JP2022115981A - 抗体及び使用方法 - Google Patents

抗体及び使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022115981A
JP2022115981A JP2022076493A JP2022076493A JP2022115981A JP 2022115981 A JP2022115981 A JP 2022115981A JP 2022076493 A JP2022076493 A JP 2022076493A JP 2022076493 A JP2022076493 A JP 2022076493A JP 2022115981 A JP2022115981 A JP 2022115981A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
klb
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2022076493A
Other languages
English (en)
Inventor
ヨンメイ チェン，
Yongmei Chen
ジェームズ アーンスト，
Ernst James
ホック ソン キム，
Hok Seon Kim
純一郎 園田
Junichiro Sonoda
クリストフ シュピース，
Spiess Christoph
スコット スターウィッキ，
Stawicki Scott
ヤン ウー，
Yan Wu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52347471&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2022115981(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of JP2022115981A publication Critical patent/JP2022115981A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

【課題】ＫＬＢ及びＦＧＦＲ１に結合する抗体並びにその使用方法を提供する。【解決手段】β－クロトー（ＫＬＢ）及び線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）に結合する単離された二重特異性抗体又はその抗原結合部分を提供する。該抗体又はその抗原結合部分は、ＫＬＢのＣ末端ドメインに結合してよく、該抗体又はその抗原結合部分は、インビボで血中グルコースレベルを低下させてよい。【選択図】図１Ａ

