UA120357C2 - Виділене біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язується з klb і fgfr1 та спосіб його застосування - Google Patents

Виділене біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язується з klb і fgfr1 та спосіб його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA120357C2
UA120357C2 UAA201607298A UAA201607298A UA120357C2 UA 120357 C2 UA120357 C2 UA 120357C2 UA A201607298 A UAA201607298 A UA A201607298A UA A201607298 A UAA201607298 A UA A201607298A UA 120357 C2 UA120357 C2 UA 120357C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
shi
amino acid
acid sequence
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201607298A
Other languages
English (en)
Inventor
Йонгмей ЧЕН
Йонгмэй Чэн
Джеймс Ернст
Джэймс Эрнст
Хок Сон Кім
Хок Сон Ким
Юнічіро Сонода
Юничиро Сонода
Крістоф Спісс
Кристоф СПИСС
Скотт Ставіцкі
Скотт Ставицки
Ян Ву
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52347471&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA120357(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дженентек, Інк., Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA120357C2 publication Critical patent/UA120357C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Винахід стосується виділеного біспецифічного антитіла, яке зв'язує KLB і FGFR1, способу одержання, його застосування, виділеної нуклеїнової кислоти, клітини-хазяїна та фармацевтичної лікарської форми.

Description

Винахід стосується виділеного біспецифічного антитіла, яке зв'язує КІВ і БСЕВІ1, способу одержання, його застосування, виділеної нуклеїнової кислоти, клітини-хазяїна та фармацевтичної лікарської форми.
Претензії на пріоритет
Ця заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої патентної заявки США номер 61/920,396, поданої 23 грудня 2013 р., і попередньої патентної заявки США номер 62/081,435, поданої 18 листопада 2014, які включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
Перелік послідовностей
Дана заявка містить перелік послідовностей, що був представлений в електронному вигляді у форматі АЗСІЇ ії включений у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
Зазначена копія АЗСІЇ, створена 22 грудня 2014 року, має назву 008206.0170 5І хі розмір 155,738 байт.
Область техніки
Даний винахід відноситься до антитіл, які зв'язуються з бета-Клото (КІВ), рецептором фактора росту фібробластів 1 (ЕСЕ) або з тим й іншим, і способів їх застосування.
Рівень техніки
Фактор росту фібробластів 21 (БОЕ21) і його найближчий гомолог ЕСЕ19 є членами надсімейства ЕСЕ. Для здійснення сигналінгу ЕСЕ21 необхідна присутність ізоформ ЕСБЕ- рецептора (ЕСЕРК) і мембранозв'язаного корецептора бета-Клото (КІ В) (Одама еї аї. Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА 104(18): 7432-37 (2007); О052010/0184665). Також показано, що ЕСЕ19 здійснює сигналінг через ізоформи ЕСЕК, які перебувають у комплексі з КІ В (У/и єї аї. 9. ВіоЇ. Спет. 282(40): 29069-29072 (2007)). З 7 основних ізоформ ЕОБЕЕК, присутніх у ссавців (16, 26, ЗБ, 1с, 2с,
Зс і 4), тільки три ізоформи - ЕСЕКІТс, 2с і Зс - здатні передавати сигнал і від ЕСЕ19, і від
ЕОЕ21 у випадку зв'язування з корецептором КІВ, що переважно експресується у печінці, жировій тканині та підшлунковій залозі (боєї7 апа Мопатітаді, Маїшге гемієму5. МоїІесшіаг Сеї!
Віоїоду 14, 166-180 (2013)). З цих рецепторів ЕСЕКТс, очевидно, відіграє провідну роль в опосередкуванні метаболічного ефекту ЕОЕ21. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь теорією, автори думають, що ЕОБЕ21 діє, викликаючи гомодимеризацію ізоформ ЕСЕК у присутності мембранозв'язаного корецептора КІ В. На відміну від інших ЕСЕ-лігандів, ЕСЕ21 демонструє дуже низьку спорідненість до будь-якого з БОБЕР. Проте, висока спорідненість зв'язування з КІ В через С-кінцеву область залучає ЕСЕ21 до комплексу ЕСЕР/КІ В, дозволяючи
Зо ЕСЕ21 взаємодіяти з рецептором ЕСЕК, незважаючи на низьку спорідненість тільки до ЕСЕК.
ЕСЕ21 був ідентифікований як сильнодіючий модифікуючий захворювання білковий агент, що дозволяє лікувати такі захворювання як ожиріння та діабет типу 2 у моделях захворювань на тваринах (КпагіопепКом еї аї. У. Сіїп. Іпмеб5і. 115(6): 1627-35 (2005)). Було показано, що рекомбінантний ЕСЕ21 призводив до зниження рівня ліпідів у печінці, підвищував чутливість до інсуліну та нормалізовував глікемічний контроль у мишей, дефіцитних за сигналінгом лептину (ор/ор або ар/аБ), або в мишей з дієтою з високим вмістом жирів (НЕО). Зниження рівня глюкози в крові та поліпшення у показниках різних факторів серцевосудинного ризику також спостерігалися в страждаючих ожирінням і діабетом макак-резусів, що одержували щодня рекомбінантний ЕСЕ21. Було показано, що БОЕ21 і РОЕ19 активують функцію термогеніну в жировій тканині, позитивній за роз'єднувальним білком 1 (ШСРІ) (коричневі та бежеві жирові тканини; ВАТ) у гризунів, що страждають ожирінням (Ри еї аї., Епдостіпоїоду 145, 2594-2603 (2004); Со5Кип єї а!., Епдостіпоіїоду 149, 6018-6027 (2008); Рівне" єї аі., Сепез 4 ОємеІортепі 26, 271-281 (2012)).
Хоча клінічне застосування рекомбінантних аналогів ЕСЕ21 або ЕСЕ19 у цей час перебуває в стадії випробувань для лікування метаболічних захворювань, їхня розробка для терапевтичного втручання виявилася складним завданням. Так, наприклад, для приматів, що не включають людину, час напіввиведення ЕРОБЕ21 у сироватці крові становить приблизно 2 години і є занадто коротким для практичного клінічного застосування, а білок, що залишився в кров'яному руслі, ЕОЕ21 може швидко інактивуватися шляхом протеолітичного розщеплення.
Були початі спроби поліпшити ці властивості за допомогою білкової інженерії, але такі зміни можуть підсилити імуногенність та інші побічні ефекти, характерні для модифікації. Іншою серйозною проблемою є можливе виникнення довгострокових побічних ефектів від хронічної терапії ЕСЕ21. Наприклад, повідомлялося, що ЕОЕ21 здатне індукувати резистентність печінки до гормону росту шляхом індукції ХОС 52, інгібітора сигналінгу рецептора гормону росту (Іпадакі еї а!., СеїЇ Меїар. 8: 77-83 (2008)). У людини резистентність до гормону росту або його недолік асоційовані з низькою кістковою масою в дітей і дорослих, а трансгенна надекспресія ЕСЕ21 або введення мишам протягом двох тижнів рекомбінантного ЕСЕ21 призводять до значної втрати мінеральної щільності кісткової тканини. Ще не було показано, що пов'язані з кістковою тканиною побічні ефекти ЕСЕ21 можуть бути відділені від його корисних метаболічних ефектів. бо Крім того, трансгенна надекспресія БОБ19 може призвести до гепатоцелюлярного канцерогенезу через активацію рецептора ЕСЕ (ЕСЕБК) 4 (Ри єї аї., Епдостіпоїоду 145, 2594-2603 (2004); Тотіїпзоп еї аї., Епдосгіпоїоду 143, 1741-1747 (2002); Егепсиі еї аї!., Ро Опе 7, е36713 (2012)).
Рекомбінантні моноклональні антитіла (АБ) можуть виступати в якості потужного терапевтичного засобу, тому що можуть забезпечити високу селективність до мішені, чудовий фармакокінетичний профіль та інші властивості, важливі для фармацевтичного агента (Спап апа Сапег, Маїште геміємв. Іттипоіоду 10, 301-316 (2010)). Наприклад, було показано, що антитіло-антагоніст, специфічне до ЕСЕКІс, здатне викликати втрату ваги в мишей і мавп (МИО2005/037235), а опосередкована антитілом-антагоністом селективна активація ЕСЕКІТс є достатньою для відновлення чутливості до інсуліну БОБ21 у мишей з діабетом (УМО2012/158704; МУ еї а). Зсіепсе Тгапвзіайопа! Мей. 3(113): 1-10 (2011)). Антитіла, які зв'язуються з комплексом КІ В/ЕСЕКІс, були запропоновані як активатори/терапевтичні агенти (005 7,537,903; МО2011/071783; ММО2012/158704). Іншими авторами були запропоновані два альтернативних підходи для виборчої активації комплексу ЕСЕКІ1сС/КІ В: з використанням анти-
КІ. В антитіла з високою афінністю птітАбБ1 (Бойл еї аїЇ. сі. Тгап5і. Мей. 4: 162га153 (2012)) і біспецифічного поліпептиду авімера С3201 проти ЕСЕКІ1/КІВ, пов'язаного з людським сироватковим альбуміном (НЗА) (05 8,372,952).
Оскільки ЕСОЕ19 і ЕСЕ21 мають значний вплив на метаболізм глюкози, то в даній області зберігається потреба в розробці терапевтичних молекул і способів модулювання опосередкованої ЕСЕ19 або ЕСГЕ21 активності.
Сутність винаходу
Даний винахід відноситься до антитіл, які зв'язуються з КІ В, антитіл, які зв'язуються з
ЕСЕНІ, і біспецифічних антитіл, які зв'язуються з КІВ і БОЕКІ, і способів їх застосування.
Даний винахід заснований, частково, на виявленні біспецифічних антитіл, які зв'язуються з КІ В і
ЕСЕКІ, вибірково активують рецепторний комплекс ЕСЕКІсС/КІВ й індукують корисні метаболічні зміни, очікувані при ЕСЕ21-подібній активності, у тому числі зниження ваги та поліпшення метаболізму глюкози і ліпідів без істотного впливу на печінку та без втрати кісткової маси.
У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло являє собою біспецифічне антитіло. Для
Зо прикладу, а не як обмеження, виділене антитіло за даним винаходом може зв'язуватися з бета-
Клото (КІ В) і рецептором фактора росту фібробластів 1 (ЕСЕМКТ), причому антитіло зв'язується із С-кінцневим доменом КІВ. Для прикладу, але не як обмеження, виділене антитіло за даним винаходом зв'язується з КІВ і ЕСЕКІс. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло зв'язується З фрагментом КІ В, що містить амінокислотну послідовність
ЗЗРІКГАМІРУМСМУККІ І КУМУУКАМУСОМОІМІТАБ (БО 10 МО: 142). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з епітопом усередині фрагмента ЕСЕК1, що включає амінокислотну послідовність КІГІНАМРААКТУКЕКСР (ЗЕО ІЮО МО: 143) або ЕКРОНКІССУКУВУ (ЗЕО ІО МО: 144).
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом активує комплекс КІГВ/ЕСЕК1с.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом знижує рівень глюкози в крові іп мімо. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло не робить істотного впливу на щільність кісткової тканини. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не робить істотного впливу на печінку. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло індукує значно більш низькі рівні фосфорилювання ЕКК і МЕК у печінці у порівнянні з ЕОЕ21. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з КІ В з Ка від 108 М до 10-3 М. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може зв'язуватися з білюом ЕОЕКІ1 з Ка від 108 М до 1073 М. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може зв'язуватися з ЕСЕКІТс з Ка від 108 М до 1073 М. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з КІВ з Ка « 10 нМ ії з ЕСЕКІс з Ка » 300 нМ. У деяких варіантах здійснення винаходу біспецифічне антитіло анти-КІ В/ланти-ЕОЕКІ може включати плече анти-
ЕСЕНІ, що має Ка приблизно від 10 нМ до 10 мкМ.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом зв'язується з епітопом, присутнім в КІВ. Для прикладу, а не як обмеження, даний винахід передбачає анти-КІ В антитіло, яке зв'язує той самий епітоп, що й антитіло, показане на Фігурах ЗА і В. У деяких варіантах здійснення анти-КІ В антитіло за даним винаходом зв'язує той самий епітоп, що й антитіла 12А11 або 805. У деяких варіантах здійснення анти-КЇВ антитіло зв'язується з епітопом у межах С-кінцевого домена КІВ. У деяких варіантах здійснення анти-КІ В антитіло зв'язується З фрагментом КІ В З амінокислотною послідовністю
ЗЗРІВІ АМІРУУСУВКІ І АУМУУВАММСОМОІМІТАБ (ЗЕО ІО МО: 142). 60 У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КіІ В/анти-ЕОЕКІ! за даним винаходом включає перше антитіло або його антигенсполучну частину, що включає варіабельну область важкого ланцюга та варіабельну область легкого ланцюга, де варіабельна область важкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 128, і варіабельна область легкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в
ЗЕБЕО ІО МО: 130. У деяких варіантах здійснення друге антитіло або його антигенсполучна частина включає варіабельну область важкого ланцюга та варіабельну область легкого ланцюга, де варіабельна область важкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 132, і варіабельна область легкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 9595 ідентична послідовності, представленої в ЗХЕО ІЮ МО: 134.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КіІ В/анти-ЕОЕКІ! за даним винаходом включає перше антитіло або його антигенсполучну частину, що включає область важкого ланцюга й область легкого ланцюга, де область важкого ланцюга містить послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в зЕО ІЮ МО: 129, і область легкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 131. У деяких варіантах здійснення друге антитіло або його антигенсполучна частина включає область важкого ланцюга й область легкого ланцюга, де область важкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 133, і область легкого ланцюга включає послідовність амінокислот, яка, щонайменше, на 95 95 ідентична послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 135.
Даний винахід також відноситься до анти-КІ В антитіла, яке включає: (а) НМАК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮ МО: 1-15, (5) НУВ-І3, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮ МО: 79-93, і (с) НМЕ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи 5ЕО ІЮ МО: 16-31.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-КІ В антитіло включає (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮ МО: 1-15, (р) НУВ-НаІ, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮ МО: 16-31, ї (с) НМЕ-НЗ, яка містить
Зо амінокислотну послідовність, вибрану з групи 5ЕО ІЮ МО: 32-47.
У деяких варіантах здійснення анти-КІ В антитіло додатково містить (а) НМАК-11, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи 5ЕО 0 МО: 48-62, (р) НУВ-І12, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮ МО: 63-78, і (с) НМЕ-І3, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи 5ЕО ІЮ МО: 79-93.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-КІ В антитіло включає (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12, (Б) НМК-На2г, яка містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 28, (с) НМЕА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 44, (а) НМВ-11, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 59, (є) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 75, і () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 90.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-КІ В антитіло включає (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15, (Б) НМК-На2, яка містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 31, (с) НМЕА-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 47, (а) НМВ-11, яка містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО: 62, (е) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 78, і () НМК-ІЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 93.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-КІ В антитіло включає (а) варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 128, і (Б) варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 130.
У деяких варіантах здійснення антитіло містить (а) важкий ланцюг, який включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 129, і (Б) легкий ланцюг, який включає амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО: 131.
В іншому аспекті даний винахід передбачає анти-КІ В антитіло, яке включає (а) варіабельну область важкого ланцюга, що має, щонайменше, 09595 ідентичність амінокислотної послідовності з 5ЕО 10 МО: 128; (Б) варіабельну область легкого ланцюга, що має, щонайменше, 9595 ідентичність амінокислотної послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 130; ії (с) варіабельну область важкого ланцюга, як описано в (а), і варіабельну область легкого ланцюга, як описано в (Б).
Даний винахід також відноситься до антитіл, які зв'язуються з ЕСЕКІ1, наприклад, ЕСЕК16с. 60 Для прикладу, а не як обмеження, антитіло за даним винаходом містить варіабельний домен,
що зв'язується з ЕОЕКІ. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з фрагментом ЕОЕК'І, що має амінокислотну послідовність КІ НАМРААКТУКЕКСР (5ЕО ІЮ МО: 143) або ЕКРОНКІСОСУКМРКУ (5ЕО ІО МО: 144). У деяких варіантах здійснення антитіло містить (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО: 136, (р) НМВ-Н2, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 137, (с) НМК-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 138, (4) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 139, (ев) НМВ-І2, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 140, і () НМНА-1І3, яка містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 141. У деяких варіантах здійснення антитіло містить (а) варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО
ІО МО: 132, ії (Б) варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮО МО: 134. У деяких варіантах здійснення антитіло включає (а) важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 133, і (Б) легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 135. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом зв'язується з фрагментом ЕСЕКІс, що має амінокислотну послідовність
КІНАМРААКТУКЕКСР (ЗЕО ІЮ МО: 143) або ЕКРОНКІССУКМЕМУ (ЗЕО ІЮ МО: 144).
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє собою моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло являє собою людське, гуманізоване або химерне антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має знижену ефекторну функцію.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення даний винахід відноситься до клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує спосіб одержання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за даним винаходом, у результаті чого утворюється антитіло. У деяких варіантах здійснення цей спосіб додатково включає виділення антитіла з клітини-хазяїна.
Даний винахід також відноситься до фармацевтичної лікарської форми, що включає одне або декілька антитіл за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах здійснення даного винаходу фармацевтична лікарська форма містить додатковий терапевтичний агент.
В іншому аспекті даний винахід передбачає антитіло за винаходом для застосування як лікарський засіб. У деяких варіантах здійснення антитіло призначається для застосування в лікуванні метаболічних порушень, наприклад, синдрому полікістозних яєчників (РСОБ), метаболічного синдрому (МЕТ), ожиріння, неалкогольного стеатогепатиту (МАБН), неалкогольної жирової хвороби печінки (МАРІО), гіперліпідемії, артеріальної гіпертензії, діабету 2 типу, діабету не 2 типу, діабету 1 типу, латентного аутоїмунного діабету (ГАБ) і діабету дорослого типу в молодих (МОЮ). У деяких варіантах здійснення антитіло призначається для застосування в лікуванні діабету 2 типу. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло призначається для застосування в лікуванні ожиріння. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує антитіло для застосування в лікуванні синдрому Барде-Бідля, синдрому
Прадера-Віллі, синдрому Альстрема, синдрому Коена, спадкоємної остеодистрофії Олбрайта (псевдогіпопаратиреоїдизму), синдрому Карпентера, синдрому МОМО, синдрому Рубінштейна-
Тейбі, синдрому ламкої Х-хромосоми і синдрому Бьорьєсона-Форсмана-Лемана. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує антитіло для використання в активації рецепторного комплексу КІ В/ЕСЕКІ1, наприклад, рецепторного комплексу КІ. В/ЕСЕКІ16.
В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до застосування антитіла, розкритого в даному описі, для одержання лікарського засобу для лікування порушень обміну речовин, наприклад, синдрому полікістозних яєчників (РСО5), метаболічного синдрому (МЕТ), ожиріння, неалкогольного стеатогепатиту (МА5Н), неалкогольної жирової хвороби печінки (МАРІб), гіперліпідемії, артеріальної гіпертензії, діабету 2 типу, діабету не 2 типу, діабету 1 типу, латентного аутоїмунного діабету (ГА) і діабету дорослого типу в молодих (МОБУ), а також старіння та пов'язаних з ним захворювань, таких як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона й А 5. У деяких варіантах здійснення даного винаходу метаболічне порушення є діабетом 2 типу. У деяких варіантах здійснення даного винаходу метаболічне порушення є ожирінням. У деяких варіантах здійснення даного винаходу одержання лікарського засобу являє собою одержання лікарського засобу для активації рецепторного комплексу КІ В/ЕСЕК1с.
В іншому своєму аспекті даний винахід передбачає спосіб лікування індивідуума, що має захворювання, вибране з групи, що складається з синдрому полікістозних яєчників (РСО5), метаболічного синдрому (МЕТ), ожиріння, неалкогольного стеатогепатиту (МАБН), неалкогольної жирової хвороби печінки (МАРІ 0), гіперліпідемії, артеріальної гіпертензії, діабету 60 2 типу, діабету не 2 типу, діабету 1 типу, латентного аутоїмунного діабету (ГАБ) і діабету дорослого типу в молодих (МОБУ), а також старіння та пов'язаних з ним захворювань, таких як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона й А! 5, де зазначений спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості одного або більше антитіл згідно з даним винаходом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу захворювання є діабетом, наприклад, діабетом 2 типу. У деяких варіантах здійснення даного винаходу захворювання є ожирінням. У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає спосіб лікування індивідуума, що має захворювання та/або розлад, вибраний з групи, що складається з синдрому Барде-Бідля, синдрому Прадера-
Віллі, синдрому Альстрема, синдрому Коена, спадкоємної остеодистрофії Олбрайта (псевдогіпопаратиреоїдизму), синдрому Карпентера, синдрому МОМО, синдрому Рубінштейна-
Тейбі, синдрому ламкої Х-хромосоми і синдрому Бьорьєсона-Форсмана-Лемана. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму додаткового терапевтичного засобу. У деяких варіантах здійснення спосіб з використанням одного або декількох антитіл за даним винаходом не впливає на функцію печінки в індивідуума. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує спосіб індукування втрати ваги, який включає введення індивідууму ефективної кількості одного або більше антитіл за даним винаходом.
В іншому аспекті даний винахід передбачає спосіб активації рецепторного комплексу КІ В-
ЕСЕКІтс в індивідуума, який включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла за даним винаходом.
Короткий опис креслень
На Фігурі 1А представлена агоністична активність анти-РОЕКІ1 антитіл і фрагментів таких антитіл.
На Фігурі 18 представлені результати експериментів за конкурентним зв'язуванням з використанням анти-ЕСЕКІ антитіл.
На Фігурі 1С представлені амінокислотні залишки ЕСЕК1, важливі для зв'язування анти-
ЕСЕКІ антитіл, представлених у даному описі. На Фігурі 1С наведені БЕО ІО МО: 159, 159, 143 і 144, відповідно, у порядку перерахування.
На Фігурі 10 представлені результати сайт-специфічного мутагенезу для визначення амінокислотних залишків, важливих для зв'язування анти-РЗЕКІ1 антитіл, представлених у даному описі.
Зо На Фігурі 1ЕЄ представлені результати сайт-специфічного мутагенезу для визначення амінокислотних залишків, важливих для зв'язування анти-РЗЕКІ1 антитіл, представлених у даному описі.
На Фігурі 1Е представлені важливі для зв'язування залишки на просторовій моделі ЕСЕКІ1.
На Фігурі 2А представлені значення афінності двох анти-ЕОЕКІ антитіл до ЕОСЕКІБ і
ЕСЕВТс.
На Фігурі 28 представлене зв'язування анти-ОЕКІ1 антитіла з різними ЕСЕК.
На Фігурі 2С представлене анти-ЕЗЕКІ! антитіло, що виступає в якості специфічного агоніста для ЕСЕКІ у люциферазному аналізі САЇ -ЕЇ КТ (ЕТ5-подібний фактор транскрипції 1) в клітинах І 6.
На Фігурі 20 представлене анти-ОЕКІ антитіло, що виступає в якості специфічного агоніста для ЕСЕК1 у люциферазному аналізі САЇ -ЕЇ КІ в клітинах НЕК293.
На Фігурі 2Е показано, що анти-ЕОЕКІ1 антитіло призводить до нормалізації рівнів глюкози в крові при його введенні мишам з діабетом ор/об.
На Фігурі ЗА представлені послідовності варіабельної області легкого ланцюга для 17 анти-
КІ. В антитіл. Послідовності СОК-Ї1 включають по порядку ЗЕО ІЮ МО: 48-62; послідовності
СОК 12 включають по порядку 5ЕО ІЮ МО: 63-78; і послідовності СОН ІЗ включають по порядку
ЗЕО І МО: 79-93. Послідовності варіабельної області легкого ланцюга включають по порядку
ЗЕО ІО МО: 111-127.
На Фігурі ЗВ представлені послідовності варіабельної області важкого ланцюга для 17 анти-
БО КІ. В антитіл. Послідовності СОБ-НІ1 для антитіл включають по порядку (111-805) 5ЕО І МО: 1-15; послідовності СОК Н2 включають по порядку ЗЕО ІО МО: 16-31; послідовності СОК НЗ включають по порядку 5ЕО ІЮ МО: 32-47. Послідовності варіабельної області важкого ланцюга для антитіл включають по порядку 5ЕО ІЮ МО: 94-110.
На Фігурі 4 представлена медіана зрушення, що спостерігається на діаграмі ЕАС5 при вимірюванні ступеня зв'язування 0,8 мкг/мл різних анти-КІВ антитіл з клітинами 293, які експресують ПК В.
На Фігурі 5 представлене відносне зв'язування різних анти-КІ В антитіл з білком ЯКІ В-ЕСО-
НІ5.
На Фігурі бА представлена схема, що зображує антитіла, представлені в даному описі, і бо модель утворення комплексу біспецифічного антитіла з КІ В/ЕСЕМК с для активації сигналу.
На Фігурі 6В представлена модель утворення комплексу ЕСЕКТс-КІ В-ЕСЕ21, що активує сигналінг.
На Фігурі 6С представлені результати люциферазного аналізу СА -ЕЇ КІ для ЕОБ21 і біспецифічного антитіла (В5АБ) 17 з використанням дефіцитних за ЕСЕКІ1 клітин НЕДО293.
Клітини трансфікували для експресії зазначених рецепторів.
На Фігурі 60 представлений вестерн-блот аналіз первинних людських адипоцитів, оброблених зазначеним білком (ЕСЕ21 (100 нМ) або да (33 нМ)) протягом 1 год. Зразки були продубльовані для кожної обробки.
На Фігурі 7А представлені результати індукції різними біспецифічними антитілами з плечима анти-ЕСЕКІ1 й анти-КІ В в люциферазному аналізі СА -ЕЇ К1. Слід зазначити, що біспецифічні антитіла з плечем КІМАБІ виявили значну КІ В-незалежну активність приблизно через агоністичну активність КІМАБІ ар. Подібної активності не було виявлено у випадку біспецифічних антитіл з плечима КІМАБ2 або К1МАБЗ.
На Фігурі 7В показано, що індукція сигналінгу за допомогою різних біспецифічних антитіл з плечима анти-ЕСЕКІ1 й анти-КІ В залежить від ЕСЕКІс і КІ В.
На Фігурі 7С представлене біспецифічне антитіло з плечима анти-ОЕКІ1 й анти-КІ В, що індукує активність люциферази залежно від дози в клітинах, які експресують рекомбінантний
ПЕСЕмс і КІ В, але не в клітинах без експресії КІ В.
Фігура 8А являє собою схематичне зображення трьох варіантів біспецифічних анти-
КІ В/анти-ЕОЕК1с антитіл. Синій - людська послідовність, червоний - мишача послідовність.
Приблизне положення олігосахаридного ланцюга при М297 в (1) позначено як 7. Варіанти, що не є ефекторами ((2) і (3)), не мають олігосахаридних ланцюгів через мутацію М2970. Зірочками в (2) зазначене приблизне положення мутації 0265А. Орієнтація "виступ-в-западину" також показана на Фігурі. (1) являє собою В5АбБІ0; (2) являє собою В5зАбБ20; і (3) являє собою В5АБІ17.
На Фігурі 88 представлені результати аналізу М5О рЕКК у первинних людських адипоцитах, оброблених В5АБТО і його похідними, контрольним Ідсї або ЕСЕ21 протягом 10 хв. Дані являють собою середні значення х 5ЕМ (М-3). БЕКВІ1 (1) являє собою В5АБІ10; БЕКВІ (2) являє собою
В5АБ20О; і ВЕКВІ (3) являє собою В5АБ17.
На Фігурі 9А представлений люциферазний аналіз СА! -ЕЇКІ у міобластах пацюка 16.
Зо Клітини котрансфікували експресійним вектором для зазначених рецепторів. Трансфіковані клітини інкубували з різними концентраціями В5АБІ10 або позитивним контролем, ЕСЕ21, ЕСЕ19 або КІМАБІ протягом 6 год. перед люциферазним аналізом.
На Фігурі 9В представлені результати люциферазних аналізів СА -ЕЇ К!І, аналогічних представленому на Фігурі 9А. Трансфіковані клітини 6 обробляли комбінаціями ЕСЕ21 і
В5ЗАБІ1І7, як зазначено на Фігурі. М-4.
На Фігурі 9С представлені результати люциферазних аналізів САЇ-ЕЇ КТ, аналогічних представленим на фігурі 9А. Трансфіковані клітини І Є обробляли комбінаціями ЕСЕ21 і В5АБІ17, як зазначено на Фігурі. М-4.
На Фігурі 90 представлене зв'язування анти-РОЕКІ антитіла та біспецифічних анти-
КІ. В/анти-ЕОЕКІ антитіл, В5АВО і В5АБІ10 з клітинами, які експресують КІВ, ЕОЕМК1с або обидва білка.
На Фігурі 10А представлене зв'язування біспецифічного антитіла з плечима анти-РОЕК1 й анти-КІ-В й анти-РОЕКІ антитіла з клітинами, які експресують ЕСЕКІс, КІ В або обидва білка.
На Фігурі 108 представлені Ка зв'язування В5АБІ10 з клітинами НЕК293, які експресують різні комбінації людського та мишачого КІ В/ЕСЕКІ1.
На Фігурі 11 представлений аналіз зв'язування В5АБ1ІО0 або попередньо сформованих комплексів ВБАБТО/КІ В у концентрації 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ, 6,25 нМ зі злитим білююм ЕСЕК1-ЕСО-Бс, що був іммобілізованим на чипі Для створення попередньо сформованих комплексів В5АБІТО/КІВ білок В5АБІО і рекомбінантний білок КІ В-ЕСО попередньо інкубували при співвідношенні 1:11. Слід зазначити, що швидкість дисоціації для комплексу В5АБТО/КІ В була нижче у порівнянні зі швидкістю дисоціації тільки для В5АБІ0, але тільки у тому випадку, коли на чипі був зв'язаний ЕСЕКТс, а не ЕСЕКІТЮ, що вказувало на утворення потрійного комплексу.
На Фігурі 12А представлена схема експерименту ТКЕ-ЕВЕТ.
На Фігурі 128 представлена інтенсивність ТК-РЕКЕТ клітин СО57, які експресують ЗМАР- мічений белкок ЕСЕКТс разом з неміченим КІ В або без нього, через 15 хвилин після додавання зазначених лігандів. ВБАВБ17, ЕОЕ21, ЕСЕ1 і ЕСЕ2 використовувалися в концентрації 67 нМ, 50
НМ, 62,5 нМ, 12 нМ, відповідно. Дані представлені як відношення інтенсивності сигналу ЕКЕТ при 665 нм до інтенсивності випромінювання донора при 620 нм (відношення ЕКЕТ), і наведені бо середні значення ж 5ЕМ трьох незалежних експериментів (М-3). р «0,05 (У, «0,01 (73, «0,0001
(7) у порівнянні з контролем РВ5.
На Фігурі 13А наведені результати експериментів з визначення того, яка частина КІ В має важливе значення для зв'язування двох анти-КІ В антитіл. Схема структури білка КІ В показана у верхній частині. Кожний зі стовпців представляє людський КІ В, людський КІ А, кролячий КІ В, щурячий КІ В, мишачий КІ В або химерні конструкції, що позначено кольором. У правій частині показане зв'язування на основі даних ЕАС5 КІ ВтптАбБІ і контрольного КІ ВітАбБ2 з клітинами
НЕДО293, які тимчасово експресують кожну з конструкцій. Слід зазначити, що КІ ВтАбр1 не зв'язується з кролячим КІ В, але заміна фрагмента з 34 амінокислот (амінокислоти 805-838) на відповідну людську послідовність робить зв'язування можливим.
На Фігурі 138 представлена амінокислотна послідовність сегмента людського білка КІ В з сигнальною послідовністю, що відповідає положенням 857-890 (що відповідає положенням 805- 838 амінокислотної послідовності білка КІВ, який не включає сигнальну послідовність) і відповідні послідовності в різних зазначених видів. На Фігурі 138 представлені ЗЕО ІЮ МО: 160- 164, відповідно, у порядку перерахування.
На Фігурі 14А представлене зв'язування БОБ21 і БОЕ19 з комплексом В5ЗАБІТО/КІВ за даними 5РК. В5АбБІ0 був пов'язаний з чипом, а білок КІ В-ЕСО і білок ЕСЕ (0,2, 0,8 або 2 мкм) вводили послідовно.
На Фігурі 148 представлені результати люциферазного аналізу САЇ-ЕЇ КІ у міобластах пацюка 16. Клітини були котрансфіковані експресійними векторами, що містять ЕСЕКА і КІ В.
Трансфіковані клітки інкубували з різними концентраціями зазначених білків протягом б год. перед початком люциферазного аналізу.
На Фігурі 14С представлений вестерн-блот, що був проведений для оцінки фосфорилювання ЕКК в клітинах гепатоми Н4АПЕ. Слід зазначити, що В5АБбБ17 не блокував здатність ЕСЕ19 активувати комплекс ЕСЕКА/КІ В (Фіг. 148) або індукувати фосфорилювання
ЕКК в клітинах гепатоми НАПЕ (Фіг. 14С).
На Фігурі 15А представлені значення рівнів глюкози в крові (день 7), 95 зміни маси тіла (день 7) і щоденного споживання їжі (дні 0-3) у мишей С57ВІ/6 на дієті з низьким рівнем жиру та мишей ар/ар (п-7) після однократної внутрішньочеревинної ін'єкції ВБАВ17 або контрольного
Ідс у дозі З мг/кг (миші на дієті з низьким рівнем жиру) або 5 мг/кг (миші аБ/абр).
Зо На Фігурі 158 представлені рівні маси тіла та глюкози в крові мишей з індукованим дієтою ожирінням (ІС), яким вводили внутрішньочеревинні ін'єкції зазначеного Ід (В5АБ20) у дозі З мг/кг у дні 0 і 6 (стрілки). М-9.
На Фігурі 15С представлені результати тесту на толерантність до глюкози з тими ж мишами й антитілами, дані за якими зазначені на Фігурі 158, на 14-й день.
На Фігурі 150 представлений рівень печінкових тригліцеридів, а також маркери в сироватці тварин, дані за якими зазначені на Фігурах 158-С, на 17-й день.
На Фігурі 15Е представлене споживання глюкози всім організмом, вимірюване під час гіперінсулінемічних-еуглікемічних фіксацій для мишей ОІО через 5 днів після однієї внутрішньочеревинної ін'єкції зазначеного ідс (В5АБ17) у кількості 10 мг/кг (М-12).
Горизонтальна вісь відображає рівень інсуліну в сироватці крові. Стрілки вказують напрямок змін від базального рівня до рівня після стимуляції інсуліном. р «0,05 (3, «0,005 (73, «0,0001 (7) у порівнянні з контролем.
На Фігурі 15Е представлене ендогенне вироблення глюкози, вимірюване під час гіперінсулінемічних-еуглікемічних фіксацій у мишей 0ІО через 5 днів після однієї внутрішньочеревинної ін'єкції зазначеного ідс (В5АБ17) у кількості 10 мг/кг (М-12).
Горизонтальна вісь відображає рівень інсуліну в сироватці крові. Стрілки вказують напрямок змін від базального рівня до рівня після стимуляції інсуліном. р «0,05 (3, «0,005 (73, «0,0001 (7) у порівнянні з контролем.
На Фігурі 1555 представлене поглинання глюкози в тканинах після стимуляції інсуліном, вимірюване під час гіперінсулінемічних-еуглікемічних фіксацій у мишей 0ІО через 5 днів після однієї внутрішньочеревинної ін'єкції зазначеного дае (В5АБІ17) у кількості 10 мг/кг (М-12). р «0,05 (3, «0,005 (7, «0,0001 (7 у порівнянні з контролем.
Фігура 16А представляє М-кінцеву амінокислотну послідовність мишачого КІВ (ЗЕО ІЮ МО: 165), а також відповідну амінокислотну послідовність, кодовану алелем КІб у мишей КО (ЗЕО ІЮ
МО: 166). Місенс-мутація в гені КІБ призводить до зрушення рамки зчитування після другого амінокислотного залишку в алелі КО, що показано червоним шрифтом.
На Фігурі 168 представлена експресія білка КІВ в епідидимальній білій жировій тканині мишей дикого типу (--/) і нокаутних за КІВ мишей (-/-).
Фігура 16С ілюструє важливу роль КІВ для впливу В5АБ20 на метаболізм глюкози. Тест на бо толерантність до глюкози (ТТ) у мишей БІО, які одержали чотири щотижневі ін'єкції ВЗАр20 або контрольного ІдС:ї у дозі З мг/кг. ЗТ був проведений на 23-й день, через три дні після останньої ін'єкції. Миші перебували в умовах НЕО протягом 20 тижнів до СТТ. "р «0,05.
На Фігурі 160 представлені параметри сироватки мишей ОІО на 7-й день після внутрішньочеревинної ін'єкції біспецифічних анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіл або КІМАБІ у дозі 50 мг/кг, або носія. М-6.
На Фігурі 17 представлена кількість ЕСЕ23 і неорганічного фосфору в сироватці мишей СІЮ на 7-й день після внутрішньочеревинної ін'єкції ВБАБ17 у дозі 50 мг/кг. М-6. Р «0,0005.
На Фігурі 18А представлена кількість відхилень рівня глюкози в артеріальній крові у процесі експерименту з фіксації. Миші СІО одержали В5АБІ17 або контроль Ідс у дозі 10 мг/кг за 5 днів до проведення експерименту з фіксації.
На Фігурі 188 представлена вага тіла в день проведення експерименту з фіксації.
На Фігурі 18С представлена швидкість інфузії глюкози під час експерименту з фіксації. р -0,05 (3, «0,001 (У у порівнянні з контролем.
На Фігурі 19А представлене споживання енергії (ЕЕ) (зверху) і дихальний коефіцієнт (КО) (знизу) у мишей БІО, що одержали одну внутрішньочеревинну ін'єкцію 10 мг/кг Їдс у зазначений час при 21-22 76. М-7.
На Фігурі 198 представлені ЕЕ (вгорі) і КО (внизу) у мишей на дієті з низьким рівнем жиру, що одержали одну внутрішньочеревинну ін'єкцію 10 мг/кг Їдах у зазначений час. Мишей тримали при 21-22 "С, після чого температура в клітинах була змінена до термонейтральної (29-30 "С) на 6 день після ін'єкції ІЧ. М-6 - 7.
На Фігурі 19С представлене поглинання тканинами фтордезоксиглюкози (ЕС) у мишей БІО через 40 год. після однократної внутрішньочеревинної ін'єкції зазначеного Ідсі у дозі 10 мг/кг.
М-8. Миші голодували протягом ночі перед вимірюванням поглинання ЕОО.
На Фігурі 190 представлений вестерн-блот аналіз іпдУмМАТ, зібраних на 7-й день після однієї внутрішньочеревинної ін'єкції (В5АБ17 або контрольного ДС: при дозі 10 мг/кг) і хірургічної імплантації осмотичного насоса (СІ 316,243 (0,75 нмоль/год.) або носій).
На Фігурі 19Е представлена експресія мРНК ОСРІ у первинних підшкірних адипоцитах людини, оброблених зазначеним білком у концентрації 30 нМ протягом 48 годин. М-3.
На Фігурі 19Е представлена температура тіла мишей 0ІО, що одержували 10 мг/кг ВБАБ17
Зо або контрольного да. М-7 - 8.
На Фігурі 1905 представлений профіль експресії генів в ІВАТ у мишей 0ІО, що одержали однократно 10 мг/кг ЇдС Її ЕОЕ21 два рази на день в дозі 2 мг/кг/добу або контрольний РВ5 протягом 5 днів. Представлені всі гени, експресія яких значно відрізнялися в зразках після обробки В5АбБІ17 і контролем або ЕСБЕ21 і контролем.
На Фігурі 19Н представлені ЕЕ (ліворуч) і КО (праворуч) у мишей на дієті з низьким рівнем жиру, які одержали однократну внутрішньочеревинну ін'єкцію біспецифічних анти-КіІ В/анти-
ЕСЕК' антитіл або контрольного да у дозі 10 мг/кг й яким хірургічно імплантували осмотичний насос (СІ -316,243 у кількості 0,5 нмоль/год. або носій) у день 0. Показані середні значення протягом зазначених 24 год.
На Фігурі 20А представлені значення УО2 (вгорі), МСО2 (посередині) і загальна активність мишей БІО, описаних на Фігурі 19А. Значення МО2 і МСО2 нормовані на значення ваги тіла, вимірювані в моменти часу, зазначені як Ж. Мишам 0ІО вводили 10 мг/кг В5АбБ17 або контрольного да.
На Фігурі 208 представлені значення МО2 (вгорі), МСО2 (посередині) і загальна активність мишей БІО, описаних на Фігурі 198. Значення МО2 і МСО2 нормовані на значення ваги тіла, вимірювані в моменти часу, зазначені як й. Мишам 0ІО вводили 10 мг/кг В5АБ17 або контрольного да.
На Фігурі 21А представлене середнє значення ЕЕ за даними непрямої калориметрії.
Величина середнього збільшення зазначена під графіками. БІО 21 "С: Середнє значення ЕЕ протягом 03-06 після ін'єкції Їх в експерименті, представленому на Фіг. 19А. Миші на дієті з низьким рівнем жиру 21 "С: середнє значення ЕЕ протягом 03-06 після ін'єкції Ідс в експерименті, показаному на Фіг. 198. Миші на дієті з низьким рівнем жиру після підвищення температури до 30 "С: середні значення ЕЕ протягом 06-09 після ін'єкції Іс (тобто З дні після зміни температури) в експерименті, показаному на Фіг. 198. БІО 30 "С: середнє значення ЕЕ протягом Ю3-06 після ін'єкції Ід у мишей ІС, акліматизованих до термонейтральних умов.
На Фігурі 218 представлені зміни ЕЕ у мишей БІО в термонейтральних умовах. Мишей БІО акліматизували до термонейтральних умов протягом 2-х тижнів перед однократною внутрішньочеревинною ін'єкцією (показано стрілююю) В5АБ17 або контрольного Ідсї у дозі 10 мг/кг. М-З -- 4. 60 На Фігурі 21С представлені середні значення ЕЕ і КО у мишей БІО при нормальній температурі лабораторії (21 "С) протягом 03-5 після хірургічної імплантації осмотичного насоса та ін'єкції препарату. В 00 миші одержали внутрішньочеревинну ін'єкцію В5АБб17 або контрольного Ідсї у дозі 10 мг/кг. Група ЕСЕ21 також одержала болюс 2 мг/кг ЕСЕ21 шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції в БО. Кожній миші також підшкірно імплантували осмотичний насос в БО для інфузії ЕСЕ21 при дозі 60 мкг/добу або контрольного РВ5. М-8 - 9." Р «0,005.
На Фігурі 22 представлені дані, показані на Фіг. 19Е, і представлені в іншому масштабі, щоб показати відповідну різницю в центральній температурі тіла протягом дослідження в мишей рІО, що одержували 10 мг/кг В5АБ17, і мишей БІО, що одержували 10 мг/кг контрольного Іда.
Чорна лінія являє собою розрахункову різницю і сині лінії є 95 У5-ими точковими довірчими інтервалами для різниці. Їд(х вводили на 13-й день (стрілка). М-7 -- 8.
На Фігурі 23 показано, що ЕСБ21 і В5АБбБ20 індукують приблизно однаковий рівень фосфорилювання ЕКК і МЕК в епідидимальній жировій тканині, паховій жировій тканині (іп9УМАТ), міжлопатковій бурій жировій тканині (ІВАТ) та тканині підшлункової залози. Тканини одержували через 1 год. (печінка, підшлункова залоза й епідидимальна біла жирова тканина (еуМАТ)) або через 2 год. (ІВАТ або іпдУМАТ) після внутрішньочеревинної ін'єкції мишам С57ВІ /6 на дієті з низьким рівнем жиру в кількості 10 мг/кг (ВБАБ20) або 1 мг/кг (ЕСЕ21). Тотальні ЕКК і
МЕК служать як контроль кількості нанесеного зразка.
На Фігурі 24А представлені зміни ваги тіла та рівні високомолекулярного адипонектину в сироватці крові мишей ІО (М-6), які одержали однократну внутрішньочеревинну ін'єкцію
В5ЗАБІ7 у зазначеній дозі (мг/кг).
На Фігурі 248 показані зміни ваги тіла та рівні високомолекулярного адипонектину в сироватці крові макак (М-3), які одержали однократну внутрішньочеревинну ін'єкцію В5АБ17 у зазначеній дозі (мг/кг).
На Фігурі 24С представлений ЕЕ мишей БІО (ліворуч: дикий тип, праворуч: адірод КО), які одержали однократну внутрішньочеревинну ін'єкцію зазначеного Ідсї (В5АБІ17) у дозі 10 мг/кг (стрілка). М-5 - 6.
На Фігурі 240 представлені різні метаболічні параметри мишей дикого типу (/к) і адірод ДО (7-3 БІО, які одержали однократну внутрішньочеревинну ін'єкцію зазначеного Ідеї (В5АБ17) у дозі 10 мг/кг. М-6. АОС: площа під кривою в СТ або ІТТ (ТТ -0 -2 год.) р «0,1 (Ж), «0,05 (У,
Зо «0,005 (7 у порівнянні з контролем.
На Фігурі 25 представлена тотальна РНК, яку одержали від мишей, описаних на Фіг. 1965, за допомогою ЯФРСК.
На Фігурі 26 представлений рівень фосфорилювання ЕКК під дією В5АБ17 у мишачих тканинах. Тканини одержували через 1 год. після внутрішньочеревинної ін'єкції мишам С57ВІ /6 на дієті з низьким рівнем жиру В5АБІ17 або контрольного Ідсї у кількості 10 мг/кг й обробляли імуногістохімічно з використанням антитіл, специфічних до фосфорилованого ЕКК.
Репрезентативні зображення, отримані від 2-х тварин, показані для кожної групи. (1)
Підшлункова залоза, (2) корональна ділянка мозку, що містить супрахіазматичні ядра (стрілка), (3) корональна ділянка мозку, що містить агеа розігета (трикутні скупчення пофарбованих клітин) і центральний канал (стрілка) і (4) корональна ділянка мозку, що містить серединне піднесення (стрілка). Слід зазначити, що індукований В5АБб17 сигнал був очікувано в ацинарних клітинах підшлункової залози, але не в кожній з ділянок головного мозку.
На Фігурі 27 представлена нормалізація НЕО-індукованої проліферації гепатоцитів під дією
В5АБ20. Поглинання Вга печінкою в мишей СІО, що одержували В5АБ2оО (1 або З мг/кг/гиждень) або контрольний Іда (3 мг/кг/ тиждень) протягом 8 тижнів або в контрольних мишей С57ВІ /6 на дієті з низьким рівнем жиру. " р «0,05 у порівнянні з мишами БІО, що одержували да (М-5 - 8).
На Фігурі 28А представлена схема експерименту, результати якого показані на Фігурі 288.
Миші БІО одержували В5АБ2О (1 або З мг/кг/ тиждень) або контрольний Ідсї (1 мг/кг/тиждень) протягом 6 тижнів, як зазначено на Фігурі. Контрольні миші С57ВІ/6 на дієті з низьким рівнем жиру залишалися без обробки.
На Фігурі 288 представлений кістковий фенотип після обробки В5АбБ20. Стегно та гомілка препарували та піддавали аналізу НСТ. (М-7 -- 8). Слід зазначити, що не спостерігалося ніяких негативних ефектів за різними параметрами кісткової тканини в трабекулярній і кортикальній кістці, за винятком можливого стовщення кортикальної кістки, що показало тенденцію до зниження при обробці З мг/кг/лиждень В5АБ20, хоча значення й не досягли статистичної значимості. Тому що було показане зменшення товщини кортикальної кістки під час відсутності впливу на щільність трабекулярної кісткової тканини в мишей на низькокалорійній дієті (11), спостережуваний ефект може бути пов'язаний з втратою ваги. р «0,001 (773, «0,01 (7, «0,05 (У, «0,1 (5), «0,2 (5) у порівнянні з мишами БІО, обробленими контрольним Іда. М--7 «з 8. бо На Фігурі 29 представлені рівні кортикостерону в мишей після обробки В5АБІ17. Рівні сироваткового кортикостерону були виміряні при експериментальному часі (77) - З після евтаназії шляхом декапітації. Контрольні (СТКІ) миші на дієті з низьким рівнем жиру не одержували ніякої обробки. Ліпополісахариди (ГР5) вводили внутрішньочеревинно мишам на дієті з низьким рівнем жиру в дозі 1 мг/кг за З год. до евтаназії (2Т-0) як позитивний контроль (12). (до вводили внутрішньочеревинно мишам БІО у дозі 5 або 25 мг/кг за 5 днів до евтаназії, як зазначено. Зазначений статистичний аналіз був проведений без групи І Р5. М-12.
На Фігурі 30 представлене зв'язування різних біспецифічних антитіл із плечима анти-ЕСЕВ1 й анти-КІ В з клітинами, що експресують ЕСЕКІ1с або ЕСЕРМКс і КІ В.
На Фігурі 31 представлене зв'язування похідних УМ/182.5 і иМ/182.5 з білками ЕОЕКІ1, показане методом ЕГІ5А.
Докладний опис винаходу
Для більшої ясності, але не як обмеження, докладний опис розкритого предмета розділений на наступні підрозділи.
І. Визначення
ІІ. Антитіла
І. Способи застосування
ІМ. Фармацевтичні лікарські форми і
М. Вироби.
І. Визначення "Каркасна область людського акцептора" для цілей даного винаходу являє собою структуру, що містить амінокислотну послідовність каркасної області варіабельного домена легкого ланцюга (МІ) або каркасної області варіабельного домена важкого ланцюга (УН), отриманих з каркасної області людського імуноглобуліну або каркасної області людської консенсусної послідовності, які визначені нижче. Каркасна область людського акцептора, "отримана з" каркасної області людського імуноглобуліну або каркасної області людської консенсусної послідовності, може містити ту саму амінокислотну послідовність або вона може містити зміни амінокислотної послідовності. У деяких варіантах здійснення кількість амінокислотних змін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше, або 2 або менше. У деяких варіантах здійснення даного винаходу
Зо каркасна область людського акцептора Мі ідентична послідовності каркасної області МІ. людського імуноглобуліну або послідовності каркасної області людської консенсусної послідовності. "Афінність" відноситься до сили суми всіх нековалентних взаємодій між однією ділянкою зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і його партнером зі зв'язування (наприклад, антигеном). Якщо не зазначено інше, в даному описі, "афінність зв'язування" відноситься до внутрішньої афінності зв'язування, що відображає взаємодію 1:1 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом й антигеном). Афінність молекули Х до її партнера У у загальному випадку може бути представлена константою дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна звичайними способами, відомими в даній області, у тому числі тими, які представлені в даному описі. Конкретні ілюстративні приклади варіантів здійснення вимірювання афінності зв'язування описані нижче.
Антитіло зі "зрілою афінністю" відноситься до антитіла з одним або декількома змінами в одній або декількох гіперваріабельних областях (НУК) у порівнянні з вихідним антитілом, що не має такі зміни, що призводять до поліпшення афінності антитіла до антигена. "Клото-бета", "КІ В" і "Сета-клото", як вони використані в даному описі, відносяться до будь- якого нативного бета-клото з будь-якої хребетної тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, людина) і гризуни (наприклад, миші та пацюки), якщо не зазначено інше. Термін охоплює "повнорозмірний", непроцесований КІВ, а також будь-яку форму КІВ, що є результатом процесингу в клітині. Термін також включає варіанти, що зустрічаються у природі,
КІВ, наприклад, варіанти сплайсингу або алельні варіанти. Необмежуючий приклад амінокислотної послідовності людського КІВ, що є мішенню антитіла за даним винаходом, за винятком сигнальної послідовності, виглядає наступним чином:
ЕЗИаравАМЗКМРМЕТРУМЕЗОЇ ЕМОТЕРКМЕРМ Спа тал оМЕс!БУККОИКаИРБІМ ОНРЕЇІНТ ніКМУЗЗТМавБОБМІРІ ЕКОЇ ЗАГОРІБМЗЕМОББІЗМУ РА ЕРОСІМТМАМАКИаГ ОМУБТИЇ БА МІ ВМ
ІЕРІМТ МНУУ/ОІ РІГ АГОЄЕКУС,СИМКМОПІОТЕМОМАТУСРОМЕеСОВУКУУМІТІНМРУІ МАУ НСОМО ТИМ
НАРСЕКОМІ ААМУТМаНМікКАНЗКУМ НМУМТНЕАРНОКИУМІ БІТ аЗНУ/ЛЕРМАЗЕМТМОІЕКСОО
ЗМУБЗМІ СМ/ЕАМРІНИрООМРЕСМАККІ ЕЗМІ РІЕБЕАДЕКНЕМАИТАОЕРАЕЗЕОРММЕКРІ МІТМАК
МИаомм5іІ М ВЕАСМУМКГСЕМММРАШАЕМСХЕТОЗАУКТЕОТТАІМММКМНІ ЗОМ ОАІВІ ОБІВМУга
УТАМЗИ ОСЕЕМОБАМТІВВаї ЕММОЕМЗКОКЕВКРКЗЗАНУУКОПАЕМСИЕ5І КЕЗТРОМОСОБРОС 60 РЕБМОИМТЕБЗМІ КРЕЗМАЗОРОЕБЗОРНІ УМУМАТОаМАГІЇ НАМЕСУВІ КТАРАОСТОЕММІККОЇ ЕМІ.
АВМКМУТНУВЕАЇ ОМ/АБМІ РТОМІ БАММАОАІ ВУМАСУМ5ЕИІ КІ СІЗАММТІ МУРТНАНІ СІ РЕРІЇ.
НАВСМІ МРОТАЕАРОАМАСІ СРОБЇ СІ МКІ МІТІМЕРМАІ 5ВІММАЗамМмОТМсААНМІ І МАНАГ АМУ
ВІ МОВОЕВРБОВОИАМ5БІ 5І НАСМАЕРАМРУАОЗНУВААЕВЕЇ ОБГЕІАМ/ГАЕРІ ЕКТИаЮОМРААМАЕМУ
ІА5КНАНОЇ 555АЇ РВІ ТЕАЕВВ І КаТУМОБгСАСМНЕТТВЕММНЕОЇ АО5АМОБОВОІОГІ ОТ 5
ЗРТВІ АМІРИМЯУВКИ ВМ УААМУСОМО МІ ТАБИаїрроАЕВОВІ ВКУМІ СКМ ОЄЕМІ КАМПТОКМВІК
СУМАРКІ АЕЕКЗКРАБГСРЕТ5ОЕКАКООІОЄММКМІЗ5АСЕРЕРЕМ555АСБОТОЕМТЕСТМСІ РІ МОК
КРИТ ЯССЕЕЗТІ МО БІАІЄОВОКАВКЕМКАКМІ ОНІРІ ККаКАМУ5 (ЗЕО ІО МО: 145).
У деяких варіантах здійснення білок КІ В може включати М-кінцеву сигнальну послідовність, що має амінокислотну послідовність
МКРИаСААаЗРЕМЕУЛЕЕЗТОЕТТАУАМТМЗМОИаИТОВ5МІІ ЗА ШІ ВАМТа (5ЕО І МО: 157).
Термін "С-кінцевий домен КІВ" відноситься до карбокси-кінцевого глікозидаза-подібного домену КІВ. Наприклад, С-кінцевий домен прикладу білка КІ В, представлений у послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 145, містить наступну амінокислотну послідовність:
ЕРСОРЄБУМСОМТЕБМІ КРЕЗБМАБЗРОБЕБОРНІ УММУМАТОМВІ І НАМЕСУВІ КТАРАОСТОЕУМІКК
ОГЕМІ АВМКУТНУВЕАЇ ОМ/АБМІ РТОМІ БАММАОАСГАУУ ВСУМ5ЕИІ КІ СІЗАММТІ УМРТНАНІ СІ.
РЕРІГГНАВСММІ МРОТАЕАРОАМАСІ СРОБЇ СІ УКІ МІТІМЕРМАІ 5ВІММАЗаМОТМаААНМІ І МАН
АЇ АМ/ВІ МОВОРАРБОВОАМ5БІ БІ НАОМ/УДЕРАМРУАОБЗНУУВААЕВРЕЇ ОБГЕІАМ/ГАЕРІ ЕКТаОУРАА
МАЕМІАЗКНАНИЇ 5554АЇІ РВІ ТЕАДЕВАТ І КИТМОБСАЇ МНЕТТАЕММНЕОЇ АДаЗАМОБОВОІОГРІ ОЮІ
ТАГ55РТАІ АМІРУУСУВКІ І ВУМУМААММаОМОІМІ ТАБИаїроОАЕВОВІ АКУМІ СКМ ОЕМІ КАМТОК
МВІКаУМАРЕКІ АЕЕКЗКРАБГСЕЕТЗОРКАКОЗОЗІОЄУМКМІЗЗАИагРЕЕМ55А (5ЕО ІО МО: 155).
Терміни "анти-КІ В антитіло" й "антитіло, що зв'язується з КІ В" відносяться до антитіла, яке здатне зв'язуватися з КІ В з достатньою афінністю таким чином, що антитіло є корисним в якості діагностичного та/або терапевтичного засобу для цілеспрямованого впливу на КІ В. В одному варіанті здійснення ступінь зв'язування анти-КІ В антитіла з неспорідненими, що не відносяться до КІВ, білками становить менше ніж приблизно 10 95 від зв'язування антитіла з КІ В, яке виміряне, наприклад, за допомогою радіоїмуноаналізу (КІА). У деяких варіантах здійснення, антитіло, що зв'язується з КІ В має константи дисоціації (Ка) х 1 мкМ, х 100 НМ, х 10 НМ, «1 НМ, 0,1 НМ, х 0,01 нМ або «х 0,001 нМ (наприклад, 109 М або менше, наприклад, від 1029 М до 1073
М, наприклад, від 109 М до 10-73 М). У деяких варіантах здійснення, анти-КІВ антитіло
Зо зв'язується з епітопом КІВ, що є консервативним для КІ В з різних видів. У деяких варіантах здійснення, анти-КІ В антитіло зв'язується з епітопом КІВ, що перебуває в С-кінцевій частині білка.
Термін "рецептор фактора росту фібробластів 1" або "БОЕКІ", який використовують в даному описі, відноситься до будь-якого нативного ЕСЕКІ з будь-якої хребетної тварини, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, людина) і гризуни (наприклад, миші та пацюки), якщо не зазначено інше. Термін охоплює "повнорозмірний", непроцесований ЕСЕКІ, а також будь-яку форму ЕСЕКІ, що є результатом процесингу в клітині. Термін також включає варіанти, що зустрічаються у природі, ЕСЕКІ1, наприклад, варіанти сплайсингу або алельні варіанти, у тому числі ЕСЕКІс. Не обмежуючий приклад амінокислотної послідовності людського ЕСЕКІТс наведений нижче:
ММ/5МУКСІ КАВА (5ЕО І МО: 146), ЕОХОРМУСАРМЕМЕБРІ КАВА (ЗЕО І МО: 146) М КА (ЗЕБЕО 10 МО: 146).О0О5МРАОБСІ КАВА (5ЕБО ОО МО: 146)ОАЇКАА (5БО 10 МО: 146) ТКРМРУМАРУМ/ТОРЕКМЕККІКАН (5ЕБО 10 МО: 146)5ТІКвА (5БО 10 МО: 146). МАТ БИМО5УУРЗОКИамММУТСІМЕМЕМСИаБвІМНТМОЇ КАВА (5ЕО ІЮ МО: 146).МАІ КАВ (5ЕО І
МО: 146).КНІЕММаЗКІСРОМІ КАВА (5ЕО ІО МО: 146).НІ КАВА (5ЕО І МО: 146). 5ННЗАМІ КАВА (ЗЕБЕО І МО: 146).ПМСТОАРІКАВ (5ЕБЕО 10 МО: 146) ЕН5БОМАМУНКІ КАВА (5ЕБО ОО МО: 146)52МІ КАВА (5ЕО І МО: 146) Б! КАВА (5ЕО 10 МО: 146) 4СЕООММІ КАВА (5ЕБО ІО МО: 1463ІКАА (5ЕБО 10 МО: 146)ІСКНКМИІМІ КА (ЗЕО 10 МО: 1460ІКАВ (БО ОО МО: 146). РЕЕОЇ КАК (ЗЕО І МО: 146).ККСІНАВОІ КАВА (5ЕО І МО: 146). АВВІННІОМУККТттМОаВІ КА В (ЗЕБЕО 10 МО: 146).М5РОМІКАА (5ЕБО 10 МО: 146)КІКАА (5БО 10 0 МО: 146). ВОСМУНАМРБЗОВРТЕКОЇ КАВА (ЗЕО ІО МО: 146). РІ ВОМ5РЗЕРОТАЗЗТОЗ5ОЕОЗМЕЗНЕРІРЕЕРСІ РАНРАОГ АМОС ІКАА (5ЕБО ОО МО: 146).
Термін "анти-ЕСЕКІтс антитіло" відноситься до антитіла, яке здатне зв'язуватися з ЕСЕКІ1 з достатньою афінністю таким чином, що антитіло є корисним в якості діагностичного та/або терапевтичного засобу для цілеспрямованого впливу на ЕОЕКІТс. В одному варіанті здійснення ступінь зв'язування анти-ЕОЕМК1 антитіла з неспорідненим, що не відноситься до ЕСЕК1с білком становить менше ніж приблизно 1095 від зв'язування антитіла з ЕОЕКІс, яке виміряне, наприклад, за допомогою радіоімуноаналізу (КІА). У деяких варіантах здійснення, антитіло, яке 60 зв'язується з ЕСЕКТс, має константи дисоціації (Ка) х 1 М, х 100 мМ, х 10 мМ, х 1 мМ, «х 100
МКМ, х 10 мкМ, х 1 мкМ, х 100 НМ, ТО НМ, хх 1 НМ, «0,1 НМ, х 0,01 нМ, або х 0,001 НМ. У деяких варіантах здійснення, Ка антитіла, що зв'язується з ЕСЕКІ1с, описаним в даному описі, може бути 103 М або менше, або 109 М або менше, наприклад, від 109 М до 1073 М, наприклад, від 109 М до 10-73 М. У деяких варіантах здійснення анти-ОЕР1 антитіло зв'язується з епітопом
ЕСЕК тс, що є консервативним серед ЕОЕКТс з різних видів.
Термін "антитіло" в даному описі використовується в самому широкому сенсі та включає різні структури антитіла, включаючи, без обмеження, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл, за умови, що вони проявляють бажану антигенсполучну активність. "Фрагмент антитіла" відноситься до молекули, крім інтактного антитіла, що містить частину інтактного антитіла, яке зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло. Приклади фрагментів антитіл включають, але не обмежуються ними, Ем, Раб, Бар", БабЄ5Н, Е(аб")»; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕмМ); і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. "Антитіло, що конкурує за зв'язування" з контрольним антитілом, відноситься до антитіла, що блокує зв'язування контрольного антитіла з його антигеном в конкурентному аналізі на 50 95 або більше, і, навпаки, референсне антитіло блокує зв'язування антитіла з його антигеном в конкурентному аналізі на 50 95 або більше. Приклад конкурентного аналізу описаний у розділі "Антитіла", Нагіоуг апа І апе (Сода 5ргіпд Нагбог Ргез5, Соїй Зргіпд Нагбог, МУ).
Термін "химерні" антитіла відноситься до антитіл, у яких частина важкого та/або легкого ланцюга отримана з одного джерела або виду, у той час як інша частина важкого та/або легкого ланцюга, отримана з іншого джерела або виду. "Клас" антитіла відноситься до типу константного домена або константної області, яку має його важкий ланцюг. Існує п'ять основних класів антитіл: ІДА, дО, ІДЕ, до і дм, і деякі з них можуть бути додатково підрозділені на підкласи (ізотипи), наприклад, Ідс1, Ідс2, дез, Ідс4,
ІЗА1 і ІдА2. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються а, б, є, у, і М, відповідно.
