EA023700B1

EA023700B1 - Cd127-связывающие белки

Info

Publication number: EA023700B1
Application number: EA201290589A
Authority: EA
Inventors: Айан Керби; Александр Х. Тейлор; Томас Мэттью Уэбб; Юй Сюэ
Original assignee: Глаксо Груп Лимитед
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2016-07-29
Also published as: CA2787070A1; EP2528947A2; US8940303B2; US20120282254A1; WO2011094259A3; JP5850860B2; CN102812046B; NZ601271A; IL220899A; SG182590A1; PE20170687A1; US9150653B2; KR20130028055A; UA104663C2; CN102812046A; IL220899A0; TW201136607A; JP2013517799A; EP2528947A4; ZA201205624B

Abstract

В изобретении предложены антигенсвязывающие белки, которые связываются с человеческим рецептором IL-7 (CD127). Антигенсвязывающие белки представляют собой типичные антитела и полезны в лечении заболеваний или расстройств у людей, в особенности аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз.

Description

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим белкам, в частности иммуноглобулинам, которые специфически связываются с α-цепью человеческого рецептора ГЬ-7 (С.Н127). Изобретение также относится к способам лечения заболеваний или расстройств с использованием указанных белков, фармацевтическим композициям, содержащим указанные белки, и способам их изготовления. Другие аспекты настоящего изобретения будут понятны из нижеприведенного описания.

Предшествующий уровень техники

Рассеянный склероз (РС) представляет собой хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание, поражающее центральную нервную систему. Полагают, что при РС инфильтрирующие воспалительные иммунокомпетентные клетки вовлечены в деструкцию олигодендроцитов, представляющих собой клетки, обеспечивающие образование и поддержание жирового слоя, известного как миелиновая оболочка. РС приводит к истончению или полной потере миелина. При потере миелина нейроны больше не могут эффективно проводить электрические сигналы, что ведет к многочисленным неврологическим дисфункциям. У индивидов, страдающих от РС, происходит образование аутореактивных Т-клеток, участвующих в формировании воспалительных очагов вдоль миелиновой оболочки нервных волокон. Спинно-мозговая жидкость пациентов, страдающих от активного РС, содержит активированные Тклетки, инфильтрирующие ткань головного мозга и приводящие к характерным воспалительным очагам с разрушением миелина. Несмотря на то что симптомы рассеянного склероза и течение заболевания отличаются у разных людей, существуют три формы заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий РС, вторичный прогрессирующий РС и первичный прогрессирующий РС.

На ранних стадиях РС воспалительные атаки происходят в течение коротких интервалов острого повышения активности заболевания. За этими эпизодами следуют периоды восстановления и ремиссии. В периоде ремиссии происходит рассасывание местного отека в очагах в нервной системе, иммунокомпетентные клетки становятся менее активными или неактивными, и происходит ремиелинизация аксонов клетками, образующими миелин. Проведение сигналов по нервам улучшается, и нетрудоспособность, вызванная воспалением, становится менее тяжелой или полностью исчезает. Эту фазу заболевания называют рецидивирующе-ремиттирующим РС (РРРС). Тем не менее, полного заживления всех очагов не происходит. Некоторые сохраняются в форме хронических очагов, обычно имеющих демиелинизированную центральную область без иммунокомпетентных клеток. С течением времени происходит гибель большей части клеток в центре таких очагов, хотя воспаление часто продолжается на их краях. Возможна хорошая адаптация головного мозга к потере некоторых нейронов, и постоянной нетрудоспособности может не быть на протяжении многих лет. Тем не менее, более 50% пациентов с РС в конечном счете переходят в стадию прогрессивного ухудшения, называемую вторичным прогрессирующим РС (ВПРС). На этой стадии базисные лекарственные средства больше не оказывают эффекта на течение заболевания, и нетрудоспособность пациентов постоянно ухудшается. Разрушение нейронов, начиная с ранних стадий при естественном течении РС, позволяет предположить, что прогрессирующая нетрудоспособность при ВПРС может быть результатом накопленной потери нейронов, которая в конечном счете превышает компенсаторные возможности головного мозга. Первичный прогрессирующий РС представляет собой тип рассеянного склероза без рецидивов, но при котором в течение периода продолжительностью несколько лет происходит постепенная потеря физических и когнитивных функций.

Цель лечения пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом состоит в снижении частоты и тяжести рецидивов (и, посредством этого, предотвращении обострений), а также в предотвращении или задержке начала прогрессирующей фазы заболевания. Для достижения этой цели, особенно раньше, использовали иммуномодулирующие или иммуносупрессивные лекарственные средства, но они никогда не имели широкого признания ввиду ограниченной эффективности и значительной токсичности. Например, были успешно проведены крупные рандомизированные контролируемые исследования с интерфероном бета-1а, интерфероном бета-1Ь и ацетатом глатирамера.

Как измененные аутоиммунные Т-клеточные ответы, так и дисфункция регуляторной сети иммунной системы играют важную роль при аутоиммунных патологических состояниях человека, таких как РС и ревматоидный артрит (Кисйгоо с1 а1., (2002) Алии. Кеу. 1ттипо1. 20:101-123; Зокрейга апй Магйи (2005) Аппи. Кеу. 1ттипо1. 23: 683-747; Той апй Мю88ес (2007) Сигг. Θρίη. Кйеита1о1. 19:284-288).

Несмотря на то что этиология и патогенез РС остаются неизвестными, его обычно рассматривают как аутоиммунное патологическое состояние, при котором, как полагают, аутореактивные Т-клетки, обладающие патогенным потенциалом, такие как Т_н1- и Т_н17-клетки, играют важную роль. Существуют доказательства активации этих эффекторных Т-клеток ш У1уо при развитии заболевания, и ими обусловлено воспаление в центральной нервной системе (ЦНС). Также существуют доказательства того, что эти Т-клетки опосредуют разрушение клеток, экспрессирующих миелин, в очагах при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ) и РС в активной фазе заболевания. С другой стороны, у пациентов с РС присутствует недостаточность регуляторных Т-клеток (Т_гед-клеток), в норме сдерживающих патогенные Т_Н1- и Т_н17-клетки, что также способствует отклонению иммунной системы к провоспалительному состоянию.

Три независимые группы недавно сообщили результаты обширного сканирования генома на пред- 1 023700 мет однонуклеотидных полиморфизмов (8ΝΡ) в общей сложности у 17947 доноров с или без РС. После сканирования 334923 8ΝΡ они обнаружили высокозначимую связь (в целом, р = 2,9 х 10^-7) несинонимичного кодирующего 8ΝΡ в альфа-цепи человеческого рецептора 1Ь-7 (1Ь-7Ка) и восприимчивости к РС. Данный 8ΝΡ соответствует замене Т на С в экзоне 6 СО 127 (также известного как 1Ь-7Ка). Эта замена увеличивает вероятность пропуска экзона 6 при сплайсинге РНК, что приводит к образованию растворимой формы СГО127. Кроме того, экспрессия РНК СЭ127 и 1Ь-7 в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) пациентов с РС существенно выше, чем в СМЖ пациентов с другими неврологическими расстройствами.

Известно, что 1Ь-7 и рецептор 1Ь-7 (1Ь-7К) играют важную роль в развитии и гомеостазе Т-клеток и В-клеток, главным образом в тимусе. Действительно, клетки стромы тимуса, фетальный тимус и костный мозг являются местами образования 1Ь-7. Рецептор 1Ь-7 состоит из двух субъединиц, СГО127 и общей цепи (гамма-цепи или ус), общей для рецепторов интерлейкина-2 (1Ь-2), интерлейкина-4 (1Ь-4), интерлейкина-9 (1Ь-9), интерлейкина-15 (1Ь-15) и интерлейкина-21 (1Ь-21).

СЭ127 также известен как альфа-рецептор ГО-7 (1Ь-7Ка) и р90 1Ь-7К. Человеческий СЭ127 (регистрационный номер 8\υι55-ΡιόΙ Ρ16871) имеет в общей сложности 459 аминокислот (20 в сигнальной последовательности). Он содержит внеклеточную область из 219 аминокислот, трансмембранную область из 25 аминокислот и внутриклеточную область из 195 аминокислот. Нумерация остатков в СИ 127, как она использована здесь (например, для описания эпитопов антител), основана на полноразмерном белке, включая остатки сигнальной последовательности. С.П127 может существовать в четырех изоформах, изоформа Н20 (регистрационный номер 8γίδδρΓ0ΐ Ρ16871-1) имеет следующую аминокислотную последовательность (включая сигнальную последовательность).

мти-стгрсм урзи-сотзе ΕδΟΥΑΟΝΟβί еоаеюэузр зсузоьеумс зонз1_тсаре ΟΡϋνΝΤΤΝΙ_Ε ΡΕΙΟΟΑΙ,νΕν КСЬИРРКеОЕ ΙΥΠΕΤΚΚΓί Ι.Ι0Κ5ΝΙ0νΚ УСЕКЗЬТСКК Ю1_ТТ17КРЕ ΑΡΡϋΙ-3νΐΥΡ ΕΟΑΝϋΡννΤΡ ΝΤ3ΗΙ_0ΚΚΥν ΚνίΜΗϋνΑΥΡ ΟΕΚΟΕΝΚννΤΗ νΝΙ_55ΤΚΙ_ΤΙ_ ЮРКЬОРААМ ΥΕΙΚνΡδΙΡϋ ΗΥΡΚΟΡΜοΕΜ 5Ρ3ΥΥΡΡΤΡΕ ΙΝΝ350ΕΜϋΡ ШТ13ИЗР РЗУАНУНА С71ЭЛ/ККР1КР ΐνννΡδίΡΟΗΚ КТ1_ЕН|_СККР ΡΚΝΙΝνδΡΝΡ ЕЗРЮСО1НР νϋΟΙΟΑΡΟΕν ΕΟΡΙ_ΟϋΤΡΡΟ ΟΙ.ΕΕ5ΕΚΟΡΙ. ССОУОЗРЫСР 3ΕϋνννΤΡΕ3 РеРВЗЗЬТСЬ ΑΟΝνεΑΟϋΑΡ 11.555Н51-0С ΡΕ56ΚΝ6ΡΗν УСВ1_1_1_31_еТ ΤΝ3ΤδΡΡΡΡ3 Ι_Ο5ΟΙΙ_ΤΙ_ΝΡ νΑΟΟΟΡΙΙ_Τ3 Ι_<33ΝΟΕΕΑΥν ΤΜ53ΡΥ0Ν0 (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)

СЭ127 также обнаружен в рецепторе лимфопоэтина стромы тимуса (Т8ЬР). Рецептор Т8ЬР представляет собой гетеродимер СИ 127 и фактора 2, подобного рецепторам цитокинов (СКЬР2, су!окше гессрЮг-Пкс £ас1ог 2).

Связывание 1Ь-7 с 1Ь-7К активирует множество сигнальных метаболических путей, включая активацию Янус-киназ (ΙΆΚ-киназ) 1 и 3, что приводит к фосфорилированию и активации трансдуктора сигналов и активатора транскрипции 5 (8ТАТ-5). Этот метаболический путь является ключевым для выживания развивающихся в тимусе предшественников Т-клеток, поскольку активация 8ТАТ-5 необходима для индукции антиапоптотического белка Вс1-2 и предотвращения проникновения проапоптотического белка Вах в митохондрии. Другим опосредованным 1Ь-7К метаболическим путем является активация фосфатидилинозитол-3-киназы (Р13-киназы), приводящая к фосфорилированию проапоптотического белка Ваб и его накоплению в цитоплазме. Экспрессия С.П127 происходит в покоящихся периферических Т-клетках и Т-клетках памяти. Механизм регуляции выживания и гомеостаза Т-клеток посредством 1Ь-7 и источник 1Ь-7 на периферии не полностью ясны. Кроме того, его возможная роль в дифференцировке и функционировании патогенных Т-клеток при аутоиммунном заболевании мало изучена и в значительной степени неизвестна. Существует несколько сообщений, позволяющих предположить, что 1Ь-7 может способствовать патогенезу аутоиммунных заболеваний.

Недавно Ьш и коллеги (Ыи е! а1., (2010) №1иге Мебюше 16:191-197) описали роль 1Ь-7 в выживании и росте Т_Н17. Мышиные антитела против С.П127 (включающие антитела против С.П127 1А11 и 6А3) и их роль в лечении РС и других аутоиммунных заболеваний описаны в заявке РСТ № РСТ/и82009/053136.

Желательно выделить и разработать дополнительные моноклональные антитела, которые связываются с и/или ингибируют биологическое действие человеческого С.П127. Такие антитела могут быть терапевтически полезны в лечении РС и других воспалительных и аутоиммунных заболеваний и расстройств, особенно заболеваний и расстройств, в которые вовлечены патогенные клетки ТН17.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении предложены антигенсвязывающие белки, которые специфически связываются с С.П127. Антигенсвязывающие белки могут быть использованы в терапевтических способах, в частности в лечении или предотвращении заболеваний, в которые вовлечены патогенные клетки Т_н17. Антигенсвязывающие белки могут связываться с С.П127 и ингибировать, например нейтрализовать, биологическую функцию СЭ127.

В первом аспекте изобретения предложены антигенсвязывающие белки, такие как антитела, которые содержат от одного до шести из следующих гипервариабельных участков или их вариантов:

(1) СПРН1, как указано в 8ЕО ГО N0:2, (2) СГОВН2. как указано в 8Е0 ГО N0:3, (3) СПРН3, как указано в 8ЕО ГО N0:4 или в любой из 8ЕО ГО Ν0:132-8Ερ ΙΌ N0:137,

- 2 023700 (4) СГОКЕЕ как указано в 8Еф ГО N0:5, (5) СОКЬ2, как указано в 8Еф ГО N0:6, (6) СОКЬ3, как указано в 8Еф ГО N0:7.

В еще одном аспекте изобретения предложены антигенсвязывающие белки, такие как антитела, которые содержат от одного до шести из следующих гипервариабельных участков или их вариантов:

(1) СОКН1, как указано в 8ЕО ГО N0:39, (2) СОКН2, как указано в 8Еф ГО N0:40, (3) СГОК11.Έ как указано в 8ЕО ГО N0:41, (4) СГОКЕЕ как указано в 8Еф ГО N0:42, (5) СГОКЕ® как указано в 8Еф ГО N0:43, (6) СПКЬ3, как указано в 8Еф ГО N0:44.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, возможно химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Антитело может содержать один или более чем один СОК (гипервариабельный участок) (из 8Еф ГО N0:2-7 или 39-44 из донорного антитела) в скелете акцепторного антитела. Скелет акцепторного антитела может представлять собой человеческое антитело.

В одном аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:

(1) СЭКН1, как указано в 8Еф ГО N0:2, (2) СЭКН2, как указано в 8Еф ГО N0:3, (3) СЭКН3, как указано в 8ЕО ГО N0:4 или в любой из 8ЕО ГО Ы0:132-8Еф ГО N0:137, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 66, остатка фенилаланина, метионина, изолейцина, лейцина или валина в положении 69, и остатка валина, аргинина, аланина или лейцина в положении 71 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация в соответствии с Кабат).

В одном воплощении гуманизированное антитело содержит лейцин в положении 69. В одном воплощении гуманизированное антитело содержит валин в положении 71. В одном воплощении гуманизированное антитело содержит лейцин в положении 69 и валин в положении 71. В одном воплощении гуманизированное антитело содержит лизин в положении 66, лейцин в положении 69 и валин в положении 71. За исключением вышеупомянутых точечных мутаций, вариабельная область тяжелой цепи может иметь последовательность скелетной человеческой генеративной вариабельной области. Например, в одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи происходит из ЮНУ1_2 человеческой скелетной области (8ЕО ГО N0:116).

Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложено антитело, содержащее один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:

(1) СЭКН1, как указано в 8Еф ГО N0:2, (2) СЭКН2, как указано в 8Еф ГО N0:3, (3) СЭКН3, как указано в 8ЕО ГО N0:4 или в любой из 8ЕО ГО К0:132-8Еф ГО N0:137, в скелетной области У_Н, где скелетная область У_Н происходит из человеческой генеративной скелетной области У_Н и содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 66, остатка фенилаланина, метионина, изолейцина, лейцина или валина в положении 69, и остатка валина, аргинина, аланина или лейцина в положении 71 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация в соответствии с Кабат). В одном воплощении человеческая скелетная область У_Н представляет собой человеческую скелетную область ЮНУ1_2(8Еф ГО N0:116).

Антитело по изобретению может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую СГОК111 (8ЕО ГО N0:2) и СГОКЮ (8ЕО ГО N0:4); СГОК112 (8ЕО ГО N0:3) и СГОКЮ (8ЕО ГО N0:4); СГОК111 (8ЕО ГО N0:2) и СГОКН2 (8ЕО ГО N0:3); или СГОКН1 (8ЕО ГО N0:2), СГОК112 (8ЕО ГО N0:3) и СГОКН3 (8Еф ГО N0:4). Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи любой из 8Еф ГО N0:10-17 (с 1А11.Н0 У_Н по 1А11.Н7 У_Н). В одном воплощении гуманизированное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи 8Еф ГО N0:13 (1А11.Н3 У_Н). В любом из этих воплощений СГОКН3 с 8Еф ГО N0:4 может быть замещен СЭКН3, как указано в любой из 8Еф ГО ®0:132-8ЕО ГО N0:137. Альтернативно, вариабельная область тяжелой цепи с 8Еф ГО N0:13 может содержать одну или более чем одну замену, выбранную из N980, №8Е, Р100ЬЕ, Р100ЬН, Р100Ы и Р100ЬУ (Кабат). В еще одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131. В одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи образует пару с вариабельной областью легкой цепи 8Еф ГО N0:16.

В настоящем изобретении также предложено антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:

(1) СГОКЕЕ как указано в 8Еф ГО N0:5, (2) СНКЕ2, как указано в 8Еф ГО N0:6, (3) СНКЕ3, как указано в 8Еф ГО N0:7, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 45,

- 3 023700 остатка пролина в положении 46, остатка триптофана в положении 47, остатка валина в положении 58, остатка валина в положении 60, остатка серина в положении 70, и остатка тирозина или фенилаланина в положении 71 вариабельной области легкой цепи (нумерация в соответствии с Кабат).

В одном воплощении антитело содержит остаток пролина в положении 46. В одном воплощении антитело содержит остаток тирозина в положении 71. В одном воплощении антитело содержит остаток пролина в положении 46 и остаток тирозина в положении 71.

Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую СОВЫ (8ЕО ГО N0:5) и СОВЬ3 (8ЕС ГО N0:7); СОВЬ2 (8ЕС ГО N0:6) и С0ВЬ3 (8ЕС ГО N0:7); СОВЫ (8ЕС ГО N0:5) и С0ВЬ2 (8ЕС ГО N0:6); или СОВЫ (8ЕС ГО N0:5), СОВЬ2 (8ЕС ГО N0:6) и СОВЬ3 (8ЕС ГО N0:7). Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи любой из 8Е0 ГО N0:18-27 (с 1Л11.Ь0 ν_κпо 1Л11.Ь9 ν_κ). В одном воплощении антитело содержит вариабельную область легкой цепи с 8Е0 ГО N0:22 (1А11.Ы ν_κ).

В еще одном аспекте изобретения предложено антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:

(1) СОВН1, как указано в 8Е0 ГО N0:2, (2) СОВН2, как указано в 8Е0 ГО N0:3, (3) СОВН3, как указано в 8ЕС ГО N0:4 или в любом из 8ЕС ГО N0:132^0 ГО N0:137, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 66, остатка фенилаланина, метионина, изолейцина, лейцина или валина в положении 69 и валина, аргинина, аланина или лейцина в положении 71 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация в соответствии с Кабат);

и вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:

(1) СОВЫ, как указано в 8Е0 ГО N0:5, (2) СОВЕ2, как указано в 8Е0 ГО N0:6, (3) СОВЕ3, как указано в 8Е0 ГО N0:7, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: остатка лизина в положении 45, остатка пролина в положении 46, остатка триптофана в положении 47, остатка валина в положении 58, остатка валина в положении 60, остатка серина в положении 70 и остатка тирозина или фенилаланина в положении 71 вариабельной области легкой цепи (нумерация в соответствии с Кабат).

Антитело может содержать любую комбинацию СОВН1, С0ВН2, СОВН3, СОВЫ, СОВЕ2 и СОВЕ3, включающую от одного СЭВ тяжелой цепи и одного СЭВ легкой цепи, до всех шести указанных СЭВ (т.е. все 3 СЭВ тяжелой цепи и 3 СЭВ легкой цепи). В одном воплощении антитело содержит все шесть из СОВН1, СОВН2, СОВН3, СИНЕЕ СИ1В.2 и СОВЫ.

В одном из воплощений антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:

(1) С0ВН1, как указано в 8Е0 ГО N0:2, (2) С0ВН2, как указано в 8Е0 ГО N0:3, (3) С0ВН3, как указано в 8ЕС ГО N0:4 или в любом из 8ЕС ГО N0:133^0 ГО N0:138, и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:

(1) СОВЫ, как указано в 8Е0 ГО N0:5, (2) С0ВЬ2, как указано в 8Е0 ГО N0:6, (3) С0ВЬ3, как указано в 8Е0 ГО N0:7, где антитело дополнительно содержит остаток лейцина в положении 69 вариабельной области тяжелой цепи и остаток пролина в положении 46 вариабельной области легкой цепи.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:13 (1А11.Н3 УА или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:13, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из 8Е0 ГО N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:22 (1Л11.Ь4 ν_κ) или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:22.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:114 или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:114 или 8Е0 ГО N0:118. В конкретных воплощениях тяжелая цепь содержит одну или более чем одну замену, выбранную из N980, №98Е, Р100ЬЕ, Р100ЬН, Р100Ы и Р100ЬУ (Кабат). В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО

- 4 023700

N0:115 или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности §Е0 ГО N0:115. В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность §Е0 ГО N0:114 или 118, или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности §Е0 ГО N0:114 или 118, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность §Е0 ГО N0:115 или аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности §Е0 ГО N0:115. Конкретное воплощение содержит антигенсвязывающий белок, имеющий аминокислотную последовательность тяжелой цепи §Е0 ГО N0:118 и аминокислотную последовательность легкой цепи §Е0 ГО N0:115.

В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, который содержит одну или более чем одну из:

(1) 0ΌΚΗ1, как указано в §Е0 ГО N0:2, или вариант этого СОК, (2) СГОКН2. как указано в §Е0 ГО N0:3, или вариант этого СОК, (3) СГОКНЗ, как указано в §Е0 ГО N0:4, или вариант этого СОК, или СГОКНЗ, как указано в любой из §ЕО ГО Ы0:132-§Ер ГО N0:137, (4) СОКЫ, как указано в 8Е0 ГО N0:5, или вариант этого СОК, (5) СПКЬ2, как указано в 8Е0 ГО N0:6, или вариант этого СОК, (6) СГОРЕЗ, как указано в 8Е0 ГО N0:7, или вариант этого СОК, дополнительно содержащий скелетную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере один из следующих остатков:

(а) Уа1, 11е или 01у в положении 2, (б) Ьеи или Уа1 в положении 4, (в) Ьеи, 11е, Ме! или Уа1 в положении 20, (г) Сук в положении 22, (д) ТЬг, А1а, Уа1, 01у или §ег в положении 24, (е) 01у в положении 26, (ж) Тгр или Туг в положении 47, (з) 11е, Ме!, Уа1 или Ьеи в положении 48, (и) 11е, Ьеи, РЬе, Ме! или Уа1 в положении 69, (к) Агд, Уа1, А1а или Ьеи в положении 71, (л) А1а, Ьеи, Уа1, Туг или РЬе в положении 78, (м) Ьеи или Ме! в положении 80, (н) Туг или РЬе в положении 90, (о) Сук в положении 92, (п) Агд, Ьук, 01у, §ег, Ηίκ или Акп в положении 94, и/или скелетную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере один из следующих остатков:

(р) 11е в положении 2, (с) Ьеи в положении 4, (т) Сук в положении 23, (у) Тгр в положении 35, (ф) Туг в положении 36, (х) Туг или РЬе в положении 71, (ц) Сук в положении 88, (ч) РЬе в положении 98, где антигенсвязывающий белок способен связываться с СГО127.

Антигенсвязывающий белок может содержать любую комбинацию СЭКН1, СЭКН2, СЭКН3, СОКЫ, СОКЬ2 и СПКЬ3, включающую от одного СОК до шести из указанных СОК (§Е0 ГО N0:2-7). В одном из воплощений антигенсвязывающий белок содержит все шесть из указанных СОК (§Е0 ГО N0:27).

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит как области скелетной области тяжелой цепи, так и скелетной области легкой цепи, как описано выше.

В одном воплощении, антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, возможно гуманизированное или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.

Один или более чем один вариант СОК этого аспекта по изобретению может содержать:

(а) вариант СПКН1 (§ЕО ГО N0:2), где:

1) остаток тирозина в положении 32 заменен на изолейцин, гистидин, фенилаланин, треонин, аспарагин, цистеин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту;

2) остаток треонина в положении 33 заменен на тирозин, аланин, триптофан, глицин, лейцин или

- 5 023700 валин;

3) остаток метионина в положении 34 заменен на изолейцин, валин или триптофан и/или

4) остаток аспарагина в положении 35 заменен на гистидин, глутаминовую кислоту, глутамин, серин, тирозин или треонин;

(б) вариант С1Ж112 (81У) ГО N0:3), где:

1) остаток лейцина в положении 50 заменен на аргинин, глутаминовую кислоту, триптофан, тирозин, глицин, глутамин, валин, аспарагин, лизин или аланин;

2) остаток изолейцина в положении 51 заменен на лейцин, валин, треонин, серин или аспарагин;

3) остаток аспарагина в положении 52 заменен на аспарагин, лейцин, серин или тирозин;

4) остаток тирозина в положении 53 заменен на аланин, глицин, серин, лизин, треонин или аспарагин;

5) аспарагин в положении 54 заменен на серин, треонин, лизин, аспарагин или глицин;

6) валин в положении 56 заменен на тирозин, аргинин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глицин, серин или аланин; и/или

7) серин в положении 58 заменен на лизин, аспарагин, треонин, аргинин, глицин, фенилаланин или тирозин;

(в) вариант СЭКН3 (8ЕЦ ГО N0:4), где валин в положении 102 заменен на тирозин, гистидин, изолейцин, серин, аспарагиновую кислоту или глицин;

(г) вариант СЭРЫ (8ЕЦ ГО N0:5), где:

1) серин в положении 29 заменен на валин; и/или

2) метионин в положении 33 заменен на лейцин; и/или (д) вариант СГОРР-3 (8ЕЦ ГО N0:7), содержащий одну или более чем одну из следующих замен:

1) глутамин в положении 89 заменен на лейцин;

2) глутаминовая кислота в положении 90 заменена на глутамин;

3) триптофан в положении 91 заменен на тирозин; и/или

4) тирозин в положении 93 заменен на серин или аргинин. Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную область тяжелой цепи любой из 8Е0 ГО N0:10-17 (с 1А11.Н0 У_Н по 1А11.Н7 У_Н) или вариабельную область тяжелой цепи любой из 8Е0 ГО N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131. В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:13 (1А11.Н3 У_Н). Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную область легкой цепи любой из 8Е0 ГО N0:18-27 (1А11.Ь0 У_к по 1А11.Ь9 У_к). В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область легкой цепи 8Е0 ГО N0:22 (1А11.Ь4 У_к).

В конкретном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:13 (1А11.Н3 У_Н) и вариабельную область легкой цепи с 8Е0 ГО N0:22 (1А11.Ь4 У_к). В еще одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь с 8Е0 ГО N0:114 или 8Е0 ГО N0:118, в частности 8ЕЦ ГО N0:118, и легкую цепь с 8ЕЦ ГО N0:115. Тяжелая цепь может дополнительно содержать любую из следующих замен: N980, №98Е. Р100ЬЕ, Р100ЬН, Р100Ы и Р100ЬУ (Кабат).

В еще одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит одну или более чем одну точечную мутацию в СОРН3, и где антигенсвязывающий белок обладает более высокой связывающей аффинностью в отношении ГО-7Р по сравнению с антигенсвязывающим белком, лишенным указанной мутации. Например, в одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит СОРН3, как указано в 8Е0 ГО N0:132-137. В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:121, 123, 125, 127, 129 или 131.

В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, как изложено в:

(а) 81У) ГО N0:11, (б) 81Т) ГО N0:12, (в) 81У) ГО N0:13, (г) 81Т) ГО N0:14, (д) 81Т) ГО N0:15, (е) 81У) ГО N0:16, (ж) 81У) ГО N0:17, (з) 81У) ГО N0:121, (и) 81Т) ГО N0:123, (к) 81Т) ГО N0:125, (л) 81У) ГО N0:127, (м) 81У) ГО N0:129, (н) 81Т) ГО N0:131, или вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий 70% или большую идентичность одной из 8Е0 ГО N0:11-17, где антигенсвязывающий белок способен связываться с СО127.

В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи имеет 75% или большую, 80% или боль- 6 023700 шую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность одной из 8ЕЦ ГО N0:11-17.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:13, или вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий 70% или большую, 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность 8Е0 ГО N0:13.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок имеет тяжелую цепь, имеющую 70% или большую, 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность 8Е0 ГО N0:115 или 8Е0 ГО N0:118.

В одном воплощении тяжелая цепь или вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой один из вариантов из 8ЕЦ ГО N0:11-17, 121, 123, 125, 127, 129, 131, и где степень вариации состоит из одного или более чем одного из:

1) Уа1, 11е или 01у в положении 2,

2) Ьеи или Уа1 в положении 4,

3) Ьеи, 11е, Ме! или Уа1 в положении 20,

4) ТЬг, А1а, Уа1, 01у или 8ег в положении 24,

5) Тгр или Туг в положении 47,

6) 11е, Ме!, Уа1 или Ьеи в положении 48,

7) 11е, Ьеи, РЬе, Ме! или Уа1 в положении 69,

8) Агд, Уа1, А1а или Ьеи в положении 71,

9) А1а, Ьеи, Уа1, Туг или РЬе в положении 78,

10) Ьеи или Ме! в положении 80,

11) Туг или РЬе в положении 90 и

12) Агд, Ьув, 01у, 8ег, Ηίδ или Авп в положении 94.

В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен легкой цепи, как изложено в:

(а) 8 ЕЕ) ГО N0:19, (б) 8ЕО ГО N0:20, (в) 8ЕО ГО N0:21, (г) 8ЕО ГО N0:22, (д) 8ЕО ГО N0:23, (е) 8ЕО ГО N0:24, (ж) 8ЕО ГО N0:25, (з) 8ЕО ГО N0:26, (и) 8ЕО ГО N0:27, или вариабельный домен легкой цепи, имеющий 70% или большую идентичность одной из 8Е0 ГО N0:19-27, где антигенсвязывающий белок способен связываться с СГО127.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:22, или вариабельный домен легкой цепи, имеющий 70% или большую идентичность 8ЕЦ ГО N0:22.

В одном воплощении вариабельный домен легкой цепи имеет 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность одной из 8ЕЦ ГО N0:19-27.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, имеющую 70% или большую, 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность 8ЕЦ ГО N0:115.

В настоящем изобретении рассмотрено любое образование пар описанных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. Таким образом, в одном воплощении изобретения также предложен антигенсвязывающий белок, содержащий любую из следующих комбинаций вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи:

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:11 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:19, 8ЕО ГО N0:20, 8ЕО ГО N0:21, 8ЕО ГО N0:22, 8ЕО ГО N0:23, 8ЕО ГО N0:24, 8Е0 ГО N0:25, 8ЕЦ ГО N0:26 или 8ЕЦ ГО N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8ЕЦ ГО N0:19, 8ЕЦ ГО N0:20, 8ЕЦ ГО N0:21, 8ЕЦ ГО N0:22, 8ЕО ГО N0:23, 8ЕО ГО N0:24, 8ЕО ГО N0:25, 8ЕО ГО N0:26 или 8ЕО ГО N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:12 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:19, 8ЕО ГО N0:20, 8ЕО ГО N0:21, 8ЕО ГО N0:22, 8ЕО ГО N0:23, 8ЕО ГО

- 7 023700

N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:13 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:14 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:15 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26, или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:16 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:17 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:121 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:123 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:21, δΕΟ ΙΌ N0:22, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:25, δΕΟ ΙΌ N0:26 или δΕΟ ΙΌ N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с δΕΟ ΙΌ N0:125 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или боль- 8 023700 шую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕО ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26, или ЗЕЦ ГО N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:19, ЗЕО ГО N0:20, ЗЕО ГО N0:21, ЗЕО ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26, или ЗЕЦ ГО N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕЦ ГО N0:127 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26 или ЗЕЦ ГО N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26 или ЗЕЦ ГО N0:27);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕЦ ГО N0:129 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26 или ЗЕЦ ГО N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26 или ЗЕЦ ГО N0:27); или вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕЦ ГО N0:131 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26 или ЗЕЦ ГО N0:27 (или последовательностью, имеющей 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую или 99% или большую идентичность любой из ЗЕЦ ГО N0:19, ЗЕЦ ГО N0:20, ЗЕЦ ГО N0:21, ЗЕЦ ГО N0:22, ЗЕЦ ГО N0:23, ЗЕЦ ГО N0:24, ЗЕЦ ГО N0:25, ЗЕЦ ГО N0:26 или ЗЕЦ ГО N0:27).

В одном из воплощений антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность последовательности, изложенной в ЗЕЦ ГО N0:13, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность последовательности, изложенной в ЗЕЦ ГО N0:22.

В одном из воплощений антигенсвязывающий белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в ЗЕЦ ГО N0:13, и вариабельный домен легкой цепи, как указано в ЗЕЦ ГО N0:22.

В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий один или более чем один из следующих гипервариабельных участков:

(1) СЭКН1, как указано в ЗЕЦ ГО N0:2, или вариант этого СГОК (2) СЭКН2, как указано в ЗЕЦ ГО N0:3, или вариант этого СГОК (3) СЭКН3, как указано в ЗЕЦ ГО N0:4, или вариант этого СЭК, или СЭКН3, как указано в любой из ЗЕЦ ГО N0:132-8^ ГО N0:137, (4) СЭКЫ, как указано в ЗЕЦ ГО N0:5, или вариант этого СЭК, (5) СЭКЕ2, как указано в ЗЕЦ ГО N0:6, или вариант этого СЭК, (6) СЭКЕ3, как указано в ЗЕЦ ГО N0:7, или вариант этого СЭК, где по меньшей мере один из указанных СГОК представляет собой вариант СЭК, и где указанный антигенсвязывающий белок способен связываться с СГО127.

В одном воплощении антигенсвязывающий белок содержит, по меньшей мере, СГОКЕ® как указано в ЗЕЦ ГО N0:6, или его вариант. В одном воплощении, антигенсвязывающий белок содержит, по меньшей мере, СЭКН3, как указано в ЗЕЦ ГО N0:4, или вариант этого СГОК Вариант СГОК согласно этому аспекту изобретения может содержать:

(а) вариант СЭКН1 (ЗЕЦ ГО N0:2), где:

2) остаток треонина в положении 33 заменен на тирозин, аланин, триптофан, глицин, лейцин или валин;

- 9 023700 (б) вариант С1Ж112 (ЗЕО ΙΌ N0:3), где:

(в) вариант СГОРН3 (ЗЕЦ ΙΌ N0:4), где валин в положении 102 заменен на тирозин, гистидин, изолейцин, серин, аспарагиновую кислоту или глицин;

(г) вариант СОКЫ (ЗЕО ГО N0:5), где:

2) метионин в положении 33 заменен на лейцин; и/или (д) вариант СОКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:7), содержащий одну или более чем одну из следующих замен:

1) глутамин в положении 89 заменен на лейцин;

4) тирозин в положении 93 заменен на серин или аргинин.

В еще одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий:

1) СГОКН1, как указано в ЗЕО ГО N0:2, или вариант его СОК,

2) СГОКН2. как указано в ЗЕО ГО N0:3, или вариант его СОК,

3) СОКН3, как указано в ЗЕО ГО N0:4 или вариант его СОК, или СОКН3, как указано в любой из ЗЕО ГО N0:132^0 ГО N0:137, в скелетной области вариабельного домена тяжелой цепи, которая содержит по меньшей мере один из:

(а) Уа1, 11е или 01у в положении 2, (б) Ьеи или Уа1 в положении 4, (в) Ьеи, 11е, Ме! или Уа1 в положении 20, (г) Сук в положении 22, (д) ТЫ, А1а, Уа1, 01у или Зет в положении 24, (е) 01у в положении 26, (ж) Тгр или Туг в положении 47, (з) 11е, Ме!, Уа1 или Ьеи в положении 48, (и) 11е, Ьеи, РЬе, Ме! или Уа1 в положении 69, (к) Агд, Уа1, А1а или Ьеи в положении 71;

(л) А1а, Ьеи, Уа1, Туг или РЬе в положении 78;

(м) Ьеи или Ме! в положении 80;

(н) Туг или РЬе в положении 90;

(о) Сук в положении 92;

(п) Агд, Ьук, 01у, Зег, Ηίκ или Акп в положении 94; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий:

(1) СГОРЬЕ как указано в ЗЕО ГО N0:5, или вариант его СОК, (2) СПКЬ2, как указано в ЗЕО ГО N0:6, или вариант его СОК, (3) СПКЬ3, как указано в ЗЕО ГО N0:7, или вариант его СОК в скелетной области вариабельного домена легкой цепи, которая содержит по меньшей мере один из:

(а) 11е в положении 2, (б) Ьеи в положении 4, (в) Сук в положении 23, (г) Тгр в положении 35, (д) Туг в положении 36, (е) Туг или РЬе в положении 71, (ж) Сук в положении 88, (з) РЬе в положении 98;

где антигенсвязывающий белок способен связываться с СГО127.

Вариант СОК по этому аспекту изобретения может содержать:

(а) вариант С1Ж111 (ЗЕО ГО N0:2), где:

- 10 023700

(б) вариант С1Ж112 (8ЕЕ) ГО N0:3), где:

6) валин в положении 56 заменен на тирозин, аргинин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глицин, серин или аланин и/или

(в) вариант СГОВН3 (8Е0 ΙΌ N0:4), где валин в положении 102 заменен на тирозин, гистидин, изолейцин, серин, аспарагиновую кислоту или глицин;

(г) вариант СОКЬ1 (8Е0 ГО N0:5), где:

2) метионин в положении 33 заменен на лейцин; и/или (д) вариант СОКЬ3 (8Е0 ГО N0:7), содержащий одну или более чем одну из следующих замен:

1) глутамин в положении 89 заменен на лейцин;

2) глутаминовую кислоту в положении 90 заменен на глутамин;

3) триптофан в положении 91 заменен на тирозин и/или

В одном воплощении антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, возможно гуманизированное или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В еще одном аспекте изобретения предложено антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:

(1) СОКН1, как указано в 8ЕО ГО N0:39, (2) СГОВН2. как указано в 8Е0 ГО N0:40, (3) С1Ж1ЕЕ как указано в 8ЕО ГО N0:41, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: валина в положении 24, тирозина в положении 27, серина в положении 28, изолейцина в положении 29, треонина в положении 30, метионина в положении 48, глицина в положении 49, изолейцина в положении 67, серина в положении 68, аргинина в положении 71, треонина в положении 73 и фенилаланина в положении 78 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация по Кабат).

В одном воплощении антитело содержит по меньшей мере один, два, три, четыре или все пять из остатков тирозина в положении 27, треонина в положении 30, метионина в положении 48, изолейцина в положении 67 и аргинина в положении 71.

Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую СГОВН1 (8Е0 ГО N0:39) и СГОВН3 (8ЕО ГО N0:41); СГОВН2 (8ЕО ГО N0:40) и СГОВН3 (8ЕО ГО N0:41); СГОВН1 (8ЕО ГО N0:39) и СГОВН2 (8ЕО ГО N0:40); или СГОВН1 (8ЕО ГО N0:39), СГОВН2 (8ЕО ГО N0:40) и СГОВН3 (8ЕО ГО N0:41). Антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи любой из 8Е0 ГО N0:48-56 (с 6Л3ЮНУ4_61.Н1 У_Н по 6Л3ЮНУ4_61.Н9) или 8ЕО ГО N0:58-68 (с 6А3ЮНУ3-33.Н1 У_Н по 6А3 ЮНУ3-33.Н11).

В настоящем изобретении также предложено антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:

(1) СГОВЕ-Е как указано в 8Е0 ГО N0:42 (2) СПВЬ2, как указано в 8Е0 ГО N0:43 (3) СПВЬ3, как указано в 8Е0 ГО N0:44, где антитело дополнительно содержит:

(а) один или оба остатка глутамина в положении 45 и остаток лизина в положении 70 вариабельной области легкой цепи или (б) один или более чем один из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в положении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в положении 104 (нумерация по Кабат).

В одном воплощении антитело содержит как остаток глутамина в положении 45, так и остатка ли- 11 023700 зина в положении 70. В еще одном воплощении антитело содержит каждый из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в положении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в положении 104.

Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую СОВЫ (ЗЕО ГО N0:42) и С1)ВЕ.3 (ЗЕО ГО N0:44); С11ВЕ2 (ЗЕО ГО N0:43) и С11ВЕ3 (ЗЕО ГО N0:44); или С11ВЕ1 (ЗЕО ГО N0:42) и С11ВЕ2 (ЗЕО ГО N0:43); или С11ВЕ1 (ЗЕО ГО N0:42), С11ВЕ2 (ЗЕО ГО N0:43) и С11ВЕ3 (ЗЕО ГО N0:44). Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:7072 и 138 (6А3.Ь1 ν_κ, 6А3.Ь2 ν_κ, 6А3.Ь3 ν_κ и 6А3.Ь27 ν_κ).

(1) СПИНУ как указано в ЗЕО ГО N0:39, (2) СГОВН2, как указано в ЗЕО ГО N0:40, (3) С11В113, как указано в ЗЕО ГО N0:41, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из: валина в положении 24, тирозина в положении 27, серина в положении 28, изолейцина в положении 29, треонина в положении 30, метионина в положении 48, глицина в положении 49, изолейцина в положении 67, серина в положении 68, аргинина в положении 71, треонина в положении 73 и фенилаланина в положении 78 вариабельной области тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два или три из следующих гипервариабельных участков:

(1) СГОВЕЕ как указано в ЗЕО ГО N0:42, (2) СГОВЕ2, как указано в ЗЕО ГО N0:43, (3) СГОВЕ3, как указано в ЗЕО ГО N0:44, где антитело дополнительно содержит:

Антитело может содержать любую комбинацию СГОВНЕ СЭВН2, СГОВН3, СОВЫ, СГОВЕ2 и СГОВЕ3, включая от одного СОК тяжелой цепи и одного легкой цепи до всех шести указанных СОК.

В одном из воплощений антитело содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:

(1) СПВН1, как указано в ЗЕО ГО N0:39, (2) СГОВН2, как указано в ЗЕО ГО N0:40, (3) СНИН3_ как указано в ЗЕО ГО N0:41, (4) СОВЫ, как указано в ЗЕО ГО N0:42, (5) СГОВЕ2, как указано в ЗЕО ГО N0:43, (6) СГОВЕ3, как указано в ЗЕО ГО N0:44, где антитело дополнительно содержит по меньшей мере один из:

(а) валина в положении 24, тирозина в положении 27, серина в положении 28, изолейцина в положении 29, треонина в положении 30, метионина в положении 48, глицина в положении 49, изолейцина в положении 67, серина в положении 68, аргинина в положении 71, треонина в положении 73 и фенилаланина в положении 78 вариабельной области тяжелой цепи; и/или (б) : а) по меньшей мере одного из остатка глутамина в положении 45 и остатка лизина в положении 70 вариабельной области легкой цепи или

б) одного или более чем одного из лейцина в положении 4, тирозина в положении 31, метионина в положении 70, треонина в положении 85, тирозина в положении 94, глицина в положении 100 и валина в положении 104 (нумерация по Кабат).

