. Бі-, три- й тетрарозгалужені комплексні М-глікани з розгалужувальним М-ацетилглюкозаміном синтезуються, коли (3ІСМАсСтТ-ПШ діє після а-манозидази ЇЇ і створення гілок за допомогою

СіСМАсТт-ї, сІСМАсСТтТ-ІМ і СіСМАсТтТ-У.

Додавання додаткових цукрів, що в основному відбувається у апараті транс-Гольджи, перетворює гібридні й розгалужені М-глікани на велику групу зрілих комплексних М-гліканів.

Цукри можуть бути додані до ядра, розгалужувальні залишки М-ацетилглюкозаміну можуть бути подовжені додаванням цукрів, а подовжені гілки можуть бути кеповані або оброблені.

Наприклад, продуктом С1ІСМАстТ- є дворозгалужений М-глікан, який може бути подовжений додаванням фукози, галактози й сіалової кислоти зі створенням комплексного М-глікану з двома гілками. Комплексні М-глікани можуть мати, наприклад, багато додаткових цукрів, в тому числі приєднаних до ядра М-глікану, додаткові гілки, гілки, подовжені полі-ЧМ-ацетиллактозаміновими одиницями, і різні структури, що кепують. Комплексні типи олігосахаридів синтезуються в апараті Гольджи з манозо-3-вмісних олігосахаридів, наприклад, шляхом додавання залишків М- ацетилглюкозаміну, галактози й сіалової кислоти.

Модифікація ядра зазвичай являє собою додавання фукози на «(1-6 зв'язку М- ацетилглюкозаміну, сусіднього з аспарагіном у ядрі глікану. Фукозилтрансферази, залучені у перенесення фукози до цього М-ацетилглюкозаміну ядра, вимагають попередньої дії СІСМАсТт-1.

Більшість комплексних і гібридних М-гліканів мають подовжені гілкию, що утворені шляхом

Зо додавання В-зв'язаного галактозного залишку до ініціювального М-ацетилглюкозаміну з утворенням універсального зв'язувального блока СаїІВ1-4С1ісМАс, який називають /-М- ацетиллактозаміном 2 типу. Виступи можуть бути додатково подовжені завдяки послідовному додаванню залишків М- ацетилглюкозаміну й галактози з утворенням тандемних повторів

ІасМАс (-З3саїр1- 4сІСМАср1-)п, що називають полі-М-ацетиллактозаміном. В іншому прикладі

В-зв'язана галактоза додається до С-3 М-ацетилглюкозаміну з утворенням СаїІр1-ЗсісМАс, який називають М-ацетиллактозаміновою послідовністю 1 типу. В деяких білках ДВ-зв'язаний М- ацетилгалактозамін додається до М-ацетилглюкозаміну замість рД-зв'язаної галактози з утворенням виступу з подовженням (аіМАср1-4(3сМАс. Реакції кепування або обробки передбачають додавання до гілок сіалової кислоти, фукози, галактози, М-ацетилгалактозаміну й сульфату. Цукри, що кепують, найчастіше є а-зв'язаними та, тому, випинаються з р-зв'язаних стрічкоподібних гілок полі-М-ацетиллактозаміну.

Лізосомні ферменти можуть набувати СсісСМАс-1-Р при 0-6 залишків манози в олігоманозо-М- гліканах у апараті цис-Гольджи. Потім М-ацетил-глюкозамін вилучається в апараті транс-

Гольджи за допомогою глікозидази, що тим самим піддає залишки Мап-6-Р, що розпізнаються рецептором Мап-6-Р і спрямовуються для підкислення, дії прелізосомного компартмента.

Гібридні типи олігосахаридів синтезуються в апараті Гольджи із структур манози-3 і манози- 5 ядра шляхом додавання, наприклад, залишків М-ацетилглюкозаміну, галактози й сіалової кислоти. Гібридні М-глікани утворюються, якщо СісМАсМапоаїйсМАса глікан не піддається дії а- манозидази ІЇ в результаті чого периферичні залишки «1-3Мап і «1-6Мап залишаються інтактними й немодифікованими в зрілому глікопротеїні. Незавершена дія а-манозидази Ії може дати в результаті гібриди СісМАсМапасісМАсг». Інша манозидаза апарата Гольджи, а- манозидаза ЇХ, також діє на СіпмМАсМапоаїсМАс», створений за допомогою СісСМАсСТт-1.

Докладний огляд шляхів біосинтезу й ферментів, застосовних для створення М-зв'язаних гліканів (наприклад, високо манозних типів олігосахаридів) описані в 5іапієу еї аї., "М-Сіусапв" іп

Ев5зепійаІ5 ої Спусоріоіоду, Ед. Магїкі, Ситтіпов5, апа Ев5Кпо, Соїд Зргіпа Наїбог Ргезв5, 2009. Як зазначено вище, післятрансляційне глікозилювання рекомбінантної а-галактозидази-А людини є важливим для належної спрямованої міграції білка. Наприклад, заміна серинового залишку в амінокислотному положенні 215 призводить до порушення спрямованої міграції ферменту до ліпосоми (Мипіег-І ептапп еї аї., ). Віої. Спет. 271:15166-15174, 1996; М/аї єї аї., Маї. Веу. 60 Містобріо!ї. 3:119-128, 2005). Дослідження різних глікоформ білка с-галактозидази-А людини,

експресованого в клітині СНО, описується в Маїзишга еї а!., Сіусобіоіоду 8:329-339, 1998.

Типовий попередник і зрілі послідовності білка а-галактозидази-А людини представлені на фігурі 2, відповідно (5ЕО ІЮО МО: 1 ї 2, відповідно). Рекомбінантний білок а-галактозидази людини, описаний в даному документі, може містити послідовність, яка щонайменше на 9590 ідентична (наприклад, щонайменше на 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентична) БЕО ІО МО: 1 або 2. Рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини можуть мати (наприклад, складатися з) послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична (наприклад, щонайменше на 9695, 97905, 98965, 9995 або 10095 ідентична) 5ЕО ІЮ МО: 1 або 2. В інших прикладах рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини може містити послідовність 5ЕО І МО: 2 з 1-30 амінокислотами (наприклад, 1-25 амінокислотами, 1-20 амінокислотами, 1-15 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-5 амінокислотами, 1-3 амінокислотами, 1 або 2 амінокислотами, 20-25 амінокислотами, 15-25 амінокислотами, 10-25 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-8 амінокислотами й 5-15 амінокислотами), видаленими з М-кінця, і/або 1-30 амінокислотами, видаленими 3 С-кінця (наприклад, 1-25 амінокислотами, 1-20 амінокислотами, 1-15 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-5 амінокислотами, 1-3 амінокислотами, 1 або 2 амінокислотами, 20-25 амінокислотами, 15-25 амінокислотами, 10-25 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-8 амінокислотами і 5-15 амінокислотами).

Рекомбінантний білок са-галактгозидази-А людини може бути ковалентно зв'язаний з гетерологічною амінокислотною послідовність або міткою. Необмежувальні приклади гетерологічної амінокислотної послідовності, яка може бути зв'язана з рекомбінантним білком а- галактозидази людини, передбачають полі-Ніє мітку, хітин-зв'язувальний білок, мальтоза- зв'язувальний білок, глутатіон-5- трансферазу й стрептавідин. Будь-який тип мітки може бути ковалентно зв'язаний з білком а-галактозидази-А людини (наприклад, флуоресцентна група, радіонуклеотид і флуоресцентний білок). Додаткові приклади молекул, що можуть бути ковалентно зв'язані з білком а-галактозидази-А людини, передбачають полімер, наприклад, поліетиленгліколь, полівініл, поліестер, полілактид, полігліколід, полікапролактон та їх сополімери.

Типовий попередник і зрілі послідовності білка а-галактозидази-А людини представлені на фігурі 2, відповідно (5ЕО ІЮО МО: 1 ї 2, відповідно). Рекомбінантний білок а-галактозидази людини, описаний в даному документі, може містити послідовність, яка щонайменше на 9590 ідентична (наприклад, щонайменше на 9695, 9795, 98905, 9995 або 10095 ідентична) 5ЕО ІО МО: 1 або 2. Рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини можуть мати (наприклад, складатися з) послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична (наприклад, щонайменше на 9695, 97905, 98965, 9995 або 10095 ідентична) 5ЕО ІЮО МО: 1 або 2. В інших прикладах рекомбінантний білок амінокислотами (наприклад, 1-25 амінокислотами, 1-20 амінокислотами, 1-15 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-5 амінокислотами, 1-3 амінокислотами, 1 або 2 амінокислотами, 20-25 амінокислотами, 15-25 амінокислотами, 10-25 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-8 амінокислотами й 5-15 амінокислотами), видаленими з М-кінця, і/або 1-30 амінокислотами, видаленими 3 С-кінця (наприклад, 1-25 амінокислотами, 1-20 амінокислотами, 1-15 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-5 амінокислотами, 1-3 амінокислотами, 1 або 2 амінокислотами, 20-25 амінокислотами, 15-25 амінокислотами, 10-25 амінокислотами, 1-10 амінокислотами, 1-8 амінокислотами і 5-15 амінокислотами).

Рекомбінантний білок са-галактгозидази-А людини може бути ковалентно зв'язаний з гетерологічною амінокислотною послідовність або міткою. Необмежувальні приклади гетерологічної амінокислотної послідовності, яка може бути зв'язана з рекомбінантним білком а- галактозидази людини, передбачають полі- Ніб мітку, хітин-зв'язувальний білок, мальтоза- зв'язувальний білок, глутатіон-5-трансферазу й стрептавідин. Будь-який тип мітки може бути ковалентно зв'язаний з білком а-галактозидази-А людини (наприклад, флуоресцентна група, радіонуклеотид і флуоресцентний білок). Додаткові приклади молекул, що можуть бути ковалентно зв'язані з білком а-галактозидази-А людини, передбачають полімер, наприклад, поліетиленгліколь, полівініл, поліестер, полілактид, полігліколід, полікапролактон та їх сополімери.

Типова нуклеїнова кислота (наприклад, кКДНК), що кодує білок с-галактозидази-А людини, показана на фігурі 2 (ЕО ІО МО: 1).

У деяких прикладах будь-яка з нуклеїнових кислот (наприклад, кДНК), описаних в даному документі, можуть бути ковалентно зв'язані з одним або декількома з флуоресцентної мітки й гасильника. В інших прикладах будь-яка з нуклеїнових кислот (наприклад, КДНК) може містити або додатково містити щонайменше один нуклеотид, що включає радіоізотоп (наприклад, Рзг,

РІЗ і/або 535). бо Змінені глікоформи білка а-галактозидази-А

Даний опис представляє рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини (Е722), що мають змінене (наприклад, поліпшене) глікозилювання, у порівнянні з РабгаултеФф). Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, мають, наприклад, підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6- фосфат-вмісні олігосахариди, (у порівнянні з РаргалутеФ) що забезпечує підвищене зв'язування з манозо-6- фосфатним рецептором, який, у свою чергу, може підвищити швидкість ендоцитозу рекомбінантного білка клітиною ссавця (наприклад, клітиною людини), що експресує білок-рецептор манозо-6-фосфату на своїй поверхні (у порівнянні з РГаргагутеФф)). Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, також можуть мати одне або обидва зі зниженого відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди, і підвищеного відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою тетрасіалільовані олігосахариди, у порівнянні з РабгалутеФф), що може давати зниження неспецифічного націлювання рекомбінантного білка на печінку (шляхом зв'язування з асіалоглікопротегїновим рецептором, експресованим на поверхні гепатоцитів, після введення рекомбінантного білка (а-галактозидази-А людини суб'єкту, наприклад, суб'єкту-людині) і підвищений період напіввиведення з сироватки крові, відповідно, у порівнянні з РабгагутеФф).

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі, також, наприклад, демонструє меншу варіабельність в своїй композиції (наприклад, меншу варіабельність у глікоформах) та/або є більш безпечним продуктом (наприклад, знижений ризик або рівень забруднення одним або декількома з бактеріофагів, бактерій, мікобактерій і вірусів (наприклад, ентеровірусів (наприклад, ентеровірусів людини або тварини), ріновірусів (наприклад, ріновірусів людини або тварини), людських або тваринних пікобірнавірусів, кобувірусів, інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, вірусу діареї великої рогатої худоби, реовірусу-3 великої рогатої худоби, тварини), спумавірусів великої рогатої худоби, ендогенного ретровірусу свині, вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби, вірусів гепатиту,

Мезіміги5 (наприклад, Мевзімігив 2117), норовірусів (наприклад, норовірусів людини або тварини), астровірусів (наприклад, астровірусів людини або тварини), вірусу парагрипу або метапневмовірусу людини або тварини, анелловірусів, коронавірусів, флебовірусів, вірусу

Зо Шмалленберга великої рогатої худоби, каліцивірусу, цикловірусів, цирковірусів (наприклад, цирковірусу свиней або великої рогатої худоби), козавірусів, вірусу Коксаки, кубавірусу, пестівірусу, вірусів поліоми (наприклад, вірусу поліоми великої рогатої худоби), папілома вірусу великої рогатої худоби, нового вірусу папіломи гризунів 2 типу 5У40, парвовірусів (наприклад, парвовірусу свиней, гризунів, людей або великої рогатої худоби), кардіовірусів (наприклад,

ЕМСУ), параміксовірусів, вірусу везикулярного стоматиту, гіровірусів, козавірусу, вірусу долини

Сенека, коронавірусу, інфекційної анемії коней, аденовірусу людини, каліцивірусу кішок, аденовірусу 2 типу, аденовірусу З типу великої рогатої худоби, вірусу псевдосказу, вірусної діареї великої рогатої худоби, парагрипу З типу, інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, вірусу блютанга, вірусу лейкемії кішок, дрібного вірусу мишей, парвовірусу великої рогатої худоби, вірусу долини Кеш, реовірусу (наприклад, реовірусу людини або тварини), аденовірусу коней, вірусу 5У-40, вірусу енцефаломіокардиту, РАВ5ЗМУ свиней, вірусу герпесу 4 великої рогатої худоби або ящуру)).

Раніше було показано, що ЕРабгалутеФ має значно відмінний патерн глікозилювання у порівнянні з Веріада!Ф (І ее еї аї., Сіусобіоїоду 13:305-313, 2003). Помітні відмінності в патерні глікозилювання РабгагутеФф і Реріада!Ф, як вважають, обумовлені, зокрема, різними лініями клітин, які застосовують для отримання цих білків (наприклад, Раргалгутеф продукується лінією клітин СНО, а Веріада!є продукується лінією клітин людини).

ЕабгагутеФ є рекомбінантною формою білка а-галактозидази-А людини, який отримує й продає Сепгуте. Рабгалутеф і способи створення Раргагутеф описані, наприклад, в патенті

США Мо 5356804. Веріада(ю є рекомбінантною формою білка с-галактозидази-А людини, який отримує й продає ЗПігє. ВНеріадакю і способи створення Неріада(фФ описані, наприклад, в патентах США МоМо 6083725, 6458574, 6395884 і 7133354.

Рекомбінантні білки а-галактозидази людини, представлені в даному документі (Е272С), мають дві або більше (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12) будь-яких із структурних ознак (наприклад, у будь-якій комбінації) (і) - (хі), приведених нижче. Будь-які з діапазонів значень, приведених нижче, для кожного з одного або декількох параметрів з (ї) до (хії) можуть бути присутні у рекомбінантному білку о-галактозидази-А людини, представленому в даному документі. Крім того, будь-який з рекомбінантних білків «-галактозидази людини, представлених в даному документі, можуть мати одну або декілька (наприклад, одну, дві або три) з типових бо функціональних властивостей, описаних в даному розділі. Будь-яка комбінація фізичних характеристик і/або функціональних властивостей рекомбінантних білків а-галактозидази-А людини, описаних в даному документі, можуть бути об'єднані будь-яким способом. Нижче описані типові комбінації структурних ознак рекомбінантних білків «-галактозидази-А людини, представлених в даному документі.

Крім того, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати меншу варіабельність в структурі (наприклад, меншу варіабельність у глікоформах) і/або знижений ризик або рівень забруднення (наприклад, знижений ризик або рівень забруднення).

Будь-який з білків "ПАСА, представлених у даному документі, можуть не мати детектований рівень або не мати білок, ліпід, вуглевод, нуклеїнову кислоту та контамінант (наприклад, будь- який з контамінантів, описаних у даному документі), присутні у продукті тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин або продукт крові тварин). Будь-який з білків гпАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок гпАсСА, продукований у культурі клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи безбілкового, безсироваткового та середовища з визначеним хімічним складом.

Будь-який з білків ІПАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок "ПАСА, продукований у культурі клітин, у якій використовували тільки безбілкове й/або середовище з визначеним хімічним складом. Будь-який з білків "ПАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок ПТтАСА, продукований у культурі клітин, у якій використовували тільки культуральні середовища, вибрані з групи, що складається з безбілкового, безсироваткового та середовища з визначеним хімічним складом, та який виділяють із застосуванням інтегрованого та безперервного процесу (наприклад, будь-який з інтегрованого та безперервного процесів, описаних у даному документі або у УМО 14/137903). Будь-який з білків ТАСА, представлених у даному документі, може являти собою білок пАСА з покращеним профілем безпеки (наприклад, знижений ризик забруднення (наприклад, будь-який з ілюстративних контамінантів, описаних у даному документі або відомих з рівня техніки)) порівняно з білком тпАСА, представленим у даному документі, який продукується за допомогою способу, який включає застосування середовища для культивування, що містить продукт тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин або фактор або білок крові тварин).

Зо Біофізичні властивості

І. М-зв'язані моносіалільовані олігосахариди

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, описані в даному документі, можуть мати знижений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди, у порівнянні з РаргалутеФ. Рекомбінантні білки а- галактозидази-А людини, описані в даному документі, можуть мати приблизно такий самий або трохи знижений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозовмісні олігосахариди, у порівнянні з Рабгагутеф. Ця ознака є перевагою, оскільки моносіалільовані олігосахариди можуть містити відкриті галактозні залишки, які зв'язуються з асіалоглікопротеїновим рецептором, експресованим на гепатоцитах в печінці. Печінка не є цільовою тканиною для рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, і, таким чином, зниження кількості моносіалільованих олігосахаридів, як вважають, знижує непродуктивне націлювання цього ферменту в організмі людини.

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди (наприклад, пік З у профілях міченого антраніловою кислотою

М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 1,795 до приблизно 3,295. Рекомбінантні білки а- галактозидази-А людини, представлені в даному документі, (220) можуть мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди (наприклад, пік З у профілях міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до приблизно 1,695 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 1,595, від

БО приблизно 0,195 до приблизно 1,495, від приблизно 0,195 до приблизно 1,395, від приблизно 0,190 до приблизно 1,295, від приблизно 0,195 до приблизно 1,195, від приблизно 0,195 до приблизно 1,095, від приблизно 0,195 до приблизно 0,995, від приблизно 0,195 до приблизно 0,895, від приблизно 0,195 до приблизно 0,795, від приблизно 0,195 до приблизно 0,695, від приблизно 0,190 до приблизно 0,595, від приблизно 0,195 до приблизно 0,495, від приблизно 0,295 до приблизно 1,495, від приблизно 0,295 до приблизно 1,395, від приблизно 0,295 до приблизно 1,295, від приблизно 0,295 до приблизно 1,095, від приблизно 0,295 до приблизно 0,995, від приблизно 0,295 до приблизно 0,895, від приблизно 0,295 до приблизно 0,795, від приблизно 0,395 до приблизно 1,495, від приблизно 0,395 до приблизно 1,395, від приблизно 0,395 до приблизно 1,395, від приблизно 0,395 до приблизно 1,295, від приблизно 0,395 до приблизно 1,295, від приблизно 0,395 60 до приблизно 1,195, від приблизно 0,395 до приблизно 1,095, від приблизно 0,395 до приблизно

0,995, від приблизно 0,395 до приблизно 0,895, від приблизно 0,395 до приблизно 0,795, від приблизно 0,495 до приблизно 1,495, від приблизно 0,495 до приблизно 1,395, від приблизно 0,495 до приблизно 1,295, від приблизно 0,495 до приблизно 1,195, від приблизно 0,495 до приблизно 1,095, від приблизно 0,495 до приблизно 0,995, від приблизно 0,495 до приблизно 0,895, від приблизно 0,495 до приблизно 0,795, від приблизно 0,595 до приблизно 1,495, від приблизно 0,595 до приблизно 1,395, від приблизно 0,595 до приблизно 1,295, від приблизно 0,595 до приблизно 1,195, від приблизно 0,595 до приблизно 1,095, від приблизно 0,595 до приблизно 0,995 або від приблизно 0,695 до приблизно 1,295).

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 2 у профілях міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 2,095 до приблизно 5,795.

Рекомбінантні білки с-галактозидази-А людини, представлені в даному документі (Е22С), можуть мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 2 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до 3,095 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 2,995, від приблизно 0,195 до приблизно 2,895, від приблизно 0,195 до приблизно 2,795, від приблизно 0,195 до приблизно 2,695, від приблизно 0,195 до приблизно 2,595, від приблизно 0,195 до приблизно 2,495, від приблизно 0,195 до приблизно 2,395, від приблизно 0,195 до приблизно 2,295, від приблизно 0,195 до приблизно 2,195, від приблизно 0,195 до приблизно 2,095, від приблизно 0,195 до приблизно 1,995, від приблизно 0,195 до приблизно 1,895, від приблизно 0,195 до приблизно 1,795, від приблизно 0,195 до приблизно 1,695, від приблизно 0,195 до приблизно 1,595, від приблизно 0,195 до приблизно 1,495, від приблизно 0,195 до приблизно 1,395, від приблизно 0,195 до приблизно 1,295, від приблизно 0,395 до приблизно 3,095, від приблизно 0,395 до приблизно 2,995, від приблизно 0,395 до приблизно 2,895, від приблизно 0,395 до приблизно 2,795, від приблизно 0,395 до приблизно 2,695, від приблизно 0,395 до приблизно 2,595, від приблизно 0,395 до приблизно 2,495, від приблизно 0,395 до приблизно 2,395, від приблизно 0,395 до приблизно 2,295, від приблизно 0,395 до приблизно 2,195, від приблизно 0,395 до приблизно 2,0, від приблизно 0,395 до приблизно 1,995, від приблизно 0,395 до приблизно 1,895, від приблизно 0,395 до приблизно 1,795, від приблизно 0,395

Ко) до приблизно 1,695, від приблизно 0,395 до приблизно 1,595, від приблизно 0,395 до приблизно 1,495, від приблизно 0,395 до приблизно 1,395 або від приблизно 0,395 до приблизно 1,296).

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою моносіалільовані олігосахариди або моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

І. М-зв'язані біс-манозо-б-фосфат-вмісні олігосахариди

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 11 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з РабгагутеФ. Підвищений рівень біс-манозо-6- фосфат-вмісних олігосахаридів дає в результаті підвищене націлювання на клітини, які експресують манозо-6-фосфатний рецептор на своїй плазматичній мембрані.

Зв'язування з манозо-б6-фосфатним рецептором запускає ендоцитоз ферменту в клітині й переносить фермент до клітинної лізосоми.

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 11 у профілях міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 4,095 до приблизно 7,095. Наприклад, рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс- манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 11 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 7,595 (наприклад, більш ніж приблизно 7,695, більш ніж приблизно 7,795, більш ніж приблизно 7,895, більш ніж приблизно 7,995, більш ніж приблизно 8,095, більш ніж приблизно 8,195, більш ніж приблизно 8,295, більш ніж приблизно 8,295, більш ніж приблизно 8,395, більш ніж приблизно 8,495, більш ніж приблизно 8,595, більш ніж приблизно 8,695, більш ніж приблизно 8,795, більш ніж приблизно 8,895, більш ніж приблизно 8,995, більш ніж приблизно 8,995, більш ніж приблизно 9,095, більш ніж приблизно 9,195, більш ніж приблизно 9,295, більш ніж приблизно 9,395, більш ніж приблизно 9,495, більш ніж приблизно 9,595, більш ніж приблизно 9,695, більш ніж приблизно 9,795, більш ніж приблизно 9,895, більш ніж приблизно 9,995, більш ніж приблизно 10,095, більш ніж приблизно 10,195, більш ніж приблизно 10,295, більш ніж приблизно 10,395, більш ніж приблизно 60 10,495, більш ніж приблизно 10,595, більш ніж приблизно 10,695, більш ніж приблизно 10,795,

більш ніж приблизно 10,895, більш ніж приблизно 10,995 або більш ніж приблизно 1195).

Наприклад, рекомбінантний білок «а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 11 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 7,095 до приблизно 1395, від приблизно 8,095 до приблизно 12,095 або від приблизно 9,095 до приблизно 11,095.

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6б-фосфат-вмісні олігосахариди, описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

І. М-зв'язані бісіалільовані та М-зв'язані бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в данному документі, можуть мати приблизно такий самий або підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо- вмісні олігосахариди (наприклад, пік 4 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з

ЕабгагутеФ. Представлені рекомбінантні білки «а-галактозидази-А людини можуть мати підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 5 профілювання міченого антраніловою кислотою

М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з РабгагутеФф. Вважають, що підвищений рівень бісіалільованих фукозо-вмісних олігосахаридів збільшує період напіввиведення білка іп мімо і/або іп міго (наприклад, в сироватці крові у суб'єкта або в фармацевтичній композиції).

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 4 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 11,095 до приблизно 14,2905.

Наприклад, рекомбінантний білок «а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 4 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 13,095 (наприклад, більш ніж приблизно 13,195, більш ніж приблизно 13,295, більш ніж

Ко) приблизно 13,395, більш ніж приблизно 13,495, більш ніж приблизно 13,595, більш ніж приблизно 13,695, більш ніж приблизно 13,795, більш ніж приблизно 13,895, більш ніж приблизно 13,995, більш ніж приблизно 14,095, більш ніж приблизно 14,195, більш ніж приблизно 14,295, більш ніж приблизно 14,395, більш ніж приблизно 14,495, більш ніж приблизно 14,595, більш ніж приблизно 14,695, більш ніж приблизно 14,795, більш ніж приблизно 14895, більш ніж приблизно 14,995 або більш ніж 15,095). Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 4 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 13,095 до приблизно 15,095, від приблизно 13,595 до приблизно 15,595, від приблизно 14,095 до приблизно 16,095 або від приблизно 14,595 до приблизно 16,595.

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 5 профілювання міченого антраніловою кислотою

М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 5,695 до приблизно 7,195. Рекомбінантні білки а- галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 5 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до приблизно 5,395 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 5,295, від приблизно 0,195 до приблизно 5,195, від приблизно 0,195 до приблизно 5,095, від приблизно 0,195 до приблизно 4,995, від приблизно 0,195 до приблизно 4,895, від приблизно 0,195 до приблизно

БО 4,795, від приблизно 0,195 до приблизно 4,695, від приблизно 0,195 до приблизно 4,595, від приблизно 0,195 до приблизно 4,495, від приблизно 0,195 до приблизно 4,395, від приблизно 0,195 до приблизно 4,295, від приблизно 0,195 до приблизно 4,195, від приблизно 0,195 до приблизно 4,095, від приблизно 0,195 до приблизно 3,995, від приблизно 0,195 до приблизно 3,895, приблизно 0,195 до приблизно 3,795, від приблизно 0,195 до приблизно 3,695, від приблизно 0,195 до приблизно 3,595, від приблизно 0,195 до приблизно 3,495, від приблизно 0,195 до приблизно 3,395, від приблизно 0,195 до приблизно 3,295, від приблизно 0,195 до приблизно 3,195, від приблизно 0,195 до приблизно 3,095, від приблизно 0,195 до приблизно 2,995, від приблизно 0,195 до приблизно 2,895, від приблизно 0,195 до приблизно 2,795, від приблизно 0,195 до приблизно 2,695, від приблизно 0,195 до приблизно 2,595, від приблизно 0,395 до приблизно 5,295, від 60 приблизно 0,395 до приблизно 5,195, від приблизно 0,395 до приблизно 5,095, від приблизно 0,395 до приблизно 4,995, від приблизно 0,395 до приблизно 4,895, від приблизно 0,395 до приблизно 4,796, від приблизно 0,395 до приблизно 4,695, від приблизно 0,395 до приблизно 4,595, від приблизно 0,395 до приблизно 4,495, від приблизно 0,395 до приблизно 4,395, від приблизно 0,390 до приблизно 4,295, від приблизно 0,395 до приблизно 4,195, від приблизно 0,395 до приблизно 4,095, від приблизно 0,395 до приблизно 3,995, від приблизно 0,395 до приблизно 3,895, від приблизно 0,395 до приблизно 3,795, від приблизно 0,395 до приблизно 3,695, від приблизно 0,390 до приблизно 3,595, від приблизно 0,395 до приблизно 3,595, від приблизно 0,395 до приблизно 3,495, від приблизно 0,395 до приблизно 3,395, від приблизно 0,395 до приблизно 3,295, від приблизно 0,395 до приблизно 3,195, від приблизно 0,395 до приблизно 3,095, від приблизно 0,390 до приблизно 2,995, від приблизно 0,395 до приблизно 2,895, від приблизно 0,395 до приблизно 2,795, від приблизно 0,395 до приблизно 2,695 або від приблизно 0,395 до приблизно 2,595).

