BR122014021216A2

BR122014021216A2 - Estrutura de proteína multimérica e processo para preparação da estrutura de proteína multimérica

Info

Publication number: BR122014021216A2
Application number: BR122014021216-0A
Authority: BR
Inventors: Avidor Shulman; Ilya Rudefer; Tehila Ben-Moshe; Talia Shekhter; Yaniv Azulay; Yoseph Shaaltiel; Tali Kizhner
Original assignee: Protalix Ltd
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2021-06-01
Also published as: EP3088514A1; EP2542675A1; ES2606532T3; HUS2300038I1; HRP20200428T1; BR112012022029A2; SG10201502609QA; NL301249I1; ES2708843T3; CA2791461C; ZA201206725B; FIC20230032I1; HUE030959T2; JP2013520986A; AU2011222452A1; BR112012022029B1; EP2865751B1; CA2791461A1; SG183558A1; EP2865751A1

Abstract

"estrutura de proteína multimérica e processo para preparação da estrutura de proteína multimérica". divulga no presente documento estruturas de proteínas multiméricas compreendendo no mínimo dois monõmeros de alfa-galactosidase que são ligados covalentemente um ao outro por meio de um grupo de ligação, bem como um processo para preparação das referidas estruturas, e métodos de tratamento da doença de fabry por meio da administração de uma estrutura de proteína multimérica; as estruturas de proteínas multiméricas divulgadas apresentam um desempenho melhorado, em termos de atividade melhora e/ou atividade com maior duração sob condições losossomais e um ambiente com soro.

Description

ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA

Dividido do BR 11 2012 022029 2 depositado em 31/08/2012

[01] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas aplicações, refere-se a novas estruturas de proteínas multiméricas e, mais particularmente, mas não limitado a, a estruturas de proteínas multiméricas de α-galactosidase e a usos desta no tratamento da doença de Fabry.

[02] A enzima lisossomal α-galactosidase-A (α-GAL ou α-Gal A; EC 3.2.1.22) catalisa a remoção de galactose de oligossacarídeos, glicoproteínas e glicolipídeos durante o catabolismo de macromoléculas. Deficiências nas enzimas lisossomais levam à acumulação de seus substratos nos tecidos, condições conhecidas como doenças de armazenamento lisossomal. Em humanos, a falta de α-galactosidase-A funcional leva à acumulação de glicolipídeos contendo resíduos terminais de α-galactose (primariamente globotriaosilceramida, também denominada "ceramida tri-hexosídeo", "CTH" ou "Gb3") nos tecidos, causando a doença de Fabry. A doença de Fabry é um transtorno recessivo ligado ao cromossomo X, descrito primeiramente em 1898, caracterizado por dor crônica, opacidades oculares, deficiência nos rins ou fígado, lesões à pele, deterioração vascular e/ou deficiências cardíacas. A α-galactosidase-A humana recombinante tem a habilidade de restaurar a função das enzimas nos pacientes, e a terapia de substituição de enzimas (ERT) utilizando α-GAL foi aprovada nos Estados Unidos da América em 2003 como um tratamento para a doença de Fabry. A α-GAL tornou-se a segunda proteína recombinante aprovada para o tratamento de um transtorno de armazenamento lisossomal após a β-glucosidase, um tratamento para doença de Gaucher.

[03] As α-GALs recombinantes e endógenas catalisam a hidrólise de glicolipídeos galactosilatados terminais nos lisossomos das células de órgãos como o fígado, rins, baço, coração, etc. Este local de ação natural é caracterizado por seu baixo nível de pH, que chega a alcançar no mínimo 4,5. As enzimas lisossomais, incluindo a α-GAL, são, portanto, projetadas para usar sua atividade máxima nestes baixos níveis de pH.

[04] Os tratamentos atuais de Fabry por ERT têm como base α-GAL recombinante derivado de célula de mamífero, o qual é considerado um tratamento de eficiência limitada. Estes tratamentos somente desaceleram o progresso da doença, mas não são capazes de para o seu progresso e não oferecem uma solução real e completa. Além disso, em alguns casos, a ERT com α-GALs comerciais recombinantes deve ser encerrada devido ao desenvolvimento de uma resposta imunogênica ao tratamento e, em alguns casos, o tratamento não pode ser iniciado, por razão dos problemas de imunogenicidade.

[05] A análise da estrutura do raio-X revela que uma α-GAL humana é uma glicoproteína homodimérica com cada monômero composto por dois domínios, um domínio (β/α)8 contendo o local ativo e um domínio de terminal C contendo oito filamentos β antiparalelos em duas folhas em um β tipo sanduíche [Garman & Garboczi, J Mol Biol 2004, 337:319-335]. Os dois monômeros são dispostos em uma montagem de base ao topo [de ponta a ponta] e a dimerização é não covalente. Os dois monômeros combinam-se com uma interface que se estende ao longo da largura de 75 Å do dímero e enterram 2200 Å2 de área da superfície. Os dois locais ativos do dímero são separados por aproximadamente 50 Å.

[06] A estrutura de cristal da α-GAL foi solvida para uma proteína sem ligantes, bem como para uma proteína de galactose com ligantes. Essas duas estruturas demonstram pouca mudança entre as estruturas com ligantes e sem ligantes. Não obstante, o uso de galactose ao invés de substrato natural, globotriaosilceramida (Gb3) , o último caracterizado por longas cadeias lipídicas capazes de interagir com o local ativo do segundo monômero, pode não levar à evidência de cooperatividade de local ativo. Além disso, evidências bioquímicas sugerem referida cooperatividade, exemplificando a importância da estrutura quaternária homodimérica [Bishop & Desnick, J Biol Chem 1981, 256:1307-1316]. Portanto, as propriedades cinéticas de α-GAL foram estudadas e a cooperatividade entre os monômeros da enzima homodimérica, cada um com um local catalítico de interação, foi demonstrada. Dessa forma, foi sugerido que a atividade e a estabilidade enzimática podem ser dependentes da dimerização.

[07] WO 2009/024977, pelo presente procurado, que foi incorporada para referência conforme definida mais adiante, ensina sobre conjugados de um sacarideo e uma biomolécula, ligados covalentemente entre si por meio de um ligante não hidrofóbico, bem como usos médicos utilizando tais conjugados.

[08] A Solicitação de Patente Internacional N° PCT/IL2010/000956 sob o PCT, pelo presente cessionário, ensina metodologias que utilizam α-galactosidase que exibe uma atividade lisossomal em níveis de pH maiores do que o pH lisossomal.

[09] Antecedentes adicionais da técnica incluem Bendele et al. [Toxicological Sciences 1998, 42:152-157], Patentes dos EUA N°s 5.256804, 5.580757 e 5.766.897, Solicitação de Patente Internacional PCT/NL2007/050684 (publicada como WO 2008/075957), e Seely & Richey [J Chromatography A 2001, 908:235-241].

RESUMO DA INVENÇÃO

[010] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, apresenta-se uma estrutura proteica multimérica que compreende pelo menos dois monômeros de α-galactosidase sendo covalentemente ligados um ao outro por meio de uma porção de ligação, a estrutura proteica multimérica apresentando uma característica selecionada do grupo que consiste de:

(a) uma atividade da α-GALactosidase ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa ao submeter a α-galactosidase nativa a condições plasmáticas humanas por uma hora;
(b) uma atividade da α-galactosidase que diminua ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora por um percentual que seja pelo menos 10% inferior ao percentual pelo qual uma atividade da α-galactosidase nativa diminui ao submeter a α-galactosidase nativa a condições plasmáticas humanas por uma hora;
(c) uma atividade da α-galactosidase que permaneça substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora;
(d) uma atividade da α-galactosidase, ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por uma semana, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa ao submeter a α-galactosidase nativa a condições lisossomais por uma semana;
(e) uma atividade da α-galactosidase que diminua ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por um dia por um percentual que seja pelo menos 10% inferior ao percentual pelo qual uma atividade da α-galactosidase nativa diminui ao submeter a α-galactosidase nativa a condições lisossomais por um dia;
(f) uma atividade da α-galactosidase que permaneça substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por um dia;
(g) uma atividade da α-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a forma nativa da proteína a condições lisossomais;
(h) uma atividade da α-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura proteica multimérica a uma solução aquosa com pH de 7 e uma temperatura de 37 °C, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a α-galactosidase nativa a uma solução aquosa com pH de 7 e uma temperatura de 37°C; e
(i) uma meia-vida circulante em um sistema fisiológico que seja pelo menos 20% maior do que a meia-vida circulante da α-galactosidase nativa.

[011] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, apresenta-se uma estrutura proteica multimérica que compreende pelo menos dois monômeros de α-galactosidase sendo covalentemente ligados um ao outro por meio de uma porção de ligação, onde a porção de ligação não esteja presente na α-galactosidase nativa.

[012] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, apresenta-se uma composição farmacêutica compreendendo uma estrutura proteica multimérica conforme descrito neste documento e um carreador farmaceuticamente aceito.

[013] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, apresenta-se um método para tratar a doença de Fabry, o método compreendendo a administração, em um indivíduo que precise dela, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma estrutura proteica multimérica conforme descrito neste documento, tratando, dessa forma, a doença de Fabry.

[014] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, apresenta-se um processo de preparo de uma estrutura proteica multimérica conforme descrito neste documento, o processo compreendendo a reação da α-galactosidase com um agente de reticulação que compreenda a porção de ligação descrita neste documento e pelo menos dois grupos reativos.

[015] De acordo com algumas configurações da invenção, a porção de ligação descrita neste documento não está presente na α-galactosidase nativa.

[016] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura proteica multimérica apresenta uma característica selecionada do grupo que consiste de:

(a) uma atividade da α-galactosidase ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa ao submeter a α-galactosidase nativa a condições plasmáticas humanas por uma hora;
(b) uma atividade da α-galactosidase que diminua ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora por um percentual que seja pelo menos 10% inferior ao percentual pelo qual uma atividade da α-galactosidase nativa diminui ao submeter a α-galactosidase nativa a condições plasmáticas humanas por uma hora;
(c) uma atividade da α-galactosidase que permaneça substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora;
(d) uma atividade da α-galactosidase, ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por uma semana, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa ao submeter a α-galactosidase nativa a condições lisossomais por uma semana;
(e) uma atividade da α-galactosidase que diminua ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por um dia por um percentual que seja pelo menos 10% inferior ao percentual pelo qual uma atividade da α-galactosidase nativa diminui ao submeter a α-galactosidase nativa a condições lisossomais por um dia;
(f) uma atividade da α-galactosidase que permaneça substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por um dia;
(g) uma atividade da α-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a forma nativa da α-galactosidase a condições lisossomais;
(h) uma atividade da α-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura proteica multimérica a uma solução aquosa com pH de 7 e uma temperatura de 37°C, que seja pelo menos 10% maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a α-galactosidase nativa a uma solução aquosa com pH de 7 e uma temperatura de 37 °C; e
(i) uma meia-vida circulante em um sistema fisiológico que seja maior do que uma meia-vida circulante da α-galactosidase nativa.

[017] De acordo com algumas configurações da invenção, a atividade da α-galactosidase da estrutura proteica multimérica que permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por um dia, permanece, ainda, substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por uma semana.

[018] De acordo com algumas configurações da invenção, a meia-vida circulante da estrutura proteica multimérica que é maior do que uma meia-vida circulante da α-galactosidase nativa, é pelo menos 20% maior do que a meia-vida circulante da α-galactosidase nativa.

[019] De acordo com algumas configurações da invenção, a meia-vida circulante da estrutura proteica multimérica que é maior do que uma meia-vida circulante da α-galactosidase nativa, é pelo menos 50% maior do que a meia-vida circulante da α-galactosidase nativa.

[020] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por uma atividade da α-galactosidase em um órgão mediante a administração da estrutura proteica multimérica em um vertebrado, o órgão sendo selecionado do grupo que consiste do baço, coração e rim.

[021] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura proteica multimérica compreende dois monômeros de α-galactosidase, a estrutura proteica sendo uma estrutura proteica dimérica.

[022] De acordo com algumas configurações da invenção, a α-galactosidase é uma α-galactosidase humana.

[023] De acordo com algumas configurações da invenção, a α-galactosidase é uma α-galactosidase recombinante vegetal.

[024] De acordo com algumas configurações da invenção, a α-galactosidase apresenta uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste da ID. SEQ. N°: 1, ID. SEQ. N°: 2 e ID. SEQ. N°: 3.

[025] De acordo com algumas configurações da invenção, a α-galactosidase é uma α-galactosidase alcalina.

[026] De acordo com algumas configurações da invenção, a α-galactosidase é uma α-galactosidase ácida.

[027] De acordo com algumas configurações da invenção, a porção de ligação compreende um poli(alquilenoglicol) .

[028] De acordo com algumas configurações da invenção, o poli(alquilenoglicol) compreende pelo menos dois grupos funcionais, cada grupo funcional formando uma ligação covalente com um dos monômeros da α-galactosidase.

[029] De acordo com algumas configurações da invenção, os dois grupos funcionais são grupos terminais do poli(alquilenoglicol).

[030] De acordo com algumas configurações da invenção, a porção de ligação apresenta a fórmula:
-X1-(CR1R2-CR3R4-Y) n-X2-
caracterizado pelo fato de que cada X1 e X2 é um grupo funcional que forma uma ligação covalente com pelo menos um monômero da α-galactosidase;
Y é O, S ou NR5;
n é um número inteiro de 1 a 200; e
cada R1, R2, R3, R4 e R5 é independentemente selecionado do grupo que consiste de hidrogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, alquinil, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol e tioalcoxi.

[031] De acordo com algumas configurações da invenção, os grupos funcionais formam uma ligação de amida com um monômero da α-galactosidase.

[032] De acordo com algumas configurações da invenção, n é um número inteiro de 5 a 150.

[033] De acordo com algumas configurações da invenção, n é um número inteiro de 40 a 70.

[034] De acordo com algumas configurações da invenção, a composição farmacêutica compreende, ainda, uma galactose.

[035] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura proteica multimérica destina-se à utilização como medicamento.

[036] De acordo com algumas configurações da invenção, o medicamento destina-se a tratar a doença de Fabry.

[037] De acordo com algumas configurações da invenção, a estrutura proteica multimérica destina-se à utilização no tratamento da doença de Fabry.

[038] De acordo com algumas configurações da invenção, o processo compreende a reação da α-galactosidase dimérica com o agente de reticulação.

[039] De acordo com algumas configurações da invenção, os grupos reativos compreendem um grupo de partida.

[040] De acordo com algumas configurações da invenção, o grupo reativo reage com um grupo amina para formar uma ligação de amida.

[041] De acordo com algumas configurações da invenção, cada um dos grupos reativos é capaz de formar uma ligação covalente entre a porção de ligação e pelo menos um monômero da α-galactosidase.

[042] De acordo com algumas configurações da invenção, uma relação molar do agente reticulante com os monômeros de α-galactosidase está na faixa de 5:1 a 500:1.

[043] De acordo com algumas configurações da invenção, a relação molar está na faixa de 75:1 a 300:1.

[044] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por alguém com habilidade comum na técnica à qual a invenção se refere. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou no teste de configurações da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[045] O depósito da patente ou solicitação contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias dessa patente ou da publicação da solicitação de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[046] Algumas configurações da invenção são descritas neste documento apenas por meio de exemplo, com referência aos desenhos que as acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, deve-se destacar que as particularidades mostradas são exemplares e para propósitos de discussão ilustrativa de configurações da invenção. A esse respeito, a descrição juntamente com os desenhos torna aparente àqueles com habilidade na técnica como as configurações da invenção podem ser praticadas.

Nos desenhos:

[047] A figura 1 é um gráfico que mostra a atividade de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal, como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C).

[048] A figura 2 é um gráfico que mostra a atividade de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal, e uma α-GAL-I recombinante vegetal com galactose (100 mg/mL), como uma função do tempo de incubação sob condições fisiológicas simuladas (pH 7,4, 37°C).

[049] A figura 3 é um gráfico que mostra a atividade de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal, como uma função do tempo de incubação no plasma humano a 37°C.

[050] A figura 4 é um gráfico que mostra a atividade de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal, e uma α-GAL-I recombinante vegetal com galactose (100 mg/mL), como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C).

[051] A figura 5 é um esquema que descreve as estruturas moleculares de agentes reticulantes bis-N-hidroxisuccinimida-poli(etilenoglicol) (bis-NHS-PEG) exemplares.

[052] A figura 6 é um esguema que descreve uma proteina dimérica que reagiu com agentes reticulantes bis-NHS-PEG.

[053] A figura 7 apresenta uma varredura de um gel de SDS-PAGE mostrando a α-GAL-I recombinante vegetal que foi reagida com bis-NHS-PEG5 (colunas 1-3), bis-NHS-PEG8 (colunas 7-9), e bis-NHS-PEG45 (colunas 4-6), a uma relação molar de 50:1 (colunas 1, 4 e 7), 100:1 (colunas 2, 5 e 8) e 200:1 (colunas 3, 6 e 9) bis-NHS-PEG : α-GAL, bem como marcadores de peso molecular (Mw) e α-GAL-I recombinante vegetal não reagida padrão (Std) (as setas mostram a banda que compreende um dimero de α-GAL).

[054] A figura 8 apresenta uma varredura de um gel com foco isoelétrico mostrando a α-GAL-I recombinante vegetal que foi reagida com bis-NHS-PEG5 (colunas 1-3) , bis-NHS-PEG8 (colunas 7-9) , e bis-NHS-PEG45 (colunas 4-6), a uma relação molar de 50:1 (colunas 1, 4 e 7), 100:1 (colunas 2, 5 e 8) e 200:1 (colunas 3, 6 e 9) bis-NHS-PEG : α-GAL, bem como marcadores de pH (M) e α-GAL-I recombinante vegetal não reagida padrão (Std) (as setas mostram os valores de pH de várias bandas).

[055] A figura 9 é um espectro da espectroscopia de massa MALDI-TOF de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 (o eixo x indica valores de m/z, e os valores de m/z dos picos são mostrados).

[056] A figura 10 é um espectro da espectroscopia de massa MALDI-TOF de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada por bis-NHS-PEG8 (o eixo x indica valores de m/z, e os valores de m/z dos picos são mostrados).

[057] A figura 11 apresenta uma fotografia mostrando o substrato AJ-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida trihexosida (Gb3-NBD) de α-GAL e o produto de reação lactosil ceramida-nitrobenzoxadiazol (lactosil ceramida-NBD) de α-GAL, conforme visualizado por irradiação sob luz UV (365 nm) após cromatografia de camada fina de alto desempenho, após a incubação do substrato Gb3-NBD com α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (coluna da esquerda), α-GAL Replagal® (coluna central) e sem α-GAL (coluna da direita).

[058] As figuras 12A, 12B e 12C são gráficos que mostram a atividade de α-GAL Fabrazyme®, α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal, e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG5 (FIG. 12A) , bis-NHS-PEG8 (FIG. 12B) e bis-NHS-PEG45 (FIG. 12C) a uma relação molar de 50:1 ("1" na FIG. 12A, "7" na FIG. 12B e "4" na FIG. 12C) , 100:1 ("2" na FIG. 12A, "8" na FIG. 12B e "5" na FIG. 12C) , e 200:1 ("3" na FIG. 12A, "9" na FIG. 12B e "6" na FIG. 12C) bis-NHS-PEG: α-GAL como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C);

[059] A figura 13 é um gráfico que mostra o perfil farmacocinético de α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal, e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 no plasma de camundongos Fabry; a atividade residual de cada α-GAL é apresentada como um percentual da atividade residual máxima de cada α-GAL, como uma função do tempo após a injeção das α-GALs.

[060] As figuras 14A e 14B apresentam um gráfico (FIG. 14A) mostrando a atividade de α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I) , e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEGs (prh-alfa-GAL-I-CL8) ou bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos baços de camundongos Fabry 2 horas após a injeção de α-GAL, e uma fotografia de um Western blot (FIG. 14B) mostrando α-GAL Replagal® (colunas 10-12 e 15) , α-GAL-I recombinante humana vegetal (colunas 7-9 e 13) , e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG8 (colunas 4-6) ou bis-NHS-PEG45 (colunas 1-3 e 14) nos baços de camundongos Fabry após injeção de α-GAL (colunas 1-12) ou como um padrão consistindo de 50 ng de α-GAL (colunas 13-15) .

[061] As figuras 15A e 15B apresentam um gráfico (FIG. 15A) mostrando a atividade de α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I) , e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEGs (prh-alfa-GAL-I-CL8) ou bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45 ) nos fígados de camundongos Fabry 2 horas após a injeção de α-GAL, e uma fotografia de um Western blot (FIG. 15B) mostrando α-GAL Replagal® (colunas 10-12 e 15), α-GAL-I recombinante humana vegetal (colunas 7-9 e 13), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG8 (colunas 4-6) ou bis-NHS-PEG45 (colunas 1-3 e 14) nos fígados de camundongos Fabry após injeção de α-GAL (colunas 1-12) ou como um padrão consistindo de 50 ng de α-GAL (colunas 13-15) .

[062] A figura 16 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG8 (prh-alfa-GAL-I-) ou bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos corações de camundongos Fabry 2 horas após a injeção de α-GAL.

[063] A figura 17 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG8 (prh-alf α-GAL-I-CL8 ) ou bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos rins de camundongos Fabry 2 horas após a injeção de α-GAL.

[064] A figura 18 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos baços de camundongos Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dias e 7 dias após a injeção de α-GAL (α-GAL endógena tipo selvagem (WT - wild type) é mostrada como padrão).

[065] A figura 19 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos fígados de camundongos Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dias e 7 dias após a injeção de α-GAL (α-GAL endógena tipo selvagem (WT) é mostrada como padrão).

[066] A figura 20 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos corações de camundongos Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dias e 7 dias após a injeção de α-GAL (α-GAL endógena tipo selvagem (WT) é mostrada como padrão).

[067] A figura 21 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal® e α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-I-CL45) nos rins de camundongos Fabry 2 horas, 24 horas, 3 dias e 7 dias após a injeção de α-GAL (α-GAL endógena tipo selvagem (WT) é mostrada como padrão).

[068] A figura 22 apresenta uma fotografia de uma imagem de um gel de SDS-PAGE mostrando α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® (coluna da esquerda), e α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® que foi reagida com bis-NHS-PEG45 (coluna central), bem como marcadores de peso molecular (coluna da direita; os pesos moleculares dos marcadores são indicados em unidades de Kda) .

[069] A figura 23 apresenta uma fotografia de um gel com foco isoelétrico mostrando α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® (coluna da esquerda) , e α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® que foi reagida com bis-NHS-PEG45 (coluna central), bem como marcadores de pH (coluna da direita).

[070] As figuras 24A e 24B são espectros da espectroscopia de massa MALDI-TOF de α-GAL recombinante humana de mamífero (FIG. 24A), e α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada por bis-NHS-PEG45 (o eixo x indica valores de m/z, e os valores de m/z (em unidades de Da) dos picos são mostrados).

[071] A figura 25 é um gráfico de Michaelis-Menten mostrando a velocidade (V) de hidrólise de p-nitrofenil-α-D-galactopiranosida (pNP-G) por α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® (Replagal) e α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® reticulada por bis-NHS-PEG45 (Replagal CL45), como uma função da concentração de pNP-G.

[072] As figuras 26A e 26B são gráficos que mostram a atividade de α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® (Replagal) e α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® reticulada por bis-NHS-PEG45 (Replagal-CL45) como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C) (FIG. 26A) ou no plasma humano a 37°C (FIG. 26B) .