Настоящее изобретение охватывает образование любой пары описанных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи. Таким образом, в одном воплощении изобретения также предложен антигенсвязывающий белок, содержащий любую из следующих комбинаций вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи:

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:47 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:48 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или боль- 12 023700 шую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:49 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72, ЗЕО ГО N0:73 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72, ЗЕО ГО N0:73 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:50 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:51 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:52 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:53 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:54 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:55 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:56 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:70, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:72 или ЗЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с ЗЕО ГО N0:57 (или последовательность, имеющую 75% или

- 13 023700 большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:58 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:59 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:60 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:61 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:62 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:64 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8Е0 ГО N0:65 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ЕО ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8Е0 ГО N0:69, 8ЕО ГО N0:70, 8ЕО ГО N0:71, 8ЕО ГО N0:72 или 8ЕО ГО N0:138);

- 14 023700 вариабельный домен тяжелой цепи с 8ЕЦ ГО N0:66 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ΙΤ) ГО N0:69, 81Т) ГО N0:70, 8ΙΤ) ГО N0:71, 8ΙΤ) ГО N0:72 или 81Т) ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8ЕЦ ГО N0:69, 81Т) ГО N0:70, 81Т) ГО N0:71, 8ΙΤ) ГО N0:72 или 81Т) ГО N0:138);

вариабельный домен тяжелой цепи с 8ЕЦ ГО N0:67 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ΙΤ) ГО N0:69, 81Т) ГО N0:70, 8ΙΤ) ГО N0:71, 8ΙΤ) ГО N0:72 или 81Т) ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8ЕЦ ГО N0:69, 81Т) ГО N0:70, 81Т) ГО N0:71, 8ΙΤ) ГО N0:72 или 81Т) ГО N0:138); и вариабельный домен тяжелой цепи с 8ЕЦ ГО N0:68 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую идентичность указанной последовательности) с вариабельным доменом легкой цепи любой из 8ΙΤ) ГО N0:69, 81Т) ГО N0:70, 8ΙΤ) ГО N0:71, 8ΙΤ) ГО N0:72 или 81Т) ГО N0:138 (или последовательность, имеющую 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, или 99% или большую идентичность любой из 8ЕЦ ГО N0:69, 81Т) ГО N0:70, 81Т) ГО N0:71, 8ΙΤ) ГО N0:72 или 81Т) ГО N0:138).

В конкретном воплощении предложен антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, как указано в 8ЕЦ ГО N0:53, 54 55 или 56, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, как указано в 81Т) ГО N0:138.

Связывающий белок может представлять собой антитело, в частности гуманизированное или человеческое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В еще одном аспекте изобретения предложено химерное антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0:28 и вариабельный домен легкой цепи 8ЕЦ ГО N0:29, или вариабельный домен тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0:73 и вариабельный домен легкой цепи 8ЕЦ ГО N0:74.

Антигенсвязывающий белок по изобретению может не ингибировать сигнализацию, опосредованную Т8ЬР. В одном воплощении антигенсвязывающий белок не ингибирует сигнализацию, опосредованную Т8ЬР.

В изобретении также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению. В одном воплощении изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот 8ΙΤ) ГО N0:30-38, 81Т) ГО N0:75-113, 8ΙΤ) ГО N0:119-120 и 8ΙΤ) ГО N0:122, 124, 126, 128 и 130. В настоящем изобретении также предложен экспрессирующий вектор, содержащий определенную здесь молекулу нуклеиновой кислоты, и рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая определенный здесь экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор может содержать молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с любой одной или более чем одной из 8ЕЦ ГО N0:30-38, 8ЕЦ ГО N0:75-113, и 8ЕЦ ГО N0:119-120 и 8ЕЦ ГО N0:122, 124, 126, 128 и 130. В одном воплощении экспрессирующий вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий белок, как описано ранее. В еще одном воплощении изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор, как описано ранее. В еще одном воплощении изобретения предложено антитело, экспрессирующееся клеткой-хозяином, как описано ранее.

В изобретении также предложен способ продуцирования антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению, при котором осуществляют стадию культивирования клетки-хозяина, как определено выше, и выделения антигенсвязывающего белка.

В изобретении также предложены антитело или антигенсвязывающий белок по изобретению, которые экспрессируются клеткой-хозяином, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.

В изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием, при котором осуществляют стадию введения субъекту антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, страдающего заболеванием, в которое вовлечены патогенные клетки ТН17, при котором осуществляют стадию введения субъекту антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, страдающего заболеванием, ассоциированным с повышающей регуляцией экспрессии ГО-17, при котором осуществляют стадию введения субъекту антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению.

- 15 023700

В частности, аутоиммунное или воспалительное заболевание, в которые вовлечены патогенные клетки Т_Н17, или заболевание, ассоциированное с повышающей регуляцией экспрессии 1Ь17, может представлять собой рассеянный склероз (М§), системную красную волчанку (§ЬЕ), ревматоидный артрит, болезнь Бехчета или астму. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению будет полезен в способе лечения рассеянного склероза. Здесь описаны другие заболевания, которые можно лечить путем введения антигенсвязывающих белков по изобретению.

В изобретении также предложен описанный здесь антигенсвязывающий белок для применения в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием; заболеванием, в которое вовлечены патогенные клетки ТН17; или заболеванием, ассоциированным с повышающей регуляцией эскпрессии 1Ь17.

В изобретении предложено применение описанного здесь антигенсвязывающего белка в изготовлении лекарственного средства для использования в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием; заболеванием, в которое вовлечены патогенные клетки ТН17; или заболеванием, ассоциированным с повышающей регуляцией эскпрессии 1Ь17.

Другие аспекты и воплощения изобретения будут понятны из следующего подробного описания. Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 демонстрирует комплементзависимую цитотоксичность моноклонального антитела тАЬ 1А11 Н3Ь4 против 1Ь7К на клетки НЕК293, экспрессирующие МБ-7К.

Фиг. 2 демонстрирует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность гуманизированного тАЬ 1А11 Н3Ь4 против 1Ь7К и Рс-деактивированного тАЬ против 1Ь7К (1А11 Н3Ь4Рс) на клетки НЕК293, экспрессирующие МЬ-7К, в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови.

Фиг. 3А и 3В демонстрируют ингибирование со стороны 1А11 Н3Ь4 вызванного 1Ь-7 фосфорилирования §ТАТ5 в человеческих мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), полученных из двух различных доноров.

Фиг. 4Λ-4Ω демонстрируют ингибирование со стороны 1А11 Н3Ь4 вызванного 1Ь-7 продуцирования 1Ь-17 в дифференцированных человеческих клетках ТЬ17 (у четырех различных доноров).

Фиг. 5А-5Е демонстрируют отсутствие влияния 1А11 Н3Ь4 на Т§ЬР-индукцию ТАКС (хемокин, регулируемый тимусом и при активации).

Подробное описание изобретения

Сигнализация, опосредованная 1Р-7/1Ь-7К, крайне необходима для выживания и размножения коммитированных Т_Н17-клеток и у мышей, и у людей, в то время как ее роль в дифференцировке Т_Н17клеток несущественна по сравнению с ролью 1Ь-6 (Ыи е! а1., (2010) №-Ниге МеФсше 16:191-197). Неожиданно оказалось, что эффект антагонизма в отношении 1Ь-7К на иммунную систему ίη νίνο высокоселективен при ЭАЭ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит), модели рассеянного склероза на животных, и влияет на ТН17-клетки и, в меньшей степени, ТН1-клетки, преимущественно с фенотипом клеток памяти, и не влияет на Т_гед-клетки. Эта селективность, по-видимому, играет важную роль в восстановлении соотношения патогенных Т_Н17-клеток и Т_гед-клеток антагонизмом в отношении 1Ь-7К при ЭАЭ и обусловливает эффективность лечения.

Роль сигнализации, опосредованной 1Р-7/1Ь-7К, при выживании и размножении Т_Н17-клеток обеспечивает убедительное объяснение эффективности лечения с использованием антагонизма в отношении 1Ь-7К при аутоиммунных заболеваниях человека, таких как РС. Нейтрализация 1Ь-7 или антагонизм в отношении 1Ь-7К, вероятно, имеют уникальные терапевтические преимущества. С одной стороны, лечение обладает селективностью, которая позволяет отличать патогенные Т_Н1- и Т_Н17-клетки от Т_гед-клеток и неродственных иммунокомпетентных клеток. С другой стороны, дополнительные терапевтические преимущества антагонизма в отношении 1Ь-7К включают его селективный эффект на выживание и размножение дифференцированных ТН17-клеток, в отличие от дифференцировки ТН17-клеток. Вероятно, направленное воздействие на поддержание коммитированных Т_Н17-клеток ίη νίνο, а не на дифференцировку Т_Н17-клеток более эффективно в терапевтическом контексте. Таким образом, ингибирование сигнализации, опосредованной рецептором 1Ь-7, обеспечивает перспективное терапевтическое вмешательство для лечения аутоиммунных или воспалительных заболеваний.

Используемый здесь термин сигнализация, опосредованная 1Ь-7К обозначает биологический эффект, обусловленный рецепторным комплексом 1Ь-7, связанным с его лигандом, 1Ь-7. Таким образом, сигнализация, опосредованная 1Ь-7К, включает одно или более чем одно, или все из индуцированного 1Ь-7 фосфорилирования §ТАТ-5, индуцированного 1Ь-7 размножения Т_Н17-клеток и индуцированного 1Ь-7 выживания Т_Н17-клеток, но не обязательно ограничивается ими.

Мышиные антитела 1А11 и 6А3 описаны в заявке на патент № РСТ/и§2009/053136 (^02010/017468). Эти антитела специфически связываются с альфа-цепью человеческого рецептор 1Ь-7, СГО127 (§Е0 ГО N0:1). Вариабельные домены этих антител описаны в §Е0 ГО N0:8 и 9 (У_Н, У_К 1А11 соответственно) и §Е0 ГО N0:45 и 46 (У_Н, У_К 6А3 соответственно).

В настоящем изобретении предложены антигенсвязывающие белки, содержащие один или более чем один из гипервариабельных участков (СОК) 1А11 или 6А3 и их вариантов. Антигенсвязывающие

- 16 023700 белки могут связываться с 1Б-7Р и нейтрализовать сигнализацию, опосредованную им. В одном из воплощений изобретения предложены гуманизированное антитела, содержащие от одного до шести СОК мышиных антител 1А11 или 6А3 (донорное антитело) в человеческом акцепторном антителе.

Используемый здесь термин антигенсвязывающий белок относится к антителам, фрагментам антитела и другим белковым конструкциям, таким как домены, которые способны связываться с СО127. В одном воплощении антигенсвязывающий белок представляет собой антитело.

Используемый здесь термин антитело в самом широком смысле относится к молекулам, имеющим иммуноглобулиноподобный домен, и включает моноклональное, рекомбинантное, поликлональное, химерное, гуманизированное, биспецифическое и гетероконъюгатное антитела; единичный вариабельный домен, доменное антитело, антигенсвязывающие фрагменты, иммунологически эффективные фрагменты, одноцепочечные Ρν, диатела, ТапбаЬк™ и т.д. (обзор альтернативных форматов антитела смотри в НоШдег апб Нибкоп, №Цигс Вю1есЬпо1оду, 2005, Уо1. 23, N0. 9, 1126-1136).

Фраза единичный вариабельный домен иммуноглобулина относится к вариабельному домену антигенсвязывающего белка (У_Н, У_НН, Уь), который специфически связывается с антигеном или эпитопом независимо от различия вариабельной области или домена.

Доменное антитело или бАЬ можно рассматривать как единичный вариабельный домен, который способен к связыванию с антигеном. Единичный вариабельный домен может представлять собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела других видов, таких как грызуна (например, как раскрыто в \У0 00/29004), усатой акулы и камелидные У_НН бАЬ. Камелидные У_НН представляют собой полипептиды единичного вариабельного домена иммуноглобулина, полученные из видов, включая верблюда, ламу, альпака, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела, имеющие тяжелую цепь, но естественным образом лишенные легких цепей. Такие УНН домены могут быть гуманизированы в соответствии со стандартными способами, имеющимися в области техники, и такие домены также рассматривают, как доменные антитела в соответствии с изобретением. При использовании здесь, У_Н включает камелидные У_НН домены.

Используемый здесь термин домен относится к свернутой белковой структуре, сохраняющей свою третичную структуру независимо от остальной части белка. Как правило, домены являются ответственными за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без утраты функции оставшейся части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более чем одна петля заменена на последовательности, не характерные для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые усечены или содержат И- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена. Домен может связываться с антигеном или эпитопом независимо от различия вариабельной области или домена.

Антигенсвязывающий фрагмент также может быть создан в результате перегруппировки одного или более чем одного СОК с белковыми скелетами, такими как домены, не относящимися к антителам. Белковый скелет или домен, не относящийся к антителам, представляет собой белковый скелет или домен, подвергнутый белковой инженерии для обеспечения связывания с лигандом, отличающимся от его природного лиганда, например домен, который представляет собой производное скелета, выбранного из СТЬА-4 (цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4, Еν^Ьобу); липокалина, белковых молекул, таких как Ζ-домен белка А (аффитело, 8рА), А-домена (авимер/МаХЬобу); белков теплового шока, таких как СгоЕ1 (бактериальный шаперонин, относящийся к семейству белков теплового шока 60) и СгоЕ8 (кошаперонин СгоЕЬ); трансферрина (1гап8-Ьобу); белков-анкириновых повторов (ОАРРш); пептидного аптамера; лектинового домена С-типа (тетранектин); человеческого γ-кристаллина и человеческого убиквитина (аффилины); ΡΟΖ доменов; скорпионовых токсинов, доменов человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца; и фибронектина (аднектин); которые подвергнуты белковой инженерии для обеспечения связывания с лигандом, отличающимся от соответствующего природного лиганда.

СТЬА-4 (цитотоксического Т-лимфоцитарный антиген 4) представляет собой 0028-семейство рецепторов, экспрессирующихся в основном на СО4+ Т-клетках. Их внеклеточный домен имеет складку 1д, подобную вариабельному домену. Петли, соответствующие СОР антитела, могут быть заменены на гетерологическую последовательность, придающей отличающиеся связывающие свойства. Молекулы СТЬА4, сконструированные таким образом, что обладают отличающимися специфичностями связывания, также известны как эвитела. Дополнительную информацию смотри в 1оигпа1 о£ 1ттипо1одюа1 Мебюбк 248 (1-2), 31-45 (2001).

Липокалины представляют собой семейство внеклеточных белков, которые переносят небольшие гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они обладают жесткой вторичной структурой β-складки с множеством петель по открытому концу канонической структуры, которая может быть сконструирована таким образом, чтобы связываться с различными антигенами- 17 023700 мишенями. Антикалины имеют размер от 160 до 180 аминокислот и являются производными липокалинов. Дополнительную информацию смотри в ВюсЫт ВюрЬук Ас!а 1482: 337-350 (2000), И87250297В1 и И820070224633.

Аффитело представляет собой скелет, происходящий из белка А 8!арЬу1ососсик аитеик, который может быть сконструирован таким образом, чтобы связываться с антигеном. Домен состоит из трехспирального узелка из приблизительно 58 аминокислот. Библиотеки получают путем рандомизации поверхностных остатков. Дополнительную информацию смотри в Рто!еш Епд. Иек. 8е1. 17, 455-462 (2004) и ЕР1641818А1.

Авимеры представляют собой мультидоменные белки, происходящие из семейства А-доменного скелета. Нативные домены из приблизительно 35 аминокислот заимствуют определенную связанную дисульфидными мостиковыми связями структуру. Разнообразие создается путем перетасовки природной вариации, демонстрируемой семейством А-доменов. Дополнительную информацию смотри в №Циге Βίο!есЬпо1оду 23(12), 1556-1561 (2005) и Ехрег! 0ρίηίοη оп 1пуе5ОдаОопа1 Итидк 16(6), 909-917 (.Типе 2007).

Трансферрин представляет собой мономерный сывороточный переносящий гликопротеин. Трансферрины могут быть сконструированы таким образом, чтобы связывать различные антигены-мишени, путем встраивания пептидных последовательностей, таких как один или более чем один СИК, в экспонированную поверхностную петлю. Примеры сконструированных трансферриновых скелетов включают Ттапк-Ьойу. Дополнительную информацию смотри в 1. Вю1. СЬет 274, 24066-24073 (1999).

Сконструированные белки с анкириновыми повторами (ИАКРш) представляют собой производные анкирина, которые представляют собой семейство белков, опосредующих присоединение интегральных белков мембраны к цитоскелету. Единичный анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, состоящий из двух α-спиралей и β-складки. Они могут быть сконструированы таким образом, чтобы связывать различные антигены-мишени путем: рандомизации остатков в первой α-спирали и β-складки каждого из повторов; или вставки пептидных последовательностей, таких как один или более чем один из СИК. Их связывающая поверхность может быть увеличена путем увеличения количества модулей (способ аффинного созревания). Дополнительную информацию смотри в 1. Мо1. Вю1. 332, 489-503 (2003), РИАБ 100(4), 1700-1705 (2003) и 1. Мо1. Вю1. 369, 1015-1028 (2007) и И820040132028А1.

Фибронектин представляет собой скелет, который может быть сконструирован таким образом, чтобы связываться с антигеном. Аднектины состоят из скелета из природной аминокислотной последовательности 10-го домена из 15 повторяющихся единиц человеческого фибронектина тип III (РИ3). Три петли по одному концу β-сэндвича могут быть сконструированы таким образом, чтобы дать аднектину возможность специфически распознавать интересуемые терапевтические мишени. Дополнительную информацию смотри в Рто!еш Епд. Иек. 8е1. 18, 435-444 (2005), И820080139791, ^02005056764 и И86818418В1.

Пептидные аптамеры представляют собой комбинаторные распознающие молекулы, которые состоят из белка константного скелета, как правило, тиоредоксина (ТгхА), который содержит связанную вариабельную пептидную петлю, встроенную в активный сайт. Дополнительную информацию смотри в Ехрег! 0рш. Вю1. ТЬег. 5, 783-797 (2005).

Микротела происходят из встречающихся в природе микробелков длиной 25-50 аминокислот, которые содержат 3-4 цистеиновых мостика; примеры микробелков включают Ка1а!аВ1 и конотоксин и ноттины (кпоЬшк). Микробелки имеют петлю, которая может быть сконструирована таким образом, что включает до 25 аминокислот, не влияя на общее складывание микробелка. Дополнительную информацию по сконструированным ноттиновым доменам смотри в ^02008098796.

Другие связывающие домены включают белки, которые используются в качестве скелета для придания отличающихся свойств связывания с антигеном-мишенью, включая человеческий γ-кристаллин и человеческий убиквитин (аффилины), домены человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца, РИ2домены Как-связывающего белка АР-6, скорпионовые токсины, (харибдотоксин), обзор лектиновых доменов С-типа (тетранектинов) содержится в главе 7 - №п-ЛпОЬойу 8саРГо1Й5 Ргот НапйЬоок оГ ТЬегареи0с АпБЬоФек (2007, ейЬей Ьу 8!еГап ИиЬе1) и Рто!еш 8аепсе 15:14-27 (2006). Связывающие домены по настоящему изобретению могут быть получены из любого из этих альтернативных белковых доменов и любой комбинации СИК по настоящему изобретению, привитых к домену.

Антигенсвязывающий фрагмент или иммунологически эффективный фрагмент может содержать частичные вариабельные последовательности тяжелой или легкой цепи. Фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. Альтернативно, фрагменты имеют длину по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 100 аминокислот.

Используемый в настоящем описании термин специфически связывает в отношении антигенсвязывающих белков означает, что антигенсвязывающий белок связывается с СИ127 при отсутствии или несущественном связывании с другими (например, неродственными) белками - т.е. описанные здесь антигенсвязывающие белки и антитела могут специфически связываться с СИ127. Тем не менее, термин не исключает тот факт, что антигенсвязывающие белки могут также обладать перекрестной реактивностью в отношении СИ127 других видов, таких как мышиные СИ127, СИ127 яванского макака (Масаса Гаксюи- 18 023700

1апз) или игрунки. В одном воплощении антигенсвязывающий белок связывается как с СЭ127 яванского макака, так и игрунки. Описанные здесь антигенсвязывающие белки могут связываться с человеческим СЭ127 с по меньшей мере в 2, 5, 10, 50, 100 или 1000 раз большей аффинностью по сравнению со связыванием с С.О127 других видов.

Связывающая аффинность или равновесная константа диссоциации (К_с) взаимодействия антигенсвязывающий белок-00127 может составлять 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше. Альтернативно К_с может составлять от 5 до 10 нМ; или от 1 до 2 нМ. К_с может составлять от 1 до 500 пМ или от 500 пМ до 1 нМ. Связывающую аффинность антигенсвязывающего белка определяют при помощи константы скорости ассоциации (к_а) и константа скорости диссоциации (ка) (К_с = к_б/к_а). Связывающая аффинность может быть измерена при помощи В1Асоге™, например, путем захвата антигена при помощи СО127, связанного с чипом СМ5, путем связывания с первичным амином и захвата антитела на этой поверхности. Способ В1Асоге™. описанный в примере 4, может быть использован для измерения связывающей аффинности. Альтернативно, связывающая аффинность может быть измерена при помощи ΡΌΒΤΕόίο. например, путем захвата антигена при помощи СО127, связанного с иглой СМ5, путем связывания с первичным амином и захвата антитела на этой поверхности.

ка может составлять 1х 10^-3 с^-1 или меньше, 1х 10^-4 с^-1 или меньше, или 1х10^-5 с^-1 или меньше. к_б может составлять от 1х10^-5 до 1х10^-4 с^-1; или от 1х10^-4 до 1х10^-3 с^-1. Медленная ка может приводить в результате к медленной диссоциации комплекса антигенсвязывающий белок-лиганд и улучшенной нейтрализации лиганда.

Специалисту в данной области техники понятно, термин производное предназначен для определения не только источника в смысле физического происхождения материала, а также определяет материал, который структурно идентичен материалу, но который не происходит из референсного источника. Такие остатки, обнаруженные в донорном антителе не обязательно должны быть очищены из донорного антитела.

Под выделенным подразумевают, что молекула, такая как антигенсвязывающий белок, извлечена из окружающей среды, в которой ее можно обнаружить в природе. Например, молекула может быть очищена от вещества, с которым она обычно существует в природе. Например, антигенсвязывающий белок может быть очищен по меньшей мере до 95, 96, 97, 98 или 99%, или больше относительно культуральных сред, содержащих антигенсвязывающий белок. Антигенсвязывающие белки и антитела по настоящему изобретению могут представлять собой выделенные антигенсвязывающие белки и антитела.

Химерное антитело относится к типу сконструированного антитела, которое содержит встречающиеся в природе вариабельные области (легкой цепи и тяжелой цепи), происходящие из донорного антитела, в ассоциации с константными областями легкой и тяжелой цепи, происходящими из акцепторного антитела.

Гуманизированное антитело относится к типу сконструированного антитела, имеющего один или более чем один СОК, происходящий из отличного от человеческого донорного иммуноглобулина, где оставшиеся происходящие из иммуноглобулина фрагменты молекулы, происходят из одного или более чем одного человеческого иммуноглобулина(ов). Дополнительно, остатки, поддерживающие скелет, могут быть изменены для сохранения связывающей аффинности (смотри, например, Онссп с1 а1., Ргос. №ι11 Асаб δ^ υδΑ, 86:10029-10032 (1989), Нобдзои е1 а1., Вю/ТесЬио1оду, 9:421 (1991)). Подходящее человеческое акцепторное антитело может быть выбрано из обычной базы данных, например базы данных КАВАТ®, базы данных Ьоз А1атоз и δ\νί55 Рго1еш ба1аЬазе (Швейцарской белковой базы данных), по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностям донорного антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией со скелетными областями донорного антитела (на аминокислотной основе), может быть подходящим для получения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной скелетной области тяжелой цепи для встраивания донорных СОК. Подходящее акцепторное антитело, способное предоставлять константные или вариабельные скелетные области легкой цепи, может быть выбрано аналогичным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не обязательно должны происходить из того же самого акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описаны несколько путей продукции таких гуманизированных антител; смотри, например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.

Термин донорное антитело относится к антителу, которое вносит вклад в аминокислотные последовательности его вариабельных доменов, один или более чем один СОК или другие функциональные фрагменты или его аналоги с первым партнером иммуноглобулином. Таким образом, донор обеспечивает область, кодирующую измененный иммуноглобулин, и в результате экспрессирует измененное антитело, обладающее антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерной для донорного антитела.

Термин акцепторное антитело относится к антителу, гетерологичному донорному антителу, которое предоставляет все (или любой фрагмент) аминокислотные последовательности, кодирующие его скелетные области тяжелой и/или легкой цепи, и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи, первому иммуноглобулиновому партнеру. Человеческое антитело может представлять собой акцептор- 19 023700 ное антитело.

Используемые здесь термины У_Н и У_ъ относятся соответственно к вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающего белка. У_к также используется для обозначения вариабельного домена легкой цепи.

СОК определены как аминокислотные последовательности гипервариабельного участка антигенсвязывающего белка. Они представляют собой гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. В вариабельном фрагменте иммуноглобулина имеются три СОК (или гипервариабельных участка) тяжелой и три СОК легкой цепи. Таким образом, используемый здесь термин СОК относится ко всем трем СОК тяжелой цепи, всем трем СОК легкой цепи, всем СОК тяжелой и легкой цепи, или по меньшей мере двух СГОК.

В данном описании, если не указано иное, аминокислотные остатки в последовательностях вариабельного домена и последовательностях полноразмерного антитела пронумерованы в соответствии с правилами нумерации по Кабат. Аналогично, термины СОК, СИКЫ, СОКЬ2, СОКЬ3, СЭКН1, СОКН2, СЭКН3 использованы в примерах в соответствии с правилами нумерации по Кабат. Дополнительную информацию смотри в КаЬа! е! а1., Зесщепсек о£ Рто!ешк о£ 1ттипо1одюа1 1п!егек!, 4!Ь Ей., и.З. Оерайтеп! о£ Неа1!Ь апй Нитап ЗеМсек, №Июпа1 1пкй!и!ек о£ Неа1!Ь (1987).

Специалисту в данной области техники понятно, что существуют правила альтернативной нумерации аминокислотных остатков в последовательностях вариабельного домена и последовательностях полноразмерного антитела. Также существуют альтернативные правила нумерации последовательностей СЭК, например, изложенные в СЬо!Ыа е! а1. (1989) №1иге 342: 877-883. Структура и белковый фолдинг антитела может означать, что другие остатки рассматриваются как часть последовательности СОК, и это понятно специалистам в данной области техники. Таким образом, используемый здесь термин соответствующий СОК относятся к последовательности СОК с использованием любого правила нумерации, например, изложенного в табл. 1.

Другие правила нумерации последовательности СОК, доступные специалистам, включают способы АЬМ (Итуегкйу о£ Ва!Ь) и контакт (Итуегкйу Со11еде Ьопйоп). Минимальная перекрывающаяся область с использованием по меньшей мере двух способов из Кабата, СЬойа, АЬМ и контактного способа может быть определена с получением минимальной связывающей единицы. Минимальная связывающая единица может представлять собой субфрагмент СОК.

В табл. 1 ниже представлено одно определение с использованием каждого из правил нумерации для каждого СОК или связывающей единицы. Схема нумерации по Кабат использована в табл. 1 для нумерации аминокислотной последовательности вариабельного домена. Следует отметить, что некоторые из определений СОК могут варьировать в зависимости от использованных конкретных публикаций.

Таблица 1

	СОН по Кабат	СОН по СКоба	СОН по АЬМ	СОЯ в соответствии с контактным способом	Минимальная связывающая единица
Н1	31-35/35А/35В	26-32/33/34	26-35/35А/35В	30-35/35А/35В	31-32
Н2	50-65	52-56	50-58	47-58	52-56
НЗ	95-102	95-102	95-102	93-101	95-101
и	24-34	24-34	24-34	30-36	30-34
Ь2	50-56	50-56	50-56	46-55	50-55
ЬЗ	89-97	89-97	89-97	89-96	89-96

Использованный здесь термин антигенсвязывающий сайт относится к сайту на антигенсвязывающем белке, который способен специфически связываться с антигеном. Он может представлять собой единичный домен (например, эпитопсвязывающий домен) или одноцепочечные Ρν (ЗсРу) домены, или он может представлять собой спаренные У_Н/У_Ь домены, которые могут быть обнаружены на обычном антителе.

Используемый здесь термин эпитоп относится к фрагменту антигена, который контактирует с конкретным связывающим доменом антигенсвязывающего белка. Эпитоп может быть линейным, содержащим, по существу, линейную аминокислотную последовательность антигена. Альтернативно, эпитоп может быть конформационным или дискретным. Например, конформационный эпитоп содержит аминокислотные остатки, которым требуется элемент структурного ограничения. Дискретный эпитоп содержит аминокислотные остатки, разделенные другими последовательностями, т.е. не представляет собой непрерывную последовательность в первичной последовательности антигена. В контексте третичной и четвертичной структуры остатки дискретного эпитопа достаточно близки друг к другу, чтобы связываться с антигенсвязывающим белком.

Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин идентичный или идентичность последовательности указывает на степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или двумя аминокислотными последовательностями, и, если требуется при оптимальном совмещении и сравнении с подходящими вставками или делециями.

- 20 023700

Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных положений/общее число положений в 100 раз), принимая во внимание число брешей и длину каждой бреши, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять, используя математический алгоритм, как описано ниже.

Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить, используя программу САР в пакете программ ОСО, используя матрицу ЖУ8дарбпа.СМР и вес бреши 40, 50, 60, 70 или 80, и вес длины бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями можно также определить, используя алгоритм Е. Меуег8 и МШег (Сотри!. Арр1. Βίοδοί., 4:11-17 (1988)), который включен в программу АЫСН (версия 2.0), используя таблицу веса остатков РАМ120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить, используя алгоритм №еб1етап и ХУшъсН (1. Мо1. Βίο1. 48:444-453 (1970)), который включен в программу САР пакета программ ОСО, используя либо матрицу В1о88ит 62, либо матрицу РАМ250 и вес бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В одном из способов полинуклеотидная последовательность может быть идентична описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, 8ЕО ГО N0:30-39, 8ЕО ГО N0:76-105), то есть быть идентична на 100%, или она может включать определенное целое число нуклеотидных изменений по сравнению с референсной последовательностью, например по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична. Такие изменения выбраны из по меньшей мере одной из нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставки, и где указанные изменения могут находиться в 5'- или 3'-концевых положениях референсной нуклеотидной последовательности или где либо еще между этими концевыми положениями вперемежку или по отдельности среди нуклеотидов в референсной последовательности, или в одной или более чем одной смежных группах в пределах референсной последовательности. Количество нуклеотидных изменений определяют, умножая общее количество нуклеотидов в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, 8ЕО ГО N0:30-39, 8ЕО ГО N0:76-105) на числовой процент соответствующей идентичности в процентах (деленной на 100) и вычитая это произведение из указанного общего количества нуклеотидов в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, 8ЕС ГО N0:30-39, 8ЕС ГО N0:76-105), или

П_п — Χ|Ί - (Хи · у), где Ил представляет собой количество нуклеотидных изменений, х_п представляет собой общее количество нуклеотидов в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, 8Е0 ГО N0:30-39, 8Е0 ГО N0:76-105), и у представляет собой 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70 для 70%, 0,75 для 75%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,98 для 98%, 0,99 для 99% или 1,00 для 100%, · представляет собой символ оператора умножения, и где любой нецелочисленный результат произведения хп и у округляют в меньшую сторону к ближайшему целому числу, после чего его вычитают из х_п

Аналогично, полипептидная последовательность может быть идентична описанной здесь референсной полипептидной последовательности (смотри, например, 8Е0 ГО N0:1-29, 8Е0 ГО N0:40-75), которая идентична на 100%, или она может включать в себя определенное целое число аминокислотных замен по сравнению с референсной последовательностью, так что % идентичности составляет менее 100%, как, например, по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, или 99% идентичности. Такие изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставки, и где указанные изменения могут находиться в амино- или карбокси-концевых положениях референсной полипептидной последовательности или гделибо вразброс еще между этими концевыми положениями или по отдельности среди аминокислот в референсных последовательностях или в одной или более чем одной смежных группах в пределах референсной последовательности. Количество аминокислотных изменений для данного % идентичности определяют, умножая общее количество аминокислот в полипептидной последовательности, кодируемой в описанной здесь полипептидной референсной последовательности (смотри, например, 8Е0 ГО N0:1-29, 8Е0 ГО N0:40-75), на числовой процент соответствующей идентичности в процентах (деленной на 100) и затем вычитая это произведение из указанного общего количества аминокислот в описанной здесь референсной полипептидной последовательности (смотри, например, 8Е0 ГО N0:1-29, 8Е0 ГО N0:40-75), или

где п_а представляет собой количество аминокислотных изменений, х_а представляет собой общее количество аминокислот в описанной здесь референсной полинуклеотидной последовательности (смотри, например, 8Е0 ГО N0:1-29, 8Е0 ГО N0:40-75), и у представляет собой 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70 для 70%, 0,75 для 75%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,98 для 98%, 0,99 для

- 21 023700

99% или 1,00 для 100%, · представляет собой символ оператора умножения, и где любой нецелочисленный результат произведения х_а и у округляют в меньшую сторону к ближайшему целому числу, после чего его вычитают из х_а.

Процент идентичности может быть определен для полноразмерной последовательности или любых ее фрагментов; и с или без каких-либо вставок или делеций.

Каждый из терминов пептид, полипептид и белок относится к молекуле, содержащей два или более чем два аминокислотных остатка. Пептид может быть мономерным или полимерным.

В данной области техники признано, что некоторые аминокислотные замены рассматривают как консервативные. Аминокислоты делятся на группы на основе общих свойств боковых цепей, и замены в группах, которые сохраняют всю или по существу всю связывающую аффинность антигенсвязывающего белка по изобретению рассматривают как консервативные замены, смотри табл. 2 ниже.

Таблица 2

Боковая цепь	Члены
Гидрофобные	теГ а1а, уа1, 1еи, Не
Нейтральные гидрофильные	суз, зег, (Иг
Кислые	азр, д1и
Основные	азп, д1п, Ыз, 1уз, агд
Остатки, которые влияют на ориентацию цепи	д1у, рго
Ароматические	(гр, 1уг, рИе

В настоящем изобретении предложен антигенсвязывающий белок, которых связывается с СГО127 и содержит СОКН3 8Еф ГО N0:4; вариант этого СОКН3, или С1Ж11.3 с 8Еф ГО N0:1.32-81®) ГО N0:137. Антигенсвязывающий белок может специфически связываться с СГО127 и также может нейтрализовать активность ГО-7К.

В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит СГОКН2 8Еф ГО N0:3; или вариант этого СГОКН2. Антигенсвязывающий белок может специфически связываться с СГО127 и может также нейтрализовать активность ГО-7К.

Антигенсвязывающий белок может содержать дополнительно к описанным выше последовательностям СГОКН3 или СГОКН2 один или более чем один СОК, или все СОК, в любой комбинации, выбранные из С1Ж111 (81®) ГО N0:2), С1Ж112 (8Еф ГО N0:3), С1Ж11.3 (8Еф ГО N0:4, или любой из с 81®) ГО ^:132-8Еф ГО N0:137), С1Ж1.1 (8Еф ГО N0:5), С1Ж1.2 (8Еф ГО N0:6) и С1Ж1..3 (8Еф ГО N0:7); или вариант любого из указанных СОК.

Например, антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН3 (8Еф ГО N0:4) и СГОКН1 (8Еф ГО N0:2) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН3 (8Еф ГО N0:4) и СГОКН2 (8Еф ГО N0:3) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН1 (8Еф ГО N0:2) и СГОКН2 (81®) ГО N0:3) и С1Ж11.3 (8Еф ГО N0:4) или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКЫ (8Еф ГО N0:5) и СОКЬ2 (8Еф ГО N0:6) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СОКЬ2 (8Еф ГО N0:6) и СОКЬ3 (8Еф ГО N0:7) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКЫ (8Еф ГО N0:5), СОКЬ2 (8Еф ГО N0:6) и СОКЬ3 (8Еф ГО N0:7) или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН3 (8Еф ГО N0:4) и СОКЬ3 (8Еф ГО N0:7) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН3 (8Еф ГО N0:4), СГОКН2 (8Еф ГО N0:3) и СОКЬ3 (8Еф ГО N0:7) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН3 (81®) ГО N0:4), С1Ж112 (81®) ГО N0:3), С1Ж1.2 (81®) ГО N0:6) и С1Ж1..3 (81®) ГО N0:7) или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать СГОКН1 (8Еф ГО N0:2), СГОКН2 (8Еф ГО N0:3), С1Ж11.3 (81®) ГО N0:4), С1Ж1.1 (81®) ГО N0:5), С1Ж1.2 (81®) ГО N0:6) и С1Ж1..3 (81®) ГО N0:7). Альтернативно, может присутствовать вариант СОК, или СГОКН3 8Еф ГО N0:4 может быть заменен на любой из СОК 81®) ГО N0:132-137.

В настоящем изобретении предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит СГОКН3 8Еф ГО N0:41; или вариант этого СГОКН3. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать активность ГО-7К.

В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит СГОКН2 8Еф ГО N0:40; или вариант этого СГОКН2. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать активность ГО-7К.

Антигенсвязывающий белок может содержать дополнительно к описанным выше последовательностям СГОКН3 или СГОКН2 один или более чем один СОК, или все СОК, в любой комбинации, выбранные из С1Ж111 (81®) ГО N0:39), С1Ж112 (81®) ГО N0:40), С1Ж113 (81®) ГО N0:41), С1Ж1.1 (81®) ГО N0:42),

- 22 023700

СЭКЬ2 (ЗЕЦ ΙΌ N0:43) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44); или вариант любого из указанных СЭК.

Например, антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41) и СЭКН1 (ЗЕЦ ГО N0:40) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41) и СЭКН2 (ЗЕЦ ГО N0:40) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН1 (ЗЕЦ ГО N0:39) и СГОК112 (ЗЕЦ ГО N0:40), и СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41) или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКЬ1 (ЗЕЦ ГО N0:42) и СЭКЬ2 (ЗЕЦ ГО N0:43) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКЬ2 (ЗЕЦ ГО N0:43) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКЬ1 (ЗЕЦ ГО N0:42), СГОКЕ2 (ЗЕЦ ГО N0:43) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44) или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41), СЭКН2 (ЗЕЦ ГО N0:40) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44) или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41), СГОК112 (ЗЕЦ ГО N0:40), СГОК1.2 (ЗЕЦ ГО N0:43) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44) или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать СЭКН1 (ЗЕЦ ГО N0:39), СЭКН2 (ЗЕЦ ГО N0:40), СЭКН3 (ЗЕЦ ГО N0:41), СГОК1.1 (ЗЕЦ ГО N0:42), СГОК1.2 (ЗЕЦ ГО N0:43) и СЭКЬ3 (ЗЕЦ ГО N0:44). Альтернативно, может присутствовать вариант СГОК.

В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит соответствующий СГОКН3 последовательности вариабельного домена ЗЕЦ ГО N0:8, или вариант этого СГОКН3 в скелетной области человеческого акцепторного антигенсвязывающего белка. Антигенсвязывающий белок может нейтрализовать активность СГО127. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать один или более чем один, или все из соответствующих СГОК, выбранных из последовательности вариабельного домена ЗЕЦ ГО N0: 8 и/или ЗЕЦ ГО N0: 9, или вариант его СГОК.

В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который специфически связывается с СГО127 и содержит соответствующий СГОКН3 последовательности вариабельного домена ЗЕЦ ГО N0:45, или вариант этого СГОКН3 в скелетной области человеческого акцепторного антигенсвязывающего белка. Антигенсвязывающий белок может нейтрализовать активность СГО127. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать один или более чем один, или все из соответствующих СГОК, выбранных из последовательности вариабельного домена ЗЕЦ ГО N0:45 и/или ЗЕЦ ГО N0:46, или вариант этого СГОК.

Например, антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКН3 и соответствующий СГОКН1 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКН3 и соответствующий СГОКН2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКНЕ соответствующий СГОКН2 и соответствующий СГОКН3 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКЫ и соответствующий СЭКБ2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СЭКЬ2 и соответствующий СГОКЕ-3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СЭКЬ1, соответствующий СЭКБ2 и соответствующий СЭКБ3 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКН3 и соответствующий СЭКБ3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКН3, соответствующий СГОКН2 и соответствующий СЭКБ3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКН3, соответствующий СГОКН2, соответствующий СЭКБ2 и соответствующий СЭКБ3 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать соответствующий СГОКНЕ соответствующий СГОКН2, соответствующий СГОКН3, соответствующий СЭКЬ1, соответствующий СЭКБ2 и соответствующий СЭКБ3 или их варианты.

Соответствующие СГОК могут быть определены в соответствии со способами Кабата (1987), СНойа (1989), АЬМ или контактным способом. Определение каждого из способов можно найти в табл. 1 и может быть применено к референсному вариабельному домену тяжелой цепи (ЗЕЦ ГО N0:8 или ЗЕЦ ГО N0:45) и референсному вариабельному домену легкой цепи (ЗЕЦ ГО N0:9 и ЗЕЦ ГО N0:46) для определения соответствующего СГОК.

В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит связывающую единицу Н3, содержащую остатки 95-101 по Кабат ЗЕЦ ГО N0:8, или вариант Н3.

Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческий, гуманизированный или химерный антигенсвязывающий белок, такой как антитело.

Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать одну или более чем одну или все связывающие единицы, выбранные из Н1, содержащие остатки 31-32 по Кабат ЗЕЦ ГО N0:8, Н2, содержащие остатки 52-56 по Кабат ЗЕЦ ГО N0:8, Ь1, содержащие остатки 30-34 по Кабат ЗЕЦ ГО N0:9, Ь2, со- 23 023700 держащие остатки 50-55 по Кабат 8ЕО ГО N0:9, и Ь3, содержащие остатки 89-96 по Кабат 8ЕО ГО N0:9; или вариант связывающей единицы.

В настоящем изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с ΟΌ127 и содержит связывающую единицу Н3, содержащую остатки 95-101 по Кабат 8Е0 ГО N0:45, или вариант Н3. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческий, гуманизированный или химерный антигенсвязывающий белок, такой как антитело.

Антигенсвязывающий белок может дополнительно содержать одну или более чем одну или все связывающие единицы, выбранные из Н1, содержащие остатки 31-32 по Кабат 8Е0 ГО N0:45, Н2, содержащие остатки 52-56 по Кабат 8Е0 ГО N0:46, Ь1, содержащие остатки 30-34 по Кабат 8Е0 ГО N0:46, Ь2, содержащие остатки 50-55 по Кабат 8Е0 ГО N0:46, и Ь3, содержащие остатки 89-96 по Кабат 8Е0 ГО N0:46; или вариант связывающей единицы.

Например, антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н3 и связывающую единицу Н1 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н3 и связывающую единицу Н2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н1, связывающую единицу Н2 и связывающую единицу Н3 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Ь1 и связывающую единицу Ь2 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Ь2 и связывающую единицу Ь3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Ь1, связывающую единицу Ь2 и связывающую единицу Ь3 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н3 и связывающую единицу Ь3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н3, связывающую единицу Н2 и связывающую единицу Ь3 или их варианты. Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н3, связывающую единицу Н2, связывающую единицу Ь2 и связывающую единицу Ь3 или их варианты.

Антигенсвязывающий белок может содержать связывающую единицу Н1, связывающую единицу Н2, связывающую единицу Н3, связывающую единицу Ь1, связывающую единицу Ь2 и связывающую единицу Ь3 или их варианты.