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані та бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди, описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

ІМ. М-зв'язані трисіалільовані олігосахариди

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою трьохрозгалужені, трисіалільовані олігосахариди форми 2 (тобто пік 6" профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з ГабгалгутеФф).. Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати знижений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 1 (наприклад, пік 6 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з ГабгагутеФф) Вставка на фігурі 10 показує дві структури трьохрозгалуженого трисіалільованого олігосахариду, де одна з двох структур відповідає піку 6 (форма 1), а інша з двох структур відповідає піку 6' (форма 2) на профілі хроматографічного елюювання М- зв'язаних олігосахаридів, дериватизованих з 2-АА. Вважають, що підвищений рівень трисіалільованих фукозо-вмісних олігосахаридів збільшує період напіввиведення білка іп мімо і/або іп мійго (наприклад, в сироватці крові у суб'єкта або в фармацевтичній композиції).

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 2 (наприклад, пік 6" профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,595 до приблизно 1,295. Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужений трисіалільовані олігосахариди форми 2 (наприклад, пік 6' профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж 2,095 (наприклад, більш ніж 2,195, більш ніж 2,295, більш ніж 2,395, більш ніж 2,490, більш ніж 2,595, більш ніж 2,695, більш ніж 2,795, більш ніж 2,895, більш ніж 2,995, більш ніж 3,090, більш ніж 3,195, більш ніж 3,295, більш ніж 3,395, більш ніж 3,495, більш ніж 3,595, більш ніж 3,690, більш ніж 3,795, більш ніж 3,895, більш ніж 3,995, більш ніж 4,095, більш ніж 4,195, більш ніж 4,295, більш ніж 4,395, більш ніж 4,495, більш ніж 4,595, більш ніж 4,695, більш ніж 4,795, більш ніж 4,895, більш ніж 4,995, більш ніж 5,095, більш ніж 5,195, більш ніж 5,295, більш ніж 5,395, більш ніж 5,490, більш ніж 5,595, більш ніж 5,695, більш ніж 5,795, більш ніж 5,895, більш ніж 5,995, більш ніж 6,095, більш ніж 6,195, більш ніж 6,295, більш ніж 6,395, більш ніж 6,495, більш ніж 6,595, більш ніж 6,790, більш ніж 6,895, більш ніж 6,995, більш ніж 7,095 або більш ніж 7,195). Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Б220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 2 (наприклад, пік 6" профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 5,095 до приблизно 9,095,

БО від приблизно 5,595 до приблизно 8,595, від приблизно 6,095 до приблизно 8,095 або від приблизно 6,595 до приблизно 7,595.

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 1 (наприклад, пік б профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 9,595 до приблизно 1395. Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі, може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 1 (наприклад, пік 6 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 0,195 до приблизно 9,095 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 8,995, від 60 приблизно 0,195 до приблизно 8,895, від приблизно 0,195 до приблизно 8,795, від приблизно 0,195 до приблизно 8,695, від приблизно 0,195 до приблизно 8,595, від приблизно 0,195 до приблизно 8,495, від приблизно 0,195 до приблизно 8,395, від приблизно 0,195 до приблизно 8,295, від приблизно 0,195 до приблизно 8,195, від приблизно 0,195 до приблизно 8,095, від приблизно 0,195 до приблизно 7,995, від приблизно 0,195 до приблизно 7,895, від приблизно 0,195 до приблизно 7,795, від приблизно 0,195 до приблизно 7,695, від приблизно 0,195 до приблизно 7,595, від приблизно 0,195 до приблизно 7,495, від приблизно 0,195 до приблизно 7,395, від приблизно 0,195 до приблизно 7,295, від приблизно 0,195 до приблизно 7,195, від приблизно 0,195 до приблизно 7,095, від приблизно 0,195 до приблизно 6,995, від приблизно 0,195 до приблизно 6,895, від приблизно 0,195 до приблизно 6,795, від приблизно 0,195 до приблизно 6,695, від приблизно 0,195 до приблизно 6,595, від приблизно 0,195 до приблизно 6,495, від приблизно 0,195 до приблизно 6,395, від приблизно 0,195 до приблизно 6,295, від приблизно 0,195 до приблизно 6,195, від приблизно 0,195 до приблизно 6,095, від приблизно 0,195 до приблизно 5,995, від приблизно 0,195 до приблизно 5,895, від приблизно 0,195 до приблизно 5,795, від приблизно 0,195 до приблизно 5,695, від приблизно 0,195 до приблизно 5,595, від приблизно 0,195 до приблизно 5,495, від приблизно 0,195 до приблизно 5,395, від приблизно 0,195 до приблизно 5,295, від приблизно 0,190 до приблизно 5,195, від приблизно 0,195 до приблизно 5,095, від приблизно 0,195 до приблизно 4,995, від приблизно 0,195 до приблизно 4,895, від приблизно 0,195 до приблизно 4,795, від приблизно 0,195 до приблизно 4,695, від приблизно 0,195 до приблизно 4,595, від приблизно 0,190 до приблизно 4,495, від приблизно 0,195 до приблизно 4,395, від приблизно 0,195 до приблизно 4,295, від приблизно 0,195 до приблизно 4,195, від приблизно 0,195 до приблизно 4,095, від приблизно 0,195 до приблизно 3,995, від приблизно 0,195 до приблизно 3,895, від приблизно 0,190 до приблизно 3,795, від приблизно 0,195 до приблизно 3,695, від приблизно 0,195 до приблизно 3,595, від приблизно 0,195 до приблизно 3,495, від приблизно 0,195 до приблизно 3,395, від приблизно 0,195 до приблизно 3,295, від приблизно 0,195 до приблизно 3,195 або від приблизно 0,195 до приблизно 3,095).

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди, описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

М. Відношення моль/моль сіалової кислоти/білка

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати відношення моль/моль сіалової кислоти до білка, яке є приблизно таке саме або більш ніж в РаргалутеФ. Вважають, що підвищене число молекул сіалової кислоти, присутніх в олігосахаридах, підвищує період напіввиведення білка іп міо і/або іп мімо (наприклад, у фармацевтичній композиції і в сироватці крові ссавця).

Еабга7утеФ має відношення моль/моль сіалової кислоти до білка від приблизно 2,6 до приблизно 3,3. РабгалгутефФ також має відношення моль/моль сіалової кислоти до манозо-6- фосфату, яке більше ніж 1,5. Наприклад, рекомбінантний білок са-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), може мати відношення моль/моль сіалової кислоти до білка, яке більше ніж 3,0 (наприклад, більше ніж 3,1, більше ніж 3,2, більше ніж 3,3, більше ніж 3,4, більше ніж 3,5, більше ніж 3,6, більше ніж 3,7, більше ніж 3,8, більше ніж 3,9, більше ніж 4,0, більше ніж 4,1, більше ніж 4,2, більше ніж 4,3, більше ніж 4,4, більше ніж 4,5, більше ніж 4,6, більше ніж 4,7, більше ніж 4,8, більше ніж 4,9 або більше ніж 5,0).

Типові способи визначення відношення моль/моль сіалової кислоти до білка описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

МІ. М-зв'язані нейтрально заряджені олігосахариди

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати знижений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (наприклад, пік 1 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з Гарга7гутеФф)

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою

М-зв'язані нейтрально заряджені олігосахариди (наприклад, пік 1 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 4,095 до приблизно 7,195.

Наприклад, рекомбінантний білок «а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі, може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (наприклад, пік 1 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 0,195 до приблизно 3,995 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 3,895, від приблизно 0,195 до приблизно 3,795, від приблизно 0,195 до приблизно 3,695, від приблизно 0,195 до приблизно 3,595, від приблизно 0,195 до приблизно 3,495, від приблизно 0,195 до приблизно 3,395, від 60 приблизно 0,195 до приблизно 3,295, від приблизно 0,195 до приблизно 3,195, від приблизно 0,195 до приблизно 3,095, від приблизно 0,195 до приблизно 2,995, від приблизно 0,195 до приблизно 2,895, від приблизно 0,195 до приблизно 2,795, від приблизно 0,195 до приблизно 2,695, від приблизно 0,195 до приблизно 2,595, від приблизно 0,195 до приблизно 2,495, від приблизно 0,195 до приблизно 2,395, від приблизно 0,195 до приблизно 2,295, від приблизно 0,195 до приблизно 2,195, від приблизно 0,195 до приблизно 2,095, від приблизно 0,195 до приблизно 1,995, від приблизно 0,195 до приблизно 1,895, від приблизно 0,195 до приблизно 1,795, від приблизно 0,195 до приблизно 1,695, від приблизно 0,195 до приблизно 1,595, від приблизно 0,195 до приблизно 1,495, від приблизно 0,195 до приблизно 1,395, від приблизно 0,195 до приблизно 1,295, від приблизно 0,195 до приблизно 1,195, від приблизно 0,195 і 1,095, від приблизно 0,395 до приблизно 3,995, від приблизно 0,395 до приблизно 3,895, від приблизно 0,395 до приблизно 3,795, від приблизно 0,395 до приблизно 3,695, від приблизно 0,395 до приблизно 3,595, від приблизно 0,395 до приблизно 3,495, від приблизно 0,395 до приблизно 3,395, від приблизно 0,390 до приблизно 3,295, від приблизно 0,395 до приблизно 3,195, від приблизно 0,395 до приблизно 3,095, від приблизно 0,395 до приблизно 2,995, від приблизно 0,395 до приблизно 2,895, від приблизно 0,395 до приблизно 2,795, від приблизно 0,395 до приблизно 2,695, від приблизно 0,395 до приблизно 2,595, від приблизно 0,395 до приблизно 2,495, від приблизно 0,395 до приблизно 2,395, від приблизно 0,395 до приблизно 2,295, від приблизно 0,395 до приблизно 2,195, від приблизно 0,395 до приблизно 2,095, від приблизно 0,395 до приблизно 1,995, від приблизно 0,395 до приблизно 1,895, від приблизно 0,395 до приблизно 1,795, від приблизно 0,395 до приблизно 1,695, від приблизно 0,395 до приблизно 1,595, від приблизно 0,395 до приблизно 1,495, від приблизно 0,395 до приблизно 1,395, від приблизно 0,395 до приблизно 1,295, від приблизно 0,395 до приблизно 1,195 або від приблизно 0,395 до приблизно 1,095).

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (наприклад, пік 1 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

МІ. М-зв'язані манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди

Представлені рекомбінантні білки с-галактозидази-А людини можуть мати приблизно такий самий або трохи знижений відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, які являють

Зо собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди, у порівнянні з РабгагутеФф).

М-зв'язані манозо-б-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 7 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 5,595 до приблизно 10,095.

Наприклад, рекомбінантний білок «а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 7 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 0,195 до приблизно 7,095 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 6,995, від приблизно 0,195 до приблизно 6,895, від приблизно 0,195 до приблизно 6,795, від приблизно 0,195 до приблизно 6,695, від приблизно 0,195 до приблизно 6,595, від приблизно 0,195 до приблизно 6,495, від приблизно 0,195 до приблизно 6,395, від приблизно 0,195 до приблизно 6,295, від приблизно 0,195 до приблизно 6,195, від приблизно 0,195 до приблизно 6,095, від приблизно 0,195 до приблизно 5,995, від приблизно 0,195 до приблизно 5,895, від приблизно 0,195 до приблизно 5,795, від приблизно 0,195 до приблизно 5,695, від приблизно 0,195 до приблизно 5,595, від приблизно 0,195 до приблизно 5,495, від приблизно 0,195 до приблизно 5,395, від приблизно 0,195 до приблизно 5,295, від приблизно 0,195 до приблизно 5,195 або від приблизно 0,195 до приблизно 5,095).

Наприклад, рекомбінантний білок «а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 7 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 5,095 до приблизно 7,090.

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 7 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

МІ. М-зв'язані монофосфорильовані олігосахариди

Представлені рекомбінантні білки «а-галактозидази-А людини можуть мати підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою монофосфорильовані олігосахариди, у порівнянні з РГабгалгутеФ). 60 ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою

М-зв'язані монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 8 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 10,995 до приблизно 14,7905.

Наприклад, рекомбінантний білок са- галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 8 профілювання мічених антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 14,8905 (наприклад, більш ніж приблизно 14,995, більш ніж 15,095, більш ніж приблизно 15,195, більш ніж приблизно 15,295, більш ніж приблизно 15,395, більш ніж приблизно 15,495, більш ніж приблизно 15,595, більш ніж приблизно 15,695, більш ніж приблизно 15,795, більш ніж приблизно 15,895, більш ніж приблизно 15,995, більш ніж приблизно 16,095, більш ніж приблизно 16,195, більш ніж приблизно 16,295, більш ніж приблизно 16,395 більш ніж приблизно 16,495, більш ніж приблизно 16,595, більш ніж приблизно 16,695, більш ніж приблизно 16,795, більш ніж приблизно 16,895, більш ніж приблизно 16,995, більш ніж приблизно 17,095, більш ніж приблизно 17,195, більш ніж приблизно 17,295, більш ніж приблизно 17,395, більш ніж приблизно 17,495, більш ніж приблизно 17,595, більш ніж приблизно 17,695, більш ніж приблизно 17,795, більш ніж приблизно 17,895, більш ніж приблизно 17,995, більш ніж приблизно 18,095, більш ніж приблизно 18,195, більш ніж приблизно 18,295, більш ніж приблизно 18,395, більш ніж приблизно 18,495, більш ніж приблизно 18,595, більш ніж приблизно 18,695, більш ніж приблизно 18,795, більш ніж приблизно 18,895, більш ніж приблизно 18,995, більш ніж приблизно 19,095, більш ніж приблизно 19,195, більш ніж приблизно 19,295, більш ніж приблизно 19,395, більш ніж приблизно 19,495, більш ніж приблизно 19,595, більш ніж приблизно 19,695, більш ніж приблизно 19,795, більш ніж приблизно 19,895, більш ніж приблизно 19,995, більш ніж приблизно 20,095, більш ніж приблизно 20,195, більш ніж приблизно 20,295, більш ніж приблизно 20,395, більш ніж приблизно 20,495, більш ніж приблизно 20,595, більш ніж приблизно 20,695, більш ніж приблизно 20,795, більш ніж приблизно 20,895, більш ніж приблизно 20,995, більш ніж приблизно 21,095, більш ніж приблизно 21,195, більш ніж приблизно 21,295, більш ніж приблизно 21,395, більш ніж приблизно 21,495, більш ніж приблизно 21,595, більш ніж приблизно 21,695, більш ніж приблизно 21,795, більш ніж приблизно 21,895, більш ніж приблизно 21,995, більш ніж приблизно 22,095, більш ніж приблизно 22,195, більш ніж приблизно 22,295, більш ніж приблизно 22,395, більш ніж приблизно 22,495, більш ніж приблизно

Ко) 22,595, більш ніж приблизно 22,695, більш ніж приблизно 22,795, більш ніж приблизно 22,895, більш ніж приблизно 22,995 або більш ніж приблизно 23,095). Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 8 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 15,595 до приблизно 17,595, від приблизно 16,09 до приблизно 18,095 або від приблизно 16,595 до приблизно 18,5905.

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 8 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

ЇХ. М-зв'язані тетрасіалільовані олігосахариди

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 9 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), у порівнянні з РабгалгутеФ. Вважають, що підвищений рівень тетрасіалільованих олігосахаридів збільшує період напіввиведення білка іп мімо і/або іп міїго (наприклад, в сироватці крові у суб'єкта або в фармацевтичній композиції).

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 9 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 2,395 до приблизно 4,895. Наприклад, рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 9 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 4,995 (наприклад, більш ніж приблизно 5,095, більш ніж приблизно 5,195, більш ніж приблизно 5,295, більш ніж приблизно 5,395, більш ніж приблизно 5,495, більш ніж приблизно 5,595, більш ніж приблизно 5,695, більш ніж приблизно 5,795, більш ніж приблизно 5,895, більш ніж приблизно 5,995, більш ніж приблизно 6,095, більш ніж приблизно 6,195, більш ніж приблизно 6,295, більш ніж приблизно 6,395, більш ніж приблизно 6,495, більш ніж приблизно 6,595, більш ніж приблизно 6,695, більш 60 ніж приблизно 6,795, більш ніж приблизно 6,895, більш ніж приблизно 6,995, більш ніж приблизно

7,095, більш ніж приблизно 7,195, більш ніж приблизно 7,295, більш ніж приблизно 7,395, більш ніж приблизно 7,495, більш ніж приблизно 7,595, більш ніж приблизно 7,695, більш ніж приблизно 7,795, більш ніж приблизно 7,895, більш ніж приблизно 7,995 або більш ніж приблизно 8,095).

Наприклад, рекомбінантний білок «а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220), може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 9 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 6,095 до приблизно 8,095, від приблизно 6,595 до приблизно 8,595, від приблизно 6,095 до приблизно 9,095 або від приблизно 7,095 до приблизно 9,095.

Типові способи здійснення та визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 9 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

Х. М-зв'язані гібридні структури, що є моносіалільованими та монофосфорильованими

Представлені рекомбінантні білки «а-галактозидази-А людини можуть мати підвищений відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані, монофосфорильовані, гібридні структури, у порівнянні з Рабгалгутеф).

ЕабгагутеФф має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані монофосфорильовані гібридні олігосахариди (наприклад, пік 10 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 6,095 до приблизно 8,195. Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі, може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних гібридних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані монофосфорильовані гібридні олігосахариди (наприклад, пік 10 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 8,295 (наприклад, більш ніж приблизно 8,395, більш ніж приблизно 8,490, більш ніж приблизно 8,595, більш ніж приблизно 8,695, більш ніж приблизно 8,795, більш ніж приблизно 8,895, більш ніж приблизно 8,995, більш ніж приблизно 9,095, більш ніж приблизно 9,195, більш ніж приблизно 9,295, більш ніж приблизно 9,395, більш ніж приблизно 9,495, більш ніж приблизно 9,595, більш ніж приблизно 9,695, більш ніж приблизно 9,795, більш ніж приблизно

Ко) 9,895, більш ніж приблизно 9,995, більш ніж приблизно 10,095, більш ніж приблизно 10,195, більш ніж приблизно 10,295, більш ніж приблизно 10,395, більш ніж приблизно 10,495, більш ніж приблизно 10,595, більш ніж приблизно 10,695, більш ніж приблизно 10,795, більш ніж приблизно 10,895, більш ніж приблизно 10,995, більш ніж приблизно 11,095, більш ніж приблизно 11,195, більш ніж приблизно 11,295, більш ніж приблизно 11,395, більш ніж приблизно 11,495 або більш ніж приблизно 11,595). Наприклад, рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, представлений в даному документі, може мати відсотковий вміст загальних М- зв'язаних гібридних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані монофосфорильовані гібридні олігосахариди (наприклад, пік 10 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 8,595 до 10,595, від приблизно 9,095 до приблизно 11,095 або від приблизно 8,595 до приблизно 9,595.

Типові способи визначення відсоткового вмісту загальних М-зв'язаних олігосахаридів, які являють собою моносіалільовані та монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 10 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

ХІ. Ізоелектрична точка

Рекомбінантні білки с-галактозидази-А людини, представлені в данному документі, також мають зміщену ізоелектричну точку у порівнянні з РабгагутеФ при аналізі за допомогою зображеного капілярного ізоелектричного фокусування (ісіЕЕ) (див. приклад З і таблицю 3).

Типові способи визначення ізоелектричної точки поліпептиду описані в прикладах. Додаткові способи визначення ізоелектричної точки поліпептиду (наприклад, у гелях для ізоелектричного фокусування) відомі з рівня техніки.

ХІІ. Відношення моль/моль манозо-6б-фосфату до білка

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в даному документі, можуть мати відношення моль/моль манозо-6б-фосфату до білка, яке є приблизно таке саме або більш ніж в РаргагутеФф. Вважають, що підвищене відношення моль/моль манозо-6б-фосфату до білка підвищує клітинне відновлення білка клітинами, що експресують манозо-6-фосфатний рецептор у плазматичній мембрані.

Еабга7утеФ має відношення моль/моль манозо-б6-фосфату до білка від приблизно 1,7 до приблизно 3,1. Наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази- А людини, представлений в бо даному документі (Е222), може мати відношення моль/моль манозо-6-фосфату до білка, яке в основному є таким самим, що і в ГабгалгутефФф або більш ніж 1,7 (наприклад, більш ніж 1,8, більш ніж 1,9, більш ніж 2,0, більш ніж 2,1, більш ніж 2,2, більш ніж 2,3, більш ніж 2,4, більш ніж 2,5, більш ніж 2,6, більш ніж 2,7, більш ніж 2,8, більш ніж 2,9, більш ніж 3,0, більш ніж 3,1, більш ніж 3,2, більш ніж 3,3, більш ніж 3,4 або більш ніж 3,5). Наприклад, рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, представлений в данному документі (Е222), може мати відношення моль/моль манозо-б6-фосфату до білка, яке становить від приблизно 1,8 до приблизно 3,5 (наприклад, від приблизно 1,8 до приблизно 3,4, від приблизно 1,8 до приблизно 3,3, від приблизно 1,8 до приблизно 3,2, від приблизно 1,8 до приблизно 3,1, від приблизно 1,8 до приблизно 3,0, від приблизно 1,8 до приблизно 2,9, від приблизно 1,8 до приблизно 2,8, від приблизно 1,8 до приблизно 2,7, від приблизно 1,8 до приблизно 2,6, від приблизно 1,8 до приблизно 2,5, 1,8 до приблизно 2,4, від приблизно 1,8 до приблизно 2,3, від приблизно 1,8 до приблизно 2,2, від приблизно 1,8 до приблизно 2,1, від приблизно 1,8 до приблизно 2,0, від приблизно 1,9 до приблизно 3,5, від приблизно 1,9 до приблизно 3,4, від приблизно 1,9 до приблизно 3,3, від приблизно 1,9 до приблизно 3,2, від приблизно 1,9 до приблизно 3,1, від приблизно 1,9 до приблизно 3,0, від приблизно 1,9 до приблизно 2,9, від приблизно 1,9 до приблизно 2,8, від приблизно 1,9 до приблизно 2,7, від приблизно 1,9 до приблизно 2,6, від приблизно 1,9 до приблизно 2,5, від приблизно 1,9 до приблизно 2,5, від приблизно 1,9 до приблизно 2,4, від приблизно 1,9 до приблизно 2,3, від приблизно 1,9 до приблизно 2,2, від приблизно 1,9 до приблизно 2,1, від приблизно 2,0 до приблизно 3,5, від приблизно 2,0 до приблизно 3,4, від приблизно 2,0 до приблизно 3,3, від приблизно 2,0 до приблизно 3,2, від приблизно 2,0 до приблизно 3,1, від приблизно 2,0 до приблизно 3,0, від приблизно 2,0 до приблизно 2,9, від приблизно 2,0 до приблизно 2,8, від приблизно 2,0 до приблизно 2,7, від приблизно 2,0 до приблизно 2,6, від приблизно 2,0 до приблизно 2,5, від приблизно 2,0 до приблизно 2,4, від приблизно 2,0 до приблизно 2,3, від приблизно 2,0 до приблизно 2,2, від приблизно 2,1 до приблизно 3,5, від приблизно 2,1 до приблизно 3,4, від приблизно 2,1 до приблизно 3,3, від приблизно 2,1 до приблизно 3,2, від приблизно 2,1 до приблизно 3,1, від приблизно 2,1 до приблизно 3,0, від приблизно 2,1 до приблизно 2,9, від приблизно 2,1 до приблизно 2,8, від приблизно 2,1 до приблизно 2,7, від приблизно 2,1 до приблизно 2,6, від приблизно 2,1 до приблизно 2,5, від приблизно 2,1 до приблизно 2,4, від приблизно 2,1 до

Ко) приблизно 2,3, від приблизно 2,2 до приблизно 3,5, від приблизно 2,2 до приблизно 3,4, від приблизно 2,2 до приблизно 3,3, від приблизно 2,2 до приблизно 3,2, від приблизно 2,2 до приблизно 3,1, від приблизно 2,2 до приблизно 3,0, від приблизно 2,2 до приблизно 2,9, від приблизно 2,2 до приблизно 2,8, від приблизно 2,2 до приблизно 2,7, від приблизно 2,2 до приблизно 2,6, від приблизно 2,2 до приблизно 2,5, від приблизно 2,2 до приблизно 2,4, від приблизно 2,3 до приблизно 3,5, від приблизно 2,3 до приблизно 3,4, від приблизно 2,3 до приблизно 3,3, від приблизно 2,3 до приблизно 3,2, від приблизно 2,3 до приблизно 3,1, від приблизно 2,3 до приблизно 3,0, від приблизно 2,3 до приблизно 2,9, від приблизно 2,3 до приблизно 2,8, від приблизно 2,3 до приблизно 2,7, від приблизно 2,3 до приблизно 2,6, від приблизно 2,3 до приблизно 2,5, від приблизно 2,4 до приблизно 3,5, від приблизно 2,4 до приблизно 2,9, від приблизно 2,4 до приблизно 2,8, від приблизно 2,4 до приблизно 2,7, від приблизно 2,4 до приблизно 2,6, від приблизно 2,5 до приблизно 3,5, від приблизно 2,5 до приблизно 3,4, від приблизно 2,5 до приблизно 3,3, від приблизно 2,5 до приблизно 3,2, від приблизно 2,5 до приблизно 3,1, від приблизно 2,5 до приблизно 3,0, від приблизно 2,5 до приблизно 2,9, від приблизно 2,5 до приблизно 2,8, від приблизно 2,5 до приблизно 2,7, від приблизно 2,6 до приблизно 3,5, від приблизно 2,6 до приблизно 3,4, від приблизно 2,6 до приблизно 3,3, від приблизно 2,6 до приблизно 3,2, від приблизно 2,6 до приблизно 3,1, від приблизно 2,6 до приблизно 3,0, від приблизно 2,6 до приблизно 2,9, від приблизно 2,6 до приблизно 2,8, від приблизно 2,7 до приблизно 3,5, від приблизно 2,7 до приблизно 3,4, від приблизно 2,7 до приблизно 3,3, від приблизно 2,7 до приблизно 3,2, від приблизно 2,7 до

БО приблизно 3,1, від приблизно 2,7 до приблизно 3,0, від приблизно 2,7 до приблизно 2,9, від приблизно 2,8 до приблизно 3,5, від приблизно 2,8 до приблизно 3,4, від приблизно 2,8 до приблизно 3,3, від приблизно 2,8 до приблизно 3,2, від приблизно 2,8 до приблизно 3,1, від приблизно 2,8 до приблизно 3,0, від приблизно 2,9 до приблизно 3,5, від приблизно 2,9 до приблизно 3,4, від приблизно 2,9 до приблизно 3,3, від приблизно 2,9 до приблизно 3,2, від приблизно 2,9 до приблизно 3,1, від приблизно 3,0 до приблизно 3,5, від приблизно 3,0 до приблизно 3,4, від приблизно 3,0 до приблизно 3,3, від приблизно 3,0 до приблизно 3,2, від приблизно 3,1 до приблизно 3,5, від приблизно 3,1 до приблизно 3,4, від приблизно 3,1 до приблизно 3,3, від приблизно 3,2 до приблизно 3,5, від приблизно 3,4 до приблизно 3,4 або від приблизно 3,3 до приблизно 3,5). бо Типові способи визначення відношення моль/моль манозо-6-фосфату до білка описані в прикладах. Додаткові способи відомі з рівня техніки.

Функціональні властивості

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини, представлені в данному документі, можуть мати одну або декілька (наприклад, одну, дві або три) з наступних функціональних ознак: підвищений ендоцитоз (наприклад, підвищена швидкість ендоцитозу) клітиною ссавця, що експресує манозо-6-фосфатний рецептор, знижене зв'язування з асіалоглікопротеїновим рецептором і підвищена афінність до манозо-6-фосфатного рецептора, кожна у порівнянні з

Еабгагутеф)

Способи визначення ендоцитозу (наприклад, швидкість ендоцитозу) рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини в клітині ссавця, що експресує манозо-6-фосфат, відомі з рівня техніки (наприклад, з Ов5рогпе єї аїЇ., Си. Ргоїос. Сеї! Віо!., Спарієї 11, Опії 11.18, 2005).