[073] As figuras 27A-27D são gráficos mostrando a atividade de α-GAL Replagal® (R) e de α-GAL Replagal® reticulada com bis-NHS-PEG45 (R-CL45) nos baços (FIG. 27A), fígados (FIG. 27B), corações (FIG. 27C) e rins (FIG. 27D) de camundongos Fabry 2 horas após a injeção de α-GAL.

[074] As figuras 28A-28D são gráficos mostrando os níveis de Gb3 nos corações (FIG. 28A), rins (FIG. 28B), fígados (FIG. 28C) e baços (FIG. 28D) de camundongos Fabry, como uma função do tempo após a injeção de α-GAL Replagal® (R) ou de α-GAL Replagal® reticulada com bis-NHS-PEG45 (R-CL45) .

[075] As figuras 29A e 29B apresentam varreduras dos géis de SDS-PAGE mostrando α-GAL-II recombinante humana vegetal (FIGs. 29A e 29B, coluna 2), e α-GAL-II recombinante humana vegetal que foi reagida bis-NHS-PEG21 (FIG. 29A, coluna 3), bis-NHS-PEG45 (FIG. 29A, coluna 4), ou bis-NHS-PEG68 (FIG. 29B, coluna 3), bem como marcadores de peso molecular (FIGs. 29A e 29B, coluna 1; os pesos moleculares dos marcadores são indicados em unidades de Kda).

[076] As figuras 30A-30C são espectros da espectroscopia de massa MALDI-TOF de α-GAL-II recombinante humana vegetal (FIG. 30A), e de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG21 (FIG. 30B) ou bis-NHS-PEG45 (FIG. 30C) (o eixo x indica valores de m/z, e valores de m/z (em unidades de Da) dos picos são mostrados).

[077] As figuras 31A-31D são gráficos mostrando a atividade de α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® (Replagal), α-GAL-II recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-II) e α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG2i (prh-alfa-GAL-II-CL2i; FIGs. 31A e 31C) , bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45; FIGs. 31A-31D) ou bis-NHS-PEG68 (prh-alfa-GAL-II-CL68; FIGs. 31B e 31D) como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C) (FIGs. 31A e 31B) ou no plasma humano a 37°C (FIGs. 31C e 31D) (os dados apresentados nas FIGs. 31C e 31D são de experimentos diferentes).

[078] As figuras 32A e 32B são gráficos mostrando os perfis farmacocinéticos de α-GAL Replagal® (Replagal), α-GAL-II recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-II), e α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45) no plasma de camundongos Fabry; a concentração de cada α-GAL é apresentada como uma função do tempo após a injeção de α-GAL (FIGs. 32A e 32B apresentam os mesmos dados em diferentes periodos de tempo).

[079] As figuras 33A-33L são gráficos mostrando a atividade de α-GAL Replagal® (Replagal), α-GAL-II recombinante humana vegetal (prh-alfa-GAL-II) e α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 (prh-alfa-GAL-II-CL45; FIGs. 33A-33L) ou bis-NHS-PEG21 (prh-alfa-GAL-II-CL21; FIGs. 33E-33L), nos corações (FIGs. 33A, 33E e 331), rins (FIGs. 33B, 33F e 33J), fígados (FIGs. 33C, 33G e 33K) , e baços (FIGs. 33D, 33H e 33L) de camundongos Fabry 2 horas (FIGs. 33A-33H) , 7 dias (FIGs. 33A-33D e 331-33L) , 14 dias (FIGs. 33A-33D) e 28 dias (FIGs. 33A-33D) após a injeção de α-GAL.

[080] As figuras 34A-34C são gráficos mostrando os parâmetros cinéticos Vmax (FIG. 34A) , KM (FIG. 34B) e kcat (FIG. 34C) , para α-GAL-II recombinante humana vegetal (prh-alphα-GAL-II) e α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-alphα-GAL-II-CL45), como uma função do pH.

[081] A figura 35 apresenta uma varredura de um gel de SDS-PAGE mostrando a α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-I), e a α-GAL-I recombinante humana vegetal que foi reagida com NHS-PEG metoxi-encapsulada apresentando um peso molecular de 2 KDa (prh-α-GAL-I-PEG 2000), 5 KDa (prh-α-GAL-I-PEG 5000) ou 10 KDa (prh-α-GAL-I-PEG 10000), bem como marcadores de peso molecular (coluna da esquerda; os pesos moleculares dos marcadores são indicados em unidades de Kda).

[082] As figuras 36A e 36B são Çfráficos que mostram a atividade de α-GAL recombinante humana de mamífero Fabrazyme® (Fabrazyme), α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® (Replagal), α-GAL-I recombinante humana vegetal e α-GAL-I recombinante humana vegetal que foi reagida com NHS-PEG metoxi-encapsulada apresentando um peso molecular de 2 KDa (α-GAL-I-PEG 2000), 5 KDa (α-GAL-I-PEG 5000) ou 10 KDa (α-GAL-I-PEG 10000), como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C) (FIG. 36A) ou em plasma humano a 37°C (FIG. 36B).

[083] A figura 37 apresenta uma varredura de um gel de SDS-PAGE mostrando a α-GAL-I recombinante vegetal que foi reagida com bis-NHS-PEG2 (colunas 1-3), bis-NHS-PEG4 (colunas 4-6), bis-NHS-PEG68 (colunas 7-9), bis-NHS-PEG150 (colunas 10-12) e bis-NHS-PEG45 (CL45) , a uma relação molar de 50:1 (colunas 1, 4, 7 e 10), 100:1 (colunas 2, 5, 8 e 11) e 200:1 (colunas 3, 6, 9 e 12) bis-NHS-PEG:α-GAL, bem como marcadores de peso molecular (MW) .

[084] A figura 38 apresenta uma varredura de um gel de SDS-PAGE mostrando a α-GAL-I recombinante vegetal que foi reagida com bis-COOH-PEG12 (colunas 1-3) , bis-COOH-PEG28 (colunas 4-6) , bis-COOH-PEG45 (colunas 7-9) , e bis-NHS-PEG45 (CL45) , a uma relação molar de 50:1 (colunas 1, 4 e 7), 100:1 (colunas 2, 5 e 8) e 200:1 (colunas 3, 6 e 9) bis-NHS-PEG:α-GAL, bem como marcadores de peso molecular (MW), e α-GAL-I recombinante vegetal não reagida como controle (com).

[085] A figura 39 é um gráfico mostrando a atividade de α-GAL Replagal®, α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-I), e α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 (prh-α-GAL-I-CL45), bis-NHS-PEG4 (prh-α-GAL-I-CL4), bis-NHS-PEG2 (prh-α-GAL-I-CL2) , bis-COOH-PEG45 (prh-α-GAL-I-CLA45) bis-COOH-PEG28 (prh-α-GAL-I-CLA28) ou bis-COOH-PEG12 (prh-α-GAL-I-CLA12) como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37 °C) .

[086] As figuras 40A e 40B são gráficos que mostram a atividade de α-GAL-II humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 como uma função do tempo de incubação sob condições lisossomais simuladas (tampão fosfato-citrato, pH 4,6, 37°C) (FIG. 40A) ou no plasma humano a 37°C (FIG. 40B) (FIG. 40B mostra a atividade de α-GAL recombinante de mamífero Replagal® e de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada para comparação).

[087] A figura 41 apresenta uma varredura de um gel de SDS-PAGE mostrando α-GAL-II recombinante vegetal de 3 lotes diferentes (colunas 1-3) e α-GAL-II recombinante vegetal que foi reagida com bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (colunas 4-8), bem como marcadores de peso molecular (MW).

[088] A figura 42 apresenta uma varredura de um gel com foco isoelétrico mostrando α-GAL-II recombinante vegetal de 3 lotes diferentes (colunas 1-3) e α-GAL-II recombinante vegetal que foi reagida com bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (colunas 4-8), bem como marcadores de pH (M).

[089] As figuras 43A-43F são espectros da espectroscopia de massa MALDI-TOF de α-GAL-II recombinante humana vegetal (FIG. 43A), e de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes (FIGs. 43B-43F, respectivamente) (o eixo x indica valores de m/z, e valores de m/z (em unidades de Da) dos picos são mostrados).

[090] A Figura 44 é um gráfico que mostra a velocidade catalítica (V) da atividade da α-GAL exibida pela α-GAL-II humana vegetal reticulada por bis-NHS-PEG45 de 5 lotes diferentes, como uma função da concentração do substrato (p-nitrofenil-α-D-galactopiranosida).

DESCRIÇÃO DE CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[091] A presente invenção, em algumas de suas configurações, se refere a novas estruturas proteicas multiméricas e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a estruturas proteicas multiméricas de □-galactosidase e à sua utilização no tratamento da doença de Fabry.

[092] Antes de explicar pelo menos uma aplicação da invenção detalhadamente, deve-se compreender gue a invenção não está, necessariamente, limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de ser praticada ou realizada de várias formas.

[093] Deficiências de uma proteína lisossomal (por exemplo, defeitos em uma proteína lisossomal ou ausência de uma proteína lisossomal) podem causar danos consideráveis à saúde de um indivíduo (uma doença do armazenamento lisossomal). A terapia de reposição enzimática (ERT - Enzyme Replacement Therapy) , na qual a proteína deficiente é administrada a um paciente, tem sido utilizada em tentativas para tratar doenças de armazenamento lisossomal. No entanto, a administração da proteína deficiente não necessariamente resulta em um aumento considerável e/ou persistente da atividade da proteína in vivo.

[094] A doença de Fabry é um exemplo de uma doença de armazenamento lisossomal recessiva (herdada) ligada ao X que pode causar uma ampla variedade de sintomas sistêmicos. Uma deficiência da enzima lisossomal □-galactosidase A devido a mutação faz com que um glicolipideo conhecido como globotriaosilceramida (também conhecido como Gb3 ou ceramida trihexosida) se acumule dentro dos vasos sanguíneos, outros tecidos e órgãos. Esse acúmulo leva a uma deterioração de sua função adequada. Duas terapias de reposição enzimática (ERTs) estão disponíveis para compensar funcionalmente a deficiência de α-galactosidase. A algasidase alfa (Replagal®, Shire) e a algasidase beta (Fabrazyme®, Genzyme) são formas recombinantes da enzima humana α-galactosidase A. Essas enzimas são difíceis de serem fabricadas e, como tal, são caras. Recentemente, uma contaminação na planta da Genzyme em Allston, MA, causou uma escassez de algasidase beta, e os suprimentos foram racionados para pacientes em um terço da dose recomendada.

[095] Conforme se mostra neste documento, as α-galactosidases exercem sua atividade máxima em baixos níveis de pH, característicos dos lisossomos, enquanto sua atividade em níveis de pH mais elevados é comprometida. Dessa forma, por exemplo, a α-galactosidase utilizada na ERT teria pouca capacidade de hidrolizar glicolipídeos galactosilados terminais no soro de pacientes com Fabry.

[096] Além disso, conforme mostrado adicionalmente neste documento, mesmo sob condições lisossomais, a atividade das α-galactosidases é gradualmente comprometida, embora a uma taxa mais lenta do que em niveis mais elevados de pH.

[097] Motivados pela necessidade de resolver a atividade comprometida das α-galactosidases, os presentes inventores pesquisaram formas estabilizadas da α-galactosidase (α-GAL). Mais especificamente, os presentes inventores idealizaram que uma forma estabilizada de α-galactosidase exibiria atividade mais duradoura em geral, incluindo atividade mais prolongada no soro. Dessa forma, os presentes inventores projetaram e prepararam e praticaram com sucesso formas estabilizadas de α-galactosidase nativa e, de fato, mostraram que essas formas estabilizadas exibem um desempenho melhorado em termos de melhora da atividade e/ou atividade mais prolongada tanto sob condições lisossomais quanto em um ambiente sérico, que permite uma melhora da atividade da proteína in vivo.

[098] Os presentes inventores demonstraram a formação de formas estabilizadas de α-galactosidase que exibem um desempenho melhorado por meio da reticulação de α-galactosidase nativa, através da formação de nova ligação covalente entre os monômeros da α-galactosidase.

[099] Agora, com referência aos desenhos, as Figuras 1 e 4 mostram a diminuição da atividade enzimática sob condições lisossomais para α-GAL I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL I) e α-GAL Fabrazyme® e Replagal®. As Figuras 2 e 3 mostram a diminuição da atividade enzimática sob condições fisiológicas simuladas ou no plasma humano, para as mesmas variedades de α-GAL. As Figuras 2 e 4 mostram que a galactose reduz a taxa da diminuição da atividade da α-GAL.

[0100] A Figura 5 mostra agentes de reticulação de PEG (polietilenoglicol) exemplares, de acordo com configurações opcionais da invenção. A Figura 6 descreve um dimero reticulado de α-GAL de acordo com configurações opcionais da invenção.

[0101] As Figuras 7-10 e 37 mostram que a prh-α-GAL-I reagiu com agentes reticulantes exemplares compreendendo porções de N-hidroxissuccinimida. A Figura 38 mostra que a prh-α-GAL-I reagiu com agentes reticulantes exemplares compreendendo grupos carboxila, após a ativação in situ com N-hidroxissuccinimida. As Figuras 7, 37 e 38 mostram que a reação com o agente reticulante resultou no aparecimento da α-GAL primariamente em uma forma dimérica ao invés de uma forma monomérica sob condições de desnaturação, indicando que a estrutura quaternária da α-GAL era mantida por reticulação covalente. A Figura 11 mostra que a α-GAL reticulada manteve sua atividade enzimática.

[0102] As Figuras 12A-12C e 39 mostram que a prh-α-GAL-I reticulada exibe uma atividade mais duradoura do que a α-GAL não reticulada sob condições lisossomais simuladas. O aumento da estabilidade é mais forte em ligantes PEG28 e PEG45 do que em ligantes PEG mais curtos. A figura 13 mostra que a prh-α-GAL-I reticulada exibe uma atividade mais duradoura do que a α-GAL não reticulada no plasma in vivo. As Figuras 14A-21 mostram que a prh-α-GAL-I reticulada exibe uma atividade melhorada in vivo no baço, no fígado, no coração e nos rins. A melhora da atividade da α-GAL é mais forte em ligantes PEG45 do que em ligantes PEG mais curtos. As Figuras 15A, 15B e 19 mostram que embora a prh-α-GAL-I reticulada exiba uma atividade melhorada in vivo, a atividade melhorada não é tão concentrada no fígado quanto a atividade da α-GAL Replagal®.

[0103] Os resultados acima indicam que a α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada resulta em um dímero com estabilidade melhorada, que permite um aumento mais eficaz da atividade da α-GAL quando administrada in vivo.

[0104] De forma semelhante, as Figuras 22-28D mostram que a reticulação da α-GAL recombinante humana de mamífero resulta em um dímero covalentemente ligado (Figuras 22-24B), que exibe atividade enzimática normal (Figura 25), bem como atividade mais prolongada tanto sob condições lisossomais quanto no plasma (Figuras 26A-26B), e atividade melhorada in vivo no baço, fígado, coração e nos rins (Figuras 27A-28D).

[0105] De forma semelhante, as Figuras 29A-33L mostram que a reticulação da α-GAL II recombinante humana vegetal resulta em um dímero covalentemente ligado (Figuras 29-30), que exibe atividade enzimática mais prolongada tanto sob condições lisossomais quanto no plasma (Figuras 31A-31B), e atividade melhorada in vivo no plasma e no fígado, coração e nos rins (Figuras 32A-33L). Conforme mostram as FIGs. 33A-33L, a reticulação com um ligante PEG45 foi particularmente eficaz na melhora da atividade in vivo.

[0106] Esses resultados indicam que os efeitos vantajosos da reticulação são aplicáveis a uma variedade de proteínas α-GAL.

[0107] As Figuras 34A-34C mostram que a reticulação da α-GAL melhora os parâmetros da catálise enzimática da α-GAL, amplia a faixa de pH para a atividade da α-GAL, e permite a atividade da α-GAL em pH de aproximadamente 7 ou mais.

[0108] As Figuras 35-36B mostram que a PEGuilação sem reticulação não tem efeito significativo sobre a atividade da α-GAL, indicando que os efeitos vantajosos da reticulação são especificamente devidos à reticulação, ao invés de um efeito da PEGuilação.

[0109] As Figuras 40-44 mostram que a reticulação da α-GAL, de acordo com as configurações da invenção, permite boa reprodutibilidade da estabilidade (Figuras 40A-40B), grau de reticulação covalente (Figuras 41-43F) e propriedades enzimáticas (Figura 44) da α-GAL reticulada.

[0110] Os resultados apresentados neste documento mostram que as estruturas proteicas multiméricas covalentemente reticuladas de α-galactosidase são caracterizadas por uma estabilidade maior e atividade melhorada sob condições fisiologicamente relevantes, em comparação com as formas nativas de α-galactosidase.

[0111] Dessa forma, a estrutura proteica multimérica covalentemente ligada pode exibir uma atividade que é maior do que a atividade de uma forma nativa de α-galactosidase, como resultado de a atividade da forma nativa decair mais rapidamente ao longo do tempo do que a atividade da estrutura proteica multimérica reticulada, que é estabilizada pela reticulação covalente.

[0112] A estrutura proteica multimérica covalentemente reticulada pode exibir uma atividade que é maior do que a atividade de uma forma nativa de α-galactosidase, também devido a uma maior atividade inicial (por exemplo, devido a diferentes parâmetros de atividade), isto é, independentemente de qualquer redução de atividade ao longo do tempo.

[0113] De fato, de acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, apresenta-se uma estrutura proteica multimérica que compreende pelo menos dois monômeros de α-galactosidase sendo covalentemente ligados um ao outro por meio de uma porção de ligação. De acordo com algumas configurações, a estrutura proteica multimérica apresenta uma estabilidade maior do que aquela da α-galactosidase nativa e/ou uma atividade inicial maior do que aquela da α-galactosidase nativa, conforme descrito em detalhes abaixo.

[0114] Neste documento, o termo "monômero" com relação à α-galactosidase refere-se a um polipeptideo individual da α-galactosidase. O polipeptideo pode incluir substitutos não-peptidicos (por exemplo, uma ou mais porções sacarídicas) .

[0115] Neste documento, o termo "nativo" com relação à α-galactosidase envolve proteínas que compreendem uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica (isto é, pelo menos 95% de homologia, opcionalmente pelo menos 99% de homologia e, opcionalmente, 100%) a uma sequência de aminoácidos de uma proteína α-galactosidase que ocorre naturalmente. Uma α-galactosidase nativa pode ser uma proteína isolada de uma fonte natural, ou uma proteína produzida recombinatemente (por exemplo, derivada de células de mamíferos, de células vegetais, de células de levedura, de células bacterianas, de células de insetos).

[0116] O termo "nativa", quando utilizado em referência a uma estrutura quaternária de α-galactosidase (por exemplo, um dímero de α-galactosidase), compreende, ainda, uma estrutura quaternária substancialmente idêntica àquela de uma proteína que ocorre naturalmente.

[0117] Neste documento, a frase "proteína que ocorre naturalmente" refere-se a uma proteína em uma forma que ocorre na natureza (por exemplo, em um organismo), com relação à sequência de aminoácidos da proteína, bem como à estrutura quaternária da proteína se a proteína estiver em uma forma multimérica.

[0118] Modificações pós-translacionais (por exemplo, a glicosilação) de proteínas α-galactosidase que ocorrem naturalmente (por exemplo, em um organismo que expressa a proteína α-galactosidase que ocorre naturalmente) podem estar presentes, ausentes ou modificadas na forma nativa da α-galactosidase referida neste documento. Uma forma nativa de α-galactosidase (por exemplo, uma α-galactosidase produzida de forma recombinante) pode, opcionalmente, compreender modificações pós-translacionais diferentes do que aquelas da α-galactosidase que ocorre naturalmente, desde que a forma nativa da α-galactosidase retenha uma sequência e estrutura de aminoácidos substancialmente semelhante à da α-galactosidase que ocorre naturalmente, conforme descrito acima.

[0119] Neste documento, a forma nativa de uma proteína pode se referir a uma estrutura monomérica (por exemplo, um monômero da α-galactosidase) e/ou a uma estrutura multimérica (por exemplo, um dímero da α-galactosidase). Por exemplo, uma proteína dimérica pode ser descrita como uma forma nativa de α-galactosidase, e um polipeptídeo monomérico em uma proteína dimérica pode ser descrito como uma forma nativa do monômero α-galactosidase.

[0120] Opcionalmente, a estrutura proteica multimérica descrita neste documento é uma estrutura dimérica, assim como a forma nativa da α-galactosidase.

[0121] Alternativamente, a estrutura proteica multimérica compreende mais de dois monômeros de α-galactosidase. Por exemplo, a estrutura proteica multimérica pode ser um tetrâmero, um hexâmero ou um octâmero que compreende monômeros de α-galactosidase.

[0122] As estruturas proteicas multiméricas descritas neste documento compreendem ligações covalentes que ligam os monômeros α-galactosidase naquele lugar, e que estão ausentes da forma nativa da α-galactosidase.

[0123] Opcionalmente, a porção de ligação que liga os monômeros de α-galactosidase é uma porção que não está presente em uma forma nativa de α-galactosidase (por exemplo, uma porção de ligação sintética).

[0124] Dessa forma, por exemplo, a porção de ligação é, opcionalmente, uma porção que é covalentemente ligada a uma cadeia lateral, um N-terminal ou um C-terminal, ou uma porção relacionada a modificações pós-translacionais (por exemplo, uma porção sacaridica) de outro monômero da α-galactosidase. Essas porções de ligação são descritas exemplarmente em detalhes a seguir.

[0125] Alternativamente, a porção de ligação faz parte dos monômeros da α-galactosidase que estão sendo ligados (por exemplo, uma parte de uma cadeia lateral, N-terminal ou C-terminal, ou uma porção relacionada a modificações pós-translacionais (por exemplo, uma porção sacaridica) de um monômero da α-galactosidase, bem como de uma cadeia lateral, um N-terminal ou um C-terminal, ou uma porção relacionada a modificações pós-translacionais (por exemplo, uma porção sacaridica) de outro monômero da α-galactosidase).

[0126] Dessa forma, por exemplo, a porção de ligação pode ser uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação de amida) entre um grupo funcional de uma cadeia lateral, N-terminal, C-terminal ou porção relacionada a modificações pós-translacionais de um monômero (por exemplo, uma amina), e um grupo funcional complementar de uma cadeia lateral, N-terminal, C-terminal ou porção relacionada a modificações pós-translacionais de outro monômero (por exemplo, carboxila), onde essa ligação covalente é ausente da forma nativa da α-galactosidase. Outras ligações covalentes, como, por exemplo, uma ligação de éster (entre um grupo hidroxi e uma carboxila); uma ligação de tioéster; uma ligação de éter (entre dois grupos hidroxi); e uma ligação tioéter; uma ligação de anidrido (entre duas carboxilas); uma ligação de tioamida; uma ligação de carbamato ou tiocarbamato, também são contempladas.

[0127] Opcionalmente, a porção de ligação é desprovida de uma ligação de dissulfeto. No entanto, uma porção de ligação que inclui uma ligação de dissulfeto em uma posição que não forma uma ligação entre os monômeros (por exemplo, clivagem da ligação de dissulfeto não cliva a ligação entre os monômeros) está dentro do escopo dessa aplicação da invenção. Uma vantagem potencial da porção de ligação desprovida de uma ligação de dissulfeto é que ela não é susceptível à clivagem por condições levemente redutoras, como são as ligações de dissulfeto.

