CN110545842A - 使用抗emp2抗体和pd-1/pdl-1途径拮抗剂组合疗法治疗癌症 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于在患有癌症(例如，乳腺癌)的受试者中治疗这种癌症的组合物和方法。特别地，本文提供的所述组合物包括抗EMP2抗体和PD‑1/PD‑L1途径拮抗剂。

Description

使用抗EMP2抗体和PD-1/PDL-1途径拮抗剂组合疗法治疗癌症

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月20日提交的美国临时专利申请第62/448,830号的优先权，其以全文引用的方式并入。

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技术领域

本发明涉及使用抗EMP2抗体与PD-1/PDL-1抑制剂的组合疗法治疗癌症(例如，乳腺癌)的方法。

背景技术

乳腺癌仍然是全世界女性中最常见的恶性肿瘤。乳腺癌是一种异质性疾病，其表现出广泛的临床行为、预后和组织学(Tavassoli F、Devilee P，编者.(2003)WHO肿瘤分类.(WHO Classification of Tumors.)《病理学和遗传学：乳腺及女性生殖器官的肿瘤.(Pathology&Genetics：Tumors of the breast and female genital organs.)》Lyon(法国(France))：IARC Pres)。乳腺癌是沿着乳腺组织导管和小叶排列的细胞的异常生长，并且通过癌症是在导管还是小叶中开始以及细胞是否已经侵入(生长或扩散)穿过导管或小叶来分类，以及通过在显微镜下观察细胞的方式(组织组织学)来分类。单个乳腺肿瘤具有侵入性和原位癌症的混合物并不罕见。

乳腺癌的分子分类已经识别了具有临床和生物学意义的特定亚型，通常称为“内在”亚型，包括内在腔亚型、内在HER2富集亚型(也称为HER2⁺或ER^-/HER2⁺亚型)和内在基底样乳腺癌(BLBC)亚型。(Perou等人，2000)。内在亚型的识别通常通过组合方法实现，包括(1)组织病理学检测，(2)雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)表达状态和(3)检测特征性细胞标志物。

表达正常乳腺中基底上皮细胞的基因特征性的基底样乳腺癌(BLBC)占所有乳腺癌的至多15％-25％(Kreike等人.2007)并且与所有乳腺癌类型的最差预后相关。BLBC表达不足的雌激素受体(ER^-)、孕酮受体(PR^-)和人类表皮生长因子受体2(HER2^-)，并涵盖60％至90％的所谓“三阴性”(ER^-/PR^-/HER2^-)乳腺癌。尽管大多数基于ER、PR和HER2的表达状态的基底样乳腺癌通常称为三阴性，但并非所有基底样乳腺癌都是三阴性的。

上皮膜蛋白-2(人类EMP2，SEQ ID NO：1)是在三阴性乳腺癌中过表达的四跨蛋白的生长停滞特异性-3/外周髓鞘蛋白-22(GAS3/PMP22)家族的成员。

SEQ ID NO：1(ACCESSION P54851)MLVLLAFIIA FHITSAALLF IATVDNAWWVGDEFFADVWR ICTNNTNCTV INDSFQEYST LQAVQATMIL STILCCIAFF IFVLQLFRLK QGERFVLTSIIQLMSCLCVM IAASIYTDRR EDIHDKNAKF YPVTREGSYG YSYILAWVAF ACTFISGMMY LILRKRK

在功能上，EMP2与整合素αvβ3和粘着斑激酶(FAK)两者相关并调节其定位和活性。EMP2(SEQ ID NO：1)在肺、眼和泌尿生殖道的上皮细胞中以高水平表达。与几种四跨蛋白(CD9、CD81、PMP22)一样，鼠成纤维细胞中的EMP2定位于脂筏结构域。EMP2控制细胞表面运输和某些整合素、GPI连接蛋白和I类MHC分子的功能，并相互调节小窝蛋白表达。参见Claas等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》276：7974-84(2001)；Hasse等人，《(神经科学研究杂志(J Neurosci Res)》69：227-32(2002)；Wadehra等人，《实验分子病理学(Exp MolPathol)》74：106-12(2003)；Wadehra等人，《分子生物学细胞(Mol Biol Cell)》15：2073-2083(2004)；Wadehra等人，《生物化学杂志》277：41094-41100(2002)；和Wadehra等人，《临床免疫学(Clin Immunol)》107：129-136(2003)。

先前已显示EMP2可以用作治疗表达或过表达EMP2的癌症(例如三阴性乳腺癌和子宫内膜癌)的靶标。Gordon等人，《癌基因(Oncogene)》32(46)：5369-76(2013)和Fu等人，《分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther)》13(4)：902-15(2014)

程序性死亡-配体1(PD-L1)是40kDa的1型跨膜蛋白，据推测其在特定事件如组织同种异体移植、妊娠和其它疾病状态期间在遏制免疫系统中起主要作用。PDL-1通过与其受体、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合起作用，所述程序性细胞死亡蛋白1在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上发现，以调节活化或抑制。例如，PD-L1与PD-1在T细胞上的结合传递抑制TCR介导的IL-2产生和T细胞增殖活化的信号。

经常发现PD-L1在多种实体恶性肿瘤中过表达，所述恶性肿瘤包括黑素瘤和肺癌、膀胱癌、结肠癌、肝癌和头颈癌。Kiet等人，《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)》26：677-704(2008)。原发性乳腺癌也表达PD-L1，其中在三阴性乳腺癌中表达通常较高。Mittendorf等人，《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》2：361-370(2014)。显然，PD-L1的上调可使癌症避开宿主免疫系统。通过适应性免疫抗性，肿瘤能够通过T细胞耗竭和免疫遏制共同选择PD-1/PD-L1途径，从而避开抗肿瘤免疫反应的破坏。

PD-L1和PD-1抑制剂为癌症的治疗提供了有前景的途径。此类抑制剂可通过阻断抑制性PD-L1和PD-1分子起作用，从而抑制保护癌症免受T细胞影响和促进或增强抗癌免疫反应的机制。例如，抗PD-1抗体派姆单抗(pembrolizumab)已被批准用于治疗晚期黑素瘤、非小细胞肺癌和头颈部鳞状细胞癌。参见，例如，Franklin等人，《外科肿瘤学欧洲杂志(EurJ Surg Oncol)》S0748-7983(16)30866-6(2016)；El-Osta等人，Onco Targets Ther.9：5101-16(2016)；和La-Beck等人，《药物疗法(Pharmacotherapy)》35(10)：963-76(2015)。

仍然存在对用于预防、治疗和调节EMP2表达癌症(包括乳腺癌)的其它方法和组合物的巨大需求。因此，本文提供了满足这些和其它需要的组合物和方法。

发明内容

本文提供了用于治疗乳腺癌的组合物和方法。如本文所述，抗EMP2抗体与PD-1/PD-L1途径拮抗剂的组合疗法在乳腺癌的治疗中表现出意想不到的协同效应，其比单独使用PD-1或PD-L1拮抗剂的治疗更有效。此外，使用包括PD-1/PD-L1途径拮抗剂和其它已知癌症疗法(例如，抗VEGF-A抗体)的组合疗法未观察到这种协同效应。

在一个方面，本文提供了治疗患有乳腺癌的受试者的方法。方法包括以下步骤：向有需要的受试者给予包括有效量的EMP2结合蛋白和有效量的程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂的组合物。

在一些实施例中，EMP2结合蛋白特异性结合于EMP2的第二细胞外环中的表位，其中表位包括具有SEQ ID NO：2的肽

在一个示例性实施例中，EMP2结合蛋白包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。在某些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的可变重链区和具有根据SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施例中，EMP2结合蛋白包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)。在一些实施例中，HCDR1是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ IDNO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：17。在一些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的可变重链区和具有根据SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施例中，结合蛋白是单克隆抗体、人类化单克隆抗体、人类抗体、ScFv、双功能抗体、微抗体，或三功能抗体、嵌合抗体，或重组抗体。

在本发明方法的某些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：7的轻链。在本发明方法的某些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：8的轻链。在本发明方法的一些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：10的轻链。

在本发明方法的一些实施例中，EMP2结合蛋白与细胞毒剂或标记物缀合。

在本发明方法的一些实施例中，程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-1拮抗剂。在某些实施例中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体选自由以下组成的群组：派姆单抗、匹立珠单抗(pidilizumab)、REGN2810和纳武单抗(nivolumab)。

在本发明方法的一些实施例中，程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-L1拮抗剂。在某些实施例中，PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施例中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗(avelumab)、BMS-936559、度伐单抗(durvalumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。

在某些实施例中，本发明方法用于治疗三阴性乳腺癌。

另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包括有效量的EMP2结合蛋白和有效量的程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂。

在本发明药物组合物的一些实施例中，EMP2结合蛋白包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中轻链可变区包括三个轻链可变区(LCDR)。在某些实施例中，HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ IDNO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。

21.在药物组合物的一些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的可变重链区和具有根据SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区。

22.在一些实施例中，EMP2结合蛋白包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括三个重链互补决定区(HCDR)，并且轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)。在一些实施例中，HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：17。在某些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的可变重链区和具有根据SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区。

在本文提供的本发明药物组合物的一些实施例中，EMP2结合蛋白是单克隆抗体、人类化单克隆抗体、人类抗体、ScFv、双功能抗体、微抗体，或三功能抗体、嵌合抗体，或重组抗体。

在某些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：7的轻链。在一些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：8的轻链。在一些实施例中，EMP2结合蛋白包括具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：10的轻链。

在药物组合物的一些实施例中，EMP2结合蛋白与细胞毒剂或标记物缀合。

在药物组合物的一些实施例中，程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-1拮抗剂。在某些实施例中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个示例性实施例中，抗PD-1抗体选自由以下组成的群组：派姆单抗、匹立珠单抗、REGN2810和纳武单抗。在某些实施例中，程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-L1拮抗剂。在一些实施例中，PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个示例性实施例中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗、BMS-936559、度伐单抗和阿特珠单抗。