Необмежувальні приклади клітин ссавця, що експресують манозо-6-фосфатний рецептор, передбачають фібробласти й епітеліальні клітини. Як відомо з рівня техніки, ендоцитоз рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, може бути виявлений за зниженням рівнів білка в середовищі для культивування тканин (або в сироватці крові ссавця), підвищенням лізосомних або внутрішньоклітинних рівнів рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини в клітині ссавця, що експресує манозо-6-фосфатний рецептор, або опосередковано, наприклад, за зниженням накопичення глікосфінголіпідів з кінцевими а-галактозильними залишками, такими як глоботриаозилцерамід (С1/-3), в клітині ссавця, що контактує, або в середовищі для культивування тканин (або в сироватці крові ссавця). Зниження рівнів рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини в середовищі для культивування тканин (або в сироватці крові ссавця), може бути виявлено, наприклад, із застосуванням аналізу з антитілом (наприклад, імуносорбентного аналізу з імобілізованими ферментами) або аналізу активності (наприклад, аналізу активності із застосуванням рМР або 4МИ як субстратів). Прикладами антитіл, що зв'язуються з рекомбінантним білком са-галактозидази-А людини, є доступні від МіПіроге,

Пезрап Віозсієпсев, Іпс., Тпептто зсіепійіс Рієгсе Апііїродіев, Асгіз Апііродієє СтЬНнНі 0

Зузієтв. Способи визначення лізосомних або внутрішньоклітинних рівнів рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини можуть передбачати, наприклад, застосування імунофлуоресцентної мікроскопії, клітинної пермеабілізації та імуноблотингу і/або мас-спектрометрії клітинного або

Зо лізосомного лізату. Зниження накопичення глоботриаозилцераміду (СІ -3) може бути визначено, наприклад, шляхом виявлення рівнів (3/-3 в середовищі для культивування тканин або в сироватці крові ссавця в залежності від часу із застосуванням мас-спектрометрії (наприклад,

Кіт єї аї., Когеап 9. Іпієтт. Мей. 25:415-421, 2010) або аналізу з антитілом (наприклад, публікація заявки на патент США Мо 2012/0178105)3. У кожному випадку ендоцитоз рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини можна порівнювати з РабгагутеФф).

Способи визначення здатності білка (наприклад, рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини) до зв'язування з асіалоглікопротеїновим рецептором відомі з рівня техніки. Наприклад, аналіз для виявлення зв'язування рекомбінантного білка са-галактозидази-А людини з асіалоглікопротетїновим рецептором може передбачати стадію приведення в контакт клітини (наприклад, гепатоциту), що експресує асіалоглікопротеїн. Зв'язування рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини з асіалоглікопротетїновим рецептором, також можна виявити із застосуванням поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, методикою Віасоге) (див., наприклад, біоКтаїег еї а!., Віоогу. Мед. Спет. 17:7254-7264, 2009) або аналізу зв'язування асіалоглікопротетнового рецептора за допомогою флуоресцентної поляризації, описаного в

Когпіома ей а). (Апа). Віоспет. 425:43-46, 2012). У будь-якому випадку зв'язування рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини з асіалоглікопротеїновим рецептором можна порівнювати з Рабгагутеф)

Способи визначення зв'язування рекомбінантного білка а-галактозидази-А з манозо-6- фосфатним рецептором можуть бути здійснені із застосуванням аналізів, що передбачають стадію приведення рекомбінантного білка а-галактозидази-А у контакт з клітиною (наприклад, фібробластом або ендотеліальною клітиною), що експресує манозо-б6-фосфатний рецептор. В інших прикладах зв'язування рекомбінантного білка с-галактозидази-А з манозо-6-фосфатним рецептором може бути визначено із застосуванням поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, методикою Віасогє) або способів афінної хроматографії. Зв'язування рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини з манозо-б6-фосфатним рецептором можна порівнювати з Рабгагутеф)

Типові рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі, може мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бо моносіалільовані олігосахариди (наприклад, пік З профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до приблизно 1,695 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 1,395 або від приблизно 0,195 до приблизно 1,095) і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 11 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), більш ніж приблизно 7,595 (наприклад, більш ніж приблизно 8,595, більш ніж приблизно 9,095 або більш ніж приблизно 9,595). Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини може, крім того, мати відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 4 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), більш ніж приблизно 13,095 (наприклад, більш ніж приблизно 13,595, більш ніж приблизно 14,095, більш ніж приблизно 14,595, більш ніж приблизно 15,095, більш ніж приблизно 15,595 або більш ніж приблизно 16,095) і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 2 (наприклад, пік 6" профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), більш ніж приблизно 2,095 (наприклад, більш ніж приблизно 2,595, більш ніж приблизно 3,095, більш ніж приблизно 3,595, більш ніж приблизно 4,095, більш ніж приблизно 4,595, більш ніж приблизно 5,095, більш ніж приблизно 5,595, більш ніж приблизно 6,095, більш ніж приблизно 6,595 або більш ніж приблизно 7,095).

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини може додатково мати одну або декілька (наприклад, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім або дев'ять) з наступних фізичних характеристик: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (наприклад, пік 1 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до приблизно 3,995 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 3,595, від приблизно 0,195 до приблизно 3,095, від приблизно 0,195 до приблизно 2,595 або від приблизно 0,195 до приблизно 2,095); відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо- вмісні олігосахариди (наприклад, пік 2 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до приблизно 3,095 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 2,595 або від приблизно 0,195 до приблизно 2,095); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 5 профілювання

Зо міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), від приблизно 0,195 до приблизно 5,395 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 5,095, від приблизно 0,195 до приблизно 4,595, від приблизно 0,195 до приблизно 4,095, від приблизно 0,195 до приблизно 3,595, від приблизно 0,195 до приблизно 3,095 або від приблизно 0,195 до приблизно 2,595); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 1 (наприклад, пік 6 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 0,195 до приблизно 9,095 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 8,595, від приблизно 0,195 до приблизно 8,095, від приблизно 0,195 до приблизно 7,595, від приблизно 0,195 до приблизно 7,095, від приблизно 0,190 до приблизно 6,595, від приблизно 0,195 до приблизно 6,095, від приблизно 0,195 до приблизно 5,595, від приблизно 0,195 до приблизно 5,095, від приблизно 0,195 до приблизно 4,595, від приблизно 0,195 до приблизно 4,095, від приблизно 0,195 до приблизно 3,595, від приблизно 0,195 до приблизно 3,095, від приблизно 0,195 до приблизно 2,595 або від приблизно 0,195 до приблизно 2,095); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 7 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить від приблизно 0,195 до приблизно 7,090 (наприклад, від приблизно 0,195 до приблизно 6,595, від приблизно 0,195 до приблизно 6,095, від приблизно 0,195 до приблизно 5,595, від приблизно 0,195 до приблизно 5,095, від приблизно 0,195 до приблизно 4,595 або від приблизно 0,195 до приблизно 4,095); відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 8 профілювання міченого антраніловою кислотою М- зв'язаного олігосахариду), більш ніж приблизно 14,895 (наприклад, більш ніж приблизно 15,09, більш ніж приблизно 15,595, більш ніж приблизно 16,095, більш ніж приблизно 16,595, більш ніж приблизно 17,095, більш ніж приблизно 17,595, більш ніж приблизно 18,095, більш ніж приблизно 18,595, більш ніж приблизно 19,095, більш ніж приблизно 19,595, більш ніж приблизно 20,095, більш ніж приблизно 20,595, більш ніж приблизно 21,095, більш ніж приблизно 21,595, більш ніж приблизно 22,095, більш ніж приблизно 22,595 або більш ніж приблизно 23,095); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік У профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 4,990 (наприклад, більш ніж приблизно 5,095, більш ніж приблизно 5,595, більш ніж приблизно 6,095, 60 більш ніж приблизно 6,595, більш ніж приблизно 7,095, більш ніж приблизно 7,595 або більш ніж приблизно 8,095); і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані монофосфорильовані гібридні олігосахариди (наприклад, пік 10 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який становить більш ніж приблизно 8,295 (наприклад, більш ніж приблизно 8,595, більш ніж приблизно 9,095, більш ніж приблизно 9,595 або більш ніж приблизно 10,0965).

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини також може мати одну або декілька з наступних функціональних ознак: підвищений ендоцитоз (наприклад, підвищена швидкість ендоцитозу) клітиною ссавця, що експресує манозо-б6- фосфатний рецептор, знижене зв'язування з асіалоглікопротетїновим рецептором і підвищену афінність до манозо-6- фосфатного рецептора, у порівнянні з РГаргагутеф).

В інших прикладах рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди (наприклад, пік З профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який менше ніж в РабгагутеФф), і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс- манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 11 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який більш ніж в Рабгагутеф).

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини також може мати відсотковий вміст загальних

М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 4 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який є приблизно таким самим або більш ніж в РабгаггутеФф) та відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 2 (наприклад, пік 6 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який є більш ніж в РабгалутеФф).

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини також може мати один або декілька з наступних структурних ознак: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (наприклад, пік 1 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який менше ніж в Рабгагутеф); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 2 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який приблизно такий самий або менше ніж в Рабгалгутеф; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди (наприклад, пік 5 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який менше ніж в РабгагутеФф; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трьохрозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 1 (наприклад, пік 6 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який менше ніж в

ЕабгагутеФф; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (наприклад, пік 7 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який приблизно такий самий або менше ніж в

ЕабгагутеФф; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфорильовані олігосахариди (наприклад, пік 8 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який більше ніж в РабргагутефФ; відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (наприклад, пік У профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який більше ніж в РабгагутеФф); та відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані монофосфорильовані гібридні структури (наприклад, пік 10 профілювання міченого антраніловою кислотою М-зв'язаного олігосахариду), який більше ніж в

ЕабгагутеФ. Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини також може мати одну або декілька з наступних функціональних ознак: підвищений ендоцитоз (наприклад, підвищена швидкість ендоцитозу) клітиною ссавця, що експресує манозо-6- фосфатний рецептор, знижене зв'язування з асіалоглікопротетїновим рецептором і підвищену афінність до манозо-6- фосфатного рецептора, кожна у порівнянні з РГабгагутеф)

Вектори експресії

Також представлені в даному документі вектори експресії, що містять послідовність (наприклад, кКДНК), яка кодує рекомбінантні білки с-галактозидази-А людини за даним винаходом. Наприклад, вектор експресії може містити послідовність (наприклад, кКДНК), що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, яка щонайменше на 9095 ідентична (наприклад, щонайменше на 9095, 9295, 94905, 9695, 9895, 9995 або 10095 ідентична) 5ЕО ІЮ МО: 1. Крім послідовності вектори експресії можуть містити промотор (і необов'язково одну або декілька енхансерних послідовностей), функціонально пов'язаних з 5-кінцем послідовності бо (наприклад, кКДНК), що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини. Вектори експресії можуть містити послідовність, що кодує пептид білка СО52 людини зі стартовим кодоном ТТ, функціонально пов'язаним з 5-кінцем послідовності (наприклад, кДНК), що кодує рекомбінантний білок, і послідовність, що кодує полі(А) сайт розпізнавання, функціонально пов'язаний з 3'-кінцем послідовності (наприклад, кКДНК), що кодує рекомбінантний білок. Вектори експресії можуть містити послідовність (наприклад, КДНК), що кодує маркер добору ссавця (наприклад, білок синтетази людини або собаки), і промоторну послідовність, функціонально пов'язану з 5'-кінцем послідовності (наприклад, кКДНК), що кодує маркер добору ссавця, і необов'язково інтронну послідовність раннього 5МУ40 і полі(А) сигнальну послідовність, обидві з яких функціонально пов'язані з 3'-кінцем послідовності (наприклад, кКДНК), що кодує ген добору ссавця. Вектори експресії можуть містити одну або декілька (наприклад, дві або три) з прокаріотичної промоторної послідовності, яка функціонально пов'язана 3 5'-кінцем послідовності, що кодує прокаріотичний ген добору (наприклад, ген стійкості до ампіциліну), послідовність точки початку реплікації прокаріот та послідовність точки початку реплікації еукаріот.

Необмежувальні приклади промоторних послідовностей (і необов'язково однієї або декількох енхансерних послідовностей), які можуть бути функціонально пов'язані з послідовністю (наприклад, КДНК), що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, передбачають ранній промотор вірусу мавпи 40 (5М40), промотор рибосомального білка 21 (гре21), промотор Д-актину хом'яка, промотор цитомєгаловірусу (СМУ) (наприклад, передранній промотор СМУМ (див., наприклад, ТезсПпепдоп еї аї., Апіїісапсег Не5. 22:3325-3330, 2002), промотор убіквітину С (ОВС), промотор фактора елонгації 1-х (ЕЕТА), промотор фосфоенолпіруват-карбоксикінази (РСК), промоторну/енхансерну ділянку ІЕ2 з СММ миші (див., наприклад, СНагїеїага еї аї!., Віоїеснпо!ї. Віоєпа. 96:106-117, 2007) і промотор курячого Д-актину.

Додаткові необмежувальні приклади генних промоторів людини, що можуть бути застосовані у будь-якому з векторів експресії описаних в даному документі, описуються у базі даних промоторів ссавців (вебсайт інституту М/ізтаг тгротраб мізіег.ирепп.еди). Додаткові приклади промоторних послідовностей ссавців, що можуть бути застосовані у векторах експресії, відомі з рівня техніки. Одним необмежувальним прикладом промотора та енхансера, що можуть бути застосовані в плазміді експресії, є промотор курячого ВД-актину з енхансером СММУ (відомий з

Зо рівня техніки як промотор САСІС). Вектори експресії, представлені в даному документі, можуть містити послідовність промотора гро21, промотора В-актину хом'яка або раннього промотора

ЗМ40, функціонально пов'язану з 5'-кінцем послідовності (наприклад, КкКДНК), що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, послідовність, що кодує пептид білка СО52 людини зі стартовим кодоном ТО, функціонально пов'язану з 5'-кінцем нуклеїнової кислоти (наприклад, кКДНК), що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини (наприклад, будь- якої з нуклеїнових кислот, що кодують рекомбінантний білок са-галактозидази-А людини, описаний в даному документі), і послідовність, що містить полі(А) сайт розпізнавання, функціонально пов'язаний з 3-кінцем послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини.

Необмежувальні приклади послідовностей полі(А) сайта розпізнавання передбачають полі(А) сайт розпізнавання гормону росту великої рогатої худоби. Структурні ознаки полі(А) сайта розпізнавання людини описуються в Мипез єї аі!., ЕМВО .. 29:1523-1536, 2010. Додаткові полі(А) сайти розпізнавання добре відомі з рівня техніки.

У деяких прикладах вектор експресії мітить промотор рД-актину хом'яка й послідовність, що кодує пептид білка СО52 людини, зі стартовим кодоном ТТСИ, які функціонально пов'язані з 5'- кінцем послідовності (наприклад, КДНК), що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, і ранній інтрон 5М40 та полі(А) послідовність розпізнавання, функціонально пов'язану з 3-кінцем послідовності (наприклад, КДНК), що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини.

Деякі вектори експресії можуть містити послідовність, що кодує ген добору ссавця.

Необмежувальні приклади генів добору ссавця передбачають ген дигідрофолатредуктази, гени стійкості до гідроміцину, гени стійкості до неоміцину, гени стійкості до бластицидину, гени стійкості до зеоцину, гени глутамінсинтетази, гени стійкості до дигідрофолату та гени гіпоксантингуанін- фосфорибозилтрансферази. Приклади послідовностей, що кодують ці гени добору ссавця відомі з рівня техніки. 5'-кінець послідовності, що кодує ген добору ссавця може бути функціонально пов'язаний з промотором (наприклад, будь-яким з типових промоторів, описаних в даному документі або відомих з рівня техніки).

Деякі вектори експресії (наприклад, будь-який з векторів експресії, описаних в даному документі) можуть містити послідовність точки початку реплікації ссавців і/або послідовність бо точки початку реплікації прокаріот. Послідовності точки початку реплікації ссавців відомі з рівня техніки (наприклад, з Тодогоміс еї аї., Егопі. Віозсі,4:0859-0568, 1999; Аіадіет, Егопі. Віовсі. 9:2540-2547, 2004; Натіїп, Віоеззауз5 14:651-659, 1992). Послідовності точки початку реплікації прокаріот також відомі з рівня техніки (наприклад, з Магсгуп5кКі єї аї., Сцт. Оріп. Сепеї. Оєм. 3:775- 782, 1993).

Необмежувальним прикладом вектора є плазміда. Необмежувальні приклади плазмід, представлених в даному документі, показані на фігурах З і 4. На фігурі З зображена плазміда, що кодує наступні елементи: нуклеїнова кислота (наприклад, кКДНК), що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, промотор (наприклад, промотор р-актину хом'яка), зв'язаний з

Б'-кінцем нуклеїнової кислоти, що кодує білок а-галактозидази-А людини, послідовність, що кодує пептид СО52 людини, що має стартовий кодон ТО, який функціонально пов'язаний з 5'- кінцем послідовності, що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, полі(А) послідовність розпізнавання (наприклад, полі(А) послідовність розпізнавання раннього 5М40), що функціонально пов'язана з 3-кінцем другою, що кодує рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ген (маркер) добору ссавця (наприклад, ген дигідрофолатредуктази або ген глутамінсинтетази людини або собаки), і промоторна послідовність (наприклад, раннього промотора 5М40), функціонально пов'язана з

Б-кінцем послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує ген (маркер) добору ссавця. На фігурі 4 зображена плазміда експресії, що містить послідовність, яка кодує рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, промоторну послідовність (наприклад, промотора та інтрона СМУ), функціонально пов'язану з 5'-кінцем послідовності, що кодує рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, полі(А) послідовність розпізнавання (наприклад, полі(А) послідовність розпізнавання раннього 540), функціонально пов'язану з 3'-кінцем послідовності, що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, послідовність, що кодує ген (маркер) добору ссавця (наприклад, ген глутамінсинтетази), промоторну послідовність (наприклад, промотора

ЗУ40), функціонально пов'язану з 5'-кінцем послідовності, що кодує ген (маркер) добору ссавця, послідовність точки початку реплікації прокаріот, послідовність, що кодує прокаріотичний ген (маркер) добору (наприклад, ген стійкості до ампіциліну), прокаріотичну промоторну послідовність, функціонально пов'язану з 5'-кінцем прокаріотичного гена (маркера) добору, і послідовність точки початку реплікації еукаріот.

Зо Вектором експресії може бути вірусний вектор. Необмежувальні приклади вірусних векторів передбачають аденовірусні вектори, вектори вірусу герпесу, бакуловірусні вектори та ретровірусні вектори. Вектором експресії також може бути плазміда або косміда.

Клітини-хазяїни

Також в даному документі представлені клітини-хазяїни, що включають послідовність, що кодує рекомбінантний білок са-галактозидази-А людини, описаний в даному документі.

Послідовність може бути функціонально пов'язана з промоторною послідовністю (наприклад, будь-якою з типових промоторних послідовностей, описаних в даному документі, або будь-якою з промоторних послідовностей вірусів або ссавців, відомих з рівня техніки). Наприклад, послідовність, що кодує рекомбінантний білок са-галактозидази-А людини, і послідовність промоторної послідовності, функціонально пов'язаної з 5'-кінцем послідовності, що кодує рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, можуть бути інтегровані у хромосому в клітині- хазяїнові. В інших прикладах послідовність, що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, і промоторна послідовність, що функціонально пов'язана з 5'-кінцем послідовності, що кодує рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, присутні у векторі експресії (наприклад, будь-якому з векторів експресії, описаних в даному документі) в клітині-хазяїнові.

Способи введення нуклеїнових кислот (наприклад, будь-яких з нуклеїнових кислот або векторів експресії, описаних в даному документі) в клітину (наприклад, клітину-хазяїна ссавця), відомі з рівня техніки. Наприклад, нуклеїнова кислота може бути введена в клітину із застосуванням ліпофекції, електропорації, опосередкованої кальцію фосфатом трансфекції, вірусної (наприклад, ретровірусної) трансдукції, опосередкованої ОЕАЕ-декстраном клітинної трансфекції, опосередкованої дендримером трансфекції, ультразвукової порації, оптичної трансфекції, імпалефекції, гідродинамічної доставки, магнетофекції або балістичної трансфекції.

Клітиною-хазяїном може бути будь-який тип клітини ссавця. Наприклад, клітиною-хазяїном може бути лінія клітин, наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) (наприклад, клітини СНО 00144, клітини СНО-КІ, клональні клітини С02.31, клональні клітини А14.13, клональні клітини С02.57 і клональні клітини ГО5.43), 5р2.0, клітини мієломи (наприклад, М5/0),

В-клітини, клітини гібридоми, Т-клітини, ембріональні клітини нирки людини (НЕК) (наприклад,

НЕК 293Е і НЕК 29З3БЕ), епітеліальні клітини африканської зеленої мавпи (Мего) або епітеліальні бо клітини нирки собаки Мадіп-багтбу (кокер спанієля) (МОСК). Додаткові клітини ссавця, які можна

Зо культивувати із застосуванням способів, описаних в даному документі, відомі з рівня техніки.

Клітиною-хазяїном може бути, наприклад, епітеліальна клітина, ендотеліальна клітина, лімфоцит, клітина нирки, клітина легені, Т-клітина, клітина мієломи або В-клітина. Деякі клітини- хазяїни можна вирощувати в суспензійній культурі клітин або в культурі адгезивних клітин.

Способи створення лінії клітин ссавця

Також в даному документі представлені способи створення лінії клітин ссавця, застосовні для рекомбінантної експресії глікопротеїну (наприклад, рекомбінантного білка с-галактозидази-

А людини, будь-якого з інших ферментів, приведених в таблиці 1, або будь-якого з інших глікопротеїнів, відомих з рівня техніки). На фігурі 5 представлена блок-схема, що показує стадії, які можуть бути застосовні для створення батьківської лінії клітин, оптимізованої для експресії рекомбінантного глікопротеїну. Способи можуть передбачати забезпечення лінії залежних від сироватки крові іморталізованих клітин і послідовне культивування лінії клітин ссавця в: (1) середовищі для культивування клітин, що передбачає першу концентрацію (1Х) сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 30 днів (наприклад, від приблизно 5 днів до приблизно 25 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 20 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 15 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 12 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 11 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 9 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 8 днів або від приблизно 5 днів до приблизно 7 днів); (2) середовищі для культивування клітин, що передбачає від приблизно 0,2Х до приблизно 0,4Х (наприклад, від приблизно 0,2Х до приблизно 0,3Х) концентрацію сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 30 днів (наприклад, від приблизно 5 днів до приблизно 25 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 20 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 15 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 12 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 11 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 9 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 8 днів або від приблизно 5 днів до приблизно 7 днів); ї (3) середовищі для культивування клітин, що передбачає від приблизно 0,01Х до приблизно 0,25Х (наприклад, від приблизно 0,01Х до приблизно 0,20Х, від приблизно 0,01Х до приблизно 0,15Х або від приблизно 0,01Х до приблизно 0,08Х) сироватки крові тварин, протягом від приблизно 5 днів до приблизно 30 днів (наприклад, від приблизно 5 днів до

Ко) приблизно 25 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 20 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 15 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 12 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 11 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 9 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 8 днів або від приблизно 5 днів до приблизно 7 днів), створення культур одноклітинних субклонів з культури після послідовного культивування й відбір субклону, що має прийнятну трансфекційну ефективність, клітинний ріст у безсироватковому середовищі для культивування і рекомбінантну експресію білка; і культивування відібраного субклону у безбілковому, безсироватковому середовищі з визначеним хімічним складом протягом від приблизно 5 днів до приблизно 30 днів (наприклад, від приблизно 5 днів до приблизно 25 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 20 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 15 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 12 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 11 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 9 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 8 днів або від приблизно 5 днів до приблизно 7 днів); створення культур одноклітинних субклонів з культури після культивування у безбілковому, безсироватковому середовищі з визначеним хімічним складом і відбір субклону, що має прийнятні трансфекційну ефективність, пікову щільність клітин, ростові властивості, об'ємну продуктивність (МРЕ) і профіль глікозилювання для глікопротеїну, де відібраний субклон з (Її) є застосовним для рекомбінантної експресії глікопротеїну.

Також представлені способи створення лінії клітин ссавця, застосовні для рекомбінантної експресії глікопротеїну (наприклад, будь-якого з рекомбінантних білків, описаних в даному документі або відомих з рівня техніки), що передбачають (а) одержання лінії залежних від сироватки крові іморталізованих клітин і послідовне культивування лінії клітин ссавця в: (1) середовищі для культивування клітин, що передбачає першу концентрацію (1Х) (наприклад, приблизно 595) сироватки крові тварин (наприклад, фетальної бичачої сироватки крові) протягом від приблизно 1 дня до приблизно 30 днів (наприклад, приблизно 2 днів до приблизно 25 днів, приблизно 2 днів до приблизно 20 днів, приблизно 2 днів до приблизно 15 днів, приблизно 2 днів до приблизно 12 днів, приблизно 2 днів до приблизно 11 днів, приблизно 2 днів до приблизно 10 днів, приблизно 2 днів до приблизно 9 днів, приблизно 2 днів до приблизно 8 днів або приблизно 2 днів до приблизно 7 днів); (2) середовищі для культивування 60 клітин, що передбачає від приблизно 0,2Х до приблизно 0,6Х (наприклад, від приблизно 0,2Х до приблизно 0,5Х) концентрацію сироватки крові тварин (наприклад, фетальної бичачої сироватки крові) протягом від приблизно 1 дня до приблизно 30 днів (наприклад, приблизно 2 днів до приблизно 25 днів, приблизно 2 днів до приблизно 20 днів, приблизно 2 днів до приблизно 15 днів, приблизно 2 днів до приблизно 12 днів, приблизно 2 днів до приблизно 11 днів, приблизно 2 днів до приблизно 10 днів, приблизно 2 днів до приблизно 9 днів, приблизно 2 днів до приблизно 8 днів або приблизно 2 днів до приблизно 7 днів); і (3) середовищі для культивування клітин, що передбачає приблизно ОХ до приблизно 0,20Х (наприклад, приблизно ОХ до приблизно 0,15Х, приблизно ОХ до приблизно 0,10Х або приблизно ОХ до приблизно 0,05Х) сироватки крові тварин (наприклад, фетальної бичачої сироватки крові) протягом від приблизно 5 днів до приблизно 30 днів (наприклад, від приблизно 5 днів до приблизно 25 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 20 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 15 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 12 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 11 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 10 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 9 днів, від приблизно 5 днів до приблизно 8 днів або від приблизно 5 днів до приблизно 7 днів); (Б) створення культур одноклітинних субклонів з культури після послідовного культивування, і відбір культури субклону, що має прийнятні трансфекційну ефективність, клітинний ріст у безсироватковому середовищі для культивування і рекомбінантну експресію білка (наприклад, відбір культури субклону, що має найкращу трансфекційну ефективність, клітинний ріст і рекомбінантну експресію білка у порівнянні з іншими тестованими культурами субклонів); (с) створення культур одноклітинних субклонів з відібраної культури субклону в (Б); і (4) відбір культури одноклітинного субклону, створеної в (с), що має прийнятні трансфекційну ефективність, пікову щільність клітин (наприклад, пікову щільність клітин в безсироватковому середовищі), ростові властивості (наприклад, ріст в безсироватковому середовищі), об'ємну продуктивність (УРВ) і рекомбінантну експресію білка, де відібраний субклон з (а) є застосовним для рекомбінантної експресії глікопротеїну (наприклад, культура субклону, що має найкращу трансфекційну ефективність, пікову щільність клітин, ростові властивості, УРЕ і рекомбінантну експресію білка) у порівнянні з іншими тестованими культурами субклону).

Також в даному документі представлені клітини ссавця або лінії клітин ссавця, отримані будь-яким із способів, описаних в даному документі. Необмежувальні приклади залежних від

Зо сироватки крові іморталізованих клітин, які можуть бути застосовані у будь-якому із способів, описаних в даному документі, передбачають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини мієломи, В- клітини, клітини гібридоми, Т-клітини, ембріональні клітини нирки людини (НЕК), епітеліальні клітини африканської зеленої мавпи (Мего) та епітеліальні клітини нирки собаки Мадіп-ОСагбру (кокер спанієля) (МОСК). Інші лінії залежних від сироватки крові іморталізованих клітин, що можуть бути застосовані в будь-якому із способів, описаних в даному документі, відомі з рівня техніки. Наприклад, залежною від сироватки крові лінією іморталізованих клітин може бути лінія епітеліальних клітин, лінія ендотеліальних клітин, лінія клітин-лімфоцитів, лінія клітин нирки, лінія клітин легені, лінія Т-клітин, лінія клітин мієломи або лінія В- клітин. У деяких прикладах залежна від сироватки крові лінія іморталізованих клітин зростає у суспензії. В інших прикладах залежна від сироватки крові лінія іморталізованих клітин зростає в культурі адгезивних клітин.

У деяких прикладах залежна від сироватки крові лінія іморталізованих клітин ендогенно не експресує дигідрофолатредуктазу. Відібраний субклон (або перший, або другий субклон, відібраний в способах) може зростати в суспензії.

Способи культивування лінії іморталізованих клітин ссавця відомі з рівня техніки. Способи визначення ефективності трансфекції, клітинного росту у безсироватковому середовищі для культивування, рекомбінантної експресії білка, пікової щільності клітин (наприклад, пікової щільності життєздатних клітин), ростових властивостей клітин, об'ємної продуктивності та профілю глікозилювання отриманого рекомбінантного білка, добре відомі з рівня техніки.

