KR20110089193A - 식물 배양에서 고-만노스 단백질의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ER 시그널로 단백질을 표적시키고/표적시키거나 골지를 바이패싱하면서, 식물 배양에서 글리코실화 단백질, 특히 고-만노스 글리코실화물 생산하는 장치, 시스템 또는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자도입 식물 뿌리, 특히 당근 세포를 사용하여 효소적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소를 생산 및 발현하는 벡터 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 생물학적으로 활성인 고-만노스 글루코세레브로시다제(GCD)를 고수율로 발현 및 생산하는 숙주세포, 특히 유전자도입 현탁 당근 세포, 벡터 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리소좀 저장 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

식물 배양에서 고-만노스 단백질의 생산{Production of high mannose proteins in plant culture}
본 발명은 특히 식물 배양액에서 고-만노스(high mannose) 단백질 생산을 위한 숙주세포, 이들 단백질을 생산하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
고셔병(Gaucher's disease)은 가장 널리 퍼진 리소좀 저장 장애(lysosomal storage disorder)이다. 이 고셔병은, 글루코스와 세라미드로의 글리코스핑고지질 글루코세레브로시드(글루코실세라미드, GlcCer) 가수분해를 촉매하는 막결합 리소좀 효소로서 글루코실세라미다제(glucosylceramidase)로도 알려진 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase) 결핍증의 원인이 되는 열성 유전자 장애(염색체 1 q21-q31)에 의해 야기된다. 고셔병은 대식세포의 리소좀에 GlcCer을 축적시키는 hGCD(인간 글루코세레브로시다제) 유전자(GBA)의 점돌연변이에 의해 야기된다. 고셔 세포라 불리는 특성 저장 세포(characteristic storage cell)는 간, 지라 및 골수에서 발견된다. 관련 임상적 증상으로는 몇몇 간비종대(hepatosplenomegaly), 빈혈(anemia), 저혈소판증(thrombocytopenia) 및 골격 퇴화(skeletal deteriora-tion)가 포함된다.
인간 GCD를 코딩하는 유전자의 서열은 1985년에 최초로 결정되었다(6). 단백질은 536-mer 프로-펩티드로부터 유도된 497개의 아미노산으로 구성된다. 성숙 hGCD는 5개의 N-글리코실화 아미노산 공통서열(consensus sequence) (Asn-X-Ser/Thr)을 가진다. 이들 부위중 4개는 정상적으로 글리코실화된다. 제 1 부위의 글리코실화는 활성 단백질 생산에 있어서 필수적이다. 고-만노스 및 복합 올리고당 사슬 모두가 동정되었다(7). 태반으로부터의 hGCD는 7%의 탄수화물을 포함하며, 그중 20%는 고-만노스 형태이다(8). 생화학적 및 부위-특이적 돌연변이 연구는 폴딩(folding), 활성화제 상호작용(activator interaction) 및 활성 부위 지정(active site location)에 중요한 영역 및 잔기의 초기 맵(initial map)을 제공하였다(9).
뉴라미다제(아시아로 효소(asialo enzyme) 수득)로 태반 hGCD를 처리하면, 간의 효소 활성이 동시에 증가하면서 래트의 간 세포에 의한 흡수율 및 청소율(clearance)이 증가한다(Furbish et al., 1981, Biochim. Biophys. Acta 673: 425-434). 이러한 글리칸-변형 태반 hGC는 현재 고셔병의 치료에서 치료제로서 사용되고 있다. 생화학적 및 부위-특이적 돌연변이 연구는 폴딩(folding), 활성화제 상호작용(activator interaction) 및 활성 부위 지정(active site location)에 중요한 영역 및 잔기의 초기 맵(initial map)을 제공하였다[Grace etal., J. Biol. Chem. 269: 2283-2291 (1994)].
고셔병은 각각 hGC 활성도의 수준(level)에 의해 결정되는 세 가지 형태로 존재한다. 이 질병에 의해 영향받는 주된 세포는, GlcCer 축적으로 인해 크게 확장되는 대식세포로서, "고셔 세포"라고도 한다.
GCD 결핍이 고셔병의 일차적인 원인으로서 확인됨에 따라, 이들 장애에 대한 치료방법으로 효소 대체 치료법이 개발되었다.
드 두베(De Duve)는 결손 리소좀 효소를 생물학적으로 활성인 외인성 효소로 대체하는 방법이 리소좀 저장 질환의 치료에 실시가능한 접근법일 수 있음을 제안하였다[Fed Proc. 23: 1045 (1964)].
그 이후, 효소 대체 요법이 각종 리소좀 저장 질환을 치료하는데 유리할 수 있음이 여러 연구에 의해 제안되었다. 태반으로부터 제조되었거나(CeredaseTM) 보다 최근에는 재조합적으로 제조된(CerezymeTM) 외인성 효소(B-글루코세레브로시다제)로 치료했던 I형 고셔병을 가진 개체들에게서 가장 성공적인 결과가 나타났다.
자연원으로부터 유도된 비변형 글루코세레브로시다제는 4 개의 탄수화물 사슬을 가진 당단백질이다. 이 단백질은 체내 포식 세포를 표적으로 하지 않으므로, 따라서 치료적 가치가 제한된다. 현존하는 고셔병 치료법을 개발함에 있어서, 글루코세레브로시다제의 탄수화물 사슬에서 말단 당은 3 개의 상이한 글리코시다제로 처리하여 순차적으로 제거된다. 이 글리코시다제 치료법은 말단 당이 만노스 잔기로 구성된 당단백질을 생산한다. 포식 세포는, 만노스 잔기로 종결하는 올리고당 사슬을 가진 글리코펩티드 및 당단백질을 인지하는 만노스 수용체를 가지기 때문에, 글리코세레브로시다제의 탄수화물 리모델링(remodeling)을 통해 이들 세포에의 효소 표적화를 개선시켰다[Furbish et al., Biochem. Biophys. Acta 673: 425,(1981)].
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 글리코실화는 hGCD 활성에 있어서 결정적인 역할을 하며, 따라서 모든 글리코실화 부위(Sf9 및 COS-1 세포 모두)를 파기하는(abolishing) 점돌연변이 또는 튜니카마이신(tunicamycin, Sf9 세포)를 사용하여 세포주에 발현된 hGCD를 탈글리코실화(deglycosylation)하면 효소 활성을 완전히 잃게 된다. 또한, E. Coli에 발현된 hGCD는 비활성적인 것으로 밝혀졌다. 다른 추가의 연구에서 단백질 활성에 대한 여러 글리코실화 부위의 중요성을 나타내었다. 시판되는 효소는, 실제(actual) 단백질 활성에서 글리코실화의 역할 이외에, 특정 약물의 전달을 촉진하는 글리칸 서열 변형(modification)을 함유한다. 이 글리코실화 단백질은 글리칸 서열을 가진 만노스만을 포함하도록 추출후 리모델링된다.
인간 GCD 효소는 4 개의 글리코실화 부위 및 22개의 리신을 가진다. 이 재조합적으로 생성된 효소(CerezymeTM)는 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 495번 위치에서 태반 효소와는 다르다. 또한, 재조합체는 하나의 고-만노스 사슬을 보유하는 반면, 태반 GCD는 더 많은 퓨코스 및 N-아세틸-글루코사민 잔기를 가지기 때문에, 재조합체 GC와 태반 GCD의 올리고당 조성은 서로 다르다. 상기 언급한 바와 같이, GCD 형태 모두는 대식세포를 표적화시킬 수 있는 말단 만노스를 노출시키기 위해 3개의 상이한 글리코시다제(뉴라미니다제, 갈락토시다제 및 P-N 아세틸-글루코사미니다제)로 처리된다. 재조합적으로 생성된 효소를 포함하는 약제학적 제제가 미국 특허 제5,549,892호에 기술되어 있다. 본원에 충분히 설명된 바와 같이 언급된 모든 참고문헌은 참고로서 본원에 포함되는 것임을 유념해야 한다.
현존하는 리포솜 효소 대체 요법 치료와 연관된 하나의 결점은 예를 들어 흡수율 저하, 기질이 축적되는 특정 세포의 리소좀에의 표적화 감소 및 리소좀의 기능적 생체내 반감기 단축으로 인해 효소의 생체내 생물활성이 바람직하지 않게 낮다는 것이다.
현존하는 GCD 재조합 효소의 또 다른 주요 결점은 비용이 많이 들어, 보건 의료 시스템에 경제적으로 무거운 부담을 지울 수 있다. 이들 재조합 효소의 고비용은 현존하는 치료법에 비교적 많은 양의 치료제가 필요하고 정제 프로토콜이 복잡하기 때문에 발생하는 것이다. 따라서, 구명(life saving) 요법이 이를 요하는 모든 사람에게 더 많이 제공될 수 있도록 GCD 비용을 낮추는 것이 지급히 필요하다.
약제학적 용도의 단백질은 전통적으로 포유동물 또는 박테리아 발현계에서 생성된다. 지난 10년간 새로운 발현계가 식물에서 개발되었다. 이 방법은 식물 게놈내로 단일가닥(single stranded) DNA 분자(T-DNA)를 삽입할 수 있는 박테리아인 아그로박테륨(Agrobacterium)을 사용한다. 펩티드 및 단백질의 대량 생산을 위한 유전자 도입이 비교적 간단하기 때문에, 이 방법은 대안적인 단백질 발현계로서 점점 대중화되고 있다(1).
번역후수식(post translational modification)은 박테리아 발현계에 존재하지 않았지만, 식물 유래 발현계는 단백질 발현 및 활성에 결정적인 것으로 알려진 이들 변형을 촉진한다. 포유동물과 식물 단백질 발현계 사이의 주요 차이점의 하나는 생합성 경로(biosynthetic pathway)의 차이에 의해 야기된 단백질 당 측쇄의 변이(variation)이다. 글리코실화는 활성, 폴딩, 안정성, 용해도, 프로테아제에 대한 감수성, 혈액 청소율(blood clearance rate) 및 단백질의 항원 전위에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 식물에서의 특정 단백질의 생성은 식물 글리코실화의 잠재적 가지형성(potential ramification)을 고려해야 한다.
단백질 글리코실화는 두 개의 카테고리, 즉 N-결합 및 O-결합 변형으로 나누어진다(2). 이 두 형태는 글리칸 부위가 부착되는 아미노산이 다르다; 즉 O-결합은 Ser 또는 Thr 잔기에 부착되는 반면, N-결합은 Asn 잔기에 부착된다. 또한, 각각의 형태의 글리칸 서열은 특유의 뚜렷한 특징을 가진다. 두 가지 형태 중 N-결합 글리코실화가 더 풍부하여 단백질 기능에 대한 영향이 넓게 연구되고 있다. 한편, O-결합 글리칸은 상대적으로 부족하여 단백질에 대한 그의 영향에 관한 정보를 입수할 수 없다.
발명의 요약
배경기술에는 식물 배양액에서 글리코실화 단백질을 선택적으로 생산하는 장치, 시스템 또는 방법에 대해 전혀 교시되거나 제시되어 있지 않다. 배경기술에는 또한 식물 배양액에서 고-만노스 단백질을 생성하는 장치, 시스템 또는 방법도 교시되거나 제시되어 있지 않다. 배경기술에는 소포체(ER)를 통해 식물 배양액에서 단백질을 생성하는 장치, 시스템 또는 방법 역시 교시되거나 제시되어 있지 않다. 또한, 골지체를 바이패스(by-pass)하면서 소포체(ER)을 통해 식물 배양액에서 단백질을 생성하는 장치, 시스템 또는 방법도 배경기술에는 교시되거나 제시되어 있지 않다. ER 시그널을 사용하여 골지체를 바이패스하도록 함으로써 식물 배양액에서 단백질을 생성하는 장치, 시스템 또는 방법 역시 배경기술에 교시되거나 제시되어 있지 않다.
본 발명은 임의로 그리고 바람직하게는 ER 시그널을 가지고 이러한 단백질을 표적하면서(및/또는 조작 처리하면서) 식물 배양액에서 글리코실화 단백질, 특히 고-만노스 글리코실화 단백질을 생성하는 장치, 시스템 및 방법을 제공함으로써 이들 배경기술의 단점을 해소한다. 단일 가설에 의해 제한되는 것은 아니지만, 이러한 표적화는 단백질로 하여금 골지체를 바이패스하여 목적하는 글리코실화, 특히 고-만노스 글리코실화를 보유하게 하는 것으로 여겨진다. 본 명세서에 사용된 용어 "식물 배양액(plant culture)"은 배양액에서 성장시킨 임의의 형태의 유전자도입 및/또는 다른 유전자조작된 식물 세포를 포함한다. 유전자조작은 임의로 영구적 또는 일시적일 수 있다. 바람직하게도, 배양액은, 적어도 하나의 식물의 생물학적 구조가 존재하지 않는 것과 같이 완전 식물을 형성하도록 조합되지 않는 세포를 특징으로 한다. 임의로 그리고 바람직하게도, 배양액은 다수의 상이한 형태의 식물 세포를 특징으로 할 수 있으나, 바람직하게도 배양액은 특정 형태의 식물 세포를 특징으로 한다. 특정 형태의 식물 세포를 특징으로 하는 임의의 식물 배양액은 원래 다수의 상이한 형태의 이러한 식물 세포로부터 최초로 유도될 수 있다.
식물 세포는 고체 표면(예컨대 플라스틱 배양 용기(vessel) 또는 플레이트) 또는 현탁액에서의 배양을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 형태의 적합한 배양 방법에 따라 성장시킬 수 있다.
본 발명은 또한 유전자도입 식물, 특히 당근 세포를 사용하여 효소적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소를 발현 및 생성하기 위한 벡터(vector) 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 생물학적으로 활성인 고-만노스 글루코세레브로시다제(GCD)를 고수율로 발현 및 생성하기 위한 숙주세포, 특히 현탁된 유전자도입 당근 세포, 벡터 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리소좀 저장 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 불완전(deficient) 세포에 생물학적으로 활성인 충분한 양의 리소좀 효소, 특히 인간 GCD를 제공하는 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GCD와 같은 리소좀 효소를 코딩하는 유전자를 효율적으로 생성케하는 신규한 벡터 조성물을 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 GCD와 같은 리소좀 효소의 고-만노스 글리코실화와 같이, 특정의 글리코실화 요건을 가진 단백질을 생성하기 위한 경제적으로 실시가능한 기술에 대한 오랜동안의 절실했던 요구를 해소한다. 본 발명은 식물 세포 배양액을 사용함으로써 오랫동안 갈망했던 요구를 해소할 수 있다.
본 발명을 추가로 설명하기 위해, 지금부터 고-만노스 단백질의 생합성 경로에 대해 간단히 설명한다. 고-만노스 및 복합 N-결합 글리칸의 기본적인 생합성 경로는 모든 진핵세포중에 보존된다. 생합성은 소포체(ER)에서 올리고당 전이효소(oligosaccharyl transferase)에 의해 돌리콜 지질 담체로부터 단백질상의 특정 Asn 잔기로 글리칸 전구체를 전이시킴으로써 개시한다. 전구체는 이어 소포체(ER)에서 글리코시다제 I과 II 및 가상 만노시다제(hypothetical mannosidase)에 의해 변형되어 포유류에서 일어나는 프로세스와 유사한 고-만노스 구조를 생성한다.
