JP2014534965A - コンパニオン診断を用いた乳癌の治療 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、トリプルネガティブサブタイプを含む乳癌を治療するための組成物及び方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、トリプルネガティブ乳癌腫瘍を含む乳癌患者を治療するための医薬組成物であって、ＥＭＰ２の第２細胞外ループアミノ酸の特定の配列を含むエピトープに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１０月１３日に提出された米国特許出願第６１／５４６，９８２号に対する優先権の利益を請求する。尚、この文献の開示内容は、その全体を参照として本明細書に組み込むものとする。

連邦政府による資金援助を受けた研究開発で達成された発明の権利に関する記載
本発明は、National Institutes of Healthによって賦与された助成金番号ＣＡ１３１７５６の政府支援を受けて達成された。政府は、本発明に一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、抗ＥＭＰ２抗体、その医薬組成物、並びにトリプルネガティブ乳癌などのＥＭＰ２を過剰発現する癌の検出及び治療にこれらを使用する方法に関する。

発明の背景
乳癌は、依然として世界中の女性の間で最も多く見られる悪性腫瘍である。乳癌は、異質性疾患であり、これは、広範な臨床的挙動、予後、及び組織学を呈示する（Tavassoli F, Devilee P, editors. (2003) WHO Classification of Tumors. Pathology & Genetics: Tumors of the breast and female genital organs. Lyon (France): IARC Pres)。乳癌は、乳房組織管及び小葉の内側を覆う細胞の異常増殖であり、癌が、乳管又は小葉のいずれで開始したのか、細胞が、乳管又は小葉を介して浸潤（増殖又は拡大）しているかどうか、並びに顕微鏡下で細胞がどのように見えるか（組織学）によって分類される。単一の乳房腫瘍が浸潤性及び非浸潤性癌の混合を有することは珍しくない。

乳癌の分子分類によって、臨床的及び生物学的意味を有する特定のサブタイプ（一般に「内因性」サブタイプとも呼ばれる）が同定されており、このようなものとして、内因性ルミナールサブタイプ、内因性ＨＥＲ２リッチサブタイプ（また、ＨＥＲ２^＋又はＥＲ⁻／ＨＥＲ２^＋サブタイプ）及び内因性基底細胞型乳癌（ＢＬＢＣ）サブタイプが挙げられる（Perou et al. 2000）。内因性サブタイプの同定は、典型的に（１）組織病理学的検出、（２）エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）発現状態、並びに（３）特徴的細胞マーカの検出を含む方法の組合せによって達成される。

正常な乳腺における基底上皮細胞に特徴的な遺伝子を発現する基底細胞型乳癌（ＢＬＢＣ）は、全乳癌の１５％〜２５％までを占め（Kreike et al. 2007）、あらゆる乳癌型のうち最も悪い予後を伴う。ＢＬＢＣは、エストロゲン受容体（ＥＲ⁻）、プロゲステロン受容体（ＰＲ⁻）、及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２⁻）を過少発現し、いわゆる「トリプルネガティブ」（ＥＲ⁻／ＰＲ⁻／ＨＥＲ２⁻）乳癌の６０％〜９０％を占める。ほとんどの基底細胞型乳癌は、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の発現状態に基づいて、トリプルネガティブと呼ばれることが多いが、全ての基底細胞型乳癌がトリプルネガティブであるわけではない。

従って、内因性基底細胞型乳癌サブタイプは、「ハイブリッド」基底細胞型乳癌サブタイプとして本明細書に記載する少なくとも３つの異なるサブタイプにさらに区分することができる。ハイブリッドトリプルネガティブサブタイプに加えて、ハイブリッド基底細胞型乳癌サブタイプは、基底細胞型乳癌と少なくとも１つの他の乳癌分子サブタイプの両方に類似するプロフィールを有する。例えば、ハイブリッド基底細胞型サブタイプは、ＥＲ⁻／ＰＲ⁻／ＨＥＲ^＋の受容体プロフィールを有するハイブリッド基底細胞型／ＨＥＲ２^＋、ＥＲ^＋／ＰＲ^−又は＋／ＨＥＲ^−又は＋の受容体プロフィールを有するハイブリッド基底細胞型／ルミナールサブタイプ、並びにＥＲ⁻／ＰＲ⁻／ＨＥＲ⁻の受容体プロフィールを有するハイブリッド基底細胞型／トリプルネガティブサブタイプを含むことができる。

内因性ルミナール乳癌サブタイプは、ＥＲ及び／又はＰＲ（ＥＲ^＋及び／又はＰＲ^＋）の発現又は過剰発現を特徴とする。ルミナールサブタイプは、ＨＥＲ２状態に基づき、ＨＥＲ２の過少発現（ＥＲ^＋／ＰＲ^＋又は−／ＨＥＲ⁻）をさらに特徴とするルミナールＡサブタイプ、及びＨＥＲ２の過剰発現（ＥＲ^＋／ＰＲ^＋又は−／ＨＥＲ^＋）をさらに特徴とするルミナールＢサブタイプにさらに区分することができる。内因性ルミナールサブタイプは、最も治療可能な乳癌サブタイプであると考えられ、最良の予後を伴う。

ＥＲ及びＨＥＲ２は、それぞれルミナール及びＨＥＲ２乳癌の治療の指針となるが、依然として、化学療法がＢＬＢＣの全身治療の唯一の手段である。選択的に若い女性、特にアフリカ系アメリカ人女性が罹患するＢＬＢＣは、高い組織学的グレード、攻撃的な臨床的挙動、並びに脳及び肺への転移の高い速度と関連する（Carey et al. 2006）。他の乳癌サブタイプとは異なり、ＢＬＢＣの場合、腫瘍サイズとリンパ節転移の間に関係はないようである（Dent et al. 2007）。

ＢＬＢＣは、基底サイトケラチン（ＣＫ５／６、ＣＫ１４、及びＣＫ１７）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−ｋｉｔ、及びｐ５３の発現と関連すると共に、ＥＲ、ＰＲ、及びＨＥＲ２発現の非存在に関連する。非常に多様な関連遺伝子があるために、ＢＬＢＣは、一連の診断マーカを用いた様々な研究でそれぞれ別に定義されている。例えば、Nielsenらは、基底サイトケラチン、ＥＧＦＲ、及び／又はｃ−ｋｉｔ発現陽性以外に、ＥＲ及びＨＥＲ２発現陰性に基づいて、ＢＬＢＣを定義した（Nielsen et al. 2004）。他方で、他のグループは、ＥＲ及びＨＥＲ２発現陰性、及びＣＫ５、Ｐ−カドヘリン、及びｐ６３発現陽性（Elsheikh et al. 2008）、又はビメンチン、ＥＧＦＲ、並びにＣＫ５／６発現陽性（Livasy et al. 2006）に基づき、ＢＬＢＣを定義している。このような様々な技術的手法と、非常に多様な患者コホートとの組み合わせによって、上記のマーカについての実験結果の矛盾が説明されるかもしれない。

ホルモン受容体のみを検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いた基底細胞型サブタイプの同定は、セラノスティック（theranostic）バイオマーカの検出より望ましくない。何故なら、同定が、１つ又は複数の特定の腫瘍マーカの存在ではなく、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）のＩＨＣ染色の非存在に基づいて行われるからである。その診断法は、組入れ（inclusion）ではなく、除外（exclusion）の１つである。

乳癌の予測及び治療に役立つ重要な分子特性決定が、過去十年にわたって行われてきた。これらには、ＢＲＣＡ１突然変異状態、並びにエストロゲン受容体（ＥＲ）の発現及び上皮増殖因子受容体２型（ＥＲＢＢ２又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ）の発現が含まれる。遺伝子発現プロファイリングによって、近年、特定の癌サブタイプが同定されており、その各々が異なる分子シグネチャーを有する。この分子分類系は、乳癌を、基底細胞型サイトケラチン（ＣＫ５／６、１４、１７）、ｐ５３の発現、並びに上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）の過剰発現によって、４つの生物学的に異なるサブタイプ：１）正常／非癌性；２）エストロゲン−受容体（ＥＲ）−陽性ルミナール乳癌；３）ＥＲ陰性、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌；並びに４）ＥＲ陰性乳癌に区分する。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びＥＲモジュレータを用いた治療は、これら受容体を発現する腫瘍に関して臨床的有望性を示している。しかし、個体の約１５％しかＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現を有していないため、一般的集団において、この治療の有用性は限定される。さらに、乳癌の７０％がＥＲを発現するが、発現の低減及び／又は抗ＥＲ治療に対する耐性が主要な課題である。

特に攻撃型の乳癌は、ＥＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現が欠失している。この攻撃型の乳癌は、一般にトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）と呼ばれる。この変異型は、ごく一部の患者（１０〜１５％）に起こるが、乳癌による全死亡者数の約半数を占めている。

トリプルネガティブ乳癌は、典型的に、ＢＲＣＡ１遺伝子中に突然変異を保有する若いアフリカ系アメリカ人女性及び白人女性に認められる。トリプルネガティブ乳癌は、典型的に、ＥＲ／ＰＲ（−／−）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（−／−）、ＥＧＦＲ（＋）、ｐ５３（−）及びサイトケラチン５／６（＋Ｉ＋）である。

いくつかのトリプルネガティブ乳癌は、化学療法に応答するが、トリプルネガティブ乳癌のあるサブセットは、化学療法耐性であり、高度に転移性であり、極めて悪い予後を伴う。従って、この攻撃的サブタイプに発現される新しい分子標的を同定することが、当分野において、高い優先順位で依然として必要とされている。

本明細書に記載するように、上皮膜タンパク質−２（ＥＭＰ２）は、トリプルネガティブ乳癌に過剰発現される。ＥＭＰ２は、増殖停止特異的３（ＧＡＳ３）ファミリーに属するテトラスパンタンパク質である。機能的に、ＥＭＰ２は、インテグリンαｖβ３及びフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）と結合し、両者の局在化及び活性を調節する。ＥＭＰ２（配列番号１）は、肺、眼、及び泌尿生殖器の上皮細胞に高レベルで発現される。数種のテトラスパンタンパク質（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＰＭＰ２２）同様、マウス線維芽細胞のＥＭＰ２は、脂質ラフトドメインに局在化する。ＥＭＰ２は、細胞表面トラフィッキング、並びに特定のインテグリン、ＧＰＩ結合タンパク質、及びクラスＩ ＭＨＣ分子の機能を制御して、カベオリン発現を相互に調節する（Claas et al., J Biol Chem 276:7974-84（2001)；Hasse et al., J Neurosci Res 69:227-32 (2002)；Wadehra et al., Exp Mol Pathol 74:106-12 (2003)；Wadehra et al., Mol Biol Cell 15:2073-2083 (2004)；Wadehra et al., J Biol Chem 277:41094-41100 (2002)； and Wadehra et al., Clin Immunol 107:129-136 (2003)を参照されたい)。

配列番号１（アクセッションＰ５４８５１）ＭＬＶＬＬＡＦＩＩＡ ＦＨＩＴＳＡＡＬＬＦ ＩＡＴＶＤＮＡＷＷＶ ＧＤＥＦＦＡＤＶＷＲ ＩＣＴＮＮＴＮＣＴＶ ＩＮＤＳＦＱＥＹＳＴ ＬＱＡＶＱＡＴＭＩＬ ＳＴＩＬＣＣＩＡＦＦ ＩＦＶＬＱＬＦＲＬＫ ＱＧＥＲＦＶＬＴＳＩ ＩＱＬＭＳＣＬＣＶＭ ＩＡＡＳＩＹＴＤＲＲ ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦ ＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧ ＹＳＹＩＬＡＷＶＡＦ ＡＣＴＦＩＳＧＭＭＹ ＬＩＬＲＫＲＫ
ＥＭＰ２は、ポストゴルジエンドソームコンパートメントから適切な原形質膜位置への分子の移動を促進することによって、様々なタンパク質及び糖脂質のトラフィッキングを調節するようである。具体的には、ＥＭＰ２は、選択分子の糖脂質リッチ脂質ラフトミクロドメイン（ＧＥＭ）への適切なトラフィッキングを促進すると考えられている（Wadehra et al., Mol Biol Cell 15:2073-83 (2004)）。ＧＥＭは、コレステロールが豊富なミクロドメインであり、これは、往々にして、シャペロン、レセプトソーム、並びに効率的シグナル伝達に重要なタンパク質複合体と関連している（Leitinger et al., J Cell Sci 115:963-72 (2002)；Moffett et al., J Biol Chem 275:2191-8 (2000)）。さらに、ＧＥＭは、ゴルジ装置から原形質膜へのタンパク質の正しい選別に関与している（Abrami et al., J Biol Chem 276:30729-36（2001)；Galbiati et al., Cell 106:403-11 (2001)；Gruenberg et al., Curr Opin Cell Biol 7:552-63 (1995)）。この点において、原形質膜上のＥＭＰ２発現レベル又はその局在の調節により、インテグリン、フォーカルアドヒージョンキナーゼ、クラスＩ主要組織適合性分子、並びにその他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ５４及びＧＰＩ結合タンパク質）などの複数のクラスの分子の表面レパトアが改変される（Wadehra et al., Dev Biol 287:336-45 (2005)；Wadehra et al., Clinical Immunology 107:129-36 (2003)；Morales et al., Invest Opthalmol Vis Sci (2008)）。

