KR20170124549A - 글리코실화된 리소좀 단백질, 생산 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글리코실화 패턴에 따라 잠재적으로 다양하게 글리코실화된 복수의 리소좀 단백질을 포함하는 리소좀 단백질 조성물로서, 상기 글리코실화 패턴이 적어도 45%의 포시만노스형 N-글리칸 (몰%)을 갖는 리소좀 단백질 조성물; 선태류 식물 또는 세포에서 리소좀 단백질 조성물을 제조하는 방법, 및 리소좀 단백질 조성물의 의학적 및 비-의학적 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 리소좀 단백질은 파브리병 치료를 위한 a-갈락토시다제 또는 고쉐병의 치료를 위한 β-글루코세라미다제일 수 있다. 독특한 글리코실화는 -놀랍게도, CHO 세포 생산된 리소좀 단백질에 대해 공통적인 만노스-6-포스페이트 없이도- 향상된 치료학적 효능을 발생시킨다.

Description

글리코실화된 리소좀 단백질, 생산 방법 및 용도

본 발명은 포유동물 발현 시스템과 비교하여 변형된 글리코실화를 얻기 위한 식물에서의 재조합 단백질 발현 분야에 관한 것이다.

리소좀 축적병(Lysosomal storage disease, LSD)은 생명을 위협하는 유전적 질환의 그룹이다; 이들 대부분은 단일 리소좀 효소 또는 단백질의 결핍에 의해 초래되며, 이는 세포 내 기질의 비정상적인 축적으로 이어진다. 현재 효소 대체 요법(ERT)이 여러 LSD에 대해 유일하게 이용 가능한 특이적 치료법이다. 이러한 질환에서, 리소좀 축적은 누락 효소의 정맥내 주입에 의해 많은 표적 조직에서 제거될 수 있다. 전통적으로, ERT에 사용된 재조합 효소는 배양된 포유동물 세포에서 생산된다. 예를 들어, US 6,083,725는 인간 세포로부터의 α-갈락토시다제를 기재하고 있다. 최근에, 대안적인 접근법으로서, 식물-기반 발현 시스템이 치료학적 용도를 위한 리소좀 효소를 생산하는데 이용되었다 (Shaaltiel et al. (2007) Plant Biotechnol J 5:579-590; Du et al. (2008) J Lipid Res 49:1646-1657; De Marchis et al. (2011) Plant Biotechnol J 9:1061-1073; He et al. (2012) Nat Commun 3:1062). 포유동물 세포-기반 시스템과 비교하여, 식물-기반 시스템은 낮은 생산 비용, 포유동물 병원체에 의한 오염 위험 제거, 및 이끼의 경우, N-글리코실화 경로의 비교적 용이한 조작을 포함하는 수개의 이점을 갖는다. 그러나, ERT를 위한 식물 세포 생산 효소의 주요 염려는 포유동물 세포-생산 효소와 상이한 이들의 N-글리칸 구조이다. 특히, 식물 세포에서 발현되는 리소좀 효소는 전형적으로, 추가의 인위적 인산화 없이는 말단 만노스 잔기 상의 만노스 6-포스페이트(M6P) 변형을 획득하지 못한다. 당 사슬은 ERT에서 중추적인 역할을 한다. 정맥내 투여된 리소좀 효소는 효소의 탄수화물 구조를 인식하는 세포 표면 수용체를 통해 조직에 의해 흡수된다. M6P 수용체 (M6PR)와 만노스 수용체 (MR)는 이러한 흡수 시스템에 대한 두 가지 주요 기여인자를 대표한다.

대부분의 리소좀 효소는 M6P 잔기를 가지고 있다. 일반적으로, 대부분의 LSD에 대한 ERT에서 M6PR-매개된 식균작용 경로는 충분한 효소 전달에 결정적인 것으로 여겨진다 (Sly et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15172-15177; Sands et al. (2001) J Biol Chem 276: 43160-43165). MR은 -반대로- 마크로파지 상에 존재하며 이들 세포에서 효소 치환을 목적으로 하는 ERT의 치료학적 효과만 촉진시키는 것으로 여겨진다.

WO 02/08404 및 WO 2012/098537은 타바코에서 다양한 리소좀 효소의 생성을 기술한다.

WO 03/073839는 식물 씨앗, 특히 타바코 식물의 씨앗에서 리소좀 효소의 생성을 기술한다.

US 7,011,831은 곤충 세포에서 복합 N-글리칸 글리코실화를 갖는 리소좀 효소의 생성을 기술한다.

WO 2008/132743은 ER 신호 펩티드 및 액포성(vacuolar) 표적화 신호를 갖는 발현 작제물을 사용한, 타바코에서 고 만노스 글리코실화된 리소좀 효소의 생성을 기술한다.

EP 2 789 686 A1은 포유동물-형 포스포릴화된 글리칸을 생성하기 위한 식물 글리코실화 경로의 변형을 기술한다.

US 2006/040353은 N-연결된 글리칸 상으로 베타-갈락토스를 전달하는 것을 기술한다. 만노스-6-포스페이트를 갖는 글리코단백질이 리소좀 질환의 치료에 제안된다.

치바(Chiba) 등은 효모 S. 세레비시애(S. cerevisiae)로부터 인간 α-gal A를 생산하였다 (Chiba et al. (2002) Glycobiology 12:821-828). 이 경우, M6P는 말단 만노스에 의해 덮히고, 박테리아 α-만노시다제에 의한 만노스 잔기의 제거는 배양된 섬유아세포에서 효소의 M6PR-의존성 흡수 개선을 유도하였다. 최근에는, α-gal A는 또 다른 유전자-조작된 효모 균주에서 발현되었으며, 이는 만노실포스페이트 트랜스퍼라제의 양성 조절인자인 MNN4를 과발현시킨다 (Tsukimura et al. (2012) Mol Med 18:76-82). 이러한 α-gal A 제조물에서 포스포릴화된 N-글리칸 함량은 아갈시다제 알파보다 더 높았다 (28.7% vs. 15.3%). 파브리 마우스로의 이러한 효소의 반복된 주입은 아갈시다제 알파-주입된 마우스에서의 것과 유사한 심장 및 신장 Gb₃ 감소를 발생시켰다. 가장 최근에, 키즈너(Kizhner) 등은 타바코 세포 배양물에서 생성된 인간 α-gal A의 정제 및 특징 규명을 보고했다 (Kizhner et al. (2015) Mol Genet Metab 114 (2):259-267). 기타 식물-제조 리소좀 효소로서, 이러한 aGal은 비-포스포릴화된다. 그러나, 이러한 단백질은 화학적으로 가교되고 페길화된다. 이러한 변형은 아갈시다제 알파 또는 베타와 비교할 경우 증가된 시험관내 안정성 및 극적으로 연장된 순환 반감기 (~10hr)를 포함하는 단백질 특성에서 중요한 변화와 관련이 있다. 이러한 효소의 흡수 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 그러나, 현저하게 느린 혈장 청소는 상기 흡수가 M6PR- 또는 MR-매개 세포내이입을 통해서가 아니라는 것을 시사한다.

US 6,887,696은 타바코 식물, 고등 식물에서 두 개의 리소좀 단백질(lysosomal protein), 즉 알파-글루코세레브로시다제 및 알파-갈락토시다제를 발현시키는 방법을 기술하고 있다. 많은 양의 복합 N-글리칸 특히, GnMXF, MGnXF, GnGnXF, GnMx 및 MGnX를 갖는, 타바코 생산 리소좀 단백질은 다양한 글리코실화 패턴을 가졌다.

본 발명의 목적은 적합한 글리코실화를 필요로 하는 리소좀 축적병의 치료를 위한 치료제로서 활성인 리소좀 단백질의 생성을 위한 대안적 공급원을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명의 이러한 목적은, i) 리소좀 단백질 상의 포시만노스형 (paucimannosidic) 글리코실화가 치료 옵션에 대한 적합성을 부여하고, ii) 이러한 포시만노스형 글리코실화는 선태류 식물 발현 시스템에서 용이하게 수득될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한 본 발명에 의해 해결된다.

본 발명은 선태류 식물 또는 세포에서 리소좀 단백질을 엔코딩하는 전이유전자를 발현시키는 것을 포함하여 리소좀 단백질 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 리소좀 단백질은 N-말단 분비 신호와 발현되며, 상기 분비 신호는 세포내 처리 동안 선택적으로 제거되며, 특히 리소좀 단백질은 서열 VDTM (SEQ ID NO: 1)을 갖는 C-말단 액포(vacuolar) 신호가 결여되며, 상기 방법은 상기 식물 또는 세포로부터 발현된 리소좀 단백질을 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 리소좀 단백질 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 글리코실화 패턴에 따라 잠재적으로 다양하게 글리코실화된 복수의 리소좀 단백질을 포함하는 리소좀 단백질 조성물로서, 상기 글리코실화 패턴은 적어도 45%의 포시만노스형 N-글리칸 (몰%)을 갖는 리소좀 단백질 조성물을 추가로 제공한다. 이러한 단백질 조성물은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있다.

또한, 복합 N-글리칸을 포함하는 리소좀 단백질을 처리하는 방법으로서, 상기 방법이 샘플에 리소좀 단백질을 제공하고 샘플을 선태류 식물 HEXO, 바람직하게는, HEXO3 효소와 접촉시켜 선태류 식물 HEXO 효소가 리소좀 단백질로부터 말단 GlcNAc 잔기를 절단하여, 포시만노스형 N-글리칸을 생성하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. HEXO 효소는 세포, 특히 식물 세포에 존재할 수 있다. 리소좀 단백질은 의약 또는 약학적 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 리소좀 단백질을 엔코딩하는 상기 전이유전자를 포함하는 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 선태류 식물 세포 또는 식물을 제공한다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 환자에게 본 발명에 따른 리소좀 단백질 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 리소좀 축적병의 치료 방법에 관한 것이다.

모든 이러한 양태는 상호 관련되어 있고, 본원에 제시된 전체 발명의 일부를 동등하게 형성하며, 본 발명의 바람직한 구체예는 임의의 조합으로 이들 양태들 중 어느 하나에 관한 것일 수 있으며, 예를 들어, 주어진 작제물 또는 방법에 의해 형질전환된 식물 또는 세포가 제공될 수 있거나 본 발명에 따라 글리코실화되는 임의의 리소좀 단백질의 생성에 이용될 수 있다. 임의의 구체예 또는 바람직한 특징에 대한 하기 상세한 설명은 동등하게 모든 양태에 관한 것이다. 예를 들어, 리소좀 단백질의 생성물 특징은 방법이 이의 생성물 특징을 갖는 이러한 리소좀 단백질을 생성하도록 선택됨을 의미한다. 특정 방법 단계의 설명은 이 방법 단계에 의해 변형된 단백질을 동등하게 서술한다. 본 발명의 세포는 세포에서 임의의 본 발명의 제조 방법을 용이하게 하기 위해 형질전환된다. 모든 리소좀 단백질은 리소좀 단백질을 (치료학적으로 또는 비-치료학적으로) 사용하는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명은 청구범위에서 추가로 규정된다.

발명의 상세한 설명

리소좀 축적병(LSD)은 리소좀 기능의 결함으로 인한 대략 50개의 희귀 유전 대사 장애의 그룹이다. 리소좀은 여러 중요 효소를 포함하는 다양한 분자를 분해하는 역할을 한다. 이러한 효소 중 하나에 결함이 있는 경우, 돌연변이로 인해, 큰 분자가 세포 내부에 축적되어 결국 세포를 사멸시킨다. 리소좀 축적병은 지질, 글리코단백질 또는 뮤코폴리사카라이드의 대사에 필요한 단일 효소의 결핍 결과로서 일반적으로 리소좀 이상으로 초래된다.

리소좀 축적병의 치료는 대부분 증상에 따르며, 효소 대체 요법이 가장 일반적이다. ERT는 흡수 경로를 통한 세포 내로의 활성 리소좀 단백질의 투여를 필요로 한다.

전통적으로, ERT에 사용된 재조합 효소는 배양된 포유동물 세포에서 생성된다. 최근에, 대안적인 접근법으로서, 식물-기반 발현 시스템은 치료학적 용도를 위한 리소좀 효소를 생산하는데 이용되었다. 포유동물 세포-기반 시스템과 비교하여, 식물-기반 시스템은 더 낮은 생산 비용, 포유동물 병원체에 의한 오염 위험 제거, 및 이끼의 경우, N-글리코실화 경로의 비교적 용이한 조작을 포함하는 수개의 이점을 갖는다. 그러나, ERT를 위한 식물 세포-생산 효소 사용을 고려할 경우 주요 염려는 포유동물 세포-생산 효소와 상이한 이들의 N-글리칸 구조이다. 특히, 식물 세포에서 발현되는 리소좀 효소는 말단 만노스 잔기 상의 만노스 6-포스페이트 (M6P) 변형을 전형적으로 획득하지 못한다.

본 발명은 식물 세포 특히, 선태류 식물 세포에서 전이유전자 리소좀 단백질을 생성하는 새로운 방법으로서, 놀랍게도, 포시만노스형 글리코실화 즉, 분지된 -Man<(Man)₂ 구조에서 소수 개 예를 들어, 2개의 만노스 잔기로 종결되는 글리코실화 정도가 높은 글리코단백질의 형성을 유도하는 방법을 제공한다. 이러한 구조는 특히, 리소좀 축적병에 의해 영향을 받은 세포에서 흡수에 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 이러한 변경된 글리코실화는 리소좀 단백질에 대한 비자연적이지만, 놀랍게도 변경된 단백질은 여전히 매우 효과적인 치료학적 단백질이다.

본 발명의 방법에 사용된 리소좀 단백질은 예를 들어, 해당 기원 포유동물에서 ERT에 사용하기 위한 포유동물 기원의 전이유전자이다. 선태류 식물에서 생성된 이러한 유전자전이 리소좀 단백질은 리소좀 축적병의 치료를 위한 치료학적 단백질로서 사용될 수 있다. 이와 같이, 리소좀 단백질은 투여되는 경우 활성인 특히, 약 pH 5와 같은 리소좀에서 발생하는 상태에서 활성인 효소이다. 물론, 비활성 저장 형태 예를 들어, 동결건조된 경우도 가능하다. 본 발명의 포시만노스형 글리코실화는 효소 활성을 실질적으로 방해하지 않지만, 리소좀 단백질의 흡수 및 안정성에 영향을 준다. 놀랍게도, 리소좀 단백질 상의 본 발명의 N-글리칸은 높은 효능을 유도하여 특히 리소좀 축적병의 치료에서 이들의 치료학적 사용을 허용한다.

본 발명은 선태류 식물에 전이유전자를 도입하기 위한 공지된 방법에 의존적일 수 있다. 이종성 단백질의 생성을 위한 선태류 식물의 생물공학적 개발에 적합한 형질전환 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 성공적인 형질전환은 입자 총을 사용한 원사체 조직 내로의 직접 DNA 전이에 의해 수행되었다. 이끼 원형질체로의 PEG-매개된 DNA 전이가 또한 성공적으로 달성되었다. PEG-매개된 형질전환 방법은 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)에 대해 수차례 기술되었으며, 이는 일시적 형질전환체 및 안정한 형질전환체 둘 모두를 유도한다 (K. Reutter and R. Reski, Pl. Tissue culture and Biotech., 2, 142-147 (1996)). 게다가, 마커-비함유 형질전환은 또한 선태류 식물을 사용한 PEG-매개된 형질전환 방법에 의해 달성될 수 있으며 (Stemmer C, Koch A and Gorr G (2004), Moss 2004, The 7th An-nual Moss International Conference, Freiburg, Germany) 다중 뉴클레오티드 서열의 후속 도입에 사용될 수 있다.

생물반응기에서 본 발명에 사용하기에 적합한 선태류 식물, 예컨대, 렙토브리움 피리포르메(Leptobryum pyriforme) 및 스파그넘 마젤라니쿰(Sphagnum magellanicum)을 배양하는 것에 관한 상세한 정보는 종래 기술 분야에 공지되어 있다 (E. Wilbert, "Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism", Ph.D. thesis, University of Mainz (1991); H. Rudolph and S. Rasmussen, Crypt. Bot., 3, 67-73 (1992)). 본 발명의 목적에 특히 바람직한 것은 피스코미트렐라 파텐스를 사용하는 것인데, 이는 분자 생물학 기술이 이러한 유기체에 대해 실시되기 때문이다 (R. Reski Bot. Acta, 111, pp. 1-15 (1998)). 선태류 식물의 배양에 있어서, 미량원소와 같은 보충물을 갖거나 (Baur et al. (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340) 갖지 않는 배지가 사용될 수 있다 (Weise et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, 337-345).

리소좀 단백질 조성물을 제조하는 본 발명의 방법은 바람직하게는, 선태류 식물 또는 세포에서 리소좀 단백질을 엔코딩하는 전이유전자를 발현시키는 것을 포함하며, 상기 리소좀 단백질은 N-말단 분비 신호와 발현되며, 리소좀 단백질은 서열 VDTM (SEQ ID NO: 1)을 갖는 C-말단 액포 신호가 결여되어 있다. 이는 액포 표적화를 피할 것이며, 이는 (배출과는 다른) 액포에서의 리소좀 단백질 저장 및 잠재적으로 액포에서 다양한 글리콜-처리로 이어질 것이며, 이때 포시만노스형 글리코형태는 여전히 어느 정도까지는 가능하다. 골지에서, 액포 표적화 없이, 선태류 식물 특이적 재조합 단백질 상호작용을 기반으로 하여, 다양한 글리코실화 경로는 놀랍게도, 액포 처리와 무관하게 많은 양의 포시만노스형 글리코실화로 이어진다. 이는 타바코에서 분비의 비-액포 경로가 포시만노스형 글리코실화 대신에 대부분 복합 N-글리칸의 형성으로 이어지기 때문에 매우 놀랍다 (US6887696). 분명하게는, 선태류 식물은 이러한 변형으로 이어지는 리소좀 단백질의 독특한 인지를 갖는다.

SEQ ID NO: 1은 효율적인 액포 표적화를 유도하는 C-말단 식물 액포 표적화 신호이다. 일부 구체예에서, 다른 액포 표적화 신호, 특히 비-식물 신호가 존재할 수 있어, 액포를 피하면서 분비 경로를 따라 덜 효율적인 액포 표적화 및 일부 발현을 초래한다. 그러나, 가장 바람직한 구체예에서, 액포 표적화 신호는 발현 동안 또는 심지어 최종 수득된 생성물에도 존재하지 않는다. 액포 신호는 또한 세포로부터의 단백질을 수득한 후 인위적으로 제거될 수 있다.

포시만노스형 N-글리칸은 복합 N-글리칸의 트리밍을 기반으로 한다. 골지에서, 말단 GlcNAc는 복합 글리칸으로부터 제거되어 말단 만노스를 남겨두며, 선태류 식물 시스템의 경우에, (이전의 복합) N-글리칸의 두 분지 모두에서 말단 만노스를 남겨두는데 매우 효율적이다.