Термін "цитотоксичний агент", який використовують в даному описі, відноситься до речовини, що інгібує або запобігає клітинній функції та/або викликає загибель клітин або їхнє
Зо руйнування. Цитотоксичні агенти включають, без обмеження, радіоактивні ізотопи (наприклад,
АТ, 81, 25, у, Ве"86, Де"88. пт! Віг12, рз2, рр! і радіоактивні ізотопи І и); хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); агенти, інгібуючі ріст; ферменти та їхні фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження, включаючи їхні фрагменти і/або варіанти; і різні протипухлинні або протиракові засоби, описані нижче. "Ефекторні функції" відносяться до таких видів біологічної активності, що відносяться до Ес- області антитіла, які змінюються з ізотипом антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають зв'язування Сід й опосередковану комплементом цитотоксичність (СОС); зв'язування Ес-рецептора; антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АОС); фагоцитоз; понижуючу регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора) й активацію В-клітин. "Ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичної лікарської форми, відноситься до кількості, ефективної при необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу для досягнення бажаного терапевтичного або профілактичного результату. Для прикладу, а не як обмеження, "ефективна кількість" може відноситися до кількості антитіла, розкритого в даному описі, що може полегшити, звести до мінімуму та/або запобігти симптомам захворювання та/або розладу, продовжити виживаність та/або продовжити період до рецидиву захворювання та/або розладу.
Термін "Рсо-область" в даному описі використовується для визначення С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить, щонайменше, частину константної області. Термін включає нативну послідовність Ес-областей і варіанти Есо-областей. У деяких варіантах здійснення Ес-область важкого ланцюга людського Їдсї розташовується в межах від Суз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Проте, С-кінцевий лізин (Іуз447) Ес- області може бути присутнім або може не бути присутнім. Якщо не зазначено інше, то нумерація амінокислотних залишків у Ес-області або константній області знаходиться відповідно до системи нумерації ЕО, яку також називають ЕО-індексом, як це описано в Кабаї еї а!., Зедоепсез ої Ргоївїпв ої Іттипоіодісаї! Іпітегеві, Бій Еа. Рибіїс Неацй Зегмісе, Маїйопаї! Іпзійшев 60 ої Неацй, ВеїШПезаа, МО, 1991.
"Каркасна область" або "РК" відноситься до амінокислотних залишків варіабельного домена, відмінних від амінокислотних залишків гіперваріабельної області (НМ). ЕК варіабельного домена, як правило, складається з чотирьох доменів ЕК: ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4.
Відповідно, послідовності НУК і ЕК зазвичай присутні у наступному порядку в МН (або МІ): ЕК1-
НІ 1)-ЕН2-НаІ(І2)-ЕНЗ-НЗ(І 3)-ЕНА.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "Інтактне антитіло" та "ціле антитіло" використовуються в даному описі взаємозамінно для позначення антитіла, що має структуру, по суті, подібну нативній структурі антитіла, або має важкі ланцюги, які містять Ес-область, як визначено в даному описі.
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїнів" і "культура клітин-хазяїнів", які використовуються в даному описі взаємозамінно, відносяться до клітин, у які була введена екзогенна нуклеїнова кислота, в тому числі до потомства таких клітин. Клітини-хазяїни включають "трансформанти" та "трансформовані клітини", які включають первинну трансформовану клітину та її нащадків без урахування числа пасажів. Нащадки можуть бути не повністю ідентичними батьківській клітині за нуклеїновими кислотами, що містяться, але можуть містити мутації. Мутантні нащадки, що мають ту саму функцію або біологічну активність, на які був спрямований скринінг або відбір спочатку трансформованих клітин, включені в даний опис. "Людське антитіло" є антитілом, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає антитілу, що утворюється в організмі людини або клітинах людини або отриманого з відмінного від людини джерела, що використовує репертуари антитіл людини або інші кодуючі антитіла людської послідовності. Це визначення людського антитіла спеціально виключає гуманізоване антитіло, що містить нелюдські антигенсполучні залишки. "Каркасна область людської консенсусної послідовності" є каркасною областю, що являє собою амінокислотні залишки, що найбільше часто зустрічаються, при відборі послідовностей каркасних областей МІ. або УН людського імуноглобуліну. Як правило, відбір послідовностей МІ. або МН людського імуноглобуліну виробляється з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. У загальному випадку підгрупа послідовностей є такою підгрупою, що зазначена в
Каваї єї а!., Зедиепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, Ей Еайіоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242,
Веїпезаа МО (1991), Мої!5. 1-3. У деяких варіантах здійснення для МІ. підгрупа є підгрупою каппа
Ї як це зазначено в Кабраї еї а вище. У деяких варіантах здійснення для МН підгрупа є підгрупою І, як це зазначено в КарБбаї єї аї. вище. "Гуманізоване" антитіло відноситься до химерного антитіла, що містить амінокислотні залишки з НМЕ, відмінні від людських, і амінокислотні залишки з людських ЕК. У деяких варіантах здійснення, гуманізоване антитіло буде містити по суті все з, щонайменше, одного, а звичайно двох варіабельних доменів, у яких всі або по суті всі НМК (наприклад, СОМ) відповідають таким з антитіла, відмінного від людського антитіла, і всі або по суті всі ЕВ відповідають таким у людському антитілі. Гуманізоване антитіло, необов'язково, може містити, щонайменше, частину константної області антитіла, отриману з людського антитіла. "Гуманізована форма" антитіла, наприклад, відмінного від людського антитіла, відноситься до антитіла, що піддалося гуманізації.
Термін "гіперваріабельна область" або "НМА", який використовують в даному описі, відноситься до кожної з областей варіабельного домена антитіла, які є гіперваріабельними за послідовністю ("визначальні комплементарність області" або "СОК") і/або утворюють структурно визначені петлі ("іперваріабельні петлі"), або містять контактуючі з антигеном залишки ("контакт із антигеном"). Якщо не зазначено інше, залишки НУ й інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) пронумеровані в даному описі відповідно до КаБбаї еї аї., вище.
Як правило, антитіла містять шість НМЕ: три у МН (НІ, Н2, НЗ) і три у МІ (11, 12, Г3). Приклади
НМК в даному описі, включають: (а) гіперваріабельні петлі, які відповідають амінокислотним залишкам 26-32 (І 1), 50-52 (І 2), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) (Споїйіа апа І евК, У. Мої. Віої. 196:901-917 (1987)); (б) СОН, які відповідають амінокислотним залишкам 24-34 (І 1), 50-56 (І 2), 89-97 (І 3), 31-3556 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) (Кавбаї єї аІ., хХедоепсез ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодісаї Іпієгеві, Бій Ед.
Рибіїс Неанцй 5егуісе, Маїййопаї Іпвзійшез ої Неайй, ВеїШйезаа, МО (1991)); (с) контакт із антигеном, який відповідає амінокислотним залишкам 27с-36 (І 1), 46-55 (І 2), 89-96 (13), 30-356 (НІ), 47-58 (Н2г) і 93-101 (НЗ) (МасСаїйшт єї аїЇ. 9). Мої. Віоії. 262: 732-745 (1996)); а також (а) комбінації (а), (Б) і/або (с), включаючи амінокислотні залишки НМА 46-56 (І 2), 47-56 (І 2), 48-56 (І 2), 49-56 (І 2), 26-35 (НІ), 26-35Б (НІ), 49-65 (Н2г), 93-102 (НЗ) і 94-102 (НЗ).
У деяких варіантах здійснення залишки НУК включають залишки, які визначені на Фігурі ЗА 60 або ЗВ або в іншому місці даного опису.
"Імунокон'югат" відноситься до антитіл, кон'югованих із однією або декількома гетерологічними молекулами, включаючи цитотоксичний агент, але не обмежуючись ним.
Терміни "індивідуум" або "суб'єкт", які використовують в даному описі взаємозамінно, відносяться до ссавців. Ссавці включають, але не обмежуються ними, одомашнених тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак, коней), приматів (наприклад, людей і приматів, відмінних від людини, таких, як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, мишей і пацюків). У деяких варіантах здійснення індивідуум або суб'єкт є людиною. "Виділене" антитіло являє собою антитіло, яке було відділене від компонентів його природного оточення. У деяких варіантах здійснення антитіло очищають до більш ніж 95 95 або 9995 чистоти, що визначається, наприклад, електрофоретично (наприклад, 5О5-РАСЕ, ізоелектричним фокусуванням (ІЕР), капілярним електрофорезом) або хроматографічно (наприклад, іонообмінною НРІС або НРІ С зі зверненою фазою). Для огляду способів оцінки чистоти антитіл, див., наприклад, Еіаїтап еї аї., ). Спготаїйоадг. В 848:79-87 (2007). "Виділена" нуклеїнова кислота відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що була відділена від компонентів її природного оточення. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай містять цю молекулу нуклеїнової кислоти, але молекула нуклеїнової кислоти присутня екстрахромосомно або у хромосомній локалізації, що відрізняється від природної локалізації у хромосомі. "Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло" (у тому числі стосовна до специфічних антитіл, наприклад, анти-К/В антитіла) відноситься до однієї або декількох молекул нуклеїнових кислот, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла (або їхні фрагменти), у тому числі такої молекули нуклеїнової кислоти (таких молекул нуклеїнових кислот) в одному векторі або в окремих векторах і такої молекули нуклеїнової кислоти (таких молекул нуклеїнових кислот), яка є присутньою (які присутні) в одному або декількох місцях у клітині-хазяїні.
Термін "моноклональне антитіло", який використовують в даному описі, відноситься до антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що становлять популяцію, є ідентичними та/або зв'язують той самий епітоп, за винятком можливих варіантів антитіл, наприклад, що містять природні мутації або мутації, що виникають у процесі одержання препарату моноклонального антитіла; такі варіанти зазвичай присутні в незначних
Зо кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклонального антитіла спрямовано проти однієї детермінанти на антигені. Таким чином, термін "моноклональний" вказує на характер антитіла, отриманого з по суті гомогенної популяції антитіл, і не повинен бути витлумачений як потребуючий одержання антитіла яким- небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, які повинні використовуватися відповідно до розкритого в даному описі винаходу, можуть бути отримані за допомогою різних методів, включаючи, але не обмежуючись методом гібридоми, методом рекомбінантних ДНК, методом фагового дисплея та методами, що передбачають використання трансгенних тварин, що містять всі або частину локусів людського імуноглобуліну, такі способи та інші приклади способів одержання моноклональних антитіл наведені в даному описі. "Голе антитіло" відноситься до антитіла, що не кон'юговане з гетерологічним фрагментом (наприклад, цитотоксичним залишком) або радіоактивною міткою. Голе антитіло може бути присутнім у фармацевтичній лікарській формі. "Нативні антитіла" відносяться до молекул, що зустрічаються у природі, імуноглобулінів з різними структурами. Так, наприклад, нативні антитіла ІДС являють собою гетеротетрамерні глікопротетїни розміром близько 150000 дальтон, що складаються з двох однакових легких ланцюгів і двох однакових важких ланцюгів, які зв'язані дисульфідними містками. Від М- до С- кінця кожний важкий ланцюг має варіабельну область (МН), що також називається важким варіабельним доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, а потім три константних домена (СНІ, СН2 ї СНЗ). Аналогічним чином, від М- до С-кінця, кожний легкий ланцюг має варіабельну область (МІ), яку називають також легким варіабельним доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, за яким слідує константний легкий (СІ) домен. Легкий ланцюг антитіла може бути віднесений до одного з двох типів, які називають каппа (к) і лямбда (Х), відповідно до амінокислотної послідовності його константного домена.
Термін "вкладиш в упакування", який використовують в даному описі, відноситься до інструкцій, терапевтичних продуктів, що включають зазвичай у комерційні впакування, які містять інформацію про показання, застосування, дозування, введення, комбіновану терапію, протипоказання та/або попередження, що стосуються застосування таких терапевтичних продуктів. бо "Відсоток (96) ідентичності амінокислотної послідовності" стосовно референсної послідовності поліпептиду визначається як відсоток амінокислотних залишків у послідовності- кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишкам у послідовності референсного поліпептиду, після вирівнювання послідовностей і введення розривів, якщо це необхідно, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей, і без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності амінокислотної послідовності можна досягти різними способами, які відомі фахівцям в даній області, наприклад, з використанням загальнодоступного програмного забезпечення, такого як ВГА5Т, ВІ АБТ-2, АГІОМ або Медаїдп (ОМАЗТАК). Фахівці в даній області можуть визначити відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання за всією довжиною порівнюваних послідовностей. Для цілей даного винаходу, однак, значення ідентичності послідовності амінокислот у 96 були отримані з використанням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей АЇЇСМ-2. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей
АПСИМ-2 розроблена Сепепіесі, Іпс., і її вихідний код був зареєстрований з користувальницькою документацією в Бюро охорони авторських прав США, Вашин'гтон, округ Колумбія, 20559, де він зареєстрований для охорони авторських прав США з реєстраційним номером Ме ТХО510087.
Програма АСІСМ-2 перебуває у відкритому доступі від Сзепепіесй, Іпс., Південний Сан
Франциско, Каліфорнія, або може бути скомпільована з вихідного коду. Програма АГІСМ-2 повинна бути скомпільована для використання в операційній системі ОМІХ, включаючи цифровий ШМІХ М4.00. Всі параметри порівняння послідовностей встановлені програмою
АЦОМ-2 і не міняються.
У тих ситуаціях, де АГІОМ-2 використовується для порівняння амінокислотних послідовностей, бо ідентичності амінокислотної послідовності даної амінокислотної послідовності А стосовно даної амінокислотної послідовності В, у порівнянні з даною амінокислотною послідовністю В або проти даної амінокислотної послідовності В (що як альтернатива може бути сформульована як дана амінокислотна послідовність А, що має певний Ус ідентичності амінокислотної послідовності стосовно даної амінокислотної послідовності В, у порівнянні з даною амінокислотною послідовністю В або проти даної амінокислотної послідовності В) розраховують у такий спосіб:
Ко) 100 помножити на дріб Х/У, де Х являє собою кількість амінокислотних залишків, оцінених програмою вирівнювання
АЦІСМ-2 як ідентичні збіги при програмному вирівнюванні А і В, і де М являє загальну кількість амінокислотних залишків у В. Варто розуміти, що там, де довжина амінокислотної послідовності
А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, 9о ідентичності амінокислотної послідовності А стосовно В, не буде дорівнює 95 ідентичності амінокислотної послідовності В стосовно А. Якщо спеціально не зазначено інше, то всі значення 95 ідентичності амінокислотних послідовностей, які використовують в даному описі, одержують, як описано у попередньому абзаці з використанням комп'ютерної програми АГІСМ-2.
Термін "фармацевтична лікарська форма" відноситься до препарату, що перебуває у формі, здатній забезпечити біологічну активність активного інгредієнта, що міститься в ньому, для його ефективності, і який не містить додаткових компонентів, що неприйнятно токсичні для суб'єкта, якому будуть вводити лікарську форму.
Термін "фармацевтично прийнятний носій", який використовують в даному описі, відноситься до інгредієнта у фармацевтичній лікарській формі, що відрізняється від активного інгредієнта, і який не токсичний для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає буфер, наповнювач, стабілізатор або консервант, але не обмежується ними.
Використовуваний в даному описі термін "лікування" (і його граматичні варіанти, такі як "лікувати" або "терапія") відноситься до клінічного втручання в спробі змінити природний плин стану індивідуума, що піддається лікуванню, і яке може бути виконане як з метою профілактики, так і при клінічній патології. Бажані ефекти лікування включають запобігання виникнення або рецидиву захворювання, ослаблення симптомів, зменшення яких-небудь прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазування, зниження швидкості прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення хворобливого стану, ремісію або поліпшення прогнозу, але не обмежуються ними. У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом можуть бути використані для затримки розвитку захворювання або вповільнення прогресування захворювання.
Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до домена важкого або легкого ланцюга антитіла, що бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга (МН ії МІ, відповідно) нативного антитіла, як бо правило, мають аналогічні структури, при цьому кожний домен містить чотири консервативні каркасні області (ЕК) та три гіперваріабельні області (НМК). (Дивися, наприклад, Кіпаї єї аї.
Кибу Іттипоіоду, 6" ед., М.Н. Егеетап апа Со., раде 91 (2007).) Один домен МН або Мі. може бути достатнім для надання антигенсполучної специфічності. Крім того, антитіла, які зв'язуються з конкретним антигеном, можуть бути виділені з використанням домена МН або МІ. з антитіла, що зв'язується з антигеном, для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів МІ. або
МН, відповідно. Див., наприклад, Ропоїапо еї аї., у). Іттипої. 150:880-887 (1993); Сіатквоп вї аї.,
Маїиге 352:624-628 (1991).
Термін "вектор", як він використовується в даному описі, відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної до переносу іншої нуклеїнової кислоти, з якою він зв'язаний. Термін включає вектор як самореплікуючу структуру нуклеїнової кислоти, а також вектор, включений у геном клітини-хазяїна, в яку він впроваджений. Деякі вектори здатні направляти експресію нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори в даному описі називаються "експресійними векторами".
ІІ. Антитіла
В одному з аспектів даний винахід заснований, частково, на виявленні біспецифічних антитіл, які зв'язуються з КІВ і БЕОЕКІс і вибірково активують рецепторний комплекс
ЕСЕМКІс/КІ В й індукують корисні метаболічні зміни, очікувані від ЕОЕ21-подібної активності, у тому числі втрату ваги та поліпшення метаболізму глюкози і ліпідів, без істотного впливу на печінку та без втрати кісткової маси.
У деяких варіантах здійснення передбачені антитіла, які зв'язуються з КІ В. Даний винахід також відноситься до анти-РОЕКІ1 антитіл, наприклад, анти-ОЕК1с антитіл. Даний винахід також забезпечує біспецифічні антитіла, які зв'язуються з КІ В і ЕСЕКІ1 (називають в даному описі біспецифічні анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіла). У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ за даним винаходом зв'язується з КІВ і БЕОЕКІ1с. У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом включають антитіла, які не блокують зв'язування та/або взаємодію ЕСЕ лігандів, наприклад ЕБОБЕ19 і ЕСЕ21, з комплексом
КІ В/РВЕВ 6.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не робить істотного впливу на печінку, наприклад, на функції печінки. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь конкретною
З0 теорією, автори припускають, що антитіло за даним винаходом не приводить до активації рецепторного комплексу ЕСЕКІсС/КІВ у печінці. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не модулює активність рецепторного комплексу ЕСЕК/КІВ у печінці у порівнянні з модуляцією рецепторного комплексу ЕСЕЕ/КІ В у печінці білююом ЕОБ21. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не призводить до інгібування комплексу
ЕСЕКА/КІ В та/або не призводить до перевищення рівня ферментів печінки, таких як АГ Т, АЗТ,
АГ Р ії СОН, але не обмежуючись ними. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не функціонує як агоніст комплексу ЕСЕК2сС/КІ В та/або комплексу ЕСЕКЗсС/КІ В. у печінці, які можуть активувати сигналінг МАРКО і/або змінювати експресію Зргу4 і ЮБизрб у печінці. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не призводить до активації сигналінгу МАРКО у печінці у порівнянні з активацією сигналінгу МАРКО за допомогою білка
ЕСЕ21. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не функціонує в якості агоніста комплексу ЕСЕКА/КІ В у печінці.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може бути гуманізованим. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає каркасну область людського акцептора, наприклад, каркасну область імуноглобуліну людини або структуру людської консенсусної послідовності.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може являти собою моноклональне антитіло, у тому числі химерне, гуманізоване або людське антитіло. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може являти собою фрагмент антитіла,
БО наприклад, Ем, Раб, Раб", 5сЕм, діантитіло або Е(ар")». У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло являє собою повнорозмірне антитіло, наприклад, інтактне антитіло да, або антитіло іншого класу або ізотипу, як визначено в даному описі. У певних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може включати будь-яку з ознак, окремо або в комбінації, як докладно описано нижче в розділах 1-7.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути використані, наприклад, для діагностики або лікування метаболічних порушень. Необмежуючі приклади метаболічних розладів включають синдром полікистозних яєчників (РСО5), метаболічний синдром (Мей), ожиріння, неалкогольний стеатогепатит (МАБН), неалкогольну жирову хворобу печінки (МАРІО), гіперліпідемію, артеріальну гіпертензію, діабет 2 типу, діабет не 2 типу, діабет 1 типу, латентний бо аутоїмунний діабет (ГАЮ), діабет дорослого типу в молодих (МОЮСУ), а також старіння та пов'язані з ним захворювання, такі як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона й АЇ 5.
А. Приклади анти-КІ В антитіл
В одному з аспектів даний винахід відноситься до виділених антитіл, які зв'язуються з білком
КІ В. У деяких варіантах здійснення анти-КІ В антитіло за даним винаходом зв'язується з С- кінцевим доменом КІ В. У деяких варіантах здійснення анти-КІ В антитіло за даним винаходом зв'язується з фрагментом КІ В, який включає амінокислотну послідовність,
З5РТІВІАМІРМСУВКІ І ВМУУКАММООМОІМІТАВ (5БО ОО МО: 142). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-КІі В антитіло, наприклад, 8С5, представлене в даному описі.
У деяких варіантах здійснення анти-КІВ антитіло за даним винаходом містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних із: (а) НМЕА-НІ, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність з ЗЕО ІЮ МО: 1-15, наприклад, 12 або 15; (Б) НМЕ-На2, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з БЗЕО ІЮ МО: 16-31, наприклад, 28 або 31; (с) НУВ-НЗ, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО: 32-47, наприклад, 44 або 47; (4) НМК-11, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з
ЗЕО ІЮО МО: 48-62, наприклад, 49 або 62; (е) НМК-12, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО: 63-78, наприклад, 75 або 78; і (І) НМЕ-1 3, яка містить будь- яку амінокислотну послідовність, вибрану з БЗЕО ІЮ МО: 79-93, наприклад, 90 або 93.
У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує анти-КІ В антитіло, що містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних із: (а) НМЕА-НІ, яка містить
ЗЕО І МО: 12; (5) НУВ-Н2, яка містить послідовність ЗЕО ІЮ МО: 28; (с) НМЕ-НЗ, яка містить послідовність ФЕО ІЮ МО: 44; (а) НУМВ-І1, яка містить БЕО ІЮ МО: 49; (є) НМК-12, яка містить
ЗЕО ІО МО: 75; і () НМК-13, яка містить зЕО ІО МО: 90. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує анти-КІ В антитіло, що містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних із (а) НМЕ-НІ, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 15; (Б) НМЕ-Н2, яка містить ЗЕО
ІО МО: 31; (с) НУВ-НЗ, яка містить послідовність БЕО ІЮ МО: 47; (4) НМА-11, яка містить ЗЕО ІЮ
МО: 62; (є) НУВ-1І2, яка містить ЗЕО ІО МО: 78; і (І) НМЕ-І 3, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 93.
Даний винахід також відноситься до анти-К/В антитіла, яке містить послідовність варіабельного домена важкого ланцюга (МН), що має, щонайменше, 90 95, 91 Фо, 92 95, 93 Об,
Зо 94 95, 95 95, 96 95, 97 96, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 128. У деяких варіантах здійснення послідовність МН, що має, щонайменше, 90 9», 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 96, 96 95, 97 95, 98 90 або 99 95 ідентичності, містить заміни (наприклад, консервативні заміни, що розкрито нижче), інсерції або делеції стосовно референсної послідовності, але анти-КІВ антитіло, що містить цю послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з КІ В. У деяких варіантах здійснення у 5ЕО ІЮО МО: 128 у цілому були заміщені, вставлені та/або вилучені від 1 до 10 амінокислот. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції виникають в областях поза НМК (тобто у ЕК). Як альтернатива або додатково, анти-КІВ антитіло включає послідовність МН з 5ЕО ІО МО: 128, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності, що описано нижче. У деяких варіантах здійснення МН містить одну, дві або три НМК, вибраних із: (а) НМК-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 15, (Б) НМК-Н2, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 31, і (с) НУВ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО: 47.
В іншому аспекті даний винахід передбачає анти-К/В антитіло, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), що має, щонайменше, 90 95, 91 95, 92 о, 93 о, 94 Ор, 95 95, 96 95, 97 9, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ
МО: 130. У деяких варіантах здійснення послідовність Мі, що має, щонайменше, 90 95, 91 Об, 92 96, 93 6, 94 96, 95 о, 96 96, 97 У, 98 96 або 99 95 ідентичності, містить заміни (наприклад, консервативні заміни) інсерції або делеції стосовно референсної послідовності, але анти-КІ В антитіло, що містить цю послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з КІ В. У деяких варіантах здійснення у 5ЕО ІЮ МО: 130 у цілому були заміщені, вставлені та/або вилучені від 1 до 10 амінокислот. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції виникають в областях поза НМА (тобто, у ЕК). Як альтернатива або додатково, анти-К/В антитіло містить послідовність МІ з БЕО ІО МО: 130, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності.
У деяких варіантах здійснення МІ. містить одну, дві або три НМК, вибраних із (а) НМК-11, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 62; (Б) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 78; і (с) НМА-1І З, яка містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 93.
Даний винахід також відноситься до анти-КіІ В антитіла, де антитіло містить УН, як описано у бо будь-якому з варіантів здійснення, наведених вище, і МІ, як описано у будь-якому з варіантів здійснення, наведених вище. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло містить послідовності МН і МІ з 5ЕО ІЮ МО: 128 і 5ЕБЕО ІО МО: 130, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей.
У деяких варіантах здійснення анти-КІВ антитіло зв'язується з фрагментом КІВ, що складається з амінокислотної послідовності ЗЗРТКІ АМІРУУЄУККІ ГКЕУУУКАМУООМОІМІТАБ (ЗЕО ІО МО: 142).
В. Приклади анти-ЕОЕКІ антитіл
В одному з аспектів даний винахід відноситься до виділених антитіл, які зв'язуються з білком
ЕСЕКТ. У деяких варіантах здійснення анти-ЕОСЕКІ антитіло за даним винаходом зв'язується з
ЕСЕМКІ1с. У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає анти-РОЕКІ1 антитіло, що містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних із: (а) НМЕ-НІ, яка містить БЕО ІЮ МО: 136; (Б) НМА-Н2, яка містить ЗЕО ІО МО: 137; (с) НМА-НЗ, яка містить ЗЕО
ІО МО: 138; (а) НУВ-11, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 139; (е) НМЕ-12, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 140; ї ()
НМВ-1І-3, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 141.
У деяких варіантах здійснення анти-ЕОЕКІ! антитіло за даним винаходом містить послідовність варіабельного домена важкого ланцюга (УН), що має, щонайменше, 90 95, 91 95, 9295, 9395, 94 95, 95 95, 96 95, 97 96, 98 95, 9995 або 100 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 132. У деяких варіантах здійснення послідовність МН, що має, щонайменше, 90 9», 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 96, 96 95, 97 95, 98 90 або 99 95 ідентичності, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), інсерції або делеції стосовно референсної послідовності, але анти-РОЕКІ антитіло, що містить цю послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з ЕСЕКТ. У деяких варіантах здійснення у 5ЕО ІЮ МО: 132 у цілому були заміщені, вставлені та/"або вилучені від 1 до 10 амінокислот. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції виникають в областях поза НМЕК (тобто у ЕК). Як альтернатива або додатково, анти-ОЕР1 антитіло включає послідовність МН з 5ЕО ІЮ МО: 132, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У деяких варіантах здійснення МН містить одну, дві або три НУЕ, вибраних із: (а) НМЕ-НІ, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 136, (Б) НУВ-На2, яка містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 137, і (с) НМЕ-НЗ, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 138.
Даний винахід також відноситься до антитіла анти-ЕОЕКТ, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (М), що має, щонайменше, 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 Фо, 95 95, 96 9о, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 134. У деяких варіантах здійснення послідовність МІ, що має, щонайменше, 90 95, 91 Ов, 92 Фо, 93 95, 94 95, 95 У, 96 9о, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), інсерції або делеції стосовно референсної послідовності, але анти-РОЕК1 антитіло, що містить цю послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з ЕСЕКІ. У деяких варіантах здійснення у 5ЕО ІЮ МО: 134 у цілому були заміщені, вставлені та/або вилучені від 1 до 10 амінокислот. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції, присутні в областях поза НМК (тобто у ЕК). Як альтернатива або додатково, анти-ОЕКІ1 антитіло містить послідовність МІ з БЕО ІО МО: 134, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності.
У конкретному варіанті здійснення МІ. містить одну, дві або три НМК, вибрані з (а) НМК-1І1, яка містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 139; (Б) НМК-12, яка містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 140; і (с) НМЕ-1І 3, яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 141.
В іншому аспекті передбачене анти-РОЕКІ1 антитіло, яке містить МН, як у будь-якому з варіантів здійснення, наведених вище, і МІ, як у будь-якому з варіантів здійснення, наведених вище. У деяких варіантах здійснення винаходу анти-ЕОЕКІ1 антитіло містить послідовності МН і
МІ. з БЕО ІО МО: 132 і БЕО ІЮО МО: 134, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей.
У деяких варіантах здійснення антитіло ЕОЕКІ! за даним винаходом зв'язується з фрагментом ЕСЕК'Тс, що має амінокислотну послідовність КІГНАМРААКТМКЕКСР (5ЕО ІЮ МО: 143) або ЕКРОНКІССУКМАУ (ЗЕО ІО МО: 144).
С. Приклади біспецифічних анти-КІ В/(анти-ЕОЕКІ1 антитіл
Даний винахід також забезпечує біспецифічні антитіла, які зв'язуються з КІ В і ЕСЕКІ1 (тобто біспецифічні анти-КІ В/анти-ЕОЕМКІ антитіла). Біспецифічне антитіло має дві різних специфічності зв'язування, див., наприклад, патенти США МоМо 5922845 і 5837243; 7ейдег (1999)
У. Іттипої. 163:1246-1252; Ботазипадагат (1999) Нит. Апіїродієв 9:47-54; Кеїег (1997) Сапсег
Вез. 57:4008-4014. Для прикладу, а не як обмеження, в даному описі передбачені біспецифічні антитіла, що мають одну ділянку зв'язування (наприклад, ділянку зв'язування антигена) для бо першого епітопу, присутнього на КІВ, і другу ділянку зв'язування для другого епітопу,
присутнього на ЕСЕК1І. Для прикладу, а не як обмеження, даний винахід відноситься до антитіла, в якому одне плече зв'язується з КІ В і включає будь-яку з послідовностей анти-Кі В антитіл, представлених в даному описі, і друге плече зв'язується з ЕСЕКІ і включає будь-яку з послідовностей анти-ЕОЕКІ! антитіл, представлених в даному описі. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 за даним винаходом має одну ділянку зв'язування першого епітопу, присутнього на КІ В, і другу ділянку зв'язування другого епітопу, присутнього на ЕСЕК1бс.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕСЕМК1, представлене в даному описі, відноситься до антитіла, що модулює активність комплексу КІ В/ЕСЕК16с.
Наприклад, біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕОЕК1 антитіло може функціонувати в якості агоніста й активувати комплекс КІ В/ЕСЕМК1с. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-
КІ.В/анти-ОЕКІ являє собою антитіло, що збільшує активність комплексу КІВ/РСЕК1с, щонайменше, на 10 95, 20 95, ЗО бо, 40 95, 50 95, 60 о, 70 96, 80 90, 90 95, 99 95 або 99,9 95. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЗЕКІ може являти собою антитіло, що призводить до фосфорилювання послідовно активованих мішеней комплексу
КІ. В/ЕОЕКІ1с, наприклад, МАРКО й/або ЕКК.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕСЕМК1, представлене в даному описі, відноситься до антитіла, що модулює активність комплексу КІГВ/ЕОЕКс їі не блокує взаємодію та/або зв'язування нативних лігандів ЕСЕ, наприклад ЕСЕ19 і ЕСЕ21, з комплексом КІ В/ЕСЕКІс. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-
ЕСЕМІ, представлене в даному описі, відноситься до антитіла, що не блокує активність та/або зв'язування нативних лігандів ЕСЕ з рецептором ЕСЕ під час відсутності КІВ. Для прикладу, а не як обмеження, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-РОЕКІ1 за даним винаходом не блокує взаємодію нативних лігандів ЕСЕ з комплексом ЕСЕРБТ/КІГА та/або тільки ЕОЕК1І. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ, представлене в даному описі, відноситься до антитіла, що не блокує активність та/або зв'язування нативних лігандів
ЕСЕ з КІ В під час відсутності ЕСЕК1. Для прикладу, а не як обмеження, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ за даним винаходом не блокує взаємодію нативних лігандів ЕСЕ з комплексом ЕСЕКА/КІ В, комплексом ЕСЕК2сС/КІ В і/або комплексом ЕСЕРЕЗсС/КІ В.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕК1, наприклад, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕМК1з або його антигенсполучна частина, включає області важкого ланцюга та легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення даного винаходу повнорозмірний важкий ланцюг включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 ов, 91 95, 92 95, 93 9, 94 9, 95 90, 96 9, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮО МО: 129. У деяких варіантах здійснення даного винаходу повнорозмірний легкий ланцюг включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 ов, 91 95, 92 95, 93 9, 94 9, 95 90, 96 9, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮО МО: 131. У деяких варіантах здійснення даного винаходу повнорозмірний важкий ланцюг містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 129. У деяких варіантах здійснення даного винаходу повнорозмірний легкий ланцюг включає послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 131.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕК1, наприклад, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЗЕМК1с або його антигенсполучна частина, включає варіабельну область важкого ланцюга та варіабельну область легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення варіабельна область важкого ланцюга включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 Фо, 93 Уо, 94 95, 95 90, 96 У, 97 Уо, 98 95, 99 Фо або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮ МО: 128. У деяких варіантах здійснення варіабельна область легкого ланцюга включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 9о, 97 95, 98 95, 99 90 або 100 95
БО ідентична послідовності, представленої у З5ЕО ІО МО: 130. У деяких варіантах здійснення варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність амінокислот, представлену в ЗХЕО
ІЮ МО: 128. У деяких варіантах здійснення варіабельна область легкого ланцюга включає послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 130.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КіВ/анти-РОЕКІ1 містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК, вибраних із (а) НМЕ-НІ, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 1-15, наприклад, 12 або 15; (Б)
НМУВ-Н2, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО: 16-31, наприклад, 28 або 31; (с) НМА-НЗ, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з
ЗЕО ІЮО МО: 32-47, наприклад, 44 або 47; (4) НМАК-11, яка містить будь-яку амінокислотну 60 послідовність, вибрану з 5ЕО ІЮ МО: 48-62, наприклад, 49 або 62; (є) НМЕ-1 2, яка містить будь-
яку амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІО МО: 63-78, наприклад, 75 або 78; і () НМЕ-
І З, яка містить будь-яку амінокислотну послідовність, вибрану з БЗЕО ІЮ МО: 79-93, наприклад, 90 або 93.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕК1, наприклад, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕСЕК1с, містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК, вибраних із (а) НМК-НІ, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 12; (Б) НМЕ-Н2, яка містить БЕО ІЮО МО: 28; (с) НМА-НЗ, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 44; (4) НМАК-1І1, яка містить 5ЕО ІЮ
МО: 49; (е) НУМВ-12, яка містить 5ЕО ІО МО: 75; і () НМЕ-1І3, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 90. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує анти-КІ В антитіло, що містить, щонайменше, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних із (а) НМЕ-НІ, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 15; (б) НУВ-Н2, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 31; (с) НУВ-НЗ, яка містить послідовність ЗЕО ІЮ МО: 47; (4)
НМВА-Ї11, яка містить ЗЕО ІО МО: 62; (є) НМА-12, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 78; і () НМА-І3, яка містить зЕО ІЮ МО: 93.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіло, наприклад, біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕСЕК1с антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга, що містить домени СОКІ, СОК2 і СОКЗ, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домени СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ. У деяких варіантах здійснення домен СОК1 варіабельної області важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 1-15. У деяких варіантах здійснення домен СОМК2 варіабельної області важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 16-31. У деяких варіантах здійснення домен СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 9о, 97 95, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентична послідовності ЗЕО І МО: 32-47. У деяких варіантах здійснення домен СОК1 варіабельної області легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 зо, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮ МО: 48-62. У деяких варіантах здійснення домен СОК2 варіабельної області легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 95, 93 9, 94 95, 95 95, 96 90, 97 90, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності ФЕО 10
МО: 63-78. У деяких варіантах здійснення домен СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 Фо, 93 о, 94 95, 95 Ор, 96 95, 97 Фо, 98 оо, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮ МО: 79-93.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕК1, наприклад, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1с, включає варіабельну область важкого ланцюга, що містить домени СОКІ, СОК2 і СОКЗ, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домени СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ. У деяких варіантах здійснення домен СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 1-15. У деяких варіантах здійснення домен СОМК2 варіабельної області важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16-31. У деяких варіантах здійснення домен СОМКЗ варіабельної області важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 32-47. У деяких варіантах здійснення домен СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 48- 62. У деяких варіантах здійснення домен СОКа2 варіабельної області легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 63-78. У деяких варіантах здійснення домен СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 79-93.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕК1, наприклад, біспецифічне антитіло анти-КіІ В/анти-ЗЕКІс, включає домен СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, представлену в 5ЕО І МО: 15; домен СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 31; домен СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, представлену в ЗХЕО
ІЮ МО: 47; домен СОКІ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 62; домен СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, представлену в ЗЕО І МО: 78; і домен СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 93.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕСЕКІ1 включає перше антитіло або його антигенсполучну частину, і включає друге антитіло або його антигенсполучну частину, де перше антитіло або його антигенсполучна частина зв'язується з епітопом, присутнім на КІ В, а друге антитіло або його антигенсполучна частина зв'язується з епітопом, присутнім на
ЕСЕ, наприклад, на ЕСЕКІ1с. Для прикладу, а не як обмеження, перше антитіло або його бо антигенсполучна частина може включати варіабельну область важкого ланцюга та варіабельну область легкого ланцюга; і друге антитіло або його антигенсполучна частина може включати варіабельну область важкого ланцюга та варіабельну область легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення варіабельна область важкого ланцюга першого антитіла або його антигенсполучної частини включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 95, 91 95, 9295, 9395, 94 95, 95 96, 96 96, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮ МО: 128. У деяких варіантах здійснення даного винаходу варіабельна область легкого ланцюга першого антитіла або його антигенсполучної частини включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 У, 93 Фо, 94 Уо, 95 95, 96 95, 97 ЗУ», 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у БЕО ІЮО МО: 130. У деяких варіантах здійснення варіабельна область важкого ланцюга другого антитіла або його антигенсполучної частини включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 95, 91 95, 9295, 9395, 94 95, 95 96, 96 96, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮ МО: 132. У деяких варіантах здійснення даного винаходу варіабельна область легкого ланцюга другого антитіла або його антигенсполучної частини включає амінокислоти, послідовність яких, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 У, 93 Фо, 94 Уо, 95 95, 96 95, 97 ЗУ», 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у 5ЕО ІЮ МО: 134.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-КІ В антитіло, передбачене в даному описі. Наприклад, у деяких варіантах здійснення передбачено, що біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-КІ В антитіло, яке містить послідовність МН з БЕО ІЮ МО: 128, і послідовність МІ з 5ЕО ІЮО МО: 130. У деяких варіантах здійснення передбачене біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ, яке зв'язується з фрагментом КІВ, що складається з амінокислотної послідовності ХЗЗРТКГАМІРУУЄУККІГЕМЛ/ККМУООМОІМІ ТАБ (5ЕО ІО МО: 142).
У деяких варіантах здійснення передбачене біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-РСЕВІ1, яке зв'язується з фрагментом КІ В з амінокислотною послідовністю, що, щонайменше, на 90 95, 91 95, 9295, 9395, 94 95, 95 96, 96 96, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у БЕО ІО МО: 142.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-КІ В антитіло, передбачене в даному описі. Наприклад, у деяких
Зо варіантах здійснення передбачено, що біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-КІ В антитіло, яке містить повнорозмірний важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 129 і повнорозмірний легкий ланцюг з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 131.
У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає біспецифічне антитіло анти-
КІ В/анти-ЕОЕКІ, яке зв'язується 3 тим самим епітопом, що й анти-ЕСЕКІ1 антитіло, представлене в даному описі. Наприклад, у деяких варіантах здійснення передбачено, що біспецифічне антитіло анти-КІіІ В/Ланти-ЕОЕКІ зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-
ЕСЕК'І антитіло, яке містить послідовність МН з БЕО ІЮО МО: 132 і послідовність МІ з БЕО ІЮ МО: 134. У деяких варіантах здійснення передбачено, що біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-
ЕОСЕКІ зв'язується з фрагментом послідовності БЕОЕКІс, що містить амінокислотну послідовність КІНАМРААКТУМКЕКСР (ЗЕО ІЮО МО: 143) або ЕКРОНКІССОУКМАКУ (5ЕО ІЮО МО: 144).
У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає біспецифічне антитіло анти-
КІ В/анти-ЕОЕКІ, яке зв'язується 3 тим самим епітопом, що й анти-ЕСЕКІ1 антитіло, представлене в даному описі. Наприклад, у деяких варіантах здійснення передбачено, що біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ зв'язується з тим самим епітопом, що й анти-
ЕСЕКІ антитіло, яке містить послідовність важкого ланцюга з ЗЕО ІЮ МО: 133 і послідовність легкого ланцюга з БЕО ІЮ МО: МО: 135.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КіІ В/анти-ЕОЕКІ! за даним винаходом зв'язується з фрагментом ЕСЕКІс, що має амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 9о, 97 95, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮ МО: 143.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ! за даним винаходом зв'язується з фрагментом ЕСОЕКІс, що має амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 9о, 97 95, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у ЗЕО ІЮО МО: 144.
У деяких варіантах здійснення передбачене біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-РСЕВІ1, яке зв'язується з фрагментом КІВ, що має амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 90 9, 91 95, 92 95, 93 9, 94 9, 95 90, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентична послідовності, представленої у 5БЕО ІО МО: 142, і зв'язується з фрагментом ЕСЕКІТс, що має амінокислотну 60 послідовність, яка, щонайменше, на 90 95, 91 Фо, 92 95, 93 Фо, 94 95, 95 Фо, 96 Ус, 97 Фо, 98 95, 99 Уо або 100 95 ідентична послідовності, представленої у БЕО ІЮ МО: 143 або 144.
У деяких варіантах здійснення передбачене біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-РСЕВІ1, яке зв'язується з фрагментом КІВ, що має амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ
МО: 142, і зв'язується 3 фрагментом ЕСЕКІс, що має амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 143 або 144. 1. Афінність антитіла
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може мати константу дисоціації (Ко) «1 М, х 100 мМ, «х 10 мм, х 1 мМ, х 100 мкМ, х 10 мкМ, х 1 мкм, х 100 нм, « 1О НМ, «1 НМ, х 0,1 нМ, х 0,01 нм або х 0,001 нМ. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може мати Ка приблизно 103 або менше, або 108 М або менше, наприклад, від 10 М до 10-33 М, наприклад, від 109М до 10-13 М.
У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ може включати плече анти-РОЕМКІ1, що має Ка приблизно від 10 нМ до 10 мкМ. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 з плечем ЕСЕК'І, що має низьку афінність, може знизити ризик міцного зв'язування біспецифічного анти-КІ В/анти-ЕОЕК1 антитіла з ЕОЕКІ1 під час відсутності КІ В і ризик запобігання зв'язування й/або активації ЕСЕКІ1 з іншими лігандами
ЕСЕ, такими як ЕОЕ1, БОБ2, БОЕ8 і РОБЕ23, але не обмежуючись ними. У деяких варіантах здійснення плече ЕСЕМКІ1 з низькою афінністю уможливлює присутність більше високих рівнів домішок анти-РОЕКІ1, включаючи, але не обмежуючись ними, половину анти-ЕСЕМКІ1 антитіла, що несе виступ, нековалентні димери анти-ЕОЕКІ!, ковалентні димери анти-РОЕКІ1 і високомолекулярні варіанти, які не призводять до клінічно значимих побічних ефектів.
Наприклад, у деяких варіантах здійснення у препараті біспецифічного анти-КІіІ В/анти-гСЕВІ1 антитіла за даним винаходом можуть бути присутніми приблизно 2 96 високомолекулярних антитіл і 1,595 половин анти-ЕСОЕКІ! антитіл, що несуть виступ, не призводячи до несприятливих біологічних ефектів.
У деяких варіантах здійснення Ка може бути виміряна за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно міченого антигена (КІА). У деяких варіантах здійснення КІА може бути виконаний з
Еаб-версією антитіла, що цікавить, і його антигеном. Для прикладу, а не як обмеження, визначення афінності зв'язування Раб з антигеном роблять за допомогою врівноважування Бар з мінімальною концентрацією (129І)-міченого антигена у присутності серійних розведень неміченого антигена з наступним захопленням зв'язаного антигена на планшеті, покритому анти-бар антитілом (дивися, наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. ВіоІ. 293:865-881(1999)). Для створення умов аналізу багатоямкові планшети МІСКОТІТЕК? (Тпепто 5сіепіййс) покривали протягом ночі антитілом захоплення анти-бар у концентрації 5 мкг/мл (Сарреї! Гарз5) в 50 мМ розчині карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокували 2 95 (вага/об'єм) розчином бичачого сироваткового альбуміну в РВ5 протягом двох-п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). У неадсорбуючому планшеті (Мипс Ж 269620) змішували 100 пМ або 26 пмМ
Г2Ц-антигена з серійними розведеннями Раб, що цікавить (наприклад, відповідно до оцінки для анти-МЕСЕ антитіла, Рар-12, у Ргевзіа еї аіІ., Сапсег Вез. 57:4593-4599 (1997)). Раб, що цікавить, потім інкубували протягом ночі; проте, інкубування можна продовжувати протягом більше тривалого періоду (наприклад, близько 65 годин), щоб гарантувати досягнення стану рівноваги.
Після цього суміші переносили на планшет захоплення для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляли і планшет промивали вісім разів 0,1 95 полісорбатом 20 (ТМ/ЕЕМ-202) у РВ5. Після висихання планшетів у кожну ямку вносили по 150 мкл сцинтилятора (МІСКО5ЗСІМТ-20"М; РасКагі) й аналізували планшети на гамма- лічильнику ТОРСОШМТ"М (РасКага) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Раб, які давали 2095 від максимального зв'язування або менше, були відібрані для аналізу конкурентного зв'язування.
У деяких варіантах здійснення Ка може бути виміряна за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансного ВІАСОКЕ?Я. Для прикладу, а не як обмеження, аналіз із використанням ВІАСОКЕО-2000 або ВІАСОКЕ-3000 (Віасоге, Іпс., Різсагаулау, МУ) проводять при температурі 25 "С на чипах з іммобілізованим антигеном СМ5 при « 10 одиницях відгуку (КУ). У деяких варіантах здійснення карбоксиметиловані декстранові біосенсорні чипи (СМ5,
Віасоге, Іпс.) активують М-етил-М' (З-диметиламінопропіл) карбодімідом (ЕОС) і М- гідроксисукцинімідом (МН) відповідно до інструкцій виробника. Антиген розбавляють 10 мМ розчином ацетату натрію, рН 4,8, до концентрації 5 мкг/мл (- 0,2 мкМ) перед ін'єкцією при швидкості потоку 5 мкл/хв до досягнення приблизно 10 одиниць відгуку (КИ) зв'язаного білка.
Після ін'єкції для блокування непрореагувавших груп антигена ін'єктують 1 М етаноламін. Для вимірів кінетики дворазові серійні розведення Раб (від 0,78 нМ до 500 нМ) ін'єктують у РВ5 з 60 0,05 95 поверхнево-активної речовини полісорбату 20 (ТМ/ЕЕМ-207М) (РВ5Т) при 25" зі швидкістю потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Кол) та швидкості дисоціації (Кок) обчислюють за допомогою простої моделі зв'язування Ленгмюра один до одного (ВІАСОКЕ?
Емаїнайоп Боїймаге мегзіоп 3.2) шляхом одночасної апроксимації сенсограм асоціації та дисоціації. Рівноважна константа дисоціації (Ка) може бути обчислена як відношення Ков/Коп.
Див, наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881 (1999). Якщо за даними поверхневого плазмонного резонансного швидкість асоціації перевищує 106 М'"с", то швидкість асоціації може бути визначена за допомогою методу гасіння флюоресценції, що вимірює збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флуоресценції (порушення - 295 нм; емісія - 340 нм, смуга пропущення 16 нм) при 25 "С від 20 нМ анти-антиген антитіла (форма Раб) у РВ5, рн 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигена, які вимірюють на спектрометрі, такому як спектрометр зупиненого потоку (Амім Іпзігитепів) або спектрофотометр 5І/М-АМІМСО"М 8000 серії (Ппептпозресігопіс) з кюветою, яку перемішують. 2. Фрагменти антитіл
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіл включають, без обмеження, фрагменти Раб, Раб", Рар-ЗН, Е(аб"»,
Ем і зсЕм, а також інші фрагменти, описані нижче. Для огляду деяких фрагментів антитіл див.
Ниазоп єї аї. Маї. Меа. 9:129-134 (2003). Для огляду фрагментів 5сСЕм див., наприклад, Рінскіпйп, іп Те РІНаптасоїоду ої Мопосіопа! Апііродіє5, мо!Ї. 113, Возеприга апа Мооге єдв., (Зргіпдег-
Мепад, Мем Могк), рр. 269-315 (1994); див. також УМО 93/16185; і патенти США МоМо 5571894 і 5587458. Для огляду Бар і Е(ар)»-фрагментів, що містять залишковий епітоп зв'язування рецептора та збільшений час напіввиведення іп мімо, див. патент США Мо 5,869,046.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може бути діантитілом.
Діантитіла є фрагментами антитіл із двома антигенсполучними ділянками, які можуть бути бівалентними або біспецифічними. Див., ЕР 404,097; М/О 1993/01161; Нидзоп еї аї., Маї. Меа. 97129-134 (2003); і Ноїїїпдег єї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90: 6444-6448 (1993). Триантитіла та тетраантитіла також описані в Ниазоп еї аї!., Маї. Мед. 9:129-134 (2003).
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може являти собою однодоменне антитіло. Однодоменні антитіла є фрагментами антитіл, які містять повний варіабельний домен важкого ланцюга або його частину, або повний варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або його частину. У деяких варіантах здійснення однодоменне антитіло є людським однодоменним антитілом (Юотапії5, Іпс., УуУакйат, МА; див., напрмер, патент США Мо 6,248,516 ВІ).
Фрагменти антитіл можуть бути отримані різними методами, включаючи протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також одержання з рекомбінантних клітин-хазяїнів (наприклад, Е.соїї або фагу), як розкрито в даному описі, але не обмежуючись цим. 3. Химерні та гуманізовані антитіла
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє собою химерне антитіло.
Певні химерні антитіла описані, наприклад, у патенті США Мо 4816567; і Моїтізоп еї аї., Ргос.
Май. Асад. сі. ОБА, 81:6851-6855 (1984)). У деяких варіантах здійснення химерне антитіло за даним винаходом містить варіабельну область, відмінну від людської (наприклад, варіабельну область, отриману від миші, пацюка, хом'яка, кролика або примата, що не є людиною, такого як мавпа), і людську константну область. У ще одному прикладі химерне антитіло може бути антитілом "переключеного класу", в якому клас або підклас був змінений у порівнянні з вихідним антитілом. Химерні антитіла включають їх антигенсполучні фрагменти.
У деяких варіантах здійснення химерне антитіло за даним винаходом може являти собою гуманізоване антитіло. Як правило, антитіло, відмінне від людського, гуманізують для зниження імуногенності для людини, зберігаючи при цьому специфічність й афінність вихідного, відмінного від людського, антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або декілька варіабельних доменів, у яких НУК, наприклад, СОК (або їх частини), отримані з відмінного від людського антитіла, і ЕК (або їх частини) отримані з послідовностей людського антитіла.
Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити, щонайменше, частину людської константної області. У деяких варіантах здійснення деякі залишки ЕК гуманізованого антитіла заміщені відповідними залишками з відмінного від людського антитіла (наприклад, антитіла, з якого отримані залишки НУК), наприклад, для відновлення або поліпшення специфічності або афінності антитіла.
Гуманізовані антитіла та способи їх одержання розглядаються, наприклад, в АІтадго апа
Егапззоп, Егопі. Віовзсі. 13:1619-1633 (2008), і далі описані, напрмер, в Ніесптапп еї аї., Майшге 332:323-329 (1988); Оцевеп еї аї., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патенти США
МоМо 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 і 7,087,409; Казптітгі єї аї!., Меїйоа5 36:25-34 (2005) (опис 60 перестановки визначаючих специфічність областей (5ОН)); Радіап, Мої. Іттипої. 28:489-498
(1991) (опис "заміни поверхні"); ОаІгАсдпца еї аї., Меїйподв 36:43-60 (2005) (опис "перестановки
ЕВ"); ї О5Бошт еї аї., Меїйподз» 36:61-68 (2005) і КіїтКа еї аї., Вг. 9). Сапсег, 83:252-260 (2000) (опис підходу "спрямованої селекції" при перестановці ЕР).
Людські каркасні області, які можуть бути використані для гуманізації, включають, без обмеження, каркасні області, вибрані методом "найкращої відповідності" (див., наприклад, біт еї а. 9. Іттипої. 151:2296 (1993)); каркасні області, отримані з консенсусної послідовності людських антитіл певної підгрупи варіабельних областей легкого або важкого ланцюгів (див., наприклад, Сапег еї аІ. Ргос. Май). Асад. сі. ОБА, 89:4285 (1992); і Ргезіа евї аї. 9. Іттипої., 151:2623 (1993)); зрілі людські (соматично мутовані) каркасні області або людські каркасні області зародкової лінії (див., наприклад, АІтадго апа Егапб55оп, Егопі. Віовсі. 13:1619-1633 (2008)); і каркасні області, отримані шляхом скринінгу бібліотек ЕВ (див, наприклад, Васа 6ї аї.,
У. ВіоІ. Спет. 272:10678-10684 (1997) і Возок еї аї., 9. Віої. Снет. 271:22611-22618 (1996)). 4. Людські антитіла
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може являти собою людське антитіло. Людські антитіла можуть бути отримані з використанням різних способів, відомих в даній області техніки. Людські антитіла в цілому описані мап ріїкК апа мап де М/іпкеї, Сигг. Оріп.
Ріаптасої. 5: 368-74 (2001) і опрего, Ситт. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Людські антитіла можуть бути отримані шляхом введення імуногена трансгенній тварині, який був модифікований для одержання інтактних людських антитіл або інтактних антитіл з людськими варіабельними областями у відповідь на введення антигена. Такі тварини, як правило, містять весь локус людського імуноглобуліну або його частину, які заміняють ендогенні локуси імуноглобулінів або які присутні екстрахромосомно або інтегровані випадковим чином у хромосоми тварини. У таких трансгенних мишей ендогенні локуси імуноглобулінів, як правило, інактивують. Для огляду способів одержання людських антитіл із трансгенних тварин див.
Гопрего, Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Див. також, наприклад, патенти США МоМо 6075181 і 6150584, що описують технологію ХЕМОМОИБЗЕ"М; патент США Ме 5770429, що описує технологію НИОМАВУ; патент США Ме 7041870, що описує технологію К-М МОИЗ5Е?, й опубліковану патентну заявку США Мо 5 2007/0061900, що описує технологію
МЕГОСІМОИШ5Е?. Людські варіабельні області інтактних антитіл, отримані від таких тварин, можуть бути додатково модифіковані, наприклад, шляхом об'єднання з іншою людською константною областю.
Людські антитіла також можуть бути отримані методами гібридом. Були описані клітинні лінії мієломи людини та гетеромієломи миші-людини для одержання моноклональних людських антитіл. (Див, наприклад, Ко2рог у). Іттипої., 133: 3001 (1984); Вгодейг еї аї., Мопосіопаї
Апііроду Ргодисіп Тесппіднез5 апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (Магсеї! ОеккКетг, Іпс., Мем Могк, 1987); і
Воєттег вї аї., У. Іттипої!., 147: 86 (1991).) Людські антитіла, отримані методом гібридоми В- клітин людини, також описані в Її еї аїЇ., Ргос. Май. Асай. осі. ОБА, 103:3557-3562 (2006).
Додаткові способи включають способи, описані, наприклад, у патенті США Мо 7,189,826 (опис одержання моноклональних людських антитіл ІМ із гібридомних клітинних ліній) і в Мі, Хіапоаї
Міапуїхне, 26(4):265-268 (2006) (опис гібридом людини-людини). Технологія людської гібридоми (триомна технологія) також описана у МоїІтеге апа Вгапаїєїп, Нізіоіоду апа Нівіораїпо!оду, 29(3):927-937 (2005) і МоПтегз апа Вгапаїєїп, Меїнодз апа Ріпаіпдо5 іп Ехрегітепіа! апа Сііпіса)
Рпаптасоїіоду, 27(3):185-91 (2005).
Людські антитіла також можуть бути отримані шляхом виділення клонів послідовності Ем варіабельного домена, вибраних із бібліотек фагового дисплея людського походження. Такі послідовності варіабельного домена можна потім об'єднати з бажаною людською константною областю. Способи відбору людських антитіл з бібліотек антитіл описані нижче. 5. Антитіла, отримані з бібліотек
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути виділені шляхом скринінгу комбінаторних
БО бібліотек для відбору антитіл з бажаною активністю або активностями. Наприклад, в даній області відомі різні способи одержання бібліотек фагового дисплея та скринінгу таких бібліотек на наявність антитіл, що мають бажані характеристики зв'язування. Такі способи розглянуті, наприклад, в Ноодепроо т еї аїЇ. в Меїйпод35 іп Моїесціаг Віоіоду 178:1-37 (О'Віїєп єї а)!., єд., Нитап
Рге55, Тоїомжма, МУ, 2001) і додатково розкриті, наприклад, в МоСайегу еї аї., Майте 348:552-554; СІасквбоп еї аї., Майте 352: 624-628 (1991); Магкз еї аї., У. Мої. Віоі. 222: 581-597 (1992); Магк5 апа Вгадригу, Метод іп МоїІесшаг Віоіоду 248:161-175 (І о, єд., Нитап Ргез5, Тоїбула, МУ, 2003); зіани еї аї., у. Мої. Віої. 338(2): 299-310 (2004); І єе еї аї., У. Мої. Вісі. 340(5): 1073-1093 (2004);
ЕейПоизе, Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 101(34): 12467-12472 (2004); і І ее евї аї., у. Іттипої. Меїйовд5 284(1-2): 119-132 (2004). бо У деяких способах фагового дисплея репертуари генів МН і Мі клонують окремо за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСВ) і рекомбінують випадковим чином у фагових бібліотеках, які потім можуть бути піддані скринінгу на антигенсполучний фаг, як описано у
М/іпіег єї аї., Апп. Неу. Іттипої., 12: 433-455 (1994). Фаг зазвичай містить фрагменти антитіл у вигляді одноланцюгових Ем (зсЕм) фрагментів або у вигляді Рар-фрагментів. Бібліотеки з імунізованих джерел дозволяють одержати антитіла з високої афінністю до імуногена без необхідності створення гібридом. Як альтернатива, можна клонувати наївний репертуар (наприклад, людини), щоб забезпечити єдине джерело антитіл до широкого спектра чужорідних, а також власних антигенів без якої-небудь імунізації, як описано в Сстініїне5 єї а!І., ЕМВО /, 12: 725-734 (1993). У деяких варіантах здійснення наївні бібліотеки можуть також бути зроблені синтетично шляхом клонування сегментів неперебудованих У-генів зі стовбурових клітин, а також з використанням праймерів для РСВ, що містять випадкову послідовність для кодування високоваріабельних областей СОВЗ і здійснення перегрупування іп й, як описано
Ноодепроот апа МУіпіег, У. Мої. Віо!., 227: 381-388 (1992). Патентні публікації, що описують фагові бібліотеки людських антитіл, включають, наприклад, патент США Мо 5750373 і патентні публікації США МоМо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 і 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек людських антитіл, вважаються людськими антитілами або фрагментами людських антитіл в даному описі. 6. Мультиспецифічні антитіла
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може являти собою мультиспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Мультиспецифічні антитіла являють собою моноклональні антитіла, які мають специфічність зв'язування у відношенні, щонайменше, двох різних епітопів. У деяких варіантах здійснення однією зі специфічностей зв'язування є епітоп, присутній на КІВ, а іншою - епітоп на будь-якому іншому антигені. У деяких варіантах здійснення однією зі специфічностей зв'язування є епітоп, присутній на
ЕСЕМКІ, а іншою - епітоп на будь-якому іншому антигені. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло за даним винаходом може зв'язуватися з епітопом КІВ і може зв'язуватися з епітопом ЕСЕКТІ. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло за даним винаходом може зв'язуватися з епітопом КІВ і може зв'язуватися з епітопом ЕСЕК1с.
Зо Біспецифічні антитіла можуть бути отримані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.
Способи одержання мультиспецифічних антитіл включають, без обмеження, рекомбінантну коекспресію двох пар важкого ланцюга та легкого ланцюга імуноглобуліну, що мають різні специфічності (див. Міїбїєїп апа Спцеїо, Маїшге 305: 537 (1983)), ММО 93/08829, і Тгаипескег еї аї.,
ЕМВО 3. 10: 3655 (1991), і конструювання "виступ-в-западину" (дивися, наприклад, патент США
Мо 5731168). Мультиспецифічні антитіла можуть бути також отримані шляхом створення електростатичних напрямних ефектів для одержання Ес-гетеродимерних молекул антитіл (М/О 2009/089004А1); зшивання двох або більше антитіл або їхніх фрагментів (див., наприклад, патент США Мо 4676980 й Вгеппап еї а!., Зсіепсе, 229: 81 (1985)); з використанням лейцинових блискавок для одержання біспецифічних антитіл (див., наприклад, КовіеїІпу еї аї.,»У. Іттипої., 148(5):1547-1553 (1992)); за допомогою технології "діантитіл" для одержання фрагментів біспецифічних антитіл (див., наприклад, Ноїйпдег єї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 90:6444-6448 (1993)); і з використанням одноланцюгових димерів Ем (5Ем) (див., наприклад, Огибег еї аї.,.
Іттипої., 152:5368 (1994)); і одержання триспецифічних антитіл, як це описано, наприклад, в
Ти еїаї. У. Іттипої. 147:60 (1991).
Сконструйовані антитіла з трьома або більше функціональними антигенсполучними ділянками, включаючи антитіла-«восьминоги", також включені в даний опис (див., наприклад, 5 2006/0025576А1). 7. Варіанти антитіл
Даний опис додатково передбачає варіанти амінокислотних послідовностей розкритих антитіл. Наприклад, може бути бажаним поліпшення афінності зв'язування й/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можуть бути отримані шляхом внесення відповідних модифікацій у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу. Такі модифікації включають делеції та/або вставки і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла, але не обмежуються ними. Для одержання кінцевої конструкції може бути зроблена будь-яка комбінація делецій, вставок і замін, за умови, що кінцеве антитіло, тобто модифіковане антитіло, має необхідні характеристики, наприклад, відносно зв'язування антигена. а) Варіанти, що містять заміну, вставку та делецію 60 У деяких варіантах здійснення варіанти антитіл можуть мати одну або декілька амінокислотних замін. Ділянки, що представляють інтерес для мутагенезу шляхом введення замін, включають НМЕК і ЕК. Необмежуючі приклади консервативних замін показані в Таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Необмежуючі приклади більше істотних змін представлені в
Таблиці 1 під заголовком "приклади замін", і, як додатково описано нижче, заміни розділені відповідно до класу бічного ланцюга амінокислоти. Амінокислотні заміни можуть бути введені в антитіло, що цікавить, і продукти можуть бути піддані скринінгу на бажану активність, наприклад, що збереглася/лпосилене зв'язування антигена, зниження імуногенності або поліпшення комплемент-залежної цитотоксичності (СОС) або антитіло-залежної клітинно- опосередкованої цитотоксичності (АЮСС).
Таблиця 1 замін заміни
Ше() 71111111 (СешМа;МесАза; Ре, Норлейцин.//// Пе. цец(Ю 77711111 |НорлейциноМпе; Ма МесАв:Рйєїд Пе 77777771
Амінокислоти можуть бути згруповані відповідно до загальних властивостей бічного ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, Гей, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Суб, Зег, ТАг, Азп, Сп; (3) кислотні: Ар, СМ; (4) основні: Ні, Г ув, Ага; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Су, Рго; (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.