Вариант 0ΌΚ или вариант связывающей единицы включает аминокислотную последовательность, модифицированную по меньшей мере по одной аминокислоте, где указанная модификация могут быть химической или представлять собой частичное изменение аминокислотной последовательности (например, не более чем по 10 аминокислотам), где модификация дает варианту возможность сохранять биологические характеристики немодифицированной последовательности. Например, вариант представляет собой функциональный вариант, которые связывается с ΟΌ127. Частичное изменение аминокислотной последовательности 0ΌΚ может осуществляться путем делеции или замены от одной до нескольких аминокислот, или путем добавления или вставки от одной до нескольких аминокислот, или путем их комбинации (например, по не более чем 10 аминокислотам). Такой вариант 0ΌΚ или вариант связывающей единицы может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных замен, добавлений или делеций в любой комбинации в аминокислотной последовательности. Такой вариант 0ΌΚ или вариант связывающей единицы может содержать 1, 2 или 3 аминокислотных замены, вставки или делеции в любой комбинации в аминокислотной последовательности. Замены аминокислотных остатков могут представлять собой консервативные замены, например замену одной гидрофобной аминокислоты на альтернативные гидрофобные аминокислоты. Например лейцин может быть заменен на валин или изолейцин.

0ΌΚ Ь1, Ь2, Ь3, Н1, Н2 и Н3 имеют тенденцию структурно демонстрировать одну из ограниченного количества конформаций основной цепи (канонических). Конкретный класс канонической структуры 0ΌΚ определяется как длиной 0ΌΚ, так и упаковкой петли, определяемой остатками, располагающимися в ключевых положениях как 0ΌΚ, так и скелетных областях (остатки, определяющие структуру, или 8ΌΚ). Майш аиб ТПогпЮп (1996; 1 Μοί ΒίοΙ 263:800-815) разработали автоматический способ для определения ключевого остатка канонической матрицы. Кластерный анализ используют для определения канонических классов для наборов 0ΌΚ, и канонические матрицы затем идентифицируют путем анализа скрытой гидрофобности, водородсвязывающих остатков и консервативных глицинов и пролинов. 0ΌΚ последовательностей антитела могут быть распределены по каноническим классам путем сравнения последовательностей с матрицами ключевых остатков и оценки каждой матрицы с использованием матриц идентичности или сходства.

На основе канонического класса антитела 1А11 Н3Ь4 (ЗЕО ГО N0:13 (1А11.Н3 У_Н) или ЗЕО ГО N0:22 (1А11.Ь4 У_к)) связывание функционального антитела может быть предсказано таким образом, чтобы поддерживалось в присутствии следующих замен 0ΌΚ, где аминокислоты перед номером по Кабат представляют собой исходную аминокислотную последовательность, а аминокислотная последовательность в конце номера по Кабат представляют собой замещенные аминокислоты:

- 24 023700 канонические СОКН1:

Υ32Ι, Υ32Η, Υ32Ρ, Υ32Τ, Υ32Ν, Υ32Ο, Υ32Ε, Υ32ϋ Τ33Υ, ТЗЗА, Τ33νν, ТЗЗС, Τ33Ι_, Τ33ν Μ34Ι, Μ34ν, М341Л/

Ν35Ε, Ν35Η, N350, N358, Ν35Υ, Ν35Τ канонические С0КН2:

Ь50Р, Ь50Е, Ι_50\Λ/, Ι_50Υ, Ι_50<3,1.500, Ι_50ν, Ι_50Ν, Ι_50Κ, Ν50Α

151 ί, 151V, 151 Τ, 1518, 151Ν

Ν52ϋ, Ν52Ε N528, Ν52Υ

Υ53Α, Υ53Ο, Υ538, Υ53Κ, Υ53Τ, Υ53Ν

N548, Ν54Τ, Ν54Κ, Ν54ϋ, N540 ν56Υ, ν56Κ, ν56Ε, ν56ϋ, ν56Ο, У563, ν56Α 358Κ, 358Ν, 358Τ, 358ϋ, 358Ρ, 3580, 558Ρ, 358Υ канонические СОКНЗ:

νΐΟ2Υ, У102Н, VI02Ι, VI028, νΐ02ϋ, VI020 канонические СОКИ:

329У

МЗЗЬ канонические С0К1.3:

0891.

Ε90Ο \Λ/91Υ

Υ938, Υ93Κ

Таким образом, антигенсвязывающий белок может содержать или не содержать любую из вышеприведенных замен в положении СОВ. Может иметь место множество замен на вариант СОВ, на соответствующий СОВ, на связывающую единицу, на вариабельную область тяжелой или легкой цепи, на тяжелую или легкую цепь и на антигенсвязывающий белок, и таким образом любая комбинацию замен может присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению, при условии, что каноническая структура СОВ сохраняется.

Для того чтобы избежать неопределенности, вышеописанные замены не следует рассматривать как ограничивающие возможные замены в СОВ, которые могут быть осуществлены при сохранении функционального антитела против СЭ127.

Антигенсвязывающий белок, содержащий описанный СОВ, соответствующий СОВ, вариант СОВ, связывающие единицы или вариант связывающих единиц, могут демонстрировать силу связывания с СГО127, о чем свидетельствует ЕС50 (средняя эффективная концентрация), в пределах 10 крат, или в пределах 5 крат относительно силы, продемонстрированной 1А11с (химера, ν_Η - ЗЕО ГО N0:28, ν_κ - ЗЕО ГО N0:29) или 6А3с (химера, ν_Η - ЗЕО ГО N0:74, ν_κ - ЗЕО ГО N0:75). Сила связывания с СГО127 может быть продемонстрована различными способами, такими как связывающая аффинность (например, при помощи В1Асоге), или ЕС₅₀ (например, при помощи анализа ЕЬ1ЗА (иммуноферментный анализ)).

Как обсуждалось выше, конкретный класс канонической структуры СОВ определяется как длиной СОВ, так и упаковкой петли, определяемой остатками, располагающимися в ключевых положениях как СОВ, так и областях скелетной области. Таким образом, дополнительно к СОВ, представленному в ЗЕО ГО N0:2-6, варианте СОВ, соответствующему СОВ, связывающим единицам или их вариантам замены могут быть произведены по остаткам скелетной области антигенсвязывающего белка по изобретению на основе канонического класса при сохранении функционального антитела. Последние могут включать (с использованием нумерации Кабата):

тяжелая цепь: ν, I или О в положении 2; Ь или ν в положении 4; Ь, I, М или ν в положении 20; С в положении 22; Т, А, ν, О или З в положении 24; О в положении 26; I, Р, Ь или З в положении 29; в положении 36; или Υ в положении 47; I, М, ν или Ь в положении 48; I, Ь, Р, М или ν в положении 69; ν, А, В или Ь в положении 71; А, Ь, ν, Υ или Р в положении 78; Ь или М в положении 80; Υ или Р в положении 90; С в положении 92; и/или В, К, О, З, Н или N в положении 94; и/или легкая цепь: I, Ь или ν в положении 2; ν, О, Ь или Е в положении 3; М или Ь в положении 4; С в положении 23; в положении 35; Υ, Ь или Р в положении 36; З, Ь, В или ν в положении 46; Υ, Н, Р или К в положении 49; Υ или Р в положении 71; С в положении 88; и/или Р в положении 98.

- 25 023700

Любое из вышеописанных положений скелетной области, любая их комбинация или все из вышеописанных положений скелетной области могут присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению. Может существовать множество вариантов канонических положений скелетной области на вариабельную область тяжелой или легкой цепи, на тяжелую или легкую цепь и на антигенсвязывающий белок, и, таким образом, любая комбинация может присутствовать в антигенсвязывающем белке по изобретению, при условии, что сохраняется каноническая структура скелетной области.

Например, вариабельная скелетная область тяжелой цепи может содержать V в положении 2, Ь в положении 4, V в положении 20, С в положении 22, А в положении 24, О в положении 26, Р в положении 29, в положении 36, в положении 47, М в положении 48, Ь в положении 69, В в положении 71, А в положении 78, М в положении 80, Υ в положении 90, С в положении 92, и В в положении 94, и, например, вариабельная скелетная область легкой цепи может содержат I в положении 2, Ь в положении 4, С в положении 23, в положении 35, Υ в положении 36, Р в положении 71, С в положении 88, Е в положении 90 и Υ в положении 93.

Описанные здесь один или более чем один из СОВ, соответствующий СОВ, вариант СОВ или связывающая единица могут присутствовать в контексте человеческой скелетной области, например, в качестве гуманизированного или химерного вариабельного домена.

Гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи может содержать СОВ, представленный в 8ЕО ГО N0:2-4, или 8Е0 ГО N0:39-41; вариант этого СОВ; соответствующий СОВ; связывающие единицы; или их варианты, в скелетной области акцепторного антитела, имеющего 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую или 100% идентичность в скелетных областях с последовательностью человеческого акцепторного вариабельного домена в 8Е0 ГО N0:116.

Гуманизированный вариабельный домен легкой цепи может содержать СОВ, представленный в 8Е0 ГО N0: 5-7 или 8Е0 ГО N0:42-44; вариант этого СОВ; соответствующий СОВ; связывающие единицы или их варианты в скелетной области акцепторного антитела, имеющего 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую или 100% идентичность в скелетных областях с последовательностью человеческого акцепторного вариабельного домена в 8Е0 ГО N0:117.

В изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из любой из 8Е0 ГО N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 или 131. Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную областью легкой цепи, выбранную из любой из 8Е0 ГО N0:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. Любые вариабельные области тяжелой цепи могут быть комбинированы с любыми вариабельными областями легкой цепи. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать СГО127.

В изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который связывается с СГО127 и содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из любой из 8Е0 ГО N0:48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69. Антигенсвязывающий белок может содержать вариабельную область легкой цепи, выбранную из любой из 8Е0 ГО N0:70, 71, 72, 73 или 138. Любые вариабельные области тяжелой цепи могут быть комбинированы с любыми вариабельными областями легкой цепи. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать СГО127.

Вариабельная область тяжелой цепи антитела может иметь 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую или 100% идентичность любой из 8ЕЕ) ГО N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 или 131; или 8ЕЕ) ГО N0:48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69.

Вариабельная область легкой цепи антитела может иметь 75% или большую, 80% или большую, 85% или большую, 90% или большую, 95% или большую, 98% или большую, 99% или большую, или 100% идентичность любой из 8Е0 ГО N0:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27; или 8Е0 ГО N0:70, 71, 72, 73 или 138.

Процентная идентичность вариантов 8Е0 ГО N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 121, 123, 125, 127, 129 или 131 может быть определена по полноразмерной последовательности.

Вариабельная область тяжелой цепи антитела может представлять собой вариант любой из 8Е0 ГО N0:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 или 131, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию.

Вариабельной область легкой цепи антитела может представлять собой вариант любой из 8Е0 ГО N0:18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию;

Например, описанные выше канонический СОВ и канонические замены остатков в скелетной области могут также быть представлены в вариантах вариабельной области тяжелой или легкой цепи как варианты последовательностей, которые по меньшей мере на 75% идентичны или которые содержат до 30 аминокислотных замен.

В еще одном воплощении вариабельная область тяжелой цепи антитела может представлять собой

- 26 023700 вариант любой из ЗЕО ГО N0: 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию. Вариабельная область легкой цепи антитела может представлять собой вариант любой из ЗЕО ГО N0: 70, 71, 72 или 73, которая содержит 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену, вставку или делецию.

Например, описанные выше канонический СЭК и канонические замены остатков в скелетной области могут также быть представлены в вариантах тяжелой или легкой цепи как варианты последовательности, которые по меньшей мере на 75% идентичны или которые содержат до 30 аминокислотных замен.

Любые вариабельные области тяжелой цепи по изобретению могут быть комбинированы с подходящей человеческой константной областью. Любые вариабельные области легкой цепи по изобретению могут быть комбинированы с подходящей константной областью.

В изобретении также предложен антигенсвязывающий белок, который специфически связывается с СГО127 и содержит любую из следующих комбинаций вариабельного домена тяжелой цепи и легкой цепи: 1А11.Н3.Ь4 (ЗЕО ГО N0:13 и ЗЕО ГО N0:22), или антигенсвязывающий белок, которых имеет вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 75% идентичность с ЗЕО ГО N0:13, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий по меньшей мере 75% идентичность с ЗЕО ГО N0:22. Антигенсвязывающий белок может также нейтрализовать СЭ127.

Описанные выше антигенсвязывающие белки, например варианты с частичным изменением последовательности путем химической модификации и/или вставки, делеции или замены одного или более чем одного аминокислотного остатка, или варианты с 75% или большей, 80% или большей, 85% или большей, 90% или большей, 95% или большей, 98% или большей, или 99% или большей идентичностью с любой из описанных выше последовательностей, могут демонстрировать силу связывания с СЭ127, что продемонстрировано при помощи ЕС₅₀ или В1Асоге, в пределах 10 крат или в пределах 5 крат относительно силы, продемонстрированной 1А11 или 6А3. Эффективность связывания с СЭ127 может быть продемонстрована при помощи ЕС₅₀, путем осуществления анализа ЕЫЗА или при помощи связывающей аффинности, осуществляемой посредством В1Асоге.

Авторы настоящего изобретения также определили экспериментально, что некоторые положения в СЭКН3 могут быть замещены, что приводит в результате к уменьшенной связывающей аффинности (т.е. более сильному связыванию). Такие аналоги СЭКН3 изложены в табл. 4. Обнаружено, что замены в положениях N98 и Р100Ь (нумерация Кабата) особенно эффективны для увеличения аффинности. Конкретные замены включают N980, №98Е. Р100ЬЕ, Р100Ь1 и Р100ЬУ. Последовательности СГОВН3. демонстрирующие эти замены, представляют собой ЗЕО ГО N0:132, 133, 134, 135, 136 и 137 соответственно.

В настоящем изобретении рассмотрено включение таких замен в любое из описанных здесь антител.

В одном воплощении антитело по изобретению имеет остаток (Тгр) в положении 100.

Может быть желательно модифицировать эффекторную функцию антигенсвязывающего фрагмента, например, для усиления АОСС (опосредованной антителами клеточной цитотоксичности) или СЭС, периода полувыведения и т.п.

В одном воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению могут быть Рс деактивированными. Один из путей для осуществления деактивации Рс включает замену остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация в соответствии с индексом ЕЙ (Евросоюза)) константной области тяжелой цепи. Альтернативно, антигенсвязывающий белок может быть с активным Рс и не включать замену аланина в положениях 235 и 237.

Антигенсвязывающий белок может иметь период полувыведения по меньшей мере 6 ч, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 9 суток у людей ίη νίνο, или в мышиной животной модели.

Антигенсвязывающий белок может быть получен у крысы, мыши, примата (например, яванского макака, игрунки или человекообразных обезьян) или человека. Антигенсвязывающий белок может представлять собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. Антигенсвязывающий белок может содержать константную область, которая может иметь любой изотип или подкласс. Константная область может иметь изотип 1§О, например 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1§04 или их варианты. Константная область антигенсвязывающего белка может представлять собой 1дО1.

Мутационные изменения в Рс эффекторной области антитела могут быть использованы для изменения аффинности взаимодействия между РсКл и антителом для того, чтобы изменить оборот антитела. Период полувыведения антитела может быть увеличен ίη νίνο. Последнее может быть благоприятно для популяций пациентов, поскольку максимальные дозы и максимальные частоты введения доз могут быть достигнуты в результате поддержания 1С₅₀ (средней ингибирующей концентрации) ίη νίνο в течение более длительных периодов времени. Рс эффекторная функция антитела может быть удалена полностью или частично, поскольку может быть нежелательно уничтожать клетки, экспрессирующие СО127. Это удаление может приводить в результате к увеличению профиля безопасности.

- 27 023700

Антигенсвязывающий белок, содержащий константную область, может обладать уменьшенной АОСС и/или активацией комплемента, или эффекторной функцией. Константный домен может содержать деактивированную естественным путем константную область изотипа 1дО2 или 1дО4, или константную область мутантного 1дО1. Примеры подходящих модификаций описаны в ЕР0307434. Один из путей для достижения деактивации Рс включает замену остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация в соответствии с индексом ЕЙ (Евросоюза)) константной области тяжелой цепи.

Антигенсвязывающий белок может содержать одну или более чем одну модификацию, выбранную из мутантного константного домена, таким образом, что антитело обладает усиленными эффекторными функциями/АЭСС и/или активацией комплемента. Примеры подходящих модификаций описаны в §Ые1Бк е! а1. ί. Βΐο1. СЬет (2001) 276:6591-6604, Ез/зг е! а1. РЫАБ (2006) 103:4005-4010 и и§6737056, №02004063351 и №02004029207.

Антигенсвязывающий белок может содержать константный домен с измененным профилем гликозилирования таким, что антигенсвязывающий белок обладает усиленными эффекторными функциями/АЭСС и/или активацией комплемента. Примеры подходящих способов продукции антигенсвязывающего белка с измененным профилем гликозилирования описаны в №02003/011878, №02006/014679 и ЕР1229125.

Полипептид СГО127, с которым связывается антигенсвязывающий белок, может представлять собой рекомбинантный полипептид, и может содержать внеклеточный домен (ЕСГО), возможно слитый с другим белком, такой как домен Рс, или может содержать полноразмерный белок С.П127. С.П127 может находиться в растворе или может быть присоединен к твердой поверхности. Например, СП127 может быть присоединен к шарикам, такие как магнитные шарики. СГО127 может быть биотинилирован. Молекула биотина, конъюгированная с СГО127, может быть использована для иммобилизации СГО127 на твердой поверхности путем связывания биотинстрептавидина на твердой поверхности.

В настоящем изобретении также предложена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанный здесь антигенсвязывающий белок. Молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, кодирующую (1) один или более чем один СПИН, вариабельную последовательность тяжелой цепи или полноразмерную последовательность тяжелой цепи; и (2) один или более чем один СОКЬ, вариабельную последовательность легкой цепи или полноразмерную последовательность легкой цепи, с (1) и (2) на такой же молекуле нуклеиновой кислоты. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанный здесь антигенсвязывающий белок, может содержать последовательности, кодирующие (а) один или более чем один СГОКН, вариабельную последовательность тяжелой цепи, или полноразмерную последовательность тяжелой цепи; или (б) один или более чем один СОКЬ, вариабельную последовательность легкой цепи, или полноразмерную последовательность легкой цепи, с (а) и (б) на отдельных молекулах нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи, может содержать §Е0 ГО N0:30-36. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, может содержать §Е0 ГО N0:10-113.

Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи, может содержать §Е0 ГО N0:75-96. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, может содержать §Е0 ГО N0:97-100.

В настоящем изобретении также предложен экспрессирующий вектор, содержащий описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты. Также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая описанный здесь экспрессирующий вектор.

Описанный здесь антигенсвязывающий белок может продуцироваться в подходящей клеткехозяине. Способ продуцирования антигенсвязывающего белка, как описано здесь, может включать стадию культивирования описанной здесь клетки-хозяина и выделения антигенсвязывающего белка. Рекомбинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин может содержать по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, где указанная экспрессирующая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка и дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка. Альтернативно, рекомбинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин может содержать по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, где первая экспрессирующая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка, и дополнительно содержит вторую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка. Стабильно трансформированная клетка-хозяин может содержать вектор, содержащий одну или более чем одну экспрессирующую кассету, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь описанного здесь антигенсвязывающего белка. Например, такие клетки-хозяева могут содержать первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий тяжелую цепь.

Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего. Примеры таких клеточных линий включают СНО или N§0. Клетка-хозяин может представлять собой клетку-хозяина, отличную от человеческой. Клетка-хозяин может представлять собой неэмбрио- 28 023700 нальную клетку-хозяина. Клетка-хозяин может быть выращена в культуральных средах, например бессывороточных культуральных средах. Антигенсвязывающий белок может быть секретирован клеткойхозяином в культуральные среды. Антигенсвязывающий белок может быть очищен по меньшей мере до 95% или больше (например 98% или больше) от указанных культуральных сред, содержащих антигенсвязывающий белок.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно предложен набор, содержащий фармацевтическую композицию вместе с указаниями по применению. Для удобства набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с инструкциями по применению.

Структуры антител.

Интактные антитела.

Легкие цепи антител позвоночных животных можно отнести к одному из двух типов, названных каппа и лямбда на основе аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей человеческие антитела могут принадлежать к пяти отличающимся классам 1§А, Ι§ϋ, Ι§Ε, Ι§0 и 1дМ. Ι§0 и 1§А могут быть дополнительно разделены на подклассы Ι§01, Ι§02, Ι§03 и Ι§04; и !дА1 и ΙβΛ2. Видовые варианты существуют у мыши и крысы, имеющей, по меньшей мере, Ι8θ2;·ι, Ι§Ο2Β.

Более консервативные фрагменты вариабельной области названы скелетными областями (РК). Каждый из вариабельных доменов интактных тяжелой и легкой цепей содержит четыре РК, связанные тремя СОК. СОК в каждой цепи находится рядом с областями РК и вместе с СОК другой цепи вносит вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител.

Константные области непосредственно не вовлечены в связывание антител с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие в зависимой от антитела клеточноопосредованной цитотоксичности (АЭСС), фагоцитоз путем связывания с Рсу рецептором, скорость полувыведения/клиренса через неонатальный Рс рецептор (РсКп) и комплементзависимая цитотоксичность через С1с| компонент каскада комплемента.

Сообщалось, что константная область Ι§02 человека, по существу, лишена способности активировать комплемент классическим путем или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Сообщалось, что константная область Ι§04 лишена способности активировать комплемент классическим путем и только слабо опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность. Антитела, по существу, лишенные этих эффекторных функций, могут быть названы нелитическими антителами. Может быть желательно уменьшать эффекторную функцию антитела по изобретению, возможно до той степени, при которой антитело, по существу, не обладает эффекторной функцией. В одном воплощении антитело по изобретению является не литическим. В одном воплощении антитело по изобретению, по существу, не обладает эффекторной функцией. Антитело может быть конъюгировано или не конъюгировано с другой молекулой, например молекулой, предназначенной для модификации эффекторной функции, такой как цитотоксическая группировка или радиоактивная группировка. В одном воплощении антитело не конъюгировано с другой молекулой, такой как радиоактивная метка или цитотоксическая молекула. В этом воплощении антитело достигает своего функционального действия путем блокирования природного биологического взаимодействия, нежели чем путем прямого действия, уничтожающего клетки.

Человеческие антитела.

Человеческие антитела могут быть получены при помощи множества способов, известных специалистам в данной области техники. Человеческие антитела могут быть получены при помощи гибридомного способа с использованием клеточных линий человеческой миеломы или мышь-человеческой гетеромиеломы, смотри Ко/Ьог 1. Iттиηо1 133, 3001, (1984) и Вгобеиг, Мопос1опа1 АпБЬобу РгобисБоп ТесНпкщек апб АррЪсайопз, ρ. 51-63 (Магсе1 Эеккег Шс., 1987). Альтернативные способы включают применение фаговых библиотек или трансгенных мышей, в обоих из которых используются репертуары человеческих вариабельных доменов (смотри ХУиНег О., (1994), Аппи. Кеу. Iттипо1 12,433-455, Огееп Ь.Ь. (1999), 1. Iттипо1, теГОобк 231, 11-23).

В настоящее время имеется несколько штаммов трансгенных мышей, в которых локусы мышиного иммуноглобулина заменены сегментами генов человеческих иммуноглобулинов (смотри Топи/ика Κ., (2000) Р^8 97,722-727; РвЬтеИб О.М. (1996) ХаПие Вю1есНпо1. 14,845-851, Мепбе/ М.1, 1997, ХаШге ОепеБск, 15, 146-156). После антигенной стимуляции такие мыши способны продуцировать спектр человеческих антител, из которых могут быть выбраны интересующие антитела.

Для получения человеческих антигенсвязывающих белков (и их фрагментов) можно использовать технологию фагового дисплея, смотри МсСаГГеПу (1990) №11игс, 348, 552-553 и ΟτίΓΓίΐΗδ ΛΌ. е! а1. (1994) ЕМВ0 13: 3245-3260.

Способ аффинного созревания (Магкк; Вю1ес1то1. (1992) 10, 779-783) может быть использован для улучшения связывающей аффинности, где аффинность первичного человеческого антитела улучшается путем последовательного замещения вариабельных доменов Н- и Ь-цепи встречающимися в природе вариантами и отбора на основе улучшенных связывающих аффинностей. В настояще время также из- 29 023700 вестны варианты этого способа, такие как эпитопный импринтинг, смотри, например \0 93/06213; \а!егЬоике (1993) Ыис1. Ас1йк Кек 21, 2265-2266.

Химерные и гуманизированные антитела.

Химерные антитела типично получают с использованием способов рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующую антитела (например, кДНК), выделяют и секвенируют с использованием обычных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими Н- и Ь-цепи антител). Клетки гибридомы служат в качестве типичного источника такой ДНК. После выделения ДНК помещают в экпрессирующие векторы, который затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как Е. сой, клетки С0З, клетки СНО или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, с обеспечением синтеза антитела. ДНК может быть модифицирована путем замены кодирующей последовательности человеческих Ь- и Н-цепей на соответствующие нечеловеческие (например, мышиные) Н и Ь константные области; смотри, например, Моткоп (1984) РNАЗ 81, 6851.

Значительное уменьшение иммуногенности может быть достигнуто путем прививания только СОК нечеловеческих (например, мышиных) антител (донорные антитела) на человеческий скелет (акцепторный скелет) и константные области с образованием гуманизированных антител (смотри 1опек е! а1. (1986) №Лиге 321, 522-525 и УегЬоеуеп М. е! а1. (1988) Заепсе 239, 1534-1536). Тем не менее, само по себе прививание СОК может не приводить в результате к полному сохранению антигенсвязывающих свойств, и часто обнаруживают, что некоторые остатки скелета (иногда называемые обратные мутации) донорного антитела не обязательно должны сохраняться в гуманизированной молекуле, если существенная антигенсвязывающая аффинность должна быть восстановлена (смотри Спееп С. е! а1. (1989) РNАЗ 86, 10,029-10,033, Со е! а1. (1991) №йиге 351, 501-502). В этом случае из базы данных выбирают человеческие вариабельные области, демонстрирующие наибольшую гомологию последовательности с нечеловеческим донорным антителом, для того, чтобы обеспечить человеческий скелет (РК). Выбор человеческих РК может быть осуществлен из человеческих консенсусных или индивидуальных человеческих антител. Когда необходимо, тогда ключевые остатки донорного антитела замещаются в человеческом акцепторном каркасе для сохранения конформаций СОК. Компьютерное моделирование антитела может быть использовано для того, чтобы способствовать идентификации таких структурно важных остатков, смотри \099/48523.

Альтернативно, гуманизация может быть достигнута способом маскировки. Статистическим анализом уникальных человеческих и мышиных вариабельных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов было выявлено, что точные паттерны открытых остатков различны в человеческих и мышиных антителах, и наиболее характерные поверхностные положения строго предпочтительны для малого числа различных остатков (смотри Рай1ап Е.А. е! а1.; (1991) Мо1. 1ттипо1. 28, 489-498 и Рейегкеп ТТ. е! а1. (1994) 1. Мо1. Вю1. 235; 959-973). Таким образом, можно уменьшить иммуногенность нечеловеческого Ρν путем замены презентируемых остатков в его скелетной области, которые отличаются от обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку антигенность белка может коррелировать с доступностью поверхности, замена поверхностных остатков могут быть достаточной для того, чтобы сделать мышиный вариабельные домен невидимый для человеческой иммунной системы (смотри также Магк С.Е. е! а1. (1994) в НапйЬоок о£ Ехрептеп1а1 РЬагтасо1оду νо1. 113: ТЬе рЬагтасо1оду о£ топос1опа1 АпЕЬоФек, Зртшдег-Уег1ад, р. 105-134). Этот способ гуманизации назван венированием, поскольку только поверхностные антитела изменяются, тогда как поддерживающие остатки остаются ненарушенными.

Таким образом, возможно снижение иммуногенности Ρν-фрагмента от источника, не являющегося человеком, заменой открытых остатков в его скелетных областях, отличающихся от остатков, обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку может быть установлена корреляция между антигенностью белка и доступностью поверхности, замена поверхностных остатков может быть достаточной для того, чтобы мышиная вариабельная область была невидима для иммунной системы человека (смотри также Магк С.Е. е! а1. (1994) в НапйЬоок о£ Ехрептеп!а1 РЬагтасо1оду νо1. 113: ТЬе рЬагтасо1оду о£ топос1опа1 АпЕЬоФек, Зртшдег-Уег1ад, р. 105-134). Этот способ гуманизации называют маскировкой, поскольку изменяют только поверхность антитела без изменения поддерживающих остатков. Другие альтернативные подходы включают подходы, приведенные в \004/006955, и методику Нитапеетшд™ (Ка1оЬюк), в которой применяют бактериальные экспрессирующие системы и продуцируют антитела, близкие по последовательности к антителам зародышевой линии человека (А1£еш!о-М Айтапсшд Рго!еш ТЬегареиЕск, 1апиату 2007, Зап О1едо,СаЕ£огша).

Биопецифические антигенсвязывающие белки.

Биспецифический антигенсвязывающий белок представляет собой антигенсвязывающий белок, обладающий связывающими специфичностями в отношении по меньшей мере двух отличающихся эпитопов. Способы получения таких антигенсвязывающих белков известны в области техники. Традиционно, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на коэкспрессии двух пар Н-цепь-Ь-цепь иммуноглобулина, где две Н-цепи обладают отличающимися связывающими специфичностями, смотри МЕ1к!еш е! а1. (1983) ХаПне 305 537-539, \093/08829 и Ттаипескет е! а1. (1991) ЕМВ0 10, 3655-3659. Ввиду случайной сортировки Н- и Ь-цепей, получают потенциальную смесь десяти отличающихся

- 30 023700 структур антител, из которых только одна обладает желаемой связывающей специфичностью. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов, обладающих желаемыми связывающими специфичностями, с константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, областей СН2 и СН3. Область СН1, содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, может присутствовать по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующую эти слияния, и, если желательно, Ь-цепь, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы, и затем котрансфицируют в подходящий организм хозяина. Можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех цепей в один экспрессирующий вектор. В одном из подходов биспецифическое антитело состоит из Н-цепи, обладающей первой связывающей специфичностью, с одной стороны, и пары Н-Ь-цепь, обеспечивающей вторую связывающую специфичность, с другой стороны, смотри \У094/04690. Также смотри 8игекй е! а1. (1986) МеШойк ш Еп/уто1оду 121, 210.

Антигенсвязывающие фрагменты.

У фрагментов, лишенных константной области, отсутствует способность активировать комплемент классическим путем или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Традиционно такие фрагменты получают протеолитическим расщеплением интактных антител, например расщеплением под действием папаина (смотри, например, \У0 94/29348), но они могут быть получены непосредственно из рекомбинантным образом трансформированных клеток хозяина. Для получения 8сРу смотри Вий е! а1., (1988) 8с1епсе, 242, 423-426. Кроме этого, антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием ряда описанных ниже инженерных методик.

По-видимому, Ρν-фрагменты характеризуются более низкой энергией взаимодействия между двумя их цепями, чем фрагменты РаЬ. Для стабилизации ассоциации У_н- и У_ъ-доменов они были соединены с помощью пептидов (Вйй е! а1., (1988) 8аепсе 242, 423-426, ник!оп е! а1., РNА8, 85, 5879-5883), дисульфидных мостиков (01осккйиЬег е! а1. (1990) ВюскетМгу. 29, 1362-1367) и мутаций кпоЬ ш 1ю1е (Ζ1η.ι е! а1. (1997), Рго!еш δοΐ., 6, 781-788). 8сΡν-фрагменты могут быть получены при помощи способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, смотри \У1ш1о\у е! а1. (1991) Ме!йойк сотрашоп Ме!йойк Епхуток 2, 97-105 и ник!оп е! а1. (1993) 1п!. Ке\'. 1ттипо1 10, 195-217. 8сΡν могут быть получены в бактериальных клетках, таких как Е. сой, или в эукариотичеоких клетках. Одним из недостатков 8сΡν является моновалентность продукта, которая исключает наличие повышенной авидности, обусловленной поливалентным связыванием, и их короткий период полувыведения. Попытки преодоления этих проблем включают получение бивалентных ^Ρν'Λ из 8сΡν, содержащих дополнительный С-концевой цистеин, посредством химического сочетания (Айатк е! а1. (1993) Сап. Кек. 53, 4026-4034 и МсСайпеу е! а1. (1995) Рго!еш Епд. 8, 301-314) или в результате спонтанной сайт-специфической димеризации 8сΡν, содержащих неспаренный С-концевой остаток цистеина (смотри Карпуапо\' е! а1. (1995) Се11. Вюрйук. 26, 187-204). Альтернативно, можно заставить 8сΡν образовывать мультимеры, укорачивая пептидный линкер между 3 и 12 остатками с образованием диател, смотри ноШдег е! а1. (1993) РNА8 90: 6444-6448. Дальнейшее уменьшение размеров линкера может приводить к образованию тримеров 8сРУ (трител, смотри Кой! е! а1. (1997) Рго!еш Епд., 10, 423-433) и тетрамеров (тетрател, смотри Ье 0а11 е! а1. (1999) РЕВ8 Ьей., 453, 164-168). Конструирование бивалентных молекул 8сΡν также может быть осуществлено посредством генетического слияния с димеризующими белок мотивами с образованием миниантител (смотри Раск е! а1. (1992) Вюсйетшйу 31, 1579-1584) и минител (смотри ни е! а1. (1996), Сапсег Кек. 56, 3055-3061). Тандемы 8сΡν-8сΡν (^Ρν^) также могут быть получены путем соединения двух 8сΡνединиц с использованием третьего пептидного линкера, смотри Кнгнс/ е! а1. (1995) 1. 1тто1. 154, 45764582. Биспецифические диатела могут быть получены посредством нековалентного объединения двух одноцепочечных продуктов слияния, состоящих из Ун-домена одного антитела, соединенного коротким линкером с У_ь-доменом другого антитела, смотри К^ρ^^уаиоν е! а1. (1998), 1п!. 1. Сап. 77, 763-772. Стабильность таких биспецифических диател может быть повышена посредством введения дисульфидных мостиков или мутаций кпоЬ ш йо1е, как описано выше, или посредством образования одноцепочечных диател (8сОЬ), в которых два гибридных 8сΡν-фрагмента соединены через пептидный линкер, смотри Коп!егтапп е! а1. (1999) 1. 1ттипо1. Ме!йойк, 226, 179-188. Тетравалентные биспецифические молекулы могут быть получены, например, в результате слияния 8сΡν-фрагмента с Сн3-доменом молекулы 1дО или с РаЬ-фрагментом через шарнирную область, смотри Со1ота е! а1. (1997) №Циге Вю!есЬпо1. 15, 159163. Альтернативно, тетравалентные биспецифические молекулы созданы в результате слияния биспецифических одноцепочечных диател (смотри А1! е! а1., (1999) РЕВ8 Ье!!. 454, 90-94). Тетравалентные биспецифические молекулы меньших размеров также могут быть образованы посредством димеризации либо тандемов 8сΡν-8сΡν с линкером, содержащим мотив спираль-поворот-спираль (ΈίΕί миниантитела, смотри Ми11ег е! а1. (1998) РЕВ8 Ье!!. 432, 45-49), либо одноцепочечных молекул, содержащих четыре вариабельных домена (У_н и У_ь) антитела в ориентации, предотвращающей внутримолекулярное спаривание (тандемное диатело, смотри Карпуапо\' е! а1. (1999) 1. Мо1. Вю1. 293, 41-56). Биспецифические Р(аЬ')₂-фрагменты могут быть созданы посредством химического соединения РаЬ'-фрагментов или в результате гетеродимеризации через лейциновые застежки (смотри 8йа1аЬу е! а1., (1992) 1. Ехр. Мей. 175, 217-225 и Кок!е1пу е! а1. (1992), 1. 1ттипо1. 148, 1547-1553). Кроме этого, возможно получение отдельных У_н- и У_ъ-доменов, смотри И8 6248516; И8 6291158; И8 6172197.

- 31 023700

Г етероконъюгатные антитела.

Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител, полученных с использованием любого удобного способа перекрестного связывания; смотри, например, И8 4676980.

Другие модификации.

Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут содержать другие модификации для усиления или изменения их эффекторных функций. Предполагается, что используемый здесь термин эффекторная функция относится к одному или более чем одному зависимому от антитела ответу в виде опосредованной антителами клеточной цитотоксической активности (АОСС) и ответу в виде комплементзависимой цитотоксической активности (СИС)· Рс-опосредованному фагоцитозу и рециркуляции антитела через РсВп рецептор. Для антитела 1дО эффекторные функции, включающие АИСС и АОСР, опосредованы путем взаимодействия константной области тяжелой цепи с семейством Рсу рецепторов, представленных на поверхности иммунокомпетентных клеток. У людей последние включают РсуВ1 (СЭ64), РсуВП (СЭ32) и РсуВШ (СЭ16). Взаимодействие между антигенсвязывающим белком, связанным с антигеном, и образование комплекса Рс/Рсу вызывает диапазон действий, включающий цитотоксичность, активацию иммунокомпетентных клеток, фагоцитоз и высвобождение провоспалительных цитокинов.

Полагают, что взаимодействие между константной областью антитела и различными Рс рецепторами (РсВ) опосредует эффекторные функции антитела. Значительные биологические действия могут представлять собой следствие эффекторной функциональности, в частности, опосредованной антителами клеточной цитотоксической активности (АОСС), связывания комплемента (комплементзависимой цитотоксичности или СЭС), фагоцитоза (зависимого от антитела клеточноопосредованного фагоцитоза или АОСР) и периода полувыведения/клиренса антитела. Обычно способность опосредовать эффекторную функцию требует связывания антитела с антигеном, и не все антитела опосредуют каждую эффекторную функцию.

Эффекторная функция может быть измерена множеством путей, включающих, например, связывание РсуВШ с естественными клетками-киллерами или РсуВ1 с моноцитами/макрофагами для измерения АЭСС эффекторной функции. Например, антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению обладает усиленной АЭСС эффекторной функцией в анализе с естественными клетками-киллерами. Примеры таких анализов можно найти в 8Ые1б5 е! а1., 2001 Тйе 1оигпа1 о£ Вю1одюа1 Сйет18йу, νο1. 276, р65916604; Сйарре1 е! а1., 1993 Тйе 1оигпа1 о£ Вю1одюа1 Сйет18йу, ^1. 268, р25124-25131; йа/аг е! а1., 2006 РЫА5, 103; 4005-4010.

Примеры анализов для определения функции СЭС включают описанные в 1995 1. 1тт. Ме!й. 184:29-38.

Несколько изотипов человеческих константных областей, в частности изотипы 1дО4 и 1дО2, по существу, лишенные функций а) активации комплемента классическим путем и б) антителозависимой клеточной цитотоксичности. Различные модификации константной области тяжелой цепи антигенсвязывающих белков могут быть осуществлены в зависимости от желаемого свойства эффектора. Константные области 1дО1, содержащие специфические мутации, как отдельно описано, уменьшают связывание с Рс рецепторами, и, таким образом, уменьшают АЭСС и СЭС (Эипсап е! а1. №!иге 1988, 332; 563-564; Ьипб е! а1. I. 1ттипо1. 1991, 147; 2657-2662; Сйарре1 е! а1. РЫА!$ 1991, 88; 9036-9040; Вийоп апб Уоо£ Ά6ν. 1ттипо1. 1992, 51; 1-84; Могдап е! а1., 1ттипо1оду 1995, 86; 319-324; Не/агей е! а1., I. νΐΐΌ1. 2001, 75 (24); 12161-12168).

Различные модификации области Рс антител по изобретению могут быть осуществлены в зависимости от желаемого свойства. Например, специфические мутации области Рс для того, чтобы сделать литическое антитело нелитическим, подробно описаны в ЕР 0629240В1 и ЕР 0307434В2, или могут включать эпитоп связывания с рецептором спасения (какаде гесер!ог Ьшбшд ерйоре) в антитело для увеличения периода полувыведения из сыворотки крови, смотри И8 5739277. Человеческие Рсу рецепторы включают: РсуВ (I), РсуВПа, РсуВПЬ, РсуВШа и неонатальный РсВп. 8Ые1б5 е! а1., (2001) 1. Вю1. Сйет 276, 6591-6604 продемонстрировал, что общий набор остатков 1дО1 вовлечен в связывание со всеми РсуВ, тогда как РсуВП и РсуВШ используют различные сайты вне этого общего набора. Одна группа остатков 1дО1 уменьшает связывание со всеми РсуВ при замене на аланин: Рго-238, Акр-265, Акр-270, Акп297 и Рго-239. Все располагаются в 1дО СН2 домене и группируются около шарнира, сочленяющего СН1 и СН2. Хотя РсуВ1 использует только общий набор остатков 1дО1 для связывания, РсуВП и РсуВШ взаимодействуют с различными остатками дополнительно к общему набору. Изменение некоторых остатков уменьшает связывание только с РсуВП (например, Агд-292) или РсуВШ (например, О1и-293). Некоторые варианты продемонстрировали улучшенное связывание с РсуВ11 или РсуВШ, но не влияли на связывание с другим рецептором (например, 8ег-267А1а улучшал связывание с РсуВП, но связывание с РсуВШ не менялось). Другие варианты продемонстрировали улучшенное связывание с РсуВП или РсуВШ при уменьшении связывания с другим рецептором (например, 8ег-298А1а улучшал связывание с РсуВШ и уменьшал связывание с РсуВП). Для РсуВШа варианты 1дО1, обладающие наилучшим связыванием, имели комбинированные аланиновые замены по 8ег-298, О1и-333 и Ьу8-334. Полагают, что неонатальный

- 32 023700

РсКп вовлечен в клиренс антитела и трансцитоз через ткани (смотри 1ипдЬапк К.Р. (1997) 1ттипо1. Кек 16, 29-57 и СНебе е! а1. (2000) Аппи. Ке\'. 1ттипо1. 18, 739-766). Определили, что остатки человеческого 1§С1, которые непосредственно взаимодействуют с человеческим РсКп, включают 11е253, 8ег254, Ьук288, ТНг307, С1п311, Акп434 и Н1к435. Замены по любому из этих положений, описанных в этом разделе, могут обеспечить увеличение периода полувыведения из сыворотки крови и/или измененные эффекторные свойства антител.

Другие модификации включают варианты гликозилирования антител. Известно, что гликозилирование антител по консервативным положениям в их константных областях оказывает сильное действие на функцию антитела, в частности эффекторную функцию, такую как описанные выше, смотри, например, Воуб е1 а1. (1996), Мо1. 1ттипо1. 32, 1311-1318. Рассмотрены варианты гликозилирования антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где одна или более чем одна углеводородная группировка добавлена, замещена, удалена или модифицирована. Введение аспарагин-Хсеринового или аспарагин-Х-треонинового мотива создает потенциальный сайт для ферментативного присоединения углеводородных группировок и, поэтому, может быть использовано для манипуляции гликозилированного антитела. В Ка|и е! а1. (2001) ВюсНетЖгу 40, 8868-8876 концевое сиалирование иммуноадгезина ТНРК-1дС увеличивалось путем регалактозилирования и/или ресиалирования с использованием бета-1,4-галактозилтрансферазы и/или альфа, 2,3 сиалилтрансферазы. Полагают, что увеличение концевого сиалирования увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. Антитела, как и большинство гликопротеинов, типично продуцируются в виде смеси гликоформ. Эта смесь особенно очевидна, когда антитела продуцируются в эукариотических клетках, в частности клетках млекопитающих. Разработаны различные способы получения определенных гликоформ, смотри Ζ1ι;·ιπ§ е! а1. 8аепсе (2004), 303, 371, 8еагк е! а1., 8с1епсе, (2001) 291, 2344, ХУаскег е! а1. (2002) 8с1епсе, 298 1790, Эа\ак е! а1. (2002) СНет. Ке\; 102, 579, Напд е! а1. (2001) Асс. СНет. Кек 34, 727. Описанные здесь антитела (например, изотипа 1дС, например 1дС1) могут содержать определенное количество (например, 7 или меньше, например 5 или меньше, такое как два или одну) гликоформу(ы).