ＥＭＰ２発現は、ＥＭＰ２腫瘍形成と関連している（Wadehra et al., Cancer 107:90-8 (2006)）。例えば、子宮内膜癌の場合、ＥＭＰ２は、悪い臨床転帰を有する腫瘍の独立した予後指標である。ＥＭＰ２陰性腫瘍と比較すると、ＥＭＰ２陽性腫瘍は、子宮筋層浸潤性が有意に大きく、病態が重篤であり、外科的切除後も再発性又は持続性の疾患で、しかもより早期に死に至る。

本明細書に記載する研究によって、ＥＭＰ２をトリプルネガティブ乳癌の治療の標的として用いることができることが判明した。従って、ＥＭＰ２ポリペプチド、抗ＥＭＰ２抗体、及びＥＭＰ２ ｓｉＲＮＡを用いて、トリプルネガティブ乳癌を診断及び治療することができる。前述したように、トリプルネガティブ乳癌の予防、治療、及び調節に有用な方法及び組成物が依然として広く必要とされている。従って、本発明は、これらの及び他の必要性を満たす新規組成物及び方法を提供する。

発明の簡単な概要
一実施形態において、本発明は、乳癌患者を治療する方法に関する。特定の実施形態では、乳癌は、ＥＭＰ２を過剰発現するトリプルネガティブ乳癌腫瘍である。特定の実施形態では、本方法は、ＥＭＰ２を過剰発現するトリプルネガティブ乳癌に罹患した患者に、有効量の抗ＥＭＰ２抗体を投与することを含む。特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２の第２細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む。特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、生理学的に許容される担体又は薬学的に許容される担体を用いて投与する。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９ダイアボディの重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９ダイアボディの重鎖及び軽鎖可変領域と、９０％アミノ酸同一性を有する抗体と競合する。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９ダイアボディのそれと同一のＣＤＲ配列を含む。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体を用いて乳癌患者を治療する方法は、さらに、有効量の少なくとも１種の別の抗がん剤を患者に投与することを含む。特定の実施形態では、少なくとも１種の別の抗がん剤は、白金を用いた化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、及びその組合せからなる群から選択する。

特定の一実施形態において、少なくとも１種の別の抗がん剤は、ＥＧＦＲ阻害剤である。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体である。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブ、及びニモツズマブからなる群から選択される。

一実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である。特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、及びＡＧ１４７８からなる群から選択される。

一実施形態において、少なくとも１種の別の抗がん剤は、ＶＥＧＦ阻害剤である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体を含む。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブである。

実施形態のいずれかにおいて、治療しようとする組織、癌、被検者又は患者は、ヒト又は哺乳動物のものである。

一実施形態において、本方法は、コンパニオン診断をさらに含む。

さらに別の実施形態において、本発明は、ＥＭＰ２を過剰発現する癌を治療又は予防するのに有用であると考えられる、ＥＭＰ２ポリペプチド、抗ＥＭＰ２抗体、及びＥＭＰ２ ｓｉＲＮＡも提供する。

特定の実施形態において、ＥＭＰ２抗体は、単独で、又はエフェクター部分と結合させて、癌の診断、予後、又は治療に用いることができる。リシンなどの毒性薬剤と結合させたＥＭＰ２抗体、並びに非結合抗体は、ＥＭＰ２含有癌細胞を自然に標的とする有用な治療薬であると考えられる。このような抗体は、浸潤力を阻止する上で有用となりうる。ＥＭＰ２ポリペプチド及び核酸は、癌のワクチン療法に用いてもよい。

ＥＭＰ２発現が、組織タイプ及びステージによって層状化することを示す。（Ａ）乳房の正常及び腫瘍領域からの全組織ホモジネートに対し、ウエスタンブロット分析を実施した。ＥＭＰ２（１８ｋＤ）は、乳房腫瘍に高度に発現される。１人の健常な患者では、弱い発現が視覚化された。（Ｂ）組織アレイを用いて、正常及び乳房腫瘍組織をＥＭＰ２発現について染色した。腫瘍内の高いＥＭＰ２染色を有する代表的患者を示す。（Ｃ）棒グラフを用いて、各カテゴリーについてＥＭＰ２タンパク質発現の平均積算強度を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を表し；ｎは、サンプルの数である。ＥＭＰ２発現は、正常と比較して、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ、Ｐ＜０．０１）、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ、Ｐ＜０．０１）、及び転移（Ｐ＜０．０１）において有意に増大した。数は、分析したスポット数を表す。（Ｄ）１群の乳癌細胞におけるＥＭＰ２発現をウエスタンブロットにより評価した。ＥＭＰ２細胞を安定的に過剰発現するように、ＨＳ５７８／ＥＭＰ２細胞を作製した。（Ｅ）ＥＭＰ２の発現をマウス乳房細胞Ｄ２Ｆ２、ＥＭＰ２を過剰発現する細胞（Ｄ２Ｆ２／ＥＭＰ２）、並びに典型的マウス脾臓ホモジネートにおいて評価した。 抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１抗体及びダイアボディの存在下で低減した細胞浸潤を示す。（Ａ）６０μｇ／ｍｌの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１若しくは対照ＩｇＧ又は（Ｂ）２０μｇ／ｍｌのＥＭＰ２ダイアボディＫＳ８３若しくは対照ダイアボディＡ１０を細胞に１時間添加した。浸潤は、トランスウェルを通過して遊走した細胞の数として測定した。上部パネル：クリスタルバイオレットを用いて、細胞を視覚化した。下部パネル：３つの実験から平均した結果。（Ｃ）６０μｇ／ｍｌの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は対照ＩｇＧをＭＤＡ−ＭＢ−４６８に１時間添加した。これ以外に、２０μｇ／ｍｌのＥＭＰ２ ＫＳ８３ダイアボディ又は対照ダイアボディを添加した。次に、細胞を１２時間平板培養し、溶解させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、表示した抗体を用いてプロービングした。実験を３回繰り返し、代表的画像を示す。（Ｄ）３つの実験からのｐＳＲＣを、Image Jを用いて定量し、データを総Ｓｒｃレベルに対して標準化した。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又はＫＳ８３による処理が、ｐＳＲＣ発現を有意に低減した。値は、平均値（±ＳＥＭ）である。 抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１抗体及びダイアボディの存在下での細胞性塞栓の誘導を示す。（Ａ）ＨＳ５７８細胞は、内因性ＥＭＰ２発現を一切発現しないが、ＨＳ５７８／ＥＭＰ２細胞を、ＥＭＰ２を過剰発現するように作製した。６０μｇ／ｍｌの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は対照ＩｇＧ；２０μｇ／ｍｌのＥＭＰ２ダイアボディＫＳ８３又は対照ダイアボディを上記細胞に７２時間添加した。トリパンブルー色素排除を用いて、細胞生存能を決定したが、値は、３回の独立した実験からの結果を表す（±ＳＥＭ）。（Ｂ）ＺＲ−７５−１及びＭＢＡ−ＭＤ−４６８細胞を前述のように処理し、細胞生存能を決定した。値は平均値（±ＳＥＭ、ｎ＝３）である。（Ｃ）ＥＭＰ２ダイアボディ及びＩｇＧ１は、アポトーシスを促進する。ＺＲ−７５−１（上部パネル）及びＭＢＡ−ＭＤ−４６８（下部パネル）細胞を２０μｇ／ｍＬのＫＳ８３、２０μｇ／ｍＬの対照ダイアボディ、６０μｇ／ｍＬの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１、又は６０μｇ／ｍＬの対照ＩｇＧと一緒にインキュベートした。細胞を洗浄し、アネキシン（Annexin）Ｖ及びヨウ化プロピジウムで染色した。染色は、イソタイプ対照を上回るアネキシンＶ−７−アミノアクチノマイシンＤ陽性細胞（％）として表す。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。代表的グラフを示す。 ＥＭＰ２のターゲティングが腫瘍負荷を低下することを示す。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をヌードＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにｓ．ｃ．注射した。腫瘍が検出可能になったら、これらマウスに、モル当量のダイアボディ（１ｍｇ／ｋｇ）、ＩｇＧ１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）、又は表示の対照をｉ．ｔ．注射した（第０日）。週に２回マウスに注射し、カリパスを用いて、腫瘍体積をモニターした。ｎ＝６。^＊ｐ＜０．０５、ＫＳ８３及び抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１処理の両方について、それぞれダイアボディＡ１０及び滅菌食塩水と比較した。（Ｂ）第１８日に、腫瘍を切除し、ホルマリン固定してから、パラフィン包埋した。腫瘍組織学をヘモトキシリン及びエオシン染色によって評価した。代表的画像を示す。倍率：２０Ｘ。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに前述のように注射した。マウスを毎週５ｍｇ／ｋｇの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は対照ＩｇＧで処理した。カリパスを用いて、腫瘍体積を決定したが、値は、平均値（±ＳＥＭ、ｎ＝６）を示す。スチューデントｔ検定による比較、^＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）第１８日に、腫瘍を切除し、ホルマリン固定してから、パラフィン包埋した。腫瘍組織学をヘモトキシリン及びエオシン染色によって評価した。代表的画像を示す。倍率：２０Ｘ。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）Ramos細胞をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスにｓ．ｃ．注射した。腫瘍が急速に増殖したら、その週に２回（第０日及び第３日）５ｍｇ／ｋｇの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は対照ＩｇＧで全身処理した。腫瘍体積の値は、平均値（±ＳＥＭ、ｎ＝６）である。（Ｆ）第２８日の代表的ヘマトキシリン及びエオシン染色。倍率：２０Ｘ。スケールバー＝１００μｍ。 抗ＥＭＰ２抗体の存在下での正常位乳房腫瘍における腫瘍負荷の低下を示す。（Ａ）Ｄ２Ｆ２細胞は、対照ＩｇＧと比較して、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１で処理すると、アポトーシスを被りやすい。細胞をアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色した後、フローサイトメトリーによって分析した。画像は、同様の結果を示す３つの独立した実験の代表的なものである。（Ｂ）Ｄ２Ｆ２をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に注射した。腫瘍が初めて検出可能になったとき、マウスに、その週に２回（第０日及び第３日）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＥＭＰ２又は対照ＩｇＧを全身注射した。カリパスを用いて、腫瘍体積を決定した。Ｎ＝６。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による比較。（Ｃ）ヘモトクスリン及びエオシンで染色した第７日の代表的画像。倍率：２０Ｘ。スケールバー＝１００μｍ。 組換え抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１抗体の特性決定を示す。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１ヒト化抗体を構築した。構築物を確認するために、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１抗体を配列決定し、非還元（ＮＲ）及び還元（Ｒ）条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１５０ＫＤａバンドが出現したが、これは、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１に相当する分子量を呈示した。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１は、還元条件下、予測した６６ｋＤａサイズ（Ｈ鎖（Ｈ）及び２０ｋＤａ Ｌ鎖（Ｌ）バンドに相当する）のモノマーとして移動した。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１の特異性を特性決定するために、完全長抗ＥＭＰ２抗体の結合を、ＥＭＰ２ペプチド及びネイティブタンパク質に対して測定した。ヒトＥＭＰ２ペプチドを用いて、ネイティブ抗体の血清希釈物は、１０．８ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０を示した（Ｂ）。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１の結合特性をさらに決定するために、ネイティブＥＭＰ２とのその結合を、フローサイトメトリーを用いて決定した。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１は、Ｄ２Ｆ２細胞（Ｃ）上に存在するマウスＥＭＰ２と、ＥＭＰ２を過剰発現する子宮内膜癌細胞株、ＨＥＣ−１ａ／ＥＭＰ２細胞上のヒトＥＭＰ２（Ｄ）の両方を認識した。抗体の結合は、それがＥＭＰ２陰性細胞株Ramosに結合しなかったため、特異的であった（Ｅ）。最後に、ＨＥＣ−１Ａ野生型と、総ＥＭＰ２レベルの２〜４倍発現が増加しているＨＥＣ−１Ａ／ＥＭＰ２細胞を用いて、抗体の感度を測定した。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１によって、２つの細胞株の間で表面発現の差が検出された（Ｆ）。 ＥＭＰ２に対する抗体が全身毒性を示さないことを示す。抗ＥＭＰ２ダイアボディ（５５ｋＤａ）は、全身毒性を呈示しない。完全長抗体は、その原子価、分子サイズ、及び腫瘍取込み及び免疫系との相互作用などのｉｎ ｖｉｖｏ特性を改変する上で役立つ免疫グロブリン定常領域の存在が、ダイアボディとは異なる。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスに何らかの組織学的又は血清毒性を発生するかどうかを決定するために、毎週１０ｍｇ／ｋｇの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は滅菌食塩水を７週間にわたりマウスに注射した。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１の対照のいずれで処理したマウスも、体重に有意な差は示さなかった。ＡＳＴ及びコレステロールに若干の変化は見られたが、以下の表１に記載するように、変化は全て、マウスに認められる正常な範囲内であった。Ｎ＝４。