附图说明

图1是显示单独或组合使用抗EMP2抗体(PG101)和抗PD-1抗体治疗小鼠乳腺癌模型(BALB/c小鼠中的同基因4T1/萤火虫荧光素酶模型)的研究图。通过双向ANOVA，N＝5，p＜0.05。

图2是显示单独或组合使用抗EMP2抗体(PG101)和抗PD-1抗体治疗小鼠乳腺癌模型(BALB/c小鼠中的同基因4T1/萤火虫荧光素酶模型)的第二研究图。通过双向ANOVA，N＝5，p＜0.05。

图3是显示使用阿瓦斯汀(抗VEGF-A抗体)和抗PD-1抗体治疗小鼠乳腺癌模型(BALB/c小鼠中的同基因4T1/萤火虫荧光素酶模型)的图。

图4是来自本文所述的抗EMP2抗体和抗PD-1抗体治疗的肿瘤的组织学图像。对于形态学分析，肿瘤用苏木精和曙红染色。为了评估免疫细胞群，用抗F4/80抗体染色肿瘤切片。图像显示了抗EMP2抗体和抗PD-1抗体治疗的形态学和免疫细胞群的变化。N＝5。

图5是来自流式细胞术分析的图，显示增生性乳腺细胞(MCF12A)中EMP2表达水平的降低也降低了这些细胞中PDL1的表达。

图6A-图6B提供了研究的概述，显示抗PD1和抗EMP2(PG101)抗体组合疗法减少携带乳腺肿瘤的Balb/c小鼠模型中耗竭的全身性PD1+CD8+细胞。

图7提供了研究的概述，显示抗PD1和抗EMP2(PG101)抗体组合疗法减少携带乳腺肿瘤的Balb/c小鼠模型中的全身性骨髓来源的遏制性细胞。

具体实施方式

简介

本文提供了用于治疗乳腺癌的组合疗法。不受任何特定操作理论的束缚，据信抗EMP2结合蛋白和PD-1/PD-L1拮抗剂的组合疗法可用于治疗乳腺癌。如本文所述，包括抗EMP2结合蛋白(例如，抗体)和PD-1/PD-L1拮抗剂的组合疗法在减少乳腺癌肿瘤中提供协同效应。这种协同效应对单独使用抗EMP2结合蛋白或PD-1/PD-L1拮抗剂的治疗效果更大。可以与本发明方法一起使用的抗EMP2结合蛋白和PD-1/PD-L1拮抗剂描述如下。

药物组合物

在一个方面，本文提供了包括抗EMP2结合蛋白和PD-1/PD-L1途径拮抗剂的组合物。如本文所述，包括抗EMP2结合蛋白(例如，抗体)和PD-1/PD-L1拮抗剂的组合疗法在癌症(例如，乳腺癌)的治疗中提供协同效应。以下非常详细地描述了本发明组合物的组分。

抗EMP2结合蛋白

本文提供的本发明组合物包括抗EMP2结合蛋白。在一些实施例中，抗EMP2结合蛋白是抗EMP2抗体。发现用于本发明的抗EMP2抗体可呈现多种形式，如传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。在某些实施例中，抗体是抗EMP2抗体，其包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施例中，重链可变结构域包括本文所述的任何重链可变结构域，并且轻链可变结构域包括本文所述的任何轻链可变结构域。在某些实施例中，抗EMP2抗体包括重链和轻链，其中重链是本文所述的任何重链，并且轻链是本文所述的任何轻链。

传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由相同的两对多肽链构成，每对具有一个“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重链”(通常具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链被分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。因此，如本文所用，“同种型”意指由其恒定区的化学和抗原特征限定的免疫球蛋白的任何亚类。已知的人类免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。应当理解，治疗抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。

每条链的氨基端部分包括具有约100至110个或更多个主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，V区由通过称为“高变区”的极端可变的较短区分隔开的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，所述高变区各自9-15个氨基酸长或更长。

每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

高变区通常涵盖以下氨基酸残基：轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；Kabat等人，《免疫学所关注的蛋白质序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》第5版，公共卫生署(PublicHealth Service)，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196：901-917(1987)。下面描述本发明的特定CDR。

在本说明书通篇中，当提到可变结构域中的残基(大致是轻链可变区中的残基1-107和重链可变区中的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人，同前文献(1991))。

CDR有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体地，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是分子的分组，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。例如，如本文所述，抗体结合于EMP2的假定的第二细胞外结构域中的表位。

表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和其它不直接参与结合的氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。

在一些实施例中，表位衍生自SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：2是EDIHDKNAKFYPVTREGSYG并且表示来自人类EMP2的第二细胞外环的20聚体多肽序列。

在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在数个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明所关注的是重链结构域，包括重链恒定(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情况下，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，IgG背景下的“CH”结构域如下：“CH1”根据如Kabat中的EU索引是指位置118-220。“CH2”根据如Kabat中的EU索引是指位置237-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU索引是指位置341-447。

重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施例中，例如在Fc区的背景下，包括下铰链，其中“下铰链”通常指的是位置226或230。

在本发明中所关注的是Fc区。本文使用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含抗体恒定区(排除第一恒定区免疫球蛋白结构域)的多肽，并且在一些情况下是铰链的一部分。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N端。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间的下铰链区。尽管Fc区的边界可以变化，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为包括其羧基端的残基C226或P230，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施例中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR受体或FcRn受体的结合。

在一些实施例中，抗体是全长抗体。本文的“全长抗体”意指构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区，包括本文所述的一种或多种修饰。

替代地，抗体可以是多种结构，包括但不限于抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文中有时被称作“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人类化抗体、抗体融合(有时称为“抗体缀合物”)以及分别每一种的片段。仍然依赖的结构

在一个实施例中，抗体是抗体片段。特异性抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变组成的dAb片段(Ward等人，1989，《自然(Nature)》341：544-546，其以引用的方式整体并入本文中)，(v)分离的CDR区，(vi)F(ab′)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由肽连接子连接，其允许两个结构域关联以形成抗原结合位点(Bird等人，1988，《科学(Science)》242：423-426，Huston等人，1988，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》85：5879-5883，其以引用的方式整体并入本文中)，(viii)双特异性单链Fv(WO 03/11161，以引用的方式并入本文中)，以及(ix)“双功能抗体”或“三功能抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等人，2000，《酶学方法(Methods Enzymol.)》326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，《美国国家科学院院刊》90：6444-6448，均其以引用的方式整体并入本文中)。

在一些实施例中，抗体可以是不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人类化抗体。也就是说，在本发明中，CDR组可以与除了本文中的序列具体描述的那些之外的框架和恒定区一起使用。

通常，“嵌合抗体”和“人类化抗体”均指组合来自不止一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在某些情况下为大鼠)的可变区和来自人类的恒定区。“人类化抗体”通常是指非人类抗体，其具有与人类抗体中发现的序列交换的可变结构域框架区。通常，在人类化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人类来源的聚核苷酸编码或除了在其CDR内之外，与这种抗体相同。CDR(部分或全部由源自非人类生物体的核酸编码)被移植到人类抗体可变区的β-折叠框架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR确定。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018，Jones，1986，《自然(Nature)》321：522-525，Verhoeyen等人，1988，《科学》239：1534-1536，其均以引用的方式整体并入本文中。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构建体中丧失的亲和力(US5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US6054297；US 6407213，其均以引用的方式整体并入本文中)。人类化抗体最佳还包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的至少一部分，且因此通常包含人类Fc区。使用具有基因工程改造的免疫系统的小鼠也可以产生人类化抗体。Roque等人，2004，《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20：639-654，其以引用的方式整体并入本文中。用于人类化和重塑非人类抗体的多种技术和方法是本领域中众所周知的(参见Tsurushita和Vasquez，2004，《单克隆抗体的人类化(Humanization of Monoclonal Antibodies)》，《B细胞分子生物学(Molecular Biology of B Cells)》，533-545，爱思唯尔科学公司(ElsevierScience)(美国(USA))，和其中引用的参考文献，其均以引用的方式整体并入本文中)。人类化方法包括但不限于以下中所述的方法：Jones等人，1986，《自然》321：522-525；Riechmann等人，1988，《自然》332：323-329；Verhoeyen等人，1988，《科学》239：1534-1536；Queen等人，1989，《美国国家科学院院刊》86：10029-33；He等人，1998，《免疫学杂志(J.Immunol.)》160：1029-1035；Carter等人，1992，《美国国家科学院院刊》89：4285-9；Presta等人，1997，《癌症研究(Cancer Res.)》57(20)：4593-9；Gorman等人，1991，《美国国家科学院院刊》88：4181-4185；O′Connor等人，1998，《蛋白质工程(Protein Eng)》11：321-8，其均以引用的方式整体并入本文中。减少非人类抗体可变区免疫原性的人类化或其它方法可以包括表面重修方法，如例如Roguska等人，1994，《美国国家科学院院刊》91：969-973中所述，其以引用的方式整体并入本文中。在一个实施例中，亲本抗体已经亲和力成熟，如本领域中已知。基于结构的方法可用于人类化和亲和力成熟，例如USSN 11/004,590中所述。可以使用基于选择的方法使抗体可变区发生人类化和/或亲和力成熟，包括但不限于以下中所述的方法：Wu等人，1999，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》294：151-162；Baca等人，1997，《生物化学杂志》272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996，《生物化学杂志》271(37)：22611-22618；Rader等人，1998，《美国国家科学院院刊》95：8910-8915；Krauss等人，2003，《蛋白质工程》16(10)：753-759，其均以引用的方式整体并入本文中。其它人类化方法可以涉及仅移植CDR的一部分，包括但不限于以下中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人，2002，《免疫学杂志》169：1119-1125；De Pascalis等人，2002，《免疫学杂志》169：3076-3084，其均以引用的方式整体并入本文中。