У деяких варіантах здійснення неконсервативні заміни означають заміну представника одного з цих класів на представника з іншого класу.
У деяких варіантах здійснення один із варіантів введення замін включає заміщення одного або декількох залишків гіперваріабельної області вихідного антитіла, наприклад, гуманізованого або людського антитіла. Як правило, отриманий варіант (отримані варіанти), що відбирають для подальшого дослідження, характеризується зміненими, наприклад, поліпшеними певними біологічними властивостями, такими як, наприклад, підвищена афінність, знижена імуногенність, у порівнянні з вихідним антитілом і/або по суті зберігають деякі біологічні властивості вихідного антитіла. Необмежуючим прикладом варіанта із заміною є антитіло зі зрілою афінністю, що зручно одержувати, наприклад, з використанням способів дозрівання афінності на основі фагового дисплея, таких як способи, які представлені в даному описі.
Коротко, один або декілька залишків НУК мутують та варіанти антитіла піддають скринінгу з використанням фагового дисплея для виявлення конкретної біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування).
У деяких варіантах здійснення зміни (наприклад, заміни) можуть бути введені в НМК, наприклад, для поліпшення афінності антитіла. Такі зміни можуть бути введені в "гарячі точки"
НМЕ, тобто за амінокислотними залишками, що кодуються кодонами, які піддаються мутаціям з високою частотою в ході процесу соматичного дозрівання (див., наприклад, СпомаПпигу, Метоав5
МОЇ. Вісі. 207:179-196 (2008)), і/або залишкам, які контактують з антигеном, і отримані варіанти
МН або МІ. можуть бути проаналізовані на афінність зв'язування. Дозрівання афінності шляхом конструювання та повторного відбору з вторинних бібліотек описано, наприклад, в Ноодепроот еї а). іп Меїнодз5 іп Моїесшціаг Віоіосду 178:1-37 (О"Віеп еї аї., єд., Нитап Ргез5, Тоїоула,. М, (2001)). У деяких варіантах дозрівання афінності множина варіантів послідовності різних генів, вибраних для дозрівання, може бути отримане за допомогою будь-якого з множини способів (наприклад, ПЛР із помилками, перетасування ділянок ланцюга або олігонуклеотид- направленного мутагенезу). Потім створюється вторинна бібліотека. Далі цю бібліотеку скринують для ідентифікації будь-яких варіантів антитіл з бажаною афінністю. Інший спосіб одержання множини варіантів послідовності включає НМК-спрямовані підходи, в яких рандомізують декілька залишків НУК (наприклад, 4-6 залишків за один раз). Залишки НМК, залучені у зв'язування з антигеном, можуть бути ідентифіковані, наприклад, з використанням аланін-скануючого мутагенезу або моделювання. СОК-НЗ і СОБ-ІЗ3, зокрема, часто стають мішенню мутагенезу.
У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції можуть бути введені в одну або декілька НМК за умови, що зміни не призведуть до істотного зниження здатності антитіла зв'язувати антиген. Наприклад, в НМ можуть бути введені консервативні зміни (наприклад, консервативні заміни, як це передбачено в даному описі), які істотно не знижують афінність зв'язування. Такі зміни, наприклад, можуть бути введені поза контактуючих з антигеном залишків в НМЕ. У деяких варіантах послідовностей МН і Мі, зазначених вище, кожна НМК або залишається незмінною, або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
Корисний спосіб ідентифікації залишків або областей антитіла, які можуть бути використані для мутагенезу, називається "аланін-скануючий мутагенез", як описано в Сиппіпдпат апа УмеїЇ5 (1989) бсіепсе, 244:1081-1085. У цьому способі залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі як Агу, Авр, Ніб, Губ5 ії Сім) ідентифікують та заміняють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном), щоб визначити, чи впливає залишок або група залишків на взаємодію антитіла з
Зо антигеном. У місця розташування амінокислот, що проявляють функціональну чутливість до початкових замін, можуть бути введені додаткові заміни. Як альтернатива або додатково, кристалічна структура комплексу антиген-антитіло може бути використана для ідентифікації точок контакту між антитілом й антигеном. Такі контактні залишки та сусідні залишки можуть бути вибрані для мутагенезу або виключені з кандидатів на проведення мутагенезу. Варіанти можуть бути піддані скринінгу, щоб визначити, чи мають вони бажані властивості.
Вставки амінокислотних послідовностей включають злиті з аміно- і/або карбокси-кінцем поліпептиди довжиною від одного залишку до ста або більше залишків, а також вставки всередину послідовності одного або множини амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим залишком метіоніну. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають злиття М- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, для антитіло- спрямованої ферментативної пролікарської терапії (АОЕРТ)) або поліпептидом, що збільшує час напіввиведення антитіла в сироватці.
Юр) Варіанти глікозилування
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може бути змінене для збільшення або зменшення ступеня його глікозилування. Додавання або видалення ділянок глікозилування до антитіла може бути легко досягнуте шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, щоб ввести або видалити одну або декілька ділянок глікозилування.
У деяких варіантах здійснення, де антитіло містить Ес-область, може бути змінений приєднаний до нього вуглеводний фрагмент. Нативні антитіла, які продукуються клітинами ссавців, зазвичай містять розгалужений, двогілчастий олігосахарид, який, як правило, прикріплений через М-зв'язок до А5п297 в СН2-домені Ес-області. Див., наприклад, Мугідні еї аї.
ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, маннозу, М- ацетил-глюкозамін (СІСМАс), галактозу і сіалову кислоту, а також фукозу, прикріплену до СІСМАс в "основі" двогілчастої структури олігосахариду. У деяких варіантах здійснення модифікації олігосахаридів антитіла за даним винаходом можуть бути здійснені для створення варіантів антитіл з певними поліпшеними властивостями.
У деяких варіантах здійснення передбачені варіанти антитіл з вуглеводною структурою, в якій відсутня прикріплена до області Ес фукоза (прямо або побічно). Наприклад, кількість фукози в таких антитілах може становити від приблизно 1 95 до приблизно 80 95, від приблизно 60 195 до приблизно 65 95, від приблизно 5956 до приблизно 65 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 40 95, включаючи проміжні значення.
У деяких варіантах здійснення кількість фукози може бути визначена шляхом обчислення середньої кількості фукози у вуглеводному ланцюзі при А5зп297 стосовно суми всіх вуглеводних структур, прикріплених до Ап 297 (наприклад, складні, гібридні структури та структури з високим вмістом маннози), що визначається методом мас-спектрометрії МАГСОІ-ТОРЕ, як, наприклад, описано у публікації М/О 2008/077546. А5п297 відноситься до залишку аспарагіну, розташованому приблизно у положенні 297 в області Ес (Ем нумерація залишків області Ес); проте, Аб5п297 також може бути розташований на відстані 5 З амінокислот до або після положення 297, тобто між позиціями 294 і 300, через незначні варіації послідовності антитіл.
Такі варіанти фукозилування можуть мати поліпшену функцію АОСС. Див., наприклад, патентні публікації США 5 2003/0157108 (Ргевіа, І); 2004/0093621 (Куоша НакКо Кодуо Со., ЦО).
Приклади публікацій, що відносяться до "дефукозилованих" або "фукоза-дефіцитних" варіантів антитіл, включають ОЗ 2003/0157108; УМО 2000/61739; УМО 2001/29246; 05 2003/0115614; 5 2002/0164328; 05 2004/0093621; 05 2004/0132140; 005 2004/0110704; 05 2004/0110282; 5 2004/0109865; УМО 2003/085119; МО 2003/084570; УМО 2005/035586; УМО 2005/035778;
МО2005/053742; МО2002/031140; ОкКалакі єї аЇ. У. Мої. Віої. 336:1239-1249 (2004); Матапе-
ОПпикі єї а!. Віоїесі. Віоепд. 87: 614 (2004).
Дефукозиловані антитіла можуть бути отримані у будь-якій клітинній лінії, що є дефіцитною за білком фукозилування. Не обмежуючі приклади клітинних ліній включають клітини Іес13
СНО, дефіцитні за білком фукозилування (КірКа еї аїЇ. Агсй. Віоспет. Віорпу5. 249:533-545 (1986); заявка США 05 2003/0157108 А1, Ргезіа, І; ії УМО 2004/056312 А1, Адатз еї аї., особливо
Приклад 11) ї нокаутні клітинні лінії, такі як клітини СНО з нокаутом гена альфа-1,6- фукозилтрансферази, РОТ8 (див., наприклад, Матапе-ОНпикі еї аї. Віоїеси. Віоепд. 87: 614 (2004); Капаа, У. еї а!., Віоїєснпо!. Віоєпо., 94(4):680-688 (2006); і МУО2003/085107).
Також передбачені варіанти антитіл із двогілчастими олігосахаридами, наприклад, у яких двогілчастий олігосахарид, приєднаний до області Ес антитіла, ділиться на дві частини за допомогою (ІСМАс. Такі варіанти антитіл можуть мати знижене фукозилування та/або поліпшену функцію АЮСС. Не обмежуючі приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, у заявці М/О 2003/011878 (Чеап-Маїгей( еї аїІ.); патенті США 6,602,684 (Штапа єї а); ії 05
Зо 2005/0123546 (тапа єї аІ.). Також передбачені варіанти антитіл, щонайменше, з одним залишком галактози в олігосахариді, прикріпленому до Ес-області. Такі варіанти антитіл можуть мати поліпшену функцію СОС. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, у УМО 1997/30087 (Рагеї ег а); УМО 1998/58964 (Каїсй, 5.) і УМО 1999/22764 (Каїц, 5.). с) Варіанти області Ес
У деяких варіантах здійснення в область Ес антитіла, представленого в даному описі, можуть бути введені одна або декілька модифікацій амінокислот, що веде до створення варіанта області Ес. Варіант області Ес може містити людську послідовність області Ес (наприклад, людських областей Ес ІдСс1, ІдС2, Ід4с3 або Ідш24), що містить амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну) в одному або декількох положеннях амінокислот.
У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує варіант антитіла, що має деякі, але не всі ефекторні функції, що робить його бажаним кандидатом для тих застосувань, де період напіввиведення антитіла іп мімо є важливим, але деякі ефекторні функції (такі як комплемент й
АОСС) не є потрібними або корисними. Для підтвердження зменшення/усунення активності
СОС й/"або АОСС може бути проведений аналіз цитотоксичності іп міго й/або іп мімо. Наприклад, щоб гарантувати, що антитіло не має зв'язування Есук (отже, швидше за все, не має активності
АОСС), але при цьому зберігає активність зв'язування ЕсКп, може бути проведений аналіз зв'язування рецептора Ес (Ес). Первинні клітини для опосередкування АЮОСС, МК-клітини, експресують тільки ЕсСУКІЇ, тоді як моноцити експресують ЕСУКІ, ЕСУКІ! і ЕсуКІ. Експресія Ес у гемопоетичних клітинах наведена в Таблиці З на сторінці 464 в Камеїсі апа Кіпеї, Аппи. Кем.
Іттипої. 9:457-492 (1991). Не обмежуючі приклади аналізів іп міго для оцінки активності АЛОСС молекули, що представляє інтерес, описані у патенті США Мо 5500362 (див., наприклад,
Неїївігот, І. єї а). Ргос. Маї! Асайд. сі. ОБА 83:7059-7063 (1986)) і НеїЇвтот, І еї аї., Ргос. Маї!
Асад. 5сі. ОБА 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (див. Вгиддетапп, М. еї аї., у). Ехр. Мед. 166:1351- 1361 (1987)). Як альтернатива, можуть бути використані нерадіоактивні методи аналізу (див., наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІМ для проточної цитометрії (Сеї
Тесппоіоду, Іпс. Мошпіаїп Мієму, Каліфорнія); і нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СУТОТОХ 962 (Ріотеда, Маадізоп, Вісконсін). Підходящі ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і натуральні кілери (МК). Як альтернатива або додатково, активність АОСС молекули, що представляє інтерес, може бути оцінена іп мімо, 60 наприклад, у моделі на тваринах, такій як модель, описана в Сіупез5 еї аї. Ргос. Маг! Асай. 5бі.
ИБА 95:652-656 (1998). Для підтвердження відсутності здатності антитіла зв'язувати С14 і, отже, відсутності активності СОС також можуть бути виконані аналізи зв'язування С1д. Див., наприклад, аналіз зв'язування С1д і СЗс методом ЕГІЗА у УМО 2006/029879 і УМО 2005/100402.
Для оцінки активації комплементу може бути виконаний контроль СОС (див., наприклад, Сіахлапо-Запіого єї аї., У. Іттипої. Мештоав5 202:163 (1996); Стадчо, М.5. єї а!., Віоса 101:1045- 1052 (2003); і Стад9, М.5. апа М.9. Сіеппіє, Віоса 103:2738-2743 (2004)). Аналіз зв'язування ЕсАп і визначення кліренсу/напіввиведення іп мімо також можуть бути виконані з використанням способів, відомих в даній області (див., наприклад Реїкома, 5.В. єї аї., Іл. Іттипої. 18(12):71759- 1769 (2006)). У деяких варіантах здійснення у Ес-область можуть бути введені зміни, які призводять до зміни (тобто або посилення, або ослаблення) зв'язування С14 і/або комплемент- залежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано у патенті США Мо 6,194,551, УМО 99/51642, і Ідиводіє єї аї. У. Іттипої. 164: 4178-4184 (2000).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла із заміною одного або декількох залишків, вибраних із залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 в області Ес (патент
США Мо 6737056). Такі Рс-мутанти включають Ес-мутанти із замінами у двох або більше амінокислотних положеннях, вибраних із 265, 269, 270, 297 і 327, у тому числі так званий "САМА" Ес-мутант із заміною залишків 265 і 297 на аланін (патент США Ме 7332581).
Описані деякі варіанти антитіл з посиленим або ослабленим зв'язуванням з Ес. Див., наприклад, патент США Мо 6737056; УМО 2004/056312 і ЗПпівїа5 еї аї.,». Віої. Спет. 9(2): 6591- 6604 (2001).
У деяких варіантах здійснення варіант антитіла за даним винаходом включає область Ес з однією або декількома амінокислотними замінами, які поліпшують АОСС, наприклад, замінами у положеннях 298, 333 і/або 334 в області Ес (нумерація залишків ЕМО).
У деяких варіантах здійснення зміна, внесена в область Ес антитіла, наприклад, біспецифічного антитіла, представленого в даному описі, може зробити варіант антитіла зі збільшеним періодом напіввиведення та поліпшеним зв'язуванням з неонатальним рецептором
Ес (РсВп), що відповідає за перенос материнських (ДС до плода (Сиуег єї аї., У. Іттипої. 117:587 (1976) і Кіт еї аї., У. Іттипої. 24:249 (1994)), як описано в О52005/0014934А1 (Ніпіоп єї аІ.). Ці антитіла містять область Ес з однією або декількома замінами, які поліпшують зв'язування області Ес з ЕсВАп. Такі варіанти Ес включають заміни за одним або декількома із залишків області Ес, вибраних із залишків 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміну залишку 434 в області Ес (патент США Мо 7371826).
Див. також Юипсап 8 М/іпіег, Машге 322:738-40 (1988); патент США Мо 5648260; патент США
Мо 5624821; і МО 94/29351, що стосуються інших прикладів варіантів області Ес. а) Варіанти антитіл з уведеним залишком цистеїну
У деяких варіантах здійснення може бути бажано створити варіанти антитіл з уведеним цистеїном, наприклад, "ШіоМАБ", у яких один або декілька залишків антитіла заміщені залишками цистеїну. У конкретних варіантах здійснення заміщені залишки зустрічаються в доступних ділянках антитіла. При заміні цих залишків цистеїном активні тіольні групи, таким чином, виявляються розташованими в доступних місцях антитіла та можуть бути використані для кон'югації антитіла з іншими групами, такими як молекули лікарського засобу або лінкерні ділянки лікарського засобу, для створення імунокон'югату, як описано далі в даному описі. У деяких варіантах здійснення один або декілька з наступних залишків можуть бути замінені цистеїном: М205 (нумерація Караї) легкого ланцюга; А118 (нумерація Е)3) важкого ланцюга; і 5400 (нумерація Е)) важкого ланцюга області Ес. Антитіла з уведеним цистеїном можуть бути отримані, як описано, наприклад, у патенті США Ко 7,521,541. е) Похідні антитіл
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом може бути додатково модифіковане для включення в нього додаткових небілкових фрагментів, які відомі в даній області та легко доступні. Фрагменти, що підходять для одержання похідних антитіла, включають водорозчинні полімери, але не обмежуються ними. Необмежуючі приклади водорозчинних полімерів включають поліетиленгліколь (РЕС), співполімери етиленгліколя/ пропіленгліколя, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полікристалічний 1,3,6-триоксан, етилен/ малеїновий ангідрид, поліамінокислоти (або гомополімери, або статистичні співполімери), декстран або полі (М- вінілпіролідон) поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколя, співполімери пропіленоксиду/ етиленоксиду, поліоксіетиловані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт та їх суміші, але не обмежуються перерахованими вище. Поліетиленглікольпропіональдегід може мати 60 переваги у виробництві через його стабільність у воді. Полімер може бути будь-якої молекулярної маси і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, приєднаних до антитіла, може варіювати, і, якщо приєднано більше одного полімеру, то вони можуть бути однаковими або різними молекулами. У цілому, кількість та/або тип полімерів, які використовують для одержання похідних, можуть бути визначені на основі міркувань, що включають, без обмеження, конкретні властивості або функції антитіла, які будуть поліпшені, можливість застосування похідної антитіла в терапії за певних умов тощо.
У деяких варіантах здійснення передбачені кон'югати антитіла та небілкового фрагмента, які можуть бути селективно нагріті при впливі випромінювання. В одному варіанті здійснення небілковий фрагмент являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат еї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 102: 11600-11605 (2005)). У деяких варіантах здійснення випромінювання може бути будь-якої довжини хвилі та включає, без обмеження, довжини хвиль, які не ушкоджують звичайні клітини, але які нагрівають небілюовий фрагмент до температури, при якій найближчі до антитіл- небілкового фрагменту клітини гинуть. р. Способи одержання антитіл
Антитіла, представлені в даному описі, можуть бути отримані з використанням будь-якого підходу, доступного або відомого в даній області техніки. Як приклад, але не як обмеження, антитіла можуть бути отримані з використанням рекомбінантних способів і композицій, наприклад, як описано у патенті США Мо 4816567. Процедури одержання антитіл докладно описані у наведених нижче прикладах.
У даному описі додатково передбачена виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло, розкрите в даному описі. Наприклад, виділена нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що включає Мі, і/або амінокислотну послідовність, що включає МН антитіла, наприклад, легкі та/або важкі ланцюги антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу виділена нуклеїнова кислота може включати нуклеотидну послідовність, що кодує послідовність амінокислот варіабельної області важкого ланцюга, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 128, і/або нуклеотидну послідовність, що кодує послідовність амінокислот варіабельної області легкого ланцюга, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 130.
У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота може бути присутньою в одному або більше векторах, наприклад, в експресійних векторах. Використовуваний в даному описі термін
Зо "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Одним із типів векторів є "плазміда", що відноситься до кільцевої дволанцюгової петлі ДНК, в яку можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, у якому додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в якій вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний сайт ініціації реплікації й епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неєепісомальні вектори ссавців) інтегруються в геном клітини-хазяїна при введенні в клітину-хазяїна, і в такий спосіб реплікуються разом з геномом хазяїна. Більше того, деякі вектори, експресійні вектори, здатні регулювати експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані У загальному випадку, експресійні вектори, які використовують в методах рекомбінантних ДНК, часто перебувають у вигляді плазмід (векторів). Проте, розкритий предмет винаходу призначений для включення й інших форм експресійних векторів, таких як вірусні вектори (наприклад, дефектні за реплікацією ретровіруси, аденовіруси й адено-асоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції.
У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за даним винаходом й/"або один або декілька векторів, що включають нуклеїнові кислоти, можуть бути введені у клітину-хазяїна. У деяких варіантах здійснення введення нуклеїнової кислоти в клітину може бути здійснене будь-яким способом, відомим в даній області, включаючи, але не обмежуючись трансфекцією, електропорацією, мікроін'єкцією, інфекцією вірусним вектором або вектором бактеріофагу, що містить послідовності нуклеїнових кислот, злиттям клітин, хромосома- опосередкованим переносом генів, опосередкованим мікроклітинами переносом генів, злиттям сферопластов тощо. У деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн може включати, наприклад, бути трансформованою: (1) вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, і амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла, або (2) першим вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, і другим вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла. У деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн є еукаріотичною клітиною, наприклад, клітиною яєчника китайського хом'ячка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, клітини МО, МБО, ЗР20).
У деяких варіантах здійснення способи одержання анти-КІВ або анти-РСОЕКІ1с антитіла 60 можуть включати культивування клітини-хазяїна, в яку була введена нуклеїнова кислота, яка
Зо кодує антитіло, в умовах, що підходять для експресії антитіла, і, необов'язково, виділення антитіла з клітини-хазяїна та/або з середовища для культивування клітин. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло витягають з клітини-хазяїна за допомогою хроматографічних способів.
Для одержання рекомбінантного антитіла за даним винаходом нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло, наприклад, як це описано вище, може бути виділена та вставлена в один або декілька векторів для подальшого клонування й/або експресії в клітині-хазяїні. Така нуклеїнова кислота може бути легко виділена та відсеквенована з використанням загальноприйнятих способів (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла).
Підходящі клітини-хазяїни для клонування або експресії векторів, які кодують антитіло, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, представлені в даному описі. Наприклад, антитіла можуть бути отримані у бактеріях, зокрема, коли глікозилування й ефекторні функції Ес не є потрібними. Для експресії фрагментів антитіл і поліпептидів у бактеріях див., наприклад, патенти США МоМо 5,648,237, 5,789,199 і 5,840,523. (Див. також Спапоп, МеїШтоаз іп МоїІесшаг
Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. Іо, єд., Нитапа Ргез5, Тоїоула, МУ, 2003), рр. 245-254, що описують експресію фрагментів антитіл в Е.соїї.) Після експресії антитіло може бути виділене з клітинної бактеріальної маси в розчинній фракції та може бути додатково очищено.
Крім прокаріот підходящими клонуючими або експресуючими хазяїнами для векторів, що кодують антитіло, є еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі, у тому числі гриби та штами дріжджів, у яких шляхи глікозилування були "гуманізовані", що дозволяє одержувати антитіла з частково або повністю людським характером глікозилування. Див.
Сегпдгов5, Маї. Віотесп. 22:1409-1414 (2004), і Ії єї а!., Маї. Віоїєсн. 24:210-215 (2006). Підходящі клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла можуть бути також отримані з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Була ідентифікована множина бакуловірусних штамів, які можуть бути використані в сполученні з клітинами комах, зокрема, для трансфекції клітин зЗродоріега Ігидірегаа.
Підходящі клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла також одержують з
Зо багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Була ідентифікована множина бакуловірусних штамів, які можуть бути використані в сполученні з клітинами комах, зокрема, для трансфекції клітин зЗродоріега Ігидірегаа.
У деяких варіантах здійснення як клітини-хазяїни можуть бути використані культури рослинних клітин. Див., наприклад, патенти США МоМо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 і 6417429 (опис технології РІ АМТІВООСІЕ5"М для одержання антитіл у трансгенних рослинах).
У деяких варіантах здійснення як хазяїни також можуть бути використані клітини хребетних.
Для прикладу, а не як обмеження, можуть бути використані клітинні лінії ссавців, які адаптовані до росту в суспензії. Необмежуючі приклади використовуваних ліній клітин-хазяїнів ссавців включають лінії клітин нирки мавпи СМІ1, трансформовані 5М40 (СО5-7); клітини ембріональної нирки людини (293 або клітини 293, як описано, наприклад, в Ссгапат еї аї., У. Сеп МігоїЇ. 36:59 (1977); клітини нирки дитинчати хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (клітини ТМА, як описано, наприклад, в Майег, Віо!І. Кергод. 23:243-251 (1980)); клітини нирок мавпи (СМІ1); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини пацюка лінії Вийаю (ВЕ ЗА); клітини легенів людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТЕ, описані, наприклад, в МаїНег еї аї., АппаїЇ5 М.У. Асад. 5сі. 383:44-68 (1982); клітини
МЕС5, а також клітини Е54. Інші корисні лінії клітин-хазяїнів ссавців включають лінії клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи клітини ОНЕК СНО, див. ОпПасиб еї аї., Ргос.
Май. Асад. сі. ОБА 77:4216 (1980)); і клітинні лінії мієломи, такі як МО, М5О і 5р2/0. Для огляду деяких ліній клітин-хазяїнів ссавців, придатних для продукування антитіл, див., наприклад,
Магакі апа Ми, Меїйнод3з іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. І о, вєд., Нитапа Ргев5, Тоїоула, МУ), рр. 255-268 (2003).
У деяких варіантах здійснення способи одержання біспецифічних і/або мультиспецифічних антитіл включають рекомбінантну коекспресію двох пар важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглобуліну, що мають різні специфічності (див. Міїєїтеіїп апа СиєПо, Маїште 305: 537 (1983), патентну заявку РСТ УМО 93/08829 і ТгапесКег ін, ЕМВО .. 10:. 3655 (1991)), і інженерії методом "виступ-в-западину" (див., наприклад, патент США Мо 5731168), але не обмежуються ними.
Біспецифічні антитіла також можуть бути отримані шляхом створення напрямних бо електростатичних ефектів для створення Есо-гетеродимерних молекул антитіл (УМО
2009/089004А1); зшивання двох або більше антитіл або їхніх фрагментів (див., наприклад, патент США Мо 4676980, і Вгеппап еї а!., Зсієпсе, 229: 81 (1985)); з використанням лейцинової блискавки для одержання біспецифічних антитіл (див., наприклад, КовіеїІпу еї аї.,»У. Іттипої., 148(5):1547-1553 (1992)); за допомогою технології "діантитіла" для одержання фрагментів біспецифічних антитіл (див., наприклад, Ноїйпдег єї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 90:6444-6448 (1993)); і з використанням димерів одноланцюгових Ем (5Ем) (див., наприклад, Огибег еї аї., ».
Іттипої!., 152:5368 (1994)); також можуть бути отримані триспецифічні антитіла, як це описано, наприклад, в Тий еї аї. У. Іттипої!. 147:60 (1991).
Біспецифічні та мультиспецифічні молекули даного винаходу також можуть бути отримані з використанням хімічних методів (див., наприклад, Ктгап7 (1981) Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 78:5807), за допомогою технології "полідоми" (див., наприклад, патент США 4474893), або рекомбінантних ДНК. Біспецифічні та мультиспецифічні молекули, розкриті в даному описі, також можуть бути отримані шляхом кон'югації складової специфічності зв'язування, наприклад, специфічності зв'язування першого епітопу та другого епітопу, з використанням способів, які відомі в даній області та представлені в даному описі. Для прикладу, а не як обмеження, кожна специфічність зв'язування біспецифічної та мультиспецифічної молекули може бути отримана окремо та потім кон'югована з іншою. Якщо специфічність зв'язування опосередкована білком або пептидом, то можуть бути використані різноманітні агенти для сполучення або агенти, що зшивають, для ковалентної кон'югації. Необмежуючі приклади агентів, що зшивають, включають білок А, карбодіїмід, М-сукцинімідил-5-ацетил-тіосацетат (5АТА), М-сукцинімідил-3-(2- піридилдитіо) пропіонат (5ЗРОР) і сульфосукцинімідил 4-(М-малеімідометил) циклогексан-1- карбонову кислоту (сульфо-ЗМСС) (див., наприклад, Кагроу5Ку (1984) 3. Ехр. Мед. 160:1686; І ім (1985) Ргос. Маї!. Асай. сі. ОБА 82:8648). Інші способи включають способи, які описані Рашив (Вепгіпу Іп5. Мій. (1985) Мо. 78, 118-132; Вгеппап (1985) бсіеєпсе 229:81-83), Сіеппів (1987) 9.
Ітітипої. 139: 2367-2375). Якщо специфічності зв'язування опосередковані антитілами (наприклад, двома гуманізованими антитілами), вони можуть бути кон'юговані через сульфгідрильний зв'язок між С-кінцевими шарнірними областями двох важких ланцюгів. У деяких варіантах здійснення винаходу шарнірна область може бути модифікована, щоб містити непарне число сульфгідрильних залишків, наприклад, по одному сульфгідрильному залишку, до
Зо кон'югування.
У деяких варіантах здійснення обидві специфічності зв'язування біспецифічного антитіла можуть бути закодовані в одному векторі й експресовані та зібрані в одній клітині-хазяїні. Цей спосіб особливо зручний у використанні, коли біспецифічна та мультиспецифічна молекула є злитим білююм МАБ х МАБ, МАБ х Раб, Раб х Р(ар")»2 або ліганд х Раб. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло за даним винаходом може бути одноланцюговою молекулою, такою як одноланцюгове біспецифічне антитіло, одноланцюговою біспецифічною молекулою, що містить один ланцюг антитіла та детермінанту зв'язування, або одноланцюговою біспецифічною молекулою, що містить дві детермінанти зв'язування. Біспецифічні та мультиспецифічні молекули можуть бути також одноланцюговими молекулами або можуть містити, щонайменше, два окремі ланцюги в молекулі. Способи одержання бі- та мультиспецифічних молекул описані, наприклад, у патенті США Мо 5,260,203; патенті США Мо 5455030; патенті США Мо 4881175; патенті США Мо 5132405; патенті США Мо 5091513; патенті
США Мо 5476786; патенті США Мо 5013653; патенті США Мо 5258498; і у патенті США Мо 5482858. Штучно створені антитіла з трьома або більше функціональними антигенсполучними ділянками (наприклад, ділянками зв'язування епітопу), включаючи антитіла-«восьминоги", також включені в даний опис (див., наприклад, 5 2006/0025576А1).
Даний винахід також передбачає триспецифічні, наприклад, трифункціональні, антитіла. Для прикладу, а не як обмеження, триспецифічне антитіло за даним винаходом може зв'язуватися та/або взаємодіяти з епітопом, присутнім на КІ В, епітопом, присутнім на ЕОЕКТ, і епітопом або антигеном, присутнім на третьому білку, включаючи, але не обмежуючись ними, РОСБ5КОУ, СОСОК,
Адіро, 2п8, Арої, М5ТМ, Іп5 або ЕАВРА.
У деяких варіантах здійснення для одержання антитіла за даним винаходом може бути використана система, в якій застосовуються тварини. Одна така система, в якій для одержання гібридом застосовуються тварини, є мишачою системою. Одержання гібридом у миші є дуже добре відпрацьованою процедурою. Протоколи імунізації та способи виділення імунізованих спленоцитів для злиття відомі в даній області. Партнери для злиття (наприклад, клітини мишачої мієломи) та процедури злиття також відомі (див., наприклад, Нагіоуг апа І апе (1988),
Апіїродієв, А І арогаїгу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагтог І арогаїогу Рге55, Соїй 5ргіпд Наїбог Мем
ХО). бо Е. Аналізи
Антитіла згідно з даним винаходом, представлені в даному описі, можуть бути ідентифіковані, проскриновані або охарактеризовані за фізичними/ хімічними властивостями та/або біологічною активністю за допомогою різних аналізів, відомих в даній області техніки та наведених в даному описі. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом можна тестувати на його активність зв'язування антигена відомими способами, такими як твердофазний імуноферментний аналіз (ЕІ І5А), радиоімуноаналіз (КІА) або вестерн-блот аналіз. Кожний з цих аналізів, як правило, виявляє присутність комплексів білок-антитіло, що цікавлять, шляхом використання міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного для комплексу, що представляє інтерес. Наприклад, комплекси антитіло-КІ В можуть бути виявлені, наприклад, з використанням зшитого з ферментом антитіла або фрагменту антитіла, які розпізнають та специфічно зв'язуються з комплексом антитіло-КІ В. Як альтернатива, комплекси можуть бути виявлені за допомогою будь-якого з множини інших імунологічних аналізів. Наприклад, антитіло може бути радіоактивно позначене та використане в радиоімуноаналізі (КІА) (див., наприклад,
МУвіпігтацр, В., Ріїпсіріе5 ої Вадіоїттипоаззау5, Земепій Тгаіпіпд Соцшгве оп Вадіоїїдапа Авззау
Тесппідние5, Тпе Епдосгіпе Зосіеїу, Магсп, 1986, де документ включений за допомогою посилання в даний опис). Радіоактивний ізотоп може бути виявлений за допомогою таких засобів, як лічильник Гейгера або сцинтиляційний лічильник або за допомогою авторадіографії.
У деяких варіантах здійснення для ідентифікації антитіла, що конкурує з антитілом анти-КІ В за даним винаходом, наприклад, 12А11 або 8С5, за зв'язування з КІ В, можуть бути використані конкурентні аналізи. У деяких варіантах здійснення таке конкуруюче антитіло зв'язується з тим самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), що зв'язує 12А11 або 8С5.
Докладні приклади способів виявлення епітопу, з яким зв'язується антитіло, представлені в
Могтіз (1996) "Ерйкоре Марріпд Ргоїосої5, " іп Мефоавз іп МоїІесшіаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргезв,
Тоюуа, М).
У необмежуючому прикладі конкурентного аналізу, іммобілізований КІ В можна інкубувати у розчині, що містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з КІ В (наприклад, 12А11 або 8С5), і друге не мічене антитіло, яке піддається перевірці на його здатність конкурувати з першим
Зо антитілом за зв'язування з КІ В. Друге антитіло може бути присутнім у супернатанті гібридоми.
Як контроль іммобілізований КІ В інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, але не друге не мічене антитіло. Після інкубації в умовах, що роблять можливим зв'язування першого антитіла з КІВ, надлишок незв'язаного антитіла видаляють та вимірюють кількість мітки, пов'язаної з іммобілізованим КІВ. Якщо кількість мітки, що відповідає іммобілізованому КІ В, істотно знижується в тестованому зразку у порівнянні з контрольним зразком, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з КІВ. Див. Напомжм апа Іапе (1988) Апіібодієв: А І абогаюгу Мапиаї! сп.14 (Сода брііпд Нагброг І абогаюгу, Соїд 5ргіпа Нагтог,
МУ). 2. Аналізи активності
Даний винахід передбачає аналізи для виявлення анти-КІ В антитіл, що мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, активацію рецепторного комплексу
КІ В/РЕЕВс. Також передбачені антитіла, що мають таку біологічну активність іп мімо й/або іп міго. У деяких варіантах здійснення даного винаходу аналізи можуть включати зв'язування антитіл за даним винаходом з клітинами, наприклад, клітинами 293Т, які експресують КІВ, і аналіз активності та/лабо стану фосфорилювання однієї або декількох наступних мішеней рецепторного комплексу КІ В-ЕСЕКІ1с, наприклад, ЕКК. У деяких варіантах здійснення даного винаходу аналіз може включати введення антитіла за даним винаходом суб'єкту, наприклад, відмінній від людини тварині, і аналіз впливу антитіла на рівень глюкози в суб'єкта.
Е. Імунокон'югати
У даному описі додатково передбачені імунокон'югати, що містять антитіло, розкрите в даному описі, кон'юговане з одним або декількома цитотоксичними агентами, такими як хіміотерапевтичні засоби або лікарські засоби, інгібуючі ріст агенти, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження або їхні фрагменти), або радіоактивні ізотопи. Наприклад, антитіло або його антигенсполучна ділянка згідно з даним винаходом можуть бути функціонально зв'язані (наприклад, шляхом хімічного зв'язування, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з одним або декількома іншими сполучними молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або міметик зв'язування.
У деяких варіантах здійснення імунокон'югат являє собою кон'югат антитіло-лікарський засіб бо (АБС), у якому антитіло кон'югують з одним або декількома лікарськими засобами, включаючи,
але не обмежуючись ними, мейтансиноїд (див. патенти США МоМо 5,208,020, 5,416,064 й європейський патент ЕР 0 425 235); ауристатин, такий як фрагменти монометилауристатину ОЕ і ОЄ (ММАЕ і ММАБЕ) (див. патенти США МоМо 5,635,483, 5,780,588 і 7,498,298.); доластатин; каліхеаміцин або його похідні (див. патенти США МоМо 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 і 5,877,296; Ніптап еї аї., Сапсег Вев. 53:3336-3342 (1993); і І оде еї аї., Сапсег Рез. 58:2925-2928 (1998)); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (див. Кгаї»? евї аі!., Ситепі Мед. Сет. 13:477-523 (2006); Уентеєу еї аї!., Віоогдапіс 8
Мед. Спет. І ейегз 16:358-362 (2006); Тогдом вї а!., Віосоп). Спет. 16:717-721 (2005); Мааду евї аї.,
Ргос. Май. Асай. осі. ОБА 97:829-834 (2000); бБиром/снік еї аї., Віоогу. 5 Мед. Спет. І ецЦег5 12:1529-1532 (2002); Кіпа еї а!., У. Мед. Спет. 45:4336-4343 (2002); і патент США 6,630,579); метотрексат; віндезин; таксан, такий як доцетаксел, паклітаксел, лоротаксел, тесетаксел й ортатаксел; трихотецен і СС1065.
У деяких варіантах здійснення імунокон'югат містить антитіло, представлене в даному описі, кон'юговане з ферментативно активним токсином або його фрагментом, включаючи, але не обмежуючись ними, ланцюг А дифтерійного токсину, активні фрагменти дифтерійного токсину, що не зв'язуються, ланцюг А екзотоксину (із синегнійної палички), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, ланцюг модекцину, альфа-сарцин, білки АїІештіез огаїї, білки діантини, білки Рпуйїаса
Атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ї РАР-5), інгібітор з Мотогаїса сНагапійа, курцин, кротин, інгібітор з зЗараопагіа опісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени.
У деяких варіантах здійснення імунокон'югат містить антитіло, представлене в даному описі, кон'юговане з радіоактивним атомом з утворенням радіокон'югату. Множина радіоактивних ізотопів доступна для одержання радіокон'югатів. Необмежуючі приклади включають АЇг", 191, 25, Мо, Ве!86, Ве88, Зрптюз, Віг!2, рег, Ррг2 і радіоактивні ізотопи и. Якщо для виявлення використовується радіокон'югат, він може включати радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад, Тсо9т або 1123 або спінову мітку для ядерно-магнітної резонансної томографії (ММА) (також відомої як магнітно-резонансна томографія, МН), такі як йод-123, йод- 131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.
Кон'югати антитіла та цитотоксичного агента можуть бути отримані з використанням множини біфункціональних сполучаючих білки агентів, таких як М-сукцинімідил-3-(2-
Зо піридилдитіо) пропіонат (5РОР), сукцинімідил-4-(М-малеімідометил) циклогексан-1-карбоксилат (З5МОС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (наприклад, диметиладипімідат
НОЇ), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), біс-азидо сполуки (такі як біс (п-азидобензоїл) гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс (п-діазонійбензоїл) етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,6б-діїзоціанат) і біс-активні фторовані сполуки (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, імунотоксин рицину може бути отриманий, як описано у Міена еї аЇ., Зсіепсе 238:1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1- ізотіоціанатобензил-З3-метилдіетилентриамінопентаацетинова кислота (МХ-ОТРА) являє приклад хелатуючого агента для кон'югації радіонукліду з антитілом. Див. УМО94/11026. Лінкер може являти собою "лінкер, що розщеплюється", який полегшує вивільнення цитотоксичного лікарського засобу в клітині. Наприклад, можуть бути використані кислото-чутливий лінкер, чутливий до пептидази лінкер, фотолабільний лінкер, диметиловий лінкер або дисульфід- вмісний лінкер (Спагі еї аіІ., Сапсег Вев. 52:127-131 (1992); патент США Мо 5208020).
У даному описі імунокон'югати або АЮС спеціально включають, але не обмежуються кон'югатами, отриманими з використанням поперечно-зшиваючих реагентів, які включають, без обмеження, ВМР, ЕМО5, СМВ5, НВУЗ, І С-5МОС, МВ5, МРВН, 5ВАР, 5ІА, БІАВ, МОСС, 5МРВ,
ЗМРН, сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМИО5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-
ЗМСС, а також сульфо-5МРВ і 5М5В (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, від Ріегсе Віотесппо!оду, Іпс., Коскога, ІС., США).
І. Способи застосування
Даний опис також відноситься до способів застосування описаних антитіл, наприклад, біспецифічного анти-КІ В/анти-ЕОЗЕМК! антитіла. У деяких варіантах здійснення способи спрямовані на терапевтичне застосування розкритих в даному описі антитіл. У деяких варіантах здійснення способи спрямовані на застосування описаних антитіл у способах діагностики.
А. Способи діагностики та детекції
У деяких варіантах здійснення будь-яке антитіло, розкрите в даному описі, що має специфічність до КІ В, наприклад, анти-КІ В антитіло та/або біспецифічне анти-КІ В/анти-РС ЕВ антитіло, розкриті вище, може бути корисне для виявлення КІ В у біологічному зразку. В іншому своєму аспекті даний опис відноситься до способів діагностики та/або детекції захворювання із застосуванням анти-КЇВ антитіла або біспецифічного анти-Кі В/анти-ЕОЕК1 антитіла, бо розкритих в даному описі. Термін "детекція" в даному описі включає кількісну й/або якісну детекцію.
У деяких необмежуючих варіантах здійснення біологічний зразок включає клінічний зразок, одну або декілька клітин, клітини в культурі, клітинні супернатанти, клітинні лізати та зразки тканини, але не обмежується ними. Джерелом зразка може бути тверда тканина (наприклад, зі свіжого, замороженого та/або консервованого органа, зразка тканини, біоптату або аспірату) або клітини індивідуума. У деяких варіантах здійснення біологічний зразок може включати одну або декілька клітин і/або тканину печінки, наприклад, з печінки суб'єкта.
У деяких варіантах здійснення передбачене анти-КІ В антитіло для застосування в способі діагностики або детекції. У ще одному аспекті передбачений спосіб детекції присутності КІВ у біологічному зразку. У деяких варіантах здійснення спосіб діагностики або детекції включає контактування біологічного зразка з антитілом, що зв'язує епітоп, присутній на КІ В, як розкрито в даному описі, в умовах, що допускають зв'язування антитіла з КІ В, і детекцію комплексу, що утворюється, антитіла та КІВ. Такий спосіб може являти собою спосіб іп мійго або іп мімо, наприклад, імунофлуоресцентний аналіз або вестерн-блоттинг. У деяких варіантах здійснення анти-КІ В антитіло використовують для відбору суб'єктів, яким може бути показана терапія анти-
КІВ антитілом, наприклад, де КІ В є біомаркером для відбору пацієнтів.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом, наприклад, біспецифічне анти-
КІ. В/анти-ЕОЕКІ антитіло, яке використовують в описаних способах, не робить істотного впливу на печінку, наприклад, на функції печінки. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не модулює активність рецепторного комплексу ЕСЕРУКІ В у печінці у порівнянні з модуляцією рецепторного комплексу ЕСЕК/КІ В у печінці білююм ЕСЕ21. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не призводить до інгібування комплексу ЕСЕКА/КІ В і або не призводить до підвищення рівнів печінкових ферментів, включаючи АЇТ, А5Т, АЇГР і
СІ ОН, але не обмежуючись ними. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не функціонує як агоніст комплексу ЕСЕК2с/КІ В і/або комплекси ЕСЕКЗсС/КІ В у печінці, що може призвести до активації сигналінгу МАРКО та/або зміненої експресії Зргу4 і бизрб у печінці.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не призводить до активації сигналінгу МАРКО у печінці у порівнянні з активацією сигналінгу МАРКО білком ЕСЕ21. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом не функціонує в якості агоніста комплексу
Зо ЕСЕКАУ/КІ В у печінці.
У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом, наприклад, біспецифічне анти-
КІ .В/анти-ОЕКІ антитіло для застосування в розкритих способах включає антитіла, які не блокують зв'язування та/або взаємодію лігандів ЕСЕ, наприклад, ЕСЕ19 і ЕСЕ21, з комплексом
КІВ/ЕОЕКІс. У деяких варіантах здійснення біспецифічне анти-КіІВ/анти-РОЕК1 антитіло, розкрите в даному описі, відноситься до антитіла, що модулює активність комплексу
КІ В/ЕОЕКІс і не блокує взаємодію та/або зв'язування нативних лігандів ЕСЕ, наприклад,
ЕСЕ19 і ЕСЕ21, з комплексом КІ В/ЕСЕМК1с. У деяких варіантах здійснення біспецифічне анти-
КІ. В/анти-РОЕКІ1 антитіло, розкрите в даному описі, відноситься до антитіла, що не блокує активність та/або зв'язування нативних лігандів ЕСЕ з рецептором ЕСЕ під час відсутності КІ В.
Для прикладу, а не як обмеження, біспецифічне анти-КіІ В/анти-ЕОЕКІ! антитіло за даним винаходом не блокує взаємодію нативних лігандів ЕСЕ з комплексом ЕСЕКТ/КГ А або тільки з
ЕСЕ. У деяких варіантах здійснення біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіло, розкрите в даному описі, відноситься до антитіла, що не блокує активність та/або зв'язування нативних лігандів ЕСЕ з білком КІВ під час відсутності ЕСЕКІ. Для прикладу, а не як обмеження, біспецифічне анти-КіІ В/Данти-ОЕКІ антитіло за даним винаходом не блокує взаємодію нативних лігандів ЕСЕ з комплексом ЕСЕКА/КІ В, комплексом ЕСЕРК2с/КІ В і/або комплексом
ЕеаЕВЗс/КІ В.
У деяких варіантах здійснення анти-КіІ В антитіла, анти-ЕОЕМ1с антитіла та/або біспецифічні анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ антитіла, наприклад, анти-КІ В/анти-ЕЗЕКІс, які використовують в
БО описаних способах, можуть бути позначені. Мітки включають, без обмеження, мітки або фрагменти, які детектуються безпосередньо, наприклад, флуоресцентні, хромофорні, електронно-щільні, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки, а також фрагменти, такі як ферменти або ліганди, які детектуються побічно, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярної взаємодії. Не обмежуючі приклади міток включають радіоізотопи З2Р, 140, 125І, ЗН, ії, флуорофори, такі як хелати рідкоземельних металів або флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люциферазу світлячка та бактеріальну люциферазу (див. патент США 4,737,456), люциферин, 2,3- дигідрофталазиндіони, пероксидазу хрону (НЕР), лужну фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази цукрів, наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу та бо глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу, оксидази гетероциклів, такі як уриказа та ксантиноксидаза, у сполученні з ферментом, що використовує пероксид водню для окислювання попередника барвника, такий як НЕР, лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/ авідин, спінові мітки, бактеріофагові мітки, стабільні вільні радикали, а також подібні ним мітки.
В. Способи лікування
У деяких варіантах здійснення одне або декілька антитіл, розкритих у даному описі, можуть бути використані для лікування захворювання та/або розладу в суб'єкта. Як приклад, а не обмеження, хвороба може бути порушенням обміну речовин. Необмежуючі приклади метаболічних розладів включають синдромом полікистозних яєчників (РСО5), метаболічний синдром (Мей), ожиріння, неалкогольний стеатогепатит (МАН), неалкогольну жирову хворобу печінки (МАРІО), гіперліпідемію, артеріальну гіпертензію, діабет 2 типу, діабет не 2 типу, діабет 1 типу, латентний аутоїмунний діабет (АБ) і діабет дорослого типу в молодих (МОЮ). У деяких варіантах здійснення даного винаходу метаболічним порушенням є діабет 2 типу. У деяких варіантах здійснення даного винаходу метаболічним порушенням є ожиріння.
У деяких варіантах здійснення одне або декілька антитіл, розкритих в даному описі, можуть бути використані для лікування синдрому Барде-Бідля, синдрому Прадера-Віллі, синдрому
Альстрема, синдрому Коена, спадкоємної остеодистрофії Олбрайта (псевдогіпопаратиреоїдизм), синдрому Карпентера, синдрому МОМО, синдрому Рубінштейна-
Тейбі, синдрому ламкої Х-хромосоми та синдрому Бьорьєсона-Форсмана-Лемана. У деяких варіантах здійснення одне або декілька антитіл, розкритих в даному описі, можуть бути використані для лікування старіння та пов'язаних з ним захворювань, таких як хвороба
Альцгеймера, хвороба Паркінсона й АЇ 5.
У деяких варіантах здійснення одне або декілька антитіл, розкритих в даному описі, можуть бути використані для лікування хвороби серця, інсульту, серцевих приступів, гіперінсулінемії, високого кров'яного тиску, захворювання коронарних судин серця, мігрені або головних болів, безпосередньо пов'язаних з ожирінням або черепною гіпертензією, застійної серцевої недостатності, новоутворень, дисліпідемії, анемії, хвороби жовчного міхура, остеоартриту, дегенеративного артриту, остеохондрозу, дегенеративного захворювання суглобів, при заміні суглобів, для лікування прискореного дегенеративного захворювання суглобів, астми, рецидивуючої пневмонії, рецидивуючого плевриту, рецидивуючого бронхіту, рестриктивного
Зо легеневого захворювання, гастроезофагеального рефлюкса (ГЕРБ), надлишку волосся на обличчі та тілі (гірсутизму), висипань, хронічних шкірних інфекцій, надлишкової пітливості, частих грибкових інфекцій, стресового нетримання сечі, нерегулярних менструацій, гормональних порушень, полікистозу яєчників, безплідності, раку (наприклад, раку молочної залози, товстої кишки та матки), апное в сні, ідіопатичної внутрішньочерепної гіпертензії, депресії, психологічної/ сексуальної дисфункції, соціальної дискримінації та передчасної смерті.
У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує антитіло для застосування в способі лікування. Для прикладу, а не як обмеження, даний винахід забезпечує антитіло, наприклад, біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕСЕМКІ1 антитіло, для застосування в способі лікування суб'єкта, що має порушення обміну речовин, наприклад, РСО5, Меї, ожиріння, МАЗН, МАРІО, гіперліпідемію, артеріальну гіпертензію, діабет 2 типу, діабету не 2 типу, діабет 1 типу, латентний ГАЮ, МООУ, а також, що перебуває в стані старіння та страждаючого пов'язаними з ним захворюваннями, такими як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона й АЇ5, який включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла, розкритого в даному описі. У деяких варіантах здійснення даний винахід забезпечує антитіло, наприклад, біспецифічне анти-
КІ В/анти-ЕСЕКІ антитіло, для застосування в способі лікування суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом, описаним вище, який включає введення індивідууму ефективної кількості зазначеного антитіла.
У деяких варіантах здійснення спосіб може додатково включати введення суб'єкту ефективної кількості, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента. Не обмежуючі приклади додаткових терапевтичних агентів, наприклад, другого терапевтичного агента, описані нижче.
У деяких варіантах здійснення даний винахід додатково відноситься до способу індукції втрати ваги, який включає введення індивідууму ефективної кількості одного або більше антитіл, запропонованих у даному винаході, наприклад, біспецифічного анти-КІ В/анти-РСЕН1 антитіла.
Терміни "індивідуум", "пацієнт" або "суб'єкт" які використовують в даному описі взаємозамінно, відносяться до ссавця. Ссавці включають, але не обмежуються ними, одомашнених тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак, коней), приматів (наприклад, людей і приматів, відмінних від людини, таких як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, мишей і бо пацюків). У деяких варіантах здійснення індивідуум або суб'єкт є людиною.
Даний опис додатково передбачає антитіло, наприклад, біспецифічне анти-КІ В/анти-СЕВ1 антитіло, для застосування в активації корецепторного комплексу КІ.В/ЕСЕКс, наприклад, у суб'єкта. Для прикладу, а не як обмеження, біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕСЕМК1 антитіло може бути біспецифічним анти-КІ В/анти-ЕОЕКІс антитілом. У деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає антитіло, наприклад, біспецифічне анти-КІі В/анти-ЕОЕКІ1 антитіло, для застосування в способі активації корецепторного комплексу КІ.В/РЕОЕКІ1с у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення даного винаходу спосіб включає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла для активації рецепторного комплексу КІ. В/ЕОЕК16.
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути застосовані в терапії або окремо, або в комбінації з іншими агентами. Для прикладу, а не як обмеження, антитіло за даним винаходом може бути введене спільно, щонайменше, з одним додатковим терапевтичним агентом. У деяких варіантах здійснення другий/ додатковий терапевтичний агент може включати антидіабетичний агент, агент, що запобігає ожирінню, або лікарський засіб для метаболічних захворювань, включаючи, але не обмежуючись ними, антигіпертензивні ліки та статини. Не обмежуючі приклади другого/ додаткового терапевтичного агента включають метформін, піоглітазон, ОРРА4Ї, аналоги СІ Р1, сульфонілсечовини, інсулін, аналоги лептину та лорказерин (наприклад, ВЕ МОЄ).
Даний винахід також відноситься до застосування антитіла, наприклад, біспецифічного анти-КІ В/анти-ЕСЕКІ1 антитіла, для виробництва або одержання лікарського засобу. У деяких варіантах здійснення даного винаходу лікарський препарат призначений для лікування порушень обміну речовин, як описано вище. У деяких варіантах здійснення даний винахід відноситься до застосування антитіла для виробництва лікарського засобу для лікування ожиріння. У деяких варіантах здійснення даний винахід відноситься до застосування антитіла для виробництва лікарського засобу для лікування діабету 2 типу. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як розкрито в даному описі. У деяких варіантах здійснення даного винаходу лікарський препарат призначений для активації корецепторного комплексу КІ В/ЕСОЕКІс. У деяких варіантах здійснення даного винаходу лікарський препарат може бути використаний у способі активації корецепторного комплексу
КІ. В/ЕОЕКІ1с в індивідуума, який включає введення індивідууму кількості лікарського засобу, ефективного для активації рецепторного комплексу КІ В/ЕСЕК1с.
У деяких варіантах здійснення антитіло для застосування в описаних способах лікування може бути присутнім у фармацевтичній композиції. У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична композиція може включати фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична композиція може включати одне або декілька антитіл за даним винаходом.
Додатково або альтернативно, фармацевтична композиція може включати другий терапевтичний агент. Коли одне або декілька з описаних антитіл вводять з іншим терапевтичним агентом, одне або декілька антитіл й інший терапевтичний агент можна вводити у будь-якому порядку або одночасно. Такі комбіновані терапії, згадані вище, охоплюють комбіноване введення (де два або декілька терапевтичних агентів включені в ту саму або в окремі лікарські форми), а також роздільне введення, і у цьому випадку введення антитіла за даним винаходом може відбуватися до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного агента або агентів. В одному варіанті здійснення час між введенням антитіла за даним винаходом і введенням додаткового терапевтичного агента становить приблизно один місяць, або приблизно один, два або три тижні, або приблизно один, два, три, чотири, п'ять або шість днів.
Антитіло за даним винаходом (і будь-який додатковий терапевтичний агент) можна вводити будь-якими підходящими способами, включаючи парентеральний, внутрішньолегеневий і назальний, і, якщо антитіло бажано застосовувати для місцевого лікування, можна використовувати внутрішньоосередкове введення. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревинне або підшкірне введення. Дозування може бути здійснене будь-яким підходящим способом, наприклад, за допомогою ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції, що частково залежить від того, чи є введення короткочасним або хронічним. У даному описі передбачені різні схеми дозування, включаючи, без обмеження, одне або декілька введень у різних часових точках, болюсне введення й імпульсну інфузію.
Антитіла згідно з даним винаходом будуть введені у фармацевтичну композицію, дозовані та введені відповідно до гарної медичної практики. Фактори, що підлягають розгляду в цьому бо контексті, включають конкретний розлад, що підлягає лікуванню, конкретного ссавця, що піддається лікуванню, клінічний стан окремого пацієнта, причину розладу, місце доставки агента, спосіб введення, схему введення та інші фактори, відомі практикуючим лікарям.
Антитіло необов'язково може бути введене у фармацевтичну композицію з одним або декількома агентами, які використовують в цей час для запобігання або лікування розглянутого розладу. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, яке присутнє у лікарській формі, типу розладу або лікування та інших факторів, описаних вище. Інші агенти, як правило, використовують у тих самих дозах і вводять тими самими шляхами, як розкрито в даному описі, або в дозах, які становлять приблизно від 1 до 99 95 від доз, розкритих в даному описі, або у будь-якому дозуванні та будь-якому способі, які були емпірично/ клінічно визначені як підходящі.
Для профілактики або лікування захворювання відповідне дозування антитіла за даним винаходом (при застосуванні окремо або в комбінації з одним або декількома іншими додатковими терапевтичними агентами) буде залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу антитіл, тяжкості та протікання захворювання, від того, вводять антитіло у профілактичних або терапевтичних цілях, від попередньої терапії, історії хвороби пацієнта та реакції на антитіло, а також думки лікаря. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом можна вводити в міру необхідності. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло може бути введене пацієнту один раз або декілька разів. Як приклад, але не як обмеження антитіло та/"або фармацевтичну лікарську форму, що містить антитіло, розкрите в даному описі, можна вводити суб'єкту два рази на день, один раз на день, один раз на два дні, один раз на три дні, один раз на чотири дні, один раз на п'ять днів, один раз на шість днів, один раз на тиждень, раз на два тижні, один раз на три тижні, один раз на місяць, раз на два місяці, один раз на три місяці, раз на півроку або раз на рік.
У деяких варіантах здійснення залежно від типу та тяжкості захворювання початкова передбачувана доза для введення пацієнту, наприклад, за допомогою одного або декількох окремих введень або шляхом безперервної інфузії може становити приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг антитіла (наприклад, 0,1 мг/кг-10 мг/кгу. Одна типова добова доза може варіювати від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше залежно від зазначених вище факторів. У деяких варіантах здійснення винаходу добова доза може бути більше, ніж приблизно 100 мг/кг. У
Зо деяких варіантах здійснення доза може бути відрегульована для досягнення концентрації антитіла у плазмі 1-1000 мкг/мл і, в деяких способах, для досягнення концентрації 25-300 мкг/мл.
У випадку повторного введення протягом декількох днів або більше залежно від стану лікування зазвичай може бути продовжене до бажаного придушення симптомів захворювання.
Приклад однієї дози антитіла буде перебувати в діапазоні від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. У деяких варіантах здійснення пацієнту можуть бути введені одна або декілька доз, що становлять приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-які їх комбінації). Як альтернатива, антитіло можна вводити у вигляді лікарської форми з уповільненим вивільненням, що потрібно вводити рідше. Дозування та частота може змінюватися залежно від часу напіввиведення антитіла в організмі пацієнта. У деяких варіантах здійснення такі дози можна вводити періодично, наприклад, щотижня або один раз на три тижні (наприклад, таким чином, що пацієнт одержує від двох до двадцяти, або, наприклад, приблизно шість доз антитіла). Може бути введена початкова більш висока навантажувальна доза, за якою слідує одна або декілька більш низьких доз.
У деяких варіантах здійснення спосіб може додатково включати моніторинг суб'єкта та визначення ефективності лікування. Наприклад, хід терапії можна легко контролювати за допомогою традиційних способів й аналізів.
ІМ. Фармацевтичні лікарські форми
У даному описі додатково передбачені фармацевтичні лікарські форми, які містять одне або декілька антитіл, як розкрито в даному описі, з фармацевтично прийнятним носієм. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції можуть включати комбінацію декількох (наприклад, двох або більше) антитіл й/або їх антигенсполучних частин, розкритих в даному описі. У деяких варіантах здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом може включати одне або декілька біспецифічних антитіл анти-КІ В/анти-ЕСЕНІ1.
У деяких варіантах здійснення розкриті фармацевтичні лікарські форми можуть бути отримані шляхом об'єднання антитіла, що має бажаний ступінь чистоти, з одним або декількома необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями (Кетіпдіоп'є РНаптасеціїса! Зсіепсе5 161 еайіоп, О5ої, А. Еа. (1980)), у формі ліофілізованих лікарських форм або водних розчинів.
Як приклад, але не як обмеження, ліофілізовані лікарські форми антитіл описані у патенті США 60 Мо 6,267,958. У деяких варіантах здійснення водні лікарські форми антитіл можуть включати лікарські форми, які описані у патенті США Мо 6,171,586 і УМО2006/044908, де останні лікарські форми включають гістидин-ацетатний буфер. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло може мати чистоту більше ніж приблизно 80 95, більше ніж приблизно 90 95, більше ніж приблизно 91 95, більше ніж приблизно 92 95, більше ніж приблизно 93 95, більше ніж приблизно 94 95, більше ніж приблизно 95 95, більше ніж приблизно 96 95, більше ніж приблизно 97 95, більше ніж приблизно 98 95, більше ніж приблизно 99 95, більше ніж приблизно 99,1 95, більше ніж приблизно 99,2 95, більше ніж приблизно 99,3 95, більше ніж приблизно 99,4 95, більше ніж приблизно 99,5 95, більше ніж приблизно 99,6 95, більше ніж приблизно 99,7 95, більше ніж приблизно 99,8 95 або більше ніж приблизно 99,9 95.
Фармацевтично прийнятні носії як правило, є нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах і концентраціях і включають, без обмеження, буфери, такі як фосфатний, цитратний буфер й інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як хлорид октадецилдиметилбензиламонію; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію; хлорид бензетонію; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3- пентанол і м-крезол); низькомолекулярні (приблизно менше 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, маннозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕЮОТА; цукри, такі як сахароза, манніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, 2п-білкові комплекси); іМабо неіїонні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (РЕС). Приклади фармацевтично прийнятних носіїв у даному описі додатково включають агенти для диспергування лікарських засобів в інтерстиціальній тканині, такі як розчинні активні в нейтральному середовищі глікопротеїни гіалуронідази (5НАБЕОСР), наприклад, розчинні глікопротеїни гіалуронідази РН-20 людини, такі як ГНиИРН2гО (НЖ'ЕМЕХ-, Вахівг Іпієтаїйіопаї,
Іпс.). Деякі приклади 5НАБЕСР і способи їх застосування, включаючи гНиРН2О, описані в опублікованих патентних заявках США МоМо 2005/0260186 і 2006/0104968. В одному з аспектів, 5«НАБЕСР поєднують з одним або декількома додатковими глікозаміногліканазами, такими як хондроїтинази.
Носій може бути придатний для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Залежно від способу введення активна сполука, тобто біспецифічне анти-КІ В/анти-
ЕСЕМКІ1 антитіло, може бути покрите матеріалом для захисту сполуки від дії кислот й інших природних умов, які можуть інактивувати сполуку.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом також можна вводити в комбінованій терапії, тобто в сполученні з іншими агентами. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції, розкриті в даному описі, можуть також містити більше ніж один активний інгредієнт, якщо це необхідно для конкретного призначення, що підлягає лікуванню, наприклад, інгредієнти з комплементарною активністю, які не роблять негативного впливу один на одного. У деяких варіантах здійснення даного винаходу фармацевтична лікарська форма може включати другий активний інгредієнт для лікування того самого захворювання, для якого використовується перший терапевтичний агент. Такі активні інгредієнти переважно присутні в комбінації в кількостях, які ефективні для призначеної мети. Для прикладу, а не як обмеження, лікарська форма за даним винаходом може також містити більше ніж один активний інгредієнт, якщо це необхідно для конкретного призначення, що підлягає лікуванню, переважно активні інгредієнти з комплементарною активністю, які не роблять негативного впливу один на одного. Наприклад, може бути бажано додатково забезпечити другий терапевтичний агент, корисний для лікування того самого захворювання. Такі активні інгредієнти переважно присутні в комбінації в кількостях, які ефективні для призначеної мети.
Композиція за даним винаходом може бути введена різними способами, відомими в даній області техніки. Шлях і/або спосіб введення змінюються залежно від бажаних результатів.
Активні сполуки можуть бути об'єднані з носіями, які захищають сполуку від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді лікарських форм із контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластирі та мікроінкапсульовані системи доставки.
Можуть бути використані біорозкладані, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри та полімолочна кислота. Множина способів одержання таких лікарських форм описана, наприклад, в Зивіаійпей апа СопігоїІєа
Кеїєазе Огид Оеїїмегу Зузіетв, У.К. Кобіпзоп, ей., Магсе! ОеккКег, Іпс., Мем/ МогК, 1978. У деяких бо варіантах здійснення фармацевтичні композиції виготовлені згідно зі стандартом Належної виробничої практики (СМР) Керування з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів.
