KR102298080B1 - 재조합 당단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원에서 제공되는 것은 글리코실화 프로파일이 변경된 (예를 들어, 개선된) 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질), 및 이러한 단백질 중 1가지 이상을 포함하는 제약 조성물 및 키트이다. 또한 제공되는 것은 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A)의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포의 생성 방법, 재조합 당단백질의 제조 방법, 및 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질) 중 적어도 1가지를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이다.

Description

재조합 당단백질 및 이의 용도{RECOMBINANT GLYCOPROTEINS AND USES THEREOF}
관련 출원과의 교차 참조
본 출원은 2013년 10월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/894,879호 및 2013년 11월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/901,942호에 대한 우선권을 주장하는데, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 출원은 생명 공학 분야, 더 구체적으로, 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A)의 생성 및 대상체에서의 리소좀 축적병 (예를 들어, 파브리병(Fabry disease))의 치료에 관한 것이다.
리소좀 축적병은 세포의 리소좀 내에서 당지질 또는 다당류 노폐물을 분해시키는 효소를 코딩하는 유전자에서의 결함의 결과인 일군의 40가지 초과의 질병이다. 효소 생성물, 예를 들어 당류 및 지질은 그 후에 새로운 생성물로 재순환된다. 이러한 질병 각각은 리소좀에서의 효소의 수준에 영향을 주는 유전성 상염색체성 또는 X-연관 열성 형질에서 생긴다. 일반적으로, 병에 걸린 개체의 세포 및 조직에서 이러한 효소의 생물학적 또는 기능적 활성은 감소되거나 전혀 없다. 예시적인 리소좀 축적병 및 결부된 효소 결핍의 목록이 도 1에 예시되어 있으며, 미국 특허 제6,066,626호의 표 1에 기술되어 있다. 그러한 질환에서, 효소 기능의 결핍은 체내에서 세포의 리소좀에서 지질 또는 탄수화물 기질의 점진적인 전신 퇴적을 생성하며, 이는 결국 기관 기능의 손실 및 사망을 야기한다.
파브리병은 리소좀 효소 α-갈락토시다아제-A의 결핍에 의해 야기되는 리소좀 축적병이다. 이러한 리소좀 히드롤라아제의 결핍은 신체의 대부분의 조직에서의 글리코스핑고지질 글로보트리아실세라마이드(GL3) 및 관련 지질의 점진적인 퇴적을 초래한다. GL3의 퇴적은 혈관 내피에서 주로 발견된다. GL3의 점진적인 내피 축적은 기관, 예컨대 신장, 심장 또는 뇌에서 허혈 및 경색으로 이어지며, 이는 극심한 통증, 신부전, 및 심질환 및 뇌혈관 질환을 야기한다. 혈관 질환으로부터의 신장, 심장 및/또는 뇌 합병증에 의한, 효소 대체 요법으로 치료되지 않은 파브리 환자의 평균 수명은 남성의 경우 50세이고 여성의 경우 70세이다 (문헌[Lidove et al., Int. J. Clin. Pract. 61:293-302, 2007]).
의학적 치료에서 사용하기 위한 재조합 단백질은 흔히, 혈액 제제 (예를 들어, 인간외 동물 혈청 또는 혈장)를 포함하는 액체 배지의 사용을 포함하는 세포 배양법에 의해 생성된다. 재조합 단백질을 함유하는 의약품의 오염은 생명공학 산업에서 문제가 되어 왔다 (문헌[Nims, BioProcessing J. 10:4-10, 2011]; 문헌[Plavsic et al., BioProcessing J. 9:6-12, 2011]; 문헌[Plavsic et al., Dev. Biol. Stand 99:95-109, 1999]). 예를 들어, 그러한 의약품에서의 다수의 상이한 바이러스의 존재는 일부의 경우에 재조합 단백질을 생성하는 세포의 배양에 사용되는 액체 배지에 존재하는 혈액 제제 (예를 들어, 인간외 동물 혈청 또는 혈장)에 기인한다. 재조합 단백질 생성용 세포 배양물에서 발견된 그리고 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장, 또는 동물 혈청 단백질)의 사용에 의해 야기되는 것으로 생각되는 오염 물질의 예가 본원에 기술되어 있다. 재조합 단백질 생성용 세포 배양에서의 무혈청 배지 또는 동물성 제품 무함유 배지의 사용이 유익하며, 이는 상기 배양 배지가 더 우수하게 규정되고 단순화되며, 감소된 오염 물질 정도를 갖고, 재조합 단백질 생성용 세포 배양에서 오염의 위험 또는 오염 물질의 수준을 없애거나 감소시키며, 세포 배양을 이용하여 재조합 단백질 생산 비용을 더 낮추기 때문이다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 글리코실화 프로파일이 변경된 (예를 들어, 개선된) 단백질 (예를 들어, 효소, 예를 들어, α-갈락토시다아제-A)이 본원에 기술된 방법을 이용하여 생성될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 따라서, (예를 들어, 효소 대체 요법용의 종래에 제조된 효소와 비교하여) 글리코형의 가변성이 감소되고/되거나 오염의 위험 또는 수준이 감소되고/되거나 (예를 들어, 바이러스 오염의 위험 또는 수준이 감소되고/되거나) 글리코실화 프로파일이 변경 및 개선된 α-갈락토시다아제-A 단백질, 이러한 α-갈락토시다아제-A 단백질 중 1가지 이상을 포함하는 제약 조성물 및 키트 (예를 들어, 글리코형의 가변성이 감소되고/되거나 오염의 위험 또는 수준이 감소된 (예를 들어, 바이러스 오염의 위험 또는 수준이 감소된) 제약 조성물), 당단백질 (예를 들어, α-갈락토시다아제-A)의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포의 생성 방법, 재조합 당단백질 (예를 들어, α-갈락토시다아제-A)의 제조 방법, 대상체에 있어서 파브리병의 치료 방법 및 글로보트리아오실세라마이드의 혈청중 수준의 감소 방법, 및 포유류 세포 (예를 들어, 시험관 내에서의 세포 또는 대상체에서의 세포)에서 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A의 수준의 증가 방법이 본원에 제공된다. 또한, α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
하기의 구조적 특징 중 1가지 또는 이들 둘 모두를 갖는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A(rhAGA) 단백질이 본원에 제공된다: 약 0.1% 내지 약 1.5%인, 모노시알릴화(monosialylated) 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 9% 초과인, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율. 예를 들어, 청구항 1의 rhAGA 단백질은 약 0.1% 내지 약 1.5%인 모노시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 9% 초과인, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율의 구조적 특징을 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 0.1% 내지 약 1.3% ((예를 들어, 약 0.1% 내지 약 1.0%, 또는 약 0.1% 내지 약 0.7%)인, 모노시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 8.5% 초과 (예를 들어, 약 9.0% 초과)인, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다.
본원에 제공된 rhAGA 단백질은 하기의 군으로부터 선택되는 구조적 특징 중 1가지 이상을 추가로 가질 수 있다: 약 13.5% 초과인, 바이시알릴화(bisialylated) 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 2.0% 초과인, 제2형의 트리시알릴화(trisialylated) 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 3.0 초과인 시알산/단백질의 몰/몰 비. 예를 들어, 본원에 제공된 rhAGA 단백질은 하기의 구조적 특징을 추가로 가질 수 있다: 약 13.5% 초과인, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 2.0% 초과인, 제2형의 트리시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 3.0 초과인 시알산/단백질의 몰/몰 비. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 13.8% 초과 (예를 들어, 약 14.0% 초과)인, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 4% 초과 (예를 들어, 약 6% 초과)인, 제2형의 트리시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 3.2 초과 (예를 들어, 약 3.4 초과)인 시알산/단백질의 몰/몰 비를 갖는다.
본원에 제공된 rhAGA 단백질은 하기의 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 구조적 특징을 추가로 가질 수 있다: 약 0.1% 내지 약 3.9%인, 중성으로 하전된 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 3.0%인, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 5.3%인, 바이시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 9.0%인, 제1형의 트리시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 1% 내지 약 7.0%인, 만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 14.8% 초과인, 모노포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 4.9% 초과인, 테트라시알릴화(tetrasialylated) 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 8.2% 초과인, 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율. 예를 들어, 본원에 기술된 rhAGA 단백질은 하기의 군으로부터 선택되는 구조적 특징 중 4가지 이상을 가질 수 있다: 약 0.1% 내지 약 3.9%인, 중성으로 하전된 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 3.0%인, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 5.3%인, 바이시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 9.0%인, 제1형의 트리시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 1% 내지 약 7.0%인, 만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 14.8% 초과인, 모노포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 4.9% 초과인, 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 8.2% 초과인, 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 0.1% 내지 약 3.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 2.0%)인, 중성으로 하전된 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 1.0% 내지 약 2.0% (예를 들어, 약 1.5% 내지 약 2.0%)인, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 3.0% 내지 약 5.0% (예를 들어, 약 4.0% 내지 약 5.0%)인, 바이시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 0.5% 내지 약 8.0% (예를 들어, 약 0.5% 내지 약 5.0%)인, 제1형의 트리시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 4% 내지 약 6.9% (예를 들어, 약 5% 내지 약 6.8%)인, 만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 15% 초과 (예를 들어, 약 16% 초과)인, 모노포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 6% 초과인, 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 일부 실시 양태에서, rhAGA 단백질은 약 8.5% 초과 (예를 들어, 약 9.0% 초과)인, 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다.
본원에 제공된 rhAGA 단백질은 하기 특성 중 1가지 또는 하기 특성 둘 모두를 가질 수 있다: (i) 파브라자임(Fabrazyme)®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의한 증가된 엔도사이토시스(endocytosis) 및 (ii) 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질에 대한 증가된 친화성. 예를 들어, 본원에 제공된 rhAGA 단백질은 (i) 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의한 증가된 엔도사이토시스; 및 (ii) 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질에 대한 증가된 친화성을 가질 수 있다.
본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장 또는 동물성 혈액 제제)에 검출가능한 수준의 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않거나 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않을 수 있다.
본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지의 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 rhAGA 단백질일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 무단백질 배지 및/또는 화학적 규정 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 rhAGA 단백질일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 그리고 통합된 그리고 연속적인 공정을 이용하여 단리된 rhAGA 단백질일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 통합된 그리고 연속적인 공정은 (a) 세포가 실질적으로 없는, 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함하는 액체 배양 배지를 제공하는 단계 (여기서, 액체 배양 배지를 제1 다중-크로마토그래피 시스템 (MCCS1) 내로 공급함); (b) MCCS1을 사용하여 액체 배지 중 rhAGA 단백질을 포착하는 단계 (여기서, 재조합 치료용 단백질을 함유하는 MCCS1의 용출액을 제2 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2) 내로 연속적으로 공급함); 및 (c) MCCS2를 사용하여 재조합 치료용 단백질을 정제 및 폴리싱(polishing)하는 단계 (여기서, MCCS2로부터의 용출액은 rhAGA 원료 의약품(drug substance)이며, 본 공정은 통합된 것으로서, 액체 배양 배지로부터 rhAGA 원료 의약품인 MCCS2로부터의 용출액으로 연속적으로 진행됨)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2가지의 상이한 단위 조작(unit operation)을 수행한다. 일부 실시 양태에서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 이용은 컬럼 스위칭을 수반한다. 일부 실시 양태에서, MCCS1은 재조합 단백질을 포착하는 그리고 바이러스를 불활성화시키는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, MCCS2는 재조합 치료용 단백질을 정제하는 그리고 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼을 이용한다. 일부 실시 양태에서, MCCS1은 제1 주기적 역류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1), 예를 들어, 4개-컬럼 PCCS를 포함하는 PCCS1이다. 일부 실시 양태에서, (PCCS1의 실시 양태에서) 4개-컬럼 PCCS에서의 4개의 컬럼 중 3개는 액체 배양 배지로부터의 재조합 치료용 단백질을 포착하는 단위를 수행한다. 일부 실시 양태에서, (PCCS1의 실시 양태에서) 4개-컬럼 PCC1에서의 4개의 컬럼 중 3개로부터의, 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 함유하는 용출액은 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼 내로 공급된다. 일부 실시 양태에서, (PCCS1의 실시 양태에서) 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼은 바이러스 불활성화를 위하여 재조합 치료용 단백질을 함유하는 용출액을 낮은 pH에서 유지함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼으로부터의 용출액을 PCCS2 내로 공급하기 전에 인-라인(in-line) 완충제 조정 저장부를 사용하여 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼으로부터의 용출액의 pH를 조정하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, PCCS2는 3개의 크로마토그래피 컬럼 및 1개의 크로마토그래피 막을 포함한다. 일부 실시 양태에서, PCCS2에서의 3개의 크로마토그래피 컬럼은 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 PCCS1의 용출액으로부터 본원에 제공된 rhAGA를 정제하는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, PCCS2에서의 3개의 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출액을 PCCS2에서의 크로마토그래피 막 내로 공급한다. 일부 실시 양태에서, PCCS2에서의 크로마토그래피 막은 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 PCCS2에서의 3개의 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출액 중의 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, PCCS2에서의 크로마토그래피 막은 양이온 교환을 통하여 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, PCCS2에서의 크로마토그래피 막의 유통액(flow through) 및 세척액(wash)은 rhAGA 원료 의약품이다.
또한 제공되는 것은 본원에 기술된 임의의 rhAGA 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 함유하는 제약 조성물이다. 예를 들어, 제약 조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제약 조성물은 약 4 mg/mL 내지 약 6 mg/mL (예를 들어, 약 5 mg/mL)의 농도의 rhAGA를 함유한다. 일부 실시예에서, 제약 조성물은 살균, 동결 건조 산제이다. 일부 실시 양태에서, 제약상 허용가능한 담체는 만니톨, 제1인산나트륨, 1수화물, 제2인산나트륨 7수화물의 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 에이전트(agent)일 수 있다.
본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장 또는 동물성 혈액 제제)에 검출가능한 수준의 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 존재하지 않거나 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않을 수 있다.
본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지의 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 본원에 제공된 rhAGA 단백질일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 무단백질 배양 배지 및/또는 화학적 규정 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지의 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 그리고 통합된 그리고 연속적인 공정을 이용하여 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 예시적인 통합된 그리고 연속적인 공정을 이용하여) 단리된 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함할 수 있다.
또한 제공되는 것은 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열; 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열; 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 TTG 개시 코돈을 갖는, 인간 CD52 단백질의 펩티드를 코딩하는 서열; 및 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열을 함유하는 발현 벡터이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터 서열은 햄스터 rpS21 프로모터, 햄스터 β-액틴 프로모터, 및 SV40 초기 프로모터의 군으로부터 선택되며; 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열은 SV40 초기 폴리(A) 인식 서열이다. 일부 실시 양태에서, 발현 벡터는 인간 또는 개 글루타민 신테타아제, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열을 추가로 함유한다. 일부 실시 양태에서, 인간 또는 개 글루타민 신테타아제를 코딩하는 서열의 5' 말단은 SV40 초기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 인간 또는 개 글루타민 신테타아제, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열의 3' 말단은 SV40 초기 인트론 및 폴리(A) 시그널 서열에 작동가능하게 연결된다.
또한 제공되는 것은 하기 단계를 포함하는, 당단백질의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포주의 생성 방법이다: (a) 혈청-의존성 불사화(immortalized) 포유류 세포주를 제공하는 단계; (b) 포유류 세포주를 (1) 제1 농도 (1X)의 동물 혈청을 함유하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 10일 동안; (2) 약 0.2X 내지 약 0.3X의 농도의 동물 혈청을 함유하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 10일 동안; 및 (3) 약 0.01X 내지 약 .08X의 동물 혈청을 함유하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 10일 동안 순차적으로 배양하는 단계; (c) (b) 후에 배양물로부터 단일-세포 서브클론(subclone) 배양물을 생성하는 단계; (d) 허용가능한 형질감염 효율, 무혈청 배양 배지에서의 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 갖는 (c)의 서브클론을 선발하는 단계; (d) (d)의 선발된 서브클론을 무단백질, 무혈청, 화학적 규정 배지에서 약 5일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 또는 약 5일 내지 약 10일) 동안 배양하는 단계; (e) (d) 후에 배양물로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하는 단계; 및 (f) 허용가능한 형질감염 효율, 최고 세포 밀도, 성장 특성, 체적 생산율(volumetric productivity rate; VPR), 및 당단백질의 글리코실화 프로파일을 갖는 (e)의 서브클론을 선발하는 단계 (여기서, (f)의 선발된 서브클론은 당단백질의 재조합적 발현에 유용함). 또한 제공되는 것은 하기 단계를 포함하는, 당단백질의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포주의 생성 방법이다: (a) 혈청-의존성 불사화 포유류 세포주를 제공하는 단계; (b) 포유류 세포주를 (1) 제1 농도 (1X)의 동물 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 1일 내지 약 10일 (예를 들어, 약 3일) 동안; (2) 약 0.2X 내지 약 0.6X의 농도 (예를 들어, 0.5X)의 동물 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 1일 내지 약 10일 (예를 들어, 약 3일) 동안; 및 (3) 0X 내지 약 .10X의 동물 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 10일 (예를 들어, 약 8일) 동안 순차적으로 배양하는 단계; (c) (b) 후에 배양물로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하는 단계; (d) 허용가능한 형질감염 효율, 무혈청 배양 배지에서의 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 갖는 (c)의 서브클론을 선발하는 단계; (e) (d)의 선발된 서브클론으로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하는 단계; 및 (f) 허용가능한 형질감염 효율, 최고 세포 밀도, 성장 특성, 체적 생산율(VPR), 및 재조합 단백질 발현을 갖는 (e)의 서브클론을 선발하는 단계 (여기서, (f)의 선발된 서브클론은 당단백질의 재조합적 발현에 유용함).
일부 실시예에서, 혈청-의존성 불사화 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포주(Chinese Hamster Ovary cell line)이다. 일부 실시 양태에서, 혈청-의존성 불사화 포유류 세포주는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 내생적으로 발현하지 않는다. 일부 실시 양태에서, (f)의 선발된 서브클론은 현탁 상태로 성장한다. 일부 실시 양태에서, 재조합적 단백질 발현은 항체와 효소 (예를 들어, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질) 둘 모두 중 하나의 발현이다. 또한 제공되는 것은 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성되는 당단백질의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포이다.
또한 제공되는 것은 하기 단계를 포함하는 재조합 당단백질의 제조 방법이다: 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성되는 당단백질의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포를 제공하는 단계; 당단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 발현 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 단계; 상기 세포를 당단백질을 생성하기에 충분한 조건 하에서 무혈청 성장용 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 세포 또는 성장용 배양 배지로부터 당단백질을 수확하는 단계. 일부 실시예에서, 배양을 현탁 세포 배양법을 이용하여 수행한다. 일부 실시 양태에서, 배양을 생물 반응기를 사용하여 수행한다. 일부 실시 양태에서, 배양을 무단백질, 무혈청, 화학적 규정 배지를 이용하여 수행한다 (예를 들어, 무단백질, 무혈청, 화학적 규정 배지를 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 배양함). 일부 실시 양태에서, CHO 세포는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 내생적으로 발현하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 재조합 당단백질은 효소 (예를 들어, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)이다. 일부 실시 양태에서, 당단백질을 코딩하는 서열은 서열 번호 1의 서열과 90% 이상 동일하다. 일부 실시 양태에서, 발현 벡터는 하기를 추가로 함유한다: 당단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열; 당단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 TTG 개시 코돈을 갖는, 인간 CD52 단백질의 펩티드를 코딩하는 서열; 및 당단백질을 코딩하는 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된, 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열. 일부 실시 양태에서, 프로모터 서열은 햄스터 rpS21 프로모터, 햄스터 β-액틴 프로모터, 및 SV40 초기 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되며; 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열은 SV40 초기 폴리(A) 인식 서열이다. 일부 실시 양태에서, 발현 벡터는 인간 또는 개 글루타민 신테타아제, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인간 또는 개 글루타민 신테타아제, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열의 5' 말단은 SV40 초기 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 인간 또는 개 글루타민 신테타아제, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열의 3' 말단은 SV40 초기 인트론 및 폴리(A) 시그널 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 당단백질을 상기 세포로부터 수확한다. 일부 실시예에서, 당단백질을 세포 배양 배지로부터 수확한다. 또한 제공되는 것은 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)이다. 또한 제공되는 것은 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 당단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 함유하는 제약 조성물이다. 예를 들어, 제약 조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 당단백질은 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질이며, 제약 조성물은 약 4 mg/mL 내지 약 6 mg/mL (예를 들어, 약 5 mg/mL)의 농도의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 함유한다. 일부 실시 양태에서, 제약 조성물은 살균, 동결건조 산제이다.
또한 제공되는 것은 대상체에서의 파브리병의 치료 방법이며, 이는 파브리병을 갖는 대상체에게 본원에 제공된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A(rhAGA) 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 투여는 전신 투여 (예를 들어, 정맥내 투여)이다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 rhAGA를 체중 1 kg당 약 0.5 mg 내지 약 2.0 mg (예를 들어, 체중 1 kg당 약 1.0 mg)의 용량으로 투여한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 2회 이상의 용량의 rhAGA 단백질이 투여된다. 예를 들어, 적어도 상기 2회 이상의 용량의 rhAGA 단백질은 약 2주 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태는 진통제, 항응고제, 아세틸콜린에스테라아제 억제제, β-차단제, 및 글루코실세르마이드 신타아제 억제제의 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 추가의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 파브리병을 갖는 것으로 진단되었다.
또한 제공되는 것은 포유류 세포에서 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준을 증가시키는 방법이며, 이는 포유류 세포를 본원에 제공된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A(rhAGA) 단백질의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 시험관 내 세포 (예를 들어, 시험관 내 인간 세포)이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 대상체 (예를 들어, 인간) 내에 있다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 파브리병을 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시예에서, 접촉은 rhAGA를 대상체에게 전신 투여함으로써 수행된다. 예를 들어, 전신 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 rhAGA를 체중 1 kg당 약 0.5 mg 내지 약 2.0 mg (예를 들어, 체중 1 kg당 약 1.0 mg)의 용량으로 투여한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 2회 이상의 용량의 rhAGA 단백질이 투여된다. 예를 들어, 적어도 상기 2회 이상의 용량의 rhAGA 단백질은 약 2주 간격으로 투여될 수 있다.
또한 제공되는 것은 대상체의 혈청 중 글로보트리아오실세라마이드의 감소 방법이며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 제공된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A(rhAGA) 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 8 ㎍/mL 초과의 혈청중 수준의 글로보트리아소일세라므드를 갖는다. 일부 실시예에서, 대상체는 파브리병을 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시 양태에서, 투여는 전신 투여 (예를 들어, 정맥내 투여)이다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 rhAGA를 체중 1 kg당 약 0.5 mg 내지 약 2.0 mg (예를 들어, 체중 1 kg당 약 1.0 mg)의 용량으로 투여한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 2회 이상의 용량의 rhAGA 단백질이 투여될 수 있다. 예를 들어, rhAGA 단백질의 상기 2회 이상의 용량 중 적어도 2회는 약 2주 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태는 진통제, 항응고제, 아세틸콜린에스테라아제 억제제, β-차단제, 및 글루코실세르마이드 신타아제 억제제의 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 추가의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 인간이다.
"단리된"이라는 용어는 1가지 이상의 오염 물질 (예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 또는 탄수화물, 또는 이의 조합)로부터 분리된 분자를 의미한다. 비제한적 실시예에서, 단리된 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 기타 당단백질은 중량 기준으로 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순수하다.
"액체 배양 배지"라는 용어는 포유류 세포가 시험관 내에서 성장하게 하거나 증식하게 하기에 충분한 영양소를 포함하는 유체를 의미한다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 하기 중 1가지 이상을 포함할 수 있다: 아미노산 (예를 들어, 20가지의 아미노산), 퓨린 (예를 들어, 하이포잔틴), 피리미딘 (예를 들어, 티미딘), 콜린, 이노시톨, 티아민, 폴산, 비오틴, 칼슘, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티미딘, 시아노코발아민, 피루베이트, 리포산, 마그네슘, 글루코스, 나트륨, 칼륨, 철, 구리, 아연, 및 나트륨 중탄산염. 일부 실시 양태에서, 액체 배양 배지는 포유류 유래의 혈청을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 액체 배양 배지는 포유류 유래의 혈청 또는 또 다른 추출물을 포함하지 않는다 (규정된 액체 배양 배지). 일부 실시 양태에서, 액체 배양 배지는 미량 금속, 포유류 성장 호르몬, 및/또는 포유류 성장 인자를 포함할 수 있다. 액체 배양 배지의 또 다른 예로는 최소 배지 (예를 들어, 무기 염, 탄소원 및 물만을 포함하는 배지)가 있다. 액체 배양 배지의 비제한적 예가 본원에 기술되어 있다. 액체 배양 배지의 또 다른 예는 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 구매가능하다. 액체 배양 배지는 임의의 밀도의 포유류 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, 생물 반응기로부터 제거되는 액체 배양 배지의 용적에는 포유류 세포가 실질적으로 없을 수 있다.
"무혈청 액체 배양 배지"라는 용어는 포유류 혈청을 포함하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
"혈청-함유 액체 배양 배지"라는 용어는 포유류 혈청을 포함하는 액체 배양 배지를 의미한다.
"화학적 규정 액체 배양 배지"라는 용어는 본 기술 분야의 용어로서, 이는 화학 성분 전부가 공지되어 있는 액체 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 화학적 규정 액체 배양 배지는 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을, 이러한 제제가 전형적으로 알부민과 지질의 복합 믹스(mix)를 포함하는 바와 같이 포함하는 것이 아니다.