복합 및 하이브리드 구조로의 글리칸 서열의 추가의 변형은 골지에서 일어난다. 이러한 변형은 α-만노시다제 I에 의한 4개의 만노스 잔기의 제거, N-아세틸글루코사민 잔기의 추가, α-만노시다제 II에 의한 2개의 만노스 잔기의 제거, N-아세틸글루코사민 잔기의 추가를 포함하며, 임의로 이 단계에서 식물 특이 N-결합 글리칸을 수득하기 위해 크실로스 및 퓨코스 잔기가 첨가될 수 있다. 코어로의 크실로스 및 글루코스의 전이후, 복합형 N-글리칸은 말단 퓨코스 및 갈락토스의 첨가를 통해 추가로 처리될 수 있다. 추가의 변형은 당단백질 수송동안 일어날 수 있다.
몇몇 접근법은 현재 배경기술에서 식물에서의 단백질 글리코실화를 제어 및 조정(tailor)하기 위해 사용되고 있으나, 모두 특히 본 발명에 비해 상당한 결점이 있다. 펩티트 사슬로부터 글리코실화 부위의 제거 또는 글리코실화 완전 억제와 같은 엄청난 변형이 하나의 방법론이다. 그러나, 이 접근법은 구조적 결함을 일으킬 수 있다. 추가의 접근법은 특정 탄수화물 처리 효소의 넉아웃(knock-out) 및 도입을 포함한다. 역시, 이 접근법도 어렵고 식물 세포 자체에 결정적인 악영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 ER 시그널을 사용하고/사용하거나 ER에서 골지체로의 분비를 차단함으로써, 배경기술의 접근법이 가진 상기한 결점을 해소한다. 단일 가설에 의해 제한되는 것은 아니지만, 고-만노스 구조의 리소좀 효소가 바람직하기 때문에, 분비가 차단될 수 있거나 단백질이 ER에서 유지될 수 있다면, 자연발생 고-만노스 구조는 리모델링할 필요없이 수득된다.
상기한 바와 같이, 내막계(endomembrane system)를 통해 수송된 단백질은 먼저 소포체에 들어간다. 이 단계를 위해 필요한 수송 시그널은 소위 시그널 펩티드라 불리는 분자의 N-말단 종단에 있는 시그널 서열에 의해 표시된다. 시그널 펩티드는, 이 시그널 펩티드에 부착된 전구체 단백질을 소포체에 삽입하는 것인 그의 기능을 달성하면, 전구체 단백질로부터 단백질가수분해적으로 분리된다. 그의 특이적 기능에 의해, 이러한 형태의 시그널 펩티드 서열은 박테리아, 효모, 진균, 동물 또는 식물이든 상관없이 모든 생세포(living cell)에 진화하는 동안 고도로 보유된다.
시그널 펩티드에 의해 소포체내로 삽입된 다수의 식물 단백질은 ER에 머무르지 않고, 소포체에서 골지로 수송되고, 골지로부터 액포(vacuole)로 계속 운송된다. 이러한 운송 리사이드(traffic reside)에 대한 선별 시그널의 한 부류가 전구체 단백질의 C-말단부에 거주하는 시그널이다[Neuhaus and Rogers, (1998) Plant Mol. Biol. 38: 127-144]. 소포체내로의 삽입을 위한 N-말단 시그널 펩티드 및 C-말단 액포 표적화 시그널 모두를 포함하는 단백질은 복합 글리칸을 포함할 것으로 기대되며, 여기서 복합 글리칸은 골지에 있는 단백질에 부착된다[Lerouge et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38: 31-48]. C-말단 선별 시그널의 성질은 매우 폭넓게 변할 수 있다. 미국 특허 제 6,054,637호에는 액포 표적화 단백질로서 작용하는 액포 단백질인 토바코 기본 키티나아제(Tobacco basic chitinase)의 영역으로부터 수득된 펩티드 단편이 기술되어 있다. C-말단 표적화 시그널 및 복합 글리칸을 포함하는 액포 단백질의 예로는 콩 종자(bean seed)로부터의 파세올린(Phaseolin) 저장 단백질이 있다[Frigerio et al., (1998) Plant Cell 10: 1031-1042; Frigerio et al., (2001) Plant Cell 13: 1109-1126].
모든 진핵세포에서 액포 단백질은 최종 목적지로서 액포에 격리하기 전에 ER 및 골지를 통과하는 것이 패러다임이다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 형질전환된 식물의 뿌리 세포는 의외로 고-만노스 GCD를 생성하였다. 유리하게도, 이 고-만노스 생성물은 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌고, 따라서 활성화를 위한 추가의 단계를 필요로 하지 않는다. 단일 가설에 의해 제한되는 것은 아니지만, 식물 세포 배양액에서 생성되는 재조합 단백질과 함께 ER 시그널을 사용하면 골지로의 수송을 해소할 수 있고, 따라서 목적하는 고-만노스 글리코실화를 보유할 수 있었을 것으로 판단되었다. 임의로, 골지를 바이패스하는 특정 형태의 메카니즘을 포함하여 고-만노스 글리코실화를 생성할 수 있는 특정 형태의 메카니즘이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
하나의 일면으로, 본 발명은 관심의 대상이 되는 고-만노스 재조합 단백질을 생성하는 숙주세포에 관한 것이다. 이 세포는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 또는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염될(transfected) 수 있다. 이러한 핵산 분자는 액포 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열에 실시가능하게 연결된 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함한다. 제 1 핵산 서열은 임의로 ER(소포체) 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 3 핵산 서열에 추가로 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 숙주세포는 관심의 대상이 되는 단백질이 이 세포에 의해 고-만노실화된 형태로 형성된다는 점에 특징이 있다.
본 발명의 숙주세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다.
하나의 일례로, 본 발명의 숙주세포는 원핵 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 가장 바람직하게는 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포이다. 이들 세포는 이후 기술된 바람직한 식물 숙주세포를 감염시키는데 사용된다.
다른 바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포는 진핵세포, 바람직하게는 식물 세포, 가장 바람직하게는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹중에서 선택된 식물 뿌리 세포일 수 있다.
바람직한 일례로, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다. 본 발명의 형질전환 당근 세포는 현탁액중에서 성장시키는 것에 유념해야 한다. 상기 언급되거나 실시예에 기술된 바와 같이, 이들 세포는 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포에 의해 형질전환되었다.
또 다른 일례로, 본 발명의 숙주세포내 포함된 재조합 핵산 분자는 기본 토바코 키티나아제 A 유전자로부터 유도된 액포 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 결합하는 리소좀 효소를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함한다. 이 액포 시그널 펩티드는 서열번호: 2에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가진다. 제 1 핵산 서열은 서열번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 ER(소포체) 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 3 핵산 서열과 작동가능한 결합으로 추가로 연결될 수 있다. 하나의 일례로, 본 발명의 숙주세포내 포함된 재조합 핵산 분자는 식물 세포에서 작용하는 프로모터(promoter)를 추가로 포함한다. 이 프로모터는 본 발명의 재조합 분자에 작동가능하게 연결되어야 한다.
또 다른 일례로, 이 재조합 핵산 분자는 식물 세포에서 바람직하게 작용하는 작동가능하게 결합된 터미네이터(terminator)를 임의적으로 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 핵산은 억제, 촉진 및 조절 요소 및/또는 선택가능한 마커(maker)를 임의적으로 추가로 포함할 수 있다. 이들 조절 요소는 재조합 분자에 작동가능하게 연결될 수 있음을 유념해야 한다.
바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포에 의해 생성된 관심의 대상이 되는 고-만노스 단백질은 노출(exposed) 만노스 말단 잔기를 가진 고-만노스 당단백질일 수 있다.
다른 바람직한 일례에 따라, 이러한 고-만노스 단백질은 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제(sphingomyelinase), 헥소사미니다제(hexosa-minidase), α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 리소좀 효소일 수 있다. 바람직한 일례로, 리소좀 효소는 인간 글루코세레브로시다제(GCD)일 수 있다. 이후의 재조합 GCD, rGCD, rhGCD는 모두 달리 지적하지 않으면, 각종 형태의 재조합 인간 GCD를 의미한다.
이전에 기술한 바와 같이, 가장 널리 퍼진 리소좀 저장 장애인 고셔병은 대식세포의 리소좀에 GlcCer을 축적시키는 hGCD(인간 글루코세레브로시다제) 유전자(GBA)의 점돌연변이에 의해 야기된다. GCD 결핍이 고셔병의 일차 원인으로서 확인됨에 따라 이들 장애에 대한 치료방으로 효소 대체 치료법이 개발되었다. 그러나, 글리코실화는 표적세포에 대한 흡수 및 hGCD 활성에 결정적인 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 다른 바람직한 일례에 따라, 적절히 글리코실화된 hGCD는 바람직하게는 식물 세포 배양액에서 hGCD의 발현을 조절하는 것에 의해, 임의로 그리고 더욱 바람직하게는 ER 시그널을 제공하는 것에 의해, 및/또는 다르게는 임의로 그리고 더욱 바람직하게는 골지로의 수송을 차단함으로써 제공된다.
임의로 및 바람직하게도, hGCD는 고셔병의 치료 또는 예방을 위해 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진다.
또한, 특정의 일례로, 바람직한 숙주세포는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)로부터의 35S 프로모터, 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 합성효소(octopine synthase) 터미네이터 및 TMV (토바코 모자이크 바이러스, Tobacco Mosaic Virus) 오메가 번역 인핸서(enhancer) 요소를 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자에 의해 형질전환되거나 형질감염된다. 바람직한 일례에 따라, 이 재조합 핵산 분자는 실질적으로 서열번호: 13에 의해 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하며, 실질적으로 서열번호: 14에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가진 고-만노스 GCD를 코딩한다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 리소좀 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공하는 것이 이해되어야 한다.
하나의 바람직한 일례로, 본 발명의 발현 벡터는 생물학적으로 활성인 고-만노스 인간 글루코세레브로시다제(GCD)를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게도, 바람직한 발현 벡터는 서열번호: 13에 의해 나타낸 바와 같이 실질적인 핵산 서열을 가진 핵산 재조합 핵산 분자를 포함한다.
두 번째 일면으로, 본 발명은 본 발명의 숙주세포에 의해 생성된 재조합 고-만노스 단백질에 관한 것이다.
바람직한 일례로, 고-만노스 단백질은 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소일 수 있다. 가장 바람직하게도, 리소좀 효소는 인간 글루코세레브로시다제(GCD)일 수 있다.
추가로, 본 발명은 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진 생물학적으로 활성인 재조합 고-만노스 리소좀 효소를 제공한다.
바람직한 일례에 따라, 본 발명의 재조합 리소좀 효소는 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체와 결합할 수 있다. 바람직하게도, 표적 부위는 리소좀 저장 질환으로 고통받는 대상(subject)내에 존재할 수 있다.
재조합 리소좀 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가지는 것을 유념해야 한다. 특정 일례로, 표적 부위의 표적 세포는 대상의 간의 쿠퍼세포(Kupffer cell)일 수 있다.
바람직한 일례로, 재조합 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택될 수 있다.
가장 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
세 번째 일면으로, 본 발명은 고-만노스 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 (a) 관심의 대상이 되는 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염된 재조합 숙주세포의 배양액을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)에 의해 제조된 숙주세포 배양액을 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하여, 숙주세포가 고-만노실화된 형태의 단백질을 생산하게 하는 단계; (c) 상기 세포로부터 단백질을 회수하고 단계 (a)에서 제공된 배양액으로부터 세포를 채취하는 단계; (d) 적합한 단백질 정제법에 의해 단계 (c)의 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
바람직한 일례에 따라, 이 방법에 의해 사용된 숙주세포는 본 발명의 숙주세포이다.
다른 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 생성된 고-만노스 단백질은 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소일 수 있다.
이 재조합 효소는 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체에 결합할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다. 따라서, 표적 부위에서 표적 세포는 대상의 간에서 쿠퍼세포(Kupffer cell)일 수 있다.
특정일례로, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게도, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)일 수 있다.
또다른 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 숙주세포는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹중에서 선택된 식물 뿌리 세포일 수 있다. 가장 바람직하게도, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다. 본 발명의 방법에서 형질전환 숙주 당근 세포는 현탁액중에서 성장되는 것에 특히 유념해야 한다.
추가의 일면으로, 본 발명은 (a) 형질전환 식물 뿌리 세포로부터 정제된 생물학적으로 활성인 재조합 형태의 리소좀 효소를 제공하는 것을 포함하고, 리소좀 효소에 비정상적 결함이 있는 세포를 효율적으로 표적시킬 수 있는 외인성 재조합 리소좀 효소를 사용하여 리소좀 저장 질환을 가진 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 생물학적으로 활성인 재조합 효소는 추가(appended) 올리고당상에 노출 말단 만노스 잔기를 가지며; (b) 대상에게 치료학적 유효량의 생물학적으로 활성인 재조합 리소좀 효소를 투여한다. 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 재조합 고-만노스 리소좀 효소는 본 발명의 숙주세포에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게도, 숙주세포는 당근 세포이다.
다른 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 리소좀 효소는 노출 만노스 잔기를 가진 적어도 하나의 올리고당 사슬을 포함하는 고-만노스 효소일 수 있다. 이 재조합 효소는 대상내의 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체와 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다.
더욱 특히, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택될 수 있다. 바람직하게도, 이 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
따라서, 바람직한 일례에 따라, 본 발명의 방법은 리소좀 저장 질환, 특히 고셔병의 치료를 위해 의도된 것이다.
이 경우, 표적 부위에서의 표적 세포는 대상의 간에서 쿠퍼 세포일 수 있다.
본 발명은 본 발명에 의해 정의된 생물학적으로 활성인 재조합 고-만노스 리소좀 효소를 활성성분으로서 포함하는 리소좀 저장 질환 치료용 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명의 조성물은 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 고셔병을 치료하기 위해 의도된 것이다. 이러한 조성물은 바람직하게는 본 발명에 의해 정의된 생물학적으로 활성인 고-만노스 인간 글루코세레브로시다제(GCD)를 활성성분으로서 포함할 수 있다.
본 발명은 리소좀 저장 질환 치료용 또는 예방용 의약을 제조하기 위한 본 발명의 생물학적 활성 재조합 고-만노스 리소좀 효소의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 이러한 질환은 고셔병일 수 있다.
따라서, 생물학적으로 활성인 리소좀 효소는 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 생물학적으로 활성인 고-만노스 인간 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
본 발명에 따라, 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 단백질이 고-만노스 단백질로 생성될 수 있도록 하는 시그널을 포함하여, 고-만노스 재조합 단백질을 생성하는 숙주세포가 제공된다. 바람직하게도, 폴리뉴클레오티드는 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 시그널 펩티드는 ER (소포체) 표적화 시그널 펩티드를 포함한다. 바람직하게도, 폴리뉴클레오티드는 액포 표적화 시그널 펩티드를 코딩하기 위한 제 3 핵산 서열을 추가로 포함한다.