Можуть бути отримані препарати з уповільненим вивільненням, що містять антитіло, розкрите в даному описі. Підходящі приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, де матриці перебувають у вигляді формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. У деяких варіантах здійснення активні інгредієнти можуть бути поміщені в мікрокапсули, отримані, наприклад, способами коацервації або шляхом міжфазної полімеризації, наприклад, у гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули та полі(метилметакрилат)ні мікрокапсули, відповідно, у колоїдні системи доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або в макроемульсії. Такі способи описані в Ветіпаїоп'5 Рнаптасешіса! бсіепсев5, 161п еййіоп, Оз5ої, А. Еа. (1980).
Для введення антитіла за даним винаходом за допомогою певних способів введення може бути необхідно покрити сполуку матеріалом для запобігання його інактивації або вводити сполуку разом з матеріалом для запобігання його інактивації. Наприклад, сполука може бути введена суб'єкту у відповідному носії наприклад, у ліпосомах або в розріджувачі.
Фармацевтично прийнятні розріджувачі включають фізіологічний розчин і водні буферні розчини. Ліпосоми включають емульсії вода-в-олії-у-воді СОР, а також звичайні ліпосоми (5ігедзап еї а... (1984) У. Меигоїттипої. 7:27).
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії та стерильні порошки для екстемпорального одержання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Використання таких середовищ й агентів для фармацевтично активних речовин відоме в даній області За винятком тих випадків, коли звичайне середовище або агент несумісні з активною сполукою, передбачене їхнє застосування у фармацевтичних композиціях за даним винаходом. У композиції також можуть бути включені додаткові активні сполуки.
Терапевтичні композиції, як правило, повинні бути стерильними, по суті ізотонічними і стабільними в умовах виробництва та зберігання. Композиція може бути отримана у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, що підходить для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і т.п.) та їхні підходящі суміші. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, за рахунок використання покриття, такого як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у випадку дисперсії та за рахунок використання поверхнево- активних речовин. У багатьох випадках у композицію переважно включати ізотонічні агенти, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як манніт, сорбіт або хлорид натрію. Пролонгована абсорбція ін'єкційних композицій може бути досягнута шляхом включення в композицію агента, що затримує абсорбцію, наприклад, солей моностеарату та желатину.
Стерильні ін'єкційні розчини можуть бути отримані шляхом включення одного або декількох передбачених антитіл у необхідній кількості у відповідний розчинник з додаванням, якщо буде потреба, одного або комбінації інгредієнтів, перерахованих вище, з наступною стерилізацією шляхом мікрофільтрації, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани.
Як правило, дисперсії одержують шляхом введення активної сполуки в стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище та необхідні інші інгредієнти з тих, які перераховані вище. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних ін'єкційних розчинів переважними способами одержання є вакуумне сушіння та сублімаційне сушіння (ліофілізація), які забезпечують одержання порошку активного інгредієнта з будь-яким додатковим бажаним інгредієнтом з попередньо стерилізованого фільтруванням розчину.
Терапевтичні композиції можуть бути також введені з використанням медичних пристроїв, відомих в даній області. Наприклад, терапевтичну композицію за даним винаходом можна вводити за допомогою безголкового ін'єкційного пристрою для підшкірних ін'єкцій, такого як пристрій, описаний, наприклад, у патентах США МоМо 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 або 4,596,556. Приклади імплантатів і модулів, які використовують у даному винаході, включають пристрої, описані у патенті США Мо 4,487,603, що розкриває імплантований мікроінфузійний насос для дозування препарату з контрольованою швидкістю; патенті США Мо 4486194, в якому описаний терапевтичний пристрій для введення препаратів через шкіру; патенті США Мо 4447233, в якому представлений інфузійний насос для доставки препарату з точною швидкістю інфузії; патенті США Мо 4447224, в якому описаний імплантований інфузійний пристрій зі змінним потоком для безперервної доставки лікарського засобу; патенті США Мо 4439196, в якому описана багатокамерна осмотична система доставки бо лікарського засобу; і у патенті США Мо 4475196, в якому описана осмотична система доставки лікарського засобу. Відомі багато інших подібних імплантатів, системи доставки та модулі.
Для терапевтичних композицій лікарські форми за даним винаходом включають такі лікарські форми, які придатні для перорального, назального, місцевого (у тому числі трансбуккального та під'язикового), ректального, вагінального та/або парентерального введення. Лікарські форми можуть бути зручно представлені у вигляді стандартної лікарської форми та можуть бути отримані будь-якими способами, відомими в області фармації. Кількість антитіла, яка може бути об'єднана з матеріалом-носієм для одержання лікарської форми для однократного введення, варіює залежно від суб'єкта, що підлягає лікуванню, і конкретного способу введення. Кількість антитіла, яка може бути об'єднана з матеріалом-носієм для одержання лікарської форми для однократного введення, як правило, являє собою кількість композиції, що дає терапевтичний ефект. Як правило, зі ста відсотків, ця кількість становить від приблизно 0,01 відсотка до приблизно дев'яносто дев'яти відсотків активного інгредієнта, від приблизно 0,1 відсотка до приблизно 70 відсотків або від приблизно 1 відсотка до приблизно 30 відсотків активного інгредієнта.
Лікарські форми для місцевого або трансдермального введення композицій за даним винаходом включають порошки, спреї, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пластирі й інгалятори. Активна сполука може бути змішана в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм, і, необов'язково, з будь-якими необхідними консервантами, буферами або пропелентами.
Фрази "парентеральне введення" та "введений парентерально" означають способи введення, відмінні від ентерального та місцевого введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і включають внутрішньовенні, внутрішньом'язові, внутрішньоартеріальні, інтратекальні, внутрішньокапсульні, інтраорбітальні, внутрішньосерцеві, внутрішньошкірні, внутрішньочеревинні, транстрахеальні, підшкірні, підепідермісні, внутрішньосуглобні, субкапсулярні, субарахноїдальні, інтраспинальні, епідуральні та надчеревинні ін'єкції й інфузії, не обмежуються ними.
Ці фармацевтичні композиції можуть також містити ад'юванти, такі як консерванти, змочуючі агенти, емульгатори та диспергуючі агенти. Запобігання присутності мікроорганізмів може бути забезпечене як за рахунок процедур стерилізації, описаних вище, так і включенням різних
Зо антибактеріальних і протигрибкових агентів, наприклад, парабенів, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти та подібних ним агентів. Крім того, може бути бажано включати в композиції ізотонічні агенти, такі як цукри, хлорид натрію та подібні речовини. Крім того, пролонгована абсорбція ін'єкційної фармацевтичної форми може бути досягнута включенням агентів, які затримують абсорбцію, таких як моностеарат алюмінію та желатин.
У деяких варіантах здійснення, коли антитіла за даним винаходом вводять у вигляді фармацевтичних препаратів людині та тваринам, вони можуть бути введені окремо або у вигляді фармацевтичної композиції, що містить, наприклад, від приблизно 0,01 95 до приблизно 99,5 95 (або від приблизно 0,1 до приблизно 90 95) антитіла, розкритого в даному описі, у сполученні з фармацевтично прийнятним носієм.
М. Вироби
Даний опис додатково відноситься до виробів, що містять матеріали, придатні для лікування, профілактики та/або діагностики розладів, описаних вище.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу виріб включає контейнер й етикетку або вкладиш, закріплені на контейнері або пов'язані з контейнером. Необмежуючі приклади підходящих контейнерів включають пляшки, флакони, шприци, мішки для розчинів, що вводять внутрішньовенно, і т.п. Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, таких як скло або пластик. Контейнер може містити композицію, що сама по собі або в сполученні з іншою композицією є ефективною для лікування, профілактики та/або діагностики стану, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може являти собою пакет для внутрішньовенного розчину або флакон, що має пробку, яка піддається проколюванню голкою, для підшкірних ін'єкцій).
У деяких варіантах здійснення щонайменше один активний агент у композиції являє собою антитіло, розкрите в даному описі. На етикетці або вкладиші в упакуванні може бути зазначено, що композицію використовують для лікування певного стану.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, що міститься в ньому, де композиція містить антитіло за даним винаходом; і (б) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, де композиція містить додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний агент. У деяких варіантах здійснення даного винаходу виріб може додатково містити вкладиш в упакуванні, який вказує, що ці композиції можуть бути бо використані для лікування конкретного стану.
Як альтернатива або додатково, виріб може додатково включати додатковий контейнер, наприклад, другий або третій контейнер, який включає фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатичну воду для ін'єкцій (ВУМЕІ), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера та розчин декстрози, але не обмежуючись ними. Виріб може включати інші матеріали, бажані з комерційної та споживчої точки зору, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.
Наведені нижче приклади лише ілюструють даний опис і не повинні розглядатися як яке- небудь обмеження.
Приклади
Приклад 1. Характеристика агоністичних анти-РОЕК1 антитіл.
Три отриманих методом фагового дисплея анти-ЕОЕКІ антитіла, УМ/182.2 (також називають в даному описі "КІМАБІ1"), МУМ182.3 (також називають в даному описі "КІМАБ2") ї МУМ182.5 (також називають в даному описі "КІМАБЗ") були описані раніше (М/О 2012/158704, включена в даний опис за допомогою посилання). Кожне з трьох антитіл діє як потужний ЕСЕК1- селективний агоніст і проявляє інсулін-сенсибілізуючі властивості в мишей.
Для більше глибокого розуміння цієї агоністичної активності була перевірена здатність фрагментів Раб цих антитіл діяти в якості агоніста ЕСЕКТс. Клітини НЕК293 культивували в модифікованому за методом Дульбекко середовищі Ігла (МЕМ) ї- 10 95 фетальної телячої сироватки (ЕВ5) і тимчасово трансфікували експресійними векторами, що кодують люциферазу
Вепійа (рВІ-5М40, Рготеда), ЕСЕК1с, транскрипційний активатор (рЕА2-ЕЇК! або реЕА2-СВЕВ, зігаїадепе) і репортерну люциферазу світлячка під контролем сайтів зв'язування САЇ 4 (рЕкК-
Г ис, 5ігаїадепе), використовуючи трансфекційний реагент РОСЕМЕ? НО (Коспе). Наступного дня трансфіковані клітини культивували протягом ще 6-8 год. у безсироватковому середовищі та на них тестували дес і кожне з УУУ182.2, МУМ182.3 ії УУМ182.5 при зростаючих концентраціях.
Активність люциферази в клітинах визначали з використанням системи люциферазного аналізу
РОАЇІ -О ОФ (Рготеда) і сканера ЕММІБІОМО Миші ареї (РегкіпЕІтег). Активність люциферази світлячка нормалізували за активністю коекспресованої люциферази Кепійа. Зненацька виявилося, що УУМ182.2 Бар, але не МУМ182.3 Бар або муУм182.5 Рар, виявив агоністичну активність (Фіг. 1А).
Зо Фіг. 18 представляє експерименти з конкурентного зв'язування, які були виконані для вивчення причин розходжень в активації ЕСЕКІ1 під дією УУУ182.2 Раб ї УЛ/182.3 Бар. УУМу182.2 додатково характеризували у порівнянні з УМу/182.3, що має високу афінність, а також у порівнянні з більше низькоафінним анти-РОЕКІ1 антитілом, УМ/182.5. Обидва антитіла УУМ182.2 і УМ/182.3 конкурували з УМ/182.5 за зв'язування з позаклітинним доменом ЕСЕКІ1 (ЕСО), і це говорить про те, що всі З антитіла розпізнають області ЕСЕКІ, що перекриваються. Проте, як показано на фіг. 18, відносна афінність УУМ182.5 була значно нижче (ІСво » 30 разів), ніж в "УММ182.2 і МУМ182.3.
Фіг. 2А показує афінності зв'язування анти-ЕОЕКІ1 антитіл, УУМ182.2 ї МУМ182.3, з ЕСЕКІЬ і
ЕСЕКІТс. Афінність анти-РОЕКІ антитіл оцінювали для визначення того, чи пояснюють розходження в афінності анти-РОЕК1 антитіл розходження, спостережувані для їх агоністичної активності. Аналіз афінності зв'язування Раб з ЕСЕКТЬ або ЕСЕКІТс проводили з використанням приладу ВІАСОРБЕ? Т100, як описано в Ііапуд та ін. У. Мої. ВіоІ. 366(3): 815-29 (2007), з наступними змінами. Мишаче антитіло до людського антитіла Ес було нанесене першим на карбоксиметилований декстрановий чип СМ5 ВіАсоге з використанням процедури безпосереднього зв'язування з вільними аміногрупами, описаної виробником. УУ/182.2 або
УМІ182.3 були захоплені на чипі СМ5 біосенсора до досягнення приблизно 200 одиниць відгуку (КУ). Вимірювання зв'язування проводили з використанням робочого буфера, що складається з 10 ММ НЕРЕБЗ рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,005 95 поверхнево-активної речовини Р20 (НВЗ-Р- буфера). Серії 2-кратних розведень білка ЕСЕКІТс ЕСО-НІібх вводили в діапазоні концентрацій 1,5-50 нМ в НВ5-Р-буфері при швидкості потоку 30 мкл/хв при 25 "С. Швидкості асоціації (Коп, моль/с) та швидкості дисоціації (Кої6, с) були розраховані з використанням простої моделі зв'язування Ленгмюра один до одного (ВІАСОКЕ? ЕмаїЇчайоп Зоймаге мегзіоп 3.2). Рівноважну константу дисоціації (Ка, моль) розраховували як відношення Кон/Коп. Як показано на фіг. 2А, спостережувані афінності МУМ182.2 і МЛ/182.3 були дуже схожими, що свідчить про те, що афінність не може пояснити різницю в агоністичній активності двох антитіл.
Фіг. 28 показує здатність УМ/182.5 (КІМАБЗ) специфічно взаємодіяти з ЕСЕКТ1. Як і УМ/182.2 і УМм182.3, ЛИ 82.5 показало специфічне зв'язування з ЕСЕКТІ в аналізі ЕГІЗА (Фіг. 2В).
Фіг. 2С показує агоністичну активність МУМ182.5 для різних БСОЕК у клітинах 16 в люциферазному аналізі з використанням САЇ-ЕЇ К1 (ЕТ5-подібний фактор транскрипції 1). Для бо проведення люциферазного аналізу клітини НЕК293Т або пацюка 16 трансфікували експресійними векторами, що кодують відповідні рецептори під контролем СММ-промотору, люциферазу Кепійа (РКІ-54М40, Рготеда), злитий білок транскрипційного активатора САЇ -ЕЇ К1 (рЕА2-ЕГКІ, компанії АдіепО і репортерну люциферазу світлячка під контролем сайтів зв'язування САЇ 4 (РЕК-І ис, Адіеп), з використанням трансфекційного реагенту Гибепе НО (Рготеда). Наступного дня трансфіковані клітини культивували протягом ще 6-8 годин у безсироватковому середовищі ЮОМЕМ, що містить відповідні білкові ліганди в різних концентраціях. Активність люциферази в клітинах визначали з використанням системи люциферазного аналізу ЮцаІ-біо (Рготеда) і сканера Епумізіоп Мийі аре! (РегКіпЕІтег).
Активність люциферази світлячка нормалізована до активності спільно експресованої люциферази Кепійа, і показана як середнє значення х ЗЕМ. Подібно МУМ182.2 ії МлЛ/182.3, "УМ/182.5 виступав у якості специфічного агоніста для ЕСЕКІ у клітинах І 6 (Фіг. 23).
Агоністична активність УМ/182.5 додатково протестована в клітинах НЕК293 за допомогою люциферазного аналізу СЗАІЇ-ЕЇ КІТ, описаного вище. Як показано на Фіг. 20, МУМ182.5 також виступав у якості специфічного агоніста для ЕСЕКІТс у люциферазному аналізі САГ-ЕЇКІ у клітинах НЕК293.
Фіг. 2Е показаний вплив УУМУ182.5 на рівень глюкози в крові в моделі діабету на мишах. Для визначення рівня глюкози в крові миші були придбані в даскзоп І арогаїогу й утримувалися в стерильному віварії при температурі 21 7С за стандартом 12 год. світло/12 год. темряви з доступом до їжі (АВОЇЕТУ 5010) і воді в необмеженій кількості. Миші ар/йь лінії С57ВІ КБ) були самками, а інші миші були самцями. Для годівлі відповідно до дієти з високим вмістом жирів була використана дієта з високим вмістом жирів і високим вмістом вуглеводів (Напап ТекКіай
Т0.03584, 58,4 95 калорій з жиру). Рівні неорганічного фосфору та кальцію в сироватці визначали за допомогою біохімічного аналізатора СОВА5 ІМТЕСКАЗ? 400 (Коспе). Рівні ЕЄСЕ23 у сироватці визначали за допомогою ЕГІЗА (Іттшоріс5). Рівні глюкози в крові визначали за допомогою глюкометра СОМТОШЕЗ? (Вауег). Для аналізу ліпідів у печінці використовували набір для кількісного визначення тригліцеридів (МВІ. Іп(егпайкопаїЇї). Загальні холестерин, тригліцериди,
В-гідроксибутират (Тегппо ОМА) і вільні жирні кислоти (Коспе) у сироватці визначали за допомогою колориметричного аналізу. Для визначення рівнів сироваткового інсуліну (Стгувіаї
Спет), сироваткового БОБ23 (Іттшоріс5), сироваткового високомолекулярного мишачого
Зо адипонектину (АїІрсо) і сироваткового високомолекулярного адипонектину мавп (КО Зузіетв5) використовували ЕГІЗА. Кортикостерон вимірювали за допомогою радіоіїмуноаналізу (Мапаегріїї
Ноптопе Аззау 85. Апапуїїса! Зегмісе5 Соге). Всі миші, яких використовували для ін'єкцій, мали вік близько 2-4 місяців, за винятком КІ В-дефіцитних мишей, які були використані в деяких дослідах у віці 7-8 місяців. Подібно введенню УУМ182.2 і УУМ182.3, введення УУМ182.5 нормалізує рівень глюкози в крові у діабетичних мишей ар/аь (Фіг. 203).
Приклад 2. Картування епітопів анти-РСЕМК1 антитіл.
ЕСО ЕСЕКІ1 складається з трьох Ід-подібних доменів, які називають 01-03. Як показано на
Фіг. 1С, два непересічні пептиди Р2б6: КІНАМРААКТУМКЕКСР (5ЕБЕО ІЮО МО: 143) ії Р28:
ЕКРОНКІСОМУКМУКУ (ЗЕО 10 МО: 144), присутніх у домені Ю2 ЕСЕКІ, були попередньо ідентифіковані як такі, що зв'язуються з двома антитілами УМ/182.2 і УЛ/182.3 (МО 2012/158704, включена в даний опис за допомогою посилання).
Щоб визначити, які залишки у цих пептидах є найбільш важливими для зв'язування антитіла, у клітинах НЕК293 експресували повнорозмірні білюи ЕСЕКІ1 з різними замінами на аланін у межах певних областей епітопів і тестували їх на зв'язування антитіл за допомогою Вестерн- блоттингу. Як показано на Фіг. 10, заміни на аланін у К175, К177, 205, К208 запобігали зв'язування УУМ182.2 ії МУу182.5, не впливаючи на експресію, що показано за допомогою зондування з використанням анти-РОЕМК1 до домена 01 (анти-О01). Зв'язування УМ/182.3 було відвернене при заміні К2084А, але не при замінах К175, К177 або У205.
Здатність антитіл активувати мутантні ЕСЕКІ1 із замінами на аланін іп мімо тестували за допомогою аналізу САЇ-ЕЇ КІ, описаного вище. Було встановлено, що для кожного з анти-
ЕСЕКІ антитіл активація добре корелює з властивостями зв'язування цих мутантів (Фіг. 1Е). Ці результати свідчать про те, що для зв'язування УМ/182.2 і ММЛ/182.5 незважаючи на різну афінність зв'язування необхідний подібний набір амінокислот у домені 02, у той час як для зв'язування УМ/182.3 має велике значення інший набір амінокислот у тій самій області.
Кристалічні структури 2:2 комплексу ЕСЕК ЕСО/ЕСБЕ були описані раніше (Ріоїпіком еї а. Сеї 98(5): 641-50 (1999)). У гомодимерних структурах 22 РОЕКІс ЕСО/РОБ2 один домен 02 взаємодіє з іншим доменом 02, і кожний ЕОБГ2 зв'язується з двома доменами 02 з двох сторін, щоб стабілізувати димер 02 (Фіг. 1). У цих структурах важливі для зв'язування УМ/182.2 і "УМ/182.5 заміни на аланін (К175, К177, 205 ії К208) розташовані всередині димера 02. Тому 60 що УМ/182.2 Ра діє в якості агоніста, то передбачається, що УМ/182.2 баб може зв'язуватися з двома доменами 02 одночасно для стабілізації димера 02, і по суті, діє як молекулярний міметик лігандів ЕСЕ. На основі аналізу замін на аланін можна прийти до висновку, що УМ/182.5 гар може зв'язуватися аналогічним чином за винятком того, що його афінність значно нижче, ніж в УМ/182.2 Раб.
Приклад 3. Виділення та характеристика анти-КІ В антитіл.
Миші ВАГВ/С були імунізовані НЕК293, стабільно експресуючими білки ПЕСЕКІ1с і РКІ В.
Селезінки збирали через 12 тижнів й одержували гібридоми. Гібридоми, які продукують антитіла анти-ПКІ В, були ідентифіковані за допомогою аналізу ЕАС5 з використанням клітин НЕК293, які використовували для імунізації. Загалом, клітини 293, експресуючі один КІВ, один ПЕСЕКІ1 або обидва білки, офарблювали розведеним супернатантом гібридоми та РЕ-кон'югованими козячими антитілами проти мишачого антитіла дос (даскзоп І арх) у буфері ЕАС5 (0,5 95 ВЗА у
РВ5З). Той же самий буфер РАС5 використовували для промивання пофарбованих клітин.
Пофарбовані клітини аналізували за допомогою РАСбсап (Весіоп бісКіпзоп) і програмного забезпечення для аналізу Біомло БАС5 (Тгееє 5їаг). КДНК, що кодує важкий ланцюг і легкий ланцюг ІдсСь клонували в експресійні вектори. Всі рекомбінантні молекули моноклонального антитіла одержували з тимчасово трансфікованих клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) й очищали з використанням звичайної колоночної хроматографії.
Було виявлено близько 20 різних гібридом, які продукують анти-КІ В антитіла. Послідовності
СОК легкого ланцюга та важкого ланцюга для 16 із цих анти-КІ В антитіл наведені в таблицях 2 і 3. Послідовності легкого ланцюга цих 16 анти-КІ В антитіл, а також 8С5 показані на Фіг. ЗА (11241, 6012, 1104, 8Е1, 4633, 8Н7, 21Н3, 25Е7, 14Еб, 14С6, 24А1, 5Е8, 6С1, 12А1, 1288, 14С10 і 805; 5ЕО ІЮО МО: 111-127, відповідно).
Послідовності важкого ланцюга цих 16 анти-КІ В антитіл, а також 8С5 показані на Фіг. ЗВ (11241, 6012, 1104, 8Е1, 4633, 8Н7, 21Н3, 25Е7, 14Еб, 14С6, 24А1, 5Е8, 6С1, 12А1, 1288, 14С10 і 805; 5ЕО ІЮО МО: 94-110, відповідно).
Таблиця 2
Послідовності СОЕ Н мишачих моноклональних анти-КіІ В антитіл
Сов НІ сов'н2 сов НЗ3
ЗУСІБ (5ЕО І МО: | ТИиЗБИаСАУТУУРОБУКОа , 111 «ЕО ІЮ МО: 16 аарамА ом (5ЕО ІЮ МО: 32)
ОМУММ (ЗЕО І МОРЕМООТІМОРКЕРО (5ЕО й 6012 ІЮ МО: 17 ЕТТУЕАМ (5ЕО ІО МО: 33)
ММамМ5 (ЗЕО І міу,аравіІМУН5ЗА ІБ (ЗЕО , 1104 І МО: 18 ТНОМ/РОМ (5ЕО ІО МО: 34)
ОТУММ (ЗЕО І ВІОРОМаМАКМОРКЕОС , прееМеМАКу ВАІСМСУА! СУ (5ЕО 10 МО: 35)
ОТМІН (5ЕО ІЮ МО: | ВІОРАМЕОМТКМОРКЕРОЮ , 46с3 прРАМаМТКУ СТ5УЗМУРАХ (ЗЕО 10 МО: 36) вн ЗМІН (ЗЕО ІЮ МО: ЕІОРОМЗМЗМУМОКЕКа г аУМУМУаь5ЗРЕМЕАМ (5ЕО І б ЗЕО ІО МО: 21 МО: 37 21н3 ЗМІН (ЗЕО ІЮ МО: ЕІОРОМЗМЗМУМОКЕКа г аУМУМУаь5ЗРЕМЕАМ (5ЕО І б ЗЕО ІО МО: 21 МО: 37
ОТЕТН (ЗЕО ІЮ МОЇ ВІОРОМаМТКМОРКЕеОС , 25Е7 ЕО ІЮ МО: 22 ВАГамамАМОМ (5ЕО І МО: 38)
ЕМТММ (ЗЕО ІЮ СІМРММаЕТЗУМОКЕКИ , 14Е6 ЗЕО ІЮ МО: 23 КТТММ (5ЕО ІО МО: 39) 14С6 БИМЕ (ЗЕО ІЮ МО: по МЕМЕНО (ЗЕО ВОУУПААМУЕОУ (5ЕО ІЮ МО: 40)
ОМЕМН (5ЕО І АМ/РЕМАЮЗУМУМОКЕКСИА , 2г4А1 МО: 10 ФЕО ІЮ МО: 25 ЕССМУ (ЗЕО І МО: 41)
ОТМІН (5ЕО ІЮ МО: | ВІОРАМЕОМТКМОРКЕРОС , всі ЗУММЕ (ЗЕО І МО: ЕП /РЕЗОЗТКУМЕКЕКМ (5ЕО | ФСМНУРСУМІ ММ (5ЕО ІЮ МО: 9 ІО МО: 27 43
АУМ/М5 (З5ЕО І ЕІ5БРОББТІМУТРОЇ КО (5ЕО , 12А11 МО: 12 ІЮ МО: 28 РБЗБРАГОМ (5ЕО І МО: 44)
Продовження таблиці 2
МмОаММ (5ЕО 10 МІОТОТОЕАТУТООЕКИа , 1288 МО: 13 ФЕО І МО: 29 ЕЕМаї РСЕРМ (ЗЕО ІЮ МО: 45) 1410 ТАМИ (5ЕО І. | НІММУОСОКАММРАЇ КБ (5ЕО рам равзЕмМАМОМ (ЗЕО І МО:
МО: 14 ІО МО: 30 46 тУамн (5ЕО І міузааетруМмААРІЗ (5ЕО ,
МО: 15 Іо МО: 31 рхуавтумрАІЮМ (5ЕО ІЮ МО: 47)
Таблиця З
Послідовності СОК І. мишачих моноклональних анти-КІ- В антитіл
Сов СовВІг СОоВІЗ
ЗАБОМІЗММІ М (ЗЕО ІО МО: ЕТ55І АБ (ЗЕО І МО: | ООУБКІ РУУТ (ЗЕО І МО:
ПЕООО Тв 53 79
ЗАББОБОИВУТЕ (5ЕО ІО МО: | ОТОКІ АБ (ЗЕО ІЮО МО: | ГОСТамРІ Т (5ЕО І МО: б012 |до 64 80
ВАБОВІЗММЕМ (ЗЕО І УТЗАГО5 (5ЕО І МО: | НОУВТІ РУУТ (ЗЕО І МО:
ПрК о мо:5О 65 с
КАБОНІММУМІ А (ЗЕО 10 СТТМІЕТ (ЗЕО ІЮ МО: | ООММ/МТРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 8Е1 ї
МО: 51 66 82 в55ОМІУнНЗраТмтмі Е КУЗМАЕ5 (5ЕО ІЮ МО: , авсз | НББВОМІМИБОС РОСВНМІ т (ЗЕО ІО МО: 83)
КАБОРМББАМА (5ЕО ІЮ ЗАБУВУТ (5ЕО ІО МО: | ООНМІМРМТ (5ЕО 10 МО:
ВНУ мо:53 58 84
КАБОРМББАМА (5ЕО ІЮ ЗАБУВУТ (5ЕО ІО МО: | ООНМІМРМТ (5ЕО 10 МО: 21нЗ Мо: 53 58 84
КАБОНІММУМІ А (ЗЕО 10 САМІ ЕТ (ЗЕО ІО МО: | ООММУ/МТРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 257 |Ммо:ві 69 82
ВАБОБЕЇБИМІ 5 (ЗЕО ІЮ МО: ААЗТІ 05 (5ЕО І МО: | ГОМавУРМТ (5ЕО ІО МО: 136 54 70 85
ЗАБОБІБЗ5БЗУІ М (ЗЕОІЮ | САМІ АБ (ЗЕО ІЮ МО: | НОМ/З5ЗУРІ Т (ЗЕО І МО: 1466 |Мо:55 7 86
Аді кЗБОБИЇМЗамокмМі А ГАЗТАЕ5 (ЗЕО І МО: | ООНН5ТРМУТ (5ЕО ІО МО:
ЗЕО ІО МО: 56 72 87
ВАБОЗЗУМНМУ (ЗЕО ІО МО:| МТОТІ АР (5ЕО І МО: | ООБТІЗРЗМУТ (5ЕО ІЮ МО:
ЗВ 57 73 88
КАБОММОБМУМА (ЗЕО І ЗАБУВЕБЗ (5ЕО ІО МО: | ООМУМІЗРМТ (5ЕО 10 МО: бС1 Мо: 58 74 89
ВАБОБІБОММУМ (5ЕО 10 МАБОБІЗ (5ЕО 0 МО: | ОМанмеЕРМТ (5ЕО О МО: 121 мо: 59 75 90
КАБЕОІММАГА (5ЕО І МО: ААТОЇ ЕТ (ЗЕО ІО МО: | ООММУБМРІ Т (ЗЕО ІЮ МО: 1288 60 76 91 14С10 пливе оБуоМеРМА (ЗЕО пАБМЕВ (5ЕОІЮ МО: ОО5МЕОУТ (5ЕО ІО МО: 92) 8с5 ВАБЕБМЕЗМОМАМУМТ (ЗЕОЇ ВААМГО5 (ЗЕО ІО МО: | ООБМЕОРММУТ (5ЕО ІЮ МО:
ІО МО: 62 78 93
Більшість отриманих з гібридом анти-КІ В антитіл разом з одним антитілом, отриманим за допомогою фагового дисплея (позначене Рі й 5, що було отримано за допомогою фагового дисплея з використанням рекомбінантного білка ЯКІ В-ЕСО-НІЗ (КО бЗузіетв)), були ранжовані на основі медіани зрушення, яку спостерігали на діаграмі ЕАС5 при вимірюванні зв'язування 0,8 мкг/мл антитіл із клітинами 293, що експресують ПКІ В (Фіг. 4).
Крім того, деякі антитіла були ранжовані за ЕГІ5БА. Для цих експериментів анти-КіІ В антитіла, що є химерними рекомбінантними ДС. з мишачими варіабельними областями та константними областями пІдСт!, були використані для вимірювання зв'язування білка НКІ В-
ЕСО-НІів5. Відносне зв'язування всіх тестованих антитіл за винятком 14Еб6 було схожим, 14Е6б виявило більш сильне зв'язування в умовах ЕЇГ І5А, ніж при аналізі ЕАСЗ (Фіг. 5).
Приклад 4. Зв'язування КІ В з анти-КІ В антитілами.
Для тестування конкуренції зв'язування між різними анти-КІ В антитілами використовували
ЕІ ІЗА. У деяких експериментах антитіла ІдСс, очищені з супернатантів гібридоми, що відповідають 6012, 8С5 і 111, біотинілювали з використанням набору для біотинілювання
МН5-РЕО зоїйй РНазе (Ріегсе). Зв'язування з білком КІ В-ЕСО-Ні5 тестували з використанням кон'югованого з пероксидазою хрону стрептавідину у присутності різних концентрацій анти-Кі В, отриманих із гібридом. У деяких експериментах зв'язування рекомбінантного людського ІдСї з білком КІВ-ЕСО-Ніх тестували з використанням кон'югованого з пероксидазою хрону антитіла проти людського ДС: (Чдаскзоп ІттипоКезеагсії Іпс.) у присутності різних концентрацій анти-
КІ В, отриманих із гібридом. Було відзначено, що жодне з антитіл 11Е1, 1104, 8Е1 ії 46023 не конкурують з 6012 за зв'язування (інші білюи не були випробувані проти 6012). Анти-КІ В антитіла 14Е6 і 12А11 конкурують за зв'язування з 8С5, але не з 1104 і 14С10 (інші не випробовували проти 8С5), і 1104 конкурує за зв'язування з 111, але не з 6012, 8Е1 і 4603 (інші не були випробувані проти 11Е1).
Приклад 5. Міжвидова крос-реактивність анти-КіІ В антитіл.
Видову крос-реактивність розкритих анти-КІ В антитіл аналізували за допомогою аналізу
ЕАСЗ з використанням кДНК КІ В з миші, пацюка, кролика, яванського макака та макак-резусів, клонованої в експресійні вектори ссавців рЕК, які тимчасово трансфікували в клітини НЕК293ЗТ.
Експресовані послідовності позаклітинного домена поліпептиду КІВ були наступними.
Миша:
ЕЗЕаДИаКАМ/ ОККОУУЗРУМРЗОЇ Р МОТЕРКМЕБУУСМОаТаАРОМЕСЗУКТОС,С ВА РОМ ОВ УМХ зн НаУМаТтоАЗТОБМІР ЕКО ГАГОРІ ЯМБЕМОБ5ІЗМРАГЕРМаИТМААММАОСсІ ММ ВАС ОБІ М
ГАМІЕРІМТ МНУ/ОЇ РІ ТІ ОБЕМаСУУКМАТМІОЇ ЕМОМАТМСРОТРС,СОВУКУУМІТІНМРУЇ МАУ НОБа
ТамнНАРСЕКОаМІ ТАМУТМанмі ІКАНБКУМ НМУОКМЕА! РНОКОУМІ 51 аЗНУЛЕРМА ТОММЕОМІ
МСОНЗМ55МІ СМ РАМРІНИЕрРИОУРЕЄЕМКТОаАМІРЕЕЗЕАЕКЕЕМВатАОРРАЕЗЕИаРММЕВРЗМТМ
УКМаИаоммБі М /вОомМі МУМІКСЕМООРОПІЗЕМСМ ЕТОЗМІКТЕОТТАІМММКМЕІ МОМ ОАІКЕОЕІВМ
ЕСУТАМТ ГОСЕЕМОрАУТТАНИаИТсЕММоєМЗЕОКЕВКРКОЗАНУМКОПООМСИвЕРІ КЕЗТРОМКСИа А
ЕРСОЕБУИ,МТЕБМІ КРЕЕТУ55РОЕТОРНІ УМ МУТаМВІ МАМЕСУВІ КТАРЗОСТОМУБІККАМЕ
МІ АКМКУТНУОГАЇ СМТ РТОМІ БКУМАОМІ ВУУАСУМБЕИІ КІ ЯМЕРММТІ МНРТНЗНІ СІ РІ Р
Коо) ГП ЗБаСМ І МММТАКАРООМУАЕЇ СЕВЕГ СаО УК УМТІМЕРМАВІ БОМУМА ТЗМОТУВААНМІ МІАНАЮО
УМНІМОВОМАРМОНаИАМ5І ЗІ НСОМ/АЕРАМРЕМОЗНУКААЕВЕЇ ОБГЕІАМ/ГАОРІ ЕКТаЮМРБЗУМ
КЕМІАЗБКМОВИЇ 555МІ РАЕТАКЕЗВІ УКИАТМОЕМАЇ МНЕТТА!ЕМІНКОЇ МТМАЗМАВАОСМОРІГОБІТВ
І 55Р5АВГАМТРУСУВКІ ГАМА АМУВОВОЇМІ ТАМИ ОО АГЕОБОТАКУМІ ЕКУМОЕАЇ КАМПТОКУКІ
КамуАРКІ ТЕЕКЗКРАРСЕЕТЗОЕВАКЗЗМОБГУЗКІ ІЗ РАЕМАЗРАССОРАЕОТОСТІСЗЕЇ М (ЗЕО ІО МО: 158).
Пацюк (ж ЕГАС на М-кінці): рУКООООКГЕєБИаракаІМмрккомиУ5РУМРООІ РІ МОТЕРКМЕБУУ СМ, ОАРОМЕаБМКАРИ
ВаРБІМОВУМОЗНІ НаММЗТОАЗТОММУРІ ЕКО АГОРІ ЯМЗЕМОББІЗМУ РА ЕРМаТУМААУММАКО
ГОМУВАГОБІ МІ АВМІЕРІМТ МНУОЇГ РТ ОЄЕМСИСаСуУКкМАТМІОЇ ЕМОМАТМСЕОТРарАМУКУУІТІН
МРМ МАУУуУНСГИТаМНАРСЕКОМСТАУМ ГМЕАНМКАНЗКУМ НММОКМЕАВ РНОКОУЛ ІТТ а ЗНУЛЕ
РМАТЕММЕОСМІМСОНОЗМ5ЗЗМІ СМУЕАМРІНЕВИаОМРЕЄРМКТЗ5ОМІРЕЕЗЕАЕКЕЕМНИаТАОРГЕАЕЗЕС
РММЕАРЗМТУУКМСИаомУ5і МОМ МУМІКСЕМОМРАІІЗЕМСУ ЕТОБМІКТЕОТТАІМММКМРЕІ МОМ
ГОАІКЕОЕІОМЕРаУТАМ/Т І ОСБгЕМОБАУТТАВаИгиЕУМОєМЗЕОКЕВКРКЗЗАНУУКОПООМСИЕРІ О
ЕЗТРОМКООЕРСОРБУИМТЕЗМІ КРЕЕТМ55РОЕТОРНІ МУ МУТОаМА МАМЕСМУВІ КТАРЗОСТ
ОУМ5ІККАМЕМІ АКМКУТНУОРАЇ ОМ РТОМІ ЗКІМАОМІ ВУМАСУМ5ЕСІ КІ СІ5РММУТІ МНРТ
Н5ОНІ ОЇ РМРІ І 55О:5С23УМІ МТ МТАКАРОЮМАСІ СЕКЕГ СІ МКСМПТІМЕРМАІ 5ЗОМУМАТЗМОТУВАА
НМ-МІАНАСУМНІ МОВОУА!АРМОНИАМ5БІ ЗІ НВОМАЕРАМРУМЕЗНУКААЕВ ЕІ ОБГЕІАМ/ГАОРІ ЕК тТармурРІ АМКЕМІАЗККОНВИЇ 555МІ РАЕТІ КЕЗВІ УКОаТтІОЕМАМНЕТТА!ЕМІНКОЇ МТМСЗМАВН ОМ
ОРГОВІТВІ 55Р5ВІГАМТРИСМАКИ СУА ВММАОМОІМУТАМСИІООІ АГЕОВОТАКММІ ЕКУМОЕАЇ.
КАМ ІОКУКІКаУМАЕКІ ТЕЕКЗКРАРСЕЕТЗОЕКАКЗЗМОГУЗКІ ІЗ5ЗИЕ55ЕМАЗРАССОРРЕОТЕ
САЇІСБ5ЕЇ ТТ (ЗЕО ІЮ МО: 147).
Кролик (ях ГГ АС на М-кінці): рУКООООКГОгРЕИравАУМ ЗОМРМІ ЗРУМЕБОГ РЕ МОТЕРКМЕРМ МЕ ТаАРОМЕСаБМУККОаИ
КагзУМОНРІАТНІ МУЗЗАраТвзвоБМІРІ ЕКОЇ ЗАГОБ ЯМЗЕМОБЕ5ІЗМ РА ЕРОСТМАМАМАКаИЇ О жУМАПОБИГАМІЕРММТМНУОГ РУМАГОЕКМИасьикМЕТОЕМОМАТУСРОТРарвуУкмтнм
РУХИ МАУНнОматаІ НАРЕЕКОаМУМААУУ ТМанмІ | КАНЗКУУ НМУМАМЕА!А РНОКОУМІ БІТ аЗНУМЕ
РМААЕБІМОІЇ КСООЗБМУБЗМІ С(МУ ЕЄАМРІНИВСОМРЕУМТККІ І ЗМІ РАЕЗЕАЕКМЕУВИатТтАВЕРАБЗЕ
СРММЕКРІ МГМАКМООММУ5І МІ АОМІ МУІКСЕМаМРАШАЄЕМСУМ ЕТОЗУМОТЕОТТАІМММКМ М
ОМІГОАІВ ЕМ АМЕг,аУТАМЗІИ ЇЇ ОСЕЕМОБАММТ Аа гЕУМОєМЗЕОВЕВАРКЗЗАНУУКОМІСЕМСИЯ (510) ЕТ АВЕАТРОЇ ОСОЕБГРСОЕБУМИаМУТЕЗМІ КРЕЗМАЗОРОЕБОРНІ УММ/МАТОаМАМІ НАМЕСУВІ КТАР
АОСТОГРІТІККО ЕМ АВМКУТНЕВЕАГГ ОМ АБМІ РТОМІ ЗЕММАОАЇ ВУУАСУМТЕІ КІ МІЗРМУТІ.
МЖУРТНАНІ агГРАРІ ІТ НЗасшямі ОРБЗБТАКАРАОМУАСІ СЕВЕЇ СІ МКІСМІТІМЕРМАІ БОМУМАТЗМОТУ
ОСААНМІ ПАНАЇММ/НІ МОВОМАРЗОВСИАЇ 5І ЗІ НЗОМАЕРАМРУМАЗНУ/ОААЕВНІ ОБЕІАМУЕАЕРІ.
ЕКТарУРМАМАЕМІАЗКТАВИїЇ 555МІ РАЕБВАЕВНВІ УКИААВЕМАЇ МНЕТТАЕММНЕООМОИЗАМО БОВОМОНОВІТВІ АБРОВІ АУМРУСЕСКИ АУМАМММИрІ СУМІ ТАМа!рроаг ОоМрО! ВОМ Е
КУМОЕАЇ КАМІ ІОКІКІКЕУМАРКІ ТЕЕКЗКРАГСЕГЕТЗОЕКАКЗОЗІОБЄУМКИТЗМагРЗЕМСРАСМО
ТОСМРЕСТМСТ ПІ. (ЗЕО ІО МО: 148).
Яванський макак (ї- ЕГ АС на М-кінці):
ВУКООООКІЕЕЗСОВИавВАУМЗКМРМЕТРУМЕЗОЇ ГІ МОТЕРКМЕРУСс.МОатТаАГ ОМЕаБМУККОС
КаРБЗІМОНЕМНТНІ КМУЗЗТМОа5ЗЗОБМІРІ ЕКОЇ ЗАГОРІСМЗЕМОЕБІЗМ РВІ ЕРОСІМТМАМАКаИ ОО
ММ О5І МІ АМІЕРІМТІ МНУУПІ РІ АГОєЕКМИасСськмМОТПОТЕМОМАТУСЕОТРаОвУКУМ ІТІНМРУ
ГМАУнНахатамнаАРСЕКОМІ ААМУУТМанмі ІКкАНЗКУУМНМУМ ТНЕАРНОКОСОУМІ БІТ аЗНУМЕРМА
ЗЕМТМОІЇ КСООЗБМУБЗМІ СМ ЕАЗРІНИЕВИОМУРЕСМКККІ І БІ РІ ЕЗЕАДЕКМЕУВа ТАОЕРАЕББа Р
ММЕКРІ МТГМАКМСИОМУ5І МІ ВЕАЇГМУЛКСЕММУМРАШАЕМСМ ЕТОЗНУКТЕОТТАІМММКМРІ ЗОМ.
ОАІВІОБІВМЕаМТАМ БІ ОСЕЕМОБАМТІВ Ваг ЕМУОЕМЗКОКЕВКРКЗЗАНУУКОПАЕМСИ ЕІ КЕ
АТРОМОСОЕБЕРСОЕБЗУСМУТЕЗМІ КРЕЗМАБЗРОЕЗОРМІ УУМ/МАТОаМАЇ І НАМЕСУВІ КТАРАОСТО
ЕММІККОЇ ЕМ АВМКУТНУВЕАГ ОМ АБМІ РТОМІ БАУМАОАЇІ ВМ АСУМ5ЕІ КІ СІЗАММТІ МУРТ
НАНІ аг РЕРІ ГНАССУМ МРЗТМЕАРОАУАдаї СРОБГ срІ МКІМТІМЕРМАГ БО УМАЗОМОТУСААН
МІГ УМАНАГАМУВІ МОВОРА!АРЗОВСИАМБІ БІ НАСМАЕРАМРМАОЗНУУВААДЕВНЕІ ОБГБЕІАМ/ГАЕРІ ЕКТ
СОМРААМАЕМІАЗКНАНВИї 5554ЇІ РАІ ТЕАЕВВІ І. КаТУрЕСАЇ МНЕТТАЕУМНЕОГ даЗзАУОЗОоВО
ІОРГООІТВІ З5РТАВІАМІРУ СМАКИ У УвАММИаОМОІМІ ТАБаИ БрОАГЕВОВІ АКУМІ ЕКМІ ОБЄМ.
КАМ ІОКУВІКЕУМАРЕКІ АЕЕКЗКРАГСЕЕТЗОРКАКОЗОЗІОЄУМКМІЗЗЗИаЕРЗЕМЗЗЗАОЗОТОКМТЕ
СТУС РА (5ЕО ІЮ МО: 149).
Макак-резус (я ЕГАС на М-кінці):
ВУКООООКІЕЕЗСОВИавВАУМЗКМРМЕТРУМЕЗОЇ ГІ МОТЕРКМЕРУСс.МОатТаАГ ОМЕаБМУККОС
КаРБЗІМОНЕМНТНІ КМУЗЗТМОа5ЗЗОБМІРІ ЕКОЇ ЗАГОРІСМЗЕМОЕБІЗМ РВІ ЕРОСІМТМАМАКаИ ОО
УУМАГО5І МІ АМІЕРІМТІ МНУ/ОІ РІ АГОЕКМИаСИУКМОПТПОТЕМОМАТМСРОТЕС,ОВУКУУТІНМРУ
ГМАУнНахатамнаАРСЕКОМІ ААМУ ТМанМ кКАНОЗКУМНМУМТНЕАРНОКОИУМІ 5ІТІ СЗНУМЕРМА
ЗЕМТМОІЇ КСООЗБМУБЗМІ СМ ЕАМРІНИВСОМРЕСМКККІ І ІІ РІ ЕЗЕАЕКМЕУВИатТАОЕЕБАЕЗЕеаР
Зо ММЕКРІ МГМАКМСИОмМУ5І МІ ВЕАГМУЛКГЕММУМРОШАЄМСОСХМЕТОЗНУКТЕОТТАІМММКМРІ ЗОМ.
ОАІВІОБІВМЕаМТАМ БІ ОСЕЕМОБАМТІВ Ваг ЕМУОЕМЗКОКЕВКРКЗЗАНУУКОПАЕМСИ ЕІ КЕ
АТРОМОСОЕБЕРСОЕБЗУСМУТЕЗМІ КРЕЗМАЗОЗРОЕЗОРМІ УУМ/МАТОаМАГІ НАМЕСУВІ КТАПРАОСТО
ЕММІККОЇ ЕМ АВМКУТНУВЕАГ ОМ АБМІ РТОМІ БАУМАОАЇІ ВМ АСУМ5ЕІ КІ СІЗАММТІ МУРТ
НАНІ аг РЕРІ ГНАССУМ МРЗТМЕАРОАУАдаї СРОБГ срІ МКІМТІМЕРМАГ БО УМАЗОМОТУСААН
МІГ УМАНАГАМУВІ МОВОРА!АРЗОВСИАМБІ ЗІ НАСМ/АЕРАМРМАОЗНУУВААДЕВНЕІ ОБГБЕІАМ/ГАЕРІ ЕКТ
СОМРААМАЕМІАЗ5КНА ВИЇ 5554АЇІ РАІ ТЕАЕВВГ І КИаТУМОЕСАЇ МНЕТТАЕММНЕОГ даЗзНУОЗОВО
ІОРГООІТВІ З5РТАВІАМІРУ СМАКИ У УвАММИаОМОІМІ ТАБаИ БрОАГЕВОВІ АКУМІ ЕКМІ ОБЄМ.
КАМ ІОКУВІКЕУМАРЕКІ АЕЕКЗКРАГСЕЕТЗОРКАКОЗОЗІОЄУМКМІЗЗЗИаЕРЗЕМЗЗЗАОЗОТОКМТЕ
СТУС ЕГМ (ЗЕО ІЮ МО: 150).
Як показано в Таблиці 4, було виявлено, що більшість антитіл, наприклад, 6012, 1104 і 8Е1, зв'язуються з КІВ кролика, яванського макака та макак-резусів і біля половини анти-кі В антитіл, наприклад, 8С5, 14Е6 і 14С6, зв'язуються з КІ В миші та пацюка.
Таблиця 4
Зв'язування мишачих анти-КІ В антитіл з КІ В із різних видів
ВЕС ПИВ НИНІ НСС СТЕ
. миша пацюк кролик Макак-резус антитіло макак 14066 ТАК ТАК ТАК ТАК ТАК
Продовження таблиці 4
Приклад 6. Картування епітопів анти-Кі В антитіл.
Щоб визначити, чи зв'язують анти-КІВ антитіла позаклітинний домен (ЕСО) людського альфа-Клото (КГ А), була використана конструкція, що має наступну послідовність.
Передбачена експресована поліпептидна послідовність (з С-кінцевим (внутрішньоклітинним)
НАС):
ЕРОДРИАОТГМАВЕЗАРРАРЕААСІЇ ГОСТЕРОСЕЇ МАМавЗААМОТЕСсСМООнНакаАІМОТЕТН
НРГАРРЕОЗАМАБІ РІ САРЗБРІ ОРАТаЮМАБЗОЗУМММЕРВОТЕАЇ ВЕ аУТНУВЕБІЗБУХАВМІ РМаБЗА
СМРМАЕСІ ВУУАВІГЕВІ ЕЕГ ЯМОРМУМТІ МНУ/ОГ РОВІ ОБАМСаСсСУАМААГ АОНЕВОМАЕЇ СЕВНЕ ,аОМКУУМПІЮМРУУМАМУНИа МАТОВІ АРСІВИаЗРВАЇГ СМ МАНМІ ГГ АНАКУМНІ ММТЗЕАРТОСЮОЯЮ
МБІАЇ 5Б5НУМІМР ААМТОНЗІКЕСОКІ ОЕМ СМ/РГАКРУБІВИаОМРЕБЗМКММІ ЗІ РОЕТЕЗЕККРІКСОА
ТАОЕРАЇ СЕРСРТІ 5ЕОЇ ГОРНМКЕРОЇ ЕЗРМІ ВО І ЗУМОЇ ЕЕМНРОЇІРІМЕМСМ ЕМ ТКА ОрАКУ
МУМІ ККРІМЕТІ КАІК ВСИОМОМІСМ ТАМ ЗІ МОСС ЕЕ НАСУЗІВВИЇ ЕММОРІ ЗО0ОКМІ І РКЗЗАЇ ЕМО
КИПЕКМОЕРРІ РЕМОРІ Е2ТЕРСОСБАМС,УМОММІОМОТТІ БОЕТОІ МУМ М ОМННЗКАКУрИ,УМТК
КАКЗУСМОРГААІОРОІАТ ОЕЄМНУТНЕВЕБІ СУХА РІ аМОБОММНТІ ОММАСМАЗЕЇ МАУМІТРУМ
А МОРМАРМОІ РА ГАВОСАМУЕМРУТАЇ АРАЕМАВІ СЕОБЇ аНнННУК УТ ММЕРУТАММТУЗАС
НМ 'КАНАГАМУНУУМЕКЕАНАОМОИКІВІАЇ ОАОУМІЕРАСРЕЗОКОКЕМАЕВМІ ЕБЕОІСУМІ АЕРІБаа За
ВОУРМУУМАВМ І МОВММЕГРМЕТЕВСЕККИООСТЕОРГАГЗНУТТІ МОЗЕКЕОРІКУМОМ ЕМОЕМТОІТ
МІ МЗРБООМАММУРУЇ ВКМІ МУМІ КЕКМОа ОЇ РММИЗМИа! рраі НАЕОВОЇ ВУУУМОМУІМЕАЇ КАНІГО
СІМ. СОМ ЕАУЗЕМОВТАРАРСОЇ УАХААВОБГЕРКАЗМКНУВКІЮЗМИаЕРОРЕТІ ЕВЕСРЕЕРТУСТЕС
ЗЕЕНТАК5БІ ГАРІАРІ ЕЕАБІЇБІ 5 ТЕМ УЗККИавАЗУКІ ЕОУКООООК (ЗЕО ІЮ МО: 151).
Обидва білки КГ А та КІ В мають два глікозидаза-подібних домена, один М-кінцевий і один С- кінцевий. Щоб визначити область КІВ, розпізнавану антитілами, анти-КІВ, РКІВ, ВКА і химерну конструкцію, що містить М-кінцевий глікозидаза-подібний домен ПКІА і С-кінцевий глікозидаза-подібний домен ПКІВ, клонували в експресійний вектор ссавців рРСММ-Тад4А (Адіїепі). М- і С-кінцеві домени ПКГА та РКІ В відповідають послідовностям 5ЕО ІЮО МО: 151 і
ЗЕО ІЮ МО: 145, відповідно, як показано в Таблиці 5. М-кінцеві домени НКІА та ЯКІВ були розділені на 5 сегментів, ії С-кінцеві домени були розділені на 5 сегментів на основі гомології послідовностей між двома білками.
Зо
Таблиця 5
Підпослідовності КГ А та КІ В
Сегмент 2 ЕСО КІ В 78-184 із БЕО ІЮ МО: 145
Продовження таблиці 5
Антитіла згідно з даним винаходом аналізували за допомогою ГАС, і приблизно половина антитіл за даними цього аналізу розпізнавала М-кінцевий глікозидаза-подібний домен ПКІВ, у той час як інші антитіла розпізнавали С-кінцевий глікозидаза-подібний домен (Таблиця 6). Як показано в Таблиці 6, два антитіла, які розпізнають М-кінцевий домен ПКІ- В, зв'язують частину домена, що містить сегмент 1, у той час як іншим для зв'язування необхідні тільки сегменти 2-5.
Таблиця 6
Картування зв'язування мишачих анти-КіІ В антитіл
Приклад 7. Визначення біспецифічних антитіл, які специфічно активують комплекс
ЕСЕВ'Тс/КІ В.
На підставі здатності К1МАБ активувати ЕОЕКІ у вигляді Раб була отримана молекула, в якій більше низькоафінне КІМАБ було приєднано до більш високоафінного анти-КІ В антитіла, що призвело до створення біспецифічного анти-Кі В/анти-ЕСЕМК1 антитіла (Фіг. бА;
МО2012/158704).
Не бажаючи обмежуватися конкретною теорією, автори припускають, що ЕсЕ21- опосередкована активація відбувається шляхом залучення ЕОЕ21 до комплексу ЕСЕКІ1сС/КІ В через С-кінцевий КІ В-сполучний хвіст, у той час як детермінанти для ЕСЕК-специфічності розташовуються в М-кінцевій області, що, імовірно, зв'язується з ЕСЕК з низькою афінністю (див. Фіг. 6В) (Жіе еї а. ЕБЕВ5 Гей. 583(1): 19-24 (2009). Таким чином, приєднання низькоафінного КІМАБІ до високоафінного анти-КІВ антитіла у вигляді біспецифічного антитіла може призвести до КІ В-залежного агоністу ЕСЕКІ. Не бажаючи обмежуватися конкретною теорією, автори припускають, що біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕСЕКІ1 антитіло, яке включає плече ЕСОЕКІ, що має низьку афінність, може знизити ризик міцного зв'язування біспецифічного анти-КіІ В/анти-ЕОЕМКІ! антитіла з РОКІ під час відсутності КВ і ризик запобігання зв'язування й/або активації ЕСОЕКІ1 іншими лігандами ЕСЕ (наприклад, ЕСЕ1, ЕСЕ2,
ЕСЕ8 їі РСЕ23). Крім того, плече ЕСЕКІ1 з низькою афінністю уможливлює присутність більш високих рівнів домішок анти-ОгКІ!, включаючи, без обмеження, половину антитіла анти-
ЕСЕКІ, що несе виступ, нековалентні димери анти-РОЕКІ1 антитіл, ковалентні димери анти-
ЕСЕКІ і форми з високою молекулярною масою, які не призводять до клінічно значимих побічних ефектів.
У даному описі БЕКВІ, загалом, відноситься до будь-якого із декількох біспецифічних анти-
КІ В/анти-ЕСЕКІ антитіл, розкритих в даному описі. Докладні дані про конкретні біспецифічні анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіла, розкриті на фігурах, представлені нижче. Клітини НЕК293 котрансфікували сумішшю чотирьох експресійних векторів, що кодують важкі та легкі ланцюги анти-РОЕКІ (УУ/182.2 (КІМАБІ) і 182.3 (КІМАБ2)) й анти-КІ В антитіл, описаних вище.
Важкі ланцюги анти-ЕОЕКІ й анти-К/В були відповідно позначені Ріад-пептидом й Осі- гістидином, так що гетеродимер Ідсї може бути очищений за допомогою послідовного афінного очищення із кондиціонованого середовища. Частково очищений гетеродимер ІдСсь потім аналізували в люциферазному аналізі САЇГ--ЕЇ К1 для ідентифікації КІ В-залежних агоністів. Щоб звести до мінімуму неправильне спарювання важких і легких ланцюгів, анти-ЕОЕКІ1 був експресований з людською константною областю Бар, а анти-КЇВ був експресований з мишачою константною областю Рар. Мічені біспецифічні Ід; спочатку були випробувані в неочищеному вигляді з використанням 28 комбінацій З анти-К1МАбБЗз і 18 анти-КІ В АБ (Таблиця 7).
Фіг. 7А показує дані з індукції для деяких біспецифічних комбінацій УМ/182.2 (К1МАБТІ), "УМ182.3 (ЕІМАБ2) ії УМ/182.5 (КІМАБЗ) з 1805, 12А11 і 14Е6 в люциферазному аналізі САЇ -
ЕКТ. У більшості випадків, було відзначено, що активований біспецифічними антитілами сигналінг значно краще відбувається в клітинах, які коекспресують ЕСЕМКІс і КІ. В, у порівнянні з клітинами, які експресують тільки ЕСЕКТс, але не КІ В.
На підставі даних про активність цих антитіл у початкових експериментах 8 репрезентативних анти-КІ В АБ (РПЖ5, 805, 12А11, 14310, 6012, 1104, 6С1 ї, як негативний контроль, 14Еб) були використані для одержання немічених біспецифічних антитіл з УМ/182.5 (одержували за допомогою описаної вище технології "виступ-в-западину" і використовували для подальшого дослідження (див. вище, і, наприклад, в АїмеїЇ, еї аї РЕВ5 І ей. 583(1): 19-24 (2009)). Як показано на Фіг. в8А, біспецифічні антитіла були отримані з константною областю
Ідс21 людини (дикого типу, з ефекторною функцією (1)) і з константною областю ІдДС1 людини з
Зо мутацією М2975 для усунення ефекторної функції (3) або константною областю миші з подвійною мутацією (026505/М42975| (АМС) для усунення ефекторної функції (2).
В таблиці 7 нижче перераховані різні біспецифічні антитіла, які були отримані з використанням технології "виступ-в-западину".
Таблиця 7
Біспецифічні анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіла
ВА | нтИ-ЕОЕВМі плече НТ ЕСЕНІ Анти-КІ В плече Анти-КІ-В
ЩВ платформа платформа
УМм182.3 Людський Ідс1 РПЯ5 Людський Ідс1
УМм182.2 Людський Ідс1 РПЯ5 Людський Ідс1 - Химера мишачий
УмМм182.3 Людський Ідс1 14Е6б МН/МІ-людський ІдС1 - Химера мишачий
УмМм182.3 Людський Ідс1 805 (КІ ВтАБІ1) МН/МІ-людський ІДС - Химера мишачий уУм182.5 Людський Ідс1 1104 (КГ ВтАБ5) МН/МІ -людський ІСІ - Химера мишачий во уУм182.5 Людський Ідс1 14010 (КІ ВтАбБЗ) УН/МІ-людський І9С1 - Химера мишачий
УмМм182.5 Людський Ідс1 6С1 (КІ ВтАбаі) МН/МІ-людський ІДС - Химера мишачий
Що уУм182.5 Людський Ідс1 6012 (КІ ВтАбБб) МН/МІ-людський ІДС - Химера мишачий
Що УмМм182.5 Людський Ідс1 12А11 (КІ ВтАбБг) МН/МІ-людський ІдС1 - Химера мишачий
УмМм182.5 Людський Ідс1 805 (КІ ВтАБІ1) МН/МІ-людський ІДС 11. |МмМм1825 Людський!9б1 8с5КАНЗ.ВМІ. Людський ІдДС1 М2970
М2970
Продовження таблиці 7
Людський Ідс1 -
Химера людський 20 |МмМ/182.5 МН/М-мишачий Мишачий 805 Мишачий ІдСсга ОАМаИа
Ідс2га ОАМСа
В якості контрольного ізотипу (30 були використані антитіла проти аглютиніну амброзії (мишачий Ідсі2а) або людські анти-Нег2 антитіла трастузумаб (94051 людини). Рар-фрагменти експресували в Е.соїї й очищали з використанням звичайної колоночної хроматографії. За винятком ЕСЕ21, що був використаний в аналізі зв'язування радіоактивно міченого ліганду з клітинами, що проводили з йод-міченим ЕОСЕ21 від Ріоепіх РІагтасешісаіє і зробленим самостійно неміченим ЕСЕ21, рекомбінантний ЕОСЕ21 для всіх інших аналізів був отриманий від
ВО Бувієтв (2539-Е6/СЕ). Кожна з біспецифічних комбінацій (за винятком негативного контролю) показала залежність сигналінгу від ЕСОЕКІс і КІВ. Дані для деяких комбінацій показані на Фіг. 7В. Крім того, сполучення плечей анти-КІ В і УМ/182.5 (КЕ! МАБЗ) показало більш низький фоновий сигналінг у клітинах, які експресують ЕСЕКІ1с, але не КІ В.
Як показано на Фіг. 6С, активність анти-КІі В/Ланти-ЕОЕКІіс антитіла (В5АБ17) була протестована на клітинах НЕК293, дефіцитних за ЕСЕК'І, які експресують різні рецептори.
Клітини НЕК293Т, дефіцитні за ЕСЕКТІ, були отримані з використанням способу СКІЗБРЕ -са59 за допомогою осгідових РНК. Анти-КІ В/анти-ЕОЕКІс антитіла показали індукцію активності люциферази в рекомбінантних клітинах, які коекспресують ПЕСЕРМК с і РНКІ В (Фіг. 6С).
Аналогічні результати спостерігалися для інших анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1с антитіл. Як показано на Фіг. 7С, при тестуванні в люциферазному аналізі ЗАЇ-ЕЇК!1 в клітинах НЕК293, які експресують ЕСЕМК1с разом з КІВ або без нього, множина комбінацій біспецифічних антитіл із плечей анти-ЕОЕКІ й анти-КІ В, наприклад, В5АБ5, 6, 7, 8, 9, 10, дозозалежно індукували активність люциферази в клітинах, які експресують рекомбінантні ПЕСОЕКІТс і КІ В, але не в клітинах без експресії КІ В. Ці результати вказують на те, що ці біспецифічні антитіла діють як
КІ В-залежні агоністи ЕСЕ, так само, як ЕСЕ21.
Також була протестована синергія антитіла анти-КІ В/анти-ЕОЕК1с (В5АБ17) з ЕСЕ21. Як показано на Фіг. 9В, між В5АБ17 і ЕОБЕ21 не спостерігалося синергії, коли послідовно збільшували концентрацію ЕСЕ21, а концентрацію В5АБ17 залишали незмінною.