"무단백질 액체 배양 배지"라는 용어는 임의의 단백질 (예를 들어, 임의의 검출가능한 단백질)을 포함하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
"통합 공정"이라는 용어는 특정한 결과 (예를 들어, 액체 배양 배지로부터의, (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 포함하는) 치료용 단백질 원료 의약품의 생성)를 달성하도록 협력하여 기능하는 구조 요소들을 이용하여 수행되는 공정을 의미한다.
"연속 공정"이라는 용어는 재조합 단백질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 재조합 단백질)을 함유하는 배양 배지로부터 원료 의약품 (예를 들어, 재조합 단백질을 함유하는 원료 의약품)을 생성하기 위한 시스템의 적어도 일부분을 통하여 유체를 연속적으로 공급하는 공정을 의미한다. 예를 들어, 재조합 치료용 단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)을 포함하는 액체 배양 배지는 시스템이 작동 중이고 치료용 단백질 원료 의약품이 시스템 외부로 공급되는 동안 시스템 내로 연속적으로 공급된다. 연속 공정을 수행하는 데 사용될 수 있는 그러한 시스템의 비제한적 예가 미국 가특허 출원 제61/856,930호 및 미국 가특허 출원 제61/775,060호에 기술되어 있다.
"다중-컬럼 크로마토그래피 시스템" 또는 "MCCS"라는 용어는 2개 이상의 상호연결 또는 스위칭 크로마토그래피 컬럼 및/또는 크로마토그래피 막의 시스템을 의미한다. 1가지 예시적인 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템으로는 2개 이상의 상호연결 또는 스위칭 크로마토그래피 컬럼 및/또는 크로마토그래피 막을 포함하는 주기적 역류 크로마토그래피 시스템(PCC)이 있다. 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템의 추가의 예가 본 기술 분야에 공지되어 있다.
"분비형 단백질" 또는 "분비형 재조합 단백질"이라는 용어는 본 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 적어도 부분적으로 포유류 세포로부터 적어도 세포외 공간 내로 (예를 들어, 나와서 액체 배양 배지 내로) 분비되는 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질)을 의미한다. 당업자라면 "분비형 단백질"이 분비형 단백질로 간주되기 위하여 전적으로 세포로부터 해리될 필요는 없음을 알 것이다.
"관류식 배양"이라는 용어는 복수의 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 제1 액체 배양 배지에서 배양하는 것으로서, 여기서, 상기 배양은 제1 액체 배양 배지의 주기적인 또는 연속적인 제거, 및 이와 동시에 또는 그 직후 실질적으로 동일한 체적의 제2 액체 배양 배지를 용기 (예를 들어, 생물 반응기)에 첨가하는 것을 포함함을 의미한다. 일부 실시예에서, 배양 기간 동안 증가하는 기간 (예를 들어, 약 24시간의 기간, 약 1분 내지 약 24시간의 기간, 또는 24시간 초과의 기간)에 걸친 제거되고 첨가되는 제1 액체 배양 배지의 체적 (예를 들어, 매일을 기준으로 한 배양 배지 재공급 속도)의 증가하는 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)가 있다. 매일 제거되고 대체되는 배지의 분율은 배양되는 특정 세포, 초기 접종 밀도 및 특정 시점에서의 세포 밀도에 따라 달라질 수 있다. "RV" 또는 "반응기 체적(reactor volume)"은 배양 공정의 시작시에 존재하는 배양 배지의 체적 (예를 들어, 접종 후 존재하는 배양 배지의 총 체적)을 의미한다. 관류식 배양을 수행하는 데 사용될 수 있는 생물 반응기는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 당업자라면 생물 반응기가 관류식 배양에서 사용되도록 개조될 (예를 들어, 관류식 생물 반응기가 되도록 개조될) 수 있음을 알 것이다.
"유가식 배양"이라는 용어는 본 기술 분야의 용어이며, 이는 복수의 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 제1 액체 배양 배지에서 배양하는 것으로서, 여기서, 용기 (예를 들어, 생물 반응기)에 존재하는 세포의 배양은 제1 액체 배양 배지 또는 제2 액체 배양 배지를 세포 배양물로부터 상당히 또는 유의하게 제거하지 않고서 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가하는 것을 포함함을 의미한다. 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지와 동일할 수 있다. 유가식 배양의 일부 실시예에서, 제2 액체 배양 배지는 농축된 형태의 제1 액체 배양 배지이다. 유가식 배양의 일부 실시예에서, 제2 액체 배양 배지는 건조 분말로서 첨가된다. 당업자라면, 생물 반응기는 유가식 배양에서 사용되도록 개조될 (예를 들어, 유가식 생물 반응기가 되도록 개조될) 수 있다.
"비생산율" 또는 "SPR"은 본 기술 분야의 용어로서, 본원에서 사용되는 바와 같이 일일 포유류 세포당 생성된 재조합 치료용 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 치료용 항체의 SPR은 일반적으로 질량/세포/일로서 측정된다. 재조합 치료용 효소의 SPR은 일반적으로 단위/세포/일 또는 (단위/질량)/세포/일로서 측정된다.
"체적 생산율" 또는 "VPR"은 본 기술 분야의 용어로서, 본원에서 사용되는 바와 같이 일일 배양물 체적당 (예를 들어, 생물 반응기, 베셀(vessel), 또는 튜브 체적 1 L당) 생성된 재조합 치료용 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 치료용 항체의 VPR은 일반적으로 질량/L/일로서 측정된다. 재조합 치료용 효소의 VPR은 일반적으로 단위/L/일 또는 질량/L/일로서 측정된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서 사용하기 위해 본원에 기술되어 있으며; 본 기술 분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 한정하고자 하는 것이 아니다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리(entry), 및 본원에서 언급된 다른 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충될 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 좌우한다.
본 발명의 1가지 이상의 실시 양태의 상세 사항이 첨부된 도면 및 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]에 개시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점이 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용] 및 도면으로부터, 그리고 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 리소좀 축적병 및 각각의 질환에 있어서의 상응하는 효소 결함의 목록이다.
도 2는 전구체형 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 및 전구체형 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 아미노산 서열 (각각 서열 번호 1 및 2)과, 성숙형 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 3)이다.
도 3은 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 포함하는 pGZ629-2GFZ 벡터(2GFZ)의 지도이다.
도 4는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있는 벡터의 지도이다.
도 5는 재조합 당단백질의 발현용으로 최적화된 모 세포주를 생성하는 데 사용되는 단계를 나타내는 흐름도이다.
도 6은 크기 배제 컬럼으로부터의 파브라자임® 및 레플라갈(Replagal)®의 용출을 나타내는 크로마토그램이다.
도 7a는 파브라자임®의 질량 대 전하 매트릭스 보조 레이저 탈착(mass-to-charge matrix-assisted laser desorption)/이온화(ionization) 비행 시간형 질량 분광(time-of-flight 질량 분광법)(MALDI-TOF MS) 프로파일이다.
도 7b는 레플라갈®의 MALTI-TOF MS 질량 분광 프로파일이다.
도 8은 파브라자임® (상부) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G) (중간 및 하부)의 3개의 질량 대 전하 MALDI-TOF 질량 분광 프로파일의 세트이다.
도 9는 파브라자임® 및 레플라갈®의 소듐-도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔의 사진이다.
도 10은 각각의 피크에 상응하는 N-결합 올리고당(류) 구조를 나타내는, 2-안트라닐산으로 유도체화된 (AA-표지됨) N-결합 올리고당류의 예시적인 크로마토그래피 용출 프로파일이다. 삽도는 2개의 3-안테나형(triantennary), 트리시알릴화올리고당 구조를 나타내며, 여기서, 2-AA로 유도체화된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 용출 프로파일에서 상기 2개의 구조 중 하나는 피크 6에 상응하며 (제1형), 상기 2개의 구조 중 다른 하나는 피크 6' (제2형)에 상응한다.
도 11은 파브라자임® (청색) 및 레플라갈® (적색)로부터의 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 용출 프로파일이다.
도 12는 파브라자임® (2개의 막대의 각각의 세트에서 좌측 막대) 및 레플라갈® (2개의 막대의 각각의 세트에서 우측 막대)에 있어서 중성으로 하전된 올리고당류 (피크 1), 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 2), 모노시알릴화 올리고당류 (피크 3), 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 4), 바이시알릴화 올리고당류 (피크 5), 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (제1형; 피크 6), 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (제2형; 피크 6'), 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 7), 모노포스포릴화 올리고당류 (피크 8), 테트라시알릴화 올리고당류 (피크 9), 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 올리고당류 (피크 10), 및 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 11) (좌측에서 우측으로)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 13은 각각 효소에 의해 소화된 단백질의 LCMS 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 레플라갈®에 있어서 Asn108의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 14는 각각 효소에 의해 소화된 단백질의 LCMS 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 레플라갈®에 있어서 Asn161의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 15는 각각 효소에 의해 소화된 단백질의 LCMS 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 레플라갈®에 있어서 Asn184의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 16은 각각 효소에 의해 소화된 단백질의 LCMS 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 Asn108의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 17은 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 Asn108의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 LCMS 분석에 따른 각각의 피크에 존재하는 N-결합 올리고당류의 구조를 나타내는 예시적인 그래프이다.
도 18은 각각 효소에 의해 소화된 단백질의 LCMS 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 Asn161의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 19는 각각 효소에 의해 소화된 단백질의 LCMS 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 Asn184의 아미노산 잔기에 존재하는 N-결합 올리고당류의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 20은 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)로부터의 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 용출 프로파일이다.
도 21a는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 중성으로 하전된 올리고당류 (피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 21b는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 모노시알릴화, 마이너스 푸코스 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 21c는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 2)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 22a는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 22b는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 바이시알릴화 올리고당류 (피크 5)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 22c는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (제1형; 피크 6)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 23a는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (제2형; 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 23b는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 23c는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 모노포스포릴화 올리고당류 (피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 24a는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 테트라시알릴화 올리고당류 (피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 24b는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 올리고당류 (피크 10)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 24c는 AA-표지된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 분석에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)에 있어서 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 25a는 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰 대 몰의 비를 나타내는 그래프이다 (상부).
도 25b는 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 N-아세틸뉴라민산(NANA) 대 단백질의 몰 대 몰의 비를 나타내는 그래프이다.
도 26은 파브라자임® (FZ) (적색) 및 레플라갈® (녹색)의 표면 플라즈몬 공명 (비아코어(Biacore)) 용해성 양이온 비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체-결합 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 27은 파브라자임® (FZ) (적색) 및 레플라갈® (녹색)의 표면 플라즈몬 공명 (비아코어) 용해성 양이온 비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체-결합 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 28은 표면 플라즈몬 공명 (비아코어)에 의해 결정되는 바와 같은, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 상대적인 용해성 양이온 비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 결합성을 나타내는 그래프이다.
도 29는 증가하는 농도의 만노스-6-포스페이트에 의한 만노스-6-포스페이트 수용체 친화성 컬럼으로부터 용출되는 파브라자임® (FZ) 및 레플라갈®의 상대적인 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 30은 증가하는 농도의 만노스-6-포스페이트에 의한 만노스-6-포스페이트 수용체 친화성 컬럼으로부터 용출되는 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 상대적인 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 31은 파브라자임® (FZ) 및 레플라갈®의 영상화 모세관 등전 집중 (imaged capillary isoelectric focusing; icIEF) 피크 프로파일이다.
도 32a는 ciIEF의 피크 1 내지 5에 존재하는 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 32b는 ciIEF의 피크 6 내지 11에 존재하는 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 32c는 ciIEF의 피크 12 내지 14에 존재하는 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 33은 합성 pNP 기질을 사용하여 결정된, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 Km의 그래프이다.
도 34는 합성 pNP 기질을 사용하여 결정된, 파브라자임® (FZ) 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 Vmax의 그래프이다.
도 35는 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 컬럼으로부터의 파브라자임® (청색) 및 레플라갈® (녹색)의 용출 프로파일이다.
도 36은 0.1 mg/kg의 파브라자임®을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후, 또는 0.1 mg/kg의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A 단백질 (FZ2G)을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후 파브리 마우스 모델에서, 또는 단회 용량의 비히클을 정맥내 투여한 파브리 마우스 모델에서 간 조직에서의 GL3의 양 (간 조직 1 mg당 GL3의 ng)을 나타내는 그래프이다. 1개의 샘플을 분석으로부터 배제하였으며, 그 이유는 이것이 그럽스 검정(Grubbs' test) (p < 0.01)에 따르면 이상치인 것으로 계산되기 때문이었다 (그래프에서 "a""로 표시된 군).
도 37은 0.1 mg/kg의 파브라자임®을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후, 또는 0.1 mg/kg의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A 단백질 (FZ2G)을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후 파브리 마우스 모델에서, 또는 단회 용량의 비히클을 정맥내 투여한 파브리 마우스 모델에서 비장 조직에서의 GL3의 양 (비장 조직 1 mg당 GL3의 ng)을 나타내는 그래프이다.
도 38은 1.0 mg/kg의 파브라자임®을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후, 또는 1.0 mg/kg의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A 단백질 (FZ2G)을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후 파브리 마우스 모델에서, 또는 단회 용량의 비히클을 정맥내 투여한 파브리 마우스 모델에서 심장 조직에서의 GL3의 양 (심장 조직 1 mg당 GL3의 ng)을 나타내는 그래프이다.
도 39는 1.0 mg/kg의 파브라자임®을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후, 또는 1.0 mg/kg의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 A 단백질 (FZ2G)을 단회 정맥내 투여한지 3일 또는 14일 후 파브리 마우스 모델에서, 또는 단회 용량의 비히클을 정맥내 투여한 파브리 마우스 모델에서 신장 조직에서의 GL3의 양 (신장 조직 1 mg당 GL3의 ng)을 나타내는 그래프이다.
도 40은 1 mg/kg의 파브라자임® (원; 각각의 시점에서 5마리의 마우스) 또는 1 mg/kg의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 (정사각형; 각각의 시점에서 8마리의 마우스)의 단회 정맥내 투여 후 파브리 마우스 모델에서의 시간이 지남에 따른 효소 활성을 나타내는 그래프이다.
본원에서 제공되는 것은 파브라자임®과 비교하여 글리코실화 프로파일이 변경된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 및 1가지 이상의 상기 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 함유하는 조성물, 제약 조성물 및 키트이다. 현재 제공된 재조합 당단백질 및 현재 제공된 재조합 당단백질을 함유하는 조성물은 예를 들어 하기 이득을 갖는다: 더 적은 글리코형의 가변성 및/또는 더 낮은 오염 위험 또는 수준 (예를 들어, 더 낮은 바이러스 오염 위험 또는 수준). 현재 제공된 재조합 당단백질은 또한 하기 비제한적 이점 중 1가지 이상을 가질 수 있다: 파브라자임®과 비교하여, 임의의 조합의, (재조합 당단백질을 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여한 후 간세포의 표면 상에서 발현되는 비시알산당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 결합함에 의한) 간에의 비특이적 표적화의 감소, 그 표면 상에 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포 (예를 들어, 인간 세포)에 의한 재조합 당단백질의 엔도사이토시스의 속도의 증가, 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질에 대한 친화성의 증가, 혈청중 반감기의 증가, 및 유효 용량의 감소. 또한 제공되는 것은 재조합 당단백질 (예를 들어, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포의 생성 방법 및 재조합 당단백질 (예를 들어, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)의 제조 방법이다. 또한 제공되는 것은 파브리병의 치료 방법, 대상체의 혈청 중 글로보트리아오실세르마이드의 수준의 감소 방법, 및 포유류 세포 (예를 들어, 시험관 내 세포 또는 대상체에서의 세포)에서 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A의 수준의 증가 방법이다. 또한 제공되는 것은 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터이다.
알파-갈락토시다아제-A
인간 α-갈락토시다아제-A (α-D-갈락토시드 갈락토히드롤라아제; α-gal A; EC 3.2.1.22)는 Xq22 상의 유전자에 의해 코딩되는 리소좀 엑소글리코시다아제이다. 성숙형 인간 α-갈락토시다아제-A는 398개 아미노산 (대략 51 kD)의 2개의 비-공유 결합 서브유닛으로 구성된 호모이량체로서, 상기 서브유닛 각각은 활성 부위 및 가능한 3개의 N-결합 글리코실화 부위 (N139, N192, 및 N215)를 포함한다. α-갈락토시다아제-A 단백질의 활성 부위는 촉매 활성에 결정적인 2개의 아스파르트산 잔기 (D170 및 D231)를 갖는다. α-갈락토시다아제-A 단백질의 3차원 결정 구조는 1996년에 공개되었다 (문헌[Munier-Lehmann et al., J. Biol . Chem . 271:15166-15174, 1996]). 알파-갈락토시다아제-A는 글로보트리아오실세라마이드 (GL-3) 및 기타 α-갈락틸-말단화 중성 글리코스핑고지질, 예컨대 갈라비오실세라마이드 및 혈액형 B 물질을 세라마이드 디헥소사이드 및 갈락토스로 가수분해시키는 것을 촉매한다. 재조합 형태의 α-갈락토시다아제-A의 비활성은 합성 기질, 예를 들어 p-니트로페닐-α-D-갈락토피라노시드(pNP)를 사용하여 테스트될 수 있다.
인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 글리코실화는 인간 세포에서 리소좀에의 그의 표적화를 허용한다. 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 및 기타 인간 당단백질의 글리코실화에 사용되는 세포 경로의 간단한 요약이 하기에 제공되어 있다.
인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 소포체에서 합성된다. 합성 후, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 각각의 단량체는 골지체에서 번역-후 변형을 겪는다. 상기에 나타낸 바와 같이, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 각각의 단량체는 3개의 가능한 N-글리코실화 부위 (N139, N192, 및 N215)를 갖는다. 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 몇몇 생리학적 글리코형이 있다. N139 잔기는 복합 탄수화물들을 연결시키며, 반면에 N192 및 N215 잔기는 만노스가 풍부한 올리고당들을 연결시키며 따라서 리소좀에 의한 섭취를 위한 효소의 표적화에 연루된다. 소포체에서의 합성 후, 리소좀 효소의 전구체는 골지체로 이전된다. 만노스-6-포스페이트(M6P) 잔기의 번역 후 변형, 특히 부가는 시스(cis)-골지에서 일어난다. M6P-효소 복합체는 M6P 수용체에 결합되며, 트랜스-골지 네트워크(network)로부터 방출되는데, 이로부터 상기 복합체는 프리리소좀 구획(prelysosomal compartment)/엔도좀 구획(endosomal compartment)로 수송된다. 일단 엔도좀 구획 내이면, 산성 pH는 효소가 그의 수용체로부터 해리되게 한다. 그 후 이것은 탈포스포릴화를 겪어서 성숙형의 기능성 효소를 생성한다. 그 후, 상기 수용체는 트랜스-골지로 재순환되어 다른 효소를 모집하거나, 원형질 막으로 이동하는데, 여기서 이것은 내생 효소를 수집할 수 있다 (문헌[Sly et al., J. Cell Biochem. 18:67-85, 1982]; 문헌[Helenius et al., Ann. Rev. Biochem. 32:1-100, 1997]).
모든 진핵생물 N-글리칸의 생합성은 소포체(ER) 막의 세포질면에서, 돌리콜 피로포스페이트 N-아세틸글루코사민(Dol-P-P-GlcNAc)을 생성하도록 UDP-GlcNAc로부터 지질-유사 전구체 돌리콜 포스페이트(Dol-P)로의 GlcNAc-P의 이전으로 시작된다. 단백질 올리고사카릴트랜스퍼라아제에 의해 ER에서 단백질 내의 Asn-X-Ser/Thr의 서열 내의 아스파라긴으로 전체 글리칸이 이전되기 전에 Glc3Man9GlcNAc2의 글리칸을 생성하도록 14개의 당이 순차적으로 Dol-P에 부가된다. 단백질-결합된 N-글리칸은 막-결합된 글리코시다아제 및 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 촉매되는 복잡한 일련의 반응에 의해 ER 및 골지체에서 후속적으로 리모델링된다. 14개-당 올리고만노스 글리칸이 Asn-X-Ser/Thr에 공유 부착된 후, ER에서 Glc3Man9GlcNAc2로부터 3개의 당을 제거하기 위하여 일련의 반응이 이용된다. 이러한 트리밍(trimming) 단계는 모든 진핵생물 사이에 보존되어 있다. Glc3Man9GlcNAc2의 트리밍은 α-글리코시다아제 I 및 II에 의한 글루코스 잔기의 순차적인 제거로 시작된다. 상기 둘 모두의 글루코시다아제는 ER의 내강에서 기능을 하며, 이때 α-글리코시다아제 I은 말단 α1-2Glc에 작용하고 α-글루코시다아제 II는 2개의 내부 α1-3Glc 잔기를 순차적으로 제거한다. ER을 떠나기 전에, ER α-만노시다아제 I이 많은 당단백질에 작용하는데, 상기 ER α-만노시다아제 I은 말단 α1-2Man을 Man9GlcNAc2의 중심 아암(arm)으로부터 특이적으로 제거하여 Man8GlcNAc2 이성질체를 생성한다. 골지체로 가는 도중 ER을 떠나는 대다수의 당단백질은 (ER α-만노시다아제 I이 작용했는지에 따라) 8개 또는 9개의 만노스 잔기를 갖는 N-글리칸을 갖는다. 대부분의 당단백질에 있어서, 추가의 만노스 잔기는 Man5GlcNAc2가 생성될 때까지 골지체의 시스 구획에서 제거된다.
하이브리드(hybrid) 및 복합 N-글리칸의 생합성은 GlcNAcT-1로 칭해지는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제의 작용에 의해 내측 골지체에서 개시된다. GlcNAcT-1은 Man5GlcNAc2의 코어에서 만노스 α1-3의 C-2에 N-아세틸-글루코사민 잔기를 부가하는데, 이는 N-글리칸의 제1 분지를 개시한다. 일단 이 단계가 일어났으면, 대사수의 N-글리칸은 α-만노시다아제 II에 의해 트리밍되는데, 이는 말단 α1-3Man 및 α1-6Man 잔기를 GlcNAcMan5GlcNAc2로부터 제거하여 GlcNAcMan3GlcNAc2를 형성한다. 일단 2개의 만노스 잔기가 제거되면, GlcNAcT-II에 의해 제2 N-아세틸글루코사민이 만노스 α1-6의 C-2에 부가되어 모든 2-안테나형, 복합 N-글리칸을 위한 전구체를 생성한다. 생성된 글리칸은 2개의 말단 N-아세틸글루코사민 잔기의 부가에 의해 개시된 2개의 안테나 또는 분지를 갖는다. 추가의 분지는 (GlcNAcT-IV에 의해) 코어 만노스 α1-3의 C-4에서 그리고 (GlcNAcT-V에 의해) 코어 만노스 α1-6의 C-6에서 개시되어 3-안테나형 및 4-안테나형 N-글리칸을 생성할 수 있다. GlyNAcT-IX 또는 GlcNAcT-Vb로 칭해지는 또 다른 효소는 C-6 코어 만노스 α1-6에서 GlcNAcT-V와 동일한 반응을 촉매하지만, GlcNAcT-V와는 대조적으로 GlnNAcT-IX/Vb는 N-아세틸글루코사민을 코어 만노스 α1-3의 C-6으로 또한 이전시킬 수 있다. 또 다른 분지는 GlcNAcT-VI에 의해 코어 만노스 α1-3의 C-4에서 개시될 수 있다.
복합 및 하이브리드 N-글리칸은 GlcNAcT-III에 의해 코어의 β-만노스에 부착되는 이등분(bisecting) N-아세틸글루코사민 잔기를 지닐 수 있다. 이등분 N-아세틸글루코사민을 갖는 2-안테나형, 3-안테나형 및 4-안테나형 복합 N-글리칸은, α-만노시다아제 II 후 그리고 GlcNAcT-II, GlcNAcT-IV, 및 GlcNAcT-V에 의한 분지의 개시 후 GlcNAcT-III이 작용할 때 합성된다.
대부분 트랜스 골지체에서 일어나는 추가의 당 부가는 하이브리드 및 분지형 N-글리칸을 성숙형, 복합 N-글리칸의 광범위한 어레이로 전환시킨다. 당은 코어에 부가될 수 있으며, N-아세틸글루코사민 잔기의 분지화는 당 부가에 의해 연장될 수 있고, 연장된 분지는 캡핑(capping)되거나 장식될 수 있다. 예를 들어, GlcNAcT-II의 생성물은 2개의 분지를 갖는 복합 N-글리칸을 생성하도록 푸코스, 갈락토스 및 시알산의 부가에 의해 연장될 수 있는 2-안테나형 N-글리칸이다. 복합 N-글리칸은 예를 들어 많은 추가의 당 (N-글리칸의 코어에 부착된 것을 포함함), 추가의 분지, 폴리-N-아세틸락토사민 단위에 의해 연장된 분지, 및 상이한 캡핑 구조를 가질 수 있다. 복합형 올리고당류는 골지체에서 예를 들어 N-아세틸글리코사민, 갈락토스 및 시알산 잔기의 부가에 의해 만노스-3-함유 올리고당류로부터 합성된다.