在一个实施例中，本发明的抗体可以是多特异性抗体，并且特别是双特异性抗体。这些是结合于两种(或更多种)不同抗原或同一抗原上的不同表位的抗体。

在一些实施例中，抗体是双功能抗体。

在一个实施例中，抗体是微抗体。微抗体是最小化的抗体样蛋白，其包含与CH3结构域连接的scFv。Hu等人，1996，《癌症研究(Cancer Res.)》56：3055-3061，其以引用的方式整体并入本文中。在一些情况下，scFv可以与Fc区连接，并且可以包括一些或整个铰链区。

本文所述的抗体可以是分离的或重组的。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，特异性结合于EMP2的分离的抗体基本上不含特异性结合除EMP2之外的抗原的抗体。

然而，特异性结合于人类EMP2或鼠EMP2的表位、同种型或变体的分离的抗体可以具有与其它相关抗原的交叉反应性，所述其它相关抗原例如来自其它物种，如EMP2物种同源物。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品。

用于编码主链上的蛋白质(包括天然抗体、片段抗体或合成主链)的抗EMP2可变区序列可以亲和地结合EMP-2。通过这种结合，这些蛋白质可用于EMP2检测，并阻断EMP2功能。这些可变区序列在天然抗体主链上的表达，或作为用放射性核素标记的scFv、三功能抗体、双功能抗体或微抗体的表达，在体内检测携带EMP-2的细胞中特别有用。在这些主链或天然抗体主链上的表达有利于体内阻断EMP-2的功能和/或杀死携带EMP-2的细胞(例如，妇科肿瘤)。

本发明的抗EMP2抗体特异性结合EMP2配体(例如SEQ ID NO：1和2的人类和鼠EMP2蛋白)。

针对特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体对抗原或表位的KD为至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、替代地至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M、或更大来展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体的KD对于对照分子相对于抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。

另外，可以例如通过抗体对抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来展现对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。

在一些实施例中，本文提供的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQID NO：3共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包括与NO：4或SEQ ID NO：5共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，如下所示：

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRGRKSAGIDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)。PG-101重链可变区结构域。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSGWTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO：4)。PG-101变体1轻链可变区结构域。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNLWTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO：5)。PG-101变体2轻链可变区结构域。

如本文所述，此类抗EMP2抗体是变体抗EMP2抗体，其与已知的抗EMP2抗体相比有利地表现出增加的表位(SEQ ID NO：2)结合。

在一些实施例中，抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：4共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包括具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施例中，抗体包括与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的重链，和与根据SEQ IDNO：7的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的轻链。在一些实施例中，抗体包括具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链。

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRGRKSAGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYYDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：6)。PG-101重链。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSGWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：7)。PG-101变体1轻链。

在一些实施例中，抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：5共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包括具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施例中，抗体包括与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的重链，和与根据SEQ IDNO：8的氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的轻链。在一些实施例中，抗体包括具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNLWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：8)。PG-101变体2轻链。

在一些实施例中，抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：9共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包括具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链可变区。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNGWTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO：9)。PG-101亲本轻链可变区结构域。

在一些实施例中，抗体包括与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的重链，和与根据SEQ IDNO：10的氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的轻链。在一些实施例中，抗体包括具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNGWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：10)。PG-101亲本轻链。

在一些实施例中，抗EMP2包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包括根据SEQID NO：11的HCDR1、根据SEQ ID NO：12的HCDR2、根据SEQ ID NO：13的HCDR3，和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括根据SEQ ID NO：14的LCDR1、根据SEQ ID NO：15的LCDR2和根据SEQ ID NO：16的LCDR3，如下所述。

在一些实施例中，抗EMP2包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包括根据SEQID NO：11的HCDR1、根据SEQ ID NO：12的HCDR2、根据SEQ ID NO：13的HCDR3，和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括根据SEQ ID NO：14的LCDR1、根据SEQ ID NO：15的LCDR2和根据SEQ ID NO：17的LCDR3，如下所述。

可变重链CDR1：SYAMH(SEQ ID NO：11)

可变重链CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：12)

可变重链CDR3：DRRGRKSAGIDY(SEQ ID NO：13)

可变轻链CDR1：QASQDISNYLN(SEQ ID NO：14)

可变轻链CDR2：AASSLQS(SEQ ID NO：15)

可变轻链CDR3：LQDYSGWT(SEQ ID NO：16)

可变轻链CDR3：LQDYNGWT(SEQ ID NO：17)

本发明进一步提供了可与本发明方法一起使用的变体抗体。也就是说，可以对本发明的抗体进行许多修饰，包括但不限于CDR中的氨基酸修饰(亲和力成熟)、Fc区中的氨基酸修饰、糖基化变体、其它类型的共价修饰等。本文提供的本发明抗体的CDR如下：

本文的“变体”意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽的多肽序列。氨基酸修饰可包括取代、插入和缺失，前者在许多情况下是优选的。

通常，变体可包括任何数量的修饰，只要蛋白质的功能仍然存在，如本文所述。也就是说，在用本文所述的重链或轻链可变区产生的氨基酸变体的情况下，例如，抗体仍应特异性结合于人类和/或鼠EMP2两者。类似地，如果产生具有Fc区的氨基酸变体，例如，变体抗体应该保持用于抗体的特定应用或适应症所需的受体结合功能。

然而，一般来说，通常使用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，因为通常目标是以最少数量的修饰改变功能。在一些情况下，存在1至5个修饰，其中1-2、1-3和1-4也发现可用于许多实施例中。

应注意，氨基酸修饰的数量可以在功能结构域内：例如，可能期望在野生型或工程化蛋白的Fc区中具有1-5个修饰，以及例如在Fv区中具有1至5个修饰。变体多肽序列优选与亲本序列具有至少约80％、85％、90％、95％或至多98或99％的同一性。应注意，取决于序列的大小，同一性百分比将取决于氨基酸的数量。

“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指用其它氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。例如，取代S100A是指变体多肽，其中位置100处的丝氨酸被丙氨酸替换。如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序中在特定位置处添加氨基酸。如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中在特定位置处去除氨基酸。

“变体Fc区”在本文中意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于野生型Fc序列的Fc序列。Fc变体可以指Fc多肽本身，包含Fc变体多肽的组合物或氨基酸序列。

与“亲本”抗体相比，可以进行亲和力成熟以使抗体对抗原的结合亲和力增加至少约10％至50-100-150％或更多，或1至5倍。优选的亲和力成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过已知方法产生。参见例如Marks等人，1992，《生物技术(Biotechnology)》10：779-783，其描述了通过重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结构域改组的亲和力成熟。以下中描述了CDR和/或框架残基的随机突变诱发：例如Barbas等人1994，《美国国家科学院院刊》91：3809-3813；Shier等人，1995，《基因(Gene)》169：147-155；Yelton等人，1995，《免疫学杂志(J.Immunol.)》155：1994-2004；Jackson等人，1995，《免疫学杂志》154(7)：3310-9；以及Hawkins等人，1992，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》226：889-896。

替代地，可以在本发明抗体的一个或多个CDR中进行“沉默的”氨基酸修饰，例如不显著改变抗体对抗原的亲和力。这么做的原因有很多，包括优化表达(如可以对编码本发明抗体的核酸进行)。

因此，包括在本发明的CDR和抗体的定义内的是变体CDR和抗体；也就是说，本发明的抗体可以包括本文所述的本发明抗体(SEQ ID NOS：11至16)的一个或多个CDR中的氨基酸修饰。另外，如下所述，氨基酸修饰也可以独立地和任选地在CDR之外的任何区(包括框架区和恒定区)中进行。

在一些实施例中，本文提供的抗EMP2抗体由变体Fc结构域构成。如本领域中已知的，抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，赋予称为效应功能的一系列重要功能能力。这些Fc受体包括但不限于(在人类中)FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)相关的同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)、FcRn(新生受体)、C1q(涉及补体依赖性细胞毒性(CDC)的补体蛋白)和FcRn(涉及血清半衰期的新生受体)。可以在一个或多个位置进行合适的修饰，如通常概述的，例如在美国专利申请11/841,654和其中引用的参考文献，US 2004/013210、US2005/0054832、US 2006/0024298、US 2006/0121032、US 2006/0235208、US 2007/0148170、USSN 12/341,769、美国专利第6,737,056号、美国专利第7,670,600号、美国专利第6,086,875号中，其均明确地以全文引用的方式并入本文中，且特别用于增加与Fc受体结合的特异性氨基酸取代。

除了上面概述的修饰之外，还可以进行其它修饰。例如，可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫化物桥键来使分子稳定(Reiter等人，1996，《自然生物技术(NatureBiotech.)》14：1239-1245，其以引用的方式整体并入)。另外，存在多种抗体的共价修饰，其可以如下所述进行。

抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在转译后进行。例如，通过使抗体的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体的几种类型的共价修饰引入分子中。

半胱氨酰残基最常与α-卤代乙酸盐(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基还可通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑等反应来衍生。

另外，半胱氨酸处的修饰在下面进一步描述的抗体-药物缀合物(ADC)应用中特别有用。在一些实施例中，抗体的恒定区可被工程化以含有一个或多个特别具“硫醇反应性”的半胱氨酸，以便允许药物部分的更特异性和受控的放置。参见例如美国专利第7,521,541号，其以全文引用的方式并入本文中。

通过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反应将组氨酰基残基衍生化，因为这种试剂针对组氨酰基侧链相对具有特异性。对溴苯酰甲基溴也是适用的；反应较佳在pH 6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。

赖氨酰基和氨基端残基与丁二酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生化具有逆转赖氨酰基残基电荷的作用。用于衍生化含α-氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯(如吡啶甲酰亚胺酸甲酯)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；及与乙醛酸酯的转氨酶催化反应。