바람직하게도, 시그널은 재조합 단백질이 ER에 대해 표적되도록 한다. 더욱 바람직하게도, 시그널은 재조합 단백질이 ER에 대해 표적되도록 하는 시그널 펩티드를 포함한다. 가장 바람직하게도, 폴리뉴클레오티드는 시그널 펩티드를 코딩하기 위한 핵산 세그먼트(segment)를 포함한다.
임의로 그리고 바람직하게도, 시그널은 재조합 단백질이 골지를 바이패스하도록 한다. 바람직하게도, 시그널은 재조합 단백질이 골지에 대해 표적되지 않도록 하는 시그널 펩티드를 포함한다. 더욱 바람직하게도, 폴리뉴클레오티드는 시그널 펩티드를 코딩하는 핵산 세그먼트를 포함한다.
임의로 및 바람직하게도, 숙주세포는 진핵 및 원핵 세포중 어느 하나일 수 있다. 임의로, 원핵 세포는 박테리아 세포, 바람직하게는 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포이다. 바람직하게도, 진핵 세포는 식물 세포이다. 더욱 바람직하게도, 식물 세포는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹중에서 선택된 식물 뿌리 세포이다. 가장 바람직하게도, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다.
바람직하게도, 재조합 폴리뉴클레오티드는, 기본 토바코 키티나제 A 유전자로부터 유도된 액포 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 결합된 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함하며, 여기서 액포 시그널 펩티드는 서열번호: 2에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지고, 제 1 핵산 서열은 임의로 서열번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 ER (소포체) 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 3 핵산 서열에 추가로 작동가능하게 연결된다.
더욱 바람직하게, 재조합 폴리뉴클레오티드는, 식물 세포에서 작용하며, 재조합 분자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 추가로 포함한다.
가장 바람직하게도, 재조합 폴리뉴클레오티드는 식물 세포에서 작용하며 재조합 분자에 작동가능하게 연결되는 터미네이터를 추가로 포함한다.
또한 가장 바람직하게도, 재조합 폴리뉴클레오티드는 임의로 추가적인 억제, 촉진 및 조절 요소 및/또는 선택가능 마커를 추가로 포함하며, 여기서 조절 요소는 재조합 분자에 작동가능하게 연결된다.
바람직한 일례로, 고-만노스 단백질은 적어도 하나의 노출 만노스 잔기로 글리코실화된 고-만노스 당단백질이다. 더욱 바람직하게도, 고-만노스 단백질은 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소이다.
가장 바람직하게도, 리소좀 효소는 인간 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
바람직하게도, GCD는 서열번호: 7에 의해 나타낸 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩된, 실질적으로 서열번호: 8에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게도, 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해, 또는 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염되며, 여기서 재조합 폴리뉴클레오티드는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)로부터의 35S 프로모터, 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 합성효소(octopine synthase) 터미네이터를 추가로 포함하며, 조절 요소는 TWV (토바코 모자이크 바이러스, Tobacco Mosaic Virus) 오메가 번역 인핸서 요소이고, 실질적으로 서열번호: 14에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가진 GCD를 코딩하는 실질적으로 서열번호 13에 의해 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 가진다.
바람직한 구체예에 따라, 상술한 숙주세포에 의해 생성된 재조합 고-만노스 단백질이 제공된다.
바람직하게도, 고-만노스 단백질은 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소이다.
더욱 바람직하게도, 리소좀 효소는 인간 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
본 발명의 다른 바람직한 일례에 따라, 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진 생물학적으로 활성인 재조합 고-만노스 리소좀 효소가 제공된다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 시그널 펩티드 활성을 가진 제 1 부분 및 리소좀 효소 활성을 가진 제 2 부분을 포함하는 재조합 단백질이 제공되며, 여기서 제 1 부분은 제 2 부분이 식물 세포에서 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬로 처리되도록 한다.
바람직하게도, 리소좀 효소는 고셔병 치료용 또는 예방용 단백질을 포함한다.
더욱 바람직하게도, 단백질은 hGCD를 포함한다.
바람직하게도, 제 1 부분은 식물 세포 ER 표적화 시그널 펩티드를 포함한다. 더욱 바람직하게도, 재조합 효소는 리소좀 저장 질환으로 고통받는 대상내의 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다.
또한 가장 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된다.
바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
또한 바람직하게도, 표적 부위의 표적 세포는 대상의 간에서 쿠퍼 세포이다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 식물 세포 배양액에서 생성된 재조합 고-만노스 단백질이 제공된다. 바람직하게, 이 단백질은 ER에 단백질을 표적시키기 위한 식물 시그널 펩티드를 특징으로 한다.
더욱 바람직하게도, 식물 시그널 펩티드는 뿌리 식물 세포 배양액에서 ER에 단백질을 표적시키기 위한 펩티드를 포함한다. 가장 바람직하게도, 뿌리 식물 세포 배양액은 당근 세포를 포함한다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 식물 세포 배양액에서 생성된 재조합 고-만노스 hGCD 단백질이 제공된다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 고-만노스 단백질을 생성하기 위한 식물 세포 배양액의 용도가 제공된다.
다른 바람직한 일례에 따라, 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 형질감염된 재조합 숙주세포의 배양액을 제조하고; 이 숙주세포 배양액을 단백질 발현을 허용하는 조건하에서 배양하여, 숙주세포가 단백질을 고-만노스화된 형태로 생성하도록 하는 것을 포함하여, 고-만노스 단백질을 생성하는 방법이 제공된다.
바람직하게도, 숙주세포 배양은 현탁액중에서 배양된다. 더욱 바람직하게도, 본 방법은 단백질 정제 단계를 추가로 포함한다.
다른 바람직한 일례에 따라, 본 방법은 이전에 기술된 바와 같은 숙주세포를 사용하여 수행된다. 바람직하게도, 고-만노스 단백질은 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소이다. 더욱 바람직하게도, 재조합 효소는 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체에 결합한다. 가장 바람직하게도, 재조합 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다.
바람직하게도, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된다.
더욱 바람직하게도, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다. 가장 바람직하게도, 표적 부위에서 표적 세포는 대상의 간에서 쿠퍼 세포이다.
바람직하게도, 숙주세포는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹중에서 선택된 식물 뿌리 세포이다.
더욱 바람직하게도, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다.
가장 바람직하게도, 형질전환 숙주 당근 세포는 현탁액중에서 성장된다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 형질전환 식물 뿌리 세포로부터 정제되며, 리소좀 효소에 비정상적 결함이 있는 세포를 효율적으로 표적시킬 수 있고, 추가의 올리고당상에 노출 말단 만노스 잔기를 가진, 생물학적으로 활성인 재조합 형태의 리소좀 효소를 제공하는 단계; 및 대상에게 치료학적 유효량의 생물학적으로 활성인 재조합 리소좀 효소를 투여하는 단계를 포함하여, 외인성 재조합 리소좀 효소를 사용하여 리소좀 저장 질환을 가진 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 이전에 설명한 바와 같은 임의의 숙주세포 및/또는 단백질을 사용하여 임의로 수행될 수 있다.
바람직하게도, 재조합 효소는 대상내의 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다. 가장 바람직하게도, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된다. 또한, 가장 바람직하게도 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
또한 가장 바람직하게도, 리소좀 저장 질환은 고셔병이다. 또한 가장 바람직하게도, 표적 부위에서 표적 세포는 대상의 간에서 쿠퍼 세포이다.
다른 바람직한 일례에 따라, 상술한 바와 같은 생물학적으로 활성인 재조합 고-만노스 리소좀 효소를 활성성분으로 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 리소좀 저장 질환 치료용 약학 조성물이 제공된다. 바람직하게도, 리소좀 저장 질환은 고셔병이다. 더욱 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 생물학적으로 활성인 고-만노스 인간 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 리소좀 저장 질환의 치료용 또는 예방용 의약을 제조하기 위한 상술한 바와 같은 생물학적으로 활성인 재조합 고-만노스 리소좀 효소의 용도를 제공한다. 바람직하게도, 질환은 고셔병이다. 더욱 바람직하게도, 생물학적으로 활성인 리소좀 효소는 생물학적으로 활성인 고-만노스 인간 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
본 발명은 다음의 도면에 의해 추가로 설명될 것이며, 이는 단지 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 첨부된 청구범위에 의해 또한 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 단지 예로서 본 명세서에 기술된다:
도 1a-1b,
도 1a는 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus)로부터의 35S 프로모터, TWV (토바코 모자이크 바이러스, Tobacco Mosaic Virus) 오메가 번역 인핸서(enhancer) 요소, ER 표적화 시그널, 인간 GCD 서열(또한 서열번호: 7로 나타냄) 액포 시그널 및 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 옥토파인 합성효소 터미네이터 서열을 포함하여 생성되는 발현 카세트(expression cassette)를 나타낸다.
도 1b는 pGreenII 플라스미드 백본의 모형 지도(schematic map)를 나타낸다.
도 2는 항 hGCD 특이 항체를 사용하는 hGCD 형질전환 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 나타낸다. 표준 Cerezyme (레인 1)은 양성 대조군으로서 사용되었고, 형질전환되지 않은 칼루스(callus)는 음성 대조군(레인 2)으로서 사용하였으며, 다양하게 선택된 칼루스 추출물은 레인 3-8에 도시하였다.
도 3a-3c는 XK 컬럼(2.6×20㎝)에 팩킹된(packed) 강한 양이온 교환 수지(Macro-Prep high-S support, 바이오-라드(Bio-Rad))상에서의 rhGCD의 제 1 정제 단계를 나타낸다. 이 컬럼은 전도도 모니터링, pH 및 280nm에서의 흡광도를 제공하는 AKTA 프라임 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))으로 구성되었다. rh-GCD의 용리는 600mM NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 수득하였다. 도 3a는 이 정제 단계의 표준 작업(run)을 나타낸다. 작업중 수집된 분획을 도 3b에 표시된 바와 같이 효소 활성 에세이에 의해 모니터링하였고, 효소 활성(용리 피크에서)을 표시하는 튜브를 풀링하였다(pooled). 도 3c는 활성도에 대해 에세이된 용리 분획의 쿠마시-블루(coomassie-blue) 염색을 나타낸다.
도 3d-3f는 도 3a-3c에 상응하는 그래프로서 제 2 컬럼에 대한 것이다.
도 4a-4c는 XK 컬럼(2.6×20㎝)에 팩킹된 소수성 인터랙션(interaction) 수지(TSK 겔, Toyopearl Phenyl-650C, 토소 코포레이션(Tosoh Corp.))상에서의 재조합 hGCD의 최종 정제 단계를 나타낸다. 이 컬럼은 전도도 모니터링, pH 및 280nm에서의 흡광도를 제공하는 AKTA 프라임 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))으로 구성하였다. 이전 컬럼으로부터의 GCD 용리 풀(pool)을 6 ㎖/분으로 부하한 다음 UV 흡광도가 기저선(baseline)에 도달할 때까지 평형 버퍼로 세척하였다. 순수한 GCD를 50% 에탄올 함유 10 mM 시트르산 버퍼로 용리시켰다.
도 4a는 이러한 정제 단계의 표준 작업을 나타낸다.
도 4b는 효소 활성 에세이에 의해 모니터링한 작업중 수집된 분획을 나타낸다.
도 4c는 활성도에 대해 에세이된 용리 분획의 쿠마시-블루(coomassie-blue) 염색을 나타낸다.
도 5는 복막 대식세포에 의한 흡수에 따른 재조합 hGCD의 활성도를 나타내고(도 5a-5c), 도 5d는 본 발명에 따른 재조합 GCD의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 rGCD에 대한 글리코실화 구조를 CerezymeTM의 것과 비교한 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 rGCD에 대한 글리코실화 구조를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 rGCD에 대한 추가의 N-글리칸 글리코실화 구조를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
약제학적 용도의 단백질은 전통적으로 전형적으로 포유동물 또는 박테리아 발현계에서 생성되었다. 과거 몇 년간, 장래성이 있는 신규한 발현계가 식물에서 발견되었다. 단백질 및 펩티드의 대량 생산을 위한 신규 유전자 및 포텐셜의 도입이 비교적 간단하기 때문에, '식물유래 의약품(molecular pharming)'은 단백질 발현계로서 점점 대중화되고 있다.
포유류와 식물 단백질 발현계 사이의 주요 차이점의 하나는 생합성 경로의 차이에 의해 야기된 단백질 글리코실화 서열의 변이(variation)이다. 글리코실화는 활성, 폴딩, 안정성, 용해도, 프로테아제에 대한 감수성, 혈액 청소율 및 단백질의 항원 전위에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 식물에서의 특정 단백질의 생성은 식물 글리코실화의 잠재적 가지형성을 고려해야 한다.
탄수화물 부분은 가장 통상적인 단백질의 번역후수식(post-translational modificaiton)중 하나이다. 단백질 글리코실화는 두 개의 카테고리, 즉 N-결합 및 O-결합으로 나뉘어진다. 이 두 형태는 단백질상에서 글리칸 부위가 부착되는 아미노산이 다르다; 즉 O-결합은 Ser 또는 Thr 잔기에 부착되는 반면, N-결합은 Asn 잔기에 부착된다. 또한, 각각의 형태의 글리칸 서열은 특유의 뚜렷한 특징을 가진다. 두 가지 형태중 N-결합 글리코실화가 더 풍부하여 단백질 작용에 대한 그의 영향이 넓게 연구되고 있다. 한편, O-결합 글리칸은 상대적으로 부족하여 단백질에 대한 그의 영향에 관한 정보를 입수할 수 없다. 식물에서 단백질 글리코실화에 이용가능한 주요 데이터는 O-결합 글리칸보다는 N-결합 글리칸에 집중된다.
본 발명은 임의로 및 바람직하게는 현탁액중에서 성장된 유전자도입 식물 세포, 바람직하게는 뿌리 세포에 기초한 식물 발현계를 기술한다. 이러한 발현계는 특히 관심의 대상이 되는 고-만노스 단백질을 효율적으로 생성하기 위해 디자인된다. 용어 "고-만노스"는 적어도 하나의 노출 만노스 잔기를 가진 글리코실화를 포함한다.