본 발명에 따르면, 분비 신호 서열이 일반적으로, 아미노산 서열의 N-말단에 사용된다. N-말단 분비 신호는 또한 수송 펩티드 또는 ER 신호 서열로서 지칭된다. 이는 엔코딩되고 발현된 아미노산 서열의 일부이다. 분비 신호는 직접적으로 세포의 ER 내로의 발현으로 이어져서 분비 경로 설정한다 (또는 혈관 신호가 존재하는 경우 액포 지정으로 이어진다). 분비 신호는 일반적으로 발현 동안 단백질 아미노산 서열로부터 본질적으로 제거된다. 이는 식물 세포에서 자연적인 과정이다. 전이유전자의 발현 생성물의 적절한 국소화를 허용하기 위해, 리소좀 단백질의 유전자는 식물 세포에서 국소화를 허용하도록 변형될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리드 핵산 서열이 식물 또는 식물 세포의 형질전환을 위한 작제물에 사용된다. 예를 들어, 포유동물 효소의 국소화-관련 도메인은 식물 서열에 의해 대체되어 예컨대, 식물의 골지 및/또는 ER에서 올바른 국소화 및 세포 수송을 달성한다. 식물 분비 신호의 예는 SEQ ID NO: 5이지만, 임의의 다른 식물 분비 신호가 사용될 수 있다. 이는 사용된 선태류 식물 종에 대한 내생성 서열일 수 있거나 이는 이종 식물 서열일 수 있으나, 바람직하게는 여전히 선태류 식물 서열이다.

본 발명의 방법은 서열 VDTM (SEQ ID NO: 1)을 갖는 식물 (선태류 식물) 액포 신호가 없는 리소좀 단백질의 발현을 포함한다. 이는 ER로부터 골지로의 발현 경로를 유도하며 궁극적으로는 분비에 이르러, 액포에서 단부-국소화를 회피한다. 선태류 식물에서, 분비는 배양 배지로 직접적으로 이루어질 수 있다. 다른 식물에서, 이는 식물 세포의 아포플라스트 구획으로 분비될 수 있다. 놀랍게도, 심지어 액포 배치 없이, 높은 정도의 포코만노스형 글리코실화가 본 발명의 방법에 의해 달성될 수 있다.

이어서, 최종 단계로서, 상기 식물 또는 세포로부터 발현된 리소좀 단백질이 수득된다. 이를 위해, 리소좀 단백질은 세포로부터의 추출 공정으로부터 수집될 수 있으며, 이는 파괴적이거나 비파괴적일 수 있다. 바람직하게는, 발현된 리소좀 단백질은 식물 또는 세포의 분비된 물질, 예를 들어, 배양 배지로부터, 바람직하게는, 생산 세포 또는 식물을 파괴하지 않으면서 수득된다. 이어서, 수득된 리소좀 단백질은 예를 들어, 적어도 80%(m/v), 바람직하게는 적어도 90%(m/v), 특히 바람직하게는, 적어도 95%(m/v), 또는 적어도 98%(m/v) 또는 적어도 99%(m/v)의 농도로 정제될 수 있다.

바람직하게는, 선태류 식물 또는 세포는 이끼, 바람직하게는, P. 파텐스, 식물 또는 세포이다. 선태류 식물은 임의의 선태류 식물일 수 있으나, 바람직하게는, 이끼, 우산이끼 또는 붕어마름으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는, 선태류 식물 강 또는 피스코미트렐라(Physcomitrella), 푸나리아(Funaria), 스파그넘(Sphagnum), 세라토돈(Ceratodon), 마르찬티아(Marchantia) 및 스패로카르포스(Sphaerocarpos) 속으로부터 선택된다. 피스코미트렐라 파텐스가 특히 바람직한 시스템인데, 이는 상동성 재조합의 비율이 높기 때문이다.

본 발명의 소재는 식물 및 식물 세포이다. 본원에 사용된 바와 같이 "식물 세포"는 분리된 세포, 단일화된 세포를 지칭할 수 있으나, 또한 식물 조직 바람직하게는, 캘러스(callus), 원사체, 체관부, 물관부, 잎살, 트렁크, 잎, 엽상체, 클로로네마, 분지체, 헛뿌리 또는 배우자낭체로부터 선택된 조직 내의 또는 이의 세포, 또는 식물 유기체 내의 세포를 지칭할 수 있다. 세포는 원형질체 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 분리된 식물 세포 또는 심지어 식물 조직이 본 발명에 따라 형질전환되며, 이어서 식물 또는 식물 조직으로 성장되거나, 식물 세포 배양물 예컨대, 현탁 배양물, 예를 들어, 생물반응기에 남아있게 된다 (Hohe & Reski, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81, 2005: 307-311).

바람직하게는, 리소좀 단백질은 서열 KDEL (SEQ ID NO: 2)을 갖는 C-말단 ER 보유 신호가 추가로 결여되어 있다. ER 보유 신호는 ER 또는 골지 시스템에서의 보유로 이어진다. 이는 발현된 단백질에서 관찰된 글리코실화 패턴에 상당한 영향을 끼칠 수 있는데, 왜냐하면 글리코실화가 변형되는 기질 단백질에 대해 경쟁하는 여러 글리코실화 효소와의 경쟁적 과정이기 때문이다. 포시만노스형 트리밍이 ER 보유로 인해 유익할 것으로 기대할 수 있었지만, 놀랍게도 이러한 (또는 임의의) ER 보유 신호 없이 많은 양의 포시만노스형 N-글리칸을 갖는 본 발명의 리소좀 단백질이 발현되었다.

SEQ ID NO: 2는 효율적인 ER 또는 골지 보유를 유도하는 C-말단 ER 보유 신호이다. 또한, 바람직하게는, ER 보유를 또한 어느 정도 담당하고 있는 C-말단 디-리신 모티프 (KXKX)가 또한 결여되어 있다. 일부 구체예에서, 기타 ER 보유 신호 특히, 비-식물 신호가 존재할 수 있으며, 이는 덜 효율적인 ER/골지 보유로 이어지며 분비를 향해 구획으로부터 구획으로 더욱 신속하게 처리된다. 그러나, 가장 바람직한 구체예에서, ER 보유 신호는 발현 동안 또는 심지어 최종 수득된 생성물에도 존재하지 않는다. ER 보유 신호는 또한 세포로부터 단백질을 수득한 후 인위적으로 제거될 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 있어서 특히 바람직하게는, 리소좀 단백질은 식물 C-말단 ER 보유 신호 서열 및 식물 C-말단 액포 신호 서열이 결여되었으며, 특히 바람직하게는, 이는 임의의 C-말단 ER 보유 신호 서열 및 임의의 C-말단 액포 신호 서열이 결여된다. 식물 신호는 식물 기원으로 비롯되며, 식물, 특히 선태류 식물에서 발견된다. 이들은 선태류 식물에서 작용적이다. 상기 설명된 바와 같이, ER 보유는 필요하지 않으며, 심지어 액포 처리도 본 발명의 선태류 식물 발현 시스템에서 높은 포시만노스형 글리코실화에 필요하지 않다.

바람직하게는, 리소좀 단백질은 천연 리소좀 단백질 또는 이의 절두부의 아미노산을 갖는 C-말단에서 종결되는 발현된 아미노산 서열을 포함한다. 이는 단백질 서열에 어떠한 추가도 존재하지 않음을 의미한다. 바람직하지 않긴 하지만, 절두가 가능하다. 물론, 절두는 본 발명의 리소좀 단백질의 활성에 상당한 영향을 미치지 않으며, 이는 상기 설명된 바와 같이 여전히 요구된다. 효소 활성은 포유동물, 특히, 인간 세포에서의 리소좀 상태 예컨대, pH 5에서 천연 리소좀 단백질과 비교하여 예를 들어, 최대 20% 감소될 수 있다. 천연 리소좀 단백질의 C-말단 아미노산에서 절두는 최대 50, 바람직하게는, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 10, 최대 5 또는 일, 또는 이들 값 사이의 임의의 범위 (예를 들어, 1 내지 10 등)의 결실일 수 있다. 절두된 알파-갈락토시다제는 예를 들어, US 6,887,696 B2 (본원에 참조로 통합됨)에 기술된 바와 같이 이러한 절두로 활성화되는 것으로 알려져 있다.

바람직하게는, 선태류 식물 또는 세포는 HEXO3 전이유전자를 포함하거나 포함하지 않는다. HEXO3는 식물에서 자연적으로 발견되는 효소이다. 이는 HEXO3 활성을 심지어 추가로 증가시키기 위해 전이유전자로서 공급될 수 있다 (또는 공급되지 않을 수 있다). 전이유전자의 도입은, 리소좀 단백질 전이유전자가 예를 들어, 게놈 재조합 하이브리드화 또는 플라스미드 도입에 의해 식물 또는 세포 내로 혼입되는 것과 동일한 방법으로 촉진될 수 있다. HEXO3는 식물의 아포플라스트 라이닝 원형질막에서 일부 포시만노스형 글리코실화를 담당하는 것으로 알려져 있으며 (Liebminger et al., J Biol Chem 2011, 286: 10793-10802; Bosch et al., Curr Pharm Des. 2013;19(31):5503-12), 그러나, 아라비돕시스 탈리아나에서 리엡민거(Liebminger)에서 발견된 HEXO 활성은 선태류 식물에서 발견된 높은 포시만노스형 글리코실화를 설명할 수 없다. 관련 효소 HEXO1은 일부 액포 포시만노스형 글리코실화를 담당하며 HEXO2는 아라비돕시스에서 낮은 활성을 갖는 것으로 보인다. 선태류 식물에서 더 높은 활성 또는 더 우수한 접근가능성이 있을 수 있다.

명백하게는, 선태류 식물 HEXO는 특히 리소좀 단백질에 대해 매우 활성이다. 따라서, 본 발명은 복합 N-글리칸을 포함하는 리소좀 단백질을 처리하는 방법으로서, 상기 방법이 샘플에 리소좀 단백질을 제공하고 샘플을 선태류 식물 HEXO, 바람직하게는, HEXO3, 효소와 접촉시켜 선태류 식물 HEXO 효소가 리소좀 단백질로부터 말단 GlcNAc 잔기를 절단하여, 포시만노스형 N-글리칸을 생성하는 것을 포함하는 시험관내 방법을 제공한다. 본질적으로, 선태류 식물에서 발견된 천연 리소좀 단백질 글리코실화 경로는 또한 선태류 식물 세포 밖에서 특히, 시험관 내에서 분리된 HEXO 효소로 수행될 수 있거나, 또 다른 세포에서, 바람직하게는, 식물 세포에서 그러한 식물을 선태류 식물 특히, 이끼 예컨대, p. 파텐스로부터의 활성 HEXO 효소로 치환함으로써 수행될 수 있다. 이러한 식물은 비-선태류 식물, 예를 들어, 고등 식물, 또는 선태류 식물이어서 상기 상세히 기술된 바와 같이 HEXO, 바람직하게는, HEXO3, 유전자 로드를 증가시킬 수 있다.

바람직하게는, 선태류 식물 또는 세포는 알파1,3-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제를 억제 또는 제거하였다. 이러한 식물 효소는 적어도 이들의 천연 활성 장소 예컨대, 골지에서 활성 또는 농도가 감소될 수 있다. 바람직하게는, 제거되는 효소는 WO 2004/057002에 기재된 바와 같은 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 베타-1,2-자일로실트랜스퍼라제이다. 따라서, 바람직한 구체예에 따르면, 상기 식물 세포는 추가로, 상기 식물의 유전자를 엔코딩하는 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 베타-1,2-자일로실트랜스퍼라제를 특히, 넉-아웃시킴으로써, 바람직하게는, 재조합에 의해 발현된 단백질 중 어느 하나의 유전자에 의해 특히 바람직하게는, 차단시킴으로써, 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 베타-1,2-자일로실트랜스퍼라제의 감소된 활성, 바람직하게는, 완전한 기능 손실을 갖는다. 이러한 조치는 인간과 같은 포유동물에서 면역원성일 수 있는 식물-유형 글리코실화의 형성을 방지한다.

또한, 이러한 방법을 수행하기에 적합한 선태류 식물 세포 또는 식물이 제공된다. 세포 또는 식물은 방법에 대해 기술된 바와 같은 리소좀 단백질을 엔코딩하는 전이유전자 및 선택적으로 상기 기술된 바와 같은 임의의 추가의 변형 또는 전이유전자를 포함한다.

본 발명은 본원에 기재된 임의의 제조 방법에 의해 수득가능한 리소좀 단백질 조성물을 추가로 제공한다. 리소좀 단백질은 상기 기술된 바와 같은 방법 또는 바람직한 변이 또는 구체예에 의해 수행된 바와 같은 임의의 특징을 가질 수 있다. 리소좀 단백질은 일반적으로 복수의 이러한 리소좀 단백질로 수득되며, 본 발명의 리소좀 글리코실화 패턴은 (유전자전이) 리소좀 단백질을 위한 선태류 식물에서 관찰된다.

특히, 본 발명은 글리코실화 패턴에 따라 잠재적으로 다양하게 글리코실화된 복수의 리소좀 단백질을 포함하는 리소좀 단백질 조성물로서, 상기 글리코실화 패턴이 적어도 45%, 바람직하게는, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 또는 적어도 70%의 포시만노스형 N-글리칸을 갖는, 리소좀 단백질 조성물을 제공한다.

본원에 제시된 모든 백분율 값은 다르게 나타낸 경우를 제외하고는 몰 백분율이다.

복수는 본 발명의 단백질의 제조물로서, 즉 개별화된 단백질이 아닌, 발현되는 경우 하나 초과의 리소좀 단백질을 포함하는 세포 또는 식물로부터 수득된 바와 같은 이러한 단백질의 거시적 제조물을 포함하는 단백질의 제조물에 관한 것이다. 제조물은 적어도 1000개 단백질 분자, 특히 바람직하게는, 적어도 100000개 분자 또는 적어도 1백만개 분자를 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에서 또는 이에 의해 생성된 또는 사용된 또는 조성물의 리소좀 단백질은 α-갈락토시다제, 바람직하게는, α-갈락토시다제 A (GLA); β-글루코세라미다제, β-글루코시다제 (글루코세레브로시다제); α-만노시다제; 아스파르틸글루코사미니다제; β-만노시다제; 산 세레미다제; α-푸코시다제; β-갈락토시다제, β-헥소사미니다제 활성인자 단백질; 갈락토세레브로시다제, 갈락토세라미다제; 리소좀 산 리파제 (LAL); α-아이두로니다제; 아이두로네이트-2-설파타제; 글루코사민-N-설파타제, 헤파란설파트설파미다제 (SGSH); α-N-아세틸-글루코사미니다제 (NAGLU); (헤파란) α-글루코사미니데-N-아세틸트랜스퍼라제; N-아세틸갈락토사민-6-설파타제; β-갈락토시다제; N-아세틸갈락토사민-4-설파타제; β-글루코로니다제; 뉴라미니다제; 스핑고마이엘리나제, 스핑고마이엘린 포스포디에스테라제; 산 알파-1,4-글루코시다제; β-헥소사미니다제, 또는 이의 α 서브유닛; 알파-N-아세틸갈락토사미니다제 (NAGA), α-갈락토사미니다제; β-헥소사미니다제 A; 갈락토스-6-설페이트 설파타제; 히알루로니다제로부터 선택된 임의의 것이다. 본 발명의 모든 구체예에서 특히 바람직한 것은 α-갈락토시다제이다. 바람직한 α-갈락토시다제는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열로부터 발현될 수 있는, 예를 들어, SEQ ID NO: 3의 인간 α-갈락토시다제, 또는 이로부터의 절두된 α-갈락토시다제이다. 또한, 글루코세레브로시다제 예를 들어, SEQ ID NO: 7의 핵산 서열로부터 발현될 수 있는, 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 인간 글루코세레브로시다제가 바람직하다. 또한, 알파-글루코시대, 예를 들어, SEQ ID NO: 9의 핵산 서열로부터 발현될 수 있는, 예를 들어, SEQ ID NO: 8의 인간 알파-글루코시대가 바람직하다. 또 다른 구체예에서, 글루코세레브로시다제 및 알파-글루코시대는 본 발명에 따른 리소좀 단백질의 군으로부터 배제된다.

바람직하게는, 리소좀 단백질은 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 하나 이상의 포시만노스형 N-글리칸을 갖는다:

(화학식 1)

여기에서, 사각형은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 나타내며, 원은 만노스(Man)을 나타내며, T가 있는 원은 말단 만노스를 나타낸다. 본원에서 또한 "MM" 글리칸으로서 언급된 이러한 화학식 1은 추가로 변형될 수 있는 코어 구조를 나타내며 - 포시만노스형 N-글리칸에서, T-만노스가 말단에 유지되는 한 즉, 당 사슬의 비-환원 말단에 존재하는 한 이러한 추가의 변형이 또한, 가능하다. 말단 만노스는 메틸화될 수 있으며, 특히, O-메틸화될 수 있다. 일반적인 변형은 GlcNAc 또는 Man 서브유닛 중 하나 이상이 α1,3-푸코실화될 수 있고/거나, α1,6- 푸코실화될 수 있고/거나 β1,2-자일로실화될 수 있는 것이다. α1,3-푸코실화 및 α1,6-푸코실화는 환원 GlcNAc에서 일반적으로 발견된다. β1,2-자일로실화는 일반적으로 비-말단 만노스 (화학식 1에서 T가 없는 원)에서 발견된다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는, α1,3-푸코실화 및/또는 β1,2-자일로실화는 상기 언급된 바와 같이 제조 동안 각 효소의 억제로 인해 예방 또는 감소된다. α1,6-푸코실화는 존재할 수 있거나 없다. 이는 식물에서는 흔하지 않지만, α1,6-푸코실트랜스퍼라제를 발현 세포 또는 식물 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 리소좀 단백질의 N-글리칸의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 화학식 1의 구조를 포함하거나 이로 구성된다 (몰%).

본 발명의 포시만노스형 N-글리칸 구조는 화학식 (2)로 또한 나타낼 수 있다:

(화학식 2)

화학식 2는 탄수화물 서브유닛 연결 유형을 추가로 보여준다. 오른쪽의 GlcNAc는 리소좀 단백질의 아미노산 서열에 결합된다. 올리고사카라이드의 환원 및 비-환원 말단은 통상적으로 환원-말단 모노사카라이드 잔기를 사용하여 우측으로 가장 멀리 그리고, 비-환원 말단을 사용하여 좌측으로 가장 멀리 당겨진다 (예를 들어, 화학식 2에서와 같이). 환원 GlcNAc는 예컨대, -GlcNAc₂-Man₃와 같이 본원에 제시된 짧은 화학식에서는 왼쪽에 나타냄을 주의하라. N-글리칸에서, 환원-GlcNAc는 리소좀 단백질의 아미노산 사슬의 아스파라긴에 결합된다. 이는 Asn 잔기로의 결합인 왼쪽 "-"에 의해 나타낸다. 포시만노스형 글리코형태에서, 2개의 비-환원 만노스 말단이 존재한다 (화학식 2에서 왼쪽, 화학식 1에서 위).

