UA127586C2 - Біспецифічні анти-cd37-антитіла, моноклональні анти-cd37-антитіла та способи їх застосування - Google Patents

Біспецифічні анти-cd37-антитіла, моноклональні анти-cd37-антитіла та способи їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA127586C2
UA127586C2 UAA201910706A UAA201910706A UA127586C2 UA 127586 C2 UA127586 C2 UA 127586C2 UA A201910706 A UAA201910706 A UA A201910706A UA A201910706 A UAA201910706 A UA A201910706A UA 127586 C2 UA127586 C2 UA 127586C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
region
sequence
zeo
antigen
Prior art date
Application number
UAA201910706A
Other languages
English (en)
Inventor
Сімоне Остінді
Симоне Остинди
Франк Бьорскенс
Франк Бёрскенс
Естер Брей
Эстер Брей
ден Брінк Едвард ван
Ден Бринк Эдвард Ван
Андреас Холленстейн
Марейє Овердейк
Марейе ОВЕРДЕЙК
Маргарет Ліндорфер
Маргарет Линдорфер
Рональд Тейлор
Рональд Тэйлор
Пауль Паррен
дер Хорст Хілма ван
дер Хорст Хилма ван
Шамюло Мартіна І.Д.
Шамюло Мартина Е.Д.
Тюна Мютіс
Тюна Мютис
Original Assignee
Ґенмаб Холдінґ Б.В.
Генмаб Холдинг Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ґенмаб Холдінґ Б.В., Генмаб Холдинг Б.В. filed Critical Ґенмаб Холдінґ Б.В.
Publication of UA127586C2 publication Critical patent/UA127586C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Винахід стосується біспецифічного антитіла, специфічного до CD37, що зв'язуються з різними епітопами людського антигену CD37.

Description

(54) БІСПЕЦИФІЧНІ АНТИ-СО37-АНТИТІЛА, МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИ-СО37-АНТИТІЛА ТА СПОСОБИ ЇХ
ЗАСТОСУВАННЯ
(57) Реферат:
Винахід стосується біспецифічного антитіла, специфічного до СЮОЗ37, що зв'язуються з різними епітопами людського антигену СО37.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, які специфічно зв'язують людський антиген СО37. Винахід відноситься, зокрема, до СОЗ37-специфічних молекул біспецифічного антитіла, які зв'язуються з різними епітопами людського антигену СО37, де молекули біспецифічного антитіла мають поліпшені взаємодії Ес-Ес при зв'язуванні з СО37 на поверхні клітини й, таким чином, мають поліпшені ефекторні функції. Винахід також відноситься до нових моноклональних вихідних антитіл, з яких одержують першу або другу антигензв'язувальну область молекул біспецифічного антитіла. Винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, які містять ці молекули, і до лікування раку й інших захворювань із використанням цих композицій.
Попередній рівень техніки
Лейкоцитарний антиген СО37 ("СО37"), також відомий як ОР5Б2-40, тетраспанін-2б6 або
Т5РАМО26, є трансмембранним білком суперродини тетраспанінів (МаескКег еї аІ., РЕАЗЕВ 9. 1997; 11: 428-442). За нормальної фізіології СОЗ37 експресується на В-клітинах під час стадій від пре-В до периферійних зрілих В-клітин, але, як повідомляється, відсутній на плазматичних клітинах (ЦикК еї аї., у. Раїйої. 1987; 152: 12-21). Антиген СО37 слабко експресується на Т-клітинах і мієлоїдних клітинах, таких як моноцити, макрофаги, дендритні клітини й гранулоцити (Зспугагіг-
Аїріє? еї аї., У. Іттипої 1988; 140 (3): 905-914). СО0О37 широко експресується на злоякісних клітинах при різних В-клітинних лейкозах і лімфомах, включаючи неходжкінську лімфому (НХЛ) і хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ) (Мооге еї аї. У Іттипої. 1986; 137 (9): 3013).
Декілька націлених на СОЗ37 агентів на основі антитіл оцінюються як потенційні терапевтичні засоби проти В-клітинних неоплазій та інших злоякісних новоутворень. До них відносяться, наприклад, радіоіїмуно-кон'югати, такі як БеталутинФ), кон'югати антитіло-лікарський засіб, такі як
ІМОМ529 і Ао5-67Е, і переформатовані або Есо-сконструйовані антитіла, такі як отлертузумаб і
ВІ 836826 (Новак апа Робак, Ехреп Оріп Віо! Тег. 2014; 14 (5): 651-61). Анти-СО37 антитіла були запропоновані для використання їх як терапевтичних агентів у форматах, описаних вище, і в інших форматах (див., наприклад, УМО 2012/135740, УМО 2012/007576, МО 2011/1112978, УМО 2009/126944, МО 2011/112978 і ЕР 2 241 577).
Беталутин - це мишаче анти-СО37-антитіло, лілотомаб (раніше ННІ/ тетуломаб),
Зо кон'юговане з лютецієм-177. Беталутин швидко інтерналізується, інгібує ріст В-клітин іп міїго і продовжує виживання при внутрішньовенному введенні на моделі ОСацаі-5СІО (Оаніє єї а! 2013,
Апіїсапсег Нез 33: 85-96).
ІМОМ529 є АОС (кон'юкатом антитіла й ліків), який складається з антитіла К7153А, кон'югованого з мейтансиноїдом ОМ! через лінкер З5МСОС (сукцинімідил-трансо-4-
Імалеімідометилі|циклогексан-1-карбоксилат). Повідомляється, що антитіло К7153 індукує апоптоз клітин Като5, які експресують СО37, за відсутності перехресного зв'язування. Воно також індукувало СОС (комплементзалежну цитотоксичність) і АОСС (антитіло-залежну цитотоксичність) у клітинних лініях лімфоми Беркита, хоча здатність індукувати СОС була набагато меншою в порівнянні з ритуксимабом (Оескегі еї аї., Віоса 2013; 122 (20): 3500-10). Ці
Ес-опосередковані ефекторні функції К7153А зберігаються в кон'югованому з ОМ-1 антитілі.
Адепзує розробляє АС5-67Е, людське мАт анти-СО37 І|дДС2, кон'юговане з монометилауристаміном Е. АО567Е індукує сильну цитотоксичність і апоптоз (Регеїга еї аї!., Мої
Сапсег ТНег 2015; 14 (7): 1650-1660).
Отлертузумаб (спочатку відомий як ТКО-016) є 5МІР. (імуно-фармацевтичним препаратом на основі модульного білка малого розміру; ЗМІРЗ - це дисульфід-зв'язані димери одноланцюгових білків, які складаються із одного антигензв'язувального МН/Л/І, сполучної шарнірної області й Ес (фрагментної, кристалізованої) області (СН2 - СНЗ)). Механізми його дії - індукція апоптоза й АОСС, але не СОС (2пао еї а! 2007, Віоса 110 (7), 2569-2577). тАб3З37.1/ВІ 836826 є химерним антитілом, яке розроблене для зв'язування з високою спорідненістю з ЕсукШа (СО1ба) (Неїдег ей а 2011, Віоой 118: 4159-4168). Воно має проапоптотичну активність, яка не залежить від зшивки Ес дО, хоча проапоптотична активність збільшується при зшивці. Воно демонструє потужну АЮСС для СО37-В-клітинних ліній і первинних клітин ХЛЛ.
Незважаючи на ці та інші досягнення в даній галузі, все ще існує потреба в поліпшених анти-
СО37-антитілах для лікування раку й інших захворювань.
Відповідно, метою даного винаходу є забезпечення анти-СО37 антитіл, які можуть бути корисними при лікуванні раку й/або інших захворювань. Завданням даного винаходу є створення анти-СОЗ37 антитіл, які покращені відносно СОС клітин людини комплементом людини, у порівнянні з антитілами попереднього рівня техніки. Ще однією метою є створення 60 біспецифічного антитіла, яке має з'єднувальні ланки, отримані із двох вихідних антитіл, які зв'язуються з різними епітопами на СОЗ37, і де біспецифічне антитіло має підвищені СОС і/або
АС у порівнянні з комбінацією двох вихідні моноклональних антитіл, які зв'язують зазначені різні епітопи, і/або з кожним з вихідних моноклональних антитіл. Ще однією метою є створення нових моноклональних антитіл, які зв'язують різні епітопи на СО37, зокрема, метою є забезпечення антитіл анти-СО37, які зв'язують нові епітопи СО37. Ще однією метою даного винаходу є забезпечення нових моноклональних антитіл, які зв'язують різні епітопи на СОЗ37, які можуть служити вихідними антитілами для біспецифічних антитіл запропонованих винаходом.
Ще однією метою є створення біспецифічних антитіл, які зв'язуються із двома різними епітопами на СОЗ37, і де біспецифічні антитіла мають поліпшену взаємодію Ес-Ес при зв'язуванні з СО37 на плазматичній мембрані, у порівнянні з біспецифічним антитілом того ж ізотипа, і які мають ідентичні з'єднувальні ланки, як біспецифічне антитіло запропоноване винаходом.
Виклад сутності винаходу
Автори даного винаходу несподівано виявили, що біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з двома різними епітопами на СО37, та яке має мутацію, яка посилює взаємодію Ес-
Ес при зв'язуванні з СО37 на плазматичній мембрані, більш ефективно індукує СОС, ніж комбінація двох антитіл анти-СО37, кожне з яких має специфічність зв'язування з одним із двох різних епітопів на СЮО37 і має ту саму мутацію, яка посилює взаємодію Ес-Ес, або будь-яке антитіло, яке має ту саму мутацію, що посилює взаємодію БЕс-Бс, як таке. Крім того, біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується із двома різними епітопами на СОЗ37, і яке має мутацію, яка посилює взаємодії Ес-Бс, є більш ефективним для індукції АЮСС, ніж комбінація двох антитіл анти-СО37, кожне з яких має специфічність зв'язування у відношенні одного із двох різних епітопів на СОЗ37, і які мають таку саму мутацію, що посилює взаємодію Ес-
Ес.
Відповідно, винахід відноситься до нових біспецифічних антитіл, які зв'язуються 3 людським
СО37, що мають кращі властивості своїх антигензв'язувальних характеристик, їх здатності індукувати СОС і АОСС, їхньої взаємодії Ес-Ес при зв'язуванні з мембранозв'язаними мішенями, їх цитотоксичного ефекту у відношенні СО37-експресувальних клітин, та інші властивості, як описано в даній заявці.
Відповідно, у першому аспекті даний винахід відноситься до біспецифічного антитіла, яке
Зо містить першу й другу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з СЮО37 людини, і яке має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 62, і першу й другу Ес область імуноглобуліну людини, де перша й друга антигензв'язувальні області зв'язують різні епітопи на СО37, і де перша й друга Ес області містять одну або кілька амінокислотних мутацій, які посилюють взаємодію с-Ес між біспецифічними антитілами при зв'язуванні з мембранозв'язаним СО37, у порівнянні із взаємодією Ес-Ес між біспецифічними антитілами, які не мають зазначеної мутації (мутацій).
Таким чином, в одному аспекті забезпечується біспецифічне антитіло, яке містить першу й другу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з СЮО37 людини, що мають послідовність
ЗБО ІЮ МО: 62, і першу й другу Ес-область імуноглобуліну людини, де перша й друга антигензв'язувальні області зв'язують різні епітопи на СО37 і де перша й друга Ес області містять одну або кілька амінокислотних мутацій, які посилюють взаємодію с-Ес між біспецифічними антитілами при зв'язуванні з мембранозв'язаною мішенню, у порівнянні з взаємодією Ес-Ес між біспецифічними антитілами, що не мають зазначеної мутації (мутацій).
У другому аспекті винахід відноситься до анти-СОЗ37 антитіла, яке зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й антитіло анти-СО37, яке містить: () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 16, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 17, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 18, ї М. область, яка містить СОКІ1 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20, і послідовність СОК2:
КАБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 21 (0101; або (ї) МН область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 9, послідовність
БО СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 10, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 11, ії МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 113, і послідовність СОМ:
ААФ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 14 (0051.
У третьому аспекті винахід відноситься до анти-СО37 антитіла, яке зв'язується з людським
СО37, яке включає: () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 23, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 24, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 25, ії МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 27, і послідовність СОК2:
ХАЗ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 28; Г016), або (ї) МН область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 2, послідовність 60 СОК2, зазначену в 5ЕО ІО МО: 3, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІО МО: 4, і МІ. область,
яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІО МО: 6, і послідовність СОК2: ЕАХБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 7. (0041
У четвертому аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить біспецифічне антитіло або антитіло запропоноване винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
У п'ятому аспекті винахід відноситься до біспецифічного антитіла, або антитіла або запропонованої винаходом композиції для застосування її як медикаменту. У конкретних аспектах вони призначені для застосування при лікуванні раку або аутоїмунного захворювання, або запальних захворювань, і зокрема, для застосування при лікуванні В-клітинних неоплазій.
В інших аспектах винахід відноситься до способів лікування, комбінованого лікування, послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують запропоновані винаходом антитіла, до векторів і клітин-хазяїв, які їх експресують, і до способів детекції присутності або антигену СО37, або клітин, які експресують антигени СОЗ37 у зразку або у суб'єкта.
Короткий опис креслень
Фігура 1: СОС, опосередкований варіантами 528.1, на первинних пухлинних клітинах ХЛЛ.
Здатність індукувати СОС на первинних пухлинних клітинах ХЛЛ (А) Іде1-(328.1-К-О9В-аеїкК,
Ідс1-с28.1-Е345К або Іде1-612-Е345Е (клітини: отримані від пацієнта, із уперше поставленим діагнозом/ без лікування (РВ - отримані з периферійної крові)) і (В) Ідс1-428.1, Ідс1-с28.1-
Е4300 або Ідс1-612 (клітини: отримані від пацієнта, із уперше поставленим діагнозом/ без лікування (ВМ - отримані з кісткового мозку)) визначали іп міго. Показані дані демонструють 9о лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі- позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 2: Кількісне визначення рівнів експресії СО37, 2046, 2055 ії СО59 на пухлинних клітинах ХЛЛ. Рівні експресії СО37, 2046, СО55 і СО59 на клітинах ХЛЛ від одного пацієнта (пацієнт ММ-РВОО00О5, із уперше поставленим діагнозом/ без лікування) визначали проточною цитометрією. Кількість антигену показана у вигляді молекул на клітину. тідс1 є мишачим ІдДС1, к ізотиповий контроль.
Фігура 3: Зв'язування гуманізованих антитіл анти-СО37 і їх варіантів із клітинами Дауді.
Зв'язування Ід1-004-Н5І 2, ІдДС21-004-Н5БІ 2-Е4З30С, Іда1-005-Н11 2, Ідс1-005-Н112-Е4З0С, Ідеа1- 010-НБІ2, ІдсСт-010-Н5І 2-Е430с, ІдС1-016-Н512 ії Ідс1-016-Н5І 2-Е4300 із клітинами Дауді визначали проточною цитометрією. Показані дані є значеннями середньої інтенсивності флуоресценції (МЕ) для одного репрезентативного експерименту.
Фігура 4: Зв'язування 28.1 і 37.3 і їх варіантів із клітинами Дауді. Зв'язування Ідс1-428.1,
Ідс1-с228.1-Е430С, Ідс1-37.3 і Ідс1-37.3-Е430Об із клітинами Дауді визначали методом проточної цитометрії. Показані дані є значенням середньої інтенсивності флуоресценції (МЕ) для одного репрезентативного експерименту.
Фігура 5: Зв'язування варіантів гуманізованого СОЗ37-антитіла Ід51-016-Н512 із клітинами
Дауді. Зв'язування Ід1-016-Н5І2, Ідс1-016-Н5І 2-Е4З0С, Ідс1-016-Н5І 2-Е405І -Е4300 і Ід1- 016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е4300 із клітинами Дауді визначали методом проточної цитометрії.
Показані дані є значеннями середньої інтенсивності флуоресценції (МЕ!) для одного репрезентативного експерименту.
Фігура 6: Зв'язування варіантів антитіла СО37 із клітинами СНО, які експресують СО37 яванського макака. Зв'язування 19де1-004-Н5І 2-Е430С, Ідс1-005-Н112-Е4З0С, Іда1-010-Н5І 2-
Е43З0Сс, Ідс1-016-Н5БІ2-Е4300, ІдсСт-528.1 ї Ідсб1-2428.1-Е430б визначали за допомогою проточної цитометрії. Показані дані є значеннями середньої інтенсивності флуоресценції (МЕ) для одного репрезентативного експерименту.
Фігура 7: Визначення конкуренції зв'язування між СО37 антитілами, і СОС, опосередкованої гуманізованими СО37 антитілами, їх варіантами й комбінаціями СО37 антитіл на клітинах Каї). (А) Конкуренцію зв'язування між Ідс1-37.3-Е430с, Ідс1-528.1-Е430С, Іщда1-004-Н5І 2-Е4З0С,
Ідс1-005-Н112-Е430Сс, Іде1-010-Н512-Е4300 і ІдФб1-016-Н5І 2-Е4346 визначали методом проточної цитометрії. Клітини Ка) інкубували з неміченими антитілами для первинного зв'язування, а потім з антитілами-зондами, міченими Аїеха Рішог 488. Втрата зв'язування А 488- мічених антитіл-зондів після попередньої інкубації з неміченим антитілом у порівнянні зі зв'язуванням тільки А 488-міченого антитіла вказує на конкуренцію зв'язування між А 488- міченим і неміченим антитілом. Показані дані є значеннями від подвійних випробувань молекул еквівалентного розчинного флуорохрома (МЕ5Е) для одного репрезентативного експерименту. (8В-С) Здатність індукувати СОС на клітинах Каїї Іде1-004-НБІ 2, Іда1-005-Н112, Ідс1-010-Н51І 2,
Ідс1-016-Н512 ї Ідс1-37.3, з мутацією Е430СО або без неї, і комбінації цього були визначені іп міго. Показані дані демонструють 9о лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих бо клітин (які відповідають Рі-позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 8: Схематичний огляд конкуренції зв'язування між СО37 антитілами. Конкуренцію зв'язування між Ідс1-37.3-Е430с, Іда1-528.1-Е430с, Ідс1-004-Н5БІ 2-Е4300, Іда1-005-НІІ 2-
Е4ЗО0С, ІДС1-010-Н5БІ 2-Е430 і Ідс1-016-Н5БІ 2-Е43400 для Каїї клітин визначали за допомогою проточної цитометрії, використовуючи немічені антитіла для первинного зв'язування й мічені
АІеха Рішог 488 антитіла-зонди для виявлення наступного зв'язування конкуруючого антитіла.
Колірна індикація: чорний - одночасне зв'язування; білий - конкуренція зв'язування; сірий - споріднене антитіло.
Фігура 9: СОС, опосередкована гуманізованими СОЗ37 антитілами і їх варіантами на клітинах
Дауді. Здатність індукувати СОС на клітинах Дауді Ідс1-004-Н5І 2, Ідс1-004-НБІ 2-Е4З0С, Ідс1- 005-НІ112, Ідс1-005-Н112-Е430С, Ідс1-010-НБІ2, Іда1-010-Н5БІ 2-Е430Сс Іда1-016-Н512 і Іде1- 016-Н5І 2-Е4300 визначали іп міїго. Показані дані демонструють 95 лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають РіІ-позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 10: СОС, опосередкована 528.1 і 37.3 і їх варіантами, і СОС у клітинах Дауді, опосередкована гуманізованими СО37 антитілами з різними мутаціями, які посилюють взаємодію Ес-Ес, на клітинах Дауді. (А) Здатність індукувати СОС на клітинах Дауді Ідс1-с28.1,
Ідс1-с228.1-Е430С, Ідса1-37.3 ії Ід51-37.3-ЕЄ4300 визначали іп міго. Показані дані демонструють 95 лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі- позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії. (8-С) Здатність індукувати СОС на клітинах Дауді (А) Іде1-010-Н5БІ 2-К4098-Е430С, Ідс11-010-Н5БІ 2-ЕЗ345В8-
К409В, Іда1-010-Н5І 2-Е345К-К4098, Ідс1-010-Н5І 2-К4098-Е4305, Ідс1-010-Н5І2-ККОХ і (В)
Ідс1-016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е430С, ІдД21-016-Н5І 2-Е345К-Е405І, Ідс1-016-Н5БІ 2-Е405І -Е4305 і 016-Н5І2-Е3458-Р405І визначали іп мійго. Показані дані демонструють 9о лізису (максимальний лізис при концентрації антитіл 10 мкг/мл), визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі- позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії, для одного репрезентативного експерименту. Планки похибок указують на варіацію в експерименті (виконують у двох повторностях).
Фігура 11: СОС, опосередкована варіантами гуманізованого антитіла Ідс1-016-Н512 на клітинах Дауді. Здатність індукувати СОС на клітинах Дауді Ідс1-016-Н5І 2, Ідс11-016-Н5БІ 2-
Зо Е4ЗО0С, ІдС1-016-Н5БІ 2-Е405І -Е4300 ії Ідб1-016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е4300 була визначена іп міго. Показані дані демонструють 9о лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі-позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 12: СОС, опосередкована біспецифічними антитілами СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, СО37-антитілами (комбінацією) з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, і одновалентними антитілами, що зв'язують СОЗ37, з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, на клітинах Дауді; і СОС активність варіантів антитіл СОЗ37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-
Ес, і їхні комбінації на клітинах ОСІ-І у-7. (А) Здатність індукувати СОС на клітинах Дауді р5іІдс1- 016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е430сх005-НІ11 2-К4098-Е430С, Іас11-005-Н112-Е430С, Іда1-016-Н5І 2-
Е4З0С, комбінації Ідс1-005-Н1І 2-К4098-Е4300 плюс Ідс1-016-Н5І 2-Е405І -Е430С, вда 1-612-
Е405І-Е430сх005-НІ112-К4098-Е4300 ої 0 р5Іде1-016-Н51І 2-І 2905-4051 -Е430схр12-КА098-
Е430б, і (В) Б51д1-016-НБІ 2-І 6905-4051 -Е430сх010-Н5І 2-К4098-Е430С, Тдс1-010-Н5І 2-
Е4зО0Сс, Ідс1-016-Н5БІ 2-Е4300, комбінації Ідс1-010-Н5І 2-Е430б плюс 1Ідс1-016-Н5І2-Е4З0С, р5Іда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430схр12-КА4098-Е4300 і Б519051-612-Е405І -Е430сх010-Н5І 2-
К4098-Е4300 була визначена іп мійго. Показані дані демонструють 95 лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі- позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії. (С) Здатність до індукції клітин ОСІ-Гу-7 біспецифічного антитіла сО037 р5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е4300х010-Н5І 2-К4098-Е4з0О, Сб037 моноспецифічних двовалентних (моноклональних) антитіл 19д(51-010-Н5І 2-Е430с, Ідс1-016-
Н5БІ2-Е4300, комбінації Ідос1-010-Н5І12-Е4300 плюс /Ідс1-016-Н5І2-Е4300, одновалентних
СО37 антитіл р5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-Е405І -Е430схр12-К4098-Е430с, /-Б51901-612-Е405І -
Е4З0сіхО10-Н5БІ 2-КА098-Е430С і комбінації р5Іде1-016-Н5І 2-і 2905-4051 -Е430схр12-К4098-
Е4300 плюс Б51де1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 оцінювали іп міго. Показані дані демонструють 95 лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі- позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії. (Ю) Значення ЕС5О0 індукції СОС за допомогою Б5Ідсе1-016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е430сх012-К4098-Е4300 плюс р5Іда1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4305 і Ід1-010-Н5І 2-Е4306 плюс Ідс1-016-Н5І 2-
Е430б, як визначено в 2 незалежних експериментах. (у Значення ЕС5О індукції СОС за допомогою Б5Ід(е1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5І 2-К4098-Е4306 і Ідс1-010-Н5І 2-
Е4300 плюс Ідс1-016-Н5І 2-Е4300, визначені в З незалежних експериментах. бо Фігура 13: СОС, опосередкована біспецифічними СО37 антитілами й біспецифічними СО37 антитілами з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес на клітинах Дауді. Здатність індукувати
СОС на клітинах Дауді (А) Б5Ід(е1-016-Н5БІ 2-Е405І х005-НІ11 2-К409Е і р5Іде1-016-Н5І 2-І С905-
Е405І -Е430с1х005-Н1І 2-КА098-Е4300, ї (В). б5Ідсат1 -016-Н5І 2-Е405І х010-Н5І 2-К409К і р5Ідос1- 016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5І 2-КА409А8-Е430с о визначали іп міго. Показані дані демонструють о лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі-позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 14: СОС, опосередкована біспецифічними СО37 антитілами з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, СО37 антитілами (комбінацією) з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, і одновалентними з'єднувальними СОЗ37 антитілами з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, на первинних ХЛЛ пухлинних клітинах. Здатність індукувати СОС на первинних пухлинних клітинах
ХЛЛ (пацієнт: ММ-ВМОО091, із уперше поставленим діагнозом/без лікування (ВМ - отримані з кісткового мозку)) для (А) Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх005-НІ11 2-К4098-Е43З0а, Іда1- 005-Н11 2-К4098-Е4З0С, Іда1-016-Н5І 2-Е405І -Е4300, комбінації Ідс1-005-Н11 2-К4098-Е430с плюс Ідсе1-016-Н5І 2-Е405І -Е430Сс, Б5Ід21-612-Е405І -Е4300х005-Н11 2-К4098-Е430 і Б5ІдС1- 016-Н5БІ2-І 2905-4051 -Е430схЬ12-К4098-Е430О, її 0 (8В) 0/0 р5іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -
Е4З0сіхО10-Н5БІ 2-КА098-Е4З0С, Іда1-010-Н5І1 2-Е430С, ІД21-016-Н5І 2-Е4306, комбінації Ідс1- 010-Н5І2-Е430б плюс о Ідс1-016-Н512-Е4300, 0 Б5Ід01-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430схБ12-
К4098-Е4300 і реІдвс1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 визначали іп міго. Показані дані демонструють 96 лізису, визначений шляхом вимірювання відсотка мертвих клітин (які відповідають Рі-позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 15: СОС, опосередкована біспецифічним СО37 антитілом з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, на клітинних лініях В-клітинної лімфоми. Здатність Б51дсе1-016-Н5І 2-І 2905-
Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 при концентрації 10 мкг/мл індукувати СОС у ряді ліній клітин В-лімфоми визначали іп міїго. Рівні експресії СО37 визначали кількісною проточною цитометрією, і вони представлені у вигляді молекул на клітину, середнє значення ж 50 для 2 експериментів. Білі стовчики вказують на сприйнятливість до СОС (лізис »10 95, середнє значення у 2 експериментах), опосередкований бБ5ідсат-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430Ссх010-
Н5ЬІ2-К4098-Е4300, чорні стовчики вказують на несприйнятливість до СОС («10 905 лізис, середнє значення від 2 експериментів), опосередковану Б51Іде1-016-Н5І 2-І 0905-4051 -
Е4З0СсіхО10-Н5БІ 2-КА098-Е4зЗ0С0.
Фігура 16: АЮСС, опосередкована біспецифічними СО37 антитілами з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, СЮО37 антитілами (комбінаціями) з мутацією, яка посилює взаємодію
Ес-Ес, і одновалентними з'єднувальними СО37 антитілами з мутацією, яка посилює взаємодію
Ес-Ес, на клітинах Дауді й клітинах Каїї. Здатність індукувати АОСС (А) Б51д(1-016-Н5І 2-І С905-
Е405І -Е430с1х005-Н1І 2-К4098-Е430Сс, /- да1-005-Н112-К4098-Е430с, / Іде1-016-Н5І 2-Е405І -
Е43005 і комбінації Ід(е1-005-Н11 2-К4098-Е4300 плюс Ідс1-016-Н5І 2-Е405І -Е430О на клітинах
Дауді, і (В) Б5Іда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е430с, дат-010-Н5І 2-
Е4ЗО0С, Іде 1-016-Н5БІ 2-Е4305 і комбінації Ід1-010-Н5І 2-Е4300 плюс Ідс1-016-Н5І 2-Е4300 на клітинах Дауді, і (С) Б51де1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5БІ 2-К4098-Е4З0С, Іда1-010-
Н5БІ2-Е430с, Ідс1-016-НБІ2-Е4300, комбінації ІдсС1-010-Н512-Е4300 плюс 1Ідс1-016-Н5І 2-
Е4з0О, рзіда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх512-К4098-Е4300 і р5Іде1-612-Е405І -
Е4З0сіхО10-Н5І 2-КА098-Е4300 на клітинах Ка|ї визначали іп мйго з використанням аналізу вивільнення хрому. Показані дані є 95 специфічного лізису; планки похибок указують на варіації в аналізі, з 5 повторностями (А, В) або 6 повторностями (С) на точку даних.
Фігура 17: Кількісне визначення рівнів експресії СО37, С046, СО55 ії СО59 на пухлинних клітинах (А) ХЛЛ, (В) ФЛ, (С) МКЛ або (0) ДКБКЛ. Рівні експресії на пухлинних клітинах визначали проточною цитометрією. Кількість антигену показана як здатність зв'язування антитіл.
Фігура 18: СОС, опосередкована біспецифічним СО37 антитілом з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, на первинних пухлинних клітинах пацієнтів із ХЛЛ, ФЛ, МКЛ, ДКЕКЛ або В-НХЛ (без додаткової класифікації). Здатність р51де1-016-Н5І 2-І 2905-Е405І х010-Н5І 2-К4098-Е430С індукувати СОС на пухлинних клітинах, отриманих від пацієнтів з (А) ХЛЛ, (В) ФЛ і (С) МКЛ,
ДКБКЛ або В-НХЛ (без додаткової класифікації) визначали проточною цитометрією. Індукція
СОС представлена як відсоток лізису, який обумовлений часткою 7-ААО-позитивних пухлинних клітин, з використанням 100 мкг/мл (А і В) або 10 мкг/мл (С) р5Ідс1-016-Н5І 2-І С905-Е405І хО10-
НО 2-К4098-Е4З0С.
Фігура 19: Зв'язування біспецифічного СО37 антитіла з мутацією, яка посилює БЕс-Ес взаємодію, з В-клітинами в крові людини або яванського макака. Зв'язування мічених АІеха-488 р5Іда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5БІ 2-КА098-Е4305 з В-клітинами в крові (А) людини бо або (В) яванського макака визначали методом проточної цитометрії. Мічений АІеха-488 Ідс1-
р12 використовували як антитіло негативного контролю. Дані представлені у вигляді середніх геометричних значень інтенсивності флуоресценції А488 для одного репрезентативного донора/тварини. Планки похибок показують варіацію в експерименті (вимірювання у двох повторностях).
Фігура 20: Цитотоксичність біспецифічного СЮО37 антитіла з мутацією, яка посилює Ес-Ес взаємодію, і моноклонального СЮОЗ7-специфічного антитіла з посиленою Есук-взаємодією, відносно В-клітин крові людини або яванського макака. (А) Цитотоксичність Б519д1-016-Н5БІ 2-
І С905-Е405І -Е430Ссх010-Н5БІ 2-К4098-Е4300 і І9у61-0037-82-52390-І332Е для В-клітин крові людини й (В) рб5Іда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е4300 для В-клітин крові яванського о макака визначали в аналізі цитотоксичності в цільній крові. Ідс1-р12 використовували як негативне контрольне антитіло. Дані представлені як 96 виснаження В- клітин для одного репрезентативного донора/ тварини. Планки похибок показують зміни в експерименті (вимірювання у дві повторностях).
Фігура 21: СОС, опосередкована біспецифічним СО37 антитілом з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, СО20-специфічним антитілом або їх комбінацією. (А-О) Здатність індукувати
СОС на пухлинних клітинах, отриманих від 2 пацієнтів із ХЛЛ, для б51де1-016-Н5І 2-І С905-
Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е4300, офатумумаба або їх комбінації, у зазначених концентраціях визначали ех мімо. Дані представлені як 9о життєздатних В-клітин.
Фігура 22: Співвідношення доза-ефект для тритижневих доз р5Ідсое1-016-Н5І 2-І 2905-Е405І -
Е4З0сіхО10-Н5БІ 2-К4А098-Е4300 на моделі УММ-3. (А) Пухлинний ріст ксенотрансплантатів УММ-
З після лікування різними дозами Б5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5БІ 2-К4А098-
Е4300 або антитіла для контролю ізотипа (Ідс1-012). Середнє значення й ЗЕМ кожної групи (п-10) показані для кожного моменту часу. (В) Розмір пухлини на мишу в день 25. Середнє значення й 5ЕМ зазначені для кожної групи лікування. Відмінності були проаналізовані за допомогою тесту Манна-Уїтні. Статистично достовірні відмінності були визначені в такий спосіб: б-р 01; - р «0,001.
Фігура 23: Співвідношення доза-ефект для тритижневих доз р5Ідсое1-016-Н5І 2-І 2905-Е405І -
Е4З0сіхО10-Н5БІ 2-К4А098-Е4300 на моделі Рашцайї-Інс. (А) Ріст пухлини (визначений за активністю люциферази, біолюмінесценцією) ксенотрансплантатів Юацаі-ІШс після обробки різними дозами рзіда1-016-Н5І 2-І 6905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 або антитіла контролю ізотипа (дс1-012). Середнє значення й ЗЕМ кожної групи (п--9) показані для кожного моменту часу. (В)
Активність люциферази на мишу на 36 день. Середнє значення й 5ЕМ зазначені для групи лікування. Відмінності були проаналізовані однобічним дисперсійним аналізом, без виправлення найменшої значимої різниці Фішера. Статистично достовірні відмінності були зазначені в такий спосіб: 77 - р.«0,01; и - р «0,001.
Фігура 24: Концентрації в плазмі Б51де1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-КА09В8-
Е430с і ІдбС1-612 після внутрішньовенної ін'єкці мишам 5СІО. Мишам 5СІО уводили внутрішньовенно одну дозу (А-В) 100 мкг (5 мг/кг) або (С-О) 500 мкг (25 мг/кг) Б51д(1-016-Н5БІ 2-
І С905-Е405І -Е430Ссх010-Н5БІ 2-К4098-Е43005 або Ідс1-612.
Фігура 25. Аналіз зв'язування СО37 антитіл з СОЗ37 варіантами з аланіновими мутаціями в позаклітинних доменах. 2-оцінку (кратна зміна) визначали як а5 (нормалізоване 9МЕГаа положення)|-м)/б, де н ії с - середнє значення й стандартне відхилення (50) нормалізованого
ОМРЇ усіх мутантів. Залишки, у яких значення 7-оцінки було нижче -1,5 (зазначене пунктирною лінією), вважалися "мутантами із втратою зв'язування". Цифри над х-віссю відносяться до амінокислотних положень. Зверніть увагу, що х-вісь не є безперервною: ліва частина (до пунктирної лінії) осі є залишками в невеликій позаклітинній петлі людського СОЗ37, які не є аланінами або цистеїнами; права частина осі є залишками у великій позаклітинній петлі людського СОЗ37, які не є аланінами або цистеїнами. Пунктирна лінія позначає 7-оцінку (кратна зміна) -1,5.
Фігура 26 СОС, опосередкована сумішами СО37 антитіл з мутацією, яка посилює взаємодію
Есо-Бс, плюс клінічно встановлених продуктів СО20 антитіл, на клітинах Каїї. СОс- опосередкований лізис клітин Каїї (95 лізису, виражений як Рі-позитивна клітинна фракція, як визначено за допомогою проточної цитометрії) для серій розбавлень концентрації антитіл 1:0, 3:1, 1:11, 3:1 і 01 сумішей антитіл (кінцева концентрація 10 мкг/мл) для СО37 антитіл з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, плюс стандартні продукти СО20 антитіл: МабТнега (ритуксимаб),
Аглета (офатумумаб) і сагума (обінутузумаб, СА101): (А) суміші з Ідс1-37.3-Е4300; (В) суміші з
Ідс1-с28.1-Е4300; (С) суміші з Ід1-004-Е4300; (0) суміші з Ід1-005-Е4300; (Е) суміші з Ідс1- 010-Е4305 і (Р) суміші з Ідс1-016-Е4300.
Докладний опис винаходу бо Визначення
Термін "СО0О37", який використовується у даній заявці, відноситься до лейкоцитарного антигену СО37, також відомого як ОРБ52-40, тетраспанін-2б і Т5РАМ2б, який є сильно глікозильованим трансмембранним білком із чотирма трансмембранними доменами (ТМ) і одним малим і одним більшим позаклітинним доменом. Білок Ното з5арієп5, тобто людський білок СО37, кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка кодує амінокислотну послідовність, показану в ЗЕО ІЮО МО: 62 (білок СО37 людини: Опіргоїкр/5м/і55-Ргої Р11049). У цій амінокислотній послідовності залишки з 112 до 241 відповідають великому позаклітинному домену, залишки з 39 до 59 - малому позаклітинному домену, тоді як інші залишки відповідають трансмембранним і цитоплазматичним доменам. Білок Масаса Памісціагі5, тобто білок яванського макака СО37 кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну послідовність, показану в ЗЕО ІЮ МО: 63 (білок СЮО37 яванського макака: інвентарний номер
Сепрапк ХР 005589942). Якщо це не суперечить контексту, термін "СО37" означає "людський
СО37". Термін "С0О37" включає будь-які варіанти, изоформи й видові гомологи СОЗ37, які природно експресуються клітинами, включаючи пухлинні клітини, або які експресуються на клітинах, трансфікованих геном або КкДдНК СО37.
Термін "людський СО20" або "СО20" відноситься до людського СО2О (піргоїкр/5м/і55-Ргої
МоР11836) і включає будь-які варіанти, ізоформи й видові гомологи СО20, які природно експресуються клітинами, включаючи пухлинні клітини, або експресуються на клітинах, трансфікованих геном або КДНК СО20. До видових гомологів відносяться СО2О макаки-резус (Масаса тиїана; ОпіргоїКкр/Зм/із5-Ргої Мо НОУХРІ) і яванського макака СО20 (Масаса Памісшагів).
Терміни "антитіло, яке зв'язує СЮО37", "анти-СОЗ37-антитіло", "СО37-з'єднувальне антитіло", "б037-специфічне антитіло", "СО37 антитіло", які можуть використовуватися в даній заявці як взаємозамінні, відносяться до будь-якого антитіла, яке зв'язує епітоп на позаклітинній частині
С037.
Термін "антитіло" (Ат) у контексті даного винаходу відноситься до молекули імуноглобуліну, фрагменту молекули імуноглобуліну або її похідного, яке має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном за типових фізіологічних умов зі значним періодом напівжиття, таким як щонайменше приблизно 30 хвилин, щонайменше приблизно 45 хвилин, щонайменше приблизно одна година, щонайменше приблизно дві години, щонайменше приблизно чотири години, щонайменше приблизно 8 годин, щонайменше приблизно 12 годин, приблизно 24 години або більше, приблизно 48 годин або більше, приблизно 3, 4, 5,6, 7 або більше днів тощо, або будь-який інший відповідний функціонально визначений період (такий як час, достатній для індукції, стимуляції, посилення й/або модуляції фізіологічної відповіді, пов'язаної зі зв'язуванням антитіла з антигеном і/або час, достатній для того, щоб антитіло забезпечило ефекторну активність). Варіабельні області важкого й легкого ланцюгів молекули імуноглобуліну містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл (Ат) можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (такі як ефекторні клітини) і компонента системи комплементу, такі як С1д, перший компонент у класичному шляху активації комплементу. Як зазначено вище, термін "антитіло" у даному документі, якщо не зазначено іншого, або явно не суперечить контексту, включає фрагменти антитіла, які є антигензв'язующими фрагментами, тобто зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може виконуватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади антигензв'язувальних фрагментів, які охоплюються терміном "антитіло", включають (ї) фрагмент Рар' або Раф, одновалентний фрагмент, який складається з доменів Мі,
МН, СІ ї СНІ, або одновалентне антитіло, як описано в УМО2007059782 (СептарБб); (ії) Е(аб)»2 фрагменти, двовалентні фрагменти, що містять два Рар-фрагмента, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; (ії) фрагмент Га, який складається власне з доменів МН і СНІ; (ім) фрагмент Ем, який складається власне з доменів МІ. і МН одного плеча антитіла, (м) фрагмент дар (Умага еї аї., Маїшге 341, 544 546 (1989)), який складається власне з МН домена, і також називається доменним антитілом (Ної еї аї.; Тгепаз Віоїесппої. 2003 Мом; 21 (11): 484-90); (мі) камелідні або нанотіла (Кемеїб5 еї аї; Ехреп Оріп Віо! Тег. 2005 ап; 5 (1): 111-24) ії (мії) ізольована гіперваріабельна ділянка (СОК). Крім того, хоча два домена фрагмента Гм, МІ. ї МН кодуються окремими генами, вони можуть бути об'єднані з використанням рекомбінантних методів за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє їм бути утвореними у вигляді єдиного білкового ланцюга, у якому МІ. і області МН спаровуються з одержанням одновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (5СЕм), див., наприклад, Віга еї аІ.,, Зсіепсе 242, 423 426 (1988) і Нивіоп еї аі, РМАЗ ОБА 85, 5879 5883 (1988)). Такі одноланцюгові антитіла охоплюються терміном антитіло, якщо не вказано іншого або чітко не 60 зазначено в контексті. Хоча такі фрагменти, як правило, включені в значення антитіла, вони в сукупності й кожний незалежно є унікальними ознаками даного винаходу, що демонструють різні біологічні властивості й корисність. Ці та інші корисні фрагменти антитіл у контексті даного винаходу, а також біспецифічні формати таких фрагментів обговорюються тут далі. Для біспецифічних антитіл запропонованих винаходом такі фрагменти пов'язані з доменом Ес.
Також слід розуміти, що термін антитіло, якщо не зазначено іншого, також включає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (мАт), антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла й гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (антигензв'язувальні фрагменти), отримані будь-яким відомим способом, таким як ферментативне розщеплення, пептидний синтез і рекомбінантні методи. Отримане антитіло може мати будь-який ізотип.
Термін "біспецифічне антитіло" відноситься до антитіла, яке має специфічність щонайменше для двох різних епітопів, які зазвичай не перекриваються. Такі епітопи можуть перебувати на одній або різних мішенях. Для даного винаходу епітопи перебувають на одній і тій же мішені, а саме СО37. Приклади різних класів біспецифічних антитіл, що містять область Ес, включають асиметричні біспецифічні молекули, наприклад, ІдсС-подібні молекули з комплементарними доменами СНЗ; і симетричні біспецифічні молекули, наприклад рекомбінантні Ідс-подібні молекули з подвійним націлюванням, де кожна антигензв'язувальна область молекули зв'язує щонайменше два різні епітопа; але не обмежуються ними.
Приклади біспецифічних молекул включають ТгіотарФ (Топ РПапта/ Егезепіи5 Віоїеси,
МО/2002/020039), Кпобрв-іп-Ноїез (Сепепієснй, УУО1998/50431), Ст55МАБ5 (НКоспє, МО 2009/080251, УМО 2009/080252, МО 2009/080253), електростатично підібрані Ес-гетеродимерні молекули (Атдеп, ЕР1Т870459 і УУМО2009089004; Спидаі), 0О5201000155133; Опсотеа, УМО 2010/129304), 1 02-У (Сепепіесі), Оід-Тіло, Рід-Тіло й Тід-Тіло (Рпаптарбсіпе), сконструйоване обміном ланцюгів доменне тіло (ЗЕЕО-тіло) (ЕМО Серопо, ММО2007110205), біспецифічні Ідс і
Ідо2 (Ріїгег/Кіпаї, УМО 2011/143545), А7утеїгіс каркас (Хутемогкв/ Мегок, УМО2012058768), тар-
Ем (Хепсог, УМО 2011/028952), Хтаб (Хепсог), двовалентні біспецифічні антитіла (Коспе, МО 2009/080254), біспецифічні дос (Еїї І Шу), молекули ОиободуфФ (Септаб А/5, УМО 2011/131746),
Оеїйтар (Медіттипе, 052014/0348839), Вісіопісв (Меги5, МО 2013/157953), Моміттипе (кАбодіе5, УМО 2012/023053), ЕслЛадр (Кедепегоп, УМО 2010/151792), (01)-щ (1545К/ Ботапіїв),
Зо антитіла два-в-одному або Баре подвійної дії (Сепепіесй, АдімАт), тАбБ2 (Б-еїаг, МО 2008/003116), молекули 2уроду"м (7упдепіа),) СомХ-боду (СоуХ/ Ріїге), ЕупотАрз (Сомадеп/дапозеп Сііао), Ощшамаь (Ощша/їувз/ Коспе), іМмаб (Медіттипе), подвійний варіабельний домен (0М0)-ІУТМ (Аррої), дводоменні антитіла з подвійною головкою (пііемег; Запоїї Амепії5,
МО 2010/0226923), Тв2АЬ (Медіттипе/А7), В5АБ (7утодепеїйсз), НЕВСИГЕ5 (Віодеп Ідес,
И57,951,918), зсЕм-гібріди (Ссепепіесп/ Коспе, Момапів, ІІттипоМеадісв, Спапа7нои Адат Віоїєсн
Іпс, 10226, СМ), ТАБ (Коспе, УМО2012/025525, УМО2012/025530), ЗсЕм/Ес гібріди, ЗСОКРІОМ (Етегепі ВіозоїІшіоп5/Тгиріоп, 2утодепеїійс5/ ВМ5), Іпіегсеріог (ЕтегдепО), переорієнтовані антитіла з подвійною афінністю (Ес-ОАВТТМ) (МастосСепісз, МУО2008/157379, МО2010/080538),
ВЕАТ (СіІептаюк), бі-Оіабоду (ІМКЛопе/Еїї Шу) ії хімічно зшиті мАт (онкологічний центр
Каптапов), а також ковалентно злиті мАт (АЇММ Тпегарецшіїс5), але не обмежуються ними.
Термін "повнорозмірне антитіло" у контексті даного опису відноситься до антитіла (наприклад, вихідного або варіантного антитіла), яке містить усі константні й варіабельні домени важкого й легкого ланцюга, що відповідають тим, які зазвичай виявляються в антитілі дикого типу цього класу або ізотипа.
Термін "химерне антитіло", який використовується у даній заявці відноситься до антитіла, у якому варіабельна область отримана від якогось виду крім людини (наприклад, отримана від гризунів), а константна область отримана від іншого виду, такого як людина. Химерні антитіла можуть бути отримані за допомогою інженерії антитіл. "Інженерія антитіл" - це термін, який використовується для позначення різних видів модифікацій антитіл, який добре відомий фахівцеві в даній галузі техніки. Зокрема, химерне антитіло може бути отримане з використанням стандартних методик ДНК, як описано в Затьгоок еї аї., 1989, МоїІесшціаг Сіопіпо:
А Гарогаїюгтгу Мапиа!, Мем/ мМогК: Соїй 5ргіпд Нагрог І арогаїогу Ргеб55, Сп. 15. Таким чином, химерне антитіло може бути генетично або ферментативно сконструйованим рекомбінантним антитілом. Фахівцеві в даній галузі техніки відомо, як створити химерне антитіло, і таким чином, одержання химерного антитіла відповідно до даного винаходу може бути виконане іншими способами, ніж це описано в даному документі. Химерні моноклональні антитіла для терапевтичного застосування розроблені для зниження імуногенності антитіл. Вони звичайно можуть містити нелюдські (наприклад, мишачі) варіабельні області, які є специфічними до потрібного антигену, і домени важкого й легкого ланцюгів константної області антитіла людини. 60 Терміни "варіабельна область" або "варіабельні домени", які використовуються в контексті химерних антитіл, відносяться до області, яка включає СОК і каркасні області як важкого, так і легкого ланцюгів імуноглобуліну.
Термін "олігомер", як він використовується у даному документі, відноситься до молекули, яка складається з більш ніж одного, але обмеженого числа мономерних ланок (наприклад, антитіл), на відміну від полімеру, який, щонайменше в принципі, складається з необмеженої кількості мономерів. Типовими олігомерами є димери, тримери, тетрамери, пентамери й гексамери. Аналогічно, "олігомеризація", така як, наприклад, "гексамеризація", відповідно до даної заявки, означає, що відбувається збільшення розподілу антитіл і/або інших димерних білків, які містять області зв'язування мішені, згідно з винаходом, в олігомери, такі як гексамери.