코어 변형은 종종 글리칸의 코어 내의 아스파라긴에 인접한 N-아세틸글루코사민에의 α1-6 결합에 있어서 푸코스의 부가이다. 푸코스를 이러한 코어 N-아세틸글루코사민으로 이전시키는 데 연루된 푸코실트랜스퍼라아제는 GlcNAcT-1의 사전 작용을 요구한다. 대다수의 복합 및 하이브리드 N-글리칸은 제2형 N-아세틸락토사민으로 지칭되는 편재하는 빌딩 블록(building block) Galβ1-4GlcNAc을 생성하도록 β-결합된 갈락토스 잔기를 개시 N-아세틸글루코사민에 부가함으로써 만들어지는 연장된 분지를 갖는다. 안테나는 N-아세틸글루코사민 및 갈락토스 잔기의 순차적인 부가에 의해 추가로 연장되어 폴리-N-아세틸락토사민으로 칭해지는 LacNAc (-3Galβ1-4GlcNAcβ1-)n의 탠덤(tandem) 반복체를 생성할 수 있다. 또 다른 예에서, β-결합된 갈락토스는 N-아세틸글루코사민의 C-3에 부가되어, 제1형 N-아세틸락토사민 시퀀스(sequence)로서 지칭되는 Galβ1-3GlcNAc를 생성한다. 일부 단백질에서, β-결합된 N-아세틸갈락토사민은 β-결합된 갈락토스 대신 N-아세틸글루코사민에 부가되어 GalNAcβ1-4GlcNAc 연장체를 갖는 안테나를 생성한다.
캡핑 또는 장식 반응은 시알산, 푸코스, 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, 및 술페이트를 분지에 부가하는 것을 수반한다. 캡핑 당은 가장 일반적으로는 α-결합되며 따라서 β-결합된 리본-유사 폴리-N-아세틸락토사민 분지로부터 떨어져서 연장된다.
리소좀 효소는 시스 골지체에서 올리고만노스 N-글리칸 상의 만노스 잔기의 C-6에 GlcNAc-1-P를 획득할 수 있다. 그 후, N-아세틸-글루코사민은 글리코시다아제에 의해 트랜스 골지체에서 제거됨으로써 Man-6-P 잔기가 노출되고, 상기 잔기는 Man-6-P 수용체에 의해 인식되어 산성화된 프리리소좀 구획으로 보내진다.
하이브리드형 올리고당류는 골지에서, 예를 들어, N-아세틸글리코사민, 갈락토스, 및 시알산 잔기의 부가에 의해 만노스-3 및 만노스-5 코어 구조로부터 합성된다. 하이브리드 N-글리칸은, α-만노시다아제 II가 GlcNAcMan5GlcNAc2 글리칸에 작용하지 않을 경우 형성되어서, 성숙형 당단백질에서 온전하고 비변형되는 주변 α1-3Man 및 α1-6Man 잔기를 남긴다. α-만노시다아제 II의 불완전한 작용은 GlcNAcMan4GlcNAc2 하이브리드를 생성할 수 있다. 또 다른 골지체 만노시다아제, α-만노시다아제 IIX가 GlcNAcT-1에 의해 생성되는 GlnNAcMan5GlcNAc2에 또한 작용한다.
N-결합된 글리칸 (예를 들어, 고 만노스형 올리고당류)의 생성에 사용되는 생합성 경로 및 효소의 상세한 개관이 문헌[Stanley et al., "N-Glycans", Essentials of Glycobiology, Ed. Varki, Cummings, and Eskho, Cold Spring Harbor Press, 2009]에 기술되어 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A의 번역 후 글리코실화는 단백질의 적당한 트래피킹(trafficking)에 중요하다. 예를 들어, 아미노산 위치 215에서의 세린 잔기의 치환은 리소좀으로의 효소 트래피킹을 손상시킨다 (문헌[Munier-Lehmann et al., J. Biol. Chem. 271:15166-15174, 1996]; 문헌[Wildt et al., Nat. Rev. Microbiol. 3:119-128, 2005]). CHO 세포에서 발현되는 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 상이한 글리코형을 설명하는 연구가 문헌[Matsuura et al., Glycobiology 8:329-339, 1998]에 기술되어 있다.
인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 예시적인 전구체 및 성숙 서열이 각각 도 2에 예시되어 있다 (각각 서열 번호 1 및 2). 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 서열과 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 포함할 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 서열과 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 서열로 이루어질 수 있다). 다른 실시예에서, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 1 내지 30개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 25개 아미노산, 1 내지 20개 아미노산, 1 내지 15개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 5개 아미노산, 1 내지 3개 아미노산, 1 또는 2개 아미노산, 20 내지 25개 아미노산, 15 내지 25개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 8개 아미노산, 및 5 내지 15개 아미노산)이 N-말단으로부터 제거되고/되거나 1 내지 30개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 25개 아미노산, 1 내지 20개 아미노산, 1 내지 15개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 5개 아미노산, 1 내지 3개 아미노산, 1 또는 2개 아미노산, 20 내지 25개 아미노산, 15 내지 25개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 8개 아미노산, 및 5 내지 15개 아미노산)이 C-말단으로부터 제거된 서열 번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 이종 아미노산 서열 또는 태그(tag)에 공유 결합될 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질에 결합될 수 있는 이종 아미노산 서열의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 폴리-His 태그, 키틴-결합 단백질, 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 및 스트렙타비딘. 임의의 유형의 태그가 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질에 공유 결합될 수 있다 (예를 들어, 형광 기, 방사성 뉴클레오티드, 및 형광 단백질). 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질에 공유 결합될 수 있는 분자의 추가의 예는 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐, 폴리에스테르, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 및 이들의 공중합체를 포함한다.
인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 예시적인 전구체 및 성숙 서열이 각각 도 2에 예시되어 있다 (각각 서열 번호 1 및 2). 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 서열과 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 포함할 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 서열과 적어도 95% 동일한 (예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 서열로 이루어질 수 있다). 다른 실시예에서, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 1 내지 30개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 25개 아미노산, 1 내지 20개 아미노산, 1 내지 15개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 5개 아미노산, 1 내지 3개 아미노산, 1 또는 2개 아미노산, 20 내지 25개 아미노산, 15 내지 25개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 8개 아미노산, 및 5 내지 15개 아미노산)이 N-말단으로부터 제거되고/되거나 1 내지 30개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 25개 아미노산, 1 내지 20개 아미노산, 1 내지 15개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 5개 아미노산, 1 내지 3개 아미노산, 1 또는 2개 아미노산, 20 내지 25개 아미노산, 15 내지 25개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 8개 아미노산, 및 5 내지 15개 아미노산)이 C-말단으로부터 제거된 서열 번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 이종 아미노산 서열 또는 태그에 공유 결합될 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질에 결합될 수 있는 이종 아미노산 서열의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 폴리-His 태그, 키틴-결합 단백질, 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 및 스트렙타비딘. 임의의 유형의 태그가 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질에 공유 결합될 수 있다 (예를 들어, 형광 기, 방사성 뉴클레오티드, 및 형광 단백질). 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질에 공유 결합될 수 있는 분자의 추가의 예는 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐, 폴리에스테르, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 및 이들의 공중합체를 포함한다.
인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 예시적인 핵산 (예를 들어, cDNA)이 도 2에 예시되어 있다 (서열 번호 1).
일부 실시예에서, 본원에 기술된 임의의 핵산 (예를 들어, cDNA)은 형광 태그 및 켄칭제(quencher) 중 1가지 이상에 공유 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, 임의의 핵산 (예를 들어, cDNA)은 방사성 동위 원소 (예를 들어, P32, P33, 및/또는 S35)를 포함하는 1가지 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나 추가로 포함할 수 있다.
α-갈락토시다아제-A 단백질의 변경된 글리코형
본 명세서는 파브라자임®과 비교하여 변경된 (예를 들어, 개선된) 글리코실화를 갖는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)을 제공한다. 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 예를 들어 (파브라자임®과 비교하여) 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 증가된 백분율을 갖는데, 이는 만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 증가된 결합성으로 이어지고, 이는 다시, (파브라자임®과 비교하여) 그 표면 상에 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포 (예를 들어, 인간 세포)에 의한 재조합 단백질의 엔도사이토시스의 속도를 증가시킬 수 있다. 또한, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여, 모노시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 감소된 백분율 및 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 증가된 백분율 (이는 파브라자임®과 비교하여 각각 (인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여한 후 간세포의 표면 상에서 발현되는 비시알산당단백질 수용체에 결합함에 의한) 재조합 단백질의 간에의 비특이적 표적화의 감소, 및 혈청중 반감기의 증가로 이어질 수 있음) 중 하나 또는 이들 둘 모두를 가질 수 있다.
또한, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 예를 들어, 그 조성의 더 적은 가변성 (예를 들어, 글리코형의 더 적은 가변성)을 나타내고/내거나 더 안전한 제품이다 (예를 들어, 박테리오파지, 박테리아, 마이코박테리아 및 바이러스 (예를 들어, 엔테로바이러스 (예를 들어, 인간 또는 동물 엔테로바이러스), 리노바이러스 (예를 들어, 동물 또는 인간 리노바이러스), 동물 또는 인간 피코비르나바이러스, 코부바이러스, 전염성 소 비기관염 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 소 레오바이러스-3, 칼리시바이러스과(caliciviridae), 에코바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스 (예를 들어, 동물 또는 인간 로타바이러스), 소 스푸마바이러스, 돼지 내인성 레트로바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스, 베시바이러스 (예를 들어, 베시바이러스 2117), 노로바이러스 (예를 들어, 동물 또는 인간 노로바이러스), 아스트로바이러스 (예를 들어, 인간 또는 동물 아스트로바이러스), 동물 또는 인간 파라인플루엔자 또는 메타뉴모바이러스, 아넬로바이러스, 코로나바이러스, 플레보바이러스, 소 슈말렌베르그 바이러스, 칼리시바이러스, 사이클로바이러스, 써코바이러스 (예를 들어, 돼지 또는 소 써코바이러스), 코사바이러스, 콕사키바이러스, 쿠바바이러스, 페스티바이러스, 폴리오마 바이러스 (예를 들어, 소 폴리오마 바이러스), 소 파필로마바이러스, 새로운 설치류 파필로마 제2형 SV40, 파르보바이러스 (예를 들어, 돼지, 설치류, 인간, 또는 소 파르보바이러스), 카디오바이러스 (예를 들어, EMCV), 파라믹소바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 자이로바이러스(gyrovirus), 코사바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca valley virus), 코로나바이러스, 말 전염성 빈혈 바이러스, 인간 아데노바이러스, 고양이 칼리시바이러스, 아데노바이러스 제2형, 소 아데노바이러스 제3형, 가성 광견병 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 파라인플루엔자 제3형, 전염성 소 비기관염 바이러스, 블루텅 바이러스(bluetongue virus), 고양이 백혈병 바이러스, 마우스 미세 바이러스, 소 파르보바이러스, 캐시 밸리 바이러스(cache valley virus), 레오바이러스 (예를 들어, 동물 또는 인간 레오바이러스), 개 아데노바이러스, SV-40 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 포리스(porice) PRRSV, 소 헤르페스 바이러스 4, 또는 족구병 바이러스) 중 1가지 이상에 의한 오염의 위험 또는 수준의 감소).
이전에 파브라자임®은 레플라갈®과 비교하여 유의하게 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 것으로 밝혀져 있었다 (문헌[Lee et al., Glycobiology 13:305-313, 2003]).
파브라자임®과 레플라갈®의 글리코실화 패턴의 주목할 만한 차이는 부분적으로는 이러한 단백질의 생성에 사용되는 상이한 세포주에 기인하는 것으로 생각된다 (예를 들어, 파브라자임®은 CHO 세포주에 의해 생성되며, 레플라갈®은 인간 세포주에 의해 생성된다).
파브라자임®은 겐자임(Genzyme)에 의해 제조되고 판매되는 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 재조합 형태이다. 파브라자임® 및 파브라자임®의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,356,804호에 기술되어 있다. 레플라갈®은 셔(Shire)에 의해 제조되고 판매되는 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 재조합 형태이다. 레플라갈® 및 레플라갈®의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,083,725호; 미국 특허 제6,458,574호; 미국 특허 제6,395,884호; 및 미국 특허 제7,133,354호에 기술되어 있다.
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질 (FZ2G)은 (예를 들어, 임의의 조합의) 하기에 열거된 (i) 내지 (xii)의 임의의 구조적 특징 중 2가지 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)을 갖는다. (i) 내지 (xii)의 1가지 이상의 파라미터 각각에 있어서의 하기에 열거된 값의 임의의 범위가 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질에 존재할 수 있다. 게다가, 본원에 제공된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질은 이 섹션에 기술된 예시적인 기능적 특성 중 1가지 이상 (예를 들어, 1, 2 또는 3가지)을 가질 수 있다. 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 물리적 특성 및/또는 기능적 특성의 임의의 조합이 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 구조적 특징들의 예시적인 조합이 하기에 기술되어 있다.
게다가, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 구조의 더 적은 가변성 (예를 들어, 글리코형의 더 적은 가변성) 및/또는 감소된 오염 위험 또는 수준 (예를 들어, 감소된 오염 위험 또는 수준)을 가질 수 있다.
본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장 또는 동물성 혈액 제제)에 검출가능한 수준의 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않거나 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않을 수 있다. 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지의 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 rhAGA 단백질일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 무단백질 배지 및/또는 화학적 규정 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 rhAGA 단백질일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 그리고 통합된 그리고 연속적인 공정 (예를 들어, 본원에 또는 국제 공개 제14/137903호에 기술된 통합된 그리고 연속적인 공정 중 임의의 것)을 이용하여 단리된 rhAGA 단백질일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질은 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장 또는 동물 혈액 인자 또는 단백질)을 함유하는 배양 배지의 사용을 포함하는 방법에 의해 생성된 본원에 제공된 rhAGA 단백질과 비교하여 개선된 안전 프로파일 (예를 들어, 감소된 오염 위험 (예를 들어, 본원에 기술되거나 본 기술 분야에 공지된 예시적인 오염물질 중 임의의 것))을 갖는 rhAGA 단백질일 수 있다.
생물물리학적 특성
I. N- 결합된 모노시알릴화 올리고당류
본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 모노시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 감소될 수 있다. 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류의 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 대략 동일하거나 약간 감소될 수 있다. 이러한 특징은 유리하며, 그 이유는 모노시알릴화 올리고당류가 간에서 간세포 상에서 발현되는 비시알산당단백질 수용체에 결합되는 노출된 갈락토스 잔기를 함유할 수 있기 때문이다. 간은 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 표적 조직이 아니며, 따라서 모노시알릴화 올리고당류의 양의 감소는 인간 체내에서 이 효소의 비생산적 표적화를 감소시키는 것으로 생각된다.
파브라자임®은 약 1.7% 내지 약 3.2%의, 모노시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일에서 피크 3)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 0.1% 내지 약 1.6% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 1.5%, 약 0.1% 내지 약 1.4%, 약 0.1% 내지 약 1.3%, 약 0.1% 내지 약 1.2%, 약 0.1% 내지 약 1.1%, 약 0.1% 내지 약 1.0%, 약 0.1% 내지 약 0.9%, 약 0.1% 내지 약 0.8%, 약 0.1% 내지 약 0.7%, 약 0.1% 내지 약 0.6%, 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.4%, 약 0.2% 내지 약 1.4%, 약 0.2% 내지 약 1.3%, 약 0.2% 내지 약 1.2%, 약 0.2% 내지 약 1.0%, 약 0.2% 내지 약 0.9%, 약 0.2% 내지 약 0.8%, 약 0.2% 내지 약 0.7%, 약 0.3% 내지 약 1.4%, 약 0.3% 내지 약 1.3%, 약 0.3% 내지 약 1.3%, 약 0.3% 내지 약 1.2%, 약 0.3% 내지 약 1.2%, 약 0.3% 내지 약 1.1%, 약 0.3% 내지 약 1.0%, 약 0.3% 내지 약 0.9%, 약 0.3% 내지 약 0.8%, 약 0.3% 내지 약 0.7%, 약 0.4% 내지 약 1.4%, 약 0.4% 내지 약 1.3%, 약 0.4% 내지 약 1.2%, 약 0.4% 내지 약 1.1%, 약 0.4% 내지 약 1.0%, 약 0.4% 내지 약 0.9%, 약 0.4% 내지 약 0.8%, 약 0.4% 내지 약 0.7%, 약 0.5% 내지 약 1.4%, 약 0.5% 내지 약 1.3%, 약 0.5% 내지 약 1.2%, 약 0.5% 내지 약 1.1%, 약 0.5% 내지 약 1.0%, 약 0.5% 내지 약 0.9%, 또는 약 0.6% 내지 약 1.2%)의, 모노시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일에서 피크 3)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
파브라자임®은 약 2.0% 내지 약 5.7%의, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일에서 피크 2)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 0.1% 내지 3.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 2.9%, 약 0.1% 내지 약 2.8%, 약 0.1% 내지 약 2.7%, 약 0.1% 내지 약 2.6%, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 약 0.1% 내지 약 2.4%, 약 0.1% 내지 약 2.3%, 약 0.1% 내지 약 2.2%, 약 0.1% 내지 약 2.1%, 약 0.1% 내지 약 2.0%, 약 0.1% 내지 약 1.9%, 약 0.1% 내지 약 1.8%, 약 0.1% 내지 약 1.7%, 약 0.1% 내지 약 1.6%, 약 0.1% 내지 약 1.5%, 약 0.1% 내지 약 1.4%, 약 0.1% 내지 약 1.3%, 약 0.1% 내지 약 1.2%, 약 0.3% 내지 약 3.0%, 약 0.3% 내지 약 2.9%, 약 0.3% 내지 약 2.8%, 약 0.3% 내지 약 2.7%, 약 0.3% 내지 약 2.6%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.3% 내지 약 2.4%, 약 0.3% 내지 약 2.3%, 약 0.3% 내지 약 2.2%, 약 0.3% 내지 약 2.1%, 약 0.3% 내지 약 2.0, 약 0.3% 내지 약 1.9%, 약 0.3% 내지 약 1.8%, 약 0.3% 내지 약 1.7%, 약 0.3% 내지 약 1.6%, 약 0.3% 내지 약 1.5%, 약 0.3% 내지 약 1.4%, 약 0.3% 내지 약 1.3%, 또는 약 0.3% 내지 약 1.2%)의, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 2)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
모노시알릴화 올리고당류 또는 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
II. N-결합된 비스-만노스 -6- 포스페이트 올리고당류
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 증가될 수 있다. 증가된 수준의 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류는 그의 원형질 막 상에서 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 세포에 대한 증가된 표적화로 이어진다. 만노스-6-포스페이트 수용체에의 결합은 세포 내로의 효소의 엔도사이토시스 및 세포 리소좀으로의 효소의 셔틀링(shutμLing)을 트리거링한다(trigger).
파브라자임®은 약 4.0% 내지 약 7.0%의, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일에서 피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 7.5% 초과 (예를 들어, 약 7.6% 초과, 약 7.7% 초과, 약 7.8% 초과, 약 7.9% 초과, 약 8.0% 초과, 약 8.1% 초과, 약 8.2% 초과, 약 8.2% 초과, 약 8.3% 초과, 약 8.4% 초과, 약 8.5% 초과, 약 8.6% 초과, 약 8.7% 초과, 약 8.8% 초과, 약 8.9% 초과, 약 8.9% 초과, 약 9.0% 초과, 약 9.1% 초과, 약 9.2% 초과, 약 9.3% 초과, 약 9.4% 초과, 약 9.5% 초과, 약 9.6% 초과, 약 9.7% 초과, 약 9.8% 초과, 약 9.9% 초과, 약 10.0% 초과, 약 10.1% 초과, 약 10.2% 초과, 약 10.3% 초과, 약 10.4% 초과, 약 10.5% 초과, 약 10.6% 초과, 약 10.7% 초과, 약 10.8% 초과, 약 10.9% 초과, 또는 약 11% 초과)인, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 7.0% 내지 약 13%, 약 8.0% 내지 약 12.0%, 또는 약 9.0% 내지 약 11.0%인, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
III. N- 결합된 바이시알릴화 및 N- 결합된 바이시알릴화 푸코스 -함유 올리고당류
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 대략 동일하거나 증가될 수 있다. 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 바이시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 5)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 감소될 수 있다. 증가된 수준의 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류는 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 (예를 들어, 대상체에서의 혈청에서 또는 제약 조성물에서) 상기 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다.
파브라자임®은 약 11.0% 내지 약 14.2%의, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)는 약 13.0% 초과 (예를 들어, 약 13.1% 초과, 약 13.2% 초과, 약 13.3% 초과, 약 13.4% 초과, 약 13.5% 초과, 약 13.6% 초과, 약 13.7% 초과, 약 13.8% 초과, 약 13.9% 초과, 약 14.0% 초과, 약 14.1% 초과, 약 14.2% 초과, 약 14.3% 초과, 약 14.4% 초과, 약 14.5% 초과, 약 14.6% 초과, 약 14.7% 초과, 약 14.8% 초과, 약 14.9% 초과, 또는 15.0% 초과)인, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 13.0% 내지 약 15.0%, 약 13.5% 내지 약 15.5%, 약 14.0% 내지 약 16.0%, 또는 약 14.5% 내지 약 16.5%의, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
파브라자임®은 약 5.6% 내지 약 7.1%인, 바이시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 5)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 0.1% 내지 약 5.3% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 5.2%, 약 0.1% 내지 약 5.1%, 약 0.1% 내지 약 5.0%, 약 0.1% 내지 약 4.9%, 약 0.1% 내지 약 4.8%, 약 0.1% 내지 약 4.7%, 약 0.1% 내지 약 4.6%, 약 0.1% 내지 약 4.5%, 약 0.1% 내지 약 4.4%, 약 0.1% 내지 약 4.3%, 약 0.1% 내지 약 4.2%, 약 0.1% 내지 약 4.1%, 약 0.1% 내지 약 4.0%, 약 0.1% 내지 약 3.9%, 약 0.1% 내지 약 3.8%, 약 0.1% 내지 약 3.7%, 약 0.1% 내지 약 3.6%, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3.4%, 약 0.1% 내지 약 3.3%, 약 0.1% 내지 약 3.2%, 약 0.1% 내지 약 3.1%, 약 0.1% 내지 약 3.0%, 약 0.1% 내지 약 2.9%, 약 0.1% 내지 약 2.8%, 약 0.1% 내지 약 2.7%, 약 0.1% 내지 약 2.6%, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 약 0.3% 내지 약 5.2%, 약 0.3% 내지 약 5.1%, 약 0.3% 내지 약 5.0%, 약 0.3% 내지 약 4.9%, 약 0.3% 내지 약 4.8%, 약 0.3% 내지 약 4.7%, 약 0.3% 내지 약 4.6%, 약 0.3% 내지 약 4.5%, 약 0.3% 내지 약 4.4%, 약 0.3% 내지 약 4.3%, 약 0.3% 내지 약 4.2%, 약 0.3% 내지 약 4.1%, 약 0.3% 내지 약 4.0%, 약 0.3% 내지 약 3.9%, 약 0.3% 내지 약 3.8%, 약 0.3% 내지 약 3.7%, 약 0.3% 내지 약 3.6%, 약 0.3% 내지 약 3.5%, 약 0.3% 내지 약 3.5%, 약 0.3% 내지 약 3.4%, 약 0.3% 내지 약 3.3%, 약 0.3% 내지 약 3.2%, 약 0.3% 내지 약 3.1%, 약 0.3% 내지 약 3.0%, 약 0.3% 내지 약 2.9%, 약 0.3% 내지 약 2.8%, 약 0.3% 내지 약 2.7%, 약 0.3% 내지 약 2.6%, 또는 약 0.3% 내지 약 2.5%)의, 바이시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 5)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
바이시알릴화 및 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 것이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
IV. N-결합된 트리시알릴화 올리고당류
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 제2형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (즉, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 증가될 수 있다. 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 제1형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 감소될 수 있다. 도 10의 삽도는 2개의 3-안테나형, 트리시알릴화올리고당 구조를 나타내며, 여기서, 2-AA로 유도체화된 N-결합 올리고당류의 크로마토그래피 용출 프로파일에서 상기 2개의 구조 중 하나는 피크 6에 상응하며 (제1형), 상기 2개의 구조 중 다른 하나는 피크 6' (제2형)에 상응한다. 증가된 수준의 트리시알릴화 푸코스-함유 올리고당류는 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 (예를 들어, 대상체에서의 혈청에서 또는 제약 조성물에서) 상기 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다.