Наприклад, ефективність трансфекції може бути визначена шляхом виявлення рівня експресії репортерного гена у плазміді експресії, трансфекованої в клітину (наприклад, експресію такого репортерного гена можна виявити із застосуванням сортування клітин за допомогою флуоресценції). Рекомбінантна експресія білка, наприклад, може бути визначена шляхом виявлення рівнів рекомбінантного білка, присутнього в середовищі для культивування тканин або в клітині із застосуванням антитіла, яке специфічно зв'язується з рекомбінантним білком.

Рекомбінантна експресія білка може передбачати, наприклад, одне або обидва з антитіла або ферменту (наприклад, рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини або будь-якого з ферментів, приведених на фігурі 1). Пікову щільність клітин і клітинний ріст можна оцінювати, наприклад, шляхом вимірювання щільності клітин (наприклад, щільності життєздатних клітин) в бо залежності від часу у культурі клітин (наприклад, із застосуванням гемоцитометра або іншого із комерційно доступних автоматичних лічильників клітин). Об'ємна продуктивність клітини може бути визначена із застосуванням способів, відомих з рівня техніки, шляхом оцінювання рівнів рекомбінантного білка, присутнього в середовищі для культивування клітин або в клітині в залежності від часу. Профіль глікозилювання рекомбінантного глікопротеїну, продукованого клітиною, може бути визначений, наприклад, із застосуванням будь-якого із способів, описаних в розділі Приклади даного опису (наприклад, дериватизація 2-амінобензойною кислотою (АА) і виявлення за допомогою капілярного електрофорезу з індукованою лазером флуоресценцією).

З рівня техніки добре відомо, що лінію клітин ссавця, отриману способами, описаними в даному документі, можна зберігати при низькій температурі (наприклад -20"С, нижче -30"С, нижче -407С, нижче -507С, нижче -60"С, нижче -70"С або нижче -807"С) до подальшого застосування. Способи отримання маточних культур лінії клітин ссавця для зберігання при низьких температурах описані, наприклад, в Нем/йї, Меїпоаз Мої! Віо!. 640:83-105, 2010, і Ріеєїап,

Сит. Ргоїос. Нит. Сепеї. Арепаїх 3:30, 2006). У деяких прикладах лінії клітин ссавця, отримані способами, описаними в даному документі, не піддаються середовищу, що містить сироватку крові, або середовищу для культивування, що містить сироватку крові (наприклад, до зберігання та/або після зберігання). У деяких прикладах лінії клітин ссавця, отримані способами, описаними в даному документі, культивують тільки в середовищі для культивування без компонентів тваринного походження (АОС). У деяких прикладах лінії клітин ссавця, отримані способами, описаними в даному документі, культивують тільки в безсироватковому, безбілковому ростовому середовищі з визначеним хімічним складом.

Способи отримання рекомбінантного глікопротеїну

Також в даному документі представлені способи отримання рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, рекомбінантного білка са-галактозидази-А людини, будь-якого з ферментів, приведених на фігурі 1, або будь-якого рекомбінантного глікопротеїну, відомого з рівня техніки).

Ці способи передбачають одержання клітини ссавця, отриманої будь-яким із способів, описаних в даному документі, введення в клітину нуклеїнової кислоти (наприклад, вектора експресії), що містить послідовність, що кодує глікопротеїн (наприклад, рекомбінантний білок с-галактозидази-

А людини, будь-який з ферментів, описаних на фігурі 1, і будь-який інший глікопротеїн, відомий з рівня техніки), культивування клітини в безсироватковому середовищі для культивування в

Зо умовах, достатніх для продукування глікопротеїну, і збирання глікопротеїну з клітини або з ростового середовища для культивування. Також представлені рекомбінантні глікопротеїни (наприклад, рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини), отримані будь-яким із способів, описаних в даному документі.

В деяких випадках нуклеїновою кислотою, що включає послідовність, що кодує глікопротеїн, є вектор експресії (наприклад, будь-який з векторів експресії, описаних в даному документі). В інших прикладах нуклеїнова кислота, що включає послідовність, що кодує глікопротеїн, інтегрована в хромосому клітини ссавця.

У деяких прикладах культивування здійснюють із застосуванням суспензійної культури клітин. В інших прикладах культивування здійснюють із застосуванням ряду мікроносіїв, що мають поверхню, яка забезпечує приєднання та ріст клітини ссавця. Ряд мікроносіїв може мати середній діаметр, наприклад, від приблизно 20 мкм до приблизно 1 мм (наприклад, від приблизно 20 мкм до приблизно 250 мкм, від приблизно 100 мкм до приблизно 250 мкм, від приблизно 150 мкм до приблизно 250 мкм, від приблизно 250 мкм до 500 мкм, від приблизно 200 мкм до приблизно 300 мкм, від приблизно 750 мкм до 1 мм, від приблизно 200 мкм до приблизно 800 мкм, від приблизно 200 мкм до приблизно 500 мкм або від приблизно 500 мкм до приблизно 800 мкм), де мікроносії мають поверхню, яка дозволяє або забезпечує приєднання клітини ссавця (наприклад, будь-якої з клітин ссавця, описаних в даному документі або відомих з рівня техніки). У деяких прикладах мікроносій може містити одну або декілька пор (наприклад, одну або декілька пор з середнім діаметром від приблизно 10 мкм до приблизно 100 мкм). В деяких випадках поверхні мікроносіїв і/або поверхня однієї або декількох пор у багатьох мікроносіїв покриті засобом, що забезпечує приєднання клітини ссавця до мікроносія (наприклад, приєднання до зовнішньої поверхні мікроносіїв і/або до поверхні пор в мікроносії).

Мікроносії можуть бути приблизно сферичними або еліпсоїдними за формою. За деякими варіантами здійснення мікроносії мають зовнішню поверхню, і/або пори мікроносія мають поверхню, яка є позитивно зарядженою (наприклад, позитивно зарядженою через присутність

М,М-діетиламіноетильних груп). Необмежувальні типові мікроносії, які можуть бути застосовані у будь-якому із способів, описаних в даному документі, включають СуїоРогетМ 1 і СуюРогеТтм 2 (доступний від СЕ Неайнсагє, І йе Зсієпсев5, Різсаїаулау, Мем Уегзеу). Додаткові приклади мікроносіїв, які можуть бути застосовані для культивування, загально доступні й відомі з рівня бо техніки.

У деяких прикладах культивування здійснюють із застосуванням біореактора. Біореактор може мати об'єм, наприклад, від приблизно 1 л до приблизно 10000 л (наприклад, від приблизно 1 л до приблизно 50 л, від приблизно 50 л до приблизно 500 л, від приблизно 500 л до приблизно 1000 л, від 500 л до приблизно 5000 л, від приблизно 500 л до приблизно 10000 л, від приблизно 5000 л до приблизно 10000 л, від приблизно 1 л до приблизно 10000 л, від приблизно 1 л до приблизно 8000 л, від приблизно 1 л до приблизно 6000 л, від приблизно 1 л до приблизно 5000 л, від приблизно 100 л до приблизно 5000 л, від приблизно 10 л до приблизно 100 л, від приблизно 10 л до приблизно 4000 л, від приблизно 10 л до приблизно 3000 л, від приблизно 10 л до приблизно 2000 л або від приблизно 10 л до приблизно 1000 л).

Кількість рідкого середовища для культивування, присутнього у біореакторі, може складати, наприклад, від приблизно 0,5 л до приблизно 5000 л (наприклад, від приблизно 0,5 л до приблизно 25 л, від приблизно 25 л до приблизно 250 л, від приблизно 250 л до приблизно 500 л, від 250 л до приблизно 2500 л, від приблизно 250 л до приблизно 5000 л, від приблизно 2500 л до приблизно 5000 л, від приблизно 0,5 л до приблизно 5000 л, від приблизно 0,5 л до приблизно 4000 л, від приблизно 0,5 л до приблизно 3000 л, від приблизно 0,5 л до приблизно 2500 л, від приблизно 50 л до приблизно 2500 л, від приблизно 5 л до приблизно 50 л, від приблизно 5 л до приблизно 2000 л, від приблизно 5 л до приблизно 1500 л, від приблизно 5 л до приблизно 1000 л або від приблизно 5 л до приблизно 500 л). Культивування клітин може бути здійснено, наприклад, із застосуванням біореактора з підживленням або перфузійного біореактора. Культивування може бути здійснено шляхом культивування з підживленням або перфузійного культивування (наприклад, у біореакторі).

Внутрішня поверхня будь-якого з біореакторів, описаних в даному документі, може мати щонайменше одне покриття (наприклад, щонайменше одне покриття з желатину, колагену, полі-І -орнітину, полістиролу й ламініну), та, як відомо з рівня техніки, один або декілька отворів для барботування ОО, СО» і Ме2 крізь рідке середовище для культивування та механізм перемішування для збовтування рідкого середовища для культивування. Біореактор може інкубувати культуру клітин в атмосфері з контрольованою вологістю (наприклад, при вологості більш ніж 2095, 3095, 4095, 5095, 6095, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095 або 9595, або при вологості 10095). Біореактор також може бути оснащений механічним пристроєм, який здатний вилучати

Зо об'єм рідкого середовища для культивування з біореактора, і необов'язково фільтр в механічному пристрої, що вилучає клітини з рідкого середовища для культивування протягом процесу перенесення рідкого середовища для культивування з біореактора (наприклад, система змінного тангенціального потоку (АТЕ) або фільтрації в тангенціальному потоці (ТЕР)).

Культивування може передбачати піддавання рідкого середовища для культивування у біореакторі атмосфері, що містить максимум або приблизно 1595 СО» (наприклад, максимум або приблизно 1495 Со», 1295 Со», 1095 Со», во Со», бою Со», Бо Со», доро Со», Зоо Со», 29

Со» або максимум або приблизно 195 СО»).

Культивування можна здійснювати при температурі від приблизно 3170 до приблизно 4070.

Фахівцям буде зрозуміло, що температура може бути змінена в конкретній точці(ах) часу протягом культивування, наприклад, погодинно або щодня. Наприклад, температура може бути змінена або зміщена (наприклад, підвищена або знижена) через приблизно один день, два дні, три дні, чотири дні, п'ять днів, шість днів, сім днів, вісім днів, дев'ять днів, десять днів, одинадцять днів, дванадцять днів, чотирнадцять днів, п'ятнадцять днів, шістнадцять днів, сімнадцять днів, вісімнадцять днів, дев'ятнадцять днів або приблизно двадцять днів або більше після початкового засівання біореактора клітиною ссавця). Наприклад, температура може бути зміщена вверх (наприклад, змінена до або до приблизно 0,1,0,2,0,3,0,4,0,5,0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,1,5,2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5,5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або до, або до приблизно 2070). Наприклад, температура може бути зміщена вниз (наприклад, змінена до більш ніж 0,052; або приблизно 0,1,0,2,0,3,0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,1,0,1,5,2,0,2,5,3,0,3,5,4,0,4,5,5,0,5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або до, або до приблизно 2020).

Культивування може бути здійснено із застосуванням безбілкового, безсироваткового середовища з визначеним хімічним складом. Необмежувальні приклади такого середовища відомі з рівня техніки та є комерційно доступними. Необмежувальні приклади застосовного середовища для культивування передбачають, наприклад, СО СНО, Орії СНО і Ропі СНО (усі доступні від Ше ТесНипоіодієв; Стапа Івіапа, МУ), середовище Нусеїї СНО (Тнепто Рівпег

Зсіепійіс, Іпс.; Майнат, МА), середовище Ех-сеї!ї СО СНО Ривіоп (бідта-Аїагсн Со.; 51. І оців,

МО) і середовище РожегСНО (І опга Стоир, Па.; Вазеї, 5м/йї2епапа).

Клітиною ссавця може бути будь-яка з клітин ссавця, описаних в даному документі. 60 Наприклад, клітиною ссавця може бути клітина СНО. Клітиною ссавця може бути клітина, яка ендогенно не експресує дигідрофолатредуктазу (наприклад, клітина СНО, яка ендогенно не експресує дигідрофолатредуктазу).

Рекомбінантним глікопротевїном може бути фермент (наприклад, білок а-галактозидази-А людини, будь-який з білків, наведених на фігурі 1, або будь-який інший глікопротеїн, відомий з рівня техніки) або антитіло або його фрагмент, що зв'язує антиген. У деяких прикладах нуклеїнова кислота (наприклад, вектор експресії) включає послідовність, яка щонайменше на 9095 (наприклад, щонайменше на 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095) ідентична 5ЕО ІО МО: 1. Нуклеїнова кислота (наприклад, вектор експресії) може містити промоторну послідовність, функціонально пов'язану з 5'-кінцем нуклеїнової кислоти, що кодує глікопротеїн, послідовність, яка кодує пептид більюьа СО52 людини зі стартовим кодоном ТТа, функціонально пов'язаним з 5'-кінцем нуклеїнової кислоти, що кодує глікопротеїн, і послідовність, яка кодує полі(А) сайт розпізнавання, функціонально пов'язаний з 3'-кінцем нуклеїнової кислоти, що кодує глікопротеїн. Наприклад, промоторна послідовність може бути вибрана з групи, що складається з промотора грбе21 хом'яка, промотора р-актину хом'яка й раннього промотора 5М40. Послідовністю, що кодує полі(А) сайт розпізнавання може бути послідовність полі(А) сайта розпізнавання раннього 5У40. У деяких прикладах промоторною послідовністю може бути промотор р-актину хом'яка, а полі(А) послідовністю розпізнавання є послідовність полі(А) сайта розпізнавання раннього 540. У деяких прикладах нуклеїнова кислота додатково містить послідовність, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки (наприклад, де 5'-кінець нуклеїнової кислоти, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки, функціонально пов'язаний з раннім промотором 5М40, а 3'-кінець нуклеїнової кислоти, що кодує глутамінсинтетазу людини або собаки, функціонально пов'язаний з інтроном раннього 5МУ40 і полі(А) сигнальною послідовністю). У деяких прикладах нуклеїнова кислота додатково містить послідовність, що кодує дигідрофолатредуктазу (ОНЕВ) (наприклад, ОНЕВ людини або миші) (наприклад, де 5'-кінець нуклеїнової кислоти, що кодує дигідрофолатредуктазу, функціонально пов'язаний з раннім промотором 5М40, а 3- кінець нуклеїнової кислоти, що кодує дигідрофолатредуктазу, функціонально пов'язаний з раннім інтроном 5М40 і полі(А) сигнальною послідовністю).

Культивування може бути здійснено із застосуванням перфузійного біореактора.

Зо Перфузійне культивування добре відомо з рівня техніки й передбачає вилучення з біореактора першого об'єму першого рідкого середовища для культивування (наприклад, що включають будь-які концентрації клітин ссавця, наприклад, перший об'єм першого рідкого середовища для культивування, що практично не містить клітини) і додавання до першого рідкого середовища для культивування другого об'єму другого рідкого середовища для культивування. Вилучання й додавання може бути здійснено одночасно або послідовно або з комбінації цих двох варіантів.

Крім того, вилучення й додавання можна здійснювати безперервно (наприклад, при швидкості, при якій вилучається й замінюється об'єм від 0,195 до 80095 (наприклад, від 195 до 70095, від 195 до 60095, від 195 до 50095, від 195 до 40095, від 195 до 35095, від 195 до 300905, від 195 до 250965, від 195 до 10095, від 10095 до 200905, від 595 до 15095, від 1095 до 5095, від 1595 до 4095, від 895 до 8095 і від 495 до 3095) об'єму біореактора або об'єму першого рідкого середовища для культивування за будь-який даний період часу (наприклад, за 24-годинний період, за інкрементальний період часу від приблизно 1 години до приблизно 24 годин або за інкрементальний період часу більш ніж 24 години)), або періодично (наприклад, один раз кожного третього дня, через день, один раз в день, двічі на день, три рази на день, чотири рази на день або п'ять разів на день), або з будь-якою комбінацією цих варіантів. При періодичному здійсненні об'єм, який вилучають або замінюють (наприклад, за приблизно 24-годинний період, за інкрементальний період часу від приблизно 1 години до приблизно 24 годин або за інкрементальний період часу більш ніж 24 години), можуть становити, наприклад, від 0,195 до 80095 (наприклад, від 195 до 70095, від 195 до 600905, від 195 до 500905, від 195 до 40095, від 195 до 30090, від 195 до 20095, від 195 до 10095, від 10095 до 20095, від 595 до 150905, від 1095 до 5095, від 1595 до 4095, від 895 до 8095 і від 495 до 3095) об'єму біореактора або першого об'єму рідкого середовища для культивування. Перший об'єм першого рідкого середовища для культивування, що вилучають, і другий об'єм другого рідкого середовища для культивування, що додають, може в деяких випадках підтирмуватися приблизно однаковим протягом кожного 24-годинного періоду (або, як альтернатива, протягом інкрементального періоду часу від приблизно 1 години до приблизно 24 годин або інкрементального періоду часу більш ніж 24 годин) протягом усього або частини періоду культивування. Як відомо з рівня техніки, швидкість, при якій вилучають перший об'єм першого рідкого середовища для культивування (об'єм/одиниця часу), і швидкість, при якій додають другий об'єм другого рідкого середовища для культивування бо (об'єм/ одиниця часу), можуть варіювати. Швидкість, при якій вилучають перший об'єм першого рідкого середовища для культивування (об'єм/одиниця часу), і швидкість, при якій додають другий об'єм другого рідкого середовища для культивування (об'єм/одиниця часу), можуть бути приблизно однаковими або можуть біти різними.

Як альтернатива, об'єм, що вилучають і додають, може змінюватися (наприклад, поступово підвищуватися) протягом кожного 24-годинного періоду (або, як альтернатива, протягом інкрементального періоду часу від 1 години до приблизно 24 годин або інкрементального період часу більш ніж 24 години) в ході періоду культивування. Наприклад, об'єм першого рідкого середовища для культивування, що вилучають, та об'єм другого рідкого середовища для культивування, що додають, за кожний 24-годинний період (або, як альтернатива, протягом інкрементального періоду часу від 1 години до приблизно 24 годин або інкрементального період часу більш ніж 24 години), за період культивування можуть бути підвищені (наприклад, поступово або ступінчастими кроками) від об'єму, який становить від 0,595 до приблизно 2095 об'єму біореактора або об'єму першого рідкого середовища для культивування до від приблизно 2595 до приблизно 15095 об'єму біореактора або об'єму першого рідкого середовища для культивування.

Фахівцям буде зрозуміло, що перше рідке середовище для культивування і друге рідке середовище для культивування можуть бути середовищами одного типу (наприклад, безсироватковим або безсироватковим, безбілюовим середовищем з визначеним хімічним складом). В інших випадках перше рідке середовище для культивування і друге рідке середовище для культивування можуть бути різними.

Перший об'єм першого рідкого середовища для культивування може бути вилучений, наприклад, із застосуванням механічної системи й/або за допомогою просочування або гравітаційного потоку об'єму крізь стерильну мембрану з відсіканням за молекулярною масою, при цьому виключаються клітини ссавця, присутні в об'ємі.

Другий об'єм другого рідкого середовища для культивування може бути доданий до першого рідкого середовища для культивування автоматично, наприклад, перфузійним насосом. В деяких випадках вилучення першого об'єму першого рідкого середовища для культивування (наприклад, першого об'єму першого рідкого середовища для культивування, що практично не містить клітин ссавця) і додавання до першого рідкого середовища для культивування другого

Зо об'єму другого рідкого середовища для культивування не відбувається протягом щонайменше 1 години (наприклад, протягом 2 годин, протягом З годин, протягом 4 годин, протягом 5 годин, протягом 6 годин, протягом 7 годин, протягом 8 годин, протягом 9 годин, протягом 10 годин, протягом 12 годин, протягом 14 годин, протягом 16 годин, протягом 18 годин, протягом 24 годин, протягом 36 годин, протягом 48 годин, протягом 72 годин, протягом 96 годин або після 96 годин) після засівання біореактора клітиною ссавця.

Як альтернатива або додатково, культивування може бути здійснено із застосуванням біореактора з підживленням. Таке культивування є відомим з рівня техніки та передбачає протягом більшої частини періоду культивування додавання (наприклад, періодичне або безперервне додавання) до першого рідкого середовища для культивування другого об'єму другого рідкого середовища для культивування. Додавання другого рідкого середовища для культивування може бути здійснено безперервно (наприклад, при швидкості додавання об'єму від 0,195 до 30095 (наприклад, від 195 до 25095, від 195 до 10095, від 10095 до 200905, від 595 до 15095, від 1095 до 5095, від 1595 до 4095, від 895 до 8095 і від 495 до 3095) об'єму біореактора або об'єму першого рідкого середовища для культур за будь-який даний період часу (наприклад, за 24-годинний період, за інкрементальний період часу від приблизно 1 години до приблизно 24 годин або за інкрементальний період часу більш ніж 24 години)), або періодично (наприклад, один раз кожного третього дня, через день, один раз в день, двічі на день, три рази на день, чотири рази на день або п'ять разів на день), або з будь-якою комбінацією цих варіантів. При періодичному здійсненні об'єм, який додають (наприклад, за приблизно 24-годинний період, за

БО інкрементальний період часу від приблизно 1 години до приблизно 24 годин або за інкрементальний період часу більш ніж 24 години), можуть становити, наприклад, від 0,195 до 30095 (наприклад, від 195 до 20095, від 195 до 10095, від 10095 до 200905, від 595 до 15095, від 1090 до 5095, від 1595 до 4095, від 895 до 8095 і від 495 до 3095) об'єму біореактора або першого об'єму рідкого середовища для культивування. Другий об'єм другого рідкого середовища для культивування, що додають, може в деяких випадках підтримуватися приблизно однаковим протягом кожного 24-годинного періоду (або, як альтернатива, протягом інкрементального періоду часу від приблизно 1 години до приблизно 24 годин або інкрементального періоду часу більш ніж 24 годин) протягом усього або частини періоду культивування. Як відомо з рівня техніки, швидкість, при якій додають другий об'єм другого рідкого середовища для бо культивування (об'єм/одиниця часу), може варіювати протягом усього або частини періоду культивування. Наприклад, об'єм другого рідкого середовища для культивування, що додають, може змінюватися (наприклад, поступово підвищуватися) протягом кожного 24-годинного періоду (або, як альтернатива, протягом інкрементального періоду часу від 1 години до приблизно 24 годин або інкрементального період часу більш ніж 24 години) в ході періоду культивування. Наприклад, об'єм другого рідкого середовища для культивування, що додають, за кожний 24-годинний період (або, як альтернатива, протягом інкрементального періоду часу від 1 години до приблизно 24 годин або інкрементального період часу більш ніж 24 години), за період культивування можуть бути підвищені (наприклад, поступово або ступінчастими кроками) від об'єму, який становить від 0,595 до приблизно 2095 об'єму біореактора або об'єму першого рідкого середовища для культивування до від приблизно 2595 до приблизно 15095 об'єму біореактора або об'єму першого рідкого середовища для культивування. Швидкість, при якій додають другий об'єм другого рідкого середовища для культивування (об'єм/одиниця часу), може бути приблизно однаковою протягом усього або частини періоду культивування.

Фахівцям буде зрозуміло, що перше рідке середовище для культивування і друге рідке середовище для культивування можуть бути середовищами одного типу (наприклад, безбілюювим середовищем для культур або безсироватковим, безбілюовим середовищем з визначеним хімічним складом). В інших випадках першим рідким середовищем для культивування може бути тип, який відрізняється від другого рідкого середовища для культивування. Об'єм другого рідкого середовища для культур може бути доданий до першого рідкого середовища для культивування автоматично, наприклад, перфузійним насосом.

В деяких випадках додавання до першого рідкого середовища для культивування другого об'єму другого рідкого середовища для культивування не відбувається через щонайменше 1 годину, але не більш ніж 7 днів після засівання біореактора клітиною ссавця (наприклад, до щонайменше 2 годин, протягом З годин, протягом 4 годин, протягом 5 годин, протягом 6 годин, протягом 7 годин, протягом 8 годин, протягом 9 годин, протягом 10 годин, протягом 12 годин, протягом 14 годин, протягом 16 годин, протягом 18 годин, протягом 24 годин, протягом 36 годин, протягом 48 годин, протягом 72 годин, протягом 96 годин або через 96 годин, але не більш ніж 7 днів після засівання біореактора клітиною ссавця). Клітинне середовище для культивування в культурах з підживленням зазвичай збирають наприкінці періоду

Зо культивування, однак, середовище для культивування клітин в культурах з підживленням також можна збирати в одну або декілька точок часу протягом періоду культивування.

Фахівцям буде зрозуміло, що будь-який з різних параметрів культивування (наприклад, біореактор, об'єми, швидкості або частоти заміни об'ємів культури, перемішування, температури, середовище для культивування і/або концентрації СО»2), згадані в даному документі, можуть бути застосовані у будь-якій комбінації при здійсненні цих способів.

Може біти здійснена додаткова стадія виділення рекомбінантного глікопротеїну. Як добре відомо з рівня техніки, такі способи відрізняються в залежності від фізичних властивостей та активностей глікопротеїну. Наприклад, параметри, такі як специфічність зв'язування глікопротеїну (наприклад, субстратна або активність зв'язування антигену), сумарний заряд мМабо розмір, треба враховувати при розробці стадій для виділення рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, з середовища для культивування або з клітини). Один або декілька будь- яких з наступних способів можуть бути застосовані для виділення рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, рекомбінантного глікопротеїну, отриманого із застосуванням будь- якого із способів, описаних в даному документі): афінна колонкова хроматографія, іоно- (наприклад, катіоно- або аніоно-) обмінна колонкова хроматографія, ексклюзійна колонкова хроматографія, зворотно-фазова колонкова хроматографія, фільтрація й осадження.

Необмежувальні способи виділення рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини описані в прикладах.

У деяких прикладах виділення рекомбінантного глікопротеїну з рідкого середовища для культивування може бути здійснено із застосуванням інтегрованого безперервного процесу (наприклад, процесу, що передбачає застосування щонайменше двох хроматографічних систем с кількома колонками (МСС5)). Необмежувальні приклади інтегрованих безперервних процесів для виділення рекомбінантного глікопротеїну описані в попередніх заявках на патенти США

МоМо 61/775060 і 61/856390, а також МО 14/137903 Необмежувальні приклади інтегрованих та безперервних процесів виділення (ПАСА, представленого у даному документі, з рідкого середовища для культивування описані нижче.

Способи, описані в даному документі, додатково можуть передбачати складання виділеного рекомбінантного глікопротеїну у фармацевтично прийнятному допоміжному засобі або буфері (наприклад, для введення суб'єкту). Такі способи додатково можуть передбачати стерильне 60 фільтрування, інактивацію вірусів, ОМ опромінення й/або ліофілізацію або будь-яку їх комбінацію.

Інтегровані й безперервні процеси виділення білка ПІТАСА

Представлений у даному документі ПАСА можна виділяти із застосуванням інтегрованого й безперервного процесів. Способи виділення рекомбінантного білка із застосуванням інтегрованого і безперервного процесів і деталі стосовно стадії таких процесів відомі з рівня техніки. Див. МО 14/137903 та публікацію заявки на патент США Мо 2014/0225994. Крім того, в

МО 14/137903 також описуються системи й обладнання, які можна застосовувати для виконання цих інтегрованих і безперервних процесів.

Наприклад, інтегрований і безперервний процеси для виділення білка гпАСА, представленого у даному документі, можуть включати: (а) забезпечення рідкого середовища для культивування, що містить білок ГПАСА, представлений у даному документі, що практично не містить клітин, де рідке середовище для культивування подають у першу хроматографічну систему з кількома колонками (МСС51); (5) захоплення білка ПАСА, представленого у даному документі, у рідкому середовищі для культивування із застосуванням МСОСО1, де елюат МСОСО1, який містить білок ГПАСА, представлений у даному документі, безперервно подають у другу хроматографічну систему з кількома колонками (МОС52); і (с) очищення й доочищення білка

ІПАСА, представленого у даному документі, із застосуванням МОС52, де елюат з МСОС52 являє собою виділений білок ІпПАСА, представлений у даному документі, або являє собою білкову лікарську речовину ГАС, і процес є інтегрованим і безперервно протікає з рідкого середовища для культивування в елюат з МСОС52, який являє собою виділений білок "ПАСА, представлений у даному документі, або білкову лікарську речовину ПАСА.

МОС51 та/або МОС52 можуть, наприклад, виконувати щонайменше дві елементарні операції. У деяких варіантах здійснення МОС51 або МОС52, або обидві, передбачають перемикання колонок. У деяких варіантах здійснення МОС51 виконує елементарні операції захоплення білка ПАСА, представленого у даному документі, та інактивації вірусів. У деяких варіантах здійснення МСОС52 виконує елементарні операції очищення та доочищення білка

ІПАСА, представленого у даному документі.

У МОС51 і/або МОС52 можна застосовувати, наприклад, щонайменше дві хроматографічні колонки. У МОСС51 і/або МОСС52 можна застосовувати, наприклад, щонайменше дві хроматографічні мембрани. У МОСС51 і/або МОС52 можна застосовувати, наприклад, щонайменше одну хроматографічну колонку та щонайменше одну хроматографічну мембрану.