Description

優先権主張
この出願は、２０１３年１２月２３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／９２０３９６及び２０１４年１１月１８日出願された米国仮特許出願シリアル番号６２／０８１４３５に対する優先権を主張し、それらは両方ともその全体が参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。２０１４年１２月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、００Ｂ２０６．０１７０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、大きさは１５５，７３８バイトである。
発明の分野
本発明は、β－クロトー（ＫＬＢ）、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、又はその両方に結合する抗体、及びその使用方法に関する。
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）及びその最も近い相同ＦＧＦ１９はＦＧＦスーパーファミリーのメンバーである。ＦＧＦ２１シグナル伝達は、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）アイソフォーム及び膜結合型共受容体クロトーβ（ＫＬＢ）を必要とする（Ogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7432-37 (2007)；米国特許出願公開第２０１０／０１８４６６５号）。ＦＧＦ１９はまたＫＬＢと複合体形成したＦＧＦＲアイソフォームを介してシグナル伝達することが示されている（Wu et al. J. Biol. Chem. 282(40): 29069-29072 (2007)）。哺乳動物種によりコードされるＦＧＦＲの７つの主要なアイソフォーム（１ｂ、２ｂ、３ｂ、１ｃ、２ｃ、３ｃ、及び４）のうち、主に肝臓、脂肪組織、及び膵臓で発現される共受容体ＫＬＢにより結合された場合のみ、３つのアイソフォーム、ＦＧＦＲ１ｃ、２ｃ及び３ｃが、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１の両方によるシグナル伝達を伝達することができる。これらの受容体のうち、ＦＧＦＲ１ｃは、ＦＧＦ２１の代謝効果を媒介する主要な役割を果たしていると思われる。特定の理論に拘束されることなく、ＦＧＦ２１は、膜結合共受容体ＫＬＢの存在下でＦＧＦＲのアイソフォームのホモ二量体化を誘導することによって作用すると考えられている。他のＦＧＦリガンドとは異なり、ＦＧＦ２１は、任意の個々のＦＧＦＲに対して非常に低い親和性を呈する。しかし、Ｃ末端尾部領域を介するＫＬＢへの高親和性結合は、ＦＧＦＲ単独に対する低親和性にもかかわらず、ＦＧＦ２１がＦＧＦＲと相互作用することができるように、ＦＧＦＲ／ＫＬＢ複合体にＦＧＦ２１を補充する。
ＦＧＦ２１は、動物疾患モデルにおいて肥満症及び２型糖尿病を回復させる強力な疾患修飾タンパク質薬剤として同定された（Kharitonenkov et al. J. Clin. Invest. 115(6): 1627-35 (2005)）。組換えＦＧＦ２１は、肝臓の脂質を減少させることが示されていますインスリン感受性を改善し、レプチン－シグナル伝達欠損（ｏｂ／ｏｂ又はｄｂ／ｄｂ）マウス又は高脂肪食（ＨＦＤ）－摂取マウスにおける血糖コントロールを正常化する。血糖の減少及び様々な心血管リスク因子の改善はまた、組換えＦＧＦ２１で毎日処置された肥満症及び糖尿病アカゲザルにおいて観察されている。肥満症げっ歯類において、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ１９は両方とも脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）陽性脂肪組織（茶色とベージュの脂肪組織；ＢＡＴ）の熱発生機能を活性化することが示されている（Ｆu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Fisher et al., Genes & Development 26, 271-281 (2012)）。
組換えＦＧＦ２１又はＦＧＦ１９類似体の臨床応用は現在、代謝性疾患の治療のために試験されているが、治療的介入のためのそれらの開発は挑戦的であることが証明された。例えば、ＦＧＦ２１の血清半減期は、非ヒト霊長類において～２時間であり、実用的な臨床応用のためには短すぎ、循環中の残りのＦＧＦ２１タンパク質はタンパク質分解的切断によって急速に不活性化することができる。タンパク質工学を介してこれらの特性を改善する努力がなされているが、このような修飾は、免疫原性及び他の修飾特異的有害作用を増加させることができる。もう一つの重要な課題は、慢性的なＦＧＦ２１媒介療法からの長期にわたる有害作用の可能性である。例えば、ＦＧＦ２１はＳＯＣＳ２、成長ホルモン受容体シグナル伝達の阻害剤の誘導を介して肝成長ホルモン抵抗性を誘導することが報告されている（Inagaki et al., Cell Metab. 8: 77-83 (2008)）。ヒトでは、成長ホルモン抵抗性又は欠乏は、小児及び成人における骨量の低下に関連しており、ＦＧＦ２１のトランスジェニック過剰発現又は組換えＦＧＦ２１によるマウスの２週間の処置は、骨密度の劇的な損失をもたらす。ＦＧＦ２１の骨関連の有害作用が有益な代謝効果から切り離すことができることはまだ実証されていない。更に、ＦＧＦ１９のトランスジェニック過剰生産はＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ）の活性化を介して肝細胞の発癌につながる可能性がある（Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Tomlinson et al., Endocrinology 143, 1741-1747 (2002); French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)）。
組換えモノクローナル抗体（Ａｂｓ）は、それらが優れた標的選択性、薬物動態プロファイル、及び薬剤のための他の重要な特性を与えることができるため、強力な治療法として機能することができる（Chan and Carter, Nature reviews. Immunology 10, 301-316 (2010)）。例えば、ＦＧＦＲ１ｃに特異的な抗体アンタゴニストは、マウス及びサルにおける体重減少を誘導し（国際公開第２００５／０３７２３５号）、ＦＧＦＲ１ｃのアゴニスト抗体媒介性選択的活性化は、糖尿病マウスにおいてＦＧＦ２１によるインスリン感作を再現するのに十分であることが報告された（国際公開第２０１２／１５８７０４号；Wu et al. Science Translational Med. 3(113): 1-10 (2011)）。ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体に結合する抗体が、活性化剤／治療剤として提案されている（米国特許第７，５３７，９０３号；国際公開第２０１１／０７１７８３号；国際公開第２０１２／１５８７０４号）。他の者は、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ複合体を選択的に活性化するための２つの代替的なアプローチ、例えば、ｍｉｍＡｂ１と呼ばれる高親和性抗ＫＬＢ抗体（Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)）及び、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結した二重特異性抗ＦＧＦＲ１／ＫＬＢ ＡｖｉｍｅｒポリペプチドのＣ３２０１（米国特許第８，３７２，９５２号）などを検討した。
グルコース代謝におけるＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１の重要な役割を考えると、ＦＧＦ１９又はＦＧＦ２１媒介性活性を調節する治療用分子及び方法を開発するための技術の必要性が残っている。
本開示は、ＫＬＢに結合する抗体、ＦＧＦＲ１に結合する抗体、並びにＫＬＢ及びＦＧＦＲ１の両方に結合する二重特異性抗体、及びその使用方法を提供する。本発明は、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ受容体複合体を選択的に活性化し、肝臓に重大な影響を与えることなくかつ骨量の損失を伴わない体重減少並びにグルコース及び脂質代謝の改善を含む、ＦＧＦ２１様活性から予想される有益な代謝変化を誘発するＫＬＢ及びＦＧＦＲ１の両方に結合する二重特異性抗体の発見に一部基づいている。
ある実施態様において、抗体は二重特異的抗体である。例えば、及び限定するものではないが、本発明の単離された抗体は、β－クロトー（ＫＬＢ）及び線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）の両方に結合することができ、ここで抗体は、ＫＬＢのＣ末端ドメインに結合する。例えば、及び限定するものではないが、本発明の単離された抗体は、ＭＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃの両方に結合する。ある実施態様において、抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１４２）を含むＫＬＢの断片に結合する。ある実施態様において、抗体は、アミノ酸配列ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）又はＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）を含むＦＧＦＲ１の断片内のエピトープに結合する。
ある実施態様において、本開示の抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を活性化させる。ある実施態様において、本開示の抗体は、インビボで血中グルコースレベルを低下させる。ある実施態様において、抗体は骨密度に有意に影響を与えない。ある実施態様において、本開示の抗体は、肝臓に有意な影響を与えることはない。ある実施態様において、抗体は、肝臓においてＥＲＫ及びＭＥＫのリン酸化を、ＦＧＦ２１が誘導するよりも有意に低いレベルで誘導する。ある実施態様において、抗体は、１０－８Ｍから１０－１３ＭのＫｄでＫＬＢと結合する。ある実施態様において、本開示の抗体は、１０－８Ｍから１０－１３ＭのＫｄでＦＧＦＲ１タンパク質に結合することができる。ある実施態様において、本開示の抗体は、１０－８Ｍから１０－１３ＭのＫｄでＦＧＦＲ１ｃに結合することができる。ある実施態様において、抗体は、＜１０ｎＭのＫｄでＫＬＢに結合し、＞３００ｎＭのＫｄでＦＧＦＲ１ｃに結合する。ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、約１０ｎＭから約１０μＭのＫｄを有する抗ＦＧＦＲ１アームを含むことができる。
ある実施態様において、本開示の抗体は、ＫＬＢ上に存在するエピトープに特異的に結合する。例えば、及び限定するものではないが、本開示は、図３Ａ及びＢに示す抗体と同一のエピトープに結合する抗ＫＬＢ抗体を提供する。ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、１２Ａ１１又は８Ｃ５抗体と同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体はＫＬＢのＣ末端ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１４２）からなるＫＬＢの断片に結合する。
ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第一抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３０に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、第二抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１３２に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３４に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む。
ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、重鎖領域及び軽鎖領域を含む第一抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、重鎖領域は、配列番号１２９に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖領域は、配列番号１３１に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、第二抗体又はその抗原結合部分は、重鎖領域及び軽鎖領域を含み、ここで、重鎖領域は、配列番号１３３に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖領域は、配列番号１３５に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む。
本開示は更に、（ａ）配列番号１－１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｂ）配列番号７９－９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３、及び（ｃ）配列番号１６－３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２を含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、（ａ）配列番号１－１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１６－３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３２－４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は更に、（ａ）配列番号４８－６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号６３－７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｃ）配列番号７９－９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、（ａ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｂ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
別の態様において、本開示は、（ａ）配列番号１２８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；（ｂ）配列番号１３０のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；及び（ｃ）（ａ）に記載の重鎖可変領域及び（ｂ）に記載の軽鎖可変領域を含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
本開示は更に、ＦＧＦＲ１、例えばＦＧＦＲ１ｃに結合する抗体を提供する。例えば、及び限定するものではないが、本開示の抗体は、ＦＧＦＲ１に結合する可変ドメインを含む。ある実施態様において、抗体は、アミノ酸配列ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）又はＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）からなるＦＧＦＲ１の断片に結合する。ある実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。ある実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｂ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある実施態様において、本開示の抗体は、アミノ酸配列ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）又はＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）からなるＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する。
ある実施態様において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体である。ある実施態様において、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。ある実施態様において、抗体は減少したエフェクター機能を有する。
別の態様において、本開示は、本開示の抗体をコードする単離された核酸を提供する。ある実施態様において、本開示は、本開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。ある実施態様において、本開示は、抗体が産生されるように、本開示の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。ある実施態様において、この方法は宿主細胞から抗体を回収することを更に含む。
本開示は更に、本発明の一以上の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤を提供する。ある実施態様において、薬学的製剤は付加的な治療剤を含む。
別の態様において、本開示は、医薬としての使用のための本発明の抗体を提供する。ある実施態様において、抗体は、代謝障害、例えば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）を治療することに使用のためである。ある実施態様において、抗体は、２型糖尿病を治療することに使用のためである。ある実施態様において、抗体は、肥満症を治療することに使用のためである。ある実施態様において、本開示は、バルデ－ビードル症候群、プラダー・ウィリー症候群、アルストレーム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルービンスタイン－テービ症候群、脆弱Ｘ症候群及びＢｏｒｊｅｓｏｎ－フォルスマン・リーマン症候群を治療することにおける使用のための抗体を提供する。ある実施態様において、本開示は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１受容体複合体、例えば、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体を活性化することにおける使用のための抗体を提供する。
別の態様において、本開示は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）並びに老化及びアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳなどの関連疾患の治療のための医薬の製造における、本明細書に開示される抗体の使用を提供する。ある実施態様において、代謝障害は２型糖尿病である。ある実施態様において、代謝障害は肥満症である。ある実施態様において、製造はＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体を活性化するするための医薬のものである。
別の態様において、本開示は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）並びに老化及びアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳなどの関連疾患からなる群から選択される疾患を有する個体を治療する方法を提供し、該方法は本開示の一以上の抗体の有効量を個体に投与することを含む。ある実施態様において、疾患は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。ある実施態様において、疾患は肥満症である。ある実施態様において、本開示は、バルデ－ビードル症候群、プラダー・ウィリー症候群、アルストレーム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルービンスタイン－テービ症候群、脆弱Ｘ症候群及びＢｏｒｊｅｓｏｎ－フォルスマン・リーマン症候群からなる群から選択される疾患及び／又は障害を有する個体を治療する方法を提供する。ある実施態様において、本方法は、付加的治療剤を個体へ投与することを更に含む。ある実施態様において、本開示の一以上の抗体を用いる方法は、個体において肝機能に影響を与えない。ある実施態様において、本開示は、本開示の一以上の抗体の有効量を個体に投与することを含む、体重減少を誘導する方法を提供する。
別の態様において、本開示は、本開示の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体においてＫＬＢ－ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体を活性化する方法を提供する。
図１Ａは、抗ＦＧＦＲ１抗体及び抗体断片のアゴニスト活性を示す。 図１Ｂは、抗ＦＧＦＲ１抗体を用いた結合競合実験の結果を示す。 図１Ｃは、本開示の主題の抗ＦＧＦＲ１抗体による結合のために重要なＦＧＦＲ１のアミノ酸残基を示す。図１Ｃは、出現順にそれぞれ、配列番号１５９、１５９、１４３及び１４４を開示する。 図１Ｄは、本開示の主題の抗ＦＧＦＲ１抗体による結合のために重要なアミノ酸残基を決定するための部位特異的変異誘発の結果を示す。 図１Ｅは、本開示の主題の抗ＦＧＦＲ１抗体による結合のために重要なアミノ酸残基を決定するための部位特異的変異誘発の結果を示す。 図１Ｆは、ＦＧＦＲ１の空間充填モデルにおける結合のために重要な残基を示す。 図２Ａは、ＦＧＦＲ１ｂ及びＦＧＦＲ１ｃに対する２つの抗ＦＧＦＲ１抗体の親和性を示す。 図２Ｂは、様々なＦＧＦＲへの抗ＦＧＦＲ１抗体の結合を示す。 図２Ｃは、Ｌ６細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１（ＥＴＳ様転写因子１）ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦＲ１に特異的アゴニストとして作用した抗ＦＧＦＲ１抗体を示す。 図２Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦＲ１に特異的アゴニストとして作用した抗ＦＧＦＲ１抗体を示す。 図２Ｅは、抗ＦＧＦＲ１抗体は、糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスに注射した場合、血糖値を正常化することを示している。 図３Ａは、１７の抗ＫＬＢ抗体について軽鎖可変領域配列を示す。ＣＤＲ Ｌ１配列は、順番に、配列番号４８－６２であり；ＣＤＲ Ｌ２配列は、順番に、配列番号６３－７８であり；ＣＤＲ Ｌ３配列は、順番に、配列番号７９－９３である。軽鎖可変領域配列は、順番に、配列番号１１１－１２７である。 図３Ｂは、１７の抗ＫＬＢ抗体について重鎖可変領域配列を示す。抗体のＣＤＲ Ｈ１配列は、順番に（１１Ｆ１－８Ｃ５）、配列番号１－１５であり；ＣＤＲ Ｈ２配列は、順番に、配列番号１６－３１であり；ＣＤＲ Ｈ３配列は、順番に、配列番号３２－４７である。抗体の重鎖可変領域配列は、順番に、配列番号９４－１１０である。 図４は、ｈＫＬＢを発現する２９３細胞への種々の抗ＫＬＢ抗体の結合を測定する０．８μｇ／ｍｌでのＦＡＣＳプロットで観察された中央値のシフトを示す。 図５は、ｈＫＬＢ－ＥＣＤ－ＨＩＳタンパク質に対する種々の抗ＫＬＢ抗体の相対的結合を示す。 図６Ａは、本開示の主題の抗体及びシグナル活性化のためのＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体複合体形成のためのモデルを示す模式図です。。 図６Ｂは、シグナル活性化のためのＦＧＦＲ１ｃ－ＫＬＢ－ＦＧＦ２１複合体形成のためのモデルを示す。 図６Ｃは、ＦＧＦＲ１欠損ＨＥＫ２９３細胞を用いた、ＦＧＦ２１及び二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）１７のＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。細胞は、示された受容体を発現するようにトランスフェクトされた。 図６Ｄは、示されたタンパク質（ＦＧＦ２１（１００ｎＭ）又はＩｇＧ（３３ｎＭ）で１時間処置した初代ヒト脂肪細胞のウエスタンブロット分析を示す。試料はそれぞれの処置について複製された。 図７Ａは、ＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイにおける抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する様々な二重特異性抗体による誘導を示す。Ｒ１ＭＡｂ１アームを有する二重特異性Ａｂは、恐らくはＲ１ＭＡｂ１のＦａｂのアゴニスト活性に起因して有意なＫＬＢ－独立活性を示したことの注意されたい。そのような活性は、Ｒ１ＭＡｂ２又はＲ１ＭＡｂ３アームを有する二重特異性Ａｂをでは観察されなかった。 図７Ｂは、抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する様々な二重特異性抗体によるシグナル伝達の誘導が、ＦＧＦＲ１ｃとＫＬＢの両方に依存していることを示す。 図７Ｃは、ＫＬＢ発現を有しない細胞においてではなく、組換えｈＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢを発現する細胞において、用量依存的にルシフェラーゼ活性を誘導した抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する二重特異性抗体を示す。 図８Ａは、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体の３つの変異体の概略図である。青：ヒト、赤：マウス。（１）中のＮ２９７でのオリゴ糖鎖のおおよその位置は＾で示される。エフェクターのないバージョン（（２）及び（３））は、Ｎ２９７Ｇ変異によりオリゴ糖鎖を欠いている。（２）中の星印は、Ｄ２６５Ａ変異のおおよその位置を示している。ノブ対ホールの方向もまた示される。（１）はＢｓＡｂ１０を表し；（２）はＢｓＡｂ２０を表し；及び（３）はＢｓＡｂ１７を表す。 図８Ｂは、ＢｓＡｂ１０及びその誘導体、対照ＩｇＧ又はＦＧＦ２１で１０分間処置された初代ヒト脂肪細胞におけるＭＳＤ ｐＥＲＫアッセイを示している。データは、平均±ＳＥＭを表す（Ｎ＝３）。ｂＦＫＢ１（１）はＢｓＡｂ１０を表し；ｂＦＫＢ１（２）はＢｓＡｂ２０を表し；及びｂＦＫＢ１（３）はＢｓＡｂ１７を表す。 図９Ａは、ラットＬ６筋芽細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。細胞は、示された受容体の発現ベクターによりコトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞をルシフェラーゼアッセイの前に６時間、様々な濃度のＢｓＡｂ１０又は陽性対照、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ１９又はＲ１ＭＡｂ１とともにインキュベートした。 図９Ｂは、図９Ａに示すように、類似のＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。示されるように、トランスフェクトされたＬ６細胞は、ＦＧＦ２１及びＢｓＡｂ１７の組み合わせで処置された。Ｎ＝４． 図９Ｃは、図９Ａに示すように、類似のＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。示されるように、トランスフェクトされたＬ６細胞は、ＦＧＦ２１及びＢｓＡｂ１７の組み合わせで処置された。Ｎ＝４． 図９Ｄは、ＫＬＢ、ＦＧＦＲ１ｃ又はその両方を発現する細胞への抗ＦＧＦＲ１抗体及び抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、ＢｓＡＢ９及びＢｓＡｂ１０の結合を示す。 図１０Ａは、ＦＧＦＲ１ｃ、ＫＬＢ又はその両方を発現する細胞への抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する二重特異性抗体及び抗ＦＧＦＲ１抗体の結合を示す。 図１０Ｂは、ヒト及びマウスのＫＬＢ／ＦＧＦＲ１の様々な組み合わせを発現しているＨＥＫ２９３細胞への結合についてのＢｓＡｂ１０のＫｄを示す。 図１１は、、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭでのＢｓＡｂ１０又は予め形成されたＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体のチップ上に固定化したＦＧＦＲ１－ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質への結合分析を示す。予め形成されたＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体を生成するために、ＢｓＥｂ１０と組換えＫＬＢ－ＥＣＤタンパク質を１：１の比率でプレインキュベートした。解離速度は、ＦＧＦＲ１ｂでなく、ＦＧＦＲ１ｃがチップ上に捕捉された場合にのみ、ＢｓＡｂ１０単独よりもＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体で遅く、三次元複合体の形成を示していた。 図１２Ａは、ＴＲ－ＦＲＥＴ実験計画の概略図である。 図１２Ｂは、指示したリガンドの添加後１５分での、タグ無しＫＬＢの有無にかかわらず標識されたＳＮＡＰタグ付きＦＧＦＲ１ｃタンパク質を発現するＣＯＳ７細胞上のＴＲ－ＦＲＥＴ強度を示す。ＢｓＡｂ１７、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２は、それぞれ６７ｎＭ、５０ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２ｎＭで使用した。データは６２０ｎｍでドナー発光で割った６６５ｎｍでのＦＲＥＴ強度（ＦＲＥＴ比）、及び３つの独立した実験（Ｎ＝３）の平均±ＳＥＭを示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対ＰＢＳ対照。 図１３Ａは、ＫＬＢのどの部分が２つの抗ＫＬＢ抗体による結合に重要であったかを決定するための実験の結果を示す。ＫＬＢタンパク質構造の模式図が上部に示される。各バーは、ヒトＫＬＢ、ヒトＫＬＡ、ウサギＫＬＢ、ラットＫＬＢ、マウスＫＬＢ、又はキメラ構築物を表す。右側には、一過性に各構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳに基づくＫＬＢｍＡｂ１及び対照ＫＬＢｍＡｂ２の結合が示される。ＫＬＢｍＡｂ１はウサギＫＬＢと結合しないが、３４アミノ酸断片（アミノ酸８０５から８３８）の対応するヒト配列への置換は結合を付与する。 図１３Ｂは、シグナル配列を有するヒトＫＬＢタンパク質の位置８５７から８９０セグメントのアミノ酸配列（シグナル配列を含まないＫＬＢタンパク質の位置８０５から８３８までのアミノ酸配列に対応する）及び様々な指示された種における対応配列を示す。図１３Ｂは、出現順にそれぞれ、配列番号１６０－１６４を開示する。 図１４Ａは、ＳＰＲによるＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体へのＦＧＦ２１及びＦＧＦ１９の結合を示す。ＢｓＡｂ１０はチップ上に捕捉され、ＫＬＢ－ＥＣＤタンパク質及びＦＧＦタンパク質（０．２、０．８、又は２μＭで）が連続注入された。 図１４Ｂは、ラットＬ６筋芽細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。細胞は、ＦＧＦＲ４及びＫＬＢの両方の発現ベクターによりコトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞をルシフェラーゼアッセイの前に６時間、様々な濃度の指示されたタンパク質とともにインキュベートした。 図１４Ｃは、Ｈ４ＩＩＥ肝細胞におけるＥＲＫリン酸化をモニターするために実施されたウェスタンブロットを示す。ＢｓＡｂ１７は、Ｈ４ＩＩＥ肝癌細胞においてＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体を活性化するために（図１４Ｂ）、又はＥＲＫリン酸化を誘導するために（図１４Ｃ）ＦＧＦ１９の能力をブロックしなかったことに注意。 図１５Ａは、リーンＣ５７ＢＬ／６及びｄｂ／ｄｂマウス（ｎ＝７）の３ｍｇ／ｋｇ（リーン）又は５ｍｇ／ｋｇ（ｄｂ／ｄｂ）でのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧの単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注入後の、血糖値（７日目）、％体重変化（７日目）及び毎日の食物摂取量（０－３日）を示す。 図１５Ｂは、０日及び６日目（矢印）に３ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ２０）の腹腔内注入を受けた食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重及び血糖値を示す。Ｎ＝９． 図１５Ｃは、１４日目に１５Ｂで使用したのと同じマウス及び抗体を用いた糖負荷試験の結果を示す。 図１５Ｄは、１７日目の１５Ｂ－Ｃに示した動物における肝トリグリセリド及び血清マーカーの量を示す。 図１５Ｅは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入後５日のＤＩＯマウスでの高インスリン血症－正常血糖クランプの間に測定された全身のグルコース利用を示す。横軸は、血清インスリンレベルを表す。矢印は、基底からインスリン刺激状態への変化の方向を示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対対照。 図１５Ｆは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入後５日のＤＩＯマウスでの高インスリン血症－正常血糖クランプの間に測定された内因性グルコース産生を示す。横軸は、血清インスリンレベルを表す。矢印は、基底からインスリン刺激状態への変化の方向を示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対対照。 図１５Ｇは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入後５日のＤＩＯマウスでの高インスリン血症－正常血糖クランプの間に測定されたインスリン刺激性の組織のグルコース取り込みを示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対対照。 図１６Ａは、マウスＫＬＢタンパク質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１６５）及びＫＯマウスにおいてＫｌｂ対立遺伝子によってコードされる対応するアミノ酸配列（配列番号１６６）を示す。赤文字で示すように、Ｋｌｂ遺伝子のミスセンス変異はＫＯ対立遺伝子における２番目のアミノ酸の後にフレームシフトをもたらす。 図１６Ｂは、野生型（＋／＋）及びＫＬＢノックアウト（－／－）マウスの精巣上体白色脂肪組織におけるＫＬＢタンパク質発現を示す。 図１６Ｃは、ＫＬＢは、グルコース代謝に影響するＢｓＡｂ２０において重要であることを示している。３ｍｐｋでＢｓＡｂ２０又は対照ＩｇＧの週４回の注入を受けたＤＩＯマウスにおける糖負荷試験（ＧＴＴ）。ＧＴＴは、最後の注入の３日後、２３日目に行われた。マウスはＧＴＴの前の２０週間ＨＦＤを受けた。＊ｐ＜０．０５． 図１６Ｄは、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体若しくはＲ１ＭＡｂ１又はビヒクルの腹腔内注入後７日目のＤＩＯマウスにおける血清パラメータを示す。Ｎ＝６． 図１７は、５０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７の腹腔内注入後７日目のＤＩＯマウスにおける血清中のＦＧＦ２３と無機リンの量を示す。Ｎ＝６．＊＊＊ｐ＜０．０００５． 図１８Ａは、クランプ実験中の動脈血糖可動域の量を示す。ＤＩＯマウスはクランプ実験の５日前に１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けた。 図１８Ｂは、クランプ実験の日の体重を示す。 図１８Ｃは、クランプ実験の間のグルコース注入速度を示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００１（＊＊）対対照。 図１９Ａは、２１－２２℃で指示された時間に１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧの単回腹腔内注入を受けたＤＩＯマウスのエネルギー消費（ＥＥ）（左）及び呼吸商（ＲＱ）（右）を示す。Ｎ＝７。 図１９Ｂは、指示された時間に１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧの単回腹腔内注入を受けた痩せたマウスのＥＥ（上）及びＲＱ（下）を示す。マウスは、２１－２２℃で維持され、その後、ケージ温度はＩｇＧの注入後６日目に熱中性（２９－３０゜Ｃ）にシフトされた。Ｎ＝６～７。 図１９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧの単回腹腔内注入後４０時間でのＤＩＯマウスにおける組織のフルデオキシグルコース（ＦＤＧ）の取り込みを示す。Ｎ＝８．ＦＤＧ取り込みが測定される前に、マウスを一晩絶食させた。 図１９Ｄは、単回腹腔内注入後（１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧ）及び浸透圧ポンプ（ＣＬ３１６，２４３（０．７５ｎｍｏｌ／時間）又はビヒクル）の外科的移植後７日目に回収されたｉｎｇＷＡＴのウエスタンブロット分析を示す。 図１９Ｅは、４８時間、３０ｎＭで指示されたタンパク質により処置された初代ヒト皮下脂肪細胞におけるＵＣＰ１のｍＲＮＡの発現を示す。Ｎ＝３． 図１９Ｆは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けたＤＩＯマウスの深部体温を示す。Ｎ＝７～８。 図１９Ｇは、単回１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ及びＦＧＦ２１を２ｍｇ／ｋｇ／日で１日２回又は対照ＰＢＳを５日間受けたＤＩＯマウスのｉＢＡＴの遺伝子発現プロファイルを示す。ＢｓＡｂ１７と対照との間又はＦＧＦ２１と対照との間有意差が認められた全ての遺伝子が列挙された。 図１９Ｈは、０日目に抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体又は対照ＩｇＧの１０ｍｇ／ｋｇでの単回腹腔内注入及び浸透圧ポンプ（ＣＬ３１６，２４３（０．７５ｎｍｏｌ／時間）又はビヒクル）の外科的移植を受けた痩せたマウスのＥＥ（左）及びＲＱ（右）を示す。指示された２４時間の期間中の平均値が示されている。 図２０Ａは、図１９Ａに記載されたＤＩＯマウスのＶＯ２（上）、ＶＣＯ２（中央）の量及び総活性カウントを示す。ＶＯ２とＶＣＯ２の値は＃によって示されている時間で測定された体重値によって正規化されている。ＤＩＯマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けた。 図２０Ｂは、図１９Ｂに記載されたＤＩＯマウスのＶＯ２（上）、ＶＣＯ２（中央）の量及び総活性カウントを示す。ＶＯ２とＶＣＯ２の値は＃によって示されている時間で測定された体重値によって正規化されている。ＤＩＯマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けた。 図２１Ａは、間接熱量測定の平均ＥＥ値を示す。平均増加の大きさは、グラフの下に示される。２１°ＣでＤＩＯ：実験でＩｇＧ注入後のＤ３－Ｄ６の間のＥＥの平均値は図１９Ａに示される。２１℃で痩せた：実験でＩｇＧ注入後のＤ３－Ｄ６の間のＥＥの平均値は図１９Ｂに示される。３０℃に切り替え後痩せた：実験でＩｇＧ注入後（すなわち、温度スイッチ３日後）のＤ６－Ｄ９の間のＥＥの平均値は図１９Ｂに示される。３０℃でＤＩＯ：熱中性に順応させたＤＩＯマウスにおけるＩｇＧ注入後のＤ３－Ｄ６の間のＥＥの平均値。 図２１Ｂは、熱中性でのＤＩＯマウスにおけるＥＥの変化を示す。ＤＩＯマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注入（矢印）の前に２週間熱中性に順応させた。Ｎ＝３～４。 図２１Ｃは、浸透圧ポンプの外科的移植及び薬物注射の後のＤ３－５の間の、通常の実験室の温度（２１℃）でのＤＩＯマウスにおける平均ＥＥ及びＲＱを示す。Ｄ０で、マウスは１０ｍｇ／ｋｇでＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧの腹腔内注入を受けた。ＦＧＦ２１群はまた、Ｄ０に２ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１の腹腔内注入ボーラス投与を受けた。各マウスはまた、Ｄ０に６０μｇ／日でＦＧＦ２１又はＰＢＳ対照を注入するために浸透圧ポンプが皮下移植された。Ｎ＝８～９。＊＊ｐ＜０．００５。 図２２は、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けたＤＩＯマウス間の試験過程にわたって深部体温における近似差を示すように再プロットされた図１９Ｆに示したデータを示す。黒い線は推定差で、青い線は、差の９５パーセント点別信頼区間である。ＩｇＧは１３日目（矢印）に投与された。Ｎ＝７～８。 図２３は、精巣上体脂肪、鼠径部脂肪、及び甲骨間褐色脂肪、並びに膵臓におけるＦＧＦ２１及びＢｓＡｂ２０誘導性ＥＲＫ及びＭＥＫの同程度のリン酸化を示す。組織は、１０ｍｇ／ｋｇ（ＢｓＡｂ２０）又は１ｍｇ／ｋｇ（ＦＧＦ２１）での痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内注入後１時間で（肝臓、膵臓及び精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ））又は２時間で（ｉＢＡＴ又はｉｎｇＷＡＴ）回収された。総ＥＲＫ及びＭＥＫは、負荷対照としての役割を果たす。 図２４Ａは、指示された用量（ｍｇ／ｋｇ）でＢｓＡｂ１７の単回腹腔内注入を受けたＤＩＯマウス（Ｎ＝６）における体重変化及び血清ＨＭＷアディポネクチンレベルを示す。 図２４Ｂは、指示された用量（ｍｇ／ｋｇ）でＢｓＡｂ１７の単回静脈内注入を受けたカニクイザル（Ｎ＝３）における体重変化及び血清ＨＭＷアディポネクチンレベルを示す。 図２４Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇで指示された（矢印）ＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入を受けたＤＩＯマウス（左：ｗｔ及び右：ａｄｉｐｏｑ ＫＯ）のＥＥを示す。Ｎ＝５～６。 図２４Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入を受けたｗｔ（＋／＋）及びａｄｉｐｏｑ ＫＯ（－／－）ＤＩＯマウスにおける様々な代謝パラメーターを示す。Ｎ＝６．ＡＵＣ：ＧＴＴ又はＩＴＴ（Ｔ＝０～２時間）の曲線下面積。ｐ＜０．１（＃）、＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）対対照。 図２５は、ｑＰＣＲを用いて図１９Ｇに記載したマウスから調製した総ＲＮＡを示す。 図２６は、マウス組織におけるＢｓＡｂ１７によるＥＲＫリン酸化のレベルを示す。組織は、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７での痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内注入後１時間で回収し、リン酸化ＥＲＫに特異的な抗体を用いた免疫組織化学に供された。２匹の動物からの代表的な画像が各グループに対して示されている。（１）膵臓、（２）視交叉上核（矢印）を含む冠状脳切片、（３）最後野（染色された細胞の三角形の集合）及び中心管（矢印）を含む冠状脳切片、及び（４）正中隆起（矢印）を含む冠状脳切片。ＢｓＡｂ１７誘導性シグナル伝達は、調べた脳切片のいずれにおいてもでなく、膵臓腺房細胞中で明らかであったことに注意。 図２７は、ＢｓＡｂ２０によるＨＦＤ誘導性肝細胞増殖の正常化を示す。８週間ＢｓＡｂ２０（１又は３ｍｇ／ｋｇ／週）又は対照ＩｇＧ（３ｍｇ／ｋｇ／週）で処置されたＤＩＯマウス又は痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓のＢｒｄＵ組み込み。＊ｐ＜０．０５対ＩｇＧ－処置ＤＩＯマウス（Ｎ＝５～８）。 図２８Ａは、図２８Ｂに示す実験の概略図である。ＤＩＯマウスは、６週間にわたって指示されるようにＢｓＡｂ２０（１又３ｍｇ／ｋｇ／週）又は対照ＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ／週）を受けた。対照の痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスは処置を受けなかった。 図２８Ｂは、ＢｓＡｂ２０処置後の骨表現型を示す。大腿骨と脛骨を切開し、μＣＴ分析に供した。（Ｎ＝７～８）。負の効果は、統計的有意性に達しなかったが、３ｍｇ／ｋｇ／週のＢｓＡｂ２０処置により減少傾向を示した皮質骨の厚さの可能性を除いて海綿骨及び皮質骨の様々な骨パラメーターでは観察されなかったことに注意。カロリー制限マウスにおける海綿骨密度に影響のない皮質骨の厚さの減少が報告されているので（１１）、観察された効果は体重減少に関連する可能性がある。ｐ＜０．００１（＊＊＊），＜０．０１（＊＊）、＜０．０５（＊）、＜０．１（＃）、＜０．２（＄）対対照ＩｇＧで処置されたＤＩＯマウス。Ｎ＝７～８。 図２９は、ＢｓＡｂ１７処置後のマウスにおけるコルチコステロンのレベルを示す。血清コルチコステロンレベルは、断頭による安楽死の後、Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ時間（ＺＴ）＝３で測定した。対照（ＣＴＲＬ）痩せたマウスは、処置を受けなかった。陽性対照としてリポ多糖（ＬＰＳ）が安楽死（ＺＴ＝０）の３時間前に１ｍｇ／ｋｇで痩せたマウスに腹腔内注入された（１２）。ＩｇＧは、指示されるように、安楽死の５日前に５又は２５ｍｇ／ｋｇでＤＩＯマウスに腹腔内注入された。示された統計分析は、ＬＰＳ群を含めないで行われた。Ｎ＝１２． 図３０は、抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する様々な異なる二重特異性抗体のＦＧＦＲ１ｃ又はＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬＢを発現する細胞への結合を示す。 図３１は、ＥＬＩＳＡによるＦＧＦＲ１タンパク質へのＹＷ１８２．５及びＹＷ１８２．５誘導体の結合を示す。
詳細な説明
明確にするためにかつ限定するものではないが、本開示の主題の詳細な説明は、以下のサブセクションに分けられる：
Ｉ．定義；
ＩＩ．抗体：
ＩＩＩ．使用方法；
ＩＶ．薬学的製剤；及び
Ｖ．製造品
定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。ある実施態様では、アミノ酸変化の数は１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。ある実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用を合計した力を指す。別段指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般には解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例となる実施態様は以下に記載されている。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つ抗体である。
特に断らない限り、本明細書で使用する「クロトーβ（Ｋｌｏｔｈｏ－ｂｅｔａ）」、「ＫＬＢ」及び「β－クロトー（ｂｅｔａ－Ｋｌｏｔｈｏ）」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型β－クロトーを指す。その用語は、「完全長」で未処理のＫＬＢ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＫＬＢを含む。その用語はまた、天然に存在するＫＬＢの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。シグナル配列を除いて、本発明の抗体によって標的とされたヒトＫＬＢアミノ酸配列の非限定的な例は、以下のとおりである：
ＦＳＧＤＧＲＡＩＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＩＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＩＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＳＴＬＬＤＡＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＭＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＦＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＲＫＫＬＦＳＶＬＰＩＦＳＥＡＥＫＨＥＭＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＲＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＳＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＤＧＷＬＮＰＳＴＡＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＧＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＶＩＳＳＲＧＦＰＦＥＮＳＳＳＲＣＳＱＴＱＥＮＴＥＣＴＶＣＬＦＬＶＱＫＫＰＬＩＦＬＧＣＣＦＦＳＴＬＶＬＬＬＳＩＡＩＦＱＲＱＫＲＲＫＦＷＫＡＫＮＬＱＨＩＰＬＫＫＧＫＲＶＶＳ（配列番号１４５）。
ある実施態様において、ＫＬＢタンパク質は、アミノ酸配列ＭＫＰＧＣＡＡＧＳＰＧＮＥＷＩＦＦＳＴＤＥＩＴＴＲＹＲＮＴＭＳＮＧＧＬＱＲＳＶＩＬＳＡＬＩＬＬＲＡＶＴＧ（配列番号１５７）を有するＮ末端シグナル配列を含むことができる。
用語「ＫＬＢのＣ末端ドメイン」はＫＬＢのカルボキシ末端グリコシダーゼ様ドメインを指す。例えば、配列番号１４５に示された例示的なＫＬＢタンパク質のＣ末端ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：ＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＤＧＷＬＮＰＳＴＡＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＧＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＶＩＳＳＲＧＦＰＦＥＮＳＳＳＲ（配列番号１５５）。
用語「抗ＫＬＢ抗体」及び「ＫＬＢに特異的に結合する抗体」は、抗体がＫＬＢを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＫＬＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＫＬＢ抗体の、無関係な、非ＫＬＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＫＬＢへの結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＫＬＢへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、異なる種由来のＫＬＢ間で保存されているＫＬＢのエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、タンパク質のＣ末端部分にあるＫＬＢ上のエピトープに結合する。
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「線維芽細胞増殖因子受容体１」又は「ＦＧＦＲ１」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＦＧＦＲ１を指す。その用語は、「完全長」非プロセス型ＦＧＦＲ１並びに細胞におけるプロセシングから生じる任意の形態のＦＧＦＲ１を包含する。その用語また、ＦＧＦＲ１の天然に存在する変異体、例えば、ＦＧＦＲ１ｃを含む、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。ヒトＦＧＦＲ１ｃの非限定的な例を以下に示す：
ＭＷＳＷＫＣＬＬＦＷＡＶＬＶＴＡＴＬＣＴＡＲＰＳＰＴＬＰＥＱＡＱＰＷＧＡＰＶＥＶＥＳＦＬＶＨＰＧＤＬＬＱＬＲＣＲＬＲＤＤＶＱＳＩＮＷＬＲＤＧＶＱＬＡＥＳＮＲＴＲＩＴＧＥＥＶＥＶＱＤＳＶＰＡＤＳＧＬＹＡＣＶＴＳＳＰＳＧＳＤＴＴＹＦＳＶＮＶＳＤＡＬＰＳＳＥＤＤＤＤＤＤＤＳＳＳＥＥＫＥＴＤＮＴＫＰＮＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥＩＩＩＹＣＴＧＡＦＬＩＳＣＭＶＧＳＶＩＶＹＫＭＫＳＧＴＫＫＳＤＦＨＳＱＭＡＶＨＫＬＡＫＳＩＰＬＲＲＱＶＴＶＳＡＤＳＳＡＳＭＮＳＧＶＬＬＶＲＰＳＲＬＳＳＳＧＴＰＭＬＡＧＶＳＥＹＥＬＰＥＤＰＲＷＥＬＰＲＤＲＬＶＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＬＡＥＡＩＧＬＤＫＤＫＰＮＲＶＴＫＶＡＶＫＭＬＫＳＤＡＴＥＫＤＬＳＤＬＩＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＤＧＰＬＹＶＩＶＥＹＡＳＫＧＮＬＲＥＹＬＱＡＲＲＰＰＧＬＥＹＣＹＮＰＳＨＮＰＥＥＱＬＳＳＫＤＬＶＳＣＡＹＱＶＡＲＧＭＥＹＬＡＳＫＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＥＤＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＩＨＨＩＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＶＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＳＮＣＴＮＥＬＹＭＭＭＲＤＣＷＨＡＶＰＳＱＲＰＴＦＫＱＬＶＥＤＬＤＲＩＶＡＬＴＳＮＱＥＹＬＤＬＳＭＰＬＤＱＹＳＰＳＦＰＤＴＲＳＳＴＣＳＳＧＥＤＳＶＦＳＨＥＰＬＰＥＥＰＣＬＰＲＨＰＡＱＬＡＮＧＧＬＫＲＲ（配列番号１４６）。
用語「抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体」は、抗体が、ＦＧＦＲ１ｃを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＦＧＦＲ１ｃに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される無関係の非ＦＧＦＲ１ｃタンパク質への抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体の結合の程度は、ＦＧＦＲ１ｃに対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＦＧＦＲ１ｃに結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、１Ｍ、≦１００ｍＭ、≦１０ｍＭ、≦１ｍＭ、≦１００μＭ、≦１０μＭ、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭを有する。ある実施態様において、本明細書に開示される、ＦＧＦＲ１ｃに結合する抗体のＫｄは、０－３Ｍ未満、又は１０－８Ｍ未満、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍから１０－１３Ｍであり得る。ある実施態様において、抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体は、異なる種由来のＦＧＦＲ１ｃ間で保存されているＦＧＦＲ１ｃのエピトープに結合する。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
参照抗体と「結合を競合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックする。の例示的競合アッセイは、“Antibodies," Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)に記載される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なった抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書で使用される用語「細胞傷害性薬物」とは、細胞機能を阻害するもしくは妨害する及び／又は細胞死もしくは破壊を引き起こす物質のことである。細胞傷害性薬物は、これらに限定されないが、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）；並びに以下に開示する様々な抗腫瘍性又は抗がん性の薬剤が挙げられる。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。例えば、限定するものではないが、「有効量」は、疾患及び／又は障害の症状を緩和する、最小化する及び／又は妨げる、生存期間を延長する及び／又は疾患及び／又は障害の再発までの期間を延長することができる本明細書に開示された抗体の量を参照することができる。
本明細書では、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域が含まれる。ある実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般に次のＶＨ（又はＶＬ）の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４に現れる。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般に、配列のサブグループは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、NIH Publication 91-3242、Bethesda MD(1991)、1-3巻と同様のサブグループである。ある実施態様では、ＶＬについては、サブグループは、上述のＫａｂａｔらと同様のサブグループカッパＩである。ある実施態様では、ＶＨについては、サブグループは、上述のＫａｂａｔらと同様のサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体可変ドメインの各領域を指す。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従って本明細書において番号が付けられる。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つを含む。本明細書における典型的のＨＶＲは、以下を含む：