파브라자임®은 약 0.5% 내지 약 1.2%의, 제2형의 3-안테나형 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 2.0% 초과 (예를 들어, 2.1% 초과, 2.2% 초과, 2.3% 초과, 2.4% 초과, 2.5% 초과, 2.6% 초과, 2.7% 초과, 2.8% 초과, 2.9% 초과, 3.0% 초과, 3.1% 초과, 3.2% 초과, 3.3% 초과, 3.4% 초과, 3.5% 초과, 3.6% 초과, 3.7% 초과, 3.8% 초과, 3.9% 초과, 4.0% 초과, 4.1% 초과, 4.2% 초과, 4.3% 초과, 4.4% 초과, 4.5% 초과, 4.6% 초과, 4.7% 초과, 4.8% 초과, 4.9% 초과, 5.0% 초과, 5.1% 초과, 5.2% 초과, 5.3% 초과, 5.4% 초과, 5.5% 초과, 5.6% 초과, 5.7% 초과, 5.8% 초과, 5.9% 초과, 6.0% 초과, 6.1% 초과, 6.2% 초과, 6.3% 초과, 6.4% 초과, 6.5% 초과, 6.7% 초과, 6.8% 초과, 6.9% 초과, 7.0% 초과, 또는 7.1% 초과)인, 제2형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 5.0% 내지 약 9.0%, 약 5.5% 내지 약 8.5%, 약 6.0% 내지 약 8.0%, 또는 약 6.5% 내지 약 7.5%인 제2형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
파브라자임®은 약 9.5% 내지 약 13%의, 제1형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 0.1% 내지 약 9.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 8.9%, 약 0.1% 내지 약 8.8%, 약 0.1% 내지 약 8.7%, 약 0.1% 내지 약 8.6%, 약 0.1% 내지 약 8.5%, 약 0.1% 내지 약 8.4%, 약 0.1% 내지 약 8.3%, 약 0.1% 내지 약 8.2%, 약 0.1% 내지 약 8.1%, 약 0.1% 내지 약 8.0%, 약 0.1% 내지 약 7.9%, 약 0.1% 내지 약 7.8%, 약 0.1% 내지 약 7.7%, 약 0.1% 내지 약 7.6%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.4%, 약 0.1% 내지 약 7.3%, 약 0.1% 내지 약 7.2%, 약 0.1% 내지 약 7.1%, 약 0.1% 내지 약 7.0%, 약 0.1% 내지 약 6.9%, 약 0.1% 내지 약 6.8%, 약 0.1% 내지 약 6.7%, 약 0.1% 내지 약 6.6%, 약 0.1% 내지 약 6.5%, 약 0.1% 내지 약 6.4%, 약 0.1% 내지 약 6.3%, 약 0.1% 내지 약 6.2%, 약 0.1% 내지 약 6.1%, 약 0.1% 내지 약 6.0%, 약 0.1% 내지 약 5.9%, 약 0.1% 내지 약 5.8%, 약 0.1% 내지 약 5.7%, 약 0.1% 내지 약 5.6%, 약 0.1% 내지 약 5.5%, 약 0.1% 내지 약 5.4%, 약 0.1% 내지 약 5.3%, 약 0.1% 내지 약 5.2%, 약 0.1% 내지 약 5.1%, 약 0.1% 내지 약 5.0%, 약 0.1% 내지 약 4.9%, 약 0.1% 내지 약 4.8%, 약 0.1% 내지 약 4.7%, 약 0.1% 내지 약 4.6%, 약 0.1% 내지 약 4.5%, 약 0.1% 내지 약 4.4%, 약 0.1% 내지 약 4.3%, 약 0.1% 내지 약 4.2%, 약 0.1% 내지 약 4.1%, 약 0.1% 내지 약 4.0%, 약 0.1% 내지 약 3.9%, 약 0.1% 내지 약 3.8%, 약 0.1% 내지 약 3.7%, 약 0.1% 내지 약 3.6%, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3.4%, 약 0.1% 내지 약 3.3%, 약 0.1% 내지 약 3.2%, 약 0.1% 내지 약 3.1%, 또는 약 0.1% 내지 약 3.0%)인, 제1형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
트리시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
V. 시알산/단백질의 몰/몰 비
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 대략 파브라자임®과 동일하거나 파브라자임®보다 더 큰 시알산 대 단백질의 몰 대 몰 비를 가질 수 있다. 올리고당류에 존재하는 증가된 수의 시알산 분자는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 (예를 들어, 제약 조성물에서 그리고 포유류의 혈청에서) 상기 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다.
파브라자임®은 약 2.6 내지 약 3.3의 시알산 대 단백질의 몰 대 몰 비를 갖는다. 또한, 파브라자임®은 1.5 초과인 시알산 대 만노스-6-포스페이트의 몰 대 몰 비를 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 3.0 초과 (예를 들어, 3.1 초과, 3.2 초과, 3.3 초과, 3.4 초과, 3.5 초과, 3.6 초과, 3.7 초과, 3.8 초과, 3.9 초과, 4.0 초과, 4.1 초과, 4.2 초과, 4.3 초과, 4.4 초과, 4.5 초과, 4.6 초과, 4.7 초과, 4.8 초과, 4.9 초과, 또는 5.0 초과)인 시알산 대 단백질의 몰/몰 비를 가질 수 있다.
시알산 대 단백질의 몰/몰 비를 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
VI. N-결합된 중성으로 하전된 올리고당류
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 감소된 백분율의, 중성으로 하전된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류를 가질 수 있다.
파브라자임®은 약 4.0% 내지 약 7.1%인, N-결합된 중성으로 하전된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 0.1% 내지 약 3.9% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 3.8%, 약 0.1% 내지 약 3.7%, 약 0.1% 내지 약 3.6%, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3.4%, 약 0.1% 내지 약 3.3%, 약 0.1% 내지 약 3.2%, 약 0.1% 내지 약 3.1%, 약 0.1% 내지 약 3.0%, 약 0.1% 내지 약 2.9%, 약 0.1% 내지 약 2.8%, 약 0.1% 내지 약 2.7%, 약 0.1% 내지 약 2.6%, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 약 0.1% 내지 약 2.4%, 약 0.1% 내지 약 2.3%, 약 0.1% 내지 약 2.2%, 약 0.1% 내지 약 2.1%, 약 0.1% 내지 약 2.0%, 약 0.1% 내지 약 1.9%, 약 0.1% 내지 약 1.8%, 약 0.1% 내지 약 1.7%, 약 0.1% 내지 약 1.6%, 약 0.1% 내지 약 1.5%, 약 0.1% 내지 약 1.4%, 약 0.1% 내지 약 1.3%, 약 0.1% 내지 약 1.2%, 약 0.1% 내지 약 1.1%, 약 0.1% 내지 1.0%, 약 0.3% 내지 약 3.9%, 약 0.3% 내지 약 3.8%, 약 0.3% 내지 약 3.7%, 약 0.3% 내지 약 3.6%, 약 0.3% 내지 약 3.5%, 약 0.3% 내지 약 3.4%, 약 0.3% 내지 약 3.3%, 약 0.3% 내지 약 3.2%, 약 0.3% 내지 약 3.1%, 약 0.3% 내지 약 3.0%, 약 0.3% 내지 약 2.9%, 약 0.3% 내지 약 2.8%, 약 0.3% 내지 약 2.7%, 약 0.3% 내지 약 2.6%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.3% 내지 약 2.4%, 약 0.3% 내지 약 2.3%, 약 0.3% 내지 약 2.2%, 약 0.3% 내지 약 2.1%, 약 0.3% 내지 약 2.0%, 약 0.3% 내지 약 1.9%, 약 0.3% 내지 약 1.8%, 약 0.3% 내지 약 1.7%, 약 0.3% 내지 약 1.6%, 약 0.3% 내지 약 1.5%, 약 0.3% 내지 약 1.4%, 약 0.3% 내지 약 1.3%, 약 0.3% 내지 약 1.2%, 약 0.3% 내지 약 1.1%, 또는 약 0.3% 내지 약 1.0%)인, 중성으로 하전된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
중성으로 하전된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
VII. N-결합된 만노스-6-포스페이트 올리고당류
제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 대략 동일하거나 약간 감소할 수 있다.
파브라자임®은 약 5.5% 내지 약 10.0%의, N-결합된 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 0.1% 내지 약 7.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 6.9%, 약 0.1% 내지 약 6.8%, 약 0.1% 내지 약 6.7%, 약 0.1% 내지 약 6.6%, 약 0.1% 내지 약 6.5%, 약 0.1% 내지 약 6.4%, 약 0.1% 내지 약 6.3%, 약 0.1% 내지 약 6.2%, 약 0.1% 내지 약 6.1%, 약 0.1% 내지 약 6.0%, 약 0.1% 내지 약 5.9%, 약 0.1% 내지 약 5.8%, 약 0.1% 내지 약 5.7%, 약 0.1% 내지 약 5.6%, 약 0.1% 내지 약 5.5%, 약 0.1% 내지 약 5.4%, 약 0.1% 내지 약 5.3%, 약 0.1% 내지 약 5.2%, 약 0.1% 내지 약 5.1%, 또는 약 0.1% 내지 약 5.0%)인, 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 5.0% 내지 약 7.0%인, 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
VIII. N-결합된 모노포스포릴화 올리고당류
제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 모노포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 증가될 수 있다.
파브라자임®은 약 10.9% 내지 약 14.7%의, N-결합된 모노포스포릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 14.8% 초과 (예를 들어, 약 14.9% 초과, 15.0% 초과, 약 15.1% 초과, 약 15.2% 초과, 약 15.3% 초과, 약 15.4% 초과, 약 15.5% 초과, 약 15.6% 초과, 약 15.7% 초과, 약 15.8% 초과, 약 15.9% 초과, 약 16.0% 초과, 약 16.1% 초과, 약 16.2% 초과, 약 16.3% 초과, 약 16.4% 초과, 약 16.5% 초과, 약 16.6% 초과, 약 16.7% 초과, 약 16.8% 초과, 약 16.9% 초과, 약 17.0% 초과, 약 17.1% 초과, 약 17.2% 초과, 약 17.3% 초과, 약 17.4% 초과, 약 17.5% 초과, 약 17.6% 초과, 약 17.7% 초과, 약 17.8% 초과, 약 17.9% 초과, 약 18.0% 초과, 약 18.1% 초과, 약 18.2% 초과, 약 18.3% 초과, 약 18.4% 초과, 약 18.5% 초과, 약 18.6% 초과, 약 18.7% 초과, 약 18.8% 초과, 약 18.9% 초과, 약 19.0% 초과, 약 19.1% 초과, 약 19.2% 초과, 약 19.3% 초과, 약 19.4% 초과, 약 19.5% 초과, 약 19.6% 초과, 약 19.7% 초과, 약 19.8% 초과, 약 19.9% 초과, 약 20.0% 초과, 약 20.1% 초과, 약 20.2% 초과, 약 20.3% 초과, 약 20.4% 초과, 약 20.5% 초과, 약 20.6% 초과, 약 20.7% 초과, 약 20.8% 초과, 약 20.9% 초과, 약 21.0% 초과, 약 21.1% 초과, 약 21.2% 초과, 약 21.3% 초과, 약 21.4% 초과, 약 21.5% 초과, 약 21.6% 초과, 약 21.7% 초과, 약 21.8% 초과, 약 21.9% 초과, 약 22.0% 초과, 약 22.1% 초과, 약 22.2% 초과, 약 22.3% 초과, 약 22.4% 초과, 약 22.5% 초과, 약 22.6% 초과, 약 22.7% 초과, 약 22.8% 초과, 약 22.9% 초과, 또는 약 23.0% 초과)인, 모노포스포릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 8)인 전체 N-올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 15.5% 내지 약 17.5%, 약 16.0% 내지 약 18.0%, 또는 약 16.5% 내지 약 18.5%인, 모노포스포릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
모노포스포릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
IX. N-결합된 테트라시알릴화 올리고당류
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 증가될 수 있다. 증가된 수준의 테트라시알릴화 올리고당류는 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 (예를 들어, 대상체에서의 혈청에서 또는 제약 조성물에서) 상기 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다.
파브라자임®은 약 2.3% 내지 약 4.8%의, 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 4.9% 초과 (예를 들어, 약 5.0% 초과, 약 5.1% 초과, 약 5.2% 초과, 약 5.3% 초과, 약 5.4% 초과, 약 5.5% 초과, 약 5.6% 초과, 약 5.7% 초과, 약 5.8% 초과, 약 5.9% 초과, 약 6.0% 초과, 약 6.1% 초과, 약 6.2% 초과, 약 6.3% 초과, 약 6.4% 초과, 약 6.5% 초과, 약 6.6% 초과, 약 6.7% 초과, 약 6.8% 초과, 약 6.9% 초과, 약 7.0% 초과, 약 7.1% 초과, 약 7.2% 초과, 약 7.3% 초과, 약 7.4% 초과, 약 7.5% 초과, 약 7.6% 초과, 약 7.7% 초과, 약 7.8% 초과, 약 7.9% 초과, 또는 약 8.0% 초과)인, 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 6.0% 내지 약 8.0%, 약 6.5% 내지 약 8.5%, 약 6.0% 내지 약 9.0%, 또는 약 7.0% 내지 약 9.0%인, 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
수행하는 그리고 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
X. 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 N- 결합된 하이브리드 구조
제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 비교하여 모노시알릴화, 모노포스포릴화, 하이브리드 구조인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 증가될 수 있다.
파브라자임®은 약 6.0% 내지 약 8.1%의, 모노시알릴화, 모노포스포릴화, 하이브리드 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 10)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 8.2% 초과 (예를 들어, 약 8.3% 초과, 약 8.4% 초과, 약 8.5% 초과, 약 8.6% 초과, 약 8.7% 초과, 약 8.8% 초과, 약 8.9% 초과, 약 9.0% 초과, 약 9.1% 초과, 약 9.2% 초과, 약 9.3% 초과, 약 9.4% 초과, 약 9.5% 초과, 약 9.6% 초과, 약 9.7% 초과, 약 9.8% 초과, 약 9.9% 초과, 약 10.0% 초과, 약 10.1% 초과, 약 10.2% 초과, 약 10.3% 초과, 약 10.4% 초과, 약 10.5% 초과, 약 10.6% 초과, 약 10.7% 초과, 약 10.8% 초과, 약 10.9% 초과, 약 11.0% 초과, 약 11.1% 초과, 약 11.2% 초과, 약 11.3% 초과, 약 11.4% 초과, 또는 약 11.5% 초과)인, 모노시알릴화, 모노포스포릴화 하이브리드 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 10)인 전체 N-결합 하이브리드 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 8.5% 내지 10.5%, 약 9.0% 내지 약 11.0%, 또는 약 8.5% 내지 약 9.5%인, 모노시알릴화, 모노포스포릴화 하이브리드 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 10)인 전체 N-결합 하이브리드 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 10)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
XI. 등전점
또한, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 영상화 모세관 등전 집중(icIEF)에 의해 분석할 때 파브라자임®과 비교하여 이동된 등전점을 갖는다 (실시예 3 및 표 3 참조).
폴리펩티드의 등전점을 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 폴리펩티드의 등전점을 결정하는 추가의 방법 (예를 들어, 등전 집중 겔)이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
XII. 만노스 -6- 포스페이트 /단백질의 몰/몰 비
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®과 대략 동일하거나 더 큰 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰 대 몰 비를 가질 수 있다. 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 증가된 몰 대 몰 비는 원형질 막에서 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 세포에 의한 상기 단백질의 세포 업데이트(update)를 증가시키는 것으로 생각된다.
파브라자임®은 약 1.7 내지 약 3.1의 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰 대 몰 비를 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 실질적으로 파브라자임®과 동일하거나 1.7 초과 (예를 들어, 1.8 초과, 1.9 초과, 2.0 초과, 2.1 초과, 2.2 초과, 2.3 초과, 2.4 초과, 2.5 초과, 2.6 초과, 2.7 초과, 2.8 초과, 2.9 초과, 3.0 초과, 3.1 초과, 3.2 초과, 3.3 초과, 3.4 초과, 또는 3.5 초과)인 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰/몰 비를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 약 1.8 내지 약 3.5 (예를 들어, 약 1.8 내지 약 3.4, 약 1.8 내지 약 3.3, 약 1.8 내지 약 3.2, 약 1.8 내지 약 3.1, 약 1.8 내지 약 3.0, 약 1.8 내지 약 2.9, 약 1.8 내지 약 2.8, 약 1.8 내지 약 2.7, 약 1.8 내지 약 2.6, 약 1.8 내지 약 2.5, 1.8 내지 약 2.4, 약 1.8 내지 약 2.3, 약 1.8 내지 약 2.2, 약 1.8 내지 약 2.1, 약 1.8 내지 약 2.0, 약 1.9 내지 약 3.5, 약 1.9 내지 약 3.4, 약 1.9 내지 약 3.3, 약 1.9 내지 약 3.2, 약 1.9 내지 약 3.1, 약 1.9 내지 약 3.0, 약 1.9 내지 약 2.9, 약 1.9 내지 약 2.8, 약 1.9 내지 약 2.7, 약 1.9 내지 약 2.6, 약 1.9 내지 약 2.5, 약 1.9 내지 약 2.5, 약 1.9 내지 약 2.4, 약 1.9 내지 약 2.3, 약 1.9 내지 약 2.2, 약 1.9 내지 약 2.1, 약 2.0 내지 약 3.5, 약 2.0 내지 약 3.4, 약 2.0 내지 약 3.3, 약 2.0 내지 약 3.2, 약 2.0 내지 약 3.1, 약 2.0 내지 약 3.0, 약 2.0 내지 약 2.9, 약 2.0 내지 약 2.8, 약 2.0 내지 약 2.7, 약 2.0 내지 약 2.6, 약 2.0 내지 약 2.5, 약 2.0 내지 약 2.4, 약 2.0 내지 약 2.3, 약 2.0 내지 약 2.2, 약 2.1 내지 약 3.5, 약 2.1 내지 약 3.4, 약 2.1 내지 약 3.3, 약 2.1 내지 약 3.2, 약 2.1 내지 약 3.1, 약 2.1 내지 약 3.0, 약 2.1 내지 약 2.9, 약 2.1 내지 약 2.8, 약 2.1 내지 약 2.7, 약 2.1 내지 약 2.6, 약 2.1 내지 약 2.5, 약 2.1 내지 약 2.4, 약 2.1 내지 약 2.3, 약 2.2 내지 약 3.5, 약 2.2 내지 약 3.4, 약 2.2 내지 약 3.3, 약 2.2 내지 약 3.2, 약 2.2 내지 약 3.1, 약 2.2 내지 약 3.0, 약 2.2 내지 약 2.9, 약 2.2 내지 약 2.8, 약 2.2 내지 약 2.7, 약 2.2 내지 약 2.6, 약 2.2 내지 약 2.5, 약 2.2 내지 약 2.4, 약 2.3 내지 약 3.5, 약 2.3 내지 약 3.4, 약 2.3 내지 약 3.3, 약 2.3 내지 약 3.2, 약 2.3 내지 약 3.1, 약 2.3 내지 약 3.0, 약 2.3 내지 약 2.9, 약 2.3 내지 약 2.8, 약 2.3 내지 약 2.7, 약 2.3 내지 약 2.6, 약 2.3 내지 약 2.5, 약 2.4 내지 약 3.5, 약 2.4 내지 약 2.9, 약 2.4 내지 약 2.8, 약 2.4 내지 약 2.7, 약 2.4 내지 약 2.6, 약 2.5 내지 약 3.5, 약 2.5 내지 약 3.4, 약 2.5 내지 약 3.3, 약 2.5 내지 약 3.2, 약 2.5 내지 약 3.1, 약 2.5 내지 약 3.0, 약 2.5 내지 약 2.9, 약 2.5 내지 약 2.8, 약 2.5 내지 약 2.7, 약 2.6 내지 약 3.5, 약 2.6 내지 약 3.4, 약 2.6 내지 약 3.3, 약 2.6 내지 약 3.2, 약 2.6 내지 약 3.1, 약 2.6 내지 약 3.0, 약 2.6 내지 약 2.9, 약 2.6 내지 약 2.8, 약 2.7 내지 약 3.5, 약 2.7 내지 약 3.4, 약 2.7 내지 약 3.3, 약 2.7 내지 약 3.2, 약 2.7 내지 약 3.1, 약 2.7 내지 약 3.0, 약 2.7 내지 약 2.9, 약 2.8 내지 약 3.5, 약 2.8 내지 약 3.4, 약 2.8 내지 약 3.3, 약 2.8 내지 약 3.2, 약 2.8 내지 약 3.1, 약 2.8 내지 약 3.0, 약 2.9 내지 약 3.5, 약 2.9 내지 약 3.4, 약 2.9 내지 약 3.3, 약 2.9 내지 약 3.2, 약 2.9 내지 약 3.1, 약 3.0 내지 약 3.5, 약 3.0 내지 약 3.4, 약 3.0 내지 약 3.3, 약 3.0 내지 약 3.2, 약 3.1 내지 약 3.5, 약 3.1 내지 약 3.4, 약 3.1 내지 약 3.3, 약 3.2 내지 약 3.5, 약 3.4 내지 약 3.4, 또는 약 3.3 내지 약 3.5)인 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰/몰 비를 가질 수 있다.
만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰/몰 비를 결정하는 예시적인 방법이 실시예에 기술되어 있다. 추가의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
기능적 특성
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 하기의 기능적 특징 중 1가지 이상 (예를 들어, 1가지, 2가지 또는 3가지)을 가질 수 있다: 각각 파브라자임®과 비교하여, 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 포유류 세포에 의한 엔도사이토시스의 증가 (예를 들어, 엔도사이토시스의 속도의 증가), 비시알산당단백질 수용체에 대한 결합성의 감소, 및 만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 친화성의 증가.
만노스-6-포스페이트를 발현하는 포유류 세포에서의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 엔도사이토시스 (예를 들어, 엔도사이토시스의 속도)를 결정하는 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Osborne et al., Curr. Protoc . Cell Biol ., Chapter 11, Unit 11.18, 2005]). 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 포유류 세포의 비제한적 예는 섬유아세포 및 상피 세포를 포함한다. 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 엔도사이토시스는 조직 배양 배지 (또는 포유류의 혈청) 중 상기 단백질의 수준의 감소, 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 리소좀중 또는 세포내 수준의 증가에 의해, 또는 간접적으로, 예를 들어, 접촉된 포유류 세포에서 또는 조직 배양 배지 (또는 포유류의 혈청)에서 글로보트리아오스실세라마이드(GL-3)와 같은 말단 α-갈락토실 잔기를 갖는 글리코스핑고지질의 축적의 감소로서 탐지될 수 있다. 조직 배양 배지 (또는 포유류의 혈청) 중 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준의 감소는 예를 들어 항체-기반 분석법 (예를 들어, 효소-결합된 면역흡착 분석법) 또는 활성 분석법 (예를 들어, 기질로서 pNP 또는 4MU를 사용한 활성 분석법)을 사용하여 결정될 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질에 결합하는 항체의 예는 밀리포어(Millipore), 라이프스팬 바이오사이언시즈, 인크.(LifeSpan BioSciences, Inc.), 서모 사이언티픽 피어스 안티바디즈(Thermo Scientific Pierce Antibodies), 아크리스 안티바디즈 게엠베하(Acris Antibodies GmbH), 및 알앤디 시스템즈(R & D Systems)로부터 입수가능하다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 리소좀중 또는 세포내 수준을 결정하는 방법은 세포 또는 리소좀 용해물의 면역형광 현미경 검사법, 세포 투과 및 면역블로팅(immunoblotting), 및/또는 질량 분광법의 사용을 포함할 수 있다. 글로보트리아오스실세라마이드(GL-3)의 축적의 감소는 예를 들어 질량 분광법 (예를 들어, 문헌[Kim et al., Korean J. Intern. Med . 25:415-421, 2010]) 또는 항체-기반 분석법 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2012/0178105호)을 이용하여 시간이 지남에 따른 조직 배양 배지 중의 또는 포유류의 혈청 중의 GL-3의 수준을 탐지함으로써 결정될 수 있다. 각각의 경우에, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 엔도사이토시스는 파브라자임®과 비교될 수 있다.
비시알산당단백질 수용체에 결합하는 단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)의 능력을 결정하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 비시알산당단백질 수용체에 대한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 결합성을 결정하는 분석법은 비시알산당단백질을 발현하는 세포 (예를 들어, 간세포)를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한 비시알산당단백질 수용체에 대한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 결합성은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어 테크놀로지(Biacore technology)) (예를 들어, 문헌[Stokmaier et al., Bioorg . Med . Chem . 17:7254-7264, 2009] 참조) 또는 문헌[Kornilova et al., Anal. Biochem . 425:43-46, 2012]에 기술된 형광 분극 비시알산당단백질 수용체 결합 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 임의의 경우에, 비시알산당단백질 수용체에 대한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 결합성은 파브라자임®과 비교될 수 있다.
만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질의 결합성을 결정하는 방법은 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질을 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 세포 (예를 들어, 섬유아세포 또는 내피 세포)에 접촉시키는 단계를 포함하는 분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 다른 실시예에서, 만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질의 결합성은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어 테크놀로지) 또는 친화성 크로마토그래피법을 이용하여 결정될 수 있다. 만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 결합성은 파브라자임®과 비교될 수 있다.