МОС51 може являти собою, наприклад, періодичну протиточну хроматографічну систему (РСС5БІ). РОС51Ї може являти собою, наприклад, РОС з чотирма колонками. У деяких варіантах здійснення чотири колонки у РОСС з чотирма колонками можуть виконувати елементарну операцію захоплення білка ПАСА, представленого у даному документі, у рідкому середовищі для культивування. Захоплення можна виконувати із застосуванням, наприклад, афінної хроматографії, катіон-обмінної хроматографії, аніон-обмінної хроматографії або хроматографії на молекулярних ситах. Афінну хроматографію можна виконувати за допомогою механізму захоплення, вибраного з, наприклад, механізму захоплення із зв'язуванням білка А, механізму захоплення із зв'язуванням субстрату, механізму захоплення антитіла або фрагмента антитіла, механізму захоплення зі зв'язуванням аптамеру та механізму зв'язування кофактора.

Елюат, що містить білок ТАСА, представлений у даному документі, з трьох із чотирьох колонок у РОС5 з чотирма колонками можна подавати у четверту колонку РОС5 з чотирма колонками.

Четверта колонка РОС з чотирма колонками може виконувати елементарну операцію, наприклад, інактивації вірусів шляхом утримування елюату, що містить білок тАСА, представлений у даному документі, при низькому рН для інактивації вірусів. Наприклад, четверта колонка РОС5 з чотирма колонками може утримувати елюат, що містить білок ТАСА, представлений у даному документі, при низькому рН для інактивації вірусів протягом періоду часу від приблизно 10 хвилин до приблизно 1,5 години.

БО У деяких варіантах здійснення МОС52 може являти собою, наприклад, періодичну протиточну хроматографічну систему (РОС52). У деяких прикладах процес додатково включає стадію регулювання рН елюату з четвертої колонки РОСС з чотирма колонками із застосуванням поточного резервуару для регулювання буфера до того, як елюат з четвертої колонки РОС5 з чотирма колонками подають у РОС52.

РОСС52 може, наприклад, містити три хроматографічні колонки та хроматографічну мембрану. Три хроматографічні колонки у РОС52 можуть виконувати, наприклад, елементарну операцію очищення білка ПАСА, представленого у даному документі (наприклад, за допомогою катіон- або аніонобмінної хроматографії) Елюат з трьох колонок у РОС52 можна подавати, наприклад, на хроматографічну мембрану у РОС52. Хроматографічна мембрана у РОС52 бо може, наприклад, виконувати елементарну операцію доочищення білка ПАСА, представленого у даному документі, у елюаті з трьох хроматографічних колонок у РОС52 (наприклад, за допомогою катіон- або аніонобмінної хроматографії). Потік крізь хроматографічну мембрану та омивання її може виконувати виділений білок ПАСА, представлений у даному документі, або білкова лікарська речовина ІтАСА.

Деякі приклади додатково включають регулювання іонної концентрації елюату з трьох колонок у РОС5І2 із застосуванням поточного регулювання буфера до того, як елюат з трьох колонок у РОС52 подають на хроматографічну мембрану у РОС52. Деякі варіанти здійснення додатково включають застосування буферної ємності між РОСТ і РОС52. Деякі приклади додатково включають фільтрування елюату з РОС5Ї1 до того, як його подають у РОС52. Деякі приклади додатково включають фільтрування рідкого середовища для культивування до того, як його подають у МСС51.

Фармацевтичні композиції й набори

Також в даному документі представлені фармацевтичні композиції що включають щонайменше один (наприклад, один, два, три або чотири) з рекомбінантних білків а- галактозидази-А людини, представлених в даному документі. Два або більше (наприклад, два, три або чотири) з будь-яких рекомбінантних білків с-галактозидази-А людини, представлених в даному документі, можуть бути присутні в фармацевтичній композиції у будь-якій комбінації. У даному документі також представлені фармацевтичні композиції, які містять, складаються з або складаються фактично з рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого у даному документі, і фармацевтично прийнятного носія.

Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може не мати детектований рівень або не мати білок, ліпід, вуглевод, нуклеїнову кислоту й контамінант (наприклад, будь-який з контамінантів, описаних у даному документі), присутні у продукті тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин або продукт крові тварин).

Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може включати білок ТАСА, який продукується у культурі клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи безбілкюового, безсироваткового і середовища з визначеним хімічним складом. Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі,

Зо може включати білок ПТтАСА, представлений у даному документі, який продукується у культурі клітин, у якій використовували тільки безбілюове середовище для культивування та/або середовище для культивування з визначеним хімічним складом. Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у данному документі, може містити білок "ПАСА, представлений у даному документі, який продукується культурою клітин, у якій використовували тільки середовища для культивування, вибрані з групи середовищ для культивування: безбілкового, безсироваткового та з визначеним хімічним складом, і який виділяють із застосуванням інтегрованого й безперервного процесу (наприклад, будь-який з інтегрованого й безперервного процесів, описаних у даному документі або в М/О 14/137903).

Будь-яка з фармацевтичних композицій, представлених у даному документі, може мати покращений профіль безпеки (наприклад, знижений ризик забруднення (наприклад, будь-який із ілюстративних контамінантів, описаних у данному документі або відомих з рівня техніки), порівняно з фармацевтичною композицією, що містить білок ПАСА (наприклад, будь-який з білків ІТАСА, представлених у даному документі), який продукується за допомогою способу, який включає застосування середовища для культивування, що містить продукт тваринного походження (наприклад, сироватка крові тварин, плазма крові тварин або фактор або білок крові тварин).

Фармацевтичні композиції можуть бути складені будь-яким способом, відомим з рівня техніки. Фармацевтичні композиції, представлені в даному документі, є переважними, оскільки вони мають знижений ризик або рівень забруднення (наприклад, знижений ризик або рівень вірусного забруднення) і/або мають знижену гетерогенність у глікоформах, присутніх в композиції.

Фармацевтичні композиції складені так, щоб відповідати призначеному для них шляху введення (наприклад, внутрішньовенному, внутрішньоартеріальному, внутрішньом'язовому, внутрішньошкірному, підшкірному або внутрішньоперитонеальному). Композиція може містити фармацевтично прийнятний носій, наприклад, стерильний розріджувач (наприклад, стерильну воду або сольовий розчин), нелетке масло, поліетиленгліколь, гліцерин, пропіленгліколь або інші синтетичні розчинники, протибактеріальні або протигрибкові засоби, такі як бензиловий спирт або метилпарабени, хлорбутанол, фенол, аскорбінова кислота, тимеросал та подібне, антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або натрію бісульфат, хелатувальні засоби, такі як бо етилендіамінтетраоцтова кислота, буфери, такі як ацетати, цитрати або фосфати, та ізотонічні засоби, такі як цукри (наприклад, декстроза), багатоатомні спирти (наприклад, маніт або сорбіт) або солі (наприклад, натрію хлорид) або будь-яку їх комбінацію. Ліпосомні суспензії також можуть бути застосовані як фармацевтично прийнятні носії (див., наприклад, патент США Мо 4522811). Препарати з композицій можуть бути складені й поміщені до ампул, одноразових шприців або багатодозових флаконів. При необхідності (наприклад, в ін'єкційних складах), належна плинність може бути підтримана, наприклад, застосуванням покриття, такого як лецитин або поверхнево-активної речовини. Абсорбція рекомбінантного білка а-галактозидази-

А людини може бути пролонгована за допомогою включення засобу, що сповільнює абсорбцію (наприклад, алюмінію моностеарат і желатин). Як альтернатива, контрольоване вивільнення може бути досягнуто за допомогою імплантів і мікроїнкапсульованих систем доставлення, які можуть містити біосумісні полімери, що біорозкладаються (наприклад, етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоестери й полімолочна кислота; Аї2га

Согрогаїйоп і Мома Рпагтасецшіїсаї, Іпс.).

Композиції, що включають один або декілька будь-яких з рекомбінантних білків а- галактозидази-А людини, може бути складена для парентерального (наприклад, внутрішньовенного, внутрішньоартеріального, внутрішньом'язового, внутрішньошкірного, підшкірного або внутрішньоперитонеального) введення у формі одиниць дозування (тобто фізично дискретних одиниці, що містять попередньо визначену кількість активного білка для полегшення введення й рівномірності дозування).

Токсичність і терапевтична ефективність композицій може бути визначена стандартними фармацевтичними процедурами в культурах клітин або на експериментальних тваринах (наприклад, мавпах). Можна, наприклад, визначити І Озо (дозу, летальну для 5095 популяції) і

ЕОво (дозу, терапевтично ефективну для 5095 популяції): терапевтичний індекс, що являє собою відношення І О50о:ЕЮзо. Засоби, що демонструють високі терапевтичні індекси, є переважними.

Якщо засіб демонструє небажаний побічний ефект, слід дотримуватися обережності, щоб звести до мінімуму потенційну небезпеку пошкодження (тобто зменшити небажані побічні ефекти). Токсичність і терапевтична ефективність композицій може бути визначена іншими стандартними фармацевтичними процедурами.

Дані, отримані з аналізів культур клітин і досліджень на тваринах можуть бути застосовані у складанні відповідного дозування будь-якого данного рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, будь-яких рекомбінантних глікопротеїнів, описаних в даному документі) при застосуванні для суб'єкта (наприклад, людини). Терапевтично ефективною кількістю одного або декількох (наприклад, одного, двох, трьох або чотирьох) рекомбінантних білків «-галактозидази-

А людини (наприклад, будь-яких з рекомбінантних білків с-галактозидази-А людини, описаних в даному документі) буде кількість, яка лікує хворобу Фабрі у суб'єкта (наприклад, знижує ризик розвитку або попереджує розвиток хвороби Фабрі у суб'єкта (наприклад, суб'єкта-людини, ідентифікованого як такого, що має підвищений ризик розвитку хвороби Фабрі)), знижує тяжкість, частоту й/або тривалість одного або декількох симптомів хвороби Фабрі у суб'єкта (наприклад, людини) (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування), знижує накопичені рівні глікосфінголіпідів з кінцевими а-галактозильними залишками, таких як глоботриаозилцерамід, у суб'єкта (наприклад, людини) з хворобою Фабрі (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування)). Ефективність і дозування будь-якого з рекомбінантних білків с-галактозидази-А людини, описаних в даному документі, можуть бути визначені фахівцем з охорони здоров'я або фахівцем з ветеринарії із застосуванням способів, відомих з рівня техніки, а також за допомогою обстеження на предмет одного або декількох симптомів хвороби Фабрі у суб'єкта (наприклад, людини). Деякі фактори можуть впливати на дозування і час, необхідні для ефективного лікування суб'єкта (наприклад, тяжкість хвороби або розладу, попереднє лікування, загальний стан здоров'я й/або вік суб'єкта, а також наявність інших хвороб).

Будь-яка з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі, можуть додатково містити один або декілька (наприклад, два, три, чотири або п'ять) додаткових терапевтичних засобів. Необмежувальні приклади додаткових терапевтичних засобів, що можуть бути включені у будь-яку з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі, передбачають протисудомні засоби (наприклад, фенітоїн, карбамазепін, фенобарбітал, метилфенобарбітал, барбексаклон, бензодіазепін, клобозан, клоназепам, клоразепат, діазепам, мідазолам, лоразепам, нітразепам, темазепам, німетазепам, фелбамат, карбамазепін, окскарбазепін, 60 еслікарбазепін ацетат, вігабатрин, прогабід, тіагабін, топірамат, габапентин, прегабалін, етотоїн,

фенітоїн, мефенітоїн, фосфенітоїн, параметадіон, триметадіон, етадіон, бекламід, примідон, бриварацетам, леветирацетам, селетрацетам, етосуксимід, фенсуксимід, месуксимід, ацетазоламід, султіам, метазоламід, зонісамід, ламотригін, фенетурид, фенацемід, валпромід і валноктамід) і протиблювотні засоби (наприклад, метоклопрамід, прохлорперазин, алізаприд, доласетрон, гранісетрон, ондансетрон, тропісетрон, палоносетрон, міртазапін, домперидон, оланзапін, дроперидол, галоперидол, хлорпромазин, прохлорперазин, апрепітант і касопітант).

Типові дози передбачають міліграмові або мікрограмові кількості будь-якого з рекомбінантних білків а-галактозидази-А людини, описаних в даному документі, на кілограм ваги суб'єкта (наприклад, від приблизно 50 мкг/кг до приблизно З мг/кг; від приблизно 100 мкг/кг до приблизно 2,5 мг/кг; від приблизно 100 мкг/кг до приблизно 2,0 мг/кг; від приблизно 500 мкг/кг до приблизно 1,5 мг/кг; від приблизно 500 мкг/кг до приблизно 1,5 мг/кг або від приблизно 800 мкг/кг до приблизно 1,2 мг/кг). Типові дози також можуть передбачати міліграмові або мікрограмові кількості одного або декількох будь-яких з одного або декількох додаткових терапевтичних засобів, описаних в даному документі на кілограм ваги суб'єкта (наприклад, від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 500 мг/кг; від приблизно 100 мкг/кг до приблизно 500 мг/кг; від приблизно 100 мкг/кг до приблизно 50 мг/кг; від приблизно 10 мкг/кг до приблизно 5 мг/кг; від приблизно 10 мкг/кг до приблизно 0,5 мг/кг або від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 50 мкг/кг для кожного введеного додаткового терапевтичного засобу). Хоча ці дози охоплюють широкий діапазон, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що терапевтичні засоби, у тому числі рекомбінантний білок а-галактозидази-А і додаткові терапевтичні засоби, описані в даному документі, варіюють за їх ефективністю, та ефективні кількості можуть бути визначені відомими з рівня техніки способами. Як правило, відносно низькі дози вводять спочатку, і медичний працівник або ветеринарний лікар, що лікує (у разі терапевтичного застосування) або дослідник (коли все ще працює над розробкою стадії) може згодом і поступово збільшувати дозу до отримання відповідної відповіді. Крім того, зрозуміло, що конкретний рівень дози для будь-якого конкретного суб'єкта буде залежати від ряду факторів, у тому числі активності конкретної сполуки, що застосовується, віку, ваги тіла, загального стану здоров'я, статі та дієти суб'єкта, часу введення, шляху введення, швидкостей виведення та періоду напіввиведення рекомбінантного глікопротеїну (наприклад, рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини)

Зо або додаткових терапевтичних засобів іп мімо. Фармацевтичні композиції можуть бути поміщені до контейнеру, упаковки або дозатора разом з інструкціями для введення.

Наприклад, один або декілька рекомбінантних білків с -галактозидази-А людини, представлених в даному документі, можуть бути запаковані у стерильний флакон як ліофілізований порошок або таблетка для подальшого відновлення та введення. Ліофілізований порошок або таблетка, що містять рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, можуть містити один або декілька стабілізувальних засобів (наприклад, один або декілька з маніту, натрію фосфату одноосновного моногідрату та натрію фосфату двохосновного гептагідрату).

Приклад ліофілізованого порошку або таблетки, що містять рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, передбачає 37 мг рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, 222 мг маніту, 20,4 мг натрію фосфату одноосновного моногідрату та 59,2 мг натрію фосфату двохосновного гептагідрату. Перед застосуванням або введенням рекомбінантного білка а- галактозидази людини ліофілізований порошок або таблетку відновлюють введенням 7,2 мл стерильною води для ін'єкції, ШОР, у флакон, з отриманням розчину 5,0 мг рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини на мл. Цей відновлений розчин додатково можна розводити ін'єкцією 0,995 натрію хлориду, ОБР, до кінцевого об'єму 500 мл, перед внутрішньовенним введенням суб'єкту при дозі приблизно 1 мг/кг. Також передбачаються набори, що включають флакон з ліофілізованою таблеткою або порошком рекомбінантної а-галактозидази людини (як описано в даному параграфі), інструкції для відновлення таблетки або порошку (як описано в даному параграфі) та інструкції для внутрішньовенного введення двічі на тиждень відновленого розчину суб'єкту при дозі приблизно 1,0 мг/кг.

Інший приклад ліофілізованого порошку або таблетки, що містять рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, передбачає 5,5 мг рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, 33,0 мг маніту, 3,0 мг натрію фосфату одноосновного моногідрату та 8,8 мг натрію фосфату двохосновного гептагідрату. Перед застосуванням або введенням рекомбінантного білка а- галактозидази людини ліофілізований порошок або таблетку відновлюють введенням 1,1 мл стерильною води для ін'єкції, ШОР, у флакон, з отриманням розчину 5,0 мг рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини на мл. Цей відновлений розчин додатково можна розводити ін'єкцією 0,995 натрію хлориду, ОР, до кінцевого об'єму 500 мл, перед внутрішньовенним введенням суб'єкту при дозі приблизно 1 мг/кг. Також передбачаються набори, що включають 60 флакон з ліофілізованою таблеткою або порошком рекомбінантної с-галактозидази людини (як описано в даному параграфі), інструкції для відновлення таблетки або порошку (як описано в даному параграфі) та інструкції для внутрішньовенного введення двічі на тиждень відновленого розчину суб'єкту при дозі приблизно 1,0 мг/кг.

Також в даному документі представлені набори, що включають щонайменше одну дозу будь-якої з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі. За деякими варіантами здійснення набори додатково можуть містити виріб для застосування при введенні фармацевтичної композиції (наприклад, будь-якої з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі) ссавцю (наприклад, людині) (наприклад, шприц, наприклад, попередньо заповнений шприц). Деякі приклади наборів передбачають одну або декілька доз (наприклад, щонайменше дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, двадцять, тридцять або сорок доз) (наприклад, внутрішньовенних, підшкірних або внутрішньоперитонеальних доз) будь-якої з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі. У деяких прикладах набір додатково містить інструкції для введення фармацевтичної композиції (або дози фармацевтичної композиції) ссавцю (наприклад, людині з хворобою Фабрі).

За деякими варіантами здійснення набори містять композицію, яка включає щонайменше один з рекомбінантних білків а-галактозидази-А людини, описаних в даному документі, та композицію, що містить щонайменше один додатковий терапевтичний засіб (наприклад, будь- яку комбінацію одного або декількох додаткових терапевтичних засобів, описаних в даному документі). За деякими варіантами здійснення набір додатково містить інструкції для здійснення будь-якого із способів, описаних в даному документі.

Хвороба Фабрі

Хвороба Фабрі являє собою Х-пов'язану рецесивну лізосомну хворобу накопичення, яка характеризується дефіцитом а-галактозидази-А, відомої як церамідтригексозидаза, що призводить до судинних та інших проявів хвороби через накопичення глікосфінголіпідів з кінцевими с -галактозильними залишками, таких як глоботриаозилцерамід (СІ -3).

Необмежувальні симптоми хвороби Фабрі передбачають ангідроз, болісні пальці, гіпертрофію лівого шлуночка, ниркові прояви та ішемічні інсульти. Тяжкість симптомів сильно варіює (див.,

Стеума! єї аї., У. Мешгої. 241:153-156, 1994). Визнається варіант з проявами, обмеженими серцем, і його частота може бути більш поширеною, ніж колись вважалося (див. МаКао, М. Епод. У). Мед. 333:288-293, 1995). Розпізнавання незвичайних варіантів може бути затримано до достатньо пізнього періоду життя, хоча діагностування у дитинстві можливо при клінічному контролі (Ко єї а!І., Атсі. Раїної. І аб. Мед. 120:86-89, 1996; Мепаеє? еї аї., Оетепі. Сегіаїг. Содп. Оізога. 8:252- 257, 1997; ЗПеїЇІєу єї а!., Редіайніс Оегт. 12:215-219, 1995). Середній вік діагностування хвороби

Фабрі складає 29 років.

Способи лікування хвороби Фабрі , що підвищують рівні а-галактозидази у лізосомі клітини ссавця та знижують рівні глоботриаозилцераміду у суб'єкта

Також в даному документі представлені способи лікування хвороби Фабрі у суб'єкта (наприклад, людини), що передбачає введення суб'єкту композиції, що містить терапевтично ефективну кількість щонайменше одного з рекомбінантних білків «-галактозидази-А людини або фармацевтичних композицій, описаних в даному документі. Рекомбінантні білки а- галактозидази-А людини, описані в даному документі, опосередковують лікування хвороби

Фабрі шляхом підвищення концентрації а-галактозидази-А у лізосомі в клітині ссавця у суб'єкта.

Успішне лікування хвороби Фабрі у суб'єкта може бути визначено фахівцем охорони здоров'я (наприклад, медсестрою, терапевтом або асистентом терапевта). Наприклад, успішне лікування може давати зниження числа, тяжкості та/або частоти одного або декількох симптомів хвороби

Фабрі у суб'єкта (наприклад, ангідрозу, болісних пальців, гіпертрофії лівого шлуночка, ниркових проявів, ішемічних інсультів і підвищених рівнів глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта) (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування). Крім того, успішне лікування може бути визначено шляхом спостереження зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові або в тканині (наприклад, нирці) суб'єкта в залежності від часу (наприклад, у порівнянні з суб'єктом з хворобою Фабрі, що отримує інше лікування, отримує плацебо або не отримує лікування, або у порівнянні з тим самим суб'єктом до лікування). Додаткові способи визначення успішного лікування хвороби Фабрі у суб'єкта описані в даному документі та відомі з рівня техніки.

Також представлені способи підвищення рівнів білка с-галактозидази-А у лізосомі в клітині ссавця (наприклад, в клітині іп міо або клітині у ссавця, такого як людина), що передбачають введення у контакт клітини щонайменше з одним з рекомбінантних білків с-галактозидази-А 60 людини, описаних в даному документі, або щонайменше з однією з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі, у кількості, достатній для підвищення рівнів білка а- галактозидази-А у лізосомі в клітині. Клітиною ссавця може бути клітина, що експресує манозо- б-фосфатний рецептор. Рівні са-галактозидази-А у лізосомі клітини ссавця можуть бути визначені із застосуванням імунофлуоресцентної мікроскопії при використанні антитіла, яке специфічно зв'язується з білком а-галактозидази людини-А. Рівні білка а- галактозидази-А у лізосомі клітини ссавця також можуть бути визначені шляхом виділення лизосом з клітини ссавця та визначення рівнів білка а-галактозидази-А в виділених лізосомах, наприклад, через застосування антитіла, яке специфічно зв'язується з білком а-галактозидази-А, або шляхом здійснення аналізу активності білка а-галактозидази-А із застосуванням лізату з виділених лізосом. Прикладом аналізу білка а-галактозидази-А є аналіз, при якому застосовують О- нітрофеніл-4-Ю-галактозид як субстрат. В цьому аналізі О-нітрофеніл-с-ЮО-галактозид перетворюється на продукти О-нітрофенол і ЮО-галактозу. В іншому прикладі аналізу для виявлення активності білка а-галактозидази-А застосовують флуорогенний субстрат, а-О- галактопіранозид (Ні еї а!., Апаї!. ВіосапаІ. Снет. 394:1903-1909, 2009). Підвищення рівня білка а-галактозидази-А в лізосомі клітини у суб'єкта (наприклад, людини) може бути опосередковано виявлено спостереженням зниження числа симптомів хвороби Фабрі, що відчуває суб'єкт (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування), зниження швидкості прояву нових симптомів хвороби Фабрі, що відчуває суб'єкт (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування), зниження тяжкості одного або декількох симптомів хвороби Фабрі у суб'єкта (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування) або зниження погіршення одного або декількох симптомів хвороби Фавбрі у суб'єкта (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування). Як альтернатива або додатково, підвищення рівня білка с-галактозидази-А у лізосомі клітини, наприклад, може бути

Зо виявлено спостереженням зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта (наприклад, у порівнянні з контрольним суб'єктом, що страждає на ту саму хворобу, але, наприклад, не отримує лікування, отримує інше лікування або отримує плацебо, або є тим самим суб'єктом до лікування). Рівень білка с-галактозидази-А у лізосомі в клітині ссавця після лікування рекомбінантним білком, описаним в даному документі, можна порівнювати з рівнем а- галактозидази-А у лізосомі клітини ссавця без лікування (наприклад, клітини того самого типу).

Також представлені способи зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові або в тканинах (наприклад, в нирці) суб'єкта (наприклад, людини), що передбачає введення щонайменше одного з рекомбінантних білків 4- галактозидази-А людини або щонайменше однієї з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі, суб'єкту. Рівень глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта може бути визначений, наприклад, із застосуванням мас-спектрометрії (Кіт еї аЇ., Когеап У. Іпіет. Мей. 25:415-421, 2010) або сендвіч-аналізом з антитілом (наприклад, аналізами, описаними в публікації заявки на патент

США Мо 2012/0178105). Рівень глоботриаозилцераміду в сироватці крові або тканині суб'єкта після введення щонайменше одного рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини або фармацевтичної композиції, представленої в даному документі, можна порівнювати з рівнем глоботриаозилцераміду в сироватці крові або тканині суб'єкта з хворобою Фабрі, що не отримує лікування або отримує інше лікування, або з рівнем глоботриаозилцераміду у суб'єкта до введення щонайменше одного рекомбінантного білка са-галактозидази-А людини або фармацевтичної композиції, представленої в даному документі.

За деякими варіантами здійснення у суб'єкта (наприклад, людини) раніше була діагностована хвороба Фабрі або підозрюється хвороба Фабрі. За деякими варіантами здійснення ссавець був ідентифікований як такий, що має підвищений ризик розвитку хвороби

Фабрі (наприклад, підвищений генетичний ризик розвитку хвороби Фабрі). Ссавцем може бути жінка або чоловік і може бути дорослий або дитина (наприклад, немовля або дошкільник). В деяких випадках суб'єктом є людина. Коли ссавцем є дитина, він або вона може мати вік від 1 дня до 18 років, включно (наприклад, від 1 дня до 17 років, від 1 дня до 16 років, від 1 дня до 15 років, від 1 дня до 14 років, від 1 дня до 13 років, від 1 дня до 12 років, від 1 дня до 11 років, від 1 дня до 10 років, від 1 дня до 9 років, від 1 дня до 8 років, від 1 дня до 7 років, від 1 дня до 6 років, від 1 дня до 5 років, від 1 дня до 4 років, від 1 дня до З років, від 1 дня до 2 років, від 1 дня 60 до 1 року, від 1 дня до 6 місяців, від Є місяців до 4 років, від 1 місяця до 5 років, від З років до 13 років або від 13 років до 18 років). Коли ссавцем є дорослий, ссавець може мати вік, наприклад, від 18 до 20 років, включно, або щонайменше або приблизно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або щонайменше або приблизно 100 років.

У суб'єкта може бути діагностована хвороба Фабрі фахівцем охорони здоров'я шляхом спостереження одного або декількох симптомів у суб'єкта (наприклад, одного або декількох будь-яких з симптомів хвороби Фабрі, описаних в даному документі або відомих з рівня техніки).

У деяких прикладах суб'єкт уже може отримувати лікування від хвороби Фабрі. В інших випадках попереднє лікування хвороби Фабрі не було успішним.

Рекомбінантні білки або фармацевтичні композиції, описані в даному документі, можуть біти введені внутрішньовенним, внутрішньоартеріальним, підшкірним, внутрішньоперитонеальним, інтрелімфатичним, внутрішньом'язовим, очним або інтратекальним введенням. Крім того, рекомбінантні білки та фармацевтичні композиції можуть бути складені із застосуванням будь- яких відомих з рівня техніки методик, і/або як описано в даному документі (наприклад, складені для підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньоартеріального, інтерлімфатичного, внутрішньом'язового, білям'язового або інтратекального введення і/або складені у ліпосомі або наночастинці).

Рекомбінантні білки а-галактозидази-А людини або фармацевтичні композиції, описані в даному документі, можуть бути введені медиком (наприклад, терапевтом, асистентом терапевта, медсестрою, асистентом медсестри або лаборантом) або фахівцем з ветеринарії. Як альтернатива або додатково, рекомбінантний білок або фармацевтична композиція можуть бути самостійно введені людиною, наприклад, пацієнтом/пацієнткою. Введення може відбуватися, наприклад, у лікарні, клініці або пункті першої допомоги (наприклад, у центрі сестринського догляду), або у будь-якій їх комбінації.

За деякими варіантами здійснення ссавцю вводять дозу від 1 мг до 400 мг будь-якого з рекомбінантних білків а«-галактозидази-А людини, описаних в данному документі, або будь-якої з фармацевтичних композицій, описаних в даному документі (наприклад, від 1 мг до 300 мг, від 1 мг до 250 мг, від 1 мг до 200 мг, від 1 мг до 150 мг, від 1 мг до 100 мг, від 1 мг до 80 мг, від 1 мг до 70 мг, від 1 мг до 60 мг, від 1 мг до 50 мг, від 1 мг до 40 мг, від 1 мг до 30 мг, від 1 мг до 20 мг, від 1 мг до 10 мг, від 20 мг до 120 мг, від 30 мг до 90 мг або від 40 мг до 80 мг). У деяких прикладах суб'єкту вводять дозу рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 4,0 мг/кг (наприклад, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 3,5 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 3,0 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 2,0 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 1,5 мг/кг, від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 1,5 мг/кг або від приблизно 0,7 мг/кг до приблизно 1,3 мг/кг).