Крім того, коли концентрацію анти-КіІВ/анти-ЕОЕКіс антитіла (В5АБ17) послідовно збільшували, а концентрацію ЕСЕ21 залишали незмінною, між В5АБбБ17 і БОБ21 не спостерігалося синергії (Фіг. 9С).
Зо Афінність зв'язування (Ка) двох біспецифічних антитіл, В5БАБІО і В5АБО, (поряд з ПЕСЕ21) у розчині з клітинами НЕК293, які експресують КІВ людини, яванського макака та миші, ЕСЕК1с людини або обидва білки ПЕСЕКІс і КІВ, вимірювали за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно міченого ліганду. Для аналізу зв'язування клітинами радіоактивного ліганду клітини НЕК293, які стабільно коекспресували КІВ і/або ЕСОЕКІТс, поміщали в 96-ямковий планшет при щільності від 100000 до 200000 клітин на 0,2 мл сполучного буфера (ОМЕМ з 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВА), 50 мМ НЕРЕЗ, рН 7.2, 0,1 95 азиду натрію та 350 мМ людського ІдС). До клітин додавали суміші для реакції конкуренції об'ємом 50 мкл, що містять фіксовану концентрацію йод-міченого ЕСЕ21 (Рпоепіх Рпагтасецшііса!5) або йод-міченого В5АБ і серійні розведення неміченого ЕСЕ21 (Сепепіесії) або неміченого В5зАБ. Реакційну суміш для конкуренції інкубували з клітинами протягом 2 год. при кімнатній температурі. Після 2 год. інкубації реакційні суміші для конкуренції переносили у фільтрувальний планшет МіПроге
Мийібзсгееп і промивали чотири рази буфером для зв'язування, щоб відокремити вільні йод- мічений ЕСЕ21 або антитіло від зв'язаних. Активність фільтрів зчитували на гамма-лічильнику
Умаїїас Умігага 1470 (РегкіпЕЇІтег І бе й Апаїуїіса! Зсіепсе5). Дані про зв'язування були оцінені з використанням програмного забезпечення Мем/ Гідапа (Сепепіесі), що використовує алгоритм апроксимації Мансона та Родбарда (Мипзоп апі Кодьага Апаї. Віоспет. 107, 220-239 (1980)) для визначення афінності зв'язування.
Як показано в Таблиці 8, обидва антитіла виявили гарну реакційну здатність стосовно клітин, які експресують тільки КІ-В (міжвидовий паттерн відповідає спостережуваному раніше), але обидва антитіла набагато слабкіше зв'язуються з клітинами, які експресують тільки
ПЕСЕН, і більш сильно зв'язуються з клітинами, які експресують НКІ В і ПЕСЕК1с.
Таблиця 8
Зв'язування біспецифічних анти-КіІ В антитіл з КІ В/ЕОЕКІ із різних видів
ВвАБіО | ббнм | ї155нМ | 1558мМ | 23нМм | зоонмМ
ВвАрУ | 98нМ | З5нМ о |немаєданихі | 22нМ | зоонМ
Фіг. 90 показує афінність В5АБІ0 і В5АБУ до клітин НЕК293, які стабільно експресують РНКІ В,
ПЕСЕМКтс або обидва білки, у порівнянні з антитілом із двома відповідними сполучними анти-
ЕСЕКІ плечима (/М/182.5) за даними аналізу ГАС5. Були отримані результати, аналогічні зазначеним вище (Фіг. 903.
Подальші експерименти проводили з одним біспецифічним антитілом, В5АБ10, що має
УММ182.5 в якості анти-ЕОЕКІ плеча та 8С5 в якості анти-КІ В плеча, і похідними В5АБ10 (В5АБ11-20). Як показано на Фіг. 6С, мишачі рецептори були експресовані в клітинах НЕК293, і було показано, що В5АБ17 також індукує активність люциферази в цих клітинах, що підтверджує видову крос-реактивність цього АБ.
В5АБІ0 потім було протестовано в міобластах пацюка 16, в яких відсутні ендогенні КІ В і
ЕСЕРЕ, але які були трансфіковані для експресії НКІ В і кожної з 5 іззоформ ПЕСЕЕ (Фіг. 9А). Було виявлено, що В5АБІТО індукує активність люциферази тільки в клітинах, які експресують як
ЕСЕКІс, так і КВ, що вказує на активність В5АБІ1О в якості специфічного агоніста для комплексу ЕСЕКТсС/КІ В, але не КІ В у комплексі з іншими ЕОСЕК (фіг. 9А). ЕОЕ21 і ЕСЕ19 були використані як контроль, щоб продемонструвати, що ЕОЕ21 індукує активність люциферази,
Зо коли клітини експресують комбінацію КІ В і будь-якого із ЕСЕКТс, 2с або Зс, і що ЕСЕ19 індукує активність люциферази, коли клітини експресують комбінацію КІ В і ЕСЕКА4. За винятком ЕСЕ21, що був використаний в аналізі зв'язування радіоактивно міченого ліганду з клітинами, що проводили з йод-міченим ЕОСЕ21 від Ріпоепіх Рпагтасеціїса!5 і зробленим самостійно неміченим
ЕСЕ21, рекомбінантний ЕСЕ21 для всіх інших аналізів був отриманий від НО бувієтв (2539-
ЕС/СЕ). кКДНК, що кодують позаклітинний домен (ЕСО) людських ЕСЕКТБ, 1с, 26, 2с, ЗБ, Зс іі 4, були клоновані в експресійний вектор, що містить промотор цитомегаловірусу (СММ), щоб одержати химерні білки людський ЕСЕК-людський Ес або Нів-мічені білки ЕСЕ.
Проте, як описане вище, вихідне анти-ЕОЗЕКТс антитіло для В5АБ1О, КІМАБЗ (УУМ182.5), зненацька може зв'язуватися з ЕСЕК16Б, ізоформою ЕСЕКІ, що не вступає у взаємодію з КІ В.
Крім того, КІМАВЗ (УМ/182.5) може активувати ЕСЕКТЬ в аналізі САС-ЕЇ КІ в клітинах 16, що відрізняється від активності В5ЗАБ1І0 (див. Фіг. 2С і 28).
Крім того, сполучення ЕСЕКТЬ і КІ В не призводить до активації під дією В5АБТ1Т0 (Фіг. 9А). Не бажаючи бути обмеженими якою-небудь конкретною теорією, автори припускають, що ці дані свідчать про те, що наявність попередньо сформованого комплексу ЕСЕКТ/КІ В є необхідною умовою для КІ В-залежної активації ЕСЕКІ під дією В5АБІ10.
Приклад 8. В5АБТІ0 і його похідні діють як молекулярні міметики ЕСЕ21.
Подальше дослідження В5АБ10 і його похідних (В5АБ11-20) і ЕОЕ21 виявило деякі подібності та розходження. Для визначення рівня фосфорилювання проміжних учасників сигналізації МАРКО клітини вирощували у базальному середовищі-2 для преадипоцитів, що містить ЕВ5, І-глутамін і ЗА-1000. При досягненні клітинами суцільного покриття підшкірні преадипоцити (придбані в І опла) диференціювали в культуральному середовищі, що містить дексаметазон, індометацин і 3-ізобутил-1-метилксантин (ІВМХ). Для аналізу експресії генів клітини диференціювали протягом 14 днів, а потім додатково культивували протягом додаткових 48 годин із зазначеними агоністами. Для аналізу сигналінгу МАРКО клітини диференціювали протягом 10 днів, культивували в середовищі без сироватки протягом З год., а потім культивували протягом додаткової години із зазначеними агоністами.
Як показано на Фіг. 60, за даними вестерн-блоттингу В5АБ10, В5АБр17, В5АБр20 і ЕСЕ21 виявили порівнянну активність відносно індукції фосфорилювання проміжних учасників сигналінгу МАРКО, таких як МЕК і ЕРК, у первинних людських адипоцитах, які являють собою релевантний тип клітин для анти-діабетичної активності ЕСЕ21. Антитіла, які використовували для Вестерн-блот аналізу, були отримані від СеїЇ бБідпаїйпу Тесппоіоду: рЕн52а (1196) (Ж3864),
РМЕКТ/2 (5217/2211) (29154), рЕВКТ/2 (1202/204) (24370), ЕНКТІ/2 (44695), Н5РЗОО (44874), Д- актин (Ж 5125), від Абсат: ОСРІ (аб10983) або від КО бузіетв: КІ В (АЕ2619).
Як показано на Фіг. 88, посилення фосфорилювання ЕКК, представлене у вигляді кратної зміни рівня рЕКК, спостерігалося у первинних людських адипоцитах, оброблених В5АБІ0,
В5АБІ17, В5АБ20 або ЕСЕ21.
Крім того, профіль афінності ВБАБ1О нагадує ЕСЕ21. При тестуванні за допомогою ГАС5
В5ЗАБІТ0 показало сильне зв'язування з клітинами, які експресують ПКІ В, поза залежністю від коекспресії ЕСЕКТ с (Фіг. 10А). Несподіваним стало дуже низьке зв'язування В5АбБІ0 з клітинами, які експресують ЕСЕКТс, але не КІ В, що вказує на надзвичайно низьку моновалентну афінність плеча УУУ182.5 (Фіг. 10А).
Як представлено на Фіг. 10В, аналіз зв'язування радіоактивного-міченого ліганду показав, що константа дисоціації (Ка) ВЗАБ10 для клітин, які експресують як ЕОЕКІс, так і КІ В, становить 2,3 НМ і близька до 5,3 нМ для ПЕОЕ21 в аналогічному форматі аналізу. Ці значення близькі до спостережуваного ЕСвхо цих молекул в аналізі САЇ-ЕЇ К1 в клітинах НЕК293 (3,2 НМ і 4,7 нМ, відповідно, для В5АБ1О і ЕОЕ21). При експресії в клітинах тільки людського КІ В або тільки мишачого КІ В Ка склали 6,6 нМ і 15,5 нМ, відповідно.
Оскільки афінність до ЕОЕКІ1 була настільки низькою, аналіз зв'язування радіоактивного- міченого ліганду не дозволяє вірогідно визначити Ка В5АБІ10 для клітин, які експресують тільки
ЕСЕКТс, але, за оцінками, вона становить » 300 нМ, як показано на Фіг. ЗВ. З тієї же причини
Зо кінетика зв'язування В5АБІ10 з ЕСЕКІ не може бути вірогідно визначена й за допомогою ЗРЕ.
Крім того, взаємодія між більами ЕСЕК1Тс-ЕСО і КІ В-ЕСО стабілізувалося В5АБІ0, як раніше спостерігалося для ЕОБЕ21, що погодиться з припущенням, що В5АБІО діє як ЕОЕКІ1с- селективний міметик ЕСЕ-21 (Фіг. 11) (мМіе еї а)Ї., Снпетіса! Віоїосау; Огид Оезідп 79, 398-410 (2012)). Взаємодія ЕСЕК1Т/КІ В/В5АБ10 була вивчена за допомогою вимірів з використанням поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) на приладі РКОТЕОМ"М ХРЕЗб (Віо-Най
І арогасогієз) при температурі 25 "С. Білок ЕСЕН1-Нів (20 мкг/мл) при рн 4,5 іммобілізували при поверхневій щільності (1000 КІ) на активований сенсорний чип РКОТЕОМ'" М ІС з використанням стандартних процедур амінного зв'язування, як описано виробником. В5АБ1Т0 і/або суміші 1:1 В5АБІ10 і КІ В-ЕСО вводили при концентрації 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100
НМ або 200 нМ у РВ5, що містить 0,005 95 об'єм/об'єм ТУМЕЕМО-20, 0,3М Масі (рн 7,4), при швидкості потоку 80 мкл/хв і записували сенсограми фаз асоціації та дисоціації. Зразки вводили протягом 300 с, після чого дисоціацію оцінювали протягом 600 с. Дані порівнювали з внутрішніми контролями, обробляли та вимірювали константи дисоціації за допомогою програмного забезпечення РЕОТЕОМ"М Мападег (версія 3.0, Віо-Кай). Передбачається, що активація комплексу ЕСЕКІсС/КІВ під дією В5АБІ10 відбувається шляхом утворення трикомпонентного комплексу з ЕЗЄЕК1Тс-ЕСО, КІ В-ЕСО і В5АБІ10.
Як показано на Фіг. 11, було також відзначено, що В5АБ1О формує потрійний комплекс з рекомбінантними КІВ-ЕСО і ЕСЕ21 або ЕСЕ19. Взаємодія В5БАБТО/КІ В/ЕОЕ була вивчена за допомогою інтерферометрії біошару (ВІЇ), виміряної на приладі Осієї КЕЮ (РогевВіо) при температурі 25 "С. В5АБІ10 (20 мкг/мл) при рН 4,5 іммобілізували на активованому реагуючому з аміногрупами біосенсорному чипі, як описано виробником. КІ В-ЕСО (20 мкг/мл) у РВ5, що містить 0,005 95 об'єм/об'єм ТУМЕЕМО-20, 0,3 М Масі (рн 7,4), захоплювали на тих же самих біосенсорних чипах, після чого проводили вимірювання з БОЕ21 (КО бЗузіет5) при концентрації 0, 0,2, 0,8, або 2 мкМ у тому самому буфері. Якісні дані були оброблені за допомогою програмного забезпечення для збору даних (ЕопевВіо).
На Фіг. 12А показана схема проведеного експерименту з резонансним флуоресцентним переносом енергії з часовим дозволом (ТК-ЕКЕТ) на поверхні клітин. Для ТКЕ-ЕВЕТ СО57- клітини котрансфікували для експресії «МАР-міченого ЕСЕКІ і неміченого КІ В і висіювали в 96- ямковий планшет із прозорим дном (Собвіаг) у кількості 100000 клітин на ямку. Трансфіковані бо клітини мітили через 24 год. після трансфекції 100 нМ кон'югованого з донором бензилгуанін
ЗМАР-Ї иті4-ТЬ (Сівбіо) і 1 мкМ кон'югованого з акцептором бензил-гуанін ЗМАРАЇехаб47 (МЕВ) протягом 1 год. при 37 "С, 5 956 СО». Після трьох промивань випромінювання Гиті4-тр і сигнал
ТВА-ЕКЕТ реєстрували при 620 нм і 665 нм, відповідно, протягом 400 мкс після затримки на 60 мкс після порушення лазером з довжиною хвилі 343 нм із використанням планшетного спектрофлуориметра заїїге2 (Тесап) при ї-0 і 1-15 хв після додавання ліганду. Сигнал емісії
АІехаб47 був виявлений при 682 нм після порушення при 640 нм на тому самому планшетному спектрофлуориметрі. Інтенсивність ЕКЕТ потім обчислювали в такий спосіб: (сигнал при 665 нм клітин, мічених ЗМАР-донором і ЗМАР-акцептором) - (сигнал при 665 нм тих самих трансфікованих клітин, мічених ЗМАР-донором і не мічених ЗМАР-акцептором).
Як показано на Фіг. 128, експеримент ТК-РКЕТ дозволяє припустити, що В5АБбІ17 і ЕСОЕ21 обидва підсилюють димеризацію ЕСЕК1ІТс-ЕСО, коли КІВ також є присутнім в клітині.
Результати представлені як відношення ЕКЕТ: інтенсивність ЕКЕТ, розділена на випромінювання донора при довжині хвилі 620 нм.
Крім того, ВБАБІТО зв'язується з С-кінневою половиною КІ В-ЕСО, у той час як ЕОБ21 і
ЕСЕ19, приблизно, зв'язуються з сайтом в М-кінцевій половині КІ В (Соеї еї аІ. Мої. СеїІ. Віої. 32(10): 1944-54 (2012); Бої еї а. 5сі. Тгапв5і. Мед. 4: 162га153 (2012)), що свідчить про те, що епітоп В5АБІО на КІВ повинен відрізнятися від сайту зв'язування БСОБЕ21 і ЕОЕ19. Для картування епітопу КІ В для В5ЗАБІТ0О проводили зв'язування 8С5 (КІ В-сполучне плече В5зАб10) з серією химерних антигенів, які експресують в клітинах НЕК293. Кожний химерний білок був сконструйований шляхом злиття КІВ людини й альфа-Клото (КІ А) людини (50 95 ідентичності з білком КІВ людини) або КІ В кролика (86 95 ідентичності з КІ В людини). Як показано на фіг.13В, 8С5 зв'язується з С-кінцевим доменом КІ В, зокрема, з областю, що містить 34 амінокислоти в
С-кінцевому домені КІ В (55РТКГАМІРУУЄУВЕКІ ГЕ УМУУКе:МУООМОМІТАБ; ЗЕО ІО МО: 142).
Як показано на Фіг. 13В, амінокислотна послідовність ЗЕО ІЮ МО: 142 може відповідати амінокислотам 857-890 білка КІ В, який включає сигнальну послідовність, наприклад, таку як послідовність з 52 амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 157, або може відноситися до амінокислот 805-838 білка КІ В, який не включає сигнальну послідовність.
Незважаючи на подібність між ЕОЕ21 і В5АБІ0 ії його похідними в активності, що має місце після зв'язування з рецептором, епітоп В5АБІТО на КІ В відрізняється від сайту зв'язування
Зо ЕСБЕ21 ї ЕСЕ 19 (Фіг. 14А).
На Фіг. 1488 показані результати люциферазного аналізу СЗАЇ-ЕЇКІ!, виконаного на міобластах пацюка 16, котрансфікованих ЕСЕК4 і КВ й оброблених ЕСЕ19 окремо або в комбінації з анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1с антитілом (В5АБ17). Як показано на Фіг. 14В, попередня обробка В5АБ17 також не блокувала активність ЕСЕ19 в клітинах І 6, які експресують комплекс
ЕСЕВАЖКІВ.
Крім того, як показано на Фіг. 14С, попередня обробка В5АБб17 не блокувала активність
ЕСЕ19 в клітинах гепатоми НАШЕ, які експресують ЕСЕКА і КІ В. У присутності ВБАБ17 ЕОЕ19 був ще здатний активувати комплекс ЕСЕКА/КІ В для індукції фосфорилювання ЕКК (Фіг. 14С).
Ці дані вказують на те, що представлене біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-РСЕНВ1, наприклад, біспецифічне антитіло анти-КІ В/анти-ЕОЕМК1с, не заважає взаємодії ЕСЕ19 або
ЕСБЕ21 з комплексом КІ В/ЕСЕК16.
Приклад 9. В5АБІ0О і його похідні діють в якості довгостроково діючого міметика ЕОР21 іп мімо.
Крос-реактивність В5АБІ0 їі його похідних з мишачим рецепторним комплексом, як описано вище (див., наприклад, Фіг. бС и 108), дозволила протестувати його активність іп мімо за допомогою моделей на мишах. Щоб уникнути потенційної токсичності від ефекторної функції
ІДС, у Ес-область В5АБ20 була введена подвійна мутація (О265А/М2970)|, що запобігає зв'язуванню з Есог і залучення імунних ефекторних клітин. Крім того, щоб уникнути потенційної токсичності від ефекторної функції Ідс, у Ес-область В5АБ17 була введена заміна М2970, що запобігає зв'язуванню з ЕсоВ і залучення імунних ефекторних клітин.
Як показано на Фіг. 15А, коли діабетичним мишам др/46 вводили внутрішньочеревинно 5 мг/кг В5БАБ17, рівень глюкози в крові знижувався під час відсутності змін у споживанні їжі та ваги тіла. Миші С57ВІ/6 на дієті з низьким рівнем жиру, що одержали В5АБ17, продемонстрували зниження рівня глюкози в крові, але не досягли токсичної гіпоглікемії (Фіг. 15А).
Крім того, коли мишам С57ВІГ/б на дієті з високим вмістом жирів (індуковане дієтою ожиріння, БІС) вводили В5АБІ17 у дозі З мг/кг у дні 0 і 6, спостерігалося значне зниження ваги та рівня глюкози в крові (Фіг. 158). Для годування відповідно до дієти з високим вмістом жирів була використана дієта з високим вмістом жирів і високим вмістом вуглеводів (Нагіап Текіай
Т0.03584, 58,4 905 калорій з жиру). 60 Як показано на Фіг. 15С, збільшення толерантності до глюкози спостерігалося в мишей
С57ВІ/6 на дієті з високим вмістом жирів (індуковане дієтою ожиріння, БІС), яким був уведений
В5АБІ1І7 у дозі З мг/кг.
У мишей С57ВІ/6 на дієті з високим вмістом жирів (індуковане дієтою ожиріння, 0ІО), яким був уведений В5АБбБ17 у дозі З мг/кг, спостерігалося зниження рівнів тригліцеридів у печінці, сироваткового інсуліну, вільних жирних кислот, тригліцеридів і загального холестерину (Фіг. 150). Аналогічні результати раніше спостерігалися при ін'єкціях ЕСЕ21.
Щоб визначити, чи потрібно для спостережуваного при лікуванні біспецифічним анти-
КІ В/анти-ЕОЕК1с антитілом поліпшення толерантності до глюкози наявність функціонального
КІВ, проводили окремий експеримент на Кірб-гетерозиготних мишах і гомозиготних КІБ- дефіцитних мишах. Для створення КІб-дефіцитних (КО) мишей КІр-специфічну пару нуклеаз із "цинковими пальцями" (2ЕМ) одержували від Зідпта-АІЯгісй і використовували для пронуклеарної мікроін'єкції відповідно до відомих способів. Пара 7ЕМ націлена на наступну послідовність КІ у геномі миші (розрізуваний сайт позначений маленькими літерами), і в мишей
КО не вистачає однієї вилученої пари основ (д виділений жирним шрифтом), що викликає зрушення рамки зчитування: ЗТТАССООСТТСіссддаазАСООсАААОСААТАТОО (5ЕБО ІЮ МО: 156). Фіг. 16А показує М-кінцеву амінокислотну послідовність мишачого білка КІ В і відповідну амінокислотну послідовність, яку кодують алелем КІБб в КІ6-дефіцитних мишей.
На Фігурі 168 наведені результати вестерн-блоттингу, який був виконаний, щоб підтвердити відсутність експресії білка КІ В в КІо-дефіцитних мишей.
Як показано на Фіг. 16С, В5АБ20 поліпшує толерантність до глюкози в КІір-гетерозиготних мишей, що виміряно за допомогою тесту на толерантність до глюкози (ТТ), але не в гомозиготних КІб-дефіцитних мишей, що вказує на необхідність присутності функціонального
КІ В для поліпшення толерантності до глюкози. Для тесту на толерантність до глюкози (ТТ) миші голодували протягом ночі, і їм вводили внутрішньочеревинно 2 г/кг розчин глюкози.
Крім того, на відміну від анти-ЕОЕКІ КІМАБІ, що змінює рівні ЕОЕ23 і фосфору в сироватці (Ми ет аї., сі Тгапзі Меа 3, 11Зга126 (2011) і УМи еї а!., РІ о Опе 8, е57322 (2013)), біспецифічне анти-КІ В/анти-ЕОЕКІ1 антитіло не впливає на ці параметри в сироватці крові, що вказує на відсутність КІ В-незалежної агоністичної активності ЕСЕКТІ (Фіг. 1603.
Як показано на Фіг. 17, В5АБ17 не міняє рівнів ЕОЕ23 або фосфору в сироватці, які є
Зо чутливими маркерами КІ В-незалежного ЕСЕКІ. Дію інсуліну в оброблених В5АБ17 мишей вимірювали за допомогою гіперінсулінемічних-еуглікемічних фіксацій. У цілому мишей анестезували ізофлураном і катетеризували ліву загальну сонну артерію та праву шийну вену для відбору проб й інфузії, відповідно. Вільні кінці катетерів були тонельно виведені під шкірою на задню частину шиї, де вільні кінці катетерів були прикріплені до трубки з МІСКО-
ВЕМАТНАМЕС- (0,033 в 00). Тварин після операції містили індивідуально та щодня реєстрували вагу тіла. Всі метаболічні експерименти були проведені після 5-денного періоду післяопераційного відновлення та були попередньо описані. Мишей у свідомості в умовах вільного поводження поміщали в 1 л пластиковий контейнер з підстилкою та не давали корм з 7:00 ранку (І - -300 хв). Миші були негайно підключені до двоканального поворотного з'єднання із нержавіючої сталі (Іпетесі І абогаюгіє5), щоб забезпечити одночасно інфузію в яремну вену та відбір проб артеріальної крові. Мишей не торкали і вони могли вільно пересуватися, щоб виключити стрес. За 2 год. до початку фіксації в яремну вену вводили болюс 5 мкКі |ІЗ-ЗНІ-О- глюкози (ї - -120 хв), після чого витікала постійна інфузія зі швидкістю 0,05 мкКі/хв. Після 2 год. періоди врівноважування при ї-0 хв (тобто 5 год. голодування) відбирали вихідний зразок артеріальної крові для вимірювання рівня глюкози в крові, (3--НІ-О-глюкози, гематокриту й інсуліну в плазмі. Потім починали процедуру гіперінсулінемічної-еуглікемічної фіксації протягом 145 хв (4 мОд/кг/хв). І3--НІ-О-глюкозу додавали до змінної інфузії глюкози, що була використана для підтримки еуглікемії, а постійну інфузію (3--НІ-Ю-глюкози припиняли, щоб зафіксувати питому активність глюкози в артеріальній крові на постійному рівні. Червоні клітини крові від миші донора лінії С57ВІ /6) промивали та відновлювали в рівному об'ємі 0,9 95 гепаринізованого фізіологічного розчину (гематокрит - 50 95) і проводили їх інфузію зі швидкістю 4 мкл/хв протягом даного дослідження, щоб замінити кров, вилучену під час дослідження. Зразки артеріальної крові брали через кожні десять хвилин, щоб визначити рівень глюкози в крові. При 1-80, 90, 100 ї 120 хв були взяті зразки крові для визначення |З3--НІ-О-глюкози. При 1-120 хв у катетер яремної вени вводили болюс 13 мкКі 2-дезокси "С|глюкози (12-27С2105). При 1-122, 125, 130, 135 ії 145 хв артеріальну кров відбирали для визначення рівня глюкози в крові, І3--НІ|-О- глюкози та (2-2С105 у плазмі. Концентрацію інсуліну в артеріальній крові вимірювали в точках 100 їі 120 хв. При 1-145 хв мишей анестезували. Камбалоподібний, литковий м'яз, білу зовнішню частину латерального широкого м'яза стегна (Оцай), печінку, серце, епідидимальну та підшкірну бо білу жирову тканину, буру жирову тканину та мозок вирізали, негайно заморожували в рідкому азоті та зберігали при -70"С до майбутнього аналізу тканини. Імунореактивний інсулін аналізували з використанням набору І іпсо Каї Кадіоттипоавззау (ГіпсоКезеагесй).
Для вимірювання рівня |ІЗ--НІ-О-глюкози зразки плазми депротеїнізували за допомогою гідроксиду барію (Ва(ВІН)») і сульфату цинку (71505), сушили і визначали радіоактивність за допомогою рідинної сцинтиляції. Вирізані тканини депротеїнізували хлорною кислотою та потім нейтралізували до рН -- 7,5. У частині зразка вимірювали радіоактивність (2-10 і (2-"Сб10а0- фосфат (12-"С1»ІОСР)), а частину обробляли Ва(ОН)» і 7п505, і для неї вимірювали радіоактивність у супернатанті (2-10). Рівні радіоактивності (2-251065 і (2-"Щ1М0-фосфату (2-"Фроср), визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного підрахунку. Швидкості потоків глюкози були оцінені з використанням рівняння нестаціонарного стану, що враховує об'єм розподілу (130 мл/кг). Тканинноспецифічний кліренс (Ка) (2-00 і показник поглинання глюкози (Ко) розраховували, як описано раніше (Кгаедеп, Е.М/. еї аї!.,, Ат. У. Рпузіої. 248, ЕЗ353- 362 (1985)): Ко-42-"С10СРканина/Л ОС (2-7СОсСтплазма, Ное--Као х (глюкоза| плазма, Де (2-2С410СР тканина Є радіоактивністю |(2-7СІОСР у тканині (розпадів у хвилину/г), АОС (2-7С1ОСіплазма Є ПЛОЩеЮ під кривою зникнення (2-10 у плазмі (розпадів у хвилину/мл/хв), (глюкоза|плазма Є Середнім рівнем глюкози в крові (мкг/мкл) протягом часу експерименту (-102-125 хв). Дані представлені у вигляді середнього значення х ЗЕМ.
Як показано на Фіг. 15Е, що представляє споживання глюкози всім організмом, виміряне після однократної ін'єкції ВБАБ17 у дозі 10 мг/кг, ВБАБ17 збільшує швидкість стимульованого інсуліном споживання глюкози всім організмом.
Крім того, як показано на Фіг. 15Е, В5АБ17 підсилює придушення інсуліном швидкості ендогенної продукції глюкози після однократної ін'єкції ВБАБ17 у дозі 10 мг/кг. Ці результати вказують на те, що однократне введення 10 мг/кг ВБАБ17 мишам БІО за 5 днів до фіксації помітно знижувало концентрації глюкози й інсуліну після голодування.
Поглинання глюкози тканинами (Ко) наприкінці стимульованого інсуліном періоду підсилювалося в серці, кістякових м'язах, білій жировій тканині (М/АТ) та міжлопатковій ВАТ тканині (ІВАТ), що вказує на сенсибілізацію В5АБ17 всього організму до інсуліну (Фіг. 1505).
В ході експерименту з фіксації була визначена кількість відхилень рівня глюкози в артеріальній крові. Як показано на Фіг. 18А, в ході експерименту з гіперінсулінемічної-
Зо еуглікемічної фіксації кількість відхилень рівня глюкози в артеріальній крові в мишей, яким вводили В5АбБІ17, відрізнялася від кількості відхилень у мишей, яким вводили контрольний Іда.
Також була визначена різниця у вазі між мишами, яким вводили В5АбБ17, і мишами, яким вводили контрольний Ідсї. Як показано на фіг. 188, зміни в концентраціях глюкози й інсуліну спостерігалися без видимої втрати у вазі.
Після ін'єкції ВБАБІ17 також аналізували стаціонарну швидкість інфузії глюкози. Як показано на Фіг. 18С, стаціонарна швидкість інфузії глюкози збільшилася на 64 95 після ін'єкції ВБАБ17. Ці результати показують, що В5АБ17 поліпшив чутливість всього організму до інсуліну в мишей
ІО ще до того, як стала очевидною втрата ваги.
Попередні дослідження з фармакологічними дозами ЕСЕ19 або ЕСЕ21 показали збільшення витрати енергії (ЕЕ) (Ри еї аї., Епдосгіпоїоду 145, 2594-2603 (2004); СозКип еї аї., Епдостіпоїоду 149, 6018-6027 (2008); Ми еї аї!., Рі о Опе 8, е57322 (2013); іп еї а!., Сеї!! Меїаб 17, 779-789 (2013)), таким чином, було висловлене припущення, що буде спостерігатися аналогічний ефект.
Для розрахунку ЕЕ і дихального коефіцієнта (КО) були використані наступні рівняння.
ЕЕ-МО»2х(3,8154-41,232Хх КО), де (КО-МСО»2/МО»). Дійсно, одна ін'єкція ВБАВ17 БІО або мишам на дієті з низьким рівнем жиру при нормальній кімнатній температурі (21 "С) призвела до значного збільшення споживання Ог2 (МОг), вироблення СО2 (МСО»г) і ЕЕ у тварини після ін'єкції без істотної зміни активності (Фіг. 19А). Зненацька було виявлено, що спостережуване збільшення
ЕЕ на 1115-4695 не супроводжувалося значними змінами в дихальних коефіцієнтах (ВНО-МСО»/МО») (Фіг. 19А).
Аналогічне збільшення ЕЕ без зміни КО було викликане безперервною інфузією ЕСЕ21 мишам БІО (Фіг. 213).
Фіг. 20А показує кількість МО, МСО» і загальне вимірювання активності мишей ОІО, що одержували одну ін'єкцію В5АБ17 при нормальній кімнатній температурі.
Як показано на фіг. 198, збільшення ЕЕ зберігалося, коли температура клітини була підвищена до термонейтральної (29-30 "С), що дозволяє припустити, що викликана В5АБ17 індукція активації коричневого жиру не залежить від адаптивного термогенного входу із симпатичної нервової системи.
Фіг. 208 показує кількість МО, МСО» і загальне вимірювання активності мишей ОІО, що одержували одну ін'єкцію В5АБ17 при нормальній кімнатній температурі з наступним зрушенням бо температури до термонейтральної.
Підвищення ЕЕ було також очевидно, коли мишей 0іІО, акліматизованих до термонейтральної кімнатної температури (29-30 "С), тестували протягом двох тижнів (Фіг. 218).
Як показано на Фіг. 21А, що показує середні величини ЕЕ, зміни в ЕЕ спостерігалися в мишей на дієті з низьким рівнем жиру та мишей 0СІО при нормальній кімнатній температурі й у мишей на дієті з низьким рівнем жиру та мишей 0ІО, акліматизованих у термонейтральній кімнатній температурі.
На противагу цьому, безперервна інфузія агоніста ВЗ-специфічних адренорецепторів Сі - 316,243, як й очікувалося, індукувала гостре підвищення ЕЕ і зниження КО (Фіг. 19Н).
Безперервну інфузію ЕСЕ21 або СІ -316,243 здійснювали за допомогою осмотичного міні-насоса (АЇІ7еї 2001), який імплантували підшкірно. Таким чином, індукція ЕЕ під дією В5АБ17 і ЕСЕ21 є стійкою, але, як передбачається, більше виборчою, ніж інші описані раніше механізми активації
ВАТ, такі як введення симпатоміметиків (норадреналіну або агоніста ВЗ-специфічних адренорецепторів СІ -316243), серцевих натрійуретичних пептидів, або інтерлейкіну 4, які супроводжуються посиленням окислювання ліпідів і зниженням КО (сегпап-Ніпев еї аї., Мо).
Се! 44, 851-863 (2011); Майвезоп єї аїЇ., Атегісап іоитта! ої рпузіооду. Епаосгіпоїоду апа теїароїїєт 299, ЕЗ374-383 (2010); Модиуєп еї аїЇ., Маїште 480, 104-108 (2011); ВіїКепієїй еї аї. ріаретез 57, 3199-3204 (2008); Вогаїссніа еї а!., У. Сііп. Іпмеві. 122, 1022-1036 (2012); і де бБоцигаєї а!., Оіареїез 46, 1257-1263 (1997)).
Не бажаючи обмежуватися конкретною теорією, автори вважають, що декілька ліній доказів дозволяють припустити домінуючу роль активації ВАТ у метаболічній дії ВБАБ17. По-перше, як показано на Фіг. 19С, ін'єкції ВБАВБ17 підвищують поглинання 18Е-фтордезоксиглюкози (БОС) саме в ІВАТ.
По-друге, однократні ін'єкції В5АбБ17 індукували експресію білка ОСРІ у паховій МАТ (іпоУуАТ), що свідчить про перетворення жирової тканини у буру (Фіг. 190).
Як показано на Фіг. 19Е, також спостерігалася індукція експресії ОСРІ у культивованих первинних адипоцитах, оброблених ЕСКЕ21 або В5АБІ17, що вказує на пряму дію на зрілі адипоцити. Для визначення експресії ОСРІ тотальну РНК використовували для синтезу кКДНК із використанням набору для синтезу КДНК ЗХОРЕВ5СВІРТ МІГО (АВІ). Для ДРСВ зразки у трьох повторностях поміщали уприлад Мії 7 ВеаІ-Тіте РОСА (Арріїєд Віозувієт5). Використовували
Зо попередньо створені компанією Арріїєд Віозузієт5 зонди для аналізу експресії ОСРІ Тадмапе
Сепе (Не01027785 тт). Для кожного зразка мРНК кількість нормалізували на кількість транскриптів ТВР (Н5з00427620 п) ії ЗОНА (Н5З00188166 т!).
Далі за допомогою телеметричної системи спостерігали збільшення температури тіла спокою після однократної ін'єкції В5АБ17, що тривало протягом 226 днів до поступового повернення до вихідного рівня (Фіг. 19).
Фіг. 22 показує розходження в центральній температурі тіла, які спостерігалися в мишей після однократної ін'єкції В5АБ17 у порівнянні з мишами, обробленими контрольним Іда.
Центральну температуру тіла контролювали з використанням датчика ТА-Е10 (Зсієпсез Оаїа
Іпіептаїййопаї, О5І), що імплантували у черевну порожнину. Після відновлення після хірургічного втручання мишей випадковим чином ділили на групи на підставі маси тіла та температури тіла.
Температуру тіла й активність контролювали за допомогою імплантованих систем телеметрії
О5І.
Профілі експресії генів були проаналізовані для ІВАТ з мишей 0ІО, що одержували однократну ін'єкцію В5АБ17, ЕСЕ21 або контрольного Іда. Як показано на Фіг. 196, індуковані однократною ін'єкцією В5ЗАБІ17 зміни експресії генів в І(ІВАТ нагадують результати дворазових щоденних ін'єкцій ЕСЕ21.
І, нарешті, при введенні мишам С57ВІ/6б як ЕОЕ21, так і В5АБ20 відбувається індукція фосфорилювання ЕКК і МЕК у різних жирових тканинах, у тому числі в ІВАТ й іпдУМАТ (Фіг. 23).
У попередніх дослідженнях передбачалося, що адипонектин вносить свій внесок у повну дію
ЕСЕ21 (іп еї аї., СеїЇ Меїаб 17, 779-789 (2013); НоїІапа еї аї., Сеїї Меїаб 17, 790-797 (2013)).
Насправді, одна ін'єкція В5АбБ17 мишам БІО призвела до збільшення рівнів сироваткового високомолекулярного (НММУ) адипонектину при асоційованій втраті ваги (Фіг. 24А).
Аналогічним чином, однократне введення В5АБб17 макакам на дієті з низьким рівнем жиру (Фі. 248) призвело до збільшення рівнів сироваткового високомолекулярного (НМУ) адипонектину при асоційованій втраті ваги.
Як показано на Фіг. 24С, після однократної ін'єкції ВБАБ17 миші з нокаутом адипонектину (Адірод) на НЕО демонстрували стійку реакцію, що виражається в збільшенні ЕЕ (25,3 95 збільшення проти 20,9 95 збільшення в мишей дикого типу (м/)).
Крім того, після однократної ін'єкції ВБАБ17 у мишей з нокаутом адипонектину (Адірод) на бо НЕО зменшувалася вага тіла та рівень тригліцеридів печінки (Фіг. 240). Проте зміни толерантності до глюкози, толерантності до інсуліну, зміни рівня інсуліну в сироватці крові та різних ліпідів були менш виражені в мишей з нокаутом (Фіг. 240), що погодиться з ідеєю, що
В5АБІ17 діє як міметик ЕСЕ21, регулюючи метаболізм живильних речовин всього організму, зокрема, через функції адипонектину. Для визначення толерантності до інсуліну, миші голодували протягом 4 год., і їм внутрішньочеревинно вводили 1 од/кг розчину інсуліну людини (Нитиїнп В, Еїї Су апа Сотрапу).
Підвищена селективність В5АБ1О до рецептора (див. Фіг. ЗА) й описаний раніше низький рівень проникнення молекул Ідсь у мозок (Жи еї аїЇ., Зсі ТтапеІ Мей 3, 84га44 (2011) передбачають змінений профіль безпеки В5АБІТО і його похідних у порівнянні з ЕСЕ21/19.
Відповідно до низького рівня експресії ЕСЕКІ у печінці, ЕОЕ21, але не В5АБІ17, індукує експресію мРНК класичних генів-мішеней ЕСЕК 5ргу4 і бизрб у печінці (Фіг. 25).
В5АБІ17 або В5АбБ20 також призвели до збільшення сигналу фосфо-ЕКК у різних жирових тканинах й ациноцитах підшлункової залози, але не у печінці (Фіг. 23).
Фіг. 26 показує, що В5АБб17 за даними імуногістохімії також не призводить до збільшення фосфорилювання ЕКК у різних ділянках головного мозку, включаючи циркумвентрикулярні органи.
Крім того, хронічне застосування В5АБ20 у лікуванні мишей ОІО протягом 8 тижнів зменшило кількість Вгаж клітин у печінці до рівня, характерного для мишей С57ВІ /6 на дієті з низьким рівнем жиру, протилежно тому, як це очікувалося для ЕСЕ19-подібної активності (Фіг. 27). Для включення Вг4 у печінку мишам внутрішньочеревинно вводили 100 мг/кг Вга (ВО
Віозсіепсев) за 2 год. до евтаназії. Анти-Вга фарбування проводили, як описано (Міспоїев, К., еї а». Ат. у. РаїноЇ. 160, 2295-2307 (2002)), і ВгдО-позитивні гепатоцити підраховували з використанням автоматизованої системи аналізу зображень Агіої.
Проводили аналіз кісток мишей, які були оброблені анти-КІ В/анти-ЕСЕКІ1с антитілом. Фіг. 28А показує схему аналізу. Для виконання аналізу кісткової тканини зразки стегнової кістки візуалізували за допомогою системи мікро-візуалізації нСТ40 від 5САМСО Медісаї (Бассерсдорф, Швейцарія), що працює з рентгенівською трубкою з енергією 70 кеВ і струмом 114 мкА. Безперервні аксіальні зображення зрізів були отримані з ізотропним розміром воксела 12 мкм. Морфометричний аналіз трабекулярної кістки в стегновій кістці був виконаний за
Зо допомогою програмного забезпечення нСТ40 від БХСАМСО Медіса! (Бассерсдорф, Швейцарія).
Для визначення об'єму, що цікавить (МОЇ), який включає вторинну трабекулярну кістку, що перебуває дорсальніше проксимальної пластинки росту стегнової кістки та виступає на 1,5 мм дистальніше первинної трабекулярної кістки, був використаний напівавтоматичний профіль.
Кортикальна кістка була виключена шляхом розміщення границь МОЇ у межах внутрішньої границі кортикальної кістки. До сегментації зображення для придушення електромагнітних перешкод до даних зображень був застосований обмежений тривимірний (30) гаусовський низькочастотний фільтр (сигма фільтра - 0,5, підтримка фільтра - 1). Для виділення "бінаризованої" трабекулярної структури з МОЇ застосовували глобальний поріг (0,36 г НА/см3).
Поріг трабекулярної сегментації був вибраний шляхом візуального огляду результатів сегментації з репрезентативної підмножини вибірок. Трабекулярні структурні характеристики були визначені кількісно шляхом прямого морфометричного 30-аналізу. Попередні дослідження показали, що морфометричний аналіз трабекулярної кістки за допомогою мікро-комп'ютерної томографії добре корелює з аналогічними оцінками, зробленими за допомогою гістоморфометрії.
Як показано на Фіг. 288, хронічне лікування мишей 0ІО із застосуванням ВзАбБр20 протягом б тижнів призвело до очікуваних змін у метаболічних параметрах без якого-небудь негативного сигналу в різних параметрах кісткової тканини у великогомілкової трабекулярної та стегнової кортикальної кістках за даними мікро-комп'ютерної томографії.
Як показано на Фіг. 29, ін'єкція ВБАБ17 мишам 0ІО не збільшувала рівні сироваткового кортикостерону вище контролю. Хронічний позитивний енергетичний баланс, розповсюджений у сучасному суспільстві, призводить до пандемії ожиріння та пов'язаних з ним порушенням метаболізму, які характеризуються резистентністю до інсуліну, гіперінсулінемією, порушенням толерантності до глюкози, гіперліпідемією та гепатостеатозом, які часто призводять до серйозних захворювань, таких як діабет 2 типу, цироз печінки, інсульт і хвороби серця. В 2009 році було повідомлено про наявність ОСРІ-позитивного ВАТ у дорослих людей та її функціональної значимості в активації ЕЕ за допомогою розсіювання тепла, що призвело до величезного інтересу за терапевтичною індукцією й активацією ВАТ для лікування ожиріння та пов'язаних з ним метаболічних захворювань (Уопезпіго апа Зайо, Апп. Меа., 1-9 (2014)).
Проте найбільше відомі механізми активації ВАТ також викликають ліполіз білої жирової бо тканини, що може зробити негативний вплив на серцево-судинну систему (бопд еї аї., Сеї
Меїар. 18, 118-129 (2013)). Слід зазначити, що трансплантація ВАТ збільшує ЕЕ і викликає втрату ваги без зміни КО (ебаптога еї аї., 9). Сіїп. Іпмев5і. 123, 215-223 (2013)). У зв'язку з цим
ЕСЕ21 й антитіло-агоніст анти-ОЕК1/КІВ, передбачені в даному описі, являють собою унікальний підхід до селективної індукції термогенної відповіді у ВАТ без зміни КО, тим самим імітуючи трансплантацію ВАТ, а не неспецифічну симпатоактивацію. Крім того, на підставі спостережуваних ефектів у мишей, передбачається, що опосередковувана антитілом активація комплексу ЕСОЕКІТсС/КІВ може забезпечити більш безпечний та більш ефективний засіб для боротьби з ожирінням і для анти-діабетичної терапії за рівнянням з більше широкою активацією комплексу ЕСЕРУКІ В аналогами ЕСЕ21 або ЕСЕ19.
Приклад 10. Гуманізація анти-КІ В антитіла 8С5.
Мишачі СОК легкого ланцюга з 8С5 були перенесені в каркасні області каппа 2 і каппа 4 легкого ланцюга людини. На додаток до первинного переміщення були також зроблені точкові мутації, так що у позицію 4 у кожному легкому ланцюзі була введена заміна на лейцин (позначеної "М4/"). Був проведений аналіз для виявлення тих варіантів, які краще експресуються та не проявляють значної агрегації. Аналогічним чином СОК важкого ланцюга були перенесені в каркасні області НІ, Н2, НЗ їі Н4 Іда1 важкого ланцюга людини. Різні залишки в каркасі важкого ланцюга мутували в такий спосіб: в НІ були внесені наступні зміни: К71ТЕ,
М7ЗТ і М78А (вихідний варіант позначений "КМУ", а змінений варіант - "КТА"); у Н2 були внесені наступні зміни: М7ЗТ (вихідний варіант позначений "КМУ", а змінений варіант - "КТУ"); у НЗ були внесені наступні зміни: К/1К і М78Г. (вихідний варіант позначений "КМУ", а змінений варіант - "ЕМІ-"), ї в Н4 були внесені наступні зміни: К7ТМ, М7ЗТ і М78Е (вихідний варіант позначений "КМУ", а змінений варіант - "МТЕ").
Були отримані антитіла, сконструйовані на основі всіх парних комбінацій з 4-х легких ланцюгів і 8 важких ланцюгів (у цілому 32 антитіла), і були протестовані рівні їх експресії й афінності. Грунтуючись на цих експериментах, отримані з 8С5 легкий ланцюг К4.МАї. і важкий ланцюг НЗ.КММ, проявляли найкраще сполучення рівня експресії та бажаної афінності.
Нижче наведені послідовності варіабельних областей 8С5.К4.М41Ї.НЗ.КММ гд повнорозмірного антитіла.
Варіабельна область важкого ланцюга 8С5.К4.М41.НЗ.КММ
Коо) ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОаБІ ВІ БСААБОББЗІ ТТУЯУНУУВОАРОКа! ЕМ амММУуЗаваЗТОММААЕ
ІА ТІЗКОМЗКМТ УМ ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВНрУавтУурадІюмсоОстіМТМе (5ЕБЕО І МО: 128)
Повнорозмірний важкий ланцюг 8С5.К4.МА.НЗ.КММ
ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОаБІ ВІ БСААБОББЗІ ТТУЯУНУУВОАРОКа! ЕМ амММУуЗаваЗТОММААЕ
ІЗА ТІЗКОМЗКМТ УМ ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВрУавтрадІвимУсавостІі МГУЗБЗАВТКаРБЗМЕРІ
АРББКОТЗОСИТААІ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗСИАІ ТЗаУНТЕРАМІ 055121 51 55УМТУРБЗББІ СТ
ОТМІСМУМНКРОМТКМОККУМЕРКЗСОКТНТСОРРОРАРЕГЇ СОаРБМУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУМ
МОМ5НЕОРЕУКЕММ УМВС МЕУМНМАКТКРАЕЕєОМИавт УА МІТМІ НОВУМІ МЕКЕУКСКМУМЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І БСАУКИЕУРЗОІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТР
РМ ОБразЕР ЗК ТУОКЗАМОСС,ММУЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОІ 5І РОК (ЗЕО І МО: 129)
Варіабельна область легкого ланцюга 8С5.К4.МА.НЗ.КММ
РІМГТОЗРОБІ АУБІ ЧЕВАТІМСВАЗЕВМЕЗУаМАУМ ПУМООКРООРРКІ ІМВААМІ О5ИаМРОВ
Езававатов ТІ ОАЕОМАМУУСООБМЕОРМ/ТРИОСТКМЕЇІК (ЗЕО ІО МО: 130)
Повнорозмірний легкий ланцюг 8С5.К4.МАГ.НЗ.КММ
РІМГТО5РОБІ АУ5І ЧдЧЕВАТІМСВАЗЕЗМЕЗУаМАУМ ПУМООКРЕООРРКОИ ІМВААМІ О5ИаМРОВ
ЕЗзаБаБатТоОЕТІТІЗ5І ОСАЕОМАМУУСООЗМЕОРМУ ТРОС ТКУБІКАТУААРЗУРІЕРРБЗОЕОЇІ Кат
АБУУМСІ ММЕУРАЕАКМОМКМОМАГ ОБаМЗОЕЗМТЕООЗКОБЗТУБІ 557 ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕ
МТНОІ 55РУТКЗЕМАСЕС (ЗЕО ІЮ МО: 131)
Приклад 11. Створення гібридного антитіла анти-ЕОЕКІ1 між УМ/182.3 і УЛ/182.5.
УММ182.5, яке є плечем анти-РОЕКІ, що не активує комплекс КІ В/ЕОЕКІс під час відсутності плеча анти-ЕСОЕК1, дає гарні результати в сполученні з 8С5, і має триптофан у положенні 33 важкого ланцюга, що підданий окислюванню. УМ/182.2, що, як передбачається, зв'язує той самий епітоп, що й УМ/182.5, також має триптофан у положенні 33 важкого ланцюга.
Деякі мутації були введені у цьому положенні, щоб обійти цю проблему: для УМ/182.5 були введені мутації МУЗЗ3У, УУЗЗН, МУУЗЗЕ їі МУЗЗІ, і для УУУ182.2 були введені мутації МУЗЗМ і М/ЗЗЕ.
Зненацька виявилося, що введені мутації мали різні ефекти в двох антитілах. У випадку
УМІ182.2 було відзначено, що мутації не зробили помітного впливу на афінність або агоністичну активність у відношенні ЕСЕКТ, у той час як для УУУ/182.5 мутації значно зменшили афінність й агоністичну активність стосовно ЕСЕКІ1 (див, наприклад, Фіг. 31). Тому з метою виявлення 60 антитіл з мутацією М/З3У, але з афінністю, близькою до такої для антитіла УМ/182.5, були проведені експерименти з використанням двох підходів.
В одному з підходів для послідовності УМ/182.2 М/З33У важкого ланцюга було виконане аланінове сканування СОКЗ з мутаціями на аланін у положеннях 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100а їі 1000. Афінності отриманих антитіл були проаналізовані, і були ідентифіковані антитіла, що зберегли дуже високу вихідну афінність УУУ182.2 МУЗЗУ (Таблиця 9).
Таблиця 9
Афінність похідних 7М/182.2
У другому підході СОК антитіла УМ/182.2 М/УЗЗМ (з дуже високою афінністю) й антитіла
УММ182.5 М/З33У (майже без зв'язування) були перемішані та складені в різних комбінаціях.
Антитіла УУМ182.2 МІЗЗУ і УУМ182.5 МІЗЗУ мають ідентичні послідовності СОК у легкому ланцюзі (СОВ-І1, ВАБОВСУЗТАМА (5ЕО ІО МО: 139); СОВ-1І2, ЗАБЕРУ (5ЕБЕО ІЮ МО: 140), і СОК-І З
ОО5МТТРРТ (5ЕО ІО МО: 141)), мають розходження в одному амінокислотному залишку в СОК-
НІ (имУ182.2 МУЗ33У СОВ-НІ, ЗТМІЗ (ЗЕО ІО МО: 152) і УМ/182.5 МУЗ3М СОНБ-НІ, З5ММІЗ (5ЕО І
МО: 136)); розходження в трьох амінокислотних залишках в СОК-Н2 або поруч із СОК-Н2 (УМу182.2 М/З33М СОВ-Н2, ЕІОРМОСОТУМАОБУКО (ЗЕБО І МО: 137) і УМ/и82.5 МУЗЗУ,
ЕІОРМОСАТОМАОБУКО (5БО І МО: 153), а також послідовності, що дуже сильно відрізняються, СОК-НЗ (УМ/182.2 МУЗ3М, ЕНЕСАМУМУНУУУМОМ (5ЕБЕО ІЮО МО: 154) і УМ/182.5
МІЗ3У СТОММОМ (5ЕО ІО МО: 138)). Були сконструйовані та протестовані антитіла з важкими ланцюгами на основі всіх можливих комбінацій СОР важких ланцюгів иМ/182.5 МУЗЗМ і МЛ/182.2
МІЗЗУ (вісім, включаючи два вихідних антитіла). Більшість антитіл мали афінність, аналогічну афінності одного або іншого антитіла, але, зненацька, одна комбінація продемонструвала афінність, яка була майже ідентичною вихідній афінності антитіла УУМ182.5. Це антитіло має
СОВ-НІ ії СОБК-НЗ з ММ/182.5 МУЗЗ3У, але СОК-Н2 з ММ/182.2 МУЗЗУ. Це антитіло позначили "длМ182.5 хору", щоб представити наступні зміни у послідовності УМ/182.5: М/ЗЗ3У, А496, А5бО і О58У.
Нижче наведені послідовності антитіла УМ/182.5 УО0У.
Варіабельна область важкого ланцюга УМ/182.5 0
ЕМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААЗОЕТЕТЗММІЗУМУУВОАРОаКаИ ЕМУМаєБІОРУВИарТУМАр
УКОавВЕТІЗАЮОТЗКМТАМІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСАТатруУмМмруУмУусоатІМТМ55 (ЗЕО ІО МО: 132).
Зо Повнорозмірний важкий ланцюг УУУ182.5 УСБУ
ЕМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААЗОЕТЕТЗММІЗУМУУВОАРОаКаИ ЕМУМаєБІОРУВИарТУМАр
УКОавВЕтТІЗАЮТЗКМТАМІ ОММ5І ВАЕОТАМУУУСАТаИТтОУМОУМУСаО,тІ МТУ55АЗТКОаРБЗМУЕРІ АР
ЗКЗТЗаатАА! ас МКОМЕРЕРУТУЗУУМЗИАІ ТЗаУНТЕРАМІ О55И2І 51 55УМТУРЗББ ТОМІ
СМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇГЇ СаРБЗУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМ ОМ
ЗНЕОРЕУКЕММ УМО МЕМНМАКТКРАЕЕОМУавтУАУММІ ТМ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУ5МКАЇ РАРІ
ЕКТІЗКАКИОРВЕРОММУТІ РРЗВЕЕМТКМОМ5І М/С УК ЕМРЗОІАМЕЖМЕЗМИОРЕММУКТТРРМІ О зравЕг мк ТМОКЗАМООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І 5РОК (5ЕО І МО: 133).
Варіабельна область легкого ланцюга УУМ182.5 УО0У
РІОМТО5РБОБІ БАБМАО ВМТ СВАБОВУЗТАМАМУУООКРОКАРКІ ПУЗАБЗЕЇ У5ИаУРЗАЕЗИаБ азатореТТІЗЗІ ОРЕОРАТУУСОО5М ГРРТЕРСОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 134).
Повнорозмірний легкий ланцюг УМ/182.5 ОХ
РІОМТО5РББІ БАБМАО ВМТ СВАБОВУЗТАМАМУУООКРОКАРКІ ПУЗАБЗЕЇ У5ИаУРЗАЕЗИаБ азатореТТІЗЗІ ОРЕОРАТУУСООЗМУ ГПРРТЕФОС,ТКУЄІКАТМААРБЗМУРІЕРРБЗОЕОЇ КИ ТАБУМС
ГЕММЕМРАЕАКМОУМУКМОМАЇ О5БаМЗОЕЗУМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕУТНОС
І 55РУТКЗЕМАСЕС (ЗЕО ІО МО: 135) бо
Приклад 12. Тестування біспецифічних антитіл з гуманізованими варіантами 8С5 й анти-
ЕСЕНІ1.
Різні комбінації біспецифічних антитіл 8С5.К4АНЗ.М41.КММ і різних плечей анти-ЕСЕНВІ1 тестували в люциферазному аналізі (ЗАГ -ЕЇ К1 в клітинах НЕК293, які експресують ЕСЕКТс з
КІВ або без нього. Як було відзначено раніше, кожна комбінація біспецифічного антитіла дозозалежно індукувала активність люциферази в клітинах, які експресують рекомбінантний
ПЕСЕМтс і КІ В, але не в клітинах без експресії КІВ (Фіг. 30). Ці дані підтверджують, що ці модифіковані варіанти зберігають переваги вихідних антитіл, наприклад, В5АБ13. Афінності зв'язування антитіла анти-КІВ/(анти-ЕОЕКІ!, яке має сгуманізоване плече 805 (8С5.К4.М41.НЗ.КММ) і плече 182.5 МООУ, з комплексом КІ В/ЕСЕКІТс людини, макака та миші на поверхні НЕК293, наведені в Таблиці 10.
Таблиця 10
Афінності зв'язування
Лінія клітин . (НМ) Ка (НМ) відхилення 293ПиКІ В/пиїс 1,88 293супокі В/супоїс 2,55 0,25 293т8КІ В/тв1с 3,92 0,17
На додаток до різних описаних і заявлених варіантів наведене розкриття винаходу також відноситься до інших варіантів здійснення, що має інші комбінації ознак, розкритих і заявлених у даному документі. Таким чином, конкретні ознаки, представлені в даному описі, можуть бути об'єднані одна з одною іншим способом в межах об'єму наведеного розкриття винаходу, таким чином, що розкриття винаходу включає будь-яку придатну комбінацію ознак, розкритих у даному документі Попередній опис конкретних варіантів здійснення винаходу був представлений з метою ілюстрації й опису. Він не призначений бути вичерпним або обмежувати винахід цими розкритими варіантами здійснення.
Фахівцям в даній області буде очевидно, що в композиції та способи відповідно до розкритого винаходу можуть бути внесені різні модифікації та варіації, не виходячи за межі сутності або об'єму розкритого винаходу. Таким чином, передбачається, що винахід включає модифікації та зміни, які перебувають в межах об'єму прикладеної формули винаходу та її еквівалентів.