Антитела могут быть связаны или не связаны с небелковым полимером, таким как полиэтиленгликоль (РЕС), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Конъюгация белков с РЕС представляет собой признанный способ увеличения периода полувыведения белков, а также уменьшения антигенности и иммуногенности белков. Применение ПЭГ илирования с отличающимися молекулярными массами и типами (линейные или разветвленные) исследовали с интактными антителами, а также фрагментами РаЬ', смотри Коитетк е! а1. (2000) 1п!. I. РНагтасеи!. 198:83-95.

Способы получения.

Антигенсвязывающие белки могут быть получены в трансгенных организмах, таких как козы (смотри Ро11оск е! а1. (1999), I. 1ттипо1. Мебюбк 231:147-157), цыплята (смотри Могготе (2000) Сепе!. Епд. №\ук 20:1-55, мыши (смотри Ро11оск е! а1.) или растения (смотри Эогап (2000) Сигг. 0ршюп Вю!есНпо1. 11, 199-204, Ма (1998), №1. Меб. 4; 601-606, Вае/ е! а1. (2000) ВюРНагт 13: 50-54, 8!одег Е. е! а1. (2000) Р1ап! Мо1. Вю1. 42:583-590).

Антигенсвязывающие белки также могут быть получены при помощи химического синтеза. Тем не менее, антигенсвязывающие белки типично получают с использованием рекомбинантного способа выращивания клеток, хорошо известного специалистам в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий белок, выделен и встроен в реплицируемый вектор, такой как плазмида для дополнительного клонирования (амплификации) или экспрессии. Одна из систем экспрессии представляет собой глутаматсинтетазную систему (такую как реализуемую Ьоп/а Вю1од1ек), в частности, где клетка-хозяин представляет собой СНО или N80. Полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий белок, легко выделяют и секвенируют с использованием обычных способов (например, олигонуклеотидных зондов). Векторы, которые могут быть использованы, включают плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, из которых плазмиды типично используются. Как правило, такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более чем один маркерный ген, энхансерный элемент, промотор и последовательности терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом антигенсвязывающего белка для облегчения экспрессии. Полинуклеотиды, кодирующие легкую и тяжелую цепи, могут быть встроены в отдельные векторы, и введены (например, путем трансформации, трансфекции, электропорации или трансдукции) в ту же самую клетку-хозяина одновременно или последовательно, или, если желательно, то как тяжелая цепь, так и легкая цепь может быть встроена в тот же самый вектор перед указанным введением.

Оптимизация кодона может быть использована с целью, чтобы общий уровень белка, продуцированного клеткой-хозяином, был больше при трансфекции геном с оптимизированным кодоном по сравнению с уровнем при трансфекции последовательностью дикого типа. Опубликовано несколько способов (Яакатига е!. а1. (1996) №с1ею Лабк КекеагсН 24: 214-215; \У098/34640; \У097/11086). Вследствие вырожденности генетического кода, полинуклеотиды, альтернативные в отношении раскрытых здесь (особенно с оптимизированным кодоном для экспрессии в заданной клетке-хозяине), могут также кодировать описанные здесь антигенсвязывающие белки. Поэтому использование кодонов антигенсвязывающих белков по данному изобретению может быть модифицировано с целью согласования статисти- 33 023700 ческого отклонения кодонов (сойои Ыак) клетки-хозяина для увеличения выхода транскрипта и/или продукта (например, Ноекета с( а1., Мо1. Се11 ΒίοΙ., 1987, 7(8): 2914-24). Выбор кодонов может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой-хозяином.

Сигнальные последовательности.

Антигенсвязывающие белки могут быть получены в виде слитого белка с гетерологической сигнальной последовательностью, имеющей специфический сайт расщепления по N концу зрелого белка. Сигнальная последовательность должна быть идентифицирована и воспринята клеткой-хозяином. Для эукариотических клеток-хозяев сигнальная последовательность может представлять собой, например, щелочную фосфатазу, пенициллиназу или теплостабильный энтеротоксиновый II лидер. Для дрожжевой секреции сигнальные последовательности могут представлять собой, например, лидер дрожжевой инвертазы, лидер фактора или лидер кислой фосфатазы; смотри, например, \У090/13646. В системах на основе клеток млекопитающих подходящими могут быть лидеры вирусной секреции, такие как сигнал вируса простого герпеса §0, и нативная иммуноглобулиновая сигнальная последовательность. Типично, сигнальная последовательность лигирована в рамку считывания с ДНК, кодирующей антигенсвязывающий белок по изобретению.

Ориджин репликации.

Ориджин репликации хорошо известны в области техники, причем ρΒΚ.322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, 2μ плазмида для большинства дрожжей и различные вирусные ориджины, такие как 8У40, полиомы, аденовируса, У8У или ВРУ, для большинства клеток млекопитающих. Как правило, компонент ориджин репликации не является необходимым для экспрессирующих векторов млекопитающих, но 8У40 могут быть использованы, поскольку они содержат ранний промотор.

Маркер отбора.

Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину или (б) дополняют ауксотрофный дефицит или поставляют питательные вещества, отсутствующие в сложных средах, или (в) их комбинация. Схема отбора может включать прекращение роста клетки-хозяина. Клетки, которые успешно трансформируются генами, кодирующими антигенсвязывающий белок, выживают вследствие, например, лекарственной устойчивости, придаваемой маркером отбора. Один из примеров представляет собой ΌΗΡΚ (дигидрофолатредуктаза) маркер отбора, где трансформанты выращивают в присутствии метотрексата. Клетки могут быть выращены в присутствии увеличенных количеств метотрексата для увеличения количества копий экзогенного интересующего гена. Клетки СНО представляют собой особенно интересную клеточную линию для отбора ΌΗΡΚ. Дополнительный пример представляет собой глутаматсинтетазную систему экспрессии (Боп/а Вю1офе5). Пример селективного гена для применения в дрожжах представляет собой ген Ιτρ1, смотри 8йисксотЪ е( а1. (1979) №Лиге 282, 38.

Промоторы.

Подходящие промоторы для экспрессии антигенсвязывающих белков по изобретению функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий белок. Промоторы для хозяев-прокариот включают промотор р1юЛ. бета-лактамазу и лактозные промоторные системы, щелочную фосфатазу, триптофан и гибридные промоторы, такие как Тас. Промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, включают 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты, например энолазу, глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназу, гексокиназу, пируватдекарбоксилазу, фосфофруктокиназу, глюкозо-6-фосфатизомеразу, 3-фосфоглицератмутазу и глюкокиназу. Индуцируемые дрожжевые промоторы включают алкогольдегидрогеназу 2, изоцитохром С, кислую фосфатазу, металлотионеин и ферменты, ответственные за метаболизм азота или использование мальтозы/галактозы.

Промоторы для экспрессии в системах клеток млекопитающих включают вирусные промоторы, такие как промоторы вирусов полиомы, оспы птиц и аденовирусов (например, аденовируса 2), вируса папилломы крупного рогатого скота, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса (в частности, немедленного раннего генного промотора), ретровируса, вируса гепатита В, актина, вируса саркомы Рауса (К8У) и раннего или позднего промотора вируса обезьян 40. Безусловно, выбор промотора основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. Первая плазмида может содержать К8У и/или 8У40, и/или промотор СМУ, ДНК, кодирующую вариабельный домен легкой цепи (У_ь) по изобретению, область кС вместе с маркерами резистентности к неомицину и ампициллину для отбора, и вторую плазмиду, содержащую промотор К8У или 8У40, ДНК, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи (У_Н) по изобретению, ДНК, кодирующую γ1 константную область, ΌΗΡΚ и маркер резистентности к ампициллину.

Энхансерный элемент.

При необходимости, например, для экспрессии в клетках высших эукариот может быть использован энхансерный элемент, функционально связанный с промоторным элементом в векторе. Энхансерные последовательности млекопитающих включают энхансерные элементы глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина и инсулина. Альтернативно, можно использовать энхансерный элемент вируса эукариотических клеток, такой как энхансер 8У40 (по 100-270 п.о.), энхансер раннего промотора цитомегаловиру- 34 023700 са, энхансер ро1ута, бакуловирусный энхансер или мышиный 1дО2а локус (смотри ^004/009823). Энхансер может располагаться в векторе по сайту, располагающемуся выше относительно промотора. Альтернативно, энхансер может располагаться где угодно, например в нетранслируемой области или ниже относительно сигнала полиаденилирования. Выбор и расположение энхансера могут быть основаны на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Сигналы полиаденилирования/терминации.

В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий белок. Такие сигналы типично располагаются 3' относительно открытой рамки считывания. В системах млекопитающих не ограничивающие объем изобретения примеры включают сигналы, происходящие из гормонов роста, фактора элонгации-1 альфа и вирусных (например, δν40) генов, или ретровирусных длинных концевых повторов. В дрожжевых системах не ограничивающие объем изобретения примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают происходящие из генов фосфоглицераткиназы (РОК) и алкогольдегидрогеназы 1 (АЭН). В прокариотической системе сигналы полиаденилирования как правило не требуются, и вместо этого обычно используют более короткие и более определенные терминаторные последовательности. Безусловно, выбор последовательностей полиаденилирования/терминации основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Другие способы/элементы для увеличения выходов.

Дополнительно к вышеизложенному другие особенности, которые могут быть использованы для увеличения выходов, включают хроматин-ремоделирующие элементы, интроны и специфическую для клетки-хозяина модификацию.

Клетки-хозяева.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антигенсвязывающие белки, представляют собой прокариотические, дрожжевые клетки или клетки высших эукариот. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерий, например еШегоЬас1епасеае, такие как НзсНепсЫа, например Е. сой (например, АТСС 31,446; 31,537; 27,325), Нп1егоЬас1ег. Нпуйна. К1еЬз1е11а Рто1еиз, δа1тοηе11а, например δа1тοηе11а 1ур1йтипит. δе^^аΐ^а, например δе^^аί^а тагсезсапз, и δΙη^Ο. а также ВасбП, такие как В. зиЫШз и В. ПсНешГогпиз (смотри ΌΌ 266710), Рзеиботопаз, такие как Р.аегидшоза и δΐ^ерΐοтусез. Из дрожжевых клеток-хозяев также охвачены δассЬа^οтусез сегеу1з1ае, δс1иζοзассΗа^οтусез ротЬе, К1иууеготусез (например, АТСС 16,045; 12,424; 24178; 56,500), уагго\\га ^Р402226), РкЫа РазЮбз (БР183070, смотри также Репд е! а1. (2004) 1. Вю1есЬпо1. 108 185-192), Сапб1ба, ТпсНобегта геез1а (РР244234). РетаШп, То1урос1абшт и хозяева АзрегдШиз, такие как А. тби1апз и А. тдег.

Подходящие клетки-хозяева высших эукариот включают клетки млекопитающих, такие как С0δ-1 (АТСС Н0:СКБ 1650), ί.’0δ-7 (АТСС СКЬ 1651), линия человеческих эмбриональных клеток почки 293, клетки почки детеныша хомячка (ВНК) (АТСС СКЬ. 1632), ВНК570 (АТСС N0: СКЬ 10314), 293 (АТСС Н0:СКБ 1573), клетки яичника китайского хомячка СНО (например, СНО-К1, АТСС N0: ССЬ 61, линия клеток ОНРК-СН0, такая как ΌΟ44 (смотри иг1аиЬ е! а1., (1986) δοтаΐ^с Се11 Мо1. Оепе!. 12, 555-556)), в особенности линии клеток СНО, адаптированные для суспендированной культуры, клетки Сертоли мыши, клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зелёной мартышки (АТСС СКЬ-1587), клетки ЖЬА, клетки почки собаки (АТСС ССЬ 34), человеческие клетки легкого (АТСС ССЬ 75), Нер О2 и клетки миеломы или лимфомы, например №0 (смотри υδ 5807715), δр2/0, Υ0.

Такие клетки-хозяева также могут быть дополнительно сконструированы или адаптированы для модификации качества, функции и/или выхода антигенсвязывающего белка. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают экспрессию специфическим образом модифицированных (например, путем гликозилирования) ферментов и шаперонов, складывающих белок.

Способы культивирования клеток.

Клетки-хозяева, трансформированные векторами, кодирующими антигенсвязывающие белки, могут быть культивированы при помощи любого из способов, известных специалистам в данной области техники. Клетки-хозяева можно культивировать в роллерных колбах, роллерных флаконах или системах полых волокон, за исключением крупномасштабного получения, для которого используют реакционный аппарат с мешалкой, в особенности для культур суспензий. Реакционные аппараты с мешалкой могут быть адаптированы для аэрации с использованием, например, барботеров, дефлекторов или вращающихся мешалок с малыми сдвиговыми усилиями. Для барботажных колонок и аэролифтных реакторов может быть использована непосредственная аэрация пузырьками воздуха или кислорода. Когда клетки-хозяева выращивают в бессывороточных культуральных средах, тогда эти среды дополняют агентом, защищающим клетки, таким как плюроник Р-68, для того, чтобы способствовать предотвращению повреждения клеток в результате процесса аэрации. В зависимости от характеристик клетки-хозяина могут быть использованы микроносители в качестве субстратов для роста заякоренных клеточных линий, или клетки могут быть адаптированы к суспензионной культуре (которая является типичной). Для выращивания клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев беспозвоночных, может быть использовано множество режимов функционирования, таких как выращивание культуры с подпиткой, повторная обработка партии

- 35 023700 (смотри Игареаи е! а1. (1994) Су!о!есЬпо1оду 15: 103-109), расширенная партия или перфузионная культура. Хотя рекомбинантно трансформированные клетки-хозяева млекопитающих можно выращивать в средах, содержащих сыворотку крови, таких как фетальная телячья сыворотка крови (РС8), например, такие клетки-хозяева выращивают в синтетических бессывороточных средах, таких как раскрытые в Кееп е! а1. (1995) Су!о!есЬпо1оду 17:153-163, или имеющиеся в продаже среды, такие как РгоСН0-СИМ или иЬгаСН0™ (СатЬгех N1. И8А), при необходимости дополненные источником энергии, таким как глюкоза, и синтетическими факторами роста, такими как рекомбинантный инсулин. Для выращивания клеток-хозяев в бессывороточных средах может потребоваться, чтобы эти клетки были адаптированы для выращивания в бессывороточных условиях. Один из подходов заключается в выращивании таких клеток-хозяев в средах, содержащих сыворотку крови, и повторной замене 80% культуральной среды на бессывороточную среду, таким образом, что клетки-хозяева учатся адаптироваться в бессывороточнох условиях (смотри, например, 8сЬагГепЬегд е! а1. (1995) ш Атта1 Се11 !есЬпо1оду: Иеуе1ортеп!§ !отеагЙ8 !Ье 21δ! сеп!игу (Веиуегу Е.С. е! а1. еЙ8, 619-623, К1и^ег Асайетю риЬНкЬегк).

Антигенсвязывающие белки, секретируемые в среды, могут быть выделены и очищены с использованием множества способов для достижения степени очистки, подходящей для предполагаемого применения. Например, применение антигенсвязывающих белков для лечения пациентов-людей типично требует по меньшей мере 95% чистоты, более типично 98 или 99% или большей чистоты (по сравнению с неочищенной культуральной средой). Клеточный дебрис из культуральных сред типично удаляют с использованием центрифугирования, а затем на стадии осветления супернатанта с использованием, например, микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубокой фильтрации. Существует множество других способов, таких как диализ и гель-электрофорез, и хроматографические способы, такие как хроматография на гидроксиапатитах (НА), аффинная хроматография (возможно включающая систему с присоединением аффинной метки, такой как полигистидин) и/или хроматография с гидрофобным взаимодействием (Н1С, смотри И8 5429746). Антитела после различных стадий осветления могут быть захвачены с использованием аффинной хроматографии с белком А или О. Затем могут следовать дополнительные стадии хроматографии, такие как ионообменная и/или НА хроматография, анионо- или катионообменная, эксклюзионная хроматография и осаждение сульфатом аммония. Также могут быть использованы различные стадии удаления вируса (например, нанофильтрация с использованием, например, фильтра ИУ20). После этих различных стадий получают очищенный (например, моноклональный) препарат, содержащий по меньшей мере 75 мг/мл или больше, например 100 мг/мл или больше, антигенсвязывающего белка. Такие препараты, по существу, не содержат агрегированных форм антигенсвязывающих белков.

Бактериальные системы могут быть использованы для экспрессии антигенсвязывающих фрагментов. Такие фрагменты могут быть локализованы внутриклеточно, в периплазме или секретированы вне клеток. Нерастворимые белки могут быть экстрагированы и подвергнуты рефолдингу с образованием активных белков в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, смотри 8апске/ е! а1. (1999) 1. Вю!есЬпо1. 72, 13-20 и Сирй Р.М. е! а1. (1999) Ьей Арр1 МюгоЬю1, 29, 273277.

Фармацевтические композиции.

Термины заболевания, расстройства и состояния используют взаимозаменяемо. Очищенные препараты описанного здесь антигенсвязывающего белка могут быть включены в фармацевтические композиции для применения в лечении описанных здесь заболеваний людей. Фармацевтическая композиция может быть использована в лечении заболеваний, в которые вовлечен 1Ь-7, или где благоприятным является ингибирование/нейтрализация 1Ь-7К-опосредованной сигнализации.

Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество описанного здесь антигенсвязывающего белка.

Фармацевтический препарат может содержать антигенсвязывающий белок в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Антигенсвязывающий белок может быть введен самостоятельно или как часть фармацевтической композиции.

Типично, такие композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель, который является известным и предусмотрен приемлемой фармацевтической практикой, смотри, например, КепппдЮпв РЬагтасеи!юа1 8аепсе5, 16!Ь еййюп, (1980), Маск РиЫЫипд Со. Примеры таких носителей включают стерилизованные носители, такие как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, возможно забуференный подходящими буферами до значения рН, находящегося в диапазоне от 5 до 8.

Фармацевтические композиции могут быть введены путем инъекции или непрерывной инфузии (например, внутривенной, внутрибрюшинной, интрадермальной, подкожной, внутримышечной или внутрь воротной вены).

Такие композиции подходящим образом не содержат видимых частиц. Фармацевтические композиции могут содержать от 1 мг до 10 г антигенсвязывающего белка, например от 5 мг до 1 г антигенсвязывающего белка. Альтернативно, композиция может содержать от 5 до 500 мг, например от 5 до 50 мг.

Способы приготовления таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области техники. Фармацевтические композиции могут содержать от 1 мг до 10 г антигенсвязывающего белка в стандартной лекарственной форме, возможно вместе с инструкциями для применения.

- 36 023700

Фармацевтические композиции могут быть лиофилизированными (высушенными замораживанием) для разведения перед введением в соответствии со способами, хорошо известными или понятными специалистам в данной области техники. Когда антитела по изобретению имеют изотип 1дО1, то в фармацевтическую композицию может быть добавлен хелатообразователь на основе меди, такой как цитрат (например, цитрат натрия) или ΕΌΤΑ (этилендиаминтетрауксусная кислота), или гистидин для уменьшения степени опосредованной медью деградации антител этого изотипа, смотри ЕР0612251. Фармацевтические композиции могут также содержать солюбилизатор, такой как аргининовое основание, детергент/антиагрегант, такой как полисорбат 80, и инертный газ, такой как азот, для замещения кислорода свободного пространства флакона.

Эффективные дозы и схемы введения антигенсвязывающего белка, как правило, определяют эмпирически, и они зависят от факторов, таких как возраст, масса и состояние здоровья пациента, и заболевания или расстройства, которое лечат. Такие факторы находятся в компетенции лечащего врача. Руководство по выбору подходящих доз можно найти, например, в διηίΐΐι е( а1. (1977) АиЕЪоФек ίη Питан б1адηοδίδ апб (Пегару, Кауеп Ргекк, №ν Уогк. Таким образом, антигенсвязывающий белок по изобретению может быть введен в терапевтически эффективном количестве.

Доза антигенсвязывающего белка, вводимого субъекту как правило составляет от 1 мкг/кг до 150 мг/кг, от 0,1 до 100 мг/кг, от 0,5 до 50 мг/кг, от 1 до 25 мг/кг или от 1 до 10 мг/кг массы организма субъекта. Например, доза может составлять 10, 30 или 60 мг/кг. Антигенсвязывающий белок может быть введен парентерально, например подкожно, внутривенно или внутримышечно.

При желании эффективная суточная доза терапевтической композиции может быть введена в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или больше чем шести субдоз, вводимых раздельно с подходящими интервалами, возможно, в виде единичных лекарственных форм. Например, доза может быть введена подкожно, каждые 14 или 28 суток в форме множества субдоз на каждые сутки введения.

Введение дозы может быть осуществлено путем внутривенной инфузии, типично в течение периода от 15 мин до 24 ч, такого как от 2 до 12 ч или от 2 до 6 ч. Последнее может приводить в результате к уменьшенным токсическим побочным эффектам.

Введение дозы при необходимости может быть повторено один или более чем один раз, например три раза в сутки, один раз каждые сутки, один раз каждые 2 суток, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца, один раз каждые 6 месяцев или один раз каждые 12 месяцев. Антигенсвязывающие белки могут быть введены при помощи поддерживающей терапии, например, один раз в неделю в течение периода 6 месяцев или больше. Антигенсвязывающие белки могут быть введены при помощи прерывистой терапии, например, в течение периода от 3 до 6 месяцев, и затем отсутствие дозы в течение от 3 до 6 месяцев, а затем введения антигенсвязывающих белков вновь от 3 до 6 месяцев и т.д. в течение цикла.

Доза может быть определена или скорректирована путем измерения количества 1Ь-17 в биологическом образце. Могут быть использованы другие способы определения или корректировки дозы, включая без ограничения объема изобретения биологические маркеры (биомаркеры) фармакологии, измерения мышечной массы и/или слияние, безопасность, переносимость и терапевтический ответ. Антигенсвязывающий белок может быть введен в количестве и в течение длительности времени, эффективном для понижающей регуляции 1Ь-7 опосредованной сигнализационной активности у субъекта.

Антигенсвязывающий белок может быть введен субъекту таким путем, чтобы направить терапию на конкретную область. Например, антигенсвязывающий белок может быть инъецирован локально в мышцу, например скелетную мышцу.

Антигенсвязывающий белок может быть использован в комбинации с одним или более чем одним другим терапевтически активным агентом, например иммуномодуляторами, такими как интерферон-бета (ШЫв-1а или ШЫв-1Ъ), и ацетатом глатирамера, иммунодепрессантами, такими как циклофосфамид, метотрексат, азатиоприн, кладрибин, циклоспорин и митоксантрон, другими иммунологическими способами лечения, такими как внутривенное введение иммуноглобулинов (1У1д), замещение плазмы и сульфасалазин. Дополнительный терапевтический агент может быть введен таким образом (доза, время, способ), как предписано врачом. В одном воплощении дополнительный терапевтический агент может быть введен одновременно или последовательно, или раздельно с антигенсвязывающим белком по настоящему изобретению. В одном воплощении дополнительный терапевтический агент и антигенсвязывающий белок вводят таким образом, что происходит перекрывание их фармакологических эффектов на пациента; иными словами, они оказывают биологические эффекты на пациента одновременно.

Когда антигенсвязывающий белок применяют в комбинации с другими терапевтически активными агентами, тогда индивидуальные компоненты могут быть введены вместе или по отдельности, последовательно или одновременно в отдельных или комбинированных фармацевтических композиций посредством любого подходящего пути. При введении по отдельности или последовательно антигенсвязывающий белок и терапевтически активный(е) агент(ы) может(гут) быть введен(ы) в любой последовательности.

Упомянутые выше комбинации могут быть представлены для применения в форме единой фармацевтической композиции, содержащей определенную выше комбинацию, возможно вместе с фармацев- 37 023700 тически приемлемым носителем или эксципиентом.

В случае комбинации в одной и той же композиции, понятно, что два компонента должны быть стабильны и совместимы друг с другом и другими компонентами композиции, и могут быть приготовлены для введения. При раздельном приготовлении они могут быть представлены в виде любой удобной композиции для удобства, например, таким образом, который известен в области техники для антигенсвязывающих белков.

В случае комбинации со вторым терапевтическим агентом, активным против того же самого заболевания, доза каждого компонента может отличаться от дозы, когда используют один антигенсвязывающий белок. Подходящие дозы будут очевидны специалистам в данной области техники.

Антигенсвязывающий белок и терапевтически активный(е) агент(ы) могут действовать синергетически. Другими словами, введение антигенсвязывающего белка и терапевтически активного(ых) агента(ов) в комбинации может оказывать большее действие на описанное здесь заболевание, расстройство или состояние, чем сумма каждого из действий по отдельности.

Фармацевтическая композиция может содержать набор антигенсвязывающего белка вместе с другими лекарственными средствами, возможно с указаниями по применению. Для удобства набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с указаниями по применению.

Термины индивид, субъект и пациент использованы здесь взаимозаменяемо. Субъект, как правило, представляет собой человека. Субъект также может представлять собой млекопитающее, такое как мышь, крыса или примат (например, игрунка или обезьяна). Субъект может представлять собой животное, отличное от человека. Антигенсвязывающие белки могут также иметь ветеринарное применение. Субъект, которого лечат, может представлять собой сельскохозяйственное животное, например корову или быка, овцу, свинью, вола, козу или лошадь, или может представлять собой домашнее животное, такое как собака или кошка. Животное может иметь любой возраст, или представлять собой зрелое взрослое животное.

Лечение может быть терапевтическим, профилактическим или предупреждающим. Субъект может представлять субъекта, нуждающегося в лечении. Нуждающиеся в лечении могут включать индивиды, уже страдающие конкретным медицинским заболеванием, дополнительно к индивидам, у которых заболевание может развиться в будущем.

Таким образом, описанный здесь антигенсвязывающий белок может быть использован для профилактического или предупредительного лечения. В этом случае описанный здесь антигенсвязывающий белок вводят индивиду для предупреждения или задержки начала одного или более чем одного аспекта или симптома заболевания. Субъект может не иметь симптомов. Субъект может иметь генетическую предрасположенность к заболеванию. Профилактически эффективное количество антигенсвязывающего белка вводят такому индивиду. Профилактически эффективное количество представляет собой количество, которое предупреждает или задерживает начало одного или более чем одного аспекта или симптома описанного здесь заболевания.

Описанный здесь антигенсвязывающий белок также может быть использован в способах терапии. Термин терапия охватывает уменьшение интенсивности, сокращение или предупреждение по меньшей мере одного аспекта или симптома заболевания. Например, описанный здесь антигенсвязывающий белок может быть использован для уменьшения интенсивности или сокращения одного или более чем одного аспекта или симптома описанного здесь заболевания.

Описанный здесь антигенсвязывающий белок используют в эффективном количестве для терапевтического, профилактического или предупредительного лечения. Терапевтически эффективное количество описанного здесь антигенсвязывающего белка представляет собой количество, эффективное для уменьшения интенсивности или сокращения одного или более чем одного аспекта или симптома заболевания. Описанный здесь антигенсвязывающий белок также может быть использован для лечения, предупреждения или терапии описанного здесь заболевания.

Описанный здесь антигенсвязывающий белок может оказывать в общем благоприятное действие на здоровье субъекта, например может увеличивать ожидаемую длительность жизни субъекта.

Описанный здесь антигенсвязывающий белок не обязательно должен оказывать полное излечение, или устранять каждый симптом или проявление заболевания для того, чтобы составлять пригодное терапевтическое лечение. Как понимают в соответствующей области техники, лекарства, используемые в качестве терапевтических агентов, могут уменьшать тяжесть данного болезненного состояния, но не обязательно устранять каждое проявление заболевания для того, чтобы рассматриваться в качестве терапевтических агентов. Аналогично, профилактическое лечение не обязательно должно быть полностью эффективным для предупреждения начала заболевания для того, чтобы составлять пригодный профилактический агент. Достаточно просто сокращения влияния заболевания (например, уменьшения количества или тяжести его симптомов или увеличения эффективности другой обработки, или достижения другого благоприятного действия), или уменьшения вероятности того, что заболевание проявится (например, путем задержки начала заболевания) или ухудшится у субъекта.

Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут быть использованы в терапии рассеянного склероза и при других аутоиммунных или воспалительных заболеваниях, особенно тех, в раз- 38 023700 витие которых вовлечены патогенные Т_Н17-клетки. Такие заболевания связаны с высокими уровнями экспрессии 1Б-17. Было сообщено о повышенных уровнях Ш-17 в сыворотке и СМЖ пациентов, страдающих от РС (МаГикеуюшк, Ό. с1 а1.; Ми1Г. 8с1ег. 5, 101-04; 1999) и в синовиальной жидкости, полученной у пациентов, страдающих от ревматоидного артрита. ГБ-17 также вовлечен в развитие псориаза (Нотеу еГ а1.; Т 1ттипо1. 164(12):6621-32; 2000), в то время как Нат/аош еГ а1. сообщали о высоких уровнях 1Б-17 при болезни Бехчета (8сапб. Т ВйиешаГоБ; 31:4, 205-210; 2002). Повышенные уровни 1Б-17 также наблюдали при системной красной волчанке (СКВ) (\Уопд еГ а1.; Ьирик 9(8):589-93; 2000).

Ингибирование сигнализации, опосредованной рецептором ГБ-7, может также быть полезным в лечении воспалительных (не аутоиммунных) заболеваний, при которых повышены уровни 1Б-17, таких как астма.

Соответственно воспалительные и/или аутоиммунные заболевания по изобретению включают воспалительные заболевания кожи, включая псориаз и атопический дерматит; системную склеродермию и склероз; воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ); болезнь Крона; неспецифический язвенный колит; ишемические реперфузионные расстройства, включая реперфузионное повреждение тканей, связанное с хирургическим вмешательством, ишемические состояния миокарда, такие как инфаркт миокарда, остановку сердца, реперфузию после кардиохирургического вмешательства и констрикцию после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики, инсульт и аневризмы брюшной аорты; отек головного мозга, обусловленный инсультом; травму головы, гиповолемический шок; асфиксию; респираторный дистресс-синдром взрослых; острое повреждение легких; болезнь Бехчета; дерматомиозит; полимиозит; рассеянный склероз (РС); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; остеоартрит; волчаночный нефрит; аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (РА), синдром Шегрена, васкулит; заболевания, включая диапедез лейкоцитов; воспалительное расстройство центральной нервной системы (ЦНС), синдром полиорганной недостаточности, обусловленный септицемией или травмой, алкогольный гепатит; бактериальную пневмонию; заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, включая гломерулонефрит; сепсис; саркоидоз; иммунопатологические ответы на трансплантацию тканей/органов; воспалительные заболевания легких, включая плеврит, альвеолит, васкулит, пневмонию, хронический бронхит, бронхоэктазы, диффузный панбронхиолит, экзогенный аллергический альвеолит, идиопатический фиброз легких (ИФЛ) и муковисцидоз; псориатический артрит; нейромиелит зрительного нерва, синдром Гийена-Барре (СГБ), хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), диабет 1 типа и т.п.

В частности, антагонисты по настоящему изобретению могут быть полезны в терапии рассеянного склероза при всех его формах, включая нейромиелит зрительного нерва. Предполагают, что лечение антагонистом по настоящему изобретению будет наиболее эффективным при введении в связи с активным воспалительным заболеванием, то есть, при применении в лечении клинически изолированного синдрома или рецидивирующих форм РС. Эти стадии заболевания могут быть определены клинически и/или критериями визуализации, такими как усиление гадолинием или другие более чувствительные методики, и/или другими на данный момент не установленными биомаркерами активного заболевания. В частности, антагонисты по изобретению могут быть использованы для лечения рецидивирующеремиттирующего рассеянного склероза (РРРС) (посредством внутривенной, подкожной, пероральной или внутримышечной доставки) при приближении рецидива или рецидиве у пациентов. В одном воплощении антагонист по изобретению вводят пациенту в начале рецидива или в пределах 1, 2, 3, 6, 12, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 суток от начала рецидива.

Антигенсвязывающие белки по изобретению способны связываться с СЭ127. В одном воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению способны оказывать антагонистическое действие в отношении биологического действия рецептора ГЬ-7. В одном воплощении антигенсвязывающие белки способны оказывать антагонистическое действие в отношении по меньшей мере одного из: опосредованного рецептором Ш-7 роста Т_Н17 и опосредованного рецептором Ш-7 выживания Т_Н17.

Термин ингибировать, оказывать антагонистическое действие и нейтрализовать использованы здесь в качестве синонимов. Ни один из терминов не предполагает требование полной нейтрализации; также рассматривается частичная нейтрализация, которая соответствуют снижению, но не полному устранению биологического действия.

Опосредованный рецептором Ш-7 рост и/или выживание Т_Н17 могут быть обнаружены на клеточном уровне по увеличению или поддержанию количества клеток Т_Н17, или путем увеличения отношения клеток Т_Н17 по сравнению с количествами других СЭ4+ Т-клеток, или конкретней по увеличению отношения клеток Т_Н17:Т_Н1, отношения клеток Т_Н17:Т_гед, отношения клеток (Т_Н17 плюс Т_Н1):Т_гед, и/или отношения клеток Т_Н17:(Тн1 плюс Т_гед).

На молекулярном уровне рост и/или выживание ТН17 могут быть обнаружены по увеличению продукции Ш-17 популяцией СЭ4+ Т-клеток (или популяцией клеток Т_Н17). Таким образом, в воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению уменьшают продукция Ш-17 популяцией СЭ4+ Т-клеток. Опосредованный рецептором Ш-7 рост и выживание Т_Н17 может также быть обнаружен по увеличению продукции ГРИ-у популяцией СЭ4+ Т-клеток (или популяцией клеток Т_Н17). Таким образом, в воплощении антигенсвязывающие белки по изобретению оказывают антагонистическое действие (сокращают)

- 39 023700 продукцию ШИ-у популяцией СЭ4+ Т-клеток. На молекулярном уровне антигенсвязывающие белки по изобретению могут ингибировать опосредованное рецептором 1Ь-7 фосфорилирование §ТАТ-5.

На молекулярном уровне блокирующее действие антигенсвязывающих белков по изобретению можно наблюдать и измерять при помощи таких анализов, как анализ индуцированного 1Ь-7 р§ТАТ5 или Вс1-2. На клеточном уровне блокирующее действие можно наблюдать и измерять посредством таких анализов, как анализ секреции 1Ь-17 или ГРИ-у Т_Н17-клетками. Примеры анализов описаны в заявке РСТ № РСТ/и§2009/053136 (№02010/017468).

В примере анализа р§ТАТ-5 РВМС стимулируют при помощи 1Ь-7 в присутствии и отсутствии тестируемого агента. Клетки затем количественно оценивают в отношении уровня р§ТАТ-5, например, путем окрашивания в отношении р§ТАТ-5 (например, при помощи меченого антитела против р§ТАТ-5, такого как А1еха Р1иог® 647 Мойке АпБ-§!а!5 (ρΥ694, ΒΌ [#612599])) с последующей сортировкой флуоресцентно-активированных клеток. Уровни фосфорилированного §ТАТ-5 также могут быть определены при помощи ЕЫ§А. Агенты, которые уменьшают уровень фоссфорилированного §ТАТ-5, могут представлять собой потенциальные терапевтические кандидаты для лечения аутоиммунного заболевания.

Антагонист может обладать способностью уменьшать уровни фосфорилированного §ТАТ-5 по меньшей мере на 20, 50, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% по сравнению с уровнями §ТАТ-5 в отсутствие антагониста, или по сравнению с отрицательным контролем или необработанными клетками. Антагонист может иметь 1С₅₀ 50 мкг/мл, 25 мкг/мл или меньше, 10 мкг/мл или меньше, 5 мкг/мл или меньше или 2 мкг/мл или меньше. В воплощении антагонист имеет 1С₅₀ меньше чем или равную 1 мкг/мл, меньше чем или равную 0,75 мкг/мл, меньше чем или равную 0,5 мкг/мл, меньше чем или равную 0,25 мкг/мл, или меньше чем или равную 0,1 мкг/мл.

Антагонисты по изобретению особенно эффективны в ингибировании роста клеток Т_Н17. Рост клеток Т_Н17 может быть определен в анализе роста Т_Н17, который включает стимулирование роста популяции наивных Т-клеток в присутствии и отсутствии тестируемого агента, с последущей стимуляцией клеток в направлении продукции 1Ь-17 и оценкой уровеня 1Ь-17, продуцируемого клетками в присутствии и отсутствии тестируемого агента.

В примере анализа человеческие СЭ4+ Т-клетки дифференцируются до Т_Н17 путем стимуляции с активацией Т-клеточного рецептора в присутствии 1Ь-1, 1Ь-6 и 1Ь-23. После 5 суток дифференцировки клетки ССК6+ сортируют с получением обогащенной популяции ТН17. Эту популяцию затем стимулируют человеческим 1Ь-7 и определяют увеличение 1Ь-17 и ШИ-у в супернатанте. Способность тестируемого агента, такого как антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, блокировать взаимодействие между 1Ь-7 и СЭ127, которая может быть определена по присутствию антагонистов этого взаимодействия во время периода инкубации, должна предупреждать рост клеток Т_Н17, приводя к уменьшению продукции 1Ь-17 и ГРХ-у.

Антигенсвязывающие белки по изобретению могут быть способны осуществлять 20% или больше чем 20% ингибирование секреции 1Ь-17 в таком анализе по сравнению с отрицательным контролем. Типичней, антигенсвязывающий белок осуществлять от 50, от 75, от 85 или от 90 или больше чем 90% ингибирование секреции 1Ь-17 по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент может демонстрировать 1С₅₀ меньше чем или равную 50 мкг/мл в анализе. В других воплощениях 1С₅₀ может составлять меньше чем или равна 20, 10 или 5 мкг/мл.

Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства, при котором вводят пациенту антигенсвязывающий белок по изобретению в количестве, достаточном для уменьшения количества клеток ТН17 у пациента.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта-человека, при котором субъекту водят антигенсвязывающий белок в количестве, достаточном для уменьшения опосредованного рецептором 1Ь-7 фосфорилирования §ТАТ-5.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рассеянного склероза у пациента, при котором пациенту вводят антигенсвязывающий белок по изобретению, где пациент страдает рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания у субъекта-человека, при котором субъекту вводят антигенсвязывающий белок по изобретению в количестве, эффективном для уменьшения отношения клеток ТН17 по сравнению с клетками ТН1.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания у субъекта-человека, при котором субъекту вводят антигенсвязывающий белок по изобретению в количестве, эффективном для уменьшения отношения клеток ТН по сравнению с клетками (Рохр3+) Т_геб.

Способы диагностического применения.

Описанные здесь антигенсвязывающие белки могут быть использованы для обнаружения СЭ127 в биологическом образце ίη νίίτο или ίη νίνο для диагностических задач. Например, антигенсвязывающие белки против СЭ127 могут быть использованы для обнаружения СЭ127 в выращиваемых клетках в ткани или в сыворотке крови. Ткань может быть сначала выделена (например, путем биопсии) из организма

- 40 023700 человека или животного. Могут быть использованы обычные иммуноанализы, включая ЕЫЗА, Вестернблот, иммуногистохимию или иммунопреципитацию.

Антигенсвязывающие белки могут быть представлены в диагностическом наборе, содержащем один или более чем один антигенсвязывающий белок, обнаруживаемую метку и указания для применения набора. Для удобства набор может содержать реагенты в предопределенных количествах с указаниями по применению.

Г енная терапия.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие описанные здесь антигенсвязывающие белки, могут быть введены субъекту, нуждающемуся в таком введении. Молекула нуклеиновой кислоты может экспрессировать СОК в соответствующем скелете или домене, вариабельном домене или полноразмерном антителе. Молекула нуклеиновой кислоты может находиться в векторе, который дает возможность для экспрессии в человеческой клетке или животной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты или вектор могут быть приготовлены для введения с фармацевтически приемлемым эксципиентом и/или одним или более чем одним терапевтически активным агентом, как обсуждалось выше.

Примеры

1.0. Гуманизация 1А11.

1.1. Клонирование вариабельных областей гибридомы 1А11.

Полную РНК получали из клеточных осадков гиборидом 1А11, и ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) осуществляли для получения кДНК вариабельных областей. Амплифицированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей каждой гибридомы клонировали в клонирующем векторе рСК2.1. Получали последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепей каждой гибридомы. Анализ последовательности позволил предсказать следующие пептидные последовательности (с выделенными гипервариабельными участками):

А) 1А11 УН

Εν0ίααεΘΡΕίΕΚΡΘΑ8ΜΚΙ50ΚΑ50Υ3ΕΤΘΥΤΜΝ\ΛΛ/Κ03ΗΟΚΝΙ_Ε\Λ/Ι<3Ι-ΙΝΡΥΝ<3νΤ3ΥΝ<2ΚΡΚ<3

КАТ1_ТУАКЗЗЗТАУМЕ1_1_81_ТЗЕОЗАУУУСАКООС\ГУУУУРО\ЛЛЛЗАОТТУТУ88

Б) 1А11 УЬ

Εΐνΐ_Τα8ΡΑΙΤΑΑ3Ι_θακνΤΙΤ05Α555νΤΥΜΗνΐ/ΥααΚ8ΟΤ8ΡΚΡννΐΥΕΙ5ΚΙ-Α5<3νΡνΡΕ8<38θεθΤ

3Υ3Ι_ΤΙ33ΜΕΑΕΟΑΑΙΥΥΟΟΕννΝΥΡΥΤΡΟΟΟΤΚΙ.ΕΙΚ

Рекомбинантную химерную форму антитела получали путем слияния вариабельных областей тяжелой и легкой цепей с человеческим 1§О1 Рс и каппа константными областями соответственно.

1.2. Стратегия гуманизации тяжелой цепи 1А11.

В соответствии с анализом ВЬАЗТ базы данных V гена зародышевой линии человека, ЮНУ1_2 зародышевой линии человека, который имеет 64% идентичность (включая СОК) мышиной вариабельной последовательности тяжелой цепи 1А11, был выбран в качестве предпочтительной акцепторной скелетной области для гуманизации. ν-область зародышевой линии комбинировали ίη кШсо с подходящей РК4, в данном случае с минигеном 1Н6 (Кабат, νοί. II) на основе сходства последовательностей. Первые шесть остатков из числа остатков минигена 1Н6, предшествующих мотиву ХУСРС, попадают в область СОК3, которая заменяется на входящий СОК донорного антитела. Восемь гуманизированных вариантов тяжелой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Н0 представляла собой прямое прививание мышиного СОК из 1А11 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Н1-Н3 основаны на Н0; каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 71, 66 и 69 соответственно. Конструкции Н4-Н7 включают две, три, четыре или пять из вышеприведенных обратных мутаций.