예시적인 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 0.1% 내지 약 1.6% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 1.3% 또는 약 0.1% 내지 약 1.0%)의, 모노시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 3)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율과, 약 7.5% 초과 (예를 들어, 약 8.5% 초과, 약 9.0% 초과, 또는 약 9.5% 초과)의, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다. 추가로 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 약 13.0% 초과 (예를 들어, 약 13.5% 초과, 약 14.0% 초과, 약 14.5% 초과, 약 15.0% 초과, 약 15.5% 초과, 또는 약 16.0% 초과)의, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율과, 약 2.0% 초과 (예를 들어, 약 2.5% 초과, 약 3.0% 초과, 약 3.5% 초과, 약 4.0% 초과, 약 4.5% 초과, 약 5.0% 초과, 약 5.5% 초과, 약 6.0% 초과, 약 6.5% 초과, 또는 약 7.0% 초과)의, 제2형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
추가로 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 하기의 물리적 특성 중 1가지 이상 (예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지 또는 9가지)을 가질 수 있다: 약 0.1% 내지 약 3.9% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3.0%, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 2.0%)의, 중성으로 하전된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 3.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 2.0%)의, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 2)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 5.3% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 5.0%, 약 0.1% 내지 약 4.5%, 약 0.1% 내지 약 4.0%, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3.0%, 또는 약 0.1% 내지 약 2.5%)의, 바이시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 5)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 9.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 8.5%, 약 0.1% 내지 약 8.0%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.0%, 약 0.1% 내지 약 6.5%, 약 0.1% 내지 약 6.0%, 약 0.1% 내지 약 5.5%, 약 0.1% 내지 약 5.0%, 약 0.1% 내지 약 4.5%, 약 0.1% 내지 약 4.0%, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3.0%, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 2.0%)인, 제1형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 0.1% 내지 약 7.0% (예를 들어, 약 0.1% 내지 약 6.5%, 약 0.1% 내지 약 6.0%, 약 0.1% 내지 약 5.5%, 약 0.1% 내지 약 5.0%, 약 0.1% 내지 약 4.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 4.0%)인, 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 14.8% 초과 (예를 들어, 약 15.0% 초과, 약 15.5% 초과, 약 16.0% 초과, 약 16.5% 초과, 약 17.0% 초과, 약 17.5% 초과, 약 18.0% 초과, 약 18.5% 초과, 약 19.0% 초과, 약 19.5% 초과, 약 20.0% 초과, 약 20.5% 초과, 약 21.0% 초과, 약 21.5% 초과, 약 22.0% 초과, 약 22.5% 초과, 또는 약 23.0% 초과)의, 모노포스포릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 약 4.9% 초과 (예를 들어, 약 5.0% 초과, 약 5.5% 초과, 약 6.0% 초과, 약 6.5% 초과, 약 7.0% 초과, 약 7.5% 초과, 또는 약 8.0% 초과)인, 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 약 8.2% 초과 (예를 들어, 약 8.5% 초과, 약 9.0% 초과, 약 9.5% 초과, 또는 약 10.0% 초과)인, 모노시알릴화, 모노포스포릴화 하이브리드 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 10)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율.
또한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 하기의 기능적 특징 중 1가지 이상을 가질 수 있다: 파브라자임®과 비교하여, 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 포유류 세포에 의한 엔도사이토시스의 증가 (예를 들어, 엔도사이토시스의 속도의 증가), 비시알산당단백질 수용체에 대한 결합성의 감소, 및 만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 친화성의 증가.
다른 실시예에서, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 파브라자임®보다 더 작은, 모노시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 3)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율과, 파브라자임®보다 더 큰, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는다. 또한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 대략 파브라자임®과 동일하거나 파브라자임®보다 더 큰, 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 4)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율과, 파브라자임®보다 더 큰, 제2형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6')인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 가질 수 있다.
또한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 하기의 구조적 특징 중 1가지 이상을 가질 수 있다: 파브라자임®보다 더 작은, 중성으로 하전된 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 대략 파브라자임®과 동일하거나 파브라자임®보다 더 작은, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 2)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 작은, 바이시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 5)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 작은, 제1형의 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 6)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 대략 파브라자임®과 동일하거나 파브라자임®보다 더 작은, 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 큰, 모노포스포릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 큰, 테트라시알릴화 올리고당류 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 파브라자임®보다 더 큰, 모노시알릴화, 모노포스포릴화 하이브리드 구조 (예를 들어, 안트라닐산 표지된 N-결합된 올리고당 프로파일링에서 피크 10)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율. 또한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 하기의 기능적 특징 중 1가지 이상을 가질 수 있다: 각각 파브라자임®과 비교하여, 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 포유류 세포에 의한 엔도사이토시스의 증가 (예를 들어, 엔도사이토시스의 속도의 증가), 비시알산당단백질 수용체에 대한 결합성의 감소, 및 만노스-6-포스페이트 수용체에 대한 친화성의 증가.
발현 벡터
또한 본원에서 제공되는 것은 본 발명의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)을 함유하는 발현 벡터이다. 예를 들어, 발현 벡터는 서열 번호 1의 서열과 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)을 포함할 수 있다. 그 서열에 더하여, 발현 벡터는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 (및 임의로 하나 이상의 인핸서 서열)를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 재조합 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 TTG 개시 코돈을 갖는 인간 CD52 단백질의 펩티드를 코딩하는 서열과, 재조합 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 포유류 선발 마커 (예를 들어, 인간 또는 개 신테타아제 단백질)를 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)과, 포유류 선발 마커를 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열과, 임의로, SV40 초기 인트론 서열 및 폴리(A) 시그널 서열 (이들 둘 모두는 포유류 선발 유전자를 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 3' 말단에 작동가능하게 연결됨)을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 하기 중 1가지 이상 (예를 들어, 2가지 또는 3가지)을 포함할 수 있다: 원핵생물 선발 유전자 (예를 들어, 암피실린 내성 유전자)를 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 원핵생물 프로모터 서열; 원핵생물 복제 기점 서열, 및 진핵생물 복제 기점 서열.
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)에 작동가능하게 연결될 수 있는 프로모터 서열 (및 임의로, 하나 이상의 인핸서 서열(들))의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40) 초기 프로모터, 리보좀 단백질 21(rpS21) 프로모터, 햄스터 β-액틴 프로모터, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 프로모터 (예를 들어, CMV 전초기(immediate early) 프로모터 (예를 들어, 문헌[Teschendorf et al., Anticancer Res. 22:3325-3330, 2002] 참조), 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 신장 인자 1-α(EF1A) 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK) 프로모터, 마우스 CMV 유래의 IE2 프로모터/인핸서 영역 (예를 들어, 문헌[Chatellard et al., Biotechnol . Bioeng . 96:106-117, 2007] 참조), 및 닭 β-액틴 프로모터. 본원에 기술된 임의의 발현 벡터에서 사용될 수 있는 인간 유전자 프로모터의 추가의 비제한적 예는 포유류 프로모터 데이터베이스 (위스타 인스티튜트(Wistar Institute) 웹사이트, mrpombdb.wister.upenn.edu)에 설명되어 있다. 발현 벡터에서 사용될 수 있는 포유류 프로모터 서열의 추가의 예가 본 기술 분야에 공지되어 있다. 발현 플라스미드에서 사용될 수 있는 프로모터 및 인핸서의 1가지 비제한적 예로는 CMV 인핸서를 포함하는 닭 β-액틴 프로모터 (본 기술 분야에서 CAGG 프로모터로서 공지됨)가 있다. 본원에 제공된 발현 벡터는 rpS21 프로모터, 햄스터 β-액틴 프로모터, 또는 인간 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 SV40 초기 프로모터 서열, 인간 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질 (예를 들어, 본원에 기술된 인간 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 핵산 중 임의의 것)을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA)의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 TTG 개시 코돈을 갖는, 인간 CD52 단백질의 펩티드를 코딩하는 서열, 및 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 폴리(A) 인식 부위를 함유하는 서열을 포함할 수 있다.
폴리(A) 인식 부위 서열의 비제한적 예로는 소 성장 호르몬 폴리(A) 인식 부위가 있다. 인간 폴리(A) 인식 부위의 구조적 특징은 문헌[Nunes et al., EMBO J. 29:1523-1536, 2010]에 기술되어 있다. 추가의 폴리(A) 인식 부위는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시예에서, 발현 벡터는 햄스터 β-액틴 프로모터와, TTG 개시 코돈을 갖는 인간 CD52 단백질의 펩티드를 코딩하는 서열 (이들 둘 모두는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 5' 말단에 작동가능하게 연결됨)과, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 (예를 들어, cDNA)의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 SV40 초기 인트론 및 폴리(A) 인식 서열을 포함한다.
일부 발현 벡터는 포유류 선발 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 포유류 선발 유전자의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자, 하이드로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 글루타민 신테타아제 유전자, 디하이드로폴레이트 내성 유전자 및 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자. 이러한 포유류 선발 유전자를 코딩하는 서열의 예는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 포유류 선발 유전자를 코딩하는 서열의 5' 말단은 프로모터 (예를 들어, 본원에 기술되거나 본 기술 분야에 공지된 임의의 예시적인 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 발현 벡터 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 발현 벡터)는 포유류 복제 기점 서열 및/또는 원핵생물 복제 기점 서열을 포함할 수 있다. 포유류 복제 기점 서열은 본 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Todorovic et al., Front. Biosci .4:D859-D568, 1999]; 문헌[Aladjem, Front. Biosci . 9:2540-2547, 2004]; 문헌[Hamlin, Bioessays 14:651-659, 1992]). 원핵생물 복제 기점 서열도 본 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Marczynski et al., Curr . Opin . Genet. Dev . 3:775-782, 1993]).
벡터의 비제한적 예로는 플라스미드가 있다. 본원에 제공된 플라스미드의 비제한적 예가 도 3 및 도 4에 예시되어 있다. 도 3에는 하기 요소를 코딩하는 플라스미드가 도시되어 있다: 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA), 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 프로모터 (예를 들어, 햄스터 β-액틴 프로모터), 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 TTG 개시 코돈을 갖는 인간 CD52의 펩티드를 코딩하는 서열, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 두 번째의 것의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 폴리(A) 인식 서열 (예를 들어, SV40 초기 폴리(A) 인식 서열), 포유류 선발 유전자 (마커) (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자 또는 인간 또는 개 글루타민 신테타아제 유전자)를 코딩하는 핵산 서열, 및 포유류 선발 유전자 (마커)를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 (예를 들어, SV40 초기 프로모터). 도 4에는 하기를 포함하는 발현 플라스미드가 도시되어 있다: 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 (예를 들어, CMV 프로모터 및 인트론), 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 폴리(A) 인식 서열 (예를 들어, SV40 초기 폴리(A) 인식 서열), 포유류 선발 유전자 (마커) (예를 들어, 글루타민 신테타아제)를 코딩하는 서열, 포유류 선발 유전자 (마커)를 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 (예를 들어, SV40 프로모터), 원핵생물 복제 기점 서열, 원핵생물 선발 유전자 (마커) (예를 들어, 암피실린 내성 유전자)를 코딩하는 서열, 원핵생물 선발 유전자 (마커)의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 원핵생물 프로모터 서열, 및 진핵생물 복제 기점 서열.
발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터의 비제한적 예는 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 또한 플라스미드 또는 코스미드일 수 있다.
숙주 세포
본원에 또한 제공된 것은 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 숙주 세포이다. 이 서열은 프로모터 서열 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 예시적인 프로모터 서열 또는 본 기술 분야에 공지된 임의의 바이러스 또는 포유류 프로모터 서열)에 작동가능하게 연결될 수 있다.예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 및 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터의 서열은 숙주 세포에서 염색체 내에 통합될 수 있다. 다른 실시예에서, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열 및 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열은 숙주 세포 내의 발현 벡터 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 발현 벡터)에 존재한다.
핵산 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 핵산 또는 발현 벡터)을 세포 (예를 들어, 포유류 숙주 세포) 내로 도입하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산은 리포펙션(lipofection), 전기천공, 인산칼슘-매개된 형질감염, 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스) 형질도입, DEAE-덱스트란-매개된 세포 형질감염, 덴드리머(dendrimer)-매개된 형질감염, 소노포레이션(sonoporation), 광학적 형질감염, 임팔레펙션(impalefection), 유체역학적 전달(hydrodynamic delivery), 마그네토펙션(magnetofection) 또는 탄도성 형질감염(ballistic transfection)을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다.
숙주 세포는 임의의 유형의 포유류 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 세포주, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 (예를 들어, CHO DG44 세포, CHO-K1s 세포, C02.31 클론 세포, A14.13 클론 세포, C02.57 클론 세포, 및 F05.43 클론 세포), Sp2.0, 골수종 세포 (예를 들어, NS/0), B-세포, 하이브리도마(hybridoma) 세포, T-세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 (예를 들어, HEK 293E 및 HEK 293F), 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포 (베로(Vero)) 세포, 또는 마딘-다비(Madin-Darby) 개 (코커 스파니엘(Cocker Spaniel)) 신장 상피 세포 (MDCK) 세포일 수 있다. 본원에 기술된 방법을 이용하여 배양될 수 있는 추가의 포유류 세포가 본 기술 분야에 공지되어 있다. 숙주 세포는 예를 들어 상피 세포, 내피 세포, 림프구, 신장 세포, 폐 세포, T-세포, 골수종 세포, 또는 B-세포일 수 있다. 일부 숙주 세포는 현탁 세포 배양에서 또는 유착 세포 배양에서 성장시킬 수 있다.
포유류 세포주의 생성 방법
본원에 또한 제공된 것은 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 표 1에 열거된 임의의 기타 효소, 또는 본 기술 분야에 공지된 임의의 기타 당단백질)의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포주의 생성 방법이다. 도 5는 재조합 당단백질의 발현용으로 최적화된 모 세포주를 생성하는 데 사용될 수 있는 단계를 나타내는 흐름도이다. 이러한 방법은 혈청-의존성 불사화 세포주를 제공하는 단계, 포유류 세포주를 (1) 제1 농도 (1X)의 동물 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 또는 약 5일 내지 약 7일) 동안; (2) 약 0.2X 내지 약 0.4X (예를 들어, 약 0.2X 내지 약 0.3X) 농도의 동물 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 또는 약 5일 내지 약 7일) 동안; 및 (3) 약 0.01X 내지 약 0.25X (예를 들어, 약 0.01X 내지 약 0.20X, 약 0.01X 내지 약 0.15X, 또는 약 0.01X 내지 약 0.08X)의 동물 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 또는 약 5일 내지 약 7일) 동안 순차적으로 배양하는 단계; 순차적 배양 후 배양물로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하는 단계, 허용가능한 형질감염 효율, 무혈청 배양 배지에서의 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 갖는 서브클론을 선발하는 단계; 및 선발된 서브클론을 무단백질, 무혈청, 화학적 규정 배지에서 약 5일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 또는 약 5일 내지 약 7일) 동안 배양하는 단계; 무단백질, 무혈청, 화학적 규정 배지에서 배양 후 배양물로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하는 단계; 및 허용가능한 형질감염 효율, 최고 세포 밀도, 성장 특성, 체적 생산율(VPR), 및 당단백질의 글리코실화 프로파일을 갖는 서브클론을 선발하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서, (f)의 선발된 서브클론은 당단백질의 재조합적 발현에 유용하다.
또한 제공되는 것은 하기 단계를 포함하는, 당단백질 (예를 들어, 본원에 기술되거나 본 기술 분야에 공지된 임의의 재조합 단백질)의 재조합적 발현에 유용한 포유류 세포주의 생성 방법이다: (a) 혈청-의존성 불사화 세포주를 제공하고 포유류 세포주를 (1) 제1 농도 (1X) (예를 들어, 약 5%)의 동물 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청)을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 1일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 2일 내지 약 25일, 약 2일 내지 약 20일, 약 2일 내지 약 15일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 또는 약 2일 내지 약 7일) 동안; (2) 약 0.2X 내지 약 0.6X (예를 들어, 약 0.2X 내지 약 0.5X) 농도의 동물 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청)을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 1일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 2일 내지 약 25일, 약 2일 내지 약 20일, 약 2일 내지 약 15일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 또는 약 2일 내지 약 7일) 동안; 및 (3) 약 0X 내지 약 0.20X (예를 들어, 약 0X 내지 약 0.15X, 약 0X 내지 약 0.10X, 또는 약 0X 내지 약 0.05X)의 동물 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청)을 포함하는 세포 배양 배지에서 약 5일 내지 약 30일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 또는 약 5일 내지 약 7일) 동안 순차적으로 배양하는 단계; (b) 순차적 배양 후 배양물로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하고, 허용가능한 형질감염 효율, 무혈청 배양 배지에서의 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 갖는 서브클론 배양물을 선발하는 단계 (예를 들어, 다른 테스트된 서브클론 배양물과 비교하여 최상의 형질감염 효율, 세포 성장, 및 재조합 단백질 발현을 갖는 서브클론 배양물을 선발하는 단계); (c) (b)에서의 선발된 서브클론 배양물로부터 단일-세포 서브클론 배양물을 생성하는 단계; 및 (d) 허용가능한 형질감염 효율, 최고 세포 밀도 (예를 들어, 무혈청 배지에서 최고 세포 밀도), 성장 특성 (예를 들어, 무혈청 배지에서의 성장), 체적 생산율(VPR), 및 재조합 단백질 발현을 갖는 (c)에서 생성된 단일-세포 서브클론 배양물을 선발하는 단계 (여기서, (d)의 선발된 서브클론 (예를 들어, 다른 테스트된 서브클론 배양물과 비교하여 최상의 형질감염 효율, 최고 세포 밀도, 성장 특성, VPR 및 재조합 단백질 발현을 갖는 서브클론 배양물)은 당단백질의 재조합적 발현에 유용하다.
본원에 또한 제공된 것은 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 생성되는 포유류 세포 또는 포유류 세포주이다. 본원에 기술된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 혈청-의존성 불사화 세포주의 비제한적 예는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 골수종 세포, B-세포, 하이브리도마 세포, T-세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포 (베로) 세포, 및 마딘-다비 개 (코커 스파니엘) 신장 상피 세포 (MDCK) 세포를 포함한다. 본원에 기술된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 다른 혈청-의존성 불사화 세포주는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 혈청-의존성 불사화 세포주는 상피 세포주, 내피 세포주, 림프구 세포주, 신장 세포주, 폐 세포주, T-세포주, 골수종 세포주, 또는 B-세포주일 수 있다. 일부 실시예에서, 혈청-의존성 불사화 세포주는 현탁 상태로 성장한다. 다른 실시예에서, 혈청-의존성 불사화 세포주는 유착 세포 배양에서 성장한다.
일부 실시예에서, 혈청-의존성 불사화 세포주는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 내생적으로 발현하지 않는다. 선발된 서브클론 (본 방법에서 선발된 제1 또는 제2 서브클론 중 어느 하나)을 현탁 상태로 성장시킬 수 있다.
불사화 포유류 세포주의 배양 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 형질감염 효율, 무혈청 배양 배지에서의 세포 성장, 재조합 단백질 발현, 최고 세포 밀도 (예를 들어, 최고 생존성 세포 밀도), 세포 성장 특성, 체적 생산율 및 생성된 재조합 단백질의 글리코실화 프로파일을 결정하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형질감염 효율은 세포를 형질감염시킨 발현 플라스미드 내의 리포터 유전자의 발현의 수준을 탐지함으로써 결정될 수 있다 (예를 들어, 그러한 리포터 유전자의 발현은 형광-보조된 세포 분류법을 이용하여 탐지될 수 있다). 재조합 단백질 발현은 예를 들어 조직 배양 배지에 또는 세포 내에 존재하는 재조합 단백질의 수준을 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 탐지함으로써 결정될 수 있다. 재조합 단백질 발현은 예를 들어 항체 또는 효소 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 도 1에 열거된 임의의 효소) 중 하나 또는 이들 둘 모두일 수 있다. 예를 들어 최고 세포 밀도 및 세포 성장은 (예를 들어, 혈구계 또는 기타 구매가능한 자동화 세포 카운터(counter)를 사용하여) 세포 배양물에서 시간이 지남에 따라 세포 밀도 (예를 들어, 생존성 세포 밀도)를 측정함으로써 평가될 수 있다. 세포의 체적 생산율은 세포 배양 배지에 또는 세포 내에 존재하는 재조합 단백질의 수준을 시간이 지남에 따라 평가함으로써 본 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 세포에 의해 생성된 재조합 당단백질의 글리코실화 프로파일은 예를 들어 본 명세서의 실시예 섹션에 기술된 임의의 방법 (예를 들어, 2-아미노 벤조산(AA)-유도체화 및 레이저-유도된 형광 검출을 이용한 모세관 전기영동)을 이용하여 결정될 수 있다.
본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 포유류 세포주는 미래의 사용을 위하여 저온 (예를 들어, -20℃ 미만, -30℃ 미만, -40℃ 미만, -50℃ 미만, -60℃ 미만, -70℃ 미만, 또는 -80℃ 미만)에서 보관될 수 있다. 저온에서의 보관을 위한 포유류 세포주 스톡(stock)의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Hewitt, Methods Mol . Biol . 640:83-105, 2010], 및 문헌[Phelan, Curr. Protoc . Hum. Genet. Apendix 3:3G, 2006]에 기술되어 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 포유류 세포주는 (예를 들어, 보관 전 및/또는 보관 후) 혈청-함유 및/또는 혈청-함유 배양 배지에 노출되지 않는다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 포유류 세포주는 단지 동물-유래 성분(animal-derived component; ADC)-무함유 배양 배지에서 배양된다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 포유류 세포주는 단지 무혈청, 무단백질, 화학적 규정 성장 배지에서 배양된다.
재조합 당단백질의 생성 방법
본원에 또한 제공된 것은 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 도 1에 열거된 임의의 효소, 또는 본 기술 분야에 공지된 임의의 재조합 당단백질)의 생성 방법이다. 이러한 방법은 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 생성된 포유류 세포를 제공하는 단계, 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 도 1에 기술된 임의의 효소, 및 본 기술 분야에 공지된 임의의 기타 당단백질)을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, 발현 벡터)을 상기 세포 내로 도입하는 단계, 당단백질을 생성하기에 충분한 조건 하에 무혈청 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 또는 성장 배양 배지로부터 당단백질을 수확하는 단계를 포함한다. 또한 제공되는 것은 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)이다.
일부 예에서, 당단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 발현 벡터 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 발현 벡터)이다. 다른 실시예에서, 당단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 포유류 세포의 염색체 내로 통합된다.
일부 실시예에서, 배양은 현탁 세포 배양을 이용하여 수행된다. 다른 실시예에서, 배양은 포유류 세포의 부착 및 성장을 허용하는 표면을 갖는 복수의 마이크로캐리어(microcarrier)를 이용하여 수행된다. 상기 복수의 마이크로캐리어는 예를 들어, 약 20 ㎛ 내지 약 1 mm (예를 들어, 약 20 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 150 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 250 ㎛ 내지 500 ㎛, 약 200 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 750 ㎛ 내지 1 mm, 약 200 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 약 200 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 또는 약 500 ㎛ 내지 약 800 ㎛)의 평균 직경을 가질 수 있으며, 여기서, 마이크로캐리어는 포유류 세포 (예를 들어, 본원에 기술되거나 본 기술 분야에 공지된 임의의 포유류 세포)의 부착을 촉진하거나 허용되는 표면을 갖는다. 일부 실시예에서, 마이크로캐리어는 1개 이상의 기공 (예를 들어, 평균 직경이 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 1개 이상의 기공)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 마이크로캐리어의 표면 및/또는 복수의 마이크로캐리어에서의 1개 이상의 기공의 표면은 포유류 세포가 마이크로캐리어에 부착하는 것 (예를 들어, 마이크로캐리어의 외측 표면 및/또는 마이크로캐리어에서의 기공의 표면에 부착하는 것)을 촉진하는 에이전트(agent)로 코팅된다. 마이크로캐리어는 형상이 대략 구형이거나 타원형일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 마이크로캐리어는 외측 표면을 갖고/갖거나 마이크로캐리어 기공은 양으로 하전된 (예를 들어, N,N-디에틸아미노에틸기의 존재로 인하여 양으로 하전된) 표면을 갖는다. 본원에 기술된 임의의 방법에서 사용될 수 있는 비제한적인 예시적 마이크로캐리어는 사이토포어(CytoPore)TM 1 및 사이토포어TM 2 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 라이프 사이언시즈(Life Sciences) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터 입수가능함)를 포함한다. 배양에 사용될 수 있는 마이크로캐리어의 추가의 예가 공개되어 있으며, 본 기술 분야에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 배양은 생물 반응기를 사용하여 수행된다. 생물 반응기는 예를 들어, 약 1 L 내지 약 10,000 L (예를 들어, 약 1 L 내지 약 50 L, 약 50 L 내지 약 500 L, 약 500 L 내지 약 1000 L, 500 L 내지 약 5000L, 약 500 L 내지 약 10,000 L, 약 5000 L 내지 약 10,000 L, 약 1 L 내지 약 10,000 L, 약 1L 내지 약 8,000 L, 약 1 L 내지 약 6,000 L, 약 1 L 내지 약 5,000 L, 약 100 L 내지 약 5,000 L, 약 10 L 내지 약 100 L, 약 10 L 내지 약 4,000 L, 약 10 L 내지 약 3,000 L, 약 10 L 내지 약 2,000 L, 또는 약 10 L 내지 약 1,000 L)의 체적을 가질 수 있다. 생물 반응기에 존재하는 액체 배양 배지의 양은 예를 들어, 대략 약 0.5 L 내지 약 5,000 L (예를 들어, 약 0.5 L 내지 약 25 L, 약 25 L 내지 약 250 L, 약 250 L 내지 약 500 L, 250 L 내지 약 2500 L, 약 250 L 내지 약 5,000 L, 약 2500 L 내지 약 5,000 L, 약 0.5 L 내지 약 5,000 L, 약 0.5 L 내지 약 4,000 L, 약 0.5 L 내지 약 3,000 L, 약 0.5 L 내지 약 2,500 L, 약 50 L 내지 약 2,500 L, 약 5 L 내지 약 50 L, 약 5 L 내지 약 2,000 L, 약 5 L 내지 약 1,500 L, 약 5 L 내지 약 1,000 L, 또는 약 5 L 내지 약 500 L)일 수 있다. 세포의 배양은 예를 들어 유가식 생물 반응기 또는 관류식 생물 반응기를 사용하여 수행될 수 있다. 배양은 (예를 들어, 생물 반응기에서) 유가식 배양 또는 관류식 배양에 의해 수행될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 생물 반응기의 내부 표면은 적어도 하나의 코팅 (예를 들어, 젤라틴, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리스티렌 및 라미닌의 적어도 하나의 코팅)과, 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 액체 배양 배지 내로의 O2, CO2, 및 N2의 스파징(sparging)을 위한 하나 이상의 포트(port), 및 액체 배양 배지의 교반을 위한 교반 메카니즘을 가질 수 있다. 생물 반응기는 조절된 가습 분위기에서 (예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과의 습도, 또는 100%의 습도에서 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있다. 또한 생물 반응기에는 생물 반응기로부터 소정 체적의 액체 배양 배지를 제거할 수 있는 기계 장치 및 임의로, 생물 반응기 밖으로 액체 배양 배지를 이전시키는 공정 동안 액체 배양 배지로부터 세포를 제거하는 기계 장치 내의 필터 (예를 들어, 교번 접선 유동(alternating tangential flow; ATF) 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration; TFF) 시스템)가 갖추어져 있을 수 있다. 배양은 기껏해야 또는 약 15%의 CO2 (예를 들어, 기껏해야 또는 약 14%의 CO2, 12%의 CO2, 10%의 CO2, 8%의 CO2, 6%의 CO2, 5%의 CO2, 4%의 CO2, 3%의 CO2, 2%의 CO2, 또는 기껏해야 또는 약 1%의 CO2)를 포함하는 분위기에 생물 반응기 내의 액체 배양 배지를 노출시키는 것을 포함한다.