[0128] Opcionalmente, a porção de ligação é uma porção não-peptídica (por exemplo, a porção de ligação não consiste de uma ligação de amida, um aminoácido, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um oligopeptídeo ou um polipeptídeo).

[0129] Alternativamente, a porção de ligação pode ser, ou pode compreender, uma porção peptídica (por exemplo, um aminoácido, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um oligopeptídeo ou um polipeptídeo).

[0130] Opcionalmente, a porção de ligação não é simplesmente uma extensão linear de quaisquer dos monômeros da α-galactosidase ligados a ela (isto é, o N-terminal e o C-terminal da porção peptídica não estão ligados diretamente ao C-terminal ou ao N-terminal de quaisquer dos monômeros da α-galactosidase).

[0131] Alternativamente, a porção de ligação é formada pela ligação covalente direta de um N-terminal de um monômero da α-galactosidase com um C-terminal de outro monômero da α-galactosidase, de forma a produzir um polipeptídeo fusionado. Esse polipeptídeo não será uma forma nativa de uma α-galactosidase, embora possa compreender dois monômeros da α-galactosidase essencialmente em sua forma nativa.

[0132] No entanto, a ligação covalente de monômeros da α-galactosidase descrita neste documento ocorre preferivelmente em uma forma que não seja a ligação direta de um N-terminal a um C-terminal.

[0133] A porção de ligação também é referida neste documento como uma porção reticulante. A ligação de monômeros de α-galactosidase por uma porção de ligação é referida neste documento como "reticulante".

[0134] A porção reticulante pode ser uma ligação covalente, um átomo ou grupo químico (por exemplo, um grupo C(=O)-O-, -O-, -S-, NR-, -N=N-, -NH-C(=O)-NH-, e grupos semelhantes) ou uma porção de ligação (composta de uma cadeia de grupos químicos).

[0135] Uma porção de ligação pode ser, por exemplo, um grupo polimérico ou oligomérico.

[0136] A porção de ligação é uma porção multifuncional (por exemplo, birradical, trirradical, etc.) ligada a cadeias laterais, porções relacionadas a modificações pós-translacionais (por exemplo, porções sacarídicas) e/ou terminais (isto é, N-terminais, C- terminais) de dois ou mais dos monômeros.

[0137] Conforme exemplificado neste documento na seção Exemplos, porções de ligação relativamente curtas (por exemplo, PEG2, PEG4, PEG5) podem ser menos eficazes do que porções de ligação mais longas (por exemplo, PEG28, PEG45) na reticulação entre diferentes monômeros da α-galactosidase.

[0138] Então, de acordo com algumas configurações, a porção de ligação não é uma ligação covalente, um átomo ou grupo químico, mas, de preferência, uma porção de ligação.

[0139] Portanto, de acordo com algumas configurações, a porção de ligação apresenta pelo menos 10 átomos de comprimento, opcionalmente pelo menos 20 átomos de comprimento, opcionalmente pelo menos 30 átomos de comprimento, opcionalmente pelo menos 50 átomos de comprimento, opcionalmente pelo menos 100 átomos de comprimento e, opcionalmente, pelo menos 200 átomos de comprimento.

[0140] Neste documento, o comprimento de uma porção de ligação (quando expresso como um número de átomos) refere-se ao comprimento da cadeia principal da porção de ligação, isto é, o número de átomos que formam uma cadeia linear entre os resíduos de cada um dos dois monômeros ligados por meio da porção de ligação.

[0141] Opcionalmente, a porção de ligação está abaixo de um determinado tamanho, de forma a evitar uma parte desnecessariamente excessiva da porção de ligação na proteína reticulada formada que pode interferir com a função da proteína.

[0142] Portanto, de acordo com algumas configurações, cada porção de ligação é caracterizada por um peso molecular inferior a 20 KDa, opcionalmente inferior a 10 KDa, opcionalmente inferior a 5 KDa e, opcionalmente, inferior a 3 KDa.

[0143] A fim de facilitar a reticulação, a porção de ligação é opcionalmente, substancialmente flexível, caracterizada pelo fato de que as ligações na cadeia principal da porção de ligação são, na maioria, rotacionalmente livres, por exemplo, ligações simples que não são acopladas a uma ligação dupla (por exemplo, diferente de uma ligação de amida) e caracterizada pelo fato de que a rotação não seja estericamente impedida. Opcionalmente, pelo menos 70%, opcionalmente pelo menos 80% e opcionalmente pelo menos 90% (por exemplo, 100%) das ligações na cadeia principal da porção de ligação são rotacionalmente livres.

[0144] Em algumas configurações, a porção de ligação compreende uma cadeia de poli(alquilenoglicol).

[0145] A frase "poli(alquilenoglicol)", conforme utilizada neste documento, compreende uma família de polímeros de poliéter que compartilham a seguinte fórmula geral: -O-[(CH2)m-O-]n-, caracterizada pelo fato de que m representa o número de grupos metileno presentes em cada unidade de alquilenoglicol, e n representa o número de unidades repetidas e, portanto, representa o tamanho ou comprimento do polímero. Por exemplo, quando m = 2, o polímero é chamado de polietilenoglicol, e quando m = 3, o polímero é chamado de polipropilenoglicol.

[0146] Em algumas configurações, m é um número inteiro maior do que 1 (por exemplo, m = 2, 3, 4, etc.).

[0147] Opcionalmente, m varia entre as unidade da cadeia de poli(alquilenoglicol). Por exemplo, uma cadeia de poli(alquilenoglicol) pode compreender as unidades tanto de etilenoglicol (m = 2) quanto de propilenoglicol (m = 3) ligadas.

[0148] Opcionalmente, o poli(alquilenoglicol) compreende pelo menos dois grupos funcionais (por exemplo, conforme descrito neste documento), cada grupo funcional formando uma ligação covalente com um dos monômeros da α-galactosidase. Os grupos funcionais são, opcionalmente, grupos terminais do poli(alquilenoglicol), de forma que o comprimento total do poli(alquilenoglicol) fique entre os dois grupos funcionais.

[0149] A frase "poli(alquilenoglicol)" também compreende análogos dele, nos quais o átomo de oxigênio é substituído por outro heteroátomo como, por exemplo, S, -NH-, e outros semelhantes. Esse termo abrange, ainda, derivados dos análogos acima, nos quais um ou mais dos grupos metileno que compõem o polímero são substituídos. Substitutos exemplares dos grupos metileno incluem, mas não se limitam a, alquil, cicloalquil, alquenil, alquinil, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol e tioalcoxi, e substitutos semelhantes.

[0150] A frase "unidade de alquilenoglicol", conforme utilizada neste documento, abrange um grupo -(CH2)m-O- ou um análogo dele, conforme descrito acima, que forma a cadeia principal do poli(alquilenoglicol) , caracterizada pelo fato de que o (CH2)m (ou análogo dele) é ligado a um heteroátomo que pertence a outra unidade de alquilenoglicol ou a uma porção do monômero da α-galactosidase (em caso de uma unidade terminal), e o O (ou heteroátomo análogo dele) é ligado ao (CH2)m (ou análogo dele) de outra unidade de alquilenoglicol, ou a um grupo funcional que forma uma ligação com um monômero da α-galactosidase.

[0151] Uma unidade de alquilenoglicol pode ser ramificada, de forma a ser ligada a 3 ou mais unidades de alquilenoglicol vizinhas, caracterizada pelo fato de que cada uma das 3 ou mais unidades de alquilenoglicol vizinhas fazem parte de uma cadeia de poli(alquilenoglicol) . Essa unidade de alquilenoglicol ramificada é ligada por meio de seu heteroátomo a uma unidade de alquilenoglicol vizinha, e os heteroátomos das unidades de alquilenoglicol vizinhas restantes são, cada um, ligados a um átomo de carbono da unidade de alquilenoglicol ramificada. Além disso, um heteroátomo (por exemplo, nitrogênio) pode se ligar a mais de um átomo de carbono de uma unidade de alquilenoglicol da qual faça parte, formando, dessa forma, uma unidade de alquilenoglicol ramificada (por exemplo, [(-CH2)m]2N- e unidades semelhantes).

[0152] Em configurações exemplares, pelo menos 50% das unidades de alquilenoglicol são idênticas, por exemplo, elas compreendem os mesmos heteroátomos e os mesmos valores de m que as outras. Opcionalmente, pelo menos 70%, opcionalmente pelo menos 90% e opcionalmente 100% das unidades de alquilenoglicol são idênticas. Em configurações exemplares, os heteroátomos ligados a unidades de alquilenoglicol idênticas são átomos de oxigênio. Em configurações exemplares adicionais, m é 2 para as unidades idênticas.

[0153] Em uma configuração, o ligante é um ligante de cadeia simples, linear, preferivelmente sendo polietilenoglicol (PEG).

[0154] Conforme utilizado neste documento, o termo "poli(etilenoglicol)" descreve um poli(alquilenoglicol), conforme definido acima, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 90% e, preferivelmente, 100% das unidades de alquilenoglicol são -CH2CH2-O-. De forma semelhante, a frase "unidades de etilenoglicol" é definida neste documento como unidades de -CH2CH2O-.

[0155] De acordo com configurações opcionais, a porção de ligação compreende um poli(etilenoglicol) ou um análogo dele, apresentando a fórmula geral:
-X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2-
caracterizada pelo fato de que cada X1 e X2 é um grupo funcional (por exemplo, conforme descrito neste documento) que forma uma ligação covalente com pelo menos um monômero da α-galactosidase.
Y é O, S ou NR5 (opcionalmente O);
n é um número inteiro, opcionalmente de 1 a 200 (opcionalmente de 5 a 150, e opcionalmente de 40 a 70), embora valores mais elevados de n também sejam contemplados; e
cada R1, R2, R3, R4 e R5 é independentemente selecionado do grupo que consiste de hidrogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, alquinil, alcoxi, hidroxi, oxo, tiol e tioalcoxi.

[0156] Em algumas configurações, n é pelo menos 5, opcionalmente pelo menos 8, opcionalmente pelo menos 15, opcionalmente pelo menos 25 e opcionalmente pelo menos 40.

[0157] Em algumas configurações, n é não mais do que 200, opcionalmente não mais do que 150 e opcionalmente não mais do que 70.

[0158] O poli(etilenoglicol) ou análogo dele pode, opcionalmente, compreender um copolímero, por exemplo, caracterizado pelo fato de que as unidades de CR1R2-CR3R4-Y na fórmula acima não são todas idênticas umas às outras.

[0159] Em algumas configurações, pelo menos 50% de unidades de CR1R2-CR3R4-Y são idênticas. Opcionalmente, pelo menos 70%, opcionalmente pelo menos 90% e opcionalmente 100% das unidades de CR1R2-CR3R4-Y são idênticas.

[0160] Opcionalmente, a porção de ligação é ramificada, por exemplo, de forma que para uma ou mais unidades de CR1R2-CR3R4-Y da fórmula acima, pelo menos um dentre R1, R2, R3, R4, e R5 seja - (CR1R2-CR3R4-Y)P-X3-, caracterizado pelo fato de que R1-R4 e Y são conforme definido acima, p é um número inteiro conforme definido neste documento para n (por exemplo, de 1 a 200), e X3 é conforme definido neste documento para X1 e X2.

[0161] Os grupos funcionais podem, opcionalmente, formar uma ligação como, mas limitada a, uma ligação de amida, uma ligação de amida [sic], uma ligação de éster e/ou uma ligação de éter.

[0162] Por exemplo, o grupo funcional pode, opcionalmente, compreender um grupo carbonila que forma uma ligação de amida com um átomo de nitrogênio em um polipeptideo (por exemplo, em um resíduo de lisina ou N-terminal), ou uma ligação de éster com um átomo de oxigênio em um polipeptideo (por exemplo, em um resíduo de serina, treonina ou tirosina).

[0163] Alternativamente ou adicionalmente, o grupo funcional pode, opcionalmente, compreender um heteroátomo (por exemplo, N, S, O) que forma uma ligação de amida, ligação de éster ou ligação de tioéster com um grupo carbonila em um polipeptideo (por exemplo, em um resíduo de glutamato ou de aspartato ou em um C-terminal).

[0164] Alternativa ou adicionalmente, o grupo funcional pode compreender um grupo alquila ou arila ligado a um polipeptideo (por exemplo, a um heteroátomo no polipeptideo).

[0165] Alternativamente ou adicionalmente, o grupo funcional pode, opcionalmente, compreender um átomo de nitrogênio que forma uma ligação de amina com um grupo alquila em um monômero da α-galactosidase, ou um monômero da α-galactosidase pode, opcionalmente, compreender um átomo de nitrogênio que forma uma ligação de amina com um grupo alquila no grupo funcional. Essa ligação de amina pode ser formada por aminação redutora (por exemplo, conforme descrito abaixo).

[0166] Em algumas configurações, pelo menos um dos grupos funcionais forma uma ligação de amida com um polipeptideo (por exemplo, com um resíduo de lisina naquele lugar).

[0167] Os grupos funcionais podem ser idênticos uns aos outros ou diferentes.

[0168] Em algumas configurações, pelo menos um dos grupos funcionais é ligado a uma funcionalidade de um polipeptideo (por exemplo, um grupo amina de um resíduo de lisina ou N-terminal), e pelo menos um dos grupos funcionais é ligado a uma funcionalidade diferente de um polipeptideo (por exemplo, um grupo tiol de um resíduo de cisteína).

[0169] De acordo com configurações opcionais, a estrutura proteica multimérica descrita neste documento exibe uma alta estabilidade em condições plasmáticas humanas e/ou em condições lisossomais.

[0170] Conforme utilizada neste documento, a frase "condições plasmáticas humanas" refere-se ao plasma humano como meio, a uma temperatura de 37°C.

[0171] Conforme utilizada neste documento, a frase "condições lisossomais" refere-se a uma solução aquosa com um pH de 4,6 como meio (por exemplo, um tampão fosfato-citrato descrito neste documento), a uma temperatura de 37°C.

[0172] A estabilidade melhorada sob condições lisossomais é vantajosa porque o lisossomo é um alvo para terapia de reposição para α-galactosidase, uma vez que os lisossomos são o local normal para a atividade da α-galactosidase em um organismo, e as condições lisossomais (por exemplo, pH acidico) representam condições ideais para a atividade da α-galactosidase.

[0173] Sem estar preso a qualquer teoria particular, acredita-se que a estabilidade melhorada em condições semelhantes à sérica (por exemplo, as condições plasmáticas humanas descritas neste documento) também é vantajosa porque a α-galactosidase estável no sangue pode agir sobre metabólitos (por exemplo, Gb3) presentes no sangue devido ao efluxo das células. Uma estrutura proteica multimérica ativa em soro pode, opcionalmente, ser eficiente na remoção e na prevenção de glicoesfingolipideos depositados dentro das paredes do vaso sanguíneo que promovem inflamação [Bodary et al., TCM 17 (4) :129-133] . Por exemplo, na doença de Fabry, a maior patogênese resulta do acúmulo de Gb3 no endotélio vascular, levando à oclusão vascular de pequenos vasos, isquemia e infarto desses vasos e isquemia e infarto do rim, do coração e do cérebro [Desnick et al., 2003, Annals of Internal Medicine, 138 (4) :338-346]. Adicionalmente, a estabilidade melhorada em soro pode negar a necessidade de tráfego lisossomal. Dessa forma, a ERT pode se tornar muito mais acessível, uma vez que sistemas robustos, eficientes em termos de custo, por exemplo, as plantas, podem ser empregados.

[0174] De acordo com configurações opcionais, a alta estabilidade da estrutura proteica multimérica em condições plasmáticas humanas é tal que a estrutura proteica multimérica exibe, ao ser submetida a condições plasmáticas humanas por uma hora, uma atividade da α-galactosidase que seja pelo menos 10% maior, opcionalmente 20% maior, opcionalmente 50% maior e, opcionalmente, 100% maior, do que a atividade de α-galactosidase de α-galactosidase nativa ao submeter a α-galactosidase nativa a condições plasmáticas humanas por uma hora.

[0175] Alternativamente ou adicionalmente, a alta estabilidade da estrutura proteica multimérica em condições plasmáticas humanas é tal que uma atividade da α-galactosidase da estrutura proteica multimérica diminui mais lentamente em condições plasmáticas humanas do que uma atividade correspondente da α-galactosidase nativa. Opcionalmente a estrutura proteica multimérica exibe uma atividade que diminui ao submeter a estrutura proteica a condições plasmáticas humanas por uma hora com um percentual que seja pelo menos 10% inferior, opcionalmente 20% inferior, opcionalmente 50% inferior e, opcionalmente, 80% inferior ao percentual pelo qual uma atividade correspondente da α-galactosidase nativa diminui ao submeter a α-galactosidase nativa a condições plasmáticas humanas por uma hora.

[0176] Deve-se compreender que neste documento, uma diminuição que seja "10% inferior" a uma diminuição de 50% refere-se a uma diminuição de 45% (45 sendo 10% inferior a 50%), e não a uma diminuição de 40% (50% - 10%) .

[0177] Alternativamente ou adicionalmente, a alta estabilidade da estrutura proteica multimérica em condições plasmáticas humanas é tal que uma atividade de α-galactosidase da estrutura proteica multimérica permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições plasmáticas humanas por uma hora e, opcionalmente por 2, 4 ou até mesmo 6 horas.

[0178] Conforme utilizada neste documento, a frase "substancialmente inalterada" se refere a um nível (por exemplo, de atividade) que permanece em uma variação de 50% a 150% do nível inicial e, opcionalmente, um nível que permanece pelo menos 60%, opcionalmente pelo menos 70%, opcionalmente pelo menos 80% e, opcionalmente, pelo menos 90% do nível inicial.

[0179] Opcionalmente, a alta estabilidade da estrutura proteica multimérica em condições lisossomais é tal que a estrutura proteica multimérica exibe, ao ser submetida a condições lisossomais por um período de tempo pré-determinado (por exemplo, um dia, dois dias, 3 dias, uma semana), uma atividade de α-galactosidase que seja pelo menos 10% maior, opcionalmente 20% maior, opcionalmente 50% maior e, opcionalmente, 100% maior, do que uma atividade da α-galactosidase nativa ao submeter a α-galactosidase nativa a condições lisossomais pelo mesmo período de tempo pré-determinado.

[0180] Alternativamente ou adicionalmente, a alta estabilidade da estrutura proteica multimérica em condições plasmáticas humanas é tal que uma atividade de α-galactosidase da estrutura proteica multimérica diminui mais lentamente em condições lisossomais do que uma atividade correspondente da α-galactosidase nativa. Opcionalmente a estrutura proteica multimérica exibe uma atividade que diminui ao submeter a estrutura proteica a condições lisossomais por um período de tempo pré-determinado (por exemplo, um dia, 2 dias, 3 dias, uma semana), por um percentual que seja pelo menos 10% inferior, opcionalmente 20% inferior, opcionalmente 50% inferior e, opcionalmente, 80% inferior ao percentual pelo qual uma atividade correspondente da α-galactosidase nativa diminui ao submeter a α-GAL actosidase nativa a condições lisossomais pelo mesmo período de tempo.

[0181] Alternativamente ou adicionalmente, a alta estabilidade da estrutura proteica multimérica em condições lisossomais é tal que uma atividade de α-galactosidase da estrutura proteica multimérica permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura proteica multimérica a condições lisossomais por um dia, por 2 dias, por 3 dias, por uma semana, por duas semanas e/ou por um mês.

[0182] Conforme exemplificado na seção Exemplos deste documento, além de exibir mais estabilidade ao longo do tempo, a estrutura proteica multimérica pode exibir parâmetros de atividade da α-galactosidase que são diferentes daqueles da α-galactosidase nativa.

[0183] Portanto, de acordo com configurações opcionais, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por exibir, independente de qualquer diminuição de atividade ao longo do tempo, uma atividade de α-galactosidase que é maior do que uma atividade da α-galactosidase de uma forma nativa da proteína. Opcionalmente, a atividade é 10% maior e opcionalmente 20% maior, do que a atividade correspondente da forma nativa.

[0184] A fim de caracterizar essa atividade, a atividade é preferivelmente determinada imediatamente (por exemplo, dentro de 1 hora, dentro de 15 minutos) após submeter a α-galactosidase nativa ou a estrutura proteica multimérica a condições (por exemplo, conforme descrito neste documento) nas quais a atividade diminui substancialmente, de forma que a atividade medida refletirá a atividade em si, e não um grau de estabilidade.

[0185] Opcionalmente, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por exibir uma atividade da α-galactosidase em condições lisossomais que é maior do que uma atividade correspondente da α-galactosidase nativa.

[0186] Alternativamente ou adicionalmente, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por exibir uma atividade da α-galactosidase em condições fisiológicas simuladas em pH neutro que é maior do que uma atividade correspondente da α-galactosidase nativa. As condições fisiológicas simuladas compreendem uma solução aquosa (por exemplo, tampão fosfato salino) a uma temperatura de 37°C. O pH é, opcionalmente, 7. Alternativamente, o pH é 7,4.

[0187] A atividade da α-galactosidase descrita neste documento é uma atividade biológica que é característica da α-galactosidase (por exemplo, uma atividade catalítica característica da α-galactosidase, como a hidrólise de uma porção terminal α-GALactosil de um substrato).

[0188] Em algumas configurações, uma atividade catalítica da α-galactosidase é caracterizada por uma taxa de catálise na saturação (isto é, um valor de Vmax) .

[0189] Alternativamente, uma atividade da α-galactosidase é uma atividade terapêutica (por exemplo, uma atividade enzimática apresentando um efeito terapêutico) , como uma atividade terapêutica no contexto da doença de Fabry. Opcionalmente, a atividade terapêutica é determinada em animais experimentais (por exemplo, camundongos Fabry) e, opcionalmente, em pacientes humanos com Fabry.

[0190] Técnicas para determinar uma atividade da α-galactosidase serão conhecidas para uma pessoa com habilidade. Tipicamente, a α-galactosidase (isto é, a forma nativa ou uma estrutura proteica multimérica descrita neste documento) entra em contato com um composto reconhecido na técnica como um substrato da α-galactosidase, e o grau de atividade é, então, determinado quantitativamente. Compostos que permitem a detecção particularmente conveniente de uma atividade da α-galactosidase são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente.

[0191] Em algumas configurações, a atividade da α-galactosidase é determinada testando a hidrólise de 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida (por exemplo, conforme descrito na seção Exemplos deste documento).

[0192] Em algumas configurações, a atividade da α-galactosidase é determinada testando a hidrólise de p-nitrofenil-α-D-galactopiranosida (por exemplo, conforme descrito na seção Exemplos deste documento).

[0193] Ao comparar uma atividade de uma estrutura proteica multimérica descrita neste documento com uma atividade da α-galactosidase nativa, a α- galactosidase nativa preferivelmente comprende monômeros de α-galactosidase substancialmente idênticos (por exemplo, com relação à sequência de aminoácidos e padrão de glicosilação) aos monômeros de α-galactosidase da estrutura multimérica.

[0194] De acordo com algumas configurações, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por uma meia-vida circulante em um sistema fisiológico (por exemplo, sangue, soro e/ou plasma de um humano ou animal de laboratório) que seja maior (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 50% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 900% maior) do que uma meia-vida circulante da α-galactosidase nativa.

[0195] Um aumento da meia-vida circulante pode, opcionalmente, estar associado com uma estabilidade maior in vitro (por exemplo, conforme descrito neste documento), uma estabilidade maior in vivo (por exemplo, resistência ao metabolismo) e/ou com outros fatores (por exemplo, depuração renal reduzida).