精氨酰基残基通过与一种或几种常规试剂(其中有苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮及茚满三酮)反应而进行修饰。由于胍官能团的高pKa，因此精氨酸残基的衍生化需要反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可对酪氨酰残基进行特定修饰，其中尤其关注通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记物引入酪氨酰残基中。最通常使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来分别形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白，上述氯胺T方法是合适的。

通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)，其中R和R′任选为不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。

除了下述方法之外，用双官能试剂衍生化可用于将抗体与水不溶性支撑基质或表面交联以用于多种方法。常用交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羟基丁二酰亚胺酯，例如具有4-叠氮水杨酸的酯、同型双官能亚氨酸酯，包括二丁二酰亚胺基酯如3，3′-二硫代双(丁二酰亚胺基丙酸酯)；和双官能顺丁烯二酰亚胺，如双-N-顺丁烯二酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生化剂如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫基]丙酰亚胺酸酯产生能够在光存在下形成交联的光活化中间物。替代地，在美国专利第3,969,287号；第3,691,016号；第4,195,128号；第4,247,642号；第4,229,537号；和第4,330,440号(其均以引用的方式整体并入本文中)中描述的反应性水不溶性基质如溴化氰-活化的碳水化合物和反应性底物用于蛋白质固定。

谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。替代地，这些残基在适度酸性条件下脱酰胺。这些残基的任何一种形式都落入本发明的范围。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)》，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.)，旧金山(San Francisco)，第79-86页[1983]，其以引用的方式整体并入本文中)；N端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。

另外，如本领域技术人员所理解的，标记物(包括荧光、酶、磁、放射性标记物等)都可以添加到抗体(以及本发明的其它组合物)中。

另一种类型的共价修饰是糖基化的改变。在另一个实施例中，本文公开的抗体可以被修饰以包括一种或多种工程化糖型。如本文所用，“工程化糖型”意指共价附接到抗体的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物在化学上不同于亲本抗体的碳水化合物组合物。工程化糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应功能。工程化糖型的优选形式是无岩藻糖基化，其已经显示与ADCC功能的增加相关，可能是通过与FcγRIIIa受体的更紧密结合。在本文中，“无岩藻糖基化”意指宿主细胞中产生的大部分抗体基本上不含岩藻糖，例如90-95-98％的所产生的抗体不具有明显的岩藻糖作为抗体的碳水化合物部分的组分(通常附接在Fc区中的N297处)。功能上定义的无岩藻糖基化抗体通常对FcγRIIIa受体表现出至少50％或更高的亲和力。

工程化糖型可以通过本领域已知的多种方法产生(等人，1999，《自然生物技术(Nat Biotechnol)》17：176-180；Davies等人，2001，《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》74：288-294；Shields等人，2002，《生物化学杂志(J Biol Chem)》277：26733-26740；Shinkawa等人，2003，《生物化学杂志》278：3466-3473；US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/29246A1；PCT WO02/31140A1；PCT WO 02/30954A1，其均以引用的方式整体并入本文中；(technology[Biowa，Inc.，Princeton，NJ])；糖基化工程技术[GlycartBiotechnology AG，Zürich，Switzerland])。这些技术中的许多是基于控制共价附接到Fc区的岩藻糖基化和/或等分寡糖的水平，例如通过在各种生物或细胞系、工程化或其它(例如Lec-13 CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG、通过调节参与糖基化途径的酶(例如FUT8[α1，6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III[GnTIII])或通过在IgG已经表达后修饰碳水化合物。例如，西雅图遗传学(Seattle Genetics)的“糖工程化抗体”或“SEA技术”通过添加在生产期间抑制岩藻糖基化的修饰糖来起作用；参见例如20090317869，其以全文引用的方式并入本文中。工程化的糖型通常是指不同的碳水化合物或寡糖；因此，抗体可包括工程化的糖型。

替代地，工程化的糖型可以指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG变体。如本领域中已知，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在，如下所述)，或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下文讨论特定的表达系统。

多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链附接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶附接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一种的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一种附接到羟氨酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，可方便地完成向抗体添加糖基化位点。也可以通过向起始序列(对于O-连接的糖基化位点)添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变。为方便起见，优选通过改变DNA水平来改变抗体氨基酸序列，特别是通过在预选的碱基处突变编码靶多肽的DNA，从而产生将转化为所期望的氨基酸的密码子。

增加抗体上碳水化合物部分数量的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶偶联。这些方法是有利的，因为其不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所用的偶联模式，糖可以附接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，如半胱氨酸的巯基，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330中以及Aplin和Wriston，1981，《CRC临界生物化学评论(CRCCrit.Rev.Biochem.)》，第259-306页，其均以引用的方式整体并入本文中。

去除起始抗体上存在的碳水化合物部分(例如转译后)可以通过化学或酶来实现。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。所述治疗引起除连接糖(N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰基半乳胺糖)外的大多数或所有糖的裂解，同时保持多肽完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人，1987，《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》259：52以及由Edge等人，1981，《分析生物化学(Anal.Biochem.)》118：131所描述，其均以引用的方式整体并入本文中。多肽上碳水化合物部分的酶裂解可以通过使用多种内和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等人，1987，《酶学方法(Meth.Enzymol.)》138：350所描述，其以引用的方式整体并入本文中。潜在糖基化位点的糖基化可以通过使用化合物衣霉素来预防，如Duskin等人，1982，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》257：3105所描述，其以引用的方式整体并入本文中。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。

抗体的另一种共价修饰包含以以下中所述的方式将抗体连接到各种非蛋白质聚合物(包括但不限于各种多元醇如聚乙二醇、聚丙二醇或聚环氧烷)：例如2005-2006PEG产品目录，其来自奈克塔疗法(Nektar Therapeutics)(可在奈克塔网站获得)美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337，其均以引用的方式整体并入本文中。另外，如本领域已知的，可以在抗体内的不同位置进行氨基酸取代，以促进聚合物如PEG的添加。参见例如美国公开第2005/0114037A1号，其以引用的方式整体并入本文中。

在一些情况下，标记竞争性结合测定的一种或多种组分。

也可以是抗EMP2抗体之间可能存在针对EMP2表位和/或EMP2的一部分中的一种以上的竞争的情况，例如在EMP2的特定区的抗体结合特性保留在其片段中的情况下，如在位于各种测试片段中的良好呈递的线性表位的情况下，或者在足够大的EMP2片段以及EMP2中呈递的构象表位的情况下。

评估竞争通常涉及使用本发明的抗体、EMP2(人类或鼠或两者)和测试分子评估相对抑制结合。测试分子可包括任何分子，包括其它抗体、小分子，肽等。以足以进行比较的量混合化合物，所述比较赋予关于所讨论的分子相对于其它存在的分子的选择性和/或特异性的信息。

可以改变本发明的测试化合物、EMP2和抗体的量。例如，对于ELISA评估，需要约5-50μg(例如，约10-50μg、约20-50μg、约5-20μg、约10-20μg等)的抗EMP2抗体和/或EMP2靶标来评估是否存在竞争。条件也应该适合于结合。通常，生理或接近生理条件(例如，约20-40℃的温度，约7-8的pH等)适合于抗EMP2：EMP2结合。

通常竞争通过ELISA和/或FACS分析确定的显著大于约5％的相对抑制来标志。可能期望将相对抑制的较高阈值设定为在特定上下文中什么是合适竞争水平的标准/决定因素(例如，其中竞争分析用于选择或筛选设计为具有阻断与EMP2(EMP2的天然结合配偶体或天然存在的抗EMP2抗体)结合的另一种肽或分子的结合的预期功能的新抗体)。

在一些实施例中，本发明的抗EMP2抗体特异性结合于EMP2中的一个或多个残基或区域，但也不与其它与EMP2具有同源性的蛋白质交叉反应。

通常，缺乏交叉反应性意味着当在合适的测定条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析评估时，分子之间小于约5％的相对竞争性抑制。

所公开的抗体可用于阻断配体-受体相互作用或抑制受体组分相互作用。本发明的抗EMP2抗体可以是“阻断”或“中和”。“中和抗体”是指抗体，其与EMP2的结合导致EMP2的生物活性的抑制，例如其与配体相互作用的能力、酶活性和/或信号传导能力。可以通过本领域已知的几种标准体外或体内测定中的一种或多种来评估EMP2的生物活性的抑制。

抑制结合”或“阻断结合”(例如当指抑制/阻断EMP2结合配偶体与EMP2的结合时)涵盖部分和完全抑制/阻断。EMP2结合配偶体与EMP2结合的抑制/阻断可以降低或改变当EMP2结合配偶体与EMP2结合而没有抑制或阻断时发生的细胞信号传导的正常水平或类型。与不与抗EMP2接触的配体相比，抑制和阻断还旨在包括EMP2结合配偶体在与抗EMP2抗体接触时对EMP2的结合亲和力的任何可测量的降低抗体，例如将EMP2结合配偶体与EMP2的结合阻断至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。

本发明进一步提供了产生所公开的抗EMP2抗体的方法。这些方法涵盖培养含有编码本发明抗体的分离的核酸的宿主细胞。如本领域技术人员所理解的，这可以以多种方式进行，这取决于抗体的性质。在一些实施例中，在本发明的抗体是全长传统抗体的情况下，例如，在产生抗体并且可以分离的条件下的重链可变区和轻链可变区。

通常，提供编码本发明抗体的核酸(参见，例如，SEQ ID NOS：22至25)。此类聚核苷酸编码每条重链和轻链的可变区和恒定区，但是根据本文所述的组合物，本发明也涵盖了其它组合。本发明还涵盖衍生自所公开的聚核苷酸的寡核苷酸片段和与这些聚核苷酸互补的核酸序列。