抗ＥＭＰ２抗体ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８９及びＫＳ８３の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。Kabat CDR定義を用いて、可変領域の好適なＣＤＲ配列を同定した。 本発明の抗体に使用するのに好適なＣＤＲ配列を示す抗ＥＭＰ２抗体ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８９及びＫＳ８３の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８９及びＫＳ８３ダイアボディのアミノ酸配列を示すが、それらのリンカー及びポリヒスチジンタグに下線を引いた。

発明の詳細な説明
概論
乳癌は、依然として世界中の女性において最も多く見られる悪性腫瘍である。特に攻撃型の乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現が欠失している。この攻撃型の乳癌は、一般にトリプルネガティブ乳癌と呼ばれる。トリプルネガティブ乳癌は、乳癌による全死亡者数の半数近くを占める。従って、トリプルネガティブ乳癌の分子基盤を理解することが、検出及び治療のための戦略を形成する上で必要である。

出願人は、トリプルネガティブ乳癌患者の７０％超でＥＭＰ２が高度に発現されることを発見した。トリプルネガティブ乳癌を診断する方法は、当業者には公知である。さらに、ＥＭＰ２のターゲティングが、乳癌を治療する上での治療戦略を提供しうることが既に報告されている。米国特許出願公開第２０１００２７２７３２号（その全体を参照として本明細書に組み込む）。従って、その第１の態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳癌を治療する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物と方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、生理学的に許容される担体又は薬学的に許容される担体を用いた抗ＥＭＰ２抗体の投与を提供する。別の態様では、本発明は、トリプルネガティブ乳癌を検出する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物と方法を提供する。別の態様では、本発明は、１種以上の別の療法と共投与する抗ＥＭＰ２抗体の組成物と方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法及び抗体と一緒に用いるためのコンパニオン診断方法及び製品を提供する。

抗体
本発明で有用な抗体は、伝統的な抗体、並びに抗体誘導体、断片及び模倣物などの様々な形態をしていてよい。本発明の特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９である。これらの抗体及びその使用について本明細書に記載する。

伝統的な抗体構造単位は、典型的に四量体を含む。各四量体は、典型的に、同じ２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（典型的に、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）から構成される。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、又はεとして分類され、それぞれ抗体のイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして定める。ＩｇＧは、限定するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などの複数のサブクラスを有する。ＩｇＭは、限定するものではないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２などのサブクラスを有する。従って、本明細書で用いる「イソタイプ」は、その定常領域の化学的及び抗原性特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。公知のヒト免疫グロブリンイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。治療抗体は、イソタイプ及び／又はサブクラスのハイブリッドも含んでよいことは理解すべきである。

各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担当する約１００〜１１０個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖及び軽鎖のＶドメインの各々について、３つのループを集めることにより、抗原結合部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域（以後「ＣＤＲ」と称する）と呼ばれ、この領域においては、アミノ酸配列の変化が最も大きい。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントにおいて、抗体同士で大幅に配列が異なることを指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。そうではなく、Ｖ領域は、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的一定の区間から成り、これらの領域は、長さが各々９〜１５アミノ酸か、又はこれより長い「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性の、より短い領域によって隔てられている。

各ＶＨ及びＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と、４つのＦＲから構成され、これらは、アミノ−末端からカルボキシ−末端へと、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順に配列される。

超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基約２４〜３４（ＬＣＤＲ１：「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域における約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は、重鎖を指す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)及び／又は超可変領域ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）；Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917）からのアミノ酸残基を含む。本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。

本明細書全体を通して、可変ドメイン（概算で、軽鎖可変領域の残基１〜１０７及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）における残基について言及する場合、一般にKabat番号付けシステムを用いる（例えば、Kabat et al. 前掲（1991））。

ＣＤＲは、抗原結合、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位（パラトープとして知られる）と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子群であり、通常、特定の構造的特徴、並びに特定の電荷特徴を有する。単一の抗原が、２以上のエピトープを有する場合もある。例えば、本明細書に記載するように、抗体は、ＥＭＰ２の推定第２細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基（例えば、特異的抗原結合ペプチドによって有効にブロックされるアミノ酸残基など）を含みうる。言い換えれば、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。

いくつかの実施形態において、エピトープは、配列番号２から誘導され、ここで、配列番号２は、ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧであり、ヒトＥＭＰ２の第２細胞外ループからの２０量体ポリペプチド配列を表す。

エピトープは、立体構造又は線状のいずれであってもよい。立体構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の様々なセグメントからの空間的に並列したアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖において隣接するアミノ酸残基によって生成されるものである。立体構造及び非立体構造エピトープは、変性溶剤の存在下で後のものではなく前のものとの結合が消失することで識別することができる。

エピトープは、固有の空間配置に、典型的に少なくとも３、より一般的には、少なくとも５又は８〜１０アミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が、別の抗体の標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイ、例えば、「ビニング」で確認することができる。

各鎖のカルボキシ−末端部分は、主にエフェクター機能を担当する定常領域を画定する。Kabatらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類し、そのリストを作成した（SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.を参照；その全体を参照として本明細書に組み込む）。

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスの場合、重鎖に数個の免疫グロブリンドメインがある。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、本明細書において、明瞭な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重鎖（ＣＨ）ドメインなどの重鎖ドメイン及びヒンジドメインである。ＩｇＧ抗体に関して、ＩｇＧイソタイプは各々、３つのＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧに関する「ＣＨ」ドメインは、以下の通りである。「ＣＨ１」は、KabatによるＥＵインデックスに従い、１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、KabatによるＥＵインデックスに従い、２３７〜３４０位を指し、また、「ＣＨ３」は、KabatによるＥＵインデックスに従い、３４１〜４４７位を指す。

重鎖の別のタイプのＩｇドメインは、ヒンジ領域である。「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、本明細書において、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインの間のアミノ酸を含む可変ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ２２０位で終了し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ２３７位で開始する。従って、ＩｇＧの場合、抗体ヒンジは、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むものと定義され、ここで、番号付けは、KabatによるＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ領域の場合には、下方のヒンジが含まれる。「下方のヒンジ」は、一般に２２６位又は２３０位を指す。

本発明において興味深いものは、Ｆｃ領域である。本明細書で用いる「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」とは、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域と、場合によってはヒンジの一部を含むポリペプチドを意味する。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリン、並びにこれらのドメインのＮ−末端の可変ヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）と、Ｃγ１（Ｃγ１）及びＣγ２（Ｃγ２）の間の下方のヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル−末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むものと定義されており、ここで、番号付けは、KabatによるＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、以下にさらに詳しく説明するように、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体又はＦｃＲｎ受容体との結合を改変するように、アミノ酸修飾がＦｃ領域に加えられる。

いくつかの実施形態では、抗体は、完全長である。本明細書において「完全長」とは、可変及び定常領域を含み、本明細書に概説する１つ以上の修飾を含む天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。

あるいは、抗体は、多様な構造であってよく、このようなものとして、限定するものではないが、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（「抗体模倣物」と呼ばれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）、及びそれぞれの断片が挙げられる。依然として依存する構造

一実施形態では、抗体は、抗体フラグメントである。特定の抗体フラグメントとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント、（ｉｖ）単一可変から構成されるｄＡｂフラグメント（Ward et al., 1989, Nature 341:544-546；その全体を参照として本明細書に組み込む）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、２つのドメインを結合させて、抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されている（Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883；その全体を参照として本明細書に組み込む）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ（国際公開第０３／１１１６１号；その全体を参照として本明細書に組み込む）、及び（ｉｘ）「ダイアボディ」又は「トリアボディ」、すなわち遺伝子融合物により構築された多価又は多重特異性フラグメント（Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479；国際公開第９４／１３８０４号；Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、その全体を参照として本明細書に組み込む）。

いくつかの実施形態では、抗体は、様々な種、例えば、キメラ抗体及び／又はヒト化抗体からの混合物であってよい。従って、本発明では、本明細書において配列により具体的に記載するもの以外のフレームワーク及び定常領域と一緒に、ＣＤＲセットを用いることができる。

一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」はいずれも、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的に、マウス（又は場合によってラット）由来の可変領域と、ヒト由来の定常領域を含む。「ヒト化抗体」は、一般に、可変ドメインフレームワーク領域が、ヒト抗体に存在する配列と交換されている非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体の場合、ＣＤＲを除く全抗体がヒト由来のポリヌクレオチドによってコードされているか、又は、そのＣＤＲ内を除いてこのような抗体と同一である。その一部又は全部が、非ヒト生物に由来する核酸によってコードされているＣＤＲをヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植して、抗体を作製し、その特異性を移植したＣＤＲによって決定する。このような抗体の作製については、例えば、国際公開第９２／１１０１８号、Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536（これら文献の全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。最初の移植構築物において喪失された親和性を回復するためには、選択アクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「復帰突然変異」が往々にして必要である（米国特許第５５３０１０１号；米国特許第５５８５０８９号；米国特許第５６９３７６１号；米国特許第５６９３７６２号；米国特許第６１８０３７０号；米国特許第５８５９２０５号；米国特許第５８２１３３７号；米国特許第６０５４２９７号；米国特許第６４０７２１３号；これら文献の全体を参照として本明細書に組み込む）。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含み、従って、典型的に、ヒトＦｃ領域を含む。ヒト化抗体はまた、遺伝子的に操作された免疫系を含むマウスを用いて作製することもできる。Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654（全体を参照として本明細書に組み込む）。非ヒト抗体をヒト化し、再構成するための様々な技術及び方法が、当分野において公知である（Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antib
odies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)及びそこに引用される参照文献；これらは全て、全体を参照として本明細書に組み込む）。ヒト化方法としては、限定するものではないが、以下に記載されている方法が挙げられる：Jones et al., 1986, Nature 321:522-525；Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329；Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536；Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33；He et al., 1998, J. Immunol. 160:1029-1035；Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9；Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185；O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8（これらは全て、全体を参照として本明細書に組み込む）。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減するヒト化又は他の方法としては、例えば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973（その全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されているような表面改変法が挙げられる。一実施形態において、親抗体は、当分野では公知のように、親和性成熟している。例えば、米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載されているように、ヒト化及び親和性成熟のために、構造ベースの方法を用いてもよい。抗体可変領域をヒト化する、及び／又は成熟させるために、選択を用いた方法を使用してもよく、そのようなものとして、限定するものではないが、以下に記載される方法がある：Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684；Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37):22611-22618；Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915；Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759（これらは全て、全体を参照として本明細書に組み込む）。その他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみの移植を含んでもよく、そのようなものとして、限定するものではないが、以下の文献に記載されている方法がある：米国特許出願第０９／８１０，５１０号；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125；De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084（これらは全て、全体を参照として本明細書に組み込む）。