따라서, 제 1 측면으로, 본 발명은 관심의 대상이 되는 고-만노스 재조합 단백질을 생성하는 숙주세포에 관한 것이다. 바람직하게도, 재조합 단백질은 ER(소포체) 시그널 펩티드, 더욱 바람직하게는 ER 표적화 시그널 펩티드를 특징으로 한다. 다르거나 추가적으로, 재조합 단백질은 단백질이 골지를 바이패스하도록 하는 시그널을 특징으로 한다. 이 시그널은 더욱 바람직하게는 이러한 글리코실화를 보유함으로써, 가장 바람직하게는 ER을 표적함으로써 및/또는 골지를 바이패스함으로써, 바람직하게 재조합 단백질이 고-만노스 글리코실화할 수 있도록 한다. 본 명세서에 더욱 상세히 설명한 바와 같이, 상기 시그널은 시그널 펩티드로서 작용하고, 더욱 바람직하게는 단백질 서열 일부를 형성하며, 임의로 더욱 바람직하게는 조작을 통해 단백질의 일부로서 시그널 펩티드 성질도 특징으로 하는 단백질을 형성한다. 시그널은 임의로 표적화 시그널, 보유(retention) 시그널, 회피(avoidance)(바이패스) 시그널, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 소망하는 고-만노스 글리코실화 구조를 제공할 수 있는 임의의 다른 형태의 시그널일 수 있음을 유념해야 한다.
단일 가설에 의해 제한되는 것은 아니지만, 식물 세포 배양액에서 생성되는 재조합 단백질과 함께 ER 표적화 시그널을 사용하면 골지로의 수송을 해소할 수 있고, 따라서 목적하는 고-만노스 글리코실화를 보유할 수 있었을 것으로 판단되었다. 임의로, 골지를 바이패스하는 특정 형태의 메카니즘을 포함하여 고-만노스 글리코실화를 생성할 수 있는 특정 형태의 메카니즘이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. ER 표적화 시그널 펩티드는 당업계에 널리 알려져 있고; 이들은 N-말단 시그널 펩티드이다. 임의로, 임의의 적합한 ER 표적화 시그널 펩티드를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 임의로, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 또는 이 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 (영구적으로 및/또는 일시적으로) 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 이러한 핵산 분자는, 임의로 및 바람직하게 액포 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함한다. 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된"이란 반드시 물리적 결합을 의미하는 것이 아님을 유념해야 한다. 제 1 핵산 서열은 임의로 및 바람직하게는 ER(소포체) 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 3 핵산 서열에 추가로 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 숙주세포는 관심의 대상이 되는 단백질이 적어도 하나의 노출 만노스 잔기를 포함하는 형태의 세포에 의해 생성되며, 바람직하게는 고-만노스화된 형태이다.
"세포", "숙주세포" 또는 "재조합 숙주세포"는 본 명세서에서 혼용적으로 사용되는 용어이다. 이 용어는 특정 대상의 세포만이 아니라 이러한 세포의 후손 또는 잠재 후손을 의미하는 것으로 이해된다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인해 후세에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 후손은 사실상 친세포(parent cell)와 동일하지 않을 수 있지만 본 명세서에 사용된 용어의 범위에 여전히 포함된다. 본 명세서에 사용된 "숙주세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 발현 벡터 또는 나(naked) DNA에 의해 재조합적으로 형질전환될 수 있는 세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "트랜스펙션(transfection)"은 핵산-매개 유전자 도입에 의해 핵산, 예를 들어 나 DNA 또는 발현 벡터를 수용자 세포에 도입하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수의 결과로서 세포의 유전자형이 변화되는 과정을 의미하는 것으로, 예를 들어 형질전환 세포는 목적하는 단백질의 재조합 형태를 발현한다.
약물 내성 또는 다른 선택가능 마커가 형질전환주의 선택(selection)을 촉진하고자 의도된 것임을 인지해야 한다. 추가로, 약물 내성 마커와 같은 선택가능 마커의 존재는 오염 미생물이 배양 배지에서 증식하지 않도록 하는데 유용할 수 있다. 이와 같은 형질전환 숙주세포의 순수 배양액은 유발(induced) 표현형의 생존에 필요한 조건하에서 세포를 배양함으로서 수득되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 숙주세포는 핵산 분자에 의해 형질감염되거나 형질전환될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적합하다면 리보핵산과 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 또한 뉴클레오티드 유사체로 만들어진 RNA 또는 DNA의 등가물, 유사체로서 및 기술되는 일례에 적용된 바와 같이 단일-가닥 (예컨대 센스(sense) 또는 안티센스(antisense)) 및 이중-가닥의 폴리뉴클레이티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또 다른 일례로, 본 발명의 숙주세포는 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질감염되거나 형질전환된다. 본 명세서에 사용된 "발현 벡터"는 DNA 단편을 숙주의 게놈내로 통합(integration)시킬 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합가능한(integratable) DNA 단편, 및 다른 비히클(vehicle)과 같은 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 목적하는 유전자 또는 그의 단편, 및 적합한 숙주세포에서 식별되는 작동가능하게 연결된 유전자 제어 요소를 포함하는 자기-복제 DNA 또는 RNA 작제물로서, 목적하는 유전자를 발현시킨다. 이들 제어 요소는 적합한 숙주내에서 발현될 수 있다. 일반적으로, 유전자 제어 요소는 원핵 프로모터 시스템 또는 진핵 프로모터 발현 제어 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 전형적으로 전사 프로모터(transcription promoter), 전사의 개시(onset)를 제어하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator), RNA 발현의 수준을 높이는 전사 인핸서(transcription enhancer), 적합한 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, RNA 스플라이스 이음부(splice junction), 전사 및 번역을 종결하는 서열 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 통상 벡터가 숙주세포와 독립적으로 복제하도록 하는 복제 기점을 포함한다.
동등한 기능을 제공하며 당업계에 공지된 다른 형태의 벡터도 본 발명에 사용하기에 적합하지만, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태이다. 예를 들어 문헌[Pouwels et al. Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 and supplements), Elsevier, N. Y.; and Rodriquez, et al. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988)]을 참조하기 바라며, 이 문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
일반적으로, 이러한 벡터는 형질전환 세포에서 표현형 선택(phenotypic selection)을 제공할 수 있는 특정 유전자를 추가로 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 유전자 코딩을 발현하기 위한 원핵 및 진핵 바이러스 발현 벡터의 용도가 또한 예상된다.
임의로, 벡터는 전반적인 식물 벡터(이하의 실시예와 관련하여 기술된 바와 같은 것)일 수 있다. 다르게는, 벡터는 임의로 뿌리 세포에 대해 특이적일 수 있다.
하나의 바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다.
특정 일례로, 본 발명의 숙주세포는 원핵 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 가장 바람직하게는 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포이다. 이들 세포는 이후 기술된 바람직한 식물 숙주세포를 감염시키는데 사용된다.
다른 바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포는 진핵세포, 바람직하게는 식물 세포, 가장 바람직하게는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹중에서 선택된 식물 뿌리 세포일 수 있다.
바람직한 일례로, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다. 본 발명의 형질전환 당근 세포는 현탁액중에서 성장되는 것을 유념해야 한다. 상기 언급되거나 실시예에 기술된 바와 같이, 이들 세포는 본 발명의 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens ) 세포에 의해 형질전환되었다.
본 발명의 숙주세포를 형질감염시키거나 형질전환시키기 위해 사용되는 발현 벡터 또는 재조합 핵산 분자는, 펩티드 시그널 서열을 추가, 제거 또는 변형시켜 식물 세포내막계를 통해 발현 리소좀 효소의 표적화를 증가 또는 변화시키거나 시그널 펩티드 분해(cleavage)를 변경하도록 당업자들에게 공지된 방법에 따라 추가로 변형될 수 있다. 제한하는 것은 아니나, 예를 들어 발현 작제물은 소포체(ER)에서 분비, 또는 액포 위치결정(localization), 또는 보유를 위해 리소좀 효소를 표적하도록 특별히 처리될 수 있다.
하나의 일례로, 발현 벡터 또는 재조합 핵산 분자는 식물 액포에 리소좀 효소를 표적시키는 시그널을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 혼입하도록(incorporate) 처리될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어 본 발명의 숙주세포내에 포함된 재조합 핵산 분자는 기본 토바코 키티나아제 A 유전자로부터 유도된 액포 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 결합된, 리소좀 효소를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함한다. 이 액포 시그널 펩티드는 서열번호: 2에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가진다. 제 1 핵산 서열은 서열번호: 1에 의해 나타낸 바와 같은 ER(소포체) 표적화 시그널 펩티드를 코딩하는 제 3 핵산 서열과 작동가능한 결합으로 추가로 연결될 수 있다. 하나의 일례로, 본 발명의 숙주세포내 포함된 재조합 핵산 분자는 식물 세포에서 작용하는 프로모터(promoter)를 추가로 포함한다. 이 프로모터는 본 발명의 재조합 분자에 작동가능하게 연결되어야 한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우, 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다는 것을 나타내기 위해 본 명세서에 사용된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 임의로 그리고 바람직하게도, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 2개의 단백질-코딩 영역을 결합할 필요가 있는 경우 같은 해독 프레임(reading frame)에서 접촉한다(contiguous)(예, 물리적으로 결합된다). 따라서, DNA 서열 및 조절 서열(들)은, 적절한 분자(예, 전사 활성화인자 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현하도록 하는 방식으로 연결된다.
다른 일례로, 재조합 핵산 분자는 식물 세포에서 바람직하게 작용하는 작동가능하게 결합된 터미네이터를 임의로 추가로 포함한다. 본 발명의 재조합 핵산은 임의로 추가적인 제어, 촉진 및 조절 요소 및/또는 선택가능 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이들 조절 요소는 재조합 분자에 작동가능하게 연결될 수 있음을 유념해야 한다.
발현 작제물에 사용될 수 있는 조절 요소는 식물 세포에 대해 이종 또는 동종일 수 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 식물 세포 및 식물에서 연결(linked) 서열을 고도로 전사시킬 수 있는 비식물 프로모터 또는 식물 프로모터일 수 있다. 본 발명의 실시에 효과적으로 사용될 수 있는 식물 프로모터의 비한정적인 예로 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)35S, rbcS, 엽록소 a/b 결합 단백질에 대한 프로모터, AdhI, NOS 및 HMG2, 또는 이들의 변형체 또는 유도체가 포함된다. 프로모터는 구성적(constitutive)이거나 유발가능(inducible)할 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어 유발가능 프로모터는 식물, 식물 조직 또는 식물 세포의 기계적 유전자 활성(MGA, mechanical gene activation)후 리소좀 효소 뉴클레오티드 서열의 발현을 증가시키거나 발현을 촉진하는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 숙주세포를 형질감염시키거나 형질전환시키기 위해 사용되는 발현 벡터는 식물 및 식물 세포에서 이종 유전자 발현을 향상시키거나 최대로 활용하기 위해 당업자들에게 공지된 방법에 따라 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 변형으로는 관심의 대상이 되는 단백질을 변경시키거나 프로모터 강도를 증가시키기 위해 DNA 조절 요소를 변화시키는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포에 의해 생성된 관심의 대상이 되는 고-만노스 단백질은 적어도 하나의 노출 만노스 잔기(적어도 하나의 말단 만노스 잔기)를 가진 고-만노스 당단백질일 수 있다.
또 다른 바람직한 일례에 따라, 이러한 고-만노스 단백질은 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 리소좀 효소일 수 있다.
본 발명에 의해 기술된 식물 발현계에서 생성된 임의의 효소 및 생성물과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "리소좀 효소"는 인간 또는 동물의 리소좀 효소, 변형된 인간 또는 동물의 리소좀 효소, 또는 이들 효소의 단편, 유도체 또는 변형체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 유전자도입 식물 세포에서 발현된 재조합 펩티드를 의미한다. 유용한 변형된 인간 또는 동물의 리소좀 효소로는 하나 또는 몇개의 자연발생 또는 인공 도입된 아미노산 부가체, 결실체 및/또는 치환체를 가진 인간 또는 동물의 리소좀 효소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
가용 리소좀 효소는 분비 단백질과의 생합성, 즉 리보솜에서의 합성, 조면 소포체(ER)의 표면에 대한 N-말단 시그널 펩티드의 결합, 시그널 펩티드가 분해되는 ER의 루멘(lumen)으로의 수송, 및 특정 아스파라긴 잔기(N-결합)에 올리고당의 부가, 이어 골지체에서 미완성(nascent) 단백질의 추가 변형의 초기 단계를 공유한다[von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem. 55: 167-193 (1986)]. N-결합 올리고당은 복잡하고 다양하며 비균질적일 수 있고, 고-만노스 잔기를 함유할 수 있다. 단백질은 리소좀 국재(localized) 효소에 대한 N-결합 만노스 6-포스페이트(M-6-P) 올리고당-의존성 또는 N-결합 M-6-P 올리고당-비의존성 식별 시그널을 형성하도록 ER-뒤(post-ER), 골지-앞(pre-Golgi) 구획에서 및 시스-골지(cis-Golgi)에서 추가로 처리된다[Kornfeld & Mellman, Ann. Rev. Cell Biol., 5: 483-525 (1989); Kaplan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2026 (1977)]. M-6-P 식별 시그널이 존재하면 M-6-P 수용체(MPR)에 효소가 결합된다. 이들 결합된 효소는 세포에 남고, 리소좀내로 결국 팩키징되어 원형질막에 또는 분비를 위해 표적화된 단백질로부터 분리된다.
바람직한 일례로, 리소좀 효소는 인간 글루코세레브로시다제(GCD)일 수 있다.
또한, 특정 일례로, 바람직한 숙주세포는 바람직하게는 서열번호: 9로 표시되는 핵산 서열을 가진 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)로부터의 35S 프로모터, 바람직하게는 서열번호: 12로 표시되는 핵산 서열을 가진 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 합성효소 터미네이터 및 TWV(토바코 모자이크 바이러스, Tobacco Mosaic Virus) 오메가 번역 인핸서 요소를 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자에 의해 형질전환되거나 형질감염된다. 바람직한 일례에 따라, 이 재조합 핵산 분자는 실질적으로 서열번호: 13에 의해 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하며, 실질적으로 서열번호: 14에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가진 고-만노스 GCD를 코딩한다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공하는 것이 인지되어야 한다.
하나의 바람직한 일례로, 본 발명의 발현 벡터는 생물학적으로 활성인 고-만노스 인간 글루코세레브로시다제(GCD)를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게도, 바람직한 발현 벡터는 실질적으로 서열번호: 13로 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 가진 재조합 핵산 분자를 포함한다. 특정 일례에 따라, 바람직한 발현 벡터는 하기 실시예 1에 기술된 바와 같은 pGREEN II 플라즈마를 사용한다.
본 발명이 상기 기술된 발현 벡터내에 포함되는 발현 카세트를 제공하는 것을 추가로 유념해야 한다.
두 번째 일면으로, 본 발명은 본 발명의 숙주세포에 의해 생성된 재조합 고-만노스 단백질에 관한 것이다.
바람직한 일례로, 고-만노스 단백질은 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소일 수 있다. 가장 바람직하게도, 리소좀 효소는 인간 글루코세레브로시다제(GCD)일 수 있다.
용어 "생물학적으로 활성"은, 재조합 리소좀 효소가 천연 기질 또는 상응하는 인간 또는 동물의 리소좀 효소의 유사체 또는 합성 기질을 검지가능한 수준에서 가수분해할 수 있음을 의미하도록, 식물 발현계에서 생성된 임의의 재조합 리소좀 효소와 관련하여 본원에 사용된다.
또한, 본 발명은 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진 생물학적으로 활성인 재조합 고-만노스 리소좀 효소를 제공한다.