Посилення утворення олігомерів, таких як гексамери, обумовлене підвищеною взаємодією Ес-
Ес після зв'язування з мембранозв'язаними мішенями.
Терміни "антигензв'язувальна область", "антиген-з'єднувальна область", "з'єднувальна область" або антигензв'язувальний домен, які використовуються у даній заявці, відносяться до області антитіла, яка здатна зв'язуватися з антигеном. Ця область зв'язування зазвичай визначається доменами УН і Мі. антитіла, які можуть бути додатково підрозділені на області гіперваріабельності (або гіперваріабельні області, які можуть бути гіперваріабельними за послідовністю й/або формою структурно визначених петель), які також називаються областями, які визначають комплементарність (СОК), що перемежовуються з областями, які є більш консервативними, і називаються каркасними областями (ЕК). Антиген може бути будь-якою молекулою, такою як поліпептид, наприклад, присутній на клітині, бактерії або віріоні, або в розчині. Терміни "антиген" і "мішень" можуть, якщо це не суперечить контексту, використовуватися як взаємозамінні в контексті даного винаходу.
Термін "мішень", як він використовується у даній заявці, відноситься до молекули, з якою зв'язується антигензв'язувальна область антитіла. Мішень включає будь-який антиген, на який спрямовано створене антитіло. Терміни "антиген" і "мішень" можуть відноситися до антитіла як взаємозамінні та мати те саме значення й ціль стосовно будь-якого аспекту або варіанта здійснення даного винаходу.
Термін "гуманізоване антитіло", як він використовується у даній заявці, відноситься до генно-інженерного антитіла, яке не є антитілом людини та містить константні домени людського антитіла й варіабельні домени нелюдського походження, модифіковані так, щоб вони мали високий рівень гомології послідовності з варіабельними доменами людини. Це може бути досягнуто шляхом прищеплення шести гіперваріабельних областей (СОК) антитіл, які не є антитілами людини і які разом утворюють ділянку зв'язування антигену, до гомологічної акцепторної каркасної області людини (ЕК) (див. М/О92/22653 і ЕРОб629240). Щоб повністю відновити афінність зв'язування й специфічність вихідного антитіла, може знадобитися заміна каркасних залишків вихідного антитіла (тобто антитіла, яке не є людським) у каркасних областях людини (зворотні мутації). Моделювання структурної гомології може допомогти ідентифікувати амінокислотні залишки в каркасних областях, які є важливими для з'єднувальних властивостей антитіла. Таким чином, гуманізоване антитіло може містити нелюдські послідовності СОК, первинно людські каркасні області, які за необхідності утримують одну або кілька амінокислотних зворотних мутацій у нелюдській амінокислотній послідовності, і повністю людські константні області. За необхідності, додаткові амінокислотні модифікації, які необов'язково є зворотними мутаціями, можуть застосовуватися для одержання гуманізованого антитіла із кращими характеристиками, такими як афінність і біохімічні властивості.
Гуманізовані антитіла можуть бути отримані з використанням імунізованих кроликів, гуманізації кролячих антитіл з використанням технології гуманізації зародкової лінії (СОК- щеплення) і, за необхідності, шляхом зворотної мутації залишків, які можуть бути критичними для властивостей зв'язування антитіл, як виявлено при структурному моделюванні залишків кролика. Може бути застосований скринінг потенційних Т-клітинних епітопів.
Термін "людське антитіло", як він використовується у даній заявці, відноситься до антитіл, які мають варіабельні й константні області, отримані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Людські антитіла можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються послідовностями імуноглобуліну людської зародкової лінії (наприклад, мутації, уведені шляхом випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп мійго або соматичною мутацією іп мімо). Однак термін "людське антитіло", як він використовується в даному документі, не призначений для включення антитіл, у яких послідовності СОК, отримані із зародкової лінії іншого виду ссавців, такого як миша, були прищеплені на каркасні послідовності людини.
Людські моноклональні запропоновані винаходом антитіла можуть бути отримані різними способами, включаючи звичайну методологію моноклональних антитіл, наприклад, стандартну бо методику гібридизації соматичних клітин Копіег ап Міїсїеїп, Майте 256: 495 (1975). Хоча процедури гібридизації соматичних клітин є кращими, у принципі, можуть бути використані інші способи одержання моноклональних антитіл, наприклад, вірусна або онкогенна трансформація
В-лімфоцитів або методики фагового дисплея з використанням бібліотек генів антитіл людини.
Придатною тваринною системою для одержання гібридом, які секретують людські моноклональні антитіла, є мишача система. Виробництво гібридоми в миші є дуже добре відпрацьованою процедурою. Протоколи й методи імунізації для виділення імунізованих спленоцитів для гібридизації відомі в даній галузі техніки. Партнери гібридизації (наприклад, мишачі мієломні клітини) і процедури гібридизації також відомі.
Людські моноклональні антитіла можуть бути отримані з використанням, наприклад, трансгенних або трансхромосомних мишей або кроликів, які несуть частини імунної системи людини, а не мишачої або кролячої системи.
Термін "імуноглобулін" відноситься до класу структурно споріднених глікопротеїнів поліпептидних ланцюгів, які складаються із двох пар, однієї пари легких (І) ланцюгів з низкою молекулярною масою й однієї пари важких (Н) ланцюгів, причому всі чотири зв'язані між собою дисульфідними зв'язками. Структура імуноглобулінів була добре охарактеризована. Див., наприклад, "Гипадатепіа! Іттипоіоду", Сп. 7 (Раці, МУ., ед., 2174 ей. Камеп Ргев55, М.У. (1989)).
Коротко, кожний важкий ланцюг зазвичай складається з варіабельної області важкого ланцюга (яка скорочено позначається тут як Мн або МН) і константної області важкого ланцюга (яка скорочено позначається тут як Сн або СН). Константна область важкого ланцюга звичайно складається із трьох доменів, СНІ, СН2 ії СНЗ. Кожний легкий ланцюг звичайно складається з варіабельної області легкого ланцюга (яка скорочено позначається тут як Мі або МІ) і константної області легкого ланцюга (яка скорочено позначається тут як Сі або СІ). Константна область легкого ланцюга звичайно складається з одного домена, СІ. Області МН і МІ. можуть бути додатково розділені на області гіперваріабельності (або гіперваріабельні області, які можуть бути гіперваріабельними за послідовністю й/або формою структурно визначених петель), які також називаються областями, що визначають комплементарність (СОР), які перемежовуються з областями, які є більш консервативними, каркасними областями (ЕК).
Кожна УН і МІ. звичайно складається із трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК!, СОКІ, ЕК2, СОМК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА (див. Також
Зо Споїйіа і Ге5К У. Мої. ВіоїЇ. 196, 901 917 (1987)). Якщо інше не зазначене або не суперечить контексту, послідовності СОК у даному документі ідентифікуються відповідно до правил ІМОСТ (Вгоснеї Х., Мис! Асіа5 Не. 2008; 36: М/503-508 і І еїгапс МР., Мисівїс Асіа5 Кезеагсп 1999; 27: 209-212; див. також інтернет - Пер адреса пир/Лумлму. тд ога/). Якщо інше не зазначене або це не суперечить контексту, посилання на амінокислотні положення в константних областях у даному винаході відповідає нумерації БО (Едеїтап еї аї., Ргос Маї! Асай 5сі О5 А. 1969 Мау; 63 (1): 78-85; Кабаї єї а!., "Зедиепсевз ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегевзі", БійНи Еайіоп. 1991 МІН
Рибіїсайоп Мо. 91-3242).
При використанні в даному документі, якщо це не суперечить контексту, термін « Рар-плече" або "плече" відноситься до однієї пари важкий ланцюг-легкий ланцюг і використовується тут як взаємозамінний з "половинними молекулами". Відповідно, "тсар-плече" включає варіабельні області важкого ланцюга й легкого ланцюга, а також константну область легкого ланцюга й константну область важкого ланцюга, який включає область СНІ, шарнір, область СН? і область СНЗ імуноглобуліну. "Область СНІ" відноситься, наприклад, до області людського антитіла ІдС1, яка відповідає амінокислотам 118-215 згідно з нумерацією ЕО. Таким чином, фрагмент Раб містить область зв'язування імуноглобуліну.
Терміни "область кристалізації фрагмента", "Рс область", "Ес фрагмент" або "Ес домен", які можуть використовуватися тут як взаємозамінні, відносяться до області антитіла, що містить, при розташуванні від амінокінця до карбоксикінця, щонайменше шарнірну область, домен СН2 і домен СНЗ. Ес область антитіла (дДс1 може, наприклад, бути отримана шляхом розщеплення антитіла дсС1 папаїном. с область антитіла може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (такі як ефекторні клітини) і компоненти системи комплементу, такі як СТд4, перший компонент у класичному шляху активації комплементу. Термін "шарнірна область", як він використовується у даній заявці, призначений для позначення шарнірної області важкого ланцюга імуноглобуліну.
Так, наприклад, шарнірна область людського антитіла І(дДс1 відповідає амінокислотам 216-230 згідно з нумерацією ЕО.
Термін "центральний шарнір" або "центральна шарнірна область", як він використовується у даній заявці, відноситься до чотирьох амінокислот, які відповідають положенням 226-229 людського ІдО1 антитіла. бо Термін "область СН2" або "домен СНІ", як він використовується у даній заявці, призначений для позначення області СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, наприклад, область СН2 людського антитіла 951 відповідає амінокислотам 231-340 згідно з нумерацією ЕЄО. Однак область СН2 також може бути кожним з інших ізотипів або алотипів, як описано в даній заявці.
Термін "область СНЗ" або "домен СНУ", як він використовується у даній заявці, призначений для позначення області СНЗ3 важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, наприклад, область СНЗ людського Ідст1антитіла відповідає амінокислотам 341-447 згідно з нумерацією ЕО. Однак область СНЗ також може бути кожним з інших ізотипів або алотипів, як описано в даній заявці.
Термін "ізотип", як він використовується у даній заявці, відноситься до класу імуноглобулінів (наприклад, ІдС1, Ідс2, Іде3, Ідс4, дО, ІдА, ЧЕ або ІдМ), який кодується генами константної області важкого ланцюга.
Термін "одновалентне антитіло" означає в контексті даного винаходу, що молекула антитіла здатна зв'язувати одну молекулу антигену й, отже, не здатна до зшивання антигену. "СО037 антитіло" або "анти-СОЗ37-антитіло" є антитілом, як описано вище, яке специфічно зв'язується з антигеном СОЗ37. "б037хС2О037 антитіло" або "анти-«СО37хСО37 антитіло" є біспецифічним антитілом, яке містить дві різні антигензв'язувальні області, одна з яких специфічно зв'язується з першим епітопом на антигені СОЗ37, а друга специфічно зв'язується з іншим епітопом на СО37.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло запропоноване винаходом є ізольованим. "Ізольоване біспецифічне антитіло", як використовується в даному документі, призначене для позначення біспецифічного антитіла, яке власне не містить інших антитіл, які мають різну антигенну специфічність (наприклад, ізольоване біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО37, власне не містить моноспецифічних антитіл, які специфічно зв'язуються з СЮОЗ37).
Термін "епітоп" означає білкову детермінанту, здатну зв'язуватися з антигензв'язувальною областю антитіла ("паратопом"). Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп молекул, таких як бічні ланцюги амінокислот або цукру, і звичайно мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні й неконформаційні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першим, але не з останнім, втрачається в присутності денатуруючих розчинників. Методи картування епітопів можуть
Зо визначати "структурні епітопи" або "функціональні епітопи". Структурні епітопи визначаються як ті залишки в структурі, які перебувають у прямому контакті з антитілом і можуть, наприклад, оцінюватися методами, заснованими на структурі, такими як рентгенівська кристалографія.
Структурний епітоп може містити амінокислотні залишки, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні антитіла, а також інші амінокислотні залишки, які не беруть безпосередньо участь у зв'язуванні, такі як амінокислотні залишки, які ефективно блоковані або покриті антитілом (іншими словами амінокислотний залишок перебуває в зоні дії антитіла). Функціональний епітоп визначається як ті залишки, які вносять енергетичний вклад у взаємодію, що зв'язує антиген- антитіло, і можуть бути, наприклад, оцінені за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу, такого як аланінове сканування (Сиппіпопат, ВС, 5 Умеїї5, УА (1993) Чоигпа! ої МоїІесшіаг Віоіоду;
СіІасквоп, Т. в М/еїІв, у). (1995) Зсієпсе, 267 (5196), 383-386). Функціональний епітоп може містити амінокислотні залишки, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні антитіла, а також інші амінокислотні залишки, які не беруть безпосередньої участі у зв'язуванні, такі як амінокислотні залишки, які викликають конформаційні зміни в розташуванні залишків, залучених у прямі взаємодії (Сгеепзрап, М. 5., 5 Оі Сега, Е. (1999) Маїшге Віоїесппоіоду, 17(10), 936-937). У випадку взаємодій антитіло-антиген функціональний епітоп може використовуватися для розрізнення молекул антитіл одна від одної. Функціональний епітоп може бути визначений з використанням методу аланінового сканування, як описано в Прикладі 17. Таким чином, амінокислоти в білку можуть бути заміщені аланінами, у результаті чого утворюється ряд мутантних білків, де зв'язування антигензв'язувальної області антитіла з мутантним білком знижується в порівнянні з білком дикого типу; зменшене зв'язування визначають як стандартизоване 0д (кратна зміна) (виражене у вигляді 7-оцінок), при цьому зв'язування зазначеного антитіла становить менше ніж 1,5, як зазначено в Прикладі 17.
Термін "моноклональне антитіло", як він використовується у даній заявці, відноситься до препарату молекул антитіла власне з єдиним молекулярним складом. Композиція моноклонального антитіла проявляє єдину специфічність зв'язування й афінність до конкретного епітопу. Відповідно, термін "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, які мають єдину специфічність зв'язування, які мають варіабельні й константні області, отримані з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Людські моноклональні антитіла можуть генеруватися гібридомою, яка включає В-клітину, отриману від трансгенної або 60 трансхромосомної тварини, що не є людиною, такої як трансгенна миша, яка має геном, що містить трансгенважкого ланцюга людини й трансгенлегкого ланцюга, злитий з іморталізованною клітиною.
Термін "зв'язування", як він використовується у даній заявці, у контексті зв'язування антитіла із заздалегідь визначеним антигеном звичайно є зв'язуванням з афінністью, яка відповідає Ко, рівному приблизно 105 М або менше, наприклад, 107 М або менше, наприклад, близько 109 М або менше, наприклад, близько 107 М або менше, близько 1079 М або менше, або близько 107!
М або навіть менше, якщо це визначене, наприклад, за допомогою технології Віоіауег
ІптепегоМетгу (ВІЇ) на приладі Осіеї НТХ з використанням антитіла як ліганда й антигену як аналізованої речовини, і де антитіло зв'язується із заздалегідь визначеним антигеном з афінністью, що відповідає Ко, яка щонайменше вдесятеро нижча, наприклад, щонайменше в 100 раз нижча, наприклад, щонайменше в 1000 раз нижче, наприклад, щонайменше в 10000 разів нижча, наприклад, щонайменше в 100000 разів нижча, ніж Ко зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, БСА, казеїном), відмінним від попередньо визначеного антигену або близького спорідненого антигену. Ступінь, у якому Ко зв'язування нижче, залежить від Ко антитіла, так що коли Ко антитіла дуже низький, то ступінь, у якому Ко зв'язування з антигеном нижчий, ніж Ко зв'язування з неспецифічним антигеном, може становити щонайменше 10000 раз (тобто антитіло є високоспецифічним).
Термін "Ко" (М), як він використовується у даному документі, відноситься до рівноважної константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. "Афінність", як це застосовується в даному документі, і "Ко" мають обернений зв'язок, тобто більш висока афінність позначає більш низький Ко, а більш низька афінність означає більш високий Ко.
Антитіло, яке "конкурує" або "перехресно конкурує", як це застосовується в даному документі, використовується як взаємозамінний термін з антитілом, яке "блокує" або "перехресно блокує" інше антитіло, тобто еталонне антитіло, і означає, що антитіло й еталонне антитіло конкурують за зв'язування з людським СО37, наприклад, як визначено в аналізі, описаному в Прикладі 7 даного документа. В одному варіанті здійснення антитіло проявляє зв'язування менш ніж 5095, таке як менше ніж 2095, таке як менше ніж 1595 від його максимального зв'язування в присутності конкуруючого еталонного антитіла.
Зо Як використовується в даному документі, антитіло, яке "не конкурує" або "не конкурує перехресно" або "не блокує" з іншим антитілом, тобто еталонним антитілом, означає, що антитіло й еталонне антитіло не конкурують за зв'язування з людським СО37, наприклад, як визначено в аналізі, описаному в Прикладі 7 даного документа. Для деякої пари антитіла й еталонного антитіла відсутність конкуренції в аналізі із Прикладу 7 спостерігається тільки тоді, коли одне антитіло пов'язане з антигеном у клітині, а інше використовується для конкуренції, а не навпаки. Термін "не конкурує" або "неконкурентне" або "неблокувальне" як він використовується в даному документі, також призначений для охоплення таких комбінацій антитіл. В одному варіанті здійснення антитіло проявляє зв'язування щонайменше 75 95, таке як щонайменше 80 95, таке як щонайменше 85 95 від його максимального зв'язування в присутності еталонного антитіла.
Термін "мутація, яка посилює взаємодію Ес-Ес", як він використовується у даній заявці, відноситься до мутації в (до антитілах, яка посилює взаємодію Ес-Ес між сусідніми антитілами
Іо, які пов'язані з мішенню на клітинній поверхні. Це може привести до посилення утворення олігомерів, такого як, наприклад, гексамеризація антитіл, пов'язаних з мішенню, у той час як молекули антитіл залишаються мономерними в розчині, як описано в заявках УМО 2013/004842;
УМО 2014/108198, які таким чином включені тут як посилання.
Термін "ефекторні Ес функції" або "Ро-опосередковані ефекторні функції", як він використовується у даній заявці, призначений для позначення функцій, які є наслідком зв'язування поліпептиду або антитіла з його мішенню, такою як антиген, на клітинній мембрані, і наступної взаємодії Ес-домена дб з молекулами вродженої імунної системи (наприклад, розчинними молекулами або мембранозв'язаними молекулами). Приклади ефекторних функцій
Ес включають (ії) С1д-зв'язування, (ії) активацію комплементу, (ії) комплемент-залежну цитотоксичність (СОС), (ім) антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АОСС), (м) зв'язування з Ес-гама рецептором, (мі) антитілозалежний клітинний фагоцитоз (АОСР), (мії) комплемент-залежну клітинну цитотоксичність (СОСС), (мії) посилену комплементом цитотоксичність, (їх) зв'язування з рецептором комплементу опсонізованого антитіла, опосередковане антитілом, (х) опсонізацію та (хі) комбінацію кожного з (Її) - (хХ).
Термін "гетеродимерна взаємодія між першою й другою областями СНЗ", як він використовується в даному документі, відноситься до взаємодії між першою областю СНЗ 60 першої Ес-області й другою областю СНЗ другої Ес-області в першому-СНЗ/другому-СНЗ гетеродимерному білку. Біспецифічне антитіло є прикладом гетеродимерного білка.
Термін "гомодимерні взаємодії першої й другої областей СН3З", як він використовується в даному документі, відноситься до взаємодії між першою областю СНЗ та іншою першою областю СНЗ у гомодимерному білку перший-СНЗ/перший-СНЗ і взаємодії між другою областю
СНЗ та іншою другою областю СНЗ у гомодимерному білку другий-СНЗ/другий-СНЗ.
Моноклональне антитіло є прикладом гомодимерного білка.
Термін "відновлювальні умови" або "відновлювальне середовище" відноситься до стану або середовища, у якому субстрат, такий як, наприклад, залишок цистеїна в шарнірній області антитіла, з більшою ймовірністю стане відновленим, ніж окисненим.
Даний винахід також відноситься до біспецифічних антитіл, які містять функціональні варіанти МІ. областей, МН областей, або однієї або декількох СОК з біспецифічних антитіл із прикладів. Функціональний варіант МІ, МН або СОК, який згадується у контексті біспецифічного антитіла, як і раніше дозволяє кожній області біспецифічного антитіла зберігати щонайменше значну частку (щонайменше близько 50 95, 60 95, 70 95, 80 95, 90 95, 95 95 або більш) афінності й/"або специфічності/селективності вихідного біспецифічного антитіла, і в деяких випадках таке біспецифічне антитіло може бути пов'язане з більшої афінністю, селективністю й/або специфічністю, ніж вихідне біспецифічне антитіло. Такі функціональні варіанти зазвичай зберігають значну ідентичність послідовності з вихідним біспецифічним антитілом. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій, які спільно використовуються у послідовностях (тобто, 95 гомології - кількість ідентичних позицій/загальна кількість позицій х 100), беручи до уваги кількість гепів і довжину кожного гепа, який необхідно ввести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями може, наприклад, бути визначений з використанням алгоритму Е. Меуег5 апа Ум. Мійег, Сотриї. Аррі. Віовзсі 4, 11-17 (1988), який був включений у програму АГІСМ (версія 2.0), використовуючи таблицю вагових залишків РАМ120О, штраф за продовження гепа 12 і штраф за відкриття гепа 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями може бути визначений з використанням алгоритму
МееаІетап апа Уу/ипзси, у. Мо!. Віо!. 48, 444 453 (1970).
Типові варіанти включають ті варіанти, які відрізняються від УН областей і/або МІ і/або СО
Зо послідовностей вихідного біспецифічного антитіла в основному консервативними замінами; наприклад, 10, наприклад, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 заміна у варіанті, є консервативними замінами амінокислотних залишків. Бажано, щоб варіант містив не більше 10 амінокислотних замін в області МН і/або МІ. вихідного антитіла, наприклад, не більше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або не більше 1 амінокислотної заміни. Бажано такі заміни є консервативними замінами, особливо якщо заміни перебувають у послідовності СОБ.
У контексті даного винаходу консервативні заміни можуть бути визначені замінами в межах класів амінокислот, відображених у наступній таблиці:
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Азр (0) і Сім, (Е) уз (К), Аго (БК) і Нів (Н)
Зег (5), Тиг (Т), Авп (М) і Сіп. (С)
СІу (С), Аа (А), Ма! (М), І-еи (І і Пе (І)
Суз (С), Ме! (М) і Рго (Р)
Рне (Є), Туг (У) і Тгр (МУ)
У контексті даного винаходу, якщо не зазначено іншого, для опису мутації використовуються наступні позначення: (ї) заміна амінокислоти в даному положенні реєструється, наприклад, як
К409К, що означає заміну лізина в положенні 409 на аргінін; і (ї) для конкретних варіантів використовуються конкретні трьох- або однобуквені коди, включаючи коди Хаа і Х для позначення будь-якого амінокислотного залишку. Таким чином, заміна лізина аргініном у положенні 409 позначена як К409К, а заміна лізина будь-яким амінокислотним залишком у положенні 409 позначена як К409Х. У випадку делеції лізина в положенні 409 це позначається як К4097У.
Термін "рекомбінантная клітина-хазяїн", як він використовується у даній заявці, (або просто "клітина-хазяїн") призначений для позначення клітини, у яку був уведений вектор експресії, наприклад, вектор експресії, який кодує запропоноване винаходом антитіло. Рекомбінантні клітини-хазяї включають, наприклад, трансфектоми, такі як клітини СНО, СНО-5, НЕК, НЕК293,
НЕК-293РЕ, Ехрі293Е, РЕК.Сб або М50, і лімфоцитарні клітини.
Термін "лікування" відноситься до введення ефективної кількості терапевтично активного біспецифічного запропоновного даним винаходом антитіла з метою ослаблення, полегшення, припинення або усунення (лікування) симптомів або патологічних станів.
Термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості, ефективної в дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість біспецифічного антитіла може мінятися залежно від таких факторів, як патологічний стан, вік, стать й маса тіла індивідуума, та здатність біспецифічного антитіла викликати необхідну відповідь в індивідуума.
Терапевтично ефективна кількість також є кількістю, при якій будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіла або частини антитіла виражені меншою мірою, ніж терапевтично корисні ефекти.
Термін "антиіїідіотипове антитіло" відноситься до антитіла, яке розпізнає унікальні детермінанти, звичайно пов'язані з антигензв'язувальною ділянкою антитіла.
Варіанти здійснення винаходу
У першому основному варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, яке містить першу й другу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з СЮО37 людини, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 62, і першу й другу Ес область імуноглобуліну людини, де перша й друга антигензв'язувальні області зв'язують різні епітопи на СО37, і де перша й друга Ес області містять одну або кілька амінокислотних мутацій, які посилюють взаємодію с-Ес між біспецифічними антитілами при зв'язуванні з мембранозв'язаними мішенями у порівнянні з Ес-
Ес взаємодією між біспецифічними антитілами, які не мають зазначених мутацій. Таким чином, забезпечується біспецифічне анти-СО37-антитіло, яке зв'язує два різні епітопа на СО37. Бажано два епітопа є такими, що обидва з'єднувальних плеча можуть зв'язувати той самий білок і таким чином, що кожне з'єднувальне плече не блокує зв'язування іншого плеча й/або не конкурує за зв'язування з іншим з'єднувальним плечем біспецифічної молекули. Крім того, біспецифічне антитіло містить мутацію, яка посилює взаємодію Бо-Бс між двома або декількома біспецифічними антитілами запропонованими винаходом. Це приводить до того, що біспецифічні молекули утворюють олігомери при зв'язуванні з СО37, експресованим на плазматичній мембрані клітинки-мішені. Взаємодія Ес-Бс посилюється в порівнянні з
Зо молекулою, яка є ідентичною, за винятком мутації. Бажано мутація перебуває в Ес області біспецифічної молекули. В одному варіанті здійснення це є однією амінокислотною заміною в Ес області біспецифічної молекули. Бажано це є симетричною заміною, що означає, що обидві половинні молекули (вихідні антитіла) мають мутацію. Ще однією перевагою даного біспецифічного антитіла є те, що воно має поліпшені ефекторні функції СОС і/або АОСС у порівнянні з ідентичною біспецифічною молекулою, що не має мутації, яка посилює взаємодія
Ес-Ес. Неочікувано біспецифічна молекула також має поліпшені СОС і/або АрСС у порівнянні з комбінацією двох вихідних моноклональних антитіл анти-СО37, які мають мутації для посилення
Ес-Бс взаємодій, і поліпшені СОС ї/або АЮСС у порівнянні з будь-яким вихідним моноклональним анти-СО37-антитілом, яке має мутації, які посилюють Ес-Ес взаємодії як такі.
Таким чином, запропоноване винаходом біспецифічне антитіло більш ефективно індукує СОС або АОСС, ніж комбінація антитіла, яке має першу антигензв'язувальну область, і другого антитіла, яке має другу антигензв'язувальну область, і де обидва антитіла містять мутацію, яка посилює Бо-Бс взаємодію, або в порівнянні з одиничними моноклональними анти-СО37- антитілами, що мають першу або другу антигензв'язувальні області і які містять мутацію, яка посилює Ес-Ес взаємодію.
В одному варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СОЗ37 з СОЗ37-антитілом, що містять послідовності СОР:
МН СОК послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 16,
БО МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 17,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 18,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20,
МІ. СО послідовність КАБ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 21. (О10
Бажано конкуренцію за зв'язування визначають згідно із Прикладом 7.
В іншому варіанті здійснення перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й СОЗ37 антитіло, що містить послідовності
СО:
МН СОК послідовність, зазначену в ЗЕО І МО: 16, 60 МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 17,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 18,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20,
МІ. СО послідовність КАБ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 21. Г01 0)
У додатковому варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності:
МН СОК послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 16,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 17,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 18,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20,
МІ. СО послідовність КАБ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 21. (О10
У наступному варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область запропонованого винаходом біспецифічного антитіла містить УН і МІ. послідовності: (Ї) МН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 15, і МІ. послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 19, або (ї) МН послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність, і
МІ. послідовність, що має щонайменше 9095 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність із МН послідовністю й МІ. послідовностями з 5ЕО ІЮО МО: 15 і 19.
У додатковому варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування з СЮО37 людини антитілом СО37, яке містить послідовності СОЕ:
МН СОК послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 9,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 10,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 11,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 13,
МІ. СО послідовність: АА5, і
Зо МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14. (005
У додатковому варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й СО37 антитіло, яке містить послідовності СОВ:
МН СОК послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 9,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 10,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 11,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 13,
МІ. СО послідовність: АА5, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14. І005)І
В одному варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла має функціональний епітоп, який включає одну або кілька амінокислот 182, 0189,
Т191, 1192, 0194, К195, М196, 1197 і РТІ99 5ЕО ІЮ МО: 62 (2037).
В одному варіанті здійснення винаходу зазначена перша антигензв'язувальна область зв'язується з функціональним епітопом, який містить одну або кілька амінокислот, обраних із групи, яка складається з 182, 0189, Т191, 1192, 0194, К195, М196, 1197 і РІ99 5ЕО ІО МО: 62 (С037).
В одному варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з функціональним епітопом на СОЗ37, де зв'язування з мутантним СОЗ37, у якому будь-який один або кілька амінокислотних залишків у положеннях, які відповідають положенням У182, 0189, Т191, 1192, 0194, К195, М196, 1197 і РІ99 5ЕО ІЮ МО: 62 (СО37) заміщений (заміщені) аланінами, зменшене у порівнянні зі зв'язуванням з СОЗ37 дикого типу, що мають амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 62; зменшене зв'язування визначають за 7-оцінкою (кратною зміною), коли зв'язування зазначеного антитіла нижче, ніж - 1,5, де 7-оцінку (кратну зміну) у зв'язуванні розраховують, як викладено в Прикладі 17.
У додатковому варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності:
МН СОК послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 9,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 10,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 11, 60 МІ СОН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 13,
МІ. СО послідовність: АА5, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14. (005
У додатковому варіанті здійснення винаходу перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла включає послідовності МН і МІ: (Ї) МН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 8, і МІ. послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 12, або (ї) МН послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність, і
МІ. послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність із МН послідовністю й МІ. послідовностями 5ЕО ІЮО МО: 8 і 12.
У наступному варіанті здійснення винаходу другу антигензв'язувальну область біспецифічного антитіла одержують із антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СОЗ37 з антитілом СО37, що містить послідовності СОЕК, обрані із групи, яка включає: () МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 23,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 24,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 27,
МІ. СО послідовність: УА, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 28; (016) (ї) МН СОКІ1 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 2,
МН СОК2 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 3,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 4,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 6,
МІ. СОБ2: ЕА5, і
МІ СОВЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 7; (0041 (ії) МН СОКТІ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 40,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 41,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 42,
Зо МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 44,
МІ СОБ2: РЕАК, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 45; (528.1) і (м) МН СОК послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 47,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 48,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 49,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 51,
МІ. СО послідовність: МАТ і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 52. І37.31
У наступному варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮО37 з
СО37-антитілом, що містить СОК послідовності, обрані із групи, яка включає: () МН СОН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 23,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 24,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25,
МІ СОН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 27,
МІ. СОБ2: АБ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 28; 1016) (ї) МН СОКІ1 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 2,
МН СОК2 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 3,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 4,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 6,
МІ. СОБ2: ЕА5, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 7; (0041 (ії) МН СОКТІ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 40,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 41,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 42,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 44,
МІ. СОБ2: РЕАК, і
МІ. СОНМЗ, послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 45; (528.11 і 60 (м) МН СОК послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 47,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 48,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 49,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 51,
МІ. СО послідовність: МАТ і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 52. І37.31
Таким чином, одержують біспецифічні антитіла, у яких перша й друга антигензв'язувальні області зв'язують різні епітопи на СО37 людини. Автори даного винаходу виявили, що антитіла, які мають СОК послідовності антитіла 005 (ЗЕО ІО МО: 9, 10, 11 ї 13, 1За, 14) і антитіла 010 (ЗЕО ІЮ МО 16, 17, 18 і 20, 20ба, 21) конкурують за зв'язування людського СОЗ37, і не конкурують за зв'язування людського СЮОЗ37 з жодним з антитіл, що мають СОК послідовності антитіл 016 (ЗЕО ІЮО МО: Ме23, 24, 25 і 27, 27а, 28), 004 (ЗЕО ІЮО МО 2, 3, 4 ї 6, ба, 7), 528.1 (5ЕО ІО МО:
Мо40, 41, 42 і 44, 44а, 45) і 37.3 (ЗЕО ІЮ МО: Мо47, 48, 49 і 51, 51а, 52). Однак було виявлено, що антитіла 016, 004, (328.1 і 37.3 конкурують один з одним за зв'язування людського СО37. Таким чином, біспецифічне антитіло, яке містить перше з'єднувальне плече, яке отримане з антитіла, яке конкурує за зв'язування з одним або обома антитілами 005 або 010, і друге з'єднувальне плече, яке отримане з антитіла, яке конкурує за зв'язування з кожним з 016, 004, 528.1 і 37.3 або з кожним з них, є біспецифічним антитілом, яке має специфічність до двох різних епітопів на
СО037. Автори винаходу несподівано виявили, що такі біспецифічні антитіла мають посилену активність СОС відносно клітин, які експресують СО37, у порівнянні з обробкою таких клітин комбінацією двох моноклональних антитіл, які не конкурують за зв'язування СЮОЗ37. Крім того, автори винаходу несподівано виявили, що такі біспецифічні антитіла мають посилену активність
А0СС відносно клітин, які експресують СОЗ37, у порівнянні з обробкою таких клітин комбінацією двох моноклональних антитіл, які не конкурують за зв'язування СО37.
В одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО37 з антитілом, що мають послідовності СОР. антитіла 010, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СО37 з антитілом, яке містить СОК послідовності 016.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу
Зо антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМК послідовності антитіла 010, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮО37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 004.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМ послідовності антитіла 010, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮО37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 528.1.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМК послідовності антитіла 010, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮО37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 37.3.
В одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМ послідовності антитіла 005, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮО37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 016.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМ послідовності антитіла 005, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування з людським СО37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 004.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМ послідовності антитіла 005, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮОЗ37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 528.1.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить першу 60 антигензв'язувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського
СО037 з антитілом, яке містить СОМ послідовності антитіла 005, і другу з'єднувальну область, яка отримана з антитіла, яке конкурує за зв'язування людського СЮО37 з антитілом, яке містить
СОК послідовності 37.3.
Такі біспецифічні антитіла, описані в даній заявці, можуть в інших варіантах здійснення містити заміну, що посилює взаємодію Ес-Ес, в обох Ес областях (тобто Ес областях, отриманих з першого й другого вихідного антитіла) біспецифічного антитіла, де заміна відповідає Е430О в
ІЧО1 згідно ЄШО нумерації, і де заміна посилює взаємодію Ес-Ес двох або більше біспецифічних запропонованих винаходом антитіл при зв'язуванні з мембранозв'язаною мішенню. В іншому варіанті здійснення заміна, яка посилює взаємодію Ес-Ес, відповідає ЕЗ45К в Ідс1 згідно ЄЮ нумерації.
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить другу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності, обрані із групи, яка включає: () МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 23,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 24,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 27,
МІ. СО послідовність: УА, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО І МО: 28; (016) (ї) МН СОКІ1 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 2,
МН СОК2 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 3,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 4,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 6,
МІ. СО послідовність: ЕА5, і
МІ СОМ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 7; (0041 (ії) МН СОКТІ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 40,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 41,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 42,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 44,
М СОКЗ2 послідовність: ЕАК, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 45; (528.1) і їм) МН СОКТІ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 47,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 48,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 49,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 51,
МІ. СО послідовність: МАТ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 52. І37.31
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить другу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й СО37 антитіло, яке містить СОК послідовності, обрані із групи, яка складається з: а) МН СОКІ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 23,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 24,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 25,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 27,
М СО послідовності: АБ, і
МІ СОМ послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ МО: 28; (016) р) МН СОК послідовності, зазначеної в ЗЕО ІО МО: 2,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮО МО: 3,
МН СОВЗ послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮО МО: 4,
БО М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 6,
МІ. СО послідовності: ЕА5, і
МІ. СОМЗ послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 7; (004) с) МН СОКІ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 40,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗХЕО ІЮО МО: 41,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 42,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 44,
МІ. СО послідовності: ЕАК, і
МІ. СОМЗ послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 45; (528.11 а) МН СОКІ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 47, 60 МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 48,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 49,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 51,
МІ. СО послідовність: МАТ і
МІ СОМЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 52. І37 3)
В одному варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла має функціональний епітоп, який включає одну або кілька амінокислот Е124, Е162, 0163, М164, І 165 ії НІ75 БЕО ІЮ МО: 62 (С037).
В одному варіанті здійснення винаходу зазначена друга антигензв'язувальна область зв'язується з функціональним епітопом, який містить одну або кілька амінокислот, обраних із групи, яка складається з Е124, Е162, 0163, М164, 1165 і Н1І175 5ЕО ІЮ МО: 62 (С037).
В одному варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з функціональним епітопом на СО37, у якому зв'язування з мутантним
СО37, у якому будь-який один або кілька амінокислотних залишків у положеннях, які відповідають положенням Е124, 162, 20163 М164, І 165 і НІ75 5ЕО ІО МО: 62 (С037), заміщені аланінами, зменшене в порівнянні з СЮОЗ37 дикого типу, що мають амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 62; зменшене зв'язування визначають як 27-оцінку (кратну зміну), де зв'язування зазначеного антитіла нижче -1,5, де 7-оцінку (кратну зміну) у зв'язуванні розраховують, як викладено в Прикладі 17.
Відповідно, в одному варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, яке містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 010, ї де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОЕ послідовності антитіла 016.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 010, ї де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 004.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 010, ї де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОЕ послідовності антитіла 528.1.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 010, ї де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОЕ послідовності антитіла 37.3.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 005, і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОЕ послідовності антитіла 016.
У ще одному варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 005 і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОЕ послідовності антитіла 004.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 005, і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- 60 антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 528.1.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОК послідовності антитіла 005, і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й анти-СО37- антитіло, яке містить СОЕ послідовності антитіла 37.3.
У додатковому варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності, обрані із групи, яка включає: () МН СОН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 23,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 24,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 27,
МІ. СО послідовність: УА, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 28; 1016) (ї) МН СОКІ1 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 2,
МН СОК2 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 3,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 4,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 6,
МІ. СО послідовність: ЕА5, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 7; (0041 (ії) МН СОКТІ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 40,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 41,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 42,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 44,
МІ. СОБ2: РЕАК, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮ МО: 45; (528.1) і (М) МН СОН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 47,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 48,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІЮО МО: 49,
Зо МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 51,
МІ. СО послідовність: МАТ і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 52. І37.31
У додатковому варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності, обрані із групи, яка складається з: () МН СОН послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 23,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 24,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 25,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 27,
МІ. СОК2 послідовності: УА, і
МІ СОМ послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ МО: 28; (016) (ї) МН СОКІ1 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 2,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮО МО: 3,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮО МО: 4,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 6,
М СОКО2 послідовності: ЕА5, і
МІ. СОМЗ послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 7; (004) (ії) МН СОК'І послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 40,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 41,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 42,
БО М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 44,
МІ. СО послідовності: ЕАК, і
МІ. СОМЗ послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 45; (528.11 (м) МН СОК послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 47,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 48,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 49,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 51,
МІ. СОК2 послідовності: МАТ і
МІ СОМЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 52. 37.3)
Відповідно, даний винахід також відноситься до іншого варіанта здійснення біспецифічного бо антитіла, що містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 16- 18 ї 20-21), і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності антитіла 016 (тобто 5БЕО ІЮ МО: 23-25 і 27-28). Також, як описано вище, таке запропоноване винаходом біспецифічне антитіло додатково містить мутацію, що посилює взаємодію Ес-Бс в Ес області антитіла. В одному варіанті здійснення ця мутація відповідає мутації в положенні Е430 або Е345 в ІдС1 згідно системи нумерації ЕО. В одному варіанті здійснення мутація є заміною Е43006. В іншому варіанті здійснення це заміна ЕЗА5К.
Даний винахід також забезпечує в іншому варіанті здійснення біспецифічне антитіло, яке містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 16-18 і 20- 21), і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОР. послідовності антитіла 004 (тобто 5БЕО ІЮ МО: 2-4 і 6-7).
Даний винахід також забезпечує в іншому варіанті здійснення біспецифічне антитіло, яке містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить послідовності СОК антитіла 010 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 16-18 і 20- 21), і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить послідовності СОМ антитіла 528.1 (тобто БЕО ІЮ МО: 40-42 і 44-45).
Даний винахід також забезпечує в іншому варіанті здійснення біспецифічне антитіло, яке містить першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОК послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІЮО МО: 16-18 і 20- 21), і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить СОР. послідовності антитіла 37.3 (тобто 5ЕО ІЮ МО 47-49 і 51-52).
У додатковому варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності, обрані із групи, яка включає: (Ї) МН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 22, і МІ. послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 26 (016), або (її) МН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 1, і МІ. послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 5 (0041, або (ії) МН послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 39, і МІ. послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:
Зо 43 (628.1), або (м) МН послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО: 46, і МІ. послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ
МО: 50 І37.3), або
МН послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність, і
МІ. послідовність, що має щонайменше 9095 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність до МН послідовності й МІ. послідовності, відповідно, як зазначено в кожному з (Її) - (ім).
В іншому варіанті здійснення винаходу друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і Мі. послідовності, обрані із групи, яка складається 3: (Ї) МН послідовності, зазначеної в зЕО ІЮО МО: 22, і МІ. послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ
МО: 26 (0161, (ї) МН послідовності, зазначеної в ЗЕО ІО МО: 1, і МІ. послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ МО: 51004), (ії) МН послідовності, зазначеної в БЕО ІЮ МО: 39, і МІ. послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ
МО: 43 (28.11, (м) МН послідовності, зазначеної в хЕО ІО МО: 46, і МІ. послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ
МО: 50 І37.3|,
МН послідовності, що має щонайменше 90 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність, і
МІ. послідовності, що має щонайменше 9095 ідентичність, таку як, щонайменше, 95 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 98 95 ідентичність, таку як, щонайменше, 99 95 ідентичність до МН послідовності й МІ. послідовності, відповідно, як зазначено в кожному з (Її) - (ім).
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить УН їі МІ послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІО Моз 15 і 19) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 016 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 22 і 26).
В іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область 60 біспецифічного антитіла містить УН і МІ. послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 15 і 19) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 004 (тобто 5ЕО ІЮО МО: 1 і 5).
В іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІО МО: 15 і 19) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 528.1 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 39 і 43).
В іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить УН і МІ. послідовності антитіла 010 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 15 і 19) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить послідовності МН і МІ. антитіла 37.3 (тобто 5ЕО ІО МО: 46 і 50).
У ще одному варіанті здійснення даний винахід відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 005 (тобто ЗЕО ІЮО МО 8 і 12) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і Мі послідовності антитіла 016 (тобто 5ЕО ІО МО: 22 і 26).
В іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 005 (тобто ЗЕО ІЮ МО 8 і 12) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і Мі послідовності антитіла 004 (тобто 5ЕО ІЮО МО: 1 і 5).
В іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і Мі. послідовності антитіла 005 (тобто ЗЕО ІЮО МО: 8 і 12) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 528.1 (тобто ЗЕО ІЮ МО: 39 і 43).
В іншому варіанті здійснення даний винахід також відноситься до біспецифічного антитіла, що включає першу й другу антигензв'язувальну область, де перша антигензв'язувальна область
Зо біспецифічного антитіла містить МН і МІ. послідовності антитіла 005 (тобто 5ЕО ІЮ МО 8 і 12) і де друга антигензв'язувальна область біспецифічного антитіла містить МН і Мі послідовності антитіла 37.3 (тобто 5ЕО ІО МО: 46 і 50).
У ще інших варіантах здійснення даного винаходу МН і МІ. послідовності, розкриті вище, можуть варіюватися в межах 90 95 ідентичності послідовності.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід відноситься до СО37-з'єднувальної молекули, яка містить одну антигензв'язувальну область, описану в даному документі, де СО послідовності є СОК послідовностями одного з антитіл 004, 005, 010, 016, 28.1 або 37.3. В одному варіанті здійснення така молекула має тільки одну антигензв'язувальну область. Таким чином зв'язувальна молекула має одновалентне зв'язування з СО37. Бажано така молекула містить інтактну Ес-область імуноглобуліну. В одному варіанті здійснення СО37-з'єднувальна молекула містить другу антигензв'язувальну область для нерелевантної мішені, яка, наприклад, може бути 012.
Мутації, які посилюють Ес-Ес взаємодію
В одному варіанті здійснення винаходу одна або кілька мутацій, які посилюють взаємодію
Ес-Ес у зазначених першої й другої Ес областях біспецифічного антитіла, є амінокислотними замінами. Можна сказати, що Ес область біспецифічного антитіла містить дві різні Ес області, по одній від кожного вихідного антитіла анти-СО37. Альтернативно, біспецифічне антитіло може містити одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес, у кожній половині молекули.
Слід розуміти, що мутації, які посилюють взаємодію Ес-Ес, є симетричними, тобто ідентичні мутації відбуваються у двох Ес областях.
В одному варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, у якому одна або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес у зазначених першій й другій Ес областях, є амінокислотними замінами в одному або декількох положеннях, які відповідають амінокислотним положенням 430, 440 ії 345 у людському Ідс1, згідно системи нумерації ЕО. В одному варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, у якому одна або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес у зазначених першій та другій Ес областях, є амінокислотними замінами в одному або декількох положеннях, які відповідають амінокислотним положенням 430, 440 і 345 у людському ІдС1, згідно системи нумерації Б з умовою, що заміна в 440 є 440У або 440МУ. 60 В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного антитіла, яке містить щонайменше одну заміну у зазначених першій та другій Ес областях, обрану із групи, яка включає Е430б, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, ЕЗ3450, ЕЗ45К, ЕЗ345У, 5440 і 5440МУ. У конкретному кращому варіанті здійснення біспецифічне антитіло містить щонайменше одну заміну у зазначених першій та другій Ес областях, обрану з поміж Е4300с або ЕЗ345К, бажано
Е4300. Таким чином, одержують біспецифічні антитіла, які будуть посилювати взаємодія Ес-Ес між різними антитілами, що мають зазначену мутацію. Уважається, що ця мутація змушує антитіла формувати олігомери на клітині-мішені й тим самим посилювати СОС.
В іншому варіанті здійснення біспецифічне антитіло містить одну додаткову мутацію в зазначених Бс областях, де мутація обрана з поміж К439Е, 5440К і 5440. Біспецифічне антитіло, яке має додаткову мутацію К439Е, і друге відмінне від першого антитіло або біспецифічне антитіло, яке має додаткову мутацію 5440К або 5440К, будуть формувати олігомери в структурах, що чергуються, першого й другого антитіл. Передбачається, що це пов'язане з тим, що додаткові мутації будуть краще викликати взаємодію між першим і другим антитілами, а не взаємодію між першим і першим або другим і другим антитілами через нековалентне зв'язування між зазначеними Ес областями.
Бажано, мутації, які посилюють взаємодію Ес-Ес у зазначених першій та другій Ес областях, є ідентичними замінами у зазначених першій та другій Ес областях. Відповідно, в одному кращому варіанті здійснення біспецифічні антитіла мають однакову мутацію, що посилює взаємодію Ес-Ес, в обох Ес областях. Ес область також може бути описана як Ес ланцюги, так що антитіло має два Ес ланцюги, які складають загальну Ес область антитіла. Відповідно, у кращому варіанті здійснення кожний із двох Ес ланцюгів містить заміну положення, обраного із групи положень, які відповідають амінокислотним положенням 430, 440 і 345 в ЇД01 людини згідно системи нумерації ЕО. В одному варіанті здійснення, кожний із двох Ес ланцюгів містить заміну Е430б, так що запропоноване винаходом біспецифічне антитіло містить дві заміни
Е4300. В іншому варіанті здійснення кожний із двох Ес ланцюгів містить заміну ЕЗ45К, так що запропоноване винаходом біспецифічне антитіло містить дві заміни ЕЗ45К.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло є ізотипом Їдс1.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло є ізотипом Ідс2.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло є ізотипом ІдОЗ3.