一実施形態では、本発明の抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体であってよい。これらは、２つ（又は３つ以上）の異なる抗原、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は、ダイアボディである。

一実施形態では、抗体は、ミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である。Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061（その全体を参照として本明細書に組み込む）。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に結合することができ、これは、ヒンジ領域の一部又は全部を含んでもよい。

本発明の抗体は、一般に単離されているか、又は組換え体である。「単離された抗体」とは、様々な抗原特異性を有する他の抗体をほぼ含まない抗体を指す。例えば、ＥＭＰ２に特異的に結合する単離された抗体は、ＥＭＰ２以外の抗原に特異的に結合する抗体をほぼ含まない。

しかし、ヒトＥＭＰ２又はマウスＥＭＰ２のエピトープ、イソ型又は変異型に特異的に結合する単離された抗体は、他の関連抗原、例えば、ＥＭＰ２種相同体などの他の種由来の抗原との交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない。

様々な特異性を有する単離されたモノクローナル抗体を明瞭に規定した組成で組み合わせることができる。従って、所望であれば、例えば、抗体ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９を単一の製剤に組み合わせることができる。

以下のヒト由来の抗体配列は、ヒト（ＫＳ４９、ＫＳ８３）及びマウス（ＫＳ８３）ＥＭＰ２に特異的な高結合活性抗体をコードし、本発明のいずれかの態様での使用に適した抗体可変領域重鎖及び軽鎖を有する。
ＫＳ４９重鎖−

ＫＳ４９軽鎖−

ＫＳ８３重鎖−

ＫＳ８３軽鎖−

本発明のいずれかの態様に従い用いられる他のダイアボティとしては、ＫＳ４１及びＫＳ８９がある。
ＫＳ４１重鎖−

ＫＳ４１軽鎖−

ＫＳ８９重鎖−

ＫＳ８９軽鎖−

ネイティブ抗体、フラグメント抗体、又は合成骨格などの骨格にタンパク質をコードするのに用いられる抗ＥＭＰ−２可変領域配列は、ＥＭＰ−２に能動的に結合することができる。この結合によって、ＥＭＰ−２を検出し、ＥＭＰ−２機能を阻止するのにこれらのタンパク質を用いることができる。ネイティブ抗体骨格への、又は放射性核種で標識したｓｃＦｖ、トリアボディ、ダイアボディ若しくはミニボディとしての、上記の可変領域配列の発現は、ＥＭＰ−２担持細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出において特に有用である。これらの骨格又はネイティブ抗体骨格への発現は、ＥＭＰ−２の機能を阻止する、及び／又はＥＭＰ−２担持細胞（例えば、女性生殖器腫瘍）をｉｎ ｖｉｖｏで死滅させる上で好都合である。

いくつかの実施形態では、本発明は、図８に示すように、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、及びＫＳ８９から選択される抗体のＣＤＲ領域を含む抗ＥＭＰ−２配列を提供する。本発明によって提供されるＣＤＲ領域を用いて、限定するものではないが、抗体、ｓｃＦｖ、トリアボディ、ダイアボディ、ミニボディなどの抗ＥＭＰ−２結合タンパク質を構築することができる。特定の実施形態では、本発明の抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、及びＫＳ８９から選択される抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む。抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、例えば、本明細書に記載する抗体由来のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、又はこれらの組合せを含んでもよい。本発明の具体的実施形態において、抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、本明細書に記載する抗体の３つ全てのＣＤＲ−Ｈ配列、本明細書に記載する抗体の３つ全てのＣＤＲ−Ｌ配列、又はその両方を含んでもよい。抗ＥＭＰ２ ＣＤＲ配列は、抗体骨格、又はその断片に用いてもよく、また、同様に、ヒト化抗体、又はヒト化配列を含有する抗体を含んでもよい。これらの抗体は、例えば、ＥＭＰ−２を検出する、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＭＰ−２を発現する細胞を検出する、又はＥＭＰ−２機能を阻止するために用いてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ領域は、Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、接触（contact）定義、又はその他いずれかの好適なＣＤＲ番号付けシステムを用いて定義してよい。

いくつかの実施形態では、ＣＤＲは以下の通りである。
ＣＤＲ１重鎖

ＣＤＲ２重鎖

ＣＤＲ１軽鎖

ＣＤＲ２軽鎖

ダイアボディ配列（ＫＳ４９）
重鎖、ＫＳ４９

軽鎖、ＫＳ４９

ダイアボディ配列（ＫＳ８３）
重鎖、ＫＳ８３

軽鎖、ＫＳ８３

ダイアボディ配列（ＫＳ４１）
重鎖、ＫＳ４１

軽鎖、ＫＳ４１

ダイアボディ配列（ＫＳ８９）
重鎖、ＫＳ８９

軽鎖、ＫＳ８９

いくつかの実施形態では、本発明は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、及びＫＳ８９から選択されるダイアボディのＣＤＲを有する抗体（例えば、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ）又はその断片を提供する。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、ポリヒスチンタグを欠失している。別の実施形態では、ダイアボディは、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、又はＫＳ８９ダイアボディの軽鎖及び重鎖を有する。さらに別の実施形態では、抗体は、ポリヒスチジンタグを含有する、又は含有しないＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、及びＫＳ８９からなる群から選択されるダイアボディと配列が実質的に同じである。さらに別の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、及びＫＳ８９からなる群から選択されるダイアボディの軽鎖及び重鎖配列と配列が実質的に同じである。これらの同一性は、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、及び好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれを上回るアミノ酸配列同一性であってよい。前記のいずれかのいくつかの別の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、又はＫＳ８９ダイアボディのそれと同一のＣＤＲ配列を含む。

本発明の抗ＥＭＰ−２抗体は、ＥＭＰ２リガンドに特異的に結合する（例えば、配列番号１及び２のヒト及びマウスＥＭＰ２タンパク質）。

特定の抗原又はエピトープの特異的結合は、例えば、抗原又はエピトープについて、少なくとも約１０^−４Ｍ、少なくとも約１０^−５Ｍ、少なくとも約１０^−６Ｍ、少なくとも約１０^−７Ｍ、少なくとも約１０^−８Ｍ、少なくとも約１０^−９Ｍ、あるいは、少なくとも約１０^−１０Ｍ、少なくとも約１０^−１１Ｍ、少なくとも約１０^−１２Ｍ、又はそれを上回るＫＤを有する抗体によって呈示されうるが、ここで、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的に、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープと比較して、対照分子について２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００倍以上のＫＤを有することになる。

また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープについて少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００倍又はそれを上回る抗原又はエピトープに関するＫＡ又はＫａを有する抗体によって呈示することができ、ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。

本発明は、さらに変異型抗体を提供する。すなわち、本発明の抗体に実施することができる多数の修飾があり、例えば、限定するものではないが、ＣＤＲ中のアミノ酸修飾（親和性成熟）、Ｆｃ領域中のアミノ酸修飾、グリコシル化変異型、他のタイプの共有結合修飾などがある。

本明細書において「変異型」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親ポリペプチドとは異なるポリペプチド配列を意味する。アミノ酸修飾としては、置換、挿入及び欠失が挙げられるが、多くの場合、前者が好ましい。

一般に、変異型は、本明細書に記載するように、タンパク質の機能が依然として存在する限り、いくつの修飾を含んでもよい。すなわち、例えば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９のＣＤＲを用いて作製されたアミノ酸変異型の場合には、抗体は、ヒト及び／又はマウスＥＭＰ２の両方にやはり特異的に結合すべきである。同様に、例えば、Ｆｃ領域を用いてアミノ酸変異型を作製する場合、変異型抗体は、抗体の特定の適用又は適応のために必要な受容体結合機能を維持すべきである。

しかし、多くの場合、目標は最小数の修飾で機能を改変することであるため、一般に、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換が用いられる。いくつかの実施形態では、１〜５の修飾があるが、１〜２、１〜３及び１〜４の修飾も多くの実施形態において用いられる。

上記の数のアミノ酸修飾は、機能性ドメイン内であってよいことに留意すべきである。例えば、野生型又は操作されたタンパク質のＦｃ領域では１〜５の修飾、並びにＦｖ領域では１〜５の修飾を有することが望ましいであろう。変異型ポリペプチド配列は、好ましくは、親配列（例えば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、若しくはＫＳ８９の可変領域、定常領域、並びに／又は重鎖及び軽鎖配列）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は９８又は９９％までの同一性を有する。配列のサイズによって、同一性（％）はアミノ酸の数に応じて変動することは留意すべきである。

本明細書において「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置のアミノ酸の、別のアミノ酸による置換を意味する。例えば、置換Ｓ１００Ａは、１００位でのセリンがアラニンで置換された変異型ポリペプチドを指す。本明細書で用いる「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。本明細書で用いる「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列における特定の位置のアミノ酸の除去を意味する。

本明細書で用いる「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、又は「前駆体タンパク質」とは、修飾されていないポリペプチドを意味し、これは、後に修飾されて、変異型を生成する。一般に、本明細書の親ポリペプチドは、Ａｂ７９及びＡｂ１９である。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、これをコードするアミノ酸配列を指すこともある。従って、本明細書で用いる「親Ｆｃポリペプチド」は、修飾されて変異型を生成するＦｃポリペプチドを意味し、また、本明細書で用いる「親抗体」は、修飾されて変異型を生成する抗体を意味する。

本明細書における「野生型」又は「ＷＴ」又は「ネイティブ」とは、天然に存在するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味し、これらは対立遺伝子変化を含む。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に修飾されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。

本明細書における「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、野生型Ｆｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異型は、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異型ポリペプチドを含む組成物、又はアミノ酸配列を指すこともある。

いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾を抗体のＣＤＲ（ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９）の１つ以上に実施する。一般に、いずれか単一のＣＤＲにおいて、１個のみ又は２個又は３個のアミノ酸を置換し、一般に４、５、６、７、８９又は１０以下の変更を１組のＣＤＲ内で実施する。しかし、いずれかのＣＤＲにおける、置換なし、１つ、２つ又は３つの置換のいずれかの組合せを独立に、及び任意選択でいずれか別の置換と組み合わせることができることは理解すべきである。

いくつかの態様では、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾は、「親和性成熟」と呼ばれる。「親和性成熟」抗体は、これらの改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改善をもたらす、１つ以上のＣＤＲにおける１つ以上の改変を含むものである。いくつかの態様では、稀ではあるものの、抗原に対する抗体の親和性を低減するのが望ましい場合もあるが、これは一般に好ましくない。

親和性成熟は、「親」抗体と比較して、少なくとも約１０％から５０〜１００〜１５０％若しくはそれより高く、又は１〜５倍、抗原に対する抗体の親和性を増大するように実施することができる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原についてのナノモル又はピコモル親和性を有する。親和性成熟抗体は、公知の手順によって生成される。例えば、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載するMarks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783を参照されたい。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、以下の文献に記載されている：Barbas, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813；Shier et al., 1995, Gene 169:147-155；Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9；及びHawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896。

この他に、「サイレントな」、例えば、抗原に対する抗体の親和性を有意に改変しないアミノ酸修飾を本発明の抗体のＣＤＲの１つ以上に実施することもできる。これらは、発現の最適化（本発明の抗体をコードする核酸について実施することができるように）などのいくつかの理由のために実施することができる。

従って、本発明のＣＤＲ及び抗体の定義には、変異型ＣＤＲ及び抗体が含まれる；すなわち、本発明の抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９の１つ以上にアミノ酸修飾を含むことができる。加えて、以下に概説するように、アミノ酸修飾は、独立に、かつ任意選択で、フレームワーク及び定常領域など、ＣＤＲ外部のいずれかの領域にも実施することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、変異型Ｆｃドメインから構成される。当分野では公知のように、抗体のＦｃ領域は、いくつかのＦｃ受容体及びリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる数多くの重要な機能的能力を付与する。これらのＦｃ受容体としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：（ヒトの場合）ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、例えば、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃ；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、例えば、イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２など）、並びにＦｃγＲＩＩｃ；並びにＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、例えば、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関係するアロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）並びにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）、ＦｃＲｎ（新生児型受容体）、Ｃｌｑ（補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与する補体タンパク質）並びにＦｃＲｎ（血清半減期に関与する新生児型受容体）。例えば、以下：米国特許出願第１１／８４１，６５４号及びそこに引用される参照文献、米国特許第２００４／０１３２１０号、米国特許第２００５／００５４８３２号、米国特許第２００６／００２４２９８号、米国特許第２００６／０１２１０３２号、米国特許第２００６／０２３５２０８号、米国特許第２００７／０１４８１７０号、米国特許出願第１２／３４１，７６９号、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許第７，６７０，６００号、米国特許第６，０８６，８７５号（これらはすべて、参照としてその全体を本明細書に明示的に組み込む）に概略が説明されているように、また、特にＦｃ受容体との結合を増大する特定のアミノ酸置換のために、１つ以上の位置に好適な修飾を実施することができる。