За деякими варіантами здійснення суб'єкту додатково вводять додатковий терапевтичний засіб (наприклад, будь-який з додаткових терапевтичних засобів, описаних в даному документі).

Додатковий терапевтичний засіб може бути введений суб'єкту практично одночасно з рекомбінантним білком або фармацевтичною композицією, або може бути введений в одну або декілька інших точок часу. За деякими варіантами здійснення додатковий терапевтичний засіб складають разом щонайменше з одним рекомбінантним білком са-галактозидази-А людини (наприклад, із застосуванням будь-якого з прикладів складів і композицій, описаних в даному документі).

За деякими варіантами здійснення додатковий терапевтичний засіб складають у першу дозовану форму, а щонайменше один рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини складають у другу дозовану форму. Якщо додатковий терапевтичний засіб складають у першу дозовану форму, і щонайменше один рекомбінантний білок са-галактозидази-А людини складають у другу дозовану форму, то перша дозована форма та друга дозована форма можуть бути складені, наприклад, для однакового шляху введення (наприклад, перорального, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, інтрартеріального, інтратекального, інтерлімфатичного або внутрішньоперитонеального введення) або для різних шляхів введення (наприклад, перша дозована форма складена для перорального введення, а друга дозована форма складена для підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньоартеріального або внутрішньом'язового введення). Комбінації таких режимів лікування чітко передбачаються даним винаходом.

Як описано вище, кількість щонайменше одного введеного рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини (та необов'язково додаткового терапевтичного засобу) буде залежати від того, є введення локальним (наприклад, внутрішньом'язовим) чи системним. За деякими варіантами здійснення суб'єкту (наприклад, людині) вводять не більш ніж одну дозу 60 щонайменше одного рекомбінантного білка а«-галактозидази-А людини або щонайменше однієї фармацевтичної композиції. За деякими варіантами здійснення суб'єкту (наприклад, людині) вводять більш ніж одну дозу (наприклад, дві або більше доз) будь-якої з композицій, описаних в даному документі. За деякими варіантами здійснення суб'єкту вводять дозу щонайменше одного рекомбінантного білка а-галактозидази- А людини або щонайменше однієї фармацевтичної композиції щонайменше один раз на місяць (наприклад, щонайменше двічі на місяць, щонайменше три рази на місяць, щонайменше чотири рази місяць, щонайменше один раз на тиждень, щонайменше двічі на тиждень, три рази на тиждень, один раз в день або двічі на день). Наприклад, суб'єкту можуть бути введені дві або більше доз будь-якої з фармацевтичних композицій або один або декілька з рекомбінантних білків а- галактозидази-А людини з частотою щонайменше одна доза кожні два місяці (наприклад, щонайменше одна доза кожний місяць, щонайменше одна доза на тиждень, щонайменше одна доза кожні два тижні або щонайменше одна доза на день).

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини або фармацевтична композиція можуть вводитися суб'єкту хронічно. Хронічні види лікування передбачають будь-яку форму повторного введення протягом тривалого періоду часу, таку як повторні введення протягом одного або декількох місяців, від місяця до року, одного або декількох років, більше п'яти років, більше 10 років, більше 15 років, більше 20 років, більше 25 років, більше 30 років, більше 35 років, більше 40 років, більше 45 років або довше. Як альтернатива або додатково, можуть здійснюватися хронічні види лікування. Хронічні види лікування можуть передбачати регулярні введення, наприклад один або декілька разів на день, один або декілька разів на тиждень або один або декілька разів на місяць. Наприклад, хронічне лікування може містити введення (наприклад, внутрішньовенне введення) приблизно кожні два тижні (наприклад, приблизно кожні 10-18 днів).

Придатною дозою може бути кількість рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, яка є самою низькою дозою, ефективною для створення бажаного терапевтичного ефекту. Така ефективна доза звичайно буде залежати від факторів, описаних в даному документі. Якщо бажано, ефективна щоденна доза рекомбінантного білка с0- галактозидази-А людини або фармацевтичної композиції може бути введена у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести або більше піддоз, що вводяться окремо з відповідними інтервалами протягом дня, необов'язково, в одиничних дозованих формах.

Зо Рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини або фармацевтична композиція може бути складені для пролонгованого вивільнення (наприклад, складені у полімер, що біорозкладається, або наночастинку), і в деяких випадках можуть бути введені безпосередньо у м'язову тканину, підшкірну тканину або перитонеальну порожнину суб'єкту (внутрішньом'язовим, внутрішньоперитонеальним або введенням у вигляді підшкірного депо, відповідно). Як альтернатива або додатково, склад пролонгованого вивільнення може вводитися системно (наприклад, пероральним, внутрішньовенним, інтраартеріальним, внутрішньоперитонеальним, інтерлімфатичним або підшкірним введенням). В деяких випадках рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини або фармацевтична композиція можуть бути складені для перорального, внутрішньозалозистого, білязалозистого, підшкірного, внутрішньопротокового, внутрішньом'язового, білям'язового, внутрішньоперитонеального, внутрішньом'язового, внутрішньоартеріального, трансдермального, інтерлімфатичного або внутрішньовенного введення.

Приклади

Даний винахід далі описується в наступних прикладах, які не обмежують об'єм даного винаходу, описаний формулою винаходу.

Приклад 1. Отримання лінії рекомбінантних клітин для продукування глікопротеїнів

Експерименти здійснювали для розробки лінії клітин, застосовної для рекомбінантного продукування глікопротеїнів. В цих експериментах початкову залежну від сироватки крові лінію клітин СНО (ОХВ11) періодично вирощували в середовищі для культивування тканин, що включало 595 фетальної бичачої сироватки крові, протягом трьох днів, вирощували в середовищі для культивування тканин, що включало 2,595 фетальної бичачої сироватки крові, протягом трьох днів, і вирощували в середовищі для культивування тканин, що не включало фетальну бичачу сироватку крові, протягом восьми днів. Наприкінці цього періоду культивування отриману культуру клітин СНО розбавляли та аліквотували для створення безсироваткової підпопуляції або пулу суспензійних культур. Після нарощування та оцінювання росту безсироваткові пули аліквотували для створення культур одноклітинного клону. Кожний одноклітинний клон тестували за його клітинним ростом у безсироватковому середовищі для культивування та потім підгрупу клонів тестували за ефективністю трансфекції шляхом електропорації вектора експресії що кодує червоний флуоресцентний білок (ВЕР) під бо контролем промотора р-актину хом'яка, з аналізом експресії ВЕР за допомогою протокової цитометрії через 2 дні після трансфекції. Клонів, що відповідали критеріям протягом часу подвоєння («х 35 годин) та ефективності трансфекції (» 3095 позитивний ВЕР з » 75905 життєздатністю культури), оцінювали за рекомбінантною експресією білка після стабільної трансфекції вектором(ми) експресії, що кодує ген(и) інтересу під контролем промотора р-актину хом'яка й що кодує ген ОНЕВ під контролем промотора 5У40. Після трансфекції стабільно трансфековані пули відбирали із застосуванням метотрексату (МТХ), а після відбору пули оцінювали за продуктивністю рекомбінантного білка за допомогою висівання клітин у культури без підживлення та аналізу зібраного проясненого середовища на предмет рівнів рекомбінантного білка. На основі відбору за допомогою МТХ тих, що вижили, та рівнів продукування рекомбінантного білка в стабільно трансфекованих пулах ідентифікували головний безсироватковий батьківській клон.

Головний батьківській клон субклонували й далі культивували у безбілюовому з компонентом тваринного походження без (АОС) і середовищі з визначеним хімічним складом(середовищі СО 0О44 від Іпмйгодеп) та субклони збирали у банк. Близько 27 поколінь клітин в без АОС середовищі проходило від стадії отримання одноклітинного субклону до вихідного банку заморожених клітин. Одноклітинні клони тестували на наступний предмет: ефективність трансфекції (за допомогою електропорації з вектором, що кодує ВЕР, описаним вище), ростові властивості клітин (в середовищі СО 00144 від Іпийгодеп) та стабільні трансформації для продукування рекомбінантних білків. Оцінювання стабільно трансфекованих пулів (із застосуванням середовища СО СНО від Іпийгодеп) передбачало оцінки відбору за допомогою

МТХ, пікову щільність клітин, ростові властивості та об'ємну продуктивність (МРВ).

Продуктивність рекомбінантного білка тестували, як описано вище.

Одноклональну батьківську лінію клітин після всіх стадій культивування, описаних вище, ідентифікували як таку, що має найкращу ефективність трансфекції та найкращій відбір за допомогою МТУ, пікові щільності клітин, ростові властивості клітин і об'ємну продуктивність (МРА) стабільно трансфекованих пулів. Цю батьківську лінію клітин нарощували й заморожували в аліквотах для застосування в наступних експериментах.

Приклад 2. Продукування рекомбінантної а-галактозидази-А людини

Флакон клітин, що продукують (і секретують) рекомбінантний білок са-галактозидази-А

Зо людини, розтоплювали у визначеному за хімічним складом і без компонента тваринного походження (АОС) середовищі для культур клітин в струшувальних колбах. Суміш нарощували до достатньої кількості клітин, доступної для засівання перфузійних біореакторів.

Забезпечували ріст культури до досягнення цільової високої щільності життєздатних клітин, при якій ініціювали точковий контроль щільності клітин. Безперервну перфузію розпочинали через один день після інокуляції, а потім покроково підвищували до фіксованої швидкості перфузії при цільовій високій щільності клітин у перфузійному біореакторі. Прояснену зібрану рідину (що містить рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини) безпосередньо завантажували у захоплювальну колонку із застосуванням інтегрованої безперервної системи захоплювальної хроматографії. Потім захоплений елюат (що містить рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини) додатково очищували аніон-обмінною хроматографічною смолою (АМХ) для вилучення

ДНК, білка клітини-хазяїна та інших домішок. Елюат з АМХ (що містить рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини) додатково очищували крізь смолу афінної хроматографії на імобілізованих іонах металу. Елюат афінної хроматографії на імобілізованих іонах металу (що містить рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини) концентрували до цільової концентрації рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, а потім буфер міняли на буфер з лікарською речовиною із застосуванням мембрани для фільтрації в тангенціальному потоці.

Потім лікарську дослідженню (як описано в прикладах). Потім для РК/РО дослідження (приклад 5) препарат лікарської речовини рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини складали за допомогою додавання маніту, а потім фільтрували крізь абсолютний фільтр 0,22 см".

Приклад 3. Фізичне дослідження рекомбінантної с-галактозидази-А людини

Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, отриманий та очищений у прикладі 2, фізично досліджували із застосуванням ряду біофізичних методик і порівнювали з РабгалутеФ та Веріада!Ф. Кожна з досліджуваних структурних і функціональних ознак рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини обговорюється нижче, разом із способами, застосовними для визначення кожної структурної та функціональної ознаки.

Молекулярний розмір

Молекулярний розмір РабгалутеФф), Веріада!Ф і рекомбінантного білка с- галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е72С), оцінювали із застосуванням ексклюзійної хроматографії, МА! 0І-ТОЕ М5 та електрофорезу у гелі. (510) ЗЕС

Аналіз ексклюзійної хроматографії (ЕС) здійснювали за допомогою. НРІ С Адііепі 1200 із застосуванням колонки Т5К-Ссієї (30005МУХІ (ТозоН, 7,8 ммх30 см). Вводили п'ятдесят мкл зразка і здійснювали колонкову хроматографію при швидкості потоку 0,5 мл/хвилина. Елюйовані білки виявляли при 280 нм.

МА! 0І-ТОЕ М5

МАГ! 0І-ТОЕ М5 здійснювали за допомогою першого розведення зразків (1:5) у 0,195 водній мурашиній кислоті. ВБА розбавляли до 2 мг/мл у 0,195 водній мурашиній кислоті. Розведені зразки наносили у трьох повторностях на підкладку з нержавіючої сталі МАГ І з насиченою синапіновою кислотою у водній 0,195 ТЕА, 5095 ацетонітрилі з відношенням 1 мкл/1 мкл.

Створювали десять спектрів для кожного нанесення на різних ділянках та з варіювальною інтенсивністю лазера, а потім усереднювали. Параметри налаштування приведені в таблиці 1.

Спектри калібрували до одно- та двохзарядних піків маса/заряд В5А. Необроблені дані вирівнювали із застосуванням режиму стандартного вирівнювання при піковому розрішенні 200.

Пікові значення з вимірювання у трьох повторностях усереднювали та визначали стандартне відхилення.

Таблиця 1

Параметри налаштування для МАЇ 0І-М5 аналізу Рабгалгуте

ЗО5-РАСЕ

Десять мкг кожного зразка завантажували в 4-2095 трис-гліциновий гель (Іпуийгодеп) у буфері для завантажування зразка з дитіотреїтол (ОТ). Напругу 150 подавали на гель протягом 1 часу та 25 хвилин. По завершенні гель фарбували розчином для фарбування Соотаввзіє В-250 протягом 30 хвилин. Надмірну фарбу видаляли із застосуванням знебарвлювального розчину протягом 30 хвилин.

Результати

Аналіз ексклюзійної хроматографії (ЕС) показує, що РаргалгутефФ елююється раніше та з витягненими виступами у порівнянні з Неріадакю (фігура 6). Ці результаті підтверджують, що

ЕабгалутеФ є гетерогенним і може мати більш високу молекулярну масу у порівнянні з

Веріада(Ф. Спектри МАЇ 0БІ-ТОЕЄ М5 на фігурах 7А-7В показують, що відношення маса/заряд головних частинок, що спостерігали для Рабгагутеф та Неріада!є, є порівняним. Рабргагуте? також містить частинки з більш низькою молекулярною масою рекомбінантної а-галактозидази-

А людини, які не спостерігали у Реріада(ф. Спектри МА 0І-ТОЕ М5 на фігурі 8 показують, що відношення маса/заряд головних частинок, що спостерігали для Раргалгутеб і Е/20, є порівняним. ЕРабгалутеФ містить частинки з більш низькою молекулярною масою, які не спостерігали для Ей201 у спектрі МАГОІ-ТОЕ М5. Рухомість у 505-РАСЕ Рабгагутефб і

Веріада(юф є порівняною. Незначну кількість частинок з більш високою рухомістю (з більш низькою середньою молекулярною масою) спостерігали в РабгагутеФ), але не в Неріадан (фігура 9).

Профіль глікозилювання

Профілі М-зв'язаного глікозилювання для РавргагутеФ, ВНеріада(ю і Е2220ї визначали із застосуванням дериватизування 2-антраніловою кислотою (АА) і рідинної хроматографії з нормальними фазами із виявленням флуоресценції, як в цілому описано в Катода 6ї аї., 9.

Спготаїоагарну А 1133:332-339, 2006).

Аналіз сайт-специфічних гліканів

Аналіз сайт-специфічного глікозилювання РабгагутеФ, Неріадакю і Р722 здійснювали із застосуванням гібридного лінійного іонного мас-спектрометра з уловлювачем Огбіїгар (ГТО-

Огбімгар, ТНегто РізНег 5сіепійіс), приєднаним до системи рідинної хроматографії (папоАсдийу

ІС, Маїег5). В цій процедурі ферментативне розщеплення здійснювали першим зменшенням

100 мкг білка з дитіотреітолом з наступним алкілуванням йодооцтовою кислотою. Потім зразки заміняли на трис-СІ, рН 8,0, їз застосуванням колонок Віозріп30 (Віо-Вай) з наступним 18- годинним розщепленням ендопротеїназою І убз-С та 2-годинним розщепленням трипсином.

Після розрідження мурашиною кислотою для гасіння розщеплення вводили 200 нг кожного зразка у колонку 75 мкм х 10 см 0-18 (Рісоїйії Мем ОБіесіїме5). Пептиди елюювали у поступовому градієнті 2-9595 ацетонітрилу в 0,195 мурашиній кислоті. Сканували діапазон маса/заряд від 325 до 1800 за допомогою ЕТМ5 при розділенні 60000 із залежними від даних

СІО-скануваннями з 5 найбільш високим показниками інтенсивності. Дані М5 інтегрували та обробляли із застосуванням програмного забезпечення ВРеїйпепмМ5 М 7,6 (Сепедайїа) для кількісної оцінки й збирали СІЮ спектри для підтвердження композиції глікоформ.

Результати

На фігурі 10 показана типова хроматограма АА-дериватизованих М-зв'язаних олігосахаридів

Еабгагутеф, що демонструє специфічний тип М-зв'язаного олігосахариду, присутнього в кожному з піків. Ідентичності гліканових частинок, що спостерігалися у профілях АА-міченого глікану, визначали аналізом І! СМ5. Хроматограми, що демонструють елюювання різних типів

АА-дериватизованих М- зв'язаних олігосахаридів в Рабгалгутеф і Неріада!Ф), показані на фігурі 11. Відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що відповідають кожному типу М- зв'язаного олігосахариду для РарбгалутеФ і ВНеріада!Ф, показані на фігурі 12. Відносний відсотковий вміст кожних гліканових частинок, що спостерігали при Азп108, Азп161 і Авзп184 для

Еабгагутеф і Неріада!Ф, показані на фігурах 13, 14 та 15, відповідно. Відносний відсотковий вміст кожних гліканових частинок, що спостерігали при Ав5бп108, А5п161 і Авзп184 для

Еабгаггутеф і Е72а, показані на фігурах 16 та 17, 18 та 19, відповідно.

АА-мічені профілі Рабгалутеф і Е722 показані на фігурі 20. Відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що відповідають нейтрально зарядженим олігосахаридам (пік 1), моносіалільованим фукозо-вмісним олігосахаридам (пік 2) і моносіалільованим олігосахаридам (пік 3) у Рабгагутеф і Е72а, показані на фігурах 21А-С. Відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що відповідають бісіалільованим фукозо-вмісним олігосахаридам (пік 4), бісіалільованим олігосахаридам (пік 5) і трьеохрозгалуженим трисіалільованим олігосахаридам форми 1 (пік 6) у РабгалутеФ та у Е720, показані на фігурах 22А-С. Відсотковий вміст

Зо загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що відповідають трьохрозгалуженим трисіалільованим олігосахаридам форми 2 (пік 6), манозо-6-фосфат-вмісним олігосахаридам (пік 7) і монофосфорильованим олігосахаридам (пік 8) у РабгалгутефФ та у Е720, показані на фігурах 2ЗА-С. Відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що відповідають тетрасіалільованим олігосахаридам (пік 9), моносіалільованим або монофосфорильованим олігосахаридам (пік 10) та біс-манозо-6-фосфат-вмісним олігосахаридам (пік 11) у РабгагутеФ та у Е720, показані на фігурах 24А-0.

Ці дані показують, що представлений в даному винаході рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини (Е222ї) має практично інший патерн глікозилювання у порівнянні з

ЕабгагутеФ. Наприклад, рекомбінантні білки с- галактозидази-А людини, представлені в даному документі (Е220), мають відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди (пік 1), який менше ніж в Рабгалутеф; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозо-вмісні олігосахариди (пік 2), який менше ніж в РабгагутеФф); відсотковий вміст загальних

М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-б-фосфат-вмісні олігосахариди (пік 7), який приблизно такий самий або менше ніж в РабгалутеФф; відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфорильовані олігосахариди (пік 8), який більше ніж в РГабгалутеФф); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди (пік 9), який більше ніж в Раргалгутеф); відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані та монофосфорильовані (пік 10), який більше ніж в Рабгагутеф; відсотковий вміст загальних М- зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6-фосфат-вмісні олігосахариди (пік 11), який більше ніж в РабгагутефФ. Змінений патерн глікозилювання рекомбінантних білків а- галактозидази-А людини, описаних в даному документі (222) (наприклад, у порівнянні з

ЕабгагутеФф), забезпечує кілька переваг, наприклад, одне або декілька із зниження неспецифічного націлювання рекомбінантного білка о-галактозидази-А людини на печінку (шляхом зниженого зв'язування з асіалоглікопротетновим рецептором, експресованим на поверхні гепатоцитів, після введення рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини суб'єкту, наприклад, суб'єкту-людині), підвищеної швидкості ендоцитозу рекомбінантного білка а- галактозидази людини клітиною ссавця (наприклад, клітиною людини), що експресує білок- бо рецептор манозо-б6-фосфату на своїй поверхні, підвищеної афінності до білка- рецептора манозо-б6-фосфату та підвищеного період напіввиведення з сироватки крові, у порівнянні з

Еабгагутеф)

Відношення манозо-6-фосфату й М-ацетилнейрамінової кислоти до білка

Додатковий ряд експериментів здійснювали для визначення молярного відношення манозо- б-фосфату до білка й молярного відношення М- ацетилнейрамінової кислоти до білка в рекомбінантному білку а-галактозидази-А людини, представленому в даному документі (Е72С), і в РабгагутеФф).

Дані демонструють, що рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е220ї), має молярне відношення манозо-6- фосфату до білка, що є приблизно таким самим, що і в РаргагутефФ, і підвищене молярне відношення М- ацетилнейрамінової кислоти до білка у порівнянні з Рабгалгутеф (фігури 25А-В).

Ізоелектрична точка

Капілярне ізоелектричне фокусування з детекцією безпосередньо у капілярі (ісіІЕР) застосовували для оцінювання заряду білка для кожного тестованого білка. Електроферограма для Рабгагутеф і Неріада(Ф показана на фігурі 31. Відносні відсоткові відношення діапазонів низьких, середніх та високих рі електроферограми визначили для рекомбінантного білка а- галактозидази-А, представленого в даному документі (Е72С), та РГабгалгутеф і представили на фігурах 32А-6.

Зворотно-фазова хроматографія

В іншому ряді експериментів аналізували ЕРаргалутефФ і Неріадакю із застосуванням зворотно-фазової високо ефективної рідинної хроматографії (АР- НРІ С). Зразки вводили в колонку УМО Осіу! (УМаїєт5, 2,0х100 мм) та елюювали із застосуванням лінійного градієнта

ТЕА/ацетонітрил при швидкості потоку 0,25 мл/хвилина. Елюйовані білки виявляли при 215 нм.

Аналізи здійснювали із застосуванням НРІ С Адіїєпі 1200.

Дані демонструють, що Веріада(ю елююється з колонки АВР-НРІ С у ранішу точку часу, ніж

Еабгагутеф (фігура 35).

Приклад 4. Функціональне дослідження рекомбінантної а-галактозидази-А людини

Активність зв'язування з катіон-незалежним манозо-6-фосфатним рецептором

Ряд експериментів Віасоге здійснювали для тестування здатності рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого в даному документі, РабгагутефтФ і Неріада(ю до зв'язування з катіон-незалежним манозо-6-фосфатним рецептором (СІМРРЕ).

Сенсограми Віасоге для Рабгалгутебф і Неріада!Фє показані на фігурі 26. Криві зв'язування цих сенсограм для Рабгалгутеф і Неріада!(ю показані на фігурі 27. Графік, що коротко представляє активність СІМР В-зв'язування для рекомбінантного білка с- галактозидази-А, представленого в даному документі (Е72С), і РабгагутеФф), показаний на фігурі 28. Порівняння цих даних показує, що рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е72С8), має підвищену активність СІМРВА-зв'язування у порівнянні з Рабгалгутеф)

Здатність рекомбінантного білка са-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е722), Раргалутеф і Веріада(Фф до зв'язування з манозо-6-фосфат рецептор також тестували із застосуванням афінної колонкової хроматографії. Колонки з манозо-6-фосфатним рецептором поступово елюювали з манозо-6-фосфатом і відсотковий вміст загального завантаженого рекомбінантного білка, що елюювався з колонки, в кожній фракції елюювання показано на фігурах 29 і 30). Дані указують на те, що рекомбінантний білок с-галактозидази-А, представлений в даному документі (Б220), має нижчий відносний відсотковий вміст незв'язаного та більш високий відсотковий вміст високоафінних частинок у порівнянні з

Еабгагутеф і Неріада.

Кт і Мтах

Також визначали Кт і Мтах рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е22С), і РабгалгутеФф).

Дані демонструють, що рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е2201), має знижений або приблизно такий самий Кт у порівнянні з

ЕабгагутеФф (фігура 33) і має приблизно такий саме або трохи знижений Мтах у порівнянні з

Еабгагутеф (фігура 34).

В цілому, дані, представлені в даному документі, демонструють, що рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, представлений в данному документі (222), має змінений патерн глікозилювання та поліпшену активність зв'язування з манозо-б6-фосфатним рецептором у порівнянні з РабгагутеФф).

Приклад 5. Дослідження на тваринах

Два дослідження на тваринних моделях здійснювали для оцінювання ефекту 60 рекомбінантного білка а-галактозидази-А людини, представленого в даному документі, на кліренс і фармакокінетичні параметри С -3.

Перше дослідження проводили для вивчення ефектів рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини (у порівнянні з ЕРабгалутеФ) на тканинний кліренс (1-3 після одноразового внутрішньовенного (ІМ) введення при 0,1 мг/кг ії 1 мг/кг мишам Рабргу. В даному дослідженні 90 мишей Раргу (46М/44Р) розподіляли на 5 груп (див. таблицю 2, нижче).

Тваринам групи 1 (п-10, 6М/4Е) одноразово ІМ вводили носій. Тваринам груп 2 ї З (п-20 на групу, ТЛОМ/ЛОР) одноразово ІМ вводили РабгаглутеФ при 0,1 мг/кг ї 1,0 мг/кг, відповідно.

Тваринам груп 4 і 5 (п-20 на групу, 10М/ОР) одноразово ІМ вводили рекомбінантний білок а- галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), при 0,1 мг/кг і 1,0 мг/кг, відповідно. Тварини дикого типу групи 6 (п-1М) не отримували лікування та служили контролем для калібрування С -3. Тварин піддавали евтаназії через З дні після введення дози (групи 2-5, п-10, 5М/5Е на групу) і через 14 днів після введення дози (група 1 і групи 2-5, п-10, 5М/5Е на групу). Аналіз (3-3 проводили на наступних тканинах: серце й нирка (групи 1, З і 5) та селезінка і печінка (групи 1, 2 та 4).

Таблиця 2

Схема дослідження кліренсу С -3 тут лінннн "УЮ Рой | До (повлатими поча неуте Точачасуте,

Група! Лінія миші дозування/Шл | Точка часу та | Точка часу та (Ч/Ж) зразок (мг/кг) й й ях введення Аналіз Аналіз (10) не День 2 (Групи! День З (Групи (20) 5ч/5Ж на 5Ч/5Ж на

Одноразова |/|Гузо а -3 З іїГузо СІ -3 20 День 13 День 14 (групи 20 групи 2-5, п-10, 5Ч/5Ж на групу) для | СІ -3 і І уво

КОНІ НИ с (1/0) аналізу

Короткий опис деяких з функціональних і структурних характеристик рекомбінантного білка а-галактозидази-А, представленого в даному документі (Е222), який вводили мишам Еабгу у дослідженнях на тваринах у цьому прикладі, представлений в таблиці 3, нижче. 20 Дані, демонструють, що досягається подібне зниження накопичення (1-3 в печінці, селезінці, серці та нирці мишачій моделі хвороби Фабрі після внутрішньовенного введення одноразової дози РаргалгутефФ або одноразової дози рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е22С) (див. фігури 36, 37, 38 і 39, відповідно). В цілому, дані демонструють, що немає статистично значущої різниці у кліренсі СІ -3 на мишачій моделі хвороби Фабрі після одноразової внутрішньовенно введеної дози РабгалутетФ або одноразової внутрішньовенно введеної дози рекомбінантного білка а«-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е220). 5О0

Таблиця З

Ряд фізичних та структурних характеристик Е72О, що застосовували в дослідженнях на тваринах нини ЕТ: по 5 п ав

Друге дослідження виконували для характеристики й порівняння фармакокінетичних параметрів РабгагутеФф і рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого в даному документі (Е272с), на мишах Рабгу після одноразового введення 1 мг/кг (ІМ). В даному дослідженні 20 мишей Раргу (12М/8Е) розподіляли на 2 групи (див. таблицю 4, нижче).

Тваринам груп 1 і 2 (п-10 на групу, 6М/4Р) одноразово ІМ вводили РаргагутеФ та рекомбінантний білок с-галактозидази-А людини, представлений в даному документі (Е22С), при 1,0 мг/кг, відповідно. Збирали зразки крові через 2, 15, 30, 60, 120, 240 і 480 хвилин після введення дози для аналізу ферментної активності на плямах сухої крові. Фармакокінетичні аналізи проводили із застосуванням Ріоєпіх УуіпМопіїйФ (РНагзідні Согрогаїййоп, Мошпіаїп Міему,

СА).