Зо В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло є ізотипом Іде.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло є ізотипом до.
В одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло є комбінацією ізотипів Їдс1,
ІЧ2, ІдОЗ і Ід0б4. Наприклад, антитіло першої половини, отримане з першого вихідного антитіла, може бути ізотипом Ідс1, а антитіло другої половини, отримане із другого вихідного антитіла, може бути ізотипом Ідс4, так що біспецифічне антитіло є комбінацією Ідс1 і дс4. В іншому варіанті здійснення це комбінація Ідс1і і Ідс2. В іншому варіанті здійснення це комбінація Іде і Ід3. В іншому варіанті здійснення це комбінація Ідса2 і дез. В іншому варіанті здійснення це комбінація Ідса2 і Ід4. В іншому варіанті здійснення це комбінація Ідсз і дес. Як правило, центральний шарнір є центральним шарніром типу ІдДО1, що має послідовність СРРС, але це можуть бути й інші шарніри, які є стабільними й не допускають заміни плеча Раб іп мімо, що має місце для центрального шарніра Ідея, що має послідовність СРС.
У кращому варіанті здійснення біспецифічне антитіло запропоноване винаходом є повнорозмірним антитілом.
У ще одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло є антитілом людини. У ще одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло є гуманізованим антитілом. У ще одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло є химерним антитілом. В одному варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло є комбінацією людського, гуманізованого й химерного. Наприклад, антитіло першої половини, отримане з першого вихідного антитіла, може бути антитілом людини, а антитіло другої половини, отримане із другого вихідного антитіла, може бути гуманізованим антитілом, так що біспецифічне антитіло є комбінацією людського й гуманізованого антитіла. У кращому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло зв'язується з СЮОЗ37 людини й яванського макака, що мають послідовності, зазначені в
ЗБО ІЮ МО: 62 і 63, відповідно. Це є перевагою, оскільки дозволяє проводити доклінічні токсикологічні дослідження на яванських макаках з тією ж біспецифічною молекулою, яка пізніше буде перевірена на людях. У тих випадках, коли антитіла проти людської мішені також не зв'язують мішень на тваринній моделі, дуже важко проводити доклінічні токсикологічні дослідження й неклінічний профіль безпеки молекул, що є вимогою регулювальних органів.
Біспецифічні формати антитіл
Даний винахід відноситься до біспецифічних СОЗ37хСО37 антитіл, які ефективно сприяють бо СОс- і/або АОСС-опосередкованому лізису СЮО37-експресувальних пухлинних клітин, таких як,
наприклад, В-клітинні пухлини. Залежно від необхідних функціональних властивостей для конкретного застосування конкретні антигензв'язувальні області можуть бути обрані з набору антитіл або антигензв'язувальних областей, передбачених даним винаходом. Багато різних форматів і застосування біспецифічних антитіл відомі в даній галузі техніки й були розглянуті
Копіептапп; Ога Оібвсом Тодау, 2015 дуиї; 20 (7): 838-47; і Мар», 2012 Маг-АргА(2):182-97.
Біспецифічне антитіло запропоновне даним винаходом не обмежується яким-небудь конкретним біспецифічним форматом або способом його одержання, однак біспецифічне антитіло запропоноване винаходом повинне мати інтактний Ес домен, щоб індукувати посилені взаємодії Ес-Ес.
Приклади молекул біспецифічних антитіл, які можуть бути використані в даному винаході, включають (ї) одне антитіло, яке має два плеча, які містять різні антигензв'язувальні області; (ії) антитіло із двома варіабельними доменами (0МО-Ід), де кожний легкий ланцюг і важкий ланцюг містить два варіабельні домени в тандемі через короткий пептидний зв'язок (Ууи еї аї., "Сепегайоп апа СНагасієгігайоп ої а ца! Мапаріє Сотаїп Іттиподіобиїїп (0МО-Ід М) Моїесше",
Іп: Апіїбоду Епдіпеєегіпуд, Зрііпдег Вепіп Неїдеїрегд (2010)); (ії) так звану молекулу, отриману способом "замка на причалі (досК апа ІосК)", на основі "домена димеризації й докінга" у протеїнкіназі А.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло запропоновне даним винаходом є крос- тілом або біспецифічним антитілом, отриманим за допомогою контрольованого обміну Еар- плечима (таким, яке описане в УМО2011131746 (Септаб)).
Приклади різних класів біспецифічних антитіл включають: (ї) ІдС-подібні молекули з комплементарними СНЗ доменами для прискорення гетеродимеризації; (ії) рекомбінантні Ідс- подібні молекули з подвійним націлюванням, де кожна із двох сторін молекули містить Бар фрагмент або частину Бар фрагмента щонайменше двох різних антитіл; (іїї) злиті молекули Ідс, де повнорзмірні антитіла ІДС злиті з додатковим ЕРар-фрагментом або частинами РЕар- фрагмента; (ім) Рс-злиті молекули, де одноланцюгові молекули Ем або стабілізовані діатіла злиті з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами; (м) Еар-злиті молекули, де різні Баб-фрагменти злиті разом, злиті 3 константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами; і (мі) антитіла на основі 5сЕм і діатіл і важких ланцюгів антитіл (наприклад, доменні антитіла, нанотіла), де різні одноланцюгові Ем молекули або різні діатіла або різні антитіла з важкого ланцюга (наприклад, доменні антитіла, нанотіла) злиті з Ес-, але не обмежуючись ними.
Приклади Ідо-подібних молекул з комплементарними молекулами СНЗ домена включають молекули Тгіотар/Оцаагота (Тгіоп Рпагта/ Егезепіи5 Віоїесп; Коспе, УМО2011069104), так звані молекули "виступ-в-паз" (Сбепепіеспй, УУ0О9850431), Стго55МАБ5 (Коспе, УМ/О2011117329) і електростатично керовані молекули (Атодеп, ЕРІ1І870459 і У/О2009089004; Спидаї, 05201000155133; Опсотейд, УУО2010129304), молекули І 02-У (Сепепієсн, МУ/гапікК еї аї. У. Віо!.
Спет. 2012, 287 (52): 43331-9, аої: 10.1074/Бс.М112.397869. Ериб 2012 Мом 1), молекули 0іІС- роду і РІС-роду (Рпаптарсіпе, УУМО2010134666, УМО2014081202), молекули доменного тіла, сконструйовані шляхом обміну ланцюга (ЗЕЕ»роду) (ЕМО Зегопо, ММО2007110205), молекули
Вісіопіс (Меги5, УМО2013157953), молекули Есладр (Кедепегоп, ММО201015792), біспецифічні молекули Ідс1 і Ідс2 зі сконструйованим шарніром (Ріїгег/Кіпаї, У/О11143545), молекули каркаса Алутейістм (2утемжогк5/Мегок, УМО2012058768), молекули тар-Рм (Хепсої,
МО2011028952), двовалентні біспецифічні антитіла (МУО2009080254) і молекули Юиободут (Септар А/5, ММО2011131746), але не обмежуючись ними.
Приклади рекомбінантних Ідс-подібних молекул з подвійним націлюванням включають молекули з подвійним націлюванням (01)-Ід (М/02009058383), антитіло два-в-одному (Сепепієсн; Возігот, еї ан 2009. бсіепсе 323, 1610-1614), зшиті мАт (онкологічний центр
Карманос), тАба2 (Е-5іаг, УМО2008003116), молекули 2уроду (2упдепіа; І абйеиг еї аЇ. Мар». 2013
Маг-Арг;5(2):208-18), підходи зі звичайним легким ланцюгом (СтисеПй/ Мегиз, ОБ 7,262,028), кАВоаіе5 (Моміттипе, УМО2012023053) і СомхХ-роду (Соух/Ріїгег; Борраїариаії, УВА, еї а! 2007.
Віоогуд. Мед. Снет. І ей. 17, 501-506), але не обмежуючись ними.
Приклади злитих молекул ЇДб включають молекули із двома варіабельними доменами (0М0)-Ід (АбБроц, 05 7 612 181), дводоменні антитіла з подвійною головою (піїемег; зЗапоїї
Амепіїз, ММО20100226923), ІдДс-подібні біспецифічні молекули (ІпСіопе/ Еїї І Шу, І еугіз еї аїЇ. Маї
Віотесппої. 2014 Рер; 32 (2): 191-868), Тв2АБ (Медіттипе/ А7; Оітаві єї аї. У Мої Віо!. 2009 Осі 30; 393 (3): 672-92) і молекули В5АБ (2утодепеїйсз5, ММО2010111625), молекули НЕКСИиИГЕЗ (Віодеп
Ідес, 05007951918), злиті молекули 5сЕм (Момапів), злиті молекули 5сЕм (Снапа7пои Адат
Віоїеспй Іпс, СМ 102250246) і молекули ТмМАр (Коспе, УМО2012025525, УМО20125), але не 60 обмежуються ними.
Приклади Ес злитих молекул включають гібриди 5СЕм/Ес (Реагсе еї аї., Віоспет Мої Віо! Іпі. 1997 Бер; 42 (6): 1179-88), молекули ЗСОКРІОМ (Етегдепі ВіозоЇшіопв/Тгиріоп, Віапкеп5Нір ЛИ, еі ам. ААСЕА 100 їй Аппиа! тевїіпуд 2009 (Арзігасі я 5465); 7утодепеїісв/ ВМ5, МО2010111625), молекули антитіл, здатних переорієнтовуватись, з подвійною афінністю (Ес-ОАНТ) (Масгодепісв,
МмО2008157379, МО2010080538) і Оча(ЗсЕм)2--ар молекули (Національний науково-дослідний центр медицини антитіл (Китай)), але не обмежуються ними.
Приклади Рар-злитих біспецифічних антитіл включають молекули К(ар)2 (Медагех/ АМСЕМ;
Оео еї аї. у). Іттипої. 1998 Рер 15; 160 (4): 1677-86), молекули подвійної дії або біс-Рар молекули (Сепепіесп, Вовігот, еї а! 2009. Зсіепсе 323, 1610-1614), молекули на основі димеризації й докінга (ОМ) (ІттипоМедіс5, УМО2003074569, М/О2005004809), двовалентні біспецифічні молекули (ВіоїеспоЇ, Зспоопіап5, у). Іттипої. 2000 Оес. 15; 165(12):7050-7) і молекули Раб-Ем (Ось-сеІШесп, УМО 2009040562 АТ), але не обмежуються ними.
Приклади антитіл на основі 5сСЕм, діатіл і доменних антитіл включають молекули на основі технології здатних переорієнтовуватися антитіл, з подвійний афінністью (АКТ) (Масгодепісв,
УМО2008157379, ММО2010080538), молекули СОМВОБУ (Ерідеп Віоїтесі, 2пи еї аї. Іттипої СеїЇ
Вісі. 2010 Ацо; 88(6): 667-75) і нанотіла з подвійним націлюванням (Абіупх, Нтійа єї аї!., РЕАБЕВ У. 2010), але не обмежуються ними.
В одному аспекті запропоноване винаходом біспецифічне антитіло включає першу Ес- область, яка містить першу СНЗ область, і другу Ес-область, яка містить другу СНЗ область, де послідовності першої й другої СНЗ областей є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеною першою й другою СНЗ областями є більш сильною, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СНЗ областей. Більш докладні відомості про ці взаємодії й про те, як вони можуть бути досягнуті, представлені в М/О2011131746 і УМО2013060867 (СептарБб), які таким чином включені тут як посилання.
Як описано далі в даному документі, стабільне біспецифічне СО37хСО37 антитіло може бути отримане з високим виходом з використанням певного способу на основі одного гомодимерного вихідного СОЗ37 антитіла й іншого гомодимерного вихідного СЮОЗ37 антитіла, що містить тільки кілька досить консервативних асиметричних мутацій у СНЗ областях.
Асиметричні мутації означають, що послідовності зазначених першої й другої СНЗ областей
Зо містять амінокислотні заміни в неїдентичних положеннях, так що перша й друга СНЗ області мають різні амінокислотні послідовності.
В одному аспекті біспецифічне антитіло, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, містить першу й другу Ес-область, де кожна із зазначеної першої й другої Ес-області містить щонайменше шарнірну область, СН2 ії СНЗ область, де в зазначеній першій Ес-області щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, обраним із групи, яка складається з 1366, І 368, К370, 0399, Е405, у407 і К.409 у важкому ланцюзі людського ІдС1, була заміщена, і в зазначеній другій Ес області щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, обраним із групи, яка складається з Т366, І 368, К370, 0399, 405,
У407 і К409 у важкому ланцюзі людського ІДС1, була заміщена, і де зазначена перша й зазначені друга Ес області не заміщені в однакових положеннях.
Відповідно, у кращому варіанті здійснення винаходу перша Ес область біспецифічного антитіла містить амінокислотну мутацію, яка відповідає положенням Е405 в ІдДсО1 людини, а друга Ес область біспецифічного антитіла містить додаткову амінокислотну мутацію, яка відповідає положенням К409 у людському Ідс1. Відповідно, ці мутації є асиметричними в порівнянні з вищезгаданими мутаціями, які посилюють взаємодію Ес-Ес.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 366, а зазначена друга Ес-область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається із 368, 370, 399, 405, 407 і 409. В одному варіанті здійснення амінокислота в
БО положенні 366 обрана з Аа, Ар, Сім, Ні, Азп, Маї або Сіп.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 368, а зазначена друга Ес-область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається із 366, 370, 399, 405, 407 і 409.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даному документі, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 370, а зазначена друга Есо-область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається із 366, 368, 399, 405, 407 і 409.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з варіантів бо здійснення, розкритих у даному документі, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 399, а зазначена друга Ес-область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається із 366, 368, 370, 405, 407 і 409.
В одному варіанті біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 405, а зазначена друга Ес- область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 407 і 409.
В одному варіанті біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 407, а зазначена друга Ес- область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається із 366, 368, 370, 399, 405 і 409.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислотну заміну в положенні 409, а зазначена друга Ес-область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 405 і 407.
Відповідно, в одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даному документі, послідовності зазначеної першої й другої
Ес-областей містять асиметричні мутації, тобто мутації в різних положеннях у двох Ес-областях, наприклад, мутацію в положенні 405 в одній з Ес-областей і мутацію в положенні 409 в інший
Ес-області.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислоту, відмінну від Г ух, Їеи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Авп, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Суз у положенні 409, а зазначена друга Есо-область має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 405 і 407. В одному такому варіанті здійснення зазначена перша область Ес має амінокислоту, відмінну від Гу5, ем або Меї, наприклад, су,
Аа, Маї, Пе, 5ег, ТНг, Ріе, Аг, Ні, Авр, Азп, Спи, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз, у положенні 409, і зазначена друга Ес-область має амінокислоту, відмінну від Рпе, наприклад су, Аа, Маї, Пе, 5ег,
Тиг, Гуз, Аг, Ніб, Авр, Ап, СІМ, Сп, Рго, Тгр, Туг, Суб5, Гузх або І ей, у положенні 405. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу зазначена перша Ес-область має амінокислоту, відмінну від І ух, І ей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Ага, Нів,
Авр, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Су, у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має амінокислоту, відмінну від Ріє, Агд або су, наприклад, ГІ еи, Аа, Маї, Пе, бег, Тпг, Меї, Гуз, Нів,
Авзр, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Сув, у положенні 405.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить Рпе у положенні 405 і амінокислоту, відмінну від І ух, І ей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Ага, Нів,
Авр, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Су у положенні 409, і зазначена друга Ес-область містить амінокислоту, відмінну від Ріє, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТАг, Гуз, Аго, Ні, Авр, Азп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг, Гени, Меї або Сув, у положенні 405 і Г ух у положенні 409. У наступному варіанті здійснення зазначена перша Ес-область містить Рпе у положенні 405 і амінокислоту, відмінну від Гуз, Геи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Ре, Аго, Ні, Ар, Авп, СІМ, Сп, Рго,
Тгр, Туг або Суз у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить амінокислоту, відмінну від Ріє, Агд або Су, наприклад, ГІ еи, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Меї, Гуз, Ні, Авр, Авп, Сім, Сп, Рго,
Тгр, Туг або Сув, у положенні 405, і І ух у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить Рпе у положенні 405 і амінокислоту, відмінну від І ух, І ей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Ага, Нів,
Авр, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Су у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить
Ї еи у положенні 405 і Гуз у положенні 409. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу зазначена перша Ес-область містить Рпе у положенні 405 і Агд у положенні 409, і зазначена друга Ес-область містить амінокислоту, відмінну від Ріпе, Агу або Су, наприклад, ГІ еи, Аа, маї,
Пе, бег, ТАг, Гу, Меї, Ні, Ар, Авбп, Сім, Сп, Рго, Тгтр, Туг або Су5 у положенні 405 ії Гу5 у положенні 409. В іншому варіанті здійснення зазначена перша Ес-область містить Рпе у положенні 405 і Агд у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить І еи у положенні 405 і Гуз у положенні 409.
У додатковому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить амінокислоту, відмінну від Гу5, І еи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тпг, Ре, Аго, Ні, Ар, Авп, Сім, Сп, Рго,
Тгр, Туг або Суз у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить Гуз у положенні 409, Тиг бо у положенні 370 і І еи у положенні 405. У додатковому варіанті здійснення зазначена перша Ес-
область містить Агд у положенні 409, а друга Ес-область містить Гу5 у положенні 409, Тпг у положенні 370 і ем у положенні 405.
У ще одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить Гуз у положенні 370,
Рпе у положенні 405 і Агд у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить Гуз у положенні 409, Тиг у положенні 370 і Ї еи у положенні 405.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить амінокислоту, відмінну від Гуз,
Ї ем або Меї, наприклад, СУ, Аа, Маї, Пе, бег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, А5р, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Су у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить Гуз у положенні 409 і: (а) Пе у положенні 350 і І еи у положенні 405, або (Б) Тпг у положенні 370 і Геи у положенні 405.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить Агуд у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить Гу5 у положенні 409 і: (а) Пе у положенні 350 і ей у положенні 405, або (Б) Тиг у положенні 370 і І ей у положенні 405.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить Тйг у положенні 350, Гуз у положенні 370, Рпе у положенні 405 і Агу у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить
Гуз у положенні 409 і: (а) Пе у положенні 350 і І еи у положенні 405, або (Б) ТНпг у положенні 370 і
І еи у положенні 405.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область містить Тйг у положенні 350, Гуз у положенні 370, Рпе у положенні 405 і Агу у положенні 409, а зазначена друга Ес-область містить
Пе у положенні 350, Тиг у положенні 370, І еи у положенні 405 і Г ух у положенні 409.
В одному варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має амінокислоту, відмінну від ГГ ув, ГГ еи або Меї, у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має амінокислоту, відмінну від Рпе, у положенні 405, наприклад, відмінну від Ре, Агу або сСіу у позиції 405; або зазначена перша СНЗ область має амінокислоту, відмінну від І ух, Ге або Меї, у положенні 409, а зазначена друга
Зо СНЗ область має амінокислоту, відмінну від Туг, А5р, Сім, Рпе, Гу, СіІп, Аго, Зег або ТНг, у положенні 407.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даному документі, містить першу Ес-область, що має амінокислоту, відмінну від ух, ем або Меї, у положенні 409, і другу Ес-область, що має амінокислоту, відмінну від Туг, А5р, Сім, Рпе, Гуз, Сп, Аго, Зег або Тпг у положенні 407.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даному документі, містить першу Ес-область, що має Туг у положенні 407, і амінокислоту, відмінну від Гу, Їеи або Меї у положенні 409, і другу Ес-область, що має амінокислоту, відмінну від Туг, А5р, Сім, Ріє, Гуз, Сп, Агуо, Зег або Тиг у положенні 407 і Гуз у положенні 409.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даному документі, містить першу Ес-область, що має Туг у положенні 407 і Агуд у положенні 409, і другу Ес-область, що має амінокислоту, відмінну від Туг, Ар, СІМ,
РНе, Гуз, СіІп, Агу, Зег або ТНг у положенні 407 і І уз у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення зазначена перша Ес-область має амінокислоту, відмінну від
Гуз, Геи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, бег, ТАг, Ре, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр,
Туг або Суз у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має амінокислоту, відмінну від Туг,
Азр, Сім, Ре, Гуз, СіІп, Аго, Зег або Тпг, наприклад І еи, Меї, Су, Аа, Маї, Пе, Ні, Азп, Рго, Тгр або Суб5 у положенні 407. В іншому варіанті здійснення зазначена перша Ес область має амінокислоту, відмінну від І ух, І ей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Ага, Нів,
Азр, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Сув, у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має Аа, сту, Ні, Пе, І ей, Меї, Азп, Маї або Тгр у положенні 407.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має амінокислоту, відмінну від ГГ ув, ГГ еи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Ар, Авп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або
Суз, у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має Су, І ем, Меї, Асн або Тгр у положенні 407.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має Туг у положенні 407 і амінокислоту, 60 відмінну від Гу, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Су, у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має амінокислоту, відмінну від Туг, А5р, Сім, Рпе, Гу, Сп, Аг, Зег або ТНпг, наприклад Гецй, Меї, СУ, Аа, Маї, Пе,
Ні, Азп, Рго, Тгр або Суз у положенні 407 і Г ух у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має Туг у положенні 407 і амінокислоту, відмінну від Гу, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Су у положенні 409, а зазначена друга Есо-область має Аїа, Су, Ні, Пе,
Ї ем, Меї, Азп, Маї або Тгр у положенні 407 і Г ух у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має Туг у положенні 407 і амінокислоту, відмінну від Гу, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Су, у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має Су, І еи, Меї, Асн або Тгр у положенні 407 і Гуз у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має Туг у положенні 407 і Агуд у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має амінокислоту, відмінну від Туг, А5р, Сім, Рпе, Гу, Сп,
Аго, Зег або ТНг, наприклад, І е!и, Меї, Су, Аа, Маї, Пе, Ні, Авп, Рго, Тгр або Су у положенні 407 і Гуз у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має Туг у положенні 407 і Агуд у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має Аа, Су, Ні, Пе, ем, Меї, Азп, Маї або Тгр у положенні 407 і Гуз у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, зазначена перша Ес-область має Туг у положенні 407 і Агд у положенні 409, а зазначена друга Ес-область має Су, ем, Меї, Асн або Тгр у положенні 407 і Гуз у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення біспецифічного антитіла, як визначено в кожному з розкритих тут варіантів здійснення, перша Ес-область має амінокислоту, відмінну від Г ух, Їеи або Меї, наприклад, СУ, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Рпе, Аго, Ні, Ар, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Сув, у положенні 409, а друга Ес-область має: (Ї) амінокислоту, відмінну від Ре, І ей і Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, зЗег, Тпг, Гу, Аго,
Ні, Ар, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Су, у положенні 368, або (і) Тгтр у положенні 370, або (ії) амінокислоту, відмінну від А5р, Сув, Рго, Сім, або Сіп, наприклад, Ре, І еи, Меї, Сіу, Аа, маї, Ме, Зег, ТНг, Гуз, Ага, Ні, Азп, Тгр, Туг або Сув, у положенні 399, або (ім) амінокислоту, відмінну від Гу, Агу, Зег, Тиг або Тгр, наприклад, Ре, ГІ ем, Меї, Аа, маї, су, Пе, Авп, Ні, Ар, Сім, Сп, Рго, Туг або Суз, у положенні 366.
В одному варіанті здійснення перша Ес-область має Ага, АПа, Ні5 або Сіу у положенні 409, а друга Ес-область має: () Гуз, Сп, Аа, Ар, Спи, Спу, Нів, Пе, Азп, Агоу, Зег, Тиг, Ма! або Тгр у положенні 368, або (і) Тгтр у положенні 370, або (ії) Аа, СУ, Ме, Геи, Меї, Авп, Зег, Тпг, Тгр, Ре, Нів, Гуз, Агд або Туг у положенні 399, або (ім) АІа, Ар, Сім, Ні, Азп, Маї, СіІп, Рпе, су, Пе, Г ем, Меї або Туг у положенні 366.
В одному варіанті здійснення перша Ес-область має Аг у положенні 409, а друга Ес-область має: () А5р, Сім, Су, Азп, Аго, Зег, ТНг, Ма! або Тгр у положенні 368, або (і) Тгтр у положенні 370, або (ії) Ре, Ні, ГІ ух, Агуд або Туг у положенні 399, або (ім) АІа, Ар, Сім, Ні, Азп, Маї, СіІп. у положенні 366.
На додачу до зазначених вище амінокислотних замін указані перша й друга Ес області можуть містити додаткові амінокислотні заміни, делеції або вставки відносно Ес послідовностей дикого типу.
У кращому варіанті здійснення винаходу друга Ес область біспецифічного антитіла містить мутацію, яка відповідає Е405 у людському ЇДС1, а перша Ес область містить мутацію, яка відповідає К409 у людському Ідс1, згідно ЄО нумерації.
В одному варіанті здійснення мутації в положенні Е405 і К409 є замінами. У конкретному варіанті здійснення заміна в положенні Е405 є заміною Е405І. В іншому варіанті здійснення заміна в положенні К409 є заміною К409К.
У варіантах здійснення, де біспецифічне антитіло є ізотипом Ідс4, перша Ес область може бо додатково містити заміну 4051 і заміну К409К. У таких варіантах здійснення друга Ес область не заміщена в жодному з 405 і 409 амінокислотних положень.
Слід розуміти, що, якщо не зазначено іншого, усі згадані амінокислотні мутації в розкритих положеннях є мутаціями відносно людського Іде і використання людського ІдДе1 для нумерації згідно системи нумерації ЕО.
В одному варіанті здійснення ні згадана перша, ні зазначена друга Ес-область не містять послідовність Суз-Рго-5ег-Суз у центральній шарнірній області.
У додатковому варіанті здійснення обидві із зазначеної першої й зазначеної другий Ес- області містять послідовність Суб5-Рго-Рго-Суз у центральній шарнірній області.
Таким чином, забезпечуються біспецифічні антитіла, які можуть бути отримані з високим виходом і які є стабільними іп мімо.
В іншому варіанті здійснення запропоноване винаходом біспецифічне антитіло має підвищені ефекторні функції СОС і/або АОСС у порівнянні з ідентичним біспецифічним антитілом, яке не має мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. В іншому варіанті здійснення запропоноване винаходом біспецифічне антитіло має підвищені ефекторними функціями СОС або АОСС у порівнянні з моноклональним вихідним антитілом, що мають область зв'язування або з першою, або із другою областю зв'язування біспецифічного антитіла, і які мають ідентичні мутації, що посилюють Ес-Ес взаємодію, як запропоноване винаходом біспецифічне антитіло.
Спосіб одержання біспецифічних запропонованих винаходом антитіл
Традиційні способи, такі як способи на основі гібридом і способи хімічної кон'югації (Магміп апа 2пи (2005) Асіа РІрагтасої Зіп 26: 649), можуть бути використані для одержання запропонованих винаходом біспецифічних антитіл. Спільна експресія в клітині-хазяїні двох антитіл, які складаються із різних важких і легких ланцюгів, приводить до суміші можливих продуктів антитіл на додачу до необхідного біспецифічного антитіла, яке потім може бути виділене, наприклад, афінною хроматографією або подібними способами.
Можна також використовувати стратегії, які сприяють утворенню функціонального біспецифічного продукту при спільній експресії різних конструкцій антитіл, наприклад, спосіб, описаний І іпапоїег еї аІ. (1995 9) Іттипо!ї 155: 219). Злиття гібридом пацюків і мишей, які продукують різні антитіла, приводить до обмеженої кількості гетеродимерних білків внаслідок кращого обмеженого за видовою належністю спарювання важкого/легкого ланцюгів. Іншою
Зо стратегією, що сприяє утворенню гетеродимерів у порівнянні з гомодимерами, є стратегія "виступ-в-паз", у якій виступ уводять у перший поліпептид важкого ланцюга й відповідну порожнину в другому поліпептиді важкого ланцюга, так що виступ може бути розташований у порожнині на межі цих двох важких ланцюгів, щоб сприяти утворенню гетеродимера й перешкоджати утворенню гомодимера. "Виступи" конструюють шляхом заміни невеликих амінокислотних бічних ланцюгів на межі розділення першого поліпептиду більшими бічними ланцюгами. Компенсаторні "порожнини" ідентичного або подібного розміру з виступами створюють на межі розділення другого поліпептиду шляхом заміни більших амінокислотних бічних ланцюгів більш дрібними (патент США 5731168). ЕР 1870459 (Спидаї) і М/О2009089004 (Атдеп) описують інші стратегії, що сприяють утворенню гетеродимера при спільній експресії різних доменів антитіл у клітині-хазяїні. У цих способах один або кілька залишків, які формують границю розділення СНЗ-СНЗ в обох СНЗ доменах, заміняють зарядженою амінокислотою, так що утворення гомодимера є електростатично неприйнятним, а гетеродимеризація є електростатично вигідною. В УМО2007110205 (МегсК) описана ще одна стратегія, у якій відмінності між СНЗ доменами Ідз і Їд4о використовують для прискорення гетеродимеризації.
Інший спосіб одержання біспецифічних антитіл іп мйго був описаний в МО 2008119353 (Септаб), де біспецифічне антитіло утворюється шляхом обміну "Раб-плеча" або "напів- молекули" (обміну важкого ланцюга й приєднаного легкого ланцюга) між двома моноспецифічними Ідсес4- або ІдсС 4-подібними антитілами при інкубації за відновлювальних умов. Отриманий продукт є біспецифічним антитілом, яке має два Рар-плеча, які можуть містити різні послідовності.
Кращий спосіб одержання біспецифічних антитіл анти-СО37хСО37 відповідно до даного винаходу включає способи, описані в УЛО2011131746 і УМО2013060867 (Септарб), які включають наступні етапи: а) забезпечення першого антитіла, що містить Ес область, причому зазначена Ес область містить першу СНЗ область; р) забезпечення другого антитіла, що містить другу Ес область, причому зазначена Ес область містить другу СНЗ область, де перше антитіло є антитілом анти-СО37, а друге антитіло є другим антитілом анти-СО37; де послідовності зазначених першої й другої СНЗ областей є різними і є такими, що бо гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою й другою СНЗ областями є більш сильною,
ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СНЗ областей; с) інкубації зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитіломза відновлювальних умов; і а) одержання зазначеного біспецифічного антитіла.
В одному варіанті здійснення зазначене перше антитіло разом із зазначеним другим антитілом інкубують за відновлювальних умов, достатніх для того, щоб дозволити цистеїнам у шарнірній області зазнати ізомеризації дисульфідного зв'язку, де взаємодія між зазначеним першим і другим антитілами в отриманому гетеродимерному антитілі є такою, що не відбувається заміни Рар-плеча при 0,5 мм О5Н через 24 години при 37 С.
Не бажаючи заглиблюватися в теорію, на стадії (с) дисульфідні зв'язки важкого ланцюга в шарнірних областях вихідних антитіл відновлюються, і отримані цистеїни потім здатні формувати дисульфідний зв'язок між важкими ланцюгами із залишками цистеїна іншої молекули вихідного антитіла (початково з іншою специфікою). В одному варіанті здійснення цього способу, відновлювальні умови на стадії (с) включають додавання відновника, наприклад, відновника, обраного із групи, яка складається з 2-меркаптоетиламіну (2-МЕА), дитіотреїтолу (ОТ), дитіоеритритолу (ОТЕ), глутатіону, трис(2-карбоксиетилуфосфіну (ТСЕР), І-цистеїна й бета-меркапто-етанолу, бажано відновника, обраного із групи, яка складається з 2- меркаптоетиламіну, дитіотреїтолу й трис(2-карбоксиетил) фосфіну. У додатковому варіанті здійснення стадія (с) включає відновлювальні умови, які стають, невідновлювальними умовами або менш відновлювальними, например, шляхом видалення відновника, наприклад, шляхом знесолення.
Для цього способу може бути використане кожне з СО37 антитіл, описаних у даному документі, включаючи перше й друге антитіло анти-СО37, що містять першу й/або другу Ес область. Приклади таких першої й другої Ес областей, включно з комбінацією таких першої й другої Ес областей, можуть включати будь-які з Ес областей, описаних у даній заявці.
В одному варіанті здійснення даного способу зазначені перше й/або друге антитіло є повнорозмірними антитілами.
Ес області першого й другого антитіл можуть мати будь-який ізотип, включаючи Ідс1, Ідса2,
І9О3 або ІдсС4, але не обмежуючись ними. В одному варіанті даного способу Ес області обох
Зо зазначених першого й другого антитіл мають ізотип Ідс1. В іншому варіанті здійснення одна з
Ес областей зазначених антитіл має ізотип Ідс1, а інша - ізотип Ід054. В останньому варіанті здійснення отримане біспецифічне антитіло містить Ес область Ідс1 і Ес область Ідса4 і, таким чином, може мати цікаві проміжні властивості відносно активації ефекторних функцій.
У додатковому варіанті здійснення один з вихідних білків антитіла був сконструйований так, щоб не зв'язувати білок А, що дозволяє відокремити гетеродимерний білок від зазначеного гомодимерного вихідного білка шляхом пропущення продукту через колонку з білком А.
Як описано вище, послідовності першої й другої СНЗ3 областей гомодимерних вихідних антитіл (батьківських антитіл) різні і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою й другою СНЗ областями сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначеної першої й другої СНЗ областей. Додаткові подробиці про ці взаємодії й про те, як вони можуть бути досягнуті, представлені в М/О2011131746 і УУО2013060867 (Септаб), які таким чином включені як посилання у всій повноті.
Зокрема, стабільне біспецифічне антитілло до СО37хСО37 може бути отримане з високим виходом з використанням вищевказаного запропонованого винаходом способу на основі двох гомодимерних вихідних антитіл, які зв'язують різні епітопи СОЗ37 і містять тільки декілька досить консервативних асиметричних мутацій у СНЗ областях. Асиметричні мутації означають, що послідовності зазначених першої й другої СНЗ областей містять амінокислотні заміни в неідентичних положеннях.
Біспецифічні запропоновані винаходом антитіла також можуть бути отримані шляхом спільної експресії конструкцій, що кодують перший і другий поліпептиди в одній клітині. Таким чином, у додатковому аспекті винахід відноситься до способу одержання біспецифічного антитіла, який передбачає наступні стадії: а) забезпечення першої нуклеїновокислотної конструкції, яка кодує перший поліпептид, що включає першу Ес область і першу антигензв'язувальну область першого важкого ланцюга антитіла, причому зазначена перша Ес область містить першу СНЗ область; р) забезпечення нуклеїновокислотної другої конструкції, яка кодує другий поліпептид, що включає другу Ес область і другу антигензв'язувальну область другого важкого ланцюга антитіла, причому зазначена друга Ес область містить другу СНЗ область; де послідовності зазначених першої й другої СНЗ областей є різними і є такими, що бо гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою й другою СНЗ областями є сильнішою, ніж
Зо кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СНЗ областей; за необхідності, де зазначені перша й друга нуклеїновокислотні конструкції кодують послідовності легкого ланцюга зазначеного першого й другого антитіл; с) спільна експресія зазначених першої й другої нуклеїновокислотних конструкцій у клітині- хазяїні; і а) одержання зазначеного гетеродимерного білка із клітинної культури.
Таким чином, даний винахід також відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, яка продукує біспецифічне антитіло запропоновне даним винаходом.
В одному варіанті здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло одержують кожним зі способів відповідно до даного винаходу.
Придатні вектори експресії, включаючи промотори, енхансери тощо і придатні клітини- хазяїни для продукування антитіл добре відомі в даній галузі техніки. Приклади клітин-хазяїнів включають дріжджі, клітини бактерій і ссавців, такі як клітини СНО або НЕК.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, визначене в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, містить першу Ес-область і другу Ес-область, де ні зазначена перша, ні зазначена друга Ес-область не містять послідовність Суб5-Рго-Зег-Сув5 у шарнірній області.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, визначене в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, містить першу Ес-область і другу Ес-область, де обидві із зазначених першої й другої Ес-областей містять послідовність Субз-Рго-Рго-Суб5 у шарнірній області.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, містить першу Ес-область і другу Ес-область, де перша й друга Ес-області є Ес-областями антитіла людини.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, містить першу Ес-область і другу Ес-область, де перша й друга антигензв'язувальні області містять МН послідовності антитіла людини й, за необхідності,
МІ. послідовності антитіла людини.
Зо В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, містить першу Ес-область і другу Ес-область, де перша й друга антигензв'язувальні області походять від антитіл з важких ланцюгів.
В одному варіанті здійснення біспецифічне антитіло, описане в кожному з варіантів здійснення, розкритих у даній заявці, містить першу Ес-область і другу Ес-область, де перша й друга антигензв'язувальні області містять перший і другий легкий ланцюг.
В інших варіантах здійснення запропонований винаходом спосіб спільної експресії включає будь-які з додаткових ознак, описаних вище в способі іп міго.
Вихідні антитіла
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до вихідних антитіл, які використовуються для одержання біспецифічних запропонованих винаходом антитіл.
Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід відноситься до антитіла анти-СО37, яке зв'язується з тим же епітопом на СО37 людини, що й антитіло анти-СО37, яке включає: () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 16, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 17, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 18, і М. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20, і послідовність СОК2:
КАБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 21 (0101; або (ї) МН область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в 5ЕО ІО МО: 9, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 10, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 11, ії МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 113, і послідовність СОК2:
БО АА5Б, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14 (0051.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до антитіла анти-СО37, яке конкурує за зв'язування з антитілом анти-СО37, що включає: () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 16, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 17, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 18, ії МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20, і послідовність СОК2:
КАБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 21 (0101; або (ї) МН область, яка містить послідовність СОМКІ1, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 9, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 10, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 11, ії МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 113, і послідовність СОК2: 60 ААФ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14 0051.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до антитіла анти-СО37, яке включає: () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 16, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 17, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 18, і М. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 20, і послідовність СОК2:
КАБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 21 (0101; або (ї) МН область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в 5ЕО ІО МО: 9, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 10, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 11, ії МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 113, і послідовність СОК2:
АА5Б, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14 (0051.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до антитіла анти-СО37, яке включає: () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 23, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 24, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25, і М область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 27, і послідовність СОК2:
МАВ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 28; 1016) або (ї) МН область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 2, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІО МО: 3, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІО МО: 4, і МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 6, і послідовність СОК2: ЕАЗБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 7. (0041
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до антитіла, як визначено вище, яке містить одну або кілька амінокислотних мутацій в Ес області антитіла, де мутація (мутації) посилює взаємодію Ео-Бс між антитілами при зв'язуванні з мішенню в порівнянні з Ес-Ес взаємодією між антитілами, що не мають зазначеної мутації (мутацій).
Вважаються, що зазначена посилена взаємодія ЕБсо-Ес приводить до того, що антитіла утворюють олігомери, такі як, наприклад, гексамери на клітинах-мішенях, де утворення олігомерів викликає ефект посилення СОС. У кращому варіанті здійснення одна або кілька амінокислотних мутацій в Ес області антитіла є амінокислотними замінами в одному або декількох положеннях, які відповідають амінокислотним положенням 430, 440 і 345 в Ідш1 людини, де використовують систему нумерації БОЮ ї де заміна відноситься до амінокислотної послідовності людського ЇДС1. В одному варіанті здійснення одна або кілька амінокислотних мутацій в Ро-області антитіла є амінокислотною заміною в одному або декількох положеннях, які відповідають амінокислотним положенням 430, 345 і 440 в ЇД01 людини згідно системи нумерації БО, за умови, що заміна в 440 є заміною 440 або 440УуУ. В одному варіанті здійснення щонайменше одна амінокислотна заміна в Ес області обрана із групи, яка включає
Е430с, ЕЗ45К, Е4305, Е4ЗОРГ, Е430ОТ, Е3450, ЕЗ345К, Е345У, 5440 і 544 ОМУ.
У кращому варіанті здійснення щонайменше одна заміна в зазначеній Ес області обрана з поміж Е430б або ЕЗ345К, бажано Е4300. Ці мутації що посилюють взаємодію БЕо-Ес, є симетричними мутаціями, так що два Ес ланцюги антитіла мають ідентичні мутації/заміни.
У додатковому варіанті здійснення антитіло може додатково містити заміну в положенні, яке відповідає 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409 у людському Ідс1. Антитіло, яке містить заміну в одному із цих амінокислотних положень, є стабільним антитілом; однак воно може за відновлювальних умов у так званій реакції "обміну Раб плеча" формувати біспецифічні антитіла з антитілом, яке містить заміну в іншому із цих амінокислотних положень, і яке має іншу антигензв'язувальну область. За відновлювальних умов, достатніх для того, щоб дозволити цистеїнам у шарнірній області зазнавати ізомеризації дисульфідного зв'язку, антитіло запропоноване винаходом буде формувати половинні молекули, кожна з яких містить одну антигензв'язувальну ділянку й Ес область. Заміни в неідентичних положеннях у кожному з положень, що відповідають 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409 у людському ІдС1, сприяють димеризації половинних молекул першого антитіла з половинними молекулами другого антитіла, так що біспецифічні (гетеродимерні) антитіла будуть формуватися при видаленні умов, що відновлюють, і реформуванні дисульфідних зв'язків у шарнірній області.
Таким чином, два запропоновані даним винаходом антитіла, які мають різні антигензв'язувальні області та різні з'єднувальні епітопи на СО37, і які містять заміну в обох Ес ланцюгах (Ес областях) у кожному з амінокислотних положень, що відповідають 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409 у людського ІдДС1, але в неідентичних положеннях, можуть бути придатними для одержання біспецифічного запропоновані винаходом антитіла.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 366, і зазначений другий гомодимерний білок має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 368, 370, 399, 405, 407 і 409. В одному варіанті здійснення амінокислота в положенні 366 обрана з поміж Аго, Г ув, Авп, Сп, Туг, Сім, і Су. бо В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 368, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 370, 399, 405, 407 і 409.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 370, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 399, 405, 407 і 409.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 399, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 405, 407 і 409.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 405, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 407 і 409.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 407, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 405 і 409.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислотну заміну в положенні 409, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 405 і 407.
В одному варіанті здійснення перше антитіло має амінокислоту, відмінну від ГГ ув, Ї ей або
Меї у положенні 409, таку як амінокислота, обрана із групи, яка включає Су, Аа, Маї, Пе, 5ег,
Тиг, Аго, Ні, Авр, Ап, Сім, СіІп, Тгр, Рпе або Туг у положенні 409, а зазначене друге антитіло має амінокислотну заміну в положенні, обраному із групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 405 і 407.
В одному такому варіанті здійснення зазначене перше антитіло має амінокислоту, відмінну від Гуз, Їеи або Меї у положенні 409, таку як амінокислота, обрана із групи, яка включає су,
Аа, мМаї, Пе, Зег, ТНиг, Аго, Ні, Асп Азп, Сім, Сп, Тгр, Ре або Туг у положенні 409, а зазначене друге антитіло має амінокислоту, відмінну від Рпе, у положенні 405, таку як амінокислота, обрана із групи, яка включає Су, Аа, Маї, І ем, Пе Зег, ТАг, Гуз, Аго, Нів, Авр, Авп, Си, Сп, Тгр,
Меї або Туг у положенні, що відповідає 405 в ІдсС1. В іншому варіанті здійснення даного винаходу зазначене перше антитіло має амінокислоту, відмінну від Гує, Ге або Меї, у положенні 409, а зазначене друге антитіло має амінокислоту, відмінну від Рпе, Агуд або су, у положенні 405.
В іншому варіанті здійснення зазначене перше антитіло містить Рпе у положенні 405 і амінокислоту, відмінну від Гу, І еи або Меї у положенні 409, а зазначене друге антитіло містить амінокислоту, відмінну від Ре, у положенні 405, і Гуз у положенні 409.
В іншому варіанті здійснення зазначене перше антитіло містить Рпе у положенні 405 і Агд у положенні 409, а зазначене друге антитіло містить Геи у положенні 405 і Гуз у положенні 409. У варіантах здійснення, де антитіла є ізотипами Ідс1, Ідс2 або ІдС3, перше антитіло може містити заміну Е405І, а друге антитіло може містити заміну К409К, або навпаки. Однак у варіантах здійснення, де антитіла є обома ізотипами Ідс54, амінокислота в положенні 409 природно є Ага (К). Таким чином, у таких варіантах здійснення перше антитіло не заміщене в положенні 409, але природно має К409, а друге антитіло містить заміни 4051 і К4О5К, або навпаки; друге антитіло не заміщене в положенні 409, але природно має К409, а перше антитіло містить заміни Е405І ї К40О5К. У варіантах здійснення, де одне або обидва з поміж першого й другого антитіл мають ізотип Ідса4.
Відповідно, в одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом може містити заміну, яка відповідає Е405Ї у людському ІдО1. В іншому варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом може містити заміну, що відповідає К409К у людському ІдС1. Такі два різні антитіла підходять для одержання біспецифічних запропонованих винаходом антитіл.
В найкращому варіанті здійснення перше антитіло запропоноване винаходом містить заміну
Е405І. і 4300, а друге антитіло запропоноване винаходом містить заміну К409К і Е4300. Таким чином, забезпечуються антитіла, які можуть формувати біспецифічні запропоновані винаходом антитіла, причому біспецифічні антитіла містять першу половинну молекулу, що містить заміни
Е405І їЕ4300, і другу половинну молекулу, що містить К4О9КяЕ4300, при використанні Ідс1 для нумерації. У варіантах здійснення, де ізотипом є Ід54, перша половинна молекула містить заміни Е405І -Кк409Ка-Е430б, а друга половинна молекула містить Е430б при використанні
Ід904 для нумерації. Бажано в таких варіантах здійснення Ідс4 центральна шарнірна область заміщена з амінокислотної послідовності "СРС" на послідовність "СРРС", щоб зробити біспецифічне антитіло більш стабільним іп мімо і/або іп міго у порівнянні з антитілом Ідсе4, що має центральний шарнір СРО. 60 В одному варіанті здійснення винаходу перше антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 16, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 17, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 18, ії МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІО МО: 20, і послідовність СОК2: КАФ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 21 (0101, ії Ес область, яка містить заміну Е405І і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Есо-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-Бс, є замінами в одному або декількох положеннях амінокислот, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430С, Е345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е345О0, ЕЗ345Е, ЕЗ345У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
В іншому варіанті здійснення винаходу перше антитіло включає УН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 16, послідовність СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 17, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 18, ії МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІО МО: 20, і послідовність СОК2: КАФ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 21 (010); ії Ес область, яка містить заміну К409К і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
В іншому варіанті здійснення винаходу перше антитіло включає УН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 9, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 10, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 11, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 113, і послідовність СОК2: ААФБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 14 005); і Ес область, яка містить заміну Е405І і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
У ще одному варіанті здійснення винаходу перше антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 9, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 10, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 11, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 113, і послідовність СОК2: ААФБ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 14 І005); і Ес область, яка містить заміну К409Е. і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
В одному варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 23, послідовність СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 24, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІО МО: 27, і послідовність СОК2: МА, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 28 (016, і Ес область, яка містить заміну Е405І і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
В іншому варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 23, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 24, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 25, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІО МО: 27, і послідовність СОК2: МА, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 28 016); і Ес область, яка містить заміну К409Е. і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Есо-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
В іншому варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 2, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 3, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІО МО: 4, і МІ. область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в ЗЕО ІО МО: 6, і послідовність СОК2: ЕАФ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ
МО: 7 (0041; і Ес область, яка містить заміну Е405І і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію Ес-Ес, є 60 замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає
430, 345 і 440, такі як Е430Сс, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОБР, Е430ОТ, ЕЗ3450О, ЕЗ3З45Б, ЕЗ345У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
У ще одному варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 2, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 3, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІО МО: 4, і МІ. область, яка містить послідовність СОК1, зазначену в ЗЕО ІО МО: 6, і послідовність СОК2: ЕАФ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ
МО: 7 0041; і Ес область, яка містить заміну К409К і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію Ес-Ес, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430Сс, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОБР, Е430ОТ, ЕЗ3450О, ЕЗ3З45Б, ЕЗ345У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
В іншому варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 40, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 41, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 42, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 44, і послідовність СОК2: ЕАК, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 45 (628.11; і Ес область, яка містить заміну Е4051І. і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
У ще одному варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає УН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 40, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 41, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 42, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 44, і послідовність СОК2: РАК, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 45 (628.11; і Ес область, яка містить заміну К409Е і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-Ес, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
Зо В іншому варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає УН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 47, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 48, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 49, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 51, і послідовність СОК2: МАТ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 52 І37.3|; ії Ес область, яка містить заміну Е405І і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Есо-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
У ще одному варіанті здійснення винаходу друге антитіло включає МН область, яка містить послідовність СОКІ1, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 47, послідовність СОК2, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 48, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 49, і МІ. область, яка містить послідовність
СОН, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 51, і послідовність СОК2: МАТ, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 52 ІЗ37.3Ї, і Ес область, яка містить заміну К409Е і одну або кілька мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес. У кращому варіанті здійснення, мутації, які посилюють взаємодію
Ес-гс, є замінами в одному або декількох амінокислотних положеннях, обраних із групи, яка включає 430, 345 і 440, такі як Е430с, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430ОТ, Е3450О, ЕЗ3А5Е, ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ. У кращому варіанті здійснення це Е4300.