바람직한 일례에 따라, 본 발명의 재조합 리소좀 효소는 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체에 결합할 수 있다. 바람직하게도, 이 부위는 리소좀 저장 질환으로 고통받고 있는 대상내에 존재할 수 있다.
임의로 및 더욱 바람직하게는, 재조합 리소좀 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가지는 것을 유념해야 한다. 특정 일례로, 표적 부위의 표적 세포는 대상의 간의 쿠퍼세포(Kupffer cell)일 수 있다.
바람직한 일례로, 재조합 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택될 수 있다.
가장 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
세 번째 일면으로, 본 발명은 고-만노스 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 (a) 관심의 대상이 되는 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염된 재조합 숙주세포의 배양액을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)에 의해 제조된 숙주세포 배양액을 고-만노스 단백질을 발현하는 조건하에 현탁액중에서 배양하여, 숙주세포가 단백질을 고-만노스화된 형태로 생성하도록 하는 단계; (c) 단계 (a)에서 제공된 배양액으로부터 세포를 채취하고 이 세포로부터 단백질을 회수하는 단계; (d) 적합한 단백질 정제법에 의해 단계 (c)의 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
임의로 및 바람직하게도, 재조합 단백질은 본원에 충분히 진술된 바와 같이 참고문헌으로서 본원에 포함되고, 2002년 5월 21일자로 등록된 미국특허 제 6,391,638호와 관련하여 기술된 장치에서 배양함으로써 본 발명에 따른 식물 세포에 의해 생성될 수 있다. 이 장치를 사용하여 현탁액중에서 식물 세포를 배양하는 조건은, 본 출원과 동일자로 출원되었고 본원에 충분히 진술된 바와 같이 참고로서 본 명세서에 포함되며, 본 출원과 소유권자가 동일하고 본 발명자들중 한 명에 의한 미국 특허출원(발명의 명칭: "세포/조직을 배양하는 장치 및 방법(CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM AND METHOD")과 관련하여 기술되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 관심의 대상이 되는 고-만노스 단백질의 회수 및 정제에 대한 특정의 그리고 비한정적인 예를 하기 실시예에서 발견할 수 있다. 실시예는 본 발명에 의해 생성된 재조합 h-GCD가 예기치않게 본 발명의 형질전환 당근 세포의 세포내막(internal membrane)에 결합되나 배지로는 분비되지 않았다는 것을 나타낸다. 가용성 rh-GCD는 여과 또는 정제와 같이 당업계에 공지된 수단에 따라 세포 잔유물(cell debris) 및 다른 불용성 성분으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 동결-융해 주기(freeze thaw cycle) 이후, h-GCD는 불용성 막 잔유물에 결합되어 있는 반면, 세포는 세포내 가용 단백질의 파손(breakage) 및 방출을 거치게 된다. 이 가용성 및 불용성 막 잔유물의 혼합물은 이어 원심분리되었고, 가용성 분획은 제거되었기 때문에 정제를 단순화하였다. 막 결합 hGCD는 이어 온화한 계면활성제, 프로테아제 저해제 및 중화 산화제의 존재하에서 기계적 분열에 의해 용해될 수 있다. 가용성 효소는 양이온 교환 및 소수성 인터렉션 크로마토그래피 컬럼과 같이 크로마토그래피 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 바이오리액터(bio-reactor)에서 rh-GCD 생성 및 정제 공정동안, h-GCD 동일성(identity), 수율, 순도 및 효소 활성은 하나 이상의 생화학적 에세이에 의해 결정될 수 있다. 효소 기질 또는 기질 유사체의 가수분해 검출, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 및 면역학적 분석, 예컨대 엘리사(ELISA) 및 웨스턴 블롯(Western blot)이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 실시예에 따라, 본 방법에 의해 사용되는 숙주세포는 본 발명의 숙주세포를 포함한다.
다른 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 생성된 고-만노스 단백질은 노출 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 사슬을 가진 생물학적으로 활성인 고-만노스 리소좀 효소일 수 있다.
이 재조합 효소는 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체에 결합할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다. 따라서, 표적 부위에서 표적 세포는 대상의 간에서 쿠퍼세포(Kupffer cell)일 수 있다.
특정 일례로, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게도, 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)일 수 있다.
또 다른 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 숙주세포는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹중에서 선택된 식물 뿌리 세포일 수 있다. 가장 바람직하게도, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다. 형질전환 숙주 당근 세포가 현탁액중에서 성장되는 것에 특히 유념해야 한다.
추가의 일면으로, 본 발명은 외인성 재조합 리소좀 효소를 사용하여 리소좀 저장 질환을 가진 대상, 바람직하게는 표유동물 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
처리단계 및 재료가 다소 변할 수 있는 것과 같이, 본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 실시예, 처리 단계 및 재료로 한정되지 않는다는 것으로 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 그의 등가물에 의해서만 제한되기 때문에, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 일례만을 기술하기 위해 사용되는 것이지 제한하고자 하는 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 이후의 청구범위에 걸쳐, 달리 지적되지 않는 한 단어 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 임의의 다른 완전체 또는 단계 또는 완전체 또는 단계의 그룹의 배제가 아니라 정해진 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 그룹의 포괄을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 달리 지적되지 않는 한 단수형은 복수의 지시대상을 포괄한다.
이후의 실시예는 본 발명의 일면들을 수행함에 있어서 발명자들에 의해 사용된 대표적인 기술이다. 이러한 기술은 본 발명의 실시하기 위한 바람직한 일례의 예시이나, 본 설명에 비추어 당업자들은 본 발명의 정신 및 의도한 범위를 벗어나지 않고 다수의 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
실험 과정:
플라스미드 벡터
* CE-T는 갈릴리(Galili) 교수로부터 얻은 플라스미드 CE로부터 작제하였다[미국 특허 제 5,367,110호, 1994. 11. 22]
플라스미드 CE를 SalI로 분해시켰다.
SalI 부착단은 DNA 폴리메라제 I의 큰 단편을 사용하여 무디게(blunt-ended) 만들었다. 이어, 플라스미드를 PstI로 분해시키고, 기본 엔도키티나제 유전자 [Arabidopsis thalianna] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCA CTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC로부터 ER 표적화 시그널 및 SmaI 및 PstI로 분해시킨 토바코 키티나제 A(Tobacco chitinase A): GATCTTTTAGTCGATACTATG로부터 액포 표적화 시그널을 코딩하는 DNA 단편에 결찰시켰다(ligated).
* pGREENII는 피. 물리니욱스(P. Mullineaux) 박사로부터 수득하였다[Roger P. Hellens et al., (2000) Plant Mol. Bio. 42: 819-832]. pGREEN II 벡터로부터의 발현은 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)로부터의 35S 프로모터, TWV(토바코 모자이크 바이러스, Tobacco Mosaic Virus) 오메가 번역 인핸서 요소 및 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 합성효소 터미네이터에 의해 제어된다.
cDNA
hGCD는 글루코시다제 베타 산[글루코세레브로시다제]을 함유하는 ATCC[등록번호(Accession No.) 65696], GC-2.2[GCS-2kb; 람다-EZZ-감마3 호모 사피엔스(Homo sapiens)]로부터 수득하였다. 삽입 길이(kb):2.20; 조직:섬유모세포 WI-38 세포.
발현 플라스미드의 작제
hGCD(ATTC 클론 번호 65696)에 대한 cDNA 코딩을 포워드(forward): 5'CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' 및 리버스(reverse): 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 정제 PCR DNA 생성물을 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BgII로 분해시키고(프라이머에서 밑줄친 식별 서열 참조), 동일한 효소로 분해시킨 발현 카세트 CE-T를 가진 중간 벡터(intermediate vector)내로 결찰시켰다. 발현 카세트를 중간 벡터로부터 잘라 용리시키고, 제한 효소 SmaI 및 XbaI를 사용하여 이항 벡터(binary vector) pGREENII내로 결찰시켜 최종의 발현 벡터를 형성하였다. 카나마이신(kanamycine) 내성은 pGREEN 벡터와 함께 수득된 노스 프로모터(nos promoter)에 의해 구동되는 NPTII 유전자에 의해 얻어진다(도 1b). 생성된 발현 카세트를 도 1a에 나타낸다.
생성된 플라스미드를 다음의 서열분석 프라이머를 사용하여 시그널의 정확한 인프레임 퓨젼(in-frame fusion)을 확보하기 위해 서열분석하였다: 5' 35S 프로모터: 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3', 및 3' 터미네이터: 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3'.
당근 칼루스 및 세포 현탁 배양의 확립
당근 칼루스 및 세포 현탁 배양의 확립은 토레스 케이.시.(Torres K.C.)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Tissue culture techniques for horticular crops, p.p.111, 169).
당근 세포의 형질전환 및 형질질환 세포의 분리
당근 세포의 현질전환은 앞서 기술된 방법에 의해 아그로박테륨(Agrobac -terium) 형질전환을 사용하여 수행하였다[Wurtele, E. S. and Bulka, K. Plant Sci. 61: 253-262 (1989)]. 칼루스 대신 공정내내 액체 매질중에서 성장하는 세포를 사용하였다. 배양 및 성장 시간은 액체 배양액에서의 세포의 형질전환을 위해 적응시켰다. 간단히 말하면, 아그로박테리아(Agrobacteria)를 전기천공(electroporation)에 의해 pGREEN II 벡터로 형질전환시킨 다음[den Dulk-Ra, A. and Hooykaas, P. J. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 63-72], 30 ㎎/㎖ 파로모마이신(paromomycine) 항생제를 사용하여 선택하였다. 당근 세포는 액체 매질중에서 아그로박테리아(Agrobacteria)로 형질전환시킨 다음 60 ㎎/㎖ 파로모마이신(paromomycine) 항생제를 사용하여 선택하였다.
고수준의 GCD 를 발현하는 칼루스를 분리하기 위한 형질전환 당근 세포의 스 크리닝
형질전환하고 14일후에, 배양액으로부터의 세포를 개개의 세포 클러스터(cluser)로부터 칼루스의 형성을 위해 3% 팩킹 세포 부피의 희석액에서 고체 매질상에 플레이팅하였다(plating). 개개의 칼루스의 직경이 1-2 ㎝에 도달하였을 때, 세포를 SDS 샘플 버퍼중에서 균질화시키고, 생성된 단백질 추출물을 SDS-PAGE상에서 분리한 다음[Laemmli U., (1970) Nature 227: 680-685], 니트로셀룰로스막[hybond C 니트로셀룰로스, 0.45 미크론. Catalog No: RPN203C, 애머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science)로부터 입수)]으로 전이시켰다. GCD의 검출을 위해 항 hGCD 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(이하 본 명세서에 기술됨). 상당한 수준의 GCD를 발현하는 칼루스를 확장시키고, 스케일 업(scale up), 단백질 정제 및 분석을 위해 액체 매질에 옮겨 성장시켰다.
다클론 항체의 조제
75 ㎍의 재조합 GCD(CerezymeTM)를 3 ㎖ 완전 프로인트 아주반트(Freund's adjuvant)에 현탁시키고 2 마리의 래트에 각각 주사하였다. 2주후, 래트 각각에 추가주사하였다. 추가주사하고 약 10일후 래트에서 출혈이 있었고, 항체가(antibody titer)가 떨어지기 시작할 때까지, 1주 간격으로 다시 추가주사하였다. 응혈을 제거한 후, 혈청을 부분표본(aliquot)으로 나누어 -20℃에서 저장하였다.
바이오리액터에서의 업스케일 ( upscale ) 배양 증식
rh-GCD 유전자를 가진 유전자 조작 당근 세포의 약 1 ㎝(직경) 칼루스를 4.4 gr/ℓ MSD 배지(Duchefa), 9.9 ㎎/ℓ 티아민 HCl(Duchefa), 0.5 ㎎ 엽산(Sigma), 0.5 ㎎/ℓ 바이오틴(Duchefa), 0.8 g/ℓ 카제인 하이드롤리세이트(Casein hydrolisate)(Ducifa), 당 30 g/ℓ 및 호르몬 2-4 D(Sigma)를 함유하는 직경 9㎝의 MS(Murashige and Skoog) 한천 배지 플레이트상에 플레이팅하였다.
당업계에 널리 공지된 바와 같이, MSD 액체 배지(0.2 ㎎/ℓ 2,4-디클로로아세트산을 함유하는 Murashige & Skoog (1962))중에서 형질전환 칼루스를 계대배양(sub-culturing)하여 현탁 세포 배양액을 조제하였다. 현탁 세포를 250 ㎖ 삼각플라스크(작업 부피가 25 ㎖로 출발하여 7일후 50 ㎖로 증가함)에서 60 rpm의 속도로 진탕하면서 25 ℃로 배양하였다. 이어, 같은 조건하에서 작업 부피를 300 ㎖까지 부가하여, 세포 배양액 부피를 1ℓ삼각플라스크로 증가시켰다. 7일간 배양한 1ℓ 삼각플라스크 2개로부터 유도된 현탁 세포 400㎖를 첨가하여 4ℓ MSD 배지를 함유하는 작은 바이오리액터(10ℓ)[WO98/13469 참조]의 접종물(inoculum)을 수득하였다. 1 Lpm 기류(airflow)로 25℃에서의 배양 1주후, MDS 배지를 10L까지 첨가하고, 동일한 조건에서 계속 배양하였다. 추가로 5일 배양한 후, 80μ 네트로 세포 배지(cell media)를 통과시켜 대부분의 세포를 채취 및 수집하였다. 여분의 배지는 짜내고 팩킹 세포 케이크를 -70℃로 저장하였다.
바이오리액터 장치에 대한 더욱 상세한 설명은 참고로서 이미 포함되었고, 2002년 5월 21일 등록된 미국특허 제 6,391,638호와 관련하여 찾을 수 있다.
단백질 정제
불용성 GCD로부터 배지를 분리하기 위해, 웨트(wet) 중량 약 100g의 세포를 함유하는 동결 세포 케이크를 해동시키고, 이어 해동된 세포를 4℃에서 20분간 17000xg로 원심분리하였다. 불용성 재료 및 무손상 세포(intact cell)를 세척 버퍼(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 20 mM EDTA) 100 ㎖에서 재-현탁에 의해 세척한 다음 4℃에서 20분간 17000g로 원심분리에 의해 침전시켰다. rh-GCD(재조합 인간 GCD)를 추출하고, 200 ㎖ 추출 버퍼(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 20mM EDTA, 1mM PMSF, 20mM 아스코르브산, 3.8g 폴리비닐폴리피롤리돈(PVPP), 1mM DTT 및 1% 트리톤(Triton)-x-100)중에서 펠렛의 균질화에 의해 가용화시켰다. 이어, 균질액을 실온에서 30분간 진탕한 다음 4℃에서 20분간 17000xg로 원심분리에 의해 정화시켰다. 펠렛을 버리고, 진한 시트르산을 첨가하여 상등액의 pH를 pH 5.5로 조정하였다. pH 조정후 생성된 혼탁물(turbidity)을 상술한 동일한 조건하에 원심분리에 의해 정화시켰다.