화학식 (2)는 고-만노스 및 복합 N-글리칸을 포함하는 대부분의 N-글리칸의 공동 코어이다 (문헌 [Rayon et al., J Exp. Botany, 1998, 49(326): 1463-1472] 참조). 포시만노스형 구조의 경우, 화학식 (2)에 도시된 바와 같은 왼쪽의 위 및 아래 둘 모두의 Man이 말단인 반면, 고 만노스 및 복합 N-글리칸의 경우, 적어도 하나의 Man은 또 다른 Man 또는 GlcNAc로의 추가의 결합을 함유한다. 이러한 코어의 α1,3-푸코실화, α1,6-푸코실화 및/또는 β1,2-자일로실화는 선택적이다. 각 효소가 억제되지 않는다면 α1,3-푸코실화 및 β1,2-자일로실화는 식물에서 일반적이다 (예를 들어, WO 2004/057002 또는 문헌 [Cox et al., Nature Biotech-nology 24(12), 2006:1591-7]에 나타낸 바와 같음).

발현된 리소좀 단백질이 소정량의 MGn 글리칸 (화학식 2에 도시된 바와 같이 하나의 말단 Man에서 하나의 추가의 말단 N-아세틸글루코사민) 또는 GG 글리칸 (화학식 2에 도시된 바와 같이 각 말단 Man에서 하나의 추가의 말단 N-아세틸글루코사민)을 갖는 경우, 이들 MGn 및 GG 글리칸은 베타-N-아세틸글루코사미니다제로의 처리에 의해 화학식 1 또는 2의 구조로 전환될 수 있다. 베타-N-아세틸글루코사미니다제 처리가 임의의 이끼 생산 리소좀 단백질에 수행되어 포시만노스형 글리칸을 증가시킬 수 있다. 이끼 발현 α-갈락토시다제 A는 일반적으로 베타-N-아세틸글루코사미니다제가 필요하지 않는데, 왜냐하면 포시만노스형 글리칸이 자연적으로 고농도로 존재하기 때문이다. 배양 조건에 따라, 이끼 생산 글루코세레브로시다제 및 알파-글루코시다제는 때때로 베타-N-아세틸글루코사미니다제 처리가 필요할 수 있다. 본 발명의 글리코실화된 리소좀 단백질을 생성하는 다른 방법은 곤충 또는 곤충 세포, 예컨대, Sf9 세포에서의 발현, 글리코 조작된 효모 세포에서의 발현 및 액포 표적 신호를 갖는 (비록 신호가 포유동물 환자에서 면역원성이 될 수 있기 때문에 덜 바람직하지만) 이끼에서의 발현을 포함한다. 본원에서 "이끼 생산" 또는 "선태류 식물 생산" 리소좀 단백질의 임의의 설명은 실제 제조 방법과 무관하게, 이끼에서의 생산에 의해 수득 가능한 생성물, 즉 본원에 기술된 바와 같이 많은 양의 본 발명의 포시만노스형 N-글리칸을 갖는 생성물에 관한 것이다. 본 발명의 생성물을 생성하기 위해 임의의 제조 방법이 선택될 수 있으며, "이끼 생산" 또는 "선태류 식물 생산"은 또한 비-이끼 생산 방법에서의 이러한 생성물을 나타낸다. "이끼 생산" 또는 "선태류 식물 생산"은 이끼에서 발견된 고유의 글리코실화 패턴을 표현하기 위해 사용되며, 본원에서 특히 예를 들어, 물질 청구항 및 본원의 이러한 물질의 설명에서 정의된다.

본 발명의 방법에 따른 리소좀 단백질의 선태류 식물 N-글리코실화의 고유의 특징은 본 발명의 N-글리칸에서 메틸화된 헥소스(Hex), 바람직하게는, 메틸화된 만노스(Man)의 존재이다. 이들 메틸화된 만노스는 말단인 경우, 본 발명의 리소좀 단백질의 흡수를 간섭하지 않으며, 심지어 이를 향상시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 글리코실화 패턴은 화학식 GlcNAc₂-Hex₂-메틸-Hex의 N-글리칸을 적어도 1%, 더욱 바람직하게는, 적어도 2%, 적어도 3%, 또는 적어도 4% 가지며, Hex는 바람직하게는 만노스이다 (몰%). 본 발명의 방법에 따르면, 메틸화는 일반적으로 만노스의 산소의 메틸화, 특히 2-O-메틸화이다. 이들은 본 발명의 조성물의 리소좀 단백질의 바람직한 메틸화이다. 바람직하게는, 조성물의 N-글리칸의 적어도 1%, 더욱 바람직하게는, 적어도 2%, 적어도 3%, 또는 적어도 4%는 메틸화, 특히 O- 예를 들어, 2-O-메틸화를 갖는다 (몰%). 바람직하게는, 이러한 메틸화된 N-글리칸에서, 적어도 2개의 말단 (비-환원) 만노스 중 단지 하나만 메틸화된다.

바람직하게는, 글리코실화 패턴은 하기 N-글리칸을 포함한다:

i) 0% 내지 35%, 바람직하게는, 0.5% 내지 30%, -GlcNAc₂-(Man₂메틸-Hex);

ii) 30% 내지 80%, 바람직하게는, 40% 내지 70%, 특히 바람직하게는, 45% 내지 60%, -GlcNAc₂-Man₃;

iii) 0% 내지 30%, 바람직하게는, 4% 내지 22%, -GlcNAc₂-Man₃-GlcNAc;

iv) 0% 내지 15%, 바람직하게는, 2% 내지 12%, -GlcNAc₂-Man₃-GlcNAc₂;

iv) 0% 내지 5%, 바람직하게는, 0% 내지 3%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₂;

vi) 0% 내지 11%, 바람직하게는, 1% 내지 8%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₃;

vii) 0% 내지 10%, 바람직하게는, 1% 내지 7%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₄;

viii) 0% 내지 10%, 바람직하게는, 1% 내지 7%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₅;

여기에서, 이들 화합물 모두는 함께 100% 또는 100% 미만에 이르며, 이는 자명하다 (모든%는 몰%임). 100% 미만이 가능한데, 상기 목록에 명시되지 않은 다른 N-글리칸이 존재할 수 있기 때문이다. 이러한 다른 N-글리칸은 0% 내지 30%, 바람직하게는, 0.01% 내지 20%, 특히 바람직하게는, 0.1% 내지 10%일 수 있다. 명시된 N-글리칸 i) 내지 viii) 중 어느 하나는 0% 대신 적어도 0.01%의 양으로 존재할 수 있다. GlcNAc는 N-아세틸글루코사민 서브유닛이고, Man은 만노스 서브유닛이고, Hex는 헥소스 서브유닛이고, 메틸-Hex는 메틸화된 헥소스 서브 유닛, 바람직하게는, 2-O 메틸 헥소스이다. 이러한 글리코실화 패턴에서, -GlcNAc₂- (Man₂메틸-Hex) 및 -GlcNAc₂-Man₃은 함께 적어도 45% (몰%)에 이르며, 즉 이들은 본 발명의 개요에서 언급된 바와 같이 이러한 양에 기여하는 포시만노스형 N-글리칸이다. 특히 바람직한 Hex는 상기 N-글리칸 i) 내지 viii) 중 어느 하나의 Man이다. 글리칸의 환원 말단의 GlcNAc는 상기 N-글리칸 i) 내지 viii) 중 어느 하나에서 푸코실화되거나 푸코실화되지 않을 수 있다. 분지점에서 Man은 상기 N-글리칸 i) 내지 viii) 중 어느 하나에서 자일로실화되거나 자일로실화되지 않는다.

특히 바람직한 구체예에서, 상기 i) 내지 viii)에 기록된 모든 N-글리칸은 상기 단락에서 주어진 바와 같이 바람직한 양으로 존재한다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 i) 즉, -GlcNAc₂-(Man₂메틸 -Hex)를 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 2% 또는 적어도 3%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 30%, 최대 25%, 최대 20% 또는 최대 15%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.5% 내지 30%, 1% 내지 25% 또는 2% 내지 20%의 범위일 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 ii) 즉, -GlcNAc₂-Man₃를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 80%, 최대 75%, 최대 70% 또는 최대 65%의 양으로 존재한다. 이의 양은 30% 내지 80%, 40% 내지 70% 또는 45% 내지 60%의 범위일 수 있다. 이는 본 발명에 따른 가장 중요한 N-글리칸이며, 본 발명의 임의의 구체예에서 이러한 양으로 존재할 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 iii) 즉, -GlcNAc₂-Man₃-GlcNAc를 적어도 0.5%, 적어도 2%, 적어도 4% 또는 적어도 6%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 30%, 최대 25%, 최대 20% 또는 최대 15%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.5% 내지 30%, 1% 내지 25% 또는 2% 내지 20%의 범위일 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 iv) 즉, -GlcNAc₂-Man₃-GlcNAc₂를 적어도 0.2%, 적어도 0.5%, 적어도 1% 또는 적어도 2%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 20%, 최대 15%, 최대 12% 또는 최대 10%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.5% 내지 15%, 1% 내지 12.5% 또는 2% 내지 10%의 범위일 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 v) 즉, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₂를 적어도 0.01%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1% 또는 적어도 0.5%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 5%, 최대 4%, 최대 3% 또는 최대 2%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.1% 내지 5%, 0.2% 내지 4% 또는 0.5% 내지 3%의 범위일 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 vi) 즉, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₃를 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.75% 또는 적어도 1%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 11%, 최대 10%, 최대 8% 또는 최대 6%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.5% 내지 11%, 1% 내지 10% 또는 2% 내지 9%의 범위일 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 vii) 즉, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₄를 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3% 또는 적어도 0.4%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 10%, 최대 8%, 최대 6.5% 또는 최대 5%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.1% 내지 10%, 0.2% 내지 8.5% 또는 0.3% 내지 7%의 범위일 수 있다.

또한 바람직하게는, 글리코실화 패턴은 N-글리칸 viii) 즉, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₅를 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3% 또는 적어도 0.4%의 양으로 포함한다. 특히 바람직하게는, 이는 최대 10%, 최대 8%, 최대 6.5% 또는 최대 5%의 양으로 존재한다. 이의 양은 0.1% 내지 10%, 0.2% 내지 8.5% 또는 0.3% 내지 7%의 범위일 수 있다.

본 발명의 리소좀 단백질은 임의의 공급원, 바람직하게는, 포유동물, 특히 인간 또는 인간외 동물 예컨대, 설치류, 개, 고양이, 말, 소, 낙타, 돼지일 수 있다.

본 발명의 선태류 식물 생산 리소좀 단백질을 포함하는 식물 생산 당단백질은 일반적으로 만노스 포스포릴화되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른, N-글리칸은 비-만노스 포스포릴화될 수 있으며, 특히 전혀 포스포릴화되지 않을 수 있다. 포스포릴화는 포스포릴화 효소를 발현 세포 내로 도입시킴으로써 또는 세포로부터 단백질의 분리후 포스포릴화에 의해 인위적으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 리소좀 단백질 조성물은 포스포릴화되지 않거나 포스포릴화된 리소좀 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 조성물의 리소좀 단백질의 포스포릴화된 N-글리칸의 양은 20% 미만, 특히 바람직하게는, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 또는 심지어 0.5% 미만, 예를 들어, 0%이다 (몰%).

본 발명의 리소좀 단백질은 페길화되거나 페길화되지 않을 수 있다. 페길화는 환자에 투여될 경우 용해도, 생체이용율 및 생체내 반감기를 변형시킬 수 있다. 본 발명의 포시만노스형 글리코실화된 리소좀 단백질의 반감기가 포유동물 생산 리소좀 단백질과 비교하여 더 작은 N-글리칸 구조로 인해 감소되는 것을 고려할 경우, 페길화는 이러한 단점을 보완하기 위해 특히 선호된다. 특히 바람직한 것은 가역성 페길화이며, 이는 예를 들어, 세포 흡수를 간섭하지 않도록 Schiff 염기와 같은 가수분해 가능한 결합을 도입함으로써 생체내에서 페길화의 적어도 부분적 손실을 유도한다. 또한, 세포 흡수 간섭을 감소시키기 위한 수단으로서, 페길화는 짧은 PEG 사슬, 예컨대, 4 내지 1000개, 바람직하게는, 8 내지 100개 또는 10 내지 50개 서브유닛을 갖는 PEG일 수 있다. PEG 대신에, 바람직하게는, 100 kDa 미만, 10 kDa 미만 또는 1 kDa 미만의 분자량을 갖는 임의의 짧은 친수성 폴리머가 반감기를 증가시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, PEG는 2-200개, 바람직하게는, 3 내지 100개 또는 4 내지 50개 글리콜 서브유닛을 갖는다. 리소좀 단백질(lysosomatic protein)은 PEG 단백질의 간접 부착을 위한 수단으로서 연결 모이어티를 통해 페길화될 수 있다. 대안적으로, 또한 직접 부착도 가능하다.

바람직하게는, 본 발명의 리소좀 단백질은 가교되지 않는다. 가교는 세포 흡수 및 안정성을 간섭할 수 있으며 덜 바람직하다. 바람직하게는, 가교는 페길화와 조합된다. 예를 들어, PEG는 특히, 단백질로의 결합을 위해 적어도 2개의 작용기를 갖는 바이- 또는 다중-작용성 PEG 예컨대, 비스-COOH-PEG 또는 비스-NHS-PEG의 경우에 가교제로서 사용될 수 있다. 페길화는 세포 흡수 및 안정성의 방해를 초래하는 가교의 부정적인 측면을 감출 수 있다.

가교는 예를 들어, WO 2011/107990 (본원에 참조로 통합됨)에서 알파-갈락토시다제에 대해 기술된 바와 같이 멀티머 리소좀 단백질, 특히 바람직하게는, 다이머 리소좀 단백질의 형성을 유도할 수 있다. 가교된 단백질에서, 적어도 2개의 리소좀 단백질은 직접적으로 또는 연결 모이어티를 통해 간접적으로 연결된다.

가교 및/또는 페길화는 연결 모이어티에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 연결 모이어티는 선택적으로, 리소좀 단백질 모노머의 측쇄, N-말단 또는 C-말단, 또는 번역 후 변형과 관련된 모이어티 (예를 들어, 사카라이드 모이어티)뿐만 아니라, 또 다른 리소좀 단백질 모노머의 측쇄, N-말단 또는 C-말단, 또는 번역 후 변형과 관련된 모이어티 (예를 들어, 사카라이드 모이어티)에 공유적으로 부착된 모이어티이다. 예시적인 이러한 연결 모이어티는 하기에 상세히 기술된다.

대안적으로, 연결 모이어티는 연결되는 리소좀 단백질 모노머의 일부 (예를 들어, 리소좀 단백질 모노머의 측쇄, N-말단 또는 C-말단, 또는 번역 후 변형과 관련된 모이어티 (예를 들어, 사카라이드 모이어티)뿐만 아니라 또 다른 리소좀 단백질 모노머의 측쇄, N-말단 또는 C-말단, 또는 번역 후 변형과 관련된 모이어티 (예를 들어, 사카라이드 모이어티)의 일부)를 형성한다. 따라서, 예를 들어, 연결 모이어티는 모노머 (예를 들어, 아민)의 측쇄, N-말단, C-말단 또는 번역 후 변형과 관련된 모이어티의 작용기와 또 다른 모노머 (예를 들어, 카르복실)의 측쇄, N-말단, C-말단 또는 번역 후 변형된 관련된 모이어티의 상보적 작용기 사이의 공유 결합 (예를 들어, 아미드 결합)일 수 있으며, 이때 이러한 공유 결합은 천연 형태의 α-갈락토시다제에는 부재한다. 다른 공유 결합, 예컨대, 예를 들어, 에스테르 결합 (하이드록시 기와 카르복실 사이); 티오에스테르 결합; 에테르 결합 (2개의 하이드록시 기 사이); 티오에테르 결합; 안하이드라이드 결합 (2개의 카르복실 사이); 티오아미드 결합; 카르바메이트 또는 티오카르바메이트 결합이 또한 고려된다. 선택적으로, 연결 모이어티는 디설파이드 결합이 없다. 그러나, 모노머 간의 연결을 형성하지 않는 위치에서 디설피드 결합을 포함하는 연결 모이어티 (예를 들어, 디설피드 결합의 절단은 모노머 간의 연결을 절단하지 않음)는 본 발명의 이러한 구체예의 범위내에 있다. 디설파이드 결합이 없는 연결 모이어티의 잠재적 이점은 디설파이드 결합처럼 온화한 환원 조건에 의해 절단에 민감하지 않다는 점이다. 선택적으로, 연결 모이어티는 비-펩티드 모이어티이다 (예를 들어, 연결 모이어티는 아미드 결합, 아미노산, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드로 구성되지 않는다). 대안적으로, 연결 모이어티는 펩티드 모이어티 (예를 들어, 아미노산, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 선택적으로, 연결 모이어티는 단지 여기에 부착된 임의의 리소좀 단백질 모노머의 선형 연장부가 아니다 (즉, 펩티드 모이어티의 N-말단 및 C-말단은 임의의 리소좀 단백질 모노머의 C-말단 또는 N-말단에 직접 부착되지 않는다). 대안적으로, 연결 모이어티는 융합된 폴리펩티드를 생성하도록, 리소좀 단백질 모노머의 N-말단과 또 다른 리소좀 단백질 모노머의 C-말단의 직접 공유 결합에 의해 형성된다. 이러한 폴리펩티드는 천연 형태의 α-갈락토시다제가 아닐 것이며, 그러나, 이는 본질적으로 이들의 천연 형태의 2개의 리소좀 단백질 모노머를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 α-갈락토시다제 모노머의 공유 결합은 바람직하게는, C-말단으로의 N-말단의 직접 연결 이외의 형태로 존재한다. 연결 모이어티는 바람직하게는, 10 내지 1000 Da, 바람직하게는, 20 내지 500 Da의 작은 모이어티이다.