聚核苷酸可以是RNA或DNA的形式。DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA形式的聚核苷酸在本发明的范围内。DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链的，可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可以与本文提供的编码序列相同，或者可以是不同的编码序列，由于基因密码的冗余或简并，所述序列编码与本文提供的DNA相同的多肽。

在一些实施例中，将编码本发明抗体的核酸并入表达载体中，所述表达载体可以是染色体外的或设计成整合到其所引入的宿主细胞的基因组中。表达载体可含有任何数量的合适的调控序列(包括但不限于，转录和转译控制序列、启动子、核糖体结合位点、增强剂、复制起点等)或其它组分(选择基因等)，所有这些都是可操作连接的，如本领域众所周知的。在一些情况下，使用两种核酸，并且每种核酸被置于不同的表达载体中(例如第一表达载体中的重链，第二表达载体中的轻链)，或者替代地其可以置于相同的表达载体中。本领域技术人员应理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择可取决于如宿主细胞的选择、所期望蛋白质的表达水平等因素。

通常，可以使用适合于所选宿主细胞的任何方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)将核酸和/或表达引入合适的宿主细胞中以产生重组宿主细胞，使得核酸分子可操作地连接至一种或多种表达控制元件(例如，在载体中，在由细胞中的过程产生的构建体中，整合到宿主细胞基因组中)。得到的重组宿主细胞可以在适于表达的条件下维持(例如在诱导物存在下，在合适的非人类动物中，在补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的合适培养基中)，由此产生编码的多肽。在一些情况下，重链在一个细胞中产生，而轻链在另一个细胞中产生。

可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯(Manassas)，VA获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK 293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和许多其它细胞系。非哺乳动物细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和植物，其也可用于表达重组抗体。在一些实施例中，抗体可以在转基因动物如牛或鸡中产生。

本文提供的抗EMP2抗体可以进一步包括附接到其上的标记物或可检测部分。“标记物”或“可检测部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理方式检测的组合物。例如，有用的标记物包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质，其可进行检测，例如通过将放射性标记物并入到肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。

PD-1/PD-L1途径拮抗剂

本文提供的本发明组合物包括PD-1/PD-L1途径拮抗剂。如本文所用，“PD-1/PD-L1途径拮抗剂”是指拮抗、抑制、遏制或负调节为PD-1/PD-L1(例如，PD-1或PD-L1)途径的一部分的蛋白质的活性的试剂。

PD-1/PD-L1途径抑制剂为癌症的治疗提供了有希望的途径。此类抑制剂可通过阻断抑制性PD-L1和PD-1分子起作用，从而抑制保护癌症免受T细胞影响和促进或增强抗癌免疫反应的机制。如本文所述，包括抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂的组合疗法为治疗某些癌症(表达EMP-2的癌症，例如乳腺癌)提供了出乎意料的协同效应。

PD-1/PD-L1途径的抑制剂包括例如阻断PD-1/PD-L1相互作用的试剂。在一些实施例中，PD-1/PD-L1途径拮抗剂是抗PD-1抗体。在某些实施例中，抗体是抗PD-1抗体，其结合于PD-1并抑制PD-L1与PD-1的结合。在一些实施例中，PD-1/PD-L1途径拮抗剂是抗PD-L1抗体。在某些实施例中，抗体是抗PD-L1抗体，其结合于PD-L1并抑制PD-L1与PD-1的结合。

可用于本发明组合物和方法的抗PD-1和抗PDL-1抗体包括全长免疫球蛋白(或其重组对应物)以及包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如Fab′、F(ab′)₂或其它片段)可用作本文所述方法中的抗体部分。可通过无花果蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其它蛋白酶裂解从全免疫球蛋白产生此类抗体片段。可以使用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小免疫球蛋白。例如，用于本发明的“Fv”免疫球蛋白可以通过经由肽连接子(例如，聚甘氨酸或不形成α螺旋或β片层基序的其它序列)将可变轻链区连接到可变重链区而产生。

识别特定表位的抗体片段可以通过本领域众所周知的技术产生。例如，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生F(ab′)₂片段，并且可以通过还原F(ab′)₂片段的二硫键产生Fab片段。单链抗体(Fv)可以从含有人类可变区的噬菌体文库产生。参见美国专利第6,174,708号。鞘内给予单链免疫毒素LMB-7[B3(Fv)-PE38]已显示在大鼠模型中治愈癌性脑膜炎。《美国国家科学协会公报(Proc Natl.Acad.Sci USA)》92，2765-9，其均以引用的方式整体并入本文中。

抗体抑制剂可以通过任何合适的标准方法测试，例如ELISA测定等。作为第一个测试，可以测试抗体与免疫原的结合。在建立选择性结合后，可以在体内模型中测试候选抗体的适当活性。在一个优选的实施例中，可以使用多种方法在体外和体内筛选抗体化合物。这些方法包括但不限于测量对靶标的结合亲和力、化合物在动物或细胞内的生物分布或化合物介导的细胞毒性的方法。本领域已知的这些和其它筛选方法提供了关于化合物结合于特定靶标、调节特定靶标或以其它方式与特定靶标相互作用的能力的信息，并且是化合物功效的量度。

任何合适的抗PD-1或抗PD-L1抗体可与本文提供的本发明组合物和方法一起使用。在某些实施例中，抗PD-1抗体是抗人类PD-1抗体。可用于本发明组合物的示例性抗PD-1抗体包括纳武单抗(BMS-936558，商品名：Opdivo)、派姆单抗(MK-3475)、REGN2810和匹立珠单抗(CT-011)。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是抗人类PD-L1抗体。可用于本发明组合物的示例性抗PD-L1抗体包括BMS-936559、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MEDI4736(度伐单抗)、MSB0010718C(阿维鲁单抗)和AMP-224。

在示例性实施例中，本发明组合物包括至少一种抗PD-1抗体。在某些实施例中，本发明组合物包括一种抗PD-1抗体。在某些实施例中，本发明组合物包括至少一种抗PD-L1抗体。在一些实施例中，本发明组合物包括一种抗PD-L1抗体。在一些实施例中，本发明组合物包括至少一种抗PD-1抗体和至少一种抗PD-L1抗体。在示例性实施例中，本发明组合物包括一种抗PD-1抗体和一种抗PD-L1抗体。在某些实施例中，本发明组合物包括一种抗EMP2抗体。

另外的PD-1/PD-L1途径拮抗剂描述于例如Dolan等人，《癌症控制(CancerControl)》21(3)：231-237(2014)，Goldberg，《免疫疗法(Immunotherapy)》11(9)(2015)中，其以引用的方式整体并入本文中并且，特别是与PD-1和PD-L1途径拮抗剂有关的教示。

组合物

本文提供的本发明组合物通常配制在合适的缓冲液中，所述缓冲液可以是任何药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠/硫酸钠、三缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和本领域技术人员通常已知的其它缓冲剂，如Good等人，《生物化学(Biochemistry)》5：467(1966)所述的那些。组合物可另外包括稳定剂、增强剂或其它药学上可接受的载剂或载体。药学上可接受的载剂可含有生理学上可接受的化合物，其用于例如稳定本发明的核酸或多肽和任何相关载体。生理学上可接受的化合物可包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，其特别适用于防止微生物的生长或活动。各种防腐剂是众所周知的，并且包括例如苯酚和抗坏血酸。载剂、稳定剂或佐剂的实例可以在《雷明顿氏医药科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)》，马克出版公司(Mack Publishing Company)，费城(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA)，第17版.(1985)中找到。

根据本发明的药物组合物包含治疗有效量的EMP2结合蛋白(例如，抗EMP2抗体)、PD-1/PD-L1途径拮抗剂和药学上可接受的载剂。“治疗有效剂量或量”在本文中意指产生其给予效果(例如，治疗或预防乳腺癌)的剂量(例如，治疗或预防乳腺癌)。确切剂量和配制物将取决于治疗目的，且将是由本领域的普通技术人员使用已知技术可确定的(参见例如，利伯曼(Lieberman)，《药学剂量形式(Pharmaceutical Dosage Forms)》(第1-3卷，1992)；劳埃德(Lloyd)，《药学混配的艺术、科学和技术(The Art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)》(1999)；《雷明顿：医药科学和实践(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy)》，第20版，根纳罗(Gennaro)编(2003)，和皮卡(Pickar)，《剂量计算(Dosage Calculations)》(1999))。EMP2衣原体抑制剂，如果是盐，则配制成“药学上可接受的盐”。

根据给予途径，“药学上可接受的盐”或包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的抑制剂含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使中性形式的这些化合物与足量的所期望碱在无溶剂下或在合适的惰性溶剂中接触来获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使中性形式的这些化合物与足量的所期望碱在无溶剂下或在合适的惰性溶剂中接触来获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸的酸加成盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等等；以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、顺丁烯二酸、丙二酸、苯甲酸、丁二酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、杏仁酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯基磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲烷磺酸等。还包括氨基酸的盐，如精氨酸盐等，以及有机酸的盐，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(参见例如Berge等人，《医药科学杂志(Journal of Pharmaceutical Science)》66：1-19(1977))。本发明的某些特定化合物含有使得化合物可以转化成碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。

化合物的中性形式可以通过使盐与碱或酸接触并且以常规方式分离母体化合物来进行再生。虽然化合物的母体形式与各种盐形式的不同之处在于某些物理特性，如在极性溶剂中的溶解性，但出于本发明的目的，在其它方面，盐等同于化合物的母体形式。

除盐形式外，本发明还提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下易于发生化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。另外，前药可以通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为本发明的化合物。例如，当将前药置于具有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂储库中时，可以将前药缓慢转化为本发明的化合物。

本发明的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于未溶剂化形式，并且旨在涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多种结晶或非晶形式存在。通常，所有物理形式对于本发明涵盖的用途是等同的，并且旨在落入本发明的范围内。