- 41 023700

1.3. Обоснование для гуманизации тяжелой цепи 1А11 для скелетной области ЮНУ1-2 1 11 21 СОРУ 39 48

УН1А11 ЕУСЬСОЗСРЕ 1.1.КРСАЗМК1 ЗСКАЗСУЗРТ СУТМ.ЛЛЛЛ/К Ο8ΗΟΚΝΙ_Ε\Λ/Ι

1СУН1-2 ανθΙ_να3<3ΑΕ УККРСАЗУКУ ЗСКАЗСУТРТ еУУ1И..МУУР ОАРСС!С1_Е\Л/М

1Α11 но ανοι_νοδθΑΕ уккрсазуку зсказсутрт 6υτμ..№μπ оарсосье™ ιαι 1 ηί αναι_νο3<3ΑΕ уккрсазуку зсказсутрт еггм..№мк. οαροοοι_ε\λ/μ

1Α11Η2 αναΐ_ν03<3ΑΕ УККРСАЗУКУ ЗСКАЗСУТРТ βΥΓΜ,.ΜΛΛ/Ρ ΟΑΡΟΟΟίΕυνΜ αί 1 нз ανοι_να3<3ΑΕ уккрсазуку зсказсутрт <3υτμ..№№κ αΑΡοαοι_Ε\Λ/Μ

1Α11Η4 ΟνΟίνΟδΘΑΕ УККРСАЗУКУ ЗСКАЗСУТРТ βΥΓΜ,.ΛΜ/νΡ ΟΑΡΘΩΘίΕΙΛ/Μ αί 1Η5 оусиуозсае уккрсазуку зсказсутрт еутм..лм/νρ оарсосье^м

1Α11Η6 <2УСН.УС!ЗСАЕ УККРСАЗУКУ ЗСКАЗСУТРТ СУТМ..ЛМ/УР САРСССЬЕММ

1Α11Н7 <2УО1.УС!ЗСАЕ УККРСАЗУКУ ЗСКАЗСУТРТ 6УТМ..№Л/УР САРССС1.Е\Л/М

С0Р2 66 76 83 92

УН1А11 си«ру..л/е ντεΥΝΟκρκβ катьтуакзз зтаумеььзь тзеозаууус 1СУН1-2 βννΐΝΡΝ..86 6ΤΝΥΑΟΚΡΟ6 РУТМТРОТ51 ЗТАУМЕЬЗРЬ РЗООТАУУУС 1Α11 НО ΰυΝΡΥ,,Νβ νΤ8ΥΝ0ΚΡΚΰ РУТМТР0Т31 ЗТАУМЕЬЗРЬ РЗООТАУУУС 1Α11Η1 <3υΝΡΥ..Ν6 νΤ$ΥΝΟΚΡΚΰ РУТМТУ0Т31 ЗТАУМЕЬЗРЪ РЗООТАУУУС

1Α11Η2 <3υΝΡΥ..Νβ ντεΥΝΟΚΡΚβ КУТМТР0Т51 ЗТАУМЕЬЗРЬ РЗООТАУУУС 1 αί 1 нз αυΝΡΥ..Ν6 ντεΥΝΟκρκβ ρντίτροτδΐ 8ταυμει_8ρι_ рзоотаууус αί 1Η4 αυΝΡΥ,.Νβ ντεΥΝΟκρκα κντινιτνοτδΐ зтаумеьзрг рзоотаууус αί 1Η5 αυΝΡΥ,.ΝΟ ντεΥΝΟκρκα κντυτνοτδΐ зтаумеьзрь рзоотаууус

1Α11Η6 ΰυΝΡΥ..Ν6 ντεΥΝΟΚΡΚα КУТЬТУОКЗ! 3ΤΑΥΜΕΙ_3ΡΙ_ рзоотаууус

1Α11Η7 ΰυΝΡΥ,,Νβ ντεΥΝΟΚΡΚα КУТЬТУАКЗ! 8ΤΑΎΜΕΙ_8ΡΙ_ рзоотаууус

СОРТ 104

УН1А11 АРСОСДУ......кУУРОУУУС АСТТУТУЗЗ

ΊΗ6 - ννο ССТТУТУЗЗ

1А11Н0 АКСОСЛ/У.....№УРОУУУС ОСТТУТУЗЗ

1.4. Стратегия гуманизации легкой цепи 1А11.

В соответствии с анализом ВЬАЗТ базы данных V гена зародышевой линии человека, ЮКУ3_11 зародышевой линии человека, который имел 53% идентичность (включая СЭК) мышиной вариабельной последовательности легкой цепи 1А11, был выбран в качестве предпочтительной акцепторной скелетной области для гуманизации. У-область зародышевой линии комбинировали ίη κίΐίοο с подходящей ЕК4, в данном случае с 1-областью каппа 4 минигена (Кабат, Уо1. II) на основе сходства последовательностей. Первые три остатка минигена 1К-4 попадают в область СЭК3, которая заменяется на входящий СЭК донорного антитела. Десять гуманизированных вариантов легкой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Ь0 представляла собой прямое прививание мышиного СЭВ из 1А11 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Ь1, Ь2, Ь4 основаны на Ь0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые различались в каждой из конструкций; положения 47, 71 и 46 соответственно. Конструкция Ь3 включает обе из вышеприведенных обратных мутаций 47 и 71. Конструкция Ь5 включает три из вышеприведенных обратных мутаций 47 и 71, и 46. Конструкции Ь6-Ь9 основаны на Ь5, каждая из которых включает одну, две, три и четыре дополнительные мутации скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 58, 45, 70 и 60 соответственно.

- 42 023700

1.5. Обоснование для гуманизации легкой цепи 1А11 для скелетной области ЮКУ3-11

СйР1 44

Ук1А11 ΕίνίΤΟδΡΑΙ ТАА31_СОКУТ 1ТСЗД55.......δΥΤΎΜΗΥνγοοκεοτερ

УкЗ-11 ΕίνΠΌδΡΑΤ ЬЗЬЗРСЕРАТ ЬЗСРДЗС?......ЗУЗЗУЪД νΤΥΟΩΚΡΟΩΑΡ

1А11ЮЕ1У1.Т03РАТ Ι.3Ι.3ΡΟΕΡΑΤ 1.5С5Д55.......ЗУГУМН ννΥΟΟΚΡΟΟΑΡ

1Α11 и -Ι_9 ΕΙ У1.Т03РАТ 1-31-ЗРСЕРАТ 1.3С5А55. 8\ЛУМН УЖЮКРСОАР

С0Я2 СРРЗ 94

Ук1А11 ΚΡ\ΜΥΕ/5ΚΖ. Д5СУРУРРЗС ЗСЗСТЗУЗЬТ Ι55ΜΕΑΕϋΑΑ 1УУСОЕИ/Л/У УкЗ-11 РШУОДЗЛГР ДТС1РАРРЗС 3Θ3ΘΤ0ΡΤΙ.Τ Ι33Ι.ΕΡΕ0ΡΑ УУУС 1Α11 ί.0ΡΙΧΙΥΕίδΚί Д5С1РАРРЗС ЗСЗСТОРТЬТ Ι33Ι.ΕΡΕ0ΡΑ ΥΥΥΟΟΕΙΜ/Υ 1А11Ы Ρί,ννίΥΕ/δΚί. Α5ΘΙΡΑΡΡ3Θ ЗСЗСТОРТЬТ Ι33Ι.ΕΡΕΟΡΑ УУУСОЕМ/У 1Α111_2 РШУЕ/ЗКД. Д561РАРЕЗС ЗОЗОТОУТЬТ Ι33ίΕΡΕβΕΑ νΥΥΟΟΕΥΥΑ/Υ 1Α111_3ΡΙ_ννΐΥΕ/5Κ£. Λ5ΘΙΡΑΡΕ3Θ ЗСЗСТРУТЬТ Ι3δΙ_ΕΡΕβΡΑ νΥΥΟΟΕΗΜΥ 1Α111_4 ΡΡίΙΥΕ/5Κ£ Д561РАРРЗС ЗСЗСТОРТЬТ Ι33Ι.ΕΡΕ0ΡΑ νΥΥΟΟΕΥΥΝΥ

1Α11|_5 ΡΡννίΥΕίδΚί Д5С1РАРЕЗО 3Ο3ΟΤβΥΤίΤ Ι33Ι_ΕΡΕΰΕΑ νΥΥΟΟΕΙΥΝΥ 1Α111_6 ΡΡννίΥΕ/δΚί АЗОУРАРЕЗС 3<33ΟΤΟΥΤΙ_Τ Ι33Ι_ΕΡΕΟΕΑ νΥΥΟΟΕΙΥΛίΥ 1Α11 ί.7 ΚΡννίΥΕ/δΚί. ДЗОУРАРЕЗС 5<35<3ΤΟΥΤΙ_Τ Ι33Ι_ΕΡΕϋΕΑ νΥΥΟΟΕ№ΛίΥ 1Α11Ь8 ΚΡ\ΛΖΙΥΕ/5Κί АЗОУРАРЕЗС 3Θ3ΘΤ3ΥΤΙ.Τ Ι33Ι.ΕΡΕ0ΕΑ νΥΥΟΟΕΥΥΛ/Υ 1Α111_9 ΚΡννίΥΕ/δΚί дзсурургзс ЗОЗСТЗУТЬТ Ι33Ι_ΕΡΕϋΡΑ νΥΥΟΟΕνΥΛ/Υ

Ук Ук1 Α11 .РУТРСССТ ΚΙ_ΕΙΚ 1Α111_0 ΡΥ7ΈΘΘΘΤ КУЕ1К Ык1 — -О- -V—

МЭк2 Υ—Ο------ίιЭкЗ Ρ—Ρ- -νϋΙί Эк4 ί—Θ- -V—

ΙίЭк5 I—Ο~ Ρ—2.0. Гуманизация 6А3.

2.1. Стратегия гуманизации тяжелой цепи 6А3.

В соответствии с анализом ВЬА8Т базы данных V гена зародышевой линии человека, ЮНУ4_61 зародышевой линии человека, которые имели 71% идентичность (включая СОК) мышиной вариабельной последовательности тяжелой цепи 6А3, и ΙΟΗν3_33 зародышевой линии человека, которые имели 51% идентичность (которые, как продемонстрировано ранее, хорошо экспрессируются с ΙΟΚν1_39), были выбраны в качестве предпочтительных акцепторных скелетных областей для гуманизации. ν-область зародышевой линии комбинировали ш мПсо с подходящей РК4, в данном случае с минигеном ДН6 (Кабат, ^1. ΙΙ) на основе сходства последовательностей. Первые два остатка из числа остатков минигена 1Η6, предшествующих мотиву \УОРО, попадают в область СЭК3, которая заменяется на входящий СОК донорного антитела. Десять гуманизированных вариантов тяжелой цепи со скелетной областью ΙΟΗν4_61 и двенадцать гуманизированных вариантов тяжелой цепи со скелетной областью ΙΟΗν3_33 получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Н0 представляла собой прямое прививание мышиного СОК из 6А3 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Н1-Н5 со скелетной областью ΙΟΗν4_61 основаны на Н0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 71, 27, 30, 67 и 48 соответственно. Конструкции Н6-Н9 включают две, три, четыре или пять из вышеприведенных обратных мутаций. Конструкции Н1-Н11 с каркасной областью ΙΟΗν3-33 основаны на Н0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличаются в каждой из конструкций; положения 27, 30, 28, 29, 67, 73, 78, 49, 68, 24 и 48 соответственно.

- 43 023700

2.2. Обоснование для гуманизации тяжелой цепи 6А3 для скелетной области ГСНУ4_61 1 11 21 СОР! 39 43 νΗ6Α3 βνΟίΟΕδΟΡΟ ίνΚΡ3Ο3ίδί ТСТУТОУЗ!Т ΤΌΥΛ1/ΚΛΜ/ΙΡ ΟΡΡΟΝΚίΕΙΛ/Μ 1СНУ4_61 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ ίνΚΡ3ΕΤί3ί ТСТУЗССЗУЗ 5Θ6ΥΥνΚ5ννΐΡ ΟΡΡΟΚΟίΕ\Λ/Ι 6АЗ-Н0 ОУОШЕЗСРС ίνΚΡ3ΕΤί5ί ТСТУЗССЗУЗ ΤΩΥΑνν.№ΝΙΡ. ΟΡΡΟΚΟίΕΙΛ/Ι

6АЗ-Н1 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ ίνΚΡ3ΕΤί3ί ТСТУЗССЗУЗ ΤΡΥΑίν.Μ/νίΚ ΟΡΡΟΚΟίΕΙΛ/Ι

6АЗ-Н2 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ ίνΚΡ5ΕΤί3ί ТСТУЗСУЗУЗ ГОУАИ<ЛЛМР ΟΡΡΟΚΟίΕ\Μ 6АЗ-НЗ ΟνΟίΟΕδΟΡΟ Ι_νΚΡ3ΕΤΙ_31. ТСТУЗССЗУТ ΤΟΥΑίν.Μ/νίΡ ΟΡΡΟΚΟίΕΙΛ/Ι

6АЗ-Н4 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ Ι_νΚΡ3ΕΤΙ_3Ι_ ТСТЛ/ЗССЗУЗ ΤΰΥΑνν.ΝΜΆ оррсксье™

6АЗ-Н5 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ Ι_νΚΡ3ΕΤΙ_3Ι_ ТСТУЗСеЗУЗ ΓΟΥΛίν.Μ/νίΚ ΟΡΡΘΚΘίΕΥνΜ

6Α3-Η6 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ Ι_νΚΡ8ΕΤΙ_3Ι_ ТСТУЗСУЗУЗ ГОУД№.ЛЛМР ΟΡΡΟΚΟίΕΙΛ/Ι

6Α3-Η7 ΟνΟίΟΕδΟΡΟ Ι_νΚΡ8ΕΤΙ_3Ι_ ТСТУЗСУЗУТ ΓΟΥΑίν.ΛΛΛ/ΙΡ ΟΡΡΟΚΟίΕΙΜ

6Α3-Η3 сл/сйоезоро ι_νκΡ8Ετι_3ΐ_ τοτνεογεντ τοΥΑνν./тр ορροκοίεννι 6Α3-Η9 θναΐ_αΕ8ΟΡΟ Ι_νΚΡ3ΕΤΙ_3Ι_ ТСТЛ/ЗСУЗУТ ГОУДИСЛМЛР ΟΡΡΟΚΟίΕΙΛ/Μ

СОР2 66 76 83 92

УН6АЗ Ο Υ/ΡΥ...5Θ 57ΤΥΓΡ5Ζ.Κ5 Ρ13ΙΤΒϋΤ3Κ ΝΟΡΡίΟίΝδν ΤΤΕΟΤΑΤΥΥΟ 1СН\/4_61 С ΥΙΥΥ...36 5ΤΝΥΝΡ31.Κ5 ΡΥΤΙ5ΥϋΤ5Κ ΝΟ Ρ3ίΚί35ν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ

6Α3-Η0 О Υ/ΡΥ...56 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ5 ρντίδνϋτεκ ΝΟΡ3ίΚί33ν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η1 Θ ΥΙΡΥ...3β 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ8 РУПЗРОТЗК ΝΟΡδίΚίδδν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η2 Θ ΥΙΡΥ...8β 57ΤΥΤΡ5ί.Κ5 РУПЗУОТЗК ΝΟΡ3ίΚί33ν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η3 С Υ1ΡΥ...86 3ΤΤΥΤΡ3υί3 ΡνΤΙ5νϋΤ5Κ ΝΟΡ5ίΚί33ν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η4 ο γιργ...8β згптрзисз ριτιενϋτεκ ΝΟΡδίΚίεεν тааотаууус 6Α3-Η5 С ΥΙΡΥ...86 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ5 ΡνΤΙδνϋΤδΚ ΝΟΡδίΚίδδν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η6 <3ΥΙΡΥ...8β 3ΤΤΥΤΡ51-Κε РУПЗРОТЗК ΝΟΡδίΚίδδν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η7 <3ΥΙΡΥ...3β 8ΠΎΤΡ8Ι.Κ3 ΡνΤΙδΡΟΤδΚ ΝΟΡδίΚίδδν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η3 βΥΙΡΥ...3β 3ΠΎΤΡ31.Κ3 ΡΙΤΙδΡϋΤδΚ ΝΟΡ3ίΚί33ν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η9 αΥΙΡΥ...3β 8ΠΎΤΡ5Ι-Κε ΡΙΤΙδΡϋΤδΚ ΝΟΡδίΚίδδν ΤΑΑϋΤΑνΥΥΟ

СОРЗ 104

УН6АЗ АРСС ΥΟΥΛ/ΥΡ.......ΟΥ1Μ ΘΟΟΤΤίΤνδδ

1СНУ4_61 АР

6Α3 Η0-Η9 ΑΡΘβΥΟνΑίΥΕ......ОУИ ΟΟΘΤΤντνδδ

Скелетная область 4

СОРЗ 104 νΗ6Α3 ΑοβίΑβτϊ..........о νυν οοοττίτνεε

ЮН\/4_61 АР

ЮН1 ΡΟΗ—ι_ν-~

ИЗН2 Ρϋί- -Ρ~|_ν--(инз ρον- — -Μν—ιυΗ4 ----ίν-—

ΜΗ5 Ρ05-—-ίν— юнб Μσν- —ν—

6Α3Η0-9 Ассьдеп..........οννν οοοττντνδδ

- 44 023700

2.3. Обоснование для гуманизации тяжелой цепи 6А3 для скелетной области ЮНУ3_33

11 21 СйР1 39 48

УН6АЗ ОУОЬОЕЗСРС ЬУКРЗОЗЬЗЬ ТСТУТСУ31Т Т0УДИ4МЛ/1Р ОРРСЫКЬЕУУМ 1СНУЗ.ЗЗ ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ 5ΥβΜΗ..'Μ/Ρ ОАРСКСЬЕУУУ 6АЗ-Н0 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ ТОУД№.МЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ

6АЗ-Н1 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСУТРЗ ΤΟΥΑνν.№№Κ ОАРСКСЬЕ\Л/У

6АЗ-Н2 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРТ ГОУД№.ЛПЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ 6АЗ-НЗ ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРЗРЗ Г0УДИ4ЛЛЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУЛ/

6АЗ-Н4 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ 8СААЗСРТ18 Т0УД1У.МЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ

6АЗ-Н5 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ ТОУД№.МЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ

6АЗ-Н6 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ ТОУДИ4МЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ

6АЗ-Н7 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ ТОУДЦУ.ЛМЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ

6АЗ-Н8 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ ТОУД№.ЛОТУР ОАРСКСЬЕУА/

6АЗ-Н9 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ Т0УА№.МЛ/УР ОАРСКСЬЕУУУ

6АЗ-Н10 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСАУЗСРТРЗ ТОУД9У.МЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУУ 6АЗ-Н11 ОУОЬУЕЗССС УУОРСРЗЬРЬ ЗСААЗСРТРЗ ТОУА№.МЛЛ/Р ОАРСКСЬЕУУМ

СОЙ2 66 76 83 92

УНбАЗ СУ/РУ...5С 8ΤΤΥΤΡ3Ι-Κ3 Ρ13ΙΤΡ0Τ3Κ ЫОЕРЬОЬЫЗУ ΤΤΕϋΤΑΤΥΥΟ 1СНУЗ_33 АУ/№У...0СЗЛ/КУУА05УКе ΡΡΤΙ3Ρ0Ν3Κ ГГГЬУЬОМЫЗЬ РАЕОТАУУУС 6АЗ-Н0 АУ/РУ...5С ЗТГГТРЗЬКЗ ΡΡΤΙ3ΡΟΝ3Κ МТЬУЬОМЫЗЬ РАЕОТАУУУС 6АЗ-Н1 АУ/РУ...5С 3ΤΤΥΤΡ51.Κ8 ΡΡΤΙ3ΡΟΝ3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_0ΜΝ3Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6АЗ-Н2 АУ1РУ...5С 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ3 ΡΡΤΙ3ΡϋΝ3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_αΜΝ3Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΘ 6АЗ-НЗ АУ/РУ...5С 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ3 ΡΡΤΙ3ΡΟΝ3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_0ΜΝ3Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6АЗ-Н4 АУ/РУ...5С 8ΤΤΥΓΡ3Ι.Κ8 ΡΡΤΙ3ΡΟΝ3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_0ΜΝ5Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η5 АУ/РУ...ЗС 8ΤΤΥΤΡ31.Κ3 ΡΙΤΙ3ΡϋΝ3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_ΩΜΝ3Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η6 АУ/РУ...5С 3ΤΤΥΤΡ31.Κ3 ΡΡΤΙ3Ρ0Τ3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_ΟΜΝ8Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η7 АУ1РУ...5С 3ΤΤΥΤΡ31.Κ8 ΡΡΤΙ3ΡΟΝ3Κ ΝΤΕΥίΟΜΝ8Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η8 СУ/РУ...5С 3ΤΤΥΓΡ81.Κ3 ΡΡΤΙ3ΡϋΝ3Κ ΝΤίΥίΟΜΝ3ί ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η9 АУ/РУ...5С 3ΠΎΤΡ31.Κ3 ΡΡ3Ι3Ρ0Ν3Κ ΝΤΙ·ΥΙΛΜΝ3Ι. ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η10 ΔΥΙΡΥ...8β 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ3 ΡΡΠ5ΡϋΝ5Κ ЫТЬУЬОМЫЗЬ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ 6Α3-Η11 АУ/РУ...5С 3ΤΤΥΤΡ3Ι.Κ3 ΡΡΤΙ3Ρ0Ν3Κ ΝΤΙ_ΥΙ_αΜΝ5Ι_ ΡΑΕϋΤΑνΥΥΟ

СОРЗ 104

УНбАЗ АРССУОУА/УР.......ОТО СОСТТЬТУЗЗ

1СНУЗ_33 АР

6АЗН0-Н9 АРССУОУЛ/УР.......С0СТТУТУ53

Каркасная область 4

С0РЗ 104 унбАЗ ассьлсгь.........ονυν состтьтузз

1СНУЗ_33 АР ίιϋΗ1 ΡΟΗ.....ЬУίί ϋΗ2 Ρϋί- -Р-ЬУ—Μ ϋΗ3 Ρϋν- —-му—ΜΗ4 -------ЬУ—ЮН5 Ρϋ3.....ЬУ— ίιΰΗ6 Μϋν......У—бАзно-11 ассьлсгь.........омл/состтутузз

2.4. Стратегия гуманизации легкой цепи 6А3.

В соответствии с анализом ВЬА8Т базы данных У гена зародышевой линии человека, ЮКУ1_39 зародышевой линии человека, который имел 72% идентичность (включая СОК) мышиной вариабельной последовательности легкой цепи 6А3, был выбран в качестве предпочтительной акцепторной скелетной области для гуманизации. У-область зародышевой линии комбинировали ίη йПсо с подходящей РК4, в данном случае ί-областью каппа 2 минигена (Кабат, Уо1. II) на основе сходства последовательностей. Первые два остатка из числа остатков ίΚ-2 минигена попадают в область СЭК3 и идентичны последним двум остаткам в СЭК3 легкой цепи мышиной 6А3. Пять гуманизированных вариантов легкой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Ь0 представляла собой прямое прививание мышиного СОК из 6А3 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Ь1, Ь2 основа- 45 023700 ны на Ь0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличались в каждой из конструкций; позиции 45, 70 соответственно. Конструкция Ь3 включает обе из вышеприведенных обратных мутаций.

Обоснование для гуманизации легкой цепи 6А3 для скелетной области ЮКУ1_39

СОМ 44

Ук 6АЗ ΡΙΟΜΤΟδΡΑδ ОЗАЗЬСЕЗУТ 1ТСЬА5О......ТЮАУУЬА УУУ00КР0КЗР ιοκνι _39 οιοΜτοδΡδδ ьзазуоррут 1тсьазо......тюаууьа υαόοκροκαρ

6Α3 ьо рюмтозрзз ьзазуоорут ιτουχδο......лса\л/ьа ννγοοκροκΑΡ

6Α3 и 0ЮМТС13Р53 ЬЗАЗУОЭРУТ 1ТСХАЗО......ΤΙΟΑ\Λ/Ι_Α (Л/УООКРОКАР

6Α3 Ь2 0Ι0ΜΤ05Ρ55 ЬЗАЗУСЭРУТ 1ТСЬА5<2......ΤΙ6Α\Λ/Ι_Α (Λ/ΥΟΟΚΡΟΚΑΡ

6Α3 1.3 0Ι0ΜΤ05Ρ35 ЬЗАЗУООРУТ 1ТС1_АЗО......ΤΙ6Α\Λ/Ι_Α ννΥΟΟΚΡΟΚΑΡ

ΟϋΡ2 ΟϋΡ3 94

Ук 6Α3 ОЬЫУААТРЬ АРСУРЗРРЗО 563СТКГ5РК ΙδδίΟΑΕϋΡν δΥΥΟΟΟΡΡβΤ КЗКУ1 39КЬЫУААТРЬ АРОУРЗРРЗО ЗСЗСТРРТЬТ 135ЬОРЕРРА ТУУССЮРРЗТ 6Α3 ЬО КЬЫУААТРЬ АРОУРЗРРЗС ЗСЗСТРРТЬТ 133ЬОРЕРРА УУУСООГГЗТ 6Α3 Ы ОЬЫУААТРЬ АРОУРЗРРЗС ЗОЗСТРРТЬТ 133ЬОРЕРРА УУУСООРРЗТ 6АЗ Ь2 КЬЫУААТРЬ АРОУРЗРРЗС ЗОЗСТКРТЬТ 133Ь0РЕРРА УУУССЮРРЗТ 6АЗ ЬЗ КЬЫУААТРЬ АРОУРЗРРЗС ЗОЗОТКРТЬТ 153ЬОРЕРРА УУУСООРРЗТ

Ук 6АЗ Р..1Л/ТРОООТ ΚΙ.ΕΙΚΡ 6АЗ ЬО-ЬЗ Р.лллтсаст КЬЕ1КР Каркасная область 4 ИЭк2 РСООТ КЬЕ1КР

Пять гуманизированных вариантов легкой цепи получали на основе сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкция Ь0 представляла собой прямое прививание мышиного СОК из 6А3 (с использованием определения Кабата) в выбранную выше человеческую акцепторную скелетную область. Конструкции Ь1, Ь2 основаны на Ь0, каждая из которых включает одну дополнительную мутацию скелетной области, которые отличались в каждой из конструкций; положения 45, 70 соответственно. Конструкция Ь3 включает обе из вышеприведенных обратных мутаций. Конструкция Ь27 включает больше мутаций: Т4Ь, Α31Υ, Ό70Μ, У85Т, Τ94Υ, ф100О, Ь104У (8Еф ГО N0:138).

Таблица 3

Гуманизированные варианты вариабельной области легкой цепи 6А3

Гуманизированные УЬ	Матрица	Обратные мутации (Кабат#)
ЬО	Прямое прививание бАЗУЬСРР на 1ОКУ1-39 + миниген -ΙΚ-2	нет
И	ЬО	К45О
1.2	ьо	Р70К
ЬЗ	ы	К45О, Р70К
Ь27	ьо	Т4Ь, Α31Υ, Р70М, У85Т, Τ94Υ, 01 ООО, Ы04У

2.5. Конструирование Рс-деактивированной вариабельной области тяжелой цепи.

Две аминокислотные замены Ь237А и О239А осуществляли с конструкцией 1А11 Н3. Эти модификации делают молекулу менее способной рекрутировать иммунные эффекторные клетки или комплемент. Получающуюся в результате конструкцию УН идентифицируют как 1А11 Н3-Рс, и она имеет последовательность, как показано на 8Еф ГО N0:118 (кодируемую полинуклеотидом, имеющим последовательность 8Еф ГО N0:119). Антитело, содержащее 1А11 Н3-Рс и легкую цепь 1А11.Ь4 (1А11 Н3Ь4Рс), дополнительно анализировали, как описано в примере 4 ниже.

2.6. Аффинное созревание 1А11 Н3Ь4.

2.6.1. Конструирование рекомбинантных вариантов 1А11 Н3Ь4 СЭКН3 против 1Ь7К.

Получали множество вариантов гуманизированного моноклонального антитела 1А11 Н3Ь4 против 1Ь7К. Все они отличались только единичной аминокислотной заменой в области СЭКН3 тяжелой цепи антитела, имеющей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную в 8Еф ГО N0:114 (Н3), и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в 8Еф ГО N0:115 (Ь4).

Гуманизированные по СЭКН3 варианты 1А11 Н3Ь4 в составе экспрессирующего вектора млекопи- 46 023700 тающего рЬЕРЭ получали с использованием сайт-направленного мутагенеза.

2.6.2. Экспрессия антитела в небольшом масштабе в клетках НЕК 293 6Е.

Плазмиды рБЕРХ и рЬЕРО, кодирующие легкую и тяжелую цепи вариантов 1А11 Н3Ь4 и варианты СЭКН3 соответственно временно трансфицировали вместе в клетки НЕК 293 6Е в 96-луночном формате (экспрессируемый объем 500 мкл) с использованием 293£ес!ш ОпуЦгодеп, 12347019). Супернатанты собирали путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин. Супернатанты, содержащие антитело, затем фильтровали с использованием фильтрующей пластины 0,45 мкм. Антитела оценивали непосредственно из супернатанта культуры ткани.

2.6.3. Анализ вариантов 1А11 Н3Ь4 СЭКН3 против 1Ь7К с использованием Рго!еоп.

Исходный скрининг для определения связывающей аффинности вариантов СЭКН3 антитела (которые происходят в результате экспрессии антитела в небольшом масштабе в клетках НЕК 293 6Е, и оцениваемых непосредственно из супернатанта культуры ткани, как описано в примере 2.6.2) осуществляли на Рго!е0п ХРК36 (Вюгай). Способ был следующим: белок иммобилизовали на чипе СЬС путем связывания с первичным амином, мутантные по СЭКН3 антитела затем закрепляли на этой поверхности и 1Ь7К пропускали над ними в концентрации 256, 64, 16, 4, 1 нМ, причем инжекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали в качестве двойного референсного значения для кривых связывания. 50 мМ №0Н использовали для регенерации захватывающей поверхности, удаления связавшихся мутантных по СЭКН3 антител при подготовке к другому циклу захвата и инжекции аналита. Данные подгоняли к модели 1:1 с использованием программного обеспечения для анализа, установленного в анализаторе. Анализ связывания мутантных антител осуществляли непосредственно на супернатантах культуры ткани.

Скрининг выявил несколько антител, которые, по-видимому, обладали более хорошими кинетическими профилями по сравнению с родительской молекулой (1А11 Н3Ь4). Данные, полученные в результате этого анализа и представленные в 4.2.3, демонстрируют, что несколько мутаций СЭКН3 по остаткам N98 и Р100Ь, по-видимому, улучшают связывающую аффинность с 1Ь7К. Из этого набора данных, шесть молекул отобраны для дополнительного анализа (пример 2.6.4).

2.6.4. Экспрессия антитела в клетках НЕК 293 6Е в большем масштабе.

Данные демонстрируют, что несколько мутаций СЭКН3 по остаткам N98 и Р100Ь, по-видимому, улучшают связывающую аффинность с 1Ь7К (данные представлены в 4.2.3). Таким образом, очищенное антитело получали для этих шести вариантов СЭКН3. Конструкции, кодирующие тяжелую и легкую цепь вариантов СЭКН3 1А11 Н3Ь4, субклонировали из плазмид рЬЕРО и рБЕРХ в вектор рТТ для оптимальной экспрессии в НЕК 293 6Е в большом масштабе. Плазмиды временно трансфицировали вместе в 50-100 мл НЕК 293 6Е (подробная информация о плазмидах обобщена в табл. 7) с использованием 293£ес!ш Опуйгодеп, 12347019). Триптоновую подкормку добавляли к культуре клеток через 24 ч, и клетки собирали после еще 72 ч. Антитело затем аффинно очищали с использованием колонок с иммобилизованным белком и количественно оценивали путем регистрации поглощения при 280 нм.

3.0. Конструирование гуманизированных векторов.

Последовательности ДНК гуманизированных вариабельных областей оптимизировали с использованием программного обеспечения ЬЕТ0 1.0 (Еп!е1есЬоп СтЬН) и синтезировали йе поνо путем конструирования перекрывающегося олигонуклеотида и амплификации путем ПЦР. Праймеры включали сайты рестрикции для клонирования в экспрессирующиеся векторы млекопитающих и сигнальные последовательности человеческого иммуноглобулина для секреции. Гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую гамма 1 константную область, с использованием Аде1/Как1. Параллельно, гуманизированные вариабельные области легкой цепи клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую константную область каппа, с использованием НшйШ и ВкГ\1.

4.0. Характеристики гуманизированных антител.

4.1. Определение кинетики связывания конструкций 1А11 и 6А3: В1Асоге™ 3000.

Кинетики связывания антител против СЭ127 с человеческими СЭ127 ЕСЭ оценивали с использованием устройства В1Асоге 3000 (СЕ Неа1!Ьсаге). Гуманизированные конструкции 6А3 или 1А11 захватывали на биосенсорном чипе СМ5, на котором уже иммобилизовано моноклональное антитело против человеческого 1дС (Рс специфическое) В1Асоге (СЕ НеаИЬсаге кат. № ВК-1008-39) с использованием поставляемого буфера для связывания. Диапазон концентраций человеческого СЭ127 ЕСЭ (512, 256, 128, 64, 32, 16 нМ) инжектировали в течение 240 с со скоростью потока 30 мкл/мин.

1. Захват интересующего тАЬ.

2. Ассоциация аналита с захваченным тАЬ.

3. Диссоциация аналита (буфер).

4. Регенерация при помощи оптимизированного для В1Асоге буфера. Удаляет все, кроме ковалентно связанных ап!1-Н АЬ. Циклы анализа кинетики В1Асоге: буфер, 512, 256, 128, 64, 32, 16 нМ.

1Ь7К ЕСЭ; цикл с буфером использовали в качестве двойного референсного значения.

Поверхности с антителом регенерировали при помощи 3 М МдС1₂. Кинетики определили путем общей подгонки данных к модели 1:1 Лэнгмюра с использованием программного обеспечения В1Аеуа1иайоп. Результаты представлены в примерах 4.2.1 (1А11) и 4.2.2 (6А3).

- 47 023700

4.1.1. Определение кинетик связывания выбранных вариантов 1А11 Н3Ь4 СЭКН3.

Анализ В1Асоге™ использовали для определения связывающей аффинности очищенных мутантных по СЭКН3 антител (которые получали в результате экспрессии антитела в клетках НЕК 293 6Е в большом масштабе, как описано в примере 2.6.4).

4.1.1.1. Способ 1. В1Асоге™ Т100.

Антитело против человеческого 1дО (ОЕ НеаИПсаге/В1Асоге™ ВК-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ3 путем связывания с первичным амином до уровня приблизительно 1300 резонансных единиц (КИ), Мутант по СЭКН3 антитела затем захватывали на нем, все антитела захватывались с близкими уровнями (44-56 КИ) и 1Ь-7К пропускали над ними в концентрации 256, 64, 16, 4, 1 нМ, причем инжекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали в качестве двойного референсного значения для кривых связывания. Регенерацию этой поверхности осуществляли с использованием 3 М МдС1₂. Данные по связыванию подгоняли к 1:1 модели, относящейся к программному обеспечению для анализа В1Асоге™ Т100. Анализ осуществляли с использованием НВ8-ЕР в качестве буфера для анализа, и осуществляли при 25°С с использованием В1Асоге™ Т100. Результаты представлены в 4.2.4.

4.1.1.2. Способ 2. В1Асоге™ 3000.

Антитело против человеческого 1дО (ОЕ НеаИПсаге/В1Асоге™ ВК-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином до уровня приблизительно 5400 резонансных единиц (Ки), мутант по СЭКН3 антитела затем захватывали на этой поверхности, все антитела захватывались с близкими уровнями (175-205 КИ), и 1Ь7К пропускали сверху в концентрации 64, 16, 4, 1 нМ, причем инжекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали в качестве двойного референсного значения для кривых связывания, регенерацию этой поверхности осуществляли с использованием 3 М МдС1₂. Данные по связыванию подгоняли к модели 1:1, относящейся к программному обеспечению для анализа В1Асоге™ 3000. Анализ осуществляли с использованием НВ8-ЕР в качестве буфера для анализа, и осуществляли при 25°С с использованием В1Асоге™ 3000. Результаты представлены в 4.2.5.

4.1.2. Определение видов перекрестной реактивности 1А11 Н3Ь4 у яванского макака и игрунки.

Кинетики связывания 1А11Н3Ь4 для СО127 ЕСЭ яванского макака и игрунки оценивали с использованием В1асоге 3000. 1А11 Н3Ь4 захватывали на биосенсорном чипе СМ5, на котором уже иммобилизовано моноклональное антитело против человеческого 1дО (Рс-специфического) В1Асоге (ОЕ НеаППсаге кат № ВК-1008-39). Поверхности антитела регенерировали при помощи 3 М МдС1₂. Кинетики определяли путем общей подгонки данных к модели 1: 1 Лэнгмюра с использованием программного обеспечения В1Аеуа1иа1юп. Результаты представлены в 4.3.

4.1.3. Анализ ингибирования рецептора 1Ь7.

Анализ В1Асоге™ также использовали для демонстрации того, что очищенные мутантные по СЭКН3 антитела (которые получены путем экспрессии анетитела в клетках НЕК 293 6Е в большем масштабе, как описано в примере 2.6.4) способны ингибировать взаимодействие между 1Ь7 и 1Ь7К.

1Ь7 (Ρ&Ό §ук1етк) иммобилизовали на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином; поверхность кондиционировали с использованием 10 мМ глицина, рН 3,0, с получением поверхности для анализа нейтрализации. 1Ь7К в концентрации 64 нМ инкубировали с тестируемыми антителами в концентрациях 256, 128, 64, 16, 8, 4, 2 и 1 нМ в анализе 1 и 256, 128, 64, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0,25 нМ в анализе 2. Образцы затем инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем пропускали над чипом 1Ь7/СМ5, 10 мМ глицин, рН 3,0, использовали для регенерации поверхности для следующего взаимодействия. Значения 1С₅₀ рассчитывали с использованием КоЪокаде, в котором связывающие сигналы превращали в процентные значения, основанные на максимальном сигнале, достигнутом с использованием 1Ь7К при 64 нМ с 0 нМ антитела. Результаты представлены в 4.7.

- 48 023700

4.2. Результаты по кинетике связывания.

4.2.1. 1А11.

Таблица 4

Кинетики связывания для конструкций 1А11

Образец	ка (1/мс)	кй (1/с)	КЭ(М)
1А11 Химера	9,26е4	2,98е-4	3,22е-9
1А11 НОЬО	Связывание не обнаружено	-	-
1А11 Н1Ы	Связывание не обнаружено	-	-
1А11 НбЬб	Связывание не обнаружено	-	-
1А11 Н71_5	Экспрессия не обнаружена	-	-
1А11 НЗЬ4	1,77е5	4,64е-4	2,62е-9
1А11 Н31 5	2,94е4	6,07е-3	2,07е-7
1А11 Н31 9	4,32е4	1,84е-3	4,25е-8
1А11 Н31 6	1,82е4	2,82е-3	1,55е-7
1А11 Η4Ι.4	Связывание не обнаружено	-	-
1А11 Н61_4	Связывание не обнаружено	-	-
1А11 Η7Ι.4	Экспрессия не обнаружена	-	-
Меченый биотином 1А11 Η3Ι-4	1,69е5	4,52е-4	2,67е-9
1А11 Н31 4Рс	1,8е5	6,62е-4	3,68е-9

4.2.2. 6А3.

Таблица 5

Кинетики связывания для конструкций 6А3

Образец	ка (1/мс)	кй (1/с)	Ю(М)
Н4-61_6Ь27	1,6е4	2,99е-4	19
Н4-61_71_27	3,77е4	1,04е-3	28
Н4-61_8Ь27	2,43е4	3,7е-4	15
Н4-61 9Ь27	6,99е4	1,22е-3	18

4.2.3. Выбор различных вариантов 1А11 Н3Ь4 СИКН3 против 1Ь7К при помощи анализа В1Асоге™.

Таблица 6

Анализ вариантов 1А11 Н3Ь4 СИКН3 против 1Ь-7К с использованием Рго!еоп (КИ, в нМ)

	СОРНЗ
Позиции аминокислот в 1А11 Н31.4СИРНЗ	095	096	<397	N98	Υ99	моо	УЮОа	РЮОЬ	ОЮ1	\/102
А1а	0,30	14,60	0,18	0,23	0,21	5,75	0,20	0,17	0,76	0,13
СУ5	1,16	1,97	1,34	0,24	2,74	40,90	0,32	0,06	0,94	0,15
Азр	2,48	Родительский	0,35	0,03	0,39	Плох СВЯЗ	0,26	0,08	Родительский	0,10
<31и	2,06	0,16	2,28	а,05	0,39	Плох СВЯЗ	0,38	0,04	0,44	0,10
РЬе	2,18	19,20	1,51	0,48	0,15	9,61	0,48	Родительский	1,25	0,10
О1у	Родительский	39.40	Родительский	0,18	0,52	11,50	0,89	0,24	1,00	0,10
Ηίδ	0,63	3,05	1,66	0,24	0,41	12,20	0,23	0,06	0,85	0,18
Ιεο		4,73	0,21	0,37	0,93	Плох СВЯЗ	0,20	0,06	0,71	0,09
Ьу5		25,70	2,27		4,64	7,97	2,34	0,07	1,24	0,25
Ьеи	2,14	2,67	1,08		2,42	3,36	0,44	0,15	0,92	0,33
Ме1	0,82	7,81	2,26	0,27	1,70	10,60	0,17	0,06	0,89	0,08
Азп	2,44	0,46	0,43	Родительский	1,50	10,90	0,09	0,14	0,41	0,14
Рго	6,92	6,84	0,19	5,38	6,90	Плох СВЯЗ	1,24	0,90	0,26	0,71
О1п	3,02	1,21	2,07	0,30	1,31	12,80	0,68	0,07	0,74	0,25
АГД	29,50	15,70	2,06	ОтСутСтв Связ	3,26	Плох СвяЗ	2,55	3,49	0,95	0,31
5ег	0,79	3,76	0,53	0,10	0,25	10,40	0,46	0,10	0,60	0,08
ТЬг	3,29	2,32	0,28	0,19	1,11	Плох СВЯЗ	0,31	0,14	0,49	0,10
Уа1	2,36	3,72	0,08		1,65	Плох СВЯЗ	0,17	0,05	0,59	Родительский
Тгр		15,80	4,96	0,52	0,31	Родительский	1,73	0,44	1,50	0,07
Туг		21,90	1,31	0,71	Родительский	8,67	Родительский	0,26	1,18	Отсутсте связ

Варианты СРРНЗ, обладающие улучшенной связывающей аффинностью в отношении 11_7К Отсутствие

Типичное значение Κϋ для 1А11 Н3!_4 = 0.116 нМ

- 49 023700

Таблица 7

Выбранный вариант СЭВН3 тАЬк сконструированный и экспрессирующийся

Антитело 10	Альтернативные названия	Партия №	Описание молекулы	ΙΟΝο последова- тельности ДНК	ΙΟ Νο белковой последовательности
ВРС43Э8	1А11 Η3ί4 Ν9θϋ	НЕК102	И цепь 1А11 УНЗ человеческого 11 7П	N960	против	120	121
(вариант СОЯНЗ)	3	1_ цепь 1А11 человеческого 1Ь7Р	уи	против	106	22
ВРС4399	1А11 НЭП Ν9ΘΕ (вариант СОКНЗ)	НЕК102	Н цепь 1А11 УНЗ человеческого Н_7Р	Ν98Ε	против	122	123
	4	ί цель 1А11 человеческого И7Р	νΐ_4	против	108	22
ВРС4400	1А11 НЗЬ4 РЮОЬЕ	НЕК102	Н цепь 1А11 УНЗ человеческого ΙΙ.7Ρ	РЮОЬЕ	против	124	125
(вариант СОРНЗ)	5	ί цепь 1А11 человеческого ΙΙ-7Ρ	У14	против	103	22
ВРС4401	1А11 Н31_4 РЮОЬН	НЕК102	Н цепь 1А11 УНЗ человеческого Ι17Ρ	РЮОЬН	против	126	127
(вариант СОРНЗ)	6	ί цепь 1А11 человеческого И7Р	У1_4	против	108	22
ВРС4402	1А11 Н31_4 Р100Ы	НЕК102	Н цепь 1А11 УНЗ человеческого Ш7Р	Р100Ы	против	126	129
(вариант СОРНЗ)	7	1_ цепь 1А11 человеческого Ιί7Ρ	У1_4	против	106	22
ВРС4403	ΐΑΐι Η3Ι.4 рюоьу	НЕКЮ2	Н цепь 1А11 УНЗ человеческого Н.7П	ПООЬУ	против	130	131
(вариант СОРНЗ)	8	1_ цепь 1А11 человеческого 1Ь7Р	У1_4	против	106	22
ВРС1142	1А11 НЗЬ4	НЕК102 9	Н цепь 1А11 человеческого Ι17Ρ	УНЗ	против	32	13
ΟΡΙΤ83 7988	1 цепь 1А11 человеческого И7Р	УЬ4	против	103	22

4.2.4. Анализ при помощи В1Асоге™ Т100 выбранных вариантов 1А11 Н3Ь4 СЭВН3.

В табл. 8 продемонстрованы данные, полученные в результате исследования 4.1.1.1, которые демонстрируют, что все мутации СОВН3, по-видимому, обладают более хорошими аффинностями по сравнению с родительскими молекулами, причем наилучшая конструкция, по-видимому, представляет собой ВРС4398 (Ап!1-1Ь7В 1А11 Н3Ь4 N980).