上に概説した修飾以外に、別の修飾を実施することもできる。例えば、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋結合の組込みによって分子を安定化することができる（Reiter et al. 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245；その全体を参照として本明細書に組み込む）。さらに、以下に概説するように、実施することができる抗体の様々な共有結合修飾がある。

抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれ、一般に、しかし常にではないが、翻訳後に行う。例えば、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択した側鎖又はＮ−又はＣ−末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、抗体の数種の共有結合修飾を分子に導入する。

最も一般的には、システイニル残基を、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα−ハロ酢酸塩（及び対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を取得する。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどとの反応によって誘導体化してもよい。

さらに、システインでの修飾は、以下により詳しく説明する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の用途において特に有用である。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域を操作して、特に「チオール反応性」である１つ以上のシステインを含有させてもよく、これによって、薬物部分のより特異的かつ制御された配置を可能にする。例えば、米国特許第７，５２１，５４１号（その全体を参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０のジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。というのは、この物質は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるからである。また、パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である。反応は、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施するのが好ましい。

リシニル及びアミノ末端残基は、スクシン酸又は他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質を用いた誘導体化は、リシル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに好適な他の試薬としては、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタジオン；及びトランスアミナーゼにより触媒されるグリオキシル酸塩との反応が挙げられる。

アルギニル残基は、１種又は数種の従来の試薬との反応により修飾するが、そのような試薬の中でも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、アルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これら試薬は、アルギニンのε−アミノ基と同様に、リシンの基とも反応しうる。

チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることによって、チロシル残基中への分光学的標識の導入において、特に有利に実施することができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基は、１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いて、ヨウ素化してラジオイムノアッセイに使用するための標識タンパク質を調製するが、その際、前述したクロルアミンＴ方法が好適である。

カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｎ−−Ｒ’）（式中、Ｒ及びＲ’は、任意選択で異なるアルキル基である）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾する。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換する。

二官能試薬による誘導体化は、以下に説明する方法に加えて、様々な方法で使用する水不溶性支持マトリックス又は支持面に、抗体を架橋させる上で有用である。一般に用いられている架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能イミドエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンジミジルエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能マレイミドなどが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤によって、光励起性中間体が得られ、これは、光の存在下で架橋を形成することができる。これ以外にも、シノモルグルソーゲンブロミド活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックス、並びに米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号（これらはすべて、全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されている反応性基質をタンパク質固定化に用いる。

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化することが多い。あるいは、これらの残基を穏やかな酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に含まれる。

他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86[1983]；全体を参照として本明細書に組み込む）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びいずれかのＣ−末端カルボキシル基のアミド化がある。

さらに、当業者には理解されるように、標識（蛍光、酵素、磁気、放射性などを含む）は全て、抗体（及び本発明の他の組成物）に添加することができる。

別タイプの共有修飾としては、グリコシル化の改変である。別の実施形態では、本明細書に開示する抗体を、１つ以上の改変糖型を含むように修飾することができる。本明細書で用いる「改変糖型」とは、抗体に共有結合した炭水化物を意味し、前記炭水化物組成は、親抗体のそれとは化学的に異なる。改変糖型は、限定するものではないが、エフェクター機能を増強又は低減するなどの様々な目的に有用である。改変糖型の好ましい形態は、アフコシル化であり、これは、恐らく、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体とのより緊密な結合による、ＡＤＣＣ機能の増大に関連することがわかっている。これに関して、「アフコシル化」とは、宿主細胞に産生される抗体の大部分が、フコースを実質的に含まない、例えば、９０〜９５〜９８％の産生抗体が、抗体の炭水化物部分（一般にＦｃ領域のＮ２９７に結合している）の成分として、感知可能なフコースを含まないことを意味する。機能的に定義すれば、アフコシル化抗体は、一般に、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する少なくとも５０％以上の親和性を呈示する。

改変糖型は、当分野では公知の様々な方法によって調製することができる（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473；米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；国際公開第００／６１７３９Ａ１号；国際公開第０１／２９２４６Ａ１号；国際公開第０２／３１１４０Ａ１号；国際公開第０２／３０９５４Ａ１号；参照として本明細書に組み込む；（Potelligent（登録商標）技術［Biowa, Inc., Princeton, NJ]；GlycoMAb（登録商標）グリコシル化工学技術［Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland])。これらの技術の多くは、例えば、操作された若しくは他の様々な生物若しくは細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）にＩｇＧを発現することにより、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスエラーゼ］及び／若しくはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）、又はＩｇＧが発現された後に炭水化物を修飾することによって、Ｆｃ領域に共有結合したフコシル化及び／若しくはバイセクティング（bisecting）オリゴ糖のレベルを制御することに基づく。例えば、「糖鎖改変抗体」又はSeattle Geneticsの「ＳＥＡ技術」は、生成中に、フコシル化を阻害する修飾サッカリドを添加することにより作用する。例えば、第２００９０３１７８６９号（その全体を参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。改変糖型は、典型的に、異なる炭水化物又はオリゴ糖を指す。従って、抗体は、改変糖型を含むことができる。

あるいは、改変糖型は、異なる炭水化物又はオリゴ糖を含むＩｇＧ変異型を指す場合もある。当分野では公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下に述べる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在）、又はタンパク質が生成される宿主細胞若しくは生物の両方に左右されうる。具体的発現系については以下に述べる。

ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にＮ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合についての認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的グリコシル化部位が形成される。Ｏ−結合型グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つと、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン若しくはトレオニンとの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン若しくは５−ヒドロキシリシンを用いてもよい。

抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が、前述したトリペプチド配列（Ｎ−結合型グリコシル化部位の場合）の１つ以上を含むように、これを改変することによって達成するのが好都合である。また、改変は、出発配列に対する１つ以上のセリン又はトレオニン残基（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）の付加、又はこれらによる置換によって達成することもできる。容易にするため、抗体アミノ酸配列は、特に、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成されるように、前選択した塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通して改変するのが好ましい。

抗体への炭水化物部分の数を増加する別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合によるものである。これらの方法は、Ｎ−及びＯ−結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞でのタンパク質の生成を必要としない点で有利である。用いる結合様式に応じて、糖を（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、若しくはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させてよい。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号、及びAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306（いずれも全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。

出発抗体に存在する炭水化物部分（例えば、翻訳後）の除去は、化学的又は酵素により達成することができる。化学的脱グリコシルは、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は同等の化合物に対するタンパク質の暴露を必要とする。この処理により、ポリペプチドをインタクトに維持しながら、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除いてほとんど又は全ての糖の切断が起こる。化学的脱グリコシルは、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及びEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131（いずれも全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350（全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されているように、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。潜在的グリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105（全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されているように、化合物ツニカマイシンを用いて防止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。

抗体の別のタイプの共有結合修飾は、抗体と、多種の非タンパク質性ポリマー、例えば、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンなどの様々なポリオールとの結合を含み、これは、例えば、2005-2006 PEG Catalog from Nektar Therapeutics（Nektarウェブサイトで閲覧可能）、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号又は同第４，１７９，３７７号（これらは全て、全体を参照として本明細書に組み込む）に記載の様式で行う。さらに、当分野では公知のように、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために、アミノ酸置換を抗体内での様々な位置で行ってもよい。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号（全体を参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。

本発明は、各々が、特定のセットのＣＤＲ（上に概説したように、いくつかのアミノ酸置換）を含むいくつかの抗体を提供する。上に概説したように、抗体は、６つのＣＤＲのセットにより、可変領域により、又は定常領域を含む完全長重鎖及び軽鎖により、定義することができる。さらに、上に概説したように、アミノ酸置換を行ってもよい。一般に、ＣＤＲ内の変化に関する場合、ＣＤＲの長さが比較的短いために、アミノ酸修飾は、一般に、実施されうるアミノ酸修飾の数によって表される。これはまた、変化の数に加えて、可変、定常又は完全長配列に導入することができるアミノ酸修飾の数について述べる場合も適用可能であるが、これらの変化を「同一性％」によって定義することも適切である。従って、本明細書に記載するように、本発明に含まれる抗体は、本明細書に記載するＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９に対して８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一である。

いくつかの実施形態では、ヒトＥＭＰ２及び／又はマウスＥＭＰ２との結合について、本発明の抗体（例えば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９）と競合する抗体が提供される。２つ以上の抗ＥＭＰ２抗体によるＥＭＰ２又はＥＭＰ２の一部との結合についての競合は、当分野では公知のように、あらゆる好適な技術によって決定することができる。

本発明に関して「競合」とは、試験化合物の存在下で、本発明の抗体（例えば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９）が、その特定の結合パートナー、例えば、ＥＭＰ２に結合する傾向が検出可能に有意に低下することを指す。典型的に、競合は、競合物質の存在下で、ＥＭＰ２に対する本発明の抗体の結合の少なくとも約１０〜１００％の低下を意味し、これは、ＥＬＩＳＡ又はBiacore（登録商標）アッセイなどの標準的技術によって測定される。従って、例えば、抗体が十分に競合性であるとみなす前に、少なくとも約１０％の相対的阻害が検出される；少なくとも約１５％の相対的阻害が検出される；又は少なくとも約２０％の相対阻害が検出される、競合性についての基準を設定することができる。競合抗体に属するエピトープを抗原に接近させて配置する場合、競合は、ＥＭＰ２結合の約４０％超の相対阻害（例えば、少なくとも約５０％の阻害などの少なくとも約４５％の阻害、例えば、少なくとも約６０％の阻害などの少なくとも約５５％の阻害、例えば、少なくとも約７０％の阻害などの少なくとも約６５％の阻害、例えば、少なくとも約８０％の阻害などの少なくとも約７５％の阻害、例えば、少なくとも約９０％の阻害などの少なくとも約８５％の阻害、例えば、少なくとも約９５％の阻害、又はそれより高いレベルの相対阻害）によって表されうる。

いくつかの態様では、競合的結合アッセイの成分の１つ以上を標識する。

また、例えば、ＥＭＰ２の特定の領域の抗体結合性が、その断片に保持されている状況において（例えば、様々な被験断片中に位置する十分に提示された線状エピトープ、又は十分に大きなＥＭＰ２断片並びにＥＭＰ２に提示される立体構造エピトープの場合）、２つ以上のＥＭＰ２エピトープ、及び／又はＥＭＰ２の一部に関して、抗ＥＭＰ２抗体同士の間で競合が存在する場合もある。

競合の評価は、典型的に、本発明の抗体、ＥＭＰ２（ヒト若しくはマウスのいずれか又は両方）、及び試験分子を用いた相対的阻害性結合の評価を含む。試験分子は、他の抗体、小分子、ペプチドなどを含むあらゆる分子を包含しうる。他の本発明の分子に対して、該当する分子の選択性及び／又は特異性に関する情報を与える比較を実施するのに十分な量で、化合物を混合する。

試験化合物、ＥＭＰ２及び本発明の抗体の量は変動しうる。例えば、ＥＬＩＳＡ評価の場合、競合が存在するか否かを評価するために、約５〜５０μｇ（例えば、約１０〜５０μｇ、約２０〜５０μｇ、約５〜２０μｇ、約１０〜２０μｇなど）の抗ＥＭＰ２抗体及び／又はＥＭＰ２標的が必要である。条件も結合に好適でなければならない。典型的に、生理学的条件又は生理学的に近い条件（例えば、温度約２０〜４０℃、ｐＨ約７〜８など）が抗ＥＭＰ２：ＥＭＰ２結合に好適である。