[0196] As meias-vidas circulantes podem ser determinadas coletando amostras (por exemplo, amostras de sangue, amostras de tecido) de sistemas fisiológicos (por exemplo, humanos, animais de laboratório) em vários intervalos e determinando um nível de α-galactosidase na amostra, utilizando métodos conhecidos na técnica.

[0197] Opcionalmente, a meia-vida é calculada como uma meia-vida terminal (por exemplo, conforme descrito na seção Exemplos) , caracterizada pelo fato de que a meia-vida é o tempo necessário para uma concentração (por exemplo, uma concentração sanguínea) diminuir até 50% depois que o pseudoequilíbrio de distribuição for alcançado. A meia vida-terminal pode ser calculada a partir de uma porção terminal linear de um tempo vs. a concentração em log, pela regressão linear do tempo vs. a concentração em log (vide, por exemplo, Toutain & Bousquet-Melou [J Vet Pharmacol Ther 2004, 27:427-39]). Dessa forma, a meia-vida terminal é a medida da diminuição na concentração plasmática da droga devido à eliminação da droga e não de diminuições devidas a outros motivos, e não é, necessariamente, o tempo necessário para que a quantidade de droga administrada diminua pela metade.

[0198] A determinação de um nível de α-galactosidase (por exemplo, a estrutura proteica multimérica ou a α-galactosidase nativa) pode compreender a detecção da presença física de uma α-galactosidase (por exemplo, por meio de um anticorpo contra a α-galactosidase) e/ou a detecção de um nível de uma atividade da α- galactosidase (por exemplo conforme descrito neste documento).

[0199] De acordo com algumas configurações, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por uma atividade da α-galactosidase em um órgão (por exemplo, baço, coração, rim, cérebro, fígado) pela administração (por exemplo, administração intravenosa) da estrutura proteica em um vertebrado (por exemplo, um humano, um camundongo) , por exemplo, um vertebrado com uma deficiência de α-galactosidase (por exemplo, um paciente humano com doença de Fabry, um camundongo de Fabry). Opcionalmente, a atividade da α-galactosidase no órgão é maior do que uma atividade de α-galactosidase da α-galactosidase nativa no órgão, com a administração equivalente em um vertebrado.

[0200] A atividade em um órgão pode ser uma função da absorção da α-galactosidase e/ou retenção da atividade da α-galactosidase após a absorção.

[0201] Opcionalmente, a atividade da α-galactosidase no órgão é determinada 2 horas após a administração e, opcionalmente, 24 horas, opcionalmente 3 dias, opcionalmente 7 dias e, opcionalmente, 14 dias após a administração.

[0202] O aumento da atividade da α-galactosidase no fígado pode, em alguns casos estar associado com uma atividade menor em outras partes de um organismo e, portanto, com um efeito biológico reduzido da α-galactosidase.

[0203] Portanto, em algumas configurações, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por uma atividade melhorada da α-galactosidase em um órgão que não seja o fígado. Órgãos exemplares incluem o baço, o coração e os rins.

[0204] Em algumas configurações, a estrutura proteica multimérica é caracterizada por uma atividade melhorada da α-galactosidase em um órgão após a administração (conforme descrito neste documento) que seja pelo menos 20% maior, opcionalmente pelo menos 50% maior, opcionalmente pelo menos 100% maior e, opcionalmente, pelo menos 300% maior, do que a atividade da α-galactosidase nativa depois de uma administração equivalente. Conforme observado acima, os presentes inventores desenvolveram e prepararam e praticaram com sucesso formas estabilizadas de α-galactosidase por meio de estruturas multiméricas de monômeros de α-galactosidase reticulados.

[0205] Opcionalmente, a α- galactosidase é uma α-galactosidase humana (por exemplo, uma α-galactosidase recombinante humana), por exemplo, a fim de facilitar a compatibilidade adequada para administração em indivíduos humanos. A α-galactosidase está disponível comercialmente, por exemplo, como Replagal® (algasidase alfa, Shire) e Fabrazyme® (algasidase beta, Genzyme).

[0206] Neste documento, "α-galactosidase humana" refere-se a uma α-galactosidase que compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica (por exemplo, conforme descrito acima) a uma sequência de aminoácidos de uma proteína α-galactosidase que ocorre naturalmente em humanos.

[0207] Em algumas configurações, a α-galactosidase é uma α-galactosidase recombinante vegetal, α-galactosidases exemplares incluem α-galactosidases recombinantes humanas vegetais.

[0208] Exemplos de α-GAL incluem, sem limitação, α-GAL com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de ID. SEQ N°: 1, ID. SEQ. N°: 2, e ID. SEQ. N°: 3. Opcionalmente, a α-GAL apresenta uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de ID. SEQ. N°: 2, e ID. SEQ. N°: 3.

[0209] Conforme utilizado neste documento, "α-galactosidase" refere-se a qualquer proteína que apresente uma atividade enzimática (por exemplo, hidrólise) dirigida às porções de galactose em Gb3 (por exemplo, α-galactosidase A) . Opcionalmente, "α- galactosidase " refere-se a E.C. 3.2.1.22.

[0210] A α-galactosidase de configurações da invenção pode ser purificada (por exemplo, a partir de tecido de plantas ou animais) ou gerada pela tecnologia do DNA recombinante.

[0211] Conforme descrito neste documento, a atividade da α-galactosidase em soro pode ser totalmente vantajosa, por exemplo, para reduzir os níveis de Gb3 no soro.

[0212] Portanto, em algumas configurações, a α-galactosidase é uma α-galactosidase alcalina.

[0213] Conforme utilizada neste documento, a frase "α-galactosidase alcalina" refere-se a uma α-GAL caracterizada pela capacidade de hidrolisar porções de α-galactose ligados ao terminal a partir de oligossacarideos contendo galactose sob condições de pH neutro a básico (por exemplo, aproximadamente pH 7 - 7,5), particularmente a um pH sérico normal (por exemplo, aproximadamente 7,35 - 7,45).

[0214] Apreciar-se-á que uma D-GAL alcalina de algumas configurações da invenção pode ser ativa sob condições de pH neutro ou básico, mas pode, ainda exibir atividade sob condições de pH acidico (isto é, aproximadamente 4,6).

[0215] Em uma configuração específica, a enzima é ativa sob condições de pH acídico a básico (isto é, aproximadamente pH 4,2-7,5).

[0216] Ainda, em outra configuração específica, a enzima é ativa sob pH de aproximadamente 6,57,5.

[0217] Exemplos específicos de α-galactosidases alcalinas que podem ser utilizados de acordo com os presentes ensinamentos são apresentados na Solicitação de Patente dos EUA 20070036883, W003/097791, e na PCT/IL2010/000956, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0218] Dessa forma, a α-galactosidase alcalina pode ser um membro da família de plantas selecionada do grupo que consiste das famílias Cucurbitaceae, Lamiaceae, Piperaceae, Solanaceae, Leguminosae, Cruciferae e Gramineae.

[0219] De acordo com uma configuração específica, a α-galactosidase alcalina vem do melão.

[0220] P.-R. Gaudreault e J. A. Webb descreveram em diversas publicações, (como "Alkaline alpha-galactosidase in leaves of Cucurbita pepo", Plant Sci. Lett. 24, 281-288, 1982, "Partial purification and properties of an alkaline alphα-galactosidase from mature leaves of Cucurbita pepo", Plant Physiol., 71, 662-668, 1983, e "Alkaline alpha-galactosidase activity and galactose metabolism in the family Cucurbitaceae", Plant Science, 45, 71-75, 1986), uma nova α-galactosidase purificada a partir de folhas jovens de Cucurbita pepo, que apresenta uma excelente atividade em condições alcalinas (pH 7,5). Além da α-galactosidase alcalina, eles também relataram três formas ácidas da enzima, e preferências distintas do substrato foram encontradas para as formas ácida e alcalina.

[0221] A atividade da α-galactosidase em pH alcalino foi observada em outro tecido de cucurbita, como pedúnculos de pepinos, abóboras jovens e melões jovens ("Melons: Biochemical and Physiological Control of Sugar Accumulation", In: Encyclopedia of Agricultural Science, vol. 3, pp. 25-37, Arntzen, C. J. , et al., eds. Academic Press, New York, 1994).

[0222] Bachmann et al. ("Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptens L.", Plant Physiology 105:1335-1345, 1994) que plantas de Ajuga reptens (erva de são lourenço comum), um translocador de estaquiose da família Lamiaceae não relacionada também contém uma α-galactosidase alcalina. Essa enzima foi caracterizada particularmente e descobriu-se que tinha alta afinidade com a estaquiose. Também, folhas da planta Peperomia camptotricha L. , da família Piperaceae, apresentam atividade da α-galactosidase em pH alcalino, sugerindo que elas também contêm uma enzima α-galactosidase alcalina (Madore, M. , "Catabolism of raffinose family oligosaccharides by vegetative sink tissues", In: Carbon Partitioning and Source-Sink Interactions in Plants, Madore, M. and Lucas, W. J. (eds.) pp. 204-214, 1995, Sociedade Americana de Fisiologistas Vegetais, Maryland). De forma semelhante, Gao e Schaffer (Plant Physiol. 1999; 119:979-88, que está incorporado neste documento por referência) relataram uma atividade da α-galactosidase com pH alcalino excelente em extratos brutos de tecidos de uma variedade de espécies incluindo membros das famílias Cucurbit e Coleus (Lamiaceae) families.

[0223] Exemplos específicos de sequências alcalinas de α-galactosidase vegetal são apresentados nas ID. SEQ. Nos: 4, 5 e 13 (Cucumis melo), 6 (T. tetragonioid.es) , 7 e 12 (Cucumis sativus) , 8 e 9 (Zea mays), 10 (Oruza sativa), 11 (Pisum sativum) e 14 (Coffea arabica) .

[0224] Em algumas configurações, a α- galactosidase é uma α-galactosidase ácida.

[0225] Conforme utilizado neste documento, "α-galactosidase ácida" refere-se à α- galactosidase caracterizada pela capacidade de hidrolisar porções de α-galactose ligadas ao terminal a partir de oligossacarídeos contendo galactose sob condições de pH acídico (por exemplo, aproximadamente pH 4,2 - 5), como o que ocorre em um lisossomo.

[0226] A α-galactosidase de configurações da invenção pode ser de fonte humana, animal ou vegetal, desde que nenhuma reação imunológica excessivamente adversa seja induzida pela administração in vivo (por exemplo, vegetal para humanos).

[0227] A fim de reduzir a reação imunológica, uma preparação de α-galactosidase não humana (por exemplo, de α-galactosidase vegetal) pode ser coadministrada com uma α-galactosidase humana (isto, α- galactosidase humana ácida).

[0228] Opcionalmente, a estrutura proteica multimérica compreende, ainda, pelo menos uma porção de manose-6-fosfato (M6P). A porção (ou porções) de M6P pode ser ligada a um ou mais dos monômeros de α-galactosidase da estrutura proteica multimérica (por exemplo, por meio de um ligante).

[0229] Técnicas e reagentes para introduzir porções contendo M6P em uma biomolécula (por exemplo, um polipeptídeo) são descritos na WO 2009/024977.

[0230] Conforme exemplificado na seção Exemplos deste documento, uma estrutura proteica multimérica descrita neste documento pode ser convenientemente preparada reagindo a α-galactosidase com um agente reticulante.

[0231] Portanto, de acordo com outro aspecto das configurações da invenção, apresenta-se um processo de preparo de uma estrutura proteica multimérica descrita neste documento. O processo compreende a reação da α-galactosidase, de forma a introduzir pelo menos uma porção de ligação que ligue covalentemente pelo menos dois monômeros da α-galactosidase.

[0232] Opcionalmente, a porção de ligação é uma ligação (por exemplo, uma ligação de amida, uma ligação de dissulfeto) que liga pelo menos um monômero da α-galactosidase a outro monômero da α-galactosidase. Opcionalmente, a ligação é introduzida utilizando condições e/ou reagentes adequados. Por exemplo, reagentes que são adequados para formar uma ligação de amida a partir de um grupo de ácido carboxilico e um grupo amina são conhecidos na técnica.

[0233] Opcionalmente, a porção de ligação é uma porção que não é derivada de uma parte da α-galactosidase. Por exemplo, a porção de ligação pode ser um oligômero, um polímero, um resíduo de uma molécula pequena (por exemplo, um aminoácido).

[0234] Em algumas configurações, a porção de ligação é introduzida reagindo a α-galactosidase com um agente reticulante que compreende a porção de ligação (por exemplo, conforme descrita neste documento) e pelo menos dois grupos reativos.

[0235] Opcionalmente, a α-galactosidase é reagida sob condições nas quais a α-galactosidase nativa está em uma forma dimérica.

[0236] Em algumas configurações, o agente reticulante é reagido com a α-galactosidase a uma relação molar na faixa de 5:1 a 500:1 (agente reticulante: monômero de α-galactosidase), opcionalmente em uma faixa de 50:1 a 400:1 e, opcionalmente, em uma faixa de 75:1 a 300:1 (por exemplo, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1).

[0237] O processo opcionalmente ainda compreende a purificação da proteína reticulante, por exemplo, removendo o excesso de agente reticulante. Métodos de purificação comuns podem ser utilizados, como a diálise e/ou a ultrafiltração utilizando membranas apropriadas e/ou etapas cromatográficas adicionais, incluindo a cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, e métodos semelhantes.

[0238] Um grupo reativo é selecionado adequadamente para realizar uma reação química que leva à formação de uma ligação com uma funcionalidade complementar no monômero da α-galactosidase. Opcionalmente, cada um dos grupos reativos é capaz de formar uma ligação covalente entre a porção de ligação descrita neste documento e pelo menos um polipeptídeo (por exemplo, a fim de formar um grupo funcional ligado ao polipeptídeo, conforme descrito neste documento).

[0239] Os grupos reativos de um agente reticulante podem ser idênticos uns aos outros ou diferentes.

[0240] Conforme utilizada neste documento, a frase "grupo reativo" descreve um grupo químico que seja capaz de realizar uma reação química que normalmente leva à formação de uma ligação. A ligação, de acordo com as presentes configurações, é, preferivelmente, uma ligação covalente (por exemplo, para cada um dos grupos reativos). As reações químicas que levam à formação de uma ligação incluem, por exemplo, substituições nucleofílicas e eletrofílicas, reações de adição nucleofílica e eletrofílica, alquilações, reações de eliminação da adição, reações de cicloadição, reações de rearranjo e quaisquer outras reações orgânicas conhecidas que envolvem um grupo funcional, bem como combinações delas.

[0241] O grupo reativo pode, opcionalmente, compreender uma porção não-reativa (por exemplo, uma alquila) que pode servir, por exemplo, para ligar uma porção reativa do grupo reativo a uma porção de ligação (por exemplo, poli(alquilenoglicol) ou análogo dele) descrito neste documento.

[0242] O grupo reativo é preferivelmente selecionado de forma a permitir sua conjugação à α-galactosidase. Grupos reativos exemplares incluem, mas não se limitam a, carboxilato (por exemplo, -CO2H) , tiol (-SH) , amina (-NH2) , halo, azida (-N3) , isocianato (-NCO), isotiocianato (-N=C=S), hidroxi (-OH), carbonil (e.g., aldeído), maleimida, sulfato, fosfato, sulfonil (por exemplo, mesil, tosil), etc., bem como grupos ativados, como N-hidroxisuccinimida (NHS) (por exemplo, ésteres de NHS), sulfo-N-hidroxisuccinimida, anidrido, haleto de acila (-C(=O)-halogênio), etc.

[0243] Em algumas configurações, o grupo reativo compreende um grupo de partida, como um grupo de partida suscetível à substituição nucleofílica (por exemplo, halo, sulfato, fosfato, carboxilato, N-hidroxisuccinimida).

[0244] Opcionalmente, o grupo reativo pode estar em uma forma ativada dele.

[0245] Conforme utilizada neste documento, a frase "forma ativada" descreve um derivado de um grupo químico (por exemplo, um grupo reativo) que seja mais reativo do que o grupo químico, e que é, dessa forma, prontamente capaz de realizar uma reação química que leva à formação de uma ligação. A forma ativada pode compreender um grupo de partida particularmente adequado facilitando, dessa forma, reações de substituição. Por exemplo, um grupo -C(=O)-NHS (éster de N-hidroxisuccinimida, ou -C(=O)-O-succinimida) é uma forma ativada bem conhecida de -C(=O)OH, as NHS (N-hidroxisuccinimida) que pode reagir com -C(=O)OH para formar -C(=O)-NHS, que reage prontamente para formar produtos características de reações que envolvem grupos -C(=O)OH, como amidas e ésteres.

[0246] O grupo reativo pode ser ligado ao resto da porção de ligação (por exemplo, um poli(alquilenoglicol) ou análogo dele) por meio de diferentes grupos, átomos ou ligações. Eles podem incluir uma ligação de éter [por exemplo, -O-alquil-], uma ligação de éster [por exemplo, -O-C(=O)-alquil-], um carbamato [por exemplo, O-C(=O)-NH-alqui1 - ] , etc. Dessa forma, uma variedade de grupos terminais pode ser empregada.

[0247] Os grupos a seguir exemplos não-limitantes dos diferentes grupos que podem constituir um grupo reativo conforme descrito neste documento: -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -ch2ch2sh, -ch2ch2nh2, -ch2ch2n3, -ch2ch2nco, -ch2-C (=O) -NHS, -CH2CH2-C (=O)-NHS, -C (=O)-CH2-C (=O)-NHS, -CH2CH2-NHC (=O) CH2CH2-maleimida, etc.

[0248] O número de grupos metileno em cada um dos grupos reativos acima é simplesmente exemplar, e poder ser variado.

[0249] O grupo reativo também pode compreender o heteroátomo no final de uma cadeia poli(alquilenoglicol) (por exemplo, -OH).

[0250] Em configurações exemplares da presente invenção, o grupo reativo compreende um carboxilato (por exemplo, um carboxilato ativado tal como um éster de N-hidroxisuccinimida).

[0251] Opcionalmente, o grupo reativo reage com um grupo amina na α-galactosidase (por exemplo, em um resíduo de lisina e/ou um N-terminal) para formar uma ligação de amida.

[0252] Em algumas configurações, a reação do grupo reativo compreende aminação redutora, caracterizada pelo fato de que um grupo amina reage com um grupo aldeído para formar uma imina, e a imina é reduzida (por exemplo, pela adição de um agente redutor, como cianoborohidreto de sódio) para formar uma ligação amina. O grupo reativo pode ser um grupo amina que reage com um grupo aldeído da α-galactosidase (por exemplo, em uma porção sacarídica ligada ao polipeptídeo da proteína), ou o grupo reativo pode ser um grupo aldeído que reage com um grupo amina da α-galactosidase (por exemplo, em um resíduo de lisina). Opcionalmente, a porção sacarídica da α-galactosidase é oxidada por um agente oxidante para formar um grupo aldeído, antes da reação do grupo reativo com a α-galactosidase. Por exemplo, a reação de um sacarídeo com um periodato de sódio pode ser utilizada para produzir um par de grupos aldeído em uma porção sacarídica.

[0253] Em algumas configurações, pelo menos um dos grupos reativos é selecionado de forma a reagir com uma funcionalidade de um monômero da α-galactosidase (por exemplo, um grupo amina de um resíduo de lisina ou N-terminal) , e pelo menos um dos grupos reativos é selecionado de forma a reagir com uma funcionalidade diferente de um monômero da α-galactosidase (por exemplo, um grupo tiol de um resíduo de cisteína).

[0254] Opcionalmente, um ou mais polipeptídeos descritos neste documento são reagidos com um agente de glicosilação para introduzir uma ou mais porções de M6P, a fim de obter uma estrutura proteica multimérica contendo M6P (por exemplo, conforme descrito neste documento). Reagentes de glicosilação contendo M6P adequados e sua utilização são descritos, por exemplo, na WO 2009/024977.

[0255] Conforme utilizados neste documento, os termos "amina" e "amino" referem-se ao grupo -NR'R'', caracterizado pelo fato de que R' e R'' são selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, alquil, cicloalquil, heteroalicíclico (ligado por meio de um anel de carbono) , aril e heteroaril (ligados por meio de um anel de carbono) . R' e R" são ligados por meio de um átomo de carbono deles. Opcionalmente, R' e R" são selecionados do grupo que consiste de hidrogênio e alquila compreendendo 1 a 4 átomos de carbono. Opcionalmente, R' e R" são hidrogênio.

[0256] Conforme utilizado neste documento, o termo "alquila" refere-se a um hidrocarboneto alifático saturado incluindo grupos de cadeia linear e de cadeia ramificada. Preferivelmente, o grupo alquila tem 1 a 20 átomos de carbono. Sempre que uma variação numérica, por exemplo, "1-20", for declarada neste documento, ela implica que o grupo, nesse caso o grupo alquila, pode conter 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., até e incluindo 20 átomos de carbono. Preferivelmente, a alquila é uma alquila de tamanho médio contendo 1 a 10 átomos de carbono. Mais preferivelmente, a menos que indicado de outra forma, a alquila é uma alquila menor contendo 1 a 4 átomos de carbono. O grupo alquila pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo substituto pode ser, por exemplo, cicloalquil, alquenil, alquinil, aril, heteroaril, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinil, sulfonil, ciano, nitro, azida, fosfonil, fosfinil, oxo, carbonil, tiocarbonil, ureia, tioureia, O-carbamil, N-carbamil, O-tiocarbamil, N-tiocarbamil, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido e amino, conforme esses termos são definidos neste documento.

[0257] Um grupo "cicloalquil" refere-se a um grupo de anel monocíclico ou fusionado todo de carbono (isto é, anéis que compartilham um par adjacente de átomos de carbono) caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anéis não tenha um sistema pi-elétron completamente conjugado. Exemplos, sem limitação, de grupo cicloalquil são ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno e adamantano. Um grupo cicloalquil pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo substituto pode ser, por exemplo, alquil, alquenil, alquinil aril, heteroaril, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinil, sulfonil, ciano, nitro, azida, fosfonil, fosfinil, oxo, carbonil, tiocarbonil, ureia, tioureia, O-carbamil, N-carbamil, O-tiocarbamil, N-tiocarbamil, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido e amino, conforme esses termos são definidos neste documento.

[0258] Um grupo "alquenil" refere-se a um grupo alquil que consiste de pelo menos dois átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono.

[0259] Um grupo "alquinil" refere-se a um grupo alquil que consiste de pelo menos dois átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono.

[0260] Um grupo "aril" refere-se a grupos monocíclicos ou policíclicos de anel fusionado todos de carbono (isto é, anéis que compartilham pares adjacentes de átomos de carbono) tendo um sistema pi-elétron completamente conjugado. Exemplos, sem limitação, de grupos aril são fenil, naftalenil e antracenil. O grupo aril pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo substituto pode ser, por exemplo, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, aril, heteroaril, heteroaliciclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinil, sulfonil, ciano, nitro, azida, fosfonil, fosfinil, oxo, carbonil, tiocarbonil, ureia, tioureia, O-carbamil, N-carbamil, O-tiocarbamil, N- tiocarbamil, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido e amino, conforme esses termos são definidos neste documento.