У даному описі цитуються різні публікації, патенти та патентні заявки, і їх зміст включений в даний опис за допомогою посилання у всій їх повноті.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ДЖЕНЕНТЕК, ІНК. «1205 АНТИТІЛА ТА СПОСОБИ ІХ ЗАСТОСУВАННЯ «130» 00в206.0170 «1405 «1415 «1505» 62/081,435 «151» 2014-11-18 «150» 61/920,396 «1515 2013-12-23 «160» 166 «1705 РабепесІп версія 3.5 «21051 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний
Зо пептид" «4005 1 зек Тук бі1у І1е 5ег 1 5
З5 «2105 2 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 2
Авр Тук Тук Меє Авп 1 5 «2105 З «2115 5 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 60 пептид"
«4005 З
Ап оТук сі1у Уаї 5ег 1 5 «2105 4 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 4
Авр ТК Тук Меє Авп 1 5 «2105 5 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид"
Зо «4005 5
Авр ТПг Туг І1е Нів 1 5
З5 «2105 6 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 6 зек Тут Тер І1е Нів 1 5 «2105 7 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" 60 «4005 7
Авр ТПг Робе Тік Нів 1 5 «2105 8 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 8 бі Тук ТПпг Меє Авп 1 5 «2105 9 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид"
Зо «4005 9 зек Туг Тгр І1е с1ци 1 5 «2105 10 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 10
Авр Тук сіц Меє Нів 1 5 «2105 11 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" бо «4005 11
Авр ТПг Туг І1е Нів
1 5 «2105 12 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 12
Агуд Тук Тер Меє 5ег 1 5 «2105 13 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 13
Зо Авп оТук с1у Меє Авп 1 5 «2105 14 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 14
ТПг Бек Аїа Меє сС1у І1е щЩ1У 1 5 «2105 15 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 15 (516) ТПг Тук с1у Уаї Нів 1 5
«2105» 16 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 16
ТПг Уа1 бек бек сіу б1у Агд Тук ТПг Тук Тук Рго Авр бек Уа1ї! Гув 1 в) 10 15 сову «2105 17 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний
Зо пептид" «4005 17
ТЕр Іїе Авр Рго біц Авп АвБр Ар ТБПг Ії1е Туг Авр Рго Гув Рпе сіп 1 5 10 15
З5 сову «2105 18 «211» 16 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 18
Ууаї Іїе Тр б1у Авр сіу бек ІїІе Авп Туг Нів бек Аза ІТецй І1е 5ег 1 5 10 15 «2105» 19 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність 60 «2205
«221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 19
Акуд І1е Авр Рго Бек АвБп обіу АвБп Аїа Гу Тук Авр Рго Ппув Рпе сіп 1 5 10 15 оеЩ1уУ «2105 20 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 20
Агуд тІ1е Авр Рго А1їа АБп о сіу Авп оТПг о Пув Туг Авр Рго Ппув РоПе сіп 1 5 10 15
Авр
Зо «2105 21 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 21 бі І1е Авр Рго Бек Уа1 бек Авп Бек Авп о Туг Авп о біп Гуз РПе Гу 1 в) 10 15 сову «2105 22 «2115 17 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 60 пептид"
«4005 22
Акуд І1е Авр Рго Бек Авп обіу Авп Тс Гув Тук Авр Рго Ппув Рпе сіп 1 5 10 15 сову «2105 23 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 23 б1у І1е Авп Рго Авп Авп сіу бій ТПг бек Тукг Авп о біп Гуз РПе Гу 1 5 10 15 оеЩ1уУ «2105 24
Зо «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 24 січ І1їе Рпе Рго сіу сіу біу бек ТПг І1е Тук Авп бій АвБп Рре Агд 1 5 10 15
Авр «2105 25 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 25
Аїа Іїе Тер Рго біц АвБп Азїа Авр бек Уаі! Тук АвБп о біп Ппув РПе Гув (516) 1 в) 10 15 сову «2105» 26 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 26
Акуд І1е Авр Рго Аза АвБп обіу Авп Тс пуб Тукг Авр Рго пуб Рое сіп 1 5 10 15 сову «2105 27 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
Зо «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 27 біц І1е Гей Рго сіу Бек Авр Бек ТПг Ппув Тук Уаї біц пув РпПе Гу 1 5 10 15
Уаї «2105 28 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 28 січ І1їе Бек Рго Авр бек бек ТПг І1е АБп Тук ТПг Рго бек Гей Гув 1 5 10 15
Авр 60
«2105» 29 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 29
ТЕр Іїе Авр ТПг Авр ТПг б1іу бій Аза ТБг Тує ТБ Авр Авр Ропе Гув 1 5 10 15 сову «2105 30 «211» 16 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид"
Зо «4005 30
Нів Іїе Тер Тер Авр Авр Авр Гув Агуд Тут АвБп о Рго Аза Іецп Гув бег 1 5 10 15
З5 «2105 31 «211» 16 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 31
Уаї Іїе Тер Бек сіу сіу Бек ТПг Авр Туг Авп Аїа Азїа Рпе І1е 5ег 1 5 10 15 «2105 32 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" 60 «4005 32 сі1у б1у Авр сі1у Туг Аїа Гей Авр Туг 1 5 «2105 33 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 33
Рпе ТПг ТПг Уаії Рпе Аза Туг 1 5 «2105 34 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид"
Зо «4005 34
ТПЕ Нів Авр Тер Рібе Авр Туг 1 5 «2105 35 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 35
Акуд Аза гей с1і1у АБп сбіу Туг Аїа Гец с1іу Туг 1 5 10 «2105 36 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" бо «4005 36 бі1у ТПг бек Туг Бек Тгр Рпе Аїа Туг
1 5 «2105 37 «2115 15 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 37
Тен біу Маї Меє Уаї Тугк сіу бек бек Рго Рпе Тгр Робе А1їа Туг 1 5 10 15 «2105 38 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 38
Зо Агуд Аїа Гей біу АБп сбіу Ту Аїа Меє Авр Туг 1 5 10 «2105» 39 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 39
Пув ТПг ТПКЕ Авп о Туг 1 5 «2105» 40 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 40 (516) Агуд сб1іу Туг Туг АвБр Аїа Аїа Тгр Рпе Авр Туг 1 5 10
«2105» 41 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 41 сі б1у б1у Авп Туг 1 5 «2105 42 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 42 зек с1у Авп Туг бі1у Аї1а Меє Авр Туг
Зо 1 5 «2105» 43 «2115 11 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 43 сі1у б1у Тук Нів Тук Рго с1іу Тер Геи Уа1 Туг 1 5 10 «2105» 44 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 44
Ркго Бек Рго Аїа Іецй Авр Туг 60 1 5
«2105» 45 «2115» 10 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 45 бі бій Тук с1у гейш Рпе сіу Рпе Рго Туг 1 5 10 «2105» 46 «211» 14 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 46
І1е Авр сіу І1е Тук Авр сіу бек Рпе Туг Аїа Меє Авр Туг 1 5 10
Зо «2105» 47 «2115 12 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 47
Авр Тук сіу бек ТПг Тук Уаії АвБр Аїа І1е АБвр Туг 1 5 10 «2105» 48 «2115 11 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 48 зек Аїа бек біп Уаі І1е бек Авп Тук Іеч Авп 1 5 10 60
«2105» 49 «2115» 10 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 49 зек Аїа бек бек бек б1у Агуд Тук ТПг РБре 1 5 10 «2105 50 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 50
Акуд Аза бек біп Авр І1е Бек Авп Туг Робе Авп 1 5 10
Зо «2105 51 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
З5 «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 51
Тпув Аза бек Авр Нів Іїе Авп АвБп Тер Гей Аї1а 1 5 10 «2105 52 «211» 16 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 52
Акуд Бек бек біп АвБп о І1е Уаї Нів бБекг Авр б1у АвБп ТПг Туг Гей сіц 1 5 10 15 60 «2105 53
«2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 53
Туз Аза бек сбіп Рпе Уа1 б5ег Авр Аїа Уа1 Аї1а 1 в) 10 «2105 54 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 54
Акуд Аза бек біп біц І1е бек сіу Тукг Іец б5ег 1 в) 10
Зо «2105 55 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 55 зек Аїа бБекг бек бек ТГецй бек бек бек Тук Іец Туг 1 в) 10 «2105 56 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 56
Ппув бек бек біп Бек Гей Гей Авп бек с1у Авп біп Гпув Авп бек Іей 1 в) 10 15 60 А1т1а
«2105 57 «2115» 10 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 57
Агкуд Аза бек бек бек Уаі АвБп Нів Меє Туг 1 5 10 «2105 58 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 58
Туз Аза бек біп Авп Уаі1 Авр бБег Тук Уа1 Аї1а
Зо 1 в) 10 «2105 59 «2115 11 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 59
Акуд Аза бек біп бек І1е бек Авр Тук Уа1ї! Туг 1 5 10 «2105» 60 «2115 11 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 60
Туз Аза бек бій Авр І1їе Туг Авп Агд Гей Аї1а (516) 1 в) 10
«2105» 61 «2115» 15 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 61
Акуд Аза бек біц бек Уаі Авр бек Тук б1у АвБп бек Рпе Меє Нів 1 5 10 15 «2105 62 «2115» 15 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 62
Акуд Аза бек біц бек Уаі бій бек Тук б1у Авп Агуд Тук Меє ТЕГ 1 5 10 15
Зо «2105» 63 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 63
Рпе ТПг бек бек Іецй Агд 5бег 1 5 «2105» 64 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 64
Авр ТПг бек пуб Гец Аїа 5ег 1 5 60
«2105» 65 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 65
Тук ТПг Бек Агд Гец Сіп 5ег 1 5 «2105» 66 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 66 бі1у ТПпг ТпПг Авп Гей бій ТЕГ 1 5
Зо «2105 67 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
З5 «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 67 пув Маї Бек Авп Агуд Рпе б5ег 1 5 «2105» 68 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 68 зек Аїа бБег Туг Агд Тук ТПг 1 5 60 «2105» 69
«2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 69 б1у А1а бек Авп Гей бій ТЕГ 1 5 «2105 70 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 70
Аза Аза бек ТПг Гей Авр 5ег 1 5
Зо «2105 71 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 71 б1у А1а бек Авп Гей Аїа 5ег 1 5 «2105 72 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 72
Тец А1а бек ТПг Агд бій б5ег 1 5 бо «2105 73 «2115 7
«212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 73
Тук ТрПг бек ТіПг Іецй Аїа Рго 1 5 «2105 74 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 74 зек Аїа бек Тут Агд РПпе 5ег 1 5 «2105 75
Зо «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 75
Туг Аїа бек біп бек І1е 5ег 1 5 «2105 76 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 76
А1а Аї1а ТПг бек ІТей сі ТіПг 1 5 «2105 77 бо «2115 7 «212» РЕТ
«2135 Штучна Послідовність «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 77
Агкуд Аза Бек Авп Гец біц 5ег 1 5 «2105 78 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 78
Агуд Аза Аза Ап Гец біп 5ег 1 5 «2105 79 «2115 9
Зо «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 79 біп біп Тук Бек Ппув Гей Рго Тгр ТПг 1 5 «2105 80 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 80
Рпе сіп біу ТПг б1у Тук Рго Гей ТЕПг 1 5 «2105 81 «2115 9 бо «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність
«221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 81
Нів біп Уаі1 Акуд ТБг Гей Рго Тер ТЕГ 1 5 «2105 82 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 82 біп біп Тук Тер Авп ТПг Рго Рпе ТПг 1 5 «2105 83 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний
З5 пептид" «4005 83
Рпе сіп сіу бек Нів Уаї Іеип ТПг 1 5 «2105» 84 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 84 біп біп Нів Туг Іїе Уа1 Рго Тугє ТПг 1 5 «2105 85 «2115 9 «212» РЕТ
Гс10) «213» Штучна Послідовність
«221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 85
Тец біп Тук с1іу Бек Тук Рго Тгр ТПг 1 5 «2105» 86 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 86
Нів біп Тер бек бек Тук Рго Гей ТЕГ 1 5 «2105 87 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
Зо «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид"
З5 «4005 87 біп біп Нів Нів Бек ТПг Рго Туг ТПг 1 5 «2105 88 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 88 біп біп Рпе ТПг Іїе Бек Рго Бек Меє Тук ТЕГ 1 5 10 «2105» 89 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність 60 «2205
«221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 89 біп бі1іп Ту АвБп І1їе Бек Рго Туг ТПг 1 5 «2105 90 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 90 біп АвБп обіу Нів Авп Рпе Рго Туг ТПг 1 5 «2105 91 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
Зо «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 91 біп біп Тук Тер Бек Авп Рго ІТецп ТПг 1 5 «2105 92 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 92 біп біп бек Авп бій Авр Тукг ТПг 1 5 «2105 93 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність бо «2205 «221» джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 93 сбіп біп бек Авп о біц Авр Рго Тер ТЕПг 1 5 «2105» 94 «2115» 118 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 94 сі Уаї сбіп Геп Уаії бій бек сіу сіу с1у Гей УМаї Ппув5 Рго с1у с1Уу 1 5 10 15 зек Гей пув ІТец бек Сув Аза Ркго бек біу Рпе ТПг Ррпе бек бек Туг 20 25 30 сб1у І1е бек Тер Уаі Агуд сбіп Тбг Рго бій пув Агд Гей бі Тгр Уаї
Зо
Аза ТПг Уаї бек бек б1у б1у Агкд Тук ТПг Тук Тук Рго Авр бек Уаї бо
З5 пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр АБп Аїа біц Авп ТБПг Іец Туг 65 70 75 80 40 Пен біп Мес бек бек Гей Агуд бек біц Авр ТПг Аїа Меє Туг Тук Сув 85 90 95
ТПгЕ Агуд с1іу с1у Авр біу Туг Аза Гей Авр Туг Тгр б1у бі1іп с1у ТПг 45 100 105 110 зек Уаії ТіПг Уаї бек 5ег 115 50 «2105 95 «211» 116 «212» РЕТ 55 «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 60 поліпептид"
«4005 95 бі Маї біп Гей біп біп бек сіу Аїа бій Гей Уа1і Агд Рго с1у А1а 1 5 10 15
Тец Маї Авп Гей бек Сув пув Азїа бек біу Робе АвБп І1е Гув Авр Туг 20 25 30
ТУук Меє Ап Ткгр Уа! Гуз біп Агуд Рго сій сбіп с1у ІТецп бій Тер Тбг 35 40 45 сб1у Тер І1ї1е Авр Рго бій Авп Авр Авр Тс І1е Туг Авр Рго Ппув РІПе 50 55 бо біп б1у пув Аза ТПг Іїе ТПг Аза Авр ТПг бек бек Авп ТПг Уа1ї! Туг 65 70 75 80
Тецп біп Гей ТПг о бек Гей ТПг бек біц Авр ТБПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Рбе ТПг ТПг о Уаії Рпе Аїа Туг Тер с1у Нів біп ТПг Меє Уаї 100 105 110
Зо ТВг Уа1 5ег А1а 115 «2105» 96
З5 «2115» 115 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» 40 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 96 45 сіп Уаі біп Уаї Ппув бій бек б1іу Рго б1у Гецп Уаі Аза Рго бек сіп 1 5 10 15 зек Гей бек І1е ТПг Сув ТПг Уаії бек б1у Рпе бек Гей ТПг Авп Туг 50 20 25 30 сбі1у Маї бек Тер І1їе Агуд біп Рго Рго сбіу Ппув сіу Гей сіц Тгр Іецй 55 сі1у Маї І1ї1е ТЕр б1у Авр сіу Бек Іїе Авп Туг Нів бек Аїа Іец І1е бо 60 зек Агкд Пец ТПг І1е ТПг Гув Авр о АвБп о бек Гув бек біп Уаї РПе Іей
65 70 75 80
Тпув Гей Авп бек Гей біц Аза Авр Авр ТПг Аїа ТПг Тукг Тук Суб А1а 85 90 95
Тпув ТпПЕ Нів Авр Тер Рпе Авр Туг Тгр б1у біп б1у ТПг Іецп Уаї ТПг 100 105 110
Уаї 5ек А1а 115 «2105 97 «2115» 120 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 97 бі Маї біп Гей біп біп бек сіу Аїа бій Гей Уа1! пуб Рго с1у А1а 1 5 10 15
Зо зек Уаї Ппув Тец бек Сув ТПг Азїа Аза Авр Рпе АБп І1е Гпув Авр ТЕГ 20 25 30
Тук Меє Нів Ткгр Уа1! Ппув біп Агуд Рго сій сбіп с1у ІТеп бій Тер І1е 35 40 45 б1у Акд І1ї1е Авр Рго Бек Авп сіу Авп Аїа Ппув Тукг Авр Рго Кув РБПе 50 з9 бо біп б1у пув Аїа Бек Іїе ТПг Аза Авр Бек бек бек Авп ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Тецп Нів Гей бек Бек Гей ТПг Бек бій Авр ТПг АТїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Бек Агуд Аїа Іец б1у АБп сбіу Туг Аї1а Іїеп с1у Тує Тер 0Ш1у сіп 100 105 110 сіу ТПг Бек Уа! ТПкг Уаі1ї бек 5ег 115 120 «2105 98 60 «2115» 118 «212» РЕТ
«2135 Штучна Послідовність «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 98 бі Маї біп Гей біп біп бек сіу Аїа бій Гей Уа1! пуб Рго с1у А1а 1 в) 10 15 зек Уаї Ппув Тец бек Сув ТПг Аза бек Авр Рпе АБп І1е Іїе Авр ТЕГ 20 25 30
Тук Іїе Нів Тер Уаї пув біп Агуд Рго біц біп сб1у Іей б1й Тгр Ше 35 40 45 б1у Акд І1ї1е Авр Рго Аїа Ап сіу Авп о ТПг Ппув Тукг Авр Рго Тув РБПе 50 55 бо сіп Авр Гуз Аза Аїа Гей ТПг бек Авр ТПг Авр бек Авп ТПг А1їа Туг 65 70 75 80
Тецп Гей Рпе Авп бек Гей ТПг Бек бій Авр ТПг АТїа Уаї Тук Тук Сув
Зо 85 90 95
Аза Акуд с1у ТБг бек Тук бек Тер Рпе Аза Туг Тгр С1у біп с01у ТЕГ 100 105 110
З5
Тен Уаї бек Уаї бек Аїа 115 40 «2105» 99 «2115» 124 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність 45 «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" 50 «4005 99 біп УМаії біп Гей біп біп Рго сіу Аїа бій Іїе Уа1ї пуб Рго с1у А1а 1 5 10 15 55 зек Уаі Агкд Іїец бек Сув Гув Аїа бек біу Тук Бек РПпе ТПг бек Туг 20 25 30 (516) ТЕр І1е Нів Ткгр Ма1! Ппув біп Агуд Рго сіу біп с1у Іеп бій Тер І1е сбі1у бі І1їе Авр Рго Бек Уа1 Бек Авп Бек Авп о Туг Авп о біп Тув РБПе 50 55 бо пув б1у пув Аїа ТПг Гей ТПг Аза Авр Гпув бек бек бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Меє сбіп Гей бек сіу Гей ТПг Бек бій Авр бек Аїа Уаї Тук РПе Сув 85 90 95
Уа1 Акд Геп сіу Уа1і Меєсє Уа1ї Тук сіу бек бек Рго Рпе Тгр Рпе Аїа 100 105 110
Тук Тер с1у сбіп сіу ТПг Іец Уа1 ТБПг Уаї бек А1а 115 120 «2105 100 «2115» 124 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело
Зо «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 100 біп УМаії біп Гей біп біп Рго сіу Аїа бій Іїе Уа1ї пуб Рго с1у А1а
З5 1 в) 10 15 зек Уаі Агкд Іїец бек Сув Гув Аїа бек біу Тук Бек РПпе ТПг бек Туг 20 25 30 40
Тер Іїе Нів Тер Уаї пув біп Агуд Рго біу біп сб1у Іейп б1й Тгр Ше 45 сбі1у бі І1їе Авр Рго Бек Уа1 Бек Авп Бек Авп о Туг Авп о біп Тув РБПе бо 50 пув бі1у пув Аїа ТПг Гей ТБПг Аза Авр Ппув бек бек бек ТПг А1їа Туг 65 70 75 80
Меє сбіп Гей бек сіу Гей ТПг Бек бій Авр бек Аїа Уаї Тук РПе Сув 55 85 90 95
Уаї Агкд ге сіу Уа1 Меєсє Уаї Тук сіу бек бек Рго Рпе Тгр Рпе Аїа 100 105 110 60
Тук Тер с1у сбіп сіу ТПг Іец Уа1 ТБПг Уаї бек А1а 115 120 «2105 101 «2115» 120 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 101 бі Маї біп Гей біп біп бек сіу Аїа бій Гей Гей Гпув Рго с1у А1а 1 5 10 15 зек Уаі Акуд Гей бек Сув ТПг Аза бек біу Робе Ап І1е сбіп АБр Тіг 20 25 30
Рпе ТПг Нів Тгр Уаі Агуд біп Агд Рго бій біп с1у Гей бій Тер Те б1у Акд І1е Авр Рго Бек Ап с1іу Авп о ТПг пуб Туг Авр о Рго пув РІПе бо
Зо біп б1у пув Аїа Ппув Іїе гейш Аза Авр ТПг бек бек Авп ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
З5
Тец біп Гей Іїе с1іу Гей ТПг бек біц Авр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95 40 А1а бек Акуд Аїа Гецп с1у Авп сіу Тук Аїа Меєс Авр Туг Тер с1у сіп 100 105 110 бі1у ТПг бек Уа1і ТПг Уа1 Бек 5ег 45 115 120 «2105 102 «2115» 114 50 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело 55 «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 102 бі Маї Ркго Гей біп біп бек с1іу Рго бійш Гец Уаї Гув Рго сС1у Аїа 60 1 в) 10 15
ТПгЕ Уа1ї Ппув Іїе бек Сув пуб Рго бек б1і1у Авр ТПг Рпе ТПг сі Туг 20 25 30
ТПЕ Меє Авп Тер Уаії Агд біп бек Нів с1і1у Ппув Бек Гей бій Тер І1е 35 40 45 сіу бі1у І1е Авп Рго Авп АвБп о біу бій ТПг бек Тугк Авп біп Ппув РБГе 50 55 бо пув б1у пув Аїа ТПг Гей ТПг Уа1і Авр пуб бек бек бек ТПг Аїа Ріе 65 70 75 80
Ме Авр гей Агуд Іїе Гей ТПг Бек бій Авр бек Аїа Уаї Тук РПе Сув 85 90 95
Аза Акуд пуб ТБг ТЕ АвБп о Тує Тер с1у біп сіу Тбг ТБг Гец І1е Уаї 100 105 110 зек Бег
Зо «2105 103 «2115» 120 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 103 біп І1е сбіп Гей біп біп бек сіу Аїа бій Гей Меє пуб Рго с1у А1а 1 5 10 15 зек Уаі Акуд Меєс бек Сув Ппув Аїа бек біу Туг ТПг РрПе бек бек Туг 20 25 30
ТЕр Ії1е бій Тер Уаї Ппув біп Агкуд бек біу Ні сб1у ІТейп б1й Тгр Ше 35 40 45 сі1у 611 І1ї1е Рпе Рго сіу сіу сіу Бек ТПг Іїе Туг Авп біц Авп Ріе 50 55 бо
Акуд Авр о гпув Аза ТПг Рре ТПг Аза Авр ТПг бек бек АБп ТПг Аїа Туг 65 70 75 80 60
Меє сіп Гей бек бек Гей ТПг Бек бій Авр бек Аїа Уаї Тук РПе Сув
85 90 95
Аза Агуд Агуд біу Тук Туг Авр Аїа Аза Тгр Рпе Авр Тугє Тер 01у сіп 100 105 110 сбі1у ТПпг Гей Уаі ТПг Уа1 бек Аїа 115 120 «2105 104 «2115» 114 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 104 біп Маї біп Гей Ппув біп бек сі1у Аїа бій Гей Уа1і Агд Рго с1іу ТЕПг 1 5 10 15 зек Уаії ТПг Іец бек Сув Гув Аїа бек біу Тук ТПг Рпе ТПг Авр Туг 20 25 30
Зо бі Меє Нів Тер Меє пув біп ТПг Рго Уа1і Тук сі1у Гец біц Тгр І1е 35 сі1у Аїа І1е Тер Рго бій АвБп Аза Авр бек Уа! Тук Авп біп Ппув РБГе бо пув б1у Ппув Уа1і ТПг Гей ТПг Аза Авр Гпув бек бек бек ТПг Аїа Туг 40 65 70 75 80
Ме Авр гей Агуд бек Гей ТПг Бек бій Авр бек Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95 45
ТПгЕ Агуд бій с1і1у сб1у Авп Туг Тер сіу біп біу ТП ТП Теип ТПг Уаї 100 105 110 50 зек Бег 55 «2105 105 «2115» 118 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність 60 «2205 «221» джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 105 сій Маї біп Гецп сіп біп бек б1і1у ТПг біц Гецп Уаі Акд Рго с1у А1а 1 5 10 15 зек Уаї Ппув Тец бек Сув ТПг бек Бек Авр Рпе АвБп І1е Гпув Авр ТЕГ 20 25 30
Тук Іїе Нів Тер Уаії пув біп Акуд Рго біц біп б1у Іецй Авр Тгр Іецй 35 40 45 б1у Акд І1ї1е Авр Рго Аїа Ап сіу Авп о ТПг Ппув Тукг Авр Рго Тув РБПе 50 55 бо біп б1у пув Аза Аїа Меє ТПг бек Авр ТПг бек бек Авп ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Тем Агуд Гей бек бек Гей ТПг бек біц Авр ТПг Аїа Уа1ї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза бек бек біу Авп Тук б1у Аїа Месє Авр Туг Тгр С1у біп с01у ТЕГ
Зо 100 105 110 зек Уаії ТіПг Уаї бек 5ег 115
З5 «2105» 106 «2115» 120 «212» РЕТ 40 «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 45 поліпептид" «4005 106 біп УМаії біп Гей біп біп бек с1у Авр бій Гей Меє пуб Рго с1у А1а 1 5 10 15 50 зек Уаї Ппув І1е бек Сув Ппув Уа1і! ТП б1у Авп ТПг Ррпе бек бек Туг 20 25 30 55
ТЕр І1е бій Тер Уаї пув біп Агуд Рго біу Ні сб1у Іейп б1й Тгр Ше (516) сіу бій І1е Гецп Рго сіу бек Авр бек ТПг Ппув Тук Уа! бій пув РБГе бо пув Маї пув Аза ТПг Рпе ТПг Аза Авр ТПг бек бек Ап ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Меє сіп Гей бек бек Гей ТПг Бек бій Авр бек Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд с1іу біу Тук Нів Тук Рго біу Тегр Іецп Уаі Тує Тер 0Ш1у сіп 100 105 110 сіу ТБПг Ге Уаї ТПг Уаі1ї бек Аїа 115 120 «2105 107 «211» 116 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 107
Зо сі Маї Ппув Ррпе Гей бій бек сіу сбіу сб1у Гецп Уаі сбіп Рго б1у С0Ш1У 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аїа Уаії бек б1у І1ї1е Авр Рпе 5Бег Агд Туг
З5 20 25 30
Тер Меє бек Тер Уаі Агд біп Аза Рго сіу пув б1у Іейп б1й Тгр Ше 40 сбі1у б1й1 І1їе Бек Рго Авр бек бек ТПг Іїе Ав5п Тукг ТПг Рго бек Іей бо 45
Тув Авр Гув Рпе Уаі Іїе Бек Агуд Авр Авп Аїа Гпув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80 50 ем біп Мес бек Ппув Уаі Агуд бек Азїа Авр ТПг Аїа ІТецй Туг Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд Рго бек Рго Аїа Гей Авр Туг Тер с1у сбіп с1у ТПг Гей Уаї 55 100 105 110
ТПг Уаї бек Аїа 115 60
«2105 108 «2115 119 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 108 біп І1е сбіп Гей Уаі сбіп бек с1іу Рго бій Гей Ппув пув Рго біу бій 1 5 10 15
ТПг Аїа пув І1їе бек Сув Куб Аїа бек с1іу Туг Аза Робе бек Авп Туг 20 сіу Меє АБп Тер Уаі Ппув біп Аїа Рго сб1у Пув Авр Тем Гув Тгр Меє сб1у Тер І1ї1е Авр ТПг Ар ТПг сіу біц Аза ТБПг Тує Тс Авр Авр РБе 25 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе Уаі РПе бек Гей бі ТПг бек Аїа бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80
Зо
Тец біп І1їе Авп Авп Гей пув Авп о біц Авр Меє Аїа ТПг Тук Рпе Сув 85 90 95
З5
Аза Акуд сбіц біц Тук б1у Гей Робе сіу Робе Рго Туг Тгр С01у Нів Щ1У 100 105 110 40 ТПЕ Ггецп Уаі Тібг Уаї бек Аїа 115 «2105 109 45 «2115» 124 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 109 сіп Маії ТПЕ Гецп Ппув бій бек б1іу Рго б1у І1е Іїей сбіп Рго бек сіп 1 5 10 15
ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув бек Ріпе бек біу Рібе бек Іецй бек ТПг 5ег 60 20 25 30
А1їа Меє сіу І1е с1у Тгр І1е Акуд сіп Рго Бек сіу Ппув с1і1у Гец сій 35 40 45
ТЕр геш АТїа Нів І1їе Тгр Тгр Авр Авр Авр Губв Агуд Туг АБп Рго Аїа 50 55 бо ем Ппув Бек Агд Гей ТПг І1е бек Пув Авр ТПг бег Агуд Авп о сіп Уаї1! 65 70 75 80
Рпе Гец пув І1е Аза бек Уаі Авр ТПг Аза АвБр ТПг Аза ТПг Тук Ріє 85 90 95
Сув А1ї1а Агуд І1ї1е Авр с1іу Іїе Туг Авр сіу Бек Рпе Туг Аза Меє Авр 100 105 110
Тук Тер с1у сбіп сіу ТПг бек Уа1 ТПг Уаї бек 5ег 115 120 «2105 110 «2115» 120 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
Зо «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид"
З5 «4005 110 біп Маї біп Гей Ппув біп бек с1іу Рго сбіу Гей Уа1 сіп Рго бек біп 1 5 10 15 40 зек Гец бек Уаі Аза Сув ТПг Уаії бек Авр Рпе бек Гей ТПг ТПг Туг 20 25 30 45 сіу Ма1і Ні Тер Уаі Акуд біп бек Рго сб1у Ппув с1у Гей бій Тгр Гей сі1у Маї І1ї1е Тер Бек сіу сіу Бек ТПг Авр Туг Авп Аїа Аза РоПе І1е 50 з9 бо зек Агд Пец ТПг І1е бек Гпув Авр АвБп бек Гув Бек біп Уа1і1 Рпе Ріє 65 70 75 80
Тпув Меє Авп бек Гей біп ТПг ТПг Авр ТПг Аїа І1ї1е Тукг Тукг Субв А1а 85 90 95 60
Акуд Авр о Тук біу бек ТПг Тук Уаі АвБр Аї1а І1е Авр Тугє Тер 0Ш1у сіп
100 105 110 бі1у ТПг бек Уа1і ТПг Уа1 Бек 5ег 115 120 «2105 111 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 111
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп Тс ТБг обег бек ІГецйп бек Аза бек Геш 0Щ1У 1 в) 10 15
Авр Акуд Уаї ТПг І1е І1е Сув бБег Аза бек біп Уаі І1їе Бек Авп Туг 20 25 30
Тец АБп Тер Ту біп біп пув Рго Авр с1іу ТПг Уа1ї пуб Гец Іецй І1е
Зо
Тук Рпе ТПг бек бБекг Іец Агуд бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У бо 35 зек с1іу бек біу ТПг Авр Тугк бек Гей ТіПг І1е Бек Авп Гецп бій Рго 65 70 75 80 бі Авр Уаї Аза ТПг Тук Рпе Сув біп біп Тук бек Гпув Гей Рго Тгр 40 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Гец біц Іецй Гув 100 105 45 «2105 112 «2115» 106 «212» РЕТ 50 «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 55 поліпептид" «4005 112 бі Ап о Уаї Гей ТПг біп бек Рго Аза Іїе Меє бБег Аза бег Рго 01Уу 1 5 10 15 60 бі Гпув Уаї ТПг Меє ТПг Сув бек Аза Бек бек бек Сс1у Агд Тук ТЕПг 20 25 30
Рпе Тер Туг біп сбіп Ппув бек Авп ТПг Аїа Рго пуб Гечп Тер І1еє Туг 35 40 45
Авр ТПг бек пув Іец Аза бек біу Уаі Ркго б1у Агкуд Рпе Бек сіу б5ег 50 з9 бо бі1у бек б1у Авп Бек Тук бек Гей ТПг Іїе бек бек Меє сбіц Аїа с1ц 65 70 75 80
Авр Уа1 Аїа ТПг Тук Тук Сув Рбе біп б1у ТПпг с1у Тук Рго Гей ТЕГ 85 90 95
Рпе с1у Аїа сіу ТПг Гув Гей біц Іецй Гув 100 105 «2105 113 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
Зо «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид"
З5 «4005 113
Авр І1е сіп Месє ТПг о біп Тс Рго бек бек ІГецйп бек Аза бек Ге 0Щ1У 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі ТБПг І1е АвБп Сув Агуд Аїа бек біп АвБр І1е бек Авп Туг 20 25 30
Рпе Авп о Тгр Тук біп біп Гпув Рго АвБп обіу ТПг І1ї1е Гпув Гей Гей І1е 35 40 45
Тук Тук ТПг бек Агд Іїец біп бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех щЩ1У бо 50 зек сіу бек біу ТПг Авр Тук бек Іец ТПг І1е бек Авп Ге бій сіп 65 70 75 80 55 бі Авр ув АТа ТПг Тук Рпе Сув Нів біп Уаі Акд ТПг Гей Рго Тгр 85 90 95 (516) ТПЕ Рпе сіу с1у біу ТПЕ Гпув Геп бі І1е Гув 100 105
«2105 114 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 114
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек бек бек Тук Гей бек Уаі Бек гей 0Щ1У 1 в) 10 15 бі1у бек Уаї ТПг Іїе ТПг Сув пув Аза Бек Авр Нів І1ї1е Авп АБп Тгр 20
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув Рго сб1у АвБп Аза Рго Агд Гей Іецй І1е 25
Тук б1у ТПкг ТБг Авп о Тец біцп ТБг біу Уаі Ркго бек Агуд Ріе бег 01Уу бо
Зо Ззек б1іу бек бі1у Агуд Авр Туг Іїе Гей бек І1е ТПг бек Гей біп 5ег 65 70 75 80 бі Авр Уаї Аїа бек Тук Тук Сув біп біп Туг Тгр АБп о ТПг Рго РІе
З5 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПг Гув Гец біц І11е Гув 100 105 40 «2105 115 «2115 111 «212» РЕТ 45 «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 50 поліпептид" «4005 115
А1їа Уаі1 Гей Месє ТПг біп ТП Рго Іїец бек ТГецйп Рго Уаі Бек Гїеш 0Щ1У 1 5 10 15 55
Авр сбіп Аза бБег І1е бек Сув Агуд бек Бек біп Авп І1е Уаї Нів 5ег 20 25 30 60
Авр с1у Авп ТБПг Тук ІТец бій Тер Тук ІГец біп Гпув Рго бі1у біп б5ег
35 40 45
Ркго Ппув Гец Тец І1е Тук Ппув Уа1і Бек Авп Агуд Рпе бек біу Уа1їі Рго 50 з9 бо
Авр Агуд Робе бек біу бек біу бек б1і1у Агуд Авр Рпе ТПг Гей Ггув І1е 65 70 75 80 зек Агд Уаі біц Азїа б1у Авр Гей сіу Уа1і Тук Тук Сув Рое сбіп с01Уу 85 90 95 зек Нів Уаії Гецп ТПг Рпе сб1у Аїа сіу ТПг Агд їеп сій Гецй Гув 100 105 110 «2105» 116 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид"
Зо «4005 116
Авр І1е Уаї Меєсє ТПг біп бек біп Гпув Рре Меє бек ТПг бек Уаі1і ШУ 1 5 10 15
Авр Агуд Уаі бек І1е ТПг Сув пуб Аїа бек біп Рпе Уаії бек Авр А1а 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп Пув Рго сіу біп бек Рго Гпув Іецп Гей Ше 35 40 45
Сув бек Аїа бек Тугк Агуд Тук ТПг сіу Уаі Рго Авр Агд Рое ТПг 01Уу 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Рре ТПг І1е бек Бек Уаі Агд ТЕГ 65 70 75 80 бі Авр теп Аїа Уа1ї Тук Тук Сув біп біп Нів Туг І1їе Уаї Рго Туг 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу с1у біу ТПг ТПг Іец біц І1е сі 100 105 «2105 117 60 «2115 107 «212» РЕТ
«2135 Штучна Послідовність «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 117
Авр І1е Уаї Меєсє ТПг біп бек біп Гпув Рре Меє бек ТПг бек Уаі1і ШУ 1 в) 10 15
Авр Акуд Уаї бек І1е ТПпг Сув пув Аза бек біп Рпе Уа1і бБег Авр Аїа 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп Пув Рго сіу біп бек Рго Гпув Іецп Гей Ше 35 40 45
Сув бек Аїа бек Тугк Агуд Тук ТПг сіу Уаі Рго Авр Агд Рое ТПг 01Уу 50 55 бо
Ззек с1іу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Рпе ТіПг І1е бек бек Уаі Акд ТПг 65 70 75 80 бі Авр теп Аїа Уа1ї Тук Тук Сув біп біп Нів Туг І1їе Уаї Рго Туг
Зо 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сіу сіу ТПг ТПгЕ Гей сбіц І1е с1ц 100 105
З5 «2105 118 «2115 107 «212» РЕТ 40 «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 45 поліпептид" «4005 118
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек бек бек Туг ІГецйп бек Уаі Бек Те 0Ш1У 1 5 10 15 50 б1у Акд Уаї ТПг Іїе ТПг Сув пув Аза Бек Авр Нів І1е АвБп АБп Тгр 20 25 30 55
Тец Азї1а Тер Тук біп біп пув Рго с1у АвБп Аїа Рго Агд Гецп Гей Ше (516) зек б1у Аїа бек АБп Гей сі ТПг с1іу І1е Рго Бек Агд Рпе бек 01Уу бо зек сіу бек біу Гув Авр Тук ТПг Іецйп ТПг І1е ТПг бек Ггец сбіп ТПг 65 70 75 80 бі Авр Уаї Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп Тук Тер Авп ТПг Рго РіГе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу бек біу ТПг Гув Гец біц І1е Гув 100 105 «2105 119 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 119
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек Гей бБег Аза бек Іец С1Уу 1 5 10 15
Зо січ Агкуд Уаї бек Гей ТПг Сув Акуд Аїа бек біп сій І1е бек с1у Туг 20 25 30
Тецп бек Тер Гей біп біп пув Рго Авр біу ТПг І1е Гув Агд Те Ше
З5 35 40 45
Ту Аїа Аїа бек ТПг Іец Авр бек біу Уаі Рго Агд Агуд Рпе Бех 0Щ1У 50 55 бо зек Агд бек біу Бек Авр Тук Бек Гей ТПг Іїе бек бек Ггец біц 5ег 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза Авр Туг Тук Сув Гей біп Тук сіу бек Тукг Рго Тгр 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу с1у біу ТПЕ Гпув Ге бі Геч Туз 100 105 «2105 120 «2115» 108 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» (516) «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 120 біп І1е Уаї Гей ТПг біп бек Рго Аїа Іїе Меє бБег Аза бег Рго 01Уу 1 в) 10 15 бі Акуд Уаї ТПпг Гей ТПг Сув Бек Аїа бБег бек бек Гей бекг бек вег 20 25 30
Тук Гей Тук Тер Тук біп біп пув Рго біу бек бек Рго Гув ТІеч Тгр 35 40 45
ІТІе Тук бі1у Аїа Бек АвБп Гей Аза бек біу Уаі Рго сб1у Агд РПе 5ег 50 55 бо сіу бек сіу Бек с1у ТПг бек Тук бек Гей ТПг І1їе бек бек Меє сіц 65 70 75 80
Аза сій Авр Аза Аїа бек Тук Ропе Сув Нів біп Тер Бек Бек Тук Рго 85 90 95
Тецп ТПг Рпе сіу Бек сіу ТПкг Ппув Гей бій Гей Гув 100 105
Зо «2105 121 «2115 113 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 121
Авр І1е Уаї Меєсє ТіПг біп бек Рго бек бек Гей Рго Меє бек Уа1і1 ШУ 1 5 10 15 біп гув Уаї ТПг Меє Бек Сув Ппув Бек Бек біп бек Гей Гей Авп бег 20 25 30 б1у АвБп біп Гпув Авп бек Гец Аза Тгр Тугк біп сбіп пув Рго біу біп 35 40 45 зек Рго Пув Гей Гецп Уаї Тук Геп Аза бек ТПг Агуд бій бек сіу Уаї 50 55 бо
Рго Авр Агуд Ропе І1е б1у бек біу бек б1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТЕГ (516) 65 70 75 80
І1е бек бек Уаі біп Аї1а сій Авр ІТец Аза Авр Тук Рпе Сув біп сіп 85 90 95
Нів Нів бек ТПг Рго Туг ТПг Рпе сіу сіу сбіу ТП Гув Іеч сі Іецй 100 105 110
Тув «2105 122 «2115» 108 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 122 сій бек УМаї Гецп ТПг біп бек Ркго Аїа Гей Меє бек Аїа бек Те 01У 1 5 10 15 бі Гпув Уаї ТПпПг Меє ТПг Сув Агуд Аза бБег бек бек Уаі АвБп Нів Меє
Зо 20 25 30
Тук Тер Тук біп біп пуб Бек Авр Аза бек Рго їув Іецй Тгр І1е Туг
З5
Тук ТПг Бек ТПг Ггец Аза Ркго бі1іу Уаі Рго Аїа Агкуд Рібе бек сіу б5ег бо 40 бі1у бек б1у Авп Бек Тук бек Гей ТПг Іїе бек бек Меє сбіц с1у бій 65 70 75 80 45 Авр Аїа Аза ТПг Туг Тук Сув біп біп Рбе ТПг І1е бек Рго бек Мес 85 90 95
Тук ТПкЕ Рпе сіу сіу сбіу ТП пув Гец біц І11е Гув 50 100 105 «2105 123 «2115 107 55 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело (516) «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид"
«4005 123
Авр І1е Уаї Меєсє ТПг біп бек біп Гпув Рре Меє бек ТПг бек Уаі1і ШУ 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї бек Уа1і ТПг Сув пув Аза бек біп Авп Уаі Авр Бек Туг 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп пув Аїа сіу сіп бек Рго Пув Рго Гей Ше 35 40 45
Тук бБек Аїа бек Туг Агуд Рпе бек сіу Уаі Рго АвБр Агд Рпе ТіПг с1Уу 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг біп Рпе ТПг Іецй ТПг І1е бек Авп Уа1і сіп б5ег 65 70 75 80 бі Авр Теп Аза бій Тук Рпе Сув біп біп Туг Авп І1е бек Рго Туг 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Гец біц І11е Гув 100 105
Зо «2105 124 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
З5 «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" 40 «4005 124
Авр І1е Уаї Меєсє ТПг біп бек Рго Аїа ТПг Іецй бек Уаі ТПг Рго Щ1У 1 5 10 15 45
Авр Агкуд Уаї бек Іец бек Сув Агуд Аїа бек біп бек Іїе Бек Авр Туг 20 25 30 50 Уа1ї1 Тук Тер Тук біп біп Ппув бек Ні сій бек Рго Агуд Гец Гей І1е
ІТІе Туг Аза бек біп бек І1е бек біу І1е Рго Бек Агуд Рпе Бех щЩ1Уу 50 з9 бо зек сіу бек біу Бек Авр Рпе ТПг Іец бек І1ї1е Авп Бек Уаі1і сій Рго 65 70 75 80 60 бі Авр Уаї сіу Уа1ї Тук Тук Сув біп Авп сіу Нів Авп Робе Рго Туг 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу с1у біу ТПЕ Гпув Геп бі І1е Гув 100 105 «2105» 125 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 125
Авр чІ1е сіп Меє ТПг сіп бек бек бек бек Ріе бек Уа! бек Іеч 01Уу 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тпг Сув пув Аза бек бій Авр І1е Туг Авп Агд 20 25 30
Тец А1їа Тер Тук біп біп пув Рго сіу Бек Аза Рго Агд Гей Іецй І1е
Зо зек Аїа Аїа ТПг бек ІТецп бій ТПг біу Маії Рго Бек Агуд Рпе Бех щЩ1У бо
З5 зек сіу бек біу Гпув Авр Тук ТПг Іец бек І1е ТПг бек Гей біп ТПг 65 70 75 80 40 січ Авр Уаії Аїа ТПг Тук Тук Сув біп біп Тук Тер бек АвБп Рго Гей 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу Аїа сіу ТПг Гув Гец біц І11е Гув 45 100 105 «2105» 126 «2115 110 50 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело 55 «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 126
Авр І1ї1е Уаї Гец ТПг біп бек Рго Аїа бек ІТецп А1ї1а Уаії Бек ГІец 01У 60 1 в) 10 15 біп Акуд Аза ТПг о І1їе бек Сув Агуд Аза Бек бій бек Уа1ї Авр бек Туг 20 25 30 б1у АвБп бек Рпе Меє Нів Тер Ту біп біп пув Рго с1у біп Рго Рго 35 40 45 пув Гей Гецп Іїе Тугк Акуд Аза бек АвБп Гей бій бек с1у І1е Рго Аї1а 50 55 бо
Акуд Рпе бек біу бек біу бек Агуд ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг І1е Авп 65 70 75 80
Рго Уаі біц Аза Авр Авр Уаі А1їа АвБп Тук Тук Сув біп біп Бек Авп 85 90 95 бі Авр Туг ТПг Рпе сіу сіу с1у ТПг Ппув Гец біцш І11е Гув 100 105 110 «2105 127 «2115 111 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
Зо «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид"
З5 «4005 127
Авр І1е Уаї Гецш ТПг біп бек Рго ТПг бек ІТецп Аї1а Уаі бек їеш ШУ 1 5 10 15 40 біп Акуд Аза ТПг о І1їе бек Сув Агуд Аза Бек бій бек Уаї біц бек Туг 20 25 30 45 с1у Авп Агуд Тук Меє ТПг Тер Туг біп сбіп пув Рго б1у біп Рго Рго ув Теп Гей Іїе Туг Агуд Аїа Аза АвБп Гей біп бек сіу І1е Рго А1а 50 з9 бо
Акуд Рпе бек біу бек біу бек Агд ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг І1е Авр 65 70 75 80
Рго Уаі біц Аза Авр Авр Уаі Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп Бек Авп 85 90 95 60 бі Авр Рго Тер ТПг Рпе сіу сіу с1і1у ТПкг Ппув Уаї сбіц І11е Гув
100 105 110 «2105» 128 «2115» 120 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 128 сій Маї біп Гецп Уаі сій бек сі1у сбіу сб1у Геп Уаі сбіп Рго б1у С01У 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув А1ї1а Аза бек Авр Рпе бек Гей ТПг ТПг Туг 20 25 30 сбі1у Маії Нів Тер Уаі Агуд сбіп Аза Рго с1іу Ппув сіу Гей біц Тгр Іей 35 40 45 сі1у Маї І1ї1е Тер Бек сіу сіу Бек ТПг Авр Туг Авп Аїа Аза РоПе І1е 50 55 бо
Зо зек Агд Пец ТПг І1е бек Гпув Авр АвБп бек Гув Авп о ТПг Уа1! Тук Іец 65 70 75 80 сбіп Мес Авп бек Гей Акуд Аїа бій Авр ТПг Аза Уа1і Туг Тук Сув Аїа 85 90 95
Акуд Авр о Тук біу бек ТПг Тук Уаі АвБр Аї1а І1е Авр Тугє Тер 0Ш1у сіп 100 105 110 бі1у ТПпг Геип Уа1і ТПг Уа1 Бек 5ег 115 120 «2105 129 «2115» 450 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 129 бі Маї біп Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1 сіп Рго с1у 01У 1 5 10 15 60 зек Гей Агд Іїец бек Сув А1ї1а Аза бек Авр Рпе бек Гей ТПг ТПг Туг 20 25 30 сіу Маії Ні Тер Уаі Акуд біп Аїа Рго сб1у Ппув с1у Гей бій Тгр Гей 35 40 45 сі1у Маї І1ї1е Тер Бек сіу сіу Бек ТПг Авр Туг Авп Аїа Аза РоПе І1е 50 з9 бо зек Агкд Пец ТПг І1е бек Гув Авр АвБп бек Гув Авп о ТПг Уаі1! Тук ГІей 65 70 75 80 біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа сій Авр ТПг Аїа Уа1! Тук Тук Субв А1а 85 90 95
Акуд Авр о Тук біу бек ТПг Тук Уаі Авр Аїа І1е Авр Туг Тер с1у сіп 100 105 110 сіу ТК Гец Уаї ТПг Уа1ї бек бек Аза бек ТПкг Ппув біу Рго бек Уаї 115 120 125
Рпе Рго Гец Аза Рго бек бек пуб бек ТПг бек сіу с1і1у ТПг Аїа А1а
Зо 130 135 140
Тец б1у Сув Гей Уаії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Ркго Уаї ТіПг Уаї1ї 5ег 145 150 155 160
З5
ТЕр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг бек сіу Уаії Нів ТПг Рпе Рго Аїа Уаї 165 170 175
Тецп біп бек бек с1іу Гей Тук Бек Гей бек бек Уа1! Уаї ТіПг Уаї1ї Рго 180 185 190
Ззек бек бек Гей с1у ТПг сіп ТПг Туг І1е Сув Авп Уа! АБп Нів Гув 195 200 205
Ркго Бек Авп ТПг Гуз Маї Авр о Гув пув УМаї бій Рго Ппув Бек Сув Авр 210 215 220
Тпув ТПЕ Нів ТП Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Гей Геш с1у Щ1У 225 230 235 240
Ркго Бек Уаії Рпе Іїецй Рпе Рго Ркго Гув Рго Гув Авр ТПг Ге Меє Те 245 250 255 60 зек Агуд ТПг Рго біц УМаї ТПг Сув Уаі Уаї Уаї Авр Уа1і Бек Нів сіц
260 265 270
Авр Ркго сій Уаї пуб Рбе Авп о Тгр Туг Уаі Авр б1у Уаі сі Уаї Нів 275 280 285
Авп Аза пуб ТПг Тубв Рго Агд біц бі біп Ту с1у Бек ТПг Туг Аг4д 290 295 300
Уаї Уаї Бек Уаії Гей ТПг Уаї гейш Нів сбіп Авр Тгр Гец Авп о б1у Гув 305 310 315 320 бі Тук Гпув Сув Ппув Уа1 Бек Авп Гпув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е с1іц 325 330 335 пув ТПг І1е Бек Ппув Аїа Ппув б1іу біп Рго Агд бій Ркго біп Уаї Туг 340 345 350
ТПЕ Гей Рго Рго бБег Агд біц сій Меє ТПг Гпув Авп обіп Уаї бек Іецй 355 3З6о 365 зек Сув Аїа Уаії пув б1у Рпе Туг Рго бек Авр І1ї1е Аїа Уаі1і сій Тгр 370 375 380
Зо бі бек АвБп сіу біп Рго бій Авп Авп о Тук Ппув Тс ТБг Рго Рго Уаї 385 390 395 400
З5
Тец Авр бек Авр сіу Бек Рпе Рпе Гей Уа1і бек Ппув Гей ТПг Уа1ї Авр 405 410 415 пув бек Агуд Тер біп біп б1у Авп Уаї Ріре бек Сув бек Уаї Меє Нів 420 425 430 бі Азїа Гей Нів Авп о Нів Тукг ТПг о біп пув бек Гей бек Гец бег Рго 435 440 445 с1у Гув 450 «2105 130 «2115 111 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 60 поліпептид"
«4005 130
Авр І1ї1е Уаї Гец ТПг біп бек Рго Авр бек Гей Аїа Уа1 бек ГІец с1У 1 5 10 15 бі Агкуд Аза ТПг чІ1ї1е Ап Сув Агуд Аза Бек бій бек Уаї біц бек Туг 20 25 30 с1у Авп Агуд Тук Меє ТПг Тер Тук біп сбіп Пув Рго б1у біп Рго Рго 35 40 45 ув Теп Гей Іїе Туг Агуд Аїа Аза Авп Гей біп бек сіу Уаї Рго Авр 50 55 бо
Акуд Рпе бек біу бек біу бек бі1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг І1е 5ег 65 70 75 80 зек Гец біп Аї1а б1іцш Авр Уаі Аза Уаї Тук Тук Сув біп біп Бек Авп 85 90 95 бі Авр Рго Тер ТПг Рпе сіу сбіп сбіу ТПкг Ппув Уаї сбіц І11е Гув 100 105 110
Зо «2105 131 «2115» 218 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 131
Авр І1е Уаї Гец ТПг біп бек Рго Авр бек Те Аї1а Уаі бек їеш ШУ 1 5 10 15 бій Агуд Аїа ТБПг о Іїе Авп Сув Акуд Азїа бек бій бек Уа1ї бій бек Туг 20 25 30 б1у АвБп Агуд Тук Меє ТПг Тер Тує біп біп пув Рго с1у біп Рго Рго 35 40 45 ув Теп Гей Іїе Туг Агуд Аїа Аза Авп Гей біп бек сіу Уаї Рго Авр 50 55 бо
Акуд Рпе бек біу бек біу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг І1їе 5ег 65 70 75 80 60 зек Гец біп Аї1а б1іцш Авр Уаі Аза Уаї Тук Тук Сув біп біп Бек Авп
85 90 95 біц Авр Рго Тер ТПг Рпе сіу сіп сіу ТПг Ппув Уа1 сій І1е пув Агд 100 105 110
ТпПг Уаі1і Аза АТа Рго бек Уаі Рпе Іїе Рібе Рго Рго б5ег АБр бій сіп 115 120 125 теп Гпув бек сіу ТПг Аїа бек Уаі Уаії Сув Гей Гей Авп Авп Рое Туг 130 135 140
Рго Агкд біц Аза Гуз УМаї біп Ткр Гуз Маії Авр АБп Аїа Гей сіп б5ег 145 150 155 160 с1у Авп бек біп бій бек Уа! ТБг бій біп Авр бек Пув Авр бек ТіПг 165 170 175
Тук Бек Гей бек бек ТПг Іец ТПг Ггец бек їув Аза Авр Тук сій Гув 180 185 190
Нів Ппув Уа1 Туг Аїа Сув біц Уа1! ТБг Нів біп б1у ІТецй бек бек Рго 195 200 205
Зо
Уаї ТПпгЕ Ппув Бек Рбе Авп Агд сіу сіц Сув 210 215
З5 «2105 132 «211» 116 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність 40 «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" 45 «4005 132 бі Маї біп Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1 сіп Рго с1у 01У 1 5 10 15 50 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Рпе ТПг бек Авп 20 25 30 55 ТУукг Іїе бек Тгр УМаі Агуд біп А1їа Рго сіу Пув біу Те бі Тер Уаї сі1у бі І1їе Авр Рго Тукг Авр с1у Авр ТПг Туг Туг Аза Авр бек Уаї 60 50 з9 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Аза Авр ТПг Бек Гпув Авп ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТБг АТїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
А1їа ТпПК о с1іу ТБг Авр Уа! Меє Авр Туг Ткгр б1у сіп с1у ТПг Гей Уаї 100 105 110
ТПгЕ Уаї бек 5ег 115 «2105 133 «211» 446 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 133 бі Маї біп Гей Уаі бі бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1 сіп Рго с1у 01У
Зо 1 в) 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек б1і1у Рпе ТПг Рпе ТПг бек Авп 20 25 30
З5
Тук Іїе Бек Тер Уаі Агд біп Аїа Рго сіу пув б1у Те бій Тгр Уаї 40 сі1у бі І1їе Авр Рго Тукг Авр с1у Авр ТПг Туг Туг Аза Авр бек Уаї бо 45 пув б1і1у Акуд Рпе ТПг І1їе бек Аїа Авр ТПг бек Пув Авп ТПг А1їа Туг 65 70 75 80
Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТБг АТїа Уаї Тук Тук Сув 50 85 90 95
Аза ТПг с1у ТБг Авр Уаї Меє Авр Туг Тер с1у сбіп с1у ТПг Гей Уаї 100 105 110 55
ТПг Уа1 бек бек Аза бек ТПг Ппув сіу Рго бек Уаі Рпе Рго Іецй Аїа 115 120 125 60
Ркго Бек бек пуб бек ТПг бек біу бі1у ТПпг Аза Аїа Геи с1у Сув ГІец
130 135 140
Уаї пув Авр Тук Рпе Рго сіц Рго Уа1 ТПг Уаї бек Тгр АБп бехг Щ1У 145 150 155 160
Аза гей ТПг бек біу Маії Нів ТБПг Рре Рго Аї1а Уаії Гей сбіп Бек 5ег 165 170 175 сб1у Гей Тук Бек Гей бек бек Уаі Уа1і ТПг Уа1 Рго бек бек бек Іеєц 180 185 190 бі1у ТПпг біп ТПпс Тук Іїе Сув Авп Уаі Авп о Нів Ппув Рго бек АвБп ОТГ 195 200 205 пув Ма1ії Авр Ппув Ппув Уа1ї бій Рко Пув бек Сув Авр Гув ТПкЕ Нів ТЕГ 210 215 220
Сув Ркго Рго Сув Рго Аїа Рго сій Гей Гей сіу сіу Рго бек Уаі1! РБПе 225 230 235 240
Тецп Рпе Рго Рго Пув Рго Пув Авр ТПг Ггец Месє І1е 5екг Агд ТПг Рго 245 250 255
Зо бі Маї ТПпг Сув Уаі1і Уа1 Уа1 Авр Уаі Бек Нів сій Авр Рго бій Уаї 260 265 270
З5
Тпув Рпе АвБп о Тгр Туг Уаі Авр сіу Уаі біц Уаї Ні АвБп Аї1а Гув ТПг 275 280 285 цув Рго Агд бі бій біп Тук біу бек ТПг Тук Акуд Уа1! Уаї Бек Уаї 290 295 300
Тецп ТПпг Уаї Гей Нів біп Авр Тер Гец Авп о біу Гув бій Тук Ппув Сув 305 310 315 320
Тпув Маї Бек Авп Гпув Аїа Гей Рго Аза Рго Іїе сій пув ТПг І1е 5ег 325 330 335 пув Азїа Ггув с1іу біп Рго Акуд бій Рго біп Уа1 Тук ТБПг Гей Рго Рго 340 345 350 зек Агд біц біц Меє ТПг Гув Авп обіп Уаї бек Гей Тгр Сув Гей Уаї 355 3З6о 365 (516) пув біу Рпе Тук Рго бек Авр І1їе Аїа Уаі бій Тер бій бБег АБп 01У 370 375 380 біп Ркго бій Авп Авп о Тук Ппув ТПг ТБПг Рго Рго Уа1і Гей Авр 5ег Авр 385 390 395 400 бі1у бек Рпе Рпе Гей Тук бек Ппув Гей ТПг Уа1і1 Авр пуб бБег Агд Тгр 405 410 415 біп бі1іп сб1у Авп Уа1і Рпе бек Сув Бек Уа1 Меє Нів біц Аїа Іецй Нів 420 425 430
Авп оНів Тук ТіПг біп пуб бек Гей бек Гей бек Рго с1Уу Гув 435 440 445 «2105 134 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 134
Зо Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек ІТецй бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тпг Сув Агуд Азїа бек біп Авр Уаі Бек ТПг Аїа
З5 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп пув Рго сіу Пув Аїа Ркго Гув Іеп Гей Ше 40
Тук Бек Аїа бек РіПе Іїец Тук бек біу Уаі Ркго бек Агуд Рпе Бех 0Щ1У бо 45 зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 50 січ Авр Рпе Аза ТПг Тугк Тук Сув біп біп бек Туг ТБг ТПг Рго Рго 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сбіп сбіу ТПг Гуз Уаї сбіц І11е Гув 55 100 105 «2105 135 «2115» 214 60 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність
«221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 135
Авр І1е сіп Месє ТіПг біп бек Рго бек бек ІГецйп бек Аза Бек Уаі1і Щ1У 1 5 10 15
Авр Акуд Уаї ТіПг І1е Тпг Сув Агуд Азїа бек біп Авр Уаі бБег ТПг Аїа 20 25 30
Ууаї Аза Тер Тук біп сбіп пув Рго сіу Пув Аїа Ркго Гув Іеп Гей Ше 35 40 45
Тук Бек Аїа бек РіПе Гей Тук бек сіу Уа1і Рго бБег Агд Рпе бехг 1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е Бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа ТПг Туг Тук Сув біп біп бек Тук ТПг ТПг Рго Рго 85 90 95
Зо
ТПЕ Рпе сіу сіп сіу ТБг Гуз Уа1! сіц І1е гув5 Агд ТПпг Уаі Аза Аза 100 105 110
З5
Ркго Бек Уаії Ріпе І1е Рпе Рго Рго бек Авр бі біп Гей пуб бег б1Уу 115 120 125
ТПг АТа бек Уа1ї Уа1ї Сув Гецп Гей Авп Авп Рібе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр АБп Аза Гец біп бек б1у АвБп бек сіп 145 150 155 160 бі бек Уаії ТП бі біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Тукг бек Іец 5ег 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уа1ї! Туг 180 185 190
А1їа Сув біц Уаї ТБгЕ Нів біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205 (516) Рпе Ап Акуд б1у бій Сув 210
«2105» 136 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 136 зек Авп Туг І1е 5ег 1 5 «2105 137 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 137 бі І1е Авр Рго Туг Авр с1іу Авр ТПг Туг Туг Аза Авр бек Уа1ї! Гув
Зо 1 в) 10 15 сову
З5 «2105 138 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 138 бі1у ТПпг Авр Уа1і Меє Авр Туг 1 5 «2105 139 «2115 11 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний 60 пептид"