往々にして、競合は、ＥＬＩＳＡ及び／又はＦＡＣＳ分析によって決定される約５％超の、有意に高い相対阻害によって表される。特定の状況（例えば、競合分析を用いて、ＥＭＰ２と、別のペプチド又は分子との結合（例えば、ＥＭＰ２の天然の結合パートナー又は天然に存在する抗ＥＭＰ２抗体）を阻止する機能を意図して設計された新しい抗体を選択又はスクリーニングする場合）において、何が競合の好適なレベルであるかの基準／決定要素として、より高い相対阻害の閾値を設定するのが望ましいこともある。

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２中の１つ以上の残基又は領域と特異的に結合するだけではなく、ＥＭＰ２に対する相同性を有する他のタンパク質と交差反応しない。

典型的に、「交差反応性の欠如」とは、好適なアッセイ条件下で十分な量の分子を用いたＥＬＩＳＡ及び／又はＦＡＣＳ分析によって評価される場合、分子同士の約５％未満の相対競合阻害を意味する。

開示する抗体は、リガンド−受容体相互作用を阻止する、又は受容体成分相互作用を阻害する上で有用となりうる。本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、「阻止」又は「中和」する抗体であってよい。「中和抗体」とは、ＥＭＰ２との結合によって、ＥＭＰ２の生体活性、例えば、リガンドと相互作用する能力、酵素活性、及び／又はシグナル伝達能力の阻害を引き起こす抗体を指すものとする。ＥＭＰ２の生体活性の阻害は、当分野では公知のいくつかの標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイの１つ以上によって評価することができる。

「結合を阻害する」又は「結合を阻止する」（例えば、ＥＭＰ２結合パートナーとＥＭＰ２の結合の阻害／阻止に関して言うとき）は、部分的及び完全な阻害／阻止の両方を包含する。ＥＭＰ２結合パートナーとＥＭＰ２の結合の阻害／阻止は、阻害又は阻止がない場合に、ＥＭＰ２結合パートナーがＥＭＰ２に結合するときに起こる通常のレベル又は通常タイプの細胞シグナル伝達を低減又は改変しうる。阻害及び阻止は、抗ＥＭＰ２抗体と接触していないリガンドと比較して、抗ＥＭＰ２抗体と接触させた場合、ＥＭＰ２結合パートナーとＥＭＰ２の結合親和性に測定可能な低減を含むことも意図し、例えば、ＥＭＰ２結合パートナーとＥＭＰ２の結合を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％又は１００％阻止することを含む。

本発明は、さらに、開示する抗ＥＭＰ２抗体を生成する方法も提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。当業者には理解されるように、これは、抗体の性質に応じて、様々な方法で実施することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体が、例えば、完全長の伝統的抗体である場合、抗体が産生され、これを単離することができる条件下の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域。

一般に、本発明の抗体をコードする核酸が提供される。このようなポリヌクレオチドは、重鎖及び軽鎖各々の可変及び定常領域の両方をコードするが、本明細書に記載の組成物に応じて、本発明では他の組合せも考慮される。本発明はまた、開示するポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチド断片及びこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列も考慮する。

ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡの形態であってよい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、及び合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲に含まれる。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖のいずれでもよく、一本鎖の場合、コード（センス）鎖又は非コード（アンチセンス）鎖のいずれであってもよい。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書に記載するコード配列と同一でもよいし、又は異なるコード配列であってもよく、この配列は、遺伝子コードの重複性又は同義性の結果として、本明細書に記載するＤＮＡと同じポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸は、発現ベクターに組み込まれるが、これは、染色体外であってもよいし、あるいは、導入される宿主細胞のゲノムに組み込むように設計してもよい。発現ベクターは、適切な調節配列（限定するものではないが、転写及び翻訳制御配列、プロモータ、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点など）又は他の成分（選択遺伝子など）をいくつ含んでもよく、これらは全て、当分野では公知のように、機能的に連結されている。いくつかの態様では、２つの核酸を用いて、各々を異なる発現ベクターに導入する（例えば、第１発現ベクターに重鎖を、第２発現ベクターに軽鎖を）か、あるいは、同じ発現ベクターに導入することもできる。当業者であれば、調節配列の選択などの発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどに応じて変わりうることは理解されよう。

一般に、核酸及び／又は発現は、選択した宿主細胞に適したあらゆる方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて、核酸分子が、１つ以上の発現制御エレメントに機能的に連結するように、組換え宿主細胞を作製することができる（例えば、ベクター、すなわち、細胞内のプロセスによって形成され、宿主細胞ゲノムに組み込まれた構築物で）。得られた組換え宿主細胞は、発現に好適な条件下（例えば、誘導物質の存在下、好適な非ヒト動物において、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助剤などを添加した好適な培地において）で維持することができ、これによって、コードしたポリペプチドを生成する。いくつかの態様では、１つの細胞で重鎖を、また別の細胞で軽鎖を生成する。

発現のための宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当分野では公知であり、そのようなものとして、American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAから入手可能な多くの不死化細胞株があり、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、及び多数の他の細胞株が含まれる。限定するものではないが、細菌、酵母、昆虫、及び植物などの非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現することもできる。いくつかの実施形態では、ウシ又はニワトリなどのトランスジェニック動物において抗体を生成することもできる。

処理方法
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のための抗体組成物
本発明に従い用いられる抗体の製剤は、所望の純度の抗体を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、貯蔵用に調製する。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用する用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、以下のものを含む：リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース又はデキストリンなどの他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ)などの非イオン系界面活性剤。

本明細書に記載する製剤はまた、治療しようとする特定の適応症について必要に応じ、２種以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましい場合もある。あるいは、又はこれに加えて、組成物は、細胞傷害性物質、サイトカイン、増殖阻害剤及び／若しくは小分子アンタゴニストを含んでもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で、組み合わせて存在するのが好適である。

また、活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって、調製したマイクロカプセル中に、閉じ込めてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いるべき製剤は、滅菌、又はほぼ滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。

徐放剤を調製してもよい。徐放剤の好適な例として、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスがあり、このマトリックスは、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルなどの造形製品の形態をしている。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸リュープロリドから構成される注射用ミクロスフィア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び酪酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたって分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。

カプセル化抗体が体内に長時間残っていると、３７℃の水分に暴露されるために、変性又は凝集する恐れがあり、これによって、生体活性の低減及び免疫原性の変化が起こりうる。関与する作用機構に応じて、安定化のための合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが判明した場合には、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分を制御し、適切な添加剤を使用して、特殊なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化を達成することができる。

投与方法
本発明の抗体及び化学療法薬は、ボーラスとしての、又は一定期間の持続注入による静脈内投与、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、又は吸入経路などの公知の方法に従って、被検者に投与する。特定の態様では、本発明の抗体及び化学療法薬は、癌被検者に投与する。特定の態様では、本発明の抗体及び化学療法薬は、乳癌の被検者に投与する。特定の態様では、本発明の抗体及び化学療法薬は、トリプルネガティブ乳癌の被検者に投与する。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。

治療方法
本発明の方法では、疾患又は病状に関して正の治療応答をもたらすために治療法を用いる。「正の治療応答」とは、疾患若しくは病状における改善、及び／又は疾患若しくは病状に関連する症状の改善を意味する。例えば、正の治療応答は、疾患における以下の改善のうち１つ以上を指す：（１）腫瘍細胞の数の減少；（２）腫瘍細胞死の増加；（３）腫瘍細胞生存の阻害；（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度までの緩徐、好ましくは停止）；（６）患者の生存率の増加；及び（７）疾患又は病状に関連する１つ以上の症状の幾分の軽減。

所与の疾患又は病状における正の治療応答は、その疾患又は病状に固有の標準化応答基準によって決定することができる。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像化、内視鏡検査法、腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技術を用いて、腫瘍形態学（すなわち、全腫瘍負荷、腫瘍サイズなど）の変化について評価することができる。

これらの正の治療応答以外に、療法を受ける被検者は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を享受しうる。

このような応答は、本発明の方法に従う治療後、少なくとも４〜８週間、又は場合によっては６〜８週間持続しうる。あるいは、疾患の改善は、部分的応答であるものとして分類してもよい。「部分的応答」とは、新たな病変の非存在下で、あらゆる測定可能な腫瘍負荷（すなわち、被検者に存在する悪性細胞の数、又は腫瘍塊の測定された大きさ、若しくは異常モノクローナルタンパク質の量）の少なくとも約５０％の減少を意味し、これは、４〜８週間、又は６〜８週間持続しうる。

本発明による治療は、「治療に有効な量」の使用薬剤を含む。「治療に有効な量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な用量で、かつそれに必要な期間にわたって有効である量を指す。

治療に有効な量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子に応じて変動しうる。治療に有効な量はまた、抗体又は抗体部分のあらゆる毒性若しくは有害な作用より、治療に有益な作用の方がまさるものでもある。

腫瘍療法に関して「治療に有効な量」は、疾患の進行を安定化するその能力によって測定することもできる。化合物が癌を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価することができる。

あるいは、組成物のこの特性は、当業者には公知のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、化合物が、細胞増殖を阻害するか、又はアポトーシスを誘導する能力を調べることによって評価してもよい。治療に有効な量の治療化合物は、腫瘍サイズを縮小するか、あるいは、被検者における症状を改善しうる。通常の当業者であれば、被検者の大きさ、被検者の症状の重症度、及び選択した特定の組成物又は投与経路などの因子に基づいて、このような量を決定することができる。

投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節する。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、複数回に分けた用量を所定時間にわたって投与してもよく、あるいは、治療状況の要求事項が示すように、用量を比例的に減少又は増加してもよい。非経口用組成物は、投与を容易にすると共に用量を均一にするために、単位用量形態で製剤化してよい。本明細書で用いる単位用量形態は、治療しようとする被検者に対する単位用量として適した物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要な製剤用担体と一緒に、所望の治療効果を生み出すように計算された既定量の活性化合物を含む。

本発明の用量単位形態についての詳細は、（ａ）活性化合物に固有の特徴及び達成しようとする具体的治療効果、並びに（ｂ）個体の感受性に関して、こうした治療用の活性化合物を配合する分野に固有の制約事項によって決まり、これらに直接左右される。

本発明で用いる抗ＥＭＰ２抗体について効率的な投与及び投与計画は、治療しようとする疾患又は病状に応じて変わり、当業者が決定することができる。

本発明で用いる抗ＥＭＰ２抗体の治療に有効な量の非制限的範囲の例は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５、例えば、約０．３、約１、又は約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗体は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、例えば、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、８ｍｇ／ｋｇの用量である。

当分野で通常の技術を有する医学専門家は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医は、所望の治療効果を達成するのに必要な用量より低いレベルで、医薬組成物中に用いられる薬物の用量を開始し、所望の治療効果が達成されるまで、用量を次第に増加することができる。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、２００〜４００ｍｇ／ｋｇの用量で毎週注入によって投与する。このような投与は、例えば、１〜８回、例えば、３〜５回繰り返してよい。投与は、持続注入によって、２〜２４時間、例えば、２〜１２時間にわたり実施してよい。

一実施形態において、毒性を含む副作用を低減するのに必要であれば、長時間、例えば、２４時間超にわたる緩徐な持続注入によって抗ＥＭＰ２抗体を投与する。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、毎週２５０ｍｇ〜２０００ｍｇ、例えば、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ又は２０００ｍｇの用量で、８回まで、例えば４〜６回投与する。投与は、２〜２４時間、例えば２〜１２時間の期間にわたる連続注入によって実施してもよい。このような投与計画は、必要に応じて、例えば、６ヵ月又は１２ヵ月後に１回以上繰り返してもよい。投薬量は、例えば、生物学的サンプルを採取し、抗ＥＭＰ２抗体の抗原結合領域をターゲティングする抗イディオタイプ抗体を用いることにより、投与時の血液中の本発明の化合物の量を測定することによって、決定又は調節することができる。

別の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、２〜１２週間、例えば、３〜１０週間、例えば、４〜８週間にわたり毎週１回投与する。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、維持療法によって、例えば、６ヵ月以上の期間にわたり週１回投与する。

一実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、１回の抗ＥＭＰ２抗体の注入と、その後の放射性同位体に結合させた抗ＥＭＰ２抗体の注入を含む計画によって投与する。この計画は、例えば、７〜９日後に繰り返してもよい。

非制限的例として、本発明の治療は、抗体の毎日用量として１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量で、治療開始から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日後の少なくとも１つ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０週後の少なくとも１つ、又はこれらのいずれかの組合せで、２４、１２、８、６、４、又は２時間毎の単回若しくは分割用量、又はこれらのいずれかの組合せを用いて提供してもよい。