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲのアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）、及び９４－１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。
ある実施態様において、ＨＶＲ残基は、図３Ａ若しくは図３Ｂ又は本明細書の他の箇所で同定されたものを含む。
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体を指し、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
本明細書において交換可能に使用される「個体」又は「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。ある実施態様において、個体又は被験体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。ある実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された核酸」は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗体をコードする単離された核酸」（特異的抗体、例えば、抗ＫＬＢ抗体への参照を含む）は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本開示の主題に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然型抗体」は、天然に存在する様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。
本明細書において使用される用語「添付文書」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指す。
「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを用いて得られる。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被験体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。ある実施態様において、本開示の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology 6th ed., W.H. Freeman and Co. ９１頁、 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
抗体
一態様において、本発明は、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃの両方に結合し、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ受容体複合体を選択的に活性化し、肝臓に重大な影響を与えることなくかつ骨量の損失を伴わない体重減少並びにグルコース及び脂質代謝の改善を含む、ＦＧＦ２１様活性から予想される有益な代謝変化を誘発する二重特異性抗体の発見に一部基づいている。
ある実施態様において、ＫＬＢに結合する抗体が提供される。本開示は更に、抗ＦＧＦＲ１抗体、例えば抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体を提供する。本開示は更に、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ１の両方に結合する二重特異性抗体（本明細書においては抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体と称される）を提供する。ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢとＦＧＦＲ１ｃの両方に結合する。ある実施態様において、本開示の抗体は、ＦＧＦリガンド、例えば、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１のＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体への結合及び／又は相互作用をブロックしない抗体を含む。
ある実施態様において、本開示の抗体は、肝臓、例えば肝機能に有意な影響を与えることはない。特定の理論に限定されることなく、本開示の抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ受容体複合体の活性化をもたらさない。ある実施態様において、ＦＧＦ２１タンパク質による肝臓におけるＦＧＦＲ／ＫＬＢ受容体複合体の調節と比較して、本開示の抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ／ＫＬＢ受容体複合体の活性を調節しない。ある実施態様において、本開示の抗体は、ＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体の阻害をもたらさず、及び／又は、限定されないが、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ及びＧＬＤＨなどの肝酵素の上昇をもたらさない。ある実施態様において、本開示の抗体は、肝臓においてＦＧＦＲ２ｃ／ＫＬＢ複合体及び／又はＦＧＦＲ３ｃ／ＫＬＢ複合体のアゴニストとして機能せず、このことは肝臓において活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達及び／又はＳｐｒｙ４及びＤｕｓｐ６の発現の変化につながる可能性がある。ある実施態様において、ＦＧＦ２１タンパク質によるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化と比較して、本開示の抗体は、肝臓におけるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化をもたらさない。ある実施態様において、本開示の抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体のアゴニストとして機能しない。
ある実施態様において、本開示の抗体は、ヒト化することができる。ある実施態様において、本開示の抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
ある実施態様において、本開示の抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であることができる。ある実施態様において、本開示の抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片であることができる。ある実施態様において、抗体は、完全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。ある実施態様において、以下のセクション１－７で説明されるように、本開示の抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
本開示の抗体は、例えば、代謝障害の診断又は治療のために有用である。代謝障害の非限定的な例は、例えば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、並びに老化及びアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳなどの関連疾患を含む。
Ａ．例示的な抗ＫＬＢ抗体
一態様において、本開示は、ＫＬＢタンパク質に結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ抗体はＫＬＢのＣ末端ドメインに結合する。ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１４２）を含むＫＬＢの断片に結合する。ある実施態様において、抗体は、本明細書に記載された抗ＫＬＢ抗体、例えば、８Ｃ５と同じエピトープに結合する。
ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、（ａ）配列番号１－１５の何れか一、例えば１２又は１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１６－３１の何れか一、例えば２８又は３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３２－４７の何れか一、例えば４４又は４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４８－６２の何れか一、例えば４９又は６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号６３－７８の何れか一、例えば７５又は７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７９－９３の何れか一、例えば９０又は９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五又は六のＨＶＲを含む。
ある実施態様において、本開示は、（ａ）配列番号１２を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２８を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号４４を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４９を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７５を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９０を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
ある実施態様において、本開示は、（ａ）配列番号１５を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号３１を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号４７を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号６２を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７８を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９３を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
本開示は更に、配列番号１２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば下記に開示される保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１２８において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域で（すなわちＦＲ内で）生じる。代替的に又は付加的に、抗ＫＬＢ抗体は、配列番号１２８のＶＨ配列を含み、下記に開示されるようにその配列の翻訳後修飾を含む。ある実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される一、二又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様において、本開示は、配列番号１３０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１３０において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域で（すなわちＦＲ内で）生じる。代替的に又は付加的に、抗ＫＬＢ抗体は、配列番号１３０のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。ある実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される一、二、又は三つのＨＶＲを含む。
本開示は更に抗ＫＬＢ抗体を提供し、該抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかに記載のＶＬを含む。ある実施態様において、抗体は、配列番号１２８及び配列番号１３０にそれぞれ記載のＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１４２）からなるＫＬＢの断片に結合する。
Ｂ．例示的な抗ＦＧＦＲ１抗体
一態様において、本開示は、ＦＧＦＲ１タンパク質に結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、本開示の抗ＦＧＦＲ１抗体はＦＧＦＲ１ｃに結合する。ある実施態様において、本開示は、（ａ）配列番号１３６を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１３７を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１３８を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１３９を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１４０を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４１を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＦＧＦＲ１抗体を提供する。
ある実施態様において、本開示の抗ＦＧＦＲ１抗体は、配列番号１３２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ１抗体はＦＧＦＲ１へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１３２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域で（すなわちＦＲ内で）生じる。代替的に又は付加的に、抗ＦＧＦＲ１抗体は、配列番号１３２のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。ある実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される一、二又は三つのＨＶＲを含む。
本開示は更に、配列番号１３４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＦＧＦＲ１抗体を提供する。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ１抗体は、ＦＧＦＲ１へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１３４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の領域で（すなわちＦＲ内で）生じる。代替的に又は付加的に、抗ＦＧＦＲ１抗体は、配列番号１３４のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される一つ、二つ、又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかに記載のＶＬを含む。ある実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は、配列番号１３２及び配列番号１３４にそれぞれ記載のＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
ある実施態様において、本開示の抗ＦＧＦＲ１抗体は、アミノ酸配列ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）又はＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）からなるＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する。
Ｃ．例示的な抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体
本開示は更にＫＬＢ及びＦＧＦＲ１の両方に結合する二重特異性抗体（すなわち、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体）を提供する。二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を有しており、例えば、米国特許第５，９２２，８４５号及び第５，８３７，２４３号；Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Cancer Res. 57:4008-4014を参照。例えば、限定するものではないが、本開示の主題は、ＫＬＢ上に存在する第一のエピトープに対する一つの結合部位（例えば、抗原結合部位）を有する二重特異性抗体及びＦＧＦＲ１上に存在する第二のエピトープに対する第二の結合部位を提供する。例えば、限定するものではないが、本発明は、一つのアームがＫＬＢに結合し、かつ本明細書に記載の抗ＫＬＢ抗体配列の何れかを含み、第二のアームがＦＧＦＲ１に結合し、かつ本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ１抗体配列の何れかを含む抗体を提供する。ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢ上に存在する第一のエピトープに対する一つの結合部位及びＦＧＦＲ１ｃ上に存在する第二のエピトープに対する第二の結合部位を有する。
ある実施態様において、本明細書で開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体の活性を調節する抗体を指す。例えば、二重特異性抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、アゴニストとして機能し、かつＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を活性化することができる。ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％又は９９．９％、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体の活性を増加させる抗体である。ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１の二重特異性は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体の下流標的、例えば、ＭＡＰＫ及び／又はＥＲＫのリン酸化をもたらす抗体であり得る。
ある実施態様において、本明細書に開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体活性を調節し、天然のＦＧＦリガンド、例えば、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１のＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対する相互作用及び／又は結合をブロックしない抗体を指す。ある実施態様において、本明細書に開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢの非存在下における天然のＦＧＦリガンドのＦＧＦ受容体に対する結合及び／又は活性をブロックしない抗体を指す。例えば、限定するものではないが、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ１／ＫＬＡ複合体及び／又はＦＧＦＲ１単独との天然のＦＧＦリガンドの相互作用をブロックしない。ある実施態様において、本明細書に開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ１の非存在下における天然のＦＧＦリガンドのＫＬＢへの結合及び／又は活性をブロックしない抗体を指す。例えば、限定するものではないが、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体、ＦＧＦＲ２ｃ／ＫＬＢ複合体及び／又はＦＧＦＲ３ｃ／ＫＬＢ複合体との天然のＦＧＦリガンドの相互作用をブロックしない。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖領域を含む。ある実施態様において、完全長重鎖は、配列番号１２９に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、完全長軽鎖は、配列番号１３１に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、完全長重鎖は、配列番号１２９に記載される配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、完全長軽鎖は、配列番号１３１に記載される配列を有するアミノ酸を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号１２８に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域は、配列番号１３０に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号１２８に記載される配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域は、配列番号１３０に記載される配列を有するアミノ酸を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１－１５の何れか一、例えば１２又は１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１６－３１の何れか一、例えば２８又は３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３２－４７の何れか一、例えば４４又は４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４８－６２の何れか一、例えば４９又は６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号６３－７８の何れか一、例えば７５又は７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７９－９３の何れか一、例えば９０又は９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五又は六のＨＶＲを含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１２を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２８を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号４４を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４９を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７５を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９０を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む。
ある実施態様において、本開示は、（ａ）配列番号１５を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号３１を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号４７を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号６２を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７８を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９３を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号１－１５に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号１６－３１に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号３２－４７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号４８－６２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号６３－７８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号７９－９３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号１－１５に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号１６－３１に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号３２－４７に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号４８－６２に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号６３－７８に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号７９－９３に記載される配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体は、配列番号１５に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号４７に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号６２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７８に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号９３に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、第一抗体又はその抗原結合部分を含み、及び第二抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで第一の抗体又はその抗原結合部分はＫＬＢ上に存在するエピトープに結合し、及び第二の抗体又はその抗原結合部分はＦＧＦＲ１、例えばＦＧＦＲ１ｃ上に存在するエピトープに結合する。例えば、限定するものではないが、第一抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことができ；第二抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことができる。ある実施態様において、第一抗体の重鎖可変領域、又はその抗原結合部分は、配列番号１２８に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、第一抗体の軽鎖可変領域、又はその抗原結合部分は、配列番号１３０に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、第二抗体の重鎖可変領域、又はその抗原結合部分は、配列番号１３２に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、第二抗体の軽鎖可変領域、又はその抗原結合部分は、配列番号１３４に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体と同じエピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が本明細書に提供される。例えば、ある実施態様において、配列番号１２８のＶＨ配列及び配列番号１３０のＶＬ配列を含む抗ＫＬＢ抗体と同一エピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１４２）からなるＫＬＢの断片に結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
ある実施態様において、配列番号１４２に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＫＬＢの断片に結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体と同じエピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が本明細書に提供される。例えば、ある実施態様において、配列番号１２９の完全長重鎖配列及び配列番号１３１の完全長重鎖配列を含む抗ＫＬＢ抗体と同一エピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
ある実施態様において、本開示は、本明細書に提供される抗ＦＧＦＲ１抗体と同じエピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号１３２のＶＨ配列及び配列番号１３４のＶＬ配列を含む抗ＦＧＦＲ１抗体と同一エピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、アミノ酸配列ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）又はＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）を含むＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
ある実施態様において、本開示は、本明細書に提供される抗ＦＧＦＲ１抗体と同じエピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号１３３の重鎖配列及び配列番号１３５の軽鎖配列を含む抗ＦＧＦＲ１抗体と同一エピトープに結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、配列番号１４３に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する。
ある実施態様において、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、配列番号１４４に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する。
ある実施態様において、配列番号１４２に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＫＬＢの断片に結合し、及び配列番号１４４に記載される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
ある実施態様において、配列番号１４２に記載されるアミノ酸配列を有するＫＬＢの断片に結合し、及び配列番号１４３又は１４４に記載されるアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。
１．抗体親和性
ある実施態様において、本開示の抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、１Ｍ、≦１００ｍＭ、≦１０ｍＭ、≦１ｍＭ、≦１００μＭ、≦１０μＭ、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭを有する。ある実施態様において、本開示の抗体は、約１０－３以下、又は１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３ＭのＫｄを有することができる。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、約１０ｎＭから約１０μＭのＫｄを有する抗ＦＧＦＲ１アームを含むことができる。ある実施態様において、低親和性を有するＦＧＦＲ１アームを含む抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢの非存在下でのＦＧＦＲ１への強固な結合及び他のＦＧＦリガンド、例えば、限定されないが、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８及びＦＧＦ２３によるＦＧＦＲ１の結合及び／又は活性化を防止することがもたらす抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体のリスクを軽減することができる。ある実施態様において、低親和性を有するＦＧＦＲ１アームは、臨床的に重大な副作用を生じることなく、限定されないが、抗ＦＧＦＲ１半ノブ抗体、非共有結合性の抗ＦＧＦＲ１二量体、共有結合性抗ＦＧＦＲ１二量体及び高分子量種などの抗ＦＧＦＲ１不純物のより高レベルの存在を可能にすることができる。例えば、ある実施態様において、およそ２％の高分子量種及び１．５％の抗ＦＧＦＲ１半抗体が、有害な生物学的効果を生じることなく、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体の調製物中に存在することができる。
ある実施態様において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定されることができる。ある実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施されることができる。例えば、限定するものではないが、非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）－標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Ｃｈｅｎ５Ｉ）－標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２～５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997）の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。次いで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合的結合アッセイで使用するために選択される。
ある実施態様において、ＫｄはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定することができる。例えば、限定するものではないが、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いるアッセイが、～１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。ある実施態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（～０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出されることができる。例えばChen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ－１ｓ－１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
２．抗体断片
ある実施態様において、本開示の抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片ならびに下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９～１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ある実施態様において、本開示の抗体は、ダイアボディであることができる。ダイアボディは、二価又は二重特異性のこともある２つの抗原結合部位のある抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
ある実施態様において、本開示の抗体は、単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号（Ｂ１）を参照）。
抗体断片は、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質消化及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本開示の抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。ある実施態様において、本開示のキメラ抗体は非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変えられている「クラス転換された」抗体であることができる。キメラ抗体にはその抗原結合断片が含まれる。
ある実施態様において、本開示のキメラ抗体は、ヒト化抗体であることができる。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトへの免疫原性を抑えるために親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持したままヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体由来でＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列由来である１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むことになる。ある実施態様では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びそれを作製する方法は、例えば、Almagro及びFransson、Front.Biosci.13:1619~1633(2008)で概説されており、例えば、Riechmannら、Nature 332:323~329(1988)；Queenら、Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029~10033(1989)；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、及び米国特許第７，０８７，４０９号；Kashmiriら、Methods 36:25~34(2005)（特異性決定領域（ＣＤＲ）移植法を記載している）；Padlan、Mol.Immunol.28:489~498(1991)（「リサーフェイシング」を記載している）；Dall'Acquaら、Methods 36:43~60(2005)（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにOsbournら、Methods 36:61~68(2005)及びKlimkaら、Br.J.Cancer、83:252~260(2000)（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）に更に記載されている。
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本開示の抗体は、ヒト抗体であることができる。ヒト抗体は当技術分野で公知の種々の技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的には、van Dijk及びvan de Winkel、Curr.Opin.Pharmacol.5:368~74(2001)ならびにLonberg、Curr.Opin.Immunol.20:450~459(2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製されることができる。そのような動物は典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有しており、その遺伝子座は内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わる、又は染色体外に存在するもしくは動物の染色体中に無作為に取り込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般的には不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び米国特許第６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物により産生されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより更に改変しうる。
ヒト抗体はハイブリドーマベースの方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体は、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト－ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
５．ライブラリー由来抗体
本開示の抗体は、１種又は複数の所望の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離しうる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法は当技術分野では公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に概説されている。
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片の何れかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。ある実施態様において、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
６．多特異性抗体
ある実施態様において、本開示の抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体であることができる。多特異的抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＫＬＢ上に存在するエピトープに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、結合特異性の一つはＦＧＦＲ１上に存在するエピトープに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、本開示の二重特異性抗体は、ＫＬＢ上のエピトープに結合することができ、かつ、ＦＧＦＲ１上のエピトープに結合することができる。ある実施態様において、本開示の二重特異性抗体は、ＫＬＢ上のエピトープに結合することができ、かつ、ＦＧＦＲ１ｃ上のエピトープに結合することができる。二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多特異的抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Milstein及びCuello、Nature 305:537(1983)、国際公開第９３／０８８２９号及びTrauneckerら、EMBO J.10:3655(1991)参照）、及び「ノブインホール」工学（例えば、米国特許第５７３１１６８号参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ－ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号（Ａ１））；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号（Ａ１）を参照）。
７．抗体変異体
本開示の主題は、開示された抗体のアミノ酸配列変異体を更に提供する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾は、限定されないが、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。すなわち、改変された最終抗体が所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成されることができる。
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、抗体変異体は一以上のアミノ酸置換を有することができる。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換の非限定的な例は、表１の「望ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更の非限定的な例が、表１の「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は対象の抗体に導入され、生成物は、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、又は改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）もしくは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）についてスクリーニングされることができる。
Figure 2022115981000002
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
ある実施態様において、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
ある実施態様において、置換変異体の一つのタイプは、親抗体、例えば、ヒト化又はヒト抗体などの一以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、更なる研究のために選択される１つ又は複数のこうして得られる変異体は、親抗体と比べてある種の生物学的特性、例えば、限定されないが、増加した親和性、減少した免疫原性に改変、例えば、改善を有することになる及び／又は親抗体のある種の生物学的特性を実質的に保持していることになる。置換変異体の非限定的な例は親和性成熟抗体であり、この抗体は、例えば、本明細書に記載されている技法などのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便に産生しうる。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基は変異され、変異体抗体はファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）を求めてスクリーニングされる。
ある実施態様において、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて改変（例えば、置換）を加えることもできる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又は抗原に接する残基で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築しそこから選択し直すことによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の特定の実施態様では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェインシャフッリング、又はオリゴヌクレオチド標的突然変異）のうちの何れかにより成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入されることができる。次に、二次ライブラリーが作製される。次に、前記ライブラリーはスクリーニングされて、所望の親和性を有る任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、幾つかのＨＶＲ領域（例えば、１度に４～６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定されることができる。ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３は特に標的にされることが多い。
ある特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で起こることができる。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であってよい。上に提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施態様では、それぞれのＨＶＲは、改変されない、又は１つ以下、２つ以下又は３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が該アミノ酸位に導入されて、最初の置換に対する機能的感受性を実証してもよい。その代わりに、又はそれに加えて、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００又はそれよりも多い残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ－及び／又はカルボキシル末端融合物、ならびに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、抗体介在性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）のため）又はポリペプチドへの抗体のＮ－又はＣ－末端の融合が含まれる。
ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様では、本開示の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を高める又は減じるために改変されることができる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は削除は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出される又は取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現しうる。
ある実施態様において、抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する糖は改変され得る。哺乳動物細胞により産生された未処置の抗体は典型的には、一般的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。ある実施態様では、本開示の抗体におけるオリゴ糖の改変は、ある種の改善された特性を有する抗体変更体を生み出すためになされることができる。
ある実施態様では、Ｆｃ領域に結合している（直接的に又は間接的に）フコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、約１％から約８０％、約１％から約６５％、約５％から約６５％、又は約２０％から約４０％及び間の値とすることができる。
ある実施態様において、フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定することができる。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域のおおよそ２９７位（Ｆｃ残基のＥｕ番号付け）に位置しているアスパラギン残基のことであるが、Ａｓｎ２９７は、抗体中の小さな配列変動のせいで、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、２９４位～３００位までの間に位置していることもありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有することがある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。
脱フコシル化抗体は、タンパク質フコシル化を欠いている任意の細胞株において産生され得る。細胞株の非限定的な例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ａ１）、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号（Ａ１）、Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ－１、６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
二分されたオリゴ糖を有する、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている抗体変異体が更に提供される。そのような抗体変異体は減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体の非限定的な例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改善されたＣＤＣ機能を有することができる。そのような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju,S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju,S.）に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸改変を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を産生することができる。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
ある実施態様において、本開示は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を提供する。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行えば、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合力は保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７～４９２（１９９１）の４６４ページ表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。代わりに、非放射アッセイ法を用いることもある（例えば、ＡＣＴＩＴＭ：フローサイトメトリーのための非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）：非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイも実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができずしたがってＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。ある実施態様において、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogieら、J.Immunol.164:4178~4184(2000)に記載されているように、変化した（すなわち、改善された又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域においてなされうる。
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
ある実施態様において、本開示の抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位での置換のあるＦｃ領域を含む（残基のＥＵ番号付け）。
ある実施態様において、抗体、例えば本明細書に開示された二重特異性抗体のＦｃ領域になされた改変は、半減期が増加し、母性ＩｇＧの胎児への移行の原因となる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された変異体抗体を生成することができ、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ａ１）（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ又は複数の置換がその中にあるＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある特定の実施態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作り出すのが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基は抗体の接触可能部位に存在する。更に本明細書で説明されるように、それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に置かれ、この基を使用して抗体を、薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを作り出しうる。ある実施態様において、以下の残基の何れか又は複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載される通りに産生することができる。
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本開示の抗体は当該分野において知られており容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は型は、限定されるものではないが、向上されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が定まった条件下で治療に使用されるかどうかを含む考慮事項に基づいて決定され得る。
ある実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。ある実施態様において、放射線は、通常の細胞に害を与えないが抗体－非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度にまでは非タンパク質部分を加熱する波長を含むがこれに限定されない任意の波長のものであることができる。
Ｄ．抗体産生の方法
本明細書中に開示される抗体は、当技術分野における任意の利用可能な又は既知の技術を用いて産生することができる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されている組換え法及び組成物を使用して産生することができる。抗体を生成する詳細な手順は、以下の実施例に記載される。
本開示の主題は、本明細書に開示される抗体をコードする単離された核酸を更に提供する。例えば、単離された核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列、例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードすることができる。ある実施態様において、単離された核酸は、配列番号１２８に記載の配列を有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び／又は配列番号１３０に記載の配列を有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