배양은 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 당업자라면 온도는 배양 동안 특정 시점(들)에서, 예를 들어 한 시간 또는 일일 기준으로 변화될 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 온도는 포유류 세포를 생물 반응기에 처음 접종한 후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 또는 약 20일 이상의 날에 변화되거나 이동될 수 있다 (예를 들어 증가되거나 감소될 수 있다). 예를 들어, 온도는 상승 이동될 수 있다 (예를 들어, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19℃ 또는 그 이하, 또는 약 20℃ 또는 그 이하의 변화). 예를 들어, 온도는 하강 이동될 수 있다 (예를 들어, 0.05℃ 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19℃ 초과의, 또는 약 20℃ 또는 그 이하의 변화).
배양은 무단백질, 무혈청, 화학적 규정 배지를 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 배지의 비제한적 예는 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 구매가능하다. 유용한 배양 배지의 비제한적 예는 예를 들어, CD CHO, 옵티(Opti) CHO, 및 포티(Forti) CHO (모두 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터 입수가능함; 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재), 하이셀(Hycell) CHO 배지 (서모 피셔 사이언티픽, 인크.(Thermo Fisher Scientific, Inc.); 미국 매사추세츠주 월섬 소재), 엑스-셀(Ex-cell) CD CHO 퓨전(Fusion) 배지 (시그마-알드리치 컴퍼니(Sigma-Aldrich Co.); 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 파워(Power)CHO 배지 (론자 그룹, 엘티디.(Lonza Group, Ltd.); 스위스 바젤 소재)를 포함한다.
포유류 세포는 본원에 기술된 임의의 포유류 세포일 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포는 CHO 세포일 수 있다. 포유류 세포는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 내생적으로는 발현하지 않는 세포 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타아제를 내생적으로는 발현하지 않는 CHO 세포)일 수 있다.
재조합 당단백질은 효소 (예를 들어, 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 도 1에 열거된 임의의 단백질, 또는 본 기술 분야에 공지된 임의의 기타 당단백질) 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 실시예에서, 핵산 (예를 들어, 발현 벡터)은 서열 번호 1의 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함한다. 핵산 (예를 들어, 발현 벡터)은 당단백질을 코딩하는 핵산의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열, 당단백질을 코딩하는 핵산의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 TTG 개시 코돈을 갖는 인간 CD52 단백질의 펩티드를 코딩하는 서열, 및 당단백질을 코딩하는 핵산의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 햄스터 rpS21 프로모터, 햄스터 β-액틴 프로모터, 및 SV40 초기 프로모터. 폴리(A) 인식 부위를 코딩하는 서열은 SV40 초기 폴리(A) 인식 서열일 수 있다. 일부 실시예에서, 프로모터 서열은 햄스터 β-액틴 프로모터일 수 있으며, 폴리(A) 인식 서열은 SV40 초기 폴리(A) 인식 서열이다. 일부 실시예에서, 핵산은 인간 또는 개 글루타민 신테타아제를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다 (예를 들어, 인간 또는 개 글루타민 신테타아제를 코딩하는 핵산의 5' 말단이 SV40 초기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 인간 또는 개 글루타민 신테타아제를 코딩하는 핵산의 3' 말단이 SV40 초기 인트론 및 폴리(A) 시그널 서열에 작동가능하게 연결된 경우). 일부 실시예에서, 핵산은 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) (예를 들어, 인간 또는 마우스 DHFR)를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 핵산의 5' 말단이 SV40 초기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 핵산의 3' 말단이 SV40 초기 인트론 및 폴리(A) 시그널 서열에 작동가능하게 연결된 경우).
배양은 관류식 생물 반응기를 사용하여 수행될 수 있다. 관류식 배양은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 생물 반응기로부터 제1 체적의 제1 액체 배양 배지 (예를 들어, 임의의 농도의 포유류 세포, 예를 들어, 실질적으로 세포가 없는 제1 체적의 제1 액체 배양 배지를 포함함)를 제거하는 것, 및 제1 액체 배양 배지에 제2 체적의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 것을 포함한다. 제거 및 첨가는 동시에 또는 순차적으로, 또는 이 둘의 조합으로 수행될 수 있다. 또한, 제거 및 첨가는 임의의 주어진 시간 기간에 걸쳐 (예를 들어, 24시간의 기간에 걸쳐, 약 1시간에서 약 24시간까지의 증가하는 시간 기간에 걸쳐, 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간에 걸쳐) 또는 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 일일 1회, 일일 2회, 일일 3회, 일일 4회, 또는 일일 5회), 또는 이의 임의의 조합으로, 생물 반응기의 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 0.1% 내지 800% (예를 들어, 1% 내지 700%, 1% 내지 600%, 1% 내지 500%, 1% 내지 400%, 1% 내지 350%, 1% 내지 300%, 1% 내지 250%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)의 체적을 제거 및 대체하는 속도로) 연속적으로 수행될 수 있다. 주기적으로 수행되는 경우, 제거 또는 대체되는 체적 (예를 들어, 약 24시간의 기간 내에, 약 1시간에서 약 24시간까지의 증가하는 시간 기간 내에, 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간 내에)은 예를 들어, 생물 반응기의 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 0.1% 내지 800% (예를 들어, 1% 내지 700%, 1% 내지 600%, 1% 내지 500%, 1% 내지 400%, 1% 내지 300%, 1% 내지 200%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)일 수 있다. 제거되는 제1 액체 배양 배지의 제1 체적 및 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 체적은 일부의 경우에 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸쳐 각 24시간의 기간에 걸쳐 (또는 대안적으로, 약 1시간에서 약 24시간까지의 증가하는 시간 기간 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간에 걸쳐) 대략 동일하게 유지될 수 있다. 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 제1 액체 배양 배지의 제1 체적이 제거되는 속도 (체적/시간 단위) 및 제2 액체 배양 배지의 제2 체적이 첨가되는 속도 (체적/시간 단위)는 달라질 수 있다. 제1 액체 배양 배지의 제1 체적이 제거되는 속도 (체적/시간 단위) 및 제2 액체 배양 배지의 제2 체적이 첨가되는 속도 (체적/시간 단위)는 대략 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
대안적으로, 제거 및 첨가되는 체적은 배양 기간 동안 각 24시간의 기간에 걸쳐 (또는 대안적으로, 1시간 내지 약 24시간의 증가하는 시간 기간 및 24시간 초과의 증가하는 시간 기간에 걸쳐) 변화할 수 있다 (예를 들어, 점진적으로 증가할 수 있다). 예를 들어, 배양 기간에 걸쳐 각 24시간의 기간 내에 (또는 대안적으로, 약 1시간과 24시간 초과의 시간 사이의 증가하는 시간 기간 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간 내에) 제거되는 제1 액체 배양 배지의 체적 및 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 체적은 배양 기간에 걸쳐 생물 반응기 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 0.5% 내지 약 20%인 체적으로부터 생물 반응기 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 약 25% 내지 약 150%로 증가될 수 있다 (예를 들어, 점진적으로 또는 스태거드 증가(staggered increment)를 통하여).
당업자라면, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지 (예를 들어, 무혈청 또는 무혈청, 무단백질 화학적 규정 배지)일 수 있음을 알 것이다. 다른 경우에, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지는 상이할 수 있다.
제1 액체 배양 배지의 제1 체적은 예를 들어 기계 시스템을 사용하여 및/또는 상기 체적에 존재하는 포유류 세포를 배제시키는 분자량 컷오프(cut-off)를 갖는 살균 막을 통한 상기 체적의 삼출 또는 중력 유동에 의해 제거될 수 있다.
제2 액체 배양 배지의 제2 체적은 자동화된 양식으로, 예를 들어 관류 펌프에 의해 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다. 일부의 경우에, 제1 액체 배양 배지의 제1 체적 (예를 들어, 포유류 세포가 실질적으로 없는 제1 액체 배양 배지의 제1 체적)을 제거하는 것 및 제2 액체 배양 배지의 제2 체적을 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 것은 포유류 세포를 생물 반응기에 접종한지 적어도 1시간 내 (예를 들어, 2시간 내, 3시간 내, 4시간 내, 5시간 내, 6시간 내, 7시간 내, 8시간 내, 9시간 내, 10시간 내, 12시간 내, 14시간 내, 16시간 내, 18시간 내, 24시간 내, 36시간 내, 48시간 내, 72시간 내, 96시간 내 또는 96시간 후)에는 일어나지 않는다.
대안적으로, 또는 이에 더하여, 배양은 유가식 생물 반응기를 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 배양은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 대부분의 배양 기간에 걸쳐, 제2 액체 배양 배지의 제2 체적을 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 것 (예를 들어, 주기적 또는 연속 첨가)을 포함한다. 제2 액체 배양 배지의 첨가는 임의의 주어진 시간 기간에 걸쳐 (예를 들어, 24시간의 기간에 걸쳐, 약 1시간에서 약 24시간까지의 증가하는 시간 기간에 걸쳐, 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간에 걸쳐) 또는 주기적으로 (예를 들어, 3일마다 1회, 2일마다 1회, 일일 1회, 일일 2회, 일일 3회, 일일 4회, 또는 일일 5회), 또는 이의 임의의 조합으로, 생물 반응기의 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 0.1% 내지 300% (예를 들어, 1% 내지 250%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)의 체적을 첨가하는 속도로) 연속적으로 수행될 수 있다. 주기적으로 수행되는 경우, 첨가되는 체적 (예를 들어, 약 24시간의 기간 내에, 약 1시간에서 약 24시간까지의 증가하는 시간 기간 내에, 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간 내에)은 예를 들어, 생물 반응기의 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 0.1% 내지 300% (예를 들어, 1% 내지 200%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)일 수 있다. 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 체적은 일부의 경우에 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸쳐 각 24시간의 기간에 걸쳐 (또는 대안적으로, 약 1시간에서 약 24시간까지의 증가하는 시간 기간 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간에 걸쳐) 대략 동일하게 유지될 수 있다. 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 제2 액체 배양 배지의 제2 체적이 첨가되는 속도 (체적/시간 단위)는 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸쳐 달라질 수 있다. 예를 들어, 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 체적은 배양 기간 동안 각 24시간의 기간에 걸쳐 (또는 대안적으로, 1시간 내지 약 24시간의 증가하는 시간 기간 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간에 걸쳐) 변화할 수 있다 (예를 들어, 점진적으로 증가할 수 있다). 예를 들어, 배양 기간에 걸쳐 각 24시간의 기간 내에 (또는 대안적으로, 약 1시간과 24시간 초과의 시간 사이의 증가하는 시간 기간 또는 24시간 초과의 증가하는 시간 기간 내에) 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 체적은 배양 기간에 걸쳐 생물 반응기 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 0.5% 내지 약 20%인 체적으로부터 생물 반응기 체적 또는 제1 액체 배양 배지 체적의 약 25% 내지 약 150%로 증가될 수 있다 (예를 들어, 점진적으로 또는 스태거드 증가를 통하여). 제2 액체 배양 배지의 제2 체적이 첨가되는 속도 (체적/시간 단위)는 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸쳐 대략 동일할 수 있다.
당업자라면, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지 (예를 들어, 무단백질 배양 배지 또는 무혈청, 무단백질 화학적 규정 배지)일 수 있음을 알 것이다. 다른 경우에, 제1 액체 배양 배지는 제2 액체 배양 배지와는 상이한 유형의 것일 수 있다. 제2 액체 배양 배지의 체적은 자동화된 양식으로, 예를 들어 관류 펌프에 의해 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일부의 경우에, 제2 액체 배양 배지의 제2 체적을 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 것은 포유류 세포를 생물 반응기에 접종한 후 1시간 이상, 7일 이하까지 (예를 들어, 포유류 세포를 생물 반응기에 접종한 후 적어도 2시간까지, 3시간 내, 4시간 내, 5시간 내, 6시간 내, 7시간 내, 8시간 내, 9시간 내, 10시간 내, 12시간 내, 14시간 내, 16시간 내, 18시간 내, 24시간 내, 36시간 내, 48시간 내, 72시간 내, 96시간 내, 또는 96시간 후, 7일 이하까지) 일어나지 않는다. 유가식 배양에서의 세포 배양 배지는 전형적으로 배양 기간의 마지막에 수확되지만, 유가식 배양에서의 세포 배양 배지는 또한 배양 기간 동안 하나 이상의 시점에 수확될 수 있다.
당업자라면 본원에 인용된 배양에 대한 다양한 파라미터 중 임의의 것 (예를 들어, 생물 반응기, 체적, 배양 체적을 대체하는 속도 또는 빈도, 교반, 온도, 배양 배지 및/또는 CO2 농도)이 이러한 방법의 수행에서 임의의 조합으로 이용될 수 있음을 알 것이다.
재조합 당단백질을 단리하는 추가의 단계가 수행될 수 있다. 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 그러한 방법은 당단백질의 물리적 특성 및 활성에 따라 달라진다. 예를 들어, 당단백질의 결합 특이성 (예를 들어, 기질 또는 항원-결합 활성), 순전하, 및/또는 크기와 같은 파라미터가 (예를 들어, 배양 배지로부터의 또는 세포로부터의) 재조합 당단백질의 단리 단계를 설계할 때 고려되어야 한다. 임의의 하기 방법 중 1가지 이상을 이용하여 재조합 당단백질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 생성된 재조합 당단백질)을 단리할 수 있다: 친화성 컬럼 크로마토그래피, 이온 (예를 들어, 양이온 또는 음이온) 교환 컬럼 크로마토그래피, 크기 배제 컬럼 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 여과 및 침전. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 단리하는 비제한적 방법이 실시예에 기술되어 있다.
일부 실시예에서, 액체 배양 배지로부터 재조합 당단백질을 단리하는 것은 통합, 연속 공정 (예를 들어, 적어도 2가지의 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템(MCCS)의 사용을 포함하는 공정)을 이용하여 수행될 수 있다. 재조합 당단백질의 단리를 위한 통합, 연속 공정의 비제한적 예가 미국 가특허 출원 제61/775,060호 및 미국 가특허 출원 제61/856,390호와, 국제 공개 제14/137903호에 기술되어 있다. 본원에 제공된 rhAGA를 액체 배양 배지로부터 단리하는 통합된 그리고 연속적인 공정의 비제한적 예가 하기에 기술되어 있다.
본원에 기술된 방법은 단리된 재조합 당단백질을 제약상 허용가능한 부형제 또는 완충제 (예를 들어, 대상체에의 투여용) 중에 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 살균 여과, 바이러스 불활성화, UV 조사 및/또는 동결건조, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
rhAGA 단백질을 단리하기 위한 통합된 그리고 연속적인 공정
본원에 제공된 rhAGA는 통합된 그리고 연속적인 공정을 이용하여 단리될 수 있다. 통합된 그리고 연속적인 공정을 이용한 재조합 단백질의 단리 방법 및 그러한 공정의 단계에 관한 상세 사항은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 국제 공개 제14/137903호 및 미국 특허 공개 제2014/0225994호를 참조한다. 게다가, 국제 공개 제14/137903호에는 이러한 통합된 그리고 연속적인 공정을 수행하는 데 사용될 수 있는 시스템 및 장비가 또한 기술되어 있다.
예를 들어, rhAGA 단백질을 단리하기 위한 통합된 그리고 연속적인 공정은 (a) 세포가 실질적으로 없는, 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함하는 액체 배양 배지를 제공하는 단계 (여기서, 액체 배양 배지를 제1 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1) 내로 공급함); (b) MCCS1을 사용하여 액체 배양 배지 중의 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포착하는 단계 (여기서, 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 함유하는 MCCS1의 용출액을 제2 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2) 내로 연속적으로 공급함); 및 (c) MCCS2를 사용하여 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 정제 및 폴리싱하는 단계 (여기서, MCCS2로부터의 용출액은 본원에 제공된 단리된 rhAGA 단백질이거나 rhAGA 단백질 원료 의약품이며, 본 공정은 통합된 것으로서, 상기 액체 배양 배지로부터 본원에 제공된 단리된 rhAGA 단백질 또는 rhAGA 단백질 원료 의약품인 MCCS2로부터의 용출액으로 연속적으로 진행됨)를 포함할 수 있다.
MCCS1 및/또는 MCCS2는 예를 들어 2가지 이상의 단위 조작을 수행할 수 있다. 일부 실시 양태에서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두는 컬럼 스위칭을 수반한다. 일부 실시 양태에서, MCCS1은 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포착하는 그리고 바이러스를 불활성화시키는 단위 조작을 수행한다. 일부 실시 양태에서, MCCS2는 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 정제하는 그리고 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다.
MCCS1 및/또는 MCCS2는 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼을 이용할 수 있다. MCCS1 및/또는 MCCS2는 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 막을 이용할 수 있다. MCCS1 및/또는 MCCS2는 예를 들어 1개 이상의 크로마토그래피 컬럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 이용할 수 있다.
MCCS1은 예를 들어 주기적 역류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)일 수 있다. PCCS1은 예를 들어 4개-컬럼 PCCS일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 4개-컬럼 PCCS에서의 4개의 컬럼은 액체 배양 배지로부터의 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포착하는 단위 조작을 수행할 수 있다. 포착은 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 분자체 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 단백질 A-결합 포착 메카니즘, 기질-결합 포착 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편 포착 메카니즘, 압타머-결합 포착 메카니즘, 및 보조 인자-결합 메카니즘으로부터 선택되는 포착 메카니즘을 이용하여 수행될 수 있다. 4개-컬럼 PCCS에서의 4개의 컬럼 중 3개로부터의, 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 함유하는 용출액은 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼 내로 공급된다. 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼은 예를 들어 바이러스 불활성화를 위하여 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 함유하는 용출액을 낮은 pH에서 유지함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단위 조작을 수행할 수 있다. 예를 들어, 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼은 바이러스 불활성화를 위하여 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 함유하는 용출액을 낮은 pH에서 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 유지할 수 있다.
일부 실시 양태에서, MCCS2는 예를 들어 주기적 역류 크로마토그래피 시스템 (PCCS2)일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 공정은 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼으로부터의 용출액을 PCCS2 내로 공급하기 전에 인-라인 완충제 조정 저장부를 사용하여 4개-컬럼 PCCS의 제4 컬럼으로부터의 용출액의 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
PCCS2는 예를 들면 3개의 크로마토그래피 컬럼 및 1개의 크로마토그래피 막을 포함할 수 있다. PCCS2에서의 3개의 크로마토그래피 컬럼은 (예를 들어, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여) 예를 들어 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행할 수 있다. PCCS2에서의 3개의 컬럼으로부터의 용출액을 예를 들어 PCCS2에서의 크로마토그래피 막 내로 공급할 수 있다. PCCS2에서의 크로마토그래피 막은 (예를 들어, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여) 예를 들어 PCCS2에서의 3개의 크로마토그래피 컬럼의 용출액 중의 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행할 수 있다. 크로마토그래피 막의 유통액 및 세척액은 본원에 제공된 단리된 rhAGA 단백질 또는 rhAGA 단백질 원료 의약품일 수 있다.
일부 실시예는 PCCS2에서의 3개의 컬럼으로부터의 용출액을 PCCS2에서의 크로마토그래피 막 내로 공급하기 전에 인-라인 완충제 조정을 사용하여 PCCS2에서의 3개의 컬럼으로부터의 용출액의 이온 농도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태는 PCCS1과 PCCS2 사이에 브레이크 탱크(break tank)를 사용하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시예는 PCCS1으로부터의 용출액을, 이것이 PCCS2 내로 공급되기 전에 여과하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태는 액체 배양 배지를, 이것이 MCCS1 내로 공급되기 전에 여과하는 것을 추가로 포함한다.
제약 조성물 및 키트
본원에 또한 제공된 것은 적어도 1가지 (예를 들어, 1가지, 2가지, 3가지 또는 4가지)의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 포함하는 제약 조성물이다. 2가지 이상 (예를 들어, 2가지, 3가지 또는 4가지)의 본원에 제공된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 임의의 조합으로 제약 조성물에 존재할 수 있다. 본원에서 또한 제공되는 것은 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진 제약 조성물이다.
본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장 또는 동물성 혈액 제제)에 검출가능한 수준의 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않거나 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 오염물질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 오염물질)이 전혀 존재하지 않을 수 있다.
본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 무단백질 배지, 무혈청 배지 및 화학적 규정 배지의 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 무단백질 배양 배지 및/또는 화학적 규정 배양 배지만을 사용한 세포 배양에서 생성된 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 무단백질 배양 배지, 무혈청 배양 배지 및 화학적 규정 배양 배지의 군으로부터 선택되는 배양 배지만을 사용한 세포 배양에 의해 생성된 그리고 통합된 그리고 연속적인 공정 (예를 들어, 본원에 또는 국제 공개 제14/137903호에 기술된 임의의 예시적인 통합된 그리고 연속적인 공정)을 이용하여 단리된 본원에 제공된 rhAGA 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 제약 조성물은 동물성 제품 (예를 들어, 동물 혈청, 동물 혈장, 또는 동물 혈액 인자 또는 단백질)을 함유하는 배양 배지의 사용을 포함하는 방법에 의해 생성된 rhAGA 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 rhAGA 단백질)을 함유하는 제약 조성물과 비교하여, 개선된 안전 프로파일 (예를 들어, 감소된 오염 위험 (예를 들어, 본원에서 기술되거나 본 기술 분야에 공지된 임의의 예시적인 오염물질))을 가질 수 있다.
제약 조성물은 본 기술 분야에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다. 본원에 제공된 제약 조성물은 이것이 감소된 오염 위험 또는 수준 (예를 들어, 감소된 바이러스 오염 위험 또는 수준)을 갖고/갖거나 조성물에 존재하는 글리코형의 감소된 이질성을 갖기 때문에 유리하다.
제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내)와 양립가능하도록 제형화된다. 조성물은 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 살균 희석제 (예를 들어, 살균수 또는 살균 염수), 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매, 항균제 또는 항진균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등, 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨, 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산, 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장제, 예컨대 당 (예를 들어, 덱스트로스), 폴리알코올 (예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨) 또는 염 (예를 들어, 염화나트륨) 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 리포좀 현탁물을 제약상 허용가능한 담체로서 또한 사용할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호 참조). 조성물 제제는 앰풀, 일회용 시린지, 또는 다회 투약 바이알 중에 제형화되어 봉입될 수 있다. 필요할 경우 (예를 들어, 주사가능 제형에서와 같이), 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴 또는 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 흡수는 흡수를 지연시키는 에이전트 (예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴)를 포함시킴으로써 연장될 수 있다. 대안적으로, 조절된 방출은 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템에 의해 달성될 수 있는데, 이는 생물분해성, 생물적합성 중합체 (예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산; 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼, 인크.(Nova Pharmaceutical, Inc.)를 포함할 수 있다.
임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 중 1가지 이상을 포함하는 조성물은 비경구 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내) 투여용으로, 단위 투여 형태 (즉, 투여의 용이함 및 투여량의 균일함을 위하여 소정량의 활성 단백질을 함유하는 물리적으로 분리된 단위)로 제형화될 수 있다.
조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험용 동물 (예를 들어, 원숭이)에서의 표준 의약품 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, LD50 (모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정할 수 있으며, 치료 지수는 LD50:ED50의 비이다. 고 치료 지수를 나타내는 에이전트가 바람직하다. 에이전트가 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 경우, 잠재적인 손상을 최소화하도록 (즉, 원하지 않는 부작용이 감소되도록) 주의를 기울여야 한다. 독성 및 치료 효능은 다른 표준 의약품 절차에 의해 결정될 수 있다.