가교 및/또는 페길화에서, 연결 모이어티는 리소좀 단백질로의 결합을 위한 하나 이상의 반응기를 포함할 수 있다. 이러한 반응기는 예를 들어, 티올 기와 반응하거나 아민 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "반응기"는 전형적으로 결합 형성으로 이어지는 화학 반응을 일으킬 수 있는 화학기를 기술한다. 본 구체예에 따른 결합은 바람직하게는, (예를 들어, 반응기 각각에 대한) 공유 결합이다. 결합 형성으로 이어지는 화학 반응은 예를 들어, 친핵성 및 친전자성 치환, 친핵성 및 친전자성 첨가 반응, 알킬화, 첨가-제거 반응, 고리화 첨가 반응, 재배열 반응 및 작용기와 관련된 임의의 기타 공지된 유기 반응, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 반응기는, 예를 들어, 본원에 기재된 연결 모이어티 (예를 들어, 폴리(알킬렌 글리콜) 또는 이의 유사체)에 반응기의 반응 부분을 부착시키는 역할을 할 수 있는 비-반응성 부분 (예를 들어, 알킬)을 선택적으로 포함할 수 있다. 반응기는 바람직하게는, 리소좀 단백질로의 이의 컨쥬게이션을 가능하게 하도록 선택된다. 예시적인 반응기는 비제한적으로, 카르복실레이트 (예를 들어, -CO₂H), 티올 (-SH), 아민 (-NH₂), 할로, 아지드 (-N₃), 이소시아네이트 (-NCO), 이소티오시아네이트 (-N=C=S), 하이드록시 (-OH), 카르보닐 (예를 들어, 알데하이드), 말레이미드, 설페이트, 포스페이트, 설포닐 (예를 들어, 메실, 토실), 등등, 뿐만 아니라, 활성화된 기 예컨대, N-하이드록시석신이미드 (NHS) (예를 들어, NHS 에스테르), 설포-N-하이드록시석신이미드, 안하이드라이드, 아실 할라이드 (-C(=O)-할로겐) 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 반응기는 이탈기 예컨대, 친핵성 치환에 민감한 이탈기 (예를 들어, 할로, 설페이트, 포스페이트, 카르복실레이트, N-하이드록시석신이미드)를 포함한다.

본 발명은 또한 의약으로서 본 발명의 리소좀 단백질 또는 조성물을 제공한다. 환자 예를 들어, 포유동물에 리소좀 단백질 조성물을 투여하는 것을 포함하는 리소좀 축적병을 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 이와 관련하여, 본 발명은 리소좀 축적병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 리소좀 단백질을 제공한다. 환자는 포유동물, 특히, 인간 또는 인간외 동물, 예컨대, 설치류, 개, 고양이, 말, 소, 낙타, 돼지일 수 있다. 바람직하게는, 리소좀 단백질은 단백질 아미노산 사슬에 대한 면역반응을 방지하기 위해 환자와 동일한 종으로부터 비롯된다.

바람직하게는, 질병 및 리소좀 단백질이 하기 표로부터 선택된다:

투여 용량은 바람직하게는, 0.05 내지 100 mg/체중 kg, 바람직하게는, 0.1 내지 50 mg/체중 kg, 특히 바람직하게는, 0.3 내지 10 mg/체중 kg, 예컨대, 0.3, 1 또는 3 mg/체중 kg의 용량이다.

리소좀 축적병에 대한 완치가 없기 때문에, 정기적으로 효소 대체물을 반복 투여하는 만성 치료가 필요하다. 바람직하게는, 본 발명의 리소좀 단백질은 1 내지 30일, 바람직하게는, 2 내지 25일, 더욱 바람직하게는, 3 내지 23일, 또는 심지어 4 내지 22일, 5 내지 21일, 6 내지 20일, 7 내지 19일, 8 내지 18일, 9 내지 17일, 10 내지 16일 또는 11 내지 15일의 간격을 두고 투여된다. 특히, 14일 간격이 바람직하다. 이러한 간격의 투여는 세포에서 리소좀의 일정한 효소 활성을 허용하여, 단백질 제거에 대항한다.

리소좀 단백질은 기능성 효소를 유도하여 혈관계 특히, 혈류에 도달하게 하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 정맥내 (i.v.) 주입이 바람직하다. 추가의 투여 경로는 복강내 (i.p.), 근육내 (i.m.) 및 피하 (s.c.) 투여를 포함한다. i.p., i.m. 및 s.c. 투여 경로는 표적 조직 (예컨대, 심장, 신장, 간 및 비장)에서 리소좀 단백질의 감소된 분포를 초래할 수 있으며, 더욱 충분한 양이 이러한 경로를 통해 이러한 조직으로 투여될 수 있다. 이러한 비 i.v. 경로 특히, i.p., i.m. 및 s.c.는 더욱 우수한 환자 수용성으로 인한 이점이 있으며, 일반적으로 이러한 이점은 감소된 표적 조직 분포를 능가한다. 게다가, 비-i.v. 투여의 약동학적 프로파일이 유익한데, 치료학적 효소가 연장된 기간에 결쳐 환자 혈장에서 이용가능하기 때문이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 리소좀 단백질 (선태류 식물 생산)로의 본 발명의 의학적 치료는 동일한 유형 및 정성적 효소 활성을 가지나, 비-식물, 특히 포유동물 또는 진균류 세포에서 생성되는 리소좀 단백질과 조합된다. 비-식물 생산 리소좀 단백질은 만노스-6-포스페이트 수용체 (M6PR) 인식 및 세포 흡수를 위한 포스포릴화된 만노스를 가질 수 있다. 또한, 임의의 공급원의 (인위적으로) 포스포릴화된 만노스를 갖는 리소좀 단백질은 본 발명의 리소좀 단백질과 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 포스포릴화된 또는 비-선태류 식물 리소좀 단백질 예컨대, 파브리병의 치료에 적합한 알파-갈락토시다제의 경우에 아갈시다제 알파(Agalsidase alfa) (Replagal®) 및 아갈시다제 베타 (Fabrazyme®); 고쉐병의 치료에 적합한 β-글루코세레브로시다제로서의 알글루세라제(Alglucerase) (Ceredase®), 이미글루세라제(Imiglucerase), 벨라글루세라제 알파(Velaglucerase alfa) (VPRIV); 폼페병의 치료에 적합한 알글루코시다제 알파(Alglucosidase alfa) (Myozyme®); 헌터 증후군(MPS-II)의 치료에 적합한 리소좀 효소 아이두로네이트-2-설파타제인 아이두르설파제(Idursulfase) (Elaprase®)가 이미 사용되고 있다. 다른 식물 생산 리소좀 단백질 예컨대, 탈리글루세라제 알파(Taliglucerase alfa) (Elelyso®) 즉, 글루코세레브로시다제와 조합하여 사용하는 것이 또한 가능하다. 포스포릴화된 및/또는 비-선태류 식물 리소좀 단백질은 포시만노스형 리소좀 단백질과 가교될 수 있다. 가교된 디- 또는 멀티머는 바람직하게는, 추가로 페길화된다. 이는 안정성, 반감기 및 흡수를 향상시킨다.

포시만노스형 글리코실화를 갖는 본 발명의 리소좀 단백질은 또한 샤페론 특히, 동일한 유형 및 정성적 효소 활성의 리소좀 단백질의 특이적 또는 비-특이적 샤페론과 조합될 수 있다. 리소좀 단백질의 약물학적 샤페론은 예를 들어, 1-데옥시갈락토노지리마이신 (미갈리스타트(Migalastat))이다. 샤페론은 리소좀 축적병에서 기능장애 내인성 리소좀 단백질의 일부 활성을 재확립하도록 변형될 수 있다. 내인성 리소좀 단백질은 포스포릴화된 리소좀 단백질일 수 있으며 일반적으로, 포스포릴화된 리소좀 단백질이며, 포스포릴화된 또는 비-선태류 식물 단백질의 투여를 위한 조합 요법에 대해 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 포시만노스형 리소좀 단백질의 수용체 상호작용을 보완할 수 있다. 특정 요법에 제한되지 않으면서, 샤페론은 돌연변이로 인해 손상된 활성을 가져 리소좀 축적병을 초래하는 리소좀 단백질의 효소 활성을 복구하거나 증가시킬 수 있는 것으로 보인다. 특히 바람직하게는, 미갈라스타트는 본 발명의 포시만노스형 또는 선태류 식물 생산 알파-갈락토시다제와 조합되어 사용되고/거나 파브리병의 치료에 사용된다.

포스포릴화된 또는 비-선태류 식물 리소좀 효소와의 조합물 특히, 포스포릴화로 인해 M6PR를 인식하는 것들은 본 발명의 효소의 흡수 활성을 보완하며, 이는 증가된 효율 및 더욱 광범위한 치료 적용 범위를 갖는 모든 치료학적 관련 세포에 도달되게 한다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시되며, 본 발명의 이들 구체예에 제한되지 않는다. 실시예의 임의의 요소는 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 개념과 조합될 수 있다.

도면:
도 1: 리소좀 단백질 발현을 위한 선형화된 발현 카세트 (단백질 서열: GLA) 발현
도 2: α-gal A (실버-염색된 SDS-PAGE)의 전형적인 정제의 중간 및 최종 결과
도 3: 배양 상청액으로부터 글루코세레브로시다제의 정제 (쿠마시에-염색된 SDS-PAGE)
도 4: 배양 상청액으로부터 알파-글루코시다제의 정제. ConA-크로마토그래피로부터의 농축된 용출물의 쿠마시에-염색된 SDS-PAGE. A) 이끼-GAA 용출물 대 알글루코시다제 알파 (Myozyme). B) 이끼-GAA 용출물 대 분자량 표준.
도 5: 효소의 시험관내 특징 분석. (a) SDS-PAGE에서 분리되고 쿠마시에 블루로 염색된 효소 제조물. 레인 1 및 2는 각각 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파이다. 레인 3 및 4는 PNG아제 F로 분해된 이끼 aGal 및 아갈시다제 알파이다. 화살표, 분해 후 α-gal A 효소; 화살촉, PNG아제 F (36 KDa). 단백질 표준 및 분자량은 왼쪽에 나타낸다. (b) 인간 α-gal A에 특이적인 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 검출된 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파 (각 1ng). 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터가 표시되었다. (c) 인공 기질 4-MU-α-D-갈락토피라노시드를 사용하여 결정된 효소 제조물의 특이적 α-gal A 활성. 단백질 농도는 BCA 검정에 의해 측정하였다. (d) 완충된 인간 혈장에서 희석되고 37℃에서 가열된 효소의 안정성 (데이터는 3중의 평균임). 고-mann: 고-만노스 aGal; 이끼-aGal: 이끼로부터의 α-갈락토시다제; Agal-알파: 아갈시다제 알파; Agal-베타: 아갈시다제 베타.
도 6: 시험관내 흡수 연구. (a) 5 mM M6P 또는 2 mg/ml 효모 만난의 존재 또는 부재하에 다양한 효소와 밤새 인큐베이션한 후 파브리 환자의 섬유아세포 (DMN96.125)의 세포내 α-gal A 활성. (b) Gb₃ 면역형광 염색은 비처리된 파브리 환자의 섬유아세포 (위)에서 Gb₃의 대량의 리소좀 축적을 보여주며 이끼-aGal로 처리된 세포 (아래)에서 현저하게 감소된 Gb₃를 보여준다. (c 및 d) 파브리 환자의 섬유아세포 및 미세혈관 내피 세포 IMFE1에서 MR 발현. 웨스턴 블롯 (c) 및 면역형광 염색 (d) 둘 모두에 의해 결정하여 IMFE1 세포는 MR-양성인 반면, 섬유아세포는 MR-음성이다. (e) 5 mM M6P 또는 2 mg/ml 효모 만난의 존재 또는 부재하에 다양한 효소와 밤새 인큐베이션한 후 IMFE1 세포의 세포내 α-gal A 활성. (f) IMFE1 세포에서 다양한 효소의 흡수율. 세포를 지시된 시점에서 채취하고 세포내 활성을 측정하였다. ***P < 0.001, 이끼-aGal vs. 고-mann aGal 또는 아갈시다제 알파. (g) 다양한 효소 제조물과 3시간 인큐베이션 후 IMFE1 세포에서 내재화된 α-gal A의 웨스턴 블롯 분석. (h) IMFE1 세포로의 다양한 효소의 결합. 4℃에서 3시간 인큐베이션 후, 세포 표면-결합된 효소를 효소 검정에 의해 측정하였다. 점선은 이러한 검정에서 모의-처리 IMFE1 세포의 활성 수준 (즉, 배경 수준)을 나타낸다. *P < 0.05, ***P < 0.001. 그래프의 데이터 모두는 평균 ± SEM (n = 3-4)로서 제시된다.
도 7: 혈장 약물동태. (a) 효소 활성에 의해 분석된, 주입된 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 혈장 청소. (b) 주입 후 10분째에 혈장 중의 α-gal A에 대한 웨스턴 블롯. (c) 주입 후 5 및 10분째에서 혈장 중 α-gal A 단백질 양; 웨스턴 블롯 밴드 강도를 농도 측정법으로 분석하였다. (d) 주입 후 10분째에 혈장 중 α-gal A 단백질의 양과 효소 활성의 상관관계. (a) 및 (c)의 데이터는 평균 ± SEM (n = 4-5)로서 제시된다. *P < 0.05, **P < 0.01.
도 8: 주입된 효소의 조직 분포. 효소 제조물을 파브리 마우스에 주입하고, 신장, 심장, 비장 및 간에서 α-gal A 활성을 주입 후 2시간째에 측정하였다. (a) 기관에서 특이적 활동. 데이터는 평균 ± SEM (n = 5)로서 제시된다. *P < 0.05, **P < 0.01. (b) 전체 기관에서 활성을 계산하고 데이터는 4개 기관에서 회수된 전체 활성의 %로 제시된다. (c) 웨스턴 블롯에 의해 검출된 신장 균질물 중의 α-gal A 단백질. 화살표, 이끼-aGal-주입 마우스에서 특정 α-gal A 밴드. 아갈시다제 알파-주입된 마우스에서 검출가능한 특정 밴드가 관찰되지 않았다. 화살촉, 아갈시다제 알파 밴드가 이동할 수 있는 대략적인 위치 (도 2b, 4b에 나타낸 결과에 근거함).
도 9: 주입된 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 세포 국소화. 심장 및 신장에서 주입된 효소의 세포 분포를 면역조직화학에 의해 결정하였다 (n = 2). 대표적 사진이 도시된다. (a) 심장. 별표는 면역염색 양성 세포 (가장 가능성이 있는 내피 세포)를 갖는 혈관을 나타내며, 화살표는 양성 혈관주위 세포 (아마도 마크로파지)를 나타낸다. (b) 신장. 화살표는 면역염색 양성 관 상피 세포를 나타낸다. 척도 막대: 25 μm. 원본 배율: 400x.
도 10: 주입된 효소의 조직 동태. 효소 제조물을 파브리 마우스에 주입하고, 신장 (a) , 심장 (b), 비장 (c) 및 간 (d)에서 α-gal A 활성을 주입 후 2, 24, 48 및 96시간째에 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 4-5)로서 제시된다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 11: 조직에서 축적된 Gb₃을 제거하는데 있어서 이끼-aGal의 효능. 신장 (a), 심장 (b) 및 간 (c)에서 Gb₃ 함량을 다양한 용량의 이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파 중 어느 하나의 단일 주입 후 7일째에 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 4-5)로서 제시된다. *P < 0.05, ***P < 0.001. 각 아갈시다제 알파-주입된 군의 상단에 도시된 통계적 유의성은 아갈시다제 알파와 동일한 용량의 이끼-aGal 간의 차이를 나타낸다.
도 12-14: i.p. (도 12), i.m. (도 13) 및 s.c. (도 14) 투여에 있어서 혈장 및 조직 활성.

실시예 :

실시예 1: 이끼에서 인간 알파- 갈락토시다제의 생성

실시예 1.1: 발현 균주 작제

천연 신호 서열 (SEQ ID NO: 3) 없이 알파-갈락토시다제 A (α-gal A)를 코딩하는 인간 GLA 유전자 (NCBI 기준 서열: NM_000169.2)의 DNA 서열을 코돈-최적화된 버젼 (SEQ ID NO: 4)으로서 합성하고, GeneArt/Thermo Fisher Scientific (GENEART AG, Regensburg, Germany)에 의해 이끼 발현 벡터로 서브-클로닝하였다. α-gal A 발현 작제물 및 네오마이신-내성 부여 유전자 (npt II) 작제물을 보유하는 서열을 제한 효소를 사용하여 플라스미드로부터 선형 발현 카세트 (도 1)로서 절제하였다.

안정한 α-gal A-생성 이끼 세포주를 생산하기 위해, N-글리칸에 식물 특이적 α-1,3-푸코스 및 β-1,2-자일로스 잔기가 없는 이끼 이중-넉아웃 라인의 원형질체 (Koprivova et al. (2004) Plant Biotechnol. J. 2, 517-523; Weise et al. (2007) Plant Biotechnol. J. 5(3), 389-401; WO 2004/057002)를 PEG-기반 형질전환 절차에서 정제된 발현 카세트로 형질전환시켰다 (Strepp et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 4368). 형질전환된 이끼 세포를 재생성시키고, 항생제 G418에 대한 내성에 대해 선택하였다. 2000개 내성 이끼 소식물체를 바이오매스 당 총 α-gal A 축적에 대해 2회 연속 스크리닝하였으며, 최상의 균주가 표준 생산 균주가 되었다.

선형화된 발현 카세트는 하기 유전자 요소를 포함한다: 피스코미트렐라(Physcomitrella) 액틴 프로모터 (P 액틴) 및 5’ UTR, 식물 신호 펩티드 (SP), 천연 신호 서열이 없은 인간 α-gal의 cDNA 서열 (GLA), 피스코미트렐라 투불린 3' UTR, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (P 35S), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (nptII) 및 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 터미네이터 (T 35S) (도 1). 식물 신호 펩티드는 서열 MAFYKISSVFFIFCFFLIALPFHSYA (SEQ ID NO: 5)를 함유하였다.

발현 균주는 이끼 유래된 조절 요소의 유전자 조절하에 이끼 식물의 게놈으로 안정하게 통합된 aGal-전이유전자를 갖는 완전하게 재생성된 이끼 식물이다.

실시예 1.2: 효소 생산:

α-gal A 생산 균주를 Wave™ Reactor Rocker (BioWave 20 SPS, Wave Biotech AG, Switzerland)에 위치한 20L 일회용 백 (Cellbag 20, GE Healthcare, Germany)에 4주 (27d) 동안 배양하였다. 배양 파라미터는 다음과 같다: 25-30rpm 요동율, 8° 각도, SM07-배지 (100mM NaCl, 6.6mM KCL, 2.0mM MgSO₄ x 7H₂O, 1.8mM KH₂PO₄, 20.4mM Ca(NO₃)₂ x 4H₂O, 0.05mM FeNa-EDTA, 4.9mM MES, 0.1% (w/v) PEG4000, 100.26μM H₃BO₃, 0.11μM CoCl₂ x 6H₂O, 0.1μM CuSO₄ x 5H₂O, 5μM KI, 85.39μM MnCl₂ x 4H₂O, 1.03μM Na₂MoO₄ x 2H₂O, 0.11mM NiCl₂ x 6H₂O, 0.04μM Na₂SeO₃ x 5H₂O, 0.039μM Zn-아세테이트 x 2H₂O), 25℃, 2% 내지 4% CO₂로 보충된 0.3 L x 분^-1 가압 공기 및 Osram FQ 24W 840 HO, Lumilux Cool White가 장착된 광 패널로부터 전달되는, 130 내지 310μE x m^-2 x s^-1로 조사, 하루에 24h 광. 배지에 제조업자의 지시에 따라 1000x Nitsch 비타민 혼합물 (Nitsch 비타민 혼합물, Duchefa, Netherlands)을 추가로 보충하였다. 발효 pH는 Pump20 (GE Healthcare)와 조합된 WAVEPOD I (GE Healthcare)의 도움으로 0.5M H₂SO₄ 및 0.5M NaOH로의 적정을 통해 pH5-6에서 자동 제어하였다.