ある実施態様において、核酸は、一以上のベクター、例えば、発現ベクター中に存在することができる。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、それに結合されている別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されることができる円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。また別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させることができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指令することができる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態（ベクター）である。しかし、開示される主題は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことが意図される。
ある実施態様において、本開示の抗体をコードする核酸及び／又は核酸を含む一以上のベクターは、宿主細胞に導入することができる。ある実施態様において、細胞への核酸の導入は、限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含む当技術分野で周知の任意の方法により行うことができる。ある実施態様において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクターを含むことができ、例えば、これらのベクターで形質転換される。ある実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体又は抗ＦＧＦＲ１ｃを作製する方法は、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸が導入された宿主細胞を培養し、場合により、宿主細胞及び／又は宿主細胞培養培地から抗体を回収することを含むことができる。ある実施態様において、抗体は、クロマトグラフィー技術を介して宿主細胞から回収される。
本開示の抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入されうる。そのような核酸は従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され塩基配列決定される。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ではない場合は細菌において産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号、及び米国特許第５８４０５２３号を参照されたい。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞も多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来することができる。無脊椎動物細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞も多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
ある実施態様において、植物細胞培養物を宿主細胞として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、米国特許第６０４０４９８号、米国特許第６４２０５４８号、米国特許第７１２５９７８号、及び米国特許第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載している）を参照されたい。
ある実施態様において、脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、限定するものではないが、懸濁液で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系統は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の非限定的な例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
ある実施態様において、二重特異性及び／又は多特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Milstein及びCuello、Nature 305:537(1983)、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９３／０８８２９及びTrauneckerら、EMBO J.10:3655(1991)参照）、及び「ノブインホール」工学（例えば、米国特許第５７３１１６８号参照）が含まれるが、これらに限定されない。二重特異性抗体はまた、抗体のＦｃ－ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号（Ａ１））；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
本開示の二重特異性及び多重特異性分子は、また、化学的技術（例えば、Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807を参照）、「ポリドーマ」技術（例えば米国特許第４，４７４，８９３号を参照）又は組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。本開示の主題の二重特異性及び多重特異性分子は、また、当技術分野で周知の方法を用いて、本明細書に記載されるように、構成成分の結合特異性、例えば、第一のエピトープ及び第二のエピトープの結合特異性をコンジュゲートすることにより調製することができる。例えば、限定するものではないが、二重特異性及び多重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、相互にコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドであるとき、様々なカップリング又は架橋剤が共有結合のために使用することができる。架橋剤の非限定的な例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法は、Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)により記載されるものを含む。結合特異性が抗体（例えば二つのヒト化抗体）である場合には、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートさせることができる。ある実施態様において、ヒンジ領域は、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、コンジュゲーションの前に１個を含むように修飾することができる。
ある実施態様において、二重特異性抗体の両方の結合特異性が、同じベクターにコードされ、同じ宿主細胞において発現され及び組み立てられることができる。この方法は、二重特異性及び多重特異性分子が、ＭＡｂ×ＭＡｂ、ＭＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。ある実施態様において、本開示の二重特異性抗体は、単鎖二重特異性抗体、単一鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖二重特異性分子、又は二つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子などの単鎖分子であることができる。二重特異性及び多重特異性分子はまた、単鎖分子であることができ、又は少なくとも２つの単鎖分子を含むことができる。二重及び多重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；及び米国特許第５，４８２，８５８号に記述されている。「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位（例えば、エピトープ結合部位）を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号（Ａ１）を参照）。
本開示は更に、三重特異性、例えば、三官能性、抗体を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示の三重特異的抗体は、ＫＬＢ上に存在するエピトープ、ＦＧＦＲ１上に存在するエピトープ、及び、限定されないが、ＰＣＳＫ９、ＧＣＧＲ、ＡｄｉｐｏＲ、ＺｎＴ８、ＡｐｏＬ１、ＭＳＴＮ、ＩｎｓＲ又はＦＡＢＰ４などの第３のタンパク質上に存在するエピトープ又は抗原に結合し及び／又は相互作用することができる。
ある実施態様において、動物系が、本開示の抗体を産生するために使用することができる。ハイブリドーマを調製するための一つの動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された手順である。融合のために免疫された脾細胞の単離のための免疫プロトコル及び技術は当該技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も知られている（例えば、Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New Yorkを参照）。
Ｅ．アッセイ
本明細書で提供される本開示の抗体は、当技術分野で公知でありかつ本明細書に提供される様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定され、スクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
ある実施態様において、本開示の抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又はウエスタンブロットアッセイなどの周知の方法により、その抗原結合活性について試験することができる。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に興味深いタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、ＫＬＢ－抗体複合体は、例えば、抗体－ＫＬＢ複合体を認識して特異的に結合する酵素結合抗体又は抗体断片を用いて検出することができる。あるいは、複合体は、種々の他のイムノアッセイの何れかを用いて検出することができる。例えば、抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で使用することができる（例えば、本明細書中に参考として援用される、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照）。放射性同位元素は、ガイガーカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、又はオートラジオグラフィーによって検出することができる。
ある実施態様において、競合アッセイが、ＫＬＢに結合するための本発明の抗ＫＬＢ抗体、例えば１２Ａ１１又は８Ｃ５と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合する抗体は、１２Ａ１１又は８Ｃ５により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
競合アッセイの非限定的な例において、固定化ＫＬＢは、ＫＬＢに結合する第一の標識された抗体（例えば、１２Ａ１１又は８Ｃ５）、及びＫＬＢへの結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＫＬＢが、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＫＬＢへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化ＫＬＢに結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＫＬＢに結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＫＬＢへの結合に対して第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
２．活性のアッセイ
本開示は、生物学的活性を有するそれらの抗ＫＬＢ抗体を同定するためのアッセイを提供する。生物学的活性は、例えばＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃの受容体複合体を活性化することを含むことができる。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。ある実施態様において、アッセイは、本開示の抗体を、細胞、例えば、ＫＬＢを発現する２９３Ｔ細胞に結合させ、及びＫＬＢ－ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体、例えばＥＲＫの一以上の下流の標的の活性及び／又はリン酸化状態を分析することを含むことができる。ある実施態様において、アッセイは、被験体、例えば、非ヒト動物に対する本開示の抗体を投与すること及び抗体が被験体におけるグルコースレベルに関して有する影響を分析することを含むことができる。
Ｆ．イムノコンジュゲート
本開示の主題は更に、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書に開示された抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。例えば、開示された主題の抗体又は抗原結合部分は（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他によって）、別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣物などの一以上の他の結合分子に機能的に連結することができる。
ある実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
ある実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むがこれらの限定されない酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
ある実施態様において、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には種々の放射性同位元素が利用可能である。非限定的な例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。検出のために放射性コンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含むことができる。
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えば、トルエン－２，６－ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して製造されることができる。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、リシンイムノトキシンを調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。前記リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬の放出を促進する「切断可能リンカー」とすることができる。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）を使用することができる。
本明細書のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（サクシニミジル－（４－ビニルスルホン）安息香酸（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）を含むがこれらの限定されない架橋剤試薬で調製されたそのようなコンジュゲートを明確に想定しているが、これらに限定されない。
ＩＩＩ．使用方法；
本開示の主題は更に、開示される抗体、例えば、抗ＫＬＢは／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体を使用する方法を提供する。ある実施態様において、本方法は、本開示の抗体の治療的使用を対象とする。ある実施態様において、本方法は、診断方法における開示された抗体の使用を対象とする。
Ａ．診断及び検出方法
ある実施態様において、ＫＬＢに対する特異性を有する本明細書に開示される何れかの抗体、例えば、上記に開示される抗ＫＬＢ抗体及び／又は抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、生物学的試料中においてＫＬＢの存在を検出するために有用であり得る。更なる態様では、本開示の主題は、本明細書に開示される抗ＫＬＢ抗体又は抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を用いて疾患を診断する及び／又は検出するための方法を提供する。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的及び／又は定性的検出を包含する。
ある非限定的な実施態様において、生物学的試料は、限定されないが、臨床試料、一以上の細胞、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物及び組織試料を含む。試料の供給源は、個体からの固形組織（例えば、新鮮な、凍結された、及び／又は保存された臓器、組織試料、生検、又は吸引から）又は細胞であってもよい。ある実施態様において、、生物学的試料は、肝臓から、例えば、被験体の肝臓からの一以上の細胞及び／又は組織を含むことができる。
ある実施態様において、診断又は検出の方法で使用するための抗ＫＬＢ抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＫＬＢの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、診断又は検出の方法は、抗体のＫＬＢへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように、ＫＬＢ上に存在するエピトープに結合する抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗体とＫＬＢとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法、例えば、免疫蛍光又はウェスタンブロットであって良い。ある実施態様において、例えば、ＫＬＢが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＫＬＢ抗体が抗ＫＬＢ抗体による治療にふさわしい被験体を選択するために使用される。
ある実施態様において、本開示の抗体、例えば、開示された方法における使用のための抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、肝臓、例えば、肝機能に有意な影響を及ぼさない。ある実施態様において、ＦＧＦ２１タンパク質による肝臓におけるＦＧＦＲ／ＫＬＢ受容体複合体の調節と比較して、本開示の抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ／ＫＬＢ受容体複合体の活性を調節しない。ある実施態様において、本開示の抗体は、ＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体の阻害をもたらさず、及び／又は、限定されないが、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ及びＧＬＤＨなどの肝酵素の上昇をもたらさない。ある実施態様において、本開示の抗体は、肝臓においてＦＧＦＲ２ｃ／ＫＬＢ複合体及び／又はＦＧＦＲ３ｃ／ＫＬＢ複合体のアゴニストとして機能せず、このことは肝臓において活性化されたＭＡＰＫシグナル伝達及び／又はＳｐｒｙ４及びＤｕｓｐ６の発現の変化につながる可能性がある。ある実施態様において、ＦＧＦ２１タンパク質によるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化と比較して、本開示の抗体は、肝臓におけるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化をもたらさない。ある実施態様において、本開示の抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体のアゴニストとして機能しない。
ある実施態様において、本開示の抗体、例えば開示された方法における使用のための抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦリガンド、例えば、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１のＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体への結合及び／又は相互作用をブロックしない抗体を含む。ある実施態様において、本明細書に開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体活性を調節し、天然のＦＧＦリガンド、例えば、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１のＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対する相互作用及び／又は結合をブロックしない抗体を指す。ある実施態様において、本明細書に開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢの非存在下における天然のＦＧＦリガンドのＦＧＦ受容体に対する結合及び／又は活性をブロックしない抗体を指す。例えば、限定するものではないが、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ１／ＫＬＡ複合体又はＦＧＦＲ１単独との天然のＦＧＦリガンドの相互作用をブロックしない。ある実施態様において、本明細書に開示される抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ１の非存在下における天然のＦＧＦリガンドのＫＬＢに対する結合及び／又は活性をブロックしない抗体を指す。例えば、限定するものではないが、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体、ＦＧＦＲ２ｃ／ＫＬＢ複合体及び／又はＦＧＦＲ３ｃ／ＫＬＢ複合体との天然のＦＧＦリガンドの相互作用をブロックしない。
ある実施態様において、抗ＫＬＢ抗体、抗ＦＧＦＲ１ｃ及び／又は抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ、開示された方法における使用のための二重特異性抗体は標識することができる。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。標識の非限定的な例は、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号を参照）、ルシェフェリン、２，３－ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
Ｂ．治療方法
ある実施態様において、本開示の主題の一以上の抗体は、被験体における疾患及び／又は障害を治療するために使用することができる。例えば、限定するものではないが、疾患は代謝障害であり得る。代謝障害の非限定的な例としては、代謝障害、例えば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含む。ある実施態様において、代謝障害は２型糖尿病である。ある実施態様において、代謝障害は肥満症である。
ある実施態様において、本開示の主題の一以上の抗体は、バルデ－ビードル症候群、プラダー・ウィリー症候群、アルストレーム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルービンスタイン－テービ症候群、脆弱Ｘ症候群及びＢｏｒｊｅｓｏｎ－フォルスマン・リーマン症候群を治療することに使用されることができる。ある実施態様において、本開示の主題の一以上の抗体は、老化及び関連疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳを治療するために使用することができる。
ある実施態様において、本開示の主題の一以上の抗体は、心臓病、脳卒中、心臓発作、高インスリン血症、高血圧、冠動脈疾患、肥満若しくは頭蓋高血圧に直接的に関連する偏頭痛又は頭痛、うっ血性心不全、腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、脂質異常症、貧血症、胆嚢疾患、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、変形性関節症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、椎間板変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｃ）、退行変性関節疾患、関節置換、進行性変性関節疾患、喘息、反復性肺炎、反復性胸膜炎、反復性気管支炎、肺の制限（ｌｕｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、過剰な顔面及び身体の毛（多毛症）、発疹、慢性皮膚感染症、過剰発汗、頻繁な酵母感染、腹圧性尿失禁、月経不順、ホルモン異常、多嚢胞性卵巣、不妊、癌（例えば、乳癌、結腸癌及び子宮癌）、睡眠時無呼吸、偽脳腫瘍、うつ病、心理的／性的機能不全、社会的差別及び早死を処置するために使用されることができる。
ある実施態様において、本開示は治療の方法において使用される抗体を提供する。例えば、限定するものではないが、本開示は、個体に本明細書に開示される抗体の有効量を投与することを含む、代謝障害、例えば、ＰＣＯＳ、ＭｅｔＳ、肥満、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、ＬＡＤ、ＭＯＤＹ、並びに老化及びアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳなどの関連疾患を有する被験体を治療する方法において使用のための抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を提供する。ある実施態様において、本開示は、個体に抗体の有効量を投与することを含む、上述される疾患又は障害を有する被験体を治療する方法において使用のための抗体、例えば抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を提供する。
ある実施態様において、方法は、被験体に少なくとも一の付加的治療剤の有効量を投与することを更に含む。付加的治療剤、例えば、第二治療剤の非限定的な例が以下に記載される。
ある実施態様において、本開示は、本開示の一以上の抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、体重減少を誘導する方法を更に提供する。
本明細書において交換可能に使用される「個体」、「患者」又は「被験体」は哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被験体はヒトである。
本開示の主題は更に、抗体、例えば被験体において、例えばＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃの共受容複合体を活性化することにおいて使用のための抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を提供する。例えば、限定するものではないが、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体であることができる。ある実施態様において、本開示は、抗体、例えば被験体においてＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃの共受容複合体を活性化する方法において使用のための抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を提供する。ある実施態様において、方法は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体を活性化するための抗体の有効量を被験体に投与することを含む。
本開示の抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の抗体は、少なくとも一の付加的治療剤と同時投与することができる。ある実施態様において、第二／付加的治療剤は、抗糖尿病剤、抗肥満剤又は限定されないが、抗高血圧薬及びスタチンなどの代謝状態に対する薬物を含むことができる。第二／付加的治療剤の非限定的な例としては、メトホルミン、ピオグリタゾン、ＤＰＰ４ｉ、ＧＬＰ１アナログ、スルホニルウレア、インスリン、レプチンアナログ及びｌｏｒｃａｓｅｒｉｎ（例えば、ＢＥＬＶＩＱ（登録商標））を含む。
本開示は更に、抗体、例えば、医薬の製造又は調製における抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体の使用を提供する、ある実施態様において、本医薬は上記に開示されるように、代謝障害の治療のためのものである。ある実施態様において、本開示は、肥満の治療のための医薬の製造における抗体の使用を提供する。ある実施態様において、本開示は、２型糖尿病の治療のための医薬の製造における抗体の使用を提供する。ある実施態様において、本方法は、例えば本明細書に記載されるように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。ある実施態様において、医薬はＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ共受容体複合体を活性化するするためのものである。ある実施態様において、医薬は、個体にＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体を活性化するために有効な医薬の量を投与することを含む、個体においてＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ共受容複合体を活性化する方法において使用することができる。
ある実施態様において、開示される治療方法において使用のための抗体は、薬学的組成物中に存在することができる。ある実施態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。ある実施態様において、薬学的組成物は本開示の一以上の抗体を含むことができる
付加的に又は代替的に、薬学的組成物は第二治療剤を含むことができる開示された抗体の一以上が別の治療剤と共に投与される場合、一以上の抗体及び他の治療剤は、順番に又は同時に投与することができる。上述される併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が同一又は別々の製剤中に含まれている場合）及び、本開示の抗体の投与が、付加的治療剤又は薬剤の投与の前に、同時に、及び／又は後に生じ得る、別々の投与を包含する。一実施態様において、本開示の抗体の投与及び付加的治療剤の投与は、互いに、約１ヶ月以内、又は約１、２、又は３週間以内、又は約１、２、３、４、５又は６日以内に生じる。
本開示の抗体（及び任意の付加的治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
本開示の抗体は、良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この場合の考察の因子としては、特定の治療されている障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、作用剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療実践者に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる疾患の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投与量及び投与経路を用いて、又は本明細書に記載の投与量の約１％から９９％までの投与量で、又は、適切であることが経験的／臨床的に決定される任意の投与量及び任意の経路によって使用される。
疾患を予防又は治療するために、本開示の抗体の適切な投与量（単独で、又は１種又は複数種の他の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、以前の療法、患者の臨床的病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の自由裁量に左右される。ある実施態様において、本開示の抗体は、必要に応じて投与することができる。ある実施態様において、抗体は一時的又は一連の治療にわたって患者に投与することができる。例えば、限定するものではないが、本明細書に開示されるように、抗体及び／又は薬学的製剤は、毎日２回、毎日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回又は１年に１回被験体に投与することができる。
ある実施態様において、疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。ある実施態様において、、毎日の投与量は、約１００ｍｇ／ｋｇより大きくすることができる。ある実施態様において、投与量は、１－１０００μｇ／ｍｌ、幾つかの方法では２５－３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整することができる。
病態に応じて数日間又はより長い日数にわたる反復投与について、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されることができよう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ある実施態様において、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が患者に投与されることができる。代替的に、抗体は、より少ない頻度の投与が必要とされる場合、持続放出製剤として投与することができる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に基づいて変化することができる。ある実施態様において、このような投与量は断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が抗体の約２投与量から約２０投与量、又は例えば約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与されても良い。
ある実施態様において、方法は更に、被験体をモニタリングし、治療の有効性を決定することを含むことができる。例えば、この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされうる。
ＩＶ．薬学的製剤
現在開示された主題は、更に、本明細書に記載されるような一以上の抗体を薬学的に許容可能な担体とともに含有する薬学的製剤を提供する。ある実施態様において、薬学的組成物は、現在開示された主題の複数（例えば、二以上）の抗体及び／又はその抗原結合部分の組み合わせを含むことができる。ある実施態様において、本開示の薬学的組成物は、一以上の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を含むことができる。
ある実施態様において、開示された薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。例えば、限定するものではないが、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載される。ある実施態様において、水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。ある実施態様において、抗体は、約８０％を超える、約９０％を超える、約９１％を超える、約９２％を超える、約９３％を超える、約９４％を超える、約９５％を超える、約９６％を超える、約９７％を超える、約９８％を超える、約９９％を超える、約９９．１％を超える、約９９．２％を超える、約９９．３％を超える、約９９．４％を超える、約９９．５％を超える、約９９．６％を超える、約９９．７％を超える、約９９．８％を超える又は約９９．９％を超える純度のものである。
薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含めて、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一以上の付加的なグルコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
担体は静脈内、筋肉内、大脳内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適することができる。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、化合物を不活性化し得る酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆することができる。
本開示の薬学的組成物はまた、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。ある実施態様において、本開示の薬学的組成物は、治療される特定の徴候の必要に応じて、１種より多い活性成分、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含むこともできる。ある実施態様において、薬学的製剤は第一の治療によって治療される同一疾患を治療するための第二の活性成分を含むことができる。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。例えば、限定するものではないが、本開示の製剤は、治療される特定の適応症に必要である場合、１種より多い活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含むこともできる。例えば、更に、同じ疾患の治療のために有用な第二の治療を提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
本開示の組成物は、当該技術で知られている種々の方法で投与することができる。投与の経路及び／又は様式は所望される結果に応じて変化する。活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、急速な放出に対して化合物を保護する担体と共に調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978に記載される。ある実施態様において、薬学的組成物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）適正製造基準（ＧＭＰ）の条件下で製造される。
開示された抗体を含有する徐放性製剤を調製することもできる。徐放性製剤の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。ある実施態様において、活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル、及びポリ－（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に封入され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
投与のある種の経路により、本開示の抗体を投与するため、その不活性化を防止するための物質で化合物をコーティングする、又はその不活性化を防止するための物質と化合物とを一緒に投与する必要があるかもしれない。例えば、化合物は適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤において、被験者に投与されてもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水又は水性緩衝液が含まれる。リポソームは、ｗａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌ－ｉｎ－ｗａｔｅｒ型ＣＧＦエマルジョン並びに通常のリポソームを含む（Strejan et al.. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27）。
薬学的に許容可能な担体は、無菌の水溶液又は分散系及び無菌の注射可能溶液又は分散系の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は当分野で知られている。任意の通常媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である限りを除いて、本開示の薬学的組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた組成物に組み込むことができる。
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で、無菌、実質的に等張性、及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒又は分散媒、及びそれらの適切な混合物とすることができる。適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤を使用することにより、又は分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含有せしめることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
滅菌注射溶液は、一以上の開示された抗体を、上記に列挙した成分の一つ又は組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量で組み込み、必要に応じて、続いて滅菌精密濾過、例えば滅菌濾過膜を介して濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本分散媒及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望成分の粉末を、先に滅菌－濾過されたその溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥である。
治療用組成物はまた、当該分野で周知の医療機器を用いて投与することができる。例えば、本開示の組成物は、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、５，３８３，８５１号、５，３１２，３３５号、５，０６４，４１３号、４，９４１，８８０号、４，７９０，８２４号又は４，５９６，５５６号に開示された装置などの、無針皮下注射器具を用いて投与することができる。本開示において有用なインプラント及びモジュールの例は、制御された速度で薬物を分配するための移植可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬物を投与するための治療装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４４７５１９６である。多くの他のそのようなインプラント、送達系、及びモジュールが知られている。
治療用組成物については、本開示の製剤は、経口、経鼻、局所（頬及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与を含む。製剤は、簡便には単位投薬形態で提供することができ、薬学の分野で知られた任意の方法によって調製されうる。単回投薬形態をつくるために担体物質と組み合わせることができる抗体の量は、治療される被験体と特定の投与形式に応じて変わる。単回投薬形態をつくるために担体物質と組み合わせることができる抗体の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、約０．１パーセントから約７０パーセント、又は約１パーセントから約３０パーセントの範囲である。
本開示の組成物の局所又は経皮投与用の剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性化合物は、薬学的に許容可能な担体、及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤、又は噴射剤と無菌条件下で混合することができる。
「非経口投与」及び「非経口的に投与」なる語句は、経腸及び局所投与以外の投与方式、通常は注射による投与を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれる。
これらの薬学的組成物はまた、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含有することができる。微生物の存在の防止は、上掲の滅菌手段、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の包含の両方によって確実にすることができる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを、組成物に含有せしめることもまた望ましい。加えて、注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることによりもたらすことができる。
ある実施態様において、本開示の抗体は、ヒト及び動物に医薬品として投与される場合、それらは、単独で、又は例えば、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、本明細書に記載される抗体の約０．０１％から約９９．５％（又は約０．１から約９０％）を含有する薬学的組成物として与えられることができる。
Ｖ．製造品
本開示の主題は、更に、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品に関する。
ある実施態様において、製造品は、容器、及び容器上の若しくは容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器の非限定的な例としては、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ輸液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されることができる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容することができ、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。
ある実施態様において、組成物中の少なくとも一の活性剤は本開示の主題の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択される症状の治療のために使用されることを示すことができる。
ある実施態様において、製造品は、（ａ）組成物が本開示の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。ある実施態様において、製造品は、組成物が、特定の病状を治療するのに使用可能であることを示した添付文書を更に含むことができる。
代替的に、又は付加的に、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、限定されないが例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む付加的な容器、例えば第二又は第三の容器を更に含むことができる。製造品には、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含むことができる。
以下の実施例は、本開示の主題の単なる例示であり、決して限定するものとして考えるべきではない。
実施例１：抗ＦＧＦＲ１アゴニスト抗体の特徴付け
３つのファージ由来抗ＦＧＦＲ１抗体、ＹＷ１８２．２（本明細書では「Ｒ１ＭＡｂ１」とも称す）ＹＷ１８２．３（本明細書では「Ｒ１ＭＡｂ２」とも称す）及びＹＷ１８２．５（本明細書では「Ｒ１ＭＡｂ３」とも称す）は以前に記載された（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１５８７０４号）。３つの抗体の各々は、強力なＦＧＦＲ１選択的アゴニストとして作用し、マウスにおいてインスリン感作特性を示した。
更に、このアゴニスト活性を理解するために、ＦＧＦＲ１ｃを刺激するこれらの抗体のＦａｂ断片の能力が試験された。ＨＥＫ２９３細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で培養され、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ウミシイタケルシフェラーゼＦＧＦＲ１ｃ（ｐＲＬ－ＳＶ４０，Ｐｒｏｍｅｇａ）、転写活性化因子（ｐＦＡ２－Ｅｌｋ１又はｐＦＡ２－ＣＲＥＢ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及びＧＡＬ４結合部位によって駆動されるホタルルシフェラーゼレポーターをコードする発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた。翌日、トランスフェクトされた細胞は、無血清培地中で更に６－８時間培養され、ＹＷ１８２．５ ＩｇＧ並びにＹＷ１８２．２、ＹＷ１８２．３及びＹＷ１８２．５の各々が増加する濃度で試験された。細胞のルシフェラーゼ活性は、ＤＵＡＬ－ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて決定された。ホタルルシフェラーゼ活性は共発現ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化された。驚くべきことに、ＹＷ１８２．３ Ｆａｂ又はＹＷ１８２．５Ｆａｂでなく、ＹＷ１８２．２ Ｆａｂはアゴニスト活性を示した（図１Ａ）。
図１Ｂは、ＹＷ１８２．２ Ｆａｂ及びＹＷ１８２．３ＦａｂによるＦＧＦＲ１の活性化の違いの根拠を探求するために実施した競合結合実験を示している。ＹＷ１８２．２は、高い親和性を有するＹＷ１８２．３と比較して、そして、低い親和性の抗ＦＧＦＲ１抗体、ＹＷ１８２．５と比較して更に特徴づけられた。ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３の両方は、ＦＧＦＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合においてＹＷ１８２．５と競合し、３つ全ての抗体がＦＧＦＲ１の重複領域を認識することを示している。しかし、図１Ｂに示すように、ＹＷ１８２．５の相対的親和性は、ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３のそれよりも有意に弱かった（ＩＣ５０＞３０倍）。
図２Ａは、抗ＦＧＦＲ１抗体、ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３のＦＧＦＲ１ｂ及びＦＧＦＲ１ｃに対する結合親和性を示す。抗ＦＧＦＲ１抗体の親和性は、抗ＦＧＦＲ１抗体の親和性の差異が、アゴニスト活性において観察された差異を説明するかどうかを評価するために決定された。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器を用いたＦａｂのＦＧＦＲ１ｂ又はＦＧＦＲ１ｃへの結合親和性は、Liang et al. J. Mol. Biol. 366(3): 815-29 (2007)に記載されるように以下の修飾を加えて行われた。マウス抗ヒトＦｃ抗体は、製造者により記載されている手順に従って、遊離アミノ基との直接結合を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅカルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップ上に最初にコーティングした。次いで、ＹＷ１８２．２又はＹＷ１８２．３はＣＭ５バイオセンサーチップ上に捕捉され、約２００応答単位（ＲＵ）を達成した。結合測定は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ－Ｐ緩衝液）で構成されるランニング緩衝液を用いて行った。ＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質の２倍希釈系列が、ＨＢＳ Ｐ緩衝液中で－５０ｎＭの範囲で、２５℃で３０μＬ／分の流速で注射された。会合速度（Ｋｏｎ、モル／秒あたり）及び解離速度（Ｋｏｆｆ、秒あたり）が、単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算された（ＢＩＡｃｏｒｅ評価用ソフトウェアのバージョン３．２）。平衡解離定数（Ｋｄ、モルあたり）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。図２Ａに示されるように、ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３の親和性は、非常に類似していることが観察され、親和性は、２つの抗体のアゴニスト活性の違いを説明できなかったことを示している。
図２Ｂは、ＦＧＦＲ１と特異的に相互作用するＹＷ１８２．５（Ｒ１ＭＡｂ３）の能力を示す。ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３と同様に、ＹＷ１８２．５は、ＥＬＩＳＡによりＦＧＦＲ１への特異的結合を示した（図２Ｂ）。
図２Ｃは、ＧＡＬ－ＥＬＫ１（ＥＴＳ様転写因子１）に基づくルシフェラーゼアッセイを用いた、Ｌ６細胞における種々のＦＧＦＲに対するＹＷ１８２．５のアゴニスト活性を示す。ルシフェラーゼアッセイのために、ＨＥＫ２９３Ｔ又はラットＬ６細胞は、ＦｕＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＣＭＶプロモーターウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ－ＳＶ４０，Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＧＡＬ－ＥＬＫ１転写活性化因子融合（ｐＦＡ２－ＥＬＫ１，Ａｇｉｌｅｎｔ）、及びＧＡＬ４結合部位によって駆動されるホタルルシフェラーゼレポーター（ｐＦＲ－ｌｕｃ，Ａｇｉｌｅｎｔ）の下で適切な受容体をコードする発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた。翌日、トランスフェクトされた細胞は、様々な濃度で適切なタンパク質リガンドを含む無血清ＤＭＥＭベースの培地中で更に６－８時間培養された。細胞のルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて決定された。ホタルルシフェラーゼ活性は共発現ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化され、平均±ＳＥＭとして示された。ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３と同様に、ＹＷ１８２．５はＬ６細胞におけるＦＧＦＲ１に特異的なアゴニストとして作用した（図２Ｃ）。
ＹＷ１８２．５のアゴニスト活性は、上述されるように、ＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイを用いて、ＨＥＫ２９３細胞において更に試験された。図２Ｄに示すように、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて、ＹＷ１８２．５はまたＦＧＦＲ１ｃに対する特異的アゴニストとして作用した
図２Ｅは、糖尿病マウスモデルにおいて血糖値に対するＹＷ１８２．５の効果を示す。血糖値を決定するために、マウスは、ジャクソン研究所から購入され、固形飼料（ＬＡＢＤＩＥＴ（登録商標）５０１０）及び水を自由に摂取可能な標準的な１２時間明／１２時間暗のサイクル下で２１℃で無菌動物施設内に維持された。Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊバックグラウンドのｄｂ／ｄｂマウスは雌であり、他のマウスは全て雄であった。高脂肪食負荷のために、高脂肪、高炭水化物食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．０３５８４、脂肪から５８．４％のカロリー）を使用した。血清無機リン酸塩及びカルシウムレベルをＣＯＢＡＳＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）４００化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ）によって測定した。血清ＦＧＦ２３レベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ）により決定された。血糖値は、ＣＯＮＴＯＵＲ（登録商標）グルコースメーター（Ｂａｙｅｒ）により決定した。肝臓脂質分析のために、トリグリセリド定量化キット（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用した。血清総コレステロール、トリグリセリド、βヒドロキシ酪酸（Ｔｈｅｒｍｏ ＤＭＡ）及び遊離脂肪酸（Ｒｏｃｈｅ）を比色アッセイによって決定した。ＥＬＩＳＡは、血清インスリンレベル（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）、血清ＦＧＦ２３（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ）、血清マウスＨＭＷアディポネクチン（Ａｌｐｃｏ）及び血清サルＨＭＷアディポネクチン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を決定するために使用した。コルチコステロンは、ラジオイムノアッセイ（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｓｓａｙ ＆Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｅ）によって測定した。注入のため使用される全てのマウスは、７－８ヶ月齢で特定の実験に使用されるＫＬＢ－欠損マウスを除いて、およそ２－４月齢であった。ＹＷ１８２．２とＹＷ１８２．３と同様に、ＹＷ１８２．５は糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスに注射した場合、血糖値を正常化した（図２Ｅ）。
実施例２：抗ＦＧＦＲ１抗体のエピトープマッピング
ＦＧＦＲ１ ＥＣＤはＤ１からＤ３と称され３つのＩｇ様ドメインからなる。図１Ｃに示すように、二つの非重複ペプチド（Ｐ２６：ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）及びＰ２８：ＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）は、ＦＧＦＲ１のＤ２ドメイン内に存在し、以前にＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．３の両方に結合することが同定されました（参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２／１５８７０４号）。