Таблиця 4

Схема фармакокінетичного дослідження (Ч/Ж) (мг/кг) дозування

Зразки крові зібрані на 2, 15, 30, 60, 120, 240 і 480 й Одноразова |)/ хвилинах після введення 2.1 10(в/4) втагуте (Е22) 1. |доза/м дози для аналізу

У ферментної активності на сухих зразках крові (0ОВ5

Дані демонструють, що фармакокінетичні показники Рабгалутеф і рекомбінантного білка а- галактозидази-А людини, представленого у даному документі (Е72С), у аналізовані точки часу (фігура 40) є подібними. Після збирання зразків у вигляді плям сухої крові активність ферменту та відсутність концентрації розраховували у кожну точку часу. У цілому дані демонструють подібну ферментну активність між ферментами після одноразового внутрішньовенного введення РабгагутеФ і рекомбінантного білка с-галактозидази-А людини, представленого у даному документі (Е72С), у аналізовані точки часу.

Інші варіанти здійснення

Слід розуміти, що, тоді як даний винахід описаний в поєднанні з його докладним описом, вищенаведений опис призначений для ілюстрації, а не обмеження обсягу даного винаходу, який визначається обсягом прикладеної формули винаходу. Інші аспекти, переваги й модифікації попадають в обсяг наступної формули винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«130» Сепгутве СегровБажіой «|» ВЕКОМБІНАНТНІ ГЛІКОПРОТЕТНИ тА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ: «Іі ІУ4Б-ПОО5О «Ем» БІ БОЯВІВ «ківі 2013-30-95 «150» УЗ01938 кі5ім 5013-11-08 «16505 3 «ій» кава О диня мівоже зерсія 4.0 «21їх 1287 «212» ДНК «233» оо зарівне «НК ї й зтсавстоз одавсссвоз встасаєсту дастоксоє ктасястесо сетостодек 5 сісцктсст Одавсатесс соростаза Ффозетнаса агзоадаєтшас вадовесуеск 320 зссахооост достосасто оузесчєткс асосусавсе ссрастоска девзовосса ХВО датткстоса тезатозаза зететїсаго дздасоосяе зосісасове стсзозацеоє о торавовато садцтїтвсва ЗсасссстЗ: актбабцаєє оттодасооє їсессвавов 300 застсазазо дсвавсткся звовсес саосасттес сесаїоооах гсдссзаєтя ЗО оставетату Сссасарсвза зпозстовяу сезоооаїех азсусаоакоє содиавтваа 420 зсстосасва псттссстов чабттетода тассзсовсяа стоатссся васстттоєт Ю засесозози гаапзестосх азаажтсоак дохо тасе ятуасвастх сдазавттєу 540 пеадаєацьт зтазвсясає дкестуцОке стозчсвоюа стодсвозаз сатеототає 890 тсскосозок зоссокствта сатотоссє тбкеаазаоє ссзажтатас звдаавессевза БО сзцтастося зісзсісо вазбЕссусх дзсатєтовто зстсстозаа азбтасваво 750 зотассетад шстодасатс ссбїзассаа паозузатто седатоковс содассвоюо 78О чотесдовасо зссезовтає зтхаетовВтє озсаасетто зесісавсто оааксзосва 80

Зезасткаця Беуєсстєта дастатсвка фобуєтестх бакісататх сЄзакдвестк 900 сазсвсатсв дсссієвадє сзавосксїс стеслодаки воЗасотаае коєсатсваї ЗБ саезассссї сфрмкаааса заопївссав сттазасязо даоасавехе саван свю ЩО озасоасстє кСтсаздостт восени х дізостатви свавссопаса опзозетаюх МО ядасстсаст стжвевЕксат сзсавттоск жксосстаоота азозазхнос стосватесї МАВ кскОкткса ксасасадеє сстсесьоко вазадвавує саодесекеа томата 00 тсавоустай дазотсасат вазтїсссаса Фусвскуккж костксаех здавазтаса 325 «тослорзакат сатізавада Стас 1587 «МІХ х «гії» 428 «а БОКС «213» Мощо карівле «ре 2 й , Й , меж бій і-й Ага Ап го бін іду нів увв бік бує Аа їв аа ев 1 5 ї 415

Ага реа іви мів іш уді бар ттр Ахр їіа во іх аїї го із сен є Кк з ер Ах ту мі Аа ага ТВ вра Тис омет бі ттр Сей ні тив чи 3 0 85

Агу спе меж Су Аа івн Аза Су бій Фів Фім вго Ар оЯеє Сук Кв о 55 за

Зак бів сук бен Ре ме Зі Мек АТ Бім зем мет таї заг їм щу 70 75 ко

Ткр ку Ащов А Оу тут бін тТук цец сує Ті д5р азр о сСух ге Меї : є : В й . 53 іа Рг бій ага аб Заг (ів «у з їзи Бів 3і8 Аза о вга бів Аго що 16 000 тре вго ні бі Гі Ага іп овез аа а5п туго узі ніх Зег вуз 01у 135 120 й 125 й веч вуз їжи щіу ів ТУТ АЇЗ Ар за! бі Аза Бу5 Ве Суб Аїа Оу а 135 не шк не Рго сіу бфег вне сіу Туг Тук Абр оІТе аАво АіЗ сів тВг Ре АТ 145 шо 155 ї168 яко тТгр іУ УаЇ Ар оіяи ев ух Ре Яр ші Сух Туг сух Аве бек . 155 170 о о15 іам Зі Ап ізо Аа аа су тує у ніх меб бак івц АВ цей АЗИ 180 ї5З І 186 ага ТВгосбіУ ака баг ї1а ма Туг бег оСув Бім Тер орго Сеу тує мех 135 2 | 205

ТРа Рга но щЩіп фу рге аха Туг ТВРОБіц жів що Фів тб Сув ляй щі 215 й

Ні Тгр АгФ АхИ РАБ А! Аве їі дер дер бег ТРА мух Заг жів уз их 230 215 І І 230 ас її реу дер отв тйкКо5ве КВа два бій бів аг хів маї дер ма 248 250 І 255 «іа ту вга щу О5іУ тгр Аа Ар овгОо Ар Меж сви Уж Ів 1 дев ке 255 270 вне бсіу ем Бек тир Аа бів сій Уві Тк обів меж дія веб тро Аа 295 БО 885

Ї1е мот ліз аЇа РгОо івб Ре Мет баб дело АБО зви агар нів їі бак 295 300 вто біз дів рух Аза зви фер бій А5р уз аю Уа! хів Аа її а5в

ЗУ ЕЯКУ 315 | 330 сій аби вто ів оО1у су бів оЗіу тує біз бе Ага 1 бі АВ АБИ 325 330 135 йМне віч ущі їго з; аго вго іву Зек Біу бен АТа тгр Аїд Уаї із 340 а» ї50

Мек їіїв ап ага бій біз їі біУу 0іу вго аг Бе? тує тТвг хів дід 155 їБи 365

МаТ АТа Зеє меу Ту фуя бік мі Аа СуЗ АБа вго діа сСух ве хів 3 375 ЗЕ твг віп ем іеу Бека маі був АБО вує ве у РВЕ Тут бів їгротве

Зи5 зво 395 | яю

Зег агоа іо ага Заг нів хі ажв о вго тв осі увйгомаі ву сец о сів й 5 18 15 іже Бі Аял о тТвВг о Мес Бій меж бек їібу уз аБр ів сви чо 25 «ах ї «жі» ЗВ «йтй ВІНОК хеії: ново бапівах «М» З й мав ар оава бу ши АЖ АР ТВг ОБКОо Щи Мах біу ткр о бав віз Тер бів ака вне чає суч Адп о івм АБИ о сСух біб бів шій вго ер кат сук ї 2 3

Хі ек бів уз ім вве мож бів мет АТа сін фе меї Узі бак бів ща 5 бі тв бух АзВ Аїв бі Тук піц Туг кво Су5 Ї18 Аза Ар осСух тт 5о 55 5О й

Мек аія вБго БІіп о ага азо Заг зів б1у го би Бій іа ав о вго бів вк 78 75 | о ага вве вго ніх Фі їі2 аг бій їву 813 Ав туго Уаї Ні баг гук 85 І ла З5 біу єн фу івец бїМ їТе Туг аа а5О Хаі пі дхп о їуз тТВгоСух Аїя

Зоо 105 кзКв «іу вве Рто Зіу ек те ЗУ Туг тут АЮ о хТж Аз» іа ів о зЗвВг ве 115 ї2о 125 іа а5р тер бі Уві Ар обем ву гує РНе дяр б1іу Сує тук сСух АБЕ

Ва ШИ шк Й баг ву бій азв вен Аїй Або біу ТУг вух Нів меж 5ає сце АВ ів 145 ї56 ї55 150

А Аго тве біу Абу хег хів ма? Жук баг Сух 10 Тео рго ев Тук 155 Ка: 175 меж тТгр его РВє бів вух Рг» Ай тує ТВгосію її ага біп о Туг Сух й 150 165 130 зв нів Тир або ав вве їй вв ї1бБ ар Аза баг ттр вух Баг Кв ї5У з хо іує Баг Ї18 ів абр тир Тнт бек Ве дей сій біб Аба жів Уві ахв зей 0, й З2о бо ч чаї діа су вго о1у бу Кр АВ АБВ реа ар омеє сен уві Хе Фу 255 230 а | 240 авп вна ЄЇУ сео бек тТев Аби бій бів Уді Те обій Мет АТВ ев тив

Й 285 з5а 55

Аіа Хі мет в5іа аїя Рго їв) РНа МаЄ баг аБЯ Ар сен одго нів Сів жо Й 255 ОВ

Хет вто сій дії фуз Аїа ви зав бій Ахроі мо вер оуаї їв дія тів

Жи5 ЩО 8

Ап іп АБрорРгО вен сту вух сій бі ту сів бен Ага сій Біу Ах «В 235 303 деп вне бів У ТК обі: АК оРго бен Заг бе зе АТЯ тре о аїв У | кз Ол 535 12

Аів мех тів ака Аго ій бі 016 біжу біу Ро ага Бек Туг ТВ ї1а

І Ди ЗУ І ШУ ше ки дій Уві Аїд Зекоівц біу мух ціх уві дів Сух дк вго діа Суз вне

Й 340 | 345 З50 тіж твРобів сей сво его Уві вух Аг сух без Біу ее тує Бім тгр 355 35 ЗБ

ТНг о Зег АгО зву ага Зек нів Хі Ах Рго Те одіє тк Оу бен ев

ЗЛ 325 ЗО віп без ід Аза тВг оМеї Бій мет аг сец зу5 вв ічи фей

ЗБ 398 355

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рекомбінантний білок а-галактозидази-А людини (ПАСА), що має: відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди, без вмісту фукози, який становить від 0,1 до 1,5 905; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-6- фосфатвмісні олігосахариди, який становить більш ніж 9 95. відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозовмісні олігосахариди, який становить більш ніж 13,5 90; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трирозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 2, який становить більш ніж 2,0 905; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди, який становить від 0,1 до 3,9 95; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозовмісні олігосахариди, який становить від 0,1 до 3,0 90; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди, який становить від 0,1 до 5,3 905; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трирозгалужені трисіалільовані олігосахариди форми 1, який становить від 0,1 до 9,0 905; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6- фосфатвмісні олігосахариди, який становить від 1 до 7,0 90; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфориловані олігосахариди, який становить більш ніж 14,8 905; відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди, який становить більш ніж 4,9 90; і відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані та монофосфориловані олігосахариди, який становить більш ніж 8,2 905.

2. Білок ПАСА за п. 1, де білок гПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди без вмісту фукози, який становить від 0,1 до 1,3 95.

З. Білок ПАСА за п. 2, де білок гПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди без вмісту фукози, який становить від 0,1 до 1,0 95.

4. Білок гпАСА за п. 3, де білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані олігосахариди без вмісту фукози, який становить від0О,1 до 0,7 95.

5. Білок ПАСА за п. 1, де білок гПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-б-фосфатвмісні олігосахариди, який становить більш ніж 9,5 95.

б. Білок гпАСА за п. 5, де білок (ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою біс-манозо-б-фосфатвмісні олігосахариди, який становить більш ніж 10,0 95.

7. Білок ПАСА за п. 1, де білок гПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозовмісні олігосахариди, який становить більш ніж 13,8 95.

8. Білок (ПАСА за п. 7, де білок гПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані фукозовмісні олігосахариди, який становить більш ніж 14,0 95.

9. Білок гпАСА за п. 1, де білок гпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 2, який становить більш ніж 4 95.

10. Білок гпАСА за п. 9, де білок гпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 2, який становить більш ніж 6 95.

11. Білок ПАСА за п. 1, де білок ГПАСА має співвідношення моль/моль сіалової кислоти/білка, яке становить більш ніж 3,0.

12. Білок ПАСА за п. 1, де білок ГІПАСА має співвідношення моль/моль сіалової кислоти/білка, яке становить більш ніж 3,2.

13. Білок ПАСА за п. 12, де білок ГПАСА має співвідношення моль/моль сіалової кислоти/білка, яке становить більш ніж 3,4.

14. Білок гпАСА за п. 1, де білок гпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди, який становить від 0,1 до 3,0 95.

15. Білок пАСА за п. 14, де білок гПпПАСА мас відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою нейтрально заряджені олігосахариди, який становить від 0,1 до 2,0 95.

16. Білок гпАСА за п. 1, де білок гпПАСА мас відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозовмісні олігосахариди, який становить від 1,0 до 2,0 95.

17. Білок пПАСА за п. 16, де білок ПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані фукозовмісні олігосахариди, який становить від 1,5 до 2,0 95.

18. Білок гпАСА за п. 1, де білок гпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди, який становить від 3,0 до 5,0

Фо.

19. Білок гПАСА за п. 18, де білок гГПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою бісіалільовані олігосахариди, який становить від 4,0 до 5,0

Фо.

20. Білок ПАСА за п. 1, де білок гГППАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 1, який становить від 0,5 до 8,0 95.

21. Білок ПАСА за п. 20, де білок гпПАСА мас відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою трисіалільовані олігосахариди форми 1, який становить від 0,5 до 5,0 95.

22. Білок гПАСА за п. 1, де білок гПпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6-фосфатвмісні олігосахариди, який становить від 4 до 6,9 95.

23. Білок ПАСА за п. 22, де білок ГПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою манозо-6-фосфатвмісні олігосахариди, який становить від 5 до 6,8 95.

24. Білок гПАСА за п. 1, де білок гПпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфосфориловані олігосахариди, який становить більш ніж 15 95.

25. Білок гпПАСА за п. 24, де білок ГПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою монофосфосфориловані олігосахариди, який становить більш ніж 16 95.

26. Білок гпАСА за п. 1, де білок гПпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою тетрасіалільовані олігосахариди, який становить більш ніж 6 60 Фо.

27. Білок гПАСА за п. 1, де білок гПпПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані та монофосфориловані олігосахариди, який становить більш ніж 8,5 905.

28. Білок ПАСА за п. 27, де білок ГПАСА має відсотковий вміст загальних М-зв'язаних олігосахаридів, що являють собою моносіалільовані та монофосфориловані олігосахариди, який становить більш ніж 9,0 95.

29. Фармацевтична композиція, що містить білок ПАСА за будь-яким 3 пп. 1-28 і фармацевтично прийнятний носій.

30. Фармацевтична композиція за п. 29, де композиція складена для внутрішньовенного, внутрішньоартеріального, внутрішньом'язового, внутрішньошкірного, підшкірного або внутрішньоперитонеального введення.

31. Фармацевтична композиція за п. 30, де фармацевтична композиція має концентрацію гпАсСА від 4 до 6 мг/мл.

32. Фармацевтична композиція за п. 31, де фармацевтична композиція має концентрацію гпАСА 5 мг/мл.

33. Фармацевтична композиція за п. 32, де фармацевтична композиція є стерильним, ліофілізованим порошком.

34. Фармацевтична композиція за п. 33, де фармацевтично прийнятний носій являє собою один або декілька засобів, вибраних з групи, що складається з маніту, натрію фосфату одноосновного моногідрату та натрію фосфату двоосновного гептагідрату.

35. Спосіб лікування хвороби Фабрі у суб'єкта, що передбачає введення суб'єкту з хворобою Фабрі терапевтично ефективної кількості білка ГПАСА за будь-яким з пп. 1-28.

36. Спосіб за п. 35, де введенням є системне введення.

37. Спосіб за п. 36, де системним введенням є внутрішньовенне введення.

38. Спосіб за п. 37, де суб'єкту вводять ПАСА у дозі від 0,5 мг/кг ваги тіла до 2,0 мг/кг ваги тіла.

39. Спосіб за п. 38, де суб'єкту вводять білок ПАСА у дозі 1,0 мг/кг ваги тіла.

40. Спосіб за п. 35, де суб'єкту вводять дві або більше доз білка ГПАСА.

41. Спосіб за п. 40, де щонайменше дві з двох або більше доз білка ГПАСА вводять з інтервалом два тижні. Ко) 42. Спосіб за п. 35, що додатково передбачає введення суб'єкту одного або декількох додаткових терапевтичних засобів, вибраних з групи, що складається з анальгетиків, антикоагулянтів, інгібіторів ацетилхолінестерази, В-блокаторів та інгібіторів глюкозилцерамідсинтази.

43. Спосіб за п. 35, де суб'єктом є суб'єкт-людина.

44. Спосіб за п. 35, де у суб'єкта було діагностовано хворобу Фабрі.

45. Спосіб підвищення рівня білка а-галактозидази-А у лізосомі в клітині ссавця, при цьому спосіб передбачає введення клітини ссавця у контакт з ефективною кількістю ГПАСА за будь- яким з пп. 1 - 28.

46. Спосіб за и. 45, де клітина знаходиться /п Уго.

47. Спосіб за п. 46, де клітиною є клітина людини.

48. Спосіб за п. 45, де клітина знаходиться в суб'єкті.

49. Спосіб за п. 48, де суб'єктом є людина.

50. Спосіб за п. 48, де у суб'єкта було діагностовано хворобу Фабрі.

51. Спосіб за п. 48, де введення у контакт здійснюють шляхом системного введення гППАСА суб'єкту.

Б2. Спосіб за п. 51, де системним введенням є внутрішньовенне введення.

53. Спосіб за л. 52, де суб'єкту вводять ІПАСА у дозі від 0,5 мг/кг ваги тіла до 2,0 мг/кг ваги тіла.

54. Спосіб за п. 53, де суб'єкту вводять білок ПАСА у дозі 1,0 мг/кг ваги тіла.

55. Спосіб за п. 52, де суб'єкту вводять дві або більше доз білка ГПАСА. БО 56. Спосіб за п. 55, де щонайменше дві з двох або більше доз білка ПАСА вводять з інтервалом два тижні.

57. Спосіб зниження рівня глоботриаозилцераміду в сироватці крові суб'єкта, при цьому спосіб передбачає введення суб'єкту, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості білка ГПАСА за будь-яким з пп. 1-28.

58. Спосіб за п. 57, де суб'єкт має рівень глоботриаозилцераміду в сироватці крові більш ніж 8 мкл/мл.

59. Спосіб за п. 57, де у суб'єкта було діагностовано хворобу Фабрі.

60. Спосіб за п. 57, де введенням є системне введення.

61. Спосіб за п. 60, де системним введенням є внутрішньовенне введення. 60 62. Спосіб за п. 61, де суб'єкту вводять ПАСА у дозі від 0,5 мг/кг ваги тіла до 2,0 мг/кг ваги тіла.

63. Спосіб за п. 62, де суб'єкту вводять білок ПАСА у дозі 1,0 мг/кг ваги тіла.

64. Спосіб за п. 57, де суб'єкту вводять дві або більше доз білка ГПАСА.

65. Спосіб за п. 64, де щонайменше дві з двох або більше доз білка ГПАСА вводять приблизно з інтервалом два тижні.

66. Спосіб за п. 57, що додатково передбачає введення суб'єкту одного або декількох додаткових терапевтичних засобів, вибраних з групи, що складається з анальгетиків, антикоагулянтів, інгібіторів ацетилхолінестерази, В-блокаторів та інгібіторів глюкозилцерамідсинтази.

67. Спосіб за п. 57, де суб'єктом є людина. «іжосовні хвопобв нако чення а віхвовісні Вермевуві дефекти Хвермуйа Ффермежений дефект Хастрова Помне кола веенюкознизза напри Мови, коп кутею Мчч хвороба Гуряера: 0 вбіауронізаав є ваипрнюю ідол Мен іхворова хантєра) 0 ідуренаєеульфагая МЕНЕ Свв ло пераран М суживетаза МЕТУ (Меоркю А танк тон ста фатачи МР ТУ мор ВІ хислю Погаликтознляза МУ УН (хворо ни Й-тлюкуронідаза: Хвора Бкліємн Мезретиаганкозва й іосфотранефераза Хвора Шидоера де Манти вже іван (осалактизвдаза В) Хвороба Волмана хнеда ліпаза Хвороба накспнчення кислалілааа ефіру холестерину Хвороба аунера. дікизУяне кнеза вераміднях Х весна Німзма Ока жкнеа сфіомієтіназа Хвороба КГ вечерв Б-улюкозиаан сеснівно Сеуеиую Хвороба Красє івлактазнлцерхніцеке Хворосн файрі сеталактозндаза А МІ гантліозидоз кнола П-гвлактознааа Галакторівлідоз й талактузидази та нейраевіннема Хвора ТОЙ Свков тезжими ная АХ Х воукнв Сзнауоффя. упехевмндаза А зе А х АВ є мукополієвхатиз

Фіг.

Біложчинерезнник альфа галакзозвлозн-ь щФеолнна та лик гас зві ж З ях ЕОМ: 1) ЗІЗ СА ст а вас СК ЗАВ СТА СК КТЗ ОС ЩІК БЕ СТ ОХ МК ке Ж же Зхез й Зжо За Без Був їн ЗК Шу АїЯ Бе З еВ ї В ї8 5 пи те се С Бе ЕЕ КОС ОО ШеС ВУХ СТ КО СТ АБ с СТО захв Ба зи Дів ем Уві беж ТЕО дев сів Вк су Аза дю лів Бе я їх ЗЕ ас важ Ов тр За ВО ОЗ СС КС БО КК ВОЗ СВ САС Оз З ве Бжа со ва) віз Бе їж ККО їЖЕ Ме Зіу Тї5Ю Ба БМВ Тк ЗВ Км ще ах ат тре: Ба С ас СЕ шо ЗМ Са Аа ВО мов МАХ ТОМ ОС Же Зкч Бе мех Сув дав Ма дев сув ЩІ лі щі бхо бе Зах Ск бі з ох в їх за ЗЕ ке ват АВ ЗВО СТ ТС АТЗ БАС КТ ЩО ЗАВ СУС ВУЗ МТС СА ЗАВ КВ пек Піч Без їхніх Бра мес щі Ме вів Зі бе; Меб Зах Беж ЗУ ЗУ Ж Ко ККЗ аа я БАОб Е ОС с ТК АБ УВС о МС ЖЖ ЗаЖК щаК же Х вк Ат тТтр зУа аБи дів іу Тук БВ ТуУук їж суз їі Аза вар осуз тур Ме Б 3 Б СЕ с ва ВО Сп ТВ пав оС ве СТІ СВО я ЗЕ Сех СА Сл Віз Вк: з йтз азо Звге бій піт дже Беха ій дів дев виз Вій ке м УКВ. 135 ТЕТ СС сСат ОО ЖК СО СА СТВ ОК АЖ ТАТ ПУ СК ОС Ва А тво Ре Мі (Р Хі й ПЬБ Б) ов ав» Ту щі ЩО паю Був щу КЗ зав їх со ВНІ СХВ ЗОЗ ВтТЖ ТУг оса ЖЖ ств Ох важ вла дЕЄ М ОС5 се Бен еВ ва Зі Хі Ту Ді дв За Зір вав був їх СУБ Бі ЯКУ Х Я т | | І: У 3 135 138 ТТ КК СК Ву ТТ БОБ ЕЕ ТАС ОК АТ АЖ НСС АВ ОЯКУ ЖЖЕ ТЕ ме Бк Зі ех Же Зі Тух Тух дев Тіз до дів Зію ЗВх вНе дів 385 5 МЕ Ма АС ТО СА ж а МТЗ С вда ТЕТ БАК ШОЕ ЖЕ ВО БУК ЗВ ВЕ ее тКр дів БМ Бе Беб бев Беж фбе Аюрв Сун Су Жук ув йвеш Зх їх Мо їт5 їі мів баз Меч де ЗЕ Зі ТуЖ Без МАВ Має бек Се біз бав За КУ зва ЗЕ ИН: х ужев» Й 1: с «Фіг Зістор 13 В чо ши Уж а Зх. ем ому межи ЗУ, ко ех Сл у їм Ну кн зе АСК с аа З ДжК НН ТК ес ПІР ЄВ ТО СХ СК ТЕЖ ОК зе Тзг піт вх Вес її бі Тек Бак Ср щи КО Ва зем ТУЖ МЕ кеМ ОЕтеХ ОЛИХУИ ет х шо ух ол см сх сим ХК, хх ска мих мох З СК ЖЕК СЯ ВВ КС ЯК ХА АСВ ЗВ ВУС СО КАМ ВК КС ВЕУ Зк Бе БОе ПЗ вуз вто ва ТЕ тах ЗБ: їїі6 вх ій БУХ був Зка ка Кз 35 к- со я р Кк. сускх г 3 ; ик ех Ж хек; жу о же ех ха.

СО МВ СА ВА ТК СЕ А АТХ БАК А ТОК ТОМ АБ АХ ЯКА КЕ та дм кед о Жимуєко Ж омек.