배양 말기 후, 배양액을 하기 3 단계 여과 캐스캐이드를 거쳐 이끼가 없는 정화된 무균 여과물을 전달하였다: 1) Zetaplus (01SP B3002, 3M, Germany)가 장착된 맞춤형 PP 여과 하우징 (Grosse et al. (2014) WO 2014/013045 A1)에서 케이크 여과를 통해 이끼를 채취함, 2) 이중층 Scale-Up Capsule (E0340FSA60SP03A, 3M, Germany)을 통한 심층 여과, 및 3) 최종 멸균 여과 단계 (Millipore ExpressTM Plus, 0.22 μm, Millipore, Germany).

후속하여, 멸균 여과물을 농축하고 접선 유동 여과 (TFF) (Pall Centramate 500S, 30kDa 컷오프 셀룰로스 막)를 이용하여 완충액 교환하였다. 일련의 크로마토그래피 3단계 (Butyl-650M, DEAE, S) 후, 각각 분리된 α-gal A 및 고-mann α-gal A를 대략 0.5 mg/ml로 농축하고, 제형화 완충액으로 옮기고 특징 규명하였다. 효소는 추가의 사용때까지 -65℃ 이하에서 보관하였다. 전형적인 정제 과정의 결과는 도 2에 묘사되어 있다.

효소 활성 측정:

α-gal A 활성을 0.1M N-아세틸갈락토사민 즉, α-갈락토시다제 B의 특이적 억제제의 존재하에 pH 4.4에서 5mM 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드를 사용하여 형광측정 검정에 의해 측정하였다. 단백질 농도는 공급업체 지침에 따라 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce)를 사용하여 측정하였다. 활성은 μmol/단백질 mg/시간으로 표현하였다. 결과는 도 5c에 요약된다.

SDS-PAGE 실버-염색:

샘플을 95℃에서 5분 동안 환원제 (Invitrogen)가 보충된 SDS 샘플 완충액에서 변성시켰다. NuPAGE Bis-Tris 4-12% 겔 (Invitrogen)을 단백질 분리에 사용하였다. 실버 염색은 공급업체 설명서에 따라 SilverQuest™ Staining Kit (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다.

숙주-세포-단백질 (HCP)-ELISA

정제된 α-gal A 중 잔류 HCP 수준을 정량화하기 위해 새로운 HCP ELISA가 개발되었다 (Biogenes GmbH, Germany). 간략하게는, 각 야생형으로의 모의 발효를 수행하고, 배지를 채취하고 농축하였다. 농축 단백질 용액을 토끼의 면역화에 사용하였다. 총 IgG를 사용하여 HCP 정량을 위한 샌드위치 ELISA를 생성하였다. 결과는 정제 과정에 걸쳐 10000배 만큼의 HCP의 전형적 고갈을 보여준다.

실시예 1.4: 생산 개요

이끼-aGal의 생성은 wave™-로커에 설치된 10L-단일 사용 일회용 백에서 광영양 발효 과정으로 달성되었다. 어떠한 항생제도 없는 상태에서 자란 이끼는 이끼-aGal을 순수한 미네랄 배양 배지로 분비하였다. 배양 백의 조사는 200 μmol/m²s의 평균 광자 유속으로 외부로부터 이루어졌다. 이의 최종 배양 밀도에 도달한 후, 이끼를 배지로부터의 케이크 여과에 의해 분리하고 후자를 이중 층 심층 필터 시스템 및 최종 멸균 여과에 의해 정화시켰다. 생성된 맑은 배지를 농축하고 접선 유동 여과에 의해 리버퍼링(rebuffer)시켰다.

이러한 농축된 채취물로부터, 효소를 소수성 상호작용 (HIC)-, 음이온교환 (AIE)- 및 양이온교환 (CIE)-칼럼을 연속적으로 사용하는 3단계 크로마토그래피 접근법에 의해 정제하였다. 마지막으로, 마지막 칼럼으로부터의 용출액을 리버퍼링하고 0.5 mg/ml로 농축하였다. 정제 체계는 30%의 전형적 수율의 순수한 이끼-aGal (숙주 세포 단백질 (HCP) 수준 ~100ppm, 쿠마시에 SDS-Page 상의 단일 밴드, SE-HPLC 순도 99%)을 제공하였다.

실시예 2: α- 갈락토시다제 A 비교

실시예 2.1: 효소 생산 및 활성 검정:

포시만노스형 이끼 aGal을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득하였다. 이러한 생성 균주를 단독 피스코미트렐라 파텐스 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 유전자 (Gnt I)를 표적으로 하는 넉-아웃 작제물로 추가로 형질전환시켜 고-mann aGal에 대한 생성 균주를 수득하였다. 효소의 세포 흡수에 대한 말단 만노실 잔기의 증가된 수의 효과를 평가하기 위해, α-gal A를 또한 베타-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (GNT-I) 활성이 유전적으로 고갈된 균주에서 생성하였다. 넉아웃-변형은 임의의 복합체-유형 글리칸 처리를 수행하는데 있어서 이끼의 불능을 유도하는데, 이는 모든 후속 효소 단계에 이들의 기질이 결여되어 있기 때문이다. 따라서, 시스-골지에서 알파-만노시다제 I 매개된 트리밍이 마지막 처리-단계이며, 따라서, 이러한 균주의 모든 N-글리칸은 고-만노스 유형이다. 이러한 균주에서 생성된 인간 알파-갈락토시다제는 고-mann aGal로서 지칭된다. 생산 및 정제는 실시예 1에서와 동일한 방식을 따랐다.

포유동물 세포 생산 아갈시다제 알파 (Shire, Replagal®) 및 아갈시다제 베타 (Genzyme, Fabrazyme®)를 비교 평가를 위해 수득하였다.

세포 펠렛 또는 마우스 조직을 염수 중의 빙냉 0.2% Triton X-100에 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 15분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 효소 검정에 사용하였다. α-gal A 활성을 0.1M N-아세틸갈락토사민 즉, α-갈락토시다제 B의 특이적 억제제의 존재하에 pH 4.4에서 5mM 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드를 사용하여 형광측정 검정에 의해 측정하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce)를 사용하여 측정하였다. 활성은 nmol/단백질 mg/시간으로 표현하였다.

실시예 2.2: 글리칸 분석:

이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 글리칸 분석은 HILIC-UPLC-MS를 사용하여 Protagen Protein Services (Dortmund, Germany)에 의해 수행하였다. 간략하게는, N-글리칸을 PNG아제 F를 사용하여 효소적으로 단백질로부터 방출시켰다. 정화 및 탈염 후, 분리된 글리칸을 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)를 사용하여 표지하였다. 표지된 글리칸을 60℃에서 38.5분 동안 0.5ml/분의 유량으로 78% 내지 55.9% B (완충액 A: 100mM 암모늄포르메이트 pH 4.5, 완충액 B: 아세토니트릴)의 선형 구배를 사용하여 ACQUITY UPLC BEH Glycan (2.1x100mm) 칼럼 상에서 분리하였다. 용출 글리칸의 신호를 형광 검출기 (330nm에서 여기, 420nm에서 방출)에 의해 기록하였다. 각 글리칸에 대한 형광 피크의 지정은 기록된 m/z 값 (Xevo-QTOF MS, Waters) 및 MasLynx 소프트웨어 (Version 4.1, Waters)를 사용하여 수행하였다.

고-mann aGal의 글리칸 분석은 하기와 같이 수행하였다. 약 25 μg의 a-Gal을 환원시키고 (15mM DTT), 카르바미도메틸화시키고 (55mM 아이오도아세트아미드), 아세톤 침전시켰다 (아세톤:수성상 4:1). 펠렛을 0.1M 암모늄 바이카르보네이트 완충액에 재용해시키고, 37℃에서 트립신 또는 키모트립신 (둘 모두 시퀀싱 등급의 프로테아제, Roche, Mannheim) 중 어느 하나로 12시간 동안 분해하였다.

수성 용매로서 60mM 암모늄 포르메이트 완충액을 사용하여 약 3 μg의 각 분해물을 BioBasic C18 칼럼 (BioBasic-18, 150 x 0.32 mm, 5 μm, Thermo Scientific) 상에 로딩하였다. 3%로부터 75%로의 아세토니트릴 구배를 6 μL/min의 유량으로 25분에 걸쳐 전개하였다. 양성 이온 모드에서 표준 ESI 소스가 장착된 Waters Q-TOF Ultima 질량 분광계로 검출을 수행하였다. 데이터 분석은 MassLynx4.0을 사용하여 수동으로 수행하였다.

표 1: 이끼 aGal 및 비교 효소의 N- 글리칸 분석 결과

글리칸 생화학 관점에서, HexNAc는 N-아세틸글루코사민이며, Hex는 만노스인 것으로 추측할 수 있다. 이끼 aGal, Man3 및 Man3 + 메틸의 라인 1 및 2는 포시만노스형 글리코실화를 나타낸다. 놀랍게도, 이러한 분획은 약 80% 생성되었다. 고 mann 및 알가시다제 알파는 비교 생성물을 나타낸다.

알가시다제 알파와 비교하여, 이끼 aGal은 배치 일관성이 높고 매우 균일한 구조 조성을 갖는다. 높은 배치 대 배치 일관성은 재현성 및 기능 기대를 보장하는 요망 특성이다.

표 2: 글리칸 균일성/배치-대-배치 안정성

* 단일 글리코형태 내 모든 MAD의 평균

실시예 2.3: 시험관내 열안정성 :

효소를 건강한 개체로부터 수득된 혈장에서 희석시키고 지시된 기간 동안 37℃에서 가열하였다. 중성 pH를 유지하기 위해, HEPES를 20mM의 최종 농도로 혈장에 첨가하였다. 가열 후, α-gal A 활성을 측정하였다.

실시예 2.4: 시험관내 특징 규명

이끼-aGal은 우세한 구조로서 코어-유형 Man₃GlcNAc₂를 갖는 매우 균일한 N-글리칸을 지녔다 (도 5). 이끼-aGal의 탄수화물 사슬은 만노스와 GlcNAc로 거의 배타적으로 구성되어 있었으며, 그 중 ~85%가 만노스-종결되었고, ~10%가 만노스와 GlcNAc 말단 잔기 둘 모두를 가지며, ~4%가 GlcNAc 종결되었다 (표 1). 이와 비교하여, Man₅GlcNAc₂는 고-mann aGal (표 1)에서 가장 풍부한 글리칸 구조로서, 소량의 Man₄, Man₆ 및 Man₇을 갖는다. 예상된 바와 같이, 이끼-aGal 및 고-mann aGal 둘 모두에서 포스포릴화된 글리칸은 존재하지 않았다. 아갈시다제 알파는 고도로 불균일한 글리칸 구조를 나타냈으며, 이중 ~24%는 포스포릴화된 글리칸이며, ~7%는 만노스-종결된 글리칸이며, 63%는 다양한 구조를 갖는다 (표 1).

SDS-PAGE에서, 이끼-aGal은 아갈시다제 알파보다 빠른 이동성을 가진 단일 주요 밴드로 검출되었으며 (도 5a), 이는 이끼-aGal에서 더 낮은 탄수화물 함량을 반영한다. PNG아제 F에 의한 N-글리칸의 제거 후, 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파 둘 모두는 동일한 위치로 이동하였다 (도 5a). 고-mann aGal은 이끼-aGal의 것과 유사한 이동성을 가졌다. 웨스턴 블롯 분석에서, 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파 둘 모두는 인간 α-gal A에 대한 폴리클로날 항체에 의해 검출되었다 (도 5b). 동일한 양의 로딩된 단백질을 사용하여, 웨스턴 블롯에서 이끼-aGal 밴드의 강도는 아갈시다제 알파의 것의 2.14 ± 0.58 배 (n = 3)였으며, 이는 아마도 에피토프(들)로의 항체의 접근성을 촉진할 수 있는 이끼-aGal에서 더 짧은 당 사슬로 인한 것이다.

이끼-aGal 및 고-mann aGal의 특이적 활성은 아길시다제 알파 및 아갈시다제 베타의 것과 유사하였다 (도 5c).

이끼-aGal 및 고-만노스 이끼-aGal은 인간 혈장에서 희석하고 37℃에서 가열할 경우 아갈시다제 알파 또는 아갈시다제 베타와 거의 동일한 안정성을 가졌다 (도 2d).

실시예 3: 이끼에서 고쉐병의 치료에 적합한 인간 글루코세레브로시다제의 생산

실시예 3.1: 발현 균주 작제

인간 GBA 유전자의 cDNA 서열 (Uniprot 식별자 P04062-GLCM_HUMAN, NCBI 기준 서열: NM_000157.3)을 합성하고 GeneArt^TM (Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Germany)에 의해 이끼 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 사용된 서열 (SEQ ID NO: 7)은 천연 주석 신호 펩티드(SP) 없이 인간 GBA (SEQ ID NO: 6)를 코딩하며 (정확한 절단은 SignalP4.1 웹-툴에 따라 0.522의 스코어를 갖는 것으로 예측된다), 상기 신호 펩티드는 26 aa 식물 SP로 대체하였다. GBA 서열은 아미노산 리신에 대한 대안적 코돈을 사용하여 하나의 단일 염기에서 변형되어 (SEQ ID 7에서 염기 위치 21, AAA->AAG) 클로닝을 촉진한다 (HindIII 제한 부위는 피함). GBA 발현 작제물 및 네오마이신-내성 부여 유전자 (npt II) 작제물을 보유한 서열을 제한 효소를 사용하여 플라스미드로부터 선형 발현 카세트로서 절제하였다.

실시예 1.1에서 기술된 바와 같이, N-글리칸 상에 식물 특이적 α-1,3- 푸코스 및 β-1,2-자일로스 잔기가 없는 더블-넉아웃 라인을 기반으로 하는 이끼 세포주를 사용하였다. 안정한 글루코세레브로시다제-생성 이끼 세포주를 생성하기 위해, 이러한 글리코-조작된 기본 세포주로부터의 원형질체를 실시예 1.1에 기술된 바와 같은 PEG-기반 형질전환 절차에서 정제된 발현 카세트 (도 1)로 형질전환시켰다. 선형화된 발현 카세트는 α-gal 서열 (GLA) 대신 인간 GBA 서열을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1 및 도 1에 기술된 것과 동일한 유전자 요소를 포함한다. 형질전환된 이끼 세포를 재생성시키고, 항생제 G418에 대한 내성에 대해 선택하였다. 대략 700개 내성 이끼 소식물체를 바이오매스 당 총 글루코세레브로시다제 축적에 대해 2회 연속 스크리닝하였으며, 최상의 균주가 표준 생산 균주가 되었다. 이러한 균주에서 생성된 인간 글루코세레브로시다제는 이끼-GBA로서 지칭된다.

실시예 3.2: 효소 생산 및 특징 규명

실시예 1.2 및 실시예 2에 기술된 것과 동일한 조건 및 단계를 생산에 이용하였다. 글루코세레브로시다제를 10kDa 셀룰로스 카세트를 사용한 접선 유동 여과, 포획을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 (CaptoS) 및 폴리싱(polishing)을 위한 겔 여과 (Sephadex)에 의해 정제하였다. 정제된/풍부화된 글루코세레브로시다제를 웨스턴블롯팅, 쿠마시에/실버 염색된 SDS Page 및 효소 활성 검정에 의해 분석하였다. 정제된 효소를 추가의 사용때까지 -20℃에서 보관하였다. 정제 단계는 도 3에 도시되어 있다. 유사한 고 만노스-풍부 글리코실화를 수득하였다. 반복시, MGn 및 GnGn 형태의 더 높은 GlucNac 종결된 글리칸이 발견되었다. 베타-N-아세틸글루코사미니다제로의 처리는 다량의 포시만노스형 글리칸 형태 분포를 회복시켰다.

실시예 3.3: 효소 검정

정제된 글루코세레브로시다제의 활성은 시험관내 효소 활성 검정에 의해 평가된다. 글루코세레브로시다제를 37℃에서 60mM Na-시트레이트, 1.3mM EDTA, 0.15% Triton-X100, 0.125% 소듐 타우로콜레이트, 1mM DTT, 2mM 4-니트로페닐-베타-D-글루코피라노시드, pH6에서 인큐베이션하였다. 반응을 1M NaOH로 중단시키고 생성물 형성을 405nm에서 분광학적으로 측정하였다.

실시예 4: 이끼에서 폼페병의 치료에 적합한 인간 리소좀 알파- 글루코시다제의 생산

실시예 4.1: 발현 균주 작제

인간 GAA 유전자의 cDNA 서열 (Uniprot 식별자 P10253 (LYAG_HUMAN), NCBI 기준 서열: NM_000152.4)을 합성하고 GeneArt^TM (Thermo Fisher Scien-tific, GENEART AG, Regensburg, Germany)에 의해 이끼 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 사용된 서열 (SEQ ID NO: 9)은 천연 주석 신호 펩티드(SP) 없이 인간 GAA 전구체 (SEQ ID NO: 8)을 코딩하며, 상기 신호 펩티드는 26 aa 식물 SP(정확한 절단은 SignalP4.1 웹-툴에 따라 0.847의 스코어를 갖는 것으로 예측됨) 및 절두된 프로-펩티드로 대체하였다. GAA 서열은 아미노산 트레오닌에 대한 대안적 코돈을 사용하여 하나의 단일 염기에서 변형되어 (SEQ ID 9에서 염기 위치 2484, ACG->ACA) 클로닝을 촉진하였다 (PvuI 제한 부위는 피함). GAA 발현 작제물 및 네오마이신-내성 부여 유전자 (npt II) 작제물을 보유한 서열을 제한 효소를 사용하여 플라스미드로부터 선형 발현 카세트로서 절제하였다.