세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 얻어진 데이터는 대상체 (예를 들어, 인간)에서 사용하기에 적절한 용량의 임의의 주어진 재조합 당단백질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 재조합 당단백질)을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 1가지 이상 (예를 들어, 1가지, 2가지, 3가지 또는 4가지)의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질)의 치료적 유효량은 대상체에서 파브리병을 치료하는 (예를 들어, 대상체 (예를 들어, 파브리병의 발병 위험이 증가된 것으로 확인된 인간 대상체)에서 파브리병의 발병 위험을 감소시키거나 파브리병의 발병을 예방하는), (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나 다른 치료를 받거나 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교하여) 대상체 (예를 들어, 인간)에서 파브리병의 1가지 이상의 증상의 중증도, 빈도 및/또는 지속 시간을 감소시키는, (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나 다른 치료를 받거나 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교하여) 파브리병을 갖는 대상체 (예를 들어, 인간)에서 글로보트리아오스실세라마이드와 같은 말단 α-갈락토실 잔기를 갖는 글리코스핑고지질의 축적 수준을 감소시키는 양이다. 본원에 기술된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 유효성 및 투약은 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용할 뿐만 아니라 대상체 (예를 들어, 인간)에서 파브리병의 1가지 이상의 증상의 관찰에 의해서도 건강 관리 전문가 또는 수의과 전문가에 의해 결정될 수 있다. 특정한 요인 (예를 들어, 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 종합 건강 및/또는 연령, 및 다른 질환의 존재)이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 줄 수 있다.
본원에 기술된 임의의 제약 조성물은 1가지 이상 (예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지 또는 5가지)의 추가의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 제약 조성물에 포함될 수 있는 추가의 치료제의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 항경련제 (예를 들어, 페니토인, 카르바마제핀, 페노바르비탈, 메틸페노바르비탈, 바르벡사클론, 벤조디아제핀, 클로보잔, 클로나제팜, 클로라제페이트, 디아제팜, 미다졸람, 로라제팜, 니트라제팜, 테마제팜, 니메타제팜, 펠바메이트, 카르바마제핀, 옥스카르바제핀, 에슬리카르바제핀 아세테이트, 비가바트린, 프로가비드, 티아가빈, 토피라메이트, 가바펜틴, 프레가발린, 에토토인, 페니토인, 메페니토인, 포스페니토인, 파라메타디온, 트리메타디온, 에타디온, 베클라미드, 프리미돈, 브리바라세탐, 레베티라세탐, 셀레트라세탐, 에토숙시미드, 펜숙시미드, 메숙시미드, 아세타졸라미드, 술티암, 메타졸아미드, 조니사미드, 라모트리긴, 페네투리드, 페나세미드, 발프로미드 및 발녹타미드) 및 항구토제 (예를 들어, 메토클로프라미드, 프로클로르페라진, 알리자프리드, 돌라세트론, 그라니세트론, 온단세트론, 트로피세트론, 팔로노세트론, 미르타자민, 돔페리돈, 올란자핀, 드로페리돌, 할로페리돌, 클로르프로마진, 프로클로르페라진, 아프레피탄트, 및 카소피탄트).
예시적인 용량은 대상체의 체중 1 kg당 본원에 기술된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함한다 (예를 들어, 약 50 ㎍/kg 내지 약 3 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 2.5 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 2.0 mg/kg; 약 500 ㎍/kg 내지 약 1.5 mg/kg; 약 500 ㎍/kg 내지 약 1.5 mg/kg; 또는 약 800 ㎍/kg 내지 약 1.2 mg/kg). 또한 예시적인 용량은 대상체의 체중 1 kg당 본원에 기술된 임의의 1가지 이상의 추가의 치료제 중 1가지 이상의 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함할 수 있다 (예를 들어, 각각의 투여되는 추가의 치료제에 있어서 약 1 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 10 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 10 ㎍/kg 내지 약 0.5 mg; 또는 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 ㎍/kg). 이러한 용량은 광범위한 범위를 포함하지만, 당업자라면 본원에 기술된 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질 및 추가의 치료제를 포함하는 치료제가 그의 효력 면에서 다양하고 유효량이 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 전형적으로, 처음에는 상대적으로 낮은 용량이 투여되며, 담당 건강관리 전문가 또는 수의과 전문가 (치료적 응용의 경우) 또는 연구원 (개발 단계에서 여전히 일하고 있을 때)는 적절한 반응이 수득될 때까지 후속적으로 또는 점진적으로 용량을 증가시킬 수 있다. 게다가, 임의의 특정 대상체를 위한 특정 용량 수준은 이용되는 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 종합 건강, 성별 및 다이어트, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 및 재조합 당단백질 (예를 들어, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질) 또는 추가의 치료제의 생체 내에서의 반감기를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라짐이 이해된다. 제약 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서 내에 포함될 수 있다.
예를 들어, 본원에 제공된 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 이후의 재구성 및 투여를 위하여 동결건조 산제 또는 케이크로서 살균 바이알 내에 패키지될 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 포함하는 동결건조 산제 또는 케이크는 1가지 이상의 안정제 (예를 들어, 만니톨, 제1인산나트륨 1수화물 및 제2 인산나트륨 7수화물)를 포함할 수 있다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 포함하는 동결건조 산제 또는 케이크의 예는 하기를 포함한다: 37 mg의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 222 mg의 만니톨, 20.4 mg의 제1인산나트륨 1수화물, 및 59.2 mg의 제2인산나트륨 7수화물. 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질의 사용 또는 투여 전에, 동결건조 산제 또는 케이크를 7.2 mL의 주사용 살균수, USP를 바이알 내로 주입하여 재구성시켜 5.0 mg의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질/mL의 용액을 생성한다. 이러한 재구성된 용액을 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 500 mL의 최종 체적으로 추가로 희석시킨 후 대상체에게 약 1 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여할 수 있다. 또한 포함되는 것은 동결건조 재조합 인간 α-갈락토시다아제 케이크 또는 산제의 바이알 (이 단락에서 기술된 바와 같음), 상기 케이크 또는 산제를 재구성하는 것에 대한 설명서 (이 단락에서 기술된 바와 같음), 및 재구성된 용액을 대상체에게 약 1.0 mg/kg의 용량으로 2주마다 정맥내 투여하는 것에 대한 설명서를 포함하는 키트이다.
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 포함하는 동결건조 산제 또는 케이크의 또 다른 예는 하기를 포함한다: 5.5 mg의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 33.0 mg의 만니톨, 3.0 mg의 제1인산나트륨 1수화물, 및 8.8 mg의 제2인산나트륨 7수화물. 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질의 사용 또는 투여 전에, 동결건조 산제 또는 케이크를 1.1 mL의 주사용 살균수, USP를 바이알 내로 주입하여 재구성시켜 5.0 mg의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질/mL의 용액을 생성한다. 이러한 재구성된 용액을 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 500 mL의 최종 체적으로 추가로 희석시킨 후 대상체에게 약 1 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여할 수 있다. 또한 포함되는 것은 동결건조 재조합 인간 α-갈락토시다아제 케이크 또는 산제의 바이알 (이 단락에서 기술된 바와 같음), 상기 케이크 또는 산제를 재구성하는 것에 대한 설명서 (이 단락에서 기술된 바와 같음), 및 재구성된 용액을 대상체에게 약 1.0 mg/kg의 용량으로 2주마다 정맥내 투여하는 것에 대한 설명서를 포함하는 키트이다.
또한 제공되는 것은 적어도 1회 용량의 본원에 기술된 임의의 제약 조성물을 포함하는 키트이다. 일부 실시 양태에서, 키트는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 제약 조성물)을 포유류 (예를 들어, 인간)에게 투여하는 데 사용하기 위한 물품 (예를 들어, 시린지, 예를 들어, 예비-충전 시린지)을 추가로 포함할 수 있다. 키트의 일부 실시예는 1회 이상의 용량 (예를 들어, 적어도 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 20회, 30회 또는 40회 용량) (예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 용량)의 본원에 기술된 임의의 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시예에서, 키트는 제약 조성물 (또는 소정 용량의 제약 조성물)을 포유류 (예를 들어, 파브리병을 갖는 인간)에게 투여하는 것에 대한 설명서를 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 키트는 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 중 1가지 이상을 포함하는 조성물, 및 1가지 이상의 추가의 치료제 (예를 들어, 본원에 기술된 추가의 치료제 중 1가지 이상의 임의의 조합)를 함유하는 조성물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하는 것에 대한 설명서를 추가로 포함한다.
파브리병
파브리병은 세라마이드 트리헥소시다아제로 공지된 α-갈락토시다아제-A의 결핍을 특징으로 하는 X-연관된 열성 리소좀 축적병인데, 이는 글로보트리아오스실세라마이드(GL3)와 같은 말단 α-갈락토실 잔기를 갖는 글리코스핑고지질의 축적을 통하여 혈관 및 기타 질환 증후를 초래한다. 파브리병의 비제한적 증상은 무한증, 손가락 통증, 좌심실 비대, 신장 증후, 및 허혈성 뇌졸중을 포함한다. 증상의 중증도는 극적으로 다르다 (문헌[Grewal et al., J. Neurol . 241:153-156, 1994] 참조). 심장에 제한된 증후를 갖는 변이형이 인식되며, 그의 발생은 언젠가 생각된 것보다 더 횡행할 수 있다 (문헌[Nakao, N. Eng . J. Med . 333:288-293, 1995] 참조). 특이한 변이형의 인식은 꽤 만년이 될 때까지 지연될 수 있지만, 아동기에서의 진단이 임상적 불면증에서 가능하다 (문헌[Ko et al., Arch. Pathol . Lab. Med . 120:86-89, 1996]; 문헌[Mendez et al., Dement . Geriatr . Cogn . Disord . 8:252-257, 1997]; 문헌[Shelley et al., Pediatric Derm . 12:215-219, 1995]). 파브리병의 평균 진단 연령은 29세이다.
파브리병의 치료 방법, 포유류 세포의 리소좀에서의 α-갈락토시다아제의 수준의 증가 방법 및 대상체에서의 글로보트리아오실세라마이드 수준의 감소 방법
본원에 또한 제공된 것은 대상체에게 본원에 기술된 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 파브리병의 치료 방법이다. 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 대상체에서 포유류 세포에서 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A의 농도를 증가시킴으로써 파브리병의 치료를 매개한다. 대상체에서의 파브리병의 성공적인 치료는 건강 전문가 (예를 들어, 간호사, 의사 또는 의사 보조)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 성공적인 치료는 (예를 들어, 상기 질환을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나, 다른 치료를 받거나, 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교하여) 대상체에서 파브리병의 1가지 이상의 증상 (무한증, 손가락 통증, 좌심실 비대, 신장 증후, 허혈성 뇌졸중, 및 대상체의 혈청 중 글로보트리아오실세라마이드의 수준의 증가)의 수, 중증도, 및/또는 빈도를 감소시킬 수 있다. 게다가, 성공적인 치료는 (예를 들어, 상이한 치료를 받거나, 위약을 받거나 치료를 전혀 받지 않은, 파브리병을 갖는 대상체와 비교하여, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교하여) 시간이 지남에 따른 대상체의 혈청 또는 조직 (예를 들어, 신장) 중 글로보트리아오실세라마이드의 수준의 감소의 관찰에 의해 결정될 수 있다. 대상체에서 파브리병의 성공적인 치료를 결정하는 추가의 방법이 본원에 기술되어 있으며 본 기술 분야에 공지되어 있다.
또한 제공되는 것은 포유류 세포 (예를 들어, 시험관 내 세포 또는 포유류, 예컨대 인간에서의 세포)에서 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준을 증가시키는 방법이며, 이는 상기 세포를 상기 세포에서의 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준을 증가시키기에 충분한 양의, 1가지 이상의 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 1가지 이상의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 포유류 세포는 만노스-6-포스페이트 수용체를 발현하는 세포일 수 있다. 포유류 세포의 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A의 수준은 인간 α-갈락토시다아제 단백질-A에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 결정될 수 있다. 또한 포유류 세포의 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준은 리소좀을 포유류 세포로부터 단리하고 단리된 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준을 예를 들어 α-갈락토시다아제-A 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 통하여 또는 단리된 리소좀으로부터의 용해물을 사용하여 α-갈락토시다아제 단백질-A 활성 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. α-갈락토시다아제-A 단백질 분석법의 예로는 기질로서 O-니트로페닐 α-D-갈락토시드를 사용하는 분석법이 있다. 이 분석법에서, O-니트로페닐 α-D-갈락토시드는 O-니트로페놀 및 D-갈락토스의 생성물로 전환된다. α-갈락토시다아제-A 단백질 활성을 검출하는 분석법의 또 다른 예에서는 형광원 기질, α-D-갈락토피라노시드가 사용된다 (문헌[Shi et al., Anal. Bioanal . Chem . 394:1903-1909, 2009]). 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 세포의 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준의 증가는 (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나, 다른 치료를 받거나, 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교할 경우) 대상체가 경험하는 파브리병의 증상의 수의 감소, (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나, 다른 치료를 받거나, 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교할 경우) 대상체에서 관찰되는 파브리병의 새로운 증상의 발병률의 감소, (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나, 다른 치료를 받거나, 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교할 경우) 대상체에서의 파브리병의 1가지 이상의 증상의 중증도의 감소, 또는 (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나, 다른 치료를 받거나, 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교할 경우) 대상체에서의 파브리병의 1가지 이상의 증상의 악화의 감소를 관찰함으로써 간접적으로 탐지될 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 예를 들어 세포의 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준의 증가는 (예를 들어, 파브리병을 갖지만 예를 들어 치료를 받지 않거나, 다른 치료를 받거나, 위약을 받은 대조 대상체, 또는 치료 전의 상기 대상체와 비교할 경우) 대상체의 혈청중 글로보트리아오실세라마이드의 수준의 감소를 관찰함으로써 탐지될 수 있다. 본원에 기술된 재조합 단백질로 치료한 후 포유류 세포에서 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A 단백질의 수준은 비처리된 포유류 세포 (예를 들어, 동일한 유형의 세포)의 리소좀 중 α-갈락토시다아제-A의 수준과 비교될 수 있다.
또한 제공되는 것은, 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 중 1가지 이상 또는 제약 조성물 중 1가지 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 (예를 들어, 인간)의 혈청 또는 조직 (예를 들어, 신장) 중 글로보트리아오실세라마이드의 수준을 감소시키는 방법이다. 대상체의 혈청 중 글로보트리아오실세라마이드의 수준은 예를 들어 질량 분광법 (문헌[Kim et al., Korean J. Intern. Med . 25:415-421, 2010]) 또는 항체 샌드위치(sandwich) 분석법 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2012/0178105호에 기술된 분석법)을 이용하여 결정될 수 있다. 본원에 제공된 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물의 투여 후 대상체의 혈청 또는 조직 중 글로보트리아오실세라마이드의 수준을 파브리병을 갖지만 어떠한 치료도 받지 않거나 상이한 치료를 받은 대상체의 혈청 또는 조직 중 글로보트리아오실세라마이드의 수준, 또는 상기 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 본원에 제공된 제약 조성물의 투여 전 대상체에서의 글로보트리아오실세라마이드의 수준과 비교할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간)는 이전에 파브리병을 갖는 것으로 진단되었거나 파브리병을 갖는 것으로 의심된다. 일부 실시 양태에서, 포유류는 파브리병의 발병 위험이 증가된 것으로 확인되었다 (예를 들어, 파브리병의 유전적 발병 위험의 증가). 포유류는 웅성 또는 자성일 수 있으며, 성체 또는 연소자 (예를 들어, 유아(infant) 또는 소아)일 수 있다. 일부의 경우에, 대상체는 인간이다. 포유류가 연소자일 경우, 이는 1일 내지 18세 (1일과 18세를 포함함) (예를 들어, 1일 내지 17세, 1일 내지 16세, 1일 내지 15세, 1일 내지 14세, 1일 내지 13세, 1일 내지 12세, 1일 내지 11세, 1일 내지 10세, 1일 내지 9세, 1일 내지 8세, 1일 내지 7세, 1일 내지 6세, 1일 내지 5세, 1일 내지 4세, 1일 내지 3세, 1일 내지 2세, 1일 내지 1세, 1일 내지 6개월, 6개월 내지 4세, 1개월 내지 5세, 3세 내지 13세, 또는 13세 내지 18세)일 수 있다. 포유류가 성체인 경우, 포유류는 예를 들어, 18세 내지 20세 (18세와 20세를 포함함), 또는 적어도 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95세, 또는 적어도 또는 약 100세일 수 있다.
대상체는 대상체에서 1가지 이상의 증상 (예를 들어, 본원에 기술되거나 본 기술 분야에 공지된 파브리병의 임의의 증상 중 1가지 이상)의 관찰에 의해 건강관리 전문가에 의해 파브리병을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 일부 실시예에서, 대상체는 이미 파브리병에 대하여 치료를 받고 있을 수 있다. 다른 것에서, 파브리병의 이전의 치료는 성공적이지 않았었다.
본원에 기술된 재조합 단백질 또는 제약 조성물은 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 림프간 투여, 근육내 투여, 안투여, 또는 척수강내 투여에 의해 투여될 수 있다. 또한, 재조합 단백질 및 제약 조성물은 임의의 본 기술 분야에 공지된 기술을 이용하고/하거나 본원에 기술된 바와 같이 제형화될 수 있다 (예를 들어, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 림프간 투여, 근육내 투여, 근육 주위 투여, 또는 척수강내 투여용으로 제형화되고/되거나 리포좀 또는 나노입자 중에 제형화됨).
본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물은 의료 전문가 (예를 들어, 의사, 의사 보조원, 간호사, 간호사 보조원, 또는 실험실 기술자) 또는 수의과 전문가에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 재조합 단백질 또는 제약 조성물은 인간, 예를 들어 환자 그 자신에 의해 자가-투여될 수 있다. 투여는 예를 들어 병원, 클리닉, 또는 일차 관리 시설 (예를 들어, 양로원) 또는 이의 임의의 조합에서 일어날 수 있다.
일부 실시 양태에서, 포유류에게는 1 mg 내지 400 mg의 용량의, 본원에 기술된 임의의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 본원에 기술된 임의의 제약 조성물 (예를 들어, 1 mg 내지 300 mg, 1 mg 내지 250 mg, 1 mg 내지 200 mg, 1 mg 내지 150 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 80 mg, 1 mg 내지 70 mg, 1 mg 내지 60 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 40 mg, 1 mg 내지 30 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 10 mg, 20 mg 내지 120 mg, 30 mg 내지 90 mg, 또는 40 mg 내지 80 mg)이 투여된다. 일부 실시예에서, 대상체에게는 약 0.1 mg/kg 내지 약 4.0 mg/kg (예를 들어, 약 0.1 mg/kg 내지 약 3.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 0.5 mg 내지 약 1.5 mg/kg, 또는 약 0.7 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg)의 용량의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질이 투여된다.
일부 실시 양태에서, 대상체에게는 추가의 치료제 (예를 들어, 본원에 기술된 임의의 추가의 치료제)가 추가로 투여된다. 추가의 치료제는 재조합 단백질 또는 제약 조성물이 투여되는 것과 실질적으로 동일한 시점에 및/또는 하나 이상의 다른 시점에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 추가의 치료제는 (예를 들어, 본원에 기술된 제형 및 조성물의 예 중 임의의 것을 사용하여) 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질과 함께 제형화된다.
일부 실시 양태에서, 추가의 치료제는 제1 투여 형태로 제형화되며, 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질은 제2 투여 형태로 제형화된다. 추가의 치료제가 제1 투여 형태로 제형화되고 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질이 제2 투여 형태로 제형화되는 경우, 제1 투여 형태 및 제2 투여 형태는 예를 들어, 동일한 투여 경로 (예를 들어, 경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 척수강내, 림프간, 또는 복강내 투여) 또는 상이한 투여 경로 (예를 들어, 경구 투여용으로 제형화되는 제1 투여 형태 및 피하, 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 투여 투여용으로 제형화되는 제2 투여 형태)를 위한 것으로 제형화될 수 있다. 그러한 치료 요법의 조합이 본 발명에서 명백하게 고려된다.
상기에 기술된 바와 같이, 투여되는 상기 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 (및 임의로, 추가의 치료제)의 양은 투여가 국소 (예를 들어, 근육내) 투여인지 전신 투여인지에 따라 달라진다. 일부 실시 양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간)에게 1회 초과의 용량의 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 1가지 이상의 제약 조성물을 투여한다. 일부 실시 양태에서 대상체 (예를 들어, 인간)에게 1회 초과의 용량 (예를 들어, 2회 이상의 용량)의 본원에 기술된 임의의 조성물을 투여한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 소정 용량의 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 1가지 이상의 제약 조성물을 적어도 월 1회 (예를 들어, 적어도 월 2회, 적어도 월 3회, 적어도 월 4회, 적어도 주 1회, 적어도 주 2회, 주 3회, 일일 1회, 또는 일일 2회) 투여한다. 예를 들어, 대상체에게 2회 이상의 용량의 임의의 제약 조성물 또는 1가지 이상의 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 적어도 2개월마다 1회의 투약 (예를 들어, 적어도 1개월마다 1회의 투약, 적어도 주 1회의 투약, 적어도 2주마다 1회의 투약, 또는 적어도 일일 1회 투약)의 빈도로 투여할 수 있다.
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물은 대상체에게 만성적으로 투여될 수 있다. 만성 치료는 장시간 동안의 임의의 형태의 반복 투여, 예컨대 1개월 이상, 1개월 내지 1년, 1년 이상, 5년 초과, 10년 초과, 15년 초과, 20년 초과, 25년 초과, 30년 초과, 35년 초과, 40년 초과, 45년 초과의 시간, 또는 이보다 더 긴 시간 동안의 반복 투여를 포함한다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 만성 치료가 가해질 수 있다. 만성 치료는 정기적인 투여, 예를 들어, 일일 1회 이상, 주 1회 이상 또는 월 1회 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 만성 치료는 대략 2주마다의 (예를 들어, 대략 10 내지 18일마다의) 투여 (예를 들어, 정맥내 투여)를 포함할 수 있다. 적합한 용량은 요망되는 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 양일 수 있다. 그러한 유효 용량은 일반적으로 본원에 기술된 요인에 따라 달라진다. 요망될 경우, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물의 일일 유효 용량은 그 날 전체에 걸쳐, 별도로 적절한 간격으로, 임의로, 단위 투여 형태로 투여되는 2가지, 3가지, 4가지, 5가지 또는 6가지의 또는 이보다 더 많은 하위용량(sub-dose)으로서 투여될 수 있다.
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물은 서방형용으로 제형화될 수 있으며 (예를 들어, 생물분해성 중합체 또는 나노입자 중에 제형화될 수 있으며), 일부의 경우에 대상체에서 근육 조직, 피하 조직 또는 복강 내로 직접적으로 투여될 수 있다 (각각 근육내, 복강내, 또는 피하 데포(depot) 투여). 대안적으로 또는 이에 더하여, 서방형 제형은 전신 투여될 수 있다 (예를 들어, 경구, 정맥내, 동맥내, 복강내, 림프간, 또는 피하 투여). 일부의 경우에, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 또는 제약 조성물은 경구 투여용, 선내 투여용, 선주위 투여용, 피하 투여용, 관간 투여용, 근육내 투여용, 근육 주위 투여용, 복강내 투여용, 근육내 투여용, 동맥내 투여용, 경피 투여용, 림프간 투여용 또는 정맥내 투여용으로 제형화될 수 있다.
실시예
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 설명하는데, 이는 청구 범위에 설명된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1. 당단백질 생성용 재조합 세포주의 생성
당단백질의 재조합적 생성에 유용한 세포주를 개발하기 위하여 실험을 수행하였다. 이러한 실험에서, 출발 혈청-의존성 CHO 세포주(DXB11)를 연속적으로, 5% 소 태아 혈청을 포함하는 조직 배양 배지에서 3일 동안 성장시키고, 2.5% 소 태아 혈청을 포함하는 조직 배양 배지에서 3일 동안 성장시키고, 소 태아 혈청을 포함하지 않는 조직 배양 배지에서 8일 동안 성장시켰다. 이러한 배양 기간의 마지막에, 생성된 CHO 세포 배양물을 희석시키고, 분취하여 무혈청 하위 집단(sub-population), 또는 풀, 현탁 배양물을 생성하였다. 확장 및 성장 평가 후, 무혈청 풀을 분취하여 단일-세포 클론 배양물을 생성하였다. 각각의 단일-세포 클론을 무혈청 배양 배지에서의 그의 세포 성장에 대하여 테스트하고, 그 후, 클론의 하위세트를 햄스터 β-액틴 프로모터의 제어 하의 적색 형광 단백질(RFP)을 코딩하는 발현 벡터의 전기천공에 의해 형질감염 효율에 대하여 테스트하였으며, 이때 RFP 발현을 형질감염 후 2일에 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 배가 시간 (35시간 미만) 및 형질감염 효율 (75% 초과의 배양 생존성에서 30% 초과의 RFP 양성)에 대한 기준을 충족시키는 클론을 햄스터 β-액틴 프로모터의 제어 하의 관심 대상의 유전자(들)를 코딩하는 그리고 SV40 프로모터의 제어 하의 DHFR 유전자를 코딩하는 발현 벡터(들)를 이용한 안정한 형질감염 후 재조합 단백질 발현에 대하여 평가하였다. 형질감염 후, 안정하게 형질감염된 풀을 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 선발하고, 선발 후, 세포를 비유가식 배양물 내에 접종함으로써 그리고 청징된 배지 수확물을 재조합 단백질의 수준에 대하여 분석함으로써 재조합 단백질 생산성에 대하여 풀을 평가하였다. 안정하게 형질감염된 풀의 MTX 선발, 생존성 및 재조합 단백질 생성 수준을 기반으로 하여, 리드(lead) 무혈청 모 클론을 확인하였다.