[0261] Um grupo "heteroaril" refere-se a um grupo de anel monociclico ou fusionado (isto é, anéis que compartilham um par adjacente de átomos) tendo no(s) anel(éis) um ou mais átomos, como, por exemplo, nitrogênio, oxigênio e enxofre e, além disso, tendo um sistema pi-elétron completamente conjugado. Exemplos, sem limitação, de grupos heteroaril incluem, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina e purina. O grupo heteroaril pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo substituto pode ser, por exemplo, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, aril, heteroaril, heteroaliciclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinil, sulfonil, ciano, nitro, azida, fosfonil, fosfinil, oxo, carbonil, tiocarbonil, ureia, tioureia, O-carbamil, N-carbamil, O-tiocarbamil, N-tiocarbamil, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido e amino, conforme esses termos são definidos neste documento.

[0262] Um grupo "heteroalicíclico" refere-se a um grupo monocíclico ou de anel fusionado tendo no(s) anel(éis) um ou mais átomos como nitrogênio, oxigênio e enxofre. Os anéis também podem ter uma ou mais ligações duplas. No entanto, os anéis dos têm um sistema pi-elétron completamente conjugado. O grupo heteroalicíclico pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo substituto pode ser, por exemplo, um par de elétrons isolados, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, aril, heteroaril, heteroalicíclico, halo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinil, sulfonil, ciano, nitro, azida, fosfonil, fosfinil, oxo, carbonil, tiocarbonil, ureia, tioureia, O-carbamil, N-carbamil, O-tiocarbamil, N-tiocarbamil, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, sulfonamido e amino, conforme esses termos são definidos neste documento. Exemplos representativos são piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolina e grupos semelhantes.

[0263] Um grupo "hidroxi" refere-se a um grupo -OH.

[0264] Um grupo "azida" refere-se a um grupo -N=N+=N-.

[0265] Um grupo "alcoxi" refere-se tanto a um grupo -O-alquil quanto a um grupo -O-cicloalquil, conforme definido neste documento.

[0266] Um grupo "ariloxi" refere-se tanto a um grupo -O-aril quanto a um grupo -O-heteroaril, conforme definido neste documento.

[0267] Um "éter" refere-se tanto a um grupo alcoxi quanto a um ariloxi, caracterizado pelo fato de que o grupo é ligado a um grupo alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, aril, heteroaril ou heteroaliciclico.

[0268] Uma ligação de éter descreve uma ligação -O-.

[0269] Um grupo "tiohidroxi" ou "tiol" refere-se a um grupo -SH.

[0270] Um grupo "tioalcoxi" refere-se tanto a um grupo -S-alquil quanto a um grupo -S-cicloalquil, conforme definido neste documento.

[0271] Um grupo "tioariloxi" refere-se tanto a um grupo -S-aril quanto a um grupo -S-heteroaril, conforme definido neste documento.

[0272] Um "tioéter" refere-se tanto a um grupo tioalcoxi quanto um grupo tioariloxi, caracterizado pelo fato de que o grupo é ligado a um grupo alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, aril, heteroaril ou heteroaliciclico.

[0273] Uma ligação de tioéter descreve uma ligação -S-.

[0274] Um grupo "dissulfeto" refere-se tanto a um grupo -S-tioalcoxi quanto a um grupo -S-tioariloxi.

[0275] Uma ligação de dissulfeto descreve uma ligação -S-S-.

[0276] Um grupo "carbonil" refere-se a um grupo -C(=O)-R', onde R' é definido conforme exposto acima.

[0277] Um grupo "tiocarbonil" refere-se a um grupo -C(=S)-R', onde R' é conforme definido neste documento.

[0278] Uma "carboxila" refere-se tanto a "C-carboxi" quanto a "O-carboxi".

[0279] Um grupo "C-carboxi" refere-se a um grupo -C(=O)-O-R' , onde R' é conforme definido neste documento.

[0280] Um grupo "O-carboxi" refere-se a um grupo R'C(=O)-O-, onde R' é conforme definido neste documento.

[0281] Um grupo "oxo" refere-se a um grupo =O.

[0282] Um "carboxilato" ou "carboxil" abrange tanto o grupo C-carboxi quanto o grupo O-carboxi, conforme definidos neste documento.

[0283] Um grupo "ácido carboxílico" refere-se a um grupo C-carboxi no qual R' é hidrogênio.

[0284] Um grupo "tiocarboxi" ou "tiocarboxilato" refere-se tanto ao grupo -C(=S)-O-R' quanto ao grupo O-C(=S)R'.

[0285] Um "éster" refere-se a um grupo C-carboxi caracterizado pelo fato de que R' não é hidrogênio.

[0286] Uma ligação de éster refere-se a uma ligação -O-C(=O)-.

[0287] Uma ligação de tioéster refere-se a uma ligação -O-C(=S)- ou a uma ligação -S-C(=O).

[0288] Um grupo "halo" refere-se a flúor, cloro, bromo ou iodo.

[0289] Um grupo "sulfinil" refere-se a um grupo -S(=O)-R', onde R' é conforme definido neste documento.

[0290] Um grupo "sulfonil" refere-se a um grupo -S(=O)2-R' , onde R' é conforme definido neste documento.

[0291] Um grupo "sulfonato" refere-se a um grupo -S(=O)2-O-R', onde R' é conforme definido neste documento.

[0292] Um grupo "sulfato" refere-se a um grupo -O-S (=O)2-O-R' , onde R' é conforme definido neste documento.

[0293] Um grupo "sulfonamida" ou "sulfonamido" envolve tanto o grupo S-sulfonamido quanto o grupo N-sulf onamido, conforme definido neste documento.

[0294] Um grupo "S-sulfonamido" refere-se a um grupo -S(=O)2-NR'R'', com cada R' e R" conforme definido neste documento.

[0295] Um grupo "N-sulfonamido" refere-se a um grupo R' S(=O)2-NR'', onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0296] Um grupo "O-carbamil" refere-se a um grupo -OC(=O)-NR'R'', onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0297] Um grupo "N-carbamil" refere-se a um grupo R'OC(=O) -NR''-, onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0298] Um grupo "carbamil" ou "carbamato" envolve os grupos O-carbamil e N-carbamil.

[0299] Uma ligação de carbamato descreve uma ligação -O-C(=O)-NR'-, onde R' é conforne descrito neste documento.

[0300] Um grupo "O-tiocarbamil" refere-se a um grupo -OC(=S)-NR'R'', onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0301] Um grupo "N-tiocarbamil" refere-se a um grupo R'OC(=S)NR'' onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0302] Um grupo "tiocarbamil" ou "tiocarbamato" envolve os grupos O-tiocarbamil e N-tiocarbamil.

[0303] Uma ligação de tiocarbamato descreve uma ligação -O-C(=S)-NR'-, onde R' é conforme descrito neste documento.

[0304] Um grupo "C-amido" refere-se a um grupo -C(=O)-NR'R'', onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0305] Um grupo "N-amido" refere-se a um grupo R'C(=O)-NR''-, onde cada R' e R" é conforme definido neste documento.

[0306] Um grupo "amida" envolve tanto o grupo C-amido quanto o grupo N-amido.

[0307] Uma ligação de amida descreve uma ligação -NR'-C(=O)-, onde R' é conforme definido neste documento.

[0308] Uma ligação de amina descreve uma ligação entre um átomo de nitrogênio em um grupo amina (conforme definido neste documento) e um grupo R' no grupo amina.

[0309] Uma ligação de tioamida descreve uma ligação -NR'-C(=S)-, onde R' é conforme definido neste documento.

[0310] Um grupo "ureia" refere-se a um grupo -N(R')-C(=O)-NR''R''', onde cada R' e R" é conforme definido neste documento, e R''' é definido conforme R' e R" são definidos neste documento.

[0311] Um grupo "nitro" refere-se a um grupo -NO2.

[0312] Um grupo "ciano" refere-se a um grupo -CDN.

[0313] O termo "fosfonil" ou "fosfonato" descreve um grupo -P(=O)(OR')(OR''), com R' e R" conforme descrito acima.

[0314] O termo "fosfato" descreve um grupo -O-P(=O) (OR') (OR''), com cada R' e R" conforme descrito acima.

[0315] Um "ácido fosfórico" é um grupo fosfato em que cada R é hidrogênio.

[0316] O termo "fosfinil" descreve um grupo -PR'R'', com cada R' e R" conforme descrito acima.

[0317] O termo "tioureia" descreve um grupo -N(R')-C(=S)-NR''-, com cada R' e R" conforme descrito acima.

[0318] Conforme descrito neste documento, as estrutura proteicas multiméricas descritas neste documento podem exibir estabilidade melhorada e atividade mais forte e/ou mais duradoura da α-galactosidase em sítios in vivo terapeuticamente importantes. Essas estruturas proteicas multiméricas são, portanto, altamente benéficas para utilização em várias configurações médicas nas quais a atividade da α-galactosidase é desejável, incluindo configurações terapêuticas e de pesquisa.

[0319] Portanto, de acordo com algumas configurações, a estrutura proteica multimérica descrita neste documento destina-se a utilização como um medicamento, por exemplo, um medicamento para tratamento da doença de Fabry.

[0320] De acordo outro aspecto das configurações da invenção, apresenta-se um método para tratar a doença de Fabry, o método compreendendo a administração, em um indivíduo que precise dela, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma estrutura proteica multimérica descrita neste documento.

[0321] De acordo com outro aspecto das configurações da invenção, apresenta-se uma composição farmacêutica compreendendo uma estrutura proteica multimérica conforme descrita neste documento e um carreador farmaceuticamente aceito.

[0322] Conforme utilizado neste documento, uma "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação de uma ou mais estruturas proteicas multiméricas descritas neste documento, com outros componentes químicos como carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitos e adequados. O propósito de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

[0323] A partir deste ponto, o termo "carreador farmaceuticamente aceito" refere-se a um carreador ou um diluente que não cause irritação significativa a um organismo e que não anule a atividade e as propriedades biológicas do composto administrado. Exemplos, sem limitações, de carreadores são: propilenoglicol, solução salina, emulsões e misturas de solventes orgânicos com água, bem como carreadores sólidos (por exemplo em pó) e gasosos.

[0324] Neste documento, o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar adicionalmente a administração de um composto. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis.

[0325] A composição farmacêutica compreende, opcionalmente, um ingrediente adicional que estabiliza adicionalmente a α-galactosidase da estrutura proteica multimérica. Opcionalmente, o ingrediente adicional é a galactose.

[0326] Alternativamente, um derivado da galactose (por exemplo, um glicosideo contendo galactose) pode ser utilizado ao invés da galactose. Opcionalmente, um derivado não-redutor da galactose é utilizado.

[0327] Técnicas para formulação e administração de drogas podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, que é incorporado neste documento por referência.

[0328] Composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulamento, processos de encapsulamento ou liofilização.

[0329] Composições farmacêuticas para utilização de acordo com a presente inveção podem, dessa forma, ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitos compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitem o processamento da estrutura proteica multimérica em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

[0330] Para injeção ou infusão, as estruturas proteicas multiméricas de configurações da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis como a solução de Hank, a solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico com ou sem solventes orgânicos como o propilenoglicol, e o polietilenoglicol.

[0331] Para administração transmucosal, são utilizados penetrantes na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[0332] Para administração oral, as estruturas proteicas multiméricas da invenção podem ser prontamente formuladas combinando as estruturas proteicas multiméricas com carreadores farmaceuticamente aceitos conhecidos na técnica. Esses carreadores permitem que as estruturas proteicas multiméricas descritas neste documento sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e apresentações semelhantes para ingestão oral por um paciente. Preparações farmacológicas para utilização oral podem ser feitas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante e processando a mistura de grânulos após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter núcleos de comprimidos ou de drágeas. Excipientes adequados são, em particular, enchimentos como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitos como a polivilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal deles como o alginato de sódio.

[0333] Os núcleos de drágeas são fornecidos com revestimento adequado. Para esse propósito, soluções de açúcar concentrado podem ser utilizadas, podendo, opcionalmente, conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequados. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou de drágeas para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de estrutura proteica multimérica ativa.

[0334] Composições farmacêuticas, que podem ser utilizadas oralmente, incluem cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas macias, seladas feitas de gelatina e um plastificante, como o glicerol ou o sorbitol. As cápsulas duras podem conter os ingredientes ativos na mistura com enchimentos como lactose, ligantes como amidos, lubrificantes como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas macias, as estruturas proteicas multiméricas podem ser dissolvidas ou suspensas em líquidos adequados, como óleos graxos, parafina líquida, ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, é possível adicionar estabilizantes. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para a via de administração escolhida.

[0335] Para administração oral, as composições podem ter a forma de comprimidos ou de losangos formulados de maneira convencional.

[0336] Para administração por inalação, as estruturas proteicas multiméricas para utilização de acordo com as configurações da presente invenção são convenientemente entregues na forma de um spray aerossol (que, tipicamente, inclui carreadores em pó, líquidos e/ou gasosos) a partir de uma embalagem pressurizada ou de um nebulizador, com a utilização de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, tricolofluorometano, diclorotetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada por uma válvula para entregar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, para utilização em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura de pó das estruturas proteicas multiméricas e uma base de pós adequada como, mas não se limitando a, lactose ou amido.

[0337] As estruturas proteicas multiméricas descritas neste documento podem ser formuladas para administração parenteral, por exemplo, por injeção em bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção ou infusão podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo em ampolas, ou recipientes multidose, opcionalmente com adição de um conservante. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios como agentes suspensores, estabilizantes e/ou dispersantes.

[0338] Composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas da preparação da estrutura proteica multimérica em forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões das estruturas proteicas multiméricas podem ser preparadas como suspensões e emulsões oleosas para injeção apropriadas (por exemplo, água em óleo, óleo em água ou água em óleo em emulsões oleosas). Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos como oleato de etila, triglicerídeos ou lipossomos. Suspensões aquosas para injeção podem conter substâncias, que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes adequados, que aumentam a solubilidade das estruturas proteicas multiméricas para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[0339] Alternativamente, as estruturas proteicas multiméricas podem ser na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, livre de pirogênios, antes da utilização.

[0340] A estrutura proteica multimérica de configurações da presente invenção também podem ser formuladas em composições retais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, por exemplo, bases convencionais para supositórios como manteiga de cacau e outros glicerideos.

[0341] As composições farmacêuticas descritas neste documento também podem compreender carreadores ou excipientes sólidos de fase gel adequados. Exemplos desses carreadores ou excipientes incluem, mas não são limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros como os polietilenoglicóis.

[0342] Composições farmacêuticas adequadas para utilização no contexto da presente invenção incluem composições caracterizadas pelo fato de que os ingredientes ativos são contidos em uma quantidade efetiva para alcançar o propósito pretendido. Mais especificamente, a quantidade terapeuticamente efetiva significa uma quantidade de estruturas proteicas multiméricas eficazes para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas de doença ou prolongar a sobrevida do indivíduo sendo tratado.

[0343] Para quaisquer proteínas multiméricas utilizadas nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de atividade em animais. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma variação de concentração circulante que inclui a IC50 conforme determinado por ensaios de atividade (por exemplo, a concentração das estruturas proteicas do teste, que atinge a metade do aumento máximo em uma atividade biológica da estrutura proteica multimérica). Essa informação pode ser utilizada para determinar mais precisamente doses úteis em humanos.

[0344] Conforme demonstrado na seção Exemplos que segue, uma quantidade terapeuticamente efetiva para as estruturas proteicas multiméricas de configurações da presente invenção pode variar entre aproximadamente 1 µg/kg de peso corporal e aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal.

[0345] A toxicidade e a eficácia terapêutica das estruturas proteicas multiméricas descritas neste documento podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em animais experimentais, por exemplo, determinando a EC50, a IC50 e a LD50 (dose letal que causa morte em 50% dos animais testados) para uma determinada estrutura proteica. Os dados obtidos a partir desses ensaios de atividade e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma variedade de dosagens para utilização em humanos.

[0346] A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual em vista da condição do paciente. (Vide, por exemplo, Fingi et al., 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l).

[0347] A quantidade da dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plasmáticos da porção ativa que sejam suficientes para manter os efeitos desejados, chamada de concentração mínima efetiva (MEC - minimal effective concentration). A MEC variará para cada preparação, mas pode ser estimada a partir de dados in vitro; por exemplo, a concentração necessária para alcançar o nível de atividade desejado in vitro. As dosagens necessárias para alcançar a MEC dependerão das características individuais e da via de administração. Ensaios de HPLC [High-performance liquid chromatography - Cromatografia líquida de alto desempenho] ou bioensaios podem ser utilizados para determinar as concentrações plasmáticas.

[0348] Os intervalos de dosagem também podem ser determinados utilizando o valor da MEC. As preparações devem ser administradas utilizando um regime que mantenha os níveis plasmáticos acima da MEC por 10-90% do tempo, preferivelmente entre 30-90% e, mais preferivelmente, 50-90%.

[0349] Dependendo da gravidade e da responsividade da condição a ser tratada, a dosagem também pode ser uma administração única de uma composição de liberação lenta descrita acima, com o ciclo de tratamento durando de diversos dias a diversas semanas ou até que a cura seja efetuada ou que a diminuição do estado da doença seja alcançado.

[0350] A quantidade de uma composição a ser administrada, é claro, dependerá do indivíduo que está sendo tratado, da gravidade da doença, da forma de administração, do julgamento do médico prescritor, etc.

[0351] As composições da presente invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador, como um kit aprovado pela FDA (Agência Norte-Americana de Vigilância de Alimentos e Medicamentos) , que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender uma lâmina metálica ou plástica, como, mas não limitada a, uma embalagem de blister ou recipiente pressurizado (para inalação). A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhada por instruções para administração. A embalagem ou dispensador também pode ser acompanhada por uma notificação associada com o recipiente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, a utilização ou a venda de produtos farmacêuticos, a referida notificação sendo refletiva da aprovação da agência da forma das composições para administração humana ou veterinária. Essa notificação, por exemplo, pode ser de rotulagem aprovada pela Agência Norte-Americana de Vigilância de Alimentos e Medicamentos para prescrição de drogas ou de uma bula aprovada do produto. Composições compreendendo uma estrutura proteica multimérica de configurações da invenção formuladas em um carreador farmacêutico compatível também 'podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada ou diagnóstico, conforme detalhado neste documento.

[0352] Dessa forma, de acordo com uma configuração da presente invenção, dependendo das estruturas proteicas multiméricas selecionadas, a composição farmacêutica descrita neste documento é embalada em um material de embalagem e identificada na impressão, dentro ou no material de embalagem, para utilização no tratamento de uma condição na qual a atividade da estrutura proteica multimérica seja benéfica, conforme descrito acima.

[0353] Conforme utilizado neste documento, o termo "aproximadamente" refere-se a ± 10%.

[0354] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tendo" e suas conjugações significam "incluindo mas não se limitando a".

[0355] O termo "consistindo de" significa "incluindo e limitado a".

[0356] A palavra "exemplar" é utilizada neste documento significando "servindo como exemplo, instância ou ilustração". Qualquer configuração descrita como "exemplar" não deve, necessariamente, ser considerada como preferida ou vantajosa com relação a outras configurações e/ou para excluir a incorporação de características de outras configurações.

[0357] A palavra "opcionalmente" é utilizada neste documento significando "é apresentada em algumas configurações e não apresentada em outras configurações". Qualquer configuração particular da invenção pode incluir uma pluralidade de características "opcionais" a menos que essas características sejam conflitantes.

[0358] Conforme utilizada neste documento, a forma singular "um", "uma" e "o/a" inclui referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.

[0359] Por meio dessa solicitação, várias configurações dessa invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve-se compreender que a descrição no formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser consideradas como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Consequentemente, deve-se considerar que a descrição de uma faixa revelou especificamente todas as subvariações possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, deve-se considerar que a descrição de uma faixa como de 1 a 6 tenha especificamente revelado subvariações como de l a 3, dela4, dela5, de2a4, de2a6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da extensão da faixa.

[0360] Sempre que uma faixa numérica for indicada neste documento, isso significa incluir qualquer numeral mencionado (fracionai ou integral) dentro da faixa indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/variações de" um primeiro número indicado "a" um segundo número indicado são utilizadas neste documento intercambiavelmente e significam incluir o primeiro e ο segundo números indicados e todos os números fracionais e integrais entre eles.

[0361] Conforme utilizado neste documento, o termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando a, aquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[0362] Conforme utilizado neste documento, o termo "tratando" inclui anular, substancialmente inibir, atrasar ou reverter a progressão de uma condição, substancialmente melhorar sintomas clínicos ou estéticos de uma condição ou substancialmente prevenir o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma condição.

[0363] Deve-se apreciar que determinadas características da invenção, que são, para propósitos de clareza, descritas no contexto de configurações separadas, também podem ser apresentadas em combinação em uma única configuração. Ao contrário, várias características da invenção, que são, para propósitos de brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequada em qualquer outra configuração descrita da invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias configurações não devem ser consideradas características essenciais daquelas configurações, a menos que a configuração seja inoperante sem aqueles elementos.

[0364] Várias configurações e aspectos da presente invenção, conforme delineado acima e reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[0365] Agora, faz-se referência aos exemplos a seguir, que juntamente com as descrições acima ilustram algumas configurações da invenção de forma não-limitante.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais:
bis-N-hidroxisuccinimida-poli (etilenoglicol) (bis-NHS-PEG) foi adquirido da Iris Biotech GmbH nas formas de PEG8 e 2000 Dalton (PEG45) PEG, e da Pierce na forma de PEG5, e dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO ) a uma concentração de 25 mg/mL;
Ácido cítrico foi adquirido da Sigma;
Azul de Coomassie G250 foi adquirido da Bio-Rad;
Dimetil sulfóxido foi adquirido da Sigma;
D-,(+) -galactose foi adquirida da Sigma;
Plasma humano (K3 EDTA) foi adquirido da Bioreclamation Inc;
4-Metilumbeliferona foi adquirida da Sigma;
4-Metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida foi adquirida da Sigma;
N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida trihexosida (Gb3-NBD) foi adquirida da Matreya;
Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico foi adquirido da Merck;
Solução salina tamponada com fosfato foi adquirida da Sigma;
p-Nitrofenil-α-D-galactopiranosida foi adquirida da Sigma;
Primulina foi adquirida da Sigma; o reagente spray de Primulina foi preparado dissolvendo 12,5 mg de primulina em 200 ml de acetona:água (proporção do volume 8:2);
Piridina foi adquirida da Sigma;
Ácido sinapinico foi adquirido da Sigma;
Carbonato de sódio foi adquirido da Sigma;
Fosfato de sódio foi adquirido da Sigma;
Taurocolato de sódio foi adquirido da Sigma;
Ácido trifluoroacético foi adquirido da Sigma;

α-GAL-I recombinante humana vegetal:

[0366] α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL) tendo ID. SEQ. N°: 1, referida neste documento como α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-I), foi preparada conforme descrito na Solicitação de Patente Internacional PCT/IL2008/000576 (publicada como WO 2008/132743) .

[0367] Material vegetal transgênico foi gerado utilizando plantas Nicotiana benthamiana infiltradas com construção genética contendo o cassete de expressão para α-GAL-A, para expressar a proteína α-GAL-A humana. Isso foi realizado em uma câmara de crescimento sob condições controladas. Isso foi seguido pela colheita de material vegetal e extração de proteínas solúveis das células da planta. A prh-oí-GAL-A foi então purificada por um processo de purificação envolvendo métodos padronizados para purificação de proteínas seguida por uma etapa de modificação química para fabricar a proteína reticulada. A prh-α-GAL-A atual foi extraída do material vegetal utilizando homogeneizadores. Os fragmentos vegetais foram removidos por centrifugação e a proteína foi purificada adicionalmente utilizando precipitação com sulfato de amónio e etapas de acidificação. O sobrenadante foi filtrado e carregado em uma coluna hidrofóbica, seguido por dessalinização e carregamento em uma coluna de troca catiônica. O pool da coluna de troca catiônica foi concentrado.