併用療法
いくつかの実施形態において、その抗ＥＭＰ２抗体分子は、１種以上の別の治療薬、例えば、化学療法剤と組み合わせて用いる。ＤＮＡ損傷化学療法剤の非制限的例として、以下のものが挙げられる：トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン及びその類似体若しくは代謝物、並びにドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、及びダウノルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、及びシクロホスファミド）；ＤＮＡインターカレータ（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン）；ブレオマイシンなどのＤＮＡインターカレータ及びフリーラジカル発生剤；並びにヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及びヒドロキシ尿素）。

細胞複製を破壊する化学療法剤としては、以下のものが挙げられる：パクリタキセル、ドセタキセル、及び関連類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、及び関連類似体；タリドミド、レナリドミド、及び関連類似体（例えば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブメシレート及びゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤などのＮＦ−κＢ阻害剤；癌に過剰発現したタンパク質に結合する抗体、並びに癌において上方制御、過剰発現又は活性化されることがわかっているタンパク質又は酵素の他の阻害剤（これらの阻害により、細胞複製を下方制御する）。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に記載の、又は現時点で若しくは後に当業者に周知の化学療法剤のいずれかによる治療の前、これと同時、又はその後に用いることができる。

本明細書に記載する方法の効果
本発明の特定の態様では、腫瘍特異的マーカの血清濃度の低下、全生存時間の増加、腫瘍サイズの縮小、癌寛解、転移マーカ応答の低減、及び化学療法による有害な作用の低減によって、抗ＥＭＰ２療法の効果を測定する。

本発明のいくつかの態様では、コンパニオン診断方法及び製剤を用いて、効果を測定する。コンパニオン診断による測定は、抗ＥＭＰ２治療の前、最中、又はその後に実施することができる。

コンパニオン診断
別の実施形態において、本明細書の開示内容は、コンパニオン診断方法及び製剤に関する。一実施形態では、乳癌、特に、本明細書に記載するように、トリプルネガティブ乳癌の治療をモニターするために、コンパニオン診断方法及び製剤を用いることができる。いくつかの実施形態では、コンパニオン診断方法及び製剤は、タンパク質、遺伝子又は特定の遺伝子突然変異のレベルを測定するための分子アッセイを含む。このような測定値を用いて、例えば、抗ＥＭＰ２療法が特定の個体に有益となるか否かを予測すること、抗ＥＭＰ２療法薬の有効な用量を予測すること、抗ＥＭＰ２療法薬をモニターすること、抗ＥＭＰ２療法薬を調節すること、抗ＥＭＰ２療法薬を個体に合わせて調節すること、並びに癌進行及び寛解を追跡することができる。

いくつかの実施形態では、コンパニオン診断を用いて、併用療法をモニターすることができる。

いくつかの実施形態では、コンパニオン診断は、本明細書に記載する抗ＥＭＰ２療法を含んでよい。

いくつかの実施形態では、コンパニオン診断は、抗ＥＭＰ２療法の前、最中、又はその後に用いることができる。

製造品
別の実施形態において、前述した疾患の治療に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器及びラベルを含む。好適な容器として、例えば、瓶、バイアル、注射器、及び試験管がある。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、病状を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを備えていてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穴あけ可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の活性薬剤は、抗体である。容器上の、又は容器に付随するラベルは、選択される病状を治療するために組成物を用いることを表示する。製造品は、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びデキストロース液などの薬学的に許容されるバッファーを含有する第２容器をさらに含んでもよい。これはさらに、商業上及びユーザの見地から、望ましい他の材料、例えば、別のバッファー、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を含むパッケージ挿入物を含んでもよい。

以下の参照文献は、その全体を参照として本明細書に組み込むものとする。
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以下の実施例を参照しながら、本発明を説明する。これらの実施例は、あくまで例示を目的として提供されるものであり、本発明が、これらの実施例に限定されるものとして一切解釈すべきではなく、むしろ、本明細書に記載する教示内容により明らかとなるあらゆる変更を包含すると解釈すべきである。

本発明の特定の実施形態は、説明を目的として記載するものであるが、当業者には、添付の特許請求の範囲に記載するように、本発明から逸脱することなく、詳細事項の様々な変更がなされうることは理解されよう。

実施例１：癌性乳房組織におけるＥＭＰ２タンパク質発現
乳癌におけるＥＭＰ２の発現レベルを調べるために試験を行った。最初に、５つの急速凍結ヒト侵襲性乳管癌サンプルと、正常腺乳房上皮の３つのサンプルの１セットについて、ウエスタンブロット分析及び免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。

この分析を実施するため、乳癌細胞株又は組織をレムリ（Laemmli)バッファーに溶解させてから、ＥＭＰ２検出のために、Ｎ−グリコシダーゼＦ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理することにより、Ｎ−結合型グリコシル化を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜上に移した後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファー中の１０％脱脂粉乳でブロックした。ウサギ抗ヒトＥＭＰ２抗血清（１：２０００）を用いて、ブロットをプロービングした。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて、タンパク質を検出した。ローディングコントロールとして、一次モノクローナル抗βアクチン（Singma）及び二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Amersham（登録商標）、Piscataway, NJ）を用いて、βアクチン発現を検出した。ECL（登録商標）検出試薬（Amersham（登録商標））を用いて、バンドを視覚化した。

図１Ａに示すように、一貫して、非悪性腺上皮における弱い、又は検出不能レベルと比較して、乳癌サンプルにおいてＥＭＰ２の発現は頑健であった。ＥＭＰ２は、悪性乳癌上皮の膜及び／又は細胞質に優勢に存在した（図１Ｂ）。

実施例２：組織マイクロアレイによるＥＭＰ２の発現プロフィール
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）技術を用いて、集団毎のヒト乳癌におけるＥＭＰ２の発現プロフィールを調べた。１９９５年から２０００年の間に、UCLA Medical Centerで乳癌手術を受けた２１２人の患者からのアーカイブ乳房組織サンプルを用いて、高密度の乳癌ＴＭＡを構築した。UCLA Institutional Review Boardによって承認及び監視されるように、サンプルを収集した。人口学的、臨床的、及び病理学的特徴を表２に示す。各患者からの手術サンプルから、往々にして２つ以上の組織学が得られた。

この試験は、以下のカテゴリーに集約して行った：正常な乳腺／乳管上皮（ｎ＝１３９スポット）、乳管過形成（ＤＨ；ｎ＝３５スポット）、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ；ｎ＝１４２スポット）、侵襲性乳管癌（ＩＤＣ；ｎ＝２３６スポット）、及びリンパ節転移性病変（ｎ＝６９スポット）。

ＥＭＰ２染色の強度及び頻度の半定量的積算評点が病理学者（ＲＡＳ）によって実施された。次の式を用いて、積算値を導き出した：［３（％ａ）＋２（％ｂ）＋１（％ｃ］／１００（式中、ａ、ｂ、及びｃは、それぞれ、強度３、２、及び１の細胞染色のパーセンテージである）。

非悪性乳腺及び乳管乳房上皮と比較して、ＤＣＩＳ、侵襲癌及びリンパ節転移性病変においてＥＭＰ２発現の有意な増大が認められた（図１Ｃ）。

ＴＭＡに際しては、１１人のトリプルネガティブ乳癌「ＴＮＢＣ」の患者がいた。ＴＮＢＣ腫瘍は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現が欠失している。これら１１人の患者のうち、８人（７３％）が、ＥＭＰ２の高い発現レベルを有し、３人の患者は比較的低い発現レベルを示した。

別の組の２３人のＴＮＢＣ患者も、ＥＭＰ２発現について調べた。前記と同様に、２３人のＴＮＢＣ患者のうち１７人が、ＥＭＰ２について陽性であった。

実施例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＥＭＰ２治療の効果
乳癌細胞に対する抗ＥＭＰ２治療の効果を試験するために、以下の乳癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−２０、及びＨＳ５７８を用いたが、これらはＥＲα、ＰＲ及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現並びにＺＲ−７５−１についてトリプルネガティブであり、これらの３つの受容体を発現する。

ヒト乳癌細胞株ＨＳ５７８（John Clicelli博士、UCLAからの寄贈品）、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（いずれも、Richard Pietras博士、UCLAからの寄贈品）、ＺＲ−７５−１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（American Type Culture Collection: ATCC, Manassas, VA）を１０％ウシ胎児血清（Hyclone Laboratories, Logan, UT）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（全て、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA製）を添加したＤＭＥＭ培地（Mediatech, Manassas, VA）中で培養した。

加湿した５％ＣＯ２中、３７℃で細胞を培養した。さらに、ＥＭＰ２を過剰発現するＨＳ５７８亜系を調製したが、これらについては既に説明している。対照ＨＳ５７８も作製した。これらの亜系は、それぞれ、ＨＳ５７８／ＥＭＰ２及びＨＳ５７８／Ｖと称した。さらに、マウス乳房腫瘍Ｄ２Ｆ２細胞を用いて、前述のように補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。Ｄ２Ｆ２細胞（ＢＡＬＢ／ｃマウスについて同系）は、Wei-Zen Wei博士（Wayne State University, Detroit, MI)からの親切な寄贈品であった。ウエスタンブロット分析を用いて、各細胞株におけるＥＭＰ２発現レベルを確認した。

各細胞株をＥＭＰ２発現について試験した；代表的ウエスタンブロットを図１Ｄに示す。ＥＭＰ２は、５つの細胞株のうち４つに存在するが、ＨＳ５７８細胞での検出レベルより低かった。ＥＭＰ２を発現したＨＳ５７８の変異型（ＨＳ５７８／ＥＭＰ２）、又は対照として、ベクター及び単独のＧＦＰに感染させた変異型（ＨＳ５７８／Ｖ）も構築した。ＨＳ５７８／ＥＭＰ２におけるＥＭＰ２の発現を図１Ｄに示す。本発明者らはまた、マウス乳房腫瘍細胞株Ｄ２Ｆ２におけるＥＭＰ２の発現も検出し、ＦＬＡＧタグに結合させたＥＭＰ２を過剰発現したＤ２Ｆ２の変異型（Ｄ２Ｆ２／ＥＭＰ２）を構築した。マウスの脾細胞を負の対照として用いた（図１Ｅ）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ（以下に記載する）ターゲティングの両方について、ヒト及びマウスＥＭＰ２両方の保存領域を認識する組換え抗ＥＭＰ２ダイアボディを用いた。さらに、完全長ヒト化抗ＥＭＰ２抗体（ＩｇＧ１）も構築し、これらのターゲティング実験に使用した。

既述した抗ＥＭＰ２ダイアボディ構築物、ＫＳ８３をベースとする、完全長ヒト抗ＥＭＰ２抗体（ＩｇＧ１）を構築するために。これを達成するために、ダイアボディ可変（Ｖ）領域配列をＰＣＲにより取得した後、これをｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にクローン化した。この構築物は、適正な分泌のための機能シグナルペプチドをコードする配列を含んでいた。配列決定によりクローン化を確認した。ＥＭＰ２可変軽鎖（ＶＬ）及び重鎖領域（ＶＨ）をコードする配列をそれぞれκ軽鎖及びγ重鎖ＩｇＧ１発現ベクターに挿入した。これらのベクターは、サイトメガロウイルスプロモータ（ＣＭＶ）を含有し、マウス骨髄腫細胞中に機能性組換え抗体を分泌することが判明した。重鎖及び軽鎖発現ベクターは、既述したように、マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４にトランスフェクトした。細胞をサブクローン化した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Invitrogen）及びヤギ抗ヒトκ鎖（Sigma-Aldrich）を用いたＥＬＩＳＡ（以下に説明する）により、スクリーニングした。５つの最も高い生産サブクローンを単離して、超免疫ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Sigma-Aldrich）及びStaph A（IgGsorb, The Enzyme Center, Malden, MA）を用いたＳ−３５生合成抗体標識及び免疫沈降に使用することによって、最適クローンを確認し、選択した。いったん選択したら、抗体の分泌を最大限にするために、細胞をローラボトル中で増殖させた。２〜３週間後、上澄みを回収し、以下のように精製のために濾過した。