Відповідно, винахід також відноситься до анти-СО37 антитіла, яке зв'язується 3 людським
СО37, яке містить:
БО () МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 40, послідовність
СОК2, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 41, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 42, і М. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 44, і послідовність СОК2:
ЕАК, і послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 45 |528.11, або (ї) МН область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 47, послідовність
СОВ2, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 48, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 49, ї МІ. область, яка містить послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 51, і послідовність СОК2:
МАТ, і послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 52 І37.31; (ії) і де антитіло (ії) або (ії) включає Ес область, яка містить щонайменше одну амінокислотну заміну, обрану із групи, яка включає Е430б, ЕЗ345К, Е4305, Е4ЗОР, Е430Т, Е3450, ЕЗ345Б, бо ЕЗ45У, 5440 і 5440МУ; і
(ім) де за необхідності Ес область додатково містить мутацію або К409К, або Е4051.
Як згадано вище, анти-СОЗ37-запропоновані винаходом антитіла можуть бути ізотип Ідс1,
ІЧО2, ІдО3 або Ідс4. В одному варіанті здійснення антитіло анти-СО37 по винаходу має ізотип
Іа.
В одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом є людським, гуманізованим або химерним.
В одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом зв'язується з антигенами
СО37 людини й яванського макака.
Додаткові варіанти здійснення винаходу
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до композиції, яка включає біспецифічне антитіло запропоноване винаходом, і яка додатково включає моноспецифічне анти-СО37- антитіло, бажано анти-СОЗ37-антитіло, яке має антигензв'язувальну область або з першої, або із другої антигензв'язувальної області біспецифічного антитіла.
В одному варіанті здійснення винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить запропоноване винаходом біспецифічне антитіло або анти-СО37-антитіло запропоноване винаходом й фармацевтично прийнятний носій.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до запропонованого винаходом біспецифічного антитіла, або запропонованого винаходом антитіла, або запропонованої винаходом композиції для застосування як їх медикаментів.
В одному варіанті здійснення винаходу запропоноване винаходом біспецифічне антитіло призначене для застосування його для лікування раку, аутоїмунного захворювання або запальних розладів.
В одному варіанті здійснення винаходу запропоноване винаходом анти-СО37-антитіло призначене для застосування його при лікуванні раку, аутоїмунного захворювання або запальних розладів.
В одному варіанті здійснення винаходу запропонована винаходом композиція призначена для застосування її при лікуванні раку, аутоімунного захворювання або запальних розладів.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного запропонованого винаходом антитіла для застосування його при лікуванні алергії, відторгнення трансплантата
Зо або В-клітинної неоплазії, таких як неходжкінська лімфома (НХЛ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (ХЛЛ), фолікулярна лімфома (ФЛ), мантійно-клітинна лімфома (МКЛ), плазмоклітинний лейкоз (ПКЛ), дифузійна крупноклітинна В-клітинна лімфома (ДКБКЛ) або гострий лімфобластний лейкоз (ГЛЛ).
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до біспецифічного запропонованого винаходом антитіла для застосування при лікуванні ревматоїдного артриту, такого як гострий артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагра або подагричний артрит, гострий подагричний артрит, гострий імунологічний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, артрит, індукований колагеном І типу, інфекційний артрит, артрит Лайма, проліферативний артрит, псоріатичной артрит, хвороба Стілла, артрит хребта і ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит, хронічний прогредієнтний артрит, деформуючий артрит, первинний хронічний поліартрит, реактивний артрит, і анкілозуючий спондиліт; системний червоний вовчак (СЧВ), такий як шкірний СЧВ або підгострий шкірний СЧВ, неонатальний вовчаночний синдром (НВО) і диссемінований червоний вовчак, розсіяний склероз; запальна хвороба кишківника (ЗХК), яка включає виразковий коліт і хвороба Крона, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), псоріаз, ІЗА нефропатія, (ДМ поліневропатії, міастенія гравіс, цукровий діабет, синдром
Рейно й гломерулонефрит, долонно-підошовний пустулез (ДПП), ерозивний плоский лишай, бульозний пемфігоїд, бульозний епідермоліз, контактний дерматит, і атопічний дерматит, полірадикуліт, включаючи синдром Гийена-Барре.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до запропонованого винаходом антитіла анти-СО37 для застосування його при лікуванні алергії, відторгнення трансплантата або В- клітинної неоплазії.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до запропонованого винаходом анти-
СО037-антитіла для застосування його при лікуванні алергії, відторгнення трансплантата або В- клітинної неоплазії, такої як неходжкінська лімфома (НХЛ), хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ), фолікулярна лімфома (ФЛ), мантійно-клітинна лімфома (МКЛ), плазмоклітинний лейкоз (ПКЛ), дифузійна крупноклітинна В-клітинна лімфома (ДКБКЛ) або гострий лімфобластний лейкоз (ГЛЛ).
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до запропонованого винаходом антитіла анти-СО37 для застосування його при лікуванні ревматоїдного артриту, такого як гострий бо артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагра або подагричний артрит, гострий подагричний артрит, гострий імунологічний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, артрит, індукований колагеном І типу, інфекційний артрит, артрит Лайма, проліферативний артрит, псоріатичной артрит, хвороба Стілла, артрит хребта і ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит, хронічний прогредієнтний артрит, деформуючий артрит, первинний хронічний поліартрит, реактивний артрит, і анкілозуючий спондиліт; системний червоний вовчак (СЧВ), такий як шкірний СЧВ або подгострий шкірний СЧВ, вовчаночний синдром немовлят (МІ Е) і дисемінований червоний вовчак, розсіяного склерозу, запальної хвороби кишківника (ЗХК), яка включає виразковий коліт і хворобу Крона; хронічної обструктивної хвороби легенів (ХОЗЛ), псоріазу, (ДА нефропатії, ДМ поліневропатій, міастенії гравіс, цукрового діабету, синдрому
Рейно й гломерулонефрита, долонно-підошовного пустулеза (ЛПП), ерозивного плоского лишаю, бульозного пемфігоїда, бульозного епідермоліза, контактного дерматиту й атопічного дерматиту, полірадикуліту, включаючи синдром Гийена-Барре.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до запропонованого винаходом біспецифічного антитіла для застосування його в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами. В наступному варіанті здійснення винаходу анти-СО37- запропоновані винаходом антитіла призначені для застосування їх в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами. Один або декілька додаткових терапевтичних агентів можуть, наприклад, бути обраними із групи, яка включає доксорубіцин, цисплатин, блеоміцин, кармустин, циклофосфамід, хлорамбуцил, бендамустин, вінкристин, флударабін, ібрутиніб і анти-СО20-антитіло, таке як ритуксимаб, офатумумаб, обінутузумаб, велтузумаб, окаратузумаб, окрелізумаб або ТКО-015.
У кращому варіанті здійснення винаходу додатковий терапевтичний агент є антитілом проти
Сбог20.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з людським
СО20, що має послідовності, зазначені в ЗЕО ІЮ МО: 72.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з СО20 яванського макака, що має послідовності, зазначені в БЕО ІЮ МО: 73.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з СО20 людини й яванського макака, що має послідовності, зазначені в 5ХЕО ІЮ МО: 72 і 73, відповідно.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом на СО20 людини, що не містить або не вимагає амінокислотних залишків аланіну в положенні 170 або проліну в положенні 172, але який містить або вимагає амінокислотних залишків аспарагіну в положенні 163 і аспарагіну в положенні 166 5ЗЕО ІЮО МО: 72. Прикладами таких антитіл є антитіла, позначені 2Е2 ії 708, як описано в М/О2004035607 (СептарБ), і антитіло, позначене 236, як описано в М/О2005103081 (Сепітаб). Послідовності СОК 708 наведені в
Таблиці 1.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом на СО20 людини, що не містить або не вимагає амінокислотних залишків аланіну в положенні 170 або проліну в положенні 172 з 5ЗЕО ІЮ МО: 72. Прикладом такого антитіла є 1188, як описано в МЛО2004035607 (Септаб). Послідовності СОК 1188 наведені в Таблиці 1.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з переривчастим епітопом на СО20 людини, де епітоп включає частину першої малої позаклітинної петлі й частину другої позаклітинної петлі.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло здатне зв'язуватися з переривчастим епітопом на СО20 людини, де епітоп має залишки АСІМАР малої першої позаклітинної петлі й залишки МЕЗІ.МЕІКАНТРУ другої позаклітинної петлі.
Анти-СО20-антитіла можуть характеризуватися як анти-СО20-антитіла І типу й ІІ типу. Анти-
СбОрг20-антитіла І типу, такі як офатумумаб (2Е2) і ритуксимаб, мають високу активність СОС і
АМСС але низьку апоптотичну активність, тоді як анти-СО20-антитіла || типу, такі як обінутузумаб і 1188, мають низьку або відсутню активність СОС, але високу АОСС і апоптотичну активність. Також антитіла | типу індукують СО20 до перерозподілу в більші стійкі до детергентів мікродомени (рафти), у той час як антитіла ІІ типу - немає.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, де антигензв'язувальна область конкурує за зв'язування СО20 людини з анти-СО20-антитілом, що містить послідовність варіабельного важкого ланцюга (УН) і послідовність варіабельного легкого ланцюга (МІ), як зазначено в ЗЕО
ІО МО: 74 і БЕО ІО МО: 78, відповідно.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, де антигензв'язувальна область конкурує за 60 зв'язування СО20 людини з анти-СО20-антитілом, що містить послідовність варіабельного важкого ланцюга (УН) і послідовність варіабельного легкого ланцюга (МІ), як зазначено в ЗЕО
ІО МО: 81 ї БЕО ІЮО МО: 109, відповідно.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, де антигензв'язувальна область конкурує за зв'язування СО20 людини з анти-СО20-антитілом, що містить послідовність варіабельного важкого ланцюга (УН) і послідовність варіабельного легкого ланцюга (МІ), як зазначено в ЗЕО
ІО МО: 94 і БЕО ІЮ МО: 98, відповідно.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, де антигензв'язувальна область конкурує за зв'язування СО20 людини з анти-СО20-антитілом, що містить послідовність варіабельного важкого ланцюга (УН) і послідовність варіабельного легкого ланцюга (МІ), як зазначено в ЗЕО
ІО МО: 87 ії БЕО ІЮО МО: 91, відповідно.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, де антигензв'язувальна область конкурує за зв'язування СО20 людини з анти-СО20-антитілом, що містить послідовність варіабельного важкого ланцюга (УН) і послідовність варіабельного легкого ланцюга (У), як зазначено в 5ЕО
ІО МО: 101 ї БЕО ІО МО: 105, відповідно.
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, що містить послідовності СОЕБ:
МН СОК послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 75,
МН СОК2 послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО: 76,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 77,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 79
МІ. СОК2 послідовність БА5, і
МІ СОмЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 80. 1708)
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло включає антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, що містить послідовності СОЕБ:
МН СОК послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІО МО: 82,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО: 83,
Зо МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 84,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 85
МІ. СОК2 послідовність БА5, і
МІ. СОЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 86. 11881)
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, що містить послідовності СОЕБ:
МН СОК послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 95,
МН СОН послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО: 96,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 97,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 99,
М СОКО2 послідовність АТ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 100. |Ритуксимаб
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло включає антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, що містить послідовності СОК:
МН СОК послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО: 88,
МН СОН послідовність, зазначену в 5ЗЕО ІО МО: 89,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 90,
МІ. СОМ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 92,
МІ. СОК2 послідовності ОА, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 93. (Офатумумаб
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СО20 людини, що містить послідовності СОЕБ:
МН СОК послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 102,
МН СОК2 послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 103,
МН СОКЗ послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 104,
МІ СО послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 106
М СОК2 послідовність ОМ, і
МІ СОМЗ послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО: 107. (обінутузумаб)
В одному варіанті здійснення винаходу анти-СО20-антитіло містить антигензв'язувальну область, здатну зв'язуватися з СЮО2О людини, що включає послідовності СОК, обрані із групи, 6о0 яка складається з:
ї) МН СОК'І послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 75,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗХЕО ІЮО МО: 76,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 77,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 79
М СОКЗ2 послідовності БАЗ, і
МІ СОМ послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 80. (7081; ї) МН СОКТІ1 послідовності, зазначеної в 5ХЕО ІЮ МО: 82,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 83,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 84,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 85
МІ. СОК2 послідовності ОА, і
МІ СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 86. (11881); ії) МН СОКІ1 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 95,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 96,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 97,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 99,
МІ. СОК2 послідовності АТ5, і
МІ. СОМЗ послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ МО: 100. (Ритуксимабі; їм) МН СОКТІ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 88,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 89,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮО МО: 90,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 92
МІ. СОК2 послідовності ОА, і
МІ СОМЗ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 93. (Офатумумабі; і м) МН СОН послідовності, зазначеної в ХЕО ІЮ МО: 102,
МН СОК2 послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮО МО: 103,
МН СОКЗ послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮО МО: 104,
М. СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 106
М СОг2 послідовності ОМ, і
Зо МІ СОМ послідовності, зазначеної в ЗЕО ІЮ МО: 107. |Обінутузумабі.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до застосування запропонованого винаходом біспецифічного антитіла або запропонованого винаходом анти-СОЗ37-антитіла для виготовлення медикаменту. В іншому варіанті здійснення даного винаходу його застосовують для виготовлення медикаменту для лікування раку, аутоїмунних захворювань або запальних захворювань, таких як алергія, відторгнення трансплантата або В-клітинна неоплазія, така як неходжкінська лімфома (НХЛ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (ХЛЛ), фолікулярна лімфома (ФЛ), мантійно-клітинна лімфома (МКЛ), плазмоклітинний лейкоз (ПКЛ), дифузійна крупноклітинна В-клітинна лімфома (ДКБКЛ) або гострий лімфобластний лейкоз (ГЛЛ), ревматоїдний артрит, такий як гострий артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагра або подагричний артрит, гострий подагричний артрит, гострий імунологічний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, артрит, індукований колагеном ІІ типу, інфекційний артрит, артрит Лайма, проліферативний артрит, псоріатичной артрит, хвороба Стілла, артрит хребта, і ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит, хронічний прогредієнтний артрит, деформуючий артрит, хронічний первинний поліартрит, реактивний артрит і анкілозуючий спондидіт, системний червоний вовчак (СЧВ), такий як шкірний СЧВ або підгострий шкірний
СЧВ, неонатальний вовчанковий синдром (НВС) і дисемінований червоний вовчак, розсіяний склероз, запальна хвороба кишківника (ЗХК), яка включає виразковий коліт і хворобу Крона, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), псоріаз, ІдА нефропатія, дм поліневропатії, міастенія гравіс, цукровий діабет, синдром Рейно, і гломерулонефрит, долонно- підошовний пустулез (ДПП), ерозивний плоский лишай, бульозний пемфігоїд, вроджений бульозний епідермоліз, контактний дерматит і атопічний дерматит, полірадикуліт, включаючи синдром Гійена-Барре.
В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу індукції загибелі клітин або інгібування росту й/або проліферації пухлинної клітини, яка експресує СЮО37, який передбачає введення індивідуумові, який цього потребує, ефективної кількості запропонованого винаходом біспецифічного антитіла або запропонованого винаходом анти-СОЗ7-антитіла. У деяких варіантах здійснення цей спосіб призначений для лікування індивідуума, який має алергію, відторгнення трансплантата або В-клітинну неоплазію, таку як неходжкінська лімфома (НХЛ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (ХЛЛ), фолікулярну лімфому (ФЛ), мантійно-клітинну лімфому бо (МКЛ), плазмоклітинний лейкоз (ПКЛ), дифузійну крупноклітинну В-клітинну лімфому (ДККВКЛ)
або гострий лімфобластний лейкоз (ГЛЛ), де спосіб передбачає введення зазначеному індивідуумові ефективної кількості запропонованого винаходом біспецифічного антитіла або запропонованого винаходом анти-СОЗ7-антитіла. У певних варіантах здійснення спосіб передбачає введення одного або декількох додаткових терапевтичних агентів у комбінації із зазначеним антитілом або зазначеним біспецифічним антитілом, таких як, наприклад, доксорубіцин, цисплатин, блеоміцин, кармустин, циклофосфамід, хлорамбуцил, бендамустин, вінкристин, флударабін, ібрутиніб або анти-СО20-антитіло, таке як ритуксимаб, офатумумаб, обінутузумаб, велтузумаб, окаратузумаб, окрелізумаб або ТКО-015.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу додатковий терапевтичний агент обраний із групи, яка включає: циклофосфамід, хлорамбуцил, бендамустин, іфосфамід, цисплатин, карбоплатин, оксаліплатин, кармустин, преднізон, дексаметазон, флударабін, пентостамін, кладрибін, фторурацил, гемцитабін, цитарабін, метотрексат, пралатрексат, гемцитабін, вінкристин, паклітаксел, доцетаксел, доксорубіцин, мітоксантрон, етопозид, топотекан, іринотекан, блеоміцин, СО20-специфічний ритуксимаб, обінутузумаб і офатумумаб, СО52- специфічний алемтузумаб, СОЗО-специфічний брентуксимаб, УМУ-63709178, 9М9У-64007957,
НиМах-ІІ.8, анти-ОК5, анти-МЕСЕ, анти-СО38, анти-РО-1, анти-РО-І1, анти-СТІ А4, анти-СО40, анти-СО137, анти-СІТЕК, анти-міІ5ТА, специфічні антитіла для інших імуномодулюючих мішеней, брентуксимаб ведотин, НиМах-ТАС-АОС, інтерферон, талідомід, леналідомід, аксикабтаген силолейсел, бортезоміб, ромідепсин, беліностат, вориностат, ібрутиніб, акалабрутиніб, іделалісиб, копанлісиб, сорафеніб, сунітиніб, еверолімус, рекомбінантний людський ТРЕАЇГ., біринапант і венетоклакс.
В одному варіанті здійснення винаходу додатковий терапевтичний агент обраний із групи, яка включає ібрутиніб, ритуксимаб, венетоклакс, СНОР (циклофосфамід, доксорубіцин, вінкристин і преднізон), бендамустин, флударабін, циклофосфамід і хлорамбуцил.
В одному варіанті здійснення винаходу додатковий терапевтичний агент обраний із групи, яка включає ібрутиніб, ритуксимаб і венетоклакс.
У додатковому аспекті винахід відноситься до нуклеїновокислотної конструкції, яка кодує одну або кілька послідовностей, представлених у таблиці 1. У додатковому аспекті винахід відноситься до нуклеїновокислотної конструкції, яка кодує одну або кілька послідовностей,
Зо обраних із групи, яка включає ЗЕО ІЮ МО: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ба, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1За, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20а, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 27а, 28, 29, 30, Зба й 31.
Винахід також відноситься до нуклеїновокислотної конструкції, яка кодує МН і/або МІ. область біспецифічного антитіла або анти-СО37 антитіла за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу.
Винахід також відноситься до нуклеїновокислотної конструкції, яка кодує біспецифічне антитіло або анти-СО37-антитіло за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу.
У додатковому варіанті здійснення винахід відноситься до вектора експресії, що містить одну або декілька нуклеїновокислотних конструкцій, зазначених вище. В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до клітини-хазяїнів, які містить вектор експресії, як визначено вище.
Вектор експресії в контексті даного винаходу може бути будь-яким придатним вектором, включаючи хромосомні, нехромосомні й синтетичні нуклеїновокислотні вектори (нуклеїновокислотну послідовність, що містить придатний набір елементів контролю експресії).
Приклади таких векторів включають похідні 5М40, бактеріальні плазміди, фагову ДНК, бакуловірус, дріжджові плазміди, вектори, отримані з комбінацій плазмід і фагової ДНК, і вектори вірусної нуклеїновой кислоти (РНК або ДНК). В одному варіанті здійснення нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло анти-СО37, утримується у векторі з депротеїнізованою ДНК або
РНК, включаючи, наприклад, елемент лінійної експресії (як описано, наприклад, в 5уке5 апа
Чопп5іоп, Маї Віотесі 17, 355 59 (1997), компактований нуклеїновокислотний вектор (як описано, наприклад, в 5 6077835 і/або МО 00/70087), плазмідний вектор, такий як РрРВК322, РОС 19/18 або рис 118/119, нуклеїновокислотний вектор МІЮОСЕ мінімального розміру (як описано, наприклад, в Зспакомухкі еї аїЇ., Мої Тег 3, 793 800 (2001)), або у вигляді векторної конструкції осадженої нуклеїновой кислоти, такий як конструкція з осадженого СарО4 (як описано, наприклад, в УМО200046147, Вепмепівїу) і Ке5пеї, РМАЗ ОЗА 83, 9551 55 (1986), УМідіег еї а!., Сеїї 14, 725 (1978) і Согаго апа Реагзоп, Зотаїс Сеї! Сепеїйсз 7, 603 (1981)). Такі нуклеїновокислотні вектори та їх використання добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, 05 5,589,466 і 5 5,973,972).
В одному варіанті здійснення вектор придатний для експресії антитіл анти-СО37 у бактеріальній клітині. Приклади таких векторів включають вектори експресії, такі як Вісезсгірі бо (Зігаїадепе), вектори ріМ (Мап НеекКе 5 5спизіег, У Віої Спет 264, 5503 5509 (1989), вектори рЕТ
(Момадеп, Мадізоп УМ) тощо).
Вектор експресії може також або альтернативно бути вектором, придатним для експресії в дріжджовій системі. Може бути використаний будь-який вектор, придатний для експресії в дріжджовій системі. Придатні вектори включають, наприклад, вектори, які містять конститутивні або індуцибельні промотори, такі як альфа-фактор, алкогольоксидаза й РОН (огляд: РЕ. А!,зибеї еї аї., ед. Сцтепі Ргоїосої!в5 іп Моїіесціаг Віоіоду, Стеепе Рибіїзпіпа апа УМіїеу Іпіегзсіепсе Мем/ МоїК (1987), і Огапі єї аї., Меїпоавз іп Епгутої 153, 516 544 (1987)).
Вектор експресії може також або альтернативно бути вектором, який підходить для експресії в клітинах ссавців, наприклад, вектором, що містить глутамінсинтетазу як селектований маркер, таким як вектори, описані в Веббіпоїп (1992) Віоїтесппоіоду (МУ) 10: 169-175.
Нуклеїнова кислота й/або вектор також можуть містити нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує послідовність секреції/локалізації яка може направляти поліпептид, такий як утворений поліпептидний ланцюг, у периплазматичний простір або в середовище для культивування клітин. Такі послідовності відомі в даній галузі й включають лідер секреції або сигнальні пептиди.
Вектор експресії може містити або бути пов'язаний з будь-яким придатним промотором, енхансером та іншими елементами, які полегшують експресію. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, людський промотор/енхансер СММ МЕ, а також КМ, 5М40, 513 3, ММТМ і НІМ ІТК промотори), ефективні полі (А) терминаційні послідовності, джерело реплікації для плазмідного продукту в Е.сої, ген стійкості до антибіотика як селектований маркер й/"або зручний сайт клонування (наприклад, полілінкер). Нуклеїнові кислоти можуть також містити індуцибельний промотор, на відміну від конститутивного промотору, такого як СММ ІЕ.
В одному варіанті здійснення вектор експресії, який кодує антитіло анти-СО37, може бути розташований і/або доставлений до клітини-хазяїна або тварини-хазяїна через вірусний вектор.
Таким чином, даний винахід також відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, яка продукує запропоновне даним винаходом біспецифічне антитіло, такої як трансфектома.
Винахід, крім того, відноситься до антиїдіотипового антитіла, яке зв'язується з
Зо антигензв'язувальною областю антитіла або біспецифічним антитілом запропонованим винаходом.
Спосіб виявлення іп міго присутності людського антигену СО37 або клітини, яка експресує людський СОЗ37, у зразку, причому зазначений спосіб включає: () забезпечення контакту зразка з біспецифічним антитілом за будь-яким з вищевказаних варіантів здійснення або з антитілом за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу за умов, які забезпечують утворення комплексу між антитілом або біспецифічним антитілом і с037;і (ії) детекцію утворення комплексу.
Спосіб іп мімо для виявлення присутності людського антигену СОЗ37 або клітини, яка експресує людський СО37 у суб'єкта, причому зазначений спосіб включає: () уведення біспецифічного антитіла за будь-яким з вищевказаних варіантів здійснення або антитіла за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу за умов, які забезпечують утворення комплексу між антитілом або біспецифічним антитілом і СО37; а також (ії) детекцію утворення комплексу.
Послідовності
Таблиця 1
ЕМОЇ МЕЗОСССОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБОББ5І ЗТ МОМ5УМАВОАР 1 Ун-004-Н5БІ 2 екагеЕмуУЗиУ55УаАМУМАБМАКИаВЕТІЗВОМКМТІ М ОММ5
ГААЕОТАМУУСАНЕХСаАЗЗЗОМІЕБІ МмСсОСТІ МТУ
АОМІ ТОБРОРІ БАБМАОВМТІТСОАБОБЗУУМЗОМІ АМУМООКР
5 МІ-004-НБІ2 СКАРК ІМЕАБКІ АБИМРОВЕКазавзаТЕНЕТІ ТІЗ5І ОРООЮОБА
ТУУСОСЕЕЗСІЗАОСТАРСИОСТКМЕК
6 |мнооанясовВІ (о5МУМВОМ 77777711 11111 змМнобаНньяаСрва |вАЗСС////////////7777777777777777771111111111111С1
Таблиця 1 одне ПОДОКОНА
МНн-005-Н112 екагеЕмМІаТпмАЗамМмтруАБУМАКИвВЕТІЗКТЗТТУМІ КІТЗРТА
ЕОТАТУЕСАВЕ,ЗУМСААРОРМУСОСТІ МТУ 8 |мнооБ-Не-совВІ |СЕБІЗЗМАЇГ/-/:777777777777111111111111111СсСсС озоднене оон 12 МІ -005-НІ112 КАРКОПІМАА5ТІ АБСОМРЗЕНЕКОЗИаБИТтоОгТІ ТЗІ ОРЕОБАТ жмусодах5МЗМоМТЕасатТкМЕїКк 11111101 0Мо05-Не-СоВа ФААВС//77777777777111111111111111111111111ССсСсС озон ОО о
МН-010-НБІ2 еКагеЕмУЗПЕАЗавтТруАБУМУАКаВЕТІЗВОМКМТІ М 'ОММ5
ГААЕОТАМУУСАВЕСЗТМУарАСОРМУСОСТІ МТУ озоднене ОК ТК 19 МІ -010-НБІ 2 РКСІНКАЗБТ АБауРЗАЕКОаБаЗаИатЕНЕТІ ТІЗБІ ОРООСБАТУУ
СсОобахУЗМОМІОМТ Раса ТКкМЕїКк 10111101 0МсоТ-НБІ2-СОВа ІКАВ СС
КЕ о у 22 МН-016-НБІ2 екагеЕМУУ5мМмІВАБаттуУУАТМАКИаВЕТІЗВОМКМТІ М ОММ
ЗІ ВАЕОТАТУУСАВЕ І МРазЗУХОЇМУСсОСТІ МТУ омозннне МВ 26 МІ -016-НБІ 2 АРКЕРИМУАБМІ РЕБМРОВЕКазазаТЕНЕТІ ТІЗОІ ОРООБАТУ
УСОСАрУаЗТУМААгаса ТКМЕїК 10011101 ДМІО16-НБІ2-СОВа (МАВ оводеенносюю ПДК КВ ВА 29 МІ -016-Н5БІ 2-7905 АРКЕРИМУАБМІ РЕБМРОВЕКазазаТЕНЕТІ ТІЗОІ ОРООБАТУ
УСОБАЮУаЗТУУААгаса ТКМЕК
МІ-016-Н5БІ 2-С905-
МІ-016-Н5БІ 2-С905- в
ОМОЇ МОБЕАЕУККРИаАБУКУЗСОАБИМАЕЗМЕМІНМУВОАР
І АБ АБАОТАУУУСАВУаРєРУЗУ ОВрЗРОЮМУУМОУМСКИТТ
МІм55 оз 00 КОМОЮ ВВ 36 МІ-Ь12 ОАРАЇ МІНОМЗМААЗИІЗОВЕЗОаБаБОаТОЕТІ ТІТАМЕРЕОГЕАГ
УУСОоУУаАБЗУТЕсСОСТКІ ЕВК
Таблиця 1 11100 0Ме-2е-сроВва 7 (08111111
АМОЇ ООБОРЕЇЕКРОАЗУКІЗСКАЗОУЗЕТаУМмММуУУКОММ 39 Ун-а28.1 СК ЕУЛаМІОРУМаСТ ГИМАКЕКОаКАТІ ТМОКЗЗЗТАММОЇ К
ЗІ Т5ЗЕОБАУУУСАнЗУСРМОУМ СОС ЗУ ТУ
РІОМТО5РАБІ БАБМЕЕТМТІТСАТЗЕМУУЗМІ АМУуУМООКОСК 43 М -а281 ЗРОГГМЗЕАКТ АЄЕМРЗАЕЗОБИаБИТОгБ5ІКІЗВІ ОРЕОЗОЗ
МЕСОННЗОМРУТРССИаСИТЕГ ЕК 11110 0фмМе-неавлсрна ІРАК
ОМОМУКЕБаРИОЇ МАРБОБІ БІТСТУБИаБР5І ТТЗаУЗУМУУВОРРаАа 46 МН-37.3 кагем смімусравтминНвзаА КІ ІККОНЗКЗОМРНІКІ МІ.
ОТроОтТАТУУСАКОаСУ5ВІ АНУСОСТІ МТУБА
РІОМТО5РАБІ БМУЗМИЕТМТІТСВАБЗЕМІВЗМІ АУУуМООКОСКВ
МІ-37.3 РОГГУММАТМІ АИМРЗАЕЗОБОБИТОМБІ КІМ ОБЕВРИТ жмесонУматтутгеа,асатки Ек 001100 1Ме-8378-60н2а ОО ЇМАТГ//1111111111111111111111111
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНБІ ЕР
БЗ Ідс1-Ес РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТС УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ОБООаЗЕРІ КІТ ОК
ЗАМ ОдамМуЕЗСЗУМНЕАІНМНУТОКОІ 5І РОК
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУЕРЕРУТУБУУМ
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР
БА ІдС1-Ес-деїк РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТС УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ЮОБОраЗЕРІ УЗКІТМОК
ЗАМ ОдамМуЕЗСЗУМНЕАІНМНУТОКОІ 5І ЗРО.
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР
ББ І9с1-Е4300-Ес РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОМ МОКЕУКСКУЗМКАЇ.
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТС УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ОБООаЗЕРІ КІТ ОК
ЗзеМмОдамМУЕ5СЗУМНОИАІ НМНУ ТОКБІ БІ Рак
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ 56 Ідс21-Е3458-Ес МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І СОаРБЗМУБІ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВУУЗМІТМІ НОБУУ-.МИаКЕМКСКМУЗМКАЇ.
Таблиця 1
РАРІЕКТІЗКАКСОРАВРОУУТІ РРОВЕЕМТКМОУЗІ ТС УКО
ЕУРЗОІАМЕМ/ЕЄМСОРЕММУКТТРРМІ О5ОС5ЕРІ УЗКІТУОК
ЗВМ/ООСМУЕ5СЗУМНЕАІ НМНУТОКУІ І ЗРОК
АЗТКОРБЗМЕРІАРЗЗКУТЗСОТААЇ ОСІ УКОУЕРЕРУТУЗМІМ
ЗСАЇ ТЗСУНТЕРАМІ О55С1 91 55УУТУРУЗЗВІ СТОТМІСМУ
МН!КРОМТКУОКАВУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЦ СОРБУБІ ЕР ву 0 Пост-ваОБІсво РКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОМЗНЕОРЕУКЕММ УУОСУЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМУТУВУУМІ ТМІ НОВУ МОКЕУКСКУЗМКАЇ.
РАРІЕКТІЗКАКСОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗІ ТС УКС
ЕУРЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУКТТРРМІ 5005 УК ТУОК
ЗВМ/ООСМУЕ5СЗУМНЕАІ НМНУТОКУІ ЗІ РОК
АЗТКОРБЗМЕРІАРЗЗКУТЗСОТААЇ ОСІ УКОУЕРЕРУТУЗМІМ
ЗСАЇ ТЗСУНТЕРАМІ О55С1 91 55УУТУРІЗЗВІ СТОТМІСМУ
МН!КРОМТКУОКАВУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЦ СОРБУБІ ЕР
БВ осі КОЗА РКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОМЗНЕОРЕУКЕММ УУОСУЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМУТУВУУМІ ТМІ НОВУ МОКЕУКСКУЗМКАЇ.
РАРІЕКТІЗКАКСОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗІ ТС УКС
ЕУРЗОІАУЕМ ЕЄМСОРЕММУКТТРРМІ О50С5ЕРІ У5ВІ ТУ
КЗВМ/ООСМУЕЗСУУМНЕАІ НМНУТОКЗІ ЗІРОК
АБТКОРБЗМЕРІАРЗЗКУТЗСОТААЇ ОСІ УКОУЕРЕРУТУЗМІМ
ЗСАЇ ТЗСУНТЕРАМІ О55С1 51 55УУТУРІЗУВІ СТОТМІСМУ
МА!КРОМТКУОКВУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЦ СОРБУБІ ЕР
РКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУОМЗНЕОРЕУКЕММ УУОСУЕМНМ
59 ПоСТ-Р405І-Е4300-Ес| АКТКРВЕЄОУМОТУВУУ МІ ТМІ НОМ МОКЕУКСКУЗМКА!.
РАРІЕКТІЗКАКСОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗІ ТС УКС
ЕУРЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУКТТРРМІ 05025 УК ТУОК
ЗВМ/ООСМУЕ5СЗУМНОАІ НМНУТОКОІ ЗІ РОК
АЗТКОРБЗМЕРІАРЗЗКУТЗСОТАА ОСІ УКОУЕРЕРУТУЗМІМ
ЗСАЇ ТЗСУНТЕРАМІ О55С1 91 55УУТУРІЗЗВІ СТОТМІСМУ
МН!КРОМТКУОКАВУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЦ СОРБУБІ ЕР ост -Каоев-Б4300-Ес РКРКОТІМІЗАТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУКЕММУМОСМЕУНМ
АКТКРАЕЕОУМУТУВУУМІ ТМІ НОВУ МОКЕУКСКУЗМКАЇ.
РАРІЕКТІЗКАКСОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМ ЗІ ТСІ УКО
ЕУРЗОІАУЕМ ЕЄМСОРЕММУКТТРРМІ О50С5ЕРІ У5ВІ ТУ
КЗВМ/ООСМУЕЗСЗУМНОА!І НМНУ ТОК ЗІРОК
ВТМААРЗМЕЕРРЗОЕОГКЗСТАЗУУХЛЛЯІМЕУРЕЕАКМОМІК в1 Каппа-С МОМАІ О5СМЗОЕЗУТЕООЗКОЗТУВІ 55ТІ ТІ ЗКАОУЕКНКУ
УАСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМВОЕС
М5АОЕБСІ ЗИКУРСЕМЕМСЕЕЕМІ СЗПЕСЕСМИОКТОЕМОЕ
МОІАЕМРІ ОМ/ЗКМІ АІЗСІЕТ МСА ССУСАЇ КЕ ЕХО У
ЕОМ І ГАТОЇТІ СІИЗТОВАОІ ЕНЗІ ВОУУЕКТІОКУСТМРЕ
62 | Людський СОЗ7 ЕТААЕЕЗМ/РУМОБОЇ ВСССМ/НУРООМ/ЕОМІ І ВОМОЗЕАНВ
МРСЗСУМІ ЗАТМОЄТІЇ ОКМІЇ РОЇ 5ВІ СНІ АВЗАНОАПІСАМУР
АЕЗНІУВЕССАОСІ ОКУ НММИІЗІМСІСІ СУС ЕІ СЕМТІ 8І
РІГСВМІОНУУМАГАВУВ
М5АОЕБСІ ЗИКУ РІ ЕМЕМІ РЕМ ОЗПЕСЕСМЛООКТОЕМОЕ
МОІАЕМРІ ОЇМ/ЗКМІ АІЗСМЕТМОСГ АП ССУСАЇ КЕ ЕХО. соз7 Макака- УЕСМІШІ ЕАТОЇТІ СІНЗТОВАОІ ЕВЗІО0ІМЕКТІОКУНТМР 63 | рабоіда(тісозт) | ЕЕТААЕЕЄМ/ОУМОРОЇ АССОМ НВРОГМУРОМІ ТІ. ВОМС ВА
НАУРСЗСУМІ ЗАТМО5ТІЇ ОКМІЇ РОЇ. УВІ СО АВЗАНеТОІСА
МРАМУНІУВЕССАВЗІ ОКУ. НММИ5ІМСІСІ СМС ЕІ СЕМ.
ЗІ. СВМІОНУУМВІАВУВ
МУЛУ ВІТ. МУ/РМУМ'АВАОГЕВЗІАБУМЕКТІОКУС
ТМРЕЕТААЕЕЗМ/ОУУОГОЇ ВСССОМ/НУРОЮМУ ОМ ВОМОЗ 64 |СО37ЕСО-ЕСНІів ЕАНВУРСУСУМІ ЗАТМОЗТІЇ ОКМІЇ РОЇ ЗВІ СНІ АВЗАНОАОІ
САМРАЕЗНІУВЕССАОСІ ОКУ. НММРКОСОКТНТСРРОРАР
ЕАЕСАРЗУЕІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕМКЕ
Таблиця 1
МУУУрамЕУНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАМММІ ТМ НОБУУІ МИ
КЕУКСКУ5ЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКИИОРАЕРОММУТІ РРОВЕЕМТ
КМОМ5І ТС УКаЕМРЗБОІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТАРРМІ 050 аЗЕР ЗК ТУОКЗАМООС,ММУЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5
ЗРакнннннннн
МУ ВІ УМ С С С М/ РМУУМАВАОІЇ ЕВ ОБІМЕКТІОКУНТ
МРЕЕТААЕЕБУ ОММОБОГАССаТмНЗРООМ РОМ ТІ Нама
ЕАНАМРОБЗСУМІ БАТМОБТІ ОКМІІ РОЇ ЗАІ СОЇ АВЗАН5ТОЇ
САМРАМЗНІУВЕССАН5БІ ОКУ НММРКЗСОКТНТСРРОРАРЕ 65 СОЗ7тТЕСО-ЕСНІв АЕСАРБЗУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУММОУЗНЕОРЕМКЕМ
М УУрамЕУМНМАКТКРАЕЄОМУМЗТУВУУМІ ТМ НОСІ МО К
ЕУКСКМЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКИОЮРАВЕРОМУТІ РРЗВЕЕМТК
МОМ5І ТС УКОЕМРЗОІАМЕМЕЗМООРЕММУКТАРРМІ О5ОС
ЗЕ УЗКІ ТМОКЗАУМООСМУЕЗСЗММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І 5
Ра7акннннНннНнНн
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І. СОаРБЗМУБІ ЕР
Ідс1-Е405І -ЕЗ45А РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВАВРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМУБІ ТОЇ УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМ ОСС, ЗЕ УБКІТМОК
ЗАМ ОдамМуЕЗСЗУМНЕАІНМНУТОКОІ 5І РОК
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИаСсТААЇ СС УКОМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР 67 І9С1-Е405І -ЕЗАБК РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКСИОРАКРОМУМУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТС УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМ ОСОБ КІСТМОК
ЗАМ ОдамМуЕЗСЗУМНЕАІНМНУТОКОІ 5І РОК
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР
І9С1-Е405І -Е4305 РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБОУМІ МОКЕУКСКМУ5МКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТС УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМ ОСС, ЗЕ УБКІТМОК зеМмОодаммуЕ5СЗУМНЗАЇНМНУТОКОІ 5І Рак
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІГ О55ИЇ УБІ 55БММТУРЗББІ аТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР
І9С1-К4098-ЕЗАБВ РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВАВРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМУБІ ТОЇ УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ЮОБОраЗЕРІ УЗАГТУО
КЗАМОдСаММЕ5СЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОІ 5І Рак
АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М
ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІ О55БИЇ УБІ 55БММТУРЗББІЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР 70 Ід9с1-К4098-ЕЗАБК РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУ РУУИВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКСИОРАКРОМУМУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ЮОБОраЗЕРІ УЗАГТУО
КЗАМОдСаММЕ5СЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОІ 5І Рак заАГТЗамНтТЕРАМГ ОЗ БІ ЗЗУМТУРЗЗБІаТОТМІСММ
Таблиця 1
МНКРОМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І! ССРБМУНІ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУЗНЕОРЕУКЕМУ УУВИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУБМІ ТМІ НОБУУЛІ МЕКЕМКОСКМУЗМКАЇ
РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТС УКОа
ЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ ЮОБОраЗЕРІ УЗАГТУО
КкЗеАМмОдамММЕ5СЗУМНЗАЇІ НМНУТОКОІ 5І Рак
МТТРАЕМЗ5УМаТЕРАЕРМКОаРІАМОЗОИРКРІ ЕВАМ55І МаРТ
О5БЕЕМАЕЗКТІ САМОЇММаї ЕНІАІ ССО МІРАСІМАРІСУТУМУ
УР УСаСІММИЗавБІ ГГ ААТЕКМЗАКСІ УКаКМІММ5І 5І БАХА 72 СО20 людини СМІЇ ЗІМОЇ МІКІЗНЕ КМЕБ5І МЕІВАНТРМУІМІУМСЕРАМРЗЕК
МЗРОТОМОСУБІОБІ НГ СП ЗММІЕАБЄРОБЇ МІАВВІМЕМЕМУКАТО
ЗАРКОМІМІ І ЗАЕЕККЕОТІЕІКЕЕУМаЇ ТЕТ5ЗОРКМЕЕПІВЕ Р
ІОЕЕЕЕЕЕТЕТМЕРЕРРОБСОЄЗЗРІЕМОЗ5Р
МТТРАЕМЗ5УМаТЕРАЕРМКОаРІАМОРОРКРІ І ААМ55І МаРТО
ЗЕЕМАЕБЗКАЇ ССАМОЇММаї ЕНІАЇ СОЇ МІРАСІМАРІСУТУМ/ У
РІ ММСІММИЗаві ЇЇ ААТЕКМЗАКСІ УКОКМІММ5І 5І ГААІВа
СО20 яванського 73 макака МІ ЗІМОІМІКІЗНЕ КМЕБЗІ МЕІВМНТРМІМІММСЕРАМРБЗЕКМ
ЗРОТОУСУБІОБІ РІ СІ ЗММІ ТЕАЄРОБЇ МІАСІМЕМЕУ ВА ТО5
АРКЗЗУМИЇ ЗАЕЄЕЕККЕОМІЕІКЕЕУМа! ТЕТЗ55ОРКМЕЕОІЕ ПРІ
ОЄЕЕЕЕЕТЕТМЕРЕРРОВОЄЕЗЗРІЕМОБОР
ЕМОЇ МЕЗОСІСОЇ МОРОВБІ ВІ БСААЗИЕТЕНОМАМНУУВОАР
74 мн с0р20-708 касет МЗатамАрЗУКавВЕТІЗАОМАКМ5І МОМ
М5І ВАЕОТАЇ УУСАКОЮчУСИСМУУМСсМОоУМаОст туту
ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАБОБЗУЗЗМУ АМУМООКРОЮ 78 М 6020-7088 АРВ ПМрАЗМААТОаІРАНЕЗИаЗаБЗа ТОНІ ТЗІ ЕРЕОБАМУУ
УСООВЗММ/РІТЕРСОСТВІ ЕК 71 |Месого-7овсова |ІрАБ 77/71 80 |МсО2го-7овсСов3 ІООВБММУРІТЇ 77777111
ЕМО УОЗОСИЇ УНРОСБІ ВІ БСТаЗаєЕТтТЕЗУНАМНУУВОАР 81 ун СсОг0-1188 скагеємУзнатавУтиАрзуУкавеЕтІзвОМУКкМ5І М 'ОММ5
ІГВАЕОМАУУУСАНОУУСасАазЕраі маморуУМмаоаттУтУ
З
7 |МесСОголівВвСоВа рАВСС///////////777777777771111111111111111111111СсСсС 86 |МісСОголіВВвСОВЗ ООВБОМУРЕТЇ 77777111
ЕМОЇ МЕЗССОЇ МОРОВБІ ВІ БСААЗаЄТЕМОМАМНУУНОАР 87 МН Срг20-офатумумабі СКОГ ЕМУЗТІЗМУМЗОБІМАрЗУКОаВЕТІЗАОМАККБІ МОМ
М5І ВАЕОТАЇ УУСАКОЮчУСИСМУУМСсМОоУМаОст туту
МІ 6020-офатумумаб
Мн срго- 9 офетувунаєсрна ГЕО
Мн срго- 0 одетмуневсова |АКОЮМОМИТЮМОУ
МІ Ссого- ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАБОБЗУЗЗМУ АМУМООКРОЮ 91 офатумумаб АРВ ПМрАЗМААТОаІРАНЕЗИаЗаБЗа ТОНІ ТЗІ ЕРЕОБАМУУ
УСООВЗММ/РІТЕРСОСТВІ ЕК
МІ 6020-
Таблиця 1
ЗЕОІО МОЇ ПОЗНАЧЕННЯ ПОСЛІДОВНІСТЬ
МІ сого-
МІ СОго- офатумумабсовз | ЗОНБММРІТ
ОМОГООРОАЕЇ УКРОАБУКМЗСКАЗСУТЕТЗУММНУУКОТР
СВСІ ЕМІСАІМРОМООТ5УМОКЕКОКАТІ ТАОК555ТАХУМОЇ.
За УН СО20-ритуксимаб | со| ТЄЕО5АУУУСАВЯТ
УУОООМУЕМУМ З АСТТУТУВА
МН СОг20- ритуксимаб вв сов вутетвук
МН Срг0-ритуксимаб вв сво увоКсот воду титуксима АВЗТУУСООМ/УЕММ
ОЇМІ 5О5РАЇЇ ЗАЗРОЕКМ ТМТСВАЗЗБЗУЗУ НМ ЕООКРОБ5Р
МІ. СОг20-ритуксимаб | КРУЛУАТОМІ АЗСУРУВЕЗО5О5СТ5У5І ТІЗВУЕАЕОААТУУ
СООМ/ТЗМРРТЕСССТКІ БІК
МІ бО20-ритуксимаб 9 сов вв
МІ бО20-ритуксимаб сот лою Крру о ритукимає ООМИТеМРРТ мн сого- ОМОГМОЗСАЕУККРОЗЗУКУЗСКАЗОХУАРЕЗУВУМММВОАР 101 обінутузумаб СОСІ ЕМ/УМОВІЕРСОСОТОУМОКЕКОВУТІТАОКОТОТАУМЕЇ. утузу 981 ВЗЕОТАУУУСАВМУРОСУМІ МУ СОСТІ ТУ
Мн сого- обінутузумаб СОК!1 СУАЕВУЗМ
МН сого- обінутузумабсово | РРООСОТ
Мн Сого- обінутузумаб совз | ААМУРОСУМІ МУ
Мі сого- ПІУМТОТРІ ЗІ РУТРОЕРАБІЗСАЗ5КЗИ НОМСІТТМ УММГОК 105 | обінутузумаб РООБРОП МОМОМІ УЗОУРОВЕЗО5С5СТОЕТІ КІЗВУЕАЕО утузу МОУУУСАОМІ ЕІ РУТЕССОТКУБЇІК
МІ сого- обінутузумаб СОК!1 КЗИ-НВМОТТУ
Мі сого-
Мі сого- обінутузумаб СОКЗ ДОМІ ЕІ РУТ
АБЗТКОРБМУЕРІ АРЗЗКЗТЗОСТААІ ОСІ УКОУЕРЕРУТУЗМУМ
ЗСАІ ТЗОУНТЕРАМІ О5501 У5І 554УТУРБББІ СОТОТМІСМУ
МНКРОМТКУОКВУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЇ І ССРОМБІ ЕР т08.00 обі 5о390332в | РКРКОТІМІЗАТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУКЕММ УУОСУЕУНМ 9 АКТКРВЕЄОУМ5ТУВМУБМІ ТМІ НОБУМІ МСКЕУКСКУЗМКАЇ.
РАРЕЕКТІЗКАКСОРВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМЗВІ ТС УК
СЕУРЗОІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5ОС5ЕНІ У5КІ ТУ
ОоКЗВУООСММУЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКЗВІ І РОК
ЕІМІ ТОЗРАТІ ЗІ 5РСЕВАТІ ЗСВАЗОЗМ5З5МІ АМ/УООКРОО 109. |м СсОг0 1188 АРВІИ МОАЗМВАТСІРАВЕ5ЗО5О5СТОЕТІ ТІЗЗІ ЕРЕОБАМУ
УСООВ5ОМ/РІ ТЕСОСТКУБЇІК
О5МЕЕБСОВІ УТРОТРІ ТІ ТСТУЗОЕВІ ЗТУОМ5УУВОАРОК 1410 мн со37-004 СІГЕМЛІСПУЗ5УСАУУАЗМАКСВЕТЕВКТОТТМОЇ КІТЗРТТЕО
ТАТУЕСАВЕУСА5ЗЗЗОМІЕЗЛМУСОСТІ УТУ55
Мн сО037-004 СОВІ (Сб 5ТМо
Таблиця 1 оон о 111 МІ 6037-004 РООРРКІ ПІУЕАЗКІ АБСОМРЗАЕКСОаЗОЗИТОгЕТІ тІЗСМООО
ААТУМСОСЕРЕЗСІЗАОСТАРаСсОТЕМУУК 6 |месоз7004соВві (о5МУМВОМ 77777711 1111 |1Месоз7004с0вн2а (БАЗ
СО
112 Мн с037-005 КагеміІапмАБамтрмуАБУАКаИВЕТІЗКТЗТТМОІКІТЗРТТЕ
ОТАТУМЕСАВНЕСЗУМС,СААБГОРМ РОТІ МТУ 8 |мнсоЗзяОоБсСоВІ |СЕБІЗЗМА ГГ: С77777777777777111111111111111СсС1С овен о 113 МІ 6037-0005 ОРРКОПМАА5ТІ АБСМРОВЕКОЗИаБИТОгЕТІ ТІЗСМЕБЗАВАА туиУсОобамЗМЗМоюМТгаааТтТЕУУУК 1111 |1Месоз7005сова ФААВС777777777777771111111111111111111111сСсСИсИЙ2Й оеодненню ООН те 114 Мн С037-010 КагеЕмІСпПЕАЗавТтруАБУАКаИаВеЕТІЗКТОТТМЕЇ КІТ5РТТЕО
ТАТМЕСАНЕСЗГМУСарАГОРМУСРСИТІ МТУ оон 115 МІ 6037-0110 РРОГИІНКАБТІ АБСМРЗА!ЕКОВОЗОТОБТІТІЗаИМОБОБААТ жмусодах5МЗМмоМТеасаТЕУМУК 11 |1Месоз7010сова |КАВ СС оодненною ОВК 116 Мн С037-016 КагемамрАБатУМАТУМАКИаВЕТОЗКТООТМЕЇІ КМТ ТТ
ЕОТАТУРСАВЕ! ГМРаззУМОІЇ МУсаОо,ті МТУ ож ОМ 117 МІ 6037-016 РРКРИММАБМІ РЕСУЗЗА!ЕКОаЗаИавБИтогТтІТІЗОЇ ЕБАВСААТУ
УСОСАрУаЗТУМААгасатТЕУМУК 1110 |1Месо37016сова |МАЗС////77777777711111111111111111111111
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Одержання специфічних до СОЗ37 антитіл у кроликів.
Експресійні конструкції для СО37
Були отримані наступні кодон-оптимізовані конструкції для експресії повнорозмірних варіантів СО37: людський (Ното 5аріеп5) СОЗ37 (інвентарний номер Сепрапк МР 001765) (ЗЕО
ІО МО: 62), СЮО37 яванського макака (Масаса Памісціагіє) (тСО37) (5ЕО ІЮО МО: 63). Крім того, були отримані наступні кодон-оптимізовані конструкції для експресії різних варіантів ЕСО СО37: послідовність, яка кодує сигнальний пептид, за якою іде другий позаклітинний домен (ЕС2) людського СОЗ37 (аа 112-241), злитий з Ес (СН2-СНЗ) доменом людського до з С-кінцевою Гіс- міткою (СОЗ7ЕС2-ЕсНіз, ЗЕО ІЮ МО: 64) і аналогічною конструкцією для тіСО37 (СОЗ7тЕС2-
ЕсНі5х, 5ЕО ІЮ МО: 65). Конструкції містили придатні сайти рестрикції для клонування й оптимальну послідовність Козака (ОССОССАСС) |Коак еї а). (1999) Сепе 234: 187-2081|.
Конструкції були клоновані у векторі експресії ссавців РСОМАЗ.3 (Іпмігодеп) або еквівалентному векторі.
Тимчасова експресія в клітинах СНО і НЕК
Мембранні білки тимчасово трансфікували в клітинах Егеевзіуїе 293-Е (НЕК2О9ЗЕ) (Ше
ІїесппоІодіех, США) з використанням 293їесіїп (Ійе есппоЇодіе5), власне, як описано виробником, або в клітинах Егеезуїе СНО-5 (СНО) (ге Тесппоіодієз) з використанням реагенту
Егеевіує Мах (І їе їесппоЇодіеєб), власне, як описано виробником. Розчинні білки тимчасово експресували в клітинах Ехрі293 (І Ше ТесппоЇодіез) з використанням реагенту Ехрітесіатіпе 293 (І їе їесппоїЇодіє5), власне, як описано виробником.
Злиті білки Ес (СОЗ7тТЕС2-ЕснНів і СО37ЕС2-ЕснНів) виділяли з надосадової рідини клітинної культури з використанням афінної хроматографії з білком А.
Імунізація кроликів
Імунізацію кроликів проводили в МАВ Оізсомегу СМВН (Нойрид, Німеччина). Кроликів багаторазово імунізували сумішшю СОЗ3З7ЕС2-ЕснНів і СОЗ7тЕС2-ЕсНі або НЕК29ЗЕ клітин, які тимчасово експресували людський СО37 або тіСО37. Кров цих тварин збирали, і виділяли В- лімфоцити. Використовуючи запатентований спосіб МАВ брізсомегу, окремі В-клітини сортували в комірки планшетів для мікротитрування й потім розмножували. Надосадову рідину від цих окремих В-клітин аналізували на специфічне зв'язування із клітинами СНО-5, які тимчасово експресують СО37 (СНО-СО37) і тіс037 (СНО-тСО37).
Продукування рекомбінантних антитіл
Після аналізу результатів первинного скринінга первинні збіги відбирали для секвенування, одержання й очищення рекомбінантних мат. Області, які кодують унікальний варіабельний важкий ланцюг (МН) і легкий ланцюг (МІ), були генетично синтезовані й клоновані у вектори експресії ссавців, що містять послідовності, які кодують константну область людського Ідс1 (ланцюг каппа Ід і алотип С1т (7) ІДС1, що містять важкий ланцюг із мутацією Е4300 (нумерація
ЕЙ). Під час цього процесу небажаний непарний цистеїн у деяких легких ланцюгах антитіл був замінений серином.
Рекомбінантні химерні антитіла були отримані в клітинах НЕК 293 шляхом тимчасової
Зо котрансфекції векторів експресії, які кодують важкий ланцюг (НС) і легкий ланцюг (ІС), з використанням автоматизованої процедури на платформі Тесап Ргеедот Емо. Імуноглобуліни очищали з надосадової рідини клітин, використовуючи афінне очищення (білок А) у системі
ВЕРХ біопех ОКітаїе 3000.
Реакційну здатність отриманих химерних (МН кролика, Ес людини) моноклональних антитіл (мАт), що містять мутацію Е4300, повторно аналізували на зв'язування із клітинами СНО-СО37 або СНО-тіСО37. Крім того, було проаналізоване зв'язування із клітинною лінією лімфоми
Дауді людини й функціональність в аналізі СОС на клітинах Дауді.
Приклад 2: Гуманізація химерних антитіл кролика
Генерація послідовностей гуманізованих антитіл
Послідовності гуманізованих антитіл із кролячих антитіл анти-СО37-004, -005, -010 і -016 були отримані в Апійоре (Кембридж, Великобританія). Послідовності гуманізованих антитіл були отримані з використанням технології гуманізації зародкової лінії (СОК-щеплення). Гуманізовані гени М-області були сконструйовані на основі послідовностей зародкової лінії людини, найбільш близьких до амінокислотних послідовностей МН і Мк антитіл кролика й миші. Для кожного з антитіл кролика конструювали серію від чотирьох до шести генів УН і чотирьох або п'яти генів
Мк (М), гуманізованої МУ-області зародкової лінії.
Структурні моделі М-областей антитіла кролика були отримані з використанням 5м/і55 РОВ і проаналізовані з метою ідентифікації амінокислот у каркасах М-області, які можуть бути важливими для властивостей зв'язування антитіла. Ці амінокислоти були відзначені для включення в одне або кілька варіантів СОК-щепленних антитіл.
Амінокислотну послідовність М-області важкого й легкого ланцюгів порівнювали з базою даних послідовностей М і У сегментів зародкової лінії людини, щоб ідентифікувати людські послідовності важкого й легкого ланцюгів з найбільшим ступенем гомології для використання як каркасів варіабельних доменів людини. Послідовності зародкової лінії, які використовували як основу для гуманізованих конструкцій, показано в Таблиці 2.
Таблиця 2
Найбільш близькі послідовності У-сегмента й .-сегмента зародкової лінії людини
Анти-С037 Сегмент Сегмент Сегмент Сегмент кролика зародкової лінії У- | зародкової лінії 9- | зародкової лінії У- | зародкової лінії - області людини області людини області людини області людини
Потім був сконструйований ряд гуманізованих М-областей важкого й легкого ланцюга шляхом щеплення СОК на каркаси й, за необхідності, шляхом зворотної мутації залишків, які можуть бути критичними для властивостей зв'язування антитіл, як визначено при структурному моделюванні, із залишками кролика. Варіантні послідовності з найменшою частотою виникнення потенційних Т-клітинних епітопів були потім обрані з використанням запатентованих технологій іп 5ійсо Апійоре, Горе" ії ТСЕЮО м (база даних Т-клітинних епітопів) (Регггу, Г.С.А.,
Чопев, Т.О. і ВаКег, М.Р. "Мем/ Арргоаспез 10 Ргедісноп ої Іттипе Кезропзе5 То Тпегарешііс
Ргоїєїпо дигіпа Ргєсіїпіса! Оємеіортепі" (2008). Огид5 іп НУО 9 (6): 385-396; Вгузоп, С.9., допев,
Т.О. апа ВакКег, М.Р. Ргєдісноп ої Іттиподепісіу ої Тнегарешціїс Ргоївїп5 (2010). Віодгид5 24(1):1- 8). Нарешті, нуклеотидні послідовності сконструйованих варіантів були оптимізовані за кодонами.
Для антитіла Ід01-016-Н5І2 був створений варіант із точковою мутацією у варіабельному домені для заміни вільного цистеїна: Ідс1-016-Н512-І 0905 (також з додатковими мутаціями
Е405І і Е4300). Цей мутант був створений шляхом синтезу генів (Сепеап).
Послідовності варіабельної області гуманізованих антитіл анти-СО37 показані в Переліку послідовностей у даній заявці й у Таблиці 1 вище.
Приклад 3: Одержання біспецифічних антитіл
Біспецифічні антитіла 91 генерували шляхом обміну Баб-плечей за контрольованих відновлювальних умов. Основою цього способу є використання комплементарних СНЗ доменів, які сприяють утворенню гетеродимерів за специфічних умов аналізу, як описано в М/О 2011/131746. Мутації Р405І і К409К (нумерація ЕШ) були введені в СО37 антитіла для створення пар антитіл з комплементарними СНЗ доменами. Мутації Е405І і К409К у деяких випадках поєднувалися з мутацією Е4300.
Для одержання біспецифічних антитіл два вихідні комплементарні антитіла, кожне в кінцевій концентрації 0,5 мг/мл, інкубували з 75 мМ 2-меркаптоетиламін-НСЇ (2-МЕА) у загальному об'ємі 100 мкл ТЕ при 31 С протягом 5 годин. Реакцію відновлення віспин-колонок центрифуг (центрифужні фільтри Місгосоп, ЗОК, Мійіроге) відповідно до протоколу виробника.
Зо Приклад 4: Експресійні конструкції для антитіл, тимчасова експресія й очищення.
Для експресії антитіл послідовності МН і МІ. клонували у векторах експресії (рсОМАЗ.3), які містять у випадку МН відповідний константний важкий ланцюг (НС), який у деяких випадках містить мутацію Е405І або К409К і/або мутацію ЕЗ345Е або Е430С, а у випадку МІ області легкого ланцюга (І С).
Антитіла експресували як суміші Ідс1,к. Суміші плазмідної ДНК, що кодує важкі й легкі ланцюги антитіл, тимчасово трансфікували в клітинах Ехрі29З3Е (І Ше їесппоЇодіе5, США) з використанням 293гесіїп (І Те Тесппоіодіє5), власне, як описано Міпк еї аї. (міпк еї аї!., Меїйоа5, 65 (1), 5-10 2014). Потім антитіла очищали хроматографією з іммобілізованим білком 0.
В прикладах були використані такі антитіла:
Антитіла Ідс1 дикого типу:
Ідс1-004-Н5БІ 2 (з послідовностями УН і МІ, зазначеними в ЗЕО ІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮ МО: 5)
Ідс1-005-Н112 (з послідовностями УН і МІ, зазначеними в ЗЕО ІЮ МО: 8 і ЗЕО ІЮ МО: 12)
Ідс1-010-Н512 (з послідовностями УН і МІ, зазначеними в ЗЕО ІЮ МО: 15 ії ЗЕО ІЮ МО: 19)
Ідс1-016-Н5І 2 (з послідовностями УН і МІ, зазначеними в ЗЕО ІЮ МО: 22 і ЗЕО ІО МО: 26)
Ідс1-528.1 (з послідовностями МН і МІ, зазначеними в 5ЕО ІЮО МО: 39 і ЗЕО ІЮ МО: 43 - на основі БЕО ІЮО МО: 1 і З в ЕР2241577)
Ідс1-с28.1-К4098-аеїК (також містить С-кінцеву мутацію важкого ланцюга 445-Р(-446)
Ідс1-37.3 (з послідовностями МН і МІ, зазначеними в 5ЕО ІЮ МО: 46 і ЗЕО ІЮО МО: 50 - на основі БЕО ІЮО МО: 55 і 72 в МО2011/112978)
Ідс1-6812 ((з послідовностями МН і МІ, зазначеними в ЗЕО ІЮО МО: 32 ії ЗЕО ІЮО МО: 36 - на основі дрі20-специфічного антитіла 012 |Вагбравз, СЕ. У Мої Віої. 1993 Арг 5; 230 (3): 812-231)
Антитіла Іде1 з мутацією Е4300, яка посилює взаємодію Ес-Ес:
Іс1-004-Н5БІ 2-Е430С
ІЯс1-005-Н112-Е430С
Ідс1-010-Н5БІ 2-Е430С
Ідс1-016-Н5БІ 2-Е430С
Ідса1-с28.1-Е430С
ІЯс1-37.3-Е430С
Ідс1-612-Е430С
Іс1-005-Н11 2-К4098-Е4З30с
Ідс1-010-Н5БІ 2-К4098-Е4з30Сс
Ідс1-016-Н5БІ 2-Е405І -Е430С
Ідс1-016-Н5БІ 2-1 6905-Е405І -Е43О0С
І3с1-004-Е430Сс
І3с1-005-Е430С
І3с1-010-Е43О0С
І3с1-016-Е430С
ІДО1 антитіла з мутацією Е4305, яка посилює Ес-Ес взаємодію:
Ідс1-010-Н5БІ 2-К4098-Е4305
Ідс1-016-Н5БІ 2-Е405І -Е4305
ІДО1 антитіла з мутацією ЕЗ345К, яка посилює Ес-Ес взаємодію:
Ідс1-010-Н5БІ 2-К4098-ЕЗА5К
Ідс1-016-Н5БІ 2-Е405І -ЕЗА5К
ІДО1 антитіла з мутацією ЕЗ345К, яка посилює Ес-Ес взаємодію:
Ідс1-с28.1-ЕЗ345А
Ідс1-612-ЕЗ45А
Ідс1-010-Н5БІ 2-К4098-ЕЗ45А
Ідс1-016-Н5БІ 2-Е405І -Е345А
Біспецифічні антитіла р5Іда1-016-Н5І 2-Е405І хідс1-І9са1-005-НІ1І 2-КА0ЗА р5Іда1-016-Н5І 2-Е405І хІдс1-010-Н5І 2-К409А
Біспецифічні антитіла з мутацією Е4300, яка посилює Ес-Ес взаємодію: реІда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е43001х005-Н11 2-КА098-Е430са реІда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5БІ 2-КА098-Е430са реІда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430схр12-КА098-Е4З0С р5Іда1-612-Е405І -Е4300х010-Н5БІ 2-К4098-Е4300а р5Іда1-612-Е405І -Е4300х005-НІ1І 2-К4098-Е4300а:
ІДО1 антитіло з мутацією 52390-І332Е, що посилює Есук-взаємодію:
Ідса1-с28.1-52390-І332Е
Приклад 5. Введення мутації, яка посилює взаємодію Ес-Ес, в антитіла до СО37 приводить до посилення здатності де помо індукувати комплемент-залежну цитотоксичність (СОС).
Визначення комплемент-залежної цитотоксичності (СОС)
У першому експерименті пухлинні клітини, виділені у пацієнта із ХЛЛ, який не одержував лікування (АїїсеїІ5, Каліфорнія, США), ресуспендували в середовищі КРМІ, яке містить 0,2 95
БСА (бичачого сироваткового альбуміну), і висівали в полістирольні 96-коміркові круглодонні планшети (Сгеїіпег Біо-опе, Кат. Моб50101) з щільністю 0,2х105 клітин/комірку (40 мкл/комірку) і 40 мкл серії концентрацій /дсе1-(328.1-К4098-аеїК, Ідс1-528.1-Е345К або Ідс1-612-Е345А (кінцева концентрація антитіл 0,003-10 мкг/мл). Ідс1-012-Е345К (на основі специфічного до 9др120 антитіла 012 |Ваграх5, СЕ. У Мої! ВіоЇ. 1993 Арг 5;230(3):812-231Ї) використовували як негативний контроль. Для Ідс1-с28.1-Кк4098-аеїК слід зазначити, що мутація К409Е не впливає на здатність до зв'язування або до індукції СОС. Аналогічно, мутація деїк (445-РО-446), яка була введена в антитіло для полегшення біохімічного аналізу, не впливала на зв'язування мішені або здатність до індукції СОС (див. нижче).
Після інкубації (кімнатна температура, 10 хвилин при струшуванні) у кожну комірку додавали 20 мкл об'єднаної нормальної людської сироватки (МНЗ Кат.Мо МО008 Запдцпіп, Амстердам,
Нідерланди), і інкубували планшети при 37 "С протягом 45 хвилин. Реакцію зупиняли 60 охолодженням планшетів на кризі. Потім додавали пропідіум йодид (Рі; 10 мкл розчину 10 мкг/мл; Зідта-АїЇдгіспй Спетіє ВМ, Звейндрехт, Нідерланди) і лізис визначали шляхом вимірювання процентного вмісту мертвих клітин (які відповідають Рі- позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії (ЕАС5 Сапіо І; ВО Віобсіепсе5). Графіки були отримані з використанням оптимальних значень нелінійного відбору доза-ефект із логарифмічно зміненими концентраціями в програмному забезпеченні Сгарпрай Ргізт М6.04 (Сгарпрай зопмаге, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
У другому експерименті пухлинні клітини від іншого пацієнта із ХЛЛ, який не одержував лікування (АЇїсеїЇ5, Каліфорнія, США) ресуспендували в середовищі КРМІ, яке містить 0,2 Фо
БСА, висівали в полістирольні 96б-коміркові круглодонні планшети (Сгеіїпег бБіо-опе, Кат.
Ме650101) із щільністю 0,5х107 клітин/комірку (30 мкл/комірку) і додавали 50 мкл серії концентрацій Ідсе1-5328.1, ІД21-428.1-Е4300 або Ідс1-612 (кінцева концентрація антитіл 0,003- 10 мкг/мл) в 3.33х серійних розведеннях). Після інкубації (кімнатна температура, 15 хв.) у кожну комірку додавали 20 мкл об'єднаної нормальної людської сироватки (МН5, Кат. Мо МО0О8
Запаціп, Амстердам, Нідерланди), і планшети інкубували при 37 "С протягом 45 хвилин.
Реакцію зупиняли охолодженням планшетів на кризі. Потім додавали пропідіум йодид (Рі; 20 мкл розчину 10 мкг/мл; 5ідта-Аїагіспй Спетіє ВУ, Звейндрехт, Нідерланди), і визначали лізис шляхом вимірювання процентного вмісту мертвих клітин (які відповідають Рі-позитивним клітинам) за допомогою проточної цитометрії (ЕАС5 Сапіо ІІ; ВО Віозсіепсе5). Графіки були отримані з використанням оптимальних значень нелінійного добору доза-ефект із логарифмічно зміненими концентраціями в програмному забезпеченні Сгарпрай Ргізт М6.04 (Сгарпрай зойпмаге, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Фігури 1А і 18 показують, що антитіло анти-СО37 528.1 без мутації ЕЗ4А5Е або Е4300, що посилює Ес-Ес-взаємодію (Ідс1-528.1 або Ідс1-45428.1-К4098-деіК), не індукує СОС на первинних пухлинних клітинах від пацієнтів із ХЛЯЛ, тоді як (528.1 з мутаціями ЕЗ345К або Е4300, які посилюють взаємодію Ес-Ес (Ід(1-5328.1-Е345К або Ідс1-428.1-Е430С), індукує глибоку дозозалежну СОС первинних ХЛЛ клітин.
Кількісне визначення антигенів клітинної поверхні методом проточної цитометрії (ОЇ)
Рівні експресії СО37 і мембранних регуляторних білків комплементу (пПСКР; СО46, СО55 і
СО59) на пухлинних клітинах ХЛЛ визначали з використанням набору для калібрування
Зо людського дО (Віосуїїх, Кат. МЯСРО10). Коротко, пухлинні клітини, отримані від пацієнта із ХЛЛ (як у першому експерименті, описаному вище), ресуспендували в середовищі КРМІ, яке містить 0,2 95 БСА, висівали в полістирольні 96-коміркові круглодонні планшети (Огеїіпег ріо-опе, кат. Мо 650101) із щільністю 0,5х10» клітин/комірку (30 мкл/комірку), центрифугували й додавали й 50 мкл СО37 (Абсат, кат. Ме76522) або контрольного мишачого антитіла (счищений мишачий
ІДС1,к, контроль ізотипа, клон МОРС-21, ВО кат. Ме555746). Після інкубації (4 "С, 30 хв.) в окремі комірки додавали 50 мкл каліброваних гранул. Після дворазового промивання гранул і клітин (150 мкл буфера РАС5, центрифугування протягом З хвилин при 300 д при 4 "С між етапами промивання), додавали розведення 50 мкл/комірку вторинного антитіла (РІТС- кон'югованого), як передбачено в наборі калібратора людського до. Після інкубації в темряві (4 "С, 45 хв) клітини двічі промивали буфером ЕАСЗ5, і клітини ресуспендували в 35 мкл буфера
ЕАС5 і аналізували проточною цитометрією (скінер ІпіеПісуї ібдие"М). Кількість антигену визначали шляхом розрахунків здатності зв'язування антитіл на основі калібрувальної кривої відповідно до рекомендацій виробника.
На Фіг. 2 показано, що відзначалася висока експресія СО37 на первинних пухлинних клітинах від даного пацієнта із ХЛЛ. Пацієнт демонстрував нормальні рівні експресії тсСКР.
Приклад 6: Зв'язування СОЗ7-антитіл та їх варіантів з поверхнею клітини, яка експресує
С037.
Зв'язування з поверхнею клітин, які експресують СОЗ37 (клітини Дауді, клітини СНО, які експресують СО37 яванського макака), визначали проточною цитометрією. Клітини, ресуспендовані в КРМІ, що містить 0,295 БСА, висівали при 100 000 клітин/комірку в полістирольні 96б-коміркові круглодонні планшети (Сгеіїпег Біо-опе Кат. Моб50101) і центрифугували протягом З хвилин при 300 9, 4 "С. Додавали серійні розведення (кінцева концентрація антитіл 0,003-10 мкг/мл у серійних розведеннях 3.33) СО37 або контрольних антитіл, і клітини інкубували протягом 30 хвилин при 4С. Планшети двічі промивали/центрифугували, використовуючи буфер ЕБАС5З (ФБР/ 0,195 БСА/ 0,01 95 азид натрію). Потім клітини інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С с козячим антитілом до до
К(ав)2 людини, кон'югованим з К-фікоеритрином (РЕ), (аскбоп Іттипогезеагсі І арогаїогіев5,
Іпс., Вест-Гроув, Пенсільванія; кат. Мо: 109-116-098), розведеним 1/100 у ФБР/О,1 95 БСА/0,01 95 азиду натрію. Клітини двічі промивали/уцентрифугували з використанням буфера ЕАС5Б, бо ресуспендували в 30 мкл буфера БАС5 і аналізували шляхом визначення середньої інтенсивності флуоресценції з використанням скінера ІпіеПйісуї ібце"М (Вестбург). Криві зв'язування були отримані з використанням аналізу нелінійної регресії (сигмоїдальна крива доза-відповідь зі змінним кутовим коефіцієнтом) у програмному забезпеченні сСгарпРай Ргізєт
У6.04 (СгарпРайд 5опмаге, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Зв'язування із клітинами Дауді
На Фіг. 3 показано, що гуманізовані антитіла анти-СО37 Ідст-004-Н5БІ2, Іда1-005-НІ112,
Ідс1-010-Н512 ї Ідс1-016-Н512 демонстрували дозозалежне зв'язування із клітинами Дауді.
Введення мутації Е430б, яка посилює взаємодію Ес-Ес, а для Ід51-005-Н112 також мутації
К409К у ці антитіла не впливало на зв'язування.
На Фіг. 4 показано, що введення мутації Е4300 в ІД01-528.1 або Ідс1-37.3 не впливало на зв'язування із клітинами Дауді.
Для антитіла Ід01-016-Н5І2 був створений варіант із точковою мутацією у варіабельному домені для заміни вільного цистеїна в легкому ланцюзі: 1дсе1-016-Н5І 2-Іс905. Цей варіант був також створений з додатковими мутаціями 4051 і Е4300, які, як було показано раніше, не впливають на характеристики зв'язування з мішенню. На Фіг. 5 показано, що Ідс1-016-Н512,
Ідс1-016-Н5БІ2-Е430С, Ідес1-016-Н512-Р4051-Е4300 ої 0 ІдФб1-016-НБІ2-І 2905-4051 -Е4300а продемонстрували порівнянне зв'язування із клітинами Дауді, таким чином, що мутація І С905 не впливала на зв'язування.
Зв'язування зі СНО клітинами, які експресують СЮО37 яванського макака
Зв'язування із клітинами СНО, які експресують СО37 яванського макака, визначали проточною цитометрією, використовуючи метод, описаний вище. На Фіг. 6 показано, що Ідс1- 004-Н5БІ2-Е430с, Ідеа1-005-Н112-Е4300, Ідесл1-010-Н512-Е430б ої 0 дс1-016-Н5БІ 2-Е4300 продемонстрували дозозалежне зв'язування із клітинами СНО, які експресують СО37 яванського макака. Ідс1-528.1 ї Іде1-28.1-Е4300О не зв'язувалися із клітинами СНО, які експресують СОЗ37 яванського макака.
Приклад 7: Ідентифікація антитіл до СЮОЗ37, які не конкурують за зв'язування з СОЗ37.
Конкуренція за зв'язування (її відсутність) - визначається за допомогою проточної цитометрії
Антитіла до СО37 маркірували за допомогою Аїеха Рісог 488 МН5 Е-тег (сукцинімідилового ефіру). 1 мг антитіла до СО37 (розчиненого у ФБР) переносили в 1 мл мікроцентрифужний
Зо флакон (реакційний флакон). Значення рН підвищували шляхом додавання 10 95 об'єму 1 М натрій-бікарбонатного буфера (рн 9). Безпосередньо перед використанням 1 мг складного ефіру АїІеха Рішог 488 МН5 (доведеного до кімнатної температури) розчиняли в 100 мкл ДМСО.
Реакцію мічення ініціювали додаванням 10 мкл свіжого розчину барвника Аїйеха на мг антитіла.
Реакційні пробірки закривали кришками й обережно перемішували шляхом перевертання. Після 1 години інкубації за кімнатної температури реакцію гасили додаванням 50 мкл 1М Трис у кожну реакційну пробірку. Барвник, який не прореагував, видаляли з антитіла, міченого Аїеха, гель- фільтрацією з використанням колонок Віогаа РОР'ІО, урівноважених боратним сольовим буфером, відповідно до вказівок виробника. АІеха-мічені антитіла зберігали при 4 "С і захищали від світла.
Конкуренцію зв'язування між різними антитілами до СО37 визначали проточною цитометрією. Клітини Каїї (АТСС, ССІ -86) ресуспендували в середовищі Каїї (КРМІ 1640, 10 96
ЕТС, 100 од./мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 10 мМ НЕРЕЗ і 1 мМ пірувата) у концентрації 1х107 клітин/мл. Потім аліквоти по 30 мкл суспензії клітин переносили в пробірки
ЕАС5 разом з аліквотами по 30 мкл (кінцева концентрація 40 мкг/мл) розчинів немічених антитіл. Суміш інкубували при 37 "С протягом 15 хв. при легкому струшуванні. Потім готували розбавлення антитіл, мічених А488, і після інкубації 10 мкл мічених антитіл (кінцева концентрація антитіл 4 мкг/мл) переносили в пробірки РГАС5, що містять немічені антитіла й клітини. Суміш інкубували при 37 "С протягом 15 хв. при легкому струшуванні. Після інкубації зразки гасили шляхом додавання 4 мл охолодженого на кризі ФБР, центрифугували протягом З хвилин при 4 "С при 2000 об./хв., двічі видаляли аспірацією надосадову рідину й потім ресуспендували в 125 мкл ФБР. Конкуренцію зв'язування аналізували шляхом визначення середньої інтенсивності флуоресценції з використанням ВО ЕАСзсСаїїриг (ВО Віозсіепсеб5).
Інтенсивності флуоресценції були перетворені на молекули еквівалентного розчинного флуорохома (МЕЗБЕ) для кількісного визначення.
Фігури 7А і 8 показують, що попередня інкубація клітин Каїї з їд1-005-НІ11 2-Е4305 і Ід01- 010-Н5І 2-Е4300 блокувала наступне зв'язування Ідс1-005-НІ11 2-Е4300 і Ідс1-010-Н5БІ 2Е4З0О, але не Їда1-37.3-Е430С, дат -с328.1-Е430С, Іде 1-004-Н5БІ 2-Е430 і Ід1-016-Н5І 2-Е4З300.
Попередня інкубація клітин Каїї з Ідс1-004-Н5І 2-Е4300 суттєво знижувала наступне зв'язування Іде1-37.3-Е4З0С, Ідс1-с28.1-Е430С, ІдС1-004-Н5І 2-Е430 і Іде1-016-Н5І 2-Е4З0С, 60 але не Їда1-005-Н11 2-Е4305 і Іде1-010-Н5І 2-Е4З0С.
Попередня інкубація клітин Каїї з Іде1-016-Н5І 2-Е430О блокувала наступне зв'язування
Ідс1-37.3-Е430С, Ідс1-с028.1-Е430с, дат -004-Н5І2-Е4300 і Ід51-016-Н5БІ 2-Е4300б, але не
Ідс1-005-Н11 2-Е4305 і Ід1-010-Н5І 2-Е4З00.
Попередня інкубація клітин з 1Ідс1-37.3-Е4300 блокувала наступне зв'язування всіх тестируемих антитіл. Однак, як обговорювалося вище, попередня інкубація з Іде1-005-Н11 2-
Е4300 або Ідс1-010-Н5І 2-Е4300 не блокувала зв'язування Ідсе1-37.3-Е4300.
Попередня інкубація клітин з Ідс1-(328.1-Е4300 блокувала наступне зв'язування Ідс1-37.3-
ЕЗЗОСІ, Ідат1-с28.1-Е430С, Іде1-004-Н5І 2-Е4300 і Ідб1-016-Н5БІ 2-Е4300б, але не Ідс1-005-
НІ112-Е4300 і Іде1-010-Н5І 2-Е4З300.
Конкуренція зв'язування (її відсутність) - визначення функціональним скринінгом з використанням аналізу СОС
Щоб визначити, чи демонструють не здійснюючі перехресне блокування антитіла СО37 посилену СОС при їхньому об'єднанні, і щоб підтвердити можливість функціонального об'єднання не-перехресно-блокувальних антитіл анти-СО37, був проведений аналіз СОС з використанням індивідуальних антитіл анти-СО37 і їх комбінацій.
Клітини Каїї, ресуспендовані в КРМІ, що містить 0,2 95 БСА, висівали в полістирольні 96- коміркові круглодонні планшети (Сгеїіпег ріо-опе, кат. Моб50101) з щільністю 1х10»5 клітин/комірку (30 мкл/комірку), і додавали 50 мкл гуманізованого антитіла анти-СО37, його варіантів, їх комбінацій або контрольного антитіла Ідс1-012 (кінцева концентрація антитіл 10 мкг/мл, комбінації 5-5 мкг/мл). Після інкубації (кімнатна температура, 15 хвилин, при струшуванні) у кожну комірку додавали 20 мкл об'єднаної нормальної людської сироватки (МН, кат. Мо МО0О8
Запаціп, Амстердам, Нідерланди), і планшети інкубували при 37 "С протягом 45 хвилин.
Планшети центрифугували (3 хвилини, 1200 об./хв.) і видаляли надосадову рідину. Додавали пропідіум йодид (РІ; 30 мкл розчину 1,67 мкг/мл; Зідта-Аїдгіспй Спетіє ВМ, Звейндрехт,
Нідерланди), і визначали лізис шляхом вимірювання процентного вмісту мертвих клітин (відповідно, РІ- позитивних клітин) проточною цитометрією (скінер ІпіейЙсуї ідце"М, Вестбург).
Дані аналізували з використанням програмного забезпечення СгарпРай Ргіхт (програмне забезпечення СгарпРад, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Фігури 7В і 7С показують, що комбінація Ідсе1-004-Н5І2 плюс Ідс1-010-Н512 (з мутацією
Зо Е4300 або без неї) і комбінація Ідс1-005-Н112 плюс Іде1-016-Н5І2 (з мутацією Е4300 або без неї) індукують посилення СОС, у порівнянні з їхніми індивідуальними аналогами. Комбінація
Ідс1-004-Н5І2 плюс Ідс1-016-Н512 (з мутацією Е430С або без неї) не індукувала посилення
СОС у порівнянні з їхніми індивідуальними аналогами.
На Фігурах 70 і Е показано, що комбінація Іде1-004-Н5І 2 плюс Ідс1-005-Н112 (з мутацією
Е4300 або без неї) і комбінація Ідс1-010-Н5І2 плюс Іде1-016-Н5І2 (з мутацією Е4300 або без неї) посилюють СОС у порівнянні з їхніми індивідуальними аналогами. Комбінація Ідс1-005-
НІТІ2 плюс ІдсС1-010-Н512 (з мутацією Е430б або без неї) не індукувала посилення СОС у порівнянні з їхніми індивідуальними аналогами.
Фігури 7Е і б показують, що комбінація Ід51-37.3 плюс Ідс1-005-Н112 (з мутацією Е43О00 або без неї) і комбінація Ідс1-37.3 плюс ІдсС1-010-Н512 (з мутацією Е430О або без неї) індукували посилення СОС у порівнянні з їхніми індивідуальними аналогами.
Таким чином, дослідження функціональної комбінації підтвердили результати досліджень конкуренції зв'язування для описаних антитіл анти-СО37 і показали, що не-перехресно- блокувальні антитіла анти-СО37 можна функціонально комбінувати.
Приклад 8. Уведення мутації, яка посилює взаємодію Ес-Ес, у гуманізовані антитіла анти-
СО37 приводить до підвищеної здатності де помо індукувати комплемент-залежну цитотоксичність (СОС).
Клітини Дауді, ресуспендовані в КРМІ, що містить 0,2 95 БСА, висівали в полістирольні 96- коміркові круглодонні планшети (Сгеіпег Біо-опе, кат. Меоб50101) з щільністю 1х109 клітин/комірку (30 мкл/комірку), і додавали 50 мкл серії концентрацій гуманізованих антитіл анти-СО37 і їх варіантів або контрольного антитіла Ідс1-р12 (кінцева концентрація антитіл 0,003-10 мкг/мл у серійних розбавленнях 3.33х). Після інкубації (кімнатна температура, 15 хв.) у кожну комірку додавали 20 мкл об'єднаної нормальної людської сироватки (МН, кат. Мо МО008 Запамціп,
Амстердам, Нідерланди), і планшети інкубували при 37 "С протягом 45 хвилин. Планшети центрифугували (3 хвилини, 1200 об./хв.) і видаляли надосадову рідину. Додавали пропідіум йодид (РІ; 30 мкл розчину 1,67 мкг/мл; Зідта-Аїйагіспй Спетіе ВУ, Звейндрехт, Нідерланди) і лізис визначали шляхом вимірювання процентного вмісту мертвих клітин (відповідно, Рі-позитивних клітин) проточною цитометрією (скінер ІпіеПісуї ібдце"М, Вестбург). Графіки були отримані з використанням оптимальних значень нелінійного добору доза-ефект із логарифмічно зміненими концентраціями в програмному забезпеченні сгарпРай Ргієт М6.04 (СсгарпРайд боїймаге, Сан-
Дієго, Каліфорнія, США).
На Фіг.9 показано, що Ідс1-004-Н5БІ2, Ідс1-005-НІ112, ІдСс1-010-Н512 ї І951-016-Н5І2 не індукували СОС у клітинах Дауді. Після введення мутації Е4300, яка посилює взаємодію Ес-Ес, ці антитіла (Ід51-004-Н5І 2-Е430С,. Ідс1-005-Н112-Е430С, Іда1-010-Н5І2-Е4300 і ІдС1-016-
Н5ОЬІ2-Е430сС) індукували виражену дозо-залежну СОС клітин Дауді.
На Фіг.10А показано, що Ідвс1-0528.1 і І9051-37.3 не індукували СОС на клітинах Дауді. Після введення мутації Е4300, яка посилює взаємодію Ес-Ес, ці антитіла (Ідсе1-(5328.1-Е430 і ІдС1- 37.3-Е430С) індукували виражену дозозалежну СОС клітин Дауді.
Для антитіла Ід01-016-Н5І2 був створений варіант із точковою мутацією у варіабельному домені для заміни вільного цистеїна в легкому ланцюзі: Ід(е1-016-Н512-І 0905. Крім того, цей варіант також генерували з мутацією 4051 (раніше було показано, що вона не впливає на зв'язування мішені або СОС) і мутацією Е430б, яка посилює взаємодію Ес-Ес. На Фігурі 11 показано, що /дс1-016-Н5І2-Е430с, Ідсаст-016-Н5І2-Е405І-Е4300 і Ідс1-016-Н5БІ 2-І С905-
Е405І -Е4300 продемонстрували співрозмірну активність в аналізі СОС іп міго, таким чином, мутація ЇС905 не впливає на здатність до індукції СОС. Ідс1-016-Н512 не індукує СОС на клітинах Дауді.
Крім того, уведення інших мутацій, які посилюють взаємодію Ео-Ес, ЕЗА5К, ЕЗ345К, Е4305 і
ЕКО, в Ід01-010-Н512 ї Іде1-016-Н5БІ2 призводило до вираженої СОС клітин Дауді. На Фігурах 108 ї 10С показано, що максимальний лізис клітин Дауді був співрозмірним для всіх протестованих мутацій, які посилюють взаємодію Ес-Ес.
Приклад 9: Біспецифічні антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, більш ефективно індукують СОС, ніж моноспецифічні двовалентні антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію БЕс-Ес, завдяки одновалентному зв'язку й подвійному націлюванню на епітоп.
Мутації Р405І або К409Е були введені в гуманізовані антитіла анти-СО37, які містять мутацію Е4300, для створення біспецифічних антитіл (б5Іде1) із двома СО37-специфічними
Еар-плечима, які не конкурують за зв'язування з СО37. Здатність біспецифічних СО37-антитіл, які містять мутацію Е4300, індукувати СОС визначали, як описано вище, і порівнювали зі здатністю моноспецифічних двовалентних антитіл анти-СО37, які містять мутацію Е430б, комбінації двох моноспецифічних двовалентних антитіл анти-СО37, які містять мутацію Е4300, які не конкурують за зв'язування з СО37 (кінцева концентрація об'єднаних антитіл разом ідентична до концентрації окремих біспецифічних антитіл), одновалентних антитіл анти-СО37, які містять мутацію Е4300 (тобто біспецифічних антитіл, що містять одне СО37-специфічне Рар- плече й одне не з'єднувальне Рар-плече, отриманих з Ідс1-Б12 і які містять мутацію Е430С) або комбінації двох одновалентних антитіл анти-СО37, які містять мутацію Е4300, які не конкурують за зв'язування з СОЗ37.
СОС на клітинах Дауді
На Фігурі 12А показано, що Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -єЄ4302х005-НІ11 2-К4098-Е4З30Сс більш ефективно, ніж Ідсе1-005-НІ1І12-Е43005 або Ідс1-016-Н5І2-Е4300б, індукують СОС на клітинах Дауді. Біспецифічне р51де1-016-Н5І 2-І С905-Е405І -Е430с1х005-НІТІ 2-К4А098-Е430С було також більш сильним, ніж комбінація Ідсе1-005-Н11 2-К4098-Е4300 плюс 1д1-016-Н5І 2-
Е405І-Е405Ї. Одновалентні СОЗ37-з'єднувальні антитіла Б5Іде1-612-Е405І -:430сх005-НІ1 2-
К4098-Е4305 ії Б51901-016-Н5І 2-І 6905-4051 -Е430с1х512-К4098-Е4300 також індукували СОС на клітинах Дауді, але менш ефективно, ніж р51Ідсе1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх005-Н11 2-
К4098-Е4З00.
На Фігурі 128 показано, що Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -ЕЄ4302х010-Н5БІ 2-К4098-Е4З30Сс сильніше індукувало СОС на клітинах Дауді, ніж Ідс1-010-Н5БІ 2-Е4300 або Ідс1-016-Н5І2-
Е4300. Біспецифічне Б5Іде1-016-Н5І 2-І С905-Е405І -Е430сх010-Н5І 2-К4098-Е4300 - також було більш активним, ніж комбінація Ідс1-010-Н5І2-Е4300 плюс 1/дос1-016-Н5БІ 2-Е4300.
Одновалентні з'єднувальні антитіла р5Ідсое1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430схр12-К4098-Е430 і р5Іда1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е430С0 також індукують СОС на клітинах Дауді, при цьому Б5Іде1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 є менш активним, а Б51де1-016-Н5І 2-
І С905-Е405І -Е430сх512-К4098-Е4300 є однаково активним, у порівнянні з Б51дс1-016-Н5БІ 2-
І С905-Е405І -Е430сх014-НИї 2.
Здатність індукувати СОС для біспецифічних антитіл анти-СО37, які містять мутацію Е4300б, також порівнювали зі здатністю біспецифічних антитіл анти-СО37 без мутації Е4300. На Фігурі 13 показано, що б5Іде1-016-Н5І 2-Е4051І х005-НІ11 2-К409К, а також б51до1-016-Н5І 2-Е405І хО10-
Н5І2-К409К були здатні індукувати СОС на клітинах Дауді, але були менш активними, у порівнянні з їхніми аналогами, що містять Е4300, Б51д(1-016-Н5І 2-І 6905-4051 -Е430с1х005-
НІ112-К4098-Е4300 і Б51дс1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е4З00.
СОС на клітинах ОСІ-І у-7
На Фігурі 12С показано, що одновалентні з'єднувальні антитіла Б5Іде1-016-Н5І 2-І б905-
Е405І -Е430схр12-КА4098-Е430 і Б519д1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е430С були більш ефективними щодо індукції СОС на клітинах ОСІ-Іу-7 у порівнянні з них моноспецифічними двовалентними з'єднувальними аналогами, Ідс1-016-Н5І2-Е4300 і 1Ідс1-010-Н5І 2-Е4300.
Комбінація одновалентних з'єднувальних антитіл (Б51д(1-016-Н51І 2-І 2905-4051 -Е430СсхБ12-
К4098-Е4300 плюс р5Іде1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е430с) була більш ефективною, ніж комбінація двовалентних антитіл (Ідс1-010-Н5І2-Е4306 плюс ІдС1-016-Н5І 2-Е4300), як було продемонстровано стабільним зниженням ЕСво у двох незалежних експериментах (Фіг.120). Крім того, Б51де1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 було більш ефективним в індукції СОС на клітинах ОСІ-Іу-7, ніж комбінація двовалентних антитіл (Ідсе1- 010-Н5БІ 2-Е4300 плюс 1д1-016-Н5І 2-Е430с), про що свідчить постійне зниження ЕС50 у трьох незалежних експериментах (Фіг. 12Е).
Активність комбінації одновалентних з'єднувальних антитіл (Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -
ЕЗЗО0СсіХр12-КА098-Е4300 плюс о Б5Ідс1-612-Е405І -Е430сх010-НБІ 2-К4098-Е43005-Н651-84- вбабБ-1 5-І 5-І5-нН55-5) Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е430 в індукції СОС у клітинах ОСІ-Ї у-7 була порівнянною.
СОС на первинних пухлинних клітинах ХЛЛ
Здатність біспецифічних СОЗ37-антитіл, що містять мутацію Е430О, індукувати СОС у пухлинних клітинах, отриманих від пацієнта із ХЛЛ, визначали, як описано вище, і порівнювали зі здатністю для СОЗ37-антитіл, що містять мутацію Е4300, або комбінації СОЗ37-антитіл, що містять мутацію Е4300, або одновалентних антитіл до СЮО37, що містять мутацію Е4300.
На Фігурі 14А показано, що Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -єЄ4302х005-НІ11 2-К4098-Е4З30Сс було більш активним, ніж /дсе1-005-Н1І2-К4098-Е43005 або Ідс1-016-Н5БІ2-Е405І-Е4300 в індукції СОС она пухлинних клітинах ХЛЛ. Біспецифічне Б519се1-016-Н5БІ 2-І С905-Е405І -
Е430сіх005-НІТІ 2-КА098-Е4300 було також більш активним, ніж комбінація Ідсое1-005-НІ1 2-
Ка4098-Е4300 плюс 1Ідсе1-016-Н5І 2-Е405І -Е4300. Одновалентні з'єднувальні антитіла р5Ідс1-
Зо р12-Е405І -Є430сх005-НІ11 2-К4098-Е4300 і Б51дФе1-016-Н5І 2-і 2905-4051 -Е430схр12-К4098-
Е4300 також індукували СОС на первинних пухлинних клітинах ХЛЛ, при цьому вони були менш ефективними, ніж Б51дс1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -єЄ430сх005-НІ11І 2-К4098-Е4З00.