これらのペプチドのどの残基が抗体結合のために最も重要であるかを特定するために、同定されたエピトープ領域内に様々なアラニン置換を有する完全長ＦＧＦＲ１タンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞で発現され、ウエスタンブロットによって抗体結合について試験された。図１Ｄに示すように、Ｋ１７５、Ｋ１７７、Ｙ２０５、Ｒ２０８のアラニン置換は、Ｄ１ドメインに対する抗ＦＧＦＲ１（抗Ｄ１）によって探索される場合発現に影響を与えることなく、ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．５の結合を解消した。ＹＷ１８２．３の結合は、Ｋ１７５、Ｋ１７７、又はＹ２０５の置換によってでなく、Ｒ２０８Ａによって消失した。
インビボでＦＧＦＲ１のアラニン置換変異体を活性化する抗体の能力は、上記のＧＡＬ－ＥＬＫ１アッセイを用いて試験された。活性化が各抗ＦＧＦＲ１抗体へのこれらの変異体の結合特性と良好に相関することが見出された（図１Ｅ）。これらの結果は、Ｄ２ドメイン内のアミノ酸の類似の組が、異なる親和性にもかかわらず、ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．５との結合のために必要とされており、一方同じ領域におけるアミノ酸の別個の組がＹＷ１８２．３結合に重要であることを示唆している。
２：２のＦＧＦＲ ＥＣＤ／ＦＧＦ複合体の結晶構造は以前に記載されている（Plotnikov et al. Cell 98(5): 641-50 (1999)）。２：２のホモ二量体ＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ／ＦＧＦ２の構造において、一方のＤ２ドメインが他方のＤ２ドメインと相互作用しており、各ＦＧＦ２は２つの側からの両方のＤ２ドメインに結合し、Ｄ２二量体を安定化させている（図１Ｆ）。これらの構造では、ＹＷ１８２．２及びＹＷ１８２．５の結合に重要なアラニン置換（Ｋ１７５、Ｋ１７７、Ｙ２０５、及びＲ２０８）は、Ｄ２の二量体の内側に位置している。ＹＷ１８２．２ Ｆａｂはアゴニストとして作用するので、このことは、ＹＷ１８２．２ Ｆａｂは、本質的にＦＧＦリガンドの分子模倣物として作用し、Ｄ２の二量体を安定化するために側方から、同時に２つのＤ２ドメインに結合し得ることを示唆した。アラニン置換分析に基づいて、ＹＷ１８２．５ Ｆａｂは、親和性がＹＷ１８２．２ Ｆａｂよりはるかに低いことを除いて同様に結合する可能性がある。
実施例３：抗ＫＬＢ抗体の単離及び特徴付け
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、安定的にｈＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞で免疫した。脾臓を１２週間後に回収し、ハイブリドーマを生成した。抗ｈＫＬＢ抗体産生ハイブリドーマは、免疫化に使用されるＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳ分析によって同定された。簡潔には、ｈＦＧＦＲ１単独、ｈＫＬＢ単独、又はその両方を発現する２９３細胞を、希釈したハイブリドーマ上清及びＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を用いてＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）中で染色した。同じＦＡＣＳ緩衝液が染色した細胞を洗浄するために使用された。染色された細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＦｌｏｗＪｏ ＦＡＣＳ解析ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）により分析した。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターにクローニングした。全ての組換えモノクローナル抗体分子は、一過性にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生され、通常のカラムクロマトグラフィーを用いて精製された。
抗ＫＬＢの抗体を産生する約２０種類のハイブリドーマが同定された。これらの抗ＫＬＢ抗体のうち１６におけるＣＤＲ軽鎖及び重鎖の配列が表２及び３に示される。８Ｃ５とともにこれらの抗ＫＬＢ抗体のうち１６の軽鎖配列が図３Ａに示される（１１Ｆ１、６Ｄ１２、１１Ｄ４、８Ｅ１、４６Ｃ３、８Ｈ７、２１Ｈ３、２５Ｆ７、１４Ｅ６、１４Ｃ６、２４Ａ１、５Ｆ８、６Ｃ１、１２Ａ１、１２Ｂ８、１４Ｃ１０及び８Ｃ５；それぞれ配列番号１１１－１２７）。
８Ｃ５とともにこれらの抗ＫＬＢ抗体のうち１６の重鎖配列が図３Ｂに示される（１１Ｆ１、６Ｄ１２、１１Ｄ４、８Ｅ１、４６Ｃ３、８Ｈ７、２１Ｈ３、２５Ｆ７、１４Ｅ６、１４Ｃ６、２４Ａ１、５Ｆ８、６Ｃ１、１２Ａ１、１２Ｂ８、１４Ｃ１０及び８Ｃ５；それぞれ配列番号９４－１１０）。
Figure 2022115981000003
Figure 2022115981000004
Figure 2022115981000005
Figure 2022115981000006
１つのファージ由来の抗体（組換えｈＫＬＢ－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたファージパニングによって得られ、Ｐｈ＃５と指定）と共にハイブリドーマ由来抗ＫＬＢ抗体の大部分が、ｈＫＬＢを発現する２９３細胞に対する抗体の結合を測定する０．８μｇ／ｍｌでのＦＡＣＳプロットで観察された中央値シフトに基づいてランク付けされた（図４）。
更に、抗体の一部は、ＥＬＩＳＡによってランク付けされた。これらの実験では、マウス可変領域及びｈＩｇＧ１定常領域を有するキメラ組換えＩｇＧである抗ＫＬＢ抗体が、ｈＫＬＢ－ＥＣＤ－ＨＩＳタンパク質への結合を測定するために使用された。試験した抗体の相対的結合は１４Ｅ６を除いて同様であり、ＦＡＣＳ分析に比べてＥＬＩＳＡ条件下でより良好に結合するように見えた（図５）。
実施例４：抗ＫＬＢ抗体のＫＬＢ結合
様々な抗ＫＬＢ抗体間の競合を試験するために、ＥＬＩＳＡを使用した。幾つかの実施態様において、６Ｄ１２、８Ｃ５、及び１１Ｆ１に対応するハイブリドーマ上清から精製されたＩｇＧ抗体は、ＥＺ－リンクＮＨＳ－ＰＥＯ固相ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン化された。ＫＬＢ－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質ｊへの結合は、様々な濃度のハイブリドーマ由来抗ＫＬＢの存在下で、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いて試験された。幾つかの実施態様において、組換えヒトＩｇＧのＫＬＢ－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質への結合は、様々な濃度のハイブリドーマ由来抗ＫＬＢの存在下で、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を用いて試験された。１１Ｆ１、１１Ｄ４、８Ｅ１及び４６Ｃ３のいずれもが結合について６Ｄ１２と競合しないことが観察された（他は６Ｄ１２に対して試験されなかった）。抗ＫＬＢ抗体１４Ｅ６及び１２Ａ１１は、結合について８Ｃ５と競合するが、１１Ｄ４及び１４Ｃ１０は競合せず（他は８Ｃ５に対して試験されなかった）、１１Ｄ４は、結合について１１Ｆ１と競合するが、６Ｄ１２、８Ｅ１、及び４６Ｃ３は競合しない（他は１１Ｆ１に対して試験されなかった）。
実施例５：抗ＫＬＢ抗体の異種間の交差反応性
開示される抗ＫＬＢ抗体の種交差反応性は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトされたｐＲＫ哺乳動物発現ベクターにクローニングされたマウス、ラット、ウサギ、カニクイザル及びアカゲザルからのＫＬＢ ｃＤＮＡを用いてＦＡＣＳ分析により分析された。発現されたＫＬＢ細胞外ドメインのポリペプチド配列は以下のとおりである：
マウス：
ＦＳＧＤＧＫＡＩＷＤＫＫＱＹＶＳＰＶＮＰＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＳＷＧＶＧＴＧＡＦＱＶＥＧＳＷＫＴＤＧＲＧＰＳＩＷＤＲＹＶＹＳＨＬＲＧＶＮＧＴＤＲＳＴＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＬＡＬＤＦＬＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＮＧＴＶＡＡＶＮＡＱＧＬＲＹＹＲＡＬＬＤＳＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＴＬＱＥＥＹＧＧＷＫＮＡＴＭＩＤＬＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＴＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＦＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＴＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＤＫＮＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＴＤＮＭＥＤＶＩＮＣＱＨＳＭＳＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＦＭＫＴＧＡＭＩＰＥＦＳＥＡＥＫＥＥＶＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＲＰＳＮＴＶＶＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＱＶＬＮＷＩＫＬＥＹＤＤＰＱＩＬＩＳＥＮＧＷＦＴＤＳＹＩＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＮＱＶＬＱＡＩＫＦＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＴＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＴＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＥＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＱＤＮＧＦＰＬＫＥＳＴＰＤＭＫＧＲＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＦＴＶＳＳＰＱＦＴＤＰＨＬＹＶＷＮＶＴＧＮＲＬＬＹＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＳＱＣＴＤＹＶＳＩＫＫＲＶＥＭＬＡＫＭＫＶＴＨＹＱＦＡＬＤＷＴＳＩＬＰＴＧＮＬＳＫＶＮＲＱＶＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＶＦＰＭＶＴＬＹＨＰＴＨＳＨＬＧＬＰＬＰＬＬＳＳＧＧＷＬＮＭＮＴＡＫＡＦＱＤＹＡＥＬＣＦＲＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＭＹＮＲＴＳＮＤＴＹＲＡＡＨＮＬＭＩＡＨＡＱＶＷＨＬＹＤＲＱＹＲＰＶＱＨＧＡＶＳＬＳＬＨＣＤＷＡＥＰＡＮＰＦＶＤＳＨＷＫＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＤＰＬＦＫＴＧＤＹＰＳＶＭＫＥＹＩＡＳＫＮＱＲＧＬＳＳＳＶＬＰＲＦＴＡＫＥＳＲＬＶＫＧＴＶＤＦＹＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＩＨＫＱＬＮＴＮＲＳＶＡＤＲＤＶＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＳＲＬＡＶＴＰＷＧＶＲＫＬＬＡＷＩＲＲＮＹＲＤＲＤＩＹＩＴＡＮＧＩＤＤＬＡＬＥＤＤＱＩＲＫＹＹＬＥＫＹＶＱＥＡＬＫＡＹＬＩＤＫＶＫＩＫＧＹＹＡＦＫＬＴＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＲＡＫＳＳＶＱＦＹＳＫＬＩＳＳＳＧＬＰＡＥＮＲＳＰＡＣＧＱＰＡＥＤＴＤＣＴＩＣＳＦＬＶ（配列番号１５８）。
ラット（＋Ｎ－ｔｅｒ ＦＬＡＧ）：
ＤＹＫＤＤＤＤＫＬＥＦＳＧＤＧＫＡＩＷＤＫＫＱＹＶＳＰＶＮＰＧＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＳＷＧＶＧＴＧＡＦＱＶＥＧＳＷＫＡＤＧＲＧＰＳＩＷＤＲＹＶＤＳＨＬＲＧＶＮＳＴＤＲＳＴＤＳＹＶＦＬＥＫＤＬＬＡＬＤＦＬＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＮＧＴＶＡＡＶＮＡＫＧＬＱＹＹＲＡＬＬＤＳＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＴＬＱＥＥＹＧＧＷＫＮＡＴＭＩＤＬＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＴＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＦＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＴＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＤＫＮＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＴＥＮＭＥＤＶＩＮＣＱＨＳＭＳＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＦＭＫＴＳＳＶＩＰＥＦＳＥＡＥＫＥＥＶＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＲＰＳＮＴＶＶＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＱＶＬＮＷＩＫＬＥＹＤＮＰＲＩＬＩＳＥＮＧＷＦＴＤＳＹＩＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＮＱＶＬＱＡＩＫＦＤＥＩＱＶＦＧＹＴＡＷＴＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＴＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＥＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＱＤＮＧＦＰＬＱＥＳＴＰＤＭＫＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＦＴＶＳＳＰＱＦＴＤＰＨＬＹＶＷＮＶＴＧＮＲＬＬＹＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＳＱＣＴＤＹＶＳＩＫＫＲＶＥＭＬＡＫＭＫＶＴＨＹＱＦＡＬＤＷＴＳＩＬＰＴＧＮＬＳＫＩＮＲＱＶＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＰＭＶＴＬＹＨＰＴＨＳＨＬＧＬＰＭＰＬＬＳＳＧＧＷＬＮＴＮＴＡＫＡＦＱＤＹＡＧＬＣＦＫＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＭＹＮＲＴＳＮＤＴＹＲＡＡＨＮＬＭＩＡＨＡＱＶＷＨＬＹＤＲＱＹＲＰＶＱＨＧＡＶＳＬＳＬＨＳＤＷＡＥＰＡＮＰＹＶＥＳＨＷＫＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＤＰＬＦＫＴＧＤＹＰＬＡＭＫＥＹＩＡＳＫＫＱＲＧＬＳＳＳＶＬＰＲＦＴＬＫＥＳＲＬＶＫＧＴＩＤＦＹＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＩＨＫＱＬＮＴＮＣＳＶＡＤＲＤＶＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＳＲＬＡＶＴＰＷＧＭＲＫＬＬＧＷＩＲＲＮＹＲＤＭＤＩＹＶＴＡＮＧＩＤＤＬＡＬＥＤＤＱＩＲＫＹＹＬＥＫＹＶＱＥＡＬＫＡＹＬＩＤＫＶＫＩＫＧＹＹＡＦＫＬＴＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＶＱＦＹＳＫＬＩＳＳＳＧＦＳＳＥＮＲＳＰＡＣＧＱＰＰＥＤＴＥＣＡＩＣＳＦＬＴ（配列番号１４７）。
ウサギ（＋Ｎ－ｔｅｒ ＦＬＡＧ）：
ＤＹＫＤＤＤＤＫＬＤＦＰＧＤＧＲＡＶＷＳＱＮＰＮＬＳＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＶＧＴＧＡＦＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＬＳＶＷＤＨＦＩＡＴＨＬＮＶＳＳＲＤＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＬＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＴＶＡＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＮＲＬＬＤＳＬＬＬＲＮＩＥＰＶＶＴＬＹＨＷＤＬＰＷＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＥＴＬＩＤＬＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＴＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＬＨＡＰＧＥＫＧＮＶＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＬＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＲＮＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＡＥＳＩＶＤＩＬＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＶＭＴＫＫＬＬＳＶＬＰＡＦＳＥＡＥＫＮＥＶＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＱＶＬＮＷＩＫＬＥＹＧＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＹＶＱＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＮＱＶＬＱＡＩＲＬＤＧＶＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＮＴＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＥＱＲＥＲＲＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＶＩＧＥＮＧＦＴＬＲＥＡＴＰＤＬＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＭＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＩＴＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＦＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＥＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＴＥＧＬＫＬＮＩＳＰＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＡＰＬＬＨＳＧＧＷＬＤＰＳＴＡＫＡＦＲＤＹＡＧＬＣＦＲＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＶＹＮＲＴＳＮＤＴＹＱＡＡＨＮＬＬＩＡＨＡＩＶＷＨＬＹＤＲＱＹＲＰＳＱＲＧＡＬＳＬＳＬＨＳＤＷＡＥＰＡＮＰＹＶＡＳＨＷＱＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＶＡＭＲＥＹＩＡＳＫＴＲＲＧＬＳＳＳＶＬＰＲＦＳＤＡＥＲＲＬＶＫＧＡＡＤＦＹＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＱＮＧＳＲＹＤＳＤＲＤＶＱＦＬＱＤＩＴＲＬＡＳＰＳＲＬＡＶＭＰＷＧＥＧＫＬＬＲＷＭＲＮＮＹＧＤＬＤＶＹＩＴＡＮＧＩＤＤＱＡＬＱＮＤＱＬＲＱＹＹＬＥＫＹＶＱＥＡＬＫＡＹＬＩＤＫＩＫＩＫＧＹＹＡＦＫＬＴＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＬＩＴＳＮＧＦＰＳＥＮＧＧＰＲＣＮＱＴＱＧＮＰＥＣＴＶＣＬＬＬＬ（配列番号１４８）。
カニクイザル（＋Ｎ－ｔｅｒ ＦＬＡＧ）：
ＤＹＫＤＤＤＤＫＬＥＦＳＧＤＧＲＡＶＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＶＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＶＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＮＴＬＬＤＳＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＴＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＬＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＳＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＫＫＫＬＬＳＩＬＰＬＦＳＥＡＥＫＮＥＶＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＨＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＡＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＹＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＧＧＷＬＮＰＳＴＶＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＥＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＭＩＳＳＳＧＦＰＳＥＮＳＳＳＲＣＳＱＴＱＫＮＴＥＣＴＶＣＬＦＬＡ（配列番号１４９）。アカゲザル（＋Ｎ－ｔｅｒ ＦＬＡＧ）：
ＤＹＫＤＤＤＤＫＬＥＦＳＧＤＧＲＡＶＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＶＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＶＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＮＡＬＬＤＳＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＴＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＬＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＫＫＫＬＬＳＩＬＰＬＦＳＥＡＥＫＮＥＶＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＱＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＨＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＡＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＹＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＧＧＷＬＮＰＳＴＶＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＥＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＭＩＳＳＳＧＦＰＳＥＮＳＳＳＲＣＳＱＴＱＫＮＴＥＣＴＶＣＬＦＬＶ（配列番号１５０）。
表４に示すように、大部分の抗体、例えば、６Ｄ１２、１１Ｄ４及び８Ｅ１は、ウサギ、カニクイザル及びアカゲザルからのＫＬＢに結合することが見出され、抗ＫＬＢ抗体の約半分、例えば、８Ｃ５、１４Ｅ６及び１４Ｃ６は、マウス及びラットＫＬＢに結合することが見出された。
Figure 2022115981000007
実施例６：抗ＫＬＢ抗体のエピトープマッピング
抗ＫＬＢ抗体がヒトα－クロトー（ｈＫＬＡ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合しないかどうかを決定するために、以下の配列を有する構築物が使用された：
（Ｃ末端（細胞内）ＦＬＡＧで）発現された予測されるポリペプチド配列：
ＥＰＧＤＧＡＱＴＷＡＲＦＳＲＰＰＡＰＥＡＡＧＬＦＱＧＴＦＰＤＧＦＬＷＡＶＧＳＡＡＹＱＴＥＧＧＷＱＱＨＧＫＧＡＳＩＷＤＴＦＴＨＨＰＬＡＰＰＧＤＳＲＮＡＳＬＰＬＧＡＰＳＰＬＱＰＡＴＧＤＶＡＳＤＳＹＮＮＶＦＲＤＴＥＡＬＲＥＬＧＶＴＨＹＲＦＳＩＳＷＡＲＶＬＰＮＧＳＡＧＶＰＮＲＥＧＬＲＹＹＲＲＬＬＥＲＬＲＥＬＧＶＱＰＶＶＴＬＹＨＷＤＬＰＱＲＬＱＤＡＹＧＧＷＡＮＲＡＬＡＤＨＦＲＤＹＡＥＬＣＦＲＨＦＧＧＱＶＫＹＷＩＴＩＤＮＰＹＶＶＡＷＨＧＹＡＴＧＲＬＡＰＧＩＲＧＳＰＲＬＧＹＬＶＡＨＮＬＬＬＡＨＡＫＶＷＨＬＹＮＴＳＦＲＰＴＱＧＧＱＶＳＩＡＬＳＳＨＷＩＮＰＲＲＭＴＤＨＳＩＫＥＣＱＫＳＬＤＦＶＬＧＷＦＡＫＰＶＦＩＤＧＤＹＰＥＳＭＫＮＮＬＳＳＩＬＰＤＦＴＥＳＥＫＫＦＩＫＧＴＡＤＦＦＡＬＣＦＧＰＴＬＳＦＱＬＬＤＰＨＭＫＦＲＱＬＥＳＰＮＬＲＱＬＬＳＷＩＤＬＥＦＮＨＰＱＩＦＩＶＥＮＧＷＦＶＳＧＴＴＫＲＤＤＡＫＹＭＹＹＬＫＫＦＩＭＥＴＬＫＡＩＫＬＤＧＶＤＶＩＧＹＴＡＷＳＬＭＤＧＦＥＷＨＲＧＹＳＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＬＳＱＤＫＭＬＬＰＫＳＳＡＬＦＹＱＫＬＩＥＫＮＧＦＰＰＬＰＥＮＱＰＬＥＧＴＦＰＣＤＦＡＷＧＶＶＤＮＹＩＱＶＤＴＴＬＳＱＦＴＤＬＮＶＹＬＷＤＶＨＨＳＫＲＬＩＫＶＤＧＶＶＴＫＫＲＫＳＹＣＶＤＦＡＡＩＱＰＱＩＡＬＬＱＥＭＨＶＴＨＦＲＦＳＬＤＷＡＬＩＬＰＬＧＮＱＳＱＶＮＨＴＩＬＱＹＹＲＣＭＡＳＥＬＶＲＶＮＩＴＰＶＶＡＬＷＱＰＭＡＰＮＱＧＬＰＲＬＬＡＲＱＧＡＷＥＮＰＹＴＡＬＡＦＡＥＹＡＲＬＣＦＱＥＬＧＨＨＶＫＬＷＩＴＭＮＥＰＹＴＲＮＭＴＹＳＡＧＨＮＬＬＫＡＨＡＬＡＷＨＶＹＮＥＫＦＲＨＡＱＮＧＫＩＳＩＡＬＱＡＤＷＩＥＰＡＣＰＦＳＱＫＤＫＥＶＡＥＲＶＬＥＦＤＩＧＷＬＡＥＰＩＦＧＳＧＤＹＰＷＶＭＲＤＷＬＮＱＲＮＮＦＬＬＰＹＦＴＥＤＥＫＫＬＩＱＧＴＦＤＦＬＡＬＳＨＹＴＴＩＬＶＤＳＥＫＥＤＰＩＫＹＮＤＹＬＥＶＱＥＭＴＤＩＴＷＬＮＳＰＳＱＶＡＶＶＰＷＧＬＲＫＶＬＮＷＬＫＦＫＹＧＤＬＰＭＹＩＩＳＮＧＩＤＤＧＬＨＡＥＤＤＱＬＲＶＹＹＭＱＮＹＩＮＥＡＬＫＡＨＩＬＤＧＩＮＬＣＧＹＦＡＹＳＦＮＤＲＴＡＰＲＦＧＬＹＲＹＡＡＤＱＦＥＰＫＡＳＭＫＨＹＲＫＩＩＤＳＮＧＦＰＧＰＥＴＬＥＲＦＣＰＥＥＦＴＶＣＴＥＣＳＦＦＨＴＲＫＳＬＬＡＦＩＡＦＬＦＦＡＳＩＩＳＬＳＬＩＦＹＹＳＫＫＧＲＲＳＹＫＬＥＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１５１）。
ＫＬＡとＫＬＢの両方が１つのＮ末端及び１つのＣ末端に２グリコシダーゼ様ドメインを有する。抗ＫＬＢ抗体によって認識されるＫＬＢの領域を同定するために、ｈＫＬＢ、ｈＫＬＡ及びｈＫＬＡのＮ末端グリコシダーゼ様ドメインとｈＫＬＢのＣ末端グリコシダーゼ様ドメインとを含むキメラ構築物がｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａ哺乳動物発現ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ）にクローニングされた。ｈＫＬＡ及びｈＫＬＢのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインは、表５に示すようにそれぞれ、配列番号１５１及び配列番号１４５からの配列に対応する。２つのタンパク質間の配列相同性に基づいて、ｈＫＬＡ及びｈＫＬＢのＮ末端ドメインは、５つのセグメントに分割され、Ｃ末端ドメインは、５つのセグメントに分割された。
Figure 2022115981000008
ＦＡＣＳ分析は、本開示の抗体を用いて実施され、抗体の約半分が、ｈＫＬＢのＮ末端グリコシダーゼ様ドメインを認識するが、一方他のものはＣ末端グリコシダーゼ様ドメインを認識することが観察された（表６）。表６に示すように、ｈＫＬＢのＮ末端ドメインを認識した抗体のうち２つがセグメント１を含むドメインの一部に結合し、他のものは結合のためにセグメント２－５のみを必要とした。
Figure 2022115981000009
実施例７：ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ複合体を特異的に活性化する二重特異性抗体の同定
ＦａｂとしてＦＧＦＲ１を活性化するＲ１ＭＡｂｓの能力に基づいて、より低い親和性のＲ１ＭＡｂのより高い親和性の抗ＫＬＢ抗体への連結を組み込んだ分子が、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を生成するために産生された（図６Ａ；国際公開第２０１２／１５８７０４号）。
特定の理論に縛られることなく、ＦＧＦＲ－特異性の決定基が低親和性相互作用を介してＦＧＦＲに恐らく結合するＮ末端領域に存在する一方で、ＦＧＦ２１媒介性活性化は、Ｃ末端ＫＬＢ－結合テールを通じてＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ複合体へのＦＧＦ２１の動員を介して機能することが提案されている（図６Ｂを参照）（Yie et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)）。したがって、二重特異性抗体のような高親和性抗ＫＬＢ抗体への親和性が低下したＲ１ＭＡｂ１の連結はＫＬＢ－依存ＦＧＦＲ１アゴニストを得る可能性がある。特定の理論に縛られることなく、低親和性を有するＦＧＦＲ１アームを含む抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、ＫＬＢの非存在下でのＦＧＦＲ１への強固な結合及び他のＦＧＦリガンド（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８及びＦＧＦ２３）によるＦＧＦＲ１の結合及び／又は活性化を防止することがもたらす抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体のリスクを軽減することができる。また、低親和性を有するＦＧＦＲ１アームは、臨床的に重大な副作用を生じることなく、限定されないが、抗ＦＧＦＲ１半ノブ抗体、非共有結合性の抗ＦＧＦＲ１二量体、共有結合性抗ＦＧＦＲ１二量体及び高分子量種などの抗ＦＧＦＲ１不純物のより高レベルの存在を可能にすることができる。
本明細書で使用される場合、ｂＦＫＢ１は、一般的に、本明細書に開示される幾つかの抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体の何れかを指す。図面に開示された特定の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体についての詳細については後述する。ＨＥＫ２９３細胞は、抗ＦＧＦＲ１の重鎖及び軽鎖（ＹＷ１８２．２（Ｒ１ＭＡｂ１）及びＹＷ１８２．３（Ｒ１ＭＡｂ２））並びに上述の抗ＫＬＢ抗体をコードする４つの発現ベクターの混合物でコトランスフェクトされた。抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢの重鎖は、ヘテロ二量体ＩｇＧが馴化培地から逐次的親和性精製によって精製することができるように、ＦｌａｇペプチドとＯｃｔヒスチジンでそれぞれタグ付けされた。部分的に精製されたヘテロ二量体ＩｇＧは、次いで、ＫＬＢ依存性アゴニストを同定するためにＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイで分析された。重鎖及び軽鎖の誤対合を最小化するために、抗ＦＧＦＲ１は、ヒトＦａｂ定常領域により発現させ、抗ＫＬＢはマウスのＦａｂ定常領域により発現させた。タグ付き二重特異性ＩｇＧは、最初に、３つの抗Ｒ１ＭＡｂと１８のＫＬＢ Ａｂの２８の組み合わせを使用して粗い形態で試験された（表７）。
図７Ａは、ＧＡＬ－ＥＬＫ１のルシフェラーゼアッセイにおける１８Ｃ５、１２Ａ１１及び１４Ｅ６とのＹＷ１８２．２（Ｒ１ＭＡｂ１）、ＹＷ１８２．３（Ｒ１ＭＡｂ２）及びＹＷ１８２．５（Ｒ１ＭＡｂ３）の特定の二重特異性の組み合わせにおける誘導データを示す。ほとんどの場合、二重特異性抗体は、ＫＬＢでなくＦＧＦＲ１ｃのみを発現した細胞と比較して、ＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬＢを同時発現した細胞において有意に良好にシグナル伝達を活性化することが観察された。
これらの初期の実験におけるこれらの抗体の活性に基づいて、８つの代表的な抗ＫＬＢＡｂ（Ｐｈ＃５、８Ｃ５、１２Ａ１１、１４Ｃ１０、６Ｄ１２、１１Ｄ４、６Ｃ１及び、陰性対照として、１４Ｅ６）が、ＹＷ１８２．５との非タグ化二重特異性抗体を（更なる特徴付けのために前述のノブ－ホール技術を用いて（前掲、及び、例えば、Atwell, et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)）生成するために使用された。図８Ａに示すように、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域（エフェクター機能を有する野生型（１））及びエフェクター機能を排除するＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域（３）又はエフェクター機能を排除するデュアル［Ｄ２６５Ｇ／Ｎ２９７Ｇ］変異（ＤＡＮＧ）を有するマウス定常領域（２）を用いて生成された。
以下の表７は、ノブ・イン・ホール技術を用いて作成された様々な二重特異性抗体を示している。
Figure 2022115981000010
使用されたアイソタイプ対照ＩｇＧは、抗ブタクサ（マウスＩｇＧ２ａ）又は抗ヒトＨＥＲ２トラスツズマブ（ヒトＩｇＧ１）のどちらかであった。Ｆａｂ断片は、大腸菌で発現させ、通常のカラムクロマトグラフィーを用いて精製された。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのヨウ素化ＦＧＦ２１で行われ、社内で非標識ＦＧＦ２１を作成した放射性リガンドの細胞結合アッセイを除いて、組換えＦＧＦ２１は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（２５３９－ＦＧ／ＣＦ）から入手した。（陰性対照を除く）二重特異性の組み合わせのそれぞれは、ＦＧＦＲ１ｃとＫＬＢの両方に依存するシグナル伝達を示した。特定の組み合わせについてのデータが図７Ｂに示される。また、ＹＷ１８２．５（Ｒ１ＭＡｂ３）アームと抗ＫＬＢアームとの組み合わせは、ＫＬＢでなくＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞におけるシグナル伝達より低いバックグラウンドを示した。
図６Ｃに示すように、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体（ＢｓＡｂ１７）の活性は、様々な受容体を発現するＦＧＦＲ１欠損ＨＥＫ２９３細胞において試験された。ＦＧＦＲ１欠損ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９法を用いて生成され。抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体は、組換ｈＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢを発現する細胞において、ルシフェラーゼ活性を誘導することが観察された（図６Ｃ）。
同様の結果が他の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体について観察された。図７Ｃに示すように、ＫＬＢの有無にかかわらずＦＧＦＲ１ｃを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイで試験される場合、ＫＬＢを発現しない細胞でなく、組換えｈＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢを発現する細胞において、抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームの複数の二重特異性抗体の組み合わせ、例えば、ＢｓＡｂ５、６、７、８、９、１０が用量依存的にルシフェラーゼ活性を誘導した。これらの結果は、これらの二重特異性抗体は、ちょうどＦＧＦ２１のように、ＫＬＢ依存性ＥＧＦＲアゴニストとして作用することを示している。
ＦＧＦ２１による抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体（ＢＳＡ１７）の相乗効果も試験された。図９Ｂに示すように、ＦＧＦ２１の濃度が漸増増加し、ＢＳＡ１７の濃度は変化しないままであった場合ＢｓＡｂ１７とＦＧＦ２１との間には相乗効果が認められなかった。
加えて、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体（ＢｓＡｂ１７）の濃度は増分的に増加し、ＦＧＦ２１の濃度は変化しないままであったので、ＢｓＡｂ１７とＦＧＦ２１との間には相乗効果が認められなかった（図９Ｃ）。
ヒト、カニクイザル及びマウスからのＫＬＢ、ヒトのＦＧＦＲ１ｃ、又はｈＦＧＦＲ１ｃとｈＫＬＢの両方を発現するＨＥＫ２９３細胞への（ｈＦＧＦ２１を伴う）２つの二重特異性抗体、ＢｓＡｂ１０とＢｓＡｂ９の溶液結合親和性（Ｋｄ）は放射性標識リガンド結合アッセイにより測定された。放射性リガンド細胞結合アッセイのために、ＫＬＢ及び／又はＦＧＦＲ１ｃを安定的に同時発現するＨＥＫ２９３細胞は、結合緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、０．１％アジ化ナトリウム及び３５０ｍＭのヒトＩｇＧを含むＤＭＥＭ）中０．２ｍＬあたり１００，０００から２００，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに配置された。ヨウ素化ＦＧＦ２１（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）又はヨウ素化ＢｓＡｂの固定濃度及び非標識ＦＧＦ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）又は非標識ＢｓＡｂの段階希釈濃度を含む５０μＬの競合反応混合物が細胞に添加された。細胞を含む競合反応物は室温で２時間インキュベートされた。２時間のインキュベーション後、競合反応物は、ミリポアマルチスクリーンフィルタープレートに移され、結合していないヨウ素化ＦＧＦ２１又は抗体を分離するために、結合緩衝液で４回洗浄された。フィルターをＷａｌｌａｃウィザード１４７０ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でカウントされた。結合データは、MunsonとRodbard（Munson and Rodbard Anal. Biochem.107,220-239 (1980)）のフィッティングアルゴリズムを用いるＮｅｗ Ｌｉｇａｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を用いて評価され、結合親和性を決定した。
表８に示すように、両方の抗体は、ＫＬＢのみを発現する細胞に多少良好な反応性を示したが（以前に観察されたものと一致して交差種のパターンで）、両方ともｈＦＧＦＲ１ｃのみを発現する細胞にはるかに弱く結合し、かつｈＫＬＢとｈＦＧＦＲ１ｃの両方を発現する細胞により強く結合した。
Figure 2022115981000011
図９Ｄは、ＦＡＣＳ分析を使用して２つの対応する抗ＦＧＦＲ１結合アーム（ＹＷ１８２．５）と抗体と比較して、ｈＫＬＢ、ｈＦＧＦＲ１ｃ、又はその両方を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞に対するＢｓＡｂ１０及びＢｓＡｂ９の親和性を示す。同様の結果が上記に示したものに得られた（図９Ｄ）。
更なる実験が、一つの二重特異性抗体、抗ＦＧＦＲ１アームとしてＹＷ１８２．５及び抗ＫＬＢアームとして８Ｃ５を有するＢｓＡｂ１０、並びにＢｓＡｂ１０の誘導体（ＢｓＡｂ１１－２０）を用いて行われた。図６Ｃに示すように、マウスの受容体はＨＥＫ２９３細胞で発現され、ＢｓＡｂ１７は、これらの細胞においてルシフェラーゼ活性を誘導したことが示され、この抗体の種交差反応性を確認した。
ＢｓＡｂ１０は、次に、内因性ＫＬＢとＦＧＦＲを欠くラットＬ６筋芽細胞において試験されたが、ｈＫＬＢと５つのＦＧＦＲアイソフォームのそれぞれを発現するようにトランスフェクトされた（図９Ａ）。ＢｓＡｂ１０は、ＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬＢの両方を発現する細胞においてのみルシフェラーゼ活性を誘導することが見出され、ＢｓＡｂ１０は他のＦＧＦＲとの複合体におけるＫＬＢでなく、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ複合体に対する特異的アゴニストとして作用することを示していた。ＦＧＦ２１及びＦＧＦ１９は、ＦＧＦ２１は、細胞がＫＬＢとＦＧＦＲ１ｃ、２ｃ、又は３ｃの何れか一の組み合わせを発現する場合、ルシフェラーゼ活性を誘導し、ＦＧＦ１９はＫＬＢとＦＧＦＲ４の組み合わせを発現する細胞で活性を誘導したことを実証するための対照として使用された。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのヨウ素化ＦＧＦ２１で行われ、社内で非標識ＦＧＦ２１を作成した放射性リガンドの細胞結合アッセイを除いて、組換えＦＧＦ２１は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（２５３９－ＦＧ／ＣＦ）から入手した。ヒトＦＧＦＲ１ｂ、１ｃ、２ｂ、２ｃ、３ｂ、３ｃ、及び４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡは、ヒトＦＧＦＲ－ヒトＦｃキメラタンパク質又はＨｉｓタグＦＧＦＲタンパク質を生成するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む発現ベクターにクローニングされた。
しかし、上述したように、親抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体、ＢｓＡｂ１０のＲ１ＭＡｂ３（ＹＷ１８２．５）は、驚くべきことに、ＦＧＦＲ１ｂ、ＫＬＢと相互作用しないＦＧＦＲ１のアイソフォームに特異的に結合することができる。また、Ｒ１ＭＡｂ３（ＹＷ１８２．５）は、ＢｓＡｂ１０の活性とは対照的である、Ｌ６細胞においてＧＡＬ－ＥＬＫ１アッセイでＦＧＦＲ１ｂを活性化することができる（図２Ｃ及び図２Ｂを参照）。
更に、ＦＧＦＲ１ｂとＫＬＢの組み合わせＢｓＡｂ１０による活性化をサポートしていなかった（図９Ａ）。特定の理論に縛られることなく、これらのデータは、予め形成されたＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体の存在が、ＢｓＡｂ１０によるＦＧＦＲ１のＫＬＢ依存性活性化のための前提条件であることを示唆している。
実施例８：ＢｓＡｂ１０及びその誘導体は、ＦＧＦ２１の分子模倣物として機能する
ＢｓＡｂ１０及びその誘導体（ＢｓＡｂ１１－２０）並びにＦＧＦ２１の更なる特徴付けは、幾つかの類似点と相違点を明らかにした。ＭＡＰＫシグナル伝達中間体のリン酸化レベルを決定するために、細胞はＦＢＳ、Ｌ－グルタミン及びＧＡ－１０００を含有する前脂肪細胞基本培地－２中で増殖させた。コンフルエント後、（Ｌｏｎｚａから取得した）皮下前脂肪細胞は、デキサメタゾン、インドメタシン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有する増殖培地中で分化させた。遺伝子発現解析のために、細胞を１４日間分化させ、次いで指示されたアゴニストとともに更に４８時間培養した。ＭＡＰＫシグナル伝達解析のために、細胞を１０日間分化させ、３時間無血清培地中で増殖させ、次いで、指示されたアゴニストとともに更なる時間培養した。
図６Ｄに示すように、ＢｓＡｂ１０、ＢｓＡｂ１７、ＢｓＡｂ２０及びＦＧＦ２１は、ウェスタンブロットによって決定される場合、ＦＧＦ２１の抗糖尿病活性に関連する細胞型を表す、初代ヒト脂肪細胞において、このようなＭＥＫ及びＥＲＫなどのＭＡＰＫシグナル伝達中間体のリン酸化を誘導するのに匹敵する活性を示した。ウェスタンブロット分析のために使用される抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐＦＲＳ２ａ （Ｔ１９６）（＃３８６４）、ｐＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／２２１）（＃９１５４）、ｐＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／２０４）（＃４３７０）、ＥＲＫ１／２（＃４６９５）、ＨＳＰ９０（＃４８７４）、β－アクチン（＃５１２５）から、ａｂｃａｍ：ＵＣＰ１（ａｂ１０９８３）から、又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＫＬＢ（ＡＦ２６１９）からのものであった。
図８Ｂに示すように、ｐＥＲＫのレベルの倍率変化として表されたＥＲＫのリン酸化の増加は、ＢｓＡｂ１０、ＢｓＡｂ１７、ＢｓＡｂ２０又はＦＧＦ２１で処置された初代ヒト脂肪細胞において観察された。
また、ＰｓＥｂ１０の親和性プロファイルは、ＦＧＦ２１のそれと似ている。ＦＡＣＳによって試験された場合、ＢｓＡｂ１０は、ＦＧＦＲ１ｃが共発現されたか否かによらず、ｈＫＬＢを発現する細胞へに対して強い結合を示した（図１０Ａ）。やや驚くべきことに、細胞がＫＬＢでなくＦＧＦＲ１ｃを発現した場合に、ＢｓＡｂ１０のほんの少しの結合が観察され、ＹＷ１８２．５アームの一価の親和性が極めて低いことを示していた（図１０Ａ）。
図１０Ｂに示すように、放射性標識リガンドアッセイは、ＦＧＦＲ１ｃとＫＬＢの両方を発現する細胞へのＢｓＡｂ１０の解離定数（Ｋｄ）が２．３ｎＭであり、同様のアッセイ形式でｈＦＧＦ２１について観察された５．３に近いことが示された。これらの値は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１アッセイにおけるこれらの分子の観察されたＥＣ５０に近かった（ＢｓＡｂ１０及びＦＧＦ２１においてそれぞれ３．２ｎＭ及び４．７ｎＭ）。細胞がヒトＫＬＢ単独、又はマウスＫＬＢ単独を発現する場合、Ｋｄはそれぞれ６．６ｎＭ及び１５．５ｎＭであった。
ＦＧＦＲ１への親和性が非常に低いため、放射性標識リガンドアッセイは、ＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に対するＢｓＡｂ１０のＫｄを確実に決定することができなかったが、図３Ｂに示すように、それは、＞３００ｎＭであると推定された。同様の理由により、ＦＧＦＲ１へのＢｓＡｂ１０の結合反応速度もＳＰＲによって確実に決定することができなかった。
更に、ＦＧＦ２１において以前観察されたように、ＦＧＦＲ１ｃ－ＥＣＤとＫＬＢ－ＥＣＤタンパク質間の相互作用はＢｓＡｂ１０によって安定化され、ＢｓＡｂ１０はＦＧＦＲ１ｃ選択的ＦＧＦ－２１模倣物として機能するという考えと一致する（図１１）（Yie et al., Chemical Biology; Drug Design 79, 398-410 (2012)）。ＦＧＦＲ１／ＫＬＢ／ＢｓＡｂ１０相互作用は、２５℃でＰｒｏｔｅｏｎＴＭＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により調べられた。ＦＧＦＲ１－ＨＩＳタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）は、ｐＨ４．５で、製造業者によって記載されるように標準的なアミンカップリング手順を使用して活性化ＰＲＯＴＥＯＮＴＭＧＬＣセンサーチップ上で表面密度（１，０００ＲＵ）にて固定化された。ＢｓＡｂ１０及び／又はＢｓＡｂ１０とＫＬＢ－ＥＣＤの１：１混合物は、０．００５％ｖ／ｖのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、０．３ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、又は２００ｎＭで８０μｌ／分の流速で注入され、会合及び解離相のセンサーグラムが記録された。分析物は３００秒間注入され、６００秒間解離させた。データはスポット間（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔｓ）で参照され、処理され、解離定数は、ＰｒｏｔｅｏｎＴＭ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン３．０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて測定された。ＢｓＡｂ１０によるＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ複合体の活性化は、ＦＧＦＲ１ｃ－ＥＣＤ、ＫＬＢ－ＥＣＤ及びＢｓＡｂ１０による三次元複合体の形成を示唆した。
図１１に示すように、ＢｓＡｂ１０は、組換えＫＬＢ－ＥＣＤとＦＧＦ２１又はＦＧＦ１９との三次元複合体を形成していることが観察された。ＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ／ＦＧＦ相互作用は、２５℃でＯｃｔｅｔ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）機器上でバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）測定により試験された。製造業者によって記載されるように、ＢｓＡｂ１０（２０μｇ／ｍｌ）は、ｐＨ４．５で、活性化アミン反応性バイオセンサーチップ上に固定化された。０．００５％ｖ／ｖのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、０．３ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＫＬＢ－ＥＣＤ（２０μｇ／ｍｌ）は、同じバイオセンサーチップ上に捕捉され、同じ緩衝液中０、０．２、０．８、又は２μＭでのＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定された。定性的データは、データ収集ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて処理された。
図１２Ａは、実施された細胞表面時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ－ＦＲＥＴ）実験の概略図を示す。ＴＲ－ＦＲＥＴのために、ＣＯＳ７細胞はＳＮＡＰタグ付きＦＧＦＲ１及びタグなしＫＬＢを発現するためにコトランスフェクトされ、ウェル当たり１００，０００細胞で白底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種された。トランスフェクトされた細胞は、ドナー結合ベンジルグアニンＳＮＡＰ－Ｌｕｍｉ４－ＴＢ（Ｃｉｓｂｉｏ）の１００ｎＭによりトランスフェクションの２４時間後に標識され、
アクセプター結合ベンジルグアニンＳＮＡＰＡｌｅｘａ６４７（ＮＥＢ）の１μＭにより３７℃、５％ＣＯ２で１時間標識された。３回洗浄した後、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂの発光とＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは、リガンド添加後、Ｔ＝０及びｔ＝１５分でＳａｆｉｒｅ２プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、３４３ｎｍでのレーザー励起後６０μｓ遅れて４００μｓの間、それぞれ６２０ｎｍ及び６６５ｎｍで記録された。Ａｌｅｘａ６４７の発光シグナルは、同じプレートリーダーを用いて６４０ｎｍでの励起後６８２ｎｍで検出された。ＦＲＥＴ強度は次のように計算された：（ＳＮＡＰ－ドナー及びＳＮＡＰアクセプターにより標識された細胞からの６６５ｎｍでのシグナル）－（ＳＮＡＰドナーにより標識され及びＳＮＡＰにより標識されないトランスフェクト細胞の同じバッチからの６６５ｎｍでのシグナル）。
図１２Ｂに示すように、ＴＲ－ＦＲＥＴ実験は、ＫＬＢもまた細胞中に存在する場合、ＢｓＡｂ１７とＦＧＦ２１の両方ともＦＧＦＲ１ｃ－ＥＣＤの二量体化を増強することを示唆した。結果は、ＦＲＥＴ比：６２０ｎｍでのドナー発光で割ったＦＲＥＴ強度として示された。
更に、ＢｓＡｂ１０はＫＬＢ－ＥＣＤのＣ末端半分に結合するが、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ１９は、Ｎ末端半分でＫＬＢ上の同じ部位に結合すると考えられており（Goetz et al. Mol. Cell. Biol. 32(10): 1944-54 (2012); Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)）、このことはＫＬＢ上のＢｓＡｂ１０のエピトープは、ＦＧＦ２１とＦＧＦ１９の結合部位とは異なるものでなければならないことを示唆している。ＢｓＡｂ１０のためのＫＬＢエピトープをマッピングするために、一連のキメラ抗原に対する８Ｃ５（ＢｓＡｂ１０のＫＬＢ結合アーム）の結合がＨＥＫ２９３細胞で発現された。各キメラは、ヒトＫＬＢとヒトクロトーアルファ（ＫＬＡ）タンパク質（ヒトＫＬＢタンパク質に対して５０％の同一性）又はウサギＫＬＢ（ヒトＫＬＢに対して８６％同一性）を融合することによって構築された。図１３Ａにまとめたように、８Ｃ５はＫＬＢのＣ末端ドメイン、特にＫＬＢのＣ末端ドメインに３４個のアミノ酸を含む領域において結合する（ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ；配列番号１４２）。
図１３Ｂに示すように、配列番号１４２のアミノ酸配列は、例えば配列番号１５７に記載の配列を有する５２アミノ酸配列などのシグナル配列を含むＫＬＢタンパク質のアミノ酸８５７－８９０に対応することができ、又はシグナル配列を含まないＫＬＢタンパク質のアミノ酸８０５－８３８を参照することができる。
下流の作用におけるＦＧＦ２１とＢｓＡｂ１０及びその誘導体との間の類似性にもかかわらず、ＫＬＢ上のＢｓＡｂ１０のエピトープは、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ１９結合部位とは異なる（図１４Ａ）。
図１４Ｂは、ＦＧＦＲ４とＫＬＢでコトランスフェクトされ、ＦＧＦ１９単独又は抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体（ＢｓＡｂ１７）と組み合わせて処置されたラットＬ６筋芽細胞で行われたＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図１４Ｂに示すように、ＢｓＡｂ１７の前処理はまた、ＦＧＦＲ４／ＫＬＢの複合体を発現するＬ６細胞においてＦＧＦ１９活性をブロックしなかった。
更に、かつ図１４Ｃに示すように、ＢｓＡｂ１７の前処理はまた、ＦＧＦＲ４及びＫＬＢを発現するＨ４ＩＩＥヘパトーマ細胞においてＦＧＦ１９活性をブロックしなかった。ＢｓＡｂ１７の存在下で、ＦＧＦ１９はＥＲＫのリン酸化を誘導するためにＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体を更に活性化することができた（図１４Ｃ）。これらのデータは、開示された抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃの二重特異性抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体とのＦＧＦ１９又はＦＧＦ２１の相互作用を妨害しないことを示している。
実施例９：ＢｓＡｂ１０及びその誘導体は、インビボでの長時間作用型ＦＧＦ２１模倣物として機能する
上記のように、マウス受容体複合体とＢｓＡｂ１０及びその誘導体の交差反応性（例えば、図６Ｃ及び図１０Ｂを参照）は、マウスモデルにおけるそのインビボ活性の試験を可能にした。ＩｇＧのエフェクター機能の潜在的な毒性を回避するために、デュアル変異［Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇ］がＢｓＡｂ２０に対してそのＦｃ領域において導入され、ＦｃｇＲｓへの結合及び免疫エフェクター細胞の動員を消失させた。更に、ＩｇＧのエフェクター機能の潜在的な毒性を回避するために、Ｎ２９７ＧがＢｓＡｂ１７に対してそのＦｃ領域において導入され、ＦｃｇＲｓへの結合及び免疫エフェクター細胞の動員を消失させた。
図１５Ａに示すように、５ｍｇ／ｋｇで糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスに腹腔内注入される場合、ＢｓＡｂ１７は、食物摂取又は体重に影響を与えることなく、同程度に血糖値を減少させた。ＢｓＡｂ１７で処置された痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスは、血糖値の減少を示したが、毒性低血糖に達しなかった（図１５Ａ）。
更に、高脂肪食給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（食餌誘発性肥満、ＤＩＯ）に０日目と６日目に３ｍｇ／ｋｇでＢｓＡｂ１７を注入されると、体重減少及び血糖の有意な減少が認められた（図１５Ｂ）。高脂肪食負荷のために、高脂肪、高炭水化物食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．０３５８４、脂肪から５８．４％のカロリー）を使用した。
図１５Ｃに示すように、耐糖能の改善は３ｍｇ／ｋｇでＢｓＡｂ１７を注入した高脂肪食給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（食餌誘発性肥満、ＤＩＯ）で観察された。
肝臓のトリグリセリド、血清インスリン、遊離脂肪酸、トリグリセリド及び総コレステロールの減少はまた、３ｍｇ／ｋｇでＢｓＡｂ１７を注入した高脂肪食給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（食餌誘発性肥満、ＤＩＯ）で観察された（図１５Ｄ）。同様の結果は、以前にＦＧＦ２１注入で観察された。
別の実験が、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体による処置の際に観察された耐糖能の改善が機能性ＫＬＢを必要とするかどうかを判断するために、ｋｌｂヘテロ接合マウスとホモ接合ｋｌｂ欠損マウスで行われた。ｋｌｂ欠損（ＫＯ）マウスを生成するために、Ｋｌｂ特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のペアをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、確立された方法に従って、前核マイクロインジェクションに使用した。ＺＦＮのペアはマウスゲノムにおいて次のＫＬＢの配列（小文字の切断部位）を標的にし、ＫＯマウスは、フレームシフトを引き起こす１つのｂｐ欠失（太字のｇ）を欠いている：ＧＴＴＡＣＣＧＧＣＴＴＣｔｃｃｇｇａＧＡＣＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧ（配列番号１５６）。図１６Ａは、マウスＫＬＢタンパク質のＮ末端アミノ酸配列及びｋｌｂ欠損マウスにおいてＫｌｂ対立遺伝子によってコードされる対応するアミノ酸配列を示す。