다음과 같은 크로마토그래피 컬럼 방법에 의해 추가의 정제를 실시하였다: XK 컬럼(2.6×20㎝)에 팩킹된, 25 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 5.5에서 평형화시킨 20 ㎖의 강한 양이온 교환 수지(Macro-Prep high-S support, 바이오-라드(Bio-Rad))상에 200 ㎖의 정화 추출물를 부하하였다. 이 컬럼은 전도도, pH 및 280nm에서의 흡광도를 모니터링하는 AKTA 프라임 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))으로 구성하였다. 샘플을 20 ㎖/분으로 부하한 다음, UV 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 컬럼을 유속 12 ㎖/분의 평형 버퍼(25 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 5.5)로 세척하였다. 200mM NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 rh-GCD를 예비-용리한 다음, 600mM NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 용리액을 수득하였다. 작업중에 수집한 분획을 효소 활성 에세이에 의해 모니터링하였고, 효소 활성(용리 피크에서)를 표시하는 튜브를 풀링(pooling)하였다. 풀링한 샘플을 5% 에탄올을 함유하는 물로 희석시키고(1:5), NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. rh-GCD를 함유하는 샘플을 이전 컬럼에서와 같은 동일한 수지 10 ㎖가 팩킹된 제 2 XK 컬럼(1.6×20㎝)에 도포하였다. 이 컬럼내 수지를 5% 에탄올을 함유하는 20 mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0로 평형화하였다. 샘플을 부하한 후, 컬럼을 평형 버퍼로 세척하고, 용리 버퍼(20 mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0, 5% 에탄올 및 1M NaCl)에 의해 컬럼으로부터 GCD를 용리시켰다. 용리 단계에서 흡수 피크(absorbent peak)의 분획을 풀링하고 제 3 컬럼에 도포하였다.
8 ㎖의 소수성 인터렉션 수지(TSK 겔, Toyopearl Phenyl-650C, 토소 코포레이션(Tosoh Corp.))가 팩킹된 XK 컬럼(1.6×20㎝)상에서 최종 정제 단계를 수행하였다. 수지를 5% 에탄올 함유 10 mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0중에서 평형화시켰다. 이전 컬럼으로부터의 GCD 용리 풀을 6 ㎖/분으로 부하한 다음 UV 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 평형 버퍼으로 세척하였다. 순수한 GCD를 50% 에탄올 함유 10 mM 시트르산 버퍼으로 용리시키고 풀링한 다음 -20℃에서 저장하였다.
단백질 농도의 결정
세포 추출물 및 분획중 단백질 농도는 소혈청 알부민 표준(분획 V Sigma)을 사용하여 Lowry/Bradford(바이오 라드 프로테인 에세이(Bio Rad protein assay))의 방법에 의해 에세이하였다[Bradford, M., Anal. Biochem. (1976) 72: 248] 또한, 균질 단백질 샘플의 농도는 280 ㎚에서의 흡광도, 1 ㎎/㎖=1.4 O.D280에 의해 결정하였다. 순도는 280/260 ㎚ 비율에 의해 결정하였다.
GCD 효소 활성 에세이
GCD의 효소 활성은 기질로서 p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(Sigma)를 사용하여 결정하였다. 에세이 버퍼는 60mM 포스페이트-시트레이트 버퍼 pH=6, 4 mM β-머캅토에탄올, 1.3 mM EDTA, 0.15% Triton X-100, 0.125% 소듐 타우로코레이트를 함유하였다. 에세이는 96 웰 ELISA 플레이트에서 수행하고, 0-50 ㎕의 샘플을 250 ㎕ 에세이 버퍼로 인큐베이션한 다음, 최종 농도가 4 mM가 되도록 기질을 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 생성물(p-니트로페닐; pNP) 형성을 405 ㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 405 ㎚에서의 흡광도는 t=0 및 최종 지점에서 모니터링하였다. 60분후, 각 웰에 5N NaOH 6 ㎕을 가하고, 405 ㎚에서의 흡광도를 다시 모니터링하였다. 동시(in parallel) 에세이한 기준 표준 곡선(reference standard curvu)을 사용하여 시험 샘플내 GCD의 농도를 정량하였다[Friedman et al., (1999) Blood, 93 (9): 2807-16].
생화학적 분석:
겔 단백질가수분해 및 질량 스펙트럼 분석
표준 단백질 밴드 겔을 깨끗한 면도칼로 절단하고 단백질 겔을 lOmM DTT로 환원시키고 lOmM 중탄산암모늄중 100 mM 요오도아세트아미드로 변형시켰다. 겔 조각을 10 mM 중탄산암모늄중 50% 아세토니트릴로 처리하여 단백질로부터 염색(stain)을 제거한 다음 겔 조각을 건조시켰다. 건조시킨 겔 조각을 샘플당 약 0.1 ㎍의 트립신을 함유하는 10mM 중탄산암모늄중 10% 아세토니트릴로 재수화시켰다.
트립신분해 펩티드를 다공성 R2(Persepective)로 홈필드된(home-filled) 0.1×300 mm 융합 실리카 모세관(J & W, 100 ㎛ ID)상에서 역상 컬럼크로마토그래피에 의해 분리하였다(resolved). 약 1㎕/분의 유속으로 수중 0.1% 아세트산에 의한 5에서 95%의 아세토니트릴 80분 선형 구배를 사용하여 펩티드를 용리하였다. 컬럼으로부터 나온 액체는 이온트랩(ion-trap) 질량 분석계(LCQ, 피네간(Finnegan), 캘리포니아주 산요세)로 전기분무하였다(electrosprayed). 질량분석은, 반복적 완전(full) MS 스캔, 이어 제 1 MS 스캔으로부터 선택된 가장 우세한 이온의 충돌유기해리(collision-induced dissociation, CID)를 사용하여 양성 이온 모드에서 수행하였다. 질량분석 데이터를, Sequest Software를 사용하는 NR-NCBI 데이터베이스에서 모의 단백질 가수분해 및 단백질의 CID와 비교하였다[J. Eng and J. Yates, University of Washington and Finnegan, San Jose].
단백질의 아미노 말단을 Peptide Sequencer 494A (퍼킨스 엘머(Perkin Elmer))상에서 제조사의 지침에 따라 시퀀싱하였다(sequenced).
복막 대식세포의 GCD 흡수율
대식세포에 대한 GCD의 흡수 및 표적화는 만노스/N-아세틸글루코사민 수용체에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으며, 문헌{Stahl P. and Gordon S. [J. Cell Biol. (1982) 93 (1): 49-56]}에 기술된 바와 같이, 마우스로부터 수득한 티오글리콜레이트-유도(elicited) 복막 대식세포를 사용하여 측정될 수 있다. 요약하면, 2.4% Bacto-티오글리콜레이트 배지 w/o 덱스트로즈(Difco Cat. No. 0363-17-2) 2.5 ㎖를 마우스(암컷, 균주 C57-B6)에 복강내 주사하였다. 4-5일 후, 처리 마우스를 경추 탈구(cervical dislocation)에 의해 희생시키고, 복강을 인산 완충 식염수로 세정하였다. 세포를 원심분리(1000xg 10분)에 의해 펠렛팅한 다음 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM(BeitHaemek, 이스라엘)에 재현탁시켰다. 이어, 96-웰 조직 배양 플레이트에 1-2x105 세포/웰이 되도록 세포를 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 90분후, 비접착(non-adherent) 세포를 PBS를 사용하여 3회 세척한 다음, 접착 대식세포를 효모 만난(yeast mannan)의 부재 및 존재하에(2-10, 5 ㎎/㎖) 특정량(최종 부피 200 ㎕중 0 내지 40 ㎎의 범위)의 rhGCD를 함유하는 배양 배지에서 37℃로 90분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션후, 과량의 rGCD를 함유하는 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 용해(lysis) 버퍼(lOmM Tris pH=7.3, 1mM MgCl2, 0.5% NP-40 및 프로테아제 저해제)를 사용하여 용해시켰다. 상술한 바와 같은 시험관내 글리코시다제 에세이로 세포 용해물을 처리하여 세포에 의해 흡수되는 rGCD의 활성도를 측정하였다.
실시예 1
발현 플라즈마의 작제
본 실시예는 하기 실시예와 관련하여 사용된 예시적인 발현 플라스미드의 작제를 더욱 상세하게 설명한다.
cDNA coding for hGCD(ATTC 클론 번호 65696)에 대한 cDNA 코딩을 포워드: 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3'(서열번호: 3으로도 표시함) 및 리버스: 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3'(서열번호: 4로도 표시함) 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
정제 PCR DNA 생성물을 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BgII로 분해시키고(프라이머에서 밑줄친 식별 서열 참조), 동일한 효소로 분해시킨 발현 카세트 CE-T를 가진 중간 벡터(intermediate vector)내로 결찰시켰다. CE-T는 기본 엔도키티나제 유전자 [Arabidopsis thalianna]로부터의 ER 표적화 시그널 MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEF(서열번호: 1로도 표시함) 및 토바코 키티나제 A(Tobacco chitinase A): DLLVDTM*(서열번호: 2로도 표시함)을 포함한다.
발현 카세트를 중간 벡터로부터 잘라 용리시키고, 제한 효소 SmaI 및 XbaI를 사용하여 이항 벡터(binary vector) pGREENII내로 결찰시켜 최종의 발현 벡터를 형성하였다. 카나마이신(kanamycine) 내성은 pGREEN 벡터와 함께 수득된 노스 프로모터(nos promoter)에 의해 구동되는 NPTII 유전자에 의해 얻어진다(도 1b). 생성된 발현 카세트를 도 1a에 나타낸다.
생성된 플라스미드를 다음의 서열분석 프라이머를 사용하여 시그널의 정확한 인프레임 퓨젼(in-frame fusion)을 확보하기 위해 서열분석하였다:
5' 35S 프로모터로부터의 프라이머: 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3'(서열번호: 5로도 표시함), 및 3' 터미네이터: 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3'(서열번호: 6으로도 표시함). 확인된 클론의 hGCD 코딩 서열은 서열번호:7로 표시된다.
실시예 2
당근 세포의 형질전환 및 rhGCD 를 발현하는 형질전환 세포에 대한 스크리닝
본 실시예는 하기 실시예에 사용된 바와 같이 본 발명에 따른 당근 세포를 형질전환하는 예시적인 방법을 설명한다.
당근 세포의 현질전환은 앞서 기술된 방법에 의해 아그로박테륨(Agrobac -terium) 형질전환을 사용하여 수행하였다[Wurtele and Bulka (1989) ibid .]. 유전자 조작 당근 세포를 형질전환주 선택용 항생제와 함께 MS(Murashige and Skoog) 한천 배지상에 플레이팅하였다. 도 2에 도시한 바와 같이, 생성된 칼루스로부터 제조된 추출물을 항 hGCD 특이 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 의해 GCD 발현에 대하여 시험하고, 표준 Cerezyme(양성 대조군) 및 형질전환되지 않은 세포의 추출물(음성 대조군)과 비교하였다. 시험한 여러 개의 칼루스 가운데, 스케일-업 증식 및 단백질 정제를 위해 하나의 칼루스(22번)를 선택하였다.
웨스턴 블롯은 다음과 같이 수행되었다.
이러한 에세이를 위해, 수득된 샘플로부터의 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 분리하여, 니트로셀룰로스로 전이시켰다. 이를 위해, SDS 폴리아크릴아미드 겔을 다음과 같이 제조하였다. SDS 겔은 농축 겔(stacking gel) 및 분리 겔(resolving gel)로 구성된다[문헌(Laemmli, UK 1970, Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriphage T4, Nature 227, 680-685)에 따라]. 분리 겔의 조성은 다음과 같다: 12% 아크릴아미드(바이오-라드(Bio-Rad)), 겔 용액 10㎖ 당 TEMED(N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민; Sigma catalog number T9281) 4㎕, 0.1% SDS, 375mM Tris-HCl, pH 8.8 및 암모늄 퍼설페이트(APS) 0.1%. TEMED 및 암모늄 퍼설페이트는 본 명세서에서 중합반응의 자유 래디칼 개시제(starter)로서 사용되었다. 중합 개시 약 20분 후, 농축 겔(3% 아크릴아미드, 0.1% SDS, 126 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.1% APS 및 농축 겔 용액 5㎖당 TEMED 5 ㎕)을 상기 분리 겔위에 부은 다음, 12 또는 18개의 스페이스 콤(space comb)을 삽입하여 샘플용 웰을 생성하였다.
음극 및 양극 챔버에 동일한 버퍼 용액[SDS를 함유하는 Tris 글리신 버퍼(Biorad, catalog number 161-0772), pH 8.3]을 채웠다. 항원-함유 물질을 0.5 부피(volume)의 샘플 로딩 버퍼(sample loading buffer)[30㎖ 글리세롤(Sigma catalog number G9012), 9% SDS, 15㎖ 머캅토에탄올(Sigma catalog number M6250), 187.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 500㎕ 브로모페놀 블루, 모든 부피는 샘플 버퍼 100㎖에 대한 것임)로 처리한 다음, 혼합물을 100℃에서 5분간 가열하여 농축 겔상에 부하하였다.
크기 13×9㎝의 겔에 대해, 실온에서 적절한 시간동안, 예를 들어 45-60분간 50-70 볼트(volt)의 일정한 전류세기, 이어 45-60분간 180-200 볼트의 일정한 전류세기를 사용하여 전기영동을 수행하였다. 이어, 항원을 니트로셀룰로스로 전이시켰다(Schleicher and Schuell, Dassel).
단백질 전이는 사실상 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행하였다. 겔을 인접하는 니트로셀룰로스와 함께, 두께 0.5㎝ 발포재로 된 도전성 Whatmann 3 MM 필터 페이퍼(filter paper)와 백금 전극에 의해 전류를 전달하는 와이어 전극(wire electrodes) 사이에 배치하였다. 발포재인 필터 페이퍼와 니트로셀룰로스를 전이 버퍼(transfer buffer)[바이오-라드(Bio-rad)로부터의 TG 버퍼, catalog number 161-0771, 메탄올과 물의 버퍼(20% 메탄올)로 10배 희석]로 충분히 적셔 두었다. 4℃에서 90분간 100 볼트에서 전이시켰다.
전이후, 니트로셀룰로스상의 비-결합부위(free biding site)를, 인산 버퍼(Riedel deHaen, catalog number 30435)로 희석시킨 0.1% Tween 20(Sigma Cat P1379) 및 1% 분유(Dairy America)를 함유하는 차단(blocking) 버퍼로 4℃에서 밤새 포화시켰다. 블롯 스트립(blot strip)을 37℃에서 1시간 동안 항체(상기와 같이 0.1% Tween 20 및 1% 분유를 함유하는 인산 버퍼중 1:6500 희석액, pH 7.5)와 인큐베이션하였다.