α-GAL-I recombinante humana vegetal:

[0368] α-GAL recombinante humana vegetal compreendendo uma mistura de α-GAL tendo ID. SEQ. N°: 2, e α-GAL tendo ID. SEQ. N°: 3 (sem os aminoácidos EF N-terminais presentes na ID. SEQ. N°: 1), referidas neste documento como prh-α-GAL-II, foi preparada por um processo semelhante àquele descrito acima para prh-α-GAL-I, utilizando uma construção genética diferente.

[0369] cDNA codificando a proteína □-galactosidase humana (EC 3.2.1-22 GenBank: X05790) foi otimizado e sintetizado pela GENEART AG (Regensburg, Alemanha). A utilização do códon sem o peptídeo líder (peptídeo sinal alvo do retículo endoplasmático) foi adaptada ao códon bias de genes de Nicotiana tobaccum. Durante o processo de otimização, os seguintes motivos de sequência cis-atuante foram evitados: TATA-boxes internas, sítios chi e sítios de entrada ribossômica, alongamentos de sequência ricos em AT ou ricos em GC, elementos de instabilidade de RNA ("motivos matadores"), sequências repetidas e estruturas secundárias de RNA, sítios doadores de splice (oculto) e aceptores, ponto de ramificação. Além disso, regiões de conteúdo muito alto (> 80%) ou muito baixo (< 30%) de GC foram evitadas.

[0370] A sequência nucleotídica do peptídeo líder da α-galactosidase humana nativa (peptídeo sinal alvo do retículo endoplasmático) da proteína α- galactosidase humana de comprimento completo (GenBank: X05790) foi substituída por uma sequência nucleotídica codificando o peptídeo sinal alvo do retículo endoplasmático (peptídeo líder) da proteína Arabidopsis ABPI. Esse peptídeo sinal proporciona direcionamento eficiente de uma α- galactosidase para o caminho secretório e é clivado do polipeptídeo, pela peptidase sinal, uma vez que a proteína tenha sido translocada para o retículo endoplasmático. Uma sequência nucleotídica codificando o sinal de retenção do retículo endoplasmático SEKDEL foi adicionada à sequência de cDNA no terminal 3' , permitindo a recuperação da proteína expressa do complexo de Golgi, mantendo efetivamente a proteína no retículo endoplasmático.

[0371] A proteína de interesse foi expressa como um forte promotor viral subgenômico da proteína de revestimento. O sistema tem como base a amplificação transitória (por agroinfecção) de vetores virais inseridos em uma planta por Agrobacterium. Na agroinfecção, um promotor funcional da planta e o cDNA codificando um réplicon viral são transferidos como T-DNA do Agrobacterium para as células vegetais. O T-DNA é transcrito in-planta pelo promotor vegetal para gerar o RNA viral biologicamente ativo que inicia a autorreplicação.

[0372] Para a expressão transitória um sistema de recombinação de 3 vetores com base no sistema anteriormente desenvolvido conforme descrito [Gleba et al., Vaccine 2005, 23:2042-2048]. Um dos vetores foi introduzido com o cDNA codificando a α-galactosidase e os outros dois vetores contendo genes para a construção de todo o réplicon viral integral (RdRp e Integrase) gerando, dessa forma, o RNA viral biologicamente ativo que pode iniciar a autorreplicação.

[0373] Plantas de N. benthamiana foram germinadas e cultivadas em solo de mistura comercial (Givaat Ada, IL) , suplementado com fertilizante granular de liberação lenta (Scott Marysville, OH) sob um longo regime de luz diário (16 horas de luz / 8 horas de escuro) a 24-25° C.

[0374] Agrobactérias foram transformadas com o sistema vetorial de réplicon embasado em pICH20866-alphα-GAL utilizando eletroporação (2500 V, 5 milissegundos) [den Dulk-Ra e Hooykaas, Methods Mol Biol 1995, 55:63-72]. As plantas foram infiltradas com Agrobactérias contendo os 3 plasmídeos ICON por infiltração a vácuo com métodos padronizados conhecidos na técnica.
Brevemente, plantas de N. benthamiana, de 5-6 semanas de idade, foram infiltradas submergindo todos os órgãos aéreos da planta em uma suspensão bacteriana e foram colocados em uma câmara de vácuo. Um vácuo de menos (-) 0,8 bar foi aplicado por 1 minuto, seguido por um rápido retorno à pressão atmosférica. As plantas foram devolvidas à estufa por 5-7 dias adicionais sob as mesmas condições de cultivo.

[0375] Amostras de folhas de Nicotiana benthamiana foram colhidas 5 dias após a infiltração e extraídas em tampão Laemmli para SDS-PAGE, ou em tampão para ensaio de atividade (20 mM de ácido cítrico, 30 mM de fosfato de sódio, 0,1% de albumina sérica bovina e 0,67% de etanol, pH 4,6) para ensaio de atividade catalítica da proteína expressa na planta.

[0376] A proteína α-galactosidase humana de extratos vegetais foi purificada por precipitação diferencial com sulfato de amónio de duas etapas ("salting out" [precipitação por sais]: 1a etapa 0,57 M; 2a etapa 2,27 M), seguida por cromatografia de interação hidrofóbica (resina Fenil 650 M) e cromatografia de troca catiônica.

[0377] Duas sequências (ou seja, ID. SEQ. N°: 2, e ID. SEQ. N°: 3), que diferem na presença ou na ausência de uma glicina N-terminal, foram obtidas devido ao diferente processamento da sequência líder.

Ensaio de 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida de atividade da α-GAL:

[0378] A atividade da α-GAL foi medida utilizando 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida como substrato de hidrólise. O ensaio foi realizado em tampão fosfato-citrato (20 mM de ácido citrico, 30 mM de fosfato de sódio, pH 4,6). 10 µL de amostra contendo a α-GAL testada foram incubados com 40 µL de tampão de ensaio contendo 5 mM de 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida. A mistura da reação foi incubada a 37°C por 60 minutos. 10 µL da mistura da reação foram transferidos para uma placa preta de 96 poços (Greiner), 90 µL de solução de paragem (2 M de carbonato de sódio) foram adicionados, e a fluorescência foi medida a um comprimento de onda de excitação de 365 nm e um comprimento de onda de emissão de 450 nm. A fluorescência foi traduzida para a concentração do produto, e adicionalmente para a atividade, utilizando uma curva de calibração de 4-metilumbeliferona, o produto da reação.

Ensaio de N-Dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-ceramida trihexosida (Gb3-NBD) de atividade da α-GAL

[0379] O substrato N-dodecanoil- nitrobenzoxadiazol-ceramida trihexosida (Gb3-NBD) fluorescentemente marcado é menos lipofilico do que Gb3, facilitando sua utilização em reações enzimáticas in vitro.

[0380] 10 µL de Gb3-NBD 0,1 µg/pL (em água com 10% de etanol) , e 5 µL de α-GAL 0,2 mg/mL foram adicionados a 85 µL de tampão fosfato-citrato a um pH de 4,6. A concentração final de α-GAL foi de 10 µg/mL. A reação de fundo ou não-catalisada, sem α-GAL, foi composta de 90 µL de tampão fosfato-citrato a um pH de 4,6 com 10 µL de Gb3-NBD 0,1 µg/µL (em água com 10% de etanol). As misturas da reação foram incubadas por 60 minutos a 37°C. Após a incubação, 50 µL de metanol foram adicionados à mistura da reação, e as soluções foram centrifugadas por 1 minuto. 100 µL de clorofórmio foram então adicionados, e as soluções foram centrifugadas adicionalmente por 1 minuto. A água e os solventes orgânicos foram removidos a vácuo utilizando um sistema Speed Vac. Os resíduos foram dissolvidos em 80 µL de clorofórmio:metanol (1:1). 30 µL de cada amostra foram carregados em placas de Sílica Gel 60 (Merck) para HPTLC (cromatografia de camada fina de alto desempenho) utilizando um sistema Linomat V (CAMAG) . As placas de HPTLC foram desenvolvidas utilizando uma solução de clorofórmio:metanol:H2O em uma proporção de 100:42:6 como um sistema solvente. Então, permitiu-se que as placas secassem e o substrato e as manchas de produto foram visualizados por radiação sob luz UV a um comprimento de onda de 365 nm.

Ensaio de p-Nitrofenil-α-D-galactopiranosida (p-NP-G) de atividade da α-GAL:

[0381] p-Nitrofenil-α-D-galactopirano-sida foi utilizado como substituto de hidrólise para ensaios de atividade da α-GAL. O tampão do ensaio continha 20 mM de ácido cítrico, 30 mM de fosfato de sódio, 0,1% de BSA (albumina sérica bovina) e 0,67% de etanol a pH 4,6. O ensaio foi realizado em placas de 96 poços para ELISA (Greiner) . 50 µL de amostra foram incubados com 150 µL de tampão do ensaio e 30 µL de substrato foram adicionados para obter uma concentração final de 8 mM de p-nitrofenil-α-D-galactopiranosida. A mistura da reação foi incubada a 37°C por 90 minutos. Após 90 minutos, 100 µL de carbonato de sódio 1,98 M foram adicionados em cada poço a fim de terminar a reação. A quantidade de produto de reação foi determinada medindo a absorbância a 405 nm.

Medição da estabilidade da α-GAL in vitro:

[0382] A estabilidade de α-GAL de várias fontes foi determinada adicionando α-GAL a uma das seguintes condições:

1) condições lisossomais simuladas: tampão fosfato-citrato (20 mM de ácido cítrico, 30 mM de fosfato de sódio), pH 4,6, 37°C;
2) condições lisossomais simuladas: solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, 37°C;
3) plasma humano a 37°C.

[0383] A α-GAL foi adicionada a uma concentração de 1 µg/mL, conforme determinado pela atividade da α-GAL na solução, e a solução foi incubada a 37°C. Amostras de cada solução foram coletadas em pontos de tempo pré-determinados e a atividade da α-GAL foi medida conforme descrito acima. O valor da atividade enzimática imediatamente após a adição da α-GAL testada a cada ambiente foi definida como 100%, e resultados adicionais da atividade nos pontos de tempo testados foram calculados como um percentual daquela atividade inicial.

Farmacocinética de α-GAL:

[0384] Camundongos Fabry (α-Gal-A -/0) individuais foram colocados em um dispositivo de contenção plexiglass iluminado, e a enzima foi injetado na veia da cauda. Amostras de sangue foram coletadas nos tempos indicados após a injeção por sangramento da cauda ou retro-orbital, utilizando tubos heparinizados de microhematócrito. O plasma foi diluido em tampão de atividade 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida. Um ensaio de 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosida foi realizado conforme descrito acima.

[0385] A meia-vida de eliminação terminal (T1/2) foi calculada com base nos resultados da atividade plasmática. A meia-vida terminal (meia-vida de eliminação) é o tempo necessário para a concentração plasmática diminuir até 50% após o pseudoequilibrio de distribuição ter sido alcançado. A meia vida-terminal foi calculada a partir de uma porção terminal (log-linear) da curva, por regressão linear do tempo vs. a concentração em log [Toutain & Bousquet-Melou, J Vet Pharmacol Ther 2004, 27:427-39].

Biodistribuição de α-GAL:

[0386] Camundongos Fabry (α-Gal-A -/0) foram injetados intravenosamente (na veia da cauda) com α-GAL a uma dose de 2 mg/Kg. Os tecidos (figados, rins, corações e baços) foram coletados 2 horas, 24 horas, 3 dias, 7 dias, 14 dias ou 28 dias após a injeção da enzima. Os níveis de α-GAL em camundongos controle normais e em camundongos Fabry administrados com solução salina (não-tratados) foram comparados com os níveis encontrados em camundongos Fabry que receberam α-GAL exógena. A fim de determinar a atividade da α-GAL nos tecidos, amostras de tecido descongeladas foram colocadas em tubos de polipropileno de 2 mL contendo tampão de lise (28 mM de ácido cítrico, 44 mM de fosfato sódico dibásico, 0,5% de tarurocolato de sódio, pH 4,4) conforme descrito em Oshima et al. [PNAS 1997, 94:2540-2544]. As amostras foram homogeneizadas com a utilização de um Tissuelyzer (Retsch MM400) por 10 minutos. O restante foi peletizado por centrifugação a 4°C, e os sobrenadantes resultantes foram ensaiados quanto à atividade da α-GAL por um ensaio com 4-metilumbelif eril-α-D-galactopiranosida, conforme descrito acima. As mesmas amostras também foram submetidas a análise por Western blot.

Ensaio de Gb3 in vivo:

[0387] O desfecho da eficácia da α-GAL injetada foi medido pelo ensaio de níveis de Gb3 dos tecidos animais, a fim de determinar se os níveis de Gb3 foram diminuídos pela atividade da α-GAL.

[0388] A fim de medir a hidrólise de Gb3, foram extraídos glicoesfingolipídeos neutros dos órgãos-alvo (por exemplo, fígado, rim, coração e baço). Amostras de tecido de 100 mg foram homogeneizadas em 1 mL de clorofórmio:metanol 2:1 (v/v) e centrifugadas por 20 minutos a 13.500 rpm. 62 µL de água foram adicionados a 1 mL de homogenado para gerar uma solução de 20:10:2 de clorofórmio:metanol:água. 10 µL de piridina foram adicionados ao homogenado para produzir uma concentração final de piridina de 1%. A amostra foi agitada por 24 horas a 48°C. Os solventes e a água foram removidos a vácuo utilizando um sistema Speed Vac. A amostra foi ressuspensa em 2,5 mL de metano e 250 µL de KOH em metanol 1 M foram, então, adicionados. A amostra foi então agitada por 2 horas a 37°C. A reação de saponificação foi interrompida com a adição de 10 µL de ácido acético, 2,5 mL de clorofórmio foram então adicionados à amostra, seguido da adição de 2,5 mL de água fria. A amostra foi agitada vigorosamente por 5 minutos e permitiu-se que ela descansasse por 5 minutos a fim de permitir a separação das fases. A fase superior, composta de metanol e água, foi descartada, e a fase inferior, composta de clorofórmio e metanol, foi evaporada a vácuo (Speed Vac) , e o resíduo foi ressuspenso em 300 µL de clorofórmio:metanol 1:1 (v/v) para análise dos glicoesfingolipídeos por HPTLC.

[0389] Análises qualitativas e semiquantitativas de glicolipídeos do tecido foram realizadas por cromatografia de camada fina de alto desempenho (HPTLC) (CAMAG, Suíça). A análise por HPTLC foi realizada em placas de vidro revestidas de sílica gel 60 (Merck) para HPTLC. As amostras foram carregadas nas placas utilizando um sistema Linomat 5 (CAMAG, Suíça). As placas foram desenvolvidas utilizando clorofórmio-metanol-água (60:35:4) como o sistema de solvente. Os glicoesfingolipídeos neutros foram detectados com reagente spray de primulina. O Gb3 foi identificado utilizando Gb3 de hemácias porcinas (Matreya) como padrão, e quantificado utilizando uma curva de calibração de N-heptadecanoil ceramida trihexosida (Matrieya), um padrão semissintético. As placas foram visualizadas e as manchas relevantes foram quantificadas utilizando um TLC Scanner III (CAMAG, Suíça) suportado pelo software winCATS (CAMAG, Suíça).

SDS-PAGE:

[0390] A SDS-PAGE foi realizada sob condições reduzidas utilizando um sistema Bio-Rad Criterion™ e gel de acrilamida 12% preparada internamente. O gel foi corado com Azul de Coomassie G250.

IEF (foco isoelétrico):

[0391] O IEF foi realizado utilizando uma minicélula Novex® da Invitrogen e géis pré-preparados para IEF com uma faixa de pH de 3-7 (Invitrogen) . O gel foi corado com Azul de Coomassie G250.

Espectrometria de massa (MALDI-TOF):

[0392] A MALDI-TOF foi realizada utilizando um sistema de espectrômetro de massa Bruker Reflex IV MALDI-ToF (Bruker-Franzen Analytik GmbH, Alemanha) e uma solução matriz saturada de ácido sinapínico/ácido trifluoroacético (TFA) (0,1% de TFA/acetonitrila (2:1, v/v)).

EXEMPLO I Estabilidade in vitro de α-GAL recombinante

[0393] A estabilidade in vitro de α-GAL recombinante foi medida em várias condições conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A α-GAL-I recombinante humana vegetal, bem como as α-GAL recombinantes humanas comerciais Fabrazyme® e Replagal®, foram testadas.

[0394] Conforme mostra a Figura 1, todos os tipos de α-GAL testados exibiram uma perda de atividade sob condições lisossomais simuladas.

[0395] Além disso, conforme mostra a Figura 2, todos os tipos de α-GAL testados exibiram uma perda de atividade sob condições fisiológicas simuladas. Conforme mostram adicionalmente as figuras, a presença de 100 mg/mL de galactose protegeu parcialmente a atividade de α-GAL-I recombinante vegetal sob essas condições.

[0396] De forma semelhante, conforme mostra a Figura 3, todos os tipos de α-GAL testados exibiram uma perda de atividade no plasma humano a 37°C.

[0397] Conforme mostra a Figura 4, a presença de 100 mg/mL de galactose protegeu parcialmente a atividade de α-GAL-I recombinante vegetal sob condições lisossomais simuladas.

[0398] Experimentos de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC - size exclusion chromatography) em níveis lisossomais e de pH neutro demonstraram mudanças na estrutura proteica (dados não mostrados) enquanto as análises de SDS-PAGE e Western blot não exibiram qualquer degradação da sequência de aminoácidos primários (dados não mostrados).

[0399] Esses resultados indicam que a α-GAL perde atividade sob condições lisossomais e sob condições fisiológicas devido à alteração da estrutura da proteína α-GAL, e que a galactose impede, parcialmente, essa perda de atividade.

EXEMPLO II Reticulação de α-GAL-I recombinante humana vegetal com agentes bis-N-hidroxisuccinimida-poli (etilenoglicol) (bis-NHs-PEG)

[0400] A α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-I) foi reticulada em relações molares de 50:1, 100:1 e 200:1 com bis-N-hidroxisuccinimida-poli (etilenoglicol) (bis-NHS-PEG) de vários pesos moleculares, a saber bis-NHS-PEG5, bis-NHS-PEG8 ou bis-NHS-PEG45 (bis-NHS-PEG com PEG 2.000 Daltons), as estruturas das quais são apresentadas na Figura 5.

[0401] O bis-NHS-PEG pode se ligar à proteína em dois sítios de uma proteína (por exemplo, resíduos de lisina) formando dessa forma a reticulação, ou em um sítio de uma proteína. Essas duas formas de ligação são representadas na Figura 6.

[0402] 100 µg de α-GAL-I em 28,5 µL de tampão ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) (25 mM, pH 6) foram adicionados a 13,5 µL de tampão fosfato (100 mM, pH 8) contendo 100 mg/ml de galactose.

[0403] A α-GAL-I foi reticulada com bis-NHS-PEG5 a relações molares de 1:50, 1:100, e 1:200 de proteína: reagente, adicionando bis-NHS-PEG5 em 8 µL de DMSO à solução de α-GAL-I (27,4 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:50, 54,8 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:100, e 109,7 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:200).

[0404] A α-GAL-I foi reticulada com bis-NHS-PEG45 a relações molares de 1:50, 1:100, e 1:200 de proteína: reagente, adicionando bis-NHS-PEG45 em 8 µL de DMSO à solução de α-GAL-I (103 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:50, 206 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:100, e 412 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:200). α-GAL-I foi reticulada com bis-NHS-PEGs a relações molares de 1:50, 1:100 e 1:200 de proteína: reagente, adicionando bis-NHS-PEG8 em 11,5 µL de DMSO à solução de α-GAL-I (37 µg de α-GAL-I para uma relação molar de 1:50, 73 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:100, e 146 µg de solução de α-GAL-I para uma relação molar de 1:200) .

[0405] Após adicionar o agente bis-NHS-PEG à α-GAL-I, as reações foram pipetadas e agitadas em um agitador orbital por 2 horas em temperatura ambiente.

[0406] Em todas as reações, o excesso de reagente reticulante bis-NHS-PEG foi removido por diálise contra solução salina (corte de 50 KDa).

[0407] O rendimento de dímero aumentou com o aumento da concentração de proteína e da concentração de DMSO, alcançando até 30%.

[0408] Os produtos da reação foram analisados por SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio), IEF (foco isoelétrico), Western blot e espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito acima.

[0409] Conforme mostra a Figura 7, a prh-α-GAL-I nativa padrão foi observada como um monômero (apresentando um peso molecular de 48 KDa) seguindo a eletroforese em gel, ao passo que após a reação de prh-α-GAL-I com bis-NHS-PEG, a prh-α-GAL-I apareceu principalmente na forma de um dimero (com algum monômero presente), indicando que os dois monômeros eram covalentemente ligados por reticulação com bis-NHS-PEG.

[0410] Conforme mostra adicionalmente a Figura 7, uma proporção maior de prh-α-GAL-I monomérica foi observada com os reticulantes mais curtos, bis-NHS-PEG5 e bis-NHS-PEG8, do que com o reticulante mais longo bis-NHS-PEG45. O bis-NHS-PEG45 gerou uma proporção elevada de proteína reticulada. Esses resultados indicam que os reticulantes mais curtos são menos eficazes em ligar covalentemente os monômeros.

[0411] Conforme mostra adicionalmente a Figura 7, para cada um dos reticulantes testados, o peso molecular da porção monomérica de prh-α-GAL-I aumentou após a reação com o reticulante. O aumento do peso molecular foi maior quando uma proporção maior de reticulante em relação à proteína foi utilizada (por exemplo, 200:1), e quando o peso molecular do reticulante foi maior (por exemplo, bis-NHS-PEG45) . Esses resultados indicam que os monômeros da proteína que não foram dimerizados pela reticulação foram covalentemente ligados ao reticulante bis-NHS-PEG, isto é, as proteínas foram PEGuiladas.

[0412] Os resultados acima indicam que a utilização de excesso molar mais elevado do reticulante em relação à proteína gera níveis mais elevados de modificação da α-GAL, incluindo tanto a reticulação para formar um dímero quanto a PEGuilação dessas proteínas. No entanto, uma relação molar de 100:1 proporcionou um nível elevado de reticulação, especialmente nas reações que utilizavam o reagente bis-NHS-PEG45, de forma que uma relação de 200:1 proporcionou apenas uma adição marginal à eficiência da reticulação.

[0413] Conforme mostra a Figura 8, a reação de prh-α-GAL-I com bis-NHS-PEG reduziu o ponto isoelétrico (pI) de prh-α-GAL-I confirmando, dessa forma, que o bis-NHS-PEG é covalentemente ligado à prh-α-GAL-I. A ligação de bis-NHS-PEG à prh-α-GAL-I converte os grupos amina básicos nos resíduos de lisina em grupos amida neutros reduzindo, dessa forma, o pI. A redução do pI foi mais pronunciada quando um excesso molar maior (por exemplo, de 200:1) de bis-NHS-PEG foi utilizado, confirmando os resultados acima obtidos com SDS-PAGE.

[0414] Conforme mostra ainda a Figura 8, o pi é reduzido mais por bis-NHS-PEG5 e bis-NHS-PEG8 do que por bis-NHS-PEG45.