На Фігурі 148 показано, що Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -ЕЄ4302х010-Н5БІ 2-К4098-Е4З30Сс було більш ефективним, ніж Ідсое1-010-Н5БІ 2-Е4300 або Ідс1-016-Н5І 2-Е4300, в індукції СОС первинних пухлинних клітин ХЛЛ. Біспецифічне Б5Ідсе1-016-Н5БІ 2-І 6905-4051 -Е430Ссх010-
НО 2-К4098-Е4300 також більш активно, ніж комбінація 19де1-010-Н5І 2-Е4300 плюс ІдсС1-016-
Н5БІ2-Е43006. Одновалентні з'єднувальні антитіла Б51д(е1-016-Н5І 2-І С905-Е405І -Е430схБ12-
К4098-Е430О і Б51д1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 також індукували СОС на первинних пухлинних клітинах, при цьому р5Іде1-612-Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е430С було менш активним, а Б51д(1-016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е430сх512-К4098-Е4300 було однаково активним у порівнянні з б51де1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5БІ 2-К4098-Е4З0О.
Приклад 10. Біспецифічні антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, індукують СОС на різних лініях клітин В-клітинної лімфоми із широким діапазоном експресії
С037.
Здатність р5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300, при концентрації 10 мкг/мл, індукувати СОС (як описано вище) визначали для ряду ліній клітин В-лімфоми, джерелом походження яких були різні підтипи В-клітинної лімфоми. Рівні експресії молекул
СО37 на клітинній поверхні цих клітинних ліній визначали кількісною проточною цитометрією, як описано вище.
У Таблиці З наведений огляд протестованих клітинних ліній.
Таблиця З
Лінії клітин В-клітинної лімфоми
Таблиця З
Лінії клітин В-клітинної лімфоми 22222Вайо///////////// | 7777111 Беркита/// | АТОСІССІ-86 (
На Фігурі 15 показано, що Б5Іде1-016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Е430Ссх010-Н5БІ 2-К4098-Е4З30Сс індукувало СОС у широкому діапазоні клітинних ліній В-клітинної лімфоми, отриманих з різних типів В-клітинної лімфоми.
Приклад 11. Біспецифічні антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, більш ефективно індукували антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АрСО).
Маркування клітин-мішеней
Здатність антитіл до СО37 індукувати АОСС визначали аналізом вивільнення хрому. Клітини
Дауді або Каїї збирали (5 х 106 клітин/мл) в 1 мл культурального середовища (КРМІ 1640 з додаванням 1095 донорської бичачої сироватки із залізом (0ОВ5І; ТПпептоїї5спег, кат.
Ме10371029) і сумішшю пеніциліну й стрептоміцину (реп/5ігер), до якого додавали 100 мккКі »'Сг (Хром-51; Регккіпе!тег, кат. МоМЕ2О30005МС). Клітини інкубували на водяній бані при 37 "С протягом 1 години при струшуванні. Після промивання клітин (двічі у ФБР, 1500 об./хв., 5 хвилин) їх ресуспендували в КРМІ 1640/1095 ОВ51/реп/зігер і підраховували шляхом виключення трипанового синього. Клітини розбавляли до щільності 1 х 109 клітин/мл.
Підготовка ефекторних клітин
Мононуклеарні клітини периферійної крові від здорових добровольців (Запдціп, Амстердам,
Нідерланди) були виділені з 45 мл свіжоприготовленої гепаринізованої крові (лейкоцитарний шар) за допомогою центрифугування в градієнті щільності фіколу (Віо УУпівакКкег; середовище для виділення лімфоцитів, кат. Мо17-829Е) відповідно до інструкцій виробника. Після ресуспендування клітин в КРМІ 1640/1095 ОВ5І/ реп/зігер клітини підраховували шляхом виключення трипанового синього й розбавляли до щільності 1 х107 клітин/мл.
Процедура аналізу АОСС 50 мкл мічених ?'Сг клітин-мішеней вносили піпеткою в 96-коміркові круглодонні планшети для мікротитрування (Сгеїпег Віо-Опе; кат. Моб50101) і додавали 50 мкл серії концентрацій (1,5- 5000 нг/мл кінцевих концентрацій в 3- кратних розбавленнях) СЮО37 або контрольних антитіл, розбавлені в ЕРМІ 1640/10 95 ЮОВ5І/ реп/5ігер. Клітини інкубували за кімнатної температури (КТ) протягом 15 хвилин і додавали 50 мкл ефекторних клітин, у результаті чого співвідношення
Зо ефектор: мішень становило 100:1. Клітини інкубували протягом 4 годин при 37 "С і 5 95 З». Для визначення максимального лізису 50 мкл мічених »г'Сг клітин Дауді (5000 клітин) інкубували з 100 мкл 5 95 Тійоп-Х100; для визначення спонтанного лізису (фонового лізису) 5000 мічених »'Сг клітин Дауді інкубували в середовищі об'ємом 150 мкл без будь-яких антитіл або ефекторних клітин. Рівень антитілонезалежного лізису клітин визначали шляхом інкубації 5000 клітин Дауді з 500 000 МНКПК без антитіл. Планшети центрифугували (1200 об./хв., 10 хвилин), і 25 мкл надосадової рідини переносили в 100 мкл розчину Місгозсіпі-40 (РасКага, кат. Моб0О13641) в 96- коміркових планшетах. Планшети закривали й струшували протягом 15 хвилин при 800 об./хв., і вивільнений "Сг підраховували з використанням сцинтиляційного лічильника (ТорсоипіФ),
РегкіпеІтег). Відсоток специфічного лізису розраховували в такий спосіб:
Фо специфічного лізису - (срт у зразку - срт у результаті мимовільного лізису) / (срт для максимального рівня лізису - срт у результаті спонтанного лізису), де срт позначає кількість імпульсів за хвилину.
На Фігурі 16А показано, що Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -єЄ4302х005-НІ11 2-К4098-Е4З30Сс було більш ефективним, ніж Ідс1-005-Н11 2-К4098-Е430с ог Ідс21-016-Н5І 2-Е4091І -Е4306, або ніж комбінація Іде1-005-Н1І 2-К4098-Е4300 плюс 1де1-016-Н5І 2-Е405І -Е430 в індукції АОСС на клітинах Дауді.
На Фігурі 168 показано, що Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -ЕЄ4302х010-Н5БІ 2-К4098-Е4З30Сс більш ефективне, ніж Ід(е1-010-Н5І 2-Е4300 або Іде1-016-Н5І 2-Е4300 або комбінація Ідс1-010-
Н5ЬІ2-Е4300 плюс 1Іде1-016-Н5І 2-Е4300 в індукції АОСС на клітинах Дауді.
На Фігурі 16С показані аналогічні результати, як на Фігурі 168 для МНКПК від іншого донора, і, крім того, показано, що р5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е4300 було більш ефективним, ніж одновалентні з'єднувальні антитіла Б51де1-016-Н5І 2-І С905-Е405І -
Е4ЗзО0СсіХр12-КА098-Е430 і р5Ідет1-612-Е405І -Е430сх010-Н5БІ 2-КА098-Е4300 в індукції АОСС на клітинах Каї).
Приклад 12: Біспецифічні антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, індукують потужний ефект СОС ех мімо у первинних пухлинних клітинах у пацієнтів з різними В- клітинними неоплазіями.
СОб-ефективність р5Ідс1-016-Н5І 2-І 2905-4051 х010-Н5І 2-К4098-Е4300 аналізували з використанням первинних пухлинних клітин, отриманих з п'яти різних В-клітинних неоплазій: хронічної лімфоцитарної лейкемії (ХЛЛ), фолікулярної лімфоми (ФЛ), дифузійної крупноклітинної В-клітинної лімфоми (ДКБКЛ), мантійно-клітинної лімфоми (МКЛ) і неходжкінської лімфоми (без додаткової класифікації). Усі зразки від пацієнтів були отримані після письмової інформованої згоди й збережені з використанням протоколів, затверджених
Медичним етичним комітетом Мтс відповідно до Хельсінкської декларації. Мононуклеарні клітини кісткового мозку пацієнтів (МНККМ) або мононуклеарні клітини периферійної крові (МНКПК) виділяли центрифугуванням у градієнті щільності (Рісо-Радие РІ О5, СЕ Неайвсаге) з аспіратів кісткового мозку або зразків периферійної крові пацієнтів. Клітини або використовували безпосередньо, або зберігали в рідкому азоті до подальшого використання.
Тканину лімфатичного вузла пацієнта розсікали на дрібні фрагменти й збирали в середовище «-МЕМ (Тпептоїїзспег Зсіепійс, Уолтем, Масачусетс), що містить 1 95 пеніциліну- стрептоміцину, 0,2 95 гепарину й 5 95 лізату тромбоцитів, і залишали на ніч при 37 "С. Після
Зо інкубації збирали надосадову рідину (нестромальний клітинний компартмент, який включає пухлинні клітини), і клітини фільтрували з використанням 70 мкм Еабзу 5ігаїіпег (Стгеїпег Віо-опе).
Клітини підраховували, ресуспендували в середовищі КРМІ 1640, що містить 25 95 інактивованої нагріванням ЕТС і 1095 ДМСО, і заморожували в рідкому азоті до подальшого використання.
Рівні експресії СО37 і мембранних регуляторних білків комплементу (пПСКР; СО46, СО55 і
СО59) на ізольованих клітинах пацієнта визначали з використанням ОЙКИ (ОАКО, кат. Мо
КО07811). Клітини інкубували з очищеними антитілами СО37 (ВО, кат. Ме555456), С046 (Віоіїєдепа, кат. Ме352404), СО55 (Віоієдепа, кат. Ме311302), СО59 (Віоіедепа, кат. Ме304702) і 012 (Септар) при 4 "С протягом 30 хв. Після цього був використаний метод, наданий виробником ОК. Після заключного етапу процедури набору ОЇ клітини інкубували з маркерами, специфічними для клітин лімфоми, для ідентифікації пухлинних клітин. На Фігурі 17 показані рівні експресії для кожного показника.
Пухлинні клітини, отримані від пацієнта, опсонізували 10 мкг/мл або 100 мкг/мл Б5Ідсе1-016-
Н5БІ2-ІЇ 6905-4051 хО10-Н5І 2-К4098-Е4300б, і індукцію СОС оцінювали в присутності 20 95 об'єднаної МН5. Наступні клітинні маркери були використані для ідентифікації різних клітинних популяцій: СО45-КО (ВесКтап Сошціег 836294), СО019-РС7 (ВесКтап СошиКег, кат. Мо ІМ3628),
СОрз3-м450 (ВО, кат. Мео560365), СО5-АРС (ВО, кат. Ме345783), СО5-РЕ (САКО, кат. МекО84201),
СО10-АРС-Н? (ВО, кат. Моб55404), СО10-РЕ (БАКО, кат. Моко84201), СО23-РІТС (Віоіедепа), кат.
Мо 338505), лямбда-АРС-Н7 (ВО, кат. Моб656648), каппа-РЕ (БАКО, кат. МоКО43601) і лямбда-
ІТС (Етеїса Віозсієпсе СУТ-ІГ АМВЕ). У популяції клітин СО45-- злоякісні В-клітини визначали різними маркерами залежно від показань: СОЗ3-/С019-4/СО54-4 (ХЛЛ), СО3-/С019-4/С26010-- (ФЛ,
ДКБКЛ), СО3-/2019-4/005-/0023- (МКЛ). У випадку, якщо злоякісні В-клітини не могли бути ідентифіковані на основі цих маркерів, злоякісні клітини були ідентифіковані на основі клональності з використанням фарбування каппа/лямбда. У декількох зразках злоякісні В- клітини також не могли бути ідентифіковані на основі клональності; у цих випадках оцінювали загальну популяцію В-клітин без відмінності між нормальними й злоякісними В-клітинами. Лізис розраховували, як частку позитивних за 7-аміннактиноміцином Ю (7-ААО; ВО, кат. Мо555816) злоякісних В-клітин (96), визначену за допомогою проточного цитометра І 5КЕогієзза (ВО
Віозсіепсе5, Сан-Хосе, Каліфорнія).
На Фігурі 18 показано, що Б51де1-016-Н5І 2-І С905-Е405І х0О10-Н5І 2-К4098-Е4300 має високу ефективність (лізис більш 50 95) в індукції СОС у пухлинних клітинах, отриманих у пацієнтів із ХЛЛ, ФЛ, МКЛ, ДКБКЛ або В-НХЛ (без додаткової класифікації). У клітинах від одного пацієнта з рецидивуючою/рефрактерною ФЛ Б51дсе1-016-Н5І 2-І 2905-Е405І х010-Н5БІ 2-
К4098-Е4300 було менш здатним індукувати СОС.
Приклад 13: Зв'язування біспецифічного антитіла до СО37 з мутацією, яка посилює Ес-Ес- взаємодію, з В-клітинами людини або яванського макака в цільній крові, та індукція цитотоксичності в В-клітинах у цільній крові.
Зв'язування з В-клітинами людини або яванського макака
Зв'язування з В-клітинами людини або яванського макака визначали в аналізі зв'язування цільної крові. Гепаринізовану кров людини від здорових добровольців одержували з ОМС
Шгесії (Утрехт, Нідерланди), оброблену гірудином кров від яванских макак одержували від
Сомапсе (Мюнстер, Німеччина). Аліквоти крові додавали в комірки 96-коміркового круглодонного планшета (Сгеїпег Віо-опе, кат. Моб5010; 35 мкл/комірку). Еритроцити (КВС) лізували додаванням 100 мкл буфера для лізису КВС (10 мМ КНСсО»з |Зідта РО1441, 0,1 мМ
ЕДТА (РійКа 036201 і 0,15 мм МНаСІ І|Зідта А56661)) та інкубували на кризі до завершення лізису еритроцитів. Після центрифугування протягом З хвилин при 300 9 клітини інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С із серійними розбавленнями (кінцева концентрація антитіл 0,014-30 мкг/мл в
З серійних розбавленнях) АІеха-488-міченого Б51де1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-
К4098-Е4300 або АїІеха-488-міченого контрольного Ідс1 (Ідсе1-Б12) і антитіла із прямій міткою для ідентифікації В-клітин (із суміші антитіл для подальшої ідентифікації популяцій клітин крові):
Для В-клітин крові людини використовували наступне антитіло:
Для В-клітин крові яванського макака використовували наступне антитіло:
Клітини осаджували й двічі промивали в 150 мкл буфера РАСЗ і ресуспендували в 150 мкл
ТО-РНАО-3 (кінцева концентрація 0,2 мкм; Моїесшаг Ргобев, кат. МеТ3605). Зразки аналізували
Зо проточною цитометрією з використанням проточного цитометра І 5КЕопезза. Зв'язування виражали як середнє геометричне значення інтенсивності флуоресценції А488 для життєздатних В-клітин ТО-РНАО-3-/С014-/С019-- (людини) або життєздатних В-клітин ТО-РНО-3- /6р14-/20194/С6020- (яванського макака). Логарифмічно перетворені дані аналізували з використанням значень найкращої нелінійної відповідності доза-відповідь в згарпРайд РКІЗМ.
На Фігурі 19 показано залежне від концентрації зв'язування Б51дсе1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -
Е4З0сіх0О10-Н5БІ 2-КА098-Е430 з В-клітинами в (А) крові людини й (В) крові яванського макака для одного репрезентативного донора/тварини. Середні значення ЕСзо для зв'язування з В- клітинами людини й яванського макака були в тому ж діапазоні (0,85 мкг/мл ж 0,284 на основі зв'язування з В-клітинами в крові від б людей-донорів| і (0,63 мкг/мл ж 0,228 на основі зв'язування з В-клітинами в крові від 4 тварині, відповідно), що вказує на те, що р5Іде1-016-
Н5БІ2-ІЇ 6905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 демонструє співрозмірне зв'язування з
СО37 людини й яванського макака.
Цитотоксичність стосовно В-клітин людини або яванського макака
Цитотоксичність стосовно В-клітин людини або яванського макака визначали в аналізі цитотоксичності цільної крові. Оброблена гирудином кров людини від здорових добровольців була отримана з ОМС ІЛгесії (Утрехт, Нідерланди), оброблена гирудином кров яванського макака була отримана від Сомапсе (Мюнстер, Німеччина). Кров відбирали в комірки 96- коміркового круглодонного планшета, 35 мкл/комірку.
Додавали серійні розбавлення (кінцева концентрація антитіл 0,0005-10 мкг/мл в З серійних
БО розбавленнях; кінцевий об'єм 100 мкл/комірку) Б5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430СсхО010-
Н5ЬІ 2-К4098-Е4300 або Ід051-612. В аналізах цитотоксичності з використанням цільної крові людини як еталона було включене моноклональне СЮО37-специфічне антитіло Ідс1-(328.1-
З2390-І332Е з посиленою Есук-взаємодією. Зразки інкубували при 37 "С протягом 4 годин.
Після цього еритроцити лізували, як описано вище, і зразки фарбували для ідентифікації В- клітин, як описано вище. Клітини осаджували й двічі промивали в 150 мкл буфера ЕАСЗ і ресуспендували в 150 мкл ТО-РНО-3 (кінцева концентрація 0,2 мкм; МоїЇесціаг Ргобев5, кат.
МеТ3605). Зразки аналізували проточною цитометрією з використанням проточного цитометра
І ЗКРопевзза. Після виключення дублетів визначали відсоток життєздатних ТО-РНАО-3-/С014- /6019-8О-клітин (людини) або життєздатних ТО-РНО-3-/2014-/6019-/0020--В-клітин (яванського макака). Відсоток виснаження В-клітин розраховували в такий спосіб: 96 виснаження
В-клітин - 100 х І (95 В-клітин без Ат у контролі - 95 В-клітин у зразку) / (96 В-клітин без Ат у контролі). Логарифмічно перетворені дані були проаналізовані з використанням значень найкращої нелінійної відповідності доза-відповідь в згарпРаа РКІЗМ.
На Фігурі 20 показана залежна від концентрації цитотоксичність р5Ідс1-016-Н5І 2-І С905-
Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 для В-клітин у крові (А) людини й (В) яванського макака для одного репрезентативного донора/гтварини.
Виходячи з ЕСбхо здатність Бр51Ідое1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е4300х010-Н5І 2-К4098-Е4зО0Сс індукувати цитотоксичність у клітинах В людини й яванського макака була співрозмірною: середнє значення ЕСзо для цитотоксичності для В-клітин людини (у крові від 6 донорів) - 0,077 мкг/мл ж 0,039; середнє значення ЕСв5о для цитотоксичності стосовно В-клітинам яванського макака (у крові 4 тварин) становило 0,043 мкг/мл х 0,019.
На Фігурі 20А також показана цитотоксичність моноклонального антитіла Ідс1-(428.1-52390-
ІЗ32Е з посиленою Есук-взаємодією, щодо В-клітин людини для репрезентативного відповідного донора, що показало більш низьку цитотоксичність, ніж р5Ідсе1-016-Н5І 2-І С905-
Е405І -Е430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е4300. В В-клітинах від З відповідних донорів, було виміряне максимальне виснаження В-клітин на 50 95 для Ідс1-5428.1-52390-І332Е, тоді як у З інших донорів цитотоксичність для В-клітин з цим антитілом не визначалася. В5Іде1-016-Н5І 2-І С905-
Е405І -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 індукувало цитотоксичність в 93-99 95 В-клітин в 6/6 донорів. Зв'язування Ідс1-(328.1-52390-І332Е з СО37, експресованим на клітинах Дауді, було співрозмірним з таким у Б51д(1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е430 (дані не показані).
Приклад 14: Виражена активність СОС для комбінації біспецифічного антитіла до СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, з СЮО20О-специфічним антитілом.
Здатність індукувати СОС тестували для комбінації р5Ідс1-016-Н5І 2-І С905-Е405І -
Е430сіхО10-Н5БІ 2-КА09А8-Е4300 і антитіла проти СО20 (Ідс51-С0020-оїта;х офатумумаб) на пухлинних клітинах ХЛЛ, отриманих від пацієнта, від Сопмегзапібріо (Хантсвилл, Алабама, США).
Отримані від пацієнтів МНКІК ресуспендували в КРМІ, що містить 0,295 БСА (бичачий сироватковий альбумін), і поміщали в полістирольні 96-коміркові круглодонні планшети (Сгеїпег
Біо-опе кат. Моб50101) із щільністю 0,1х106 клітин/комірку (30 мкл/комірку) і 50 мкл серії концентрацій р5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е430са (0,0625-0,05 мкг/мл) і Ід1-С0020-оїа (1-8 мкг/мл) в 2-кратних розбавленнях. В5Ідсое1-016-Н5БІ 2-І 6905-4051 -
Е4З0сіхО10-Н5БІ 2-КА098-Е4305 і Ід1-С020-ога поєднували в концентраціях антитіл, виходячи з відносної активності (різниці в ЕСво) кожного з антитіл, змішуючи дві концентрації, які будуть в середньому окремо досягати того ж ефекту. 951-612 використовували як негативний контроль.
Після інкубації (КТ, 15 хв. при струшуванні) у кожну комірку додавали 20 мкл об'єднаної нормальної людської сироватки (МН, кат. МеМО008 Запдиіп, Амстердам, Нідерланди) і планшети інкубували при 37 "С протягом 45 хвилин. Реакцію зупиняли охолодженням планшетів на кризі. Після центрифугування протягом З хвилин при 300 д клітини двічі промивали 150 мкл буфера РГАС5 і інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С с міченим К- фікоеритрином (РЕ) мишачим антитілом проти людського Ідсе1-СО019 (клон 9У3-119, ВесКтап
СошнНег, кат. Мо АО7769, 1:50 розбавлений з вихідного розчину) для визначення В-клітин пухлини й ТО-РНАО-3 (кінцева концентрація 0,2 мкм; МоЇесшаг Ргобев5, кат. МеТ3605) для ідентифікації мертвих клітин. Клітини осаджували й двічі промивали в 150 мкл буфера ЕАСЗ і аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням проточного цитометра І ЗКЕогіезза. Відсоток життєздатних клітин розраховували в такий спосіб: 95 життєздатних клітин - 100 х (число ТО-
РАО-3 З негативних результатів)/загальне число результатів).
На Фігурах 21А-О показано, що як р5Ідс1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5БІ 2-КА09В-
Е4300, так і офатумумаб індукували СОС у пухлинних клітинах, отриманих від 2 пацієнтів із
ХЛЛ, причому активність СОС підвищувалася зі збільшенням рівнів дози. Комбінація р5Ідс1- 016-Н5БІ 2-І 2905-4051 -Є430сх010-Н5І 2-К4098-Е4300 з офатумумабом приводила до підвищеної активності СОС при всіх протестованих концентраціях для обох протестованих пацієнтів із ХЛЛ, хоча ці ефекти були менш виражені при більш високих концентраціях антитіл, де окремими агентами був викликаний майже повний лізис клітин (Фіг. 21А і В). Ці результати показують, що додавання офатумамаба до Б51д(е1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430Ссх010-Н5БІ 2-
Ка4098-Е4300 дозволяє поліпшити СОС -опосередкований лізис пухлинних клітин у злоякісних В- 60 клітинах, отриманих від пацієнтів із ХЛЛ.
Приклад 15. Протипухлинна активність біспецифічного антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, на моделях ксенотрансплантатів В-клітинних неоплазій.
Протипухлинна активність на моделі підшкірного ксенотрансплантата хронічного В- клітинного лейкозу людини УММ-3
Клітини УММ-3 (1х107) інокулювали в правий бік мишей СВ17.5СІО, і починали лікувати антитілами (3 щотижневі дози по 0,1; 0,3; 1; З або 10 мг/кг, з внутрішньовенним введенням;
Ідс1-812 використовували як негативний контроль (дозування 10 мг/кг), коли пухлини досягали середнього об'єму приблизно 158 мм3. Об'єми пухлин вимірювали два рази на тиждень у двох вимірах, використовуючи штангенциркуль, і об'єм виражали в мм? за формулою: О - (Дх Ш х
Шу/г, де О - об'єм пухлини, Д - довжина пухлини (самий довгий розмір пухлини) і Ш - ширина пухлини (самий довгий розмір пухлини, перпендикулярний до Д).
На Фігурі 22А показаний об'єм пухлини на групу доз із часом, на Фігурі 22В показані об'єми пухлин на мишу на групу доз на 25 день, коли всі групи були завершені. Три щотижневі дози р5Іда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430сх010-Н5БІ 2-КА098-Е4300 у дозуванні 1, З або 10 мг/кг значно знижували ріст пухлин із клітин УММ-3, тоді дозування 0,1 або 0,3 мг/кг не впливали на ріст пухлини (тест Манна-Уіїтні, р «0,01).
Протипухлинна активність на моделі внутрішньовенного ксенотрансплантата лімфоми
Дауді-Ішс Беркита
У день 0 мишам СІЮ (С.8-17/Логпапевпза-р/гкасзсій; Нагіап) внутрішньовенно вводили клітини Дауді-Інс (трансфікувані люциферазою клітини Дауді, 2,5х105 клітин/миша). На 14, 21 і 28 день мишам внутрішньоочеревинно вводили 0,1; 0,3; 1; З або 10 мг/кг б51дсе1-016-Н5І 2-
І С905-Е405І -Е430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е4300. 0 1д01-612 використовували як негативне контрольне антитіло в дозі 10 мг/кг. Ріст пухлини оцінювали щотижня (починаючи від дня 2) за допомогою біолюмінесцентної візуалізації (ВІ). Мишам уводили внутрішньоочеревинно 100 мкл
ЮО-люциферину світлячків (30 мг/мл; Саїїрег І йезсіепсе5, кат. Мо 119222), і вимірювали біолюмінесценцію (яскравість у ф/с/см-/кв.радій. |фотонів на секунду на см? на квадратний радіані) під ізофлурановою анестезією з використанням системи біолюмінесцентної візуалізації
Віозрасе (РегкіпеІтег; зображення для мишей були отримані з ділянки спини).
На Фігурі 23А показана активність люциферази (біолюмінесценція як міра об'єму пухлини)
Зо на групу доз у часі, на Фігурі 238 показана активність люоциферази на мишу на групу доз на 36-й день, коли всі групи були ще завершені. Три щотижневі дози Б51де1-016-Н5БІ 2-І 6905-4051 -
Е430схО10-Н5БІ 2-К4098-Е4300 у дозуванні 0,1; 0,3; 1; З або 10 мг/кг значно знижували ріст клітин Дауді-Іис іп мімо (однобічний дисперсійний аналіз, без виправлення критерію найменшої значимої різниці Фішера).
Приклад 16. Оцінка плазмового кліренсу біспецифічного антитіла анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, у мишей 5СІЮ.
Самкам мишей СІЮ у віці 11-12 тижнів (С.8В-17/сгпапенза-ргкасзсідй; Напап) (3 миші на групу) уводили внутрішньовенно (в/в) одноразову дозу 100 мкг (5 мг/кг) або 500 мкг (25 мг/кг) р5Іда1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5БІ 2-КА098-Е430Сс або Іде1-612. Експеримент був розроблений для вивчення кліренсу антитіл за відсутності мішень-опосередкованого кліренсу, оскільки ні Б5Іде1-016-Н5І 2-І 2905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-КА098-Е4300, ні ІдсС1-612 не демонструють перехресну реактивність із білками миші.
Зразки крові 50-100 мкл відбирали з підшкірної вени через 10 хвилин, 4 години, 24 години, 2 дня, 7 або 8 днів, 14 днів і 21 день після введення антитіла. Кров збирали у флакони з гепарином і центрифугували протягом 5 хвилин при 10000 д. Зразки плазми розбавляли 1:50 для мишей, яким уводили 5 мг/кг (20 мкл зразка в 980 мкл РВЗА (ФБР із додаванням 0,2 95 бичачого сироваткового альбуміну (БСА)), і 1:20 для мишей, яким уводили 25 мг/кг (20 мкл зразка в 380 мкл РВЗА) і зберігали при -20 "С до визначення концентрацій мАт.
Концентрації людського ЇдД визначали за допомогою сендвіч-ІФА. Мишачі антитіла проти людського Ідс-каппа, клон МН16 (СІ В Западпіп, Нідерланди; кат. МеМ1268), наносили в кількості 100 мкл їі інкубували протягом ночі при 4 "С в 96-коміркових планшетах для ІФА МісгоЇоп (Грейнер, Німеччина) у концентрації 2 мкг/мл, і використовували як захоплювальне антитіло.
Після блокування планшетів РВ5А протягом 1 години за кімнатної температури (КТ), додавали зразки, серійно розбавлені в РВ5А і інкубували на шейкері для планшетів протягом 1 години при КТ. Планшети тричі промивали 300 мкл РВ5Т (ФБР із додаванням 0,05 9о Ту'ееп 20) і потім інкубували протягом 1 години за кімнатної температури з козячим антитілом до людського Ідс- імуноглобуліну (Часкбзоп, Уест-Грейс, Пенсільванія; кат. Мо109-035-098; 1110000 в РВ5Т з додаванням 0,295 БСА). Планшети знову тричі промивали 300 мкл РВ5Т перед інкубацією з 2,2-азино-біс(З-етилбензтіазолін-бб6-сульфоновою кислотою) (АВТ5; Коспе, Маннхейм, бо Німеччина), захищаючи від світла. Реакцію зупиняли додаванням 100 мкл 2 90 щавлевої кислоти. Абсорбцію вимірювали за допомогою рідера для мікропланшетів (Віоїек, Віноски,
Вермонт) при 405 нм. Концентрацію людського ЇДо розраховували, використовуючи введений матеріал для контрольної кривої. Як контроль планшетів був включений очищений людський
ІДО1 (ділянка зв'язування, кат. М"ВРО78). Концентрації людського до (у мкг/мл) наносили на графік (Фіг. 24А ї 24С), і площу під кривою (АОС) розраховували з використанням сгарпРай ргізт 6.0. Кліренс дО до останнього дня забору крові (21 день) визначали за формулою О х 1.000/ АОС, у якій О - уведена доза (1 мг/кг) (Фіг. 248 і 240).
Не було істотних відмінностей між показниками плазмового кліренсу Б51дс1-016-Н5І 2-
І С905-Е405І -Е430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е430 і Іде1-6812, що свідчить про те, що Б5Іде1-016-
Н5БІ2-ІЇ 6905-4051 -Е430с1х010-Н5І 2-К4098-Е4300 демонструвало співрозмірний фармакокінетичний профіль із людським Ідс1 дикого типу за відсутності зв'язування з мішенню.
Приклад 17: Визначення внеску амінокислотних залишків СО37 у зв'язування антитіл анти-
СО37 з використанням аланінового сканування.
Конструювання бібліотеки
Була синтезована бібліотека СО37 з одним аланіновим залишком (Сепеагі), у якій усі амінокислотні (аа) залишки в позаклітинних доменах людського СО37 (Опіпрої Р11049) були індивідуально мутованими в аланіни, за винятком положень, що вже містять аланіни або цистеїни. Цистеїни не були мутованими, щоб мінімізувати ймовірність структурного руйнування антигену. Бібліотеку клонували в вектор експресії рРМАС, що містить експресійну касету
СММ/ТК-роїуА, ген стійкості до Атр і джерело реплікації РВК322.
Одержання й скринінг бібліотеки
СО37 дикого типу й аланінові мутанти експресували індивідуально в клітинах Егеевіує
НЕК293 відповідно до інструкцій виробника (Тпегто Зсіепійіс). Через день після трансфекції клітини збирали. Приблизно 100000 клітин інкубували з 20 мкл кон'югованого з АіІеха488 р5ІдС1- р12-Е405І -Є430сх010-Н5БІ 2-К4098-Е4300 (одновалентне зв'язування 010) або з кон'югованим з
АІеха488 реІдат1-016-Н5І 2-І 6905-4051 -Е430с1хр12-К4098-Е4300 (одновалентне зв'язування 016) у концентрації З мкг/мл у буфері РЕАС5 (ФБР я 0,1 95 (мас./об.) бичачого сироваткового альбуміну (БСА) ж 0,02 95 (мас./об.) азиду натрію). Клітини інкубували протягом 1 години за кімнатної температури. Потім клітини двічі промивали, додаючи 150 мкл буфера ЕАСЗ і
Зо видаляючи надосадову рідину після центрифугування. Клітини ресуспендували в 20 мкл свіжого буфера ЕГАСЗ і зберігали при 4 "С до аналізу методом проточної цитометрії з використанням скінера іоце (ІпіейїСу). Увесь експеримент виконували 2 рази.
Аналіз даних
Для кожного зразка середнє зв'язування антитіл на клітину визначали як середнє геометричне значення інтенсивності флуоресценції (9ІМЕЇ) для популяції клітин без гейтинга. На
ОМЕЇ впливає афінність антитіла до мутанта СОЗ37 і рівень експресії мутанта СО37 на клітину.
Оскільки специфічні аланінові мутації можуть впливати на рівень поверхневої експресії мутанта
СО37, і для корекції відмінності в експресії для кожного мутанта СО37 у цілому, дані були нормалізовані відносно інтенсивності зв'язування неконкурентного СО37-специфічного контрольного антитіла (у цьому прикладі антитіла одновалентного зв'язування 010 і одновалентного зв'язування 016 були неконкурентними антитілами, і одне антитіло використовували як контроль для іншого антитіла), з використанням наступного рівняння:
Нормалізоване значення М РІРІ (положенняаа) - І од о9МАА (дослідногсантитілу
ОМН|(контрольноо антитіла
При цьому "положення аа" відноситься до конкретного положення аланінового мутанта або в СО37, або в СО37 дикого типу (м/).
Щоб виразити зменшення або посилення зв'язку антитіл, стандартну оцінку визначали згідно з наступним розрахунками: з --оцінкакратназміна) - Нормалізоване значення 9МЕЇ (положенняаа) - м. о
Де мн їі о є середнім значенням і стандартним відхиленням (50) нормалізованого значення
ОМЕЇ для всіх мутантів.
Посилення зв'язку в більшості випадків буде спричинене втратою зв'язку еталонного антитіла зі специфічними аланіновими мутантами. Використовуючи ці розрахунки, положення амінокислот, для яких при заміні амінокислоти на аланін не буде втрачатися або посилюватися зв'язок з конкретним антитілом, дадуть значення 7-оцінки "0", посилення зв'язку призведе до значення "2-оцінки » 0", а зниження зв'язку призведе до значення "2-оцінки « 0". Для корекції зміни зразка тільки "амінокислотні залишки СО37, у яких значення 7-оцінки було нижче -1,5, вважалися "мутантами із втратою зв'язку" У випадку, якщо МР контрольного антитіла для конкретного мутанта СО37 було нижчим, ніж середнє значення О9МРІ-2.5х50 середнього значення ОМеіконтрольного антитіла, Дані ВИКЛючали з аналізу (оскільки для цих мутантів СО37 передбачалося, що рівні експресії не були достатніми).
На Фігурі 25 показане значення "72-оцінки (кратної зміни)" антитіл анти-СО37 до варіантів
СО037 з мутаціями Ала в положеннях з 42 до 131 (згідно ЗЕО ІЮ МО: 94). Результати показують, що: - зв'язування антитіла 010 щонайменше залежить від 182, 0189, 1191, 1192, 0194, К195,
М196, 1197 ії РІ99 людського СО37; - зв'язування антитіла 016 щонайменше залежить від Е124, Е162, 2163, М164, І 165 і НІ75 людського СОЗ37.
У підсумку
Таким чином, біспецифічні антитіла, які складаються із двох СО37-специфічних антитіл, які не конкурують за зв'язування мішені, з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, показали найбільш придатну комбінацію активності СОС і активності АОСС в СО37-позитивних пухлинних клітинах. Для обох ефекторних механізмів біспецифічні антитіла з мутацією, яка посилює взаємодію Бо-Бс, показали більш високу ефективність у порівнянні з комбінацією двох неконкурентних антитіл СО37, які містять мутацію, що посилює взаємодію Ес-Ес, або з одиночними антитілами до СОЗ37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес.
Приклад 18. Оцінка іп міго активності СОС сумішей нових посилених гексамеризацією антитіл анти-СО37 із клінічно встановленими продуктами антитіл проти СО20 на клітинах Каїї.
СОб-активність сумішей антитіл анти-СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, ІДИ1- 37.3-Е430С2, ІдДа1-428.1-Е430С, ІдДСа1-004-Е430С, Ідс1-005-Е430С, І921-010-Е4305 і Іде1-016-
Е430с (останнє з 4 - химерне антитіло кролика/людини), а також клінічно встановлених продуктів моноклональних антитіл, націлених на СО20, МарТпега (ритуксимаб; Коспе,
НО124808), Аглеіта (офатумумаб; Момагіїє; С656294) і саума (обінутузумаб, СА101; (0287-А1А (САСО20)) тестували іп міго з використанням клітин Каїї лімфоми Беркита. Клітини Каї (АТСС,
Зо кат. Мо ССІ -86) культивували в КРМІ 1640 з додаванням 10 95 інактивованої нагріванням ЕТС, 1 од./мл пеніциліну, 1 мкг/мл стрептоміцину й 4 мМ І! -глютаміну. 0,1х105 клітин Каїї попередньо інкубували з антитілами в загальному об'ємі 80 мкл ЕРМІ/ 0,2 95 БСА на комірку протягом 15 хвилин на шейкері за кімнатної температури. Потім МН5 додавали до клітин після попередньої інкубації до кінцевого об'єму 100 мкл (кінцеві концентрації антитіл 10 мкг/мл; 20 95 МН5Б) та інкубували протягом 45 хвилин при 37 "С. Для всіх протестованих загальних концентрацій антитіл були аналізовані різні співвідношення двох антитіл у сумішах (1:0 - 3:11 - 1:1 - 1:3- 0:11).
Планшети центрифугували й клітини ресуспендували в 30 мкл Рі (2 мкг/мл). Лізис розраховували, як частку Рі-позитивних клітин (95), визначену за допомогою проточної цитометрії на скінері їбОце (ІпіеПйісу). Дані були проаналізовані й нанесені на графік з використанням програмного забезпечення СгарпРаа Ргізт.