Таблица 8

Идектификатор/номер молекулы	Описание молекулы	ка (М/С)	ка (1/с)	КО (нМ)
ВРС1142(СРГТ537988) Повтор 1	Απίι-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι.4	1.08Е+06	7.06Е-05	0.065
ВРС1142(СР1Т537988) Повтор 2	ΑπΙι-ί17Κ 1А11 НЗЕ4	1.12Е+О6	586Е-05	0,052
ВРС4398	ΑπΙι-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 N960 (вариант СОРНЗ)	171Е+06	3.70Е-05	0.022
ВРС4399	Αι)1ι-Ι17Β 1А11 НЗЬ4 Ν98Ε (вариант СОРНЗ)	1,45Е+06	4.08Е-05	0,028
ВРС4400	АП11-И.7Р 1А11 Н314 РЮОЬЕ (СОРНЗ вариант)	9.24Е+05	2.68Е-05	0,029
ВРС4401	Апй-1Ь7Р 1А11 НЗЬ4 РЮОЬН (вариант СОРНЗ)	9.10Е+05	3,06Е-05	0,034
ВРС4402	Αηΐι-Ι1_7Ρ 1А11 НЗЬ4 Р100Ы (вариант СОРНЗ)	8.26Е+05	3.32Е-05	0,040
ВРС4403	Αηΐί-ΙΙ_7Ρ 1А11 НЗЬ4 РЮОЬУ (вариант СОРНЗ)	8.47Е+05	3,ЗОЕ-05	0,039
ВРС1142 (НЕМ 029)	АПЙ-11.7Р 1А11 Η3ί4	1.16Е+06	6А8Е-05	0,056

Родительскую молекулу (ВРС1142-ал(|-117Р 1А11 НЗЬ4) анализировали множество раз в эксперименте с использованием материала, экспрессирующегося в СНО (ΟΡΙΤ837988), и материала, экспрессирующегося в НЕК (НЕК1029), никакого значимого различия не обнаружено между аффинностями для различных систем экспрессии родительской молекулы

4.2.5. Анализ при помощи В1Асоге™ 3000 выбранных вариантов 1А11 Н3Ь4 С.ОНВ3.

В табл. 9 продемонстрированы данные, полученные в результате исследования 4.1.1.2, и показано, что все мутации СОВН3, по-видимому, обладают более хорошими аффиностями по сравнению с родительскими молекулами, причем наилучшая конструкция, по-видимому, представляет собой ВРС4398 (1А11 Н3Ь4 N980) и ВРС4399 (1А11 Н3Ь4 N980).

- 50 023700

Таблица 9

Идентификатор/номер молекулы	Описание молекулы	ка (М/с)	кф1/с)	КО (нМ)
ВРС1142(<ЗР1Т337988> Повтор 1	Αη1ί-ΙΙ 7Ρ 1А11 Η3Ι.4	3,60Е+05	2,70Е-04	0,751
ВРС1142(<ЗР1Т337988> Повтор 2	ΑηΙί-ΙΙ 7Ρ 1А11 Η3Ι 4	3,62Е+05	2,36Е-04	0,651
ВРС4398	Ап«-П_7Р 1Α11 Η3ί4 N980 (вариант СОРНЗ)	5.44Е+05	2Д9Е-04	0,385
ВРС4399	Αη1ί-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 Ν98Ε (вариант СОРНЗ)	5,97Е+05	2,ЗЗЕ-04	0,39
ВРС4400	ΑηΙί-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 ЕЮОЬЕ (вариант СОРНЗ)	3,51 Е+05	1,91Е-04	0,546
ВРС4401	Αη1ί-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 ЕЮОЬН (вариант СОРНЗ)	3.37Е+05	1.96Е-04	0,582
ВРС4402	Αη1ί-ΙΙ_7Ρ 1А11 Н314 ЕЮОЫ (вариант СОРНЗ)	3.00Е+05	2Д0Е-04	0,668
ВРС4403	ΑηΙί-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι.4 ЕЮОЬУ (вариант СОРНЗ)	2,98Е+05	1Д9Е-04	0,636
ВРС1142 (НЕК1029)	Αηϋ-ΙΙ 7Ρ 1А11 Η3Ι.4	3.49Е+05	2,29Е-04	0,656
Родительскую молекулу (ВРС1142-ап1М1_7Р 1А11 Н31_4) анализировали множество раз в эксперименте с использованием материала, экспрессирующегося в СНО (ΟΡΙΤ537988), и материала, экспрессирующегося в НЕК (НЕМ 029}, никакого значимого различия не обнаружено меи-ду аффинностями для различных систем экспрессии родительской молекулы

Различия обнаружены в общих аффинностях, рассчитанных по двум способам. Последнее вероятно является следствием того, что 1Ь7К представляет собой гомодимер, и, таким образом, величина авидности и перекрестного связывания антитела с антигеном может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от различных плотностей 1Ь7К, иммобилизованных на различных захватывающих поверхностях, использованных в двух анализах. Несмотря на различные аффинности, обнаруженные между двумя анализами, ранжирование в двух экспериментах демонстрирует, что ВРС4398 (1А11 Н3Ь4 N980) обладает улучшенной аффинностью по сравнению с родительской молекулой 1А11 Н3Ь4.

4.3. Виды перекрестной реактивности.

Обнаружено, что 1А11 Н3Ь4 (дикий тип) перекрестно реагирует с 1Ь-7К игрунки и яванского макака, тестируемых на сравнимом уровне, при помощи системы В1асоге (табл. 10).

Таблица 10

Сравнение 1А11 Н3Ь4 с человеческим 1Ь7К, мышиным 1Ь7К и 1Ь7К яванского макака

Образец	ка (1/мс)	кб (1/с)	КЦ(М)
1А11 НЗЬ4 с человеческим И 7К	1,77е5	4,64е-4	2,62е-9
1А11 НЗЬ4 с ΙΙ-7Κ яванского макака	2,56 е4	2,34е-4	9,06е-9
1А11 Н31 4 с ΙΙ.7Π игрунки	4,93е4	2,99е-4	6,05е-9

4.4. Связывание эпитопа в соответствии с рентгеновской кристаллографией.

При использовании 1А11 Н3Ь4 РаЬ, рентгеновскую кристаллографию вместе с моделированием ш зШсо использовали для предсказания связывающих поверхностей для тАЬз для того, чтобы обеспечить механистическое понимание обнаруженной функциональной нейтрализации, и чтобы произвести рациональные выборы созревания антитела. Получена структура с высоким разрешением (2,08 А) комплекса 1А11Н3Ь4 РаЬ/человеческого рецептора 1Ь7. Внеклеточный домен человеческого рецептора 1Ь7 и 1А11Н3Ь4 экспрессировали в клетках СНО 1ее и очищали посредством аффинной хроматографии и гельфильтрации. Фрагмент РаЬ 1А11Н3Ь4 получали путем расщепления папаином. Комплекс РаЬ1А11Н3Ь4/1Ь7К Εί'.Ο получали путем смешивания РаЬ1А11Н3Ь4 с 1Ь7КесерЮг Εί'.Ο в соотношении 1:1,2 моль. Белки концентрировали и кристаллизовали с использованием диффузии паров по методу висячей капли. Данные дифракции рентгеновских лучей получали с использованием усповершенствованного источника протонов в Агдоппе №Юопа1 ЬаЬогаЮгу. Данные дифракции индексировали и масштабировали с использованием программного обеспечения НК02000. Структуру определяли путем молекулярной замены в программе Х-РЬ0К. Исходный раствор для молекулярной замены подвергали множеству циклов оптимизации молекулярной динамики в СNX и обновления при помощи программы ХУтСооЕ

На основе кристаллической структуры высокого разрешения 2.08А предположили, что 1А11Н3Ь4 связывается с рецептором 1Ь7 по 4 из внеклеточных петель 1Ь-7К, таким образом блокируя связывание лиганда 1Ь7:

петля 2: 55О1у 56А1а 57Ьеи 58Vа1 59О1и 60Vа1 61Ьуз, петля 3: 80Ьеи 81Ьеи 8211е 83О1у 84Ьуз 100Ьуз, петля 4: 138Ьуз 139Туг 142Vа1, петля: 192Туг 193Р1е.

Эти результаты согласовывались с выявленной конкуренцией за связывание с МЬ7, обнаруженной для 1А11 и 6А3.

4.5. Анализ эффекторных функций.

4.5.1. 1А11 Н3Ь4 лишен опосредованной комплементом цитотоксичности.

В общей сложности шесть отдельных экспериментов демонстрируют, что 1А11 Н3Ь4 (дикий тип) не обладает измеримой опосредованной комплементом цитотоксичности. Эти эксперименты осуществляли с использованием 1Ь-7г ВасМат трансдуцированной клеточной линии НΕК 293 МδК II в качестве мишени. Эти клетки трансдуцировали (то1 75) в течение приблизительно 21 ч при 37°С, 5% СО₂ в культуральных колбах Т175. Прикрепившиеся клетки затем удаляли из колб с использованием ТгурЬЬ и несколько раз промывали перед высеванием в количестве 1х 10⁵ клеток/50 мкл/лунку в 96-луночном план- 51 023700 шете. 25 мкл антитела добавляли в течение 30 мин при 37°С, 5% СО₂. После этой инкубации добавляли 20 мкл кроличьего комплемента, и планшет затем возвращали в инкубатор на 2 ч. Оценку клеточной жизнеспособности осуществляли путем добавления 100 мкл Се11ТПег-С1о в каждую лунку путем мягкого перемешивания с использованием многоканальной пипетки. Планшет затем визуализировали в отношении люминисцентного сигнала с использованием планшетного ридера У1с!ог У (жизнеспособные клетки демонстрировали увеличенный сигнал). Пример одного из этих экспериментов представлен на фиг. 1.

Положительное контрольное антитело (Сп!к 32092) использовали в вышеприведенном эксперименте в качестве специфического в отношении рецептора клеточной поверхности для НЕК3, который коэкспрессировался на той же самой клетки-мишени, на которой экспрессировался ЫЬ-7Ка. Это контрольное антитело использовали в той же концентрации, что 1А11 Н3Ь4 (10 мкг/мл), и комбинировали с теми же двумя источниками кроличьего комплемента (Са1ЬюсНет и 1п\'Пгодеп). Эти результаты демонстрируют, что как клетки-мишени, так и комплемент, которые использовали в анализе, способны вызывать зависимую от комплемента цитотоксичность.

4.5.2. 1А11 Н3Ь4Рс уменьшал антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АОСС).

Очищенные мононуклеарные клетки периферической крови семи человеческих доноров профилировали в качестве эффекторных клеток в анализе АЭСС. Эти эксперименты осуществляли с ЫЬ-7г ВасМат трансдуцированной клеточной линией НЕК 293 М8К II, используемой в качестве клеток-мишеней. Эти клетки трансдуцировали (то1 75) в течение приблизительно 21 ч при 37°С, 5% СО₂ в культуральных колбах Т175. Эти прикрепившиеся клетки затем удаляли из колб с использованием Тгур1е и несколько раз промывали до загрузки европием. Эти загруженные клетки комбинировали в 96-луночном планшете (2х10⁴ клеток/25 мкл/лунку), который содержал антитело против 1Ь-7К, в течение 30 мин при 37°С, 5% СО₂. После инкубации эффекторные клетки добавляли в отношениях 200, 100, 50 и 25:1 (100 мкл/лунку) и возвращали к 37°С, 5% С02 на 2 ч. После этой инкубации 25 мкл супернатанта удаляли и добавляли в 96-луноный планшет, содержащий 100 мкл/лунку проявляющего раствора Ое1йа. Планшет затем инкубировали с использованием планшетного шейкера при комнатной температуре в течение 5 мин и затем считывали в планшетном ридере У1с!ог У. Любое количество европия, высвобожденное клетками при лизисе, в окружающий супернатант (клеточная цитотоксичность) измеряли в единицах флуоресценции.

В этих анализах сравнивается способность 1А11 Н3Ь4 дикого типа и Рс-деактивированной молекулы 1А11 Н3Ь4РС связываться с человеческими эффекторными клетками через их Рс-рецепторы, и убивать положительные в отношении рецептора 1Ь-7 клетки-мишени. Общие результаты этих экспериментов демонстрируют, что Рс-деактивированные 1А11 Н3Ь4РС обладают, по меньшей мере, в двое меньшей способностью инициировать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность по сравнению с 1А11 Н3Ь4 дикого типа. Эти результаты также демонстрирует, что у шести из семи доноров деактивированное антитело способно индуцировать некоторый уровень акивности АОСС (один донор демонстрирует небольшую активность в отношении как дикого типа, так и деактивированных 1А11 Н3Ь4). Эти результаты представлены на фиг. 2.

4.5.3. Связывание Рс-рецептора.

1А11 Н3Ь4 и 1А11 Н3Ь4Рс оценивали в отношении их способности связываться со множеством Рсэффекторных рецепторов (Рс гамма I, 11а и 111а), и РсКп множества видов и по сравнению с диким типом в качестве контроля и Рс-деактивированных антител. Анализ осуществляли с использованием аппарата для исследования поверхностного плазмонного резонанса Рго!е0п ХРК36 (ВюКаб). Тестируемые антитела связывались с биосенсортным чипом СЬМ путем связывания с первичным амином. Различные Ρсγ рецепторы использовали в качестве аналитов в концентрации 2048, 512, 128, 32 и 8 нМ с использованием НВ8-ЕР (рН 7,4) в качестве буфера для анализа. Для связывания с рецептором РсКп человеческий, яванского макака, мышиный и крысиный РсКп использовали в качестве аналита в концентрации 2048, 512, 128, 32 и 8 нМ, причем анализ осуществляли при рН 6,0 и 7,4. Все сенсограммы связывания имели двойное референсное значение при инжекции 0 нМ (т.е. только буфер). Данные подгоняли к равновесным моделям, относящимся к программному обеспечению для анализа Рго!е0п.

В табл. 11 продемонстрированы аффинности, полученные для связывания антитела с различными Рс рецепторами, измеренными в этом исследовании, и продемонстрировано, что 1А11 Н3Ь4 и 1А11 Н3Ь4Рс имели поведение, сравнимое с соответствующими контрольными антителами. Антитела с деактивированным Рс (1А11 Н3Ь4Рс) демонстрировали отсутствие связывания или значительно уменьшенное связывание в отношении рецепторов Ρсγ и, следовательно, точный анализ не мог быть осуществлен. Данные для связывания РсКп демонстрируют, что Рс деактивированные и Рс дикого типа обладают похожими аффинностями для всех тестируемых видов, данные в таблице приведены для анализа при рН 6,0, связывание отсутствовало или было гораздо меньше при рН 7,4, как ожидалось.

- 52 023700

Таблица 11

Аффинности связывания 1А11 н3Ь4 (Рс деактивированных и те! Рс) с Рс рецепторами (нМ)

Конструкции	Рсу2а (Агд)	Рсу2а (ΗΪ5)	РсуЗа (РЬе)	Рсу (Уа!)	Рсу1	РсРп чело- века	РсПп яван- ского	РсРп мыши	РсКп крысы

							макака
Контрольное АЬ (Рс У/Т)	1290	1500	1840	442	149	95	156	160	112
Контрольное АЬ (Ро деактивированное)	Значительно уменьшенное связывание	Нет связы- вания	Нет связы- вания	Нет связы- вания	Значительно уменьшенное связывание	154	195	171	118
1А11 НЗБ4	1250	1040	990	319	21 4	183	210	192	145
1А11 НЗЬ4Рс	Значительно уменьшенное связывание	Нет связы- вания	Нет связы- вания	Нет связы- вания	Значительно уменьшенное связывание	158	248	207	163

4.6. Анализы силы ш уйго.

4.6.1. Ингибирование стимулируемого 1Ь-7 фосфорилирования 8ТАТ5 1А11 и 1А11 н3Ь4.

Для скрининга функционального антитела в отношении 1Ь-7Ка культуры клеток гибридомы, антитело в качестве положительного контроля или тестируемые образцы супернатантов инкубировали с клетками РВМС в течение 30 мин, а затем стимулировали 1Ь-7. Необработанные клетки анализировали в качестве фонового сигнала, тогда как клетки, обработанные 1Ь-7, рассматривали в качестве отрицательного контроля. После 30-минутной инкубации с контролями или анализируемыми образцами клетки стимулировали 1Ь-7 в течение 15 мин при 37°С. Клетки затем фиксировали 1,6% параформальдегидом/РВ8 в течение 10 мин при 37°С и пермеабилизировали в 100% метаноле в течение 20-30 мин. Клетки затем дважды промывали в буфере для окрашивания (1% В8А в РВ8) и окрашивали меченым А1еха-647 антителом против р8!а!5 (ВО Вюкаепсек 1пс #612599) в течение 1 ч. Образцы анализировали на приборе ВО Ь8К II РАС8.

Родительское моноклональное антитело 1А11 блокировало индукцию 1Ь-7 фосфорилирования 8ТАТ5 в человеческих РВМС с 1С₅₀ 0,088 мкг/мл (данные не представлены). 1А11 н3Ь4 тестировали в том же анализе с использованием РВМС из двух доноров с двумя концентрациями человеческого 1Ь-7 (0,1 и 1 нг/мл). 1А11 н3Ь4 демонстрирует очень похожую 1С₅₀ (среднее=0,087 мкг/мл) по сравнению с 1А11, указывая на то, что способ гуманизации не влиял на способность антитела ингибировать 1Ь-7индуцированное р8ТАТ5 (фиг. 3А и 3В).

4.6.2. Ингибирование 1Ь-7-индуцированной продукции 1Ь-17 в 1А11 н3Ь4.

1А11 н3Ь4 анализировали в соответствии со следующим протоколом для определения его способности ингибировать рост Т117. СЭ4+ клетки выделяли в соответствии с руководством пользователя (#130-091-155, М11!епу1). Приблизительно 1х10⁶/мл СЭ4+ клеток в 100 мкл смешивали с равным объемом 2х концентрации Т117 дифференцирующей среды (2 мкг/мл анти-СЭ28 + 10 мкг/мл анти-ШЫ-у + 10 мкг/мл анти-ГО-4 + 12,5 нг/мл 1Ь-1 β, + 20 нг/мл ГО-23 + 50 нг/мл ГО-6) и выращивали при 37°С с 5% С0₂ в течение 5 суток. Обработка различными цитокинами и факторами роста в среде Т117 предпочтительно дифференцировала СЭ4+ клетки в клетки Т117. ССК6+ клетки из дифференцированных культивированных клеток на 5 сутки сортировали с использованием ВО РАС8 80КР Апа II. ССК6+ клетки затем доводили до 2х 10⁶/мл для анализа продукции ГО-17.

Для измерения уровня ГО-17 и ГРЛ-у 100 мкл ССК6+ клеток предварительно инкубировали с тестирующим антителом в течение 1 ч при 37°С и затем смешивали с 100 мкл 10 нг/мл ГО-7. Клетки выращивали в течение 24-40 ч при 37°С с дополнением 5% С0₂. Уровни ГРИ-у и (Б-17 в 100 мкл культурального супернатанта измеряли при помощи Р1отеСу!от1х (Вепйег Мей8ук!етк) через 24 и 40 ч соответственно.

1А11 н3Ь4 тестировали в анализе роста Т117 в общей сложности в четырех образцах человеческих СЭ4+ клеток (фиг. 4Ά-Ό). Гуманизированное антитело демонстрирует значительное ингибирование продукции ГО-17 в двух образцах и обладает тенденцией ингибировать в двух других образцах. Принимая во внимание вариацию от донора к донору в этом анализе, авторы изобретения заключили, что 1А11 н3Ь4 способны блокировать опосредованный ГО-7 рост клеток Т117.

4.6.3. Действия в отношении сигнализации Т8ЬР.

Субъединица ГО-7Ка существует как в ГО-7К, так и Т8ЬР рецепторном комплексе (Т8ЬРК). Действие 1А11 н3Ь4 на опосредованную Т8ЬР передачу сигнала тестировали в анализе ш уйго на основе Т8ЬР-индукции продукции ТАКС человеческими моноцитами. Имеющееся в продаже антитело против ГО-7Ка К34.34 использовали в качестве положительного контроля для блокирования Т8ЬР-индукции ТАКС. Кроме того, Рс-деактивированный гуманизированный ЦО1 (нШдО1; ОКГГ839633) также использовали в качестве отрицательного контроля. Использовали моноциты 5 доноров, причем Т8ЬР использовали в концентрации 1 нг/мл, 1А11 н3Ь4 и нШдО1 использовали в дозах 0,001-30 мкг/мл, и К34.34 использовали в концентрации 0,4, 2 и 10 мкг/мл. Жизнеспособность клеток также оценивали путем подсчета клеток.

1А11 н3Ь4 не влияли на Т8ЬР-индукцию ТАКС, как продемонстрировано на фиг. 5А-Е, тогда как такие же 5 доноров К34.34 значительно ингибировали продукция ТАКС. Гуманизированное антитело в качестве отрицательного контроля не оказывало действие на продуцирование ТАКС. Этот набор данных

- 53 023700 демонстрирует, что 1А11 Н3Ь4 не нейтрализует ТЗЬР передачу сигнала в человеческих моноцитах. Таким образом, предполагают, что 1А11 Н3Ь4 является специфическим для нейтрализации опосредованной 1Ь-7 передачи сигнала через 1Ь-7К и не влияет на ТЗЬР передачу сигнала через ТЗЬРК.

4.7. 1Ь7 Анализ ингибирования рецептора.

В табл. 12А продемонстрированы значения 1С₅₀, полученные в анализе 1, и показано, что все конструкции имеют более хорошие значения 1С₅₀, чем наилучшее значение, полученные для родительской молекулы 1А11 Н3Ь4, и что две самые хорошие молекулы представляли собой ВРС4401 (АпБ-1Ь7К 1А11 Н3Ь4 Р100ЬН) и ВРС4398 (1А11 νΉ3 N980 Ь4). В табл. 12В продемонстрированы значения 1С₅₀, полученные в анализе 2, и также продемонстрировано, что обе конструкции ВРС4401 (Апй-1Ь7К 1А11 Н3Ь4 Р100ЬН) и ВРС4398 (1А11 УН3 N980 Ь4) обладают более хорошими значениями 1С₅₀, чем наилучшее значение, полученное для родительской молекулы 1А11 Н3Ь4. Анализы 1 и 2 осуществляли на разделяющих поверхностях ГО7К/СМ5.

Таблица 12А

1С₅₀ в анализе ингибирования рецептора (анализ 1)

Идентификатор/номер молекулы	Описание молекулы	1С„(нМ)
ВРС1142(СК1Т337988) Повтор 1	Αηίϊ-ΙΙ_7Κ 1А11 НЗЬ4	19,42
ВРС4398	Αηίϊ-ΙΙ_7Κ 1А11 Η3Ι_4 Ν98ϋ (вариант СЭРНЗ)	14,94
ВРС4399	Αηϋ-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 Ν98Ε (вариант СЭРНЗ)	15,8
ВРС4400	АпЬ-1Ь7Р 1А11 Η3Ι_4 РЮОЬЕ (вариант СЭРНЗ)	15,33
ВРС4401	Αηϋ-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 РЮОЬН (вариант СОРНЗ)	14,75
ВРС4402	Αηϋ-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι_4 Р100Ы (вариант СЭРНЗ)	15,23
ВРС4403	Απ1ί-Ιί7Ρ 1А11 НЗЬ4 РЮОЬУ (вариант СЭРНЗ)	15,54
ВРС1142 (НЕК1029)	Αηίί-ΙΙ_7Ρ 1А11 НЗЬ4	16,21
ВРС1142(ОР1Т337988) Повтор 2	ΑηΙί-ΙΙ_7Ρ 1А11 Η3Ι.4	17,23
Родительскую молекулу (ВРС1142-ал1Ш7Р 1А11 НЗЬ4) анализировали множество раз в эксперименте с использованием материала, экспрессирующегося в СНО (ΟΡΙΤ337988), и материала, экспрессирующегося в НЕК (НЕК1029).

Таблица 12Б

1С₅₀ в анализе ингибирования рецептора (анализ 2)

Идентификатор/номер молекулы	Описание молекулы	1С_и(нМ)
ВРС1142(СР1Т337938) Повтор 1	1А11 Н31_4	16,44
ВРС4398 Повтор 1	1А11 УНЗ Ν98ϋ \|_4	14,86
ВРС4401 Повтор 1	1А11 УНЗ РЮОЬН Ι.4	14,92
ВРС1142(ОР1Т337938) Повтор 2	1А11 Н31_4	16,57
ВРС1142(ОР1Т337988) Повтор 3	1А11 Н31_4	16,79
ВРС4398РерНса1е 2	1А11 УНЗ Ν98ϋ \|_4	14,17
ВРС4401 (Повтор 2)	1А11 УНЗ РЮОЬН Ι.4	15,15
ВРС1142(СР1Т337988) Повтор 4	1А11 Н3!_4	17,35
Родительскую молекулу (ВРС1142-апП-Н_7Р 1А11 Н31_4) анализировали множество раз в эксперименте с использованием материала, экспрессирующегося в СНО (3ΡΙΤ537988), повторных анализов ВРС4398 (1А11 УНЗ Ν98ϋ 1.4) и ВРС4401 (1А11 УНЗ РЮОЬН Ь4).

4.8. Анализ связывания полиморфа 1Б-7К.

1Б-7К существует в виде двух полиморфных форм, вариант 1: ТЬг66-11е128, вариант 2: 11е66-ТЬг128. Анализировали связывание 1А11Н3Б4 с обоими полиморфными формами. Антитело против человеческого 1§О (ОЕ НеаИЪсаге/В1Асоге™ ВК-1008-39) иммобилизовали на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином до уровня приблизительно 9000 резонансных единиц (КИ), 1А11Н3Ь4 затем захватывали на этой поверхности, и 1Ь7К пропускали над ней в концентрации 512, 256, 128, 64, 32 и 16 нМ, причем инжекцию 0 нМ (т.е. только буфер) использовали для двойного референса кривых связывания, регенерацию этой поверхности осуществляли с использованием 3 М М§С1₂. Данные по связыванию подгоняли к модели 1:1, относящейся к программному обеспечению для анализа В1Асоге™ 3000. Анализ осуществляли с использованием НВЗ-ЕР в качестве буфера для анализа и осуществляли при 25°С на В1Асоге™ 3000.

- 54 023700

В табл. 13 приведены полученные данные и продемонстрировано, что 1А11 Н3Ь4 обладает такой же или похожей связывающей аффинностью с обоими полиморфными вариантами (т.е. связывается с обоими полиморфами).

Таблица 13

Связывание полиморфа !Ь-7К

1А11 Η3Ι-4 с вариантом 1 ТЬгв6-11е128	К™ (Ка) 1,52е5	Κοιτ 4,15е-4	(КО)	Κϋ 2,73е-9
1А11 Η3Ι.4 с вариантом 2 ίιΙΙ_7Ρ: 1ЬЕ66-ТМг128	К,„ (Ка) 1,46е5	Кок 4,56е-4	(КО)	Κϋ 3,1е-9

В настоящем описании изобретение раскрыто со ссылкой на воплощения таким образом, который дает возможность для ясного и краткого изложения. Предполагается и должно быть понятно, что воплощения могут быть различным образом комбинированы или разделены, не выходя за объем изобретения.

- 55 023700

	Список последовательностей
<110>	(Нако Сгоир Ыш11сС
<120>	СЭ127 В1п01пд РгоЬеипз
<130>	РВ64061
<140>	61/299010
<141>	2010-01-28
<150>	ипкпоип
<151>	2011-01-26
<160>	138
<170>	ГазЬЗЕО £ог УегзЗоп 4.0
<210>	1
<211>	455
<212>	РРТ
<213>	Ното Зариепз
<220>
<223>	Ьитап СР127

<400> 1

МеЬ 1

ТЬг

Не

Ьеи

С1у 5

ТЬг

РЬе

61у

МеЬ 10

Уа1

РЬе

Зег

Ьеи

Ьеи 15

61п

Уа1

Зег

С1у

С1и

Зег

61у

Туг

А1а

С1п

Азп

С1у

Азр

Ьеи

С1и

Азр

20

25

30

А1а

61и

Ьеи

Азр

Туг

Зег

РЬе

Зег

Суз

С1п

Ьеи

С1и

Уа1

Азп

С1у

35

40

45

Зег

С1п

ΗΪ3

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

А1а

РЬе

С1и

Азр

Рго

Азр

Уа1

Азп

ТЬг

50

55

60

ТЬг

Азп

Ьеи

С1и

РЬе

С1и

11е

Суз

С1у

А1а

Ьеи

Уа1

С1и

Уа1

Ьуз

Суз

65

70

75

80

Ьеи

Азп

РЬе

Агд

Ьуз

Ьеи

С1п

С1и

11е

Туг

РЬе

11е

С1и

ТЬг

Ьуз

85

90

95

РЬе

Ьеи

11е

С1у

Ьуз

Зег

Азп

11е

Суз

Уа1

Ьуз

Уа1

С1у

С1и

Ьуз

100

105

110

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьуз

11е

Азр

Ьеи

ТЬг

11е

Уа1

Ьуз

Рго

61и

115

120

125

А1а

Рго

РЬе

Азр

Ьеи

Зег

Уа1

11е

Туг

Агд

61и

61у

А1а

Азп

Азр

РЬе

130

135

140

Уа1

ТЬг

РЬе

Азп

ТЬг

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1п

Ьуз

Туг

Уа1

Ьуз

Уа1

145

150

155

160

Ьеи

МеЬ

Н18

Азр

Уа1

А1а

Туг

Агд

О1п

61и

Ьуз

Азр

61и

Азп

Ьуз

Тгр

- 56 023700

165

170

175

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Азп

Ьеи

Зег

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1п

Агд

Ьуз

180

185

190

Ьеи

61η

Рго

А1а

МеЬ

Туг

С1и

11е

Ьуз

Уа1

Агд

Зег

11е

Рго

Азр

195

200

205

ΗΪ3

Туг

РЬе

Ьуз

С1у

РЬе

Тгр

Зег

С1и

Тгр

Зег

Рго

Зег

Туг

РЬе

210

215

220

Агд

ТЬг

Рго

С1и

11е

Азп

Зег

С1у

С1и

Мер

Азр

Рго

Не

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

11е

Ьеи

Зег

РЬе

Зег

Уа1

Ьеи

Уа1

Не

Ьеи

А1а

245

250

255

Суз

Уа1

Ьеи

Тгр

Ьуз

Агд

Не

Ьуз

Рго

Не

Уа1

Тгр

Рго

Зег

Ьеи

260

265

270

Рго

Азр

Нйа

Ьуз

ТЬг

Ьеи

С1и

ΗΪ3

Ьеи

Суз

Ьуз

Рго

Агд

Ьуз

275

280

285

Азп

Ьеи

Азп

Уа1

Зег

РЬе

Азп

Рго

61и

Зег

РЬе

Ьеи

Азр

Суз

С1п

11е

290

295

300

Н1з

Агд

Уа1

Азр

11е

С1п

А1а

Агд

Азр

С1и

Уа1

61и

61у

РЬе

Ьеи

305

310

315

320

61п

Азр

ТЬг

РЬе

Рго

С1п

61п

Ьеи

С1и

Зег

С1и

Ьуз

С1п

Агд

Ьеи

325

330

335

61у

Азр

Уа1

61п

Зег

Рго

Азп

Суз

Рго

Зег

С1и

Азр

Уа1

340

345

350

ТЬг

Рго

С1и

Зег

РЬе

61у

Агд

Азр

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

А1а

е1у

355

360

365

Азп

Уа1

Зег

А1а

Суз

Азр

А1а

Рго

11е

Ьеи

Зег

Агд

Зег

Ьеи

370

375

380

Азр

Суз

Агд

61и

Зег

С1у

Ьуз

Азп

С1у

Рго

Н1з

Т7а1

Туг

С1п

Азр

Ьеи

385

390

395

400

Ьеи

Зег

Ьеи

61у

ТЬг

Азп

Зег

ТЬг

Ьеи

Рго

РЬе

Зег

405

410

415

Ьеи

61п

Зег

С1у

11е

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Азп

Рго

Уа1

А1а

СЬп

С1у

61п

Рго

420

425

430

Не

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьеи

С1у

Зег

Азп

С1п

С1и

А1а

Туг

Уа1

ТЬг

Мер

435

440

445

Зег

РЬе

Туг

О1п

Азп

61п

450

455

<210> 2 <211> 5 <212> РК.Т <213> Миз гаизси1из <220>

<223> 1А11 СЬР Н1 <400> 2

С1у Туг ТЬг Мер Азп

- 57 023700 <210> 3 <211> 17 <212> РКТ <213> Миг тигси1из <220>

<223> 1А11 СЬК Н2 <400> 3

Ъеи Не Азп Рго Туг Азп 61у Уа1 ТЬг Зег Туг Азп С1п Ьуз РЬе Ьуз 15 10 15

61у <210> 4 <211> 10 <212> РКТ <213> Миз тизси1из <220>

<223> 1А11 СРК НЗ <400> 4

С1у Азр С1у Азп Туг Тгр Туг РЬе Азр Уа1 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> РКТ <213> Миз тизси1из <220>

<223> 1А11 СРЕЗ Ы <400> 5

8ег А1а 5ег £ег £ег Уа1 ТЬг Туг МеЬ Ηίδ 15 10 <210> 6 <211> 7

- 58 023700 <212> РКТ <213> Миз тизеи1из <220>

<223> 1А11 СОК Ь2 <400> 6 б1и Не Зег Ьуз Ьеи А1а Зег 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> РКТ <213> Миз тизси1из <220>

<223> 1А11 СЮК ЬЗ <400> 7

61п 61и Тгр Азп Туг Рго Туг ТЬг 1 5 <210> 3 <211> 117 <212> РКТ <213> Миз тизси1из <220>

<223> 1А11 ΥΗ

<400> 3

61и

Уа1

61п

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Рго

С1и

Ьеи

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

МеЬ

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

Зег

РЬе

ТЬг

61у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

О1п

Зег

ΗΪ5

С1у

Ьуз

Азп

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

О1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

61и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

61и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

А1а

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

- 59 023700

115

<210>	9
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	Миз	гаизси1из
<220>
<223>	1А11	Ук

<400> 9

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

11е

ТЬг

А1а

Зег

Ьеи

61у

1

5

10

15

61п

Ьуз

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеЬ

20

25

30

Ηΐ3

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

61и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

61у

Уа1

Рго

Уа1

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

МеС

С1и

А1а

61и

65

70

75

80

Азр

А1а

11е

Туг

Суз

С1п

61и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

35

90

95

61у

О1у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

О1и

Не

Ьуз

100

105

<210>	10
<211>	117
<212>	РЕТ
<213>	АгШтста! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н0 УН

<400> 10

61п

17а 1

61п

Ьеи

17а 1

61п

Зег

С1у

А1а

С1и

17а 1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

17а 1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

С1п

61у

Ьеи

С1и

Тгр

МеС

35

40

45

61у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

МеС

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

11е

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

- 60 023700

Агд Азр С1у Азп Туг Тгр Туг РЬе 100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115

Аер Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг 105 110

<210>	11
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫЫсЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н1 УН

<400> 11

О1п	Уа1	61п	Ьеи	Уа1	61п	Зег	С1у
1 Зег	Уа1	Ьуз	Уа1	5 Зег	Суз	Ьуз	А1а
ТЬг	МеЬ	Азп	20 Тгр	Уа1	Агд	С1п	А1а
61у	Ьеи	35 Не	Азп	Рго	Туг	Азп	40 С1у
Ьуз	50 С1у	Агд	Уа1	ТЬг	МеЬ	55 ТЬг	Уа1
65 МеЬ	61и	Ьеи	Зег	Агд	70 Ьеи	Агд	Зег
Агд	Азр	С1у	Азп	85 Туг	Тгр	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115

А1а	С1и 10	Уа1	Ьуз	Ьуз	Рго	С1у 15	А1а
Зег 25	С1у	Туг	ТЬг	РЬе	ТНг 30	С1у	Туг
Рго	С1у	С1п	С1у	Ьеи 45	61и	Тгр	МеЬ
Уа1	ТЬг	Зег	Туг 60	Азп	С1п	Ьуз	РЬе
Азр	ТЬг	Зег 75	11е	Зег	ТНг	А1а	Туг 80
Азр	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Уа1	Тгр	61у	61п	С1у но	ТЬг	ТЬг

<210>	12
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫНсиа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н2 УН

<400> 12
С1п	Уа1	С1п	Ьеи	Уа1	С1п	Зег	С1у
1				5
Зег	Уа1	Ьуз	Уа1	Зег	Суз	Ьуз	А1а
			20
ТЬг	МеЬ	Азп	Тгр	Уа1	Агд	С1п	А1а
		35					40
С1у	Ьеи	11е	Азп	Рго	Туг	Азп	С1у

А1а	С1и 10	Уа1	Ьуз	Ьуз	Рго	С1у 15	А1а
Зег	С1у	Туг	ТЬг	РЬе	ТЬг	С1у	Туг
25					30
Рго	С1у	О1п	С1у	Ьеи	61и	Тгр	МеЬ
				45
Уа1	ТЬг	Зег	Туг	Азп	С1п	Ьуз	РЬе

- 61 023700

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

Уа1

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

61и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

61у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

<210>	13
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫЫсЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.НЗ УН

<400> 13

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

61у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

61и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

61у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

11е

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	14
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЬ1Нс1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н4 УН

<400> 14

С1п Уа1 οίη Ьеи Уа1 С1п Зег 61у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго 61у А1а 15 10 15

- 62 023700

Зег

Уа1

Ьуз Уа1 20

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег 25

С1у Туг ТЬг

РЬе

ТЬг 30

С1у

Туг

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

61п

61у

Ьеи

61и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

61у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

Ьуз

Уа1

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

11е

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

61у

61п

61у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	15
<211>	117
<212>	РРТ
<213>	АгЫНсиа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н5 УН

<400> 15

61п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

61п

Зег

61у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеО

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

61п

С1у

Ьеи

61и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

11е

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

61у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	16
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫПсЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н6 УН

- 63 023700

<400> 16

εΐη

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

8ег

Уа1

Ьуз

Уа1

8ег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

Е1у

Туг

ТНг

РНе

ТНг

Е1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеО

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

61п

61у

Ьеи

61и

Тгр

МеО

35

40

45

61у

Ьеи

Не

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТНг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РНе

50

55

60

Ьуз

Е1у

Ьуз

Уа1

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

11е

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеО

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РНе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТНг

100

105

но

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

115

<210>	17
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	ΑΓΟίίίοίθΙ Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Н7 ΥΗ

<400> 17

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТНг

РНе

ТНг

С1у

Туг

20

25

30

ТНг

МеО

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеО

35

40

45

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

61у

Уа1

ТНг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РНе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

Уа1

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

А1а

Ьуз

Зег

11е

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеО

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РНе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

61п

С1у

ТНг

100

105

но

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

115

<210> 18 <211> 105

- 64 023700 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ТАН.ЬО Ук

<400> 1£

!