除了如核酸和多肽的生物聚合物之外，本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物，非对映异构体，几何异构体和单独的异构体都涵盖在本发明的范围内。在优选的实施例中，其中化合物包含氨基酸或核酸，氨基酸和核酸各自是主要的天然存在的生物对映异构体。

用于给予的组合物通常包含溶解于药学上可接受的载剂，优选水性载剂的如本文所述的试剂。可以使用多种水性载剂，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不合期望的物质。这些组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。组合物可视需要含有药学上可接受的助剂物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制物中的活性剂浓度可广泛变化，并且将根据所选择的具体给予模式和患者需要而主要基于流体体积、粘度、体重等选择。

用于本发明的合适配制物可发现于雷明顿：医药科学和实践，第20版，根纳罗(Gennaro)编(2003)，其以引入的方式并入本文中。此外，药物递送的方法的简要评述参见Langer，《科学(Science)》249：1527-1533(1990)，其以引入的方式并入本文中。本文所述的药物组合物可以本领域技术人员已知的方式制造，即，借助于常规混合、溶解、粒化、糖衣药丸制造、水磨、乳化、包封、包覆或冻干工艺。以下方法和赋形剂仅是示例性的，并且决不是限制性的。

对于注射，本文提供的本发明EMP2结合蛋白和PD-1/PD-L1途径拮抗剂可以配制在水性溶液中，优选在生理学上相容的缓冲液中，如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜给予，在配制物中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。

对于口服给予，本文提供的本发明组合物可以通过与本领域中众所周知的药学上可接受的载剂组合而容易地配制。此类载剂使化合物能配制成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、乳液、亲脂性和亲水性的悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供待治疗患者口服摄取。用于口服用途的药物制剂可以通过以下方式获得：将化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，和在必要时添加合适助剂之后，加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣药丸芯。具体来说，合适的赋形剂是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要时，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如海藻酸钠)。

糖衣丸芯具有合适的包衣。出于此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波莫凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣药丸包衣中可以添加染料或颜料以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的配合插入胶囊以及由明胶和塑化剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。配合插入胶囊可以含有活性成分与如乳糖的填充剂、如淀粉的粘合剂和/或如滑石或硬脂酸镁的润滑剂以及任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。用于口服给予的所有配制物应该是适合于这种给予的剂量。

在一些实施例中，用于静脉内给予的药物组合物可提供约0.1至100mg/患者/天。可以使用0.1至多约100mg/患者/天的剂量。在局部给予中基本上更高的剂量是可能的。制备可胃肠外给予组合物的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的，并且在如《雷明顿：医药科学和实践》，第21版2005，利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(LippincottWilliams&Wilkins)，出版商(Publishers)的出版物中有更详细的描述。

根据给予方法，药物组合物可以多种剂型和量给予。例如，适于口服给予的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和口含片。应认识到，当口服给予时，应该保护抗体免于消化。这通常通过使分子与组合物复合而使得其对酸性和酶水解具有抵抗性或通过将分子包装在如脂质体或保护屏障的恰当抗性的载剂中来实现。保护试剂以免被消化的方式是本领域中众所周知的。

药物配制物可以通过将EMP2结合蛋白和具有所期望纯度的PD-1/PD-L1途径拮抗剂与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备。此类配制物可以是冻干配制物或水性溶液。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂可为乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸酯和其它有机酸；抗氧化剂(例如抗坏血酸)防腐剂低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶，或亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；和氨基酸、单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；以及离子和非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯)；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如锌蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂。对于EMP2结合蛋白和PD-1/PD-L1途径拮抗剂中的每一种，本发明组合物可以以0.5-200mg/ml之间，或10-50mg/ml之间的浓度配制。

含有本发明EMP2结合蛋白和PD-1/PD-L1途径拮抗剂的组合物可以用于治疗或预防性治疗。在治疗应用中，将组合物以“治疗有效剂量”给予患者。组合物的一次或多次给予可为取决于患者所需和所耐受的剂量和频率的给予。用于本发明目的的“患者”或“受试者”包括人类和其它动物，特别是哺乳动物。因此，方法适用于人类疗法和兽医应用。在优选的实施例中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物，并且在最优选的实施例中，患者是人类。

药物组合物可包含另外的活性剂，包括以下中的任何一种或多种：镇痛剂、抗炎剂、抗生素、抗微生物剂、润滑剂、避孕药、杀精子剂、局部麻醉剂和抗敏止痒剂。

如本文所用，术语“载剂”是指通常用作体内或体外应用于生物系统的活性剂的稀释剂或载体的惰性物质。(例如，如治疗剂的药物)。术语还涵盖赋予组合物粘合性质的典型惰性物质。

在一些实施例中，本发明提供了包含EMP2结合蛋白、PD-1/PD-L1途径拮抗剂和细胞或生物体水平的生理学上可接受的载剂的组合物。通常，生理学上可接受的载剂以液体、固体或半固体形式存在。液体载剂的实例包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、普通缓冲盐水(135-150mM NaCl)、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、糖蛋白以提供增强的稳定性(例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)等。固体或半固体载剂的实例包括甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖糊精、乳糖、右旋糖、蔗糖、葡萄糖、肌醇、糖粉、糖蜜、淀粉、纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄蓍胶、藻酸盐、爱尔兰藓的萃取物，潘瓦尔(panwar)胶、茄替胶、艾沙婆树外皮的胶、落叶松阿拉伯半乳聚糖、明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸(例如卡波莫(Carbopol))、硅酸钙、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、高岭土、氯化钠、聚乙二醇及其组合。由于生理学上可接受的载剂部分地由所给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法确定，因此存在多种本发明的药物组合物的合适的配制物(参见，例如，《雷明顿氏医药科学》，第17版，1989)。载剂和组合物优选是无菌的。

本文提供的组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术灭菌，或者可以在无菌条件下生产。水性溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在给予前与无菌水性溶液组合。组合物可根据需要含有药学上或生理学上可接受的助剂物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和三乙醇胺油酸酯。

适合于口服给予的配制物可包含：(a)液体溶液，如有效量的包装的基于铂的药物悬浮于稀释剂中，所述稀释剂例如水、盐水或PEG 400；(b)胶囊、药囊或片剂，各自含有预定量的基于铂的药物，呈液体、固体、颗粒或明胶形式；(c)在恰当液体中的悬浮液；以及(d)合适的乳液。片剂形式可以包括以下各者中的一个或多个：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、明胶、胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药学上相容的载剂。

治疗方法

在另一方面，本文提供了通过向受试者给予有效量的本文所述的任何一种本发明药物组合物来治疗受试者中的乳腺癌(例如，侵入性癌症或转移)，预防癌症进展或降低癌症速率的方法。在一些实施例中，本发明药物组合物包括1)本文所述的抗EMP2抗体或包括本发明抗EMP2抗体的免疫缀合物；2)程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂。在一些实施例中，受试者是哺乳动物受试者。在某些实施例中，受试者是人类。在示例性实施例中，受试者为至少20岁、25岁、30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁。

在一些实施例中，本文提供的方法用于治疗难治性癌症。“治疗难治性”癌症，肿瘤细胞和肿瘤是指已经对细胞凋亡介导(例如通过死亡受体细胞信号传导，例如，Fas配体受体、TRAIL受体、TNF-R1、化学治疗药物、放射)和非细胞凋亡介导(例如毒性药物、化学品)的癌症疗法(包括化学疗法、激素疗法、放射疗法和免疫疗法)中的一种或两种变得抗性或难治性的癌症。本发明涵盖了两种类型的治疗。

在一些实施例中，本文提供的本发明方法用于治疗过表达EMP2的癌症。“过表达”是指组织中EMP2的RNA或蛋白质表达，其显著高于对照组织样品中的RNA或蛋白质表达。在一个实施例中，组织样品是自体的。与来自不太可能发展为转移或正常(即，非癌症)组织样品的患者的癌组织相比，与侵袭性、转移、激素非依赖性(例如，雄激素非依赖性)或难治性或其可能性增加相关的癌测试组织样品通常具有至少两倍高的EMP2 mRNA或蛋白表达，通常高达三、四、五、八、十或更多倍的EMP2蛋白的较高表达。当观察具有大致类似地负载有测试和对照样品的凝胶条带时，这种差异可能是显而易见的。表达增加量的EMP2的前列腺癌更可能成为侵入性、转移或发展为治疗难治性癌症。各种截断值与EMP2过表达相关，因为原发性肿瘤中的小百分比的EMP2阳性细胞可能识别具有高复发和转移风险的肿瘤。术语“过表达(overexpress)”，“过表达(overexpression)”或“过表达(overexpressed)”可互换地指与相同类型的正常细胞相比，通常在癌细胞中以可检测的更高水平转录或转化的基因。因此，过表达是指蛋白质和RNA的过表达(由于增加的转录、转录后加工、转译、转译后加工、改变的稳定性和改变的蛋白质降解)，以及由于改变的蛋白质流量模型(增加的核定位)和增加的功能活性(例如在底物的增加的酶水解中)的局部过表达。与相同类型的非癌细胞相比，过表达也可以是50％、60％、70％、80％、90％或更多(2倍、3倍、4倍)。过表达可以基于使用免疫组织化学方法观察到的视觉上可检测或可量化的差异来检测EMP2蛋白质或核酸。术语“过表达EMP2的癌症”和“与EMP2过表达相关的癌症”可互换地指根据上述定义过表达EMP2的癌细胞或组织。

在一些实施例中，所述方法包括向受试者给予免疫缀合物。免疫缀合物可包括本发明的抗EMP2抗体或与治疗剂连接的片段。在一些实施例中，治疗剂是细胞毒性剂。细胞毒性剂可选自由以下组成的群组：蓖麻毒素、蓖麻毒素A-链、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、特诺波赛、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放射菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-八叠球菌、白树素有丝分裂素、缩窄素、酚霉素、伊诺霉素、curicin、巴豆毒素、卡奇霉素、肥阜草抑制剂、类美登素和糖皮质激素蓖麻毒素。治疗剂可以是放射性同位素。治疗同位素可选自由以下组成的群组：²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