Суміші тестованих антитіл до СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, і клінічно встановлених продуктів антитіл до СО2О показали підвищену дозозалежну активність СОС у порівнянні з тією ж концентрацією окремих антитіл на клітинах Каїї (Фіг. 8). Спостерігалася невелика різниця в активності СОС при різних протестованих співвідношеннях двох антитіл у сумішах (1:3, 1:11 або 3:1). Ці дані вказують на те, що суміш посиленого гексамеризацією антитіла СО37 з мутацією, яка посилює взаємодію Ес-Ес, і клінічно встановленого продукту антитіла до СО20, такого як МартТпега, Аглегта (антитіла проти СО20 | типу) або Саума (антитіло проти СО20 ІІ типу), дозволяє поліпшити терапевтичний потенціал у пацієнтів з В- клітинними неоплазіями, які часто стають несприйнятливими до стандартної терапії, спрямованої на СО20.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ГЕНМАБ ХОЛДІНГ Б.В. «120» БІСПЕЦИФІЧНІ АНТИ-С0О37-АНТИТІЛА, МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИ-СО37-
АНТИТІЛА ТА СПОСОБИ ІХ ЗАСТОСУВАННЯ
«1305 Р/0109-мОо-рРСТ-2 60 «1605» 117
«1705 Патентна версія 3.5 «2105. 1 «211» 121 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2235 М/А «400» 1 сіи ма! сіп Гей ма! сій 5екг сІЇу сЇу су гГеи ма! сіп Рго сІу сіу 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге б5ег Су5з АЇїа АїЇа бек сіу Рпе 5ег Гей бег ТНиг туг 20 Азр Меє 5ег Тгр ма! Агу сіп АїЇа Рго сіу Гуз ОЇу Ге січ Тгр маї 5зег ІІе ІчІІе Туг 5ег 5ег ма! сіу Аїа Туг Туг АЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз бо 25 сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Азр Азп 5ег Гуз Азп ТИг Гей Туг Гей 65 70 75 80 сіп Меє А5зп 5ег гей Агуд АїЇа сій Азр ТиПг АЇїа ма! Туг Туг Суз АїЇа
Зо 85 90 95
Агу сі Туг сЇ1у Аїа 5ег 5ег 5ег Азр Туг ІІе РНе 5ег Геу Тгр с1у 100 105 110 35 сіп сіу Тйгоїеуи ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 2 «2115 8 40 «2125 РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «А00» 2 45 сІіу Рпе бег Геу бек Тиг Туг дер 1 5 «210». 3 «2115 7 50 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «4005» З 55 ІІе Туг бег 5ег ма! с1у Аїа 1 5 «210». 4 «2115 15 60 «2125 РТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «А00» 4
АІїа Агд сі Туг сіу Аіа 5ег 5ег 5ег Азр Туг ІІе Ре 5ег ге 1 5 10 15 «210». 5 «2115 113 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005 5
АЇа сіп ма! Ге Тк о сіп бег Рго бег Рго Гей 5ег АЇа 5ег маїЇ с1у 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тийг ІІе Тийг Суз сіп Аіа б5ег сіп б5ег ма! Туг Азп 5ег 20 сСіп Азп Гей АїЇа Тгр Туг сіп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей
ІЇеи ІІе Туг сім АЇа б5ег уз Ге АЇа бег сіу ма! Рго 5ег Агу РНе 25 50 55 60
Гуз сС1у бЗег сіу бек сіу Тк сі Рпе ТНПг о їеи ТНг ІІе 5ег 5ег ге 65 70 75 80 30 сбіп Рго Азр А5зр Ре Аїа Тийг Туг туг Су5 сп с1іу сі Рпе 5ег сСузв 85 90 95
ІІе б5ег АЇа Азр Су5 ТНг АЇа РНе Ссіу сіу сіу ТНг Гуз ма! сій Ше 100 105 110 35
Гуз «21055 Ь6 «2115 8 40 «2125 РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «400» 6 45 сіп б5ег ма! Туг Азп 5ег сп деп 1 5 «2105 7 «2115 13 «212» РЕТ 00 «213» Кріль європейський (огусстоїЇади5 сипіси1и5) «4005 7 сіп су сі Рпе 5ег Суз ІІе 5ег АЇа Азр Су5з Тиг АїЇа 5Б 1 5 10 «210» в «2115 117 «212» РЕТ 60 «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А
«400» 8 сі сіп 5ег ма! ма! сій 5екг су сЇу су гГеи ма! сіп Рго сІу сіу 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге бег Суз ТиИг ма! бек с1іу Рпе 5ег Ге бег 5ег Авзп 20 25 30
АїЇа Меє Азп Тгр маї!Ї Агд сіп АЇа Рго сІу Гуз сЇу Ге сЇи Тер ІПе 35 40 45
СІУу Гей ІїІе Туг АЇа 5ег с1у А5зп Тиг Ар Туг АЇа 5ег Тгр Аїа Гуз 50 55 60 сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Гуз ТИг о5ег Тиг Тиг ма! Туг гГец Гуз Пе 65 70 75 80
Тиг обег о Рго ТНг АЇїа сі Азр ТНг Аїа ТиИг Туг Рпе Су АїЇа Аг си 85 90 95 сІ1у 5ег ма! Тгр сЇу АЇа Аїа Рпе дор Рго Тгр сЇу сіп сіу Тиг гей 100 105 110 ма! Тиг ма! 5ег 5ег 115 «210» 19 «2115 8 «2125 РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «400» 9 сіу Рпе бег їеу 5ег 5ег Азп АїЇа 1 5 «210» 10 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «4А00» 10
ІчІІе Туг АЇа 5ег сІу Азп ТЕГ 1 5 «210» 11 «2115 13 «212» РЕТ 00 «213» Кріль європейський (огусстоїЇади5 сипіси1и5) «А00» 11
Аіа Агд сі сіу 5ег ма! Тгр СсСІу Аїа АЇїа РНе А5р Рго 5Б 1 5 10 «2105» 12 «2115 110 «212» РЕТ 60 «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А
«А00» 12
АІїа Туг Азр Меє ТиПг о сіп 5ег Рго 5ег 5ег ма! 5ег АЇа 5ег маїЇ с1у 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тиг ІІе Тиг Суз сіп Аіа б5ег сіп бег ІІе 5ег Азп Тгр 20 25 30
Те АїЇа Тер Туг сіп сіп Гуз Рго сіу Гуз АЇа Рго Гуз сіп Геи Пе 35 40 45
Туг Аїа АЇїа бег ТНг Ге Аїа бег сіу ма! Рго 5ег Аг4д РНе Гуз С1У 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу ТИг Азр Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5егеи сп Рго 65 70 75 80 сій Азр Рпе АїЇа ТиИг о Туг Туг Суз сіп сіп сіу Туг 5ег Азп 5ег деп 85 90 95
ІІе А5р Азп ТИг Ре сіу сіу сіу ТиИг Гуз ма! сіи Іе Гуз 100 105 110 «210» 13 «2115 б «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «4005» 13 сіп 5ег ІЇе 5ег Аз5п Тгр 1 5 «210» 14 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіЇади5 сипіси1и5) «400» 14 сіп сіп сіу Туг 5ег А5зп 5ег Ап ІІе дА5р дАзп о тТиг 1 5 10 «210» 15 «211» 119 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 15 сіи ма! сіп Гей ма! сій 5екг сІу сіу СсСІу Геи ма!ї сіп Рго с1Їу сі1у 5Б 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге бег Су5з АіЇїа АїЇа бек сіу Рпе 5ег Ге бег Туг Азп 20 25 30 60 Аїа Мес Азп Тгр ма! Аг9у сіп АЇа Рго сЇу Гуз сЇу Гей с1іи Тгр ма! 35 40 45 5ег ІІе чІІе РНе АЇа б5ег СсІу Агуд Тиг Азр Туг АїЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз
50 55 60 сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Азр Азп 5ег Гуз Азп ТИг Гей Туг Гей 65 70 75 80 сіп Меє А5зп 5ег гей Агуд АїЇа сій Азр ТиПг АЇїа ма! Туг Туг Суз АїЇа 85 90 95
Агу сЇд с1іу 5ег Тиг Тгр с1у Азр АЇа Ге Азр Рго Тгр су сіп с1у 100 105 110
Тиг Ге ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 «210» 16 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1!и5) «400» 16
Сс1У Ре 5ег Гей 5ег Туг Азп АїЇа 1 5 «2105» 17 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «4005» 17
ІІе РНе АЇа 5ег сІУу Ага ТЕГ 1 5 «210» 18 «2115 13 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «400» 18
Аа Агд сі сіу 5ег Тиг Тгр СсСІУу Азр АїЇа Геи Ар Рго 1 5 10 «210» 19 «211» 110 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 19
АІїа Туг Азр Меє ТиПг о сіп 5ег Рго 5ег ТНг Геу б5ег АЇа 5ег маїЇ с1у 5Б 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тийг ІІе Тиг Су5 сіп Аїа 5ег сіп Азп ІЇе ІЇе Азр Туг 20 25 30 60 Гей Аїа Тгр Туг сіп сп Гух Рго оЇу Гуз АЇа Рго Гуз Ге Ге Пе 35 40 45
Ні Гуз Аїа б5ег ТИг Гей Аїа б5ег сіу ма! Рго 5ег Ага РПе Гуз Сс1У
50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5ег ей сп Рго 65 70 75 80
Азр Азр Рпе Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп сіп сіу Туг 5ег Азп 5ег Азп 85 90 95
ІІе А5р Азп ТИг Ре сіу сіу сіу ТиИг Гуз ма! сіЇи Те Гуз 100 105 110 «210». 220 «2115 б «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоїіади5 сипіси1и5) «А00» 20 сіп Азп ІЇе ІІе д5р Туг го 1 5 «210» 21 «2115 12 «212» РЕТ «213» Кріль європейський (огусстоїЇади5 сипіси1и5) «А00» 21 сіп сіп сіу Туг 5ег А5зп 5ег Ап ІІе дА5р дАзп о тТиг зо 1 5 10 «2105» 22 «2115 120 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 22 сіи ма! сіп Гей ма! сій 5екг сІЇу сЇу су гГеи ма! сіп Рго сІу сіу 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге б5ег Су5з АіЇїа АїЇа бек сіу Рпе 5ег Ге б5ег Азп Туг 20 25 30
А5зп Меї сіу Тгр ма! Агд сіп АїЇа Рго СсСІу Гуз СІЇУу Ге си Тер маї 35 40 45 бег ма! ІІе д5р АЇа б5ег сіу Тиг тиг Туг Туг Аїа Тиг Тгр Аїа Гуз 50 55 60 сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Азр Азп 5ег Гуз Азп ТИг Гей Туг Гей 65 70 75 80 сіп Меє Ап 5ег гей Агуд АїЇа сій Азр ТиПг Аїа Тиг Туг Туг Суз АїЇа 85 90 95
Агу Їй Гей ге Туг Рпе сіу 5ег 5ег Туг Туг Азр Ге Тгр Су сп 60 100 105 110 сІ1у Тиг Ге ма! Тиг о ма!їЇ 5ег 5ег 115 120
«210» 23 «2115 8 «212» РЕТ «2135» Кріль європейський (огустоЇади5 сипіси!и5) «А00» 23
Сс1Уу Рпе 5ег Гей 5ег Азп Туг Авп 0 1 5 «210» 24 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстої1ади5 сипіси1и5) «А0О0» 24
ІчІІе А5р АЇа 5ег сіу Тиг ТЕГ го 1 5 «210». 25 «2115 14 «212» РЕТ 25 «213» Кріль європейський (огусстоїЇади5 сипіси1и5) «А00» 25
Аіїа Агд сі їеи Гей Туг Рібе сіу 5ег 5ег Туг Туг А5Зриеи зо 1 5 10 «210» 26 «2115 110 «212» РЕТ 35 «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А 40 «400» 26
Азр ма! ма! Меє Тис осіп 5ег Рго 5ег ТНг Геу б5ег АЇа 5ег маїЇ с1у 1 5 10 15 45 А5р Ага ма! Тиг о ІІе тис Су5 сп Аїа 5ег сіп Азп ІЇе Авзр 5ег дзвп ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу Гуз АЇа Рго Гуз Ріе гГеи ІїЇе
Туг туг АЇїа бег Азп Ге Рго РНе сіу ма! Рго 5ег Аг4д РНе Гуз С1У 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5ег ей сп Рго 65 70 75 80
Азр Азр Рпе Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп Суз АЇа Азр ма! сіу б5ег ТНг 85 90 95 60 Ттуг ма! Аїа Аїа Рбе сІЇу сіу сіу Тиг Гуз ма! сЇи ІїЇе Гу 100 105 110 «2105» 27
«2115 б «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «400» 27 сіп Ап ІЇе Ар 5ег Ап 1 5 «210». 28 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «400» 28 сіп Суз АЇа Азр ма! сіу 5ег ТНг Туг ма! АїЇа Аїа 1 5 10 «210». (29 «2115 110 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А0О0» 29
Азр ма! ма! Меє Тис осіп 5ег Рго 5ег ТНг Геу б5ег АЇа 5ег маїЇ с1у зо 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тийг о ІІе Тиг Су5 сіп Аїа б5ег сіп Азп ІІе Азр 5ег Азп 20 25 30 їеи АЇа Тгр Туг сіп сіп Гуз Рго сіу Гуз АЇа Рго Гу5 Ріпе Геи ІЇе 35 40 45
Туг туг АЇїа бег Азп Ге Рго РНе сіу ма! Рго 5ег Аг4д РНе Гуз С1У 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5ег ей сп Рго 65 70 75 80
Азр Азр Рпе Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп 5ег АЇа Азр ма! сіу б5ег ТНг 85 90 95
Туг ма! Аїа Аїа РНе сіу сіу сіу Тиг Гуз ма! сіЇи Іе Гуз 100 105 110 «2105» 30 «2115 б «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1и5) «400» 30 сіп Ап ІЇе Ар 5ег Ап 1 5 60 «210» 31 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Кріль європейський (огусстоіади5 сипіси1!и5)
«4А00» 31 сіп 5ег АЇїа Азр ма! сЇу 5ег ТНг Туг ма! Аїа діа в 1 5 10 «2105» 32 «2115 127 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 32 сіІп ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сІу АїЇа сім маї!Ї Гуз Гуз Рго с1у АїЇа 1 5 10 15
Бег ма! Гуз ма! бек Су5 сіп АЇа б5ег сіу Туг Агуд Ре 5ег Азп РПНе 20 25 30 ма! Пе н1і5 Тер ма! Агд сіп Аїа Рго сіу сіп Агд Ре сіи Тгр Меє 35 40 45 сІіу Тгр Іїе Азп Рго Туг А5зп с1Їу Азп Гуз сій Рібе б5ег АЇа Гуз РНе 50 55 бо сіп Азр Агуд ма! Тис Ре ТНг АЇа Азр Тиг о 5ег Аа Азп ТНг Аїа туг 3065 70 75 80 мес сіи Ге Агуд б5ег їеи Агуд б5ег Аіа Азр ТИг АЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95
АЇа Агд ма! сіу Рго Туг бег Тгр Азр А5р 5ег Рго сіп Азр Азп Туг 100 105 110
Туг Мет Азр ма! Тер сіу Гуз сіу Тиг Тиг о ма!ї Те маї 5ег 5ег 115 120 125 «210» 33 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 33 сіу Ттуг Агуд Ре 5ег Азп РНе ма! 1 5 «210» 34 «2115. 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 60 00о«223» М/А «400» 34 че А5зп Рго Туг Азп СсІУ А5ЗПп Гуз 1 5 «210» 35 «211» ДЦ 20 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2235 М/А «4005» 35
АІ1а Агд ма! сіу Рго Туг 5ег Тгр А5зр Азр 5ег Рго сіп Азр Азп Туг 1 5 10 15
Ттуг Мет Азр маї 20 «2105» 36 «2115» 108 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 36 сі чІІе ма! Гей ТНг о сіп бек Рго сЇу ТНг їеи 5ег їеи 5ег Рго с1у зо 1 5 10 15 сії Агд Аїа Тис о РНе 5ег Су5 Агдуд 5ег б5ег Ні 5ег ІІе Агд 5ег Ага 20 25 30
Агд ма! Аїа Тгр Туг сіп НІі5 Гуз Рго су сіп Аїа Рго Ага Гей ма! 35 40 45
ІІе ні5 сіу ма! 5ег А5зп Агуд діа бек сіу ІчІІе 5ег А5зр Агуд РНе 5ег 50 55 бо сІ1у б5ег с1у бек с1у ТиПг А5зр Ре ТиИг Ге ТиИг ІІе Тиг Аг маї сій 65 70 75 80
Рго сій Азр Рпе АЇа Гей Туг Туг Суз сіп ма! Туг сІу АЇа 5ег 5ег 85 90 95
Туг ТНг Ре СсІіу сіп сіу ТНиг Гуз Гей сЇи Аг Гуз 100 105 «210» 37 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 37 60 Ні 5ег ІІе Агод 5ег Ага Ага 1 5 «210» 38
«2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 38 сіп ма! туг сіу АЇїа 5ег 5ег Туг ТНг 1 5 «210» 39 «2115 116 «2125» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 39
АЇа ма! сіп ге сіп сіп 5ег сіу Рго сіш Ге сі Гуз Рго сіу Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ІІе 5ег Су5 Гуз АЇа б5ег сіу Туг бег Рпе ТНг сі1у тТуг 20 25 30
Азп Меїє Азп Тгр ма! Гуз сіп Азп А5п сіу Гуз бег Ге си Тер ІїЇє
Зо сіу Азп ІчІІе А5р Рго Туг Туг сіу сіу Тиг Тис о туг Азп Агду Гуз Ре бо
Гуз С1Уу Гуз АїЇа ТИгоГеи Тис ма! Азр Гуз 5ег б5ег о б5ег Тг АЇа Ттуг 65 70 75 80 35 мес сіп Ге Гуз бег гей ТНг об5ег сій Ар 5ег АіЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95 діа Агд бек ма! сіу Рго Мес Азр Туг Тгр с1іу сіп с1іу ТНг 5ег маї 40 100 105 110
Тиг ма! 5ек 5ег 115 45 «210» 40 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність 50 «220» «223» М/А «А00» 40 55 сіу Туг бег Ре Тиг сіу Туг деп 1 5 «210» 41 «2115 8 60 «2125 РТ «213» Штучна послідовність «220»
«223» М/А «400» 41
І Ше А5р Рго Туг Туг оЇу с1у тиг 1 5 «210» 42 «2115 9 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 42 діа Агд бек ма! сіу Рго Меїс Азр Туг 1 5 «210» 43 «2115 107 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 43
Зо
А5р че сіп Меє ТиПг о сіп 5ег Рго дАіа 5ег Геу б5ег АЇа 5ег маїЇ с1у 1 5 10 15 сіи Тис ома! Тис о ІЇе Тиг о Суз Агуд ТТГ обег сій Ап ма! Туг 5ег Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз сіп сІЇу Гуз 5ег Рго сіп Геи ей ма! 35 40 45 бег Рпе АЇа Гуз ТИг Гей АЇїа сі сіу ма! Рго б5ег Агуд Ріпе 5ег су 50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу ТиИг сіп РНе 5ег їеи Гуз ІЇе 5ег 5егІєи сп Рго 65 70 75 80 сі Ар бег с1у б5ег Туг Ре Суб сіп Ні5 Ні 5ег Ар А5зп Рго Тгр 85 90 95
ТиИг РнНе СсСіу сіу сіу ТНг сіи Гей сіЇи ІїЇе Гуз 5О 100 105 «2105» 44 «2115 б «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А 60 «400» 44 сі Азп ма! Туг 5ег тТуг 1 5
«210» 45 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 45 сій Ні Ні 5ег А5р доп Рго Тер Тиг 1 5 «210» 46 «2115 115 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 46 сіп ма! сп ма!їЇ Гуз сі 5ег сІЇу Рго сіу Ге ма! АЇа Рго 5ег сіп 1 5 10 15 5зег Ге б5ег ІІе Тиг Су5 ТиИг ма! бек с1іу Рпе бег Ге ТНг ТНиг 5ег 20 25 30
Зо сіу ма! 5ег Тгр ма! Агд сіп Рго Рго сІу Гуз сЇу Гей сім Тер Гей с1у ма! тІІе Тгр с1у дор с1у б5ег ТИг Ап Туг Ні 5ег АїЇа Геи Гуз 35 50 55 бо б5ег Агуд Ге бег че Гу5 Гуз Азр Ні 5ег Гу5 5ег с1п ма! РНе гГеи 65 70 75 80 40 Туз Ге Азп бег о їеи сіп ТПг о А5р Азр ТИг АЇїа Тиг Туг Туг Су Аїа 85 90 95
Гуз сіу сіу Тукг 5ег Ге Аїа Ні Тер оїу сп сіу ТНг Гей ма! те 100 105 110 45 ма! 5ег Аїа 115 «210» 47 «2115». 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 47 сС1У Рпе 5ег Гей ТиИг о тТНг 5ег су во 1 5 «210» 48 «2115 7
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 48
ІчІІе Тер сІу Азр сІУу 5ег тТНг 0 1 5 «210» 49 «2115 9 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 49
Аїа Гуз с1у сіу Туг 5ег Ге Аїа НІі5 1 5 «2105». 150 «2115 107 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 150
А5р ІчІІе сп Месє ТиПг о сіп 5ег Рго Аїа 5ег їеу бег ма! 5ег ма! с1у 1 5 10 15 сіи Тис ома! Тис о ІЇе Тиг сСуз Агуд Аїа б5ег сій Азп ІтІІе Агуд 5ег дзп 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз сіп сІЇу Гуз 5ег Рго сіп Геи ей ма! 35 40 45
А5зп ма! Аїа ТИг Азп Ге Аїа Азр сіу ма! Рго 5ег Агд РНе 5ег с1у бо 5зег сіу б5ег сіу ТиИг сіп Туг бегїеи Гуз ІЇе Азп 5ег Гей сп 5ег 65 70 75 80 50 сі А5р Ре сіу Тйг о Туг Туг Суб сп Ні Туг Тер су Тис тег тер 85 90 95
ТиИг РнНе СсСІіу сіу СІіУу ТНг Гуз Гей си ІїЇе Гуз 100 105 55 «210» 51 «2115 б «212» РЕТ «213» Штучна послідовність бо «220» «223» М/А
«А00» 51 сі Азп ІЇе Агд 5ег Ап 1 5 «2105 52 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 52 сій Ні Тукг Тер с1у Тис о тие тер тег 1 5 «2105» 53 «2115» 330 «212» РЕТ «2135 Людина (Ното 5аріепез) «4005» 53
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг
Ко 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег з5 сіу ма! Ні ТиПг о РПе Рго АЇа ма! Гей сіп 5ег б5ег су Геу Туг 5ег бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 40 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 45 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125 50 їу5 Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет ІЇе б5ег Агуд Тиг о Рго січ ма! ТНк су 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 55 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 60 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГеи Ргко Рго 5ег Агд сім си 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйго Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег Ре РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре бек Суз 5ег ма! Мес ніх сій Аїа Ге Ні А5Зп НІі5 Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105» 54 «2115 329 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» М/А «4005» 54
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго бег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 сІіу ма! Ні ТиПг РПе Рго АЇа ма! Гей сіп 5ег б5ег су Геу Туг 5ег бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 50 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 55 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125 60 губ Рго Гуз Азр ТПг Ге Меє ІІе бег Агуд ТИг о Рго си ма! ТНг су 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр
145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сп Рго Агуд сі Рго сіп Ма! Туг Тиг Ге Рго Рго 5ег Аг с1Їи си 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйго Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 зо ма! Ре бек Суз 5ег ма! Мес ніх сій Аїа Ге Ні А5Зп Ні Туг Тис 305 310 315 320 сіп Гуз 5ег ей 5ег Гей 5ег Рго с1у 325 «2105». чі55 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 55
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 5О 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма 5ег Тгр Азп 5ег су АЇа Гей Тиг 5ег 35 40 45 55 с1іу ма! Ні ТиПг РПе Рго АЇа ма! Гей сіп 5ег б5ег су Геу Туг 5ег бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5ег ей с1у ТНг сп ТНг 65 70 75 80 бо туг те Су5 А5зп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні ТИг оСу5 Рго Рго Су
100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сій ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 січ сіп Туг А5зп бек ТиИг о Туг Агд ма! Ма!Ї бек маЇ Геу Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 25... 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйго Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сЇу Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105 56 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 56
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Ре Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30 60 Ре Рго сій Рго ма! Тиг маЇ 5ег Тгр Азп 5ег с1Їу АЇа Гей Тис 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег
50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїеци с1у ТНг сп ТНг 65 70 75 80 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні ТИг оСу5 Рго Рго Су 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гу5 Рго Гуз Азр ТИг Ге Мес ІІе б5ег Аг Тиг о Рго січ ма! ТНиг су 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні А5п Аїа Гу5 ТНг Гуз Рго Агд сі 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сп Азр Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Су5з Гуз ма! 5ег дп 195 200 205 їу5 АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе сі Гуз5х Тиг ІЇе 5ег Гуз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд Агуд Рго сіп Ма! Туг ТНг Гей Рго Рго 5ег Аг4д сім сій 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйго Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеу Туг бег Гуз Гей ТиИг ма! Азр Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп с1у деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105 57 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 60 00о«223» М/А «А00» 57
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 су ма! Ні ТиПг РМБе Рго Аїа ма!ї Гей сій б5ег 5ег с1у Гец Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп Тиг 65 70 75 80 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг о Ні Тс Суб Рго Рго Су 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет ІЇе б5ег Агуд Тиг о Рго січ ма! ТНк су 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160
Зо туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5х ТНг Гуз Рго Агд сі 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп 195 200 205 їТу5 АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе сі Гуз5х Тиг ІЇе 5ег Гуз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Аг4д сім сій 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп с1Їу сіп Рго си деп 5О 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг о Тис о Рго Рго маїЇ Ге Азр 5ег Азр СсІ1у 5ег РНе Геи 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї Азр Гуз 5ег Агу Тгр сіп сіп с1У А5п 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 60 сіп губ бег Ге б5ег Ге бег Рго су Гуз 325 330 «210» 58
«2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 58
АЇїЇа бег ТНг оГу5 с1у Рго бег ма! Ре Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 50 55 60 їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80
Тукг Ше Суз Ап ма! А5Зп НІіб5 Гу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 100 105 110
Зо
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160
Туг ма! Азр сї1у ма! сіи ма!Ї ніх А5п Аїа Гу5 ТИг Гуз Рго Агд си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! гГеци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 5О 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 225 230 235 240
Мес ТИг губ АЗзп сіп ма! бег ге ТиИг о Суз Гей маЇ Гуз о1у РНе туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270 бо
АзпоТуг Гуз ТИг Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг о ма!ї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп с1У А5п 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СУ Гуз 325 330 «2105» 59 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 59
АЇїЇа бег ТИг оГу5 с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег
Ко 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80
ЗБ Туг те Суз5з А5зп ма! А5п НІіб5 їу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 100 105 110 40
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 45 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 туго ма! Азр сїу ма! сіи ма!ї ніх А5п Аїа Гу5 ТИг Гуз Рго Агд си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 60 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго бег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сі бек Азп с1Їу сп Рго си Азп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг о Тис о Рго Рго маїЇ Ге Азр 5ег Азр СсІ1у 5ег РНе Геи 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сЇу Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 15... 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «210» 60 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 60
Зо АЇїа бег ТИг оГу5 с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа Аїа ге сіу Су5з Геу ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма! Ге сіп б5ег б5ег с1у Ге Туг 5ег 50 55 60 їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80
Тукг те Суз Ап Ма! А5Зп НІіб5 Гу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей їеи сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 60 Туг ма! Азр сіу ма! сіи ма!ї Ніб5 Абп АЇїа Гу5 ТИг Гуз Рго Агд сій 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей
180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 10225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйго Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг о маї Аз5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сЇу Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «210» 61 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Людина (Ното 5аріепез) «400» 61
Агу Тпг Ома! Аіїа діа Рго 5ег ма! РнНе ІІе РНе Рго Рго 5ег А5р СсІЇи 1 5 10 15 сіп Ге губ бег сіу ТИг Аїа бег ма! Ма! Суз Гей Геу Азп Азп РПе 20 25 30
Туг Рго Агд си АїЇа Гуз ма! сіп Тегр Гуз ма! Азр Ап АЇа Гей сіп 35 40 45 5зег с1у Азп бег сіп сі б5ег ма! Тиг сім сіп Ар бег Гуз Азр 5ег бо
ТиИг Туг 5ег Геу б5ег бег ТНг Гей ТНг Гей 5ег Гуз АїЇа Азр Туг си 5065 70 75 80
Гуз Ні Гуз ма! Ттуг АЇїа Су5 сіи ма! ТтНг Ні сіп сЇу Ге 5ег 5ег 85 90 95 55 Рко ма! ТиИг Гу5 бек Ре Ап Агд сіу сім сСузв 100 105 «210» 562 «2115» 281 60 «2125 РТ «2135 Людина (Ното 5аріепез) «А00» 62
Мет б5ег АїЇа сіп сі бег Суз Гей б5ег іє ІІе Гуз Туг Ре Ге РЕНе 1 5 10 15
Ма! Ре Азп Гей Ре Ріпе РНе ма! Ге сіу б5ег Ге ІІе Рпе Су5 РНе 20 25 30
СІУу ІІе Тгр ІІе гей ІІе Ад5р Гуз ТИг о бег Ріпе ма! 5ег Ре маї сіу 35 40 45 ей Аїа Рпе ма! Рго Гей сіп ІІе Тгр 5ег уз ма! Гей Аїа Те 5ег 50 55 бо сіу те РНе тТиг мес сІу Іїе АЇїа гей їеи сіу Су5з ма! сІЇу Аїа гей 15... 65 70 75 80
Гуз сЇи Гей Агд Суз Гей їеи сіу Гей Туг Рпе сіу Меє їец їеи їеи 85 90 95
Те Ре АЇа ТиИг сіп ІЇе Тиг Ге сіу ІчІЇе Гей че 5ег Тиг с1п Ага 100 105 110
АЇа сіп Гей сі Агуд б5ег Ге Агуд Азр ма!Ї ма! сіи Гуз ТНг Пе сіп 115 120 125
Гуз Туг су ТНг Азп Рго си сій Тег Аїа Аїа сій сій б5ег Тгр дзр 130 135 140 туг ма!ї соїп РНпе сіп Ге Агд Суб Суз с1у Тер Ні Туг Рго сп др зо 145 150 155 160
Тер Ре сіп ма! Ге ІЇе Ге Агуд со1у Азп сіу 5ег си АЇа Ні5 Ага 165 170 175
Ма! Рго Суб бег Суб Туг Азп Геу б5ег АЇа ТиПг А5зп Ар 5ег ТНг Іе 180 185 190 ей Азр Гуз ма! Іїе Ге Рго сіп Геу 5ег Агд Ге с1у Ні5 Ге Аїа 195 200 205
Агуд 5ег Агдуд Ні 5ег АЇїа А5зр ІІе Су5 АЇа ма! Рго АЇа сіи 5ег НІі5 210 215 220 те туг Агуд сіи сіу Су5 Аїа сіп ОсОЇУу Геи сіп Гуз Тер Ге Ні5 А5Пп (225 230 235 240
Ап їеи ІІе 5ег ІІе ма! сІіу ІІе Су5зх Геу с1у ма!Ї сС1ЇУу Ге Геи си 245 250 255 їеи сіу Ре Мес ТИг оїеи б5ег ІЇе РНпе Ге Су5 Аг АЗп Ге Ар Ні 260 265 270 ма! Туг Азп Агд Ге АЇа Агд Туг Ага 275 280 «210» 6563 «2115» 281 «212» РЕТ «2135 Макака крабоїдний (Масаса Тазсісціасі5) бо «400» 63
Мет б5ег АїЇа сіп сі бег Суз Ге б5ег іє ІІе Гуз Туг Ре Ге РЕНе
1 5 10 15 ма! Ре Азп Ге Ре Ре Ре маЇ Ге сіу б5ег ге ІІе Ре Су РНе 20 25 30 сСІу ІІе Тгр ІІе ге ІЇІе АдА5р Гуз ТИг бег Ріпе ма! 5ег Ре маї сіу 35 40 45 ей Аїа Рпе ма! Рго Гей сіп ІІе Тгр 5ег їу5з ма! Гей Аїа Пе 5ег 50 55 60 сіу ма! Ре тТиг мес су гей АїЇа гей їеи сіу Су5з ма! с1у Аїа гей 65 70 75 80 їГу5 сої Гей Агд Сузх Ге їеу сЇ1у Ге Туг Рпе сіу Меї Геи їгеи г еи 85 90 95 ей Ре АїЇа ТНг сіп ІЇе ТНг іє СсІу ІЇе гей ІІе 5ег ТНг сіп Ага 100 105 110
АЇа сіп Гей сі Агуд б5ег Ге сіп Азр ІЇе ма! сій Гуз Тийг Пе сіп 115 120 125
Гуз туг Ні Тс Азп Рго си си Тг АїТа Аїа сіи сій б5ег Тер А5р 130 135 140 туг ма!ї сп РНе сіп Ге Агд Су5 Суз с1у Тер Ні5 5ег Рго сп дзр 145 150 155 160
Тер Ре сіп ма! Ге Тиг Ге Агуд сіу Азп сІіу 5ег си Аїа Ні Ага 165 170 175 ма! Рго Суз 5ег Суз Туг Азп Ге 5ег АіЇа ТиИг Азп д5р 5ег Тиг ІїЇє 180 185 190 ем Азр Гуз ма! ІЇе гГеи Рго сіп Ге 5ег Агд їеи сІу сіп г еи діа 195 200 205
Агуд 5ег Агуд Ні 5ег ТИг А5р ІІе Суб Аіа ма! Рго діа А5зп 5ег НІ15 210 215 220 че туг Агд сіи сіу Су5 Аїа Агд 5ег їеи сіп Гуз Тер Ге Ні5 А5Пп 225 230 235 240
А5п Ге ІІе б5ег ІІе ма! сіу ІІе Сузх їГеу сіу ма! су Геи Гей си 245 250 255 їец с1іу Ре Меє ТтиИг оїеу б5ег ІЇе Рпе Геи Су5 Агу Азп Гей дА5р Ні 260 265 270 ма! Туг Азп Агд Ге АЇа Агд Туг Ага 275 280 «210» 64 «2115» 390 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 60 00о«223» М/А «400» 64 мес Тегр Тгр Агд Геи Тгр Тгр гей гей їеу їеу їеи їеци їеи гей Тер 1 5 10 15
Рго мМмеє ма! Тгр АЇа Аг АїЇа сіп Гей сі Агдуд 5ег ей Агу др ма! 20 25 30 ма! сі Гуз Тг ІІе сіп Гуз Туг сІу ТНг Азп Рго сі сі Тиг Аїа 35 40 45
АїЇа сім сі б5ег Тгр Азр Туг ма! сіп Рбе сіп Ге Агд Суз Су с1у 50 55 бо
Тер Ні Туг Рго сіп Азр Тер Рбе сіп маїЇ Ге те Гей Агуд с1Уу А5пП 65 70 75 80 с1у б5екг січ Аїа Ні5 Агд ма! Рго Су5 5ег Су5 Туг Азп Гей 5ег АїЇа 85 90 95
ТИг Азп А5Зр бег ТНг ІЇе Гей Азр Гуз ма! ІЇе Гей Рго сіп Геи 5ег 100 105 110
Агуд Ге сТу Ні Ге Аїа Агдуд 5ег Агуд Ні 5ег АЇїа Азр ІЇе Су Аїа 115 120 125 ма! Рго Аїа сі 5ег Ні ІЇе Туг Аг9у9 сім с1у Су5 Аїа сіп с1Уу Гей 130 135 140 сій Гуз Тер Ге Ні А5пП А5п о РгО Гу б5ег Су5 А5Зр Гуз ТИг Ні Тиг 145 150 155 160
Зо
Суз Рго Рго Су Рго АЇа Рго сім АїЇа сі сіу Аіа Рго 5ег ма! РНе 165 170 175
Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТИг о їеи Меїє ІІе 5ег Агуд Тиг Рго 180 185 190 сіи ма! Тиг о Суз ма! ма! ма! Азр ма! 5ег Ні5 си А5р Рго сім ма! 195 200 205
Гуз Рпе Азп Тгр Туг ма! Азр сІіу ма! си ма! Ні5 А5пП АїЇа Гуз Тиг 210 215 220
Гуз Рго Агуд сі сЇи сіп Туг А5Зп о бег ТИг о Туг Агуд ма! ма! 5ег ма! 225 230 235 240 їец тиг маї Гец Ні сіп Азр Тгр Ге Ап Сс1у Гуз сі Ттуг Гуз Су 245 250 255
Гуз ма! 5ег Ап Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІІе сій Гуз Тиг Ше 5ег 5О 260 265 270
Гуз АЇа Гуз сІіу сп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг Гей Рго Рго 275 280 285 бег Ага сої сФіи Меє ТИг Гуз Ап сіп ма! бег Геу Тиг сСуз Геи маї 290 295 300
Гуз сС1у Рпе Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! си Тер сЇи 5ег Ап сі1у 305 310 315 320 бо сіп Рго сої АЗп Ап о Туг Гуз Тг АЇа Рго Рго ма! Гей А5р 5ег дер 325 330 335 сІ1у бег Рпе Ре Гей Туг бег Гуз Гей Тиг ма! А5р Гуз 5ег Ага Тгр 340 345 350 сій сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Су5 5ег ма! Меє Ніх сЇи Аїа Геи Н1і5 355 360 365
А5п Ні Туг Тйг сій Гуз 5ег ге б5ег їеи б5ег Рго СсСІу Гуз Ні Н15 370 375 380
Ні Ні Ні Ні5 Ні Ні 385 390 «210» 65 «2115» 390 «2125» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 65 мес Тегр Тгр Агд Геи Тгр Тгр гей гей їеу їеу їеи їеци їеи гей Тер 1 5 10 15
Рго Меє ма! Тгр АїЇа Аго9 АїЇа сіп Гей сім Агуд 5ег ей сіп дор ІЇе 20 25 30 ма! соЇи Гуз Тийг ІІе сіп Гу5 Туг Ні5 ТИг доп Рго сі сі Те Аїа
Ко 35 40 45
АЇа сі сій б5ег Тгр Азр Туг ма!їЇ сіп Ре сіп Ге Ага Су Суз с1у 50 55 бо
Тер Ні5 бек Рго сіп А5р Тгр Ре сіп ма! Ге Тиг Гей Агд сІ1У АдА5п 65 70 75 80 с1у б5екг січ Аїа Ні5 Агд ма! Рго Су5 5ег Су5 Туг Азп Гей 5ег АїЇа 85 90 95
ТИг Азп А5Зр бег ТНг ІЇе Гей Азр Гуз ма! ІЇе Гей Рго сіп Геи 5ег 100 105 110
Агуд Ге су сіп Ге Аїа Агуд 5ег Агуд Ні 5ег ТИг Азр ІЇе Су Аїа 115 120 125 ма! Рго Аїа доп 5ег Ні5 ІІе Туг Агд сіи сіу Су5 АЇа Агд 5ег Геи 130 135 140
БО сіп Гуз Тер Ге Ні дА5п А5п Рго Гуз бег Су5з дА5р Гуз ТИг Ні Тис 145 150 155 160
Суз Рго Рго Су Рго АЇа Рго сім АїЇа сі сіу Аіа Рго 5ег ма! РНе 165 170 175
Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТИг о їеи Меїє ІІе 5ег Агуд Тиг Рго 180 185 190 сіи ма! Тиг о Суз ма! ма! ма! Азр ма! 5ег Ні5 си А5р Рго сім ма! 60 195 200 205
Гуз Рпе Ап Тгр Туг ма! Азр сіу ма! си ма! Ні А5п Аїа Гуз ТНг 210 215 220
Гуз Рго Агуд сі сЇи сіп Туг А5Зп о бег ТИг о Туг Агуд ма! ма! 5ег ма! 225 230 235 240
Гей тик маї гей Ні сіп Азр Тер Геи Ап сіу Гуз сі Туг Гуз сСузв 245 250 255
Гуз ма! 5ег Ап Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІІе сій Гуз Тиг Те 5ег 260 265 270
Гуз АЇа Гуз сІіу сп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг Гей Рго Рго 275 280 285 5зег Ага січ сі Меє ТНг Гуз Азп сіп ма! бег еп ТНг Суз Геи маї 290 295 300
Гуз сС1у Рпе Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! си Тер сЇи 5ег Ап сі1у 305 310 315 320 сп Рго си Абп доп о Туг Гуз ТВг о Аїа Рго Рго ма! Ге Азр 5ег др 325 330 335 сІ1у бег Рпе Ре Гей Туг бег Гуз Гей Тиг ма! А5р Гуз 5ег Ага Тгр 340 345 350 сій сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Суб5 5ег ма! мес Ні сЇи Аїа гГеи Ні 355 360 365
А5п Ні Туг ТИйг сій Гуз 5ег ге б5ег їеу б5ег Рго СсСІу Гуз Ні Н15
Ко 370 375 380
Ні Ні5 Ні Ні Ні5 Ні 385 390 «210» 66 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 66
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Геу ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма! Ге сіп б5ег б5ег с1у Ге Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 60 Тукг че Суб Азп ма! Азп Ні Гуз Рго 5ег Азп ТИг о Гуз ма! дор Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су
100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Рпе Гей Рпе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Азр Рго сіи ма! Гуз Рпе Азп Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 січ сіп Туг А5зп бек ТиИг о Туг Агуд ма! ма бек ма!ї Геу Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд Агуд Рго сіп Ма! Туг Тиг о Гец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 25... 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг о Тис о Рго Рго маїЇ Ге Азр 5ег Азр СсІ1у 5ег РНе Геи 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105» 567 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4А00» 67
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30 бо
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 туг те Су5 А5зп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Авр Гуз 85 90 95
Агд ма! сЇи Рго Гу5 бек Су5 Азр губ ТИг Ні ТИг о Су Рго Рго сСуз 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рпе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гуз Рпе Азп Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 січ сбіп Туг А5зп бек ТиИг о Туг Агд ма! Ма! бек ма! Геу Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Зо
Гуз АЇа Геи Рго АЇа Рго ІЇе сій Гуз ТИг Пе 5ег уз АїЇа Гуз су 210 215 220 сіп Рго Агуд Гуз Рго сіп ма! Туг Тиг о Гец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 35. 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сп ма! бек гей ТНг Суз Гей ма!Ї Гуз сіу Ріпе Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйг о Тис о Рго Рго ма! Ге А5зр 5ег Азр сіу 5ег РНе Ге 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні си Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «210» 68 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність 60 0«220» «223» М/А «400» 68
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 бег ТИг 5ег сіу сіу ТПг Аїа АЇа Ге сіу Су5 Ге ма! Гу5 Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 15... 65 70 75 80 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агд ма! сЇи Рго Гу5 бек Су5 Азр Гуз ТИг Ні ТИг о Суз Рго Рго сСуз 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр зо 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 сі сбіп Туг Ап о бег ТИг о Туг Агд ма! Ма! бек маЇ Геу Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз су 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій (225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ріе Туг 245 250 255
Ргко 5ег Азр ІІе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг о Тис о Рго Рго ма! Ге Азр 5ег Азр сІу 5ег РНе Ге 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре б5ег Суб 5ег ма! Мес Ні 5ег Аїа Ге Ні5 А5п Ні Туг ТИг 60 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330
«210» 59 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 69
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 бБег Тиг б5ег сіу сіЇу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Су5 Ге Мма!ї Гуз Азр Туг
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 20 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 25. 55 70 75 80 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95 30 Агд ма! сої Рго Гу5 бег Су5 Азр Гуз ТИг о Ні ТИг о Суз Рго Рго сСуз 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125 35
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 40 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 45 січ сбіп Туг Ап бек ТиИг о Туг Агд ма! Ма! бек маЇ Ге тТиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205 50
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд Агуд Рго сіп Ма! Туг Тиг о Гец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 55 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255 60 Рго бег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сЇи бек Азп с1Їу сп Рго си Азп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйго Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе
275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг о маї Аз5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105 70 «2115» 330 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 70
Аіїа бег ТИг о Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15
Бег Тиг бег сіу сЇу Тиг Аїа АЇа ге сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег
Зо с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 35 65 70 75 80 туг те Су5 А5зп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95 40 Агд ма! сЇи Рго Гу5 бег Су5 Азр Гуз ТИг Ні ТИг о Суз Рго Рго сСуз 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125 45
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 50 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 55 сі сіп Туг А5зп бег ТиИг о Туг Агд ма! Ма! бек маЇ Ге Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205 бо
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд Гуз Рго сіп ма! Туг Тиг о Гец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270
Абп о Туг Гуз ТИйг о Тс о Рго Рго ма Гец Ар бег Азр сіу бег РНе РПНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг о ма!ї Аз5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СУ Гуз 325 330 «2105» 7/1 «2115» 330 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005 71
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 бег Тиг бег сіу сЇу Тиг Аїа АЇа ге сіу Суз Гей ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма 5ег Тгр Азп 5ег су АЇа Гей Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5ег ей с1у ТНг сп ТНг 65 70 75 80 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агд ма! сої Рго Гу5 бег Су5 Азр Гуз ТИг Ні ТИг оСуз Рго Рго сСув 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сій ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5Зп Тгр 60 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сіи ма! Ні А5п Аїа Гу5 ТНг Гуз Рго Ага си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сіп Азр Тер Гей Ап с1у Гуз сій Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270
Азп Туг губ ТИг о Тс о Рго Рго ма Геи Ар бег Азр сіу бег РНе РПНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг о маї Аз5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре б5ег Суб 5ег ма! Мес Ні б5ег Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз
Ко 325 330 «2105 72 «2115» 297 «212» РЕТ 00«2135» Людина (Ното 5арієепз) «А00» 72
Мет Тис о ТНИг о Рго Агуд Ап о бег ма! Азп сіу Тиг Рібе Рго АЇа сім Рго 44 1 5 10 15 мес Гуз с1у Рго ІІе АїЇа Меє сіп 5ег сІіу Рго Гуз Рго Ге РіПе Ага 20 25 30
Агд Меїє бег бег о їеи ма! сіу Рго Тпг сіп б5ег Рпе РПе Меї Аг4д сі 35 40 45 бег Гуз ТНг Гей сіу АїТа ма! сіп Іїе мес д5п с1у Гей Рпе Ні Іїе бо 50
АЇїа ге сіу сЇу Гей їеу Мес ІЇІе Рго АЇа СсСІіу ІЇе Туг АїЇа Рго ІїЇє 65 70 75 80
Суз ма! Тиг ма! Тгр Туг Рго Ге Тгр сіу сіу ІчІІе Меє Туг Пе Іе 55 85 90 95 б5ег сіу б5ег їеу ге АїЇа Аїа ТНг сіи Гу5 АЗзп 5ег Агд Гуз Суз Гей 100 105 110 60 ма! Гуз сіу Гуз Меїс ІІе Меє А5зп 5ег Ге 5ег Геу РНе АЇа АїЇа Іе 115 120 125 5зег сіу Меє ІЇе Ге бег ІІе Мет Азр ІЇе гей Ап ІЇе Гуз ІЇе 5ег
130 135 140
Ні Ре Геи Гу Меє сіи б5ег ге А5п Ре ІІе Агд Аїа Ні ТНИг Рго 145 150 155 160
Туг ІІе А5зп ІІе Туг Азп Суб сЇи Рго АЇа Азп Рго 5ег СсЇи Гуз Азп 165 170 175 5зег Рго 5ег ТИг сіп Туг Суз Туг б5ег ІїЇе сіІп 5ег їГеи РНе Геи СсС1У 180 185 190
ІІе ге бек ма! Мекє гей ІчІІе Рпе АЇїа РНе Рпе сіп сіи Ге ма!ї Іе 195 200 205
АїЇа сЇу ІїІе ма!Ї сій Азп сі Тгр губ Агуд Тиг Суб 5ег Агд Рго Гуз 210 215 220 5ег Азп ІЇе маїЇ Ге Геу 5ег АїЇа сіи сі Гуз Гуз сЇи сп Тиг ІїЇе 225 230 235 240 сій ІІе Гуз сій сіи ма! ма! сіу Гей ТиПг сі ТНг о б5ег б5ег сіп Рго 245 250 255
Гуз Азп сЇи сій Азр ІЇе сій ІїІе Іїе Рго Пе сіп сій сіи сіми сій 260 265 270 сій сій Тс осі Тс о Абзп Рпе Рго сій Рго Рго сіп Азр сіп сі 5ег 275 280 285 бег Рго ІІе сі А5зп А5зр бег 5ег Рго 290 295 «2105 73 «2115» 297 «2125» РЕТ «2135 Макака крабоїдний (Масаса Тазсісціасі5) «А00» 7З
Мес Типг о ТИг о Рго Агуд Азп о бег ма! Азп сіу Тиг РНе Рго АїЇа сіЇи Рго 1 5 10 15 мес Гуз с1у Рго ІЇе АїЇа Меє сіп Рго сІу Рго Гуз Рго їец Геч Ага 20 25 30
Агу Меїє б5ег б5ег ге ма! сіу Рго Тиг сіп б5ег РНе РНе Мес Агд сіи 35 40 45 бег ТїТу5 АЇїЇа Гей сіу Аїа ма! сіп Іїе Ммеє д5п с1у Гей Рпе Ні Іїе 5О 50 55 бо
АЇїа ге сіу сЇу Гей їеу Мес ІЇІе Рго АЇа СсСІіу ІЇе Туг АїЇа Рго ІїЇє 65 70 75 80
Суз ма! Тиг ма! Тгр туг Рго Геу Тгр сіу сіу ІІе Меє Туг Іїе Пе 85 90 95 б5ег сіу б5ег їеу ге АїЇа Аїа ТНг сіи Гу5 А5зп 5ег Агд Гуз Суз Гей 100 105 110 бо ма! Гуз сіу Гуз Меї ІІе Мес Азп 5ег їеу 5ег Геу РНе АїЇа АїЇа ІїЇє 115 120 125
5зег сіу Меє ІЇе Ге бег ІІе Мет Азр ІЇе гей Ап ІЇе Гуз ІЇе 5ег 130 135 140
Ні Ре Геи Гу Меє сіи б5ег їеи А5зп Ре ІІе Агд ма! Ні ТНК Рго 145 150 155 160
Туг ІІе А5зп ІЇІе Туг Азп Суб сЇи Рго АЇа Азп Рго 5ег сЇи Гуз Авп 165 170 175 бег Рго бег Тиг сіп Туг Суз Туг 5ег ІчІІе сіп 5ег їеу Рпе Гей с1у 180 185 190
ІІе ге бек ма! Мекє гей ІчІЇе Рпе АЇїа РНе РпПе сіп сіи Ге ма!ї Пе 195 200 205
АЇа сіу ІІе ма!їЇ сій д5п січ Тер Агд Агуд Тиг Су 5ег Аг4д Рго Гуз 210 215 220 5ег бег маїЇ маїЇ Ге їГеу б5ег АїЇа Ссіи сій Гуз Гуз сЇи сіп ма! Пе 20225 230 235 240 сій ІІе Гуз сій сіи ма! ма! сіу Гей ТиПг сі ТНг о б5ег б5ег сіп Рго 245 250 255 25 Туз Азп сЇи сім Азр ІЇе сЇи ІЇе ІїЇе Рго Іе сіп сім сім сЇи си 260 265 270 сій сій Тс осі Тс о Абзп Рпе Рго сій Рго Рго сіп Азр сіп сі 5ег 275 280 285