図１６Ｂは、ｋｌｂ欠損マウスにおいてＫＬＢタンパク質の発現の欠如を確認したウェスタンブロットの結果を示す。
図１６Ｃに示すように、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）によって測定される場合、ＢｓＡｂ２０はホモ接合ｋｌｂ欠損マウスでなくｋｌｂヘテロ接合体マウスにおいて耐糖能を改善し、耐糖能の改善が機能性ＫＬＢを必要とすることを示している。耐糖能試験（ＧＴＴ）のために、マウスを一晩絶食させ、腹腔内に２ｇ／ｋｇのグルコース溶液を注入した。
また、血清ＦＧＦ２３及びリンのレベルを変化させる抗ＦＧＦＲ１ Ｒ１ＭＡｂ１とは異なり（Wu et al., Sci Transl Med 3, 113ra126 (2011)及びWu et al., PLoS One 8, e57322 (2013)）、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、これらの血清パラメータに影響を及ぼさず、ＫＬＢ非依存性ＦＧＦＲ１アゴニスト活性がなかったことを示している。
図１７に示すように、ＢｓＡｂ１７はＫＬＢ非依存性ＦＧＦＲ１の高感度マーカーである血清ＦＧＦ２３又はリンレベルを変化させなかった。ＢｓＡｂ１７処置マウスにおけるインスリンの作用は、高インスリン正常血糖クランプにより測定された。簡単には、マウスはイソフルランによりで麻酔し、左総頸動脈及び右頸静脈にそれぞれ、サンプリング及び注入のためのカテーテルが挿入された。カテーテルの自由端は、カテーテルの緩い端部がＭＩＣＲＯ－ＲＥＮＡＴＨＡＮＥ（登録商標）製のチューブに結合された首の後ろに皮膚下でトンネルされた（ＯＤで０．０３３）。動物は手術後に個別に収容され、体重が毎日記録された。全ての代謝実験は、５日間の術後の回復期間の後に行い、以前に記載されている。意識があり拘束されていないマウスは寝具を敷いた１－Ｌのプラスチック容器に入れられ、午前７時に絶食された（ｔ＝－３００分）。マウスは、同時頚静脈輸液と動脈血のサンプリングを可能にするために、ただにデュアルチャネルステンレス鋼スイベル（Ｉｎｓｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に接続された。マウスは管理されず、ストレスを除くために自由に移動させた。クランプの開始２時間前に［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコースの５μＣｉのボーラスが頸静脈に与えられ（ｔ＝－１２０分）、０．０５μＣｉ／分の速度で一定の注入が続いた。２時間の平衡期間の後のＴ＝０分で（すなわち、５時間絶食）、ベースラインの動脈血試料が、血糖、［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコース、ヘマトクリット、血漿インスリンの測定のために採取された。１４５分の高インスリン正常血糖（４ｍＵ／ｋｇ／分）クランプが次に開始された。［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコースが正常血糖を維持するために使用される可変グルコース注入に添加され、一定のレベルで動脈グルコース特異的活性をクランプするように［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコースの一定注入は中止された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドのドナーマウスからの赤血球細胞は洗浄され、０．９％ヘパリン化生理食塩水（ヘマトクリット～５０％）の等量中で再構成され、研究の間に除去される血液を交換するため試験期間に４μＬ／分の速度で注入された。動脈血試料が血糖値を決定するために１０分毎に採取された。ｔ＝８０、９０、１００及び１２０分に、血液試料を［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコースを決定するために採取した。ｔ＝１２０分に、２－デオキシ［１４Ｃ］グルコース（［２－１４Ｃ］ＤＧ）の１３μＣｉのボーラスが、頚静脈カテーテル内に投与された。ｔ＝１２２、１２５、１３０、１３５、及び１４５分に、動脈血が、血糖、血漿［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコース及び［２－１４Ｃ］ＤＧを決定するためにサンプリングされた。動脈のインスリン濃度は、１００及び１２０分で測定された。次いで、ｔ＝１４５分で、マウスは麻酔された。ヒラメ筋、腓腹筋、白浅外側広筋（Ｑｕａｄ）は、肝臓、心臓、精巣上体及び皮下白色脂肪組織、褐色脂肪組織及び脳が切除され、直ちに液体窒素中で凍結され、将来の組織分析まで－７０℃で保存された。免疫反応性インスリンは、リンコラットラジオイムノアッセイキット（ＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してアッセイされた。
［３－３Ｈ］－Ｄ－グルコースを測定するために、血漿試料は、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）、硫酸亜鉛（のＺｎＳＯ４）により除タンパクされ、乾燥し、放射能が液体シンチレーション計数を用いて決定された。切除した組織は、過塩素酸で除タンパクした後、ｐＨが～７．５に中和された。試料の一部がカウントされた（［２－１４Ｃ］ＤＧ及び［２－１４Ｃ］ＤＧ－Ｇリン酸（［２－１４Ｃ］ＤＧＰ）及び一部分はＢａ（ＯＨ）２及びＺｎＳＯ４により処置され、上清がカウントされた（［２－１４Ｃ］ＤＧ）。［２－１４Ｃ］ＤＧ及び［２－１４Ｃ］ＤＧ－リン酸（［２－１４Ｃ］ＤＧＰ）放射能レベルは、液体シンチレーション計数を使用して決定された。グルコース流動速度は分布容積（１３０ｍｌ／ｋｇ）を想定し、非定常状態方程式を用いて評価された。［２－１４Ｃ］ＤＧの組織特異的クリアランス（Ｋｇ）及びグルコース取り込みの指標（Ｒｇ）は前述のように計算され（Kraegen, E.W. et al., Am. J. Physiol. 248, E353-362 (1985)）：Ｋｇ＝［２－１４Ｃ］ＤＧＰ組織／ＡＵＣ［２－１４Ｃ］ＤＧ血漿、Ｒｇ＝Ｋｇｘ［グルコース］血漿、ここで［２－１４Ｃ］ＤＧＰ組織は、組織中の［２－１４Ｃ］ＤＧＰ放射能（ｄｐｍ／ｇ）であり、ＡＵＣ［２－１４Ｃ］ＤＧ血漿は、血漿［２－１４Ｃ］ＤＧ消失曲線（ｄｐｍ／ｍＬ／分）下の面積であり、及び［グルコース］血漿は、実験期間（ｔ＝１０２～１２５分）の間の平均血糖（μｇ／μｌ）である。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７の単回注入後に測定された全身のグルコース利用を示した図１５に示すように、インスリン刺激性全身グルコース利用の速度を向上させた。
また、図１５Ｆに示すように、ＢｓＡｂ１７は、１０ｍｇ／ｋｇでのＢｓＡｂ１７の単回注射後の内因性グルコース生産速度のインスリン抑制を改善させた。これらの結果は、クランプの５日前のＤＩＯマウスにおけるＢｓＡｂ１７の１０ｍｇ／ｋｇの単回注射が、絶食させたグルコース及びインスリン濃度を有意に低下させたことを示している。
インスリン刺激期間終了時の組織のグルコース取り込み（Ｒｇ）は、心臓、骨格筋、白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び肩甲骨間ＢＡＴ組織（ｉＢＡＴ）において拡張され、ＢｓＡｂ１７による全身インスリン感作を示している（図１５Ｇ）。
動脈血糖可動域の量は、クランプ実験中に測定された。図１８Ａに示すように、動脈血糖可動域の量は、高インスリン正常血糖クランプ実験中に、ＢｓＡｂ１７を注入したマウスと対照ＩｇＧを注入したマウスとの間で異なっていた。
ＢｓＡｂ１７を注入したマウスと対照ＩｇＧを注入したマウスのと間の重量差も測定された。図１８Ｂに示すように、グルコース及びインスリン濃度で観察された変化は、体重の明らかな減少は無かった。
定常状態のグルコース注入速度はまた、ＢｓＡｂ１７を注入後に分析された。図１８Ｃに示すように、定常状態のグルコース注入速度は、ＢｓＡｂ１７注射後６４％増加した。これらの結果は、ＢｓＡｂ１７は、体重減少が明らかになる前であってもＤＩＯマウスにおける全身のインスリン感受性を改善したことを実証している。
ＦＧＦ１９又はＦＧＦ２１の薬理学的用量を用いたこれまでの研究では、，；エネルギー消費（ＥＥ）の増加を示しており（Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013); Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013)）、従って同様の効果が観察されるであろうと推論された。以下の式は、ＥＥ及び呼吸商（ＲＱ）を計算するために使用された。ＥＥ＝ＶＯ２Ｘ（３．８１５＋１．２３２×ＲＱ）、式中（ＲＱ＝ＶＣＯ２／ＶＯ２）。実際、通常の室温（２１℃）でのＤＩＯ又は痩せたマウスへの単回ＢｓＡｂ１７注入は、活動計数（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｎｔ）における有意な変化を伴うことなく、注入された動物あたりのＯ２消費量（ＶＯ２）、ＣＯ２生産（ＶＣＯ２）、及びＥＥの有意な増加につながった（図１９Ａ）。意外にも、ＥＥで観察された１５－４６％の増加は、呼吸商（ＲＱ＝ＶＣＯ２／ＶＯ２）の有意な変更を伴わなかった（図１９Ａ）。
ＲＱにおける変化なしにＥＥにおける同様の増加がＦＧＦ２１をＤＩＯマウスに継続的に注入することによって誘発された（図２１Ｃ）。
図２０Ａは、通常の室温において単回ＢｓＡｂ１７注入により処置されたＤＩＯマウスのＶＯ２、ＶＣＯ２及び総活動計数を示す。
図１９Ｂに示すように、ケージ温度を熱中性に上昇させたときに（２９－３０℃）、ＥＥの増加は維持されており、褐色脂肪活性化のＢｓＡｂ１７－誘導が交感神経系からの適応熱発生インプットに依存しないことを示唆している。
図２０Ｂは、通常の室温において単回ＢｓＡｂ１７注入により処置され、続いて熱中性へ温度をシフトさせたＤＩＯマウスのＶＯ２、ＶＣＯ２及び総活動計数を示す。
熱中性室温（２９－３０℃）で順応させたＤＩＯマウスが２週間試験されたとき、ＥＥの増加も明らかであった（図２１Ｂ）。
平均ＥＥ値を示す図２１にまとめたように、ＥＥの変化は、通常の室温で痩せた及びＤＩＯマウスにおいて及び熱中性室温で順応させた痩せた及びＤＩＯマウスにおいて観察された。
対照的に、β３特異的アドレナリン受容体アゴニストＣＬ－３１６２４３による連続的な注入は、予想通り、ＥＥの急激な増加とＲＱの減少を誘導した（図１９Ｈ）。ＦＧＦ２１又はＣＬ－３１６，２４３の連続注入を皮下移植した浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ ２００１）を用いて行われた。したがって、ＢｓＡｂ１７－及びＦＧＦ２１誘導性のＥＥは堅牢であるが、脂質酸化の促進及びＲＱの減少を伴う交感神経様作用薬（ノルエピネフリン又はβ３特異的アドレナリン受容体アゴニストＣＬ－３１６２４３）、心臓ナトリウム利尿ペプチド、又はインターロイキン４の投与など他の先に記載されたＢＡＴ活性化機構よりもより選択的であるように見える（Gerhart-Hines et al., Mol. Cell 44, 851-863 (2011); Mattsson et al., American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 299, E374-383 (2010); Nguyen et al., Nature 480, 104-108 (2011); Birkenfeld et al. Diabetes 57, 3199-3204 (2008); Bordicchia et al., J. Clin. Invest. 122, 1022-1036 (2012)；及びde Souzaet al., Diabetes 46, 1257-1263 (1997)）。
特定の理論に縛られることなく、幾つかの証拠は、ＢｓＡｂ１７の代謝作用におけるＢＡＴ活性化の支配的な役割を示唆した。まず、図１９Ｃに示されるように、ＢｓＡｂ１７の注入は、特にｉＢＡＴへの１８Ｆ－フルデオキシグルコース（ＦＤＧ）の取り込みを増加させた。
第二に、単回ＢｓＡｂ１７注入は、脂肪組織褐変の指標である、鼠径部ＷＡＴ（ｉｎｇＷＡＴ）におけるＵＣＰ１タンパク質の発現を誘導した（図１９Ｄ）。
図１９Ｅに示すように、ＵＣＰ１発現の誘導はまた、ＦＧＦ２１又はＢｓＡｂ１７により処置された培養初代脂肪細胞で観察され、成熟脂肪細胞に対する直接作用を示している。ＵＣＰ１の発現を決定するために、全ＲＮＡがＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（ＡＢＩ）を用いてｃＤＮＡを合成するために使用された。定量ＰＣＲのために、試料はＶＩＩＡ７リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で三通り行われた。使用されたアプライドバイオシステムズが予め設計したＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイプローブは、ＵＣＰ１（Ｈｓ０１０２７７８５＿ｍ１）であった。各試料について、ｍＲＮＡ量はＴＢＰ（Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１）とＳＤＨＡ（Ｈｓ００１８８１６６＿ｍ１）転写物の量に対して正規化された。
第三に、遠隔測定システムを使用して、安静時の中核体温の上昇が、単回ＢｓＡｂ１７注入後に観察され、ベースラインに徐々に戻る前に≧２６日間続いた（図１９Ｆ）。
図２２は、対照ＩｇＧで処置したマウスと比較して、単回ＢｓＡｂ１７注入後のマウスにおいて観察された中核体温の違いを示している。中核体温は、外科的に腹腔内に移植したＴＡ－Ｆ１０トランスミッタ（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＤＳＩ）を使用してをモニタリングされた。手術から回復した後、マウスは、体重及び中核体温に基づいてグループに無作為化された。中核体温と活動性は、ＤＳＩ植込み型遠隔測定システムを用いてモニタリングされた。
遺伝子発現プロファイルは、ＢｓＡｂ１７、ＦＧＦ２１又は対照ＩｇＧの単回注入を受けたＤＩＯのいＢＡＴマウスにおいて分析された。図１９Ｇに示すように、単回ＢｓＡｂ１７注入はＦＧＦ２１による１日２回の注入に類似するｉＢＡＴにおける遺伝子発現の変化を誘導した。
最後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した場合、ＦＧＦ２１とＢｓＡｂ１７の両方が、ｉＢＡＴとｉｎｇＷＡＴを含む、様々な脂肪組織中においてＥＲＫ及びＭＥＫのリン酸化を誘導した（図２３）。
以前の研究では、アディポネクチンは、ＦＧＦ２１の完全な作用に寄与することが示唆された（Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17, 790-797 (2013)）。実際に、ＤＩＯマウスへのＢｓＡｂ１７の単回注射は、関連する体重減少を伴い、血清の高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンのレベルの増加をもたらした（図２４Ａ）。
同様に、痩せたカニクイザルへのＢｓＡｂ１７の単回注射は（図２４Ｂ）、関連する体重減少を伴い、血清の高分子量（ＨＭＷ）アディポネクチンのレベルの増加をもたらした。
図２４Ｃに示すように、ＢｓＡｂ１７の単回注射の際に、ＨＦＤのアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｑ）ＫＯマウスは、ＥＥの上昇において強い反応を示した（２５．３％の増加対ｗｔマウスにおける２０．９％の増加）。
加えて、ＢｓＡｂ１７の単回注射の際に、ＨＦＤのアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｑ）ＫＯマウスは、体重及び肝臓のトリグリセリドレベルの減少を示した（図２４Ｄ）。しかし、耐糖能応答、インスリン耐性、血清インスリン及び様々な脂質の変化はＫＯマウスにおいて全て幾分平滑化され（図２４Ｄ）、ＢｓＡｂ１７は、アディポネクチンの機能を介して、部分的には全身の栄養代謝の調節におけるＦＧＦ２１模倣物として作用するという考えと一致している。インスリン耐性を決定するために、マウスを４時間絶食させ、１Ｕ／ｋｇのヒトインスリン溶液（Ｈｕｍｕｌｉｎ Ｒ， Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を腹腔内注入した。
ＢｓＡｂ１７の増加した受容体選択性（図９Ａを参照）及び以前に記載されたＩｇＧ分子の低い脳の浸透度（Yu et al., Sci Transl Med 3, 84ra44 (2011)）は、ＦＧＦ２１／１９と比較してＢｓＡｂ１７及びその誘導体の改変された安全性プロファイルを予測する。肝臓におけるＦＧＦＲ１の低発現レベルと一致して、ＢｓＡｂ１７でなくＦＧＦ２１は、肝臓における、古典的なＦＧＦＲ標的遺伝子Ｓｐｒｙ４とＤＵＳＰ６のｍＲＮＡ発現を誘導した。
ＢｓＡｂ１７又はＢｓＡｂ２０はまた、肝臓においてでなく、種々の脂肪組織及び膵臓腺房細胞において増加したリン酸化ＥＲＫシグナルを生じた（図２３）。
図２６は、ＢｓＡｂ１７はまた、免疫組織化学によって決定される場合、脳室周囲器官を含む様々な脳切片においてＥＲＫのリン酸化を増加させないことを示している。
加えて、ＦＧＦ１９様活性に対して期待されたものとは反対に、８週間にわたるＤＩＯマウスの慢性的ＢｓＡｂ２０処置は、痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスのレベルに対して肝臓におけるＢｒｄＵ＋細胞の数を減少させた（図２７）。肝臓のＢｒｄＵの取り込みのために、マウスは、安楽死２時間前に１００ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内注入された。記載されるように抗ＢｒｄＵ染色が実施され（Nicholes, K., et al. Am. J. Pathol. 160, 2295-2307 (2002)）、ＢｒｄＵ陽性肝細胞はＡｒｉｏｌ自動画像解析システムを用いてカウントされた。
抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ抗体で処置したマウスの骨の分析が実施された。図２８Ａは、分析の概略図を示す。骨分析を実行するために、大腿骨試料は、７０ｋｅＶ及び１１４マイクロアンペアの電流のＸ線管エネルギーレベルで動作するＳＣＡＮＣＯ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）μＣＴ４０マイクロ撮像システムによって撮像された。隣接する軸方向画像スライスは、１２μｍの等方性ボクセルサイズにより得られた。大腿骨内の海綿骨の形態計測分析は、Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）μＣＴ４０評価ソフトウェアを用いて行われた。半自動化された輪郭削りは、近位大腿骨成長板の背側に二次海綿骨を含み、一次海綿骨の遠位側に１．５ｍｍ伸長した目的の体積（ＶＯＩ）を定義するために使用された。皮質骨は皮質骨の内側の境界内のＶＯＩの境界の配置によって除外された。画像分割、束縛３次元（３Ｄ）ガウシアンローパスフィルターが、ノイズ抑制ために画像データに適用された（フィルターシグマ＝０．５、フィルターサポート＝１）。グローバルな閾値（０．３６ｇＨＡ／ｃｍ３）がＶＯＩからの「２値化」小柱（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）構造を抽出するために適用された。小柱の分割閾値は、試料の代表的なサブセットからの分割結果の目視検査により選択された。小柱の構造的特徴は、直接３Ｄ形態計測分析によって定量化された。これまでの研究では、マイクロコンピュータトモグラフィによる海綿骨の形態計測分析は、組織形態計測によって行われた同様の推定値と十分に相関していることを示している。
図２８Ｂに示すように、６週間のＤＩＯマウスの慢性的なＢｓＡｂ２０処置は、マイクロコンピュータートモグラフィに基づいた脛骨小柱内及び大腿皮質骨の様々な骨パラメーターの任意の負のシグナル無しに代謝パラメーターの予想される変化をもたらした。
図２９に示すように、ＤＩＯマウスへのＢｓＡｂ１７の注入は対照を超えて血清コルチコステロンレベルを増加させなかった。現代社会において一般的な慢性的な正のエネルギーバランスは、肥満の蔓延とインスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高脂血症、及び肝脂肪症により特徴づけられる関連する代謝異常を駆動させており、これらは、多くの場合、２型糖尿病、肝硬変、脳卒中及び心臓病などの深刻な病気につながる。２００９年には、成人におけるＵＣＰ１陽性ＢＡＴの存在と熱放散を介してＥＥを駆動する上でのそれらの機能的重要性が報告され、肥満症及び関連する代謝性疾患の治療ためのＢＡＴの治療的誘導及び活性化に大きな関心を寄せている（Yoneshiro and Saito, Ann. Med., 1-9 (2014)）。
しかし、ほとんどの既知のＢＡＴ活性化のメカニズムはまた、心血管転帰に影響を及ぼす可能性がある、白色脂肪組織の脂肪分解を誘導する（Dong et al., Cell Metab. 18, 118-129 (2013)）。注目すべきは、ＢＡＴの移植は、ＥＥを増加させ、ＲＱを変更することなく体重減少を誘導する（Stanford et al., J. Clin. Invest. 123, 215-223 (2013)）。この点において、ＦＧＦ２１及び本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ１／ＫＬＢアゴニスト抗体は、ＲＱを変えることなくＢＡＴにおいて熱反応を選択的に誘導し、従って非特異的な交感神経の活性化よりもむしろＢＡＴ移植を模倣するユニークなアプローチを提示する。加えて、マウスで観察されたものに基づいて、ＦＧＦ２１又はＦＧＦ１９類似体による広範なＦＧＦＲ／ＫＬＢ複合体活性化とは対照的に、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ複合体の抗体媒介性活性化は、抗肥満及び抗糖尿病治療のためにより安全でより効率的な方法を提供し得ることが想定される。
実施例１０：抗ＫＬＨ抗体８Ｃ５のヒト化
８Ｃ５のマウス軽鎖ＣＤＲがヒトＫａｐｐａ２及びＫａｐｐａ４軽鎖フレームワークに移植された。ヒトＫａｐｐａ２及びＫａｐｐａ４軽鎖フレームワークに移植された。一次移植に加えて、軽鎖の位置４がロイシンに変換されるように（「Ｍ４Ｌ」と命名）点変異もまたそれぞれで生成された。分析は、最高に発現されかつ有意な凝集を示さなかったものを同定するために実施された。同様に、重鎖ＣＤＲは、ヒトＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４ ＩｇＧ１重鎖フレームワークに移植された。重鎖バックボーンにおける様々な残基が次のように変異された：Ｈ１に対しては以下の変更が導入された：Ｋ７１Ｒ、Ｎ７３Ｔ及びＶ７８Ａ（親では「ＫＮＶ」と命名され、構築物は「ＲＴＡ」と命名）；Ｈ２に対しては以下の変更が導入された：Ｎ７３Ｔ（親では「ＫＮＶ」と命名され、構築物は「ＫＴＶ」と命名）；Ｈ３に対しては以下の変更が導入された：Ｋ７１Ｒ及びＶ７８Ｌ（親では「ＫＮＶ」と命名され、構築物は「ＲＮＬ」と命名）；及びＨ４に対しては以下の変更が導入された：Ｋ７１Ｖ、Ｎ７３Ｔ、及びＶ７８Ｆ（親では「ＫＮＶ」と命名され、構築物は「ＶＴＦ」と命名）。
４本の軽鎖及び８本の重鎖の全ての対の組み合わせ（合計３２抗体について）に基づいた抗体が作製され、発現レベル及び親和性が試験された。これらの実験に基づいて、８Ｃ５由来の軽鎖Ｋ４．Ｍ４Ｌと重鎖Ｈ３．ＫＮＶは、発現レベル及び所望の親和性の最良の組み合わせを示した。
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ可変領域及び完全長抗体の配列は以下の通りである：
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ 重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＤＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＧＳＴＹＶＤＡＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２８）
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ 完全重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＤＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＧＳＴＹＶＤＡＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＧＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１２９）
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ 軽鎖可変領域
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＥＳＹＧＮＲＹＭＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＡＮＬＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３０）
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ 完全軽鎖
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＥＳＹＧＮＲＹＭＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＡＮＬＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３１）
実施例１１：ＹＷ１８２．３とＹＷ１８２．５の間の抗ＦＧＦＲ１抗体ハイブリッドの生成
抗ＦＧＦＲ１アームの非存在下においてＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を活性化しない抗ＦＧＦＲ１アームであるＹＷ１８２．５は、８Ｃ５と組み合わされる場合に良好な結果を与えることが見いだされており、酸化を受けやすい重鎖の位置３３としてトリプトファンを有する。ＹＷ１８２．５と同じエピトープに結合するように思われるＹＷ１８２．２もまた、重鎖の位置３３にトリプトファンを有する。この問題を解消するために、幾つかの変異がこの位置に導入された：ＹＷ１８２．５については、Ｗ３３Ｙ、Ｗ３３Ｈ、Ｗ３３Ｆ及びＷ３３Ｌが導入され、ＹＷ１８２．２についてはＷ３３Ｙ及びＷ３３Ｆが導入された。驚くべきことに、導入された変異は、二つの抗体で異なる作用を有する。ＹＷ１８２．２の場合には、変異はＦＧＦＲ１に対する親和性又はアゴニスト活性に認識できるほどには影響を及ぼさなかったが、一方ＹＷ１８２．５においては、変異はＦＧＦＲ１に対する親和性及びアゴニスト活性を大きく減少させることが観察された（例えば、図３１参照）。従って、Ｗ３３Ｙ変異を有するが、ＹＷ１８２．５抗体の親和性と近い親和性を有する抗体を同定するために実験が２つのアプローチを使用して実施された。
１つのアプローチにおいて、ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ重鎖の配列のＣＤＲ３全体のアラニンスキャニングが実施され、位置９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ及び１００ｂをアラニンへ変異させた。得られた抗体の親和性が分析され、ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ親の非常に高い親和性を保持したものが同定された（図９）。
Figure 2022115981000012
第２のアプローチでは、（非常に高い親和性を有する）ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ抗体と（ほとんどが結合しない）ＹＷ１８２．５ Ｗ３３Ｙ抗体からのＣＤＲがうまく組み合わされた。ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ及びＹＷ１８２．５ Ｗ３３Ｙ抗体は、軽鎖において同一のＣＤＲ配列（ＣＤＲ－Ｌ１，ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１３９）；ＣＤＲ－Ｌ２、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１４０）；及びＣＤＲ－Ｌ３ ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号１４１）；ＣＤＲ－Ｈ１に単一アミノ酸の相違（ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ ＣＤＲ－Ｈ１、ＳＴＹＩＳ（配列番号１５２）及びＹＷ１８２．５ Ｗ３３Ｙ ＣＤＲ－Ｈ１、ＳＮＹＩＳ（配列番号１３６））；ＣＤＲ－Ｈ２内に又は隣接した３つのアミノ酸の相違（ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ ＣＤＲ－Ｈ２、ＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３７）及びＹＷ１８２．５ Ｗ３３Ｙ、ＥＩＤＰＹＤＧＡＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５３））；及び非常に異なるＣＤＲ－Ｈ３配列（ＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙ、ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１５４）及びＹＷ１８２．５ Ｗ３３Ｙ ＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１３８）を有する。ＹＷ１８２．５ Ｗ３３Ｙ及びＹＷ１８２．２ Ｗ３３Ｙからの重鎖ＣＤＲの全ての可能な組み合わせに基づいて、重鎖を有する抗体が構築され（２つの親抗体を含む８つ）、試験された。抗体の大部分は、どちらか一方と類似した親和性を有してしていたが、驚くべきことに、一つの組み合わせが親ＹＷ１８２．５抗体とほぼ同一である結合を実証した。この抗体は、ＹＷ１８２．５ Ｗ３３ＹからのＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ３を有するが、ＹＷ１８２．２からのＣＤＲ－Ｈ２を有する。この抗体は、ＹＷ１８２．５配列内の次の変更：Ｗ３３Ｙ、Ａ４９Ｇ、Ａ５６Ｄ、及びＤ５８Ｙを表すために「ＹＷ１８２．５ ＹＧＤＹ」と命名された。
ＹＷ１８２．５ ＹＧＤＹ抗体の配列は次の通りである：
ＹＷ１８２．５＿ＹＧＤＹ 重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＳＮＹＩＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＴＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３２）。
ＹＷ１８２．５＿ＹＧＤＹ 完全重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＳＮＹＩＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＴＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＧＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３３）。
ＹＷ１８２．５＿ＹＧＤＹ 軽鎖可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３４）。
ＹＷ１８２．５＿ＹＧＤＹ 完全軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３５）
実施例１２：ヒト化８Ｃ５及び抗ＦＧＦＲ１変異体との二重特異性抗体の試験
８Ｃ５．Ｋ４Ｈ３．Ｍ４Ｌ．ＫＮＶと異なる抗ＦＧＦＲ１アームの種々の二重特異性抗体の組み合わせが、ＫＬＢの有無にかかわらずＦＧＦＲ１ｃを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースルシフェラーゼアッセイで試験された。以前に観察されたように、各二重特異性抗体の組み合わせは、ＫＬＢを発現しない細胞においてでなく、組換えｈＦＧＦＲ１ｃとｈＫＬＢを発現する細胞中で用量依存的にルシフェラーゼ活性を誘導した（図３０）。これらのデータは、これらの修飾された変異体は、親抗体、例えばＢｓＡｂ１３の利点を保持することを確認する。ＨＥＫ２９３細胞の表面上のヒト、カニクイザル及びマウスＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体への、ヒト化８Ｃ５アーム（８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ）及びＹＷ１８２．５＿ＹＧＤＹアームを有する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１抗体の結合親和性が表１０に示される。
Figure 2022115981000013
示されかつ特許請求の範囲に記載の様々な実施態様に加えて、開示される主題は、また、本明細書に開示され及び特許請求の範囲に記載の特徴の他の組み合わせを有する他の実施態様を対象とする。このように、本明細書に提示される特定の特徴は、開示される主題が、本明細書に開示された特徴の任意の適切な組み合わせを含むように開示された主題の範囲内で他の方法で互いに組み合わせることができる。開示された主題の特定の実施態様の前述の説明は、例示及び説明のために提示される。網羅的であること、又は開示されたそれらの実施態様に対して開示された主題を限定するものではない。
様々な改変及び変形が開示された主題の精神又は範囲から逸脱することなく、開示される主題の組成物及び方法でなされることができることは当業者には明らかであろう。したがって、開示された主題は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある改変及び変形を含むことが意図される。
種々の刊行物、特許及び特許出願が本明細書に引用され、その内容は本明細書においてその全体が参考として援用される。
図１Ａは、抗ＦＧＦＲ１抗体及び抗体断片のアゴニスト活性を示す。 図１Ｂは、抗ＦＧＦＲ１抗体を用いた結合競合実験の結果を示す。 図１Ｃは、本開示の主題の抗ＦＧＦＲ１抗体による結合のために重要なＦＧＦＲ１のアミノ酸残基を示す。図１Ｃは、出現順にそれぞれ、配列番号１５９、１５９、１４３及び１４４を開示する。 図１Ｄは、本開示の主題の抗ＦＧＦＲ１抗体による結合のために重要なアミノ酸残基を決定するための部位特異的変異誘発の結果を示す。 図１Ｅは、本開示の主題の抗ＦＧＦＲ１抗体による結合のために重要なアミノ酸残基を決定するための部位特異的変異誘発の結果を示す。 図１Ｆは、ＦＧＦＲ１の空間充填モデルにおける結合のために重要な残基を示す。 図２Ａは、ＦＧＦＲ１ｂ及びＦＧＦＲ１ｃに対する２つの抗ＦＧＦＲ１抗体の親和性を示す。 図２Ｂは、様々なＦＧＦＲへの抗ＦＧＦＲ１抗体の結合を示す。 図２Ｃは、Ｌ６細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１（ＥＴＳ様転写因子１）ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦＲ１に特異的アゴニストとして作用した抗ＦＧＦＲ１抗体を示す。 図２Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦＲ１に特異的アゴニストとして作用した抗ＦＧＦＲ１抗体を示す。 図２Ｅは、抗ＦＧＦＲ１抗体は、糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスに注射した場合、血糖値を正常化することを示している。 図３Ａは、１７の抗ＫＬＢ抗体について軽鎖可変領域配列を示す。ＣＤＲ Ｌ１配列は、順番に、配列番号４８－６２であり；ＣＤＲ Ｌ２配列は、順番に、配列番号６３－７８であり；ＣＤＲ Ｌ３配列は、順番に、配列番号７９－９３である。軽鎖可変領域配列は、順番に、配列番号１１１－１２７である。 図３Ｂは、１７の抗ＫＬＢ抗体について重鎖可変領域配列を示す。抗体のＣＤＲ Ｈ１配列は、順番に（１１Ｆ１－８Ｃ５）、配列番号１－１５であり；ＣＤＲ Ｈ２配列は、順番に、配列番号１６－３１であり；ＣＤＲ Ｈ３配列は、順番に、配列番号３２－４７である。抗体の重鎖可変領域配列は、順番に、配列番号９４－１１０である。 図４は、ｈＫＬＢを発現する２９３細胞への種々の抗ＫＬＢ抗体の結合を測定する０．８μｇ／ｍｌでのＦＡＣＳプロットで観察された中央値のシフトを示す。 図５は、ｈＫＬＢ－ＥＣＤ－ＨＩＳタンパク質に対する種々の抗ＫＬＢ抗体の相対的結合を示す。 図６Ａは、本開示の主題の抗体及びシグナル活性化のためのＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体複合体形成のためのモデルを示す模式図です。。 図６Ｂは、シグナル活性化のためのＦＧＦＲ１ｃ－ＫＬＢ－ＦＧＦ２１複合体形成のためのモデルを示す。 図６Ｃは、ＦＧＦＲ１欠損ＨＥＫ２９３細胞を用いた、ＦＧＦ２１及び二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）１７のＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。細胞は、示された受容体を発現するようにトランスフェクトされた。 図６Ｄは、示されたタンパク質（ＦＧＦ２１（１００ｎＭ）又はＩｇＧ（３３ｎＭ）で１時間処置した初代ヒト脂肪細胞のウエスタンブロット分析を示す。試料はそれぞれの処置について複製された。 図７Ａは、ＧＡＬ－ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイにおける抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する様々な二重特異性抗体による誘導を示す。Ｒ１ＭＡｂ１アームを有する二重特異性Ａｂは、恐らくはＲ１ＭＡｂ１のＦａｂのアゴニスト活性に起因して有意なＫＬＢ－独立活性を示したことの注意されたい。そのような活性は、Ｒ１ＭＡｂ２又はＲ１ＭＡｂ３アームを有する二重特異性Ａｂをでは観察されなかった。 図７Ｂは、抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する様々な二重特異性抗体によるシグナル伝達の誘導が、ＦＧＦＲ１ｃとＫＬＢの両方に依存していることを示す。 図７Ｃは、ＫＬＢ発現を有しない細胞においてではなく、組換えｈＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢを発現する細胞において、用量依存的にルシフェラーゼ活性を誘導した抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する二重特異性抗体を示す。 図８Ａは、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体の３つの変異体の概略図である。青：ヒト、赤：マウス。（１）中のＮ２９７でのオリゴ糖鎖のおおよその位置は＾で示される。エフェクターのないバージョン（（２）及び（３））は、Ｎ２９７Ｇ変異によりオリゴ糖鎖を欠いている。（２）中の星印は、Ｄ２６５Ａ変異のおおよその位置を示している。ノブ対ホールの方向もまた示される。（１）はＢｓＡｂ１０を表し；（２）はＢｓＡｂ２０を表し；及び（３）はＢｓＡｂ１７を表す。 図８Ｂは、ＢｓＡｂ１０及びその誘導体、対照ＩｇＧ又はＦＧＦ２１で１０分間処置された初代ヒト脂肪細胞におけるＭＳＤ ｐＥＲＫアッセイを示している。データは、平均±ＳＥＭを表す（Ｎ＝３）。ｂＦＫＢ１（１）はＢｓＡｂ１０を表し；ｂＦＫＢ１（２）はＢｓＡｂ２０を表し；及びｂＦＫＢ１（３）はＢｓＡｂ１７を表す。 図９Ａは、ラットＬ６筋芽細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。細胞は、示された受容体の発現ベクターによりコトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞をルシフェラーゼアッセイの前に６時間、様々な濃度のＢｓＡｂ１０又は陽性対照、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ１９又はＲ１ＭＡｂ１とともにインキュベートした。 図９Ｂは、図９Ａに示すように、類似のＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。示されるように、トランスフェクトされたＬ６細胞は、ＦＧＦ２１及びＢｓＡｂ１７の組み合わせで処置された。Ｎ＝４． 図９Ｃは、図９Ａに示すように、類似のＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイを示す。示されるように、トランスフェクトされたＬ６細胞は、ＦＧＦ２１及びＢｓＡｂ１７の組み合わせで処置された。Ｎ＝４． 図９Ｄは、ＫＬＢ、ＦＧＦＲ１ｃ又はその両方を発現する細胞への抗ＦＧＦＲ１抗体及び抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体、ＢｓＡＢ９及びＢｓＡｂ１０の結合を示す。 図１０Ａは、ＦＧＦＲ１ｃ、ＫＬＢ又はその両方を発現する細胞への抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する二重特異性抗体及び抗ＦＧＦＲ１抗体の結合を示す。 図１０Ｂは、ヒト及びマウスのＫＬＢ／ＦＧＦＲ１の様々な組み合わせを発現しているＨＥＫ２９３細胞への結合についてのＢｓＡｂ１０のＫｄを示す。 図１１は、、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭでのＢｓＡｂ１０又は予め形成されたＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体のチップ上に固定化したＦＧＦＲ１－ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質への結合分析を示す。予め形成されたＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体を生成するために、ＢｓＥｂ１０と組換えＫＬＢ－ＥＣＤタンパク質を１：１の比率でプレインキュベートした。解離速度は、ＦＧＦＲ１ｂでなく、ＦＧＦＲ１ｃがチップ上に捕捉された場合にのみ、ＢｓＡｂ１０単独よりもＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体で遅く、三次元複合体の形成を示していた。 図１２Ａは、ＴＲ－ＦＲＥＴ実験計画の概略図である。 図１２Ｂは、指示したリガンドの添加後１５分での、タグ無しＫＬＢの有無にかかわらず標識されたＳＮＡＰタグ付きＦＧＦＲ１ｃタンパク質を発現するＣＯＳ７細胞上のＴＲ－ＦＲＥＴ強度を示す。ＢｓＡｂ１７、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２は、それぞれ６７ｎＭ、５０ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２ｎＭで使用した。データは６２０ｎｍでドナー発光で割った６６５ｎｍでのＦＲＥＴ強度（ＦＲＥＴ比）、及び３つの独立した実験（Ｎ＝３）の平均±ＳＥＭを示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対ＰＢＳ対照。 図１３Ａは、ＫＬＢのどの部分が２つの抗ＫＬＢ抗体による結合に重要であったかを決定するための実験の結果を示す。ＫＬＢタンパク質構造の模式図が上部に示される。各バーは、ヒトＫＬＢ、ヒトＫＬＡ、ウサギＫＬＢ、ラットＫＬＢ、マウスＫＬＢ、又はキメラ構築物を表す。右側には、一過性に各構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳに基づくＫＬＢｍＡｂ１及び対照ＫＬＢｍＡｂ２の結合が示される。ＫＬＢｍＡｂ１はウサギＫＬＢと結合しないが、３４アミノ酸断片（アミノ酸８０５から８３８）の対応するヒト配列への置換は結合を付与する。 図１３Ｂは、シグナル配列を有するヒトＫＬＢタンパク質の位置８５７から８９０セグメントのアミノ酸配列（シグナル配列を含まないＫＬＢタンパク質の位置８０５から８３８までのアミノ酸配列に対応する）及び様々な指示された種における対応配列を示す。図１３Ｂは、出現順にそれぞれ、配列番号１６０－１６４を開示する。 図１４Ａは、ＳＰＲによるＢｓＡｂ１０／ＫＬＢ複合体へのＦＧＦ２１及びＦＧＦ１９の結合を示す。ＢｓＡｂ１０はチップ上に捕捉され、ＫＬＢ－ＥＣＤタンパク質及びＦＧＦタンパク質（０．２、０．８、又は２μＭで）が連続注入された。 図１４Ｂは、ラットＬ６筋芽細胞におけるＧＡＬ－ＥＬＫ１ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。細胞は、ＦＧＦＲ４及びＫＬＢの両方の発現ベクターによりコトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞をルシフェラーゼアッセイの前に６時間、様々な濃度の指示されたタンパク質とともにインキュベートした。 図１４Ｃは、Ｈ４ＩＩＥ肝細胞におけるＥＲＫリン酸化をモニターするために実施されたウェスタンブロットを示す。ＢｓＡｂ１７は、Ｈ４ＩＩＥ肝癌細胞においてＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体を活性化するために（図１４Ｂ）、又はＥＲＫリン酸化を誘導するために（図１４Ｃ）ＦＧＦ１９の能力をブロックしなかったことに注意。 図１５Ａは、リーンＣ５７ＢＬ／６及びｄｂ／ｄｂマウス（ｎ＝７）の３ｍｇ／ｋｇ（リーン）又は５ｍｇ／ｋｇ（ｄｂ／ｄｂ）でのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧの単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注入後の、血糖値（７日目）、％体重変化（７日目）及び毎日の食物摂取量（０－３日）を示す。 図１５Ｂは、０日及び６日目（矢印）に３ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ２０）の腹腔内注入を受けた食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重及び血糖値を示す。Ｎ＝９． 図１５Ｃは、１４日目に１５Ｂで使用したのと同じマウス及び抗体を用いた糖負荷試験の結果を示す。 図１５Ｄは、１７日目の１５Ｂ－Ｃに示した動物における肝トリグリセリド及び血清マーカーの量を示す。 図１５Ｅは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入後５日のＤＩＯマウスでの高インスリン血症－正常血糖クランプの間に測定された全身のグルコース利用を示す。横軸は、血清インスリンレベルを表す。矢印は、基底からインスリン刺激状態への変化の方向を示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対対照。 図１５Ｆは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入後５日のＤＩＯマウスでの高インスリン血症－正常血糖クランプの間に測定された内因性グルコース産生を示す。横軸は、血清インスリンレベルを表す。矢印は、基底からインスリン刺激状態への変化の方向を示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対対照。 図１５Ｇは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入後５日のＤＩＯマウスでの高インスリン血症－正常血糖クランプの間に測定されたインスリン刺激性の組織のグルコース取り込みを示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）、＜０．０００１（＊＊＊）対対照。 図１６Ａは、マウスＫＬＢタンパク質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１６５）及びＫＯマウスにおいてＫｌｂ対立遺伝子によってコードされる対応するアミノ酸配列（配列番号１６６）を示す。赤文字で示すように、Ｋｌｂ遺伝子のミスセンス変異はＫＯ対立遺伝子における２番目のアミノ酸の後にフレームシフトをもたらす。 図１６Ｂは、野生型（＋／＋）及びＫＬＢノックアウト（－／－）マウスの精巣上体白色脂肪組織におけるＫＬＢタンパク質発現を示す。 図１６Ｃは、ＫＬＢは、グルコース代謝に影響するＢｓＡｂ２０において重要であることを示している。３ｍｐｋでＢｓＡｂ２０又は対照ＩｇＧの週４回の注入を受けたＤＩＯマウスにおける糖負荷試験（ＧＴＴ）。ＧＴＴは、最後の注入の３日後、２３日目に行われた。マウスはＧＴＴの前の２０週間ＨＦＤを受けた。＊ｐ＜０．０５． 図１６Ｄは、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体若しくはＲ１ＭＡｂ１又はビヒクルの腹腔内注入後７日目のＤＩＯマウスにおける血清パラメータを示す。Ｎ＝６． 図１７は、５０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７の腹腔内注入後７日目のＤＩＯマウスにおける血清中のＦＧＦ２３と無機リンの量を示す。Ｎ＝６．＊＊＊ｐ＜０．０００５． 図１８Ａは、クランプ実験中の動脈血糖可動域の量を示す。ＤＩＯマウスはクランプ実験の５日前に１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けた。 図１８Ｂは、クランプ実験の日の体重を示す。 図１８Ｃは、クランプ実験の間のグルコース注入速度を示す。ｐ＜０．０５（＊）、＜０．００１（＊＊）対対照。 図１９Ａは、２１－２２℃で指示された時間に１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧの単回腹腔内注入を受けたＤＩＯマウスのエネルギー消費（ＥＥ）（左）及び呼吸商（ＲＱ）（右）を示す。Ｎ＝７。 図１９Ｂは、指示された時間に１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧの単回腹腔内注入を受けた痩せたマウスのＥＥ（上）及びＲＱ（下）を示す。マウスは、２１－２２℃で維持され、その後、ケージ温度はＩｇＧの注入後６日目に熱中性（２９－３０゜Ｃ）にシフトされた。Ｎ＝６～７。 図１９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧの単回腹腔内注入後４０時間でのＤＩＯマウスにおける組織のフルデオキシグルコース（ＦＤＧ）の取り込みを示す。Ｎ＝８．ＦＤＧ取り込みが測定される前に、マウスを一晩絶食させた。 図１９Ｄは、単回腹腔内注入後（１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧ）及び浸透圧ポンプ（ＣＬ３１６，２４３（０．７５ｎｍｏｌ／時間）又はビヒクル）の外科的移植後７日目に回収されたｉｎｇＷＡＴのウエスタンブロット分析を示す。 図１９Ｅは、４８時間、３０ｎＭで指示されたタンパク質により処置された初代ヒト皮下脂肪細胞におけるＵＣＰ１のｍＲＮＡの発現を示す。Ｎ＝３． 図１９Ｆは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けたＤＩＯマウスの深部体温を示す。Ｎ＝７～８。 図１９Ｇは、単回１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ及びＦＧＦ２１を２ｍｇ／ｋｇ／日で１日２回又は対照ＰＢＳを５日間受けたＤＩＯマウスのｉＢＡＴの遺伝子発現プロファイルを示す。ＢｓＡｂ１７と対照との間又はＦＧＦ２１と対照との間有意差が認められた全ての遺伝子が列挙された。 図１９Ｈは、０日目に抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体又は対照ＩｇＧの１０ｍｇ／ｋｇでの単回腹腔内注入及び浸透圧ポンプ（ＣＬ３１６，２４３（０．７５ｎｍｏｌ／時間）又はビヒクル）の外科的移植を受けた痩せたマウスのＥＥ（左）及びＲＱ（右）を示す。指示された２４時間の期間中の平均値が示されている。 図２０Ａは、図１９Ａに記載されたＤＩＯマウスのＶＯ２（上）、ＶＣＯ２（中央）の量及び総活性カウントを示す。ＶＯ２とＶＣＯ２の値は＃によって示されている時間で測定された体重値によって正規化されている。ＤＩＯマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けた。 図２０Ｂは、図１９Ｂに記載されたＤＩＯマウスのＶＯ２（上）、ＶＣＯ２（中央）の量及び総活性カウントを示す。ＶＯ２とＶＣＯ２の値は＃によって示されている時間で測定された体重値によって正規化されている。ＤＩＯマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けた。 図２１Ａは、間接熱量測定の平均ＥＥ値を示す。平均増加の大きさは、グラフの下に示される。２１°ＣでＤＩＯ：実験でＩｇＧ注入後のＤ３－Ｄ６の間のＥＥの平均値は図１９Ａに示される。２１℃で痩せた：実験でＩｇＧ注入後のＤ３－Ｄ６の間のＥＥの平均値は図１９Ｂに示される。３０℃に切り替え後痩せた：実験でＩｇＧ注入後（すなわち、温度スイッチ３日後）のＤ６－Ｄ９の間のＥＥの平均値は図１９Ｂに示される。３０℃でＤＩＯ：熱中性に順応させたＤＩＯマウスにおけるＩｇＧ注入後のＤ３－Ｄ６の間のＥＥの平均値。 図２１Ｂは、熱中性でのＤＩＯマウスにおけるＥＥの変化を示す。ＤＩＯマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注入（矢印）の前に２週間熱中性に順応させた。Ｎ＝３～４。 図２１Ｃは、浸透圧ポンプの外科的移植及び薬物注射の後のＤ３－５の間の、通常の実験室の温度（２１℃）でのＤＩＯマウスにおける平均ＥＥ及びＲＱを示す。Ｄ０で、マウスは１０ｍｇ／ｋｇでＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧの腹腔内注入を受けた。ＦＧＦ２１群はまた、Ｄ０に２ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１の腹腔内注入ボーラス投与を受けた。各マウスはまた、Ｄ０に６０μｇ／日でＦＧＦ２１又はＰＢＳ対照を注入するために浸透圧ポンプが皮下移植された。Ｎ＝８～９。＊＊ｐ＜０．００５。 図２２は、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７又は対照ＩｇＧを受けたＤＩＯマウス間の試験過程にわたって深部体温における近似差を示すように再プロットされた図１９Ｆに示したデータを示す。黒い線は推定差で、青い線は、差の９５パーセント点別信頼区間である。ＩｇＧは１３日目（矢印）に投与された。Ｎ＝７～８。 図２３は、精巣上体脂肪、鼠径部脂肪、及び甲骨間褐色脂肪、並びに膵臓におけるＦＧＦ２１及びＢｓＡｂ２０誘導性ＥＲＫ及びＭＥＫの同程度のリン酸化を示す。組織は、１０ｍｇ／ｋｇ（ＢｓＡｂ２０）又は１ｍｇ／ｋｇ（ＦＧＦ２１）での痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内注入後１時間で（肝臓、膵臓及び精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ））又は２時間で（ｉＢＡＴ又はｉｎｇＷＡＴ）回収された。総ＥＲＫ及びＭＥＫは、負荷対照としての役割を果たす。 図２４Ａは、指示された用量（ｍｇ／ｋｇ）でＢｓＡｂ１７の単回腹腔内注入を受けたＤＩＯマウス（Ｎ＝６）における体重変化及び血清ＨＭＷアディポネクチンレベルを示す。 図２４Ｂは、指示された用量（ｍｇ／ｋｇ）でＢｓＡｂ１７の単回静脈内注入を受けたカニクイザル（Ｎ＝３）における体重変化及び血清ＨＭＷアディポネクチンレベルを示す。 図２４Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇで指示された（矢印）ＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入を受けたＤＩＯマウス（左：ｗｔ及び右：ａｄｉｐｏｑ ＫＯ）のＥＥを示す。Ｎ＝５～６。 図２４Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇで指示されたＩｇＧ（ＢｓＡｂ１７）の単回腹腔内注入を受けたｗｔ（＋／＋）及びａｄｉｐｏｑ ＫＯ（－／－）ＤＩＯマウスにおける様々な代謝パラメーターを示す。Ｎ＝６．ＡＵＣ：ＧＴＴ又はＩＴＴ（Ｔ＝０～２時間）の曲線下面積。ｐ＜０．１（＃）、＜０．０５（＊）、＜０．００５（＊＊）対対照。 図２５は、ｑＰＣＲを用いて図１９Ｇに記載したマウスから調製した総ＲＮＡを示す。 図２６は、マウス組織におけるＢｓＡｂ１７によるＥＲＫリン酸化のレベルを示す。組織は、１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１７での痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内注入後１時間で回収し、リン酸化ＥＲＫに特異的な抗体を用いた免疫組織化学に供された。２匹の動物からの代表的な画像が各グループに対して示されている。（１）膵臓、（２）視交叉上核（矢印）を含む冠状脳切片、（３）最後野（染色された細胞の三角形の集合）及び中心管（矢印）を含む冠状脳切片、及び（４）正中隆起（矢印）を含む冠状脳切片。ＢｓＡｂ１７誘導性シグナル伝達は、調べた脳切片のいずれにおいてもでなく、膵臓腺房細胞中で明らかであったことに注意。 図２７は、ＢｓＡｂ２０によるＨＦＤ誘導性肝細胞増殖の正常化を示す。８週間ＢｓＡｂ２０（１又は３ｍｇ／ｋｇ／週）又は対照ＩｇＧ（３ｍｇ／ｋｇ／週）で処置されたＤＩＯマウス又は痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓のＢｒｄＵ組み込み。＊ｐ＜０．０５対ＩｇＧ－処置ＤＩＯマウス（Ｎ＝５～８）。 図２８Ａは、図２８Ｂに示す実験の概略図である。ＤＩＯマウスは、６週間にわたって指示されるようにＢｓＡｂ２０（１又３ｍｇ／ｋｇ／週）又は対照ＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ／週）を受けた。対照の痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスは処置を受けなかった。 図２８Ｂは、ＢｓＡｂ２０処置後の骨表現型を示す。大腿骨と脛骨を切開し、μＣＴ分析に供した。（Ｎ＝７～８）。負の効果は、統計的有意性に達しなかったが、３ｍｇ／ｋｇ／週のＢｓＡｂ２０処置により減少傾向を示した皮質骨の厚さの可能性を除いて海綿骨及び皮質骨の様々な骨パラメーターでは観察されなかったことに注意。カロリー制限マウスにおける海綿骨密度に影響のない皮質骨の厚さの減少が報告されているので（１１）、観察された効果は体重減少に関連する可能性がある。ｐ＜０．００１（＊＊＊），＜０．０１（＊＊）、＜０．０５（＊）、＜０．１（＃）、＜０．２（＄）対対照ＩｇＧで処置されたＤＩＯマウス。Ｎ＝７～８。 図２９は、ＢｓＡｂ１７処置後のマウスにおけるコルチコステロンのレベルを示す。血清コルチコステロンレベルは、断頭による安楽死の後、Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ時間（ＺＴ）＝３で測定した。対照（ＣＴＲＬ）痩せたマウスは、処置を受けなかった。陽性対照としてリポ多糖（ＬＰＳ）が安楽死（ＺＴ＝０）の３時間前に１ｍｇ／ｋｇで痩せたマウスに腹腔内注入された（１２）。ＩｇＧは、指示されるように、安楽死の５日前に５又は２５ｍｇ／ｋｇでＤＩＯマウスに腹腔内注入された。示された統計分析は、ＬＰＳ群を含めないで行われた。Ｎ＝１２． 図３０は、抗ＦＧＦＲ１及び抗ＫＬＢアームを有する様々な異なる二重特異性抗体のＦＧＦＲ１ｃ又はＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬＢを発現する細胞への結合を示す。 図３１は、ＥＬＩＳＡによるＦＧＦＲ１タンパク質へのＹＷ１８２．５及びＹＷ１８２．５誘導体の結合を示す。