리드 모 클론을 서브클로닝하고, 무단백질, 동물 유래 성분(ADC)-무함유, 및 화학적 규정 배지 (인비트로겐으로부터의 CD DG44 배지)에서 추가로 배양하고, 서브클론을 예탁하였다. ADC-무함유 배지에서의 대략 27 세포 세대를 단일 세포 서브클로닝 단계로부터 초기 냉동 세포 은행으로 흘러가게 하였다. 단일 세포 클론을 하기에 대하여 테스트하였다: 형질감염 효율 (상기에 설명한 RFP 코딩 벡터를 이용한 전기천공에 의해), 세포 성장 특성 (인비트로겐으로부터의 CD DG44 배지), 및 재조합 단백질을 생성하기 위한 안정한 형질전환. 안정하게 형질감염된 풀 (인비트로겐으로부터의 CD CHO 배지를 사용함)의 평가는 MTX 선발, 최고 선발 밀도, 성장 특성 및 체적 생산율(VPR)의 평가를 포함하였다. 재조합 단백질 생산성을 상기에 설명한 바와 같이 테스트하였다.
상기에 설명한 모든 배양 단계 후, 단일 클론 모 세포주를 최상의 형질감염 효율 및 최상의 MTX 선발, 최고 세포 밀도, 세포 성장 특성, 및 안정하게 형질감염된 풀의 체적 생산율(VPR)을 갖는 것으로 확인하였다. 이러한 모 세포주를 번식시키고, 미래의 실험에서 사용하기 위하여 분취물로 냉동시켰다.
실시예 2. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A의 생성
재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 생성하는 (그리고 분비하는) 세포의 바이알을 진탕 플라스크에서 화학적으로 규정된 그리고 동물 유래 성분(ADC)를 함유하지 않는 세포 배양 배지 내로 해동시켰다. 관류식 생물 반응기에 접종하기에 충분한 양의 세포가 이용가능해질 때까지 상기 혼합물을 번식시켰다. 표적 고 생존성 세포 밀도가 도달될 때까지 (이 지점에서 세포 밀도 제어를 개시함) 상기 배양물을 성장시켰다. 연속 관류를 접종한지 1일 후에 시작하고, 그 후 관류식 생물 반응기에서 표적화 고 세포 밀도에서 고정된 관류 속도까지 서서히 증가시켰다.
청징된 수확 유체 (재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 함유함)를 통합 연속 포착 크로마토그래피 시스템을 사용하여 포착 컬럼 상에 직접적으로 로딩하였다. 그 후, 포착된 용출액 (재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 함유함)을 음이온 교환 크로마토그래피 수지(ANX)를 통하여 추가로 정제하여 DNA, 숙주 세포 단백질, 및 기타 불순물을 제거하였다. ANX 용출액 (재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 함유함)을 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 수지를 통하여 추가로 정제하였다. 금속 친화성 크로마토그래피 용출액 (재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 함유함)을 표적 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 농도로 농축시키고, 그 후, 완충제를 접선 유동 여과 막을 사용하여 원료 의약품용 완충제로 교환하였다. 그 후, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 원료 의약품을 (실시예에 설명한 바와 같이) 분석적으로 특성화하였다. 동물 PK/PD 연구 (실시예 5)를 위한 준비에서, 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 원료 의약품을 만니톨의 첨가에 의해 후속적으로 제형화하고, 그 후 0.22 cm2 절대 필터를 통하여 여과하였다.
실시예 3. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A의 물리적 특성화
실시예 2에서 생성하고 정제한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 다양한 생물물리학적 기술을 이용하여 물리적으로 특성화하고, 파브라자임® 및 레플라갈®과 비교하였다. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 연구된 구조적 및 기능적 특징 각각이 각각의 구조적 및 기능적 특징의 결정에 사용한 방법과 함께 하기에 논의되어 있다.
분자 크기
파브라자임®, 레플라갈®, 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 분자 크기를 크기 배제 크로마토그래피, MALDI-TOF MS 및 겔 전기영동을 이용하여 평가하였다.
SEC
TSK-Gel G3000SWXL 컬럼 (토소(Tosoh), 7.8 mm x 30 cm)을 사용하여 애질런트(Agilent) 1200 HPLC를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 수행하였다. 50 μL의 샘플을 주입하고, 0.5 mL/분의 유량으로 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 용출된 단백질을 280 nm에서 검출하였다.
MALDI - TOF MS
먼저 0.1% 수성 포름산에 샘플을 희석시킴으로써 (1:5) MALDI-TOF MS를 수행하였다. BSA를 0.1% 수성 포름산 중에 2 mg/mL로 희석시켰다. 희석시킨 샘플을 1 μL/1 μL의 비의 수성 0.1% TFA 중 포화 시나핀산, 50% 아세토니트릴을 이용하여 스테인리스강 MALDI 표적 상에 삼중으로 스포팅하였다(spotted). 10개의 스펙트럼을 각각의 부위에서 그리고 레이저 강도를 다르게 하여 각각의 스폿으로부터 생성하고, 그 후 평균하였다. 기기 설정치는 표 1에 열거되어 있다. 스펙트럼을 BSA의 단일 및 이중 하전 m/z 피크에 대하여 보정하였다. 200의 피크 해상도에서 디폴트 스무딩 루틴(default smoothing routine)을 이용하여 미가공 데이터를 스무딩하였다. 삼중 측정으로부터의 피크 값들을 평균하고, 표준 편차를 결정하였다.
Figure 112016048405574-pct00001
SDS-PAGE
디티올트레이톨(DTT)을 포함하는 샘플 로딩 완충제 중의 각각의 샘플 10 ㎍을 4 내지 20%의 트리스 글리신 겔 (인비트로겐(Invitrogen))에 로딩하였다. 150의 전압을 1시간 25분 동안 상기 겔에 인가하였다. 완료시에, 상기 겔을 쿠마시(Coomassie) R-250 염색 용액을 이용하여 30분 동안 염색시켰다. 30분 동안 탈염색 용액을 사용하여 여분의 스테인을 제거하였다.
결과
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석은, 파브라자임®이 레플라갈®과 비교하여 더 빨리 그리고 트레일링 숄더(trailing shoulder)를 가지고서 용출됨을 나타낸다 (도 6). 이러한 결과는 파브라자임®이 이질성이고 레플라갈®과 비교하여 더 큰 분자량을 가질 수 있음을 시사한다. 도 7a 내지 도 7b에서의 MALDI-TOF MS 스펙트럼은 파브라자임® 및 레플라갈®에서 관찰되는 주요 종의 m/z 비가 비견됨을 나타낸다. 파브라자임®은 또한 레플라갈®에서 관찰되지 않는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A의 더 낮은 분자량의 종을 함유한다. 도 8에서의 MALDI-TOF MS 스펙트럼은 파브라자임® 및 FZ2G에서 관찰되는 주요 종의 m/z 비가 비견됨을 나타낸다. 파브라자임®은 FZ2G MALDI-TOF MS 스펙트럼에서는 발견되지 않는 더 작은 분자량의 종을 함유한다. 파브라자임® 및 레플라갈®의 SDS-PAGE 이동성은 비견된다. 더 큰 이동성 (더 작은 겉보기 분자량)을 갖는 소수의 종이 파브라자임®에서 관찰되지만, 레플라갈®에서는 관찰되지 않는다 (도 9).
글리코실화 프로파일
파브라자임®, 레플라갈®, 및 FZ2G의 N-결합된 글리코실화 프로파일을 2-안트라닐산(AA)-유도체화 및 정상 액체 크로마토그래피를 이용하여 형광 검출을 이용하여 결정하였으며, 이는 일반적으로 문헌[Kamoda et al., J. Chromatography A 1133:332-339, 2006]에 기술된 바와 같다.
부위-특이적 글리칸 분석
파브라자임®, 레플라갈®, 및 FZ2G의 부위-특이적 글리코실화 분석을 액체 크로마톡그래피 시스템 (나노어퀴티 엘씨(nanoAcquity LC), 워터스(Waters))과 결합된 하이브리드 선형 이온 트랩-오비트랩(Orbitrap) 질량 분광계 (LTQ-오비트랩, 서모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 수행하였다. 이 절차에서, 먼저 100 ㎍의 단백질을 디티올트레이톨로 환원시키고 그 후 요오도아세트산으로 알킬화함으로써 효소 분해물을 제조하였다. 후속적으로, 샘플을 바이오스핀30(Biospin30) 컬럼 (바이오-라드(Bio-Rad))을 이용하여 트리스-Cl (pH 8.0)로 교환해서 넣고, 이어서 엔도프로테이나아제 Lys-C를 이용하여 18시간 분해하고 트립신을 이용하여 2시간 분해하였다. 포름산으로 희석시켜 상기 분해물을 켄칭한 후, 200 ng의 각각의 샘플 분해물을 75 ㎛ x 10 cm C-18 컬럼 (피코프릿(Picofrit), 뉴 옵젝티브즈(New Objectives))에 주입하였다. 펩티드를 0.1% 포름산 중 2 내지 95% 아세토니트릴의 계단식 구배에서 용출시켰다. m/z 범위를 톱 5 강도 데이터 의존성 CID 스캔을 이용하여 60,000의 해상도에서 FTMS에 의해 325-1800으로부터 스캐닝하였다. MS 데이터를 정량화를 위하여 리파이너MS(RefinerMS) V 7.6 소프트웨어 (진데이터(Genedata))를 사용하여 적분하여 가공하고, CID 스펙트럼을 글리코형 조성의 확인을 위하여 수집하였다.
결과
도 10은 파브라자임® AA-유도체화 N-결합 올리고당류의 전형적인 크로마토그램을 나타내는데, 이는 피크 각각에 존재하는 N-결합된 올리고당의 특정 유형을 보여 준다. AA-표지된 글리칸 프로파일에서 관찰되는 글리칸 종의 아이덴티티(identity)를 LCMS 분석에 의해 결정하였다. 파브라자임® 및 레플라갈®에 있어서 AA-유도체화 N-결합 올리고당류의 상이한 유형의 용출을 나타내는 크로마토그램이 도 11에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 레플라갈®에 있어서 N-결합된 올리고당의 각각의 유형에 상응하는 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 도 12에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 레플라갈®의 Asn108, Asn161, 및 Asn184에서 관찰되는 각각의 글리칸 종의 상대적인 백분율이 각각 도 13, 도 14 및 도 15에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 FZ2G의 Asn108, Asn161, 및 Asn184에서 관찰되는 각각의 글리칸 종의 상대적인 백분율이 각각 도 16 및 도 17과, 도 18 및 도 19에 예시되어 있다.
파브라자임® 및 FZ2G의 AA-표지된 프로파일이 도 20에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 중성으로 하전된 올리고당류 (피크 1), 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 2), 및 모노시알릴화 올리고당류 (피크 3)에 상응하는 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 도 21a 내지 도 21c에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 바이시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 4), 바이시알릴화 올리고당류 (피크 5), 및 제1형의, 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (피크 6)에 상응하는 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 도 22a 내지 도 22c에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 제2형의, 3-안테나형, 트리시알릴화 올리고당류 (피크 6'), 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 7), 및 모노포스포릴화 올리고당류 (피크 8)에 상응하는 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 도 23a 내지 도 23c에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 FZ2G에 있어서 테트라시알릴화 올리고당류 (피크 9), 모노시알릴화 또는 모노포스포릴화 올리고당류 (피크 10), 및 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 11)에 상응하는 전체 N-결합 올리고당류의 백분율이 도 24a 내지 도 24c에 예시되어 있다.
이러한 데이터는 현재 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)이 파브라자임®과 비교하여 실질적으로 상이한 글리코실화 패턴을 가짐을 나타낸다. 예를 들어, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)은 하기를 갖는다: 파브라자임®보다 더 작은, 중성으로 하전된 올리고당류 (피크 1)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 작은, 모노시알릴화 푸코스-함유 올리고당류 (피크 2)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®과 대략 동일하거나 파브라자임®보다 더 작은, 만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 7)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 큰, 모노포스포릴화 올리고당류 (피크 8)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 큰, 테트라시알릴화 올리고당류 (피크 9)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 파브라자임®보다 더 큰, 모노시알릴화된 그리고 모노포스포릴화된 (피크 10)전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및 파브라자임®보다 더 큰, 비스-만노스-6-포스페이트 올리고당류 (피크 11)인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율. (예를 들어, 파브라자임®과 비교하여) 본원에 기술된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 변경된 글리코실화 패턴은 몇몇 이점, 예를 들어 하기 중 1가지 이상을 제공한다: 파브라자임®과 비교하여, (재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질을 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여한 후 간세포의 표면 상에서 발현되는 비시알산당단백질 수용체에 결합하는 것의 감소에 의한) 간에의 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질-A의 비특이적 표적화의 감소, 그 표면 상에 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포 (예를 들어, 인간 세포)에 의한 재조합 인간 α-갈락토시다아제 단백질의 엔도사이토시스의 속도의 증가, 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질에 대한 친화성의 증가, 및 혈청중 반감기의 증가.
단백질에 대한 만노스 -6- 포스페이트 및 N- 아세틸뉴라민산의 비
추가의 실험 세트를 수행하여, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G) 및 파브라자임®에 있어서 단백질에 대한 만노스-6-포스페이트의 몰비 및 단백질에 대한 N-아세틸뉴라민산의 몰비를 결정하였다.
데이터는 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)이 파브라자임®과 대략 동일한 단백질에 대한 만노스-6-포스페이트의 몰비, 및 파브라자임®과 비교하여 단백질에 대한 N-아세틸뉴라민산의 상승된 몰비를 가짐을 나타낸다 (도 25a 내지 도 25b).
등전점
영상화 모세관 등전 집중(icIEF)을 이용하여 각각의 테스트된 단백질의 단백질 전하를 평가하였다. 파브라자임® 및 레플라갈®의 일렉트로페로그램(electropherogram)이 도 31에 예시되어 있다. 일렉트로페로그램의 저, 중 및 고 pI 범위의 상대적인 백분율을 본원에 제공된 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G) 및 파브라자임®에 대하여 결정하였으며, 이를 도 32a 내지 도 32c에 나타낸다.
역상 크로마토그래피
또 다른 실험 세트에서, 파브라자임® 및 레플라갈®을 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 분석하였다. 샘플을 YMC 옥틸 컬럼 (워터스, 2.0 x 100 mm)에 주입하고, 선형 TFA/아세토니트릴 구배를 이용하여 0.25 mL/분의 유량으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 215 nm에서 검출하였다. 분석을 애질런트 1200 HPLC를 사용하여 수행하였다.
데이터는 레플라갈®이 파브라자임®보다 더 이른 시점에 RP-HPLC 컬럼으로부터 용출됨을 나타낸다 (도 35).
실시예 4. 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A의 기능적 특성화
양이온- 비의존성 만노스 -6- 포스페이트 수용체-결합 활성
비아코어(Biacore) 실험 세트를 수행하여 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질, 파브라자임®, 및 레플라갈®이 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체(CIMPR)에 결합하는 능력을 테스트하였다.
파브라자임® 및 레플라갈®의 비아코어 센서그램(sensorgram)이 도 26에 예시되어 있다. 파브라자임® 및 레플라갈®의 이러한 센서그램으로부터의 결합 곡선이 도 27에 예시되어 있다. 본원에 제공된 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G) 및 파브라자임®의 CIMPR-결합 활성을 요약한 그래프가 도 28에 예시되어 있다. 이들 데이터의 비교는, 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)이 파브라자임®과 비교하여 증가된 CIMPR-결합 활성을 가짐을 나타낸다.
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G), 파브라자임®, 및 레플라갈®이 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합하는 능력을 친화성 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 또한 테스트하였다. 만노스-6-포스페이트 수용체 컬럼을 만노스-6-포스페이트를 이용하여 계단식으로 용출시켰으며, 각각의 용출 분획 중의, 상기 컬럼으로부터 용출된 전체 로딩 재조합 단백질의 백분율이 도 29 및 도 30에 예시되어 있다. 데이터는, 본원에 제공된 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)이 파브라자임® 및 레플라갈®과 비교하여 미결합 종의 상대적인 백분율이 더 낮고 고 친화성 종의 백분율이 더 높음을 나타낸다.
K m 및 V max
본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G) 및 파브라자임®의 Km 및 Vmax를 또한 결정하였다.
데이터는 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)이 파브라자임®과 비교하여 감소되거나 대략 동일한 Km을 가지며 (도 33) 파브라자임®과 비교하여 대략 동일하거나 약간 감소된 Vmax를 가짐을 나타낸다 (도 34).
요컨대, 본원에 제공된 데이터는 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)이 파브라자임®과 비교하여 변경된 글리코실화 패턴 및 개선된 만노스-6-포스페이트 수용체-결합 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 5. 동물 연구
2가지의 동물 모델 연구를 수행하여 GL-3 제거성 및 약동학적 파라미터에 대한 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질의 영향을 평가하였다.
파브리 마우스에서 0.1 mg/kg 및 1 mg/kg으로 단회 정맥내 (IV) 투여한 후 조직 GL-3 제거성에 대한 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질 (파브라자임®과 비교하여)의 영향을 조사하기 위하여 첫 번째 연구를 행하였다. 이 연구에서, 90마리의 파브리 마우스 (46M/44F)를 5개의 군으로 나누었다 (하기 표 2 참조). 군 1 (n=10, 6M/4F)의 동물에게 단회 IV 용량의 비히클을 투여하였다. 군 2 및 군 3 (군당 n=20, 10M/10F)의 동물에게 단회 IV 용량의 파브라자임®을 각각 0.1 mg/kg 및 1.0 mg/kg으로 투여하였다. 군 4 및 군 5 (군당 n=20, 10M/10F)의 동물에게 단회 IV 투약의, 본원에 제공된 인간 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)을 각각 0.1 mg/kg 및 1.0 mg/kg으로 투여하였다. 군 6 (n=1M)의 야생형 동물을 처리하지 않았으며, 이는 GL-3 보정을 위한 대조구로서의 역할을 하였다. 동물을 투약한지 3일 후 (군 2 내지 5, n=10, 군당 5M/5F) 및 투약한지 14일 후 (군 1 및 군 2 내지 5, n=10, 군당 5M/5F) 안락사시켰다. 하기 조직에서 GL-3 분석을 행하였다: 심장 및 신장 (군 1, 3 및 5), 및 비장 및 간 (군 1, 2 및 4).
Figure 112016048405574-pct00002
이 실시예에서 설명한 동물 연구에서 파브리 마우스에 투여한 본원에 제공된 재조합 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 기능적 및 구조적 특성 중 일부에 대한 요약이 하기 표 3에 제공되어 있다.
이 데이터는, 파브리병의 마우스 모델에서 간, 비장, 심장 및 신장에서의 GL-3의 축적의 유사한 감소가 단회 용량의 파브라자임® 또는 단회 용량의 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 정맥내 투여 후 달성됨을 나타낸다 (각각 도 36, 도 37, 도 38, 및 도 39 참조). 요컨대, 데이터는 파브라자임®의 단회 용량의 정맥내 투여 또는 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 단회 용량의 정맥내 투여 후 파브리병의 마우스 모델에서 GL-3의 제거성에 있어서 통계적으로 유의한 차이가 전혀 없음을 나타낸다.
Figure 112016048405574-pct00003
단회 1 mg/kg (IV) 투여 후 파브리 마우스에서 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 약동학적 파라미터를 특성화하고 비교하기 위하여 두 번째 연구를 행하였다. 이 연구에서, 20마리의 파브리 마우스 (12M/8F)를 2개의 군으로 나눈다 (하기 표 4 참조). 군 1 및 군 2 (군당 n=10, 6M/4F)의 동물에게 단회 IV 용량의 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)를 각각 1.0 mg/kg으로 투여한다. 혈액 샘플을 건조된 혈액 스폿에서의 효소 분석을 위하여 투약 후 2, 15, 30, 60, 120, 240, 및 480분에 수집한다. 푀닉스 윈논린(Phoenix WinNonlin)® (파르사이트 코포레이션(Pharsight Corporation), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 약동학적 분석을 행한다.
Figure 112016048405574-pct00004
데이터는 분석한 시점에서의 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 약동학적 특성 (도 40)이 유사함을 나타낸다. 샘플을 건조된 혈액 스폿으로서 수집함에 따라 효소 활성을 각각의 시점에서 계산하였으며, 농도는 그렇게 하지 않았다. 요컨대, 데이터는 분석한 시점에서 파브라자임® 및 본원에 제공된 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A 단백질(FZ2G)의 단회 정맥내 투여 후 효소들 간의 유사한 효소 활성을 나타낸다.
기타 실시 양태
본 발명을 이의 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]과 함께 설명하였지만, 전술한 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 본 발명의 범주를 예시하고자 하는 것이지 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아님을 이해해야 하는데, 이는 첨부된 청구 범위의 범주에 의해 정의된다. 기타 측면, 이점 및 변형이 하기 청구 범위의 범주 내이다.
SEQUENCE LISTING <110> Genzyme Corporation <120> Recombinant Glycoprotein and Uses Thereof <130> 37488-0005WO1 <150> 61/894,879 <151> 2013-10-23 <150> 61/901,942 <151> 2013-11-08 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60 ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180 gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240 tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300 gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360 gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420 acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480 gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540 gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600 tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660 cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720 agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780 ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840 gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900 cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960 caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020 gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080 ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140 gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200 tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260 atgcagatgt cattaaaaga cttactt 1287 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 3 <211> 398 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp 1 5 10 15 Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys 20 25 30 Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln 65 70 75 80 Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys 180 185 190 Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile 195 200 205 Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly 225 230 235 240 Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp 245 250 255 Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile 260 265 270 Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile 275 280 285 Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe 340 345 350 Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395

Claims (109)

  1. 9% 초과인, 비스-만노스-6-포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율; 및
    1.8% 내지 3.0%인, 만노스-6-포스페이트 대 단백질의 몰/몰 비를 포함하는 재조합 인간 α-갈락토시다아제-A(rhAGA) 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 14.8% 초과인, 모노포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 추가로 포함하는 rhAGA 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 4.9% 초과인, 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 추가로 포함하는 rhAGA 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 4.9% 초과인, 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 추가로 포함하는 rhAGA 단백질.
  5. 제2항에 있어서, 16% 초과인, 모노포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는 rhAGA 단백질.
  6. 제3항에 있어서, 6% 초과인, 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는 rhAGA 단백질.
  7. 제4항에 있어서, 6% 초과인, 테트라시알릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 갖는 rhAGA 단백질.
  8. ◈청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제1항에 있어서, 하기의 특성 중 1가지 또는 이들 2가지 모두를 갖는 rhAGA 단백질:
    (i) 파브라자임(Fabrazyme)®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)의 증가; 및
    (ii) 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질에 대한 친화성의 증가.
  9. ◈청구항 9은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제8항에 있어서, 하기를 갖는 rhAGA 단백질:
    (i) 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의한 엔도사이토시스의 증가; 및
    (ii) 파브라자임®과 비교하여 만노스-6-포스페이트 수용체 단백질에 대한 친화성의 증가.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 rhAGA 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 파브리병(Fabry disease)을 치료하기 위한 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내 투여용으로 제형화된 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 4 mg/mL 내지 6 mg/mL의 농도의 rhAGA를 포함하는 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 5 mg/mL의 농도의 rhAGA를 포함하는 제약 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 살균, 동결건조 산제인 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 제약상 허용가능한 담체는 만니톨, 제1인산나트륨 1수화물, 및 제2인산나트륨 7수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 에이전트인 제약 조성물.
  16. 제10항에 있어서, rhAGA 단백질의 치료적 유효량을 포함하는, 파브리병을 갖는 대상체에게 투여되는, 파브리병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  17. (a) 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 제공하는 단계:
    (i) CHO DXB11 세포주를 제공하고;
    (ii) CHO DXB11 세포주를 연속적으로
    5% 소 태아 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 3일 내지 5일 배양하고,
    2.5% 소 태아 혈청을 포함하는 세포 배양 배지에서 3일 내지 5일 배양하고,
    동물 혈청을 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 5일 내지 10일 배양하고;
    (iii) 상기 (ii)로부터 생성된 CHO 세포로부터 단일-세포 클론을 생성하되,
    상기 단일-세포 클론은 적색 형광 단백질(RFP)로 형질감염 시켰을 때 형질감염 효율이 30% 초과의 RFP 양성이고, 무혈청 배양 배지에서 배가시간이 35시간 미만이고, 배양 생존성이 75% 초과이고, 또한 상기 단일-세포 클론이 무단백질, 동물 유래 성분 무함유 배지에서 자라는 것이며;
    (b) rhAGA 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터로 상기 (iii)으로부터의 단일-세포 클론을 안정적으로 형질감염시키는 단계;
    (c) rhAGA를 생산하는 클론을 선발하는 단계;
    (d) 무단백질, 동물 유래 성분 무함유 배지에서 클론을 배양하는 단계; 및
    (e) CHO 세포로부터 rhAGA 단백질을 수확하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 rhAGA 단백질이며,
    여기서 rhAGA 단백질은 9% 초과인 비스-만노스-6-포스포릴화 올리고당류인 전체 N-결합 올리고당류의 백분율을 포함하는 것인, rhAGA 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 당단백을 코딩하는 서열이 서열 번호 1과 90% 이상 동일한 rhAGA 단백질.
  19. 제17항 또는 제18항의 rhAGA 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 파브리병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내 투여용으로 제형화된 제약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 4 mg/mL 내지 6 mg/mL의 농도의 rhAGA 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 5 mg/mL의 농도의 rhAGA 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 살균, 동결건조 산제인 제약 조성물.
  24. 제19항에 있어서, rhAGA 단백질의 치료적 유효량을 포함하는, 파브리병을 갖는 대상체에게 투여되는, 파브리병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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