С1и

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеЬ

20

25

30

Н13

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

61п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

С1и

Не

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Не

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьеи

61и

Рго

61и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210>	19
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	АгЫНсЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	1Α11.Ь1 Ук

<400> 19

С1и

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеЬ

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

61п

Ьуз

Рго

61у

61п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Тгр

Не

Туг

35

40

45

С1и

Не

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Не

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьеи

С1и

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

Θΐη

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 20

- 65 023700 <211> 105 <212> РКТ <213> АгП£1с1а1 Зециепсе <220>

<223> 1А11.Ь2 Ук

<400> 20

61и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

61и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

Мер

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

61п

Ьуз

Рго

61у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

61и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

61у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

61и

Рго

61и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

61п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

100

105

<210>	21
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	АгЫПсЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.1.3 Ук

<400> 21

61и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

61и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

Мер

20

25

30

Шз

Тгр

Туг

61п

Ьуз

Рго

61у

61п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Тгр

11е

Туг

35

40

45

61и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

61у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

О1и

Рго

61и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

61п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

61у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

100

105

- 66 023700

<210>	22
<211>	105
<212>	РЕТ
<213>	АгЫ£1с£а1 Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Ь4 Ук

<400> 22

О1и

Не

7а1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеЬ

20

25

30

ΗΪ3

Тгр

Туг

61п

Ьуз

Рго

61у

61п

А1а

Рго

Агд

Рго

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

С1и

11е

Зег

Ьуа

Ьеи

А1а

Зег

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

С1и

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

ТЬг

Ьуз

7а 1

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210>	23
<211>	105
<212>	РЕТ
<213>	АгЫ£1С1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Ь5 Ук

<400> 23

61и

11е

7а 1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

61и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

7а 1

ТЬг

Туг

Мег

20

25

30

Шз

Тгр

Туг

С1п

01п

Ьуз

Рго

С1у

01п

А1а

Рго

Агд

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

С1и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

б1и

Рго

б1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

- 67 023700

<210>	24
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зециепсе
<220>
<223>	1А11 .Ьб Ук

<400> 24

61и

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

61ц

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Суе

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеЬ

20

25

30

Ηίβ

Тгр

Туг

61п

Ьуе

Рго

61у

61п

А1а

Рго

Агд

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

С1и

11е

Зег

Ьуе

Ьеи

А1а

Зег

61у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Аар

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

61и

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Суе

61п

61и

Тгр

Аап

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

ТЬг

Ьуе

Уа1

61и

11е

Ьуе

100

105

<210>	25
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.А7 Ук

<400> 25

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

61и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суе

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеЬ

20

25

30

Ше

Тгр

Туг

61п

Ьуе

Рго

С1у

61п

А1а

Рго

Ьуе

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

61и

11е

Зег

Ьуе

Ьеи

А1а

Зег

61у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

61и

Рго

61и

65

70

75

80

Аар

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суе

61п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуе

- 68 023700

100 105

<210>	26
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	1А11. Ь8 Ук

<400> 26

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

61и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеС

20

25

30

Ηίβ

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

С1у

61п

А1а

Рго

Ьуз

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

С1и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

61и

Рго

61и

65

70

75

80

Аар

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

100

105

<210>	21
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	ΑΓίΐίΐοΐδΙ Зедиепсе
<220>
<223>	1А11.Ь9 Ук

<400> 27

61и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

О1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

МеС

20

25

30

Шз

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

61у

61п

А1а

Рго

Ьуз

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

61и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

Уа1

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Зег

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

С1и

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

61п

61и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

85

90

95

- 69 023700

61у 61у б1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз 100 105

<210>	28
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгбЬПсЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	1А11с УН

<400> 28

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

61п

С1п

Зег

61у

Рго

61и

Ьеи

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Меб

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

Зег

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

Меб

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

61п

Зег

ΗΪ5

С1у

Ьуз

Азп

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

61у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Меб

61и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

А1а

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	29
<211>	105
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	1А11с Ук

<400> 29

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

Не

ТЬг

А1а

Зег

Ьеи

61у

1

5

10

15

61п

Ьуз

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Туг

Меб

20

25

30

Низ

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Рго

Тгр

11е

Туг

35

40

45

С1и

11е

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

61у

Уа1

Рго

Уа1

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Меб

61и

А1а

С1и

- 70 023700

65

70

75

80

Азр

А1а

Не

Туг

Суз

61п

61и

Тгр

Азп Туг

Рго Туг ТЬг

РЬе

85

90

95

С1у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 30 <211> 357 <212> ПИА <213> АгХ1£1С1а1 бедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоХз.с1е зедиепсе епсосНпд 1А11.Н1 νΗ <400> 30 саддхдсадс адсХдсаадд сссддссадд аассадаадХ аХддаасХда ддсаасХасХ

ХддХдсадад ссадсддсХа дасХсдадХд

Хсаадддсад дсаддсхдад ддХасХХсда сддадссдад сассХХсасс даХдддссХд ддХдассаХд дХссдасдас хдхдхддддс дХдаадааас ддсХасасса аХсаассссХ ассдХддаХа ассдссдХдХ садддсасса ссддадссад

ХдаасХдддХ асаасддсдХ ссадсаХсад аХХасХдсдс ссдХсасадХ сдХдааддХд 60 даддсаддсс 120 дассадсХас 180 сассдсХХас 240 саддддсдас 300 дадсадс 357 <210> 31 <211> 357 <212> ΏΜΑ <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро!упис1еоХ10е зедиепсе епсосНпд 1А11.Н2 νΗ <400> 31 саддХдсадс адсХдсаадд сссддссадд аассадаадХ аХддаасХда ддсаасХасХ

ХддХдсадад ссадсддсХа дасХсдадХд

Хсаадддсаа дсаддсХдад ддХасХХсда сддадссдад сассХХсасс даХдддссХд ддХдассаХд дХссдасдас хдхдхддддс дХдаадааас ддсХасасса аХсаассссХ ассадддаХа ассдссдХдХ садддсасса ссддадссад

ХдаасХдддХ асаасддсдХ ссадсаХсад аХХасХдсдс ссдХсасадХ сдХдааддХд 60 даддсаддсс 120 дассадсХас 180 сассдсХХас 240 саддддсдас 300 дадсадс 357 <210 32 <211> 357 <212> ΏΝΑ <213> АгХл.£а.с1а1 Зедиепсе <220 <223> ро1ущ1с1еоХ1бе зедиепсе епсосНпд 1А11.НЗ νΗ <400> 32

- 71 023700 саддЬдсадс ЬддЬдсадад сддадссдад дЬдаадааас ссддадссад сдЬдааддЬд 60 адсЬдсаадд ссадсддсЬа сассЬЬсасс ддсЬасасса ЬдаасЬдддЬ даддсаддсс 120 сссддссадд дасЬсдадЬд даЬдддссЬд аЬсаассссЪ асаасддсдЬ дассадсЬас 180 аассадаадЬ Ьсаадддсад ддЬдасссЬд ассадддаЬа ссадсаЬсад сассдсЬЬас 240 аЬддаасЬда дсаддсЬдад дЬссдасдас ассдссдЬдЬ аЬЬасЬдсдс саддддсдас 300 ддсаасЬасЬ ддЬасЫзсда ЬдЬдЬддддс садддсасса ссдЬсасадЬ дадсадс 357 <210> 33 <211> 357 <212> ϋΝΑ <213> АгЫ11с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоЫс1е зециепсе епсосНпд 1А11.Н4 УН <400> 33 саддЬдсадс ЬддЬдсадад сддадссдад дЬдаадааас ссддадссад сдЬдааддЬд 60 адсЬдсаадд ссадсддсЬа сассЬЬсасс ддсЬасасса ЬдаасЬдддЬ даддсаддсс 120 сссддссадд дасЬсдадЬд даЬдддссЬд аЬсаассссЬ асаасддсдЬ дассадсЬас 180 аассадаадЬ Ьсаадддсаа ддЬдассаЬд ассдЬддаЬа ссадсаЬсад сассдсЫзас 240 аЬддаасЬда дсаддсЬдад дЬссдасдас ассдссдЬд! аНасЬдсдс саддддсдас 300 ддсаасЬасЬ ддЬасЬЬсда ЬдЬдЬддддс садддсасса ссдЬсасадЬ дадсадс 357 <210> 34 <211> 357 <212> ΌΝΑ <213> АгН£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоЫ0е аециепсе епсосЛпд 1А11.Н5 УН <400> 34 саддСдсадс ЬддСдсадад сддадссдад дСдаадааас ссддадссад сдЬдааддЬд 60 адсЬдсаадд ссадсддсЬа сассСЬсасс ддсСасасса СдаасЬдддЬ даддсаддсс 120 сссддссадд дасСсдадЬд даСдддссЬд аСсаассссЬ асаасддсд! дассадсЬас 180 аассадаадЬ Ьсаадддсаа ддЬдасссЬд ассдЬддаЬа ссадсаЬсад сассдсЬЬас 240 аЬддаасЬда дсаддсЬдад дЬссдасдас ассдссдЬдЬ аЬЬасЬдсдс саддддсдас 300 ддсаасЬасЬ ддЬасЬЬсда ЬдЬдЬддддс садддсасса ссдЬсасадЬ дадсадс 357 <210> 35 <211> 357 <212> ΌΝΑ <213> АгЫ11с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоЫс!е зедиепсе епсоИпд 1А11.Н6 УН <400> 35

- 72 023700 саддСдсадс Ьддкдсадад сддадссдад дкдаадааас адскдсаадд ссадсддска сасскксасс ддсСасасса сссддссадд дасксдадкд да£.дддсс£д аксаассссС аассадаадк ксаадддсаа дд£дассс£д ассдкддака акддааскда дсаддскдад дкссдасдас ассдссд£д£ ддсаас£.ас£ дд£аск£сда £-д£.д£ддддс садддсасса <210> 36 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> Аг£.1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1угшс1еок1<5е зедиепсе епсосНпд 1А11 ссддадссад

СдааскдддЕ асаасддсдк ададса£сад а££аскдсдс ссд£сасад£ сд£даадд£д даддсаддсс дассадсСас сассдс£Лас саддддсдас дадсадс

120

130

240

300

357

Н7 УН <400> 36 саддСдсадс кддкдсадад сддадссдад дкдаадааас адскдсаадд ссадсддска сасс££сасс ддс£асасса сссддссадд дасксдадИд да£дддсс£д аксаасссс£ аассадаадк Исаадддсаа дд^дасссЪд ассдИддсса аСддаасИда дсаддсИдад дИссдасдас ассдссд£.д£. ддсаасСасЪ ддкаскксда £д£д£.ддддс садддсасса <210> 37 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгМ£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео£1<3е епсосИпд 1А11с ΥΗ ссддадссад

Сдааскдддк асаасддсдИ ададсаЪсад аСЛасСдсдс ссдксасадк сдкдааддкд даддсаддсс дассадс^ас сассдс££ас саддддсдас дадсадс

120

180

240

300

357 <400> 37 дадд^дсадс адсИдсаадд сасддсаада аассадаадк.

акддааскдс ддсаакСаск

Идсадсадад ссадсддсИа асскддад£д ксаадддсаа кдадсскдас ддкаскксда сддссссдаа садс££сасс да^сддссЪд ддссассскс садсдаддас сдСдСддддс с£дс£даадс ддс£.асасса аксаасссс£.

асадкддсса адсдссдСдС дссддаасса ссддсдсИад

£.даас£ддд£ асаасддсд£ ааадсадсад аскаккдсдс ссдкдассдк саИдаадаИс саадсад^сс дасс£сс£ас сассдссСас саддддсдас д£с£адс

120

180

240

300

357 <2Ю> 33 <211> 315 <212> ΕΝΑ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> рс1упис1ео£.10е епсосИпд 1А11с Ук <400> 38

- 73 023700 дадаЬсдЬдс Ьдасссадад ссссдсааЫ; ассдссдсса дсс£.дддсса дааддЬдасс 60 а^сассЬдса дсдсаадсад садсдЬдасс ЬасаЬдсасЬ ддЬассадса даададсддс 120 ассадсссса адсссЬддаЬ сРасдадаЬс ЬссаадсЬсд ссЬсЬддадЬ сссЬдЬдадд 180

Псадсддса дсддсадсдд сас^адсЬас ЬсасЬдасса ЬсадсадсаЬ ддаддссдаа 24 0 дасдссдсса £с£а£Ьас£д ссаддадЬдд аасЬассссЬ асассЬЬсдд сддсддсасс 300 ааасЬддада Ьсаад 315 <210> 39 <211> 6 <212> РРТ <213> Миз ггц15си1и5 <220>

<223> 6АЗ СОК Н1 <400> 39

ТЬг Азр Туг А1а Тгр Азп

1		5
<210>	40
<211>	16
<212>	РРТ
<213>	Миз	гаизси1иэ
<220>
<223>	6АЗ	ΟϋΚ Н2
<400>	40

Туг Не РЬе Туг Зег С1у Зег ТЬг ТЬг Туг ТЬг Рго Зег Ьеи Ьуз Зег

1	5	10	15
<210>	41
<211>	11
<212>	РРТ
<213>	Миз	гаигси1иа
<220>
<223>	6АЗ	СОК НЗ

<400> 41 <31у <31у Туг Азр Уа1 Азп Туг РЬе Азр Туг Тгр 15 10 <210> 42 <211> 7

- 74 023700

<212>	РРТ
<213>	Ми 5	тизсиТиг
<220>
<223>	6АЗ	СОР. ы

<400> 42

Ьеи АТа Зег С1п ТЬг 11е СТу

1	5
<2Ю> 43 <211> Ί <212> РРТ <213> Миз	тизсиТиз
<220>
<223> 6АЗ	СЬК Ь2
<400> 43

А1а АТа ТЬг Агд Ьеи АТа Азр

1	5
<210> 44 <211> 9 <212> РРТ <213> Миг	тизсиТиз
<220>
<223> 6АЗ	сок ьз
<400> 44

С1п 61п РЬе РЬе Зег ТЬг Рго Тгр ТЬг 1 5 <210> 45 <211> 117 <212> РРТ <213> Миз тизси1из <220>

<223> 6АЗ УН <400> 45

- 75 023700

Αερ

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1и

Зег

Е1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

С1п

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

Уа1

ТНг

Е1у

Туг

Зег

11е

ТНг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Пе

Агд

Е1п

РНе

Рго

61у

Азп

Ьуз

Ьеи

Е1и

Тгр

35

40

45

МеЬ

С1у

Туг

Не

РНе

Туг

Зег

Е1у

Зег

ТНг

Туг

ТНг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

Не

Зег

Не

ТНг

Агд

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

61п

РНе

65

70

75

80

Ьеи

61п

Ьеи

Азп

Зег

Уа1

ТНг

61и

Азр

ТНг

А1а

ТНг

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Е1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

Е1у

С1п

С1у

ТНг

100

105

110

Ьеи

ТНг

Уа1

Зег

115

<210>	46
<211>	107
<212>	РКТ
<213>	Миз	тизси1из
<220>
<223>	6АЗ	Ук

<400> 46

Азр

Не

С1п

МеН

ТНг

С1п

Зег

Рго

А1а

Зег

С1п

Зег

А1а

Зег

Ьеи

Е1у

1

5

10

15

61и

Зег

Уа1

ТНг

Не

ТНг

Суз

Ьеи

А1а

Зег

61п

ТНг

Не

61у

А1а

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

Е1п

61п

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

Зег

Рго

Е1п

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

ТНг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

Е1у

Зег

С1у

ТНг

Ьуз

РНе

Зег

РНе

Ьуз

Не

Зег

Ьеи

Е1п

А1а

65

70

75

80

Е1и

Азр

РНе

Уа1

Зег

Туг

Суз

Е1п

С1п

РНе

Зег

ТНг

Рго

Тгр

85

90

95

ТНг

РНе

Е1у

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

100

105

<210> <211> <212> <213>	47 117 РКТ АгЫ£1с1а1	Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.1ЕНУ4_	61.НО УН

- 76 023700 <400> 47

61п 1	Уа1	61п	Ьеи	61п 5	61и	Зег	61у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	11е	Агд	С1п 40
Пе	С1у 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	Уа1	ТЬг	11е 70	Зег	Уа1
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 85	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	61у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

Рго	61у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	61и
Зег 25	С1у	С1у	Зег	Уа1	Зег 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	С1у	Ьуз	С1у 45	Ьеи	С1и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Азп	61п	РЬе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	61у	61п	61у 110	ТЬг	ТЬг

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

	115
<210>	48
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгП£1с1а1 Зедиепее
<220>
<223>	6А3.16НУ4_61.Н1 УН
<400>	48

61п 1	Уа1	61п	Ьеи	61п 5	61и	Зег	61у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	11е	Агд	С1п 40
11е	61у 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	61у
Ьуз 65	Зег	Агд	Уа1	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 85	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	С1у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

Рго	61у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	61и
Зег 25	С1у	С1у	Зег	Уа1	Зег 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	С1у	Ьуз	С1у 45	Ьеи	С1и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Азп	61п	РЬе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	С1у	С1п	С1у 110	ТЬг	ТЬг

<210> 49 <211> 117

- 77 023700 <212> РКТ <213> АгЫ.£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> 6А3.1СНУ4 61. Н2 УН <400> 49

О1п 1	Уа1	О1п	Ьеи	С1п 5	61и	Зег	61у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
Туг	А1а	Тгр 35	Агп	Тгр	11е	Агд	С1п 40
Не	С1у 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	Уа1	ТЬг	11е 70	Зег	Уа1
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 65	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	С1у	Туг	Азр	Уа1	Агп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

Рго	61у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	О1и
Зег 25	С1у	Туг	Зег	Уа1	Зег 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	С1у	Ьуз	С1у 45	Ьеи	61и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Агп	С1п	РЬе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Агр 105	Туг	Тгр	С1у	С1п	С1у но	ТЬг	ТЬг

<210> 50 <211> 117 <212> РКТ <213> АгШд.С1а1	Зедиепсе
<220> <223>	6АЗ.1СНУ4	61.НЗ УН

<400> 50

С1п 1	Уа1	С1п	Ьеи	С1п 5	С1и	Зег	С1у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
Туг	А1а	Тгр 35	Агп	Тгр	11е	Агд	С1п 40
11е	С1у 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	Уа1	ТЬг	11е 70	Зег	Уа1
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 65	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	С1у	Туг	Агр	Уа1	Агп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

Рго	С1у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	С1и
Зег 25	С1у	С1у	Зег	Уа1	ТЬг 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	С1у	Ьуз	С1у 45	Ьеи	С1и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Агр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Агп	С1п	РЬе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Агр 105	Туг	Тгр	С1у	С1п	С1у но	ТЬг	ТЬг

- 78 023700

	115
<210>	51
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	Αϊϋίίίοίθΐ Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ . 1СНУ4_61 . Н4 УН
<400>	51

61п 1	Уа1	61п	Ьеи	61п 5	61и	Зег	С1у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	11е	Агд	61п 40
11е	61у 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	11е	ТЬг	11е 70	Зег	Уа1
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 85	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	С1у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

Рго	С1у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	С1и
Зег 25	61у	61у	Зег	Уа1	Зег 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	61у	Ьуз	61у 45	Ьеи	61и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Азп	О1п	РЬе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	61у	61п	61у 110	ТЬг	ТЬг

<210>	52
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	6А3.16НУ4 61.Н5 УН

<400> 52
61п	Уа1	61п	Ьеи	61п	61и	Зег	С1у
1				5
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
			20
Туг	А1а	Тгр	Азп	Тгр	11е	Агд	61п
		35					40
МеЬ	61у	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег	С1у
	50					55
Ьуз	Зег	Агд	Уа1	ТЬг	11е	Зег	Уа1
65					70

Рго	С1у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	С1и
Зег 25	С1у	С1у	Зег	Уа1	Зег 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	61у	Ьуз	61у 45	Ьеи	61и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Азп	С1п	РЬе	Зег 80

- 79 023700

Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 35	Уа1	ТНг	А1а
Агд	61у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РНе
			100
Уа1	ТНг	Уа1	Зег	Зег
		115

А1а Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90	95
Азр Туг Тгр 61у	61п 61у ТНг ТНг
105	110

<210> 53 <211> 117 <212> РКТ <213> ΑΠΐίΐοίβΙ Зечиепсе

<220>

<223> 6А3.16НУ4 61.Н6 УН

<400> 53

С1п 1	Уа1	С1п	Ьеи	61п 5	61и	Зег	С1у
ТНг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТНг	Суз	ТНг	Уа1
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	11е	Агд	е1п 40
Не	61у 50	Туг	11е	РНе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	Уа1	ТНг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 85	Уа1	ТНг	А1а
Агд	61у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РНе

100

Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115

Рго	С1у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	С1и
Зег 25	С1у	Туг	Зег	Уа1	Зег 30	ТНг	Азр
Рго	Рго	61у	Ьуз	61у 45	Ьеи	С1и	Тгр
Зег	ТНг	ТНг	Туг 60	ТНг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТНг	Зег 75	Ьуз	Азп	61п	РНе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТНг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	61у	61п	61у но	ТНг	ТНг

<210>	54
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	6А3.16НУ4 61.Н7 УН

<400> 54
61п 1	Уа1	61п	Ьеи	61п 5	61и	Зег	61у
ТНг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТНг	Суз	ТНг	Уа1
Туг	А1а	Тгр	Азп	Тгр	Не	Агд	С1п

Рго	61у 10	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег 15	61и
Зег	С1у	Туг	Зег	Уа1	ТНг	ТНг	Азр
25					30
Рго	Рго	С1у	Ьуз	С1у	Ьеи	С1и	Тгр

- 80 023700

		35					40
11е	СЬу	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег	СЬу
	50					55
Ьуз	Зег	Агд	Уа1	ТЬг	11е	Зег	Агд
55					70
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег	Уа1	ТЬг	АЬа
				35
Агд	СЬу	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

				45
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
			50
Азр	ТЬг	Зег	Ьуз	Азп	СЬп	РЬе	Зег
		75					80
АЬа	Азр	ТЬг	АЬа	УаЬ	Туг	Туг	Суз
	90					95
Азр	Туг	Тгр	СЬу	СЬп	СЬу	ТЬг	ТЬг
105					110

	115
<210>	55
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	ΑΓϋίίίοίθΙ Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ . 1СНУ4_61 . Н8 УН
<400>	55

СЬп 1	УаЬ	СЬп	Ьеи	СЬп 5	СЬи	Зег	СЬу
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	Уа1
Туг	АЬа	Тгр 35	Азп	Тгр	11е	Агд	СЬп 40
11е	СЬу 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	СЬу
Ьуз 55	Зег	Агд	11е	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 85	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	СЬу	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

Рго	СЬу 10	Ьеи	УаЬ	Ьуз	Рго	Зег 15	СЬи
Зег 25	СЬу	Туг	Зег	УаЬ	ТЬг 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	СЬу	Ьуз	СЬу 45	Ьеи	СЬи	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 50	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Азп	СЬп	РЬе	Зег 80
АЬа	Азр 90	ТЬг	АЬа	νθΐ	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	СЬу	СЬп	СЬу 110	ТЬг	ТЬг

<210>	56
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫТЬсЬаЬ Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ . Ι0Ην4_61 . Н9 УН
<400>	56

- 81 023700

С1п 1	Уа1	61п	Ьеи	61п 5	С1и	Зег	С1у
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз	ТЬг	17а 1
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	11е	Агд	С1п 40
МеС	С1у 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	11е	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег	Зег 85	Уа1	ТЬг	А1а
Агд	С1у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

Рго	С1у 10	Ьеи	17а 1	Ьуз	Рго	Зег 15	С1и
Зег 25	61у	Туг	Зег	Уа1	ТЬг 30	ТЬг	Азр
Рго	Рго	61у	Ьуз	61у 45	Ьеи	61и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	ТЬг	Зег 75	Ьуз	Азп	С1п	РЬе	Зег 80
А1а	Азр 90	ТЬг	А1а	17а 1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	С1у	С1п	С1у но	ТЬг	ТЬг

	115
<210>	57
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	ΑΓϋίίίοίθΙ Зедиепсе
<220>
<223>	6Α3.Ι2Ην3-33.Η0 УН
<400>	57

С1п 1	17а 1	С1п	Ьеи	17а 1 5	С1и	Зег	С1у
Зег	Ьеи	Агд	Ьеи 20	Зег	Суз	А1а	А1а
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	17а 1	Агд	О1п 40
17а 1	А1а 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	С1у
Ьуз 65	Зег	Агд	РЬе	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	О1п	МеС	Азп	Зег 85	Ьеи	Агд	А1а
Агд	С1у	Туг	Азр	17а 1	Азп	Туг	РЬе

100

7а1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

С1у С1у Уа1 10	17а 1	С1п	Рго	С1у 15	Агд
Зег	О1у	РЬе	ТЬг	РЬе	Зег	ТЬг	Азр
25					30
А1а	Рго	О1у	Ьуз	О1у	Ьеи	О1и	Тгр
				45
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи

Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг

80

О1и Азр ТЬг 90	А1а	17а 1	Туг	Туг 95	Суз
Азр	Туг	Тгр	С1у	СТп	С1у	ТЬг	ТЬг
105					но

<210> 58 <211> 117 <212> РКТ <213> ΑΓϋίίίοίθΙ Зедиепсе

- 82 023700 <220>

<223> 6АЗ.1СНУЗ-ЗЗ.Н1 ΥΗ <400> 58

61п 1	Уа1	61п	Ьеи	Уа1 5	61и	Зег	С1у
Зег	Ьеи	Агд	Ьеи 20	Зег	Суз	А1а	А1а
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	Уа1	Агд	61п 40
Уа1	А1а 50	Туг	11е	РЬе	Туг	Зег 55	61у
Ьуз 65	Зег	Агд	РНе	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	61п	Меб	Азп	Зег 85	Ьеи	Агд	А1а
Агд	61у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

С1у	С1у 10	Уа1	Уа1	С1п	Рго	С1у 15	Агд
Зег 25	С1у	Туг	ТЬг	РНе	Зег 30	ТНг	Азр
А1а	Рго	61у	Ьуз	61у 45	Ьеи	61и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТНг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	Азп	Зег 75	Ьуз	Азп	ТЬг	Ьеи	Туг 80
С1и	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	61у	61п	С1у 110	ТНг	ТЬг

100

Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег

	115
<210>	59
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгббНеЬа! Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.16НУЗ-ЗЗ.Н2 УН
<400>	59

С1п 1	Уа1	С1п	Ьеи	Уа1 5	С1и	Зег	С1у
Зег	Ьеи	Агд	Ьеи 20	Зег	Суз	А1а	А1а
Туг	А1а	Тгр 35	Азп	Тгр	УаЬ	Агд	61п 40
Уа1	А1а 50	Туг	Не	РЬе	Туг	Зег 55	61у
Ьуз 65	Зег	Агд	РНе	ТЬг	11е 70	Зег	Агд
Ьеи	С1п	Меб	Азп	Зег 85	Ьеи	Агд	А1а
Агд	61у	Туг	Азр	Уа1	Азп	Туг	РЬе

100

Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115

С1у	С1у 10	Уа1	Уа1	С1п	Рго	С1у 15	Агд
Зег 25	С1у	РНе	ТЬг	РНе	ТЬг 30	ТНг	Азр
А1а	Рго	61у	Ьуз	61у 45	Ьеи	61и	Тгр
Зег	ТЬг	ТЬг	Туг 60	ТЬг	Рго	Зег	Ьеи
Азр	Азп	Зег 75	Ьуз	Азп	ТЬг	Ьеи	Туг 80
С1и	Азр 90	ТНг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азр 105	Туг	Тгр	61у	61п	61у 110	ТЬг	ТЬг

- 83 023700

<210>	60
<211>	117
<212>	РИТ
<213>	Ατΐΐίΐοΐδΐ Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.1СН73-33.НЗ ΥΗ

<400> 60

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

Зег

РЬе

Зег

ТЬг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

Уа1

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

Меи

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

но

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	61
<211>	117
<212>	ΡΚΊ
<213>	Аг£1£1с1а1 5е^иеηсе
<220>
<223>	6АЗ.1СНУЗ-33. Н4 νΗ

<400> 61

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

61у

РЬе

ТЬг

Не

Зег

ТЬг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

Уа1

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

Меи

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

νβΐ

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

61п

С1у

ТЬг

- 84 023700

100 105 НО

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115

<210>	62
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.16НУЗ-33.Н5 УН

<400> 62

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

01у

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

ТЬг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

Уа1

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

11е

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

61у

ТЬг

100

105

но

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	63
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	Аг£й£йс1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.1СНУЗ-33.Нб УН

<400> 63

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

ТЬг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

Уа1

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

- 85 023700

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТНг

ТЬг

100

105

110

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115

<210>	64
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	Аг£1£1с1а1 5е^иеηсе
<220>
<223>	6АЗ.1ЕНУЗ-33.Н7 УН

<400> 64

61п

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61и

Зег

61у

Е1у

61у

Уа1

61п

Рго

61у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РНе

Зег

ТНг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

35

40

45

Уа1

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

61у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

РЬе

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТНг

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210>	65
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгЬ1Нс1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.16НУЗ-33.Н8 УН

<400> 65

С1п

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61и

Зег

61у

Е1у

61у

Уа1

61п

Рго

61у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

ТЬг

Азр

- 86 023700

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

Уа1

61у

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

61у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Ме£

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

01п

61у

ТЬг

100

105

но

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210> 66 <211> 117 <212> РКТ <213> Аг£1£1с1а1 Зециепсе <220>

<223> 6АЗ.16НУЗ-33,Н9 УН <400> 66

61п

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61и

Зег

61у

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

ТЬг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

35

40

45

Уа1

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

61у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

Зег

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Ме£

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

61у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

С1п

61у

ТЬг

100

105

но

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210> 67 <211> 117 <212> РКТ <213> АгЬШсЬа! Зедиепсе <220>

<223> 6А3.16НУЗ-ЗЗ.Н10 УН

- 87 023700 <400> 67

61η νβΐ 61η Ьеи Са I 61и Зег 61у 61у 61у Са I Са I 61п Рго 61у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а 1/а1 Зег 61у РЬе ТЬг РЬе Зег ТЬг Азр 20 25 30

Туг А1а Тгр Азп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 61и Тгр 35 40 45

Са I А1а Туг Не РЬе Туг Зег 61у Зег ТЬг ТЬг Туг ТЬг Рго Зег Ьеи 50 55 60

Ьуз Зег Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг

70 75 80

Ьеи 61п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

Агд 61у Туг Азр Уа1 Азп Туг РЬе Азр Туг Тгр 61у 61п 61у ТЬг ТЬг

100 105 110

Са I ТЬг Уа1 Зег Зег

	115
<210>	68
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	АгННсйа! Зедиепсе
<220>
<223>	6АЗ.1СНУЗ-ЗЗ.Н11 νΗ
<400>	68

61п

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61и

Зег

61у

Са1

Уа1

61п

Рго

61у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

ТЬг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

МеЬ

А1а

Туг

11е

РЬе

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

61у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

61у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Са1

Зег

115

<210> 69 <211> 107 <212> РКТ

- 88 023700 <213> АгЫ£Ьс1а1 Зечиепсе <220>

<223> 5АЗ.ЬО Ук <400> 69

Азр 1	Не	С1п	Ме£	ТЬг 5	61п	Зег	Рго
Азр	Агд	Уа1	ТЬг 20	Не	ТНг	Суз	Ьеи
Ьеи	А1а	Тгр 35	Туг	С1п	С1п	Ьуз	Рго 40
Туг	А1а 50	А1а	ТНг	Агд	Ьеи	А1а 55	Азр
Зег 55	С1у	Зег	С1у	ТЬг	Азр 70	РНе	ТЬг
С1и	Азр	РНе	А1а	Уа1 85	Туг	Туг	Суз
ТНг	РНе	О1у	61п 100	О1у	ТНг	Ьу®	Ьеи

Зег	Зег 10	Ьеи	Зег	А1а	Зег	Уа1 15	61у
А1а 25	Зег	С1п	ТНг	Ые	С1у 30	А1а	Тгр
С1у	Ьуз	А1а	Рго	Ьуз 45	Ьеи	Ьеи	Ые
О1у	Уа1	Рго	Зег 60	Агд	РЬе	Зег	61у
Ьеи	ТЬг	Ые 75	Зег	Зег	Ьеи	С1п	Рго 80
С1п С1и 105	С1п 90 Ые	РЬе Ьу®	РНе	Зег	ТЬг	Рго 95	Тгр

<210> 70 <211> 107 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 6АЗ.Ы Ук
<400> 70
Азр 1	Не	С1п	Ме£	ТЬг 5	61п	Зег	Рго
Азр	Агд	Уа1	ТНг 20	Ые	ТНг	Су®	Ьеи
Ьеи	А1а	Тгр 35	Туг	61п	61п	Ьуз	Рго 40
Туг	А1а 50	А1а	ТЬг	Агд	Ьеи	А1а 55	Азр
Зег 65	61у	Зег	О1у	ТЬг	Азр 70	РЬе	ТЬг
61и	Азр	РЬе	А1а	Уа1 85	Туг	Туг	Су®
ТНг	РНе	С1у	61п 100	С1у	ТНг	Ьуз	Ьеи

Зег	Зег 10	Ьеи	Зег	А1а	Зег	Уа1 15	61у
А1а	Зег	61п	ТЬг	Не	О1у	А1а	Тгр
25					30
С1у	Ьуз	А1а	Рго	С1п	Ьеи	Ьеи	Ые
				45
С1у	Уа1	Рго	Зег	Агд	РЬе	Зег	С1у
			60
Ьеи	ТЬг	Не	Зег	Зег	Ьеи	61п	Рго
		75					80
С1п	С1п	РЬе	РЬе	Зег	ТЬг	Рго	Тгр
	90					95
С1и	Ые	Ьуз
105

<210> 71 <211> 107

- 89 023700 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зечиепсе <220>

<223> 6Α3.Τ2 Ук

<400> 71

Αδρ

11е

С1п

МеЬ

ТНг

С1п

Зег

Рго

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Αδρ

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьеи

А1а

Зег

С1п

ТЬг

11е

С1у

А1а

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

Ьу®

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

О1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

О1у

50

55

50

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Ьуз

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

С1п

Рго

55

70

75

80

С1и

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

РЬе

Зег

ТЬг

Рго

Тгр

85

Эй

95

ТНг

РЬе

61у

61п

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

11е

Ьуз

100

105

<210>	72
<211>	107
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зециепсе
<220>
<223>	бАЗ.ЬЗ Ук

<400> 72

Азр

11е

О1п

МеЬ

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

О1у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Ьеи

А1а

Зег

<31п

ТЬг

11е

О1у

А1а

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

С1п

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

61у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

О1у

50

55

60

Зег

О1у

Зег

О1у

ТЬг

Ьуз

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

С1п

Рго

55

70

75

80

С1и

Αδρ

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

РЬе

Зег

ТЬг

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 73

- 90 023700

<211>	117
<212>	РКТ
<213>	Миз тизси1из
<220>
<223>	6АЗс УН

<400> 73

Азр 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1и

Зег

61у

Рго

61у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

С1п

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

Уа1

ТНг

61у

Туг

Зег

11е

ТНг

Азр

20

25

30

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

11е

Агд

С1п

РНе

Рго

С1у

Азп

Ьуз

Ьеи

С1и

Тгр

35

40

45

МеЬ

е1у

Туг

11е

РНе

Туг

Зег

С1у

Зег

ТНг

Туг

ТНг

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

Ьуз

Зег

Агд

11е

Зег

11е

ТНг

Агд

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

61п

РНе

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

Зег

Уа1

ТНг

С1и

Азр

ТНг

А1а

ТНг

Туг

Суз

85

90

95

Агд

С1у

Туг

Азр

Уа1

Азп

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

С1у

СТп

С1у

ТНг

100

105

но

Ьеи

ТНг

Уа1

Зег

115

<210>	74
<211>	107
<212>	РКТ
<213>	Миз тизси1из
<220>
<223>	6АЗс Ук

<400> 74

Азр

11е

С1п

МеЬ

ТНг

С1п

Зег

Рго

А1а

Зег

С1п

Зег

А1а

Зег

Ьеи

С1у

1

5

10

15

61и

Зег

Уа1

ТНг

Не

ТНг

Суз

Ьеи

А1а

Зег

61п

ТНг

11е

61у

А1а

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

Зег

Рго

С1п

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

А1а

ТНг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

61у

Зег

61у

ТНг

Ьуз

РНе

Зег

РНе

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

А1а

65

70

75

80

С1и

Азр

РНе

Уа1

Зег

Туг

Суз

С1п

РНе

Зег

ТНг

Рго

Тгр

85

90

95

ТНг

РНе

СТу

С1у

СТу

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

- 91 023700 <210> 75 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгМГ1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео1;1(3е зедиепсе епсссНпд 6АЗ. 16НУ4_61.НО УН <400> 75 саддЪдсадс асс£дсасад сс^сссддса асссссадсс скдаадскда

5асдасд£да £дсаддадад £дадсддсдд адддсскдда ксаад£ссад дсадсдкдас аскас^ксда сддасссддс с£ссд£дадс дкддаксддс дд£дасса£с сдссдссдак скас^ддддс с£дд£дааас ассдас£асд касаЪскЬск адсдксдаса ассдссд£д£ садддсасса ссадсдадас с£кддаасЪд асадсддсад ссадсаадаа ас^аскдсдс ссЬа^аскдк сс£дадсс£д 60 даЬсаддсад 120 сассассЬас 130 ссад£Лсадс 240 саддддаддс 300 дадсадс 357 <2Ю> 76 <211> 357 <212> ΌΝΑ <213> ΑΓΐΐίΐοΐθΙ Зсдиспсс <220>

<223> ро1упис1еоМс1е аедиепсе епсосНпд 6АЗ . 1СНУ4_61. Н1 УН <400> 76 садд£дсадс асскдсасад сс^сссддса асссссадсс сИдаадсИда £асдасд£да кдсаддадад кдадсддсдд адддссЬдда £саад£ссад дсадсдИдас ас£ас££сда сддасссддс скссдкдадс д£дда£сддс дд^дассакс сдссдссдаИ с£ас£ддддс с^ддкдааас ассдаскасд £аса£с££с£ адсадддаса ассдссд£д£.

садддсасса ссадсдадас скЬддааскд асадсддсад ссадсаадаа аскасИдсдс сска£ас£д£ сскдадсскд 60 даксаддсад 120 сассасскас 180 ссадСЛсадс 240 саддддаддс 300 дадсадс 357 <210> 77 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео51<3с аечиспсе епсосИпд 6А3.1СНУ4 61.Н2 УН <400> 77 саддкдсадс £дсаддадад сддасссддс сСдд£дааас ссадсдадас сс£дадсс£д 60 асскдсасад кдадсддска сИссдкдадс ассдасИасд с££ддаас£д даИсаддсад 120

- 92 023700 ссХсссддса асссссадсс сХдаадсХда

ХасдасдХда адддссХдда

ХсаадХссад дсадсдХдас асХасХХсда дХддаХсддс ддХдассаХс сдссдссдаХ сХасХддддс

ХасаХсХХсХ адсдХсдаса ассдссдХдХ садддсасса асадсддсад ссадсаадаа асХасХдсдс ссХаХасХдХ сассассХас ссадХХсадс саддддаддс дадсадс

180

240

300

357 <210> 78 <211> 357 <212> ОМА <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1угшс1еоХз.с1е зедпепсе епсосНпд 6АЗ . 1СНУ4_61 .НЗ УН <400> 78 саддхдсадс ассХдсасад ссХсссддса асссссадсс сХдаадсХда

ХасдасдХда

Хдсаддадад

Хдадсддсдд адддссХдда

ХсаадХссад дсадсдХдас асХасХХсда сддасссддс сХссдХдасс дХддаХсддс ддХдассаХс сдссдссдаХ сХасХддддс сХддХдааас ассдасХасд

ХасаХсХХсХ адсдХсдаса ассдссдХдХ садддсасса ссадсдадас сХХддаасХд асадсддсад ссадсаадаа асХасХдсдс ссХаХасХдХ ссХдадссХд даХсаддсад сассассХас ссадХХсадс саддддаддс дадсадс

120

180

240

300

357 <2Ю> 79 <211> 357 <212> ОМА <213> АгХз.£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоХ1с!е зедиепсе епсосНпд 6АЗ . 1СНУ4_61 .Н4 УН <400> 79 саддХдсадс ассХдсасад ссХсссддса асссссадсс сХдаадсХда

ХасдасдХда

Хдсаддадад

Хдадсддсдд адддссХдда

ХсаадХссад дсадсдХдас асХасХХсда сддасссддс сХссдХдадс дХддаХсддс даХсассаХс сдссдссдаХ сХасХддддс сХддХдааас ассдасХасд

120

180

240

300

357 <210> 80 <211> 357 <212> ОМА <213> АгХ1£1с1а1 Йедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоХ1с1е аедиепсе епсосИпд 6АЗ.1СНУ4_61.Н5 УН

- 93 023700 <400> 30 саддЪдсадс ассЕдсасад сс£сссддса асссссадсс сИдаадсСда £асдасд£да £дсаддадад

Едадсддсдд адддссИдда

Исаад^ссад дсадсдИдас ас£ас££сда сддасссддс с£ссд£дадс дИддаИдддс ддЪдасса^с сдссдссдаИ сЕас^ддддс с£дд£дааас ассдасЕасд

Иаса£сСЛе± адсдЬсдаса ассдссдЪд£ садддсасса ссадсдадас сЕЪддаасФд асадсддсад ссадсаадаа ас±ас£дсдс сс^а^асЕдЕ сс^дадссЪд 60 даЕсаддсад 120 сассасс^ас 180 ссадСЛсадс 240 саддддаддс 300 дадсадс 357 <210> 81 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгМ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео£1с1е аедиепсе епсосИпд 6АЗ. 1<ЗНУ4_61. Н6 УН <400> 81 садд^дсадс ассЕдсасад сс£сссддса асссссадсс сЪдаадсЪда

Сасдасд£да

Ьдсаддадад

ЕдадсддсЕа адддссЪдда

ЪсаадСссад дсадсдЪдас ас£асС£сда сддасссддс сЕссдЕдадс д£дда£сддс ддСдассаСс сдссдссдаЪ сЬасСддддс с^ддЬдааас ассдасЕасд

ЕасаЕсЕФс!;

адсадддаса ассдссдСдС садддсасса ссадсдадас сЕ^ддаасФд асадсддсад ссадсаадаа асСасЪдсдс ссСа^асЬдС ссЬдадсс^д 60 даЕсаддсад 120 сассасс!;ас 180 ссад£Ссадс 240 саддддаддс 300 дадсадс 357 <210> 82 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоС10е аедиепсе епсосНпд 6АЗ.16НУ4_61.Н7 УН <400> 82 саддСдсадс асс£дсасад сс^сссддса асссссадсс с£даадс£да ^асдасдЕда £дсаддадад £дадсддс£а адддсс£дда

ЬсаадСссад дсадсд£дас асЕас^Есда сддасссддс с£ссд£дасс д£дда£сддс дд^дассаСс сдссдссда£ сЕас^ддддс сСддЕдааас ассдасЬасд £аса£с££сС адсадддаса ассдссд^дС садддсасса ссадсдадас с£Сддаас£д асадсддсад ссадсаадаа асСас£дсдс сс^а^асЕдЕ сс£дадсс£д 60 даЬсаддсад 120 сассассСас 180 ссадЬСсадс 240 саддддаддс 300 дадсадс 357 <210> 83 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгМ£1с1а1 Зедиепсе

- 94 023700

120

180

240

300

357 <220>

<223> ро1упис1ео£1<3е зедиепсе епсоШпд 6А3.1СНУ4 61.Н8 УН <400> 83 садд^дсадс асс£дсасад сс£сссддса асссссадсс сЕдаадсЕда £асдасд£да

Ьдсаддадад

Ьдадсддсдд адддссЕдда £саад£ссад дсадсдЕдас ас£ас££сда сддасссддс сЬссдЬдадс дЕддаЕсддс дд£дасса£с сдссдссдаЕ с£ас£ддддс с£дд£дааас ассдасЬасд

ЪасаЪсЕ1;с1;

адсдЕсдаса ассдссд£д£ садддсасса ссадсдадас с££ддаас£д асадсддсад ссадсаадаа ас£ас£дсдс сс£а£ас£д£.