Claims (53)

  1. β－クロトー（ＫＬＢ）及び線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）に結合する単離された二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
  2. 抗体又はその抗原結合部分が、ＫＬＢのＣ末端ドメインに結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. 抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を含むＫＬＢの断片に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
  4. 抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１４３又は配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ１ｃの断片内のＦＧＦＲ１エピトープに結合する、請求項１－３の何れか一項に記載の抗体。
  5. 抗体又はその抗原結合部分が、インビボで血中グルコースレベルを低下させる、請求項１－４の何れか一項に記載の抗体。
  6. 抗体又はその抗原結合部分が、骨密度に有意に影響を与えない、請求項１－５の何れか一項に記載の抗体。
  7. 抗体又はその抗原結合部分が、肝臓に有意に影響を与えない、請求項１－６の何れか一項に記載の抗体。
  8. 抗体又はその抗原結合部分が、肝臓においてＥＲＫ及びＭＥＫのリン酸化を、ＦＧＦ２１が誘導するよりも有意に低いレベルで誘導する、請求項１－７の何れか一項に記載の抗体。
  9. 抗体又はその抗原結合部分が、１０－８Ｍから１０－１３ＭのＫｄでＫＬＢと結合する、請求項１－８の何れか一項に記載の抗体。
  10. 抗体又はその抗原結合部分が、約１０ｎＭから約１０μＭのＫｄでＦＧＦＲ１ｃに結合する、請求項１－９の何れか一項に記載の抗体。
  11. 抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナル抗体である、請求項１－１０の何れか一項に記載の抗体。
  12. 抗体又はその抗原結合部分が、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１－１１の何れか一項に記載の抗体。
  13. 抗体又はその抗原結合部分が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１３０に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む、請求項１－１２の何れか一項に記載の抗体。
  14. 抗体又はその抗原結合部分が、
    （ａ）配列番号１－１５からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号１６－３１からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメイン；
    （ｃ）配列番号３２－４７からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメイン；
    （ｄ）配列番号４８－６２からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメイン；
    （ｅ）配列番号６３－７８からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメイン；及び
    （ｆ）配列番号７９－９３からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメイン
    を含む、請求項１－１２の何れか一項に記載の抗体。
  15. 抗体又はその抗原結合部分が、
    （ａ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメイン；
    （ｂ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメイン；
    （ｃ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメイン；
    （ｄ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメイン；
    （ｅ）配列番号７８に記載のアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメイン；
    （ｆ）配列番号９３に記載のアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメイン
    を含む、請求項１－１２の何れか一項に記載の抗体。
  16. （ａ）配列番号１－１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｂ）配列番号７９－９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３、及び（ｃ）配列番号１６－３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２を含む、抗β－クロトー抗体又はその抗原結合部分。
  17. 抗体又はその抗原結合部分が、（ａ）配列番号１－１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１６－３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３２－４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む、請求項１６に記載の抗体。
  18. （ａ）配列番号４８－６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号６３－７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｃ）配列番号７９－９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を更に含む、請求項１７に記載の抗体。
  19. 抗体又はその抗原結合部分が、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、請求項１８に記載の抗体。
  20. 抗体又はその抗原結合部分が、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、請求項１８に記載の抗体。
  21. 抗体又はその抗原結合部分が、（ａ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び（ｂ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２０に記載の抗体。
  22. 抗体又はその抗原結合部分が、（ａ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｂ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２０に記載の抗体。
  23. 請求項１６－２１に記載の任意の抗体の結合を競合的に阻害する、抗ＫＬＢ抗体又はその抗原結合部分。
  24. 抗体又はその抗原結合部分が、１２Ａ１１又は８Ｃ５抗体と同じエピトープに結合する、請求項２３に記載の抗体。
  25. 抗体又はその抗原結合部分が、ＫＬＢのＣ末端ドメイン内のエピトープに結合する、請求項２３に記載の抗体。
  26. 抗体が、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１４２）からなるＫＬＢの断片内のＫＬＢエピトープに結合する、請求項２５に記載の抗体。
  27. （ａ）配列番号１２８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；（ｂ）配列番号１３０のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；及び（ｃ）（ａ）に記載の重鎖可変領域及び（ｂ）に記載の軽鎖可変領域を含む抗ＫＬＢ抗体又はその抗原結合部分。
  28. 抗体が二重特異性抗体である、請求項１６－２７の何れか一項に記載の抗体。
  29. 抗体が、ＦＧＦＲ１に結合する可変ドメインを含む、請求項２８に記載の抗体。
  30. ＦＧＦＲ１がＦＧＦＲ１ｃである、請求項２８に記載の抗体。
  31. 抗体が、アミノ酸配列ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号１４３）又はＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号１４４）からなるＦＧＦＲ１ｃの断片に結合する、請求項３０に記載の抗体。
  32. 抗体が、（ａ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、請求項３０に記載の抗体。
  33. 抗体が、（ａ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び（ｂ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の抗体。
  34. 抗体が、（ａ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖及び（ｂ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３０に記載の抗体。
  35. （ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第一抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３０に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み；且つ
    （ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第二抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１３２に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３４に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む、単離された抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体。
  36. （ａ）重鎖領域及び軽鎖領域を含む第一抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、重鎖領域は、配列番号１２９に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖領域は、配列番号１３１に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み；且つ
    （ｂ）重鎖領域及び軽鎖領域を含む第二抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、重鎖領域は、配列番号１３３に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖領域は、配列番号１３５に記載の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸を含む、単離された抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体。
  37. 請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  38. 請求項３７に記載の核酸を含む宿主細胞。
  39. 抗体が産生されるように、請求項３８に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
  40. 宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項１－３６の何れか一項に記載の一以上の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤。
  42. 付加的治療剤を更に含む、請求項４１に記載の薬学的製剤。
  43. 医薬としての使用のための、請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体。
  44. 多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、並びに老化及びアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳなどの関連疾患からなる群から選択される障害を治療することにおける使用のための、請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体。
  45. ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１受容体複合体を活性化することにおける使用のための、請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体。
  46. 代謝障害の治療のための医薬の製造における、請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体の使用。
  47. ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１受容体複合体を活性化するための医薬の製造における、請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体の使用。
  48. 代謝障害が糖尿病である、請求項４６に記載の使用。
  49. 多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、並びに老化及びアルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳなどの関連疾患、バルデ－ビードル症候群、プラダー・ウィリー症候群、アルストレーム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルービンスタイン－テービ症候群、脆弱Ｘ症候群及びＢｏｒｊｅｓｏｎ－フォルスマン・リーマン症候群からなる群から選択される疾患を有する個体を治療する方法であって、請求項１－３６の何れか一項に記載の一以上の抗体の有効量を個体に投与することを含む方法。
  50. 疾患が糖尿病である、請求項４９に記載の方法。
  51. 付加的治療剤を個体へ投与することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
  52. 請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体においてＫＬＢ－ＦＧＦＲ１受容体複合体を活性化する方法。
  53. 抗体又はその抗原結合部分が、ＫＬＢ－ＦＧＦＲ１ｃ複合体を活性化する、請求項１－３６の何れか一項に記載の抗体。
JP2022076493A 2013-12-23 2022-05-06 抗体及び使用方法 Withdrawn JP2022115981A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920396P 2013-12-23 2013-12-23
US61/920,396 2013-12-23
US201462081435P 2014-11-18 2014-11-18
US62/081,435 2014-11-18
JP2020066038A JP2020125299A (ja) 2013-12-23 2020-04-01 抗体及び使用方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020066038A Division JP2020125299A (ja) 2013-12-23 2020-04-01 抗体及び使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022115981A true JP2022115981A (ja) 2022-08-09