실시예 1.1에서 기술된 바와 같이, N-글리칸 상에 식물 특이적 α-1,3- 푸코스 및 β-1,2-자일로스 잔기가 없는 이중-넉아웃 라인을 기반으로 하는 이끼 세포주를 사용하였다. 안정한 알파-글루코시다제-생성 이끼 세포주를 생산하기 위해, 이러한 글리코-조작된 기본 세포주로부터의 원형질체를 실시예 1.1에 기술된 바와 같은 PEG-기반 형질전환 절차에서 정제된 발현 카세트 (도 1)로 형질전환시켰다. 선형화된 발현 카세트는 α-gal 서열 (GLA) 대신 인간 GAA 서열 (SEQ ID 9) 및 상이한 이끼-프로모터를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1 및 도 1에 기술된 것과 동일한 유전자 요소를 포함한다. 형질전환된 이끼 세포를 재생성시키고, 항생제 G418에 대한 내성에 대해 선택하였다. 대략 600개 내성 이끼 소식물체를 바이오매스 당 총 알파-글루코시다제 전구체 축적에 대해 2회 연속 스크리닝하였으며, 최상의 균주가 표준 생산 균주가 되었다. 이러한 균주에서 생성된 인간 리소좀 알파-글루코시다제는 이끼-GAA로서 지칭된다.

실시예 4.2: 효소 생산 및 특징 규명

실시예 1.2 및 실시예 2에 기술된 것과 동일한 조건 및 단계를 생산에 이용하였다. 알파-글루코시다제를 Con A 세파로스 4B를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 알파-글루코시다제 함유 배지를 동일한 부피의 50mM 소듐아세테이트, 1M NaCl pH 5.2와 혼합하여 적절한 결합 조건에 대해 조절하고 크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 용출을 α-D-메틸글루코시드의 농도를 단계적으로 증가시킴으로써 달성하였다. 정제된/풍부화된 알파-글루코시다제를 웨스턴블롯팅, 쿠마시에/실버 염색된 SDS Page 및 효소 활성 검정에 의해 분석하였다. 정제된 효소를 추가의 사용 때까지 4℃ 또는 -20℃에서 보관하였다. 풍부 이끼-GAA의 SDS-PAGE 분석은 도 4에 도시되어 있다. 이끼-GAA를 함유하는 밴드의 정체는 MS-분석에 의해 확인하였다.

알파-글루코시다제는 G1-G7로 불리는 7개의 글리코실화 부위를 갖는다. 각 부위에 대한 글리코형태를 MS/MS로 검출하였다. 대부분의 부위 (GS2 제외-GnM 73%)에 대한 가장 강한 피크가 GnGn-글리코형태의 것으로 밝혀졌다. 따라서, 효소 제조물을 베타-N-아세틸글루코사미니다제로 처리하여 GlcNac 말단을 절단하여 GnM 및 GnGn을 포시만노스형 글리칸으로 전환시켰다.

실시예 5: 이끼-제조된 α- 갈락토시다제 A의 만노스 수용체- 매개된 전달은 파브리병에서 효소 결핍을 효율적으로 교정한다.

도 5.1: 시험관내 흡수 연구:

파브리 환자-유래된 피부 섬유아세포 (DMN96.125) 및 내피 세포주 (IMFE1)를 각각 DMEM 및 EGM-2MV (Lonza) 중의 10% FBS에서 배양하였다. 두 세포주 모두는 매우 낮은 α-gal A 활성을 가지며, 면역염색에 의해 검출가능한 리소좀 Gb₃ 축적을 갖는다 (Shen et al. (2008) Mol Genet Metab 95:163-168). 세포를 지시된 기간 동안 5mM M6P 또는 2mg/ml 효모 만난의 존재 또는 부재하에 α-gal A 제조물 (최종 농도 10μg/ml)과 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 세포외 α-gal A를 또한, 제거하는 트립신 처리 (0.25% 트립신/EDTA, 37℃)에 의해 채취하였다. PBS로 세척한 후, 세포 펠렛을 효소 검정 또는 웨스턴 블롯을 위해 용해시켰다.

축적된 Gb₃의 분해에서 이끼 효소의 능력을 시험하기 위해, DNN96.125 세포를 α-gal A 제조물 (10 μg/ml)과 함께 4일 동안 인큐베이션하는데, 배지는 1-2 일마다 교체하였다. 모의 처리된 세포를 비처리 대조군으로 사용하였다. Gb₃은 하기 기술된 바와 같이 면역염색에 의해 검출되었다. 효소 흡수 연구는 10 μg/ml의 최종 농도의 외인성 효소를 이용하여 파브리 환자-유래된 섬유아세포에서 수행하였다. 18시간 인큐베이션 후, 아갈시다제 알파 또는 아갈시다제 베타를 로딩한 섬유아세포는 세포내 α-gal A 활성을 현저하게 증가시켰다 (각각 비처리된 세포의 활성의 116배 및 134배) (도 6a). 이들 효소의 흡수는 M6P에 의해 거의 완전히 억제되었으며 효모 만난에 의해 부분적으로 억제되며, 이는 이러한 흡수가 M6PR을 통해 대부분 일어남을 확인시켜준다. 이끼-aGal 또는 인간-mann aGal과 인큐베이션된 섬유아세포는 세포내 α-gal A 활성의 현저하게 더 낮은 증가를 갖는다 (각각 비처리된 세포의 6.4배 및 4.8배) (도 6a). 이끼-aGal 및 고-mann aGal 둘 모두의 흡수는 M6P 또는 만난 중 어느 것에 의해서도 억제되지 않았다. 이는 이러한 세포에서 MR이 거의 또는 전혀 발현되지 않는 것과 일관된다 (도 6c,d). 낮은 흡수에도 불구하고, 파브리 환자의 섬유아세포에서 Gb₃의 리소좀 축적은 4일 동안 이끼-aGal 또는 고-mann aGal로 처리 후 현격하게 감소하였으며 (도 6b), 이는 이끼 α-gal A 효소가 리소좀에 축적된 기질을 분해할 수 있음을 암시한다.

ERT에서 정맥내 주입된 효소는 혈액과 나머지 조직 사이의 첫 번째 장벽을 형성하는 혈관 내피에 의해 가장 잘 흡수된다. 게다가, 내피 세포는 파브리병과 같은 일부 LSD에서 주요 질환-관련 세포 유형이다. 따라서, 본 발명자들은 파브리 환자-유래된 미세혈관 내피 세포 (IMFE1)에서 효소 흡수를 평가하였다. IMFE1 세포는 웨스턴 블롯 및 면역염색에 의해 측정될 경우 MR 양성이었다 (도 6c, d). 밤새 인큐베이션한 후, 이끼 α-gal A 효소는 IMFE1 세포에 의해 효율적으로 흡수되었다 (도 6e). IMFE1 세포에 의한 이끼-aGal 또는 고-mann aGal의 흡수는 효모 만난에 의해 우세하게 차단되었으며 (~60-80% 억제), 더 적은 정도 (~2-10%)로 M6P에 의해 억제되었으며, 이는 MR이 이러한 흡수에 주로 기여함을 시사한다. IMFE1 세포에 의한 아갈시다제 알파 또는 아갈시다제 베타의 흡수는 M6P (~75-82%)에 의해 대부분 억제되었으며, 그러나 또한 만난에 의해서도 억제되었다.

시험관내 흡수는 전형적으로 밤새 인큐베이션한 후 정체기에 도달하였다. 활동기에서 다양한 α-gal A 제조물의 흡수율을 비교하기 위해, IMFE1 세포를 더 짧은 기간 동안 효소 (10 μg/ml)와 인큐베이션하였다. 고-mann aGal 및 아갈시다제 알파의 흡수는 3시간까지 대략 선형이었으며, 아갈시다제 알파보다 고-mann aGal의 흡수율이 현저하게 더 높았다 (도 6f). 이끼-aGal의 흡수는 1시간 인큐베이션 후 고-mann aGal 및 아갈시다제 알파보다 현저하게 높았으며, 1-3시간에 정체기에 도달하였다 (도 6f). 더 높은 효소량 (40 μg/ml)을 갖는 것을 포함하는 반복된 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. 웨스턴 블롯은 단백질 수준에서 이러한 결과를 추가로 확인시켜 주었다 (도 6g).

효소 결합 효율을 평가하기 위해, IMFE1 세포를 M6P 또는 만난의 존재 또는 부재하에 4℃에서 다양한 효소 제조물 (10 μg/ml)과 인큐베이션하였다. 3시간 후, 세포 표면-결합된 α-gal A를 효소 활성 검정에 의해 측정하였다. 이러한 실험 조건하에, 배경 수준을 초과하는 α-gal A 활성이 고-mann aGal 또는 아갈시다제 알파와 인큐베이션한 세포에서 검출되지 않았다 (비처리된 세포의 활성) (도 6h). 이끼-aGal은 고-mann aGal 또는 아갈시다제 알파보다 현저하게 더 높은 세포 결합을 가졌다 (도 6h). 이끼-aGal의 결합은 만난에 의해 현저하게 차단되었으나, M6P에 의해서는 차단되지 않았다.

이러한 결과는, 배양된 섬유아세포보다 생체내 ERT와 아마도 더욱 관련된 배양된 미세혈관 내피 세포를 사용한 검정 시스템에서, 이끼 α-gal A 효소의 결합 및 흡수는 아갈시다제 알파보다 더욱 효율적이며, 이러한 결합/흡수는 MR을 통해 발생한다. 이러한 시험관내 데이터는 또한 이끼-생산 효소가 생체내에서 ERT에 적합할 수 있음을 시사하였다. 이끼-aGal의 결합/흡수가 고-mann aGal보다 더욱 효율적이었기 때문에, 본 발명자들은 후속 동물 연구를 위해 전자를 선택하였다.

실시예 5.2: 시험관내 결합 연구:

다중-웰 플레이트에서 IMFE1 세포를 5mM M6P 또는 2mg/ml 만난의 존재 또는 부재하에 4℃에서 α-gal A 효소 (10 μg/ml)와 인큐베이션하였다. 25mM HEPES가 보충된 배양 배지 EGM-2MV를 사용하였다. 3시간 후, 세포를 빙냉 PBS로 4회 세척하고, 4℃에서 0.2% 트리톤 중에 직접 용해시켰다. 용해물을 단백질 검정 및 α-gal A 효소 검정에 사용하였다.

실시예 5.3: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 :

샘플을 70℃에서 10분 동안 2.5% 2-메르캅토에탄올로 LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 변성시켰다. NuPAGE Bis-Tris 4-12% 또는 10% 겔 (Invitrogen)을 단백질 분리에 사용하였다. 웨스턴 블롯을 전술한 바와 같이 수행하였다 (Shen et al. (2008) Biochem Biophys Res Commun 369:1071-1075). 사용된 일차 항체는 인간 α-gal A에 대한 토끼 폴리클로날 항체 (Shire Human Genetic Therapies, Cambridge, MA), 만노스 수용체에 대한 마우스 모노클로날 항체 (클론 15-2, Abcam, Cambridge, MA) 및 GAPDH에 대한 염소 폴리클로날 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)이다. α-gal A 단백질 수준을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 농도계로 정량화하였다.

실시예 5.4: 면역형광 :

형광 면역염색을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Shen et al. (2008) Biochem Biophys Res Commun 95:163-168). 사용된 일차 항체는 Gb₃ (Seikagaku, Tokyo, Ja-pan) 및 만노스 수용체 (클론 15-2, Abcam)에 대한 마우스 모노클로날 항체였다. 세포를 DAPI로 대조염색하였다.

실시예 5.5: 동물 및 절차:

파브리 마우스는 반접합성 수컷과 동형접합성 암컷의 쌍을 번식시켜 생산되었다. 성체 (3-6개월령) 암컷 파브리 마우스를 연구 전반에 걸쳐 사용하였다. 각 실험을 위해, 동일한 연령의 동물을 사용하였다. Gb₃ 제거 연구에 있어서, 암컷 파브리 마우스가 수컷 파브리 마우스보다 더욱 적합하였는데, 왜냐하면 수컷 마우스는 축적된 Gb₃의 분해에서 주입된 효소의 효과를 혼동시키는 테스토스테론-유도된 Gb₃를 신장에서 합성하기 때문이다. 모든 주입에 있어서, 효소 제조물을 마우스 당 200 μl의 총 부피로 염수 중에 희석하고 꼬리 정맥을 통해 파브리 마우스로 주입하였다.

실시예 5.6: 혈장 약물동태:

효소 제조물을 1 mg/체중 kg의 용량으로 주입하였다 (각각 n = 5). 주입 후 1, 5, 10, 20 및 30분째에 헤파린 처리된 모세혈관을 사용하여 꼬리 추출에 의해 혈액 샘플을 수집하였다. 혈장을 분리하고 혈장 중의 α-gal A 효소 활성을 측정하였다.

이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파를 1 mg/체중 kg (BW)의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 파브리 마우스로 주입하고, 혈장 청소를 시험관내 α-gal A 효소 검정으로 분석하였다. 이끼-aGal은 아갈시다제 알파보다 순환계에서 더욱 빨리 제거되었다 (도 7a). 이끼-aGal의 더 짧은 혈장 반감기가 순환에서 더욱 신속한 효소 불활성화 (변성)보다 조직에 의한 더욱 강력한 흡수로 인한 것임을 입증하기 위해, 마우스 혈장 중 효소를 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다 (도 7b). 이끼-aGal에 대한 항체의 더 높은 반응성에 따라 (도 5b), 이끼-aGal 밴드의 강도는 2.14의 계수에 의해 수정되었다. 결과는, 주입 후 5 및 10분째에 이끼-aGal-주입된 마우스에서 α-gal A 단백질 수준이 아갈시다제 알파-주입된 마우스에서보다 현저하게 더 낮아졌음을 나타냈다 (도 7c). 5 및 10분째에서 혈장 중의 이끼-aGal의 단백질 수준은 각각 아갈시다제 알파의 것의 37% 및 28%이었으며, 이는 효소 활성 데이터와 거의 일치하였다 (이러한 2개의 시점에서 이끼-aGal-주입된 마우스 혈장에서 특정 활성은 아갈시다제 알파-주입된 마우스에서의 것의 49% 및 28%임). 추가로, 혈장에서 단백질 수준과 효소 활성 간에는 강한 상관관계가 존재하였다 (도 7d). 시험관내 흡수 연구 결과 (도 6f-h)와 함께, 이들 데이터는 정맥내 투여된 이끼-aGal이 아갈시다제 알파와 비교할 경우, 조직에서 혈관 내피 세포 및 기타 세포 유형에 의해 더욱 효율적으로 흡수됨을 시사하였다.

실시예 5.7: 생체분포:

효소 제조물을 1 mg/체중 kg의 용량으로 주입하였다 (각각 n = 5). 주입 후 2시간째에, 마우스를 (혈액을 제거하기 위해) 염수로 관류시키고, 심장, 신장, 비장 및 간을 채취하였다. 전체 기관을 균질화시키고, α-gal A 활성을 측정하였다. 신장에 있어서, 두 신장 모두를 합치고 균질화시켰다.

파브리 마우스 내로의 이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파 중 어느 하나의 정맥내 주입 (1 mg/kg BW) 후 2시간째에, 각 효소 제조물의 조직 분포를 평가하였다. 이끼-aGal-주입된 마우스로부터의 신장은 아갈시다제 알파보다 현저하게 더 높은 효소 활성을 가졌다 (도 8a). 심장 및 비장에서의 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 수준은 유사하였다 (도 8a). 간에서 이끼-aGal의 수준은 아갈시다제 알파의 것보다 현저하게 더 낮았다 (도 8a). 전체 기관 당 활성을 계산하고, 다양한 기관 사이의 비율을 비교하였다 (도 8b). 총 회복된 활성 중, 이끼-aGal의 94.9% 및 아길시다제 알파의 97.5%가 간으로 전달되었다 (P < 0.05). 이끼-aGal-주입된 마우스의 신장은 1.96%의 총 활성을 가졌으며, 이는 아갈시다제 알파-주입된 마우스의 것 (0.58%)보다 현저하게 더 높았다 (P < 0.05). 웨스턴 블롯 분석은 아갈시다제 알파와 비교하여 신장에서 이끼-aGal의 더 높은 흡수를 확인시켜주었다 (도 8c).

주입된 효소의 세포 분포를 조사하기 위해, 면역조직화학을 1 mg/kg BW의 이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파 중 어느 하나의 주입 후 24시간째에 파브리 마우스 조직에서 수행하였다. 특정 신호는 과립 세포질 패턴을 나타냈으며, 아마도 효소의 리소좀 국소화를 반영한다. 심장 및 신장에서 이러한 2개 효소의 세포 국소화는 본질적으로 동일하였다. 심장에서, 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파 둘 모두가 모세혈관 및 혈과주위 세포에서 검출된 반면, 근세포에서는 검출되지 않았다 (도 9a). 특정 염색은 어느 한 효소에 대한 신장 피질 관 상피 세포에서만 관찰되었다 (도 9b). 이러한 결과는 아갈시다제 알파의 세포 분포와 일치한다.

실시예 5.8: 면역조직화학:

이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파를 1 mg/체중 kg의 용량으로 꼬리-정맥을 통해 주입하였다 (각각 n = 2). 심장 및 신장을 효소 주입 후 1일째에 채취하였다. 비처리된 암컷 파브리 마우스 조직은 음성 대조군으로 사용하였다. 조직을 포르말린에 고정시키고, 파라핀으로 포매시키고, 5마이크론 절편을 만들었다. 면역조직화학은 조지타운 대학 (Washington, D.C.)의 조직병리학 및 조직 공유 리소스 (Histopathology and Tissue Shared Resource)에 의해 수행하였다. 간략하게는, 시트레이트 완충액에서 열-유도된 에피토프 회수 후, 절편을 3% 과산화수소 및 10% 정상 염소 혈청으로 처리하고, 인간 α-gal A (Shire)에 대한 토끼 폴리클로날 항체와 인큐베이션하였다. HRP-표지된 이차 항체와 인큐베이션한 후, DAB 발색제에 의해 신호를 검출하고, 절편을 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 신호 특이성은 일차 항체 인큐베이션이 생략된 대조군 염색으로 확인하였다. 비처리된 대조군에서 가볍고 확산되는 비-특이적 염색과 비교하여, 특정 신호는 과립 세포질 패턴을 나타냈다.

실시예 5.9: 조직 안정성:

이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파를 1 mg/체중 kg의 용량으로 꼬리-정맥을 통해 주입하였다. 주입 후 24, 48 및 96시간째에, 마우스 (군당 n = 4-5)를 관류시키고 기관을 상기의 생체분포에 기술된 바와 같이 채취하고 균질화시켰다.