[0415] Esse resultado indica que bis-NHS-PEG5 e bis-NHS-PEGs têm mais probabilidade do que o bis-NHS-PEG45 de resultar em PEGuilação em que apenas um terminal do reticulante é ligado à α-GAL. Um reticulante ligado à α-GAL apenas em um terminal é mais eficaz na redução do pI porque esse reticulante compreende um grupo carboxílico acidico (-CO2H) no terminal não ligado, além de converter um grupo amina de lisina em um grupo amida no terminal ligado.

[0416] Conforme mostra a Figura 9, a reação de prh-α-GAL-I com o reticulante bis-NHS-PEG45 aumentou o peso molar do dimero de prh-α-GAL-I de 97 KDa para 113 KDa, conforme determinado por espectrometria de massa MALDI-TOF. O aumento do peso molecular indica uma adição de aproximadamente 8 moléculas de bis-NHS-PEG45 ao dimero de prh-α-GAL-I.

[0417] Conforme mostra a Figura 10, a reação de prh-α-GAL-I com o reticulante bis-NHS-PEG8 aumentou o peso molar do dimero de prh-α-GAL-I de 97 KDa para 104 KDa, conforme determinado por espectrometria de massa MALDI-TOF. O aumento do peso molecular indica uma adição de aproximadamente 10 moléculas de bis-NHS-PEG8 ao dimero de prh-α-GAL-I.

EXEMPLO III Atividade de α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada

[0418] A fim de determinar se a α-GAL- I recombinante vegetal reticulada (prh-α-GAL-I) descrita no Exemplo II retinha atividade enzimática, a prh-α-GAL-I reticulada foi ensaiada quanto a sua atividade enzimática utilizando o ensaio com 4-metilumbeliferil-α-D- galactopiranosida descrito acima.

[0419] Conforme mostra a Tabela 1 abaixo, a prh-α-GAL-I que foi reagida com bis-NHS-PEG5, bis-NHS-PEG8 ou bis-NHS-PEG45 em excessos molares de 50:1, 100:1 e 200:1 de reagente bis-NHS-PEG, em todos os casos exibiu um nível de atividade enzimática semelhante àquele da prh-α-GAL-I nativa. Conforme foi possível mostrar, tanto a diminuição moderada quanto o aumento moderado da atividade foram observados em alguns casos, o que pode ser um resultado dos efeitos da formulação. Esses resultados indicam que a reticulação não reduziu a atividade da prh-α-GAL-I.
Tabela 1: Resultados da atividade de α-GAL-I recombinantehumana vegetal reticulada.

[0420] A atividade da prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 foi, ainda, verificada utilizando o ensaio de N-dodecanoil-NBD-ceramida trihexosida descrito acima, que testa a atividade da α-GAL em relação ao seu substrato natural, ceramida trihexosida (Gb3) . A α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® foi testada para comparação.

[0421] Conforme mostra a Figura 11, após a incubação da α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com o substrato fluorescente, quase todo o substrato foi convertido no produto, N-dodecanoil-nitrobenzoxadiazol-lactosil ceramida, de forma semelhante à reação catalisada pela α-GAL recombinante de mamífero (Replagal®) . Esse resultado confirma que a reticulação não afeta a eficácia enzimática hidrolítica da prh-α-GAL-I, utilizando um análogo próximo do substrato natural.

EXEMPLO IV Estabilidade in vitro de α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada

[0422] A estabilidade in vitro da α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada (prh-α-GAL-I), obtida conforme descrito no Exemplo II, foi medida em várias condições conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A estabilidade das α-GALs recombinantes humanas comerciais Fabrazyme® e Replagal® foi medida para comparação.

[0423] Conforme mostram as figuras 12A-12C, a estabilidade da α-GAL-I recombinante humana vegetal sob condições lisossomais simuladas foi melhorada pela reticulação com bis-NHS-PEG5 (Figura 12A), bis-NHS-PEG8 (Figura 12B) e bis-NHS-PEG45 (Figura 12C). Ainda conforme mostram essas figuras, a estabilidade da prh-α-GAL-I reticulada ao longo de uma semana foi favoravelmente comparada à estabilidade da α-GAL recombinante humana comercial. Após uma pequena diminuição da atividade residual durante as primeiras 24 horas, a prh-α-GAL-I reticulada manteve a atividade, mesmo depois de 10 dias. A diminuição inicial da atividade, observada durante as primeiras 24 horas, pode refletir a porção da α-GAL-I recombinante humana vegetal que não foi submetida à reticulação.

[0424] Conforme mostram, ainda, as Figuras 12A-12C, a prh-α-GAL-I reticulada por bis-NHS-PEG45 exibiu a estabilidade mais elevada sob condições lisossomais simuladas.

[0425] A estabilidade da α-GAL-I recombinante humana vegetal no plasma humano a 37°C também foi melhorada pela reticulação com bis-NHS-PEG45 (dados não exibidos).

[0426] Esses resultados indicam que a reticulação da α-GAL conforme descrito neste documento pode aumentar a eficácia da α-GAL in vivo aumentando a estabilidade da α-GAL em lisossomos, permitindo, dessa forma que a α-GAL atue por um período de tempo mais prolongado nos lisossomos, e aumentando a estabilidade da α-GAL no sangue, aumentando, assim, a meia-vida circulatória da α-GAL.

EXEMPLO V Farmacocinética in vitro e biodistribuição de α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada

[0427] A farmacocinética e a biodistribuição da α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-I) reticulada com bis-NHS-PEG45 ou bis-NHS-PEG8, conforme descrito no Exemplo II, foram determinadas em camundongos Fabry injetados com 2 mg/Kg de α-GAL, conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A farmacocinética e a biodistribuição de α-GAL-I recombinante humana vegetal e de α-GAL recombinante humana Replagal® foram determinadas para comparação. Amostras de sangue foram coletadas para análise farmacocinética 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 60 e 120 minutos após a injeção. Para cada tipo de a- GAL, o grupo de tratamento consistiu de seis camundongos.

[0428] Conforme mostra a Tabela 2 abaixo, a prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG8 e com bis-NHS-PEG45 aumentou a meia-vida terminal circulatória de α-GAL-I recombinante humana vegetal, com o último exibindo um efeito mais pronunciado.
Tabela 2: Meias-vidas terminais circulatórias de α-GAL recombinante

[0429] Conforme mostram a Figura 13 e a Tabela 2, a meia-vida terminal da prh-α-GAL-I reticulada por bis-NHS-PEG45 foi consideravelmente maior do que a meia-vida terminal da α-GAL Replagal®.

[0430] Conforme mostra ainda a Figura 13, a atividade da α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 em 20 minutos foi de aproximadamente 40% da atividade em 1 minuto. Além disso, a prh-α-GAL-I reticulada exibiu uma presença plasmática ativa até mesmo 4 horas após a injeção.

[0431] Esses resultados indicam que a prh-α-GAL-I reticulada permanece ativa in vivo por um período relativamente longo, o que pode permitir que a enzima alcance tecidos e órgãos adicionais.

[0432] Conforme mostram as Figuras 14A e 14B, os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada com bis-NHS-PEGg e bis-NHS-PEG45 nos baços de camundongos Fabry 2 horas após a injeção foram consideravelmente maiores do que aqueles de α-GAL-I recombinante vegetal não reticulada, bem como daqueles de α-GAL recombinante de mamífero Replagal®. Conforme mostram ainda essas figuras, os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 foram mais elevados do que os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG8. As análises de Western blot (Figura 14B) são consistentes com os resultados de biodistribuição obtidos pelo teste da atividade enzimática da α-GAL (Figura 14A).

[0433] Conforme mostram as Figuras 15A e 15B, os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada com bis-NHS-PEG8 e bis-NHS-PEG45 nos fígados de camundongos Fabry 2 horas após a injeção foram consideravelmente maiores do que aqueles de α-GAL-I recombinante vegetal não reticulada, mas menores do que os níveis de α-GAL recombinante de mamífero Replagal® no fígado. Conforme mostram, ainda, essas figuras, os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 foram levemente mais elevados do que os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG8. As análises de Western blot (Figura 15B) são consistentes com os resultados de biodistribuição obtidos pelo teste da atividade enzimática da α-GAL (Figura 15A).

[0434] Níveis mais baixos de α-GAL no fígado podem ser terapeuticamente vantajosos, uma vez que 95% das enzimas recobertas na terapia de reposição enzimática são, normalmente, encontradas no fígado e, portanto, altos níveis de α-GAL recombinante no fígado indicam níveis mais baixos de α-GAL exógena em órgãos alvo, como o coração e os rins.

[0435] Conforme mostra a Figura 16, os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada com bis-NHS-PEGe e bis-NHS-PEG45 nos corações de camundongos Fabry 2 horas após a injeção foram maiores do que aqueles de α-GAL-I recombinante vegetal não reticulada. Conforme mostra ainda essa figura, os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 foram maiores do que os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG8, bem como dos níveis de α-GAL recombinante de mamífero Replagal®.

[0436] Conforme mostra a Figura 17, os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada com bis-NHS-PEG8 e bis-NHS-PEG45 nos rins de camundongos Fabry 2 horas após a injeção foram maiores do que aqueles de α-GAL-I recombinante vegetal não reticulada. Conforme mostra ainda essa figura, os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 foram maiores do que os níveis de prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG8, bem como dos níveis de α-GAL recombinante de mamífero Replagal®.

[0437] De forma semelhante, conforme mostram as Figuras 18-21, os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 foram maiores do que os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal não reticulada no baço (Figura 18), no fígado (Figura 19), no coração (Figura 20) e nos rins (Figura 21) de camundongos Fabry, por até 7 dias após a injeção. Conforme mostram, ainda, essas figuras, os níveis de α-GAL-I recombinante vegetal reticulada com bis-NHS-PEG45 foram maiores do que os níveis de α-GAL recombinante de mamífero Replagal® no baço, no coração e nos rins.

[0438] Esses resultados indicam que a α-GAL reticulada com bis-NHS-PEG, particularmente bis-NHS-PEG45, exibe absorção melhorada nos órgãos, incluindo o rim e o coração, que são os maiores órgãos alvo no tratamento do distúrbio de Fabry. Esses resultados são consistentes com o aumento da meia-vida circulatória e estabilidade melhorada de α-GAL reticulada.

EXEMPLO VI Reticulação de α-GAL recombinante humana de mamífero com bis-N-hidroxisuccinimida-poli (etilenoglicol) (bis-NHs-PEG)

[0439] A fim de confirmar os efeitos vantajosos da reticulação descrita acima, a α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal®, que é produzida a partir da linhagem HT-1080 de fibrossarcoma humano, foi reticulada.

[0440] 333 µL de tampão fosfato (100 mM, pH 8) com 100 mg/ml D-(+)-galactose foram adicionados a 3,8 mg de bis-NHS-PEG45 em 151 µL de solução de DMSO (25 mg/ml) e 1,8 mg de α-GAL recombinante humana Replagal® em 130 µL de tampão citrato (25 mM, pH 6) . A concentração de α-GAL Replagal® foi determinada por um ensaio de atividade. A mistura da reação foi agitada utilizando um agitador orbital por 2 horas em temperatura ambiente. O excesso de reagente reticulante bis-NHS-PEG45 foi removido por diálise contra solução salina utilizando um concentrador Vivaspin 6 com um corte de 50 KDa. A atividade de α-GAL da α-GAL reticulada Replagal® indicou que a concentração de α-GAL era de 3 mg/mL.

[0441] Os produtos da reação foram analisados por SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio), IEF (foco isoelétrico) , e espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito acima.

[0442] Conforme mostra a Figura 22, a α-GAL nativa padrão Replagal® foi observada como um monômero após a eletroforese em gel, ao passo que após a reação de α-GAL Replagal® com bis-NHS-PEG45, a α-GAL apareceu na forma de um dimero, indicando que os dois monômeros foram covalentemente ligados pela reticulação com bis-NHS-PEG.

[0443] Conforme mostra a Figura 23, a reação de α-GAL Replagal® com bis-NHS-PEG45 reduziu o ponto isoelétrico (pI) da α-GAL, confirmando, dessa forma, que o bis-NHS-PEG é covalentemente ligado à α-GAL.

[0444] Conforme mostra a Figura 24, a reação de α-GAL Replagal® com o reticulante bis-NHS-PEG45 aumentou o peso molar do dimero de α-GAL Replagal® de 103,0 KDa para 121,3 KDa, conforme determinado por espectrometria de massa MALDI-TOF. O aumento do peso molecular indica uma adição de aproximadamente 9-10 moléculas de bis-NHS-PEG45 ao dimero de α-GAL, que é semelhante aos resultados descritos acima para prh-α-GAL-I.

EXEMPLO VII Atividade de α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada

[0445] A fim de determinar se a reticulação de α-GAL recombinante de mamífero descrita no Exemplo VI afetou a atividade enzimática, a α-GAL reticulada foi ensaiada quanto à sua atividade enzimática utilizando um ensaio de p-nitrofenil-α-D-galactopiranosida (pNP-G), de acordo com os procedimentos descritos acima.

[0446] Conforme mostram a Figura 25 e a Tabela 3 abaixo, a α-GAL recombinante humana de mamífero que foi reticulada com bis-NHS-PEG45 exibiu parâmetros de atividade enzimática que são muito semelhantes àqueles da α-GAL recombinante humana de mamífero nativa. Esses resultados indicam que a reticulação não afetou significativamente a atividade ou o maquinário e mecanismo catalítico da α-GAL-I recombinante humana de mamífero.
Tabela 3: Resultados da atividade de α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada

EXEMPLO VIII Estabilidade in vitro de α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada

[0447] A estabilidade in vitro da α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® reticulada, obtida conforme descrito no Exemplo VI, foi medida em várias condições conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A estabilidade da α-GAL Replagal® não reticulada foi medida para comparação, a fim de avaliar o efeito da reticulação.

[0448] Conforme mostram as Figuras 26A e 26B, a estabilidade da α-GAL recombinante humana de mamífero, tanto sob condições lisossomais simuladas (Figura 26A) quanto no plasma humano (Figura 26B), foi consideravelmente melhorada pela reticulação com bis-NHS-PEG45. A α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada exibiu maior estabilidade sob condições lisossomais simuladas do que no plasma.

[0449] Esses resultados indicam que a reticulação de α-GAL conforme descrita neste documento pode estabilizar a α-GAL recombinante a partir de múltiplas fontes e plataformas de expressão.

EXEMPLO IX Farmacocinética in vivo e biodistribuição de α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada

[0450] A farmacocinética e a biodistribuição da α-GAL recombinante humana de mamífero reticulada descritas no Exemplo VI foram determinadas medindo a atividade da α-GAL no baço, no fígado, no coração e nos rins de camundongos Fabry 2 horas, 7, 14 e 28 dias após a injeção, bem como os níveis de Gb3 nesses órgãos, conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A biodistribuição de α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® não reticulada foi determinada para comparação.

[0451] Conforme mostram as Figuras 27A-27D, os níveis de α-GAL-I recombinante de mamífero reticulada nos baços (Figura 27A), no fígado (Figura 27B) , no coração (Figura 27C) e nos rins (Figura 27D) de camundongos Fabry foram consideravelmente maiores do que aqueles de α-GAL recombinante de mamífero não reticulada.

[0452] Conforme mostram as Figuras 28A-28D, a α-GAL recombinante de mamífero reticulada diminuiu os níveis de Gb3 no coração (Figura 28A), no rim (Figura 28B), no fígado (Figura 28C) e no baço (Figura 28D) de camundongos Fabry ao longo de 28 dias após a injeção. A α-GAL recombinante de mamífero reticulada diminuiu os níveis de Gb3 em uma extensão maior do que a α-GAL recombinante não reticulada no rim (Figura 28 B) e no baço (Figura 28D) de camundongos Fabry, e aproximadamente na mesma extensão que a α-GAL recombinante de mamífero não reticulada no coração (Figura 28A) e no fígado (Figura 28C).

[0453] Esses resultados indicam que a reticulação com bis-NHS-PEG resulta em uma absorção consideravelmente melhorada de α-GAL recombinante a partir de uma variedade de fontes e plataformas de expressão nos órgãos, incluindo o rim e o coração, que são os maiores órgãos alvo no tratamento do distúrbio de Fabry. Esses resultados indicam, ainda, que a reticulação com bis-NHS-PEG resulta em uma diminuição mais substancial dos níveis de Gb3 nos órgãos.

EXEMPLO X Reticulação de α-GAL-II recombinante humana vegetal com bis-N-hidroxisuccinimida-poli (etilenoglicol) (bis-NHS-PEG)

[0454] A α-GAL-II recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-II), que carece dos aminoácidos EF presentes no N-terminal da prh-α-GAL-I, foi reticulada com bis-NHS-PEG45, bis-NHS-PEG21, ou bis-NHS-PEG68 a uma relação molar de 200:1 de bis-NHS-PEG para α-GAL, de acordo com o protocolo descrito no Exemplo II.

[0455] A prh-α-GAL-II reteve sua atividade biológica após a reticulação com bis-NHS-PEG (dados não exibidos).

[0456] Os produtos da reação foram analisados por SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio) e espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito acima.

[0457] Conforme mostram as Figuras 29A-29B, a prh-α-GAL-II nativa padrão foi observada como um monômero após a eletroforese em gel, ao passo que após a reação de prh-α-GAL-II com bis-NHS-PEG45 ou bis-NHS-PEG21 (Figura 29A), ou com bis-NHS-PEG68 (Figura 29B), a prh-α-GAL-II apareceu principalmente na forma de um dimero (com algum monômero presente), indicando que os dois monômeros são covalentemente ligados pela reticulação com um agente de reticulação bis-NHS-PEG.

[0458] Conforme mostram adicionalmente as Figuras 29A-29B, para cada um dos reticulantes testados, o peso molecular da porção monomérica de prh-α-GAL-II aumentou após a reação com o reticulante. O aumento do peso molecular foi maior para bis-NHS-PEG45 do que para bis-NHS-PEG2i (Figura 29A) , e foi maior para bis-NHS-PEG68 (compare a Figura 29A com a Figura 29B). Esses resultados indicam que os monômeros que não foram dimerizados pela reticulação, foram covalentemente ligados ao reticulante bis-NHS-PEG, isto é, as proteínas foram PEGuiladas.

[0459] Conforme mostram as Figuras 30A-30C, a reação de prh-α-GAL-II com o reticulante bis-NHS-PEG21 aumentou o peso molar do dímero de prh-α-GAL-II de 95 KDa (Figura 30A) para 109 KDa (Figura 30B) , enquanto a reação de prh-α-GAL-II com o reticulante bis-NHS-PEG45 aumentou o peso molecular do dímero de prh-α-GAL-II para 114 KDa (Figura 30C), conforme determinado por espectrometria de massa MALDI-TOF. O aumento do peso molecular indica uma adição de aproximadamente 13 moléculas de bis-NHS-PEG2i, ou de aproximadamente 9 moléculas de bis-NHS-PEG45 ao dímero de prh-α-GAL-II.

EXEMPLO XI Estabilidade in vitro de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada

[0460] A estabilidade in vitro da α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada (prh-α-GAL-II), obtida conforme descrito no Exemplo X, foi medida em várias condições conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A estabilidade da α-GAL recombinante humana comercial Replagal® foi medida para comparação.

[0461] Conforme mostram as figuras 31A-31C, a estabilidade da α-GAL-II recombinante humana vegetal foi melhorada pela reticulação com bis-NHS-PEG68 (Figuras 31B e 31D), bis-NHS-PEG46 (Figuras 31A-31D) ou bis-NHS-PEG21 (Figuras 31A e 31C), tanto sob condições lisossomais simuladas (Figuras 31A e 31B) quanto no plasma humano (Figuras 31C e 31D). Os diferentes reticulantes melhoraram a estabilidade da prh-α-GAL-II em extensões comparáveis. Conforme mostrado adicionalmente nessas figuras, a estabilidade da α-GAL-II reticulada foi maior do que a estabilidade da α-GAL recombinante humana Replagal®. A prh-α-GAL-II reticulada exibiu maior estabilidade sob condições lisossomais simuladas, bem com sob condições plasmáticas.

[0462] Conforme mostram adicionalmente as Figuras 31A-31D, a prh-α-GAL-II não reticulada é consideravelmente mais estável do que a prh-α-GAL-I não reticulada (vide as Figuras 1 e 3 para comparação) , tanto sob condições lisossomais simuladas (Figuras 1 e 31A-31B) quanto no plasma humano (Figuras 3 e 31C-31D), embora a prh-α-GAL-II ainda apresente alguma instabilidade.

[0463] Esses resultados indicam que a reticulação de α-GAL conforme descrito neste documento pode estabilizar diferentes tipos de α-GALs.

EXEMPLO XII Farmacocinética in vivo e biodistribuição de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada

[0464] A farmacocinética e a biodistribuição de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com PEG45 e com PEG21 (prh-α-GAL-II), descritas no Exemplo X, foram determinadas medindo a atividade da α-GAL no plasma e em órgãos conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos. A farmacocinética e a biodistribuição de α-GAL recombinante humana de mamífero Replagal® não reticulada foram determinadas para comparação.

[0465] Amostras de sangue foram coletadas para análises farmacocinéticas em 1, 5, 10, 30, 60, 120, 240, 480 e 1440 minutos após a injeção de camundongos Fabry com 1 mg/Kg de α-GAL.

[0466] A biodistribuição de α-GAL foi determinada colhendo o fígado, os rins, o coração e o baço de camundongos Fabry 2 horas, 7 dias, 14 dias e 28 dias após a injeção com 2 mg/Kg de α-GAL.

[0467] Conforme mostram as Figuras 32A e 32B e a Tabela 4, a reticulação de prh-α-GAL-II com bis-NHS-PEG45 aumentou consideravelmente a meia-vida terminal circulatória de prh-α-GAL-II, gerando uma meia-vida circulatória consideravelmente maior do que aquela de α-GAL recombinante de mamífero ou de prh-α-GAL-II não reticulada.
Tabela 4: Meia-vida terminal circulatória de α-GAL recombinante

[0468] Conforme mostram as Figuras 33A-33L, a reticulação de prh-α-GAL-II com PEG45 aumentou a absorção de prh-α-GAL-II no coração (Figura 33A), no rim (Figura 33B) , no fígado (Figura 33C) e no baço (Figura 33D) de camundongos Fabry, embora em um grau menor no fígado.

[0469] Conforme mostram as Figuras 33E-33L, a reticulação de prh-α-GAL-II com bis-NHS-PEG21 também aumentou a absorção de prh-α-GAL-II no coração (Figuras 33E e 331), no rim (Figuras 33F e 33J), no fígado (Figuras 33G e 33K) e no baço (Figuras 33H e 33L) de camundongos Fabry, embora esse aumento nem sempre fosse evidente depois de apenas 2 horas.

[0470] Conforme mostrado adicionalmente nessas figuras, os níveis de prh-α-GAL-II reticulada foram maiores do que os níveis de α-GAL recombinante de mamífero no coração (Figuras 33A, 33E e 331), no rim (Figuras 33B, 33F e 33J) , e no baço (Figuras 33D, 33H e 33L) de camundongos Fabry, e menores do que os níveis de α-GAL recombinante de mamífero no fígado (Figuras 33C, 33G e 33K).

[0471] Esses resultados indicam que a prh-α-GAL-II reticulada exibe atividade consideravelmente melhorada de α-GAL no plasma e em vários órgãos, particularmente em órgãos que não sejam o fígado.