항체와 인큐베이션한 후, 블롯을 PBS[인산 완충 인산나트륨 버퍼(Riedel deHaen, catalog number 30435)]로 매회 10분간 3회 세척하였다. 그후, 블롯 스트립을 실온에서 1시간 동안 적합한 이차 항체[코트 항 래트(전분자) HRP(Sigma cat # A-4914), 인산 버퍼(Riedel deHaen, catalog number 30435)로 희석시킨 0.1% Tween 20(Sigma Cat P1379) 및 1% 분유(Dairy America)를 함유하는 버퍼의 1:3000 희석액]와 함께 인큐베이션하였다. PBS로 수회 세척한 후, 블롯 스트립을 ECL 현상제(developer reagents)(Amersham RPN 2209)로 염색하였다.
ECL 시약에 블롯을 침지한 후, 블롯을 X-선 필름 FUJI Super RX 18x24에 노광시키고, FUJI-ANATOMIX 현상액 및 정착액(FUJI-X fix cat# FIXRTU 1 out of 2)으로 현상하였다. 이 처리후, 항체에 의해 결합된 단백질을 나타내는 밴드가 가시화되었다.
바이오리액터에서의 업스케일 배양 증식
22번 칼루스의 현탁 배양액을 액체 배지에서 형질전환 칼루스의 계대배양에 의해 수득하였다. 총 부피가 바이오리액터에 접종하기에 충분할 정도가 될 때까지 세포를 진탕 삼각 플라스크에서 배양하였다(실험과정에 기술된 바와 같이). 유전자 조작 유전자도입 당근 세포를 수 개월간 배양할 수 있고, 세포 수확물은 5 내지 7일의 사이클링에서 수득될 수 있다(데이터를 나타내지 않음). 배양 7일째에, 당근 세포에서 rh-GCD 생성량이 최고였을 때, 100 메쉬의 네트로 배양액을 통과시켜 세포를 채취하였다. 여과 또는 원심분리와 같이 당업계에 공지된 수단에 의해 세포를 채취할 수 있음을 유념해야 한다. h-GCD 정제 물질에 균일성을 제공하는 팩킹된 세포 케이크는 동결 온도에서 저장될 수 있다.
실시예 3
형질전환 당근 세포로부터 재조합 활성 hGCD 단백질의 정제
형질전환 당근 세포에 발현된 재조합 h-GCD는 배지중에 분비되지 않고 세포의 내막에 결합되는 것으로 밝혀졌다. 기계적 세포 파괴에 의해 불용성 막 잔유물에 결합된 rGCD가 남는다(도시하지 않음). 이어, rGCD를 온화한 계면활성제를 사용하여 용해시키고, 세포 잔유물 및 다른 불용성 성분으로부터 분리하였다. 가용성 효소를 실험과정에 설명된 바와 같이 양이온 교환 및 소수성 인터랙션 크로마토그래피 컬럼을 비롯한 크로마토그래피 기술을 사용하여 추가로 정제하였다.
불용성 GCD로부터 배지를 분리하기 위해, 웨트(wet) 중량 약 100g의 세포를 함유하는 동결 세포 케이크를 해동시키고, 이어 해동된 세포를 4℃에서 20분간 17000xg로 원심분리하였다. 불용성 물질 및 무손상 세포(intact cell)를 세척 버퍼(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 20 mM EDTA) 100 ㎖에서 재-현탁에 의해 세척한 다음 4℃에서 20분간 17000g로 원심분리에 의해 침전시켰다. r-GCD(재조합 인간 GCD)를 추출하고, 200 ㎖ 추출 버퍼(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 20mM EDTA, 1mM PMSF, 20mM 아스코르브산, 3.8g 폴리비닐폴리피롤리돈(PVPP), 1mM DTT 및 1% 트리톤(Triton)-x-100(Sigma))중에서 펠렛의 균질화에 의해 가용화시켰다. 이어, 균질액을 실온에서 30분간 진탕한 다음 4℃에서 20분간 17000g로 원심분리에 의해 정화시켰다. 펠렛을 버리고, 진한 시트르산을 첨가하여 상등액의 pH를 pH 5.5로 조정하였다. pH 조정후 생성된 혼탁물을 상술한 바와 동일한 조건하에 원심분리에 의해 정화시켰다.
다음과 같이 크로마토그래피 컬럼에 의해 추가의 정제를 실시하였다: 제 1 단계에서, XK 컬럼(2.6×20㎝)에 팩킹된, 25 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 5.5에서 평형화시킨 20 ㎖의 강한 양이온 교환 수지(Macro-Prep high-S support, 바이오-라드(Bio-Rad))상에 200 ㎖의 정화 추출물을 부하하였다. 이 컬럼은 전도도, pH 및 280nm에서의 흡광도를 모니터링하도록 하는 AKTA 프라임 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))으로 구성하였다. 샘플을 20 ㎖/분으로 부하한 다음, UV 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 컬럼을 유속 12 ㎖/분의 평형 버퍼(25 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 5.5)로 세척하였다. 200mM NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 rh-GCD를 예비-용리한 다음, 600mM NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 용리액을 수득하였다. 작업중에 수집한 분획을 효소 활성 에세이에 의해 모니터링하였고, 효소 활성를 표시하는 튜브(용리 피크에서)를 풀링(pooling)하였다. 풀링한 샘플을 5% 에탄올을 함유하는 물로 희석시키고(1:5), NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다.
도 3a는 이 정제 단계의 표준 작업(run)을 나타낸다. 작업중 수집된 분획을 도 3b에 표시된 바와 같이 효소 활성 에세이에 의해 모니터링하였고, 도 3c는 활성에 대해 에세이된 용리 분획의 쿠마시-블루(coomassie-blue) 염색을 나타낸다.
제 2 단계를 위해, rGCD를 함유하는 용리 분획을 이전 컬럼에서와 동일한 수지 10 ㎖로 팩킹된 제 2 XK 컬럼(1.6×20㎝)에 도포하였다. 이 컬럼내 수지를 5% 에탄올을 함유하는 20 mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0로 평형화하였다. 샘플을 부하한 후, 컬럼을 평형 버퍼로 세척하고, 용리 버퍼(20 mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0, 5% 에탄올 및 1M NaCl)에 의해 컬럼으로부터 rGCD를 용리시켰다. 도 3d는 이 정제 단계의 표준 작업(run)을 나타낸다. 작업중 수집된 분획을 도 3e에 표시된 바와 같이 효소 활성 에세이에 의해 모니터링하였고, 도 3f는 활성에 대해 에세이된 용리 분획의 쿠마시-블루 염색을 나타낸다.
제 3 정제 단계를 위해, 용리 단계에서 흡수 피크(absorbent peak)의 분획을 풀링하고 제 3 컬럼에 도포하였다. 제 3 정제 단계는 8 ㎖의 소수성 인터렉션 수지(TSK 겔, Toyopearl Phenyl-650C, 토소 코포레이션(Tosoh Corp.))가 팩킹된 XK 컬럼(1.6×20㎝)상에서 수행하였다. 수지를 5% 에탄올 함유 10 mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0중에서 평형화시켰다. 이전 컬럼으로부터의 GCD 용리 풀을 6 ㎖/분으로 부하한 다음 UV 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 평형 버퍼으로 세척하였다. 순수한 GCD를 50% 에탄올 함유 10 mM 시트르산 버퍼으로 용리시키고 풀링한 다음 -20℃에서 저장하였다.
도 4a는 이 정제 단계의 표준 작업(run)을 나타낸다. 작업중 수집된 분획을 효소 활성 에세이에 의해 모니터링하였고(도 4b), 도 4c는 활성도에 대해 에세이된 용리 분획의 쿠마시-블루 염색을 나타낸다.
처리된 세포의 배치식 정제에서, rGCD 단백질은 95% 이상의 수준으로 정제되었고; 제 1 및 제 3 단계만 수행할 경우, 순도는 약 80%의 수준으로 달성된다(결과 미도시).
생화학적 분석
정제 rhGCD의 동일성을 확인하기 위해, Mass-Spec Mass-Spec (MSMS) 분석을 수행하였다. 리더 펩티드(leader peptide) 및 표적 서열(targeting sequence)을 포함하는 발현 카세트의 DNA에 기초하여 얻은 결과는 예측된 아미노산 서열과 일치하는 단백질 서열의 적용범위는 49%인 것으로 나타났다.
복막 대식세포에서 재조합 rGCD 의 흡수율 및 활성도
당근에 유도된 rhGCD가 정확하게 글리코실화되어 표적 세포에 흡수됨으로써 고셔병의 치료에 유용한지를 결정하기 위해, 대식세포에 대한 rhGCD의 결합능 및 대식세포에 의한 rhGCD의 흡수능을 에세이하였다. 대식세포에 대한 rhGCD의 표적화는 만노스/N-아세틸글루코사민(Man/GlcNAc) 수용체에 의해 매개되며, 티오글리콜레이트-유도(elicited) 복막 대식세포를 사용하여 측정될 수 있다. 도 5에 나타낸 바와 같이, rGCD는 고수준으로 세포에 의해 흡수된다. 도 5a는 만노스 농도에 관한 본 발명에 따른 rGCD의 세포에 의한 흡수율을 나타낸다.
도 5a는 CerezymeTM(이 제제는 상술한 정제 단계중 제 1 및 제 3 단계만을 사용하여 80%의 순도로 제조되었다)에 필적하는 수준의 흡수율을 나타낸다.
도 5b 및 5c는 본 제제가 상술한 정제 단계의 3 단계 모두를 사용하여 95% 이상의 순도로 제조되었기 때문에, rGCD 흡수율이 CerezymeTM보다 높은 수준임을 나타낸다.
도 5c와 관련하여, 4 ㎎/㎖ 만난에 의해 억제되었을 경우, 총 활성도중 특정 활성도의 퍼센트는 확실히 현재 시판되는 제품에 대한 것보다 본 발명의 GCD(rGCD 또는 재조합 인간 GCD)에 대한 것이 다음과 같이 더 높다: GCD(CB-mix 1, 본 발명의 rGCD임) - 75%, Cerezyme - 65%.
또한, 도면에 나타낸 바와 같이, 만난의 첨가에 의해 세포에 의한 rGCD 결합은 확실히 억제되었다. 2 ㎎/㎖의 만난 농도에서, rGCD 결합은 50%까지 억제되었다.
이러한 결과는 글리칸 구조를 리모델링하지 않고도, 형질전환 당근 세포로부터 발현 및 정제된 rhGCD가 특히 Man/GlcNAc 수용체를 통해 대식세포를 표적하도록 흡수될 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 이 재조합 rhGCD는 효소적으로 활성이다.
도 5d는 rhGCD가 또한 웨스턴 블롯에서 항-GCD 항체에 의해 식별되는 것을 나타내는 것으로; 여기서 GCD 표준(레인당 5, 10 및 25 ng으로 도시함)은 시판되는 GCD(Cerezyme®)인 반면, rGCD는 본 발명에 따른 단백질을 의미한다.
실시예 4
독성학 시험
상기한 정제 방법에 따라 수득된 물질을 표준 독성학 시험 프로토콜에 따라 시험하였다(Guidance for Industry on Single Dose Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals, Center for Drug Evaluation and Research (CDER) PT 1 (61 FR43934, August 26,1996) and by ICH M3 (M) Non-clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals CPMP/ICH/286/95 modification, Nov 16 2000).
마우스에 다음과 같이 주사하였다. 1.8 mg/kg(임상 용량)을 먼저 투여한 다음 9-18 mg/kg을 투여하였다. 시험 그룹은 본 발명에 따른 rGCD(25 mM 시트레이트 버퍼, 150mM NaCl, 0.01% Tween 80, 5% 에탄올로 된 액체 담체중에서)을 수용하기 위한 6 마리의 마우스(ICR CD-1; 수컷 3 마리, 암컷 3 마리) 및 대조군으로써 담체로만 처리될 6 마리의 마우스를 포함하였다. 이어, 마우스를 14일간 관찰하고 안락사시켰다. 안락사이전에 죽은 마우스는 한마리도 없었다. 어느 마우스도 치료에 대한 유의적인 효과를 나타내지 않았다. 심각한 병리학적 소견 및/또는 체중의 변화가 어느 마우스에서도 관찰되지 않았다.
실시예 5
글리코실화 분석
이전 실시예에 관하여 기술된 바와 같이 생성된 rGCD 상에 존재하는 글리칸 구조에 대해 분석하였다. 이하에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 결과는 글리칸의 대부분은 말단 만노스 잔기 뿐만 아니라 고-만노스 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다. 유리하게, 이러한 고-만노스 생성물은 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌고, 따라서 활성화를 위한 추가의 단계가 필요치 않았다.
다음의 방법은 상기 제시된 실시예에 따라 생성된 재조합 hGCD의 글리코실화 구조를 결정하는데 사용되었다. 요약하면, N- 및 O-글리칸 모두에 대한 단당류 결합은 가수분해 및 GC-MS 방법을 사용하여 결정되었다. 이 방법은 펩티드에의 탄수화물의 결합 형태 및 당단백질의 일반적인 단당류 조성을 평가한다. 이전의 지식 및 각종 단당류들의 비율을 기초로 하여, 이 방법은 당단백질상의 글리칸의 형태를 제시할 수 있다. 이러한 정보는 단백질상에 존재하는 가능한 글리칸 구조를 평가하는데 중요하다.
다른 방법은 N-글리칸 개체의 올리고당 분석을 특징으로 하였다. 트립신과 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGaseF)에 의한 샘플의 부분표본의 분해(digestion) 및 글리칸의 퍼메틸화(permethylation) 이후 FAB-MS 및 MALDI-TOF MS를 수행하였다. 이 방법은 효소적으로 분해된 당단백질로부터 N-결합 탄수화물을 해리 및 분리하는데 사용된다. 분리된 글리칸 혼합물중 글리칸 개체의 질량을 측정하고, 이 질량을 데이터베이스로부터 그리고 단당류 조성 분석에 비추어 공지된 구조의 질량과 비교한다. 제시된 구조는 원천 유기체의 글리코실화 패턴에 또한 기초한다.
또 다른 방법은 트립신 및 PNGase F 처리 글리코펩티드의 환원적 제거(reductive elimination), 탈염 및 퍼메틸화후 O-글리칸 개체를 분석하는 것을 포함한다. O-글리칸은 PNGase F에 의해 방출되지 않으며, 따라서 펩티드에 결합된 나머지 글리칸은 대부분 O-결합 글리칸일 것이다. 이어 이들 글리칸을 환원적 제거에 의해 방출시킨 다음 질량을 분석한다.
단당류 조성 분석(이하에 요약함)은 식물 글리코실화의 특징인 헥소스, 헥사민 및 펜토스의 특징적 분포를 나타내었다. GlcNac 및 만노스의 비율은 특징적인 N-결합 구조가 우세한 글리칸 개체임을 제시한다.
상술한 바와 같이 생성된 hGCD로부터 N-글리칸의 질량 분석은, N-글리칸이 우세한 개체가 단당류 조성 Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2을 가지는 것을 나타낸다.