ЖУ хх ж жо ми Ко кОЕК села М ко Вів Ттрв джу ави бе Аве Вкв Гб без Бех Бек тжр мує Щек СБ був Ка КО ККУ щи х хажж ск о тлу КК Сех ва - Ка щеК ТК се КЕ ВЕ А МІВ ЗАС ТОВ ВК БУХ Тех АВК ОБО ЗАВ АБ АЖ БУК ЖК УК Беж Хі б; дає ств ТК бек бе 5ао ав За лк За В дер ха хх ЩЕ ке СО ШО СК ОБ ЦК ТЕ ВАТ ВМ СО АЖ АТ КІ ОО ДУХ ВОМ АВ ІБ і» Ва щі уе ТОБ Вже Зав рез Жар наб Сх Бі її Ох ака ТРЕК СО ВК БОМ ВАК СВ СА БІВ МК М АВ СК КК В КЕ зх КУ хо Ж с. щих. аж и ШК Ка дея Ж бок п до Ве сі зах Бек ТМ Ве бів іа жі ве ої бе іх Бех Тв аа «ЖЕ ака ЕІ їйе Ві іа Вів Ми бе б» Меб бех бек дае Без Яке Мо ів Ме

«ВО 5 а БК щі Лі хе Між ее бе «5 Ба Бу БОЮ ТА ка Іа ЗБЕ ЕВ За ще ща ЗХ сх Ук дуже Ук схухух жи сю Ум аУХ МОХ сжиух (ЄЮ меж вух їх Х мих ви СВУ ЗК БК ЗАМ Же МБ СА КР УК МУ Ж ОВ СВО ША ЗО ВК Щів ав ве» бан пор Був ПІВ І ХУ Бів бе аг щік ЧЕ В ХВ Ж пу У В М и Мих, г ОА и МО В мем Мих ТТ МВ КО ТОЖ СЛАВ МІК МУ МТМ ТК (КУЄ ТА ЗМУ ОХ УК ЗЕ МИХ хе сі Ух Ук ів зе Без За Беж Зх 5-5 Аіз Тже дів Уві ів

355 Зах ЖЕ АТ АТА АВС СМ СВО ОО АТ ЮК НО МОЖ СС ТОВ ТА Во А СК МЕ ів дви лю я сх хів ЧУ Зк Ка Вт: За бук Знх 165 Іа ЗБЕ Зо ЕЕ

Ки я ОК Як сх дам КУ Ком -х К 5 Че дже с, ко уві ді Зк Б КР Му зу УВх ЗІЗ СУ Зв Ба іа Су Ве Ті

КУ ЗЕ зве злих Ж об нжючаза Ж ог ето

ОВ ОСА КТС ЄЖО КНУР МО од ДОК дае СУА КО КО БМК ЗАВ УК вет ТОЖ ОА ми Ме БЕЖО Зах БЖ ех Му без ЗМ Ме тик ЖК тев ЩЕ їх 152 ях зав СА ОО ХА ВА ЖЕК САС БІБ АЙТ СКС ВКА ОО ВХ УК КМ КК. СВК пав Ох Бу Бе щеК мли Ав Ав БО МЕ КУ ЖЖ УВК кевх ям АВ я жа Ж СЖА ШО АХ МК ЛЯ ШАХ КО ОА ЗВ ЗК АЖ ОБ ФМ ТААЖВАОМАХ ен іч дз Тк Ме КЕ Веб беж бе фу МЕ ме БЖ. Зріля вахфн квт оз аа вози КО Б ЖОВ З не баб ха ЗУ бБев віз Аку Зк бо ЗБ Ме Бі Жкр ме; бі Те Ох вет жма Мет буз ха аз дев су Зав біз вк бжше Зав ех Су 3 Хі лек 35 Буз йеа БВе МеБ Сію Мах Вів ШІ Бек Ма ві ех ів 8 іх же МУ ЯЗ Аза МУ Тук ув бе ба бух бів ввю ав буз тжв» Ка Мак Ха вко ців веж ВО Бек біз пах Ах без Зі вів вв куе бід Ва вка МЗа бхо Ні БОР Мія бу Біб без АБ Вей Тек УВ3 йів Зах буз Зя жу ви би м ху ув Жує дів дер вх ЩЕ Ява бує Твж Ку і В іт Бе хе (У Зак КМа і тує Зх Ва (3 ав із іа ТОК ВБе ІВ іа Вар хв 1 ТаБ АБ Без без був Ве ба у Су Тех Ку дев 1 вк май МО бе їв ВІ АБ Зі Же уз Щі МеК ве Ма 53а ме ї5О дам Вже ЗИх бу дк бек ЇВ УЗ Зжк Зв Му Бін Ер БЕ Бев Ту УТ Мах тТЖе бко Жак зів бує ко Ба бух Тв щі Кіз вхо ів Зух са ЗЕ аз іа їв де баа МВ Віз Бзю їж Зо взе Вес їжб бе бах жів ОВ муж пек Хі зма йар Тв жи ех Ме За (ІВ 01з жу із МЗІі зв ЗЕ У БЕ пІє рою БЕК іт Кр йже дер бе Ао Мак фе Уа ік щі ЗО аа ве щі ве БеК ТЖе ба» ію БІ) УВА ТЕ іо Ме ів Бех тв В Жуа ж нев бів Ав ка без Ба Ма Зк Зав йяв Бе У Ва хі ЗУ Бах Жус Зі й Бу Бів ев вве Мій дав Бу й» Зі у) Ах Ха ВВ Же Ан ве Же ба у ж аю Уж Бук пе зва люш бів Зі барв ЗЕ За ма пі т) Ухв Ома вка Бже ее бек ке беш я же ій чаї жо ків бае хів бан АОфФ а Хо» ів 53 щі ее вка бак Тух Зх ї35 38 ків УВІ Мі Яек ве іт КУБ Зі5 Уві дів су. ви йжое дів Ста ббе ЗУ та ЖиЖ Бі Бей Мев ко ВА Бу аку зує їй ШУ Ма Тк ЩОБ Жев ЗІЗ Жве Бак Ак ви Ве Бех Яма жів ва Ве ЗБЕ МУ ЖЕ Уві бе ее ЗА пал без іа ви Ти МК із Ме Зве їн Бу Аар жяю Зав За чн. істор. Я 3

Поліс ванньсоо рані нрахагав кава еще - АСЕх, -ї В ге БЕН ВО Кн 7 Й З етопекахи нями У Бажяій пазу і ані я кі завтуяаюня 000 і несопхх ВХ З М х дО ХХ З

Я в. с «В дстевми «7 Б Я ехо ДАЖЕ, ЯБрохуєсор д-дкину хом я а і Фіг, 3 Тра курси ї ема пібметак Грехетр УМ дар | но Тчекка мочнгху рез кв куквріхе ше я Зір. о Гриминювність. ак комує С Тачиз печатку попка І с я зеркнрт НК Ь с нн НИНІ у я Прохмекц СУМУ іштрею : 5 не араб кое З ЯК Кірелікниеть ях аеккух погядвк ну й й Е люк Куровкиов СЯ Поп А) сакнщя Фіг, 4

Тзносеренвя зна без кнронаин УК МАфКНВУВИНКХ себе рік кекси ОВК ЗК Снлаюнуаан та й й плн пирощувааня ХК кл вивий ; Я зоурувянані ку АТНО Жожкй У дути дня ря Бажовних; (КуоноеюІ " береза яке ях ІНН ЕК ин не появ и КефеКТмКо тран мини они однин КЕНІЯ тиф ко Босуові яти ТЗН за доза МЕЖ ж. Кіфкктваність криниці пктр ан я СН рек УМ окон ву ву (НМИУХ ха іднххняю» ВЕРХ (Бтьнімвн Своє пуже кн пічка Горова ВКЛ В ДЕН: зу Ек ВЕ КУВОМ Вам ВЕЖУ ВВЕ Ва ж СИНИ ж Ко я ж 00 КЕДИ КККЛ Ов чик, 5 АВ | ! - 1 Вервес г : Хо го Вера : В Ї ОТ : : і 2 Ро : Се З Н : ше ії ї : Пд: МОУ ЗМ КОН ЗЕМ МН ЗАМІН ОМ ЯКА фас івана СН Фріс в

-к Канн ще хм а щу ї я т : - її ; : и пі Кабекунн (Ка В хо ке т ваше мкев. Кк т хо ее. хі ше Ї та ово ї і Се Ї хі цк ПЕ Я : х БЕК ї - х у ї Ще БУХ в й пре «й Ін Во яке ХЕ Же рококо ГУК пк Ко КК. «ід че Жежих У й її ж х щ шк т пЖКх : 1 Ж Бі ї -х їх ї КУ т ї в г : ЕЕ: Не : ме: З Келізнаій : з її ер! : щі в : ве й г : : і Ох Е х ї; се В ДЕК Ки КК Кн Куди КЕ КК ЕК КОЖ КК КЕКВ, жУхкте Фіг; 7 ТАМ - Я дав Байгадита (РИ х ; 5 КЗ зав НЕ в ЕН ! яв, «нанні | ! Й я х х їх 3 вок ва їх її З є КЯ Ва ВЕ Вх І х к. й х її КЗ Е ще тав Не ї З «Е 1 ов) п 1 І сша ЕШЯ ї ія Е хх ; ї- Е У Ка х ЕЕ ж вн ри о КО А Я Бє ЕІ С Я їх Ж Б В 1 Х ї У х Я щ-к 5 я Я Її БЕ кох ; рн теж кю кн жк хи Ше Мівса г мзеаларая «ріє. 8 НЕ,

ж : і-й Хе же я ще ДОМА ва ХУКХКИХХХИКМКИККХ і КК К ї ї Е Ко» 3 ТЕ су Зк " іЗ . й ї З й З х х. ге її КЗ З 5 х З : : : І І х їх х ї х Е ОХ Е ж. х Х БО СОМ ЕЕ 5 х х х х : : :

ї 5. Х і х х їх їх 5 рити 5 Е пОШЕЖЙ х КУ х ї ях ІЗ х ння х домо КК О КОКО КК Ам еко ек і ов 5 зва КУ Н кое вх ще і їоме ог : діфармю крисіухільсечнях пок онннннннннн АННИ 0 о Мав Н екз 5 їх сзогха ї3 Гахкетеюі узаквна ТИ Ко Айбнох уко ро вка БИЙ фо. я ша ее" х бо свою З НАНА денна г» ума ря во с мов й З А Е Кекс: НИМ у де НН ва тя Я їн дій й 5 яБю З : й З усна дк шш ше ШИ Ше Зоо я І: КН он З де фена 5 тро С яма Єв, з сни ; ІЙ оту ж Я р й І 5 ря сх ус в мила З В ї ЩА х ва Ше ЕІ | се | уко зваде З Е 2 Е Но Е й ЕН в Еу ї г і В В Ї Е зон З сн ЕЗ ЧА ШИ ще: «АК ши Анни І ЗИ ННЯ ТИ темну тету роосскетан іа ява такьні ба идю ЗМ ЗКАО ОВ 88 са» бю. ябще Зою збою оре ІДУ Здаю р Жека»хо тотетх пет, СТ плас анал ннннннни ФОН нний Некгіохекі Зауикцаенх плізюсвевунеи біг. 10

ЛЕН А, БЕхе230, Евер (СТОПУ ТОМОЗ12 гО1 ФО ОЗ 8-30 Зою ІЛЕОЯ А, Еке8О, Єтечоб СТО ВІ СТО ЗОМ ОВТ ЯЗ ООН ОХ рення Баїмахуюа ЧЕК) ! оллттервовв ЗОВ- | ! я ! в ОО З і їв ї яки : 58 й ІН. ри в ;

; і. | й в; ' й Мен и: ШІ нн ше НШ я а 28 3 во ва що 420 0 зв Хевхцов чн. в Карпалутей (БУ) ве КЗ Керізда! Ж ав 4 шин ши - у їх з . К ше . ї ще «аю Т. шк ще я т 0-3 -

5.0 ДК Ко ЯКУ ЕН ОКО ШІ щ о К кккки о оічккни Я - нення

Фіг. 13

Глікофоврми АХ НІВ і пормалізввана ном піку гліковевтнядуї заЕАе

Ї с. 4 рвим ї |а- Бодя БМК у :

іє. Зк в З ЕЩ ву : х І ! їде Яви? Н здох | Ей Ж ру Е Й ОВЕН О- | | і Я | я М де я ЕІ Е 2 і і До зак: | | М р. я чі в і, АШ Я ні ОААКА Ах сх У х 25, 5 3 ак и -к А он Жуки МАУ НІ нд ки що - х 7. лення х БАЧ ЗХн «ТЕН вв іі Ка Ес вих уж ол яи их векнни виважене ж же А ЕЕ ківі в Ак ЕІ У кт ши В Ше : вн В іш ЛЬ ш

ЕЕ. й Пн вбужук КЗ Я т ВО ші ши ШЕ ше шк. і. В

«ік. 13 Глкофворан НИ огржмалізованя звана щіу кларвсмем ну НЕ - м Мою 5 як Бобгахуте кА) і: "Бенуа вій? . щОМЕА- Б ке ВОЛЯ і б аж. ін г. НЕ я т хх сх й цУ Е А Ж х ЕЗ / З 13 Но - ї ; хх М ку г Ши Ме ще ха чо У дх ще с оче Ба денні ка жи БО у у м скан т ав сне им ово ек кі щі АК АЮ ВО АХ ака я. ка. хі з г а: кн їх т Як М я х Се ЗИ У х жк ки ик шк ше з о а с НН я же в е ке - КУ ой" и ду ЕК У - ух ще Ех -2У ПОС) СЯ СХ НО У ве ях ж й «цк

ТонковВории ЗМІЯ с норхжалізевана паца хх седан твах МК ве КТ ди ТК мов Її і КВН ЗУ я їощ. Жакичех дО ху Е й я Евігахутач ЕХ Е і дедіб ! Ж чай м 8 Кок: Мерінов! і й й г ш аа: їй х З їх її Е "Де ЕЕ о. уся й У КІ хо МЕМ с ії І ге х Я Е к г й її В ш : : в Ка т г І З о Х Зх й Му КН Х Уа ї ї дї реЯ

Ж. ях о х й чи Й: 5 жк у АК ам сов Й я Й УМ ХМК 00 сх Й М СА с а НЕ ня А І В жокеи У пе ох а п ен и КВ писк КК ОН КН ме Жди «а м КУ Са ще Ка Як Бей КО ка Й М мИ че Се КИ З 2 ож ХК ос БИ. й і Ко ке кій а КЗ Ку ща г я в М Ка у ЕК о ЗУ БУ ве У я « ще х Ке КО Що М З НЕ кож е м ОО Ко сОВИ шк жк Б Фіг 15 щ- Глвчніуючи ДЯ НОВ балконах віку відносно середа зе їх й Хиктемкк КХЕ К рек ДЕВЕЧКЕХ ЩЕ ії ! Н БЕ їі То А Дол З Ж Бі реж РОЗВІН НІ Е й НЕ і Н ! гм 15 і. ГЕЖ ! ЕЕ І ЩЕ р Б і з Ен ї З ї ЕК Е АХ Но Е мі. В яз БУ Е ц Б В М : її ух Е є ДЕ Б х же їх х Х У І: з Як х У тх Е яю ї З Х Щі ї ок щу 5 Х кох х дез хх х іх 5 Ж ї ДК, ї в ПИ ; ШК ек, х. і і В их, Му У аа Е т т а 7 Зх. СУ Ка Коооюм, до К о о Ве ШИ Ше ж и т ви и ни сх мк С ВНИМ т 7 3 Ж ж об дв 5 оо ою щу ВМ молю що в ВА не НН: В І ЕН Ве І ВУ ше ши ши ши ше ши шк ше Ши ши ше Ши ШИ ШЕ ШЕ Ще Ше; в о: НИ НН в НН НИ РО ОВО ВО хек ж 5 5 5 що я В ЩО ЯКО ях щи хе ще я А зам А Ж хз ки Ж чне 16 ізо щ. Н паеуи: пу ма кт вк 2 яки вий ек А шо - МД Мат сш дя ОО й ЩІ Що ПММ Темат ею М ПАНОМ селу чаА ме ї КИ Ще «Мох ми тУКНокЕ ех що хі » ВВ ік 15 хі : тя В Я І уїлктЖх пря і і хо « ! іхлІМК ЛЯХ І ТВ Ж 5 ї ї шк ВЗ у | й й Ж | ще ій хо і « з Е ШЕУ ' що : Я б он . в ! 3 й : ї і і М І: Е і ОК Е їі і в. ж З і це | ще ЕЕ | може ши Ом І м о | | щ І : їі ТУ і ; дося : : ї що їх ! 15 ск їх ох : іхажл р: Ж м ЕЕ З і о М ох : і І ! їі ее т . х : щоноє х : К СБУ В ТО -8 Ек ра 5 пи! Ті ша т : : ІІ сій Н УЖ ди рі : для тк о». ка М ЖЮМ Бр г; КІН НЯ зум ВИ в МА у -- МН мо - СН Е ШЕ і щ : х віудхтяк хі: свй КІ гі ії: лі МУКУ ї а НЯ пкт коро ово сн інен і віоівініни па за ЩО о Ха що Ме же дО ЯК ее А КИНЕ Х з ши и ша Не а ее Ще ЗБК ФА ОБО сце ХХ мя У ж шк В ж Гвікворен ЯМІ сном н ЗМК певна нку ван ЕЕ ІВ Ву а норна пересаньмч й рт ї 5. Н Ух І Й ШО Б І я ї г і ек РВКОЗУНОТВ З хх і ї Х їх 1 рае» З Ї Щ ОХ р-не горна Ея 1 ше хе х ї Х хх су ШО З Б і ее ОО ! Х У блем Ї Е у поетка -х2 Х ! А х і Ї Я Ку Ї у х як у 1 у ; х їх ї ще що й х і Хо й х щ 8 в х. й х Як Х х й я В щ КЕ Ка йо Я Б Кя ща І й, їв і ; фони я х УТ " Ка Ко 7 7 я з зх Кк й м ї 7 у мес к повваванК ШУ Ко Є сх ще ЇМ лх Й Й і І я ши шк ши ши ших ши ше в ї: з , ; З ха З хх Ж па 2 с

Е. и ЩЕ з Кх КК ее ке «ЩЕ - КО 5 БЕ ще ше ше, Є Шу Я щі СЯ о» х с С й ; і . З я с Ко й ЕХ й Но Щі ві щі й ху БА Б ща ЩЕ ОК А щ ня є КЗ й й м

«г. 18 у зкафоран ММ Іва сроннва пу Відновне сепедньака НИ пишним й оо сем щ- зв Бедтуле тя І З щі З р Біне : : : ї ІЧ В в 15 ще Е ЩЕ І ГЕХО З Її Н М снення й і і - і 3 СК - Її У а Ж ОМ А Пе Х і і. х й Х «хм, У У 5 З в ях Н у ях їх 5 3 ох і ; ї х З КА 5 5 що Ж Ка

«а. ву Ех Х і" Її М ї як й ЧУ Ах 4 КУ Я чо її М У ра х 3 х ПОН чях с . Я й У х Б КІ З. ГЕ зсанй і сова: рол З ща х т : т : : : нн кс ко У Ж с ее не Не АННА й І ? М МОЗ Же Ж их й я ук їх вх 2 х Са а а не а и МК МО А НС ВИ З й й і в я ШЕ ДЕ ЩЕ Є ШЕ. ко Же З Я «А З КЗ ще в дк й ци чне 15 ря я ше н я й ї Карргасун Ха хх

; Е. КУ Ж Й я ; ! ї В Е КЕ : КО 35 і К Я до кож су 4 : 53 Ще: 5 х п сб тс ко на Кн жи Ж кемананн к щ сн же уст з : Ії Ер і ІЗ 14 їх ІЗ з: - І Я : : ї їх ї ї г 4 й ї ЕН АВ й ЗО ХА АНА А ке. яку, ЕЕ ІЗ : з ї і Е:

ї

І. Е . ї х з їх ї ГЗ В х ЕН 3 х К З ня ан Ж в їх Ж сини Я. пон фр. В і пк ; за хи. З ще Ой шк Ве о "ма мае З ЩЕ. т певна нення и. ях є в в Щек я ва зн ва - х Ме чне» В оо вза ех К жо зання х « Ще й че в. й мі г щ Ше г За бе -а че. їй не: Пн . око ро рососссссюю ! Бек Ж

Фиг.

їж Я г , Ж ч поь ж, їй 44 зах пи Б Же Жар ОХ З в яв Кі фЗевех п фробудкнннкккккккккяукакяккк кіккккякннккккною ї. 7 м Ж Я ще заг і Е- К ж в ІК « 3 КІ че їв ші

5. Е и с: зканнння рубка алАА ОА ККААААА КК АААА У Тл жкля цк « ч «

«г. 2

В Шеє х ск КЕ що че В Шк? й і КЗ ць ЗУ Хлес і; ща хх в. я щйк Кок і К. Я кох Є пев Ш я нн ення чн Б ЗК ще ЕЗ -е Завай ага» яд К-З шен ОКХ : зах ще хх в Я як ях ж Фа

4 ТЕ Зазне я це :

що. хе й Же шо с й ща о Е й х « Я в Тк в Ще Я кі сонник що ЧЕ: В з жк йж « леж Х ж нн Ес Ще п зв м: з є я. с Пк т щи : ще нн Зк кино шк В с Й « «Віг.

А ща їА х а, за Ж. М жав ка о В ! БеЯ і: Я як я і я гу в МАМА З чав и гі т КУ 4 Же з а залоза Ку ! я МАС є : ей Ку Х

ЖК. одоккннююююююю крок Кф ря ще У «

«ік. 25

МО клжкки З ер де хх ооо ООТТОБО НО зеіМРА ЕТ ТА Шен ве жк З АК хх ; х Ко х ке УК я ШИ Ден Мерів? ї З р ооо, Ва: м соня З Ох цей Й ж й нин я ТД ГДЩ-Я ее дою А Ж М І» ПИШУ й ди у ск Ж м їй А рас о, ве а па Я люк ж дк ї вай Коня текі ОЖЩу пасм одн ярих КЗ жди ще а: М века ТОД ПР чи о ж вас с а М ЕЕ ше ас Укл м М юс, м А Мк і Ж м їй я с ЩЕ -к ди в ТООУ ХУ кункютдлня нас ЩІК» Ж й Мая пане ХА ів Й МО в НН еллєкюв клю : КЗ ї Ж мс Мобєжеєхюхюттю хх ХВ - ско Зх ях 5 В НІЙ лох юю якожюююю хх вк УЖ ОВО и ва ї и пекан х ля ох ій Ж УОТЖ ЖК ую уж ж, служ хх як мк і х й й До. у т Ж . «й й п - 7 лення Що Ж ЖЖ юЖмки м юю ямок же жжлже жа жАсвА Й - я І М нний ТУ ууттт є кн тттеткююк жк КЗ ШЕ в дих ее: зва Е Тй йод ек ЕХ Х а пуменвй КЕ Кк ЮК КАК КАК КАМААЛЖАКАНККАХ ї са ни В ї ї ї у у у м ми чаиИитч чати а ча чати З щ Ех ВИ зе З ВИЗ АНЯ І НН а дих ЖЖ ме. ОПО ВО еСМеА ТК а ; о доянчкоттофужетееКео твто с НЕНЕ КЯУ помсти ї й. У к м в т Ме ! сеї зай меч 0-6 БЖ цк СЯ ОН З вк дЕ - в і во : ї х К Я г пе ї І се Мапа й осв. і РИЦНИОВИ І. ЕЕ Ї ччеттччнтчнччнннчннчнннї З А аж ідків? є зно ок овен мн З ан КН ОБЖ зе жащча? М сх Й Конкенурна к. Ко Я Фріг ж

Віджоне іще Ба из Й Шо пн й ; сяк 1» г «й з «Ж я З ач а З З «23 аве ве з ВО» 8 «У ще ЩЕ

2.9

Віг. аЕ дивзіз Ку за завомагажх кодове НВ. Козоєвха Р АКОА я ЕКХНУ Кая ПЕ сте ЕІ Яеазаний її : ящик КУ язки 1 що МК поросвов Еко ЧИ ОН Шк ДВОМ, Ж ! дені Я В ОМ Ж о смум Я о я ИН в ї М ДО кре ЕС Дфетнх щи БУ БИКОВ С НВ Т Ї КТК ея шко ее ов ИН я й шою 1 МО ою ОО о НН а ШИ що ШЕ Вих С В ВА ВХ Я дурну. 1 ВЕК о ВВ мету сю ре ш ши ММ Ме Б В ш ше ШК і 5. не Кс в В и ОО р с В а МНН с НН СН і ше зе У і меж СО Рабгахут чек Передає ЧНг, ха лав: КВбевухе за данемогомю коловка МОРИ Колонка 18 В-ВО я КОНИК момоколдоководюовогооо вка: КО кам ванн Н ! СО ення е ме -. т і за -ї К Зд'язанийя Й Ж ой Н . ох ГЕ Зк язаний ї і Зх с Її Мх сор УА Мая і не хо я бізне доз Я Шк о ШИ дя є: ША г ше КО й ОЖО що : ій НЕ З ОК в КО мови Я ОБЖ ж ГК сш г 5 що К Ох МУ КЕ ак КО ке шк Мая б й о КК ше им Ме ех ТК Кк МУК у р ру «ТК НІЖКА З НЕ ок Іво щі ДЗК І Б а т ; дах ВЕК СК Ме Ва мя МЕ в ОК ще КО г х. роОрори КИ ПЕ РО Бор жд че о ц КК АК КК ЖК АК ЖК КА КК АААКААММММК Я 57 іх . о: щи ще В ! ІНН / Е ї СЕ й жшт т 5 п Я ГУ Маки З.

НН і о | ВЕК 1 Ї К і ! - І? ЗАЧ ОН ї.

Яд З ! з МАВ, і С ин М он нехонютттртмі чи - я й ї т 1 Ж ї ШИ у ней 28 чфЕ

А Пн 55 ще «ЗО щ в. зззве" Е х я . В Піна ее / я Е КооЯ Бо; та? ся ся ня В їх нн Зі вки кинь ще КО й й С Е кВ їду ї хе г 1 . е 4 зве сао ев я пк І зеввавеа

Же . ї й я де хх а я:

Фіг. а

Кт зав вав ХО я шк ой ех Ве пн. утах Ко зивв» троян берети я : жа « ж і «в У В» ! --нпл Б як ЧнНе. 4 фл род : ї КОБУуУкм ях ще хо КИ х ї м а. «сім МіІ я КО ХЗУКОМ Му (з

3. Морам ВИННІ для М тем дл 7 Ї Її сзлхлнІ уми ВИХ КК ехо ї Ж веж я я ї суд лані 0 ВИМІВ КА йж ке вин В -- Ж Мі ї Я пппплтттнт ку АХ УАААУААА У ААА т тт такт з зем й нина КО ААКААКАКАККАКАКАК КАНА ТАКА КАЛНЬКньньнньня Ж. ЗІ НВ 3 ТЕМ Іюх Яких ІОВ кн Ух ро Є В І крон МЕЖІ сс НИ ЗНИЩ пи ТЕ не ЖЖ УМЖ іти Н ее щ БО І 5 РБК Кер ЗАКЖІА КЕКВ НЕ а ОХ фік щих о ДНЗ В кВ й пава а ана рою -Х ВН Я г т ї зад - З В Я г їх У їі ух, я З Я хх З К хе ЗК ВИ: І З Я м Н 4 ге Он Х па ох 1 ж КУ КК Я їх її ОК сн Ко жк КО и НИ КІ ж В ню о ПЕ Я хх НЕ «ММ х Х пе ох і гі я З Ж вв Еш НЕ ВОЗ Как я Ку НУ Її хі ї Я КОМУ А ІНШЕ КА Ех Кв з х КУ ж ї ще ХК жим Я см МЕККА хі у ек Я яв БОБ СУ ЗЕ х Кт г З МО ЩО и в НУ р. х Ж що лях ана Я З ЩІ Я ГУ і Деу ую ом й еко ше ХО: ких - КЗ В КТ : - й хі жо іє і юе іва гі У ку З 15 ш пе тако зд іа ЗК

208. НЕМН ї хА А зам заг У ЕК З Вк Хлиива К 1-3 п пан в ЗВ ЕНН З 5 р т. ик "ВИ ї М ш Х З Я Ж ТЕ КЯ за їх їм КИ КУ хх Живаках зі» ЗА

«Ві. Н МЕТ ВА Б МНК тя. «ВЕДУ Ж МИЖЯХ Во еКолкНя: оККая БУК Я зак МОНЕ НОЕКЕУВНЕ ВЕ мав: «ек ТК АКНЕ гі ооа вен КК нні БЕЖ МЕ ер ХЕ ЗОНУ Ваня лен з Ко и НОЯ скін М Ми дім Му куки сим, НК КАХ КЖХКК КЕ ми чер М ЕМВ ВКЛ НВО ННК лиже ях ' я хе . ЗХ КУ В тує КОИПИПИИОВ хх сюдююнк. роя ОХ Би т РОЗ : дих їдою сере те г Шк Бо со ; ПИ Я 5 щ М ШО б З МЕ ї ех» ВОЗ З КО сах сс ВК ших СО у ОМС

Ук. сс ВК ЖОМУ МК ОКУ хе «В КООСКеКом ОО ДИ ж її сна срзн Деу -е УК кіно У Тож КЗ шх Ж Х ; Мей ЗКУ В Не ц що З М АЧН ще Мо ееаннає КІ мок тку З ні пох нековнння пос В ЩО ЯВКУ В МАО се верею Я. ДЯН ЗКБоЛХ ВЕж КВН ЖЕ Т ЕК КОМ ме ке еф В ше ВО вико ня (У Коуза яки ОО пе Б ме п мум кн месцак мим ї ЩЕ БЖ І ме жеечеркх Бак. пу ян Нах да ї ї. ї г Бяхак їх х Е х кн Х денних. жк Е за: рик І ї Е я її З К - х удвох Я се й - МНМА ще ОБОХ КЗ сх і ВЕН. йон ОО З яку Її ВН се шо, С ОО Ще х В НК о ОК : с ОО МК ЗХ - х В КК ОХ ЗОЗ Е КИ ше х В ПЕК а ХО х ОС За Е я ВК ВУ ЗХ ОХ У хе й В ОНИ у з Худо х УК ЯН, 7

Ку Р аМинмуют же мере і аву сйко вевсневомя зе Ко Шимуваен К кр ак Я ІКкя века ня МОМ КЕ ЖЕК ЗБІУХ ДЕ ЗАВ КВИЗННЯ зах Же КОЖУЕКЕ І ок чере СУ ав пан еаедееня а ек дня р З - ЖЕН х У вх М, З щих - і ВО ведете ск оодох у ППП х КУ К: ке Її ВО ож ОО 3 З зва а З МО Я охх й их 5566 Я ; ння ВИ ХХ: ЗК СВ КОПИПИИ Кз (В КЗ ККУ ППП г са, ВЛИВ НИМИ ПОТ З ; НО ЗНА Ин МОНО: ИН Е ее: ВИНИ У КОСИ Ж Я книг ВКИИНВ МИ ЗВ Си МЕ З МК і ММ. п ОО Гоенв М Я ос КОХ вве Я зврівц: ях нако З ВВЕ пло ка неняХ и Х Мо Ка КЕНЕ МКК АК ЯТЯ ЗБВНУ ЕКО Я ВККВНВВЕ ЗЕ ; СОУ ЕХ Ї зак чере З де ВВЕ не евх ОЗ БЕРЕ : КЖКУ | дрож м чер ЗВ ЖНИВ Кік ЗКуМККНОВ ДК: дек ОБ ХЕ | Кс -- зай ЖК ППП КЕ: Х ох я кт оо ща ї ГО жере ПОВ в ПЕН я ЕМ КТя Ду: ВО: КЕ у З МИ КО: МК: Щі: СЕ МО Бон ВХ. ня ех ПИШИ 5 х ШУМ ЗО Я М: мс ППП х х МИШКИ ОХ: у: ще осо ЗЕ: фони о а. ос КОДИ ОО НК КО: Ес І о ОО В ПИШИ - з Жив ВИМ.

ОМЕ сс ЗНУ ШЕ: о у У х й ВОМ З ж и ОО НО Гржеив «Кут ЖЕ в

Ж ї ее КИ ЖК я у хх поч КК НЯ Сх ей БУНТ мовкквей к кокну мк аку САКЕ хм ї СК дО АК с і хо Ж - хе Х х 5 У ве 3. сн Ки яка хе «м пек І Б СВО 150 ЖАХ ЕІ Трзка часу іханавне слу влення ЗОВ) ех ріг, 0