EXEMPLO XIII Efeito do pH sobre a atividade da α-GAL recombinante humana vegetal

[0472] O pH do ambiente tem um efeito significativo sobre a estabilidade e a cinética de enzimas lisossomais como a α-GAL. O pH pode afetar a ligação do substrato à enzima. O pH também pode afetar a protonação ou a desprotonação de grupos catalíticos, como os grupos carboxil ou amino, que fazem parte do sítio ativo da enzima e, dessa forma, afetam o comportamento cinético da enzima. A estabilidade da estrutura terciária ou quaternária das enzimas também é dependente do pH, e afeta a velocidade da reação enzimática, principalmente em valores de pH extremamente acídicos ou alcalinos.

[0473] A atividade da α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com PEG45 e α-GAL-II recombinante humana vegetal não reticulada foi determinada em vários valores de pH utilizando um substrato pNP-G, a fim de examinar a dependência da atividade de α-GAL do pH, e o efeito de sua reticulação. As medições foram realizadas em soluções de 20 mM de citrato e 30 mM de fosfato de sódio.

[0474] Os parâmetros cinéticos que caracterizam a atividade de α-GAL em vários valores de pH estão resumidos na Tabela 5 abaixo, e nas Figuras 34A-34C.

[0475] Conforme mostram as Figuras 34A-34C, a reticulação da α-GAL-II aumentou os parâmetros de Vmax (Figura 34A) e kcat (Figura 34C), e não teve um efeito significativo sobre o parâmetro KM (Figura 34B) .
Tabela 5: Resultados da atividade da α-GAL-II recombinante humana vegetal não reticulada (prh-α-GAL-II) e da α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com PEG45 (prh-α-GAL-II-CL45) em vários valores de pH

[0476] A melhora dos parâmetros de Vmax e kcat indica um aumento da atividade catalítica. Esse aumento é particularmente significativo em valores de pH de pelo menos aproximadamente 7, onde a atividade catalítica de α-GAL-II não reticulada é insignificante.

[0477] KM é um parâmetro cinético associado com a afinidade enzima/substrato. A ausência de um efeito significativo da reticulação sobre os valores de KM indica que a reticulação não tem efeito significativo sobre a afinidade da α-GAL com o substrato pNP-G.

EXEMPLO XIV Efeito da PEGuilação sobre a estabilidade da α-GAL

[0478] O efeito da PEGuilação sobre a estabilidade da α-GAL foi verificada, a fim de determinar se o efeito estabilizante dos reticulantes PEG é devido às propriedades do PEG ou devido à reticulação.

[0479] A α-GAL-I recombinante humana vegetal foi reagida com PEGs metoxi-encapsuladas ativadas com N-hidroxisuccinimida (NHS) com diferentes pesos moleculares (2, 5 e 10 KDa) . Esses reagentes de PEG têm um único grupo NHS e, consequentemente, PEGuilam a proteína sem formar a reticulação. Os produtos da reação foram analisados por SDS-PAGE.

[0481] Conforme mostram as figuras 36A e 36B, a PEGuilação da α-GAL-I recombinante humana vegetal sem formar reticulação não aumentou substancialmente a estabilidade da α-GAL recombinante vegetal, sob condições lisossomais simuladas (Figura 36A) ou no plasma humano (Figura 36B).

[0482] Esses resultados indicam que o efeito estabilizador da reticulação descrito acima não é um resultado da PEGuilação em si.

EXEMPLO XV Efeito do comprimento da cadeia de PEG sobre a atividade da α-GAL reticulada

[0483] A fim de avaliar o efeito do comprimento da cadeia de reticulantes PEG sobre a atividade da α-GAL, a α-GAL-I recombinante humana vegetal foi reticulada com agentes bis-NHS-PEG2, bis-NHS-PEG4, bis-NHS-PEG68 e bis-NHS-PEG150, utilizando essencialmente os mesmos procedimentos conforme descritos no Exemplo II (PEG68 e PEG150 são comprimentos de cadeia aproximados). A α-GAL-I foi reticulada com relações molares de 50:1, 100:1 e 200:1 de bis-NHS-PEG:α-GAL. Os produtos de reação foram analisados por SDS-PAGE, conforme descrito acima. A α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 conforme descrito no Exemplo II também foi analisada para comparação.

[0484] Conforme mostra a Figura 37, a análise de SDS-PAGE mostrou que todos os agentes bis-NHS-PEG reticularam a α-GAL de forma a resultar em um dimero covalentemente reticulado, e que a reticulação foi mais eficiente quando uma relação molar de 200:1 foi utilizada.

[0485] A atividade enzimática da α-GAL-I reticulada foi, então, determinada conforme descrito no Exemplo III. Os resultados estão resumidos na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6: Resultados da atividade da α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada

[0486] Conforme mostra a Tabela 6, a reticulação com PEG2 e PEG4 reduziu moderadamente a atividade da α-GAL (em aproximadamente 30-50%), ao passo que a reticulação com cadeias de PEG mais longas não afetou significativamente a atividade da α-GAL.

[0487] Esses resultados indicam que a reticulação com PEG de cadeias mais longas do que o PEG4 é vantajosa em termos de preservar a atividade da α-GAL reticulada.

EXEMPLO XVI Reticulação da α-GAL utilizando agentes bis-COOH-PEG

[0488] Como uma alternativa à reticulação da α-GAL descrita acima utilizando agentes bis-NHS-PEG pré-preparados (por exemplo, comercialmente disponíveis), a α-GAL foi reticulada com agentes bis-COOH-PEG ativando os grupos carboxil (isto é, COOH) in situ pouco antes que a reação de reticulação fosse efetuada.

[0489] Bis-COOH-PEG12, bis-COOH-PEG28 e bis-COOH-PEG45 foram, cada um, ativados pela reação com 1,1 equivalentes molares por grupo carboxil (isto é, 2,2 equivalentes molares por bis-COOH-PEG) ou tanto NHS (N-hidroxisuccinimida) quanto EDC (l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida). Então, a mistura da reação foi agitada em DMSO por 30 minutos em temperatura ambiente. O bis-COOH-PEG ativado, que é essencialmente bis-NHS-PEG, foi, então, reagido com α-GAL-Ι recombinante humana vegetal em relações molares de 50:1, 100:1 e 200:1, conforme descrito no Exemplo II. Os produtos da reação foram analisados por SDS-PAGE, conforme descrito acima. A α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 conforme descrito no Exemplo II também foi analisada para comparação.

[0490] Conforme mostra a Figura 38, a análise de SDS-PAGE mostrou que todos os agentes bis-COOH-PEG reticularam a α-GAL em alguma extensão, mas que a reticulação foi mais eficiente quando uma relação molar de 200:1 foi utilizada.

[0491] A atividade enzimática da α-GAL-I reticulada foi, então, determinada conforme descrito no Exemplo III. Os resultados estão resumidos na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7: Resultados da atividade da α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada

[0492] Conforme mostra a Tabela 7, a reticulação com cada um dos agentes bis-COOH-PEG resultou em α-GAL com aproximadamente a atividade esperada.

[0493] Esses resultados indicam que a reticulação com agentes bis-COOH-PEG não reduz a atividade da α-GAL em comparação com a reticulação com agentes bis-NHS-PEG.

[0494] Esses resultados confirmam, ainda, as descobertas acima de que a reticulação com PEG de cadeias mais longas do que o PEG4 não reduz significativamente a atividade da α-GAL reticulada.

EXEMPLO XVII Efeito do comprimento e do tipo de agente reticulante sobre a estabilidade in vitro de α-GAL-I recombinante humana vegetal reticulada.

[0495] A fim de caracterizar adicionalmente o efeito do comprimento da cadeia sobre a estabilidade da α-GAL reticulada, e comparar a estabilidade da α-GAL reticulada com agentes bis-COOH-PEG (por exemplo, conforme descrito no Exemplo XVI) com aquela de α-GAL reticulada com agentes bis-NHS-PEG, a estabilidade in vitro da α-GAL-I recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-I) reticulada com bis-NHS-PEG2, bis-NHS-PEG4, bis-COOH-PEG12, bis-COOH28, e bis-COOH-PEG45, obtida conforme descrito nos Exemplos XV e XVI, foi medida em várias condições conforme descrito acima na Seção Materiais e Métodos, e comparada com a estabilidade da prh-α-GAL-I reticulada com bis-NHS-PEG45 conforme descrito no Exemplo II. A estabilidade da α-GAL recombinante humana comercial Replagal® e da prh-GAL-I reticulada foram medidas para comparação.

[0496] Conforme mostra a Figura 39, a estabilidade da α-GAL-I recombinante humana vegetal sob condições lisossomais simuladas foi melhorada pela reticulação com cada um dos agentes bis-NHS-PEG e bis-COOH-PEG.

[0497] Conforme mostrado adicionalmente nessa figura, a estabilidade da prh-α-GAL-I reticulada foi correlacionada com o comprimento da cadeia de PEG reticulante, com bis-NHS-PEG45 e bis-COOH-PEG45 proporcionando a maior estabilidade, e bis-NHS-PEG2 proporcionando a menor estabilidade. No entanto, a reticulação com bis-COOH-PEG45 proporcionou apenas marginalmente mais estabilidade do que a reticulação com bis-COOH-PEG45, sugerindo que acima de um determinado comprimento, a estabilidade não é afetada pelo comprimento da cadeia de PEG.

[0498] Conforme mostra adicionalmente a Figura 39, a reticulação com bis-NHS-PEG45 proporcionou levemente mais estabilidade do que a reticulação com bis-COOH-PEG45. Esse pode ser um resultado da ativação incompleta do agente bis-COOH-PEG. No entanto, a diferença na estabilidade foi leve.

[0499] Além disso, a reticulação com cada um dos agentes bis-NHS-PEG e bis-COOH-PEG melhorou a estabilidade da α-GAL-I humana recombinante vegetal no plasma humano a 37°C (dados não exibidos).

[0500] Esses resultados apresentam evidência adicional de que a reticulação da α-GAL conforme descrito neste documento pode aumentar a eficácia da α-GAL in vivo aumentando a estabilidade da α-GAL nos lisossomos e no sangue, e que cadeias de PEG de aproximadamente 28-45 unidades de comprimento são mais eficazes na estabilização da α-GAL por reticulação do que as cadeias de PEG mais curtas.

EXEMPLO XVIII Parâmetros cinéticos de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada

[0501] Os parâmetros cinéticos de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada, obtidos conforme descrito no Exemplo X, bem como de α-GAL-II recombinante humana vegetal não reticulada, foram determinados utilizando um substrato pNP-G e análise de Michaelis-Menten, a fim de examinar o efeitos de sua reticulação. As medições foram realizadas em uma solução de 20 mM de citrato, 30 mM de fosfato de sódio, 0,1% de albumina sérica bovina e 0,67% de etanol, a um pH de 4,6. Os parâmetros cinéticos foram calculados utilizando valores de teor de proteína embasados em um ensaio de atividade.

[0502] Conforme mostra a Tabela 8 abaixo, a reticulação de α-GAL-II resultou na melhora das propriedades cinéticas, em comparação com a α-GAL-II não reticulada. A constante de Michaelis (KM) foi reduzida, indicando maior afinidade da enzima com relação ao substrato. Além disso, a kcat/KM, que significa a eficiência catalítica geral da enzima com esse substrato sob as condições descritas, foi melhorada para as espécies reticuladas.
Tabela 8: Parâmetros de Michaelis-Menten de α-GAL-II recombinante humana vegetal não reticulada (prh-α-GAL-II) e de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG21 (prh-α-GAL-II-CL21) , bis-NHS-PEG45 (prh-α-GAL-II-CL45) ou bis-NHS-PEG68 (prh-α-GAL-II-CL68)

EXEMPLO XIX Reprodutibilidade da reticulação de α-GAL-II recombinante humana vegetal

[0503] A reprodutibilidade de lote para lote de reticulação foi avaliada depois do preparo de 5 lotes de α-GAL-II recombinante humana vegetal (prh-α-GAL-II) reticulada com bis-NHS-PEG45 a uma relação de 200:1, utilizando procedimentos semelhantes àqueles descritos no Exemplo II.

[0504] Nos lotes 1, 2, 4 e 5, 1 mg de prh-α-GAL-II foram reagidos com 3,98 mg de bis-NHS-PEG.

[0505] No lote 3, 20,5 mg de prh-α- GAL-II foram reagidos com 80,7 mg de bis-NHS-PEG.

[0506] A atividade enzimática da prh-α-GAL-II reticulada foi determinada conforme descrito no Exemplo III. Os resultados estão resumidos na Tabela 9 abaixo.
Tabela 9: Resultados da atividade da α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada de diferentes lotes.

[0507] Conforme mostra a Tabela 9, a atividade medida foi próxima à atividade esperada em todos os 5 lotes. Em 4 dos 5 lotes, a atividade medida foi diferente da atividade esperada em até aproximadamente 10% ou menos.

[0508] Esses resultados indicam que a atividade obtida da prh-α-GAL-II reticulada é relativamente previsível e reprodutível.

[0509] A estabilidade da prh-α-GAL-II reticulada sob condições lisossomais e no plasma humano foi determinada conforme descrito acima.

[0510] Conforme mostram as Figuras 40A e 40B, a estabilidade da prh-α-GAL-II reticulada exibiu boa reprodutibilidade tanto sob condições lisossomais simuladas quanto no plasma humano.

[0511] A reticulação também foi analisada por SDS-PAGE, análise de IEF (foco isoelétrico), e espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito acima. A α-GAL-II não reticulada foi analisada para comparação.

[0512] Conforme mostra a Figura 41, a prh-α-GAL-II reticulada dos diferentes lotes exibiu o mesmo grau de dimerização covalente sob análise de SDS-PAGE.

[0513] Conforme mostra a Figura 42, a prh-α-GAL-II reticulada dos diferentes lotes exibiu os mesmos pontos isoelétricos sob análise de IEF.

[0514] Conforme mostram as Figuras 43A-43F, a prh-α-GAL-II reticulada dos lotes 1-5 (FIGs. 43B-43F, respectivamente) exibiu um aumento de aproximadamente 20-21 KDa na forma de dímero, em comparação com a prh-α-GAL-II não reticulada (FIG. 43A) . Esse aumento corresponde a aproximadamente 10 moléculas de PEG por dimero de α-GAL. Conforme mostram adicionalmente as FIGs. 43B-43F, a prh-α-GAL-II reticulada dos diferentes lotes exibiu proporções semelhantes de monômero vs. dímero.

[0515] Esses resultados indicam, ainda, a boa reprodutibilidade na reticulação de α-GAL.

[0516] Os parâmetros cinéticos da prh-α-GAL-II reticulada foram determinados utilizando um substrato pNP-G e a análise de Michaelis-Menten, a fim de examinar a reprodutibilidade da atividade enzimática. As medições foram realizadas em uma solução de 20 mM de citrato, 30 mM de fosfato de sódio, 0,1% de albumina sérica bovina e 0,67% de etanol, a um pH de 4,6. Os parâmetros cinéticos foram calculados utilizando valores de teor de proteína embasados em uma densidade óptica a 280 nm.

[0517] Conforme mostra a Figura 44, a prh-α-GAL-II reticulada dos diferentes lotes exibiu perfis semelhantes de velocidade catalítica vs. concentração de substrato.

[0518] Conforme mostra a Tabela 10 abaixo, a prh-α-GAL-II reticulada dos diferentes lotes exibiu boa reprodutibilidade dos parâmetros Vmax e kcat. O parâmetro Km variou mais entre os lotes, embora isso possa ser um artefato de quantificação da proteína.

[0519] Os resultados acima indicam boa reprodutibilidade nas propriedades enzimáticas de α-GAL reticulada.
Tabela 10: Parâmetros de Michaelis-Menten de α-GAL-II recombinante humana vegetal reticulada com bis-NHS-PEG4s em diferentes lotes

[0520] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com configurações especificas dela, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles com habilidade na técnica. Consequentemente, pretende-se adotar todas essas alternativas, modificações e variações que estejam dentro do espirito e do amplo escopo das reivindicações anexas.

[0521] Todas as publicações, patentes e solicitações de patentes mencionadas nesta especificação são neste documento incorporadas em sua totalidade por referência na especificação, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou solicitação de patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada neste documento por referência. Além disso, a citação ou a identificação de qualquer referência nesta solicitação não deve ser considerada como sendo uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Na extensão em que os cabeçalhos de seção são utilizados, eles não devem ser considerados como necessariamente limitantes.

Claims

"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", compreendendo uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de doença de Fabry por administração parenteral, a composição compreendendo: uma estrutura de proteína multimérica tendo pelo menos dois monômeros de α-galactosidase sendo ligados de forma covalente um ao outro por uma metade de ligação, caracterizada por a mencionada metade de ligação não estar presente na α-galactosidase nativa; e um carreador farmaceuticamente aceitável.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com a reivindicação 1, sendo a composição caracterizada por o mencionado carreador farmaceuticamente aceitável ser uma solução aquosa compreendendo soro fisiológico e um tampão fisiologicamente compatível, e a mencionada estrutura de proteína multimérica ser solúvel em água.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, sendo a composição caracterizada por a mencionada administração parenteral ser infusão intravenosa.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo a composição caracterizada por uma concentração da mencionada estrutura de proteína multimérica ser de 2 mg/ml.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações la4, sendo a composição caracterizada pelo fato de que a mencionada estrutura de proteína multimérica apresenta uma característica selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma atividade de α-galactosidase, ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições de plasma humano por uma hora, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade de α-galactosidase nativa ao submeter a mencionada α-galactosidase nativa a condições de plasma humano por uma hora; (b) uma atividade de α-galactosidase que diminui ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições de plasma humano por uma hora por uma porcentagem que é pelo menos 10 % menor do que a porcentagem pela qual uma atividade da mencionada α-galactosidase nativa diminui ao submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições de plasma humano por uma hora; (c) uma atividade de α-galactosidase que permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições de plasma humano por uma hora; (d) uma atividade de α-galactosidase, ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por uma semana, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade de a- galactosidase nativa ao submeter a mencionada a- galactosidase nativa às mencionadas condições lisossomais por uma semana; (e) uma atividade de α-galactosidase que diminui ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por um dia por uma porcentagem que é pelo menos 10 % menor do que a porcentagem pela qual uma atividade da mencionada α-galactosidase nativa diminui ao submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições lisossomais por um dia; (f) uma atividade de a-galactosidase que permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por um dia; (g) uma atividade de a-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições lisossomais; (h) uma atividade de α- galactosidase , imediatamente após submeter a estrutura de proteína multimérica a uma solução aquosa com um pH de 7 e uma temperatura de 37 °C, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade da α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a mencionada α-galactosidase nativa à mencionada solução aquosa com um pH de 7 e uma temperatura de 37 °C; e (i) uma meia-vida de circulação em um sistema fisiológico que é maior do que a meia-vida de circulação da mencionada α- galactosidase nativa.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com a reivindicação 5, sendo a composição caracterizada por a mencionada atividade de α-galactosidase da mencionada estrutura de proteína multimérica permanecer substancialmente inalterada ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por um dia, permanecer ainda substancialmente inalterada ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por uma semana.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo a composição caracterizada por a mencionada estrutura de proteína multimérica compreender dois monômeros de α-galactosidase, a estrutura de proteína sendo uma estrutura de proteína dimérica.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo a composição caracterizada por a mencionada α-galactosidase ser uma α-galactosidase gerada por tecnologia recombinante.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sendo a composição caracterizada por a mencionada α-galactosidase possuir uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2 e SEQ ID N.°: 3.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por a mencionada metade de ligação ter pelo menos 20 átomos de comprimento.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, sendo a composição caracterizada por a mencionada metade de ligação compreender um poli(alquileno glicol).
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, sendo a composição caracterizada por a mencionada metade de ligação possuir uma fórmula geral:
-X1-(CR1R2-CR3R4-Y)n-X2-
onde cada um dentre X1 e X2 é um grupo funcional que forma uma ligação covalente com pelo menos um monômero de a-galactosidase; Y é O, S ou NR5; n é um número inteiro de 1 a 200; e cada um dentre R1, R2, R3, R4 e R5 é selecionado de forma independente a partir do grupo consistindo de hidrogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, alquinil, alcóxi, hidróxi, oxo, tiol e tioalcóxi.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com a reivindicação 12, sendo a composição caracterizada por n ser pelo menos 25.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com a reivindicação 12, sendo a composição caracterizada por a mencionada estrutura de proteína multimérica compreender dois monômeros de α-galactosidase, a estrutura de proteína sendo uma estrutura de proteína dimérica, onde a mencionada α-galactosidase possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2 e SEQ ID N.°: 3, cada um dos mencionados grupos funcionais formando uma ligação de amida com um monômero de α-galactosidase, e n é um número inteiro de 40 a 70.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", de acordo com a reivindicação 9, sendo a composição caracterizada por a mencionada estrutura de proteína multimérica compreender dois monômeros de α-galactosidase, a estrutura de proteína sendo uma estrutura de proteína dimérica, onde a mencionada metade de ligação possui a fórmula:
onde o peso molecular do Polietileno glicol na mencionada metade de ligação é de 2 kDa, e os grupos terminais da mencionada metade de ligação formam, cada um, uma ligação de amida com um monômero de α-galactosidase.
"ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA DE PROTEÍNA MULTIMÉRICA", compreendendo uma composição farmacêutica para utilização no tratamento da doença de Fabry por administração parenteral, a composição compreendendo: uma estrutura de proteína multimérica tendo pelo menos dois monômeros de α-galactosidase sendo ligados de forma covalente um ao outro por meio de uma metade de ligação; e um carreador farmaceuticamente aceitável, caracterizada por a mencionada estrutura de proteína multimérica apresentar uma característica selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma atividade de a-galactosidase, ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições de plasma humano por uma hora, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade de a-galactosidase nativa ao submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições de plasma humano por uma hora; (b) uma atividade de α-galactosidase que diminui ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições de plasma humano por uma hora por uma porcentagem que é pelo menos 10% menor do que a porcentagem pela qual uma atividade da mencionada α-galactosidase nativa diminui ao submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições de plasma humano por uma hora; (c) uma atividade de α-galactosidase que permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições de plasma humano por uma hora; (d) uma atividade de α-galactosidase, ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por uma semana, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade de a-galactosidase nativa ao submeter a mencionada a-galactosidase nativa às mencionadas condições lisossomais por uma semana; (e) uma atividade de α-galactosidase que diminui ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por um dia por uma porcentagem que é pelo menos 10 % menor do que a porcentagem pela qual uma atividade da mencionada α-galactosidase nativa diminui ao submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições lisossomais por um dia; (f) uma atividade de α-galactosidase que permanece substancialmente inalterada ao submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais por um dia; (g) uma atividade de α-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura de proteína multimérica a condições lisossomais, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade de α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a mencionada α-galactosidase nativa às mencionadas condições lisossomais; (h) uma atividade de α-galactosidase, imediatamente após submeter a estrutura de proteína multimérica a uma solução aquosa com um pH de 7 e uma temperatura de 37°C, que é pelo menos 10 % maior do que uma atividade de α-galactosidase nativa imediatamente após submeter a mencionada α-galactosidase nativa à mencionada solução aquosa com um pH de 7 e uma temperatura de 37 °C; e (i) uma meia-vida de circulação em um sistema fisiológico que é maior em pelo menos 20 % do que a meia-vida de circulação da mencionada α-galactosidase nativa.