Family

ID=52347471

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016560886A Active JP6687533B2 (ja) 2013-12-23 2014-12-23 抗体及び使用方法
JP2020066038A Withdrawn JP2020125299A (ja) 2013-12-23 2020-04-01 抗体及び使用方法
JP2022076493A Withdrawn JP2022115981A (ja) 2013-12-23 2022-05-06 抗体及び使用方法

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016560886A Active JP6687533B2 (ja) 2013-12-23 2014-12-23 抗体及び使用方法
JP2020066038A Withdrawn JP2020125299A (ja) 2013-12-23 2020-04-01 抗体及び使用方法

Country Status (30)

Country Link
US (6) US9873748B2 (ja)
EP (2) EP3086807B1 (ja)
JP (3) JP6687533B2 (ja)
KR (3) KR102329693B1 (ja)
CN (2) CN105939727B (ja)
AU (4) AU2014369872B2 (ja)
BR (1) BR112016013960B1 (ja)
CA (1) CA2929868C (ja)
CL (1) CL2016001592A1 (ja)
CR (1) CR20160338A (ja)
DK (1) DK3086807T3 (ja)
EA (1) EA036107B1 (ja)
ES (1) ES2926375T3 (ja)
HR (1) HRP20221088T1 (ja)
HU (1) HUE059701T2 (ja)
IL (3) IL245493B (ja)
LT (1) LT3086807T (ja)
MX (2) MX2016008196A (ja)
MY (1) MY194936A (ja)
NZ (1) NZ720765A (ja)
PE (1) PE20161152A1 (ja)
PH (1) PH12016500927A1 (ja)
PL (1) PL3086807T3 (ja)
PT (1) PT3086807T (ja)
RS (1) RS63565B1 (ja)
SG (2) SG10202007790WA (ja)
SI (1) SI3086807T1 (ja)
TW (2) TWI728373B (ja)
UA (1) UA120357C2 (ja)
WO (1) WO2015100366A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
SI3097122T1 (sl) 2014-01-24 2020-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Protitelesa, ki se vežejo v domeni beta klotho 2, in metode za njihovo uporabo
AU2015236073B2 (en) 2014-03-25 2020-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. FGF21 receptor agonists and uses thereof
MX2017003478A (es) 2014-11-05 2018-02-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-fgfr2/3 y metodos para su uso.
WO2017019957A2 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
AU2016303545B2 (en) 2015-08-03 2019-09-12 Novartis Ag Methods of treating FGF21-associated disorders
EP3353211A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods for the treatment of epilepsy
MA53356B1 (fr) 2015-11-03 2022-05-31 Janssen Biotech Inc Formulations sous-cutanées d'anticorps anti-cd38 et leurs utilisations
EP3371217A1 (en) * 2015-11-08 2018-09-12 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of screening for multispecific antibodies
IL262268B1 (en) 2016-04-20 2024-01-01 Regeneron Pharma Preparations and methods for the preparation of antibodies based on the use of an amplified expression locus
SG11201807885PA (en) 2016-04-20 2018-10-30 Regeneron Pharma Compositions and methods for making antibodies based on use of expression-enhancing loci
US10899844B2 (en) 2017-02-08 2021-01-26 Novartis Ag FGF21 mimetic antibodies and uses thereof
AU2018219864A1 (en) * 2017-02-10 2019-08-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Trailshort antibody and methods of use
CN107966525B (zh) * 2017-11-06 2023-10-20 中国矿业大学(北京) 一种13co2量化脉冲标记植物的方法
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
CA3219609A1 (en) 2021-05-04 2022-11-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses

Family Cites Families (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
DE3853515T3 (de) 1987-05-21 2005-08-25 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
KR20000062345A (ko) 1996-12-26 2000-10-25 히라타 다다시 신규 폴리펩타이드, 신규 ｄｎａ 및 신규 항체
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US20020012961A1 (en) 1999-04-15 2002-01-31 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor- 19
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
JP3653469B2 (ja) 1997-11-25 2005-05-25 ジェネンテック・インコーポレーテッド 線維芽細胞増殖因子−１９
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
FR2796073B1 (fr) 1999-07-07 2003-08-29 Centre Nat Rech Scient Anticorps anti-idiotypiques des facteurs de croissance des fibroblastes et leur utilisation comme medicaments
JP2001072607A (ja) 1999-09-03 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規血管内皮機能改善法
DE60028054T2 (de) 1999-09-08 2006-12-21 Genentech, Inc., South San Francisco Fibroblasten-wachstumsfaktor-19 (fgf-19) nukleinsäure und polypeptide und verfahren zu deren verwendung für behandlung von fettleibigkeit
EP1210426A2 (en) 1999-09-10 2002-06-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polymorphisms in a klotho gene
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7504256B1 (en) 1999-10-19 2009-03-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing polypeptide
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
PT1242438E (pt) 1999-12-29 2007-02-28 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo dixorrubicinas e daunorrubicinas modificadas e seu uso terapêutico
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
ES2337696T3 (es) 2000-08-29 2010-04-28 Genentech, Inc. Metodos para aumentar la eficacia de la terapia contra el cancer.
KR100865801B1 (ko) 2000-08-29 2008-10-28 제넨테크, 인크. 암 치료의 효능을 증진시키는 방법
DK2314686T4 (da) 2000-10-06 2023-08-21 Kyowa Kirin Co Ltd Celler, der danner antistofsammensætninger
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
EP1327443A1 (en) 2001-12-21 2003-07-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic or preventing agent for the diseases caused by a decrease in the expression level of the klotho protein
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN100531796C (zh) 2002-01-31 2009-08-26 马普科技促进协会 Fgfr激动剂
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
WO2003102157A2 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050282733A1 (en) 2002-06-27 2005-12-22 Prins Johannes B Differentiation modulating agents and uses therefor
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
DE602004032370D1 (de) 2003-10-16 2011-06-01 Imclone Llc Fibroblasten-wachstumsfaktor-1-hemmer und behandlungsverfahren dafür
SI2380911T1 (en) 2003-11-05 2018-07-31 Roche Glycart Ag ANTIGEN-RELATED PATIENTS WITH INCREASED ATTENTION ON THE RECEPTOR FC AND EFFECTORAL FUNCTION
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US20070248605A1 (en) 2003-12-19 2007-10-25 Five Prime Therapetutics, Inc. Fibroblast Growth Factor Receptors 1,2,3, and 4 as Targets for Therapeutic Intervention
ES2527292T3 (es) 2004-03-31 2015-01-22 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-TGF-beta humanizados
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP2006158339A (ja) 2004-12-09 2006-06-22 Kyoto Univ βＫｌｏｔｈｏ遺伝子、Ｃｙｐ７ａ１遺伝子、及びそれらの利用
JP2008522617A (ja) 2004-12-14 2008-07-03 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ES2582652T3 (es) 2006-02-10 2016-09-14 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-FGF19 y métodos de uso de los mismos
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP3372237A1 (en) 2007-04-02 2018-09-12 Genentech, Inc. A klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
WO2008123625A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
AU2008299779B2 (en) 2007-08-03 2013-05-16 Genentech, Inc. Humanized anti-FGF19 antagonists and methods using same
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
WO2010042747A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
MX2012006397A (es) * 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
JP2013523184A (ja) * 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
CN103415300B (zh) 2010-07-20 2018-02-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 N‑末端修饰的fgf21化合物
PL2710035T3 (pl) 2011-05-16 2017-09-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Agoniści fgfr1 i sposoby stosowania
US9574002B2 (en) * 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
SI3097122T1 (sl) 2014-01-24 2020-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Protitelesa, ki se vežejo v domeni beta klotho 2, in metode za njihovo uporabo

Also Published As

Publication number Publication date
TW201531483A (zh) 2015-08-16
MY194936A (en) 2022-12-27
IL290547A (en) 2022-04-01
TWI670283B (zh) 2019-09-01
EP4219555A1 (en) 2023-08-02
TWI728373B (zh) 2021-05-21
CN105939727A (zh) 2016-09-14
US20240026033A1 (en) 2024-01-25
US9873748B2 (en) 2018-01-23
US20190177432A1 (en) 2019-06-13
KR20220100104A (ko) 2022-07-14
AU2014369872A1 (en) 2016-06-02
US20180105605A1 (en) 2018-04-19
CA2929868A1 (en) 2015-07-02
BR112016013960B1 (pt) 2023-03-14
KR102329693B1 (ko) 2021-11-23
US20220064331A1 (en) 2022-03-03
PT3086807T (pt) 2022-09-05
EA201691321A1 (ru) 2017-02-28
CA2929868C (en) 2023-07-11
RS63565B1 (sr) 2022-10-31
US10882921B2 (en) 2021-01-05
SG10202007790WA (en) 2020-09-29
US20160319038A1 (en) 2016-11-03
UA120357C2 (uk) 2019-11-25
US20150218276A1 (en) 2015-08-06
AU2019204128B2 (en) 2021-05-13
EP3086807B1 (en) 2022-07-13
LT3086807T (lt) 2022-09-26
JP2020125299A (ja) 2020-08-20
JP2017502695A (ja) 2017-01-26
JP6687533B2 (ja) 2020-04-22
AU2014369872B2 (en) 2019-03-14
PH12016500927A1 (en) 2016-07-18
EA036107B1 (ru) 2020-09-29
KR20210144910A (ko) 2021-11-30
HUE059701T2 (hu) 2022-12-28
KR20160102030A (ko) 2016-08-26
IL245493B (en) 2020-10-29
DK3086807T3 (da) 2022-09-19
IL245493A0 (en) 2016-06-30
AU2021282496A1 (en) 2022-01-06
US9884919B2 (en) 2018-02-06
IL277633A (en) 2020-11-30
CL2016001592A1 (es) 2017-03-24
SI3086807T1 (sl) 2022-10-28
AU2021215189B2 (en) 2021-09-23
CN105939727B (zh) 2020-03-17
US10246518B2 (en) 2019-04-02
PL3086807T3 (pl) 2022-10-03
EP3086807A1 (en) 2016-11-02
CN111499754A (zh) 2020-08-07
SG11201605071XA (en) 2016-07-28
ES2926375T3 (es) 2022-10-25
WO2015100366A1 (en) 2015-07-02
AU2021215189A1 (en) 2021-09-02
NZ720765A (en) 2022-02-25
TW202010754A (zh) 2020-03-16
BR112016013960A2 (pt) 2018-01-09
IL277633B (en) 2022-03-01
PE20161152A1 (es) 2016-11-08
HRP20221088T1 (hr) 2022-11-11
AU2019204128A1 (en) 2019-07-04
MX2016008196A (es) 2017-03-14
MX2020009634A (es) 2020-10-08
CR20160338A (es) 2016-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10882921B2 (en) Host cell comprising nucleic acids encoding bispecific antibodies binding to beta-klotho and fibroblast growth factor receptor 1 and antibody production
US20210087283A1 (en) Fgfr1 agonists and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220603

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220603

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220630

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230411

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230710

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20231107

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20240308