«4005 139
Акуд Аза бек біп Авр Уаі! бек ТПг Аїа Уаї А1а 1 5 10 «2105» 140 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 140 зек Аїа бек РПе Іецй Туг 5ег 1 5 «2105 141 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид"
Зо «4005 141 біп біп бек Туг ТПг ТПг Рго Рго ТПг 1 5
З5 «2105 142 «2115 34 «212» РЕТ «213» Невідомий «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Невідомого: бета-Клото пептид" «4005 142 зек Бек Рго ТПг Агд ІТеп Аза Уаії І1е Рго Тгр сіу Уаі Агд Ппув Іец 1 5 10 15
Тец Агуд Тер Уаі Агуд Агуд Авп о Тугк с1у Авр Меє Ар І1ї1е Туг І1е ТПг 20 25 30
А1їа 5ег «2105 143 бо «2115 16 «212» РЕТ
«213» Невідомий «221» джерело «223» /примітка-"Опис Невідомого: Фібробласт Зростаючий Фактор
Рецептор 1 пептид" «4005 143 пуб ТГеп Нів АТїа Уаі Рго Аза Аїа Ппув ТПг Уа1 Ппув Рібе пув Суб Рго 1 в) 10 15 «2105» 144 «211» 14 «212» РЕТ «213» Невідомий «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Невідомого: Фібробласт Зростаючий Фактор
Рецептор 1 пептид" «4005» 144
Рпе пуб Рго Авр Нів Агуд Іїе б1у б1у Тук Ппув Уа1і Агд Туг 1 в) 10 «2105» 145 «2115 992
Зо «2125 РЕТ «213» Ношо зарієепь «4005» 145
Рпе бек б1у Авр б1у Агкуд Аї1а І1е Тгр бек Ппув Авп Рго АвБп Рое ТЕГ
З5 1 в) 10 15
Ркго УМаі Авп біц бек біп Гей Рбе ІТецй Тук Авр ТПг Рпе Рго Пув Авп 20 25 30 40
Рпе РбПе Тгр сі1у І1е сб1у ТПпг с1у Аїа Гей сіп Уа1і1 сіц сі1у бек Тгр 45
Туз Гув Авр о сіу Ппув с1іу Рго Бек Іїе Тгр Авр Нів РоПе І1е Нів ТЕПг бо 50 Нів Гецп Ппув Авп Уа! бек бек ТПг Авп біу бек Бек Авр бек Туг І1е 65 70 75 80
Рпе Гец біц Гпув Авр Тецй бек Аза ІТец Авр Рпе І1ї1е сіу Уа1 Бек Ріє 55 85 90 95
Тук біп Рпе бек І1ї1е бек Тер Рго Агкд Гец Робе Рго АвБр с1у І1їе Уаї1ї 100 105 110 60
ТпПг Уаі1 Аза Авп Аїа пуб б1і1у Гей сіп Тук Тук бек ТПг Іецп Гец Авр 115 120 125
А1їа Ггечп Уаі Іей Агуд АБп чІ1е біц Рго І1ї1е Уаї ТПг Гей Туг Нів Тгр 130 135 140
Авр Гей Рго Гец Аїа Іїец біп біц Гуз Тук б1у с1у Тер пув Авп Авр 145 150 155 160
ТЕ Іїе Іїе Авр Іїе Рбе АвБп Авр Тут Аза ТПг Тук Сув Рпе сіп Меє 165 170 175
Рпе с1у Авр Агкд Уаії пуб Туг Тгр І1е ТПг І1е Нів Авп Рго Тукг Іец 180 185 190
Ууаї Аза Тер Нів сіу Тук сіу ТП сіу Меє Ні Аза Рго сіу б1ц Гув 195 200 205 с1у АвБп Гец Аза Аїа Уа1ї Туг ТБПг Уаї с1у Нібв Авп Тей І1е пув А1їа 210 215 220
Нів Бек Ппув Уа1! Тер Нів Авп о Туг Авп о ТПг Нів Роре Агуд Рго Нів сіп
Зо 225 230 235 240
Тпув б1у Тер Гей Бек Іїе ТПг Гей сіу Бек Нів Тер І1е біц Рго АвБп 245 250 255
З5
Акуд Бек біц АвБп Тс Меє Авр І1е Рпе Гув Сув біп біп Бек Меє Уаї 260 265 270 зек Уаії Гец сіу Тер Рпе Аза АвБп Рго І1е Нів с1у Авр 01у Авр Туг 275 280 285
Рго сіц сіу Мес Агуд пув Ппув Гей Рпе бек Уаї Гей Рго І1е Рібе 5ег 290 295 300 бі Аза бій пув Нів бі Меє Агуд с1іу ТПг Аза Авр Рібе Рібе Аза РіПе 305 310 315 320 зек Рпе біу Рго Авп АвБп Рпе Гув Рго Гей АвБп ТПг Меє Аїа Гуз Меє 325 330 335 бі1у біп Авп Уаії Бек Гей Авп Гей Агуд бій Аза Гец АвБп Тгр І1е Гу 340 345 350 60
Те б1іп Тук Авп Авп Рго Агуд Іїе Гей Іїе Аїа сій Авп б1іу Тгр РБПе
355 3З6о 365
ТПЕ Авр Бек Агуд Уаї Ппув ТПг бій Авр ТБг ТБг Аза І1е Тук Меє Меє 370 375 380
Тув Авп о Рпе Гей бек біп Уаі Гей сбіп Аїа Іїе Агд Гец АвБр сбіц І1е 385 390 395 400
Акуд Уаі1 Робе сіу Тук ТПг Аза Тгр бек Іецй Гей Авр с1у Рпе сій Тгр 405 410 415 біп Авр Аїа Туг ТПг Іїе Агуд Агуд с1іу Гей Рпе Тук Уаї Авр Робе Авп 420 425 430 зек Ппув біп Гув б1іп Агд Пув Рго Пув бек бек Аза Нів Тук Тук Гув 435 440 445 біп І1е І1е Агуд бій Авп сбіу Рпе бек Гей пув бій бек ТПг Рго Авр 450 455 460
УуУаї біп с1у біп Рпе Рго Сув Авр Рпе бБег Тгр біу Уаі ТПгЕ сіц б5ег 465 470 475 480
Зо
Уаї Гей Ппув Рго бій бек Уаії Аїа бек бек Рго біп Робе бек Авр Рго 485 490 495
З5
Нів Гей Тук Уаї Тер АБп Аза ТПг с1іу Авп Агуд Гей Гей Нів Агд Уаї 500 505 510 сі бі1у Маії Агд Гей Пув ТПг Акуд Рго Аїа сбіп Сув ТБг Авр Роре Уаї 515 520 525
Ап очІ1е пув пув біп Тецп бій Меє Іїеш Аза Акуд Меє пуб Уаї Тік Нів 530 535 540
Туг Агкуд Рпе Аза Гец Авр Тгр Аза бек Уаії Гец Рго ТПг б1у Авп Іецй 545 550 555 560 зек Аїа Уаі АвБп Агд біп Аї1а Гей Агуд Туг Туг Агкуд Сув Уаї Уа1ї 5ег 565 570 575 бі б1у Геп Ппув Ге с1іу Іїе Бек Аїа Меє Уа1 ТПг Гец Туг Туг Ркго 580 585 590 (516) ТПЕ Нів Аїа Нів Тецй с1і1у Гей Рго бій Рго Гей Гей Нів Аїа АБр 0Щ1У 595 бо 605
ТЕр гей Авп о Рго бек ТПг Аза сій Аза Робе сСіп Аїа Туг Аї1а сС1Уу Гей 610 615 620
Сув Рпе біп сій Геш с1у Авр Гей Уаі Гпув Гей Тер І1е ТПг І1е Авп 625 630 635 640 біц Ркго АвБп Агуд Гей бек Авр І1їе Туг Авп Агуд бек с1у АвБп АвБр ТЕГ 645 650 655
Тук б1у Аїа Аїа Нів АвБп Гей Гец Уаі Аїа Нів Аза їец Аза Тер Агкд 6бво 665 670
Тецп Тук Авр Агуд біп Рпе Агуд Рго Бек біп Агуд сіу Аїа Уаї бек Ієей 675 680 685 зек Ггец Нів Аза АБр Тгр Аза біц Рго А1їа АБп Рго Туг Аїа Авр 5ег 690 695 700
Нів Тер Агуд Аїа Аза біц Агд Рпе Гец біп Рбе б1іцш І1е А1ї1а Тгр РіПе 705 710 715 720
Зо
Аза сій Рго Гец Робе Гув5 ТПг біу Авр Туг Рго Аїа Аїа Меє Агд сіц 725 730 735
Тук Іїе Аїа бек пув Нів Агуд Агуд сіу Гей бек бек бек Аїа Геч Рго 740 745 750
Акуд Гей ТБПг біц Аза б1п Агуд Агд Тецй Тецйп Гпув с1у ТПг Уаі Авр Ріє 755 760 765
Сув А1їа Гей Авп Нів Рпе ТПг ТПг Агуд Рпе Уа1 Меє Нів сіц сіп Іей 770 775 780
Аза сіу Бек Агкд Туг Авр бек Авр Агд АБр І1е сіп Рпе Гей сбіп Авр 785 790 795 800
І1е ТБг Агд Тїец бек бек Рго ТПг Агд Те А1ї1а Уаі І1е Рго Тер Щ1У 805 810 815
Уа1 Акуд пув Гей Гей Агуд Тгр Уаі Агуд Агд Авп Туг б1у Авр Меє Авр 820 825 830
ІТІе Туг І1е ТПг Аза бек сб1у І1е АБр АБр біп Аза Гей бій Авр Авр 60 835 840 845
Акуд Гей Агуд пуб Тук Тук ІГец с1іу Ппув Тук Іїец бі1іп бій Уаї Гей Гув 850 855 860
А1їа Тук гей Іїе Авр Гув УМаії Агуд І1е Гуз бі1у Тук Тук Аїа РПе Гув 865 870 875 880
Тем Аї1а сбіц біц Ппув бек Пув Ркго Агуд Рпе сіу Рпе Рібе ТПг бек Авр 885 890 895
Рпе пув Аїа пуб бек бек І1ї1е біп Ропе Тук АвБп Гпув Уаі Іїе Бек 5ег 900 905 910
Акуд с1у Робе Рго Роре біц АвБп бег бек бек Агуд Сув Бек біп ТПг сіп 915 920 925 бі Авп о ТПпг обі Сув Тпг Уа1ї Сув Гей Рпе Гей Уа1! сіп пув Гув Рго 930 935 940
Тец І1їе Рпе Гей с1іу Сув Сув Рпе РпПе бек ТПг Гей Уаї Гей Іецй Іей 945 950 955 960
Зо зек Іїе Аїа І1е Рпбе сбіп Агуд біп Пув Акуд Агуд пуб Рпе Тер пув Аїа 965 970 975
Тпув АвБп о Гей сіп Нів Іїе Рго Гей Ппув Ппув с1іу Пув Акд Уаї Уаї1ї 5ег
З5 980 985 990 «210» 146 «2115» 820 40 «212» РЕТ «213» Ношо зарієепь «400» 146
Меє Тер бек Тер пув Сув Пец Гей Робе Тгр Аїа Уаії Іец Уаї ТПг Аїа 45 1 в) 10 15
ТПЕ Гей Сув ТПг Аза Агуд Рго бек Рго ТПг Гец Рго бій б1п Аза сіп 20 25 30 50
Рго Тер б1у Аїа Ркго Уаі бій Уаії біц бек Рпе Гей Уаі Нів Рго щу 55
Авр Гей Ггец біп Тец Агуд Сув Агд Тец Агуд Авр Авр Уаі біп бек І1е бо (516) Авп оТеЕр Гей Агуд Авр біу Уаі сбіп Гей Аїа бій бек Авп Агд ТБг Агд 65 70 75 80
І1е ТЕ с1у бі біц УМаї бій Уаії біп Авр бек Уаі Рго Аїа Авр 5ег 85 90 95 сб1у Гей Тук Аїа Сув Уа1 ТПг Бек Бек Рго бек сіу Бек Авр ТПг ТЕПг 100 105 110
Тук Рпе бек Уаії Авп Уаї! бек Авр Аза Гец Рго бек бек бій Авр Авр 115 120 125
Авр Авр Авр Авр Авр бек бек бек бій бій Гув біц ТПг Авр АвБп о Тг 130 135 140
ТПув Рго АвБп о Рго Уаі Аїа Рго Туг Тгр ТПг бек Рго сбіц Ппув Меє сій 145 150 155 160
Туз Гув Гей Нів Аїа Уаі1 Рго Аїа Аїа Ппув ТПг Уаї Ппув Рбе Гув Сув 165 170 175
Ркго Бек бек біу ТПг Рго АвБп Рго ТПг Іец Агуд Тер Гей Ггув АБп 1У 180 185 190
Зо
Тпув бій Рпе Ппув Рго Авр Нів Агуд Іїе сіу сіу Тук Ппув Уаї Агд Туг 195 200 205
А1їа ТПг Тер бек І1е І1їе Меє Авр бек Уа1і Уа1ї! Рго бек Авр ув 01У 210 215 220
АвпоТук ТПг Сув І1е Уаі б1п1 АвБп біц Тук бі1у Бек Іїе АвБп Нів ТЕГ 225 230 235 240
Тук біп Гей Авр Уаї Уаії бі1цп Агкд бек Рго Нів Агуд Рго Іїе ГІец сіп 245 250 255
А1їа с1у Гец Рго Аза АвБп о Гув ТПг о Уаі Аза їецп сіу Бек Авп Уа1 сіц 260 265 270
Рпе Меє Сув пув Уаї Тук бек Авр Рго біп Рго Нів І1ї1е Сіп Тгр Іей 275 280 285 пув Нів І1е біц Уаі Авп сбіу бек Гув І1е с1у Рго Авр АБп Гей Рго 290 295 300
Тук Уаі1 сіп І1е Гецшц Гпу5 ТПг Аїа сіу Уаі Авп ТПг ТБбг Авр Гув б1ци (516) 305 310 315 320
Меє сі Уаї гейш Нів Гей Агуд Авп Уаі1! бек Рое біц АБр Аї1а сС1у сі1ци 325 330 335
Тук ТпПк Сув Гей Аїа сіу АвБп бек І1е сі1у Гей Бек Нів Нів бек Аїа 340 345 350
ТЕр Геп ТпПг Уаї Іей сбіц Аза еп біц бій Акуд Рго Аї1а Уаї Меє ТЕГ 355 3З6о 365 зек Рго Пец Тук Іец б1п І1ї1е І1е І1їе Туг Сув ТПг сіу Аїа РіПе Іей 370 375 380
І1е бек Сув Меєсє Уа1ї б1у бек Уаії І1е Маї Тук Ппув Меє гув Бех У 385 390 395 400
ТПЕ Ппув Ппув Бек Авр Рібе Нів бек біп Мес Аза Уаї Ні Ггув Іецп Аїа 405 410 415
Ппув век І1їе Рго Гей Агуд Агуд біп Уаі ТПг Уа1і бек Аза Авр бег 5ег 420 425 430
Зо А1їа бек Меєсє Авп бек сіу Уаі Гецп Гей Уа1і Агуд Рго бек Агд Іец 5ег 435 440 445 зек бек біу ТПг Ркго Меє Гей Аїа сі1у Маії бек сій Тук бій Гей Рго 450 455 460 бі Авр Рго Агуд Тер бій Гей Рго Агуд Авр Агуд Гей Уаї Іец с1Уу Гув 465 470 475 480
Рго Гец сіу біц б1у Сув Рпе сбіу біп Уаї Уаії гейш Аза бій Аза Пе 485 490 495 сб1у Гей Авр Ппув Авр Пув Рго Авп Агуд Уа1 Тбг пуб Уаї Аза Уаї Гув 500 505 510
Меє Гей пув бек Авр Аїа ТПг бій пуб Авр Гей бек Авр Гей І1е 5ег 515 520 525 бі Меє сій Меє Меє пув Меє І1е с1у Ппув Нів пув АвБп І1е І1е Авп 530 535 540
Тецп Іїецп сб1у Аїа Сув ТПг біп Авр сіу Рго Гей Тук Уаї І1ї1е Уаї с1ц 545 550 555 560 60
Тук Аїа Бек Ппув с1у АвБп Тец Агд сій Туг Іец біп А1а Агд Агд Рго 565 570 575
Рго с1у ем бій Тук Сув Тук Авп Рго бек Нів АБп Рго сій біц сіп 580 585 590
Тецп бек бек Гпув Авр Гей Уа1і бек Сув Аїа Туг біп Уаі1і Аїа Акд с1Уу 595 бо 605
Меє сій Тук Ггеш Аїа бек пув пув Сув І1е Ніб5 Агд АБр Теп Аза Аза 610 615 620
Акуд Авп оУаії Гец Уаії ТПпг бій Авр АвБп о Уаї Меє Гув Іїе Аїа Авр Ріє 625 630 635 640 сб1у теп Аза Агуд Авр Іїе Нів Нів Іїе Авр Тук Тук Ппув Пув ТПг ТЕП 645 650 655
Авп обіу Акд Тей Рго Маії Ппув Тер Меє Аза Рго сбіц Аза Гей Рібе Авр 6бво 665 670
Акуд І1е Тук ТіПг Нів біп бек Авр Уаі! Тер бек Рпе сіу Уа1ї ГІецй Іецй
Зо 675 68о 685
ТЕр біш Іїе Рбе ТПг Гец біу сіу бек Рго Тукг Ркго біу Уаї Рго Уаї 690 695 700
З5 бі бій Гей Рпе Ппув Гей Гей пув бі с1у Нів Акуд Меєсє Авр Гув Рго 705 710 715 720 зек Авп Сув ТПг АвБп бій Геип Туг Меє Меє Меє Агуд Авр Сув Тер Нів 725 730 735
А1їа Уаї Ркго бек біп Агуд Рго ТПг Рпе Пув біп Гецш Уаї сій Авр Гей 740 745 750
Авр Агуд ч1І1е Уаі! Аза Іїецй ТПг бБег Авп о біп бій Тук Гей Авр Гей 5ег 755 760 765
Ме Рго гей Авр біп Тук бек Рго бек РіПе Рго Авр ТПг Агуд бек бег 770 775 780
ТПг Сув Бек бек сіу біц Авр бек Уаії Рібе бек Нів бій Рго Гей Рго 785 790 795 800 60 бі бій Рго Сув Гей Рго Агкуд Нів Рго Аїа сіп Тейп Аза АБп б01у щу
805 810 815
Течп Гуз Агд Агд 820 «2105» 147 «211» 948 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 147
Авр Тут пув Авр Авр Авр Авр о Гув Гец біц Ррпе бек сб1у Авр о1У Гув 1 в) 10 15
А1їа І1їе Тгр Авр Гув пув біп Туг Уаії бек Рго Уаі АвБп Рго с1у сіп 20 25 30
Тецп Рпе Гей Туг Авр ТПг Рпе Рго Пув Авп Рпе бек Тер сіу Уаі 1У
Зо
ТП сб1у Аїа Рбе сбіп Уаі біц сіу бек Тгр ув Аї1а АвБр 01у Агд Щ1У бо 35 Рго Бек І1ї1е Тгр АвБр Агуд Тук УМаії Авр бек Нів Гей Агуд с1у Уа1і! Авп 65 70 75 80 век ТБПг Авр Агд бек ТПг Авр бек Тук Уаії Рпе Гей бій Гпув Авр Гей 40 85 90 95
Тец А1їа Гей Авр Рпе Гей сіу Уаі Бек Рпе Туг сіп Рібе бег І1е 5ег 100 105 110 45
ТЕр Рго Акд Гей Рібе Рго АБп о сіу ТПг Уаі Аза Азї1а Уаї АБп Аїа Гув 115 120 125 50 сб1у Гей біп Туг Туг Агуд Аїа Гей Гей Авр бек Гей Уаї Гей Агд Авп 130 135 140 55 І1їе сій Рко І1ї1е Маії ТПКг Гей Тук Нів Ткгр Авр Гей Рго Гечп ТЕБЕ Гей 145 150 155 160 біп б1п бій Тук с1у сб1у Тер пув Авп Аїа ТПг Меє І1е Авр Іец РБПе 60 165 170 175
Авп о Авр оТут Аза ТПг Тук Сув Рпбе біп ТПпг Рпе с1у Авр Агд Уаї Гу 180 185 190
Тук Тер Іїе ТПг Іїе Нібв АвБп Рго Туг Гец Уаі Аза Тер Нів сі1у РПе 195 200 205 сіу Тк б1у Меє Нів Аза Рго сбіу бій Ппув с1іу АвБп Гей ТПг Аїа Уаї1! 210 215 220
Тук ТпПкг Уа1ї сіу Нів Авп Тец Іїе Пув Аза Нів бек Гув Уаї Тер Нів 225 230 235 240
АвпоТукг Авр о Гпув Авп о Рпе Агуд Рго Нів сбіп Ппув с1іу Тер Гец бек І1е 245 250 255
ТПг Ге сіу Бек Нів Тгр І1е сій Рго АвБп Агд ТП бій Ап Меє с1и 260 265 270
Авр Уаі1 І1е Авп Суб біп Нів Бек Меє Бек бек Уа1 Ггец с1у Тгр РБе 275 280 285
Зо А1а АвБп Рго Ії1е Нів с1у Авр б1у Авр Тук Рго біц Рпе Меє Тув ТЕПг 290 295 300 зек бек Уаії І1е Рго бій Рпе бек бі Аїа бій пув бій біц Уаї Агд 305 310 315 320 сбі1у Тпг Аза Авр Рпе Рпе Аза Рпе бек Рпе сіу Рго Авп Авп Робе Агд 325 330 335
Ркго Бек Авп ТПг Уаії Уаї Ппув Меє б1у біп Авп Уаї Бек Гей Авп Гей 340 345 350
Акуд біп Уаії Гец АвБп о Тгр І1е пуб Іец бій Тук Авр Авп Рго Агд І1е 355 3З6о 365
Тем І1їе Бек біц Авп с1у Тер Рбе ТПг Авр бек Туг І1е Гув ТПгЕ с1ц 370 375 380
Авр ТПг ТБг АТїа І1е Тук Меє Месє Гу Авп Рпе Гей Авп сбіп Уа1ї Іец 385 390 395 400 біп Аї1а І1е Ппув Рпе Авр бій Іїе сіп Уаі Рпе сіу Туг ТіПг Аїа Тгр 405 410 415 60
ТПЕ Гей гей Авр сіу Робе біц Тер сбіп Авр Аза Туг ТПг ТПг Агд Агд 420 425 430 с1у Гей Рпе Тук Уаі Авр Робе Авп бек біц біп Пув бій Агуд пув Рго 435 440 445
Ппув бек бек АТа Нів Туг Тук Ппув сбіп Іїе Ії1е сіп Авр АвБп б1іу РБПе 450 455 460
Ркго Гец біп біц бек ТП Рго Авр Меє Гув с1у сбіп Рпе Рго Сув Авр 465 470 475 480
Рпе бек Тер біу Ма1і ТПпг бій бек УМаї ІГеп Ппув Рго бій Рпе ТПг Уаї 485 490 495 зек Бек Рго біп Ропе ТПг Авр Ркго Ні Іецй Тук Уаі Тгр Авп Уа1 ТЕГ 500 505 510 с1у Авп Агуд Гецп Гей Туг Агуд Уаі сбіц с1у Маї Агкд Гей Гув ТПг Агд 515 520 525
Ркго Бек біп Сув ТПг Авр Тук Уаії бек І1е Гпув Ппув Агуд Уаі сій Меє
Зо 530 535 540
Тец А1їа Гпув Меє пув Уа1 ТПкг Нів Ту біп Рпе Аза Гей Авр Тгр ТЕГ 545 550 555 560
З5 зек Іїе Гец Ркго ТПг б1у АвБп Тїец бек Гув І1е АвБп Агуд біп Уа1ї Іец 565 570 575
Акуд Тук Тут Агкд Сув Уаії Уаї бек біц сб1у Гей Ппув Гецш с1у І1їе 5ег 580 585 590
Рго Меє Уаї ТПг Гецп Тук Нів Рго ТПг Нів бек Нів Гей с1у Іецй Рго 595 бо 605
Ме Рго Гей Гей бек бек сіу б1і1у Тер Гей Авп ТПг АвБп о ТБПг А1та Гу 610 615 620
Аза Рпе сбіп Авр Туг Аїа б1у Пец Сув Рпе Гув бій Гей с1у Авр Іецй 625 630 635 640
Уаї пув Гей Тер І1їе ТБПг І1їе Авп бій Рго Авп Агд Тецй бек Авр Меє 645 650 655 60
Тук Авп Акуд ТБг бек АвБп о Авр о ТБПг Туг Агуд Аїа Аза Ні АвБп Геи Меє
6бво 665 670
І1е Аїа Ні Аза біп Уаї Тер Нів Іец Туг Авр Агд сбіп Туг Агд Рго 675 68 685
Ууаї біп Нів сіу Аза Уа1ї бек Гей бек Ггец Нібв бег Авр Тгр Аїа сі1и 690 695 700
Рго Аїа АвБп о Рго Туг Уаії бій бек Ні Тер ув Аза Аїа біц Агд РБПе 705 710 715 720
Тец біп Рпе сій Іїе Аїа Тер Рпе Аза Авр Рго Гей Робе пуб ТПг 01Уу 725 730 735
Авр Тук Рго Іїейш Аї1а Меє пув біц Тук І1їе Аза бек Пув Пув бі1іп Агд 740 745 750 б1у Гей бек бек Бек Уа1і Гей Рго Агуд Рпе ТПг Гей пув біц б5ег Агд 755 760 765
Тец Маї Гпув с1у ТПг Іїе Авр Рпе Туг Аза Гец АвБп Нів Рпе ТПг ТПг 770 775 780
Зо
Акуд Рпе Уаї І1їе Ні пув біп Гец Авп о ТПг Авп Сув Бек Уаі Аїа Авр 785 790 795 800
З5
Акуд Авр о Уаї біп Рбе Іїец біп Авр І1е ТПг Агуд Гей бек бек Рго 5ег 805 810 815
Агд Геї Аїа Уа! ТПг Рго Тер сіу Меє Акуд Гув Гей Гей с1у Тер І1еє 820 825 830
Акуд Агуд Авп о Тут Агуд Авр о Меє Авр чІ1е Тук Уаі ТПг Аза А5Бп с1у Іе 835 840 845
Авр Авр Гец Аза Іїец б1іцшц Авр Авр біп І1е Агуд Гпув Туг Тук Ге сіц 850 855 860
Тпув Тук УМаї сбіп біш Аїа Гей пув Аїа Тук Гей І1е Авр Гув Уа1ї Гув 865 870 875 880
ІТІе пув біу Тук Ту А1ї1а Рпе Гув Іецй ТПпг бій сій Ппув Бек Ппув Рго 885 890 895 (516) Агуд Рпе сіу Рібе Рпе ТПг бек Авр Рпе Пув Аїа Ппув бек бек Уаі1і! сіп 900 905 910
Рпе Тук бек пуб ІТец І1е бек бек бек біу Рпе бек Бек бій Авп Агд 915 920 925 зек Рго Аїа Сув біу біп Рго Рго бій Авр ТПг бі Сув Аза І1е Сув 930 935 940 зек Рпе Іем ТЕПг 945 «2105» 148 «2115» 949 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005» 148
Авр Тут пув Авр Авр Авр Авр о Гув Тец Авр Рпе Рго с1у Авр с1у Аг4д 1 в) 10 15
Зо А1їа Уаї Тер бек біп Авп о Рго Авп о Гей бек Рго Уаі Авп бій бек сіп 20 25 30
Тецп Рпе Гей Туг Авр ТПг Рпе Рго Ппув Авп Рпе Рпе Тер сіу Уаі с1У
З5 35 40 45
ТП сб1у Аїа Рбе біп Уаі біц сіу Бек Тгр пув Пув Авр с1у пув б1У 50 з9 (210)
Тецп бек Уаї Тер Авр Нів Рпе Іїе Аза ТПг Нів Гей Авзп Уаї бек 5ег 65 70 75 80
Акуд Авр осіу бек бек Авр бек Туг Іїе Рпе Гей бій пув Авр Гец б5ег 85 90 95
А1їа Ггеп Авр Рібе Гей сіу Уаі бек Рпе Туг біп Рре бек І1е бек Тгр 100 105 110
Рго Агд Гец Робе Рго Авр сбі1у ТПг Уаі Аї1а Уаі Аза АБп Аїа Ггув Щ1У 115 120 125
Тец біп Тук Туг Авп Агд Гей Гей Авр Бек Гей Гей Гей Агд АБп І1е 130 135 140 60 біц Рко Уаї Уа1ї ТПг Гей Тук Нів Тгр Авр Гей Рго Тгр Аїа Іец сіп 145 150 155 160 січ пув Тук б1у с1у Тер Гув Авп бій ТЕ Гей І1їе Авр Гей Рре Авп 165 170 175
Авр Тут Аїа ТПг Тук Сув Рпе біп Тс Рпе б1у Авр Агуд Уа1і Ппув Туг 180 185 190
Тер Іїе ТПг І1їе Нібв АвБп Рго Туг Гец Уаі Аза Тер Нів с1у Тух У 195 200 205
ТП б1у Гей Нів Аза Рго сбіу сій пув б1у АвБп Уаі Аза Аза Уаї1ї Туг 210 215 220
ТПг Уаі1 сіу Нів Авп Гец Тец пув Аза Нів бек їтув Уаї Тер Нів Авп 225 230 235 240
ТУкг Авп Агуд Авп Рбе Агуд Рго Нів сіп пув с1у Тер Гей бек І1е Тбг 245 250 255
Тец б1у бек Нів Тгр Іїе бій Рго АвБп Агуд Аїа сій бек І1е Уа1їі Авр
Зо 260 265 270
І1е Гец пув Сув біп біп бек Месє Уаії бек Уаі Гей с1у Тер Рбе Аї1а 275 280 285
З5
АвпоРго І1їе Нів сіу Авр б1у Авр Туг Рго біц Маї Меє ТПг Ппув Гув 290 295 300
Тецп Гей бек Уаі Гей Рго Аза Рпе Бек біш Аїа сій Гпув АвБп біц Уаї 305 310 315 320
Агуд б1іу ТБВг Аза Авр Рпе Рпе Аза Рпе бек Робе сбіу Рго Авп Авп Ріе 325 330 335
Тпув Ркго Гей Авп ТПг Меє Аїа пув Меє с1іу біп Авп Уаї бек Гей Авп 340 345 350
Тец Акд біп Уаі Гей Ап Тер Іїе Ппув Гей бій Тук с1у Авп Рго Агд 355 36о0 365
І1е гец І1е Аїа б1іцш АБп о сбі1іу Тгр Роре ТПг Авр бБег Тугк Уаі1і сбіп Тбг 370 375 380 60 біц Авр ТПпг ТпПг Аїа Іїе Тук Меє Меє Гпув Авп Рпе Гец Авп біп Уаї
385 390 395 400
Тец бі1іп Аї1а І1е Агуд гейш Авр сіу Уаі Акуд Уаі1 Рпе сіу Туг ТПг А1а 405 410 415
Тер Бек Гей Гей Авр біу Робе бій Тер біп Авр Аїа Туг АБп ТПг Агд 420 425 430
Акуд с1у Гецп Рбе Туг Уаі Авр Робе АвБп бек бій біп Агд бій Агд Агд 435 440 445
Ркго Ппув бек бек Аза Нів Тук Тук Гуз біп УМаі І1е сС1у бій АвБп 01Уу 450 455 460
Рпе ТпПг Гей Агуд біц Аза ТПг Рго Авр Тей сбіп с1іу біп Робе Рго Сув 465 470 475 480
Авр Рпе бек Тгр біу Ма1і ТПг біц бек Уаї Гей Ппув Рго біц бек Уаї 485 490 495
Аза бек бек Рго біп Рпе бек Авр Рго Нів Іецп Туг Уа1і Тер Ап Аї1а 500 505 510
Зо
ТП б1у Авп Агуд Меє Іїец Ні Агкуд Уаі біц сб1у Уа1 Агкд Гец пув ТЕГ 515 520 525
З5
Акуд Рго Аїа біп Су5 ТПг Авр Рбе І1е ТПг І1ї1е Гпув Ппув біп Гей сіц 530 535 540
Меє теп Аза Акуд Меє Гуз Уа! ТПг Нів Рбе Агуд Рпе Аїа Гей Авр Тгр 545 550 555 560
Аза бек Уаї Ггец Рго ТПг б1у АвБп ІТец бек бій Уаі АвБп Агд сіп Аїа 565 570 575
Тец Агуд Тук Тугк Агуд Сув Уа1 Уа1! ТБг біц с1у ІТецп Гув Гей АБп Пе 580 585 590 зек Рго Меє Уаі! ТПг Іецй Тук Тук Рго ТПг Нів АТа Нів Геи с1Уу Іец 595 бо 605
Рго Аза Рго Іїец Іец Нів бек сіу с1у Тер Гей Авр Рго бБег ТПг А1а 610 615 620 (516) цув Аїа Рпбе Агуд Авр Туг Аїа с1у Гей Сув Рпе Агуд бій Іецй с1у Авр 625 630 635 640
Тецп Маї Гпув Гей Тгр І1їе ТПг Іїе АвБп бій Рго Авп Агд Гец бег Авр 645 650 655
Уаї Тук Авп Агуд ТБПг бек Авп Авр ТПг Туг біп Азїа Аза Нів Авп Гей 6бво 665 670
Тец І1ї1е Аза Нів Аїа Іїе Уа1 Тер Нів Гей Туг Авр Агд біп Туг Агд 675 68 685
Рго Бек біп Агуд сб1у Аза Гей бек Гей бек Гей Нів бек Авр Тгр А1а 690 695 700 бі Ркго Аза Авп Рго Туг Уаі1і Аза бек Нів Тер сіп Аїа Аза сій Агд 705 710 715 720
Рпе Ггец біп Рпбе бі1іцшц І1ї1е Аза Тгр Рпбе Азї1а бій Рго Гей Рпе Ппув ТЕПг 725 730 735 б1у Авр Тук Рго Уаі Аїа Меє Агуд сій Туг Іїе Аза бек Пув ТПг Агд 740 745 750
Зо
Акуд с1у Гец бек бек бек Уаії Гец Рго Агуд Рпе бБег Авр Аїа бій Аг4д 755 760 765
Агд Гечп Уаї їув б1у Аїа Аїа Авр Рпе Туг Аза Гей Авп Нів Рібе ТіПг 770 775 780
ТПг Агуд Рбе Уа1! Месє Ні біц сбіп сбіп Авп біу бек Агуд Туг Авр 5ег 785 790 795 800
Авр Агуд Авр о Уаі! біп Рпе Гей біп Авр І1е ТПг Агуд Гей Аза бек Рго 805 810 815 зек Агд Гец Аїа Уаії Меє Рго Тгр б1у б1іп с1у Ппув Гей Гей Агд Тгр 820 825 830
Меє Агуд Авп Авп о Тук с1у Авр Гей Авр Уа! Туг І1е ТПг Аз1а АБп щу 835 840 845
І1їе Авр Авр біп Аїа Гей сіп Авп Авр біп тей Агуд біп Туг Тук Іецй 850 855 860 бі Гпув Тук Уаі сбіп біш Аїа Гей Ппув Аїа Туг Гей І1ї1е Авр Тув5 І1е (516) 865 870 875 880
Туз І1е Ппув с1іу Тук Тук АТїа Рпе Ппув Гей ТПг сіц біц Гуз бек Гув 885 890 895
Рго Агкуд РіПе сіу Рпе Рпе ТПг о бБег Авр Рпе ув Аїа Кпув Бек бек І1е 900 905 910 сіп Рбе Тукг Авп о Ппув Гей І1е ТПг бек АБп о б1іу Рпе Рго бек бій Авп 915 920 925 сбі1у б1у Рго Агуд Сув Авп біп ТПпг о біп б1у Авп Рго біц Сув ТПг Уаї 930 935 940
Сув Гей Ге Гец Гей 945 «2105» 149 «2115 950 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний
Зо поліпептид" «4005 149
Авр Тут пув Авр Авр Авр Авр о Гув Іец б1цп Рпе бек с1у Авр с1у Аг4д 1 5 10 15
З5
А1їа Уа1 Тер бек їув Авп о Рго Авп Робе ТПг Рго Уаі Ап бій бек сіп 20 25 30 40
Тецп Рпе Гей Туг Авр ТПг Рпе Рго Ппув Авп Рпе Рпе Тер сіу Уаі с1У 45 ТПЕ б1у Аїа Гей сбіп Уаі сій сіу бек Тер Гув Ппув Авр с1у Пув 01У бо
Ркго Бек І1е Тгр Авр Ні Рпе Уаі! Ні ТП Нів Гей пув Авп Уа1 5ег 50 65 70 75 80 век ТПг Авп обіу бек бек Авр бек Туг І1е Рпе Гей бій Гпув Авр Гей 85 90 95 55 зек Аїа Гец Авр Рпе І1е сіу Уаії бек Рпе Туг сбіп Рпе бБег Ії1їе 5ег 100 105 110 60
ТЕр Рго Акд Гей Рібе Рго АвБр сіу І1ї1е Уаі! ТПг Уаії Аз1а АБп Аїа Гув
115 120 125 сб1у Гей біп Туг Тук Авп ТПг Гей Гей Авр бек Гей Уаї Гей Агд Авп 130 135 140
І1е бій Ркго І1е Уаї ТПпг Гей Тук Ні Тер Авр Гей Рго Гей Аїа ГІец 145 150 155 160 біп бі ув Тук б1у сб1у Тер пув Авп Авр ТПг Іїе І1е АБр І1е РіПе 165 170 175
Авп о Авр оТугт Аза ТПг Тук Сув Робе біп Тс Рре б1у Авр Агуд Уа1ї Гув 180 185 190
ТУкє Тер Іїе ТБг І1їе Ніб Авп Рго Тук Гей Уаї Аїа Тер Нів С1у Туг 195 200 205 сбі1у Тпг сіу Меє Нів Аїа Рго сіу бій Ппув с1у Авп Гец Аза А1їа Уаї 210 215 220
Тук ТпПкг Уа1ї сіу Нібв Авп Тец Іїе пуб Аза Нів бек Гув Уа1і Тер Нів 225 230 235 240
Зо
АвпоТук Авп о ТПг Ні Рре Агуд Рго Ні біп Гув с1у Тер Гей бек І1е 245 250 255
З5
ТПгЕ Ге сіу Бек Нів Тгр І1е сій Рго Авп Агд бек бій Авп ТПг Меє 260 265 270
Авр чІ1е Гей їув Сув біп біп бек Меєсє Уа1! бек Уаі Ге с1у Тгр РіПе 275 280 285
Аза бек Рго І1е Ні б1у Авр б1і1у Авр Тук Рго сіц сіу Меє Гув Гув 290 295 300
Тпув ТГецп Гей бек Іїе Гей Рго Гей Рпе Бек біц Аїа сій пув АБп бій 305 310 315 320
Ууаї Акуд с1у ТПг АТа Авр Рібе Рпе Аза Рпе бек Рпе с1у Рго Авп Авп 325 330 335
Рпе пуб Рго Тец Авп о ТПг Меє Аза Гуз Меє с1у сбіп Авп Уаі1ї! бек ГІец 340 345 350 (516) Авп о Геї Акуд бій Аза Гей Ап Тгр І1е Гуз Гецп сій Туг АвБп АБп Рго 355 3З6о 365
Агуд Ії1е гец І1ї1е Аїа біцшц АБп обіу Тер Робе ТПг Авр бек Нів Уа1ї! Гув 370 375 380
ТПгЕ бій Авр ТБг ТБг АТїа І1е Тук Меє Месє Гув Авп Рре Іец бек сіп 385 390 395 400
Уаї гей біп Аїа Іїе Агд Гец Авр бій Іїе Акд Уаі Рпе с1у Тук ТПг 405 410 415
А1їа Тер бек Іецй Гей Авр сіу Рпе сій Ткгр б1іп АвБр Аїа Туг Тібг І1е 420 425 430
Акуд Агуд с1у Гецп Робе Тук УМаії Авр Робе АвБп бек Гпув біп гув бій Агд 435 440 445
Тпув Ркго Ппув Бек Бек Аїа Нів Туг Туг Ппув біп І1е І1е Агд б1іц АвБп 450 455 460 б1у Рпе бек Гей Ппув біц Аїа ТПг Рго Авр Уаі1і сіп с1іу біп Робе Рго 465 470 475 480
Зо
Сув Авр Рпе бБег Тгр сіу Уа1 ТПпг сі Бек Уа1 Гей пув Рго біц 5ег 485 490 495
Уа1ї1 А1їа Бек бек Рго біп Рбе бек Авр Рго Туг Іей Туг Уаї Тер Авп 500 505 510
А1їа ТПг с1у Авп Агд Тец ІТец Ні Акуд Уаі біц б1у Уаї Агд Гей Гув 515 520 525
ТПгЕ Агуд Рго Аза сіп Сув ТПг Авр Рбе Уаї АвБп І1е Гу Гув біп Іецй 530 535 540 бі Меє гей Аза Агуд Меє пув Уа1ї ТПг Нів Туг Агкуд Робе Аїа Іецй Авр 545 550 555 560
Тер Аїа бек Уаі1і Ггец Рго ТПг сіу Авп Гец бег Аїа Уаі АБп Агд сіп 565 570 575
А1їа Ггечп Акуд Туг Туг Агуд Сув Уаії Уаі бек біц с1у Гецп Ппув Те с1Уу 580 585 590
І1е бек Аїа Меєсє Уаї ТПпг Гей Тук Тук Рго ТПг Нів Аза Нів Ггешй Щ1У 60 595 бо 605
Тецп Ркго бій Рго Гей гейш Нів Аза сіу с1у Тер Гей Авп Рго бек ТЕГ 610 615 620
Ууаї б1іш Аза Рпе сіп Аза Туг Аїа сіу Гей Сув Робе біп б1цп їейп ШУ 625 630 635 640
Авр Геч Уаї Туз Гей Тгр І1їе ТПг Іїе Авп бій Рго АвБп Агуд Іецй 5ег 645 650 655
Авр І1е Туг АвБп Агд бек б1у АБп Авр ТПг Ту с1у Аза Аїа Нів Авп бо бе5 670
Тец Іїецп Уаї Аза Нів Аїа гей Аза Тгр Агд Гей Туг Авр Агд біп РБе 675 68 685
Акуд Рго бек біп Агкгуд б1у А1ї1а Уаї бек Іецйц бек Гей Нів Аїа Авр Тгр 690 695 700
Аза бій Рго Аза АБп о Рго Туг Аза Авр бек Нів Тгр Агуд Аїа Аїа сіц 705 710 715 720
Зо Агуд Рпе Гей біп Рпе сбіц Іїе Аїа Тер Рбе Аїа бій Рго Геп Робе Був 725 730 735
ТпПг б1у Авр Туг Рго Аї1а Аїа Меє Агд сіц Туг І1е А1їа бек Пув Нів
З5 740 745 750
Агкуд Агуд с1іу Пец бек бек бек Аза Тец Рго Агд Теп ТПг сбіц Аїа с1іц 755 760 765
Акуд Агуд Гей Гец Гуз б1у ТПпг Уаі Авр Рпе Сув Аїа Гей Авп Нів Ре 770 775 780
ТПг Тпг Агуд Рбе Уаї Меєсє Ні сій сіп Гец Аїа сіу Бек Агуд Тукг Авр 785 790 795 800 век Авр Акуд Авр І1е біп Рпе Гей сіп Авр І1е ТПг Агуд Гей бек 5ег 805 810 815
Рго ТПг Агд Тїец Аїа Уаї І1їе Рго Тер сіу Уаі1 Акд ПУув Гей Іец Агд 820 825 830
Тер Уаі1і Агуд Агуд Авп о Туг б1і1у Авр Меє Авр І1е Туг І1е ТПпг Аза 5ег 835 840 845 60 сб1у І1е Авр АвБр сбіп Аїа Гей бій Авр Авр Агд Тецй Агуд Гув Тукг Туг 850 855 860
Тем бій пув Тук Гей біп сбіц Уа1! Гей Ппув Аїа Туг ІТей І1е Авр Гув 865 870 875 880
Уаї Агкд Іїе пув сіу Тук Тукг Аїа Роре Гу5 ІТеп Аза бі бій Ппув бБег 885 890 895
Тпув Рго Акуд Рпе сіу Рпе Рпе ТПг о бБег Авр Рпе пув Аїа пуб бек вег 900 905 910
ІІе сбіп Робе Туг Авп о Гув Меє Іїе бек бек бек с1у Рпе Рго бек сіц 915 920 925
АвпобБек бек бБег Агд Сув бек біп ТПг біп Гув АБп о ТПг бій Сув ТПг 930 935 940
Уаї Сув Гей Рре Гечц Аїа 945 950 «2105 150
Зо «2115 950 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" «4005 150
Авр о Тук пув Авр Авр Авр Авр пуб Гей бій Роре бек с1у Авр с01у Агд 1 5 10 15
А1їа Уа1 Тер бек їув Авп о Рго Авп Робе ТПг Рго Уаі Ап бій бек сіп 20 25 30
Тец Рпе Гей Туг Авр ТПг Рібпе Рго пуб Авп Рпе Рпе Тгр с1у Уа1 Щ1У 35 40 45
ТП сб1у Аїа Гец біп Уаі біц сіу бек Ткгр ув Гув Авр б1у гув Щ1У 50 55 бо
Ркго Бек І1е Тгр Авр Ні Рпе Уаії Нів ТПг Нів Гей пуб Авп Уаії! 5ег 65 70 75 80 (516) зек ТПг Авп біу бек Бек Авр бек Туг І1їе Робе Геш сій Гпув Авр Іецй 85 90 95 зек Аїа Гец Авр Ропе І1е сі1іу Уа1і Бек Рпе Туг сіп Рібе бег І1е 5ег 100 105 110
ТЕр Рго Акд Гей Рібе Рго АвБр сіу І1ї1е Уаі! ТПг Уаії Аз1а АБп Аїа Гув 115 120 125 сб1у Гей біп Туг Туг Авп Аза Гей Гей Авр бек Гей Уаї Гей Агд Авп 130 135 140
І1їе бій Рко І1ї1е Уаії ТПКг Гей Тук Нів Тгр Авр Гей Рго Гецп Аїа Іецй 145 150 155 160 біп бі ув Тук б1у б1у Тер Пув Авп Авр ТПг Іїе І1е АБр І1е РіПе 165 170 175
Авп о Авр оТугт Аза ТПг Тук Сув Робе біп Тс Рре б1у Авр Агуд Уа1ї Гув 180 185 190
Тук Тер Іїе ТПг І1їе Нібв АвБп Рго Туг Гец Уаі Аза Тер Нів с1у Туг 195 200 205
Зо сбі1у Тпг сіу Меє Нів Аїа Рго сіу бій Ппув с1у Авп Гец Аза А1їа Уаї 210 215 220
Тук Тпкг Уаї с1у Нів АвБп Гецп І1е Гпув Аїа Нів бек пуб Уаї Тер Нів 225 230 235 240
АвпоТук Авп о ТПг Ні Рре Агуд Рго Ні біп Гув с1у Тер Гей бек І1е 245 250 255
ТПгЕ Ге сіу Бек Нів Тер І1е сій Рго Авп Агд бек бій АБп ТП Меє 260 265 270
Авр І1е Ггец пув Сув біп біп бек Меє Уаї бек Уаі Ігеш с1у Ткгр Ріе 275 280 285
Аза Авп о Рго Ії1е Ні б1у Авр б1і1у Авр Тук Ркго бій сі1у Меє Ппув Гув 290 295 300 пув Гей Гецй бек І1їе Гей Рго Гей Робе бек біц Аїа бій Гув АБп бі1ц 305 310 315 320
Ууаї Акуд с1у ТПг АТа Авр Рібе Рпе Аза Ріе бек Робе б1у Рго АвБп Авп 60 325 330 335
Рпе пуб Рго Тец Авп о ТПг Меє Аза Гуз Меє с1у сбіп Авп Уаі1ї! бек ГІец 340 345 350
Ап о тей Агуд біц Аза Тец АБп о Тгр І1е Гув5 Те сій Туг Авп Авп Рго 355 3З6о 365 сіп І1е еп Іїе Аїа сій АвБп о біу Ткгр Рпе ТПг Авр бек Нів Уаї Гув 370 375 380
ТПгЕ бій Авр ТБг ТБг АТа І1е Тук Меє Мес Гув Авп Рре Іец бек сіп 385 390 395 400
Уаї гей біп Аїа Іїе Агд Гец Авр бій Іїе Акд Уаі Рпе с1у Тук ТПг 405 410 415
Аза Тер бек Ггец Іец Авр б1у Рпбе біцш Тер біп Авр Аїа Туг ТПг ІПе 420 425 430
Акуд Акуд с1у Гецп Робе Тук УМаії Авр Робе Авп бек Гув біп гув бій Агд 435 440 445
Зо Пув Рго Ппув бек бек Аїа Нів Туг Туг Ппув біп І1їе І1е Агуд бій Авп 450 455 460 б1у Рпе бек Гей Ппув біц Аїа ТПг Рго Авр Уаі сіп сіу біп Рпе Рго 465 470 475 480
Сув Авр Рпе бБег Тгр сіу Уа1 ТПпг сі Бек Уа1 Гей пув Рго біц 5ег 485 490 495
Уаї Аїа Бек Бек Рго сіп Рібе Бек Авр Рго Тукг Гей Туг Уаі1 Тер Авп 500 505 510
А1їа ТПг с1у Авп Агд Тец ІТец Ні Акуд Уаі біц б1у Уаї Агд Гей Гув 515 520 525
ТПЕ Агд Рго Аїа сбіп Суб ТПг Авр Рпе Уаї АвБп І1їе Пув Пув сіп Гей 530 535 540 бі Меє гей Аза Агуд Меє пув Уа1ї ТПг Нів Туг Агкуд Робе Аїа Іецй Авр 545 550 555 560
Тер Аїа бек Уаї Гец Рго ТПг сіу Авп Гей бБег Аїа Уаі1і АвБп Агд сіп 565 570 575 60
Аза тей Агуд Туг Туг Акуд Сув Уаї Уаії бек біп с1у Гей Гпув Гей Щ1У 580 585 590
І1їе бек Аїа Меєс Уа! ТПг Гей Тук Туг Рго ТПг Нів Аїа Нів Те 1У 595 бо 605
Тецп Ркго бій Рго Гей гейш Нів Аза сіу с1у Тер Гей Авп Рго бек ТЕГ 610 615 620
Ууаї б1іш Аза Рпе сіп Аза Туг Аза с1у Гей Сув Рре біп б1цп їейп ШУ 625 630 635 640
Авр Гей Уаї пуб Іец Тгр І1е ТБПг І1е АБп бій Рго Ап Агд Гей б5ег 645 650 655
Авр І1е Туг АвБп Агд бек б1у АБп Авр ТПг Ту с1у Аза Аїа Нів Авп 6бво 665 670
Тем Гей Уаі Аза Нів Аїа тей Аїа Тгр Агд Гей Туг Авр Агуд сіп РіГе 675 68 685
Акуд Рго бек біп Агкгуд б1у А1ї1а Уаї бек Іецйц бек Гей Нів Аїа Авр Тгр
Зо 690 695 700
Аза бій Рго Аза АБп о Рго Туг Аза Авр бек Нів Тгр Агуд Аїа Аїа сіц 705 710 715 720
З5
Акуд Рпе Гей біп Рпбе біцш І1е Аїа Тгр Рпбе Азїа бій Рго Гей РПе Гув 725 730 735
ТпПг б1у Авр Туг Рго Аї1а Аїа Меє Агд сіц Туг І1е А1їа бек Пув Нів 740 745 750
Агуд Агуд с1у Тей бек бек бек Аза Гей Рго Агуд Гей ТПг сій Аїа с1ци 755 760 765
Акуд Агуд Гей Гец Гуз б1у ТПпг Уаі Авр Рпе Сув Аїа Гей Авп Нів Ре 770 775 780
ТПг Тпг Агуд Рбе Уаї Меєсє Ні сій сіп Гец Аза б1у бек Агд Туг Авр 785 790 795 800 век Авр Агд АвБр І1е біп Рпе Іїец біп Авр І1е ТПг Агуд Гей бек 5ег 805 810 815 60
Рго ТПг Агд Тїец Азїа Уаї І1їе Рго Тгр бі1у Уаії Агд Ппув Гей Гей Агд
820 825 830
Тер Уаі1і Агуд Агуд Авп о Туг б1і1у Авр Меє Авр І1е Туг І1е ТПпг Аза 5ег 835 840 845 сб1у І1е АвБр Авр сбіп Аїа Гей сій Авр Авр Агд Гей Агуд пуб Тукг Туг 850 855 860
Тец б1п пув Тук Гей біп сій Уаії гейш пув Аза Тукг Гец І1е Авр Гу 865 870 875 880
Уаї Агкд Іїе пув сіу Тук Тукг Аїа Рбе пуб Гец Аїа біцш бій Гпув бБег 885 890 895
Пув Рго Агкуд Рпе с1іу РібПе Рібе ТПг бек Авр Рпе Ппув Аїа Пув бек 5ег 900 905 910
ІІе сбіп Робе Туг Авп о Гув Меє І1е бек бек бек с1у Рпе Рго бек сіц 915 920 925
АвпобБек бек бБег Агд Сув бек біп ТПг біп Гув АБп о ТПг бій Сув ТПг 930 935 940
Зо
Уаї Сув Геи Рпе Іец Уаї 945 950
З5 «2105 151 «2115» 989 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність 40 «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний поліпептид" 45 «4005 151 бі Ркго сб1у Авр б1у Аїа сбіп ТПг Тгр Аїа Агуд Робе бег Агд Рго Рго 1 5 10 15 50
Аза Рго сбіц Аза Аза сб1у Гей Робе біп б1у ТПг Рпе Рго Авр с1іу Ріе 20 25 30 55 Тем Тер Аї1а Уаї сіу бек Аїа Аїа Туг сбіп ТПг сій с1іу с1у Тгр сіп біп Нів с1у Ппув с1у Аїа бек Іїе Тгр Авр ТПг Ропе ТіПг Нів Нів Рго 60 50 з9 бо
Тец Азїа Рго Рго с1у Авр Бек Агуд АвБп Аїа бек Гей Рго Гец С1у А1а 65 70 75 80
Ркго Бек Рго Гец біп Рго Аїа ТПг б1у Авр Уаі Аїа Бек Авр Бек Туг 85 90 95
Авп оАвп о Уаі Рбе Агуд Авр ТПг о біц Аза Гей Агуд сбіц Гецп с1у Уа1ї ТЕГ 100 105 110
Нів Туг Акуд Ріпе бекг І1е бег Тгр Аїа Агкд Уаії Іецй Рго АБп с1у 5бег 115 120 125
Аза сі1у Маії Рго АвБп Акд бій біу Іец Агуд Туг Туг Агуд Агд Гей Іецй 130 135 140 бі Акд Те Агуд бій Гей сіу Уаі сбіп Рго Уа1 Уаї ТБПг Іец Тукг Нів 145 150 155 160
ТЕр Авр Гей Рго сбіп Агд Тец сіп Авр Аїа Туг біу б1у Тгр Аїа Авп 165 170 175
Зо Агуд Аїа Гей Аза Авр Нів Рпе Агуд Авр Туг Аїа сі Гей Сув Рібе Агд 180 185 190
Нів Рпе сіу сіу сбіп Уаї пуб Тукг Тер І1е ТБПг І1е АвБр АБп Рго Туг
З5 195 200 205
Уаї Уаії Аза Тер Нів сіу Туг Аїа ТПкг с1іу Агд їец Аїа Рго с1у І1е 210 215 220
Акуд с1іу бек Рго Агд Іїец бі1іу Туг Іец Маі Азїа Нів Авп Гей Гей Іей 225 230 235 240
А1їа Нів Аїа пуб Уа1ії Ткгр Ні Гпец Туг Авп о ТПг бек Робе Агд Рго ТЕГ 245 250 255 сіп бі1у б1у біп Уаії бек Іїе Аїа Гей бек бек Нів Тгр І1е АБп Рго 260 265 270
Акуд Агуд Меєсє ТБг Авр оНів бек І1е їув бій Сув біп Мпув бек Іецй Авр 275 280 285
Рпе Уаії Гец сі1у Тер Рпе Аза Губ5 Рго Уаі Рпе І1їе Авр с01у Авр Туг 290 295 300 60
Ркго біц бек Меєсє Гув АвБп Авп Гей бБег бек Іїе Гей Рго Авр Рое ТЕГ 305 310 315 320 бій бек біцш Ппув Ппув Рбе І1е Пув біу ТПг Аза Авр Рібе Рібе Аїа Гей 325 330 335
Сув Рпе бі1у Рго ТПг Гей бек Рпе біп Гец Тец Авр Ркго Нів Меє Гув 340 345 350
Рпе Агд біп Тїец бій бек Рго АвБп Тец Агуд біп Гей Гей бБег Тер І1е 355 3З6о 365
Авр Гей біц Рбе АвБп о Нів Рго Сбіп І1е Рпе І1е Уаі бій Авп с1у Тгр 370 375 380
Рпе Уаї бек біу ТП ТПпг Гув Агд Авр Авр Аїа пув Тук Меє Тук Туг 385 390 395 400 ем пув Ппув Рпе Іїе Меє сій ТбПг Тей Ггуз Аза І1їе Пув Тей АБр 01У 405 410 415
Уаї Авр Уаії Іїе сіу Туг ТБг Аза Тер бек Гец Месє Авр б1у Рпе сіци
Зо 420 425 430
ТЕр Нів Акуд сіу Туг бБег І1е Агуд Акуд біу Іїецш Рпе Тук Уаії Авр РіПе 435 440 445
З5
Тецп бек біп Авр Ппув Меє Гей Гей Рго Ппув бек бек Аїа Гец Рое Туг 450 455 460 біп гув Гей Іїе бій Ппув Авп о сіу Рпе Рго Рго Гей Рго біц АБп біп 465 470 475 480
Рго Гей бій біу ТПЕ Рпе Рго Сув Авр Рбе Аїа Тгр сіу Уа1і Уа1 Авр 485 490 495
АвпоТук І1їе біп Уаії Авр ТПг ТБг Іец бек біп Рпе ТПг Авр Гей Авп 500 505 510
Уаї Тук гей Тер Авр Уаї Нів Нів бек пуб Агд ІТец І1е Гув Уаі1ї Авр 515 520 525 сбі1у Маї Уаї ТПпг пув Ппув Акуд Ппув Бек Тук Сув Уа1і Авр Рібе Аїа А1а 530 535 540 60
І1їе сбіп Ркго біп І1е Аза Гей Гей сіп біц Мес Нів Уаї ТПг Нів Рре
545 550 555 560
Акуд Рпе бек Гец Авр Тгр Аї1а Гец І1е Іїецй Рго Гей с1у Ап біп б5ег 565 570 575 біп Маії АвБп Нів ТПг Ії1е Гей сіп Туг Туг Агуд Сув Меєсє Аза бек бій 580 585 590
Тец Маії Акуд Уаі Авп І1їе ТПг Рго Уаі Уаі Аїа Гей Тгр біп Рго Меє 595 бо 605
Аза Рго Авп о біп біу Тецй Рго Агд Іец Іецп Аї1а Агуд сбіп с1у Аїа Тгр 610 615 620 січ Авп о Рго Тук ТПг Аїа Тей Аїа Рпбе Аза сій Туг Аза Агуд Гей Сув 625 630 635 640
Рпе сіп біц Тец бі1у Нів Нів Уаї пуб ІТецйп Тгр І1е ТПг Меє Ап с1іц 645 650 655
Ркго Тук ТПг Агуд АБп оМеє ТПг Туг бек Аї1а сіу Нів Авп Гей Гей Гув 6бво 665 670
Зо
Аза Нів Аїа Гец Аза Ткгр Нів Уаї Туг АвБп бій Гпув Рпе Агуд Нів Аїа 675 68 685
З5 біп АвБп о біу Ппув Іїе Бек Іїе Аза гейш сбіп Аза Ар Тгр І1е бій Рго 690 695 700
А1їа Сув Ркго Рібе бек біп Пув Авр Пув біц УМаі Аї1а бій Акуд Уаї Гей 705 710 715 720 бі Рпе АвБр І1е с1у Тер гейш Аза бій Рго Іїе Робе сіу бек б1у Авр 725 730 735
Тук Рго Тер Уаї Мес Агд Авр Тгр Гец АвБп о біп Агуд Авп Ап Робе Іей 740 745 750
Тецп Ркго Тук Рпе ТПг бій Авр сій пув Ппув Гей І1їе сіп с1у ТПг РБе 755 760 765
Авр Рпе Ггец Аза Іец бек Нів Туг ТПг ТПг Іїе Гей Уа1і Авр бек біц 770 775 780 (516) ув бій Авр Рго І1їе Пув Туг Авп Авр Тук Геп сі Уа1і! сб1п сі Меє 785 790 795 800
ТПЕ Авр Іїе ТПг Тер Гец Авп о бБекг Рго бек біп Уаі Аїа Уа1 Уа1і1 Рго 805 810 815
Тер б1у гей Агуд пуб Уаї Іец Авп Тгр Гец Гуз Рпе Гув Тук С1Уу Авр 820 825 830
Тецп Ркго Меє Туг Іїе Іїе Бек Авп сіу І1е АвБр Авр б1у Іецп Нів Аїа 835 840 845 січ Авр Авр біп Гей Акуд Маї Тук Тук Месє біп Авп Туг І1е АБп б1ц 850 855 860
А1їа гей пув Аза Ні І1е Гей Авр с1іу І1е АвБп Гей Сув с1у Тук Ре 865 870 875 880
А1їа Тук бек Рбе АвБп Авр Агуд ТПг Аза Рго Агуд Рпе с1у Гей Туг Аг4д 885 890 895
Тугк Аїа Аза Авр сбіп Робе біц Ркго Ппув Аїа бек Меє Гув Нів Туг Аг4д 900 905 910
Зо
Тпув І1е І1е Авр Бек Ап сіу Рпе Рго сбіу Рго бій ТБбг Гец біц Агд 915 920 925
Рпе Сув Ркго бій біцп Рпе ТпПг Уаї Сув ТПг бі Сув Бек Рібе РіПе Нів 930 935 940
ТПгЕ Агуд пуб бек Гей Гец Аза Рпе І1їе Аза Рбе Іецш Рпе Рпе Аза 5ег 945 950 955 960
І1е Іїе бек Іец бек ІТецп І1їе Робе Тук Тук бек Ппув Ппув с1у Агд Агд 965 970 975 зек Тук Мпув ІТец б1цп Авр Тук їув Авр Авр Авр Авр Гув 980 9385 «2105 152 «2115 5 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" 60 «4005 152 зек ТПг Тукг І1е 5ег 1 5 «2105 153 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 153 бі І1е Авр Рго Туг Авр сіу Аза ТПг Авр Туг Аїа Авр бек Уа1ї! Гув 1 5 10 15 оеЩ1уУ «2105 154 «211» 14 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220»
Зо «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 154 сі Нів Рре Авр Аїа Ткр Маї Нів Туг Тук Уаї Меє Авр Туг 1 5 10 «2105 155 «2115» 455 «212» РЕТ «213» Ношо зарієепь «4005 155
Рпе Рго Сув Авр Рре бек Тер сіу Уаі ТіПг бій бек Уаї Гей Гув Рго 1 5 10 15 біц бек Уаії Аїа Бек Бек Рго сбіп Рпе бек Авр Рго Нів Гец Тук Уаї 20 25 30
ТЕр Авп Аза ТПг с1у Авп Агд Гей Гей Ні Агд Уаі біц с1у Уаі1і Аг4д 35 40 45 теп Гув ТПг Агуд Рго Аїа сіп Сув ТПг Авр Рпе Уа1ї Авп І1е Ппув Гув 50 55 бо 60 біп Гей бій Меє геш Аїа Акуд Меє пув Уа1і ТПг Нів Туг Агд Робе А1а
65 70 75 80
Тец Авр Тгр Аза бек Уа1і Гей Рго ТПг с1у Авп ІТец бек А1ї1а Уаіїі Авп 85 90 95
Акуд біп Аза Гец Агуд Туг Тук Агуд Сув Уаі Уаі бек бій с1Уу Гей Гув 100 105 110
Тец б1у І1їе Бек Аїа Меє Уа1 ТПпПг Ггец Туг Туг Рго ТПг Нів Аза Нів 115 120 125
Тец б1у Гей Рго біш Рго Гей Гей Нів Аза Ар сіу Тер Гей АвБп Рго 130 135 140 зек ТПг Аїа біц Аза Рпе сіп Аїа Туг Аї1а с1іу Гей Сув Роре сіп сі1ц 145 150 155 160
Тец б1у Авр Гей Уаї Ппув Гей Тгр І1е ТПг Іїе АвБп бій Рго АБп Агд 165 170 175
Тецп бек Авр І1їе Туг Авп Агуд бек с1іу АвБп Авр ТПг Туєк б1у Аза Аїа 180 185 190
Зо
Нів Авп Гей Гей Уаії Аза Ніб5 Аза Гей Аза Тгр Агд Іецй Туг Авр Аг4д 195 200 205
З5 біп Рпе Агуд Рго Бек біп Акуд сіу Аїа Уаі1 Бек Гей бек Гей Ні А1а 210 215 220
Авр Тгр Аїа бій Рго Аза АвБп Рго Туг Аза Авр бек Нів Тер Агуд А1а 225 230 235 240
Аза сій Агуд Рбе Іец біп Рпе сіц І1е Аза Тгр Рпе Аза бій Рго Іец 245 250 255
Рпе пув ТПг б1у Авр Туг Рго Аї1а Аїа Меє Агд сій Туг Іїе Аїа 5ег 260 265 270 пув Нів Агуд Агуд с1іу Гей бек бек Бек Аїа Гей Рго Агд Гей ТПг бій 275 280 285
Аза сій Агуд Агд Тец Тец Гуз біу Тс Уаії Авр Рпе Сув Аїа Гей Авп 290 295 300 (516) Нів Ррпе ТпПг ТПг Агуд Рбе УМаії Мес Ні сій сбіп їей Аїа с1іу бек Аг4д 305 310 315 320
Тук Авр Бек Авр Агуд Авр І1е сіп Робе Гец біп Авр І1е ТПг Агд ГІецй 325 330 335 зек Бек Рго ТПг Агд ІТеп Аза Уаії І1е Рго Тгр сіу Уаі Агд Ппув Іец 340 345 350
Тец Агуд Тер Уаі Агуд Агуд Авп о Тує с1у Авр Меє Ар І1е Туг І1е ТЕПг 355 360 365
А1ї1а бек с01у І1їе АвБр АБр біп Аза Гей сій Авр Авр Агд Гей Аг Тув 370 375 380
Тук Тук Гей сіу Ппув Тук ІТец сіп сіц Уаї Іїец Гуз Аза Тук Гей Ше 385 390 395 400
Авр пув УМаії Акд І1е Гуз б1у Тук Туг Аї1а Рпе ув Гей Аїа сій сіц 405 410 415
Тпув бек пув Рго Агуд Рпе сіу Рпе Рпе ТПг бек Авр Рбе Гув А1їа Гу 420 425 430
Зо зек Бек І1е біп Рпе Тук Авп Гув Уаі І1е бек Бек Агуд с1у Ропе Рго 435 440 445
Рпе сій Авп бек бек бек Аг4д 450 455 «2105 156 «2115» 36 «2125» ДНК «213» Мив5 вр. «4005 156
ЧдЕсассдудсс ЕСсССсссоодада сододдааадса агасдд 36 «2105 157 «2115 52 «2125 РЕТ «213» Ношо зарієепь «4005 157
Меє пув Рго сіу Сув Аїа Аза сіу бек Рго біу АБп бій Тгр ІШ1е РПе 1 в) 10 15
Рпе бек ТПг Авр біцш І1е ТПг Тс Агуд Туг Агуд Авп о ТПг Меє бек Авп 20 25 30 60 сбі1у б1у Гей сіп Агуд Бек Уаі1і Іїе Гей Бек Аїа Гей І1ї1е Гей Іецй Агд 35 40 45
А1а Уаі ТБкгЕ о1Уу 50 «2105 158 «2115» 938 «212» РЕТ «213» Мив5 вр. «4005 158
Рпе бек с1у Авр сб1у пув Аїа І1їе Тер Авр Гуз Ппув біп Тугк Уа1ї! 5ег 1 5 10 15
Ркго Маії Авп Ркго бек біп Гей Рбе ІТецй Тук Авр ТПг Рпе Рго Пув Авп 20 25 30
Рпе бек Тер сіу УМаї б1у ТпПг сб1у А1ї1а Рпе сбіп Уаі бі с1у Бек Тгр 35 40 45
Тпув ТПпгЕ Авр о с1у Агуд б1іу Рго Бек Іїе Тгр Авр Агкуд Тук Уаї Тукг в5ег 50 55 бо
Зо
Нів гей Акуд сіу УМаі Авп б1іу ТБг Авр Агуд бБег ТПг Авр бег Ту Ше 65 70 75 80
Рпе Гей бій Гпув Авр Гей Гей Аїа Гей Авр Рпе Гей сіу Уа1і бек РіПе 85 90 95
Тук біп Рпе бек І1ї1е бек Тер Рго Агд Гец Робе Рго АвБп сіу ТПг Уаї 100 105 110
Аза Аза Уаії АвБп Аїа біп сб1у Гец Агуд Туг Туг Агуд Аїа Гей Гей Авр 115 120 125 зек Гец Уаї Іїец Агд АБп І1е біц Рго І1е Уаї ТПг Гей Тук Нів Тгр 130 135 140
Авр Гей Рго Гец ТПг Іец бі1іп біц біцш Тук б1у с1у Тер пув Авп Аї1а 145 150 155 160
ТПЕ Меє Іїе Авр Гей Рпе АвБп Авр Туг Аїа ТПг Тук Сув Рпе сбіп Тбг 165 170 175
Рпе с1у Авр Агкд Уаії пуб Туг Тгр І1е ТПг І1е Нів Авп Рго Тукг Іец 60 180 185 190
Ууаї Аза Тер Нів сіу Рпе сіу ТПг сіу Меє Ні Аза Рго сіу б1іц Гув 195 200 205 б1у АвБп Гей ТПг Аїа Уа1 Тук ТПг Уаі с1у Нів Авп Гец І1е ГТу5 А1а 210 215 220
Нів Бек Ппув Уа1! Тер Нібв Авп Тук Авр Гув АвБп Рпе Агд Рго Нів сіп 225 230 235 240
Тпув б1у Тер Гей Бек Іїе ТПг Гей сіу Бек Нів Тер І1е біц Рго АвБп 245 250 255
Акуд ТВЕ Авр о Авп Месє б1іцш Авр Уаії І1е АвБп Сув біп Нів бек Меє 5ег 260 265 270 зек Уаії Гец сіу Тер Рпе Аза АвБп Рго І1е Нів с1у Авр 01у Авр Туг 275 280 285
Ркго сіц Рбе Меє Гув ТПпг с1у Аїа Меє Іїе Рго сій Рібе бег біц А1а 290 295 300
Зо січ пув бі бі Уаії Акуд біу ТБг Аза Авр Рпе Рпе Аїа РіПе бек Ріе 305 310 315 320 б1у Ркго Авп Авп Рпе Агуд Рго бек Авп ТПг Уаї! Уаї Гуз Меє сС1у сіп
З5 325 330 335
Авп оУа1! бек Ггец Авп Тец Агуд біп Уаі Іецй АвБп Тгр чІ1е Гпув Гей сіц 340 345 350
Тук Авр Авр Рго сіп І1е Іїец І1е бек бій Авп с1у Тер Рпе ТПг Авр 355 3З6о 365 зек Тук Ії1е пув ТПг біцп Авр ТПг Тс Аза І1е Тує Меє Меє Гпув Авп 370 375 380
Рпе Гей Авп о біп Уаії Гей сіп Аїа І1е Гуз Рпбе Авр сій І1е Аг4д Уаї 385 390 395 400
Рпе сіу Туг ТПг Аза Тер ТПг Іец Іец Авр сб1у Рпе бій Тер сбіп Авр 405 410 415
А1а Тук ТПг ТБг Агуд Агуд б1у Гецш Роре Тук Уаі Авр Рпе Авп бек сіц 420 425 430 60 біп гув бій Агуд Ппув Рго Ппув бек Бек Аїа Нів Тук Тук Ппув біп І1е 435 440 445
Іїе сбіп Авр Авп об1іу Рпе Рго Геп Пув бій Бек ТПг Рго Авр Меє Гуз 450 455 460 б1у Акд Рпе Рго Сув Авр Рпе бБег Тгр сіу Уа1 ТПг сій бек Уаї Іей 465 470 475 480
Тпув Ркго бій Рпе ТПг Уаі1! бек Бек Рго біп Рпе ТПг Авр Рго Нів Іей 485 490 495
Тук Уа1 Тер Авп Уаї ТіПг б1у Авп Агд Тецй Іецй Туг Агд Уаі сії щу 500 505 510
Уаї Агкд Гей Ппув ТПг Агуд Рго Бек біп Сув ТПг Авр Тук Уаі бек Ше 515 520 525 пув Ппув Акуд УМаї сій Меє Тїей Аїа Ппув Мес Ппувз Уаї Тібг Нів Тук сіп 530 535 540
Рпе Аїа Гец Авр Тгр ТПг бек І1е ІТецй Рго ТПг с1у Авп Гей бек Гув
Зо 545 550 555 560
Уаї Авп Агуд біп Уаі1 Гей Агуд Туг Туг Агуд Сув Уаі Уаі бек 611 щу 565 570 575
З5
Тецшп Ггув Гей сіу Уа1і Рпе Ркго Меє Уа1і ТПг Гей Тук Нів Рго ТПг Нів 580 585 590 зек Нів Гец біу Гей Ркго Гей Ркго Іецй ІТецй бек бек сіу с1у Тер Іец 595 (21019) 605
Авп оМеє Авп ТБПг Аза пув Аза Рпе сіп Авр Тут Аї1а бій Гей Сув Ріре 610 615 620
Акуд бій Ггец сі1у Авр ІТец Уаї пуб Іецй Тер І1е ТПг І1е Ап бій Рго 625 630 635 640
Ап о Агуд Гей бег Авр Меє Туг Авп Агуд ТПг бек АвБп Авр ТПг Туг Агд 645 650 655
Аза Аза Нібв АвБп Іїец Меє І1е Аїа Ніб5 Аза біп Уаї Тер Нів Гей Туг 6бво 665 670 60
Авр Агуд біп Тут Агуд Ркго Уаії біп Нів б1у А1ї1а Уаї бБег Гей бек Іец
675 68 685
Нів Сув Авр Тгр Аїа біц Рго Аза Авп Рго Робе Уаі! Авр бек Нів Тгр 690 695 700 пув Аї1а Аї1а сій Агуд Рпе Гей сіп Рпе сбіш Іїе Аза Тгр Робе Аї1а Авр 705 710 715 720
Ркго Гецп Рбе пуб ТПг б1у Авр Туг Ркго бек Уаії Меє Ггув бі Тук І1е 725 730 735
А1їа бек пув Авп о біп Агуд б1у Пец бек бек бек Уаі Гей Рго Агкд Ре 740 745 750
ТПгЕ Аїа Ппув бій бек Агуд Гецп Уаї Ппув с1у ТБг УМа1ї Авр Робе Туг А1а 755 760 765
Тец Авп о Нів Рпе ТПг ТПг Агуд Рпе Уаі Іїе Нів Ппув сбіп Гец АвБп ОТП г 770 775 780
Ап Агуд бег Уаі Аза Авр Агуд Авр Уаі! біп Рпе Гей сіп Авр І1е ТЕПг 785 790 795 800
Зо
Ак Гей бек бек Рго бек Агуд Гец Аїа Уа! ТПг Рго Тгр сб1у Уа1 Агд 805 810 815
З5
Тпув ІТеп Іїеп Аза Тгр І1ї1е Агуд Агд Авп Тут Агд АБр Агуд АБр Те Туг 820 825 830
І1їе ТПг Аза АБп о с1у І1їе Ар Авр Гей Аїа Гей бій Авр Ар сіп І1е 835 840 845
Акуд пув Тук Тук Те б1іш Гуз Тук Уаі сбіп біш Аїа Гей пув Аїа Туг 850 855 860
Тец І1їе Авр Ппув Уаії Ппув Іїе Ппув с1іу Тук Тук Аїа Рібе Ппув Гей ТЕПг 865 870 875 880 бі бій пув Бек Пув Рго Акуд Рпе сіу Рібе Рпе ТПг бБег Авр Робе Агд 885 890 895
А1їа пув бек бек Уаії біп Рпе Туг бек пуб Тецй І1е Бек Бек Бех ЩЩ1У 900 905 910 (516) Тем Рго Аї1а біц Ап Акуд бег Рго Аїа Сув с1іу сбіп Рго Аїа бій Авр 915 920 925
ТПЕ Авр Сув ТПг І1їе Сув бек РПе Гей Уаї 930 935 «2105 159 «2115 53 «212» РЕТ «213» Ношто варієпвь «4005 159
Меє сій пув Ппув Гей Ні Аїа Уаі Рго Аїа Аза їув5 ТПг Уаї Гпув РПе 1 5 10 15
Туз Сув Рго Бек Бек с1у ТПкг Рго Авп Рго ТПг Гей Агд Тгр Іецй Гу 20
Авпосіу пув біц Робе Гув Рго Авр Ні Агуд І1е сіу с1у Тук Ппув Уаї 25 Агуд Ту Аїа Тік Тгр «2105 160
Зо «2115 34 «212» РЕТ «213» Ношо зарієепь «4005 160 35 Зек бек Ркго ТПг Агуд Гец Аїа Уаї І1їе Ркго Тгр сіу Уаї Агк9д їТуУув Іецй 1 5 10 15
Тец Агуд Тер Уаі Агуд Агуд Авп о Тує с1у Авр Меє Ар І1е Туг І1е ТЕПг 40 20 25 30
А1т1а 5екг 45 «2105 161 «2115 34 «212» РЕТ 50 «213» Масаса тавсісціагів «4005 161 зек Бек Рго ТПг Агд ІТеп Аза Уаії І1е Рго Тгр сіу Уаі Агд Ппув Іец 1 5 10 15
Тец Агуд Тер Уаі Агуд Агуд Авп о Туг сб1у Авр Месє АБр І1е Ту ІШе ТПг 20 25 30 60
А1т1а 5екг
«2105 162 «2115 34 «212» РЕТ «213» Ваєбив вр. «4005 162
Зек бек Ркго бек Агуд Гец Аїа Уа! ТПг Ркго Тгр сіу Меє Аг9д Гу Іецй 1 5 10 15
Тец б1у Тер І1е Агуд Агуд Авп о Туг Агуд Авр Меє Ар І1е Тук Уа1ї! ТЕПг
А1а Авп 20 «2105 163 «2115 34 «212» РЕТ 25 «2135» Мив5 вр. «4005 163 зек Бек Рго бБег Агд ІТейп Аза Уаі! ТПг Рго Тгр сіу Уаі Агд Ппув Іец 1 5 10 15
Зо
Тец А1ї1а Тгр І1е Агуд Агуд Авп о Туг Агуд Авр Агуд Авр о ч11е Туг І1е ТЕПг 20 25 30
З5
А1а Авп «2105» 164 «2115 34 «212» РЕТ «213» Невідомий «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Невідомого: Кролячий поліпептид" «4005 164
Аза Бек Рго бБег Агд Іїец А1їа Уаї! Меєсє Рго Тгр с1у сі с1у Ппув Іец 1 5 10 15
Тем Агуд Тгр Меє Агуд Авп Авп о Туг б1іу Авр Гей Ар Уа1! Туг І1е Тіг 20 25 30
А1а Авп 60
«2105 165 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Мивз вр. «4005 165
Рпе бек б1і1у Авр б1у ув Аза І1е Тгр Авр Гув Ппув біп Тук Уа1і1 5ег 1 5 10 15
Рго «2105 166 «2115 14 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: Синтетичний пептид" «4005 166
Рпе бек біц ТП б1у пув біп Тук б1у І1їе Ппув Авп бек ТЕПг 1 5 10
Зо

Claims (23)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина, які зв'язуються з бета- Клото (КІВ) і рецептором фактора росту фібробластів 1 (ЕСЕ), де антитіло або його антигенсполучна частина містить: (а) перше плече, що містить: домен СОМК1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 15, домен СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 31, домен СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 47, домен СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 62, домен СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 78, і домен СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 93; (Б) друге плече, що містить: домен СОМК1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 136, домен СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 137, домен СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 138, домен СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 139, домен СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 140, і домен СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 141.