실시예 5.10: 조직 동태

다양한 기관에서 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 생체내 동태를 단일 정맥내 주입 후 조사하였다. 주입 후 2 및 24시간째에, 이끼-aGal-주입된 마우스로부터의 신장은 아갈시다제 알파-주입된 마우스와 비교하여 현저하게 더 높은 효소 활성을 가졌다 (도 10a). 그러나, 48 및 96시간에서의 활성은 유사하였다 (도 10a). 심장에서는 2 및 24시간에서 두 효소 형태 간의 유의한 차이는 없었다; 그러나, 주입 후 48 및 96시간째에 이끼-aGal의 활성은 아갈시다제 알파보다 낮았다 (도 10b). 아갈시다제 알파-주입된 마우스와 비교하여, 이끼-aGal-주입된 마우스는 분석된 모든 시점에서 비장에서 유사한 수준의 활성을 가졌으며, 간에서는 현저하게 더 낮은 활성을 가졌다 (도 10c, d). 신장 및 심장에서 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 반감기는 2 내지 3일의 범위였다. 이끼-aGal은 두 기관 모두에서 ~25% 더 짧은 반감기를 가졌다. 간에서 이끼-aGal의 반감기는 아길시다제 알파와 비교하여 현저하게 더 짧았다 (24 vs. 57 시간). 비장에서 두 효소 형태 모두의 반감기는 유사하였다 (~ 30시간).

실시예 5.11: 조직 Gb ₃ 의 제거:

6개월령의 암컷 파브리 마우스를 사용하였다. 이끼-aGal 또는 아갈시다제 알파를 0.3, 1 및 3 mg/체중 kg의 용량으로 꼬리-정맥을 통해 주입하였다 (각각 n = 4-5). 심장, 신장 및 간을 단일 주입 후 1주째에 채취하였다. 연령- 및 성별-매칭되는 비처리된 파브리 및 WT 마우스를 대조군으로서 사용하였다 (n=5). 조직을 균질화시키고 글리코스핑고리피드 추출로 처리하고, 이전에 기술된 바와 같이 질량-분광분석에 의해 Gb₃를 후속 분석하였다 (Durant et al. (2011) J Lipid Res 52:1742-1746). 8개 이소폼을 분석하였으며, 나타낸 결과는 이들 이소폼의 합계이다. Gb₃ 함량은 μg/총 단백질 mg으로 표현하였다.

축적된 Gb₃를 분해하는데 있어서 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 효능을 6개월령 파브리 마우스에 어느 한 효소의 단일 정맥내 주입 후 7일째에 비교하였다. 세 가지 다른 용량 (0.3, 1 및 3 mg/kg BW)을 시험하였다. 비처리된 파브리 마우스는 비처리된 WT 대조군과 비교하여 신장, 심장 및 간에서 현저하게 증가된 Gb₃ 수준을 가졌다 (도 11a-c). 두 형태 효소 모두가 이들 기관에서 Gb₃를 용량-의존적 방식으로 감소시켰다 (도 11a-c). 이끼-aGal 및 아갈시다제 알파는 가장 많은 용량 (3 mg/kg)에서 아갈시다제 알파의 더욱 우수한 심장 Gb₃ 제거를 제외하고, 신장 및 심장에서 Gb₃ 제거에 있어서 유사한 효능을 가졌다 (도 11a, b). 간 Gb₃ 제거에서, 아갈시다제 알파는 0.3 및 1 mg/kg의 용량에서 이끼-aGal보다 훨씬 더욱 효과적이었다 (도 11c). 더 많은 용량 (3 mg/kg)에서, 이들 2개의 효소는 유사한 간 Gb₃ 수준을 유도하였다.

실시예 6: 비- 정맥내 경로를 통한 파브리 질병 마우스 모델로의 이끼-생산 재조합 인간 α- 갈락토시다제 A의 전달

이러한 실험의 목적은 마우스 모델의 표적 조직으로의 이끼 αGal의 전달에서 비-정맥내 경로의 잠재적인 유용성을 시험하는 것이다.

실시예 6.1: 방법

실시예 1에 기술된 바와 같은 이끼-aGal을 0.69 mg/ml의 농도로 사용하였다. 성체 (8-11개월) 수컷 파브리 마우스를 사용하였다. 이끼 aGal을 복강내 (i.p.), 근육내 (i.m.) 또는 피하 (s.c.) 경로를 통해 주입하였다. 후자 두개의 경로에 있어서, 효소를 각각 허벅지 근육 (양쪽) 및 어깨 사이의 느슨한 피부 아래에 주입하였다. 1, 3 또는 10 mg/kg 체중의 용량을 시험하였다. 혈액을 주입 후 0.5, 1, 2, 4, 6 및 24시간째에 수집하고, 기관을 24시간째에 절개하였다. 샘플을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 기준선 활성에 대해서는 비처리된 파브리 마우스 (n=5)로부터의 혈장을 사용하였다. 혈장 및 조직 중 α-Gal A 활성을 표준 4MU 방법을 이용하여 측정하였다.

분광분석: 효소 반응 후, 방출된 4MU의 형광 강도를 SpectroMax M5 (Molec-ular Devices)를 사용하여 측정하였다. 이러한 장비는 i.p. 및 i.m. 주입된 마우스로부터의 샘플 분석 (및 최근 5년에 본 발명자들이 검정한 모든 샘플)에 사용하였다. 그러나, 기계적 문제가 최근 발생하였기 때문에, s.c. 주입된 마우스 샘플에 있어서, 형광을 SpectroMax Paradigm (Molecular Devices)을 사용하여 측정하였다. SpectroMax Paradigm에서 4MU 표준 곡선은 탁월한 선형성을 나타냈으며, 분석된 마우스 조직 및 혈장의 α-gal A 활성은 SpectroMax M5 (동일한 샘플을 평가함)을 사용하여 이전에 측정된 것과 매우 유사하였다. 따라서, 이러한 연구에서 2개의 상이한 분광분석 사용에 의한 데이터 변동은 매우 작아야 한다.

실시예 6.2: 결과 및 논의:

i.p. 경로 (도 12): 혈장 활성은 주입 후 0.5-2시간째에 피크에 도달하였으며, 그 후에 감소되고 6시간째에 기준선 수준으로 복귀되었다. 활성은 용량-의존적이었다. 심장, 신장, 간 및 비장에서의 활성은 용량-의존적 방식으로 증가되었다.

i.m. 경로 (도 13): 혈장 활성은 주입 후 0.5시간째에 피크에 도달하였으며, 그 후에 급격히 감소되고 4시간째에 기준선 수준으로 복귀되었다. 심장, 신장, 간 및 비장에서의 활성은 용량-의존적 방식으로 증가되었다. 한 마리의 마우스 (#14, 10 mg/kg의 용량)는 동일한 군에서 다른 것보다 현저하게 높은 조직 활성을 가졌다; 이러한 샘플은 데이터 분석으로부터 제거되었다.

s.c. 경로 (도 14): 혈장 활성은 i.m. 투여와 비슷한 패턴을 보였다. 전체적으로, 조직 활성은 용량-의존적 방식으로 증가하였다. 그러나, 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 투여량 사이의 심장 및 신장 활성에는 실질적인 차이가 없었다; 이는 이 경로의 비교적 제한된 흡수율로 인한 것일 수 있다. 10 mg/kg의 용량에서, 조직 활성은 큰 변동을 보였다; 5마리 마우스 중 2마리가 나머지 보다 극적으로 더 높은 활성을 가졌다.

실시예 6.3: 비교

효소 전달 효율은 i.p.>s.c.>(또는 유사한) i.m.의 순서이다.

i.p. vs. i.v.: i.p. 주입된 마우스 (1 mg/kg)에서 심장, 신장, 간 및 비장에서 α-Gal A 활성은 i.v. 주입된 마우스의 활성의 16%, 49%, 17% 및 35%였다 (조직 안정성 연구로부터의 데이터, 1 mg/kg, 주입 후 24시간째).

s.c. vs. i.p./i.v.: s.c. 주입이 i.p. 주입보다 조직으로 더 적은 효소 전달을 유도하지만, 다양한 기관에서 감소 비율은 비례하지 않았다. 1 mg/kg의 용량으로 s.c. 주입된 마우스에서 심장, 신장, 간 및 비장에서 α-gal A 활성은 i.p. 주입된 마우스의 것의 67%, 43%, 22% 및 24%였다. 이는, s.c. 경로가 간 및 비장과 비교하여 심장 및 신장으로의 더 많은 효소를 전달하는 경향이 있음을 암시한다. i.v. 투여와 비교할 경우 유사한 패턴이 관찰되었다. s.c.의 상기 기관에서의 활성은 i.v. 주입된 마우스의 것의 11%, 21%, 4% 및 9%였다.

비-iv 경로는 ERT를 위한 대안적인 접근법이다. i.p.는 우수한 방법으로 보인다. 인간에서의 사용을 고려할 때, s.c.는 우수한 후보자일 수 있다. 조직 양은 i.v. 투여보다 더 적지만, 단지 소량이 조직에 필요하기 때문에 충분한 양이 투여될 수 있다. 단일 투여의 낮은 조직 활성 (예를 들어, s.c. vs i.v.)이 심장 및 신장에서 축적된 Gb₃를 분해하는데 불충분한 경우, 반복된 주입으로 이러한 문제를 극복할 수 있다. 요약하면, 개선된 환자 수용성과 같은 i.p., i.m. 및 s.c. 투여의 긍정적인 측면은 감소된 표적 조직 분포를 능가한다.

실시예 7: 논의

단백질 특성뿐만 아니라 이의 계획된 적용에 따라, 다양한 발현 숙주가 선택된다. 산업 및 식품-/사료 적용을 위한 대량 단백질이 에스체리치아 콜라이와 같은 원핵동물 숙주에서 대부분 발현되는 반면, 약학적 단백질 생성은 종종 예를 들어, CHO- (중국-햄스터-난소) 또는 식물 세포와 같은 고등 진핵생물 세포에서의 발현에 의존적이다. 후자의 선택은 주로, 대부분 인간 기원인 약학적 단백질이 예를 들어, N-글리코실화와 같은 복잡한 번역후 변형 (PTM)을 필요로한다는 사실에 기초한다. 따라서, 상이한 진핵생물 발현 시스템에서 동일한 단백질의 병행 재조합 발현이 PTM에 대해 상이한 생성물 성질을 유도한다. 예를 들어, N-글리코실화의 경우, 포유동물 세포 발현 시스템은 동일한 단백질 생성물에 대해 수십 내지 수백 개의 상이한 N-글리칸 종을 이용하여 매우 불균일한 단백질 혼합물을 생성하는 경향이 있다. 이에 반해, 식물-기반 발현 시스템은 생성된 단백질에 대한 단지 소수 (전형적으로 10개 미만)의 상이한 글리칸 종이 존재하는 매우 균일한 N-글리코실화 패턴을 특징으로 한다.

약학적 단백질 생산의 경우, 생산 시스템의 선택은 종종 생성물의 구조적 및 성질 요구에 의해 촉발된다. 본 발명은 LSD로 고통받는 환자를 치료하기 위해 재조합 리소좀 단백질을 생성할 필요에 의해 주도되었다. 이들 환자는 유전가능한 유전자 돌연변이로 인해 이러한 효소의 기능 버전이 결여되었기 때문에, 재조합 생성물은 통상적인 효소 대체 요법 (예를 들어, 정맥내 주입)에 의해 대체물로서 사용된다. 표적 세포 표면상 만노스-수용체로의 결합에 의한 혈류로부터의 효율적인 흡수를 위해, 효소는 말단 만노스 잔기를 보유하는 N-글리칸으로 장식될 필요가 있다.

식물 발현 시스템에서 만노스-말단화된 N-글리칸을 갖는 aGal의 버젼을 생성하기 위해, 관례적인 방법은 N-말단에 분비 신호를 첨가하고 C-말단에 액포 표적화 신호를 첨가함으로써 단백질의 액포 표적화를 이용하였다. 이러한 접근법에서, 분비 신호는 초기 단백질을 소포체 (ER)로 향하게 하며, 여기에서 전구체-글리칸으로 장식된다. 기본 분비 경로 후, 단백질을 골지체로 수송하고 이의 글리칸은 추가로 트리밍되고 전형적인 복합체 식물-N-글리칸 형태로 처리될 것이다. 이들 글리칸은 이러한 글리칸의 두 개 모두의 가능한 만노스 말단을 커버하는 두 개의 말단 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기로 종결된다.

이어서, 2개의 글리칸 암의 마지막 두 번째 위치에서 이러한 두 개의 만노스의 노출은 제 2의 표적화 펩티드 즉, C-말단에서 액포 표적화 신호에 의해 달성된다. 이러한 펩티드는 트랜스-골지-네트워크 (TGN)에서 액포 분류 수용체에 결합하여 액포에 부착된 단백질의 표적화를 개시한다. 여기에서, 베타-N-아세틸헥소아미니다제는 말단 GlcNAc를 절단제거하고 이에 의해 만노스 잔기를 노출시킨다. 생성된 글리칸은 "포시만노스"로서 분류되며 식물 액포 단백질에 대해 전형적이다.

대조적으로, 본 발명은 단백질 서열로 C-말단 액포 신호를 혼입하는 단계를 생략한다. 따라서, 재조합 생성물은 TGN에서 액포로 분류되지 않으며, 그러나, 추가로 기본 분비 경로를 따른다. 이러한 접근법에서, 복합 N-글리칸의 트리밍 및 말단 만노스의 관련 노출은 예상되지 않는데, 포시만노스형 구조가 액포-특이적인 것으로 지정되기 때문이다 (Castilho & Steinkellner, 2012, Biotechnology Journal, 7(9), 1088-1098).

본 발명은 선태류 식물에서 N-글리칸-트리밍을 달성하여 액포 신호 없이 N-글리칸 상에 노출된 말단 만노스를 갖는 리소좀 단백질의 재조합체 버전을 생성하였다. 이는 그럼에도 불구하고, 액포 글리콜-처리의 무관련성이 리소좀 단백질의 경우 포스만노스 글리코단백질의 양이 많은 생성물을 유도하는 분비 경로로 이어진다.

이끼-aGal은 MR을 발현하는 내피 세포에 의해 효율적으로 흡수되었으며, 이러한 흡수는 효모 만난 즉, MR-매개된 세포내이입의 특이적 억제제에 의해 차단되었다. 이끼-aGal은 MR을 발현하지 않는 인간 피부 섬유아세포에 의해 효과적으로 흡수되지 않았다. 이러한 결과는 이끼-aGal의 흡수가 MR에 의해 매개됨을 나타낸다. 대조적으로, 아갈시다제 알파의 흡수는 MR 및 M6PR 둘 모두와 관련되었다. 동물 연구는, 마우스 심장 및 신장에서 이끼-aGal의 효소 활성 및 축적 제거 능력이 아갈시다제 알파의 것과 전반적으로 유사함을 드러냈다. 이러한 결과는 만노스-말단화된 효소가 파브리병 및 기타 LSD의 치료에서 M6P-보유 효소만큰 효과적일 수 있음을 시사한다.

시험한 이끼-aGal은 단백질 서열 및 구조와 관련하여 이의 인간 대응물과 동일하다. 균일하고 우세하게 만노스-말단화된 N-글리코실화는 맞춤형 이끼 균주에서의 발현에 의해 달성된다. 또한, 고-mann aGal의 생성에 있어서, GNT-I (N-아세틸트랜스퍼라제-글리코사미닐트랜스퍼라제 I)가 넉아웃되었다. 이러한 효소에 의한 N-아세틸글루코사민의 초기 글리칸으로의 전달은 복합체 형성으로의 이들의 추가 처리를 위한 필수적인 기질을 형성한다. 따라서, 복합체 글리칸 처리는 이러한 녹아웃에 의해 차단되며 모든 글리코형태는 고-mann 유형이다.

본 발명자들의 연구는 이끼가 α-gal A 및 기타 리소좀 효소를 발현시키는데 유용한 플랫폼임을 보여주었다. 한 양태에서, 이끼 그 자체는 현저하게 균일한 N-글리코실화를 특징으로 하는데 즉, 예를 들어, 포유동물 세포와 비교하여, 이들의 단백질은 고도로 재현가능한 퍼센트 분포를 갖는 극적으로 감소된 수의 글리코형태를 나타내기 때문이다. 약학적 생산과 관련하여, 이는 N-글리칸 성질이 단백질의 치료 효능에 결정적인 경우 매우 유리하다.

내피 세포에 의해 이끼-aGal의 흡수는 아갈시다제 알파의 것보다 훨씬 더욱 효율적이다. 이는 생체내 순환으로부터 주입된 이끼-aGal의 더욱 신속한 제거와 일치하였다. 내피 세포가 혈관병의 병태생리 및 파브리병에서 기타 증상에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 고려하면, 내피 세포로의 효과적인 전달은 질환 병상을 예방하고 교정하는데 유리하다. 본 발명자들의 연구는 또한, 증가된 말단 만노스 잔기에도 불구하고, 내피 세포로의 고-mann aGal의 결합/흡수가 포시만노스형 이끼-aGal보다 현저하게 덜 효율적이었음을 보여주었다. 이는 MR 결합 효율이 가능하게는, 절대수의 노출된 만노스 잔기보다는 글리칸의 입체형태에 더욱 의존적임을 시사한다.

면역조직화학에 의해, 이끼-aGal은 심장의 혈관 내피 세포 및 혈관 주위 세포에서 검출되며, 이는 MR 분포 패턴과 전반적으로 일치한다. 심금세포는 MR 또는 MR-유사 수용체를 통해 만노실화된 리간드를 세포내이입시키는 것으로 공지되어 있다. 효소가 근육 세포에서 검출되지 않았음에도 불구하고, 현저하게 감소된 심장 Gb₃ (1.0 또는 3.0 mg/kg 이끼-aGal가 투여된 파브리 마우스에서 ~45% 감소)은, 본 발명자의 면역염색 방법의 검출 한계에 있는 소량의 효소가 심근세포에 전달될 수 있음을 시사한다. 신장에서, 이끼-aGal은 관 상피 세포에서만 검출되었다. 이러한 흡수 메카니즘은 세뇨관이 MR을 발현하는 것으로 보고되어 있지 않기 때문에 명확하지 않다. 잠재적인 해석은 관 세포가 만노스-말단화된 글리코단백질의 세포내이입을 매개하는 다른 수용체(들)를 발현한다는 것이다. MR-유사 결합 활성을 갖는 이러한 미확인된 수용체(들)의 존재가 쥣과 비장 및 림프절에서 보고되었다. 메갈린-매개된 세포내이입을 통한 관 세포에 의한 여과된 효소의 재흡수가 또 다른 가능성이다.

이끼-aGal 및 아갈시다제 알파는 주입 후 2시간째에 분석될 때 다양한 조직 분포를 나타냈다. 아갈시다제 알파와 비교하여, 신장으로의 이끼-aGal의 표적화는 현저하게 향상되었으며, 간으로의 전달은 현저하게 감소되었다. 이끼-aGal의 이러한 분포 패턴이 유리한데, 신장이 이러한 질환으로부터 영향을 받는 주요 기관중 하나이기 때문이다. 간에서, 주입된 아갈시다제 알파는 아마도 M6PR, 아시알로글리코단백질 수용체 및 MR을 통해 간세포 및 동내피 세포 (내피세포 및/또는 쿠퍼 세포) 둘 모두로 전달된다. 주입된 포스포릴화된 효소로 접근할 수 있는 대부분의 M6PR은 간에 함유되어 있다. 이에 반해, 이끼-aGal은 MR을 통해 내피 및 쿠퍼 세포에 우선적으로 전달될 것이다.