Зо 5ег Рго ІІе сі Азп д5р 5ег 5ег Рго 290 295 «2105 74 35 «2115» 122 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» 40 «223» М/А «4005 74 сіи ма! сіп Гей ма! сій б5ег сіу сіу сіу Гей ма!ї сіп Рго дзр Ага 45 1 5 10 15 бег бе Агуд Гей б5ег Су5з Аїа АіЇа бек сіу Рібе ТНПг РНе Ні Ар Туг 50 АЇа Меє Ні5 Тгр ма! Аг9у сіп Аїа Рго с1Їу Гуз с1у гГеи си Тер ма! 5зег ТиИг о ІчІІе бег Тер Азп 5ег сіу ТНг ІїІе сіу Туг АїЇа А5р 5ег маї бо 55
Гуз С1у Агу Рпе ТНИг ІЇе 5ег Агуд Азр Ап АЇа Гуз Азп 5ег ге Туг 65 70 75 80 їеи сіп Мес Ап 5ег їеи Агуд АЇа сій Ар ТИг АЇа Геци Туг Туг сСузв 60 85 90 95
АЇїа Гуз Азр ІчІІе сіп Туг сіу Азп Туг Туг Туг сіу Меє Азр ма! Тер 100 105 110 сіу сіп с1у Тс Тис ома! Тис ма! 5ег 5ег 115 120 «2105 (75 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 75 с1у Ре Тис Ріпе Ні д5р Туг Аїа 1 5 «2105 76 «2115 8 «2125» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 76
ІІе бег Тер Азп 5ег сіу Тиг Іе 1 5
Зо «2105 77 «2115 15 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 77
АЇїа Гуз Азр ІчІІе сіп Туг сіу Азп Туг Туг Туг сіу Меє Азр маї 1 5 10 15 «2105» 78 «211» 107 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 78 сі чІІе ма! Гей ТНг о сіп 5ег Рго АЇа ТНг Гей 5ег їеци 5ег Рго с1у 1 5 10 15 сі Аг Аїа ТигогГеи бег Суз Агуд Аіа бег сіп 5ег ма! 5ег 5ег Туг 20 25 30 60 Гей Аїа Тгр Ттуг сіп сп Гуз Рго соЇу сіп АЇа Рго Агд Ге Геи Пе 35 40 45
Туг Азр АЇа бег А5зп Агуд АЇїа ТНг сСіу ІїЇе Рго АЇїа Аг9уд Рпе 5ег Сс1УуУ
50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу ТИг Азр Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5ег ей си Рго 65 70 75 80 сій Азр Рпе АїЇа ма! Туг Туг Суз сіп сіп Агуд 5ег Азп Тгр Рго ІїЇе 85 90 95
ТиИг РНе СсСіу сіп сіу ТНг Агд Гей сіи ІїЇе Гуз 100 105 «2105 79 «2115 б «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 79 сіп б5ег ма! 5ег 5ег Туг 1 5 «210» 80 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 80 сіп сбіп Агдуд бег Азп Тгр Рго ІІе ТНг 1 5 «210» 81 «2115 125 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 81 си ма! сіп Ге ма! сіп 5ег с1Їу сіу с1у Ге маї ніх Рго сІу с1У 1 5 10 15 б5ег бе Агуд Гей бег Суз ТИг сіу бек с1у Ре Тиг РНе 5ег Туг НІ15 20 25 30
АТїа меє ні Тер ма! Агд сіп Аїа Рго СсСІу їу5 ОЇу Ге сім Тер ма! 35 40 45 5зег ІІе чІІе сіу Тиг сіу сіу ма! Тиг Туг Туг АЇїЇа А5р 5ег маї Гуз 50 55 бо 60 с1у Агуд Рпе Тийг ІЇе бег Агуд Азр Азп ма!Ї Гу5 Азп бег Ге Туг Геиц 65 70 75 80 сіп Меє А5зп б5ег гей Агуд Аїа сій Азр Меї Аіїа ма! Туг Туг Суз АїЇа
85 90 95
Агу Азр Туг Туг сіу АЇа сіу бег РНе Туг Азр сіу Ге Туг сіу Мес 100 105 110
Азр ма! Тгр сіу сіп сіу ТНг о Тигома!ї Тиг о маї 5ег 5ег 115 120 125 «2105» 82 «2115». 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2235» М/А «4005» 82 сС1Уу Рпе ТНг РПе 5ег Туг НІі5 Аїа го 1 5 «210» 83 «2115 7 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 83
ІчІІе сіу тТиг сіу сіу ма! тиг 1 5 «210» 84 «211» 19 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 84
АЇа Ага Азр Туг Туг с1у АЇїа сіу бек РПпе Туг Азр сі1у Ге Туг су 1 5 10 15 мет Ар маї «210» 85 «2115» 66 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 85 6о0 сіп б5ег ма! 5ег 5ег Туг 1 5
«210» 86 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 86 сіп сп Агдуд 5ег А5р Тер Рго Геч ТЕГ 1 5 «210» 87 «2115» 122 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 87 сіи ма! сіп Гей ма! сіи 5ег сІіу сіу сіу Ге ма! сіп Рго сІУ Ага 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге б5ег Су5з АЇїа АїЇа бек сіу Рпе ТНг РНе Азп А5р Туг 20 25 30
АЇїЇа Ммеє Ні5 Тгр ма! Аг9у сіп Аїа Рго с1Їу Гуз с1у гГеи си Тер ма! 5зег ТиИг ІчІІе бег Тгр Азп 5ег сіу 5ег ІІе сіу Туг АїЇа А5р 5ег маї бо 35
Гуз С1у Агу Рпе ТНИг ІЇе 5ег Агуд Азр А5п АЇа Гуз Гуз 5ег ге Туг 65 70 75 80 їеи сіп Мес Азп 5ег ей Агуд АЇа сій Азр ТИг АЇа Гей Туг Туг Су 40 85 90 95
АЇїа Гуз Азр ІчІІе сіп Туг сіу Азп Туг Туг Туг сіу Меє Азр ма! Тер 100 105 110 45 сіу сбіп с1Їу Тиг Тис ома!ї Тиг ма! бек 5ег 115 120 «210» 88 «2115 8 50 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А 55 «400» 88 сС1Уу Ре ТНИг РПе Ап Азр Туг АїЇа 1 5 бо «210» 89 «2115 8 «212» РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» М/А «400» 89
ІІе бег Тер Азп 5ег сіу 5ег ІїЇе 1 5 «210» 90 «2115 15 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 90
АЇїа Гуз Азр ІчІІе сіп Туг сіу Азп Туг Туг Туг сіу Меє Азр маї 1 5 10 15 «210» 91 «211» 107 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4А00» 91 сі чІІе ма! Гей ТНг о сіп 5ег Рго АЇа ТНг Гей 5ег їеци 5ег Рго с1у 1 5 10 15 сі Агуд Аїа ТигогГеи бег Суз Агуд Аіа бег сіп 5ег ма! 5ег 5ег Туг 20 25 30
Тем АЇа Тгр Туг сіп сіп Гуз Рго сіу сіп АЇа Рго Агд Гей Гей ІїЇе 35 40 45
Туг Азр АЇа бег А5зп Агуд АЇїа ТНг сСіу ІїІе Рго АЇїа Аг9уд Рпе 5ег Сс1УуУ 50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу ТИг Азр Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5ег ей си Рго 65 70 75 80 сій Азр Рпе АїЇа ма! Туг Туг Суз сіп сіп Агуд 5ег Азп Тгр Рго ІїЇе 5О 85 90 95
ТиИг РНе СсСіу сіп сіу ТНг Агд Гей сіи ІїЇе Гуз 100 105 «210» 92 «2115 б «212» РЕТ «213» Штучна послідовність 60 0«220» «223» М/А «А00» 92 сіп б5ег ма! 5ег 5ег Туг 1 5 «210» 93 «2115 9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 93 сп соіп Агдуд б5ег Азп Тер Рго ІЇе ТНг 1 5 «210» 94 «2115 121 «2125» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 94 сп ма!ї сіп Гей сіп сіп Рго сІЇу АїЇа сій гей ма! Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15
Зо 5зег ма! Гуз Мес б5ег Суб Гуз АЇа бек сіу Туг ТНг РНе ТНг 5ег туг 20 25 30
А5п Меє Ні Тер ма! Гуз сіп ТНг Рго сІу Аг с1у Ге сЇи Тер Іе 35 40 45
СІУ Аїа ІІе Туг Рго сЇу А5зп сіу Азр ТИг 5ег Туг Азп сіп Гуз Ре 50 55 бо їу5 сЇу Гуз АЇа ТНг Ге ТиПг АЇа Азр Гу5 бег бег 5ег Тиг Аїа туг 65 70 75 80
Меєс сіп Ге бег бег о їеи ТНг об5ег сій Ар 5ег АіЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95 діа Агд бек Тиг Туг Туг сіу сіу Азр Тгр Туг РНе Азп маї Тгр с1у 100 105 110
Аа сіу ТиПг Тийг ма! Тиг маї 5ег Аїа 5О 115 120 «210» 95 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А 60 «4005» 95 сіу Туг ТНг РНе ТНг 5ег Туг Авп 1 5
«210» 96 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 96
ІчІІе Ттуг Рго с1у Азп с1у Азр ТНг 1 5 «2105» 97 «2115 14 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 97
АЇа Агд бег ТиИг Туг туг сіу сіу Азр Тгр Туг Ре Азп маї 1 5 10 «210» 98 «2115» 106 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 98 сіп чІІе ма! Гей 5ег сіп 5ег Рго АЇа ІЇе Геи 5ег АЇа 5ег Рго с1у 1 5 10 15 сі Гуз ма! Тиг о Мес Тиг Суз Агуд Аіа бег 5ег 5ег ма! 5ег Туг Пе 20 25 30
Ні Тер Ре сіп сіп губ Рго с1у б5ег 5ег Рго Гуз Рго Тгр Пе туг 35 40 45
АІЇа ТиИг 5ег А5п Гей АіЇа б5ег сіу ма! Рго ма! Агуд Ре б5ег СсІу 5ег бо 50 сіу бег с1у ТиИг бек Туг 5ег Гей ТНг ІІе 5ег Агд ма! сім Аїа си 65 70 75 80
А5зр АЇа Аіа Тийг Туг Туг Суз сіп сіп Тер Тиг обег Азп Рго Рго ТНг 85 90 95 55
Рпе СІу сіу СІ1у ТНг Гуз Гей си Пе Гуз 100 105 «210» 99 60 «211». 5 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» М/А «400» 99 5зег бег ма! 5ег туг 1 5 «210» 100 «2115. ..9 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2235» М/А «4А00» 100 сіп сіп Тер Тис об5ег Азп Рго Рго ТЕГ го 1 5 «2105» 101 «2115 119 «212» РЕТ 25 «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А 30 «4005» 101 сіІп ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сІу АїЇа сі ма! Гуз Гуз Рго сІу 5ег 1 5 10 15 35 бег ма! Гуз ма! бек Су Гуз АЇа б5ег сіу Туг Аїа РПе 5ег Туг 5ег
Тер ІїЇе А5зп Тгр маї Аг9д сіп АїЇа Рго сіу сіп сіу Гей сі Тгр Меє 40
СІУ Аг ІІе РПе Рго сІЇу Азр сЇу Азр ТИг Азр Туг Азп сіу Гуз РНе бо
Гуз с1у Агд ма! ТНг ІЇе Тис АїЇа Азр Гуз 5ег ТиИг о 5ег ТНг Аїа Туг 45 65 70 75 80 мес сіи Ге бег б5ег гей Агуд б5ег сій Азр ТИг АЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95 50 АЇа Агд Азп Ма! Рпе Азр сіу Туг Тгр Геи ма! Туг Тер су сіп су 100 105 110
Тиг Ге ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 55 «2105» 102 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність бо «220» «223» М/А
«4005» 102 сіу Ттуг АїЇа Рпе 5ег Туг 5ег Тгр 1 5 «210» 103 «2115 8 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4А00» 103
ІІе РНе Рго сІіу Азр с1у Азр ТНг 1 5 «2105» 104 «211» 12 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 104 діа Агд Азп ма! Ре Азр сіу Туг Тер Геи ма! туг зо 1 5 10 «210» 105 «2115 112 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 105
Азр ІчІІе ма! Меє Тис о сіп Тиг о Рго Ге б5ег о геу Рго ма! ТНг Рго сІу 1 5 10 15 сі Рго Аїа 5ег Ііе 5ег Су5 Агуд 5ег б5ег уз б5ег їеци Ге Ні 5ег 20 25 30
А5п сЇу чІІе Тиг Туг Гец Туг Тгр Туг Ге сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег 35 40 45
Рго сЇп Гей Гей ІІе Туг сіп Меї 5ег А5п Гей ма! 5ег сіу ма! Рго 50 55 бо
Азр Агуд Ре 5ег сіу 5ег сіу б5ег сіу ТИг Азр Ре ТНг Геи Гуз ІїЇє 65 70 75 80 5зег Агд ма! сі АЇїа сі Азр ма! сіу ма! Туг Туг Суз АїЇа сіп Азп 85 90 95 60 їеи сі Гей Рго Туг ТиИг РНе сіу сіу сіу ТиИг Гуз ма! сі Пе Гуз 100 105 110 «210» 106
«2115 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4А00» 106 їГу5 б5егїеи їеу Ні 5ег А5п сіу че Тиг туг 1 5 10 «2105» 107 «2115 9 «2125» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 107
АЇа сіп Азп Ге сій Ге Рго Туг ТНг 1 5 «210» 108 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» М/А «4А00» 108
Аіїа бег ТИг Гуз сіу Рго 5ег ма! РНе Рго Ге АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго Ма! ТНг Ма бек Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 сІіу ма! Ні ТиПг РПе Рго АЇа ма! Гей сіп 5ег б5ег су Геу Туг 5ег бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 50 туг те Су5 Азп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 55 100 105 110
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго Азр Ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125 60 губ Рго Гуз Азр ТПг Ге Меє ІІе бег Агуд ТИг о Рго си ма! ТНг су 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гуз Рпе Азп Тгр
145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гу Рго Ага си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма! 5ег маїЇ Гей ТНг маї І єц 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго сій сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз су 210 215 220 сп Рго Агуд сі Рго сіп Ма! Туг Тиг Ге Рго Рго 5ег Аг с1Їи си 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Гей ма!Ї Гуз сіу Ріе Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг о Тис о Рго Рго ма! Ге Ар 5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агдуд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 зо ма! Ре бек Суз 5ег ма! Мес Ні сіи Аїа Ге Ні д5п Ні5 Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег іє 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «210» 109 «2115 107 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4А00» 109 сі чІІе ма! Гей ТНг о сіп 5ег Рго АЇа ТНг Гей 5ег їеци 5ег Рго с1у 1 5 10 15 сі Агуд Аїа ТигогГеи бег Суз Агуд Аіа бег сіп 5ег ма! 5ег 5ег Туг 5О 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Аїа Рго Агуд Гей їеи ІїЇе 35 40 45 55 Туг Азр АЇа 5ег Азп Агу Аіа ТиПг сІЇу чІІе Рго АЇа Агуд Рпе 5ег с1у бо 5зег сіу б5ег сіу ТИг Азр Ре ТНг Ге ТНг Іїе 5ег 5ег ей си Рго 65 70 75 80 бо сій Азр Рпе АїЇа ма! Туг Туг Суз сіп сіп Агуд 5ег Азр Тгр Рго Гей 85 90 95
ТиИг РНе сіу сіу сіу ТНг Гуз ма! сіЇи ІїЇе Гуз 100 105 «2105» 110 «211» 118 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2235 М/А «400» 110 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу с1у Агу Гей ма! Тис Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг оСуз ТИг Ома! бек сіу Ре 5ег Ге бек Тиг Туг дзхр 20 Мес 5ег Тгр ма! Агу сіп АїЇа Рго сіу Гуз сЇу Гей сЇи Тгр Пе су
ІІе ІІе Туг 5ег 5ег ма! СсСІіу Аїа Туг Туг АЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз С1У бо 25
Агу Рпе ТиПг РіПе 5ег уз ТИПг обег Тиг о Тиг о маї Азр Ге Гуз ІІе ТЕГ 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг сі Азр Тиг АїЇа Тиг оТуг Рпе Суз АїЇа Агд сіи тТуг
Ко 85 90 95 сІ1у АїЇа б5ег б5ег 5ег Азр Туг ІІе Рпе 5ег ей Тгр су сіп су ТНг 100 105 110 35 їеу ма! Тиг маї 5ек 5ег 115 «2105 111 «2115 107 40 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А 45 «4005» 111 сі чІІе ма! Гей ТНг о сіп 5ег Рго АЇа ТНг Гей 5ег їеци 5ег Рго с1у 1 5 10 15 50 сі Аг Аїа ТигогГеи бег Суз Агуд Аіа бег сіп 5ег ма! 5ег 5ег Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Аїа Рго Агуд Гей їеи ІїЇе 55 35 40 45
Туг Азр АЇа бег А5зп Агуд АЇїа ТНг сСіу ІїЇе Рго АЇїа Аг9уд Рпе 5ег Сс1УуУ 50 55 бо 60 бег сіу бек с1іу ТиПг Азр РНе ТПг Ге ТНг ІЇе 5ег б5ег їеу си Рго 65 70 75 80 сій Азр Рпе АЇа ма! Туг Туг Суз сіп сіп Агуд 5ег Азр Тгр Рго Гей
85 90 95
ТиИг РНе сіу сіу сіу ТНг Гуз ма! сЇи ІїЇе Гуз 100 105 «2105» 112 «2115 116 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 112 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи Тиг о Суз ТИг Ома! бек сіу РПе 5ег їеци 5ег 5ег Ап діа 20 25 30 мет Азп Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Тгр Пе су 35 40 45
Те ІчІІе туг Аїа б5ег сіу Азп Тиг Азр Туг АЇа 5ег Тгр АЇа Гуз с1у 50 55 бо
Агу Рпе ТиПг о ІІе 5ег Гуз ТИг обег Тиг о Тиг маїЇ Азр Ге Гуз ІІе ТЕГ 65 70 75 80
Зо 5зег Рго ТиИг ТИг сі Азр Тиг Аїа Тиг о Туг Рне Суз АїЇа Аго сіи с1у 85 90 95 5ег ма! Тер сіу АЇа Аїа Ре А5р Рго Тгр сІу Рго с1іу ТНг Геи маї 100 105 110
Тиг ма! 5егк 5ег 115 «2105» 113 «2115 110 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 113
АЇїа Туг Азр Мес ТиПг о сіп Тйг о Рго Аїа 5ег ма! сЇи ма!Ї Аїа ма! сІу 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Гуз Су5 сіп АЇїа б5ег сіп 5ег ІІе 5ег АдА5п Тгр 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго с1Їу сіп Рго Рго Гуз сіп Геи Пе 35 40 45
Туг Аїа АЇїа бег ТНг Ге Аїа бег сіу ма! Рго 5ег Аг4д РНе Гуз С1У 60 50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу Тиг сіп Ре ТНг Ге ТНг ІЇе б5ег сІу ма! сіи 5ег 65 70 75 80
Аа Азр діа Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп сіп сіу Туг 5ег Азп 5ег Азп 85 90 95
І ІІе д5р А5п ТИг Рібе сЇу сіу сіу Тиг сіи ма! ма! маї Гу 100 105 110 «2105» 114 «2115 116 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 114 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тк Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг о Суз ТИг Ома! бек сіу РПе 5ег їеци 5ег Туг Азп діа 20 25 30 мет Азп Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Тгр Пе су 35 40 45
ІчІІе ІІе Ре АїЇа 5ег сіу Агуд ТНг Азр Туг АїЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз С1У 50 55 бо
Ага Рбе ТиИг ІЇе бек Гуз ТиПгобег Тиг Тиг ма! сіи Ге Гуз І1е Тиг 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг сі Азр Тиг Аїа Тиг о Туг Рне Суз АїЇа Аго сіЇи с1у 85 90 95 5ег ТиИг Тер с1у Азр Аїа Ге Азр Рго Тгр сІу Рго с1іу ТНг Геи маї 100 105 110
Тиг ма! 5ек 5ег 115 «210» 115 «2115 110 «212» РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 115
АІїа Туг Азр Меє ТиПг о сіп Тиг о Рго 5ег 5ег маї сіп АїЇа АїЇа маї сіу 1 5 10 15 сІіу Тиг ма! ТиИг ІІе Гуз Су5 сп Аїа 5ег сіп Азп ІІе ІІе Азр Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго с1іу сіп Рго Рго сіп Гей їеи Пе 35 40 45 бо
Ні Гуз Аїа б5ег ТИг Гей Аїа б5ег сіу ма! Рго 5ег Ага РПе Гуз Сс1У 50 55 бо
5зег сіу б5ег сіу Тиг сіп Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе б5ег сіу ма!Ї сіп 5ег 65 70 75 80
А5р Ар діа Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп сіп сіу Туг 5ег Азп 5ег Азп 85 90 95
ІІе А5р Азп ТИг о РНе сіу сіу сіу ТиИг сі ма! маї ма! Гуз 100 105 110 «210» 116 «2115 117 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 116 сіп 5ег ма! сі сій бег сіу сіу Агуд Ге ма! Тис Рго с1Їу ТНк Рго 1 5 10 15 їеи ТНгоГеи ТНг оСуз ТИг Ома! бек сіу Ре 5ег їеи б5ег А5зп Туг деп 20 25 30 мес сІу Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Ттр Пе сі1у ма! те А5р діа 5егкг сіу Тиг тТиг Туг Туг АЇа ТНг Тер Аїа Гуз с1у
Ко 50 55 бо
Агу Рпе ТиИг Су б5ег їу5 ТИг обег б5ег ТиИг ма! сіи Ге Гуз Меє ТЕГ 65 70 75 80 35 бег Ге ТиИг о Тиг сій Азр Тг АЇїа Тис о Туг Рбе Сузх АїЇа Аг си Геи 85 90 95 їеи Туг Рпе сІу 5ег 5ег Туг Туг Азр Гєи Тгр сЇу сіп су ТНг г ец 100 105 110 40 ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 «2105» 117 45 «211» 110 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 117
Азр ма! ма! Меє Тис о сіп Тиг о Рго діа 5ег ма! 5ег січ Рго маїЇ сіІу 5Б 1 5 10 15 сіу тТиг ма! ТНг ІЇе Гуз Су5 сп АЇїа б5ег сіп А5п ІІе д5р 5ег деп 20 25 30 60 їеи Аїа Тгр Туг сіп сЇп Гуз Рго с1Їу сп Рго Рго Гуз Ре Геи Пе 35 40 45
Туг туг АЇїа бег Азп Ге Рго РНе сіу ма! 5ег 5ег Агд РНе Гуз С1У бо 5зег сіу б5ег сіу Тиг сіп Ре ТНг Ге ТНг ІЇе 5ег Азр Ге сіЇи 5ег 65 70 75 80 і АІїа Азр діа Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп Су5 АЇа Азр ма! сіу б5ег ТНг 85 90 95
Туг ма! Аїа Аїа РнНе сіу сіу сіу Тиг сіи ма! маї ма! Гуз

Claims (3)

100 105 110 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло, яке зв'язується з СЮОЗ37 людини, яке містить: (а) варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ, послідовності яких наведені в 5ЕО ІЮО МО: 23, ЗЕБЕО ІО МО: 24 і 5ЕО ІО МО: 25, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить СОМК1І, СОК2 і СОКЗ, послідовності яких наведені в 5ЕО ІЮ МО: 27, послідовність: ХА5, ЗЕО ІЮО МО: 31, відповідно, або (Б) варіабельну область важкого ланцюга (МН), яка містить СОМК1, СОК2 і СОКЗ, послідовності яких наведені в 5ЕО ІЮО МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 17 і 5ЕО ІО МО: 18, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), яка містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮО МО: 20, послідовність: КА5, 5ЕО ІЮ МО: 21, відповідно.
2. Антитіло за п. 1, яке містить: область УН, яка містить СОБІ, СОК2 та СОРЕЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 23, 5ЕО ІЮО МО: 24 і 5ЕО ІЮО МО: 25, відповідно, і область МІ, яка містить СОК1І, СОБ2 та СОКЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 27, послідовність: АБ, і ЗЕО ІЮО МО: 31, відповідно.
3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить: область МН, СОК1, СОБ2 та СОКЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 17 і ЗЕО ІЮО МО: 18, відповідно, і область МІ,, яка містить СОР1, СОБ2 та СОРЗ, послідовності яких Зо наведені в 5ЕО ІЮО МО: 20, послідовність: КАБ, і ЗЕО ІЮ МО: 21, відповідно.
4. Антитіло за п. 2, яке відрізняється тим, що містить: область УН, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО: 22, і область МІ, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 29.
5. Антитіло за п. 3, яке відрізняється тим, що містить: область УН, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 15, і область МІ, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 19.
6. Антитіло за п. 2, яке відрізняється тим, що містить константну область важкого ланцюга Ідс1 людини.
7. Антитіло за п. 3, яке містить константну область важкого ланцюга Ідс1 людини.
8. Антитіло за п. 6, яке відрізняється тим, що константна область важкого ланцюга ІдДс1 людини містить заміну глутамінової кислоти в положенні 430 на гліцин, і де амінокислотний залишок пронумерований згідно з системою нумерації ЕО.
9. Антитіло за п. 7, де константна ділянка важкого ланцюга ІДСО1 людини містить заміну глутамінової кислоти в положенні 430 на гліцин, і де амінокислотний залишок пронумерований згідно з системою нумерації Е0О.
10. Антитіло за п. 2, яке містить константну область легкого ланцюга каппа.
11. Антитіло за п. 3, яке містить константну область легкого ланцюга каппа.
12. Біспецифічне антитіло, яке містить перший антигензв'язуючий фрагмент і другий антигензв'язуючий фрагмент, де перший антигензв'язуючий фрагмент містить першу антигензв'язуючу область й другий антигензв'язуючий фрагмент містить другу антигензв'язувальну область, де обидві перша антигензв'язуюча область і друга антигензв'язуюча область, зв'язуються з СЮО37 людини, і де (а) зазначена перша антигензв'язувальна область містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить СОКІ, СОК2 ї СОКЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 23, ЗЕО ІЮО МО: 24 і 5ЕО ІЮ МО: 25, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить СОК1І, СОК2 і СОКЗ, послідовності яких наведені в 5ЕО ІЮО МО: 27, послідовність: АБ, ЗЕО ІЮО МО: 31, відповідно, і (р) зазначена друга антигензв'язувальна область містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить СОКІ, СОК2 та СОМЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 17 ї 5ЕО ІЮО МО: 18, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить СОК1, СОК2 і СОКЗ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮО МО: 20, послідовність: КАБ, і БЕО ІЮ МО: 21, відповідно.
13. Біспецифічне антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що (а) зазначена перша антигензв'язувальна область містить область МН, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22, і область Мі, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІО МО: 29, і (р) зазначена друга антигензв'язувальна область містить область МН, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 15, і область МІ, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 19.
14. Біспецифічне антитіло за п. 13, яке відрізняється тим, що перший антигензв'язуючий фрагмент містить першу константну область важкого ланцюга Ідс!1 людини і другий антигензв'язуючий фрагмент містить другу константну область важкого ланцюга Ідс1 людини.
15. Біспецифічне антитіло за п. 14, де обидві перші та другі константні області важкого ланцюга ІДО1 людини містять заміну глутамінової кислоти в положенні 430 на гліцин, і де амінокислотний Зо залишок пронумерований згідно з системою нумерації ЕО.
16. Біспецифічне антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що перша константна область важкого ланцюга Ідс1 людини містить заміну фенілаланіну в положенні 405 на лейцин, і де друга константна область важкого ланцюга ІдДО1 людини містить заміну в положенні 409 на аргінін, де амінокислоти нумеруються згідно з системою нумерації ЕО.
17. Біспецифічне антитіло за п. 14, де перша константна область важкого ланцюга ЇД01 людини містить заміну лізину в положенні 409 на аргінін, де амінокислота нумерується згідно з системою нумерації ЕО.
18. Біспецифічне антитіло за п. 14, де друга константна область важкого ланцюга ІдДс1 людини містить заміну фенілаланіну в положенні 405 на лейцин, де амінокислота нумерується згідно з системою нумерації ЕО.
19. Біспецифічне антитіло за п. 13, де обидва, перший антигензв'язуючий фрагмент і другий антигензв'язуючий фрагмент, містять константну область легкого ланцюга каппа.
20. Біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий фрагмент, що містить перший важкий ланцюг і перший легкий ланцюг, і другий антигензв'язуючий фрагмент, що містить другий важкий ланцюг і другий легкий ланцюг, де обидва, перший антигензв'язуючий фрагмент і другий антигензв'язуючий фрагмент, зв'язуються з СОЗ37 людини, і де (а) зазначений перший важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22, і зазначений перший легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 29, і (Б) зазначений другий важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 15, і зазначений другий легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 19, та де обидва, перші важкі ланцюги та другі важкі ланцюги, містять константну область важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності, представлені в ЗЕО ІЮ МО: 59 і 5ЕО ІЮ МО: 60, відповідно, і де обидва, перші легкі ланцюги та другі легкі ланцюги, містять константну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 61.
21. Біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий фрагмент, що містить перший важкий ланцюг і перший легкий ланцюг, і другий антигензв'язуючий фрагмент, що містить другий важкий ланцюг і другий легкий ланцюг, де обидва, перший антигензв'язуючий фрагмент і другий антигензв'язуючий фрагмент, зв'язуються з СОЗ37 людини, і де (а) зазначений перший важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22, і зазначений перший легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 29, і (Б) зазначений другий важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 15, і зазначений другий легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну Зо послідовність, представлену в ХЕО ІЮ МО: 19, і де обидва, перші важкі ланцюги та другі важкі ланцюги, містять константну область важкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в ЗЕО ІЮ МО: 60 і 5ЕО ІЮ МО: 59, відповідно, і де обидва, перші легкі ланцюги та другі легкі ланцюги, містять константну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 61.
106 З з ков а оуьеу я я -- Що 1028 1-КОООА «Кк зв же юб ові МеВ ша -9 Що ЩО -В'МЕМОВ се.
ОО. / А» зу ща : . о пої ж вл 7 ча Концентрація антитіл (МКОМА)
Фіг. 1А 1004 око здввовА . Ж щі нев я тин ее ДСА ОВО ЛАЗ ся | Й ЗЕ Б Кі Ей ; й а ки дм екююссссккя Зо сосКоККо Кекс дофрннннккккхн Кк Хумююмнхю ху
28. ж Е | ой БОМ и вл 1 10 Концентрація антитн (мкм
Фіг. 18
- 500004 с . ще | ! в 400004 ШЕ 200004 ШЕ «ФУ | с . Фо . й «а о" о о с о Я Ку
Фіг. 2 вхо Ж м ОБОВ о А «а ідол-венв че юв вх ов. Лв -в- двіоБНиЯ ш МАК шен ак о 006-НИо-КАО9в-БЯ ЗО ш й Не й і, Фі о «й МАО ТОНУ ж : Ж //Й -йк юдвічнНо-не ово дхівв. /Д жк ве енВіо и як юне ни во В бно сотні шт саереекеввню нн й НО оо ох ва 4 чо Концентрація антитіл мкг мя!
Фіг. З а МО ДОВ МЕД св. . зв щу хв ММ не ДСН щш Я «ве ШО 37.30 й ах. вії ефе івси-вії жк. щ зе о пня ан пе жен В з ща Те ще «ах нннникини ще ско Меч ук й т де ав Б й 1 їй Концентрація антитіл (мклмЯ
Фіг. 4 Бий», к ей ах? я у ЯКО п їодуй т ж гу та ш і Же З есе до Д Е сно зЕЯЗоЄ Ж жів? ї ШО Не реп каз як " Ж - но кв жу хх фддтн Е ся ее я шо юеотвне см свв ев вЯЗОЮ я ше - оо вико дик їх ще а се оон КН ще в 1 ча Концентрація антитіл (мем Фіг 5
Ж зи: Я с Фор ке ок охму ве во шічм-не БАЗОЮ Зх й юань БАД а й асо в кеічненеа вною щш по 5 шов ХК ж : ж: м ЩЕ . я СОодтх йо ул о ях ; ши --у, ях що ї з о й «М х х ЗК ж Б о ИН І ши и ВоОВ ювіо Ки по В З щі Концентрація анти ел
Фіг. 6 Антитеза АлВВ ок ачеНе я БОКОМ В зе ов КОНКУ шо ВАНИЖЕ НВ ВЕККА І яке: ІСП К за В і ВХ ее вручав вен Ку
В . : М З ве т | : . т і : ШІ ее й | 15 КЕ кла З ї АК: Ж І хів ТЕМ | З Ж З її в 1 ЖЕ НО и В. Пе Ж ВВ неси о Моексю і о. й ще з їх сх г 2 й а є я КІ я я я я й ж й я я -х Мк Я й що ік БУ «Е й а «В 7 Я ж С й ТОННУ: М иХУуВІНЕХ ВнХетіЙ НПеНЕчениХ)
Фіг. тА
708. гас1-004-НО 2 1 я гас1і-о1с0- НІ о во ж- 1951-004-НО 2 (І) У ! га 1-01 НО ще т га 1-ДО АЛЕ У Еф с и тдс1-016-Н8 2 (1) я о ; . й щ ж їх ще ще у в: й а В в я Рез г же г
Фіг. 7
100 дю 1291-004-НБЇ 2-Е430 Ф) х в А ЩЕ уде-от0ч8І 2-Б430 1) б ко ГО1-004-НБІ 24306 () В Ж в ЛА, ТА таиломтв-вІ2-БаЗОС (1) Се Гас-005--11 2-ЕЯЗ00 (3 Си -Щк. ; Ж аб Для ЯКО тусл-отв-НБІ 2-БЯЗОс (1) -4 зо 0 а Й о мА З ще я
Фіг. 7С л0о др 1961-004-НБІ2 (В) 5 гсси-005-НТ2 0! що дю 1961-005-НТ2 () зе а Г9с1-010-НБІ 2 0) ово ІФ 1-010-Н5І-2 (3) 5 2 ра (М ЯКО об1-018-НБЇ 2 (! у й - о З в «ве «ще я
Фіг. 70 зв 1951-004--51 2-Е4305 (|) З я. ТС 1-005--Н11 2-40 7) во р вч дк 10051-005--11,2-Б4ЗО0 (І) я Ф во ке З, 7 а 1-О0-Н51 2-40 С Ф « ода 961-010-НБІ.2-ЕЯ30О () з що шт ІДС 018. 2.ЕдЗОС. (1) -4 2 о ше М КИ і ЕЕ
Фіг. ТЕ чо др 901.37.3 Пух ек зоб 00512 (І) бо Іо 1-37.
3 А ов-о10-НЇ 2 (І! ЩЕ бо вн й я я а не м Ки м Фе
Фіг. ТЕ
100 вро 901-37.3-Б306 (|) 5 тд 1-005-Н1: 2-Е4305 0 во - ж 991-27.3-БІ200 (І) Но 7 1д61-010-Н5: 2-Е4300 (1) с в 20 а - хх їх ше ве ще з я ще - т их ді -
Фіг. 70 Пн, Первинна зБ'яюЧЕ З ! ! шо Я енозначена цк-Зт.3. | в оо» пови. ща. 1 щен ВО Анпеювоня ТК УНО Базос кІЗОо марожащою КО МТ»ЕЯОЮ | НероЕяаюю 0 неаовною і і(пезначене) й | ! : вки-бов і вяює 0 ши ; рентна нн і т сані 00000
Фіг. 8 кош в іде 1 ЦИ НЯ о ни де. 1щ1-004-НБІ.2-Е43ОЄ ; Са ще ! ї ВО і АЙ ее де 1008-11 склав я я зх - у ч Ж во я -а. Ідс1-005-Н11.2-Е4306 їх й «в ІдДО1-010-Н5І2 в КУ Я ; : - до ї Я «ве дб 1-010-НУ Яма М Я ххх с те Ей «де 1018-52 ал я дб1-016-Н512-24306 о с -ж І С и и І У ее
0 0.03 0 1 10 Конценмтовція антитіла у меми
Фіг. 9
Щ ИЙ ід5ламе но з 50 // Я Тослме-Не 2. ЕЯЗОЄ В Й як тов-оленвІ 2-Е405І 4305 то; і я То 1-06 2-С905-ЕДО6І 4305 /Ж «ее | 1-015-Е43005 т УМ осі 001 вм 1 19 Концентрація зіститіме у вел
Фіг. 10А Нв ЩІ се в 1 ІА МП сли жи а роб м АК А А й в У ее
Фіг. 108
"7 де: во й "НН ин : /"'' Ше "ПИ дог и Кк я м Ку Ко о й каш а ГІ В я 7 й я К- КС в Ко " є я г с
Фіг. 10С 4505 во дл не /Й вк дз тов но ЖОВ ЛИЙ ав лю оно о-ва3оо х Я аб З 016-Н5І 2405430 по Що О18-НБІ 2 С909- 4051 БЯЗОО лі яке ІШдЗ -512-Е4З0О 7 не шк чн оо 9.01 Гея 7 ЩЕ. Концентрація антитіла у миклюя
Фіг. 11
198 , й ж. я во у й
5. во у и а Її 29 ВЕ ВЕ ВК ннннннннннюня
0.00 0.01 0.1 ; 10 Концентрація антитіла у мкг/ми -е- до 1-005-НТ 2-КАПЯР-ЕАЗПО ЯВНО 1дс1-016-НБІ 2-Р405І-БЯЗО я-е- о д1-005-А1: 2КЛ ОЗ ЯЗО0 ДСЛ 018 9-40 ЯМ зе ПАТО 1-АМ НОСІ СЯ пе-Е 405 -АБАЗПеМ5-Н ТАКА ЛУ-СЯ
---. реідО 1-612-Е405І-Б430СХО0Б-НИ! 2-КАОЗА-г230О -к ред 1-01Е-НЇ 24. СЯ Б-ЕАОІ ЕД ЗОСЮО12-КАЙУЕ-ЕАЗОС св ІдДО1-612-Е4200
Фіг. 12А й КЕ і ' скл я Б ТЯ ВО На і / / а Бе З оо ; ДАК кдд сосок дохо 001 о 01 1 10 Концентрація антитіла у мисль «й дО 010 2 АОС ОН 2-сЯЗо -- дсе1-019-Н5 ЗЕ АЗО іа БАНІ 2-30 -ке ОІД ВАНН 2 СВО РАН Я ОХ ОН КАМЮ ав. Веде вва Зоо НО о-КОЗНЕ3О чавко Пас БНО 2 СВО РАН ЕК НЮХ ВТ КАЛУ З «ве ЇВ АН
Фіг. 12Е
-в. Ба аст4и БАНІ СЯпБ 4051 ЗЕ ях зве 7 птн 2-капак-БЯУ «Б веїас1-612-Р40Б: Б4ЗПОХІМ НІ з Капев-ваЗло я дк- щ кож "в Бі ас БАНЯ 2 Сп е-Е 4051. -Е Я хви 2-КОЧА-Е АЗС ше і як Я «ВЕ Тез 010-Н5Се БЯ3сс я Іа -015-НаСе- СапЗ-Е Я
Я. ве ЩА В ж саке. ввідс14И 8-НУ 2-.СУПК-Е ЯПБІ.-Е ЯЗПЮ жи 2-Капан-Е «ЗП Б й й я -йк Бе ав 3. Е405: СБ 150 0.51 9 КОРЕЯ - - Я / фе Тем «01 0-51. 2-ЕЯ 30 зе А я я най 151 016-НВІ З, С 05 ЕЯЗОЮ й в Я Іші віЗ панк яли 1 чав концентрація антитіла у МКГ/МЛ
Фіг. 125 в ко ПА т ї п ли В « Мод во - - С хв КУ а Я -и в ен З Ос ху Я Я Ж ех Ки г ши жи зе их «
Фіг. 120 ві : т - ва ее, З З -й Щ ва т
8. т ; ко Ех Яке я Фе яр Со ой в. дю ме те Ко З СКУ у с че ще є ее
Фіг. 12Е во й 2 во і 40 і 0 дреди нене фун нненннтефреннннннннетвь и В 0 0 1 то Сопе Ав іп райті. а рад 1-016-НБІ 24 СВІ БАЗИ ХО05-НІТІ 2-КЯПОП-БАЗОЄ ве Вага 1-016-Н 2--6405І хОй5-НЯТІ 2-ОаЕх зве ІД 1-612-Б4З0
Фіг. ЗА 100 вича 75 БО ї - і - і; ї о о рн Кз нене Конус . 0001 0 в. і 1о Сепе Ав поті. -ке В Тас1-016-Н451 2- СвОв- Я а Зо ехо 0-51 3-ЯОВ- ЯЗ «ак ред 1-010-НЗІ 2-45 х010-Н51 2-к409К о до 1-019-Б4 0
Фіг. 158 во рай яв ко о ж ив « «в /, ї о ут Ж гі о в т Тт- Не бл 1 10 Концентрація антитіма у мету «ве дб 005 НТ 2 Кан БОС Я 1о057-016-Н5І 2-40 64305 я ас Ап02АНТ Кап Баг - То 01 6-5 2-4 Я -- реа О16-НБІ ЗІ СООБЕ4О5І ЕМ ЗО0СхП05-НТІ 2. КАО9Б-ЕЯЗОс -е- ред 1-512-Р405І-ЕЯ300х005-Н 11 2-Капав-саЗа чо рег 1-016- Не Са яп БА дохо еко «о дб -012-ЕАЗПС
Фіг. 1Я4А 100 й во М. З ас 680 жу - 40 / Ля сонний Е ей й й шк 2 КИ Й бою " . ай й т Ки З й ах ее я х зал 0 ж о
0.01 ал А та Концентрація антитіла у мхемМи «ве ЩО ОЕОю «Ве та НВ 2 ЕЗЗОО те ТАН ЕВ я АН НВ ЕКО -к- ОЗ НО СВОЯ - ВО ХО ННЯ КАПС «ре Ве ОВ ЕВ ЗОСяХО 0-2 КАСОК ЕС -- Ввід 8-НВІ 2- Сей РЯПО -кЯЗО сх 12-КАпа КАК ее де Т-Н
Фіг. 148 воооовя Тена Цнтетокоечність 1 мес щи нта Здаю 3 т ТЕЖ КУА МИМО МУ; ЯКИМ ш- КЗ Таке пон шко НО) 2002004 р зви що й | | зи Шк АН ще | І кегов- щшЕ я М Поле с с ж - А и АЙ ово Ф я хх а Фо Кк А В Ж ак У Уж х Ф ж М А ШИ «Ф я а й я а кй У «ї ее і ся
Фіг. 15 зо р гк й ї2 Е З ях 7 Ж ої : ї їх що Ж А ОКХ 1 10 1 00 109000 Концентрація анти у нгми я а НН КАКАО яв а ИОБУНТІ З ОВВ С АМ кВ СУЯ БМ чає па АНА САРА ОМ АОС ВО ЗАКОН
Фіг. 16А зо -оож р і її 104х р й няня і с в. ї--и Я чо 7 чо что000 Кочцентрація антиту у мми ча шен ЕВ я а НЕК «ее ЧНО КОЮ ків НО ОЗ яке вва ЗА СВОЯ ОС НО СКННЕНАЕНю те Шев ЗоС
Фіг. 168 -к 20» її 4 46 | А ла ; с Е де чо ; Т й се ! ї; ії Ж | БИ он 5 ! са нене в ще; ет 5 8 З ЩІ. то 0 но концентрація антитіл У вг/ми «ве АЮ НАНЕМ ОЕАОВС яко ДОННА я ЗАТВ НО ЗАСН ж КАН ВАНО БАН зе ОД АЕН ЗА СОЯНЕЬК Н КАКАО ОКА ОК» зі Зі ЗАТЕ М ТЯ СОСКАХ УЯВІ УК ЕК фіг. 16
Хлл щ 700004 Е І г во0оо сх 50000 а 84000040 ше й: х 200004 5 ь Я 100005 зач; й ря я ; КУ Ж Я Ки Ф в: й Фе
Фіг. 17А - Фа ри не щ 700004 - ВО0Об я Е- Х «ох Х 5 500004 Ф 40000 а м а 20000Я св . вояж г шен ж
0. | й а. !
в. | з в же. «А Ф о 2 ІН о
Фіг. 178 шк мкл В копооя -- Я вроро В 40000. шк З зо00о ; а 20000 Щі д . В тоо00о- «в» си "5 А м їз К-т В «В - ке в с с є
Фіг. 17С . дкеКкл - Т000я в Є водов - водою 85 «во004 ї п. | - З З00004 ззомоЯ Он Ж то0004 ! ші її ЩЕ й шен А Фе 5 ве я КУ еВ 8 тт
Фіг. 170
100 пеня зве ун Б. в бо у о Я К-
28. КЛ
Фіг. 18А пк а Недавно підткоюваний во Що Рецидуючик рефоактовний ОЗ ФЛ
Фіг. 18Е то т А 8о- о ще бо Коналий ; я о Ж 205 кр я ех М со як се шо У ей «ві Ко о ще я я
Фіг. Л8С - В0О00 че Ва АН НОМ Се КУ Я вою с мианеськапов ве Зоо ОТ и я О-ВІЗ г аю Ж ЖК дклжя й т ЗО. ХХ Я собою її о. 5 Нв ренні ; т В Ен ї Бе що Концентрація антитіл у мктяй
Фіг. 19А в От за: ВІДО В НВ СВО РЯОБЬ ЕОЮ я с й Я НЕ З С СЕ їз вою ХВ о-кадем аю зов. р С оо0оя ря ва ві т а о Концентрація знтитія м меня
Фіг. 198 що я у, ВеЩОМНЕНЕ 24 СВБ ОвІ Бех
Ж в. ї пт вне о-капакчечяою Б є «ЇЇ ох «о щез-зов ою ларі в ж ! го доля дж скю Ж. Еж в-Я пе роя КЕ ж вм о ва 2 їв ка Концентрація внтитій У маки
Фіг. 20А Ж ел і ок М дао бойні В вжш з : ; : ж Бе а 1 18 о Концентрація антитн у мкм
Фіг. 20
064 Ж вв. ТАЗ ОВІВО-О18-НО 2. СвОБ-ЕФО В КАЗИОх ЕЕ Пацієнт 1) в й о вади ее С ЗО Кен я (Пацієнт 2) я Я ж Е - В міння Ух «В » хх Кк « «З ЖК а ХЕ і я же до - чу Ку я КУ - ту
Фіг. 21А 100
Є. м | СА від -О16-НО 2 СЗ05-Е4О ЕЯЗ0ЮХх що ак ПІВНЯ З-КИВУЕ ж (83 ді 1-СО20-ога ї- ї в - Ж 1 "Пацієнт 11 ва ! (о Вб -О ВН З ЗП 5-РЯОВІ БЯЗОСХ ! 404 -8- ПІН Я 2-КаПОВ я (ВУ ос -С030-ога з «Пацієнт 7 яю. вд 1ац І 0100. нет й ї тент їх Ф Ф й -е Кк ще Ії «ї СЯ ща К » си я 2 «г й кі Си
Фіг. 218.
UAA201910706A 2017-03-31 2018-04-03 Біспецифічні анти-cd37-антитіла, моноклональні анти-cd37-антитіла та способи їх застосування UA127586C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762479712P 2017-03-31 2017-03-31
EP2018057836 2018-03-27
PCT/EP2018/058479 WO2018178396A1 (en) 2017-03-31 2018-04-03 Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127586C2 true UA127586C2 (uk) 2023-10-25

Family

ID=62044657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201910706A UA127586C2 (uk) 2017-03-31 2018-04-03 Біспецифічні анти-cd37-антитіла, моноклональні анти-cd37-антитіла та способи їх застосування

Country Status (13)

Country Link
US (7) US20200270359A1 (uk)
EP (1) EP3601354A1 (uk)
JP (2) JP7330942B2 (uk)
KR (1) KR20200074915A (uk)
CN (1) CN110914301A (uk)
AU (1) AU2018242227A1 (uk)
BR (1) BR112019020219A2 (uk)
CA (1) CA3057907A1 (uk)
IL (1) IL269645A (uk)
MX (2) MX2019011520A (uk)
SG (1) SG11201908772TA (uk)
UA (1) UA127586C2 (uk)
WO (1) WO2018178396A1 (uk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA117901C2 (uk) * 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
AU2018242227A1 (en) 2017-03-31 2019-10-17 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-CD37 antibodies, monoclonal anti-CD37 antibodies and methods of use thereof
WO2019243636A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
CN113365698A (zh) * 2018-10-04 2021-09-07 健玛保控股有限公司 包含双特异性抗cd37抗体的药物组合物
CN113271965B (zh) * 2019-01-11 2023-11-03 湖南远泰生物技术有限公司 Cd37抗体和cd37-car-t细胞
CN113504371B (zh) * 2021-07-09 2024-06-14 博以新(杭州)生物技术有限公司 基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法
JP7437558B1 (ja) 2023-07-20 2024-02-22 株式会社ファーマフーズ 情報処理装置、情報処理方法、およびプログラム

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
EP1150918B1 (en) 1999-02-03 2004-09-15 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method of manufacturing therapeutic calcium phosphate particles
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
US20030103971A1 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
EP3284753B1 (en) 2002-10-17 2019-06-05 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20 for use in the treatment of multiple sclerosis
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
PT2298815E (pt) * 2005-07-25 2015-07-16 Emergent Product Dev Seattle Moléculas de ligaçao especificas para cd37 e especificas para cd20
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
MX2008015524A (es) * 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
ES2667863T3 (es) 2007-03-29 2018-05-14 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
PL2158221T3 (pl) 2007-06-21 2019-02-28 Macrogenics, Inc. Kowalencyjne diaciała i ich zastosowania
PE20140196A1 (es) 2007-08-09 2014-03-19 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-cd37
ES2622460T3 (es) 2007-09-26 2017-07-06 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
AU2009335798B2 (en) 2008-12-19 2014-11-27 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
MX2011009810A (es) 2009-03-27 2011-09-30 Zymogenetics Inc Composiciones y metodos para usar proteinas de union multiespecificas que comprenden una combinacion anticuerporeceptor.
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
EP2445936A1 (en) 2009-06-26 2012-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
BR112012012983A2 (pt) 2009-12-04 2020-09-15 Genentech Inc método para sintetizar um anticorpo multiespecífico, método para sintetizar um painel de anticorpos multiespecíficos, método para sintetizar um análogo de anticorpo, método para sintetizar um painel de análogos de anticorpo e composições
AR080513A1 (es) 2010-03-12 2012-04-11 Inmunogen Inc Moleculas de union cd37 y sus inmunoconjugados
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
US20120189618A1 (en) 2010-07-16 2012-07-26 Boehringer Ingelheim International Gmbh Superior efficacy of cd37 antibodies in cll blood samples
PT2606064E (pt) 2010-08-16 2015-06-08 Novimmune Sa Processos para a geração de anticorpos poliespecíficos e polivalentes
KR101612999B1 (ko) 2010-08-24 2016-04-15 로슈 글리카트 아게 활성화가능 이중특이적 항체
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
MX2013011385A (es) 2011-04-01 2014-03-13 Immunogen Inc Moleculas de union a cd37 y sus inmunoconjugados.
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
EP2771364B1 (en) 2011-10-27 2019-05-22 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
DK2794905T3 (da) 2011-12-20 2020-07-06 Medimmune Llc Modificerede polypeptider til bispecifikke antistofgrundstrukturer
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
EP2849784A1 (en) * 2012-05-16 2015-03-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Combination of cd37 antibodies with ice (ifosfamide, carboplatin, etoposide)
CN104736174B (zh) * 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
AU2013348570B2 (en) 2012-11-21 2017-01-12 Pharmabcine Inc. Dual-target antibody targeting VEGFR-2 and DLL4, and pharmaceutical composition comprising same
KR20160007478A (ko) 2013-01-10 2016-01-20 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
AU2018242227A1 (en) 2017-03-31 2019-10-17 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-CD37 antibodies, monoclonal anti-CD37 antibodies and methods of use thereof
WO2019243636A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US11512137B2 (en) 2022-11-29
CN110914301A (zh) 2020-03-24
KR20200074915A (ko) 2020-06-25
US20200270359A1 (en) 2020-08-27
MX2019011520A (es) 2020-08-03
US20200291124A1 (en) 2020-09-17
JP7330942B2 (ja) 2023-08-22
BR112019020219A2 (pt) 2020-11-24
AU2018242227A1 (en) 2019-10-17
SG11201908772TA (en) 2019-10-30
EP3601354A1 (en) 2020-02-05
CA3057907A1 (en) 2018-10-04
JP2023156422A (ja) 2023-10-24
US20210024647A1 (en) 2021-01-28
MX2023011121A (es) 2023-10-03
WO2018178396A1 (en) 2018-10-04
US11034772B2 (en) 2021-06-15
US20210355232A1 (en) 2021-11-18
US20240117064A1 (en) 2024-04-11
US11396553B2 (en) 2022-07-26
IL269645A (en) 2019-11-28
US20220251231A1 (en) 2022-08-11
US20240076397A1 (en) 2024-03-07
JP2020516309A (ja) 2020-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11685789B2 (en) CD47 antigen-binding molecules
UA127586C2 (uk) Біспецифічні анти-cd37-антитіла, моноклональні анти-cd37-антитіла та способи їх застосування
JP6417442B2 (ja) ヒト組織因子抗体及びその使用
JP6034315B2 (ja) 安定なＩｇＧ４抗体
ES2927567T3 (es) Anticuerpos anti-PD1 y su uso como productos terapéuticos y de diagnóstico
JP2019527061A (ja) 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体、ｇｐｒｃ５ｄとｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用
CN107001476A (zh) 用于增强的免疫应答和癌症治疗的组合物和方法
GB2537445A (en) Binding molecules specific for CD73 and uses thereof
US11999793B2 (en) Therapeutic anti-CD9 antibody
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
US20150368329A1 (en) Methods of Treating Ocular Diseases
JP2018526990A (ja) 新規な抗ヒトｇｐｖｉ抗体およびその使用
EA026375B1 (ru) Антигенсвязывающие белки, специфические в отношении сывороточного амилоидного компонента р
CA3200865A1 (en) Anti-claudin18.2 and cd3 bispecific antibody and use thereof
WO2023036326A1 (zh) 抗人cd3抗体及其应用
WO2023104138A1 (zh) Bcma抗体及其应用
US20230399414A1 (en) Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
AU2019203917B2 (en) Modified CK and CH1 domains
WO2023225197A2 (en) Klrb1 binding agents and methods of use thereof
WO2024091919A2 (en) Klrb1 binding agents and methods of use thereof
CN118355032A (zh) Bcma抗体及其应用
EA045935B1 (ru) Антитела к cd3 и их применение
TW201335184A (zh) 人類組織因子抗體及其用途