2. Виділене біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина за п. 1, де біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина являє собою моноклональне антитіло або людське, гуманізоване або химерне антитіло.
3. Виділене біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина за будь-яким із пп. 1-2, де бо перше плече містить: (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 128, ї (5) варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 130.
4. Виділене біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина за будь-яким із пп. 1-3, де перше плече містить: (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 129, ї (5) варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 131.
5. Виділене біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина за будь-яким із пп. 1-4, де друге плече містить: (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 132, ї (5) варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 134.
6. Виділене біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина за будь-яким із пп. 1-5, де друге плече містить: (а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 133, ї (5) варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 135.
7. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує біспецифічне антитіло або його антигенсполучну частину за будь-яким із пп. 1-6.
8. Клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за п. 7.
9. Спосіб одержання біспецифічного антитіла або його антигенсполучної частини, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 8 таким чином, що продукується антитіло, і, необов'язково, виділення антитіла з клітини-хазяїна.
10. Фармацевтична лікарська форма, яка містить одне або декілька біспецифічних антитіл або їх антигенсполучних частин за будь-яким із пп. 1-6 і фармацевтично прийнятний носій.
11. Фармацевтична лікарська форма за п. 10, яка додатково містить додатковий терапевтичний агент.
12. Застосування біспецифічного антитіла або його антигенсполучної частини за будь-яким із пп. 1-6 як лікарський засіб; для активації рецепторного комплексу КІ В/ЕСЕМК1; для лікування порушень обміну речовин або для застосування в лікуванні розладу, вибраного з групи, що складається з синдрому полікистозних яєчників (РСО5), метаболічного синдрому (Мед, ожиріння, неалкогольного стеатогепатиту (МАЗН), неалкогольної жирової хвороби печінки Зо (МАНІ 0), гіперліпідемії, артеріальної гіпертензії, діабету 2 типу, діабету не 2 типу, діабету 1 типу, латентного аутоїмунного діабету (ГАЮ), діабету дорослого типу в молодих (МОЮУ), а також старіння і пов'язаних з ним захворювань, таких як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона й А! 5, синдрому Барде-Бідля, синдрому Прадера-Віллі, синдрому Альстрема, синдрому Коена, спадкоємної остеодистрофії Олбрайта (псевдогіпопаратиреоїдизм), синдрому Карпентера, синдрому МОМО, синдрому Рубінштейна-Тейбі, синдрому ламкої Х-хромосоми та синдрому Бьорьєсона-Форсмана-Лемана.
13. Застосування за п. 12, де розлад або порушення обміну речовин являє собою діабет.
14. Застосування за п. 12, де розлад або порушення обміну речовин являє собою діабет 2 типу або неалкогольний стеатогепатит (МАН).
15. Спосіб лікування індивідуума, який має захворювання, вибране з групи, що складається з синдрому полікистозних яєчників (РСО5), метаболічного синдрому (Ме), ожиріння, неалкогольного стеатогепатиту (МА5Н), неалкогольної жирової хвороби печінки (МАРІО), гіперліпідемії, артеріальної гіпертензії, діабету 2 типу, діабету не 2 типу, діабету 1 типу, латентного аутоїмунного діабету (ГА), діабету дорослого типу в молодих (МОЮУ), а також старіння і пов'язаних з ним захворювань, таких як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона й АІ 5, синдрому Барде-Бідля, синдрому Прадера-Віллі, синдрому Альстрема, синдрому Коена, спадкоємної остеодистрофії Олбрайта (псевдогіпопаратиреоїдизм), синдрому Карпентера, синдрому МОМО, синдрому Рубінштейна-Тейбі, синдрому ламкої Х-хромосоми та синдрому Бьорьєсона-Форсмана-Лемана, де спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості одного або декількох біспецифічних антитіл або їх антигенсполучних частин за будь-яким із пп.
1-6.
16. Спосіб за п. 15, де захворювання являє собою діабет.
17. Спосіб за п. 15, де захворювання являє собою діабет 2 типу.
18. Спосіб за п. 15, де захворювання являє собою МАЗН.
19. Спосіб за п. 15, який додатково включає введення індивідууму додаткового терапевтичного агента.
20. Спосіб активації рецепторного комплексу КІ.В-ЕСЕКІ1 в індивідуума, який включає введення індивідууму ефективної кількості біспецифічного антитіла або його антигенсполучної частини за будь-яким із пп. 1-6.
21. Біспецифічне антитіло за будь-яким із пп. 1-6, де біспецифічне антитіло або його антигенсполучна частина активує комплекс КІ В-ЕСЕВ 1.
Фіг. ТА НЕК2О5 я гСРКіс нЕК29 204 20 ---К1МЛьЬЗ дб 153 ; 153 -о-ВІМАБІ БаБ В ги ! --КІМАЬО Гав щ- 10 ) 70. в / | --ВІМАЬУ Га 0 ї в к зе Кз я 0 и ЇЗ КЗ а й баб абабиаб (ль (0) (А) (м) КЦІ - інтенсивність сигналу люмінесценції, відносні світлові одиниці
Фіг. 18 не (5) п- 100 яна гз ж" -ф- контроль ІДС і М , -е- КІМАБІ 50 МОУ 00-- ВІМАБ2 з МА -- КІМАБУ І: К ч и -Ь5312 -9 -6 й 10 10 10 І конкуруюче АРІ (м)
кож У Фіг, ІС «»» МЕККСНАУРААКТУКАКСР УС ТРЮР ТІ МИ КМСКЕЕКРОНКТОСТУКУКТАТИ. .. МЕККІ НАМРААКТИ | КУКт ««« МЕККСНАУРААКТУКЕКСРУБСТРЮР ТЕКИ КИСКЕЕКРОНК ГТ ОСУКУВТАТИ,..
Фіг. 10 ї 5 Ко 5 5 с Іва и ОО о ЕМ а о о в пол о ОН в ВИК с и ЖИ ше Кун ки ЖЖ УК п ов ю и ТИШІ шти год Не е ОМС Я лі Ех дЕОИСВ кл Й В Ка Анти-дЛії ше ши и: ши ши шк ши не о ШЕ : ! оо нн о и КИ НН я пн и й - УТ -- дикий тип
Фіг. КЕ обоокадннсья и о 5 вн де с ще в МЕР а най В зе со ; Ша о т ев шо Б, : Шо с а в а ке Мак т Вк - щи ак Я о НН ШЕ а а: Би
Фіг. 1Е Табу жо ко! 2 Ком 0 са НІВ І но от ЯООВА ши ш ши го РІЗВА ІЕЕ немає антитіла КН ША. кіш Антя-їМ УТ - дикий тп | ня | | й НН
Фіг. 2А Ка 00000 Ко Ко (м'єї) (67777 (м вм, РСРАТЬ| 1.9 х 106 2.2 х 1079 11,5 х 10710 о РЕОРАІс| 46 х 106 36 х 10790078 х 10710 вімАьо! ГОРАТЬ| 45 х 105 37 х 1075 82 х 10710 ніх |ЕСРКТс| 7.3 х 109 5 х 1075007 х 10710 Фі ОВ
1.24 12- ва 7 РОРКЬ Т/с Кот» -2 0-90 -6 КтМАьЗ, сом) 006390 - оптична щільність при 630 нм
Фіг, 2 зо т юе
Й. готов З ТОННА -- ГОРНЗЬ
0.5- - ДОРКОС о 3 Бо 7о-без ЕСЕК ІКТМАЬЗ Іод(пім)
Фіг. 20 Щ 200 ШИ ЕСЕКІс --КІМАБІ що се ВІМАБО Я 8 100 --ВІМАЬЗ 5о- фо -ВІМАЬУ О-
0 5. -0 5 6 ГАБ) Іод(пм)
Фр. 2 -- Контроль ідо - 600 -а- В1МАЬЗ ЮК ЕТНО льш ж 0 0 7 14 Дні
Фіг. ЗА ще га ІН НН На на тра о я рії кою ЩЕ Ж ож ж СЯ ШЕ 90» щу ку я 9/5 ож Ж окякокоживжосжюжою ВО м г фо о ше зе о вш зе зе зе ж з зе сш о зє бе за вже в Й зно овен диких ол) зно из вно денофено КИ, Фу ее вн вх Би Я свв кв кв ко со св со св со св св со св осв св ш 5 Іще: ши сш Ши 2 ши В ШО ш нн нн нн и нн а п п их ї «ЕБЕБДСЕВЕШВЕЕБЕВЕВ є І ЕЕ НЕ я м
5. З се! -Ж В Н . Б з нт
Фіг.
ЗА (продовження)
тд шини ше ШИК Же Я ЕВ їз еко же ві і, Зах Зк ША Ж т зай а ня ва а У з ке шиз Жип СК ШИК ЗО Зне дне СВК бе ХО фне нн ре КОЖ Бу» и ЗЕ
ІН ФК о ---- 5-3 ша ЖЕ нянні во НН с ден мн нс с с п п п п в с
ЇЙ со ошз см огмовко єм о ємоєюм Боб бо клю не вив єм я Зо щ-
ввевВавВЕиВЕвееЕВВЕВЕВ о | пот рез Е:
фіг, ЗА (продовження) об'яв гін он ж зн ан Ж С же зн в он рн Вк ЖЕ Об . я я яосжвож нт» ШИ «ож я Щ ЇВ з- се пе оз єв п щи ж- з- ох цооз- св вн с и ШЕ НН ЕН ОЛЖ В ке
Фіг. 38 ЩЕ сс осо зе зе З ск є лює Ве З де опе ж ойе Йо сеосе он оеодює дае пек дае дже Пе СИ ся же дю дом р ЦО бик сш ие пе бах ЖБК вк ик ке Зне еко бе Як фе Же Зако ЗЕ вени нин не нини нн с Вк сжажжнжхживжшожех же б о бом ши кос міс ж ше ще о ца са зок щі. фронт снодоен мя нн фня ДДОНЯ ДЖЙ знхозня пи ПИВО ОС У» ЩИХ з-д вих ше дае б) ки) ово ве в ше зе дв ек Бл У ЦЕ с» осв сват с са с єв св осо ка єв со св осо св КЗ ; ТИ вс в в а а ВЕН нн сн ен В В в а й ос о з каз я во со св с са дз в сш са са ко ЇШ юс ню я аа ка мьнк ШЕ я ше шк Ве ою дж дк се сюди де Шок нн С «асом ко св око єв «в с» своє сю с св кв фран кю дюово ьо в б. сь об ошко боєм М В. ве Сф зе сю че: хо ве Ж в мб мо сб сит дж жо «сю Зк ж ос Ж ЯН же ша со ма мо ва на ша мо ва і о й се ов св са В Йо око яко конт ехо якшо дк. Ж шо ве шЗ В бе бно о Й «зов око кв с» осв ко со с св осо сп слоєв Кк опо ко о й об оз му У до йно и м а ви из ши их ВИК З р Д ма жа єю єж сх с єю єм ск шк сж єж ця си ва су НУ Що де шк зб ожж ж Ж Ж ЖЖ ЖК Ж З ЄЮ Я сна сяє ее и В (С єс ос шок ж кож у о КОЖ ОК ж Ж з ж нок Шу фо зр од пеодек тж дн дю дже оре них еодюе Пе деожех ее в З Ж ша ж ра ва ск ж ра бай ЖЖ ж зда ж ума ж ж ж - взЕВАВОЕВВЕВВЕКВЕВЕО В ом Ше їжа! «ой
Фіг. ЗВ (продовження) ЩО стем зе шо - ж ж св са єм с б ос су ше кое ЩІ сс с сш ша пОЗаЖ 33 СОС ОЛЖ шнй КО сні те ев п км и и и и а в и палили Щ/ жо ше ши ха с шЕ сб ж ма се ж ме с зво Фі ба ж с ал и их с уз лих зе ко Ж ОЗ ГТ скоб з а а ум спіл чо жо жа ше киш ж не ик ни Кн Й єзо ша є є єт єть з зоб єз о єз стю с св їз єв єз ЇМ се ку онко дк онко КЛ НК нд З Зі Й синок вн веков Шщв рнн вн век фнксвні сх ЗО ох оз ож ож зе ож ож жо зай о жі ж ох вк вх КУ сен ва ба. бан біо ід мові. Ай Мой Вхоннй Бо Я оз же кож зи мо м зе ж зо м зе си сту не СВ ее але ор а й пий нн с в с нан нн - ЩО зе нн ле ож поштове с нн ше зо зш шж вне єю жа
-. ПА но ие а ЕЛЕ ЕЛ ник пи ний лій ний Пи
Б. ЗУ бхоєз св осв осв о сл кв кв осв жов єз с «й З жа у ше с шк ж см сю ж Ж с Ж ШЕ с 0 ке З ха - б соєве св св з з з шт м. Же сх 0 ку Ві З З Мч ЦО ос осо єю ша аа ж жо ака еко ж їі лі Вино сах се Др оант яняонноння ню мню юн тя жен же дев ж ка ЗЩосновонн , Й же ие ее в З ее дек вк бе кое ик бик бе Ви Зк Зх ФУ зна яна ка ай іл аа фай ік вах вай кла жтХ 33 їла зе вай аа фрак осв осв осо со сов св» со оз єв «з св со са єв св осз фу на на яз ва ва св сю ца сл жа лк мл осв осв св єв св Іф єю єв я а м о и Ух обо б ан мо ЄМ ЕЕ ЕЕВЕНЕВ зви зувицинивЕНУ вони вв щ-щ м Ен
Фіг. ЗВ (продовження) ФІ сш оз сив осів сту ких слу ших ших из фих виз клю У й с ЩО) се ж сх св ок» с ке о см ба Ко Ко «б св їв Кв с СОН саке зви ше зе о жих тр зе дик З виє Ве Зоо ЗК
Шок... СОЯ 000, кі в шшшнн ШЕ чи и: Ак и кв не в пс Ве- пи и и в НИ п ПЕ і 5 ів я Я ве Я З З З я. Дб осо се бек зи по ОСІ. же банок нн юю що ідо нн є в теле Шон же ка Ж зн ву ж св ср КК нив ас в о В о в в о Я ско со са ку ко ка со о ща ша жд о що ж що ЇВ зов ооо аю їди З а іл ке дю» бе ех блю Ма ЗД сз єв со є єть ою ста са су ко оз кт, кхз са етУ єоЄЗ ус м ко сл клю де биу МК с) У иа кеу СКУ по же в вл и и и а р и пр КЕ М ШИ п Це оз с с а Кз ок од ння и их Фу лю ме ШЕ лю с Ас в ес ВИ: ВВ Ве пасе ре ше це ни и и и ШИ В в о п їй - з "з че як де я ож «з з вв Еш и БЕ о
Чнг. 4 - Я 12004 Є е - 1000 я
Е. | Її ва . і | ря Я я 800. І зв АЙ Е в сен и и 2 60 А ре -о Ж - Х Ж Й Ще ЛІНІ ю І Ж ЛЕНІ ї МІ Її ю- АЙ : нини. З ННІ ІНН І з с ал - й нт а ж ВВ ж нс Я и ЕЕ жЯ
Фіг. 5 254 нак тим ) --- 5012 в / -- 603 с "4 -ж- ВЕ! 14 г, --е- 14Е6 05 АХ дж ! ван ! я й Го т: ААНяЯНЄ:: ЛВНВАВВОВЮВ: ЗНИК... - ЗВ Скотч орчнкктетттчннтя нини 000001 б и 10 00450 - оптична щільність при 450 нм
Фіг. А ЕСРВТе АВ 0 Біспецифічне з а Ав рух Виступ-в-западину се, До й і, ул А» Ся ек їй ов Ор Б с зм з З зити- зи за ні 5 йо 9» й РСР! КІВ сних сту Зеннннннсннн р мо у,
Фіг. 65 Фіг. бС і Я т щА Кк -ї як и» Б З Ф» Ск У их МЕД г в сна Ї р оде | с я св р зе И сні і У у «ік і в Бо сни -ї ї сен т зе. й В в а хх щш рн ря в ктй о Ф ША Ше ї м : ях ї ; ї З ЯЩЕ З: Не й ла чав ! ЕЕ . ШЕ; ; - й ї ав КР Я ех 5 г - БЕ : ее ь Хілл ТЕ я р яв Не
Чиг. 60 негативний контроль РОР2Ї ВРКВІ дб ра МЕК інн вав насінини нннннян п КЗ КЕ КИМ ПК КИ Ки М ж ЕКК и нн Д-тактин ровно вт ння Фіг 7А БОКС 140 ЕСЕВІє я КІВ - 120 Є а з з -Ю і в, 60 Я. се Н а
- Щ. БЕ З Я вия "12545678 9 Ї Імітація транефекції
2. ВІМАБІ /трастузумаб
5. ВІМАБТ/КІВтАБі
4. ВІТМАБТ/КІВтАьЗ
5. ВІМАБТ/КІ тв?
б. КІМАБО / трастузумає
7. В'МАБ? КІ Вт
8. В'МАЬО/КІВтАЬІ
9. ВІМАБО ЛК Віта?
10. Очишене ВІМАВЕ (33 МО
Фіг. 7 РОКІ 501 ду Роєвіс я КІВ - 40- шо - М ре дк з Я - ЧЕ ко ші. ЕФ «ши ШЕ й. А зо в т шШІІ. 12 54468 1 Імітація трансфекції
2. ВІМАЬЗ/КІВтАві (ЬЕКВІ)
3. ВІМАБЗ/КІ Вт? 4, ВІМАБЗ/КІ ВА
5. Очищене : ВІМАВЗ (133 ВУ)
Б. Очишщене ВБІМАВІ (Зиму
Фіг. 7 с І" І" з «ЕЕ ЕВ 5 се шк ев ач ема се єм ов чо ком єв! щ г? т тк. ще а - Зши 5 ЕЗ І 3 з сш хе Мем р.-4 сш са юс! сбишоеча ее ї 5, і т « 7 т ; Я їй ї - чна і» ; їх 5 я, ше я -- З іш в Я у ж і ус - т. ам тр ос че сенс юс св! ! | те І "ше 1 02 у. 8 дека 1 8 Кк се со чан с в
Фіг. А РИ КІВ ЕОРКІ КВ 0 КІВ що (2) (3) Людська ім Мишача Гуманізований ІкО, конетантна конетантна без ефекторних область область, функцій без ефекторних дя функцій Блакитний: люлеька послідовність и Червоний: мишача послідовність
Фіг. че а- ЕОР! -- - БЕКВІ (1) -- БЕКВІ (2) --- БЕКВІ (3) --- БЕКВІ (3) - це --- Що 8-5 21 щі Я ; - в й з / Е В у 5 Я і в / як й Ге ; в і в й Ж дода ит тю - ши 0 ; що -2000- -607-90-9 - ід ІМ) іюд (М)
Фіг. ЗА м а І? ба 5 мн ов ож ШЕ жк ж ШЕ й го в, «- г с ШИ г ї за ех в й ож як. |- ву ш (о - їз че сві Ж ші (75 ев
- Й. - "з те Й пт щ КЗ - ях і С я ж з й ке - че ві
Фіг, 9
0.8.
0.6 гжі волі вай
Е. Гу -3- 1 М БЕКВІ 02 я -- без ЇгС 00 й ша -45-12.-9.-6 ЕСЕ21, юд ТМ фіг. 9С
0.6
0.6 Щ Гр. 7-16 М ЕС ож треї а 2 М ЕСЕ З НН --- 250 /М ЕСЕ) воЄ 5 Бл 9 -е- без ЕСЕІ
0.0-- -5Й-19-98 -6 ЬЕКВІ, юд (МІ
Фіг. 90 ре НЕК295: КІВ НЕКООЗ: КІВІ НЕК; РОРКТе В «но щхЮ 200 - МВО5 Кк Бе Зою. 5000 500 - ВД ш М000- Ж ло | хо ї В - 8 З 5-6 До З 6 - К 6 рт (ам вето ем) тюрі (МО
Фіг. А НЕОРКІс - КІВ "КІВ ПРСРКТсС
Ш т. 3000 3000 | --- КІМАБЗ Ж пл чі я яв та- ВАВ 2000 2000 2000- 1000 1000 1000- У / я со) і ! : 0 5 6 0 5 6 0 5 56 Ісс16 (ПМ ові (ПМ) ото (им)
Фіг. 108 РСЕКІ /-Люлський Людський (немає) (немає) КІВ Людевкий (немає) Людський Мишачий. ВеАБ1 2.3 вм 2300 «м 6.б нм 15,5 вм Е Е : Їх має Не ас нн В ї РО Ї 5. ям сємає емМмаєс вмає даних даних даних
Фіг з «в чна: РОРВІс чне КОРИ чия: БК я 204 Аналіт: ЩА 8 яю нан БЕК! щ 10 ТА КІВ я БАКВІ во Б ВУ окойизнажя ко /З Конг исзнавів-3 В КЗ | ве и- пока 80956600 в Час (а) Часіхв) «Час (хв) Чка: РОРТЬ зви: РОТЬ Я Аналік: БЕКВІ Аналіт: МІД 4. БЕК 5 12007 1200 БО ВОЮ- оКоббисдеаеє-а 8004 0 | Кой/сзеаоге- щ я 400- 400 ; -5 05 юЮ 15 -56Б9 5 105 Час (хв) Час (хв) Фів А 343 нм м" ЕВЕТ я 665 ям ОМАР Донор ро за ОМАР /Акцентор Й й Ди | іс У ші КЕ св Ь. й З ' й У с
Фіг, 28 -КІВ «КІВ в т -------- щ жк щі. є лют блю А щ КО их в роя щі Гея ох Ж ЕНН я ох зх: ВИШНЯ до МО) р шо 80 З ж. що --О Б ЩО Я б 3 шо ше МУ Енея жо ло ХУ я В А Що ов ДИНИ, що Ше: ПНЯ : ЕЕ пе ; У ах ї як МОЙ хх сон ; З з А Коня. о ох А ЗК В х Ор МОБ Фо у Гах и | ши Я Ед шо Е-о ори ! ЕВ ши ші ММ НЕ Ш І У св фі х К й ку й Ной у Ко гх у ва їде ЩЕ ях ги ї с «2 я -9 ГКІ а Ше я В ш-
Фіг. ЗА І лов ей Я ІДООННИн р Зв'язування в зналізі ВАС КЕ ШЕзехея ЩЕ Ес Кі В ц Е КіВтАв? КСВ люзини Ж Ії ! Е - ше
КІ.А людини й нини савани ? нини я й 0 Кідкроляка 00 Й - г ПОМ А повігнгинневс сема клькокя пиши я Ї арка ан ванн Мо о : дими Й ДИКО В: і я к тт - к її їх ща ШІ : В й ОК М МО с В пашока п вх - СОУ ПАК КК «оо и НА Вени иншнинн вою и Кн и они КІВ миші ши Ш
Фіг, І3В що о Люда БЗРТНАМІ РИСЄУККТІ КчУВКНУСЬМОЇ УТА Явинський маках 55РІВІАУІРИСУВКІ ВКИУМУКАЕМНУСОМОТУїТА пок БЗРЗАГАУТРИСМНКІ ЦЕМІНАНУКО НОТ УТА Міцна НИ НН МН НЬ ЇТАН Кома ІЗ РОВІ АММРМСЕСКІ ЕЕ ВИМ МУСОВІОЇМУтТАН,
Фіг. 14А РОБ | РГС 8 2041. кІВ 8203 кв дн З 14 т В 14 | о о 12 | у г 08 ! ІЗ, - 04 . я 04. 0246 8 09246 8 Часі(хв Час (хв)
Фнг. 48 ЕСЕМКА/КІВ
0.5 м мя НИШнМ ь А а 024, ---ЕСЕ19 01 Ше --ВЕКВІ Я. зем сві
0.0
-15.0-12.0-9-6 юд (М)
Фіг. МС 04 вм СІЯ ------ вв - 01212 ям БЕКВІ -- сани -- синий - ще х о КО А КО в ва п х вк кт я ши оо зе ЕКК о оон З ОВ о В В ВО во ОХ ОО в ВО ше
Фіг. ЗА веб ИБОою лю ФО Е уві /Ко З ; ш шо На вія ех. з Б ле Ге | А пе агиь «В ОКУ Бо т ж ВА г. віч дз | в - 0 я я Кап. и и шо се п ЖЕ ее. 2 Б ш я щЩ вх в По ПОД нн щ швея ся о и ще ко ВО БИ А ГУД. линии ни пз - Незначна відмінність '
Фіг. 158 "ЗДИВДИЕ ої Ще | жк пт, 404 Ши МЕ а | Ж -- чі Я, вя 1504. 4 шо ши З т 30 ШЕ ах те мно як | Я ж. Я "опищах я ж 5 чі у; шо 04 Час (дні) Час (дні)
Чну. 15 0 не - с ри в'я й -- ВКВІ що од | «В. же
В. 204 / жо -я Бе 1009, ше 0 юЮ 60 90 120 Часіха) Фіг, 150 ВЕ З їв в 50255 к ВО Е ЦЮ я ші БЕН «болі ще В оре ск ваш ни ше її БО НИ ши ж |. кі . яю - КО 5 5 Бе шк ВН а в й о : Ко ЕХ.
п І. Его я сової 8 Ед с і. щ -- г ож ОО че ча то ВУ соя Не 55 "Бі. БЕ» Вк» 25 Бе й ! : ке жа т і Фіг 13 -а- б що БЕКВІ т Е 0 р Не я ; 2 ЕЙ ж х 5 20 ж іс «В з я 10 пак Ж Ед СЕ 9 10 1: Інеулів (нг/мл)
фіг. 15 з ш" ОРКВІ Ж з о їн їж Ек в щх ! Щ зе щк з х 40 М ж ; ЖЕ що | у ї-й і 0 5 10 15 ІТасулін (нг/мл)
Фіг. 1565 ГУ - «00 . 15 2 Е : н т 0 В юЄ ие тя и шт Ф |: і. 5 1004 78 в Е | ві ді. М хх і Оса Я : - ке і ей ЕЕ. й шов 4 Х се МО Беж Я З а КО НЯ КЕ 5 ЯН о-БНЕНЕМКО еш х хв ЖЕ - Ж з щої Кк ш е з ж щодо у тк е с ж ха Ж з шо Моз еще а а Ох ож ОВ х БЕ і 5 в Е то в «8 ко. Б те в - як я тд росі я що - я - В щ
Фіг. ІА дикий ЗО БСКАЇМОККОХУУВ... яку: ЕЗЕТ ОКО СІКМ5Т
Фіг. ІВ 4 /к - /- умо «Віг. 15 кьт/- Ки - б 6Б0О- й лю -що Е -а-ВЕКВІ | -а- ВЕКВІ г 200 /и і ЩЕ 200- / сер с р-значення для ЛИС « 005 й пе В 0-- пенал я 0 тт 0 м 60 90 120 0 3 60 90 10 Час (хв) Час (хв) п -- Незначна відмінність
Фіг. 160 Носій ЬРКВІ ШшКІМАБІ ьо Ж ал (6. р ен 23004 8-77 з ЖУ їх ЖЖ Е "т 5 200-277 обікчак ол ЧИЙ шо же я н- - 105 5 - я нік зе і СА З 22 В З МН ле | 8 М їн рон кі 2 (р-іееса сс М, с 0- СА КУ
Фіг. І? Носій -13 ОВ. 5. ЬЕКВІ -- шт бак 1 З як и.
щ 200 вазальний рівень" й 150. 2 а щі «ПТ Ех Пе еі:Ш-Я нні : ї --- Контроль їрб БО ро -я- ВКВІ ю 030 609012 Час (хв)
ЩЕ. і тю г Я 2 Б т
Фіг, 1 "Фіксація" ! же АД фен отетатнттттттттнтя ВК що Її ща щ-и в'я як Б У що нк 7 НН щ-Щ - флот т ж т Ще Що що 2 10 0 З 60 9 120 Час (хв)
Фіг. ІЗА ще Контроль Теб» 094 шк БЕКО ве
0.8 щ | й ко і Е я: . ще ша ЕМ ИН, е не ШЕ; МІ ОО РІ п у 219с и Ши ши жи Ж ШУ щу Дні після ін'єкції ЕЕ - споживання енергії
Ковтроль ТО
085. І т,
0.70 ; й й мес 0651 в б поши: ши: ший Дні після ін'єкції их - незначна відмінність КО - дихальний коефіцієнт й
Фіг. 198 же же ; ; Я Я Ор о я ш "ін щи НІ й "й І, | ! в ІТ щ а: ж Я ШЕ ще З ей. З и ее во ме г ові й Зк ше ШЕ 6 т па о. З я мав Бе ше МЕШИ ЯШЕ сш а и ви. їх З -- іш шт; Ше ЖЕ д г 5, Го . Е ие : Шк У ЗЕ ще В: пе Я тая хо а вв и й, 0 ще ще х ос й ик а ще ж 9 з і й ВВ Б ---й й Ж ва ЩЕ я. тв Кк ОХ скине ев Ва ; Б ви о ; ЩЕ СЯ соти у во й Й ; в я у офвки В 024 ша Контроль Їрїх їй З Її МК То о 041- й І Й що | Ше ох щи шк шк и Би Ба Бу жі БИ КУ ШІ й й і я ЇХ 7 ши ПО и ко ди п я ДУМ па Пенн і я 1 в у | у. е й В: ГУ я й й КО щ 09 шити ше щі ший у а вка Контроль Тр що і. й м и ох 07 Ме х КО т КА о Дні після ін'єкції с "яв ЕЕ - споживання енергії п - незначна вДМІННІСТЬ ; в я з чн КО - дихальний коефіцієнт
Фіг. 19С с 2- Ка й Контроль ІРО Еїв- р Кров є 10: д з . г. щі 1. 1! щи п-- | 1 МЕ У десни ше що кА ВВ б з ж нг. 190 ЮС БРКВІ С.
Фіг, 19Е 8 ях з. ГА Ка - Мк З он г. 57 4- й .
Б. . яко . ШЕ 224 не О-як | КО ш Фе з сч шо ДЕ: щ й 5 в що Е ш
Чиг. 19 і Ко яке Контрольївб ше ВЕКВІ г Е рило чечееаре з Ергчмеруврегнчкеии ян й БЕ вв АБО Ов я Шви Ес й в ИНА ЕЕ НІ сін ІЕЕ ВА ООН з й "а" ге ужитка с ж ОВ Я М М ще Е зв Кави г Фе жи зат Щ з і сен ше Я 0 7 й ра 28 35 Е Дні після ін'єкції х кі
Фи.190 Що аа 0яво 0-04 -06 7-бцінка но» ооо |ОВВ р вона нн ИН ВЕ ит зі о. шен жи зо З и нн ніна и НИ В ню що з не шо Ян жи нн
Фік.
І9Н Внутрнцньочеревинна ін'єкція о ! ЬРКВІ ідо -е Насас | ж. 0,6 - -ї5. 14 т ситі ше не ве Шо я ох и ще пи" й шпик " Девкедення день день " До введевих дезпь день дези й ям і бе7 : дази й» |! Ве7 ЕЕ - споживання енергії пу - незначна відмінність КО - дихальний коефіціент
Фіг. 20А Коптроль Таб 15 ши ОЕКВІ 54 ОЗ | . р М Ши щ-кй ши: У.
Б ль ще: Й хе ШЕ у 20- | : ! 15 ес "г шо шо шо ши шо ши.
Дні після ін'єкції 35 8 5 ) ї ще Му а ї гм Е | ! Б щі І й 5 м З. ву с і вх - 20-65 Я, я Ши й ше а! " Ше й Що ше й а о Й й й нин ес Шоди шк ку БИ Ки Кя Я Б . Дні після ін'єкції т вл, ще з бо іш: ї . ; і | | і Її ТЕ Б НУ Я й КЕ МЕ ЯКО: Ж ау и ши ші ші «як Кт, В щи т У М р 4 хе М ЖК 3 З ЩЕ Ж | ш чи. її ж: ШІ ші ви Би КИ Я БІ 8 Дні після ін'єкції
Фіг. 208 Контроль Є: ши БГКВІ 504 п неви серед він ви р ВН ран ну нн певні Ес пснен про нн нрічнни і ши ш ши Бі й м г КН й і Дні після ін'єкції 2 40 | А ж й й й А.
Е "Е г її ЗЕ.
НВ ; Я до І й щ і Кр бе З с. й Її о й й! щі п Б и НВО В, : "шт шов ши ши ше Дні після ін'єкції Ач | с З 120 ; о шишки їй з 5 5 Б 55 55 ша Б а Б я » іш й ь п М ш шом т й ших ниви с У 5 Дві після ін'єкції г
«ФА миші на дієті б З ВЕКВІ з низьким бі рівнем жиру миші на дієті після рівнем жиру підвищення що рівне У температури ій ок 0ю 21ес001ес юс 0 0 ові 08 08. 08 я ШУ ни Ми ще:
04 . 04 ст 0 0А- я. 5 0А У Ще а Зх Я ДКЗ 202 . щі ще 7 ще . до і о 0р- І 00 ! її 00- іх 155 п 8 6 ше: ПН пвх в ЩО щ оо- Я О у ол а БЕКВІ С КО ді щі о и ю ми шк шк шк Кл БІР БІО ЖЯ Я НЯ Дні після ін'єкції
Фіг. Іс ц ї в, ке . я з: 12 - ОО Внутрішньочеревинна ч св Насос ін'єкція сш А ЩИеЄ СО РВЄ юс З МІ о3 ЩА Бо, |. Ге я а зон ШІ ЬЕКВІ - А 0 0л- А - 02 ши |. в РОБ: ою о ЕСЕ ві І ов 1 й т
Фіг.
22 Ода т ЗК Ем КВ 0 ОХ З ло Вишиті НИКА ІЕМ - 2 шо шо ши ! й : КК Ко о ЗВ Не З вк 05 00 БЕН НК - т ЛЕи и А и шия пи 3. КЕ і ці ШИ Кп НЕ НЕ |. Фк я. Брсе:о щЕН АБ 3 ЗОН Ж, Косі ве ОМ НА В о п. фе роса щі ВЕ Б ВО ши в На їй с ОК В ОО Кн М шої. у: ща м и. с и Я я не ; Б Ц щ с. ГЕО Ж ши ре " - 0 я о В и ПН КМ С ОВ ов КО ПДАА ЕВ МЕТ ВК ЗБ ЗК ов й ВИНИ В сс я КИ тя п ши с ож с 0. я 0 пі й ї и ше а ЕН я порив м і ї : що 3 Я -8 5 ! по З ся Ні ї Н Й Час (дні) 2 тк
Фіг.
23 Печінка ПШиелункова Елидидимальня Міжловаукова Нахова чінк. ; : : те залоза 0 ЖАК І ВАТ Й АТ ие аа Я и пен Ж в нн ЛЕ В С и НН НЕ НН ема ше ни ж не п п і п п п о и п п м п п п о в шк шша а ни вн о р нн в ше Й ов ак а В сви У ВВ х с МУ юс оо сх Й не МК Бін рисок ух нн нні В МЛН ЗОВ ВІКНО КВУ сенс нн зано Ен квксдван коню ВВ К зи окон Я по А тут вавіднав ак в кл о ел тя ЗНОС Вітри не туросо в пи КУН З ЕН УЕТо ЕК ДВО А вне Уч м пи ие МВ о М и ее йо ним вв оман сао МНН юн ОХ ПЕК КИ ГК У й панна ев ве жк З у 2 сно НЕ со ее и сис ВВ ВК ВВ тв ВІ і ко и НН МОН
Фіг. 24А (ень 7 | День 7 ше | Ж Ж . Ж в 3. со хв: т В г р я щ 15 С кий хоО-В- | КЕ Щі «7 НА ле о-15 Ж В» | й а Я 20 2е---- ЗВ о ШІ 00535 0053 30 Доза (мг/кг) Доза (мг/кг)
Фіг. 243 іч дк жі НАЙ Б в--йе т 24 ра- Носій я 2100 я С Бен ЕС 2 | а-ьжві(ю) 5 Об єв тен ТИНИ; г -9246 81214 по 468104 Дні після ін'єкції Дні після ін'єкнії «Фіг. 24 шк до зву род к/ роти "ки - «084 з 5: щі тої р і. рення Е ов і і ! у Її Ім ТМ і я І зай і Що Н шиї Де ЩІ Я ік! Ж їв я ш- ш а і Мі Б і що щ ій І БИ сов ши й Ще ша не же жі як Б КІ КІШШОІ шо кл ки кй Бі КА Дні після інЧекції Дві після нє
«Віт. 240) об КУ БАКВІ Девь р День її Дежь З Дежь 11 День 11 ще 5 ВО - 5 - 5 «81 я Е | я 2х 2 Я т ой паю її Ех ТВ В в Ой стеки 85 ов Я 005 Її б7Ею НН . у 30 у до іже Бак 5 : а 5 мя .. ях Ж її: УЮ «5 ВИШИТІ ЕІ ва НЯ ЕЕ г ва о ша 5 ОВ ЮК О-/ ОяАюО-у- з о-у- зако. ронує День 6 Деньої Девю 11 День 1ї День 1 р - - ж т ВОЮ ,. В ю в НЮ чи я Е5: У, ля Й Б. І: у Кс й чан я 6041, Й я 3. Б я тя 5 5МЮ «ВОВ дя І мМ ше ноя Би и ше "в вові їх й - іш 500 іа ся Бр в ва" В 25 ЗО кв - 0 Ен ши її ши її ши єї: - 2Ю | о. Комо в ЕЕ» | шо ЕЕ. 2502 1. ШІ Ей "и щшам и шнм ї щЩРМ ВИКО-и- о -и- Оу. чі уко -7- г ще
Фіг. 25 4 С жвж ви 5 і и жо НТ и Ї ро - ОДА де Е ї ПОЛЕ: МИ Як т РИБ (два рази на день) - Контроль 1 (внутрішньочеревинно, одноразово) ш РВБ (пва рази на день) Є БЕК (внутрішньочеревнино одноразово) КОСКЇ (два рази на леньу Є Жовнтроль ТНЄ (внутришньочеревинно, одноразово);
Фіг. 26 ЯКЕ от ТЯ ке а КО Б ПОЕТ я ЕН , ши НН ко І Кв ко» К ке Аа І КН ІН й и ок, Кн АН у КВ Ж ВИННИК о пош ом оо с і ОО, ее 0 г 0 ще з и КК Я Ши с ОО А є іш 0-36 й В Е С5е ВЗ ВЕ СОЦІ ня 5 пре | ПОВ» ша ян х її о їі р 5 БАЯН Я ех В ВІ Не ВК п. ій ее є Бак жено 00 НН КО роннннни ВЕК КН, З 000 ян є ве до а в ху ВИНА що в о. и Б охо я Ех 0 ай й МОКІЯ тож: ЕКО ше ЕК и МИ й М а п ОНИ в о о. ВІ. ЕЕ З ЕВ ї 3 ІВ ! а о інн с пеня я пранні . . у зе Кн ша: г о я ЕЕ і. ж Й Ми ВВ Ж ОЙ ваНшИ що І | п сс он ЕНЕЙ І ММ и М ВХ Оу ІЛЛЯ і МЕ ни З и ОБ ОО НК І ше, НН:
х о. г 5 п: жи ко з х .
В о. ВО І Ех в. ЕВ я. У я їй Бо. и - з в ОО ВН У фо шо а. КО о В. с ща о я в й КИ ее В ОМ С о І ННЯ: Б с й че ЕН мон ОК Н М Ки У. око ху : с 5000 ие З Ме ЯВИ М Я КМ У сш ши с З КН ту. "7 «ріг. 27 СЕ 05 К - ; : кох . Чат, ж і пк тітку ск злу. вк ї ;
т . я 029 нях з В й зе ай Бан З шоу | | с І КЕ Ії : Е в ж ще че | ще КК в шШшш р. КУ в ві она 0 КК БЕ ОМ . що М .
оп . їй і т 5 15 0 що БАБІ "«вогозоювововововввовововнкою о ато ниття ОТ з К х з. Миші на дієті з низьким я с. вМЕтТОМ жиру
Фіг, 28А Аналіз. ТП вст їз кісток сироватки не. я аналіз иток Ї Ї Ї ! Ї Ї 0 1 2 З 4 5 Бо (Тижлень після нершої ін'єкції)
Фіг. 2588 Кентроль; отримуючий дієту: Контроль КВ Смс ВК а мкг вмістом жиру. овал АВМ 0 ПебжМ я т ПЕАЮС (год'ягіюг) 9965 4 18 153 5152 Ен Аналіз снровнатки інсулін (нслнл ЗВ, 04) МОЖОМе ІАОВБ" 05 ОБ) СЮ (есн 0 ВХ ТЯ 5 55 вв в се в ОВепнн(шома)у й 0 вне МІВ ЗО де Весокомолекулярний 0). ХО АЛЕ Ж ЛЮ Б6БЖ МУ» 25 Х ЗИ Загальний холестерин (мг/дя) МБ ТЕЗА Пер и ї до "ЖТригліцерили Сигідж) йЛ127 Я 28 425 і Я вва саму МИ Я Нац обіди Ох
Ст. аналіз трабекулярної речовини кістки ЩИМ БІО ОПЕК ОЮЄ НИХ 00 0135 0 Шільність кістки (ме На/ем) 128 105 ї 5 ЮЗ дб Об'єм кістки (ми?) ДВБ Ж О06 03 ПОМ ОЗ Ох и? й Загальний об'ємним 285 ЩО 285 3 007 2 НО 2Кі З ще Товщина трабекул (мм) ФО Ж 0009 ОЛ52Б Е ООН ОДБ ОО ОМ ж 00002 я пбінстаньніж О2М 005 025006 ОМ|ЖООІ 0200 Е О005 Млощеловернні БЖ 55АМ БК 0 мБжон БЛМ сет 0 БІ яз КА, а Х всї- аналіз кортикальної речовнни кістки В ОМ аю ОМ ЕО005 о 0006 093 ж 007 Щільність кістки (ме НАлемг) 1957 ІА ША що ж Ії Об'ємкісткн(ми) дББЖОО5 251006 46007 25800 Загальнийоб'ємсюм Б3УЖ017 В Ж0 БО 06550406 Товшиня кістки (мм) ЩА ХУ НЕ ФА ХЕ ВИ 5 ву о 6 5 ХЕ ОО Об'єм кісткового мозку (ман) 9 Хо Б ЗІ 0 З98 І 018
Фіг. 29 ши т 100 | ле в: К-в СТ Р 5 5 5 що МОРКВІ
Фіг. 30 ще, КВИТОК З З СБ е- ВНЗ Яся ВАБИЗ 10 вм З 2 як ВАЬД5 в А 7 ля ВАЬНБ 26 ам о вив я и - ВАД 07 ям 0 ; щі 0 ; т орі кам) іввнНняиМ) ОРНІ КІВ/РОТ 33 20 гС5о и 15 я Ша ВаАЬНИЗ 10 «єм З --- ВБАБИЗ З о ко ВЬИО 125 ам шо ваБра ій 05- і Др в-ва» ще Дін ше ше ни ами вві дим) зевНна М) .
Фіг. 31 24 ---1805 -- 182.2 МЕ -- --- 182.5 ЩЗ3Ї ре ся 1825 ЖЖ 00 185- --- 182,5 МН шення ВОЗ КМУ СИ "ЩЕ , ФО 0 | 10 100 1000 «М
UAA201607298A 2013-12-23 2014-12-23 Виділене біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язується з klb і fgfr1 та спосіб його застосування UA120357C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920396P 2013-12-23 2013-12-23
US201462081435P 2014-11-18 2014-11-18
PCT/US2014/072245 WO2015100366A1 (en) 2013-12-23 2014-12-23 Antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120357C2 true UA120357C2 (uk) 2019-11-25

Family

ID=52347471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201607298A UA120357C2 (uk) 2013-12-23 2014-12-23 Виділене біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язується з klb і fgfr1 та спосіб його застосування

Country Status (30)

Country Link
US (6) US9873748B2 (uk)
EP (2) EP3086807B1 (uk)
JP (3) JP6687533B2 (uk)
KR (3) KR102329693B1 (uk)
CN (2) CN105939727B (uk)
AU (4) AU2014369872B2 (uk)
BR (1) BR112016013960B1 (uk)
CA (1) CA2929868C (uk)
CL (1) CL2016001592A1 (uk)
CR (1) CR20160338A (uk)
DK (1) DK3086807T3 (uk)
EA (1) EA036107B1 (uk)
ES (1) ES2926375T3 (uk)
HR (1) HRP20221088T1 (uk)
HU (1) HUE059701T2 (uk)
IL (3) IL245493B (uk)
LT (1) LT3086807T (uk)
MX (2) MX2016008196A (uk)
MY (1) MY194936A (uk)
NZ (1) NZ720765A (uk)
PE (1) PE20161152A1 (uk)
PH (1) PH12016500927A1 (uk)
PL (1) PL3086807T3 (uk)
PT (1) PT3086807T (uk)
RS (1) RS63565B1 (uk)
SG (2) SG10202007790WA (uk)
SI (1) SI3086807T1 (uk)
TW (2) TWI728373B (uk)
UA (1) UA120357C2 (uk)
WO (1) WO2015100366A1 (uk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
SI3097122T1 (sl) 2014-01-24 2020-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Protitelesa, ki se vežejo v domeni beta klotho 2, in metode za njihovo uporabo
AU2015236073B2 (en) 2014-03-25 2020-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. FGF21 receptor agonists and uses thereof
MX2017003478A (es) 2014-11-05 2018-02-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-fgfr2/3 y metodos para su uso.
WO2017019957A2 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
AU2016303545B2 (en) 2015-08-03 2019-09-12 Novartis Ag Methods of treating FGF21-associated disorders
EP3353211A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods for the treatment of epilepsy
MA53356B1 (fr) 2015-11-03 2022-05-31 Janssen Biotech Inc Formulations sous-cutanées d'anticorps anti-cd38 et leurs utilisations
EP3371217A1 (en) * 2015-11-08 2018-09-12 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of screening for multispecific antibodies
IL262268B1 (en) 2016-04-20 2024-01-01 Regeneron Pharma Preparations and methods for the preparation of antibodies based on the use of an amplified expression locus
SG11201807885PA (en) 2016-04-20 2018-10-30 Regeneron Pharma Compositions and methods for making antibodies based on use of expression-enhancing loci
US10899844B2 (en) 2017-02-08 2021-01-26 Novartis Ag FGF21 mimetic antibodies and uses thereof
AU2018219864A1 (en) * 2017-02-10 2019-08-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Trailshort antibody and methods of use
CN107966525B (zh) * 2017-11-06 2023-10-20 中国矿业大学(北京) 一种13co2量化脉冲标记植物的方法
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
CA3219609A1 (en) 2021-05-04 2022-11-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses

Family Cites Families (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
DE3853515T3 (de) 1987-05-21 2005-08-25 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
KR20000062345A (ko) 1996-12-26 2000-10-25 히라타 다다시 신규 폴리펩타이드, 신규 ｄｎａ 및 신규 항체
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US20020012961A1 (en) 1999-04-15 2002-01-31 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor- 19
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
JP3653469B2 (ja) 1997-11-25 2005-05-25 ジェネンテック・インコーポレーテッド 線維芽細胞増殖因子−１９
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
FR2796073B1 (fr) 1999-07-07 2003-08-29 Centre Nat Rech Scient Anticorps anti-idiotypiques des facteurs de croissance des fibroblastes et leur utilisation comme medicaments
JP2001072607A (ja) 1999-09-03 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規血管内皮機能改善法
DE60028054T2 (de) 1999-09-08 2006-12-21 Genentech, Inc., South San Francisco Fibroblasten-wachstumsfaktor-19 (fgf-19) nukleinsäure und polypeptide und verfahren zu deren verwendung für behandlung von fettleibigkeit
EP1210426A2 (en) 1999-09-10 2002-06-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polymorphisms in a klotho gene
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7504256B1 (en) 1999-10-19 2009-03-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing polypeptide
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
PT1242438E (pt) 1999-12-29 2007-02-28 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo dixorrubicinas e daunorrubicinas modificadas e seu uso terapêutico
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
ES2337696T3 (es) 2000-08-29 2010-04-28 Genentech, Inc. Metodos para aumentar la eficacia de la terapia contra el cancer.
KR100865801B1 (ko) 2000-08-29 2008-10-28 제넨테크, 인크. 암 치료의 효능을 증진시키는 방법
DK2314686T4 (da) 2000-10-06 2023-08-21 Kyowa Kirin Co Ltd Celler, der danner antistofsammensætninger
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
EP1327443A1 (en) 2001-12-21 2003-07-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic or preventing agent for the diseases caused by a decrease in the expression level of the klotho protein
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN100531796C (zh) 2002-01-31 2009-08-26 马普科技促进协会 Fgfr激动剂
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
WO2003102157A2 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050282733A1 (en) 2002-06-27 2005-12-22 Prins Johannes B Differentiation modulating agents and uses therefor
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
DE602004032370D1 (de) 2003-10-16 2011-06-01 Imclone Llc Fibroblasten-wachstumsfaktor-1-hemmer und behandlungsverfahren dafür
SI2380911T1 (en) 2003-11-05 2018-07-31 Roche Glycart Ag ANTIGEN-RELATED PATIENTS WITH INCREASED ATTENTION ON THE RECEPTOR FC AND EFFECTORAL FUNCTION
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US20070248605A1 (en) 2003-12-19 2007-10-25 Five Prime Therapetutics, Inc. Fibroblast Growth Factor Receptors 1,2,3, and 4 as Targets for Therapeutic Intervention
ES2527292T3 (es) 2004-03-31 2015-01-22 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-TGF-beta humanizados
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP2006158339A (ja) 2004-12-09 2006-06-22 Kyoto Univ βＫｌｏｔｈｏ遺伝子、Ｃｙｐ７ａ１遺伝子、及びそれらの利用
JP2008522617A (ja) 2004-12-14 2008-07-03 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ES2582652T3 (es) 2006-02-10 2016-09-14 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-FGF19 y métodos de uso de los mismos
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP3372237A1 (en) 2007-04-02 2018-09-12 Genentech, Inc. A klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
WO2008123625A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
AU2008299779B2 (en) 2007-08-03 2013-05-16 Genentech, Inc. Humanized anti-FGF19 antagonists and methods using same
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
WO2010042747A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
MX2012006397A (es) * 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
JP2013523184A (ja) * 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
CN103415300B (zh) 2010-07-20 2018-02-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 N‑末端修饰的fgf21化合物
PL2710035T3 (pl) 2011-05-16 2017-09-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Agoniści fgfr1 i sposoby stosowania
US9574002B2 (en) * 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
SI3097122T1 (sl) 2014-01-24 2020-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Protitelesa, ki se vežejo v domeni beta klotho 2, in metode za njihovo uporabo

Also Published As

Publication number Publication date
TW201531483A (zh) 2015-08-16
MY194936A (en) 2022-12-27
IL290547A (en) 2022-04-01
TWI670283B (zh) 2019-09-01
EP4219555A1 (en) 2023-08-02
TWI728373B (zh) 2021-05-21
CN105939727A (zh) 2016-09-14
US20240026033A1 (en) 2024-01-25
US9873748B2 (en) 2018-01-23
US20190177432A1 (en) 2019-06-13
KR20220100104A (ko) 2022-07-14
AU2014369872A1 (en) 2016-06-02
US20180105605A1 (en) 2018-04-19
CA2929868A1 (en) 2015-07-02
BR112016013960B1 (pt) 2023-03-14
KR102329693B1 (ko) 2021-11-23
US20220064331A1 (en) 2022-03-03
PT3086807T (pt) 2022-09-05
EA201691321A1 (ru) 2017-02-28
CA2929868C (en) 2023-07-11
RS63565B1 (sr) 2022-10-31
US10882921B2 (en) 2021-01-05
SG10202007790WA (en) 2020-09-29
US20160319038A1 (en) 2016-11-03
JP2022115981A (ja) 2022-08-09
US20150218276A1 (en) 2015-08-06
AU2019204128B2 (en) 2021-05-13
EP3086807B1 (en) 2022-07-13
LT3086807T (lt) 2022-09-26
JP2020125299A (ja) 2020-08-20
JP2017502695A (ja) 2017-01-26
JP6687533B2 (ja) 2020-04-22
AU2014369872B2 (en) 2019-03-14
PH12016500927A1 (en) 2016-07-18
EA036107B1 (ru) 2020-09-29
KR20210144910A (ko) 2021-11-30
HUE059701T2 (hu) 2022-12-28
KR20160102030A (ko) 2016-08-26
IL245493B (en) 2020-10-29
DK3086807T3 (da) 2022-09-19
IL245493A0 (en) 2016-06-30
AU2021282496A1 (en) 2022-01-06
US9884919B2 (en) 2018-02-06
IL277633A (en) 2020-11-30
CL2016001592A1 (es) 2017-03-24
SI3086807T1 (sl) 2022-10-28
AU2021215189B2 (en) 2021-09-23
CN105939727B (zh) 2020-03-17
US10246518B2 (en) 2019-04-02
PL3086807T3 (pl) 2022-10-03
EP3086807A1 (en) 2016-11-02
CN111499754A (zh) 2020-08-07
SG11201605071XA (en) 2016-07-28
ES2926375T3 (es) 2022-10-25
WO2015100366A1 (en) 2015-07-02
AU2021215189A1 (en) 2021-09-02
NZ720765A (en) 2022-02-25
TW202010754A (zh) 2020-03-16
BR112016013960A2 (pt) 2018-01-09
IL277633B (en) 2022-03-01
PE20161152A1 (es) 2016-11-08
HRP20221088T1 (hr) 2022-11-11
AU2019204128A1 (en) 2019-07-04
MX2016008196A (es) 2017-03-14
MX2020009634A (es) 2020-10-08
CR20160338A (es) 2016-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120357C2 (uk) Виділене біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язується з klb і fgfr1 та спосіб його застосування
EP3227340B1 (en) Humanized anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof
US20180362443A1 (en) Uses of anti-her3 antibodies for treating cancer
ES2403075T3 (es) Anticuerpos contra el receptor del factor l de crecimiento similar a la insulina y usos de los mismos
US8961966B2 (en) Antibodies against ERBB3 and uses thereof
UA123826C2 (uk) Антитіла до pd1 та способи їх застосування
US20200131257A1 (en) Compositions and Methods For Treating or Preventing Endocrine FGF-Linked Diseases
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
EA017851B1 (ru) Prlr-специфическое антитело и его применения
UA121464C2 (uk) Анти-jagged1 антитіло та способи його застосування
KR20110081141A (ko) 섬유아세포성장인자수용체 ２에 대한 모노클로날 항체
KR20140101738A (ko) 항 ｉｌ-36ｒ 항체
KR20150131177A (ko) 항-CRTh2 항체 및 그의 용도
US20170190788A1 (en) Uses of anti-her3 antibodies for treating cancer
UA117608C2 (uk) Спосіб лікування еозинофільного захворювання у пацієнта шляхом застосування біспецифічного анти-il-13/il-17 антитіла
AU2013203396B2 (en) Anti-EMP2 therapy reduces cancer stem cells
JP2022523710A (ja) Ｃｄ４４に特異的な抗体
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
JP2014534965A (ja) コンパニオン診断を用いた乳癌の治療
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
WO2022098971A1 (en) Methods and agents for modulating novel immunological interaction
AU2014227437B2 (en) 4-1BB binding molecules
AU2014227437B9 (en) 4-1BB binding molecules
CN115925918A (zh) 特异性识别c5a的抗体及其应用
JP2021504492A (ja) 癌治療のための組成物および方法