在上述任何实施例中，可以进一步给予化学治疗药物和/或放射疗法。在一些实施例中，患者还接受激素拮抗剂疗法。患者与抗体或抗体片段的接触可以通过静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内或皮内给予患者抗体。

在一些实施例中，免疫缀合物包括细胞毒性剂，其是小分子。如美登素、类美登素、沙泊宁、白树素、蓖麻毒素或卡奇霉素和类似物或其衍生物的毒素也是合适的。可以与抗EMP2抗体缀合的其它细胞毒性剂包括BCNU、链霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶。也可以使用酶活性毒素及其片段。放射效应部分可以以已知方式(例如，双功能连接子、融合蛋白)并入缀合物中。本发明的抗体还可以与效应部分缀合，所述效应部分是将前药转化为活性化学治疗剂的酶。参见WO 88/07378；美国专利第4,975,278号；和美国专利第6,949,245号。抗体或免疫缀合物可任选地连接到非蛋白质聚合物((例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)上。

可以使用本领域中众所周知的方法制造抗体和细胞毒性剂的缀合物(参见美国专利第6,949,245号)。例如，缀合物可以使用多种双官能蛋白质偶联剂制成，如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(正顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(如己二酰亚胺酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸亚甲苯酯)以及双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如维特塔(Vitetta)等人，《科学(Science)》238：1098(1987)中所描述的来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸偶联至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。连接子可以是便于细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解连接子”。例如，可以使用酸不稳定连接子、肽酶敏感性连接子、二甲基连接子或含二硫连接子(夏里等人《癌症研究(Cancer Research)》52：127-131(1992))。

在其它实施例中，本文提供的方法结合其它癌症疗法(例如，根除性前列腺切除术)、放射疗法(外光束或近距离放射治疗)、激素疗法或化学疗法来实施。根除性前列腺切除术涉及去除整个前列腺和一些周围组织。当癌症被认为没有扩散到组织之外时，通常使用这种治疗。放射治疗通常用于治疗仍局限于前列腺，或已扩散到附近组织的前列腺癌。如果疾病是更晚期的，则可以使用放射来减小肿瘤的大小。激素疗法通常用于前列腺癌已经扩散到前列腺之外或已经复发的患者。激素疗法的目的是降低雄性激素、雄激素的水平，从而导致前列腺癌收缩或生长得更慢。

用于体内给予的抗体组合物

通过将具有期望纯度的一种或多种抗体(例如，抗EMP2抗体和抗PD-1或抗PD-L1抗体)与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备本文所提供的本发明组合物的配制物(《雷明顿氏医药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》第16版，Osol，A.编[1980])，用于以冻干配制物或水性溶液形式储存。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，锌蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

配制物还可提供另外的活性化合物，包括化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和抗激素剂。活性成分也可以制备为缓释制剂(例如，固体疏水性聚合物的半透性基质(例如，聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)，或聚(乙烯醇))、聚丙交酯。还可以将抗体和免疫缀合物包覆在微胶囊中，所述微胶囊是例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包覆在胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包覆在粗乳液中。

可以给予组合物用于治疗或预防性治疗。在治疗应用中，将组合物以“治疗有效剂量”给予患有疾病(例如，癌症)的患者。对此用途有效的量将取决于疾病的严重程度和患者健康的一般状态。组合物的一次或多次投可为与取决于患者所需和所耐受的剂量和频率的给予。用于本发明目的的“患者”或“受试者”包括人类和其它动物，特别是哺乳动物。因此，方法适用于人类疗法和兽医应用。在优选的实施例中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物，并且在最优选的实施例中，患者是人类。其它已知的癌症疗法可以与本发明的方法组合使用。例如，根据本发明使用的组合物还可用于将细胞靶标或敏化至其它癌症治疗剂，如5FU、长春碱、放线菌素D、顺铂、甲氨蝶呤等。

组合给予涵盖使用单独配制物或单一药物配制物共给予，并且以任何顺序连续给予，其中优选地存在两个(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。

经识别间接或直接调节EMP2的表达和/或功能的分子和化合物可可用于治疗分别过表达EMP2的癌症。这些调节剂可以单独给予或与常规化学疗法、放射疗法或免疫疗法以及目前开发的疗法组合共给予。

本文的配制物还可含有多于一种所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有互补活性但不会相互产生不利影响的活性化合物。例如，可能需要提供具有其它特异性的抗体。替代地或另外，组合物可包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或小分子拮抗剂。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。

可以将活性成分包覆在微胶囊中，所述微胶囊是例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微米球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这些技术公开于《雷明顿医药科学》第16版，Osol，A.编(1980)。

体内给予所用的配制物应为无菌的，或几乎无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德(leuprolideacetate)构成的可注射微球)，以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。虽然如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。

当包封的抗体在体内保持较长时间时，这些抗体会因在37℃下暴露于水分而变性或聚集，导致生物活性丧失并且免疫原性可能发生变化。可以根据所涉及的机制设计合理的策略以实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫化物交换而形成分子间S--S键，则可以通过修饰硫氢基残基、自酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当添加剂以及开发特定聚合物基质组成来实现稳定化。

施用模式

根据已知方法将本发明的抗体和化学治疗剂给予受试者，如以推注静脉内施用或在一段时间内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑室内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。在某些方面，将本发明的抗体和化学治疗剂给予患有癌症(例如，乳腺癌)的受试者。在某些方面，将本发明的抗体和化学治疗剂给予患有乳腺癌的受试者。在某些方面，将本发明的抗体和化学治疗剂给予患有三阴性乳腺癌的受试者。优选静脉内或皮下给予抗体。

治疗模式

在本发明的方法中，疗法用于提供相对于疾病或病况而言的积极治疗性反应。“积极治疗性反应”是预期疾病或病况的改善，和/或与疾病或病况相关联的症状的改善。例如，积极治疗性反应将指疾病的以下中的一个或多个改善：(1)赘生性细胞数量减少；(2)赘生性细胞死亡增加；(3)赘生性细胞存活抑制；(5)肿瘤生长抑制(即，在一定程度上减慢，优选地中断)；(6)患者生存率增加；以及(7)与疾病或病况相关联的一种或多种症状有一定缓解。

任何给定疾病或病症中的积极治疗性反应可以通过特定针对于所述疾病或病况的标准化反应指标来确定。可以使用如磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相成像、计算机断层摄影(CT)扫描、骨骼扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样的筛选技术评估肿瘤反应的肿瘤形态学变化(即总肿瘤负荷、肿瘤大小等)。

除这些积极治疗性反应以外，经历疗法的受试者可能受到与疾病相关联的症状得到改善的有益效果。

根据本发明的方法治疗后，这种反应可持续至少4至8周，或有时持续6至8周。替代地，疾病的改善可以归类为部分反应。“部分反应”是预期在没有新病变的情况下所有可测量的肿瘤负荷(即，受试者中存在的恶性细胞的数量，或测量的肿瘤块体积或异常单克隆蛋白质的量)中减少至少约50％，其可持续4至8周，或6至8周。

根据本发明的治疗包括使用“治疗有效量”的药剂。“治疗有效量”是指在必需剂量下及在必需时间内有效实现所期望治疗结果的量。

治疗有效量可根据如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及药剂在个体中引发期望反应的能力的因素而变化。治疗有效量还是治疗有益效果超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。

用于肿瘤治疗的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预测人类肿瘤中功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。

替代地，组合物的这种特性可以通过有经验的医师所知的体外测定检查化合物的抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其它方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和所选择的特定组合物或给予途径的此类因素来确定这样的量。

调整剂量方案以提供最佳期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间给予几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以以单位剂型配制，以便于给予和使剂量均匀。如本文所用的单位剂型是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定量的活性化合物，其经计算可与所需的药物载剂一起产生所期望的治疗效果。

本发明的单位剂型的规格由以下各项指定并且直接取决于以下各项：(a)活性化合物的独特特征及欲实现的特定治疗效果；和(b)混配这种活性化合物用于治疗个体敏感性在本领域中固有的限制。

本发明中所用的抗EMP2抗体的高效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况且可以由本领域的技术人员来确定。

用于本发明的抗EMP2抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg，如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，约如0.3，约1或约3mg/kg。在另一个实施例中，he抗体以1mg/kg或更多的剂量，如1至20mg/kg的剂量，例如5至20mg/kg的剂量，例如8mg/kg的剂量给予。

用于本发明PD-1/PD-L1途径拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg，如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，约如0.3，约1或约3mg/kg。在另一个实施例中，he抗体以1mg/kg或更多的剂量，如1至20mg/kg的剂量，例如5至20mg/kg的剂量，例如8mg/kg的剂量给予。

一般熟习本领域技术的医学专业人员可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可在药物组合物中以低于为了实现所期望治疗效果所需的水平使用的药剂的剂量开始，并逐渐提高剂量直到实现所期望效果。

在一个实施例中，抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂通过输注以每周10至500mg/kg，如200至400mg/kg的剂量给予。可以重复这种给予，例如1至8次，如3至5次。给予可以通过在2至24小时，如2至12小时的时间内连续输注进行。

在一个实施例中，抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂通过长时间，如超过24小时(如果需要)的缓慢连续输注给予，以减少包括毒性的副作用。

在一个实施例中，抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂以每周250mg至2000mg，例如300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mg或2000mg的剂量给予至多8次，如4至6次。给予可以通过在2至24小时，如2至12小时的时间内连续输注进行。这种方案可以根据需要重复一次或多次，例如在6个月或12个月后。可以通过测量给予后血液中本发明化合物的量来确定或调整剂量，例如通过取出生物样品并使用靶标抗EMP2抗体的抗原结合区的抗独特型抗体。