сс£дадсс£д да£саддсад сассасс£ас ссад££садс саддддаддс дадсадс <2Ю> 84 <211> 357 <212> ΟΝΑ <213> Аг£1£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоМ0е зедиепсе епсосНпд 6АЗ. 1СНУ4_61.Н9 νΗ <400> 84 садд£дсадс ассЕдсасад сс^сссддса асссссадсс сИдаадсИда

£.асдасдИда

Едсаддадад

ЕдадсддсЕа адддссЬдда

Ьсаад^ссад дсадсдИдас ас£асМ:сда сддасссддс сЕссдЕдасс дЬддаЬсддс да£сасса£с сдссдссдаИ с£ас£ддддс с£дд£дааас ассдасЕасд

СасаСсЬЪсЪ адсадддаса ассдссд£д£ садддсасса ссадсдадас с£.£ддаас£д асадсддсад ссадсаадаа ас^асИдсдс сс£а£.асИд1:

ссЕдадссЕд даЕсаддсад сассасс^ас ссад££садс саддддаддс дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 85 <211> 357 <212> ΟΝΑ <213> АгМ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео71с1е зедиепсе епсосНпд 6Α3.ΐ6Ην3_33 .НО νΗ <400> 85 садд^дсадс £с££дсдссд дсссссддда асссссадсс с£дсада£да

ЪасдасдИда

Ьдд^ддадад ссадсдда££ адддссЕдда £даададсад асадсс£дад асИас^Исда сддсддсддс сасс£Ьсадс дЕдддЕсдсс д££сасса£с ддссдаддас с£ас£ддддс д£ддСдсадс ассдасЬасд

£.аса£.с£1:с1:

адсадддаса ассдссд£д£ садддсасаа ссддсаддад ссЪддааГ.'Ьд асадсддсад асадсаадаа а£.£ас£.дсдс ссдИдассдИ сс£даддс£с дд£даддсад сассасс£ас сассс£д£ас

Ьадддддддс дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 86 <211> 357

- 95 023700 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓίίίίοί^Ι <220>

<223> ро1упис1ес>1;1<3е зедиепсе епсосНпд 6Α3,Ι(3Ην3_33 . ΗΙ νΗ <400> 86 садд^дсадс ^сЗЪдсдссд дсссссддда асссссадсс сИдсадаИда £асдасд£да

ЪддЪддадад ссадсддаЪа адддссЪдда

Ьдаададсад асадссИдад асИасТЫъсда сддсддсддс сасс^Ъсадс дЪдддЪсдсс дСЛсассаЪс ддссдаддас с£ас£ддддс д^ддЪдсадс ассдасЪасд

ЪасаЪсМъсЪ адсадддаса ассдссд£д£ садддсасаа ссддсаддад ссЪддаа'Ыъд асадсддсад асадсаадаа а££асСдсдс ссдСдассдИ ссФдаддсЪс 60 ддфдаддсад 120 сассасс^ас 180 сассс£д£ас 240 Ьадддддддс 300 дадсадс 357 <210> 87 <211> 357 <212> ОНА <213> АгЪ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ρο1γηυο1&ο1;ϊάθ зедиепсе епсосНпд 6АЗ.ΙΟΗν3_33.Н2 ΥΗ <400> 87 садд^дсадс £сМъдсдссд дсссссддда асссссадсс сЪдсадаЪда

5асдасд£да

Ьдд^ддадад ссадсдда££ адддссИдда

Ъдаададсад асадссЪдад асЪас^Ъсда сддсддсддс сассЪИсасс дГдддГсдсс д£1;сасса1;с ддссдаддас с^асЪддддс д^ддИдсадс ассдасИасд £аса£с1ъ£с£ адсадддаса ассдссд£д1ъ садддсасаа ссддсаддад ссЪддааН^д асадсддсад асадсаадаа аЪЪасЪдсдс ссдЪдассдЪ ссИдаддсИс 60 ддИдаддсад 120 сассасс^ас 180 сасссЗд^ас 240 Ъадддддддс 300 дадсадс 357 <2Ю> 88 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео£1с1е зедиепсе епсосИпд 6АЗ. 1СНУЗ_33 . НЗ УН <400> 88 садд^дсадс £с£Хдсдссд дсссссддда асссссадсс сИдсадаИда £асдасд£да

Ъддрддадад ссадсддаФ!;

адддссИдда

Ьдаададсад асадссИдад асИас1Ы1сда сддсддсддс садс^Фсадс дИдддИсдсс дСЛсассаЪс ддссдаддас сИасЪддддс д£дд£дсадс ассдасФасд

НасаИсИ^с^ адсадддаса ассдссд£д£ садддсасаа ссддсаддад сс^ддаа'Ыъд асадсддсад асадсаадаа аИЪасСдсдс ссдСдассдИ ссЪдаддсЪс 60 ддфдаддсад 120 сассасс^ас 180 сассс£д£ас 240 Гадддддддс 300 дадсадс 357

- 96 023700 <210> 89 <211> 357 <212> ΟΝΑ <213> ΑγΧϊ£ιοϊ&1 Зэдиэпсэ <220>

<223> ро1упис1еоХ1с1е зедиепсе епссхИпд 6Α3.1СНУЗ_33 . Н4 ΥΗ <400> 89 саддхдсадс

ХсХХдсдссд дсссссддда асссссадсс сХдсадаХда

ХасдасдХда

ХддХддадад ссадсддаХХ адддссХдда

Хдаададсад асадссХдад асХасХХсда сддсддсддс сассаХсадс дХдддХсдсс дХХсассаХс ддссдаддас сХасХддддс дХддХдсадс ассдасХасд

ХасаХсХХсХ адсадддаса ассдссдХдХ садддсасаа ссддсаддад ссХддааХХд асадсддсад асадсаадаа аХХасХдсдс ссдХдассдХ ссХдаддсХс 60 ддХдаддсад 120 сассассХас 180 сасссХдХас 240 Хадддддддс 300 дадсадс 357 <210> 90 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоХ1<1е зедиепсе епсосНпд 6АЗ. Ι(3Ην3_33 .Н5 УН <400> 90 саддХдсадс

ХасдасдХда

ХддХддадад ссадсддаХХ адддссХдда

Хдаададсад асадссХдад асХасХХсда сддсддсддс сассХХсадс дХдддХсдсс даХсассаХс ддссдаддас сХасХддддс дХддХдсадс ассдасХасд

ХасаХсХХсХ адсадддаса ассдссдХдХ садддсасаа ссддсаддад ссХддааХХд асадсддсад асадсаадаа аХХасХдсдс ссдХдассдХ ссХдаддсХс 60 ддХдаддсад 120 сассассХас 180 сасссХдХас 240 Хадддддддс 300 дадсадс 357 <210> 91 <211> 357 <212> ΕΝΑ <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоХ10е зедиепсе епсосИпд 6АЗ.1СНУЗ_33.Нб ΥΗ <400> 91 саддхдсадс ХддХддадад сддсддсддс дХддХдсадс ссддсаддад ссХдаддсХс 60

ХсХХдсдссд ссадсддаХХ сассХХсадс ассдасХасд ссХддааХХд ддХдаддсад 120 дсссссддда адддссХдда дХдддХсдсс ХасаХсХХсХ асадсддсад сассассХас 180

- 97 023700 асссссадсс Кдаададсад дККсассаКс адсадддаса ссадсаадаа сасссКдКас 240 сКдсадаКда асадссКдад ддссдаддас ассдссдКдК аККасКдсдс Кадддддддс 300

КасдасдКда асКасККсда сКасКддддс садддсасаа ссдКдассдК дадсадс 357 <210> 92 <211> 357 <212> ОНА <213> АгШ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ес£1с1е зедиепсе епсосИпд 6АЗ . 13НУЗ_33.Н7 УН <400> 92 саддКдсадс

КсККдсдссд дсссссддда асссссадсс сКдсадаКда

КасдасдКда

КддКддадад ссадсддахЗ адддссКдда

Кдаададсад асадссКдад асКасККсда сддсддсддс сассККсадс дКдддКсдсс дККсассаКс ддссдаддас сКасКддддс дКддКдсадс ассдасКасд

КасаКсККсК адсадддаса ассдссдКдК садддсасаа ссддсаддад ссКддааККд асадсддсад асадсаадаа аККасКдсдс ссдКдассдК ссКдаддсКс 60 ддКдаддсад 120 сассассКас 180 сассККсКас 240 Кадддддддс 300 дадсадс 357 <210> 93 <211> 357 <212> ΏΝΑ <213> АгК1£1с1а1 Зедиепсе <22 0>

<223> ро1упис1еоК1с1е зедиепсе епсосИпд 6АЗ . 1бНУЗ_33. Н8 УН <400> 93 саддКдсадс

КасдасдКда

КддКддадад ссадсддаКК адддссКдда

Кдаададсад асадссКдад асКасККсда сддсддсддс сассККсадс дКдддКсддс дККсассаКс ддссдаддас сКасКддддс дКддКдсадс ассдасКасд

КасаКсККсК адсадддаса ассдссдКдК садддсасаа ссддсаддад ссКддааККд асадсддсад асадсаадаа аККасКдсдс ссдКдассдК ссКдаддсКс 60 ддКдаддсад 120 сассассКас 180 сасссКдКас 240 Кадддддддс 300 дадсадс 357 <210> 94 <211> 357 <212> ОНА <213> АгКа.£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоК:Ше зедиепсе епсосПпд 6АЗ . 1СНУЗ_33 . Н9 УН <400> 94

- 98 023700 саддхдсадс

ХасдасдХда

ХддХддадад ссадсддаХХ адддссХдда

Хдаададсад асадссхдад асХасХХсда сддсддсддс сассХХсадс дХдддХсдсс дХХсадсаХс ддссдаддас сХасХддддс дХддХдсадс ассдасХасд

ХасаХсХХсХ адсадддаса ассдссдХдХ садддсасаа ссддсаддад ссХддааХХд асадсддсад асадсаадаа аХХасХдсдс ссдХдассдХ ссХдаддсХс ддХдаддсад сассассХас сасссХдХас

Ъадддддддс дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 95 <211> 357 <212> ОКА <213> АгХ1£1с1а1 Йедиепсе <220>

<223> ро1уг-ис1ес'£1с1е зедиепсе епсосИпд 6АЗ . Ι3Ην3_33.НЮ νΗ <400> 95 саддхдсадс

ХасдасдХда

ХддХддадад сддсддсддс дХддХдсадс ссддсаддад ХдадсддаХХ сассХХсадс ассдасХасд ссХддааХХд адддссХдда дХдддХсдсс ХасаХсХХсХ асадсддсад Хдаададсад дХХсассаХс адсадддаса асадсаадаа асадссХдад ддссдаддас ассдссдХдХ аХХасХдсдс асХасХХсда сХасХддддс садддсасаа ссдХдассдХ ссЪдаддсЪс ддОдаддсад сассассбас сасссидбас

Ъадддддддс дадсадс

0

180

240

300

357 <210> 96 <211> 357 <212> ОНА <213> АгХ1£з.с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1еоХ10е зедиепсе епсосИпд 6АЗ . ЮНУЗ ЗЗ .Н11 УН <400> 96 саддхдсадс

ХасдасдХда

ХддХддадад ссадсддаХХ адддссХдда

Хдаададсад асадссХдад асХасХХсда сддсддсддс сассХХсадс дХддаХддсс дХХсассаХс ддссдаддас сХасХддддс дХддХдсадс ассдасХасд

Оадддддддс дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 97 <211> 321 <212> ОКА <213> АгХ1£1с1а1 Йедиепсе <220>

<223> рс1упис1соХ1(Зе аедиепсе епсосИпд бАЗ.ЬО ν%

- 99 023700 <400 97 дасакссада кдасссадад ссссадсксс скдадсдсса дсдкдддсда аксасскдсс кддссадсса дассаккддс дсскддскдд сскддкасса ддсааддссс ссаааскдск дакскасдсс дсааскаддс ксдссдасдд аддкккадсд дсадсддаад сддсассдас ΐ-ксассскда ссаксадсад даддаскксд ссасскаска скдссадсад ккскксадса ссссскддас ддсасааадд кддадаксаа д <210 93 <211> 321 <212> ΌΝΑ <213> Агк1£1С1а1 Зедиепсе <220 <223> ро1упис1еок1с1е зедиепсе епсосНпд 6АЗ.Ы Ук кадддкдасс дсадаадссс сдкдссскск сскдсадссс скксддсддд

120

180

240

300

321 <400 93 дасакссада аксасскдсс ддсааддссс аддкккадсд даддаскксд ддсасааадд кдасссадад кддссадсса сссадскдск дсадсддаад ссасскаска кддадаксаа ссссадсксс дассаккддс дакскасдсс сддсассдас скдссадсад д

скдадсдсса дсскддскдд дсааскаддс кксассскда ккскксадса дсдкдддсда сскддкасса ксдссдасдд ссаксадсад ссссскддас кадддкдасс дсадаадссс сдкдссскск сскдсадссс скксддсддд

120

180

240

300

321 <210 99 <211> 321 <212> ОНА <213> Агк1£1с1а1 Зедиепсе <220 <223> ро1упис1еокЮ зедиепсе епсосНпд 6АЗ.Ь2 О <400 99 дасакссада кдасссадад ссссадсксс скдадсдсса дсдкдддсда аксасскдсс кддссадсса дассаккддс дсскддскдд сскддкасса ддсааддссс ссаааскдск дакскасдсс дсааскаддс ксдссдасдд аддкккадсд дсадсддаад сддсассаад кксассскда ссаксадсад даддаскксд ссасскаска скдссадсад ккскксадса ссссскддас ддсасааадд кддадаксаа д кадддкдасс дсадаадссс сдкдссскск сскдсадссс скксддсддд

120

180

240

300

321 <210 100 <211> 321 <212> ΌΝΑ <213> Агкакасаа! Зедиепсе <220 <223> ро!упис1еок1с1е зедиепсе епсосНпд бАЗ.ЬЗ Ук

- 100 023700 <400> 100 дасаЪссада аксасс1;дсс ддсааддссс адд£Ъ£адсд даддас1сксд ддсасааадд кдасссадад кддссадсса сссадскдс5 дсадсддаад ссасскаска кддадаксаа ссссадсЪсс дассаЕ5ддс да5с5асдсс сддсассаад скдссадсад сЪдадсдсса дсс1;ддс1;дд дсаас5аддс

СЪсасссЪда

Ь^сЪЬсадса дсдЪдддсда сс^ддкасса

5сдссдасдд ссаИсадсад ссссскддас

1;аддд1;дасс 60 дсадаадссс 120 сдкдссс^ск 180 сскдсадссс 240 скксддсддд 300

321 <210> 101 <211> 357 <212> ОНА <213> Аг5.1£1с1а1

Зедиепсе <220>

<223> ро1упи.с1ео51<1е зедиепсе епсосИпд 6АЗс УЕ <400> 101 дасд^ссадс ассИдсассд ккссссддса асссссадсс скдсадскда

5асдасдкда

Идсаддадад

Идассддска асаадскдда ксаададсад асадсдкдас аскас5ксда сддссссддд садсаИсасс дкддакдддс да£садса7с сасададдас скас5ддддс с5ддСдаадс ассдаскасд касаксккск ассадддаса ассдссасс5 садддсасса сс5с5садад сс5ддаас5д асадсддсад сс^ссаадаа ас5аскдсдс скскдассдк сскдадссИд 60 даксаддсад 120 сассасска1с 180 ссадк1;с1;1;с 240 саддддсдда 300 дадсадс 357 <210> 102 <211> 321 <212> ОНА <213> АгМ01с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ро1упис1ео£1с1е аедиепсе епсосИпд бАЗс Ук <400> 102 дасакссада аксасс1;дсс ддсаададсс адд050адсд даддас1сксд ддаассааас кдасссадад кддссадсса сссадскдс5 дсадсддсад кдксскаска ксдадаксаа ссссдссадс дассак^ддс да5с5асдсс сддсассаад скдссадсад сададсдсск дск1;ддс1;дд дссас5аддс к^садскЛса

ГЛскксадса скскдддсда сс^ддкасса

5ддссдасдд адаксадсад ссссскддас дадсдкдаса 60 дсадаадссс 120 сдкдсссадс 180 сскдсаддсс 240 скксддсддс 300

321 <210> 103 <211> 357 <212> ϋΗΑ <213> Аг51£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1е1с асЫ зедиепсе епсосИпд 1А11.Н0

- 101 023700 <400> 103 саддХдсадс адсХдсааад сссддссадд аассадаадХ аХддаасХда дддаасХасХ

ХддХдсадад ссхссддсха дссХддадХд

Хсаадддсад дсаддсХдад ддХасХХсда сддадссдад сассХХсасс даХдддссХд ддХдассаХд дадсдасдас сдХаХддддс дхдаадаадс ддсХасасса аХсаассссХ ассадддаса ассдссдХдХ садддаасаа ссддадссад

ХдаасХдддХ асаасддсдХ ссадсаХсад аХХасХдсдс ссдХдассдХ сдХдааддХд 60 саддсаддсХ 120 дассадсХас 180 сассдссХас 240 саддддсдас 300 дадсадс 357 <210> 104 <211> 315 <212> ϋΝΑ <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1е!с асЫ зедиепсе епсосНпд 1А11.Ь0 <400> 104 дадаХсдХдс сХдадсХдса саддссссХс

ХХсадсддса дасХХсдссд ааддХддада

Хдасасадад ссссдссасс сХдХсХсХда дсссХддсда дадддссасс 60 дсдссадсад садсдХдасс ХасаХдсасХ ддХассадса дааасссддс 120 дссХдсХдаХ сХасдадаХс ХсХаадсХдд ссадсддсаХ ХсссдсХадд 180 дсддсХсадд сассдасХХс асссХсасса ХсадсадссХ ддадсссдаа 240 ХсХасХасХд ссаддадХдд аасХассссХ аХассХХсдд сддсдддасс 300 Хсаад 315 <210> 105 <211> 315 <212> 0ΝΑ <213> АгХ1£1с1а1 Зсдиспсс <220>

<223> пис1е!с асЫ зедиепсе епсос11пд 1А11.Ы <400> 105 дадаХсдХдс сХдадсХдса саддссссХа

ХХсХсаддса дасХХсдссд ааддХддада

ХдасХсадад дсдсХадсад ддсХдХддаХ дсддаадсдд

ХсХасХасХд

Хсаад ссссдссасс садсдХдасс сХасдадаХс сассдасХХс ссаддадХдд сХдадссХда

ХасаХдсасХ адсаадсХдд асссХсасса аасХассссХ дссссддсда ддХассадса ссадсддсаХ

ХсадсХсХсХ аХассХХсдд аадддссаса 60 даадсссддс 120 Хсссдссадд 180 ддадсссдад 240 сддсддсасс 300

315 <210> 106 <211> 315 <212> ΟΝΑ <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1е1с асз.с1 зедиепсе епсосНпд 1А11.Ь2

- 102 023700 <400> 106 дада5сд£дс с£дадс5дс£ саддссссса

ЪЪсадсддсС дас£±сдссд аадд^ддада

Ъдасссадад ссссдсаасс с£дадсс1;са дссс1;ддсда дадддссас£ 60 с£дссадсад садсд£дасс £аса£дсас1; дд1;ассадса даадсссдда. 120 ддс£дсЬда1; с£асдада5с адсаадс5дд сс5с5ддса£ Ъсссдссадд 180 саддсадсдд сассдасИас асссИдасса ЪсадсадссИ ддаасссдад 240 £с£ас£ас£д ссаддад£дд аасЪаЪсссЪ асасс£5.сдд сддсддсасс 300 Ьсаад 315 <210> 107 <211> 315 <212> ОНА <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1е1с астб зедиепсе епсосИпд 1А11.БЗ <400> 107 дада5сд£дс с£дадс5дса саддсЬссса

5£садсддса дас!;5сдссд ааад5ддада

Идасссадад ссссдссаса с5д5сас5д5 сИсссддсда аадддссасс 60 дсдсс5с5ад садсдИдасс НасаИдсасЪ дд5ассадса даадсссддс 120 ддсЪдЪдда5. с£асдада£с адсаадсЪдд ссадсддса£ ссс^дссадд 180 дсддсадсдд сассдас£а£ ассс£дасса 5садсадсс£ сдадсссдад 240 £с£.ас5ас£.д ссаддадЪдд аас5асссс5 асасс^Лсдд сддсдддасс 300 Ъсаад 315 <210> 108 <211> 315 <212> ΕΝΑ <213> АгМ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1е1С астс! аедиепсе епсосНпд 1Α11.Σ4 <400> 108 дааа5Лд£дс с£дадс5дса саддсссссс

5£5адсддса дас£±сдссд аадд^ддада

Ьдасссадад ссссдссасс с^дадссЪдЪ сассаддсда дадддсаасЪ 60 дсдссадсЪс 5адсд£дасс £аса£дсас1; дд5ассадса дааасссдда 120 ддсссс£.да£ с£асдада5с £ссаадс5дд ссадсддса£ ссссдссадд 180 дсддсадсдд сассдас1;5с ассс£дасса 5садсадсс£ сдадсссдад 2 40 £д£а£Ъас£д ссаддад£дд аасЪассссЪ асасс£5.сдд сддсддсасс 300 Ьсаад 315 <210> 109 <211> 315 <212> ΟΝΑ <213> ΑΓί.ί£ίοΪ3.1 2едиепсе <220>

<223> ηυοίθϊο асхд аедиепсе епсосНпд 1Α11.Σ5

- 103 023700 <400> 109 даааХсдХдс сХдадсХдса саддссссаа

ХХсадсддсХ дасХХсдссд ааддХддада

Хдасссадад ссссдсаасс сХдадссХда дссссддада дадддссасХ 60 дсдссадсад садсдХдасс ХасаХдсасХ ддХассадса даадсссддс 120 ддсссХддаХ сХасдадаХХ адсаадсХдд ссХссддсаХ сссХдссадд 180 саддсадсдд сассдасХаХ асссХсасса ХсадсадссХ ддадсссдад 240 ХсХасХасХд ссаддадХдд аасХассссХ асассХХсдд сддсддсасс 300 Хсаад 315 <210 110 <211> 315 <212> ОМА <213> АгХ1£1С1а1 Зедиепсе <220 <223> пис1ез.с астд. зедиепсе епсосНпд 1Α11.Σ6 <400> 110 дадаХсдХдс сХдадсХдса саддссссса

ХХсадсддаа дасХХсдссд ааддХддада

ХдасссадХс асссдсааса сХдадссХда дсссаддада дадддссасс 60 дсдссХсХад сХссдХдасс ХасаХдсасХ ддХассадса даадсссддс 120 дасссХддаХ сХасдадаХс адсаадсХсд ссадсддсдХ ссссдссадд 180 дсддсадсдд дассдасХас асссХдасса ХсадсадссХ ддаасссдад 240 ХдХаХХасХд ссаддадХдд аасХассссХ асассХХсдд сддсддсасс 300 Хсаад 315 <210 111 <211> 315 <212> ОМА <213> АгХ1£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1ез.с астсЯ зедиепсе епсосНпд 1А11.1/7 <400 111 даааХХдХдс сХдадсХдса саддссссса

ХХХадсддса дасХХсдссд ааддХддада

Хдасссадад ссссдссасс сХдадссХдХ сассаддсда дадддсаасХ 60 дсдссадсХс ХадсдХдасс ХасаХдсасХ ддХассадса дааасссдда 120 адсссХддаХ сХасдадаХс ХссаадсХдд ссадсддсдХ дсссдссадд 180 дсддсадсдд сассдасХас асссХдасса ХсадсадссХ сдадсссдад 240 ХдХаХХасХд ссаддадХдд аасХассссХ асассХХсдд сддсддсасс 300 Хсаад 315 <210 112 <211> 315 <212> БЫА <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1еа.с ас10 аедиепсе епсосНпд 1А11.Ь8

- 104 023700 <400> 112 даааЬсдЬдс сЬдадсЬдса саддссссаа

ЬЬсадсддсЬ дасЬЬсдссд ааддЬддада

Ьдасссадад ссссдсаасс сЬдадссЬда дссссддада дадддссасЬ 60 дсдссадсад садсдЬдасс ЬасаЬдсасЬ ддЬассадса даадсссддс 12 0 адсссЬддаЬ сЬасдадаЫ адсаадсЬдд ссЬссддсдС сссЬдссадд 180 саддсадсдд сассЬссЬаЬ асссЬсасса ЬсадсадссЬ ддадсссдад 240 ЬсЬасЬасЬд ссаддадЬдд аасЬассссЬ асассЬЬсдд сддсддсасс 300 Ьсаад 315 <210> 113 <211> 315 <212> ЬЫА <213> АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе <22 0>

<223> пис!е1с асШ зедиепсе епсосИпд 1А11.Б9 <400> 113 дадаЬсдЬдс сЬдадсЬдса саддссссса

ЬЬсадсддаа дасЬЬсдссд ааддЬддада

ЬдасссадЬс асссдсааса сЬдадссЬда дсссаддада дадддссасс 60 дсдссЬсЬад сЬссдЬдасс ЬасаЬдсасЬ ддЬассадса даадсссддс 120 адсссЬддаЬ сЬасдадаЬс адсаадсЬсд ссадсддсдЬ ссссдЬсадд 180 дсддсадсдд дассадсЬас асссЬдасса ЬсадсадссЬ ддаасссдад 24 0 ЬдЬаЬЕасЬд ссаддадЬдд аасЬассссЬ асассЬЬсдд сддсддсасс 300 Ъсаад 315 <210> 114 <211> 441 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 1А11.НЗГЬ (Ги11 1епдЬЬ)

<400> 114

С1п Уа1 С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

5ег Уа1 Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьу®

А1а

Зег

С1у

Туг

ТНг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг МеЬ Азп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

Е1у

Е1п

Е1у

Ьеи

Е1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у Ьеи Не

Азп

Рго

Туг

Азп

61у

Уа1

ТНг

Зег

Туг

Азп

О1п

Ьу5

РЬе

50

55

60

Ьуз О1у Агд

Уа1

ТНг

Ьеи

ТНг

Агд

Аар

ТНг

Зег

11е

£ег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ С1и Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд Азр Э1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РНе

Азр

Уа1

Тгр

Е1у

С1п

61у

ТНг

ТЬг

100

105

110

- 105 023700

Уа1

ТЬг

Уа1 115

Зег

А1а

Зег

ТЬг 120

Ьу®

С1у

Рго

5ег

Уа1 125

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Ьу®

Зег

ТЬг

Зег

61у

С1у

ТЬг

А1а

Ьеи

61у

Суз

130

135

140

Ьеи

Уа1

Ьу®

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

145

150

155

160

61у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

61у

Уа1

Низ

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

165

170

175

Зег

С1у

Зег

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Ьеи

61у

180

185

190

ТНг

С1п

ТЬг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Низ

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

195

200

205

Уа1

Азр

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Низ

ТЬг

Суз

210

215

220

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

61у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Низ

61и

Азр

Рго

61и

Уа1

Ьуз

260

265

270

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

61и

Уа1

Низ

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

С1и

О1и

61п

Туг

Азп

Зег

Туг

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

290

295

300

Ьеи

Ηϊε

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

305

310

315

320

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

61и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

325

330

335

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Азр

340

345

350

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

355

360

365

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

370

375

380

Аеп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

385

390

395

400

РЬе

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

61п

О1у

Азп

Уа1

405

410

415

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Низ

С1и

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Азп

ΗΪ3

Туг

ТЬг

С1п

420

425

430

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

Ьуз

435

440

<210> 115 <211> 212 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 1А11.Ь4ГЬ (Ги11 1епдЬЬ)

- 106 023700 <400> 115

61и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

Зег

Рго

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

А1а

Зег

Уа1

ТНг

Туг

Меб

20

25

30

ΗΪ5

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Рго

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

С1и

11е

Зег

Ьу®

Ьеи

А1а

Зег

О1у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

50

55

60

61у

Зег

61у

ТНг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

С1и

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

С1и

Тгр

Азп

Туг

Рго

Туг

ТНг

РНе

85

90

95

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

Рго

Зег

100

105

но

УаЬ

РЬе

11е

РЬе

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьу®

Зег

О1у

ТЬг

А1а

115

120

125

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

Азп

РНе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

130

135

140

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

С1п

С1и

Зег

145

150

155

160

Уа1

ТЬг

61и

61п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

165

170

175

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьу®

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьу®

Низ

Ьу®

УаЬ

Туг

А1а

Су®

180

185

190

61и

Уа1

ТЬг

ΗΪ5

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТНг

Ьуз

Зег

РНе

Азп

195 200 205

Агд С1у С1и Суз

210 <210> 116 <211> 117 <212> РКТ <213> Ното Заргепз <220>

<223> Нитап ЬгтпиподЬоЪиПп Ьеа’^гу сНаип 1СНУ1-2 V депе (1еас!ег р1из V гедЬоп) зедиепсе <400> 116

Меб

Азр

Тгр

ТЬг

Тгр

Агд

11е

Ьеи

РЬе

Ьеи

УаЬ

А1а

ТЬг

О1у

1

5

10

15

А1а

Низ

Зег

61п

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

61п

Зег

61у

А1а

С1и

Уа1

Ьу®

20

25

30

Рго

С1у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТНг

РНе

35

40

45

ТНг

С1у

Туг

Меб

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

- 107 023700

50

55

60

61и

Тгр

Мек

О1у

Тгр

Не

Азп

Рго

Азп

Зег

С1у

ТЬг

Аеп

Туг

А1а

65

70

75

80

61п

Ьуз

РНе

С1п

С1у

Агд

Уа1

ТНг

МеЬ

ТНг

Агд

Аер

ТЬг

Зег

11е

Зег

85

90

95

ТНг

А1а

Туг

МеН

61и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

100

105

110

Туг Туг Суз А1а Агд 115 <210> 117 <211> 113 <212> РКТ <213> Ното Зар1епз <220>

<223> Нитап иттиподЬоЪиЫп карра НдЬЬ сЬаип 1СКУЗ-11 V депе (1еас1ег р1из V гедхоп)зедиепсе <400> 117

МеЬ 1

С1и

А1а

Рго

А1а 5

С1п

Ьеи

РНе

Ьеи 10

Ьеи

Тгр

Ьеи 15

Рго

Азр

ТЬг

С1у

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТНг

61п

Зег

Рго

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

20

25

30

Ьеи

Зег

Рго

61у

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

35

40

45

Уа1

Зег

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

50

55

60

Агд

Ьеи

11е

Туг

Азр

Азп

Агд

А1а

ТНг

С1у

11е

Рго

А1а

Агд

РНе

65

70

75

80

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Ьеи

85

90

95

С1и

Рго

С1и

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

Агд

Зег

Азп

Тгр

100

105

110

Рго

<210> 118 <211> 441 <212> РР.Т <213> АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 1А11_НЗ-Гс (ГЬЬЬ ЬЕНСТН) <400> 118

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег 61у А1а 61и 7а1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а

- 108 023700

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

61у

Туг

20

25

30

ТЬг

Меи

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

61п

61у

Ьеи

61и

Тгр

МеЬ

35

40

45

61у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

СЬу

Уа1

ТЬг

5ег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

Меи

61и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

5ег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

РЬе

Азр

7а1

Тгр

61у

61п

61у

ТЬг

100

105

но

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

61у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

115

120

125

А1а

Рго

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

ТЬг

А1а

Ьеи

С1у

Суз

130

135

140

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

145

150

155

160

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Низ

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

61п

Зег

165

170

175

Зег

С1у

Зег

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Ьеи

О1у

180

185

190

ТЬг

С1п

ТЬг

Туг

Не

Суз

Азп

Уа1

Азп

Шз

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

195

200

205

Уа1

Азр

Ьуз

УаЬ

61и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Шз

ТЬг

Суз

210

215

220

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

61у

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Меи

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Шз

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

260

265

270

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

О1и

Уа1

Нтз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

Туг

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

290

295

300

Ьеи

Низ

61п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

61и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

305

310

315

320

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

325

330

335

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Азр

340

345

350

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

61у

РЬе

355

360

365

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

61и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

370

375

380

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

385

390

395

400

РЬе

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

61п

О1у

Азп

Уа1

405

410

415

- 109 023700

РЬе	5ег Суз	8ег Уа1 420	МеЬ	ΗΪ3	С1и	А1а Ьеи Нтз Азп Нтз Туг ТЬг С1п
425	430
Ьуа	Зег	Ьеи	Зег	Ьеи	Зег	Рго	б1у	Ьуа
		435					440

<210> 119 <211> 1407 <212> ΒΝΑ <213> Аг£1£1с1а1 5едиепсе <220>

<223> 1Α11_νΗ3-Εθ ΏΝΑ (ЕЦЫ, ЬЕЫСТН, ΝΙΤΗ 5Ι6ΝΑΕ ЗЕ(2иЕЫСЕ) <400> 119 а5-дддс£.дд£- ссЪдса^-саС. ссИдСЛИсИд дИддссассд ссассдд£д£ дсасадссад 60 дЬдсадсЬдд Ьдсададсдд адссдаддЬд аадааасссд дадссадсдЬ даадд£дадс 120

Ъдсааддсса дсддс£асас сЪЪсассддс ЪасассаЪда асЪдддЪдад дсаддссссс 180 ддссадддас ЪсдадЪддаЪ дддссЪдаЪс аасссс£аса асддсдЪдас садс£асаас 240 садаадЫ;са адддсадддТ дасссЗдасс адддаТасса дса^садсас сдс£1;аса1;д 300 даасЬдадса ддсЬдаддЬс сдасдасасс дссдЬдЬаЫ: асЬдсдссад дддсдасддс 360 аасЪасИддЪ асЪИсдаИдС. д^ддддссад ддсассассд ИсасадИдад садсдссадс 420 ассаадддсс ссадсд£-д£-С. ссссс^ддсд сссадсадса ададсассад сддсддсаса 480 дссдсссЬдд дсЬдсс£дд£ дааддасЬас ££ссссдадс садЬдассдЬ д£сс£ддаас 540 адсддадссс £дассадсдд сдЬдсасасс ЪЪсссадсЪд £сс£.дсадад садсддсс£.д 600

Тасадсс1;да дсадсдЗддТ дассдЗдссс адсадсадсс Тдддсассса дасс1;аса1;с 660

ЪдЪаасдЪда ассасаадсс садсаасасс аадд^ддаса адааддЪдда дсссаададс 720

ЪдЪдасаада сссасасс£.д сссссссЪдс ссЪдсссссд адс£.ддссдд адсссссадс 780 д^дЪИссЪдЪ 5-сссссссаа дссЪааддас ассс^даИда Исадсадаас ссссдаддЪд 840 ассЬдЬдЬдд £дд£дда£д£ дадссасдад дассс£дадд £даад££саа с£дд£асдЬд 900 дасддсдЪдд адд^дсасаа Ьдссаадасс аадсссаддд аддадсад^а саасадсасс 960

ЪассдддЪдд ЪдЪссдЪдсЪ дассдЪдсЪд сассаддаЪЪ ддс£.даасдд сааддадЬас 1020 аад1;д1;аадд 5д5ссаасаа ддсссЗдсс!; дссссЬаЬсд адаааассаЗ садсааддсс 1080 аадддссадс ссадададсс ссаддЪдЪас ассс^дсссс сЪадсадада ЪдадсЪдасс 1140 аадаассадд 5д^ссс5дас с5дсс5ддТд аадддс^ТсТ ассссадсда са^сдссд^д 1200 дадЪдддада дсаасддсса дсссдадаас аасИасаада ссассссссс ^дЪдсИддас 1260 адсдаЬддса дсЬ£с££сс£ дЬасадсаад с£дассд£дд асаададсад а£ддсадсад 1320 ддсаасдЪдЪ £садсС.дс±с сдИда^дсас даддсссИдс асааНсасИа сасссадаад 1380 адссТдадсс 5д^ссссТдд саадТда 1407 <210> 120 <211> 357 <212> ΟΝΑ <213> Аг£1£1с1а1 5едиепсе <220>

<223> писТехс асз-ά епсосНпд 1А11 ΥΗ3 N980

- 110 023700 <400> 120 саддИдсадс адс£дсаадд сссддссадд аассадаад£ аСддаасСда ддсдасЪасС £дд£дсадад ссадсддс£а дас£сдад£д £саадддсад дсаддсСдад ддСасЪСсда сддадссдад сасс£Ъсасс даИдддссИд ддИдасссИд дСссдасдас рдрдрддддс дИдаадааас ддсИасасса аИсаассссИ ассаддда£а ассдссд£д£ садддсасса ссддадссад £даас£ддд£ асаасддсд£ ссадсаИсад аСЪасСдсдс ссдСсасадС сд£даадд£д 60 даддсаддсс 120 дассадсИас 180 сассдс££ас 240 саддддсдас 300 дадсадс 357 <2Ю> 121 <211> 117 <212> РКТ <213> Аг£а.£а.с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 1А11 УНЗ N980

<400> 121

С1п Уа1 С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуг

Ьуа

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег Уа1 Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РНе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг МеГ. Агп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61у

61п

61у

Ьеи

О1и

Тгр

МеП

35

40

45

О1у Ьеи 11е

Азп

Рго

Туг

Агп

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

61п

Ьуе

РНе

50

55

60

Ьуз С1у Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Агр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ С1и Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Агр

ТЬг

А1а

ν&1

Туг

Суе

85

90

95

Агд Агр С1у

Азр

Туг

Тгр

Туг

РНе

Агр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТНг

100

105

110

Уа1 ТЬг Уа1

Зег

115

<210> 122 <211> 357 <212> ОМА <213> Аг£1£1С1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1ез.с астсЯ епсосИпд 1А11 ΥΗ3 М98Е <400> 122 саддИдсадс адс£дсаадд сссддссадд аассадаадС аСддаасСда

£.ддИдсадад сддадссдад дИдаадааас ссддадссад сд£даадд£.д 60 ссадсддс£а сассЪЪсасс ддсЪасасса £.даас£ддд1; даддсаддсс 120 дасЪсдадСд да£дддсс£д а£саасссс£ асаасддсдС дассадсЪас 180 Ссаадддсад дд£дассс£.д ассадддаСа ссадсаЪсад сассдсСЪас 240 дсаддсСдад дСссдасдас ассдссд£д£ аСЪасСдсдс саддддсдас 300

111 023700 ддсдадКасК ддКасККсда КдКдКддддс садддсасса ссдКсасадК дадсадс

357 <210> 123 <211> 117 <212> РКТ <213> АгК1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 1А11 ΥΗ3 Ы98Е

<400> 123

С1п Уа1 С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

О1и

Уа1

Ьуз

Ьуа

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

8ег Уа1 Ьуэ

Уа1

8ег

Суа

Ьуа

А1а

8ег

Б1у

Туг

ТНг

РЬе

ТНг

61у

Туг

20

25

30

ТЬг МеЬ Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у Ьеи 11е

Азп

Рго

Туг

Аап

С1у

Уа1

ТНг

Зег

Туг

Аап

О1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз С1у Агд

Уа1

ТНг

Ьеи

ТЬг

Агд

Азр

ТНг

Зег

11е

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ С1и Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

65

90

95

Агд Азр С1у

С1и

Туг

Тгр

Туг

РНе

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

но

Уа1 ТНг Уа1

Зег

115

<210> 124 <211> 357 <212> ОМА <213> АгК1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> пис1ез.с асз.с1 епсосНпд 1А11 УНЗ ПООЬЕ <400> 124 саддКдсадс адсКдсаадд сссддссадд аассадаадК аКддаасКда ддсаасКасК

КддКдсадад ссадсддсКа дасКсдадКд

Ксаадддсад дсаддсКдад ддКасдадда сддадссдад сассККсасс даКдддссКд ддКдасссКд дКссдасдас

ЬдЬдЬддддс дКдаадааас ддсКасасса аКсаассссК ассадддаКа ассдссдКдК садддсасса ссддадссад

КдаасКдддК асаасддсдК ссадсаКсад аККасКдсдс ссдКсасадК сдКдааддКд 60 даддсаддсс 120 дассадсКас 180 сассдсККас 240 саддддсдас 300 дадсадс 357 <210> 125 <211> 117 <212> РКТ <213> АгК1£1с1а1 Зедиепсе

112 023700 <220>

<223> 1А11 УНЗ ИООЬЕ <400> 125

С1п

Уа1

£1п

Ьеи

Уа1

(51п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуе

Ьуз

Рго

61у

А1а

1

5

10

15

$ег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

61у

Ьеи

С1и

Тгр

МеХ

35

40

45

б1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

61у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуа

61у

Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеХ

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

С1и

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210> 126 <211> 357 <212> ОНА <213> АгХ1£1с1а1 Зесрепсе <220>

<223> пис1е!с асхс! епсосИпд νΗ3 ПООЬН <400> 126 саддХдсадс адсХдсаадд сссддссадд аассадаадХ аХддаасХда ддсаасХасХ

ХддХдсадад ссадсддсХа дасХсдадХд

Хсаадддсад дсаддсХдад ддХассасда сддадссдад сассХХсасс даХдддссХд ддХдасссХд дХссдасдас

ХдХдХддддс дХдаадааас ддсХасасса аХсаассссХ ассадддаХа ассдссдХдХ садддсасса ссддадссад

ХдаасХдддХ асаасддсдХ ссадсаХсад аХХасХдсдс ссдХсасадХ сдХдааддХд даддсаддсс дассадсХас сассдсХХас саддддсдас дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 127 <211> 117 <212> РКТ <213> АгХ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 1А11 ΥΗ3 ПООЬН <400> 127

113 023700

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и 10

Уа1

Ьуз

Рго

61у 15

А1а

Бег

Уа1

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

61у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Бег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мер

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Агд

Аар

Б1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

ΗΪ5

Азр

Уа1

Тгр

61у

О1п

61у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210 128 <211> 357 <212> ОМА <213> АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе <220 <223> пис!е1с βοϊά епсоШпд ΥΗ3 Е100Ы <400> 128 саддЬдсадс адсЬдсаадд сссддссадд аассадаадЬ аЬддаасЬда ддсаасЬасЬ

ЬддЬдсадад ссадсддсЬа дасЬсдадЬд

Ьсаадддсад дсаддсЬдад ддЬасаЬсда сддадссдад сассЬЬсасс даЬдддссЬд ддЬдасссЬд дЬссдасдас

ЬдЬдЬддддс дЬдаадааас ддсЬасасса аЬсаассссЬ ассадддаЬа ассдссдЬдЬ садддсасса ссддадссад

ЬдаасЬдддЬ асаасддсдЬ ссадсаЬсад аЬЬасЬдсдс ссдЬсасадЬ сдЬдааддЬд даддсаддсс дассадсЬас сассдсЬЬас саддддсдас дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 129 <211> 117 <212> РЕТ <213> АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе <220 <223> УНЗ Г100Ы <400> 129

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Бег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

<31у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

61у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

- 114 023700

С1у Ьеи 50

11е Азп

Рго

Туг

Азп С1у Уа1 55

ТЬг

Зег

Туг 60

Азп

61п

Ьуз

РЬе

Ьуз

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Аэр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

ЭО

95

Агд

Азр

С1у

Азп

Туг

Тгр

Туг

Не

Азр

Уа1

Тгр

С1у

61п

С1у

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210> 130 <211> 357 <212> ВЫЛ <213> ΑΓίίίίοϊΗΐ Зедиепсе <220>

<223> пис!е!с ас!с1 епсосНпд νΗ3 ПООЬУ <400> 130 саддкдсадс адскдсаадд сссддссадд аассадаадк акддааскда ддсааскаск кддкдсадад ссадсддска дасксдадкд ксаадддсад дсаддскдад ддкасдкдда сддадссдад сасскксасс дакдддсскд ддкдассскд дкссдасдас кдкдкддддс дкдаадааас ддскасасса аксаасссск ассадддака ассдссдкдк садддсасса ссддадссад кдааскдддк асаасддсдк ссадсаксад аккаскдсдс ссдксасадк сдкдааддкд даддсаддсс дассадскас сассдсккас саддддсдас дадсадс

120

180

240

300

357 <210> 131 <211> 117 <212> РКТ <213> Агк1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ΥΗ3 КЮОЬУ

<400> 131

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

<31у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

С1у

Туг

20

25

30

ТЬг

МеО

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Мек

35

40

45

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РНе

50

55

60

Ьуз

61у

Агд

Уэ1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

11е

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

30

Мер

О1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

- 115 023700

Агд Азр С1у Азп Туг Тгр Туг Уа1 Азр Уа1 Тгр С1у С1п б1у ТЬг ТЬг
100 Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115	105	но
<210>	132
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	АгЫ£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	УНЗ Μ98ϋ СРКНЗ
<400>	132
61у Азр С1у Азр Туг Тгр Туг	РЬе	Азр	7а1
1	5			10
<210>	133
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Аг£1£1с1а1 Зечиепсе
<220>
<223>	νΗ3 Ν98Ε СРКНЗ
<400>	133
С1у Азр С1у 61и Туг Тгр Туг	РЬе	Азр	Уа1
1	5			10
<210>	134
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Аг£1£1С1а1 Зедиепсе
<220
<223>	νΗ3 пооье СЭКН2
<400>	134
61у Азр С1у Азп Туг Тгр Туг	С1и	Азр	17а 1
1	5			10
<210>	135
<211>	10
<212>	РКТ

- 116 023700 <213> Аг£Ь£ЬсЬа1 Зечиепсе <220>

<223> УНЗ ПООЬН СЭВ.НЗ <400> 135

С1у Азр СЬу Аап Туг Тгр Туг НЬз Азр Уа1

1		5
<210>	136
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Аг£Ь£1с1а1	Зеяиепсе
<220>
<223>	УНЗ Г100Ы	СЬКНЗ
<400>	136

С1у Аар СЬу Азп Туг Тгр Туг 11е Азр Уа1

1		5
<210>	137
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Аг£Ь£ЬсЬа1	Зециепсе
<220>
<223>	УНЗ ГЮОЬУ	СЬКНЗ
<400>	137

СЬу Азр СЬу Азп Туг Тгр Туг Уа1 Азр Уа1

1	5
<210> 138 <211> 107 <212> РКТ <213> Аг£Ь£ЬсЬа1	Зедиепсе
<220> <223> ЙАЗ.Б27 Ук

<401

0> 1:

38

Азр

Ые

СЬп

Мек

Ьеи

СЬп

Зег

Рго

Зег

Ьеи

Зег

АЬа

Зег

УаЬ

О1у

1

5

10

15

Азр

Агд

УаЬ

ТНг

Ые

ТЬг

Суз

Ьеи

АЬа

Зег

СЬп

ТНг

11е

СЬу

Туг

Тгр

20

25

30

Ьеи

АЬа

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

Ьуз

АЬа

Рго

Ьуз

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

АЬа

ТЬг

Агд

Ьеи

АЬа

Азр

СЬу

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

МеЬ

РНе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

СЬи

Азр

РНе

АЬа

ТЬг

Туг

Суз

СЬп

РНе

Зег

Туг

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РНе

СЬу

ТЬг

Ьуз

УаЬ

СЬи

11е

Ьуз

100

105

- 117 023700

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антитело против СО127, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 и 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующие гипервариабельные участки:

(1) СОВЫ, как указано в 8Е0 ГО N0:5, (2) СПВЬ2, как указано в 8Е0 ГО N0:6, (3) СПВЬ3, как указано в 8Е0 ГО N0:7.
2. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:13 (1А11.Н3 Ун).
3. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь, как указано в 8Е0 ГО N0:114 или 8Е0 ГО N0:118.
4. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:121 или 8ЕО ГО N0:123.
5. Антитело по любому из пп.1-4, содержащее вариабельную область легкой цепи, как указано в 8ЕО ГО N0:22.
6. Антитело по любому из пп.1-5, содержащее легкую цепь, как указано в 8Е0 ГО N0:115.
7. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:13, и вариабельную область легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:22.
8. Антигенсвязывающий белок, содержащий следующие гипервариабельные участки:

(1) СОВН1, как указано в 8Е0 ГО N0:2, (2) СОВН2, как указано в 8Е0 ГО N0:3, (3) СОВН3, как указано в 8ЕО ГО N0:4, 132, 133, 134, 135, 136 или 137, (4) СОВЫ, как указано в 8Е0 ГО N0:5, (5) СПВЬ2, как указано в 8Е0 ГО N0:6, (6) СПВЬ3, как указано в 8Е0 ГО N0:7, где указанный антигенсвязывающий белок способен связываться с СГО127.
9. Антигенсвязывающий белок по п.8, содержащий следующие гипервариабельные участки:

(1) СОВН1, как указано в 8Е0 ГО N0:2, (2) СОВН2, как указано в 8Е0 ГО N0:3, (3) СОВН3, как указано в любой из 8Е0 ГО N0:132, 133, 134, 135, 136 или 137, (4) СОВЫ, как указано в 8Е0 ГО N0:5, (5) СПВЬ2, как указано в 8Е0 ГО N0:6, (6) СПВЬ3, как указано в 8Е0 ГО N0:7.
10. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний или расстройств, в которые вовлечены патогенетические аутореактивные Т-клетки, содержащая антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий белок по п.8 или 9 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
11. Применение антитела по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающего белка по п.8 или 9 в лечении субъекта, страдающего аутоиммунным или воспалительным заболеванием.