심장 및 신장에서 내부화된 이끼-aGal의 반감기는 아갈시다제 알파보다 더 짧았다. 이는 리소좀에서 단백질 분해에 대한 효소의 증가된 감수성을 유도할 수 있는 이끼-aGal에서 더 낮은 탄수화물 함량과 관련이 있을 것으로 보인다. 더욱 신속한 회전율 때문에, 주입 후 4일째에 신장에서 이끼-aGal의 활성은 아갈시다제 알파의 것과 유사하였다. 신장 및 심장에서 Gb₃ 저장의 감소는 주입 후 4일째에 잔여 효소 활성을 반영하였다.

이끼-aGal 및 아갈시다제 알파의 비교는 아갈시다제 알파의 조직 흡수에서 M6PR 및 MR의 역할을 연구하기 위해 유용한 모델로서 작용할 수 있다. 언급된 바와 같이, M6PR 및 MR 둘 모두는 시험관내에서 아갈시다제 알파의 전달을 매개하며, 따라서 어떤 수용체 경로가 특정 표적 기관에서 이러한 효소의 생체분포 및 치료학적 반응을 더욱 담당하는지 결정하기 어렵다. 현저하게 상이한 당 사슬에도 불구하고, 심장 및 신장에서 아갈시다제 알파 및 이끼-aGal의 세포 국소화는 놀랍게도 유사하였다. 이러한 기관에서 축적 제거 효능이 또한 유사하였다. 즉, 완전하게 포스포릴화되지 않은 효소와 비교하여, 아갈시다제 알파에서 M6P 잔기는 예상할 수 있는 것보다 더 넓은 분포 및 더욱 완전한 Gb₃ 제거를 유도하지 못하였다. 이러한 결과는 MR 경로가 심장 및 신장으로의 아갈시다제 알파의 표적화에 있어서 M6PR보다 더욱 중요한 역할을 수행할 수 있음을 시사하였다.

SEQUENCE LISTING <110> greenovation Biotech GmbH <120> Glycosylated lysosomal proteins, method of production and uses <130> r68744 <150> EP15159443.9 <151> 2015-03-17 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vacuolar signal <400> 1 Val Asp Thr Met 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ER retention signal peptide <400> 2 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 3 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp 1 5 10 15 Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys 20 25 30 Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln 65 70 75 80 Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys 180 185 190 Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile 195 200 205 Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly 225 230 235 240 Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp 245 250 255 Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile 260 265 270 Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile 275 280 285 Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe 340 345 350 Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395 <210> 4 <211> 1197 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ttggataatg gattggctag aactcctact atgggatggt tgcattggga gagattcatg 60 tgcaacttgg actgccaaga ggaacctgat tcttgcatct ctgagaagct gttcatggaa 120 atggctgagt tgatggtgtc tgagggatgg aaggatgctg gatacgagta cttgtgcatt 180 gatgattgct ggatggctcc tcagagagat tctgagggaa gattgcaggc tgatcctcag 240 agattccctc atggaattag gcagttggct aactacgtgc actctaaggg attgaagttg 300 ggcatctacg ctgatgtggg aaacaagact tgcgctggat tccctggatc tttcggctac 360 tacgatattg acgctcagac tttcgctgat tggggagtgg atttgttgaa gttcgatgga 420 tgctactgcg acagcttgga gaatttggct gatggataca agcacatgag cttggctttg 480 aataggactg gacggtctat tgtgtactct tgcgagtggc ctctgtacat gtggcctttc 540 cagaagccta actacactga gattaggcag tactgcaacc actggcgaaa cttcgctgat 600 atcgatgact cttggaagtc catcaagtct atcctggatt ggaccagctt caatcaagag 660 cgaattgtgg atgtggctgg acctggtgga tggaatgatc ctgatatgtt ggtgatcgga 720 aacttcggac tgtcttggaa tcagcaagtg actcagatgg ctctgtgggc tattatggct 780 gctcctttgt tcatgagcaa cgatttgagg catattagcc ctcaggctaa ggctttgttg 840 caggataagg atgtgatcgc tatcaaccag gatcctttgg gaaagcaggg ataccagttg 900 agacagggtg ataatttcga ggtgtgggag aggcctttgt ctggattggc ttgggctgtg 960 gctatgatta acagacaaga gattggaggc cctcggagct atacaattgc tgtggcttct 1020 ttgggaaagg gtgtggcttg caatcctgct tgcttcatta ctcagttgtt gcccgtgaag 1080 aggaagttgg gattctacga gtggacttct aggttgcggt cacacattaa ccctactgga 1140 actgtgttgc tgcagttgga gaacactatg cagatgagct tgaaggatct gctgtga 1197 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Physcomitrella patens <400> 5 Met Ala Phe Tyr Lys Ile Ser Ser Val Phe Phe Ile Phe Cys Phe Phe 1 5 10 15 Leu Ile Ala Leu Pro Phe His Ser Tyr Ala 20 25 <210> 6 <211> 497 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 7 <211> 1494 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcccgcccct gcatccctaa gagcttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60 acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtacctt cagccgctat 120 gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc ttgccctgtc accccctgcc 300 caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360 gtacccatgg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctatgcaga cacccctgat 420 gatttccagt tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 480 attcaccgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag cccctggaca 540 tcacccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600 cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720 ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcgtcgcca gtga 1494 <210> 8 <211> 896 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser 20 25 30 Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu 35 40 45 Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala 50 55 60 Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg 100 105 110 Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys 115 120 125 Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val 130 135 140 His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu 165 170 175 Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn 210 215 220 Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro 225 230 235 240 Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu 245 250 255 Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu 260 265 270 Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly 275 280 285 Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr 290 295 300 Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr 325 330 335 Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met 340 345 350 Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe 355 360 365 Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met 370 375 380 Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg 385 390 395 400 Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr 405 410 415 Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro 420 425 430 Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala 435 440 445 Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn 450 455 460 Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn 465 470 475 480 Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu 485 490 495 Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His 500 505 510 Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His 515 520 525 Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg 530 535 540 Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp 545 550 555 560 Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu 565 570 575 Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly 580 585 590 Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu 595 600 605 Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu 610 615 620 Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg 625 630 635 640 Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu 645 650 655 Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe 660 665 670 Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu 675 680 685 Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys 690 695 700 Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln 705 710 715 720 Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala 725 730 735 Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro 740 745 750 Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile 755 760 765 Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro 770 775 780 Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu 785 790 795 800 Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala 805 810 815 Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu 820 825 830 Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val 835 840 845 Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly 850 855 860 Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp 865 870 875 880 Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 885 890 895 <210> 9 <211> 2691 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cagcagggag ccagcagacc agggccccgg gatgcccagg cacaccccgg ccgtcccaga 60 gcagtgccca cacagtgcga cgtccccccc aacagccgct tcgattgcgc ccctgacaag 120 gccatcaccc aggaacagtg cgaggcccgc ggctgttgct acatccctgc aaagcagggg 180 ctgcagggag cccagatggg gcagccctgg tgcttcttcc cacccagcta ccccagctac 240 aagctggaga acctgagctc ctctgaaatg ggctacacgg ccaccctgac ccgtaccacc 300 cccaccttct tccccaagga catcctgacc ctgcggctgg acgtgatgat ggagactgag 360 aaccgcctcc acttcacgat caaagatcca gctaacaggc gctacgaggt gcccttggag 420 accccgcatg tccacagccg ggcaccgtcc ccactctaca gcgtggagtt ctccgaggag 480 cccttcgggg tgatcgtgcg ccggcagctg gacggccgcg tgctgctgaa cacgacggtg 540 gcgcccctgt tctttgcgga ccagttcctt cagctgtcca cctcgctgcc ctcgcagtat 600 atcacaggcc tcgccgagca cctcagtccc ctgatgctca gcaccagctg gaccaggatc 660 accctgtgga accgggacct tgcgcccacg cccggtgcga acctctacgg gtctcaccct 720 ttctacctgg cgctggagga cggcgggtcg gcacacgggg tgttcctgct aaacagcaat 780 gccatggatg tggtcctgca gccgagccct gcccttagct ggaggtcgac aggtgggatc 840 ctggatgtct acatcttcct gggcccagag cccaagagcg tggtgcagca gtacctggac 900 gttgtgggat acccgttcat gccgccatac tggggcctgg gcttccacct gtgccgctgg 960 ggctactcct ccaccgctat cacccgccag gtggtggaga acatgaccag ggcccacttc 1020 cccctggacg tccagtggaa cgacctggac tacatggact cccggaggga cttcacgttc 1080 aacaaggatg gcttccggga cttcccggcc atggtgcagg agctgcacca gggcggccgg 1140 cgctacatga tgatcgtgga tcctgccatc agcagctcgg gccctgccgg gagctacagg 1200 ccctacgacg agggtctgcg gaggggggtt ttcatcacca acgagaccgg ccagccgctg 1260 attgggaagg tatggcccgg gtccactgcc ttccccgact tcaccaaccc cacagccctg 1320 gcctggtggg aggacatggt ggctgagttc catgaccagg tgcccttcga cggcatgtgg 1380 attgacatga acgagccttc caacttcatc aggggctctg aggacggctg ccccaacaat 1440 gagctggaga acccacccta cgtgcctggg gtggttgggg ggaccctcca ggcggccacc 1500 atctgtgcct ccagccacca gtttctctcc acacactaca acctgcacaa cctctacggc 1560 ctgaccgaag ccatcgcctc ccacagggcg ctggtgaagg ctcgggggac acgcccattt 1620 gtgatctccc gctcgacctt tgctggccac ggccgatacg ccggccactg gacgggggac 1680 gtgtggagct cctgggagca gctcgcctcc tccgtgccag aaatcctgca gtttaacctg 1740 ctgggggtgc ctctggtcgg ggccgacgtc tgcggcttcc tgggcaacac ctcagaggag 1800 ctgtgtgtgc gctggaccca gctgggggcc ttctacccct tcatgcggaa ccacaacagc 1860 ctgctcagtc tgccccagga gccgtacagc ttcagcgagc cggcccagca ggccatgagg 1920 aaggccctca ccctgcgcta cgcactcctc ccccacctct acacactgtt ccaccaggcc 1980 cacgtcgcgg gggagaccgt ggcccggccc ctcttcctgg agttccccaa ggactctagc 2040 acctggactg tggaccacca gctcctgtgg ggggaggccc tgctcatcac cccagtgctc 2100 caggccggga aggccgaagt gactggctac ttccccttgg gcacatggta cgacctgcag 2160 acggtgccag tagaggccct tggcagcctc ccacccccac ctgcagctcc ccgtgagcca 2220 gccatccaca gcgaggggca gtgggtgacg ctgccggccc ccctggacac catcaacgtc 2280 cacctccggg ctgggtacat catccccctg cagggccctg gcctcacaac cacagagtcc 2340 cgccagcagc ccatggccct ggctgtggcc ctgaccaagg gtggggaggc ccgaggggag 2400 ctgttctggg acgatggaga gagcctggaa gtgctggagc gaggggccta cacacaggtc 2460 atcttcctgg ccaggaataa cacaatcgtg aatgagctgg tacgtgtgac cagtgaggga 2520 gctggcctgc agctgcagaa ggtgactgtc ctgggcgtgg ccacggcgcc ccagcaggtc 2580 ctctccaacg gtgtccctgt ctccaacttc acctacagcc ccgacaccaa ggtcctggac 2640 atctgtgtct cgctgttgat gggagagcag tttctcgtca gctggtgtta g 2691

Claims (15)

1. 선태류 식물 또는 세포에서 리소좀 단백질을 엔코딩하는 전이유전자를 발현시키는 것을 포함하여 리소좀 단백질 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 리소좀 단백질은 N-말단 분비 신호와 함께 발현되며, 상기 분비 신호는 세포내 처리 동안 선택적으로 제거되며, 상기 방법은 상기 식물 또는 세포로부터 발현된 리소좀 단백질을 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
2. 제 1항에 있어서, 발현된 리소좀 단백질이 식물 또는 세포의 분비된 물질로부터 바람직하게는, 생산 세포 또는 식물을 파괴하지 않으면서 수득되는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 리소좀 단백질이 서열 VDTM (SEQ ID NO: 1)을 갖는 C-말단 액포 신호가 결여되어 있고/거나 서열 KDEL (SEQ ID NO: 2)을 갖는 C-말단 ER 보유 신호가 결여되어 있는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 단백질이 어떠한 C-말단 ER 보유 신호 서열이 결여되어 있고/거나 어떠한 C-말단 액포 신호 서열이 결여되어 있는 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 리소좀 단백질이 천연 리소좀 단백질 또는 이의 절두부의 아미노산을 갖는 C-말단에서 종결되는 발현된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 선태류 식물 또는 세포가 이끼, 바람직하게는, P. 파텐스(P. patens), 식물 또는 세포이고/거나 선태류 식물 또는 세포가 알파1,3-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 베타1,2-자일로실트랜스퍼라제를 억제하거나 제거하는 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 리소좀 단백질 조성물.
8. 글리코실화 패턴에 따라 잠재적으로 다양하게 글리코실화된 복수의 리소좀 단백질을 포함하는 리소좀 단백질 조성물로서, 상기 글리코실화 패턴은 적어도 45%의 포시만노스형(paucimannosidic) N-글리칸 (몰%)을 갖는 리소좀 단백질 조성물.
9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 리소좀 단백질이 α-갈락토시다제, 바람직하게는, α-갈락토시다제 A (GLA); β-글루코세라미다제, β-글루코시다제 (글루코세레브로시다제); α-만노시다제; 아스파르틸글루코사미니다제; β-만노시다제; 산 세레미다제; α-푸코시다제; β-갈락토시다제, β-헥소사미니다제 활성인자 단백질; 갈락토세레브로시다제, 갈락토세라미다제; 리소좀 산 리파제 (LAL); α-아이두로니다제; 아이두로네이트-2-설파타제; 글루코사민-N-설파타제, 헤파란설파트설파미다제 (SGSH); α-N-아세틸-글루코사미니다제 (NAGLU); α-글루코사미니데-N-아세틸트랜스퍼라제; N-아세틸갈락토사민-6-설파타제; β-갈락토시다제; N-아세틸갈락토사민-4-설파타제; β-글루코로니다제; 뉴라미니다제; 스핑고마이엘리나제, 스핑고마이엘린 포스포디에스테라제; 산 알파-1,4-글루코시다제; β-헥소사미니다제, 또는 이의 α 서브유닛; 알파-N-아세틸갈락토사미니다제 (NAGA), α-갈락토사미니다제; β-헥소사미니다제 A; 갈락토스-6-설페이트 설파타제; 히알루로니다제로부터 선택된 임의의 것인 리소좀 단백질 조성물.
10. 제 7항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 리소좀 단백질이 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 하나 이상의 포시만노스형 N-글리칸을 갖는 리소좀 단백질 조성물:
    

    

    
    (화학식 1)
    상기 식에서, 사각형은 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 나타내며, 원은 만노스 (Man)를 나타내며, T가 있는 원은 말단 만노스를 나타내며, GlcNAc 또는 Man 서브유닛 중 하나 이상은 α1,3-푸코실화될 수 있고/거나, α1,6- 푸코실화될 수 있고/거나 β1,2-자일로실화될 수 있으며, 바람직하게는, 조성물의 리소좀 단백질의 N-글리칸의 적어도 10% (몰%)는 화학식 1의 구조를 포함하거나 이로 구성된다.
11. 제 10항에 있어서, 글리코실화 패턴이 적어도 1%의 화학식 GlcNAc₂-Hex₂-메틸-Hex의 N-글리칸을 가지며/거나 글리코실화 패턴이 하기 N-글리칸을 포함하는 리소좀 단백질 조성물:
    0% 내지 35%, 바람직하게는, 1% 내지 30%, -GlcNAc₂-(Man₂메틸-Hex);
    30% 내지 80%, 바람직하게는, 40% 내지 70%, -GlcNAc₂-Man₃;
    0% 내지 30%, 바람직하게는, 4% 내지 22%, -GlcNAc₂-Man₃-GlcNAc;
    0% 내지 15%, 바람직하게는, 2% 내지 12%, -GlcNAc₂-Man₃-GlcNAc₂;
    0% 내지 5%, 바람직하게는, 0% 내지 3%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₂;
    0% 내지 11%, 바람직하게는, 1% 내지 8%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₃;
    0% 내지 10%, 바람직하게는, 1% 내지 7%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₄;
    0% 내지 10%, 바람직하게는, 1% 내지 7%, -GlcNAc₂-Man₃-Hex₅;
    여기에서, 이들 화합물 모두는 함께 100% 또는 100% 미만에 이르며,
    GlcNAc는 N-아세틸글루코사민 서브유닛이며, Man은 만노스 서브유닛이며, Hex는 헥소스 서브유닛이며, 메틸-Hex는 메틸화된 헥소스 서브유닛, 바람직하게는, 2-O 메틸 헥소스이며; 단 -GlcNAc₂-(Man₂메틸-Hex) 및 -GlcNAc₂-Man₃은 함께 적어도 45%에 이르며 (모든%는 몰%임),
    특히 바람직하게는, Hex는 상기 N-글리칸 중 어느 하나에서 Man이며;
    글리칸의 환원 말단의 GlcNAc는 상기 N-글리칸 중 어느 하나에서 푸코실화되거나 푸코실화되지 않을 수 있으며; 분지점에서 Man는 상기 N-글리칸 중 어느 하나에서 자일로실화되거나 자일로실화되지 않는다.
12. 제 7항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 비-포스포릴화된 리소좀 단백질을 포함하는 리소좀 단백질 조성물.
13. 제 1항에 정의되고, 바람직하게는, 제 2항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에서 추가로 정의된 바와 같은 리소좀 단백질을 엔코딩하는 전이유전자를 포함하는, 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항의 방법을 수행하기에 적합한 선태류 식물 세포 또는 식물.
14. 복합 N-글리칸을 포함하는 리소좀 단백질을 처리하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법이 샘플에 제 7항 내지 제 12항 중의 어느 한 항의 리소좀 단백질을 제공하고, 샘플을 선태류 식물 HEXO, 바람직하게는, HEXO3, 효소와 접촉시켜 선태류 식물 HEXO 효소가 리소좀 단백질로부터 말단 GlcNAc 잔기를 절단하여, 포시만노스형 N-글리칸을 생성하는 것을 포함하는 방법.
15. 제 7항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 따른 리소좀 단백질 조성물을 투여하는 것을 포함하여 리소좀 축적병을 치료하는 방법으로서, 바람직하게는 질병 및 리소좀 단백질이 하기 표로부터 선택되는 방법:
    

    

Images