在进一步的实施例中，本发明组合物每周给予一次，持续2至12周，如3至10周，如4至8周。

在一个实施例中，抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂通过维持疗法给予，例如一周一次，持续6个月或更长时间。

作为非限制性实例，使用每24、12、8、6、4或2小时的单剂量或分剂量，或其任何组合，在治疗开始后，根据本发明的治疗可以作为抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂的日剂量提供，所述抗EMP2抗体和PD-1/PD-L1途径拮抗剂的量为每天，在以下中的至少一天：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40，或替代地，以下中的至少一周：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或其任何组合上约0.1-100mg/kg，如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg。

组合疗法

在一些实施例中，本发明组合物与一种或多种另外的治疗剂(例如化学治疗剂)组合使用。DNA损伤化学治疗剂的非限制性实例包括拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、拓朴替康、喜树碱以及其类似物或代谢物，以及多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷以及柔红霉素)；烷基化剂(例如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替派、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、甲胺喋呤、丝裂霉素C以及环磷酰胺)；DNA插入剂(例如顺铂、奥沙利铂以及卡铂)；DNA插入剂以及自由基产生剂，如博莱霉素；以及核苷模拟物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉宾、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀以及羟脲)。

破坏细胞复制的化学治疗剂包括：太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇及相关类似物；长春新碱、长春碱及相关类似物；沙立度胺、来那度胺及相关类似物(例如，CC-5013和CC-4047)；蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼、吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)；NF-κB抑制剂，包括IκB激酶抑制剂；结合于癌症中过表达的蛋白质的抗体及已知在癌症中上调、过表达或活化并且其抑制下调细胞复制的蛋白质或酶的其它抑制剂。

在一些实施例中，本发明的抗体可以在用本文所述或此时或之后由本领域技术人员已知的任何化疗剂治疗之前，同时或之后使用。

本文所述的方法的功效

在本发明的某些方面，通过降低肿瘤特异性标志物的血清浓度、增加的总存活时间、降低的肿瘤大小、癌症缓解、降低的转移标志物反应和降低的化学疗法副作用来测量本发明组合物的功效。

在本发明的某些方面，用伴随诊断方法和产品测量功效。可以在治疗之前、期间或之后进行伴随诊断测量。

制品

在其它实施例中，提供了含有可用于治疗上述病况的材料的制品。制品包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料，例如玻璃或塑料形成。容器容纳有效治疗病况的组合物并且可以具有无菌接入端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或是具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是抗体。容器上或与容器相关的标签表明组合物用于治疗选择的病况。制品还可包含第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户的观点来看合乎期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插入物。

现在参考以下实例描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，并且本发明决不应被解释为限于这些实例，而应解释为涵盖由于本文提供的教示而变得明显的任何和所有变化。

虽然本文出于说明目的已描述了本发明的特定实施例，本领域的技术人员应了解，在不脱离如所附权利要求书中所描述的本发明的情况下可以对细节进行多种变化。

实例

实例1：本发明抗EMP2抗体的构建

构建抗EMP2抗体PG-101(称为PG-101亲本)的两种变体(称为“变体1”和“变体2”)以消除PG-101的可变轻链CDR3中的脱酰胺位点。

将PG-101亲本、PG-101变体1和PG-101变体2抗体克隆到高表达哺乳动物载体系统中，并在HEK293细胞中完成三次小规模(0.03升)优质瞬时生产运行。通过蛋白A纯化来纯化抗体，并且得到4.58mg PG-101亲本、3.18mg PG-101变体1和5.10mg PG-101变体2。

PG-101亲本、PG-101变体1和PG-101变体2抗体的重链和轻链的氨基酸序列如下所示，其中每个阴影的可变区呈灰色：

PG-101亲本HC-hIgG1：

PG-101亲本LC-hκ：

PG-101 LC变体1-hκ：

PG-101 LC变体2-hκ：

每个重链和轻链的核苷酸序列如下所示：

PG-101亲本HC-hIgG1：

PG-101亲本LC-hκ：

PG-101 LC变体1-hκ：

PG-101 LC变体2-hκ：

实例2：抗EMP2和PD-1/PD-L1途径拮抗剂在同基因乳腺癌模型中是协同的

进行了两项研究，其中在BALB/c小鼠中产生了同基因乳腺癌4T1/萤火虫荧光素酶小鼠模型。用盐水、抗EMP2抗体PG-101、抗PD-1抗体(BioXCell)或PG-101和抗PD-1抗体的组合疗法治疗肿瘤。如图1和2所示，与抗PD-1抗体治疗相比，使用PG-101的抗EMP2治疗在降低总体肿瘤体积方面是优良的。此外，与单独的抗EMP2或抗PD-1疗法相比，抗EMP2和抗PD-1组合疗法表现出优良的总体肿瘤体积减少。如图3所示，使用阿瓦斯汀(抗VEGF-A抗体)和抗PD-1抗体治疗小鼠乳腺癌肿瘤模型显示对减少肿瘤体积没有影响。

在第一次研究的第10天和第二次研究的第15天，通过苏木精和曙红染色评估肿瘤组织学。还评估了F4/80表达的巨噬细胞表征。如图4所示，抗EMP2和抗PD-1抗体的组合疗法改变了肿瘤形态和CD8/巨噬细胞表达。

应理解，尽管本发明已结合其具体实施方式进行了描述，但前述描述意图说明且不限制本发明的范围。

实例3：EMP2在乳腺癌细胞系中表达的降低降低了PDL1表面表达

使用shRNA慢病毒载体在增生性乳腺癌细胞(MCF12A)中降低EMP2水平，并且随后使用流式细胞术评估这些细胞中的PDL1表达。如图5所示，EMP2的基因敲落降低了MCF12A细胞中的PDL1表达(实验重复三次)。

实例4：抗PD1和抗EMP2抗体组合疗法减少体内耗竭的全身性CD8+T细胞

为了进一步评估抗PD1和抗EMP2抗体组合疗法是否通过减少耗尽的全身性CD8+T细胞在体内影响乳腺肿瘤，用盐水、对照IgG、PG101、抗PD-1或抗PG101和抗PD1抗体的组合治疗携带4T1乳腺肿瘤的Balb/c小鼠。从这些动物的脾中定量CD8+、PD-1+细胞。如图6A和B所示，与单独使用抗PD-1或抗EMP-2以及盐水和IgG对照的治疗相比，用组合疗法治疗的小鼠显示耗竭的全身性CD8+T细胞的显著减少。

实例5：抗PD-1和抗EMP2抗体组合疗法减少体内骨髓来源的遏制性细胞(MDSC)

已经认识到骨髓来源的遏制性细胞(MDSC)以抗原非特异性方式遏制T细胞的能力。为了进一步评估抗PD1和抗EMP2抗体组合疗法是否调节此类MDSC，用盐水、对照IgG、PG101、抗PD-1或抗PG101和抗PD1抗体的组合治疗携带4T1乳腺肿瘤的Balb/c小鼠。治疗后，使用流式细胞术定量脾MDSC(CD45+、CD90-、CD11b+、Gr1+、CD115+)，并且两个独立重复的平均值显示在图7中。如图7所示，与单独使用抗PD-1或抗EMP-2以及盐水和IgG对照的治疗相比，用组合疗法治疗的小鼠显示MDSC显著减少。

Claims (34)

1.一种治疗患有乳腺癌的受试者的方法，所述方法包含向有需要的所述受试者给予包含有效量的EMP2结合蛋白和有效量的程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白特异性结合于EMP2的第二细胞外环中的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO：2

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含可变重链区和轻链可变区，所述可变重链区包含SEQ ID NO：3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：17。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含可变重链区和轻链可变区，所述可变重链区包含SEQ ID NO：3，所述轻链可变区SEQ ID NO：9。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白是单克隆抗体、人类化单克隆抗体、人类抗体、ScFv、双功能抗体、微抗体，或三功能抗体、嵌合抗体，或重组抗体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：6，所述轻链包含SEQ ID NO：7。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：6，所述轻链包含SEQ ID NO：8。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：6，所述轻链包含SEQ ID NO：10。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述EMP2结合蛋白与细胞毒性剂或标记物缀合。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-1拮抗剂。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗PD-1抗体选自由以下组成的群组：派姆单抗(pembrolizumab)、匹立珠单抗(pidilizumab)、REGN2810和纳武单抗(nivolumab)。

15.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-L1拮抗剂。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗(avelumab)、BMS-936559、度伐单抗(durvalumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。

19.一种药物组合物，其包含有效量的EMP2结合蛋白和有效量的程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ IDNO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ IDNO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含可变重链区和轻链可变区，所述可变重链区包含SEQ ID NO：3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5。

22.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，并且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ IDNO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ IDNO：15，并且LCDR3的序列是SEQ ID NO：17。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含可变重链区和轻链可变区，所述可变重链区包含SEQ ID NO：3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白是单克隆抗体、人类化单克隆抗体、人类抗体、ScFv、双功能抗体、微抗体，或三功能抗体、嵌合抗体，或重组抗体。

25.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：6，所述轻链包含SEQ ID NO：7。

26.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：6，所述轻链包含SEQ ID NO：8。

27.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：6，所述轻链包含SEQ ID NO：10。

28.根据权利要求19至27中任一项所述的药物组合物，其中所述EMP2结合蛋白与细胞毒性剂或标记物缀合。

29.根据权利要求19至28中任一项所述的药物组合物，其中所述程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-1拮抗剂。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述抗PD-1抗体选自由以下组成的群组：派姆单抗、匹立珠单抗、REGN2810和纳武单抗。

32.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡-配体1(PD-1/PD-L1)途径拮抗剂是PD-L1拮抗剂。

33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗体。

34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗、BMS-936559、度伐单抗和阿特珠单抗。