上澄みを１ｍＬのタンパク質A-Sepharose（登録商標）（Sigma-Aldrich）を含む容量１．５ｍＬのFlexColumn（Thermo Fisher Scientific）に通過させ、結合したタンパク質を、２カラム容量の０．２Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）、３カラム容量の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）及び２カラム容量の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で順に溶出させた。所望の抗体を含有する溶出画分を、Slide-A-Lyzer（登録商標）Dialysis Cassettes（Thermo Fisher Scientific）によりＰＢＳに対して透析した。精製済抗体の最終濃度をNanodrop 2000（Thermo Scientific）で測定した。組換え抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（以下を参照）によって決定した。

ＥＬＩＳＡ分析の場合、ヒトＥＭＰ２の細胞外ループに対応するビオチン化２４アミノ酸ペプチドを、ストレプトアビジンを塗布した９６ウェルプレート（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）に塗布した。具体的には、結合抗体を、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)及びTMB溶液（eBioscience, San Diego, CA)によって検出した。マイクロプレートリーダModel 550（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて、４５０ｎｍでの吸光を決定した。

ＦＡＣＳ分析の場合、ＥＭＰ２陽性細胞（ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ、又はＤ２Ｆ２細胞）又はＥＭＰ２陰性細胞（ＥＬ４又はRamos）を、１ｍＬの低温ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡバッファー（フローバッファー）中に１０^６細胞の濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液を４℃、５００ｇで５分遠心分離した。次に、細胞を１μｇの組換え抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１と一緒に４℃で２時間インキュベートした。ハプテンダンシルに特異的なＩｇＧ、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ）を非標的化抗体陰性対照として用いた。細胞を３回洗浄した後、ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）と一緒に４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、フローバッファー中に再懸濁させた。UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center及びCenter for AIDS Research Flow Cytometry Core Facilityにて、Becton Dickinson FACScan Analytic Flow Cytometer（Becton Dickinson）を用い、フローサイトメトリーを直ちに実施した。

以前の研究から、ＥＭＰ２発現は、ＦＡＫ及びＳｒｃ活性化によって浸潤を促進することが明らかにされている。ＥＭＰ２抗体が、浸潤を阻害するかどうかを決定するために、細胞を抗ＥＭＰ２ ＫＳ８３又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１又は適切な対照で処理した。ＥＭＰ２特異的ダイアボディ又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧのいずれかによる２時間の処理は、対照と比較してトランスウェル浸潤を阻害した（図２Ａ、Ｂ）。理論に束縛されるわけではないが、この作用を支持する明瞭な作用機構は、ＥＭＰ２抗体媒介によるＳｒｃリン酸化の低下である（図２Ｃ、Ｄ）。ＦＡＫリン酸化の低下も観察された。

抗ＥＭＰ２ダイアボディを用いたＥＭＰ２発現子宮内膜又は卵巣がん細胞の治療は、細胞死を引き起こすが、このような作用は乳癌細胞では試験されていない。抗ＥＭＰ２ダイアボディＫＳ８３の存在下で細胞の生存能を試験するために、対照ダイアボティＡ１０、抗ＥＭＰ２組換えＩｇＧ１、又は対照ＩｇＧ１（Sigma-Aldrich）、５×１０^４のＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＳ５７８／ＥＭＰ２、又はＨＳ５７８／Ｖ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでモル当量の抗ＥＭＰ２ダイアボディ（ＫＳ８３）、非免疫ダイアボディ（Ａ１０）、完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１、又は食塩水対照と一緒に２４〜９６時間インキュベートした。次に、細胞を収集して、非生存細胞の割合（％）を、トリパンブルー色素排除を用いて決定した。

ＫＳ８３ダイアボディ又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１のいずれかによるＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及びＨＳ５７８／ＥＭＰ２細胞の治療により、非免疫Ａ１０ダイアボディ又は食塩水対照と比較して、生存能の約３５％〜５０％の減少が起こった（図３Ａ、Ｂ）。ダイアボディ又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１によるＨＳ５７８／Ｖ（ＥＭＰ２−陰性）細胞の処理では、生存能に減少は全く起こらなかったが、これは、作用が、ＥＭＰ２発現に依存することを示している（図３Ａ）。

観察された細胞死は、明らかにアポトーシス機序によって起こる。ＫＳ８３ダイアボディ又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１（又は適切な対照）と一緒にインキュベートした細胞を、アポトーシスマーカ、アネキシンＶ、並びに生存能マーカヨウ化プロピリジウムで染色した。細胞を採取し、製造者の指示（BD Biosciences）に従って、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ検出キットで染色した。図３Ｂに示すように、抗ＥＭＰ２ダイアボディ又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１を用いたＺＲ−７５−１又はＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のインキュベーションは、４８時間以内にアポトーシスの増加を誘導した（図３Ｃ）。このような作用は、対照試薬では認められなかった。

実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＥＭＰ２治療の効果
マウスモデル系における抗ＥＭＰ２免疫試薬の効果を試験した。

初めに、ＫＳ８３ダイアボディ又は完全長ＫＳ８３−ＩｇＧ１のｉｎ ｖｉｖｏ毒性を評価した。生後７週の雌野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスをJackson Laboratoriesから取得した。マウスは、National Academy of Science Guide for the Care and Use of Laboratory Animals in the Vivairum of UCLAに従い維持した。グループ当たり少なくとも３匹のマウスに、７週間にわたって、濃度を増加しながら（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１抗体又はビヒクル対照（滅菌ＰＢＳ）を毎週静脈内（ｉ．ｖ．)注射した。１４日毎に血清を採取した。時間経過の終了時に、頸椎脱臼により、マウスを安楽死させた。組織（腎臓、肝臓、脾臓、肺、子宮、心臓、卵巣、及び皮膚）を採取し、ホルマリン中に固定して、処理し、パラフィンに包埋し、切断して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した後、病理学者が病理学的変化を分析した。全血球数及び肝酵素分析（血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、直接及び総ビリルビン）をUCLA Medical Center Clinical Laboratoriesによって定量した。

Ｋ８３又は対照ダイアボディの毎週の注射は、マウスにおいて検出可能な毒性又は有害作用を示さなかった。同様に、７週間にわたる、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける完全長抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１の毎週２回の注射（１０ｍｇ／ｋｇ）による広範な試験でも、全身若しくは組織特異的損傷又は毒性の徴候は認められなかった（図７）。

乳癌の抗体治療の前臨床移植モデルのために、トリプルネガティブ細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及び抗ＥＭＰ２ダイアボディＫＳ８３又は完全長抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１を使用した。

腫瘍移植モデルを作製するために、各条件について、生後４〜６週のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Charles River, MA）を用いた。マウスは、National Academy of Science Guide for the Care and Use of Laboratory Animals in the vivairum of UCLAに従って維持した。手短には、５％ BD matrigel（登録商標）（BD Biosciences）中に懸濁させた５×１０６ ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又は２×１０７ Ramos細胞を雌胸腺欠損マウスの肩に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。式：長さ×幅^２／２を用いて、腫瘍体積を計算した。腫瘍が検出可能になったとき（第０日）、用量１ｍｇ／ｋｇの抗ＥＭＰ２ダイアボディＫＳ８３又は非免疫ダイアボディＡ１０を、週に２回マウスに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。あるいは、腫瘍に３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｔ．）、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇ（全身）の抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ（Sigma）を毎週注射した。腫瘍サイズをモニターし、腫瘍が直径１．５ｃｍ近くになったら、又は潰瘍化したら、マウスを安楽死させた。腫瘍を単離して、固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

図４Ａに示すように、ＫＳ８３又は完全長ＥＭＰ２ ＩｇＧ１による腫瘍の治療により、非免疫試薬治療と比較して、第１５日までに腫瘍増殖の有意な低減が起こった。組織学的検査時に、抗ＥＭＰ２試薬で治療した腫瘍は、非免疫試薬で治療した腫瘍とは対照的に、広い面積の壊死を示した（図４Ｂ）。

治療手法としての抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１の全身注射もまた試験した。ｉ．ｔ．注射と同様、完全長抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１による全身治療は、対照ＩｇＧによる治療と比較して、腫瘍増殖を有意に低減した（図４Ｃ；第２８日）。このモデルも、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ治療に応答して、広範な壊死を発生した（図４Ｄ）。比較すると、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１治療群より、対照ＩｇＧ治療群において観察された壊死面積の方が小さかった。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１治療の効果が特異的であることを確認するために、Ｂリンパ腫細胞株Ramosを対照として用いた。Ramos細胞はＥＭＰ２を発現しない。抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は対照ＩｇＧ１のいずれを毎週２回注射しても、腫瘍負荷（図４Ｅ）又は腫瘍組織学（図４Ｆ）に違いは見られなかった。

抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１治療の効果のさらなる確認として、マウス乳房Ｄ２Ｆ２細胞を使用した。Ｄ２Ｆ２細胞は、原形質膜にＥＭＰ２を発現し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して同系である。抗体の力価測定並びにフローサイトメトリーによるアポトーシス及び細胞死の測定によって、抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１治療に対するＤ２Ｆ２細胞の感受性を決定した（図５Ａ）。抗体濃度に対する細胞死の用量依存的増加を観察し、対照ＩｇＧによる治療と比較して、効果が有意に増加した。

この効果をｉｎ ｖｉｖｏで再現できるかどうかを決定するために、１×１０^５ Ｄ２Ｆ２腫瘍をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体（Charles River）に注射した。腫瘍が検出可能になったら、これらを１０ｍｇ／ｋｇの抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１又は対照ＩｇＧで２回治療した。最終点の後、マウスを安楽死させ、前述のように腫瘍を単離した。これらの腫瘍は非常に速く増殖するが、この週の抗ＥＭＰ２ ＩｇＧ１の２つの治療は、対照ＩｇＧ治療と比較して５０％腫瘍負荷を有意に低下させ（図５Ｂ）、腫瘍は、顕著な壊死を呈示した（図５Ｃ）。

統計分析のために、９５％信頼レベルでの両側スチューデントの不対ｔ検定（GraphPad Prism version 3.0; GraphPad Software, La Jolla, CA）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ表現型変化又はｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖の差を評価した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。前述したように（３０〜３４）、２つの群の比較のためにマン−ホイットニー検定を用いて、ＴＭＡ分析を実施した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。

本明細書に引用した各刊行物、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、本発明の開示内容と一致する範囲まで、その全体を参照として本明細書に組み込むものとする。特に、本明細書に引用する全ての刊行物は、本発明に関連して用いられる可能性がある、刊行物に記載の方法、試薬、及び手段を説明及び開示することを目的として、その全体を参照として本明細書に組み込むものとする。本明細書における何物も、従来の技術によるこうした開示内容に本発明が先行する資格がないという容認として解釈すべきではない。

明瞭な理解を目的として、説明及び例示としてある程度詳細に、本発明を説明してきたが、当業者であれば、本発明の教示内容に照らして、発明の精神及び添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、これに特定の変更及び改変を実施しうることは容易に明らかであろう。

Claims (24)

1. 乳癌の患者を治療する方法であって、前記乳癌は、トリプルネガティブ乳癌腫瘍を含み、前記方法は、前記患者に有効量の抗体を投与することを含み、ここで、前記抗体は、ＥＭＰ２の第２細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む、方法。
2. 前記抗体が、生理学的に許容される担体又は薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９ダイアボディの重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１に記載の方法。
4. 前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９ダイアボディの重鎖及び軽鎖可変領域と、９０％アミノ酸同一性を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、又はＫＳ８９ダイアボディのそれと同一のＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の方法。
6. 有効量の少なくとも１種の別の抗がん剤を患者に投与することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記少なくとも１種の別の抗がん剤が、白金を用いた化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、及びその組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記少なくとも１種の別の抗がん剤が、ＥＧＦＲ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
9. 前記ＥＧＦＲ阻害剤が、抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブ、及びニモツズマブからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
12. 前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である、請求項８に記載の方法。
13. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、及びＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記少なくとも１種の別の抗がん剤が、ＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。
15. 前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗ＶＥＧＦ抗体が、ベバシズマブである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記抗体が、エフェクター部分と結合している、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記エフェクター部分が、有毒剤である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記有毒剤が、リシンなどである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記治療が前記癌の浸潤を阻止することを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記抗体を前記癌のワクチン療法に用いる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記患者が、ヒト又は哺乳動物である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. コンパニオン診断をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記コンパニオン診断が、抗ＥＭＰ２抗体を含む、請求項２３に記載の方法。

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