재료 및 방법
가스 크로마토그래피-질량 분석법(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS), 고속원자충격-질량분석법(Fast Atom Bombardment-Mass Spectrometry, FAB-MS) 및 딜레이드 익스트랙션-매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화 질량분석법(Delayed Extraction-Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight Mass- Spectrometry, DE-MALDI-TOF MS)의 조합법을 사용하여 분석하였다.
올리고당 분석을 위해, 트립신과 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGaseF)에 의한 샘플의 부분표본의 분해(digestion) 및 글리칸의 퍼메틸화(permethylation) 이후 FAB-MS 및 MALDI-TOF MS에 의해 N-결합 개체군을 분석하였다. 트립신과 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGaseF)에 의한 환원적 제거, 탈염 및 퍼메틸화후 O-글리칸 개체를 분석하였다. N- 및 O-글리칸 모두에 대한 단당류 결합은 가수분해, 유도체화 GC-MS 방법을 사용하여 결정되었다.
실험 설명
샘플
샘플 바이얼에 다음과 같이 고유 샘플 번호를 부여했다(표 1):

생성물
참고 번호

글루코세레브로시다제, 25mM 시트레이트 버퍼 pH 6.0, 0.01% Tween 80중에 0.8 ㎎/㎖의 지정된 농도로 각각 샘플 1㎖를 함유하는 4개의 튜브
62995
62996
62997
62998
샘플을 필요할 때까지 -10 내지 -30℃에서 저장하였다.
단백질 화학
무손상 ( intact ) 샘플의 투석
(0.8 ㎎/㎖의 지정된 농도로 단백질 1 ㎖를 함유하는) 하나의 바이얼을 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(10kDa 분자량 절단)내로 넣은 다음, 4℃에서 24시간에 걸쳐 물로 투석하였고, 여기서 물은 3번 교체하였다. 투석후, 샘플을 카세트로부터 제거하여 동결건조시켰다.
올리고당 스크리닝을 위한 무손상 샘플의 트립신 분해
10% 수성 암모니아를 사용하여 pH 8.4로 조정한 50mM 중탄산암모늄 버퍼에 상기한 투석 및 동결건조한 샘플을 재현탁한 다음, SOPs B001 및 B003에 따라 37℃에서 4시간 동안 TPCK 처리 트립신으로 분해하였다. 95℃에서 2분간 가열 블럭(heating block)에 배치하여 반응을 종결시키고, 동결건조하였다.
탄수화물 화학
펩티드 N- 글리코시다제 A 분해
당단백질 샘플로부터 트립신분해적으로 절단된 펩티드/글리코펩티드 혼합물을 37℃에서 15 시간동안 암모늄 아세테이트 버퍼(pH 5.5)에서 효소 펩티드 N-글리코시다제 A(PNGaseA)로 처리하였다. 이 반응을 동결-건조에 의해 중단시켰다. 생성된 생성물을 C18 Sep-Pak 카트리지를 사용하여 정제하였다.
환원적 제거
포텐셜 O-결합 글리코펩티드를 함유하는 Sep-Pak 분획을 0.05M 수산화나트륨중 10 ㎎/㎖ 소듐 보로하이드라이드의 용액에 용해시키고, 45℃에서 16시간동안 인큐베이션하였다. 빙초산을 첨가하여 반응을 종결시켰다
환원적으로 제거된 물질의 탈염
SOP B022에 따라 Dowex beads를 이용한 탈염을 수행하였다. 샘플을 컬럼상에 부하하고, 5% 수성 아세트산 4 ㎖를 사용하여 용리시켰다. 수집한 분획을 동결건조시켰다.
방출된 탄수화물의 퍼메틸화
환원적 제거에 의해 방출된 포텐셜 O-결합 글리칸 및 5% 수성 아세트산 Sep-Pak 분획에 용리한 N-결합 탄수화물을 수산화나트륨(NaOH)/요오드화메틸(MeI) 방법(SOP B018)을 사용하여 퍼메틸화하였다. 퍼메틸화된 N-결합 글리칸 혼합물의 일부를 FAB-MS 및 MALDI-TOF MS에 의해 분석하고, 나머지에 대해 결합 분석하였다.
N-결합 탄수화물의 결합 분석
유도체화
트립신 및 PNGase A 분해 또는 환원적 제거후 수득된 퍼메틸화 글리칸 샘플 혼합물을 가수분해시킨 다음(2M TFA, 120℃에서 2시간), 환원시켰다(2M NH4OH중 소듐 보로듀테리드(NaBD4), 실온에서 2시간, SOP B025). 빙초산중 메탄올의 혼합물(10:90)을 3회 첨가하여 보로듀테리드의 분해시 생성된 보레이트를 제거한 다음 동결건조시켰다. 그후, 아세트산무수물을 사용하여 샘플을 아세틸화시켰다(100℃에서 1시간). 아세틸화된 샘플을 클로로포름내로 추출에 의해 정제하였다. 이어, 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트(alditol acetate)를 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS)에 의해 조사하였다. 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트의 표준 혼합물 및 블랭크(blank)에 대해 또한 동일한 조건하에서 작업하였다.
가스 액체 크로마토그래피/질량 분석법( GC / MS )
헥산중에 용해시킨 유도체화 탄수화물의 부분표본(1㎕)에 대하여, 다음의 조건하에서 Autosystem XL 가스 크로마토그래피 및 Dell 데이터 시스템과 함께 Perkin Elmer Turbomass Gold 질량 분석계를 사용하여 GC/MS에 의해 분석하였다.
가스 크로마토그래피
컬럼: DB5
주입: 온-컬럼(On-column)
주입기 온도: 40℃
프로그램: 40℃에서 1분, 이어 70℃/분에서 100℃로, 100℃에서 1분간 유지, 이어 8℃/분에서 290℃, 마지막으로 290℃에서 5분간 유지.
캐리어 가스: 헬륨
질량 분석
이온화 전압: 70eV
획득 모드(Acquisition Mode): 스캐닝(Scanning)
질량 범위: 35-450 달톤(Daltons)
MS 분해능: 유니트(Unit)
무손상 글루코세레브로시다제의 당 분석
유도체화
500㎍의 글루코세레브로시다제와 등량의 부분표본을 내부표준으로서 아라비톨(Arabitol) 10㎍으로 동결건조시켰다. 이어, 이것을 80℃에서 밤새 메타노일화한 다음 질소하에 건조시켰다. 방출된 단당류를 메탄올, 피리딘 및 아세트산 무수물의 용액을 사용하여 재-N-아세틸화시키고, 질소하에서 다시 건조시킨 다음 SOP B023에 따라 트리메틸실릴(TMS) 유도체로 전환시켰다. TMS 유도체를 질소하에 부피를 감소시키고, 2㎖의 헥산에 용해시킨 다음 3분동안 초음파로 분해하였다. 이어, 이 샘플을 4℃에서 밤새 평형화시켰다. 아라비톨 10㎍을 함유하는 블랭크와 퓨코스, 크실로스, 만노스, 갈락토스, 글루코스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸뉴라민산 및 알비톨을 각각 10㎍씩 함유하는 표준 단당류 혼합물을 동시에 제조하였다. 이어, TMS 유도체를 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS)에 의해 조사하였다.
가스 액체 크로마토그래피/질량 분석법( GC / MS )
헥산중에 용해시킨 유도체화 탄수화물의 부분표본(1㎕)에 대하여, 다음의 조건하에서 Autosystem XL 가스 크로마토그래피 및 Dell 데이터 시스템과 함께 Perkin Elmer Turbomass Gold 질량 분석계를 사용하여 GC/MS에 의해 분석하였다.
가스 크로마토그래피
컬럼: DB5
주입: 온-컬럼(On-column)
주입기 온도: 40℃
프로그램: 90℃에서 1분, 이어 25℃/분에서 140℃로, 5℃/분에서 220℃로, 마지막으로 10℃/분에서 300℃, 및 300℃에서 5분간 유지
캐리어 가스: 헬륨
질량 분석
이온화 전압: 70eV
획득 모드(Acquisition Mode): 스캐닝(Scanning)
질량 범위: 50-620 달톤(Daltons)
MS 분해능: 유니트(Unit)
딜레이드 익스트랙션 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화 질량분석법( DE - MALDI-MS) 및 고속원자충격-질량분석법(FAB-MS)
Delayed Extraction(DE)과 함께 Voyager STR Biospectrometry Research Station Laser-Desorption Mass Spectrometer를 사용하여 MALDI-TOF 질량분석을 수행하였다.
건조시킨 퍼메틸화 글리칸을 메탄올:물(80:20)에 용해시키고 2,5-디하이드록시벤조산의 매트릭스를 사용하여 분석하였다. 브라디키닌(Bradykinin), 안지오텐신(Angiotensin) 및 ACTH를 외부 물질(external calibrant)로서 사용하였다.
대략 2500의 분해능을 가진 충분한 민감도로 4500 질량 범위에 대해 Vacc=8kV에서 동작하는 Scan's VG AutoSpecE 질량분석계상에서 양이온 고속원자충격 질량분석을 수행하였다. 30kV에서 동작하는 세슘이온 건(Caesium Ion Gun)을 사용하여 스펙트럼을 생성하였다. 오푸스 소프트웨어(Opus software)를 사용하는 VAX 데이터 시스템 3100 M76 상에 스펙트럼을 기록하였다.
건조시킨 퍼메틸화 글리칸을 메탄올에 용해시키고, 소스내로 삽입하기 전에 매트릭스로서 2-4㎕의 티오글리세롤로 미리 도말시킨 표적에 부하하였다.
결과 및 결론
글루코세레브로시다제의 TMS 당 분석
N-결합 올리고당 스크리닝
무손상 당단백질을 투석시키고 트립신 분해시킨 다음, 동결건조된 생성물을 PNGase A를 사용하여 분해하고, C18 Sep-Pak을 사용하여 정제하였다. 5% 수성 아세트산((N-결합 올리고당 함유) 분획을 퍼메틸화한 다음, 단편 이온에 대한 낮은 질량 범위의 유도체화 올리고당의 일부를 사용하여 FAB 질량 스펙트럼을 수득하였고, 분자 이온에 대한 높은 질량 범위의 유도체화 올리고당의 일부를 사용하여 DE-MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 수득하였다.
글루코세레브로시다제로부터 N- 글리칸의 분석
MALDI 스펙트럼에 존재하는 분자 이온 및 FAB 스펙트럼에 존재하는 우세한 단편 이온을 표 1에 열거하였다. 분자 이온 영역(Appendix III에 도시)은 m/z 1505.8(조성 Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2를 가진 구조에 대한 [M+Na]+ 준분자 이온(quasimolecular ion)과 일치)에서 우세한 시그널을 포함한다. 덜 강한 준분자 이온의 범위가 또한 복합 고-만노스 구조와 일치하게 검출되었다. 고-만노스 구조는 m/z 1579.8에서 Hex5.HexNAc2 내지 m/z 2193.0에서 Hex8.HexNAc2의 크기 범위에서 검출되었다. 복합 시그널은 m/z 1331.7(조성 Pent.Hex3.HexNAc2을 가진 구조에 대한 [M+Na]+ 준분자 이온과 일치)과 같이 덜 강하게 처리된 N-글루칸으로부터, 또는 예를 들어 m/z 1751.0(조성 Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3을 가진 구조에 대한 [M+Na]+ 준분자 이온과 일치), m/z 2375.4(조성 Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc4를 가진 구조에 대한 [M+Na]+ 준분자 이온과 일치) 및 m/z 2753.6(조성 Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc4를 가진 구조에 대한 [M+Na]+ 준분자 이온과 일치)과 같이 더 강한 N-글리칸으로부터 생성되었다.
FAB 질량 스펙트럼은 스펨트럼의 저 질량 영역에서 단편 이온에 의해 안테나 구조에 관한 정보를 제공한다(데이터 미도시). N-글리칸에서 비-환원 말단 단당으로서 헥소스(m/z 219에서) 및 HexNAc(m/z 260에서)을 동정하는 시그널이 검출되었다.
트립신 및 펩티드 N- 글리코시다제 A 분해후 글루코세레브로시다제(참조 번호 62996)의 퍼메틸화 스펙트럼에서 관찰된 질량

관찰된 시그널(m/z)
가능한 할당(Assignment)
저질량
219 Hex+
228 HexNAc+(-메탄올)
260 HexNAc+
고질량
1032.4 Pent.Hex3.HexNAc+
1171.5 Hex3.HexNAc2OMe+Na+
1299.6 m/z 1505.8로부터 퓨코스의 제거
1331.6 Pent.Hex3.HexNAc2OMe+Na+
1345.6 deoxyHex.Hex.HexNAc2OMe+Na+
1505.7 Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2OMe+Na+
1579.8 Hex5.HexNAc2OMe+Na+
1709.9 Pent.deoxyHex.Hex4.HexNAc2OMe+Na+
1750.9 Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3OMe+Na+
1783.9 Hex6.HexNAc2OMe+Na+
1989.0 Hex7.HexNAc2OMe+Na+
1997.0 Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc4OMe+Na+
2027.0 할당되지 않음
2099.0 할당되지 않음
2130.0 Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc3OMe+Na+
2193.1 Hex8.HexNAc2OMe+Na+
2375.2 Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc4OMe+Na+
2753.4 Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc4OMe+Na+
달리 지정하지 않는 한, 컬럼 하나에서 모든 질량은 모노이소토픽(monoisotopic)이다. 소프트웨어는 특히 1700Da 이상의 질량에 대해 13C 동위원소 피크에 질량수를 할당하기 때문에, 질량수는 처리안한(raw) 데이터를 직접 나타내지 않을 수 있다.
글루코세레브로시다제로부터 N- 글루칸의 결합 분석
PNGase A 분해, Sep-Pak 정제 및 퍼메틸화 후 N-결합 탄수화물에 대해 결합 분석을 수행하였다.
유도체화 시약으로부터 발생한 일부 불순물 피크를 가진 복잡한 크로마토그램이 수득되었다. 표준 혼합물과의 체류 시간 및 스펙트럼 비교에 의해 표 3에 열거한 당 함유 피크의 잠정 할당이 가능하였다.
트립신 및 펩티드 N- 글리코시다제 A 분해후 글루코세레브로시다제(참고번호 62996) GC-MS 분석에서 그의 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트로서 검출된 각종 결합 단당류의 체류 시간
관찰된 화합물 글루코세레브로시다제(62996)의 체류시간(분)
말단 크실로스 10.41
말단 퓨코스 10.84
말단 만노스 12.29(주요)
말단 갈락토스 12.55
2-결합 만노스 13.40
4-결합 글루코스 13.58
2,6-결합 만노스 14.91
3,6-결합 만노스 15.08
2,3,6-결합 만노스 15.87
4-결합 GlcNAc 16.73
3,4-결합 GlcNAc 17.59
4.3 O-결합 올리고당 스크리닝
트립신 및 PNGase A 분해후 글루코세레브로시다제의 Sep-Pak 정제로부터의 60% 2-프로판올 분획(포텐셜 O-결합 글리코펩티드 분획)에 대해 환원적 제거를 수행하였다. 반응의 종결후 샘플을 탈염시킨 다음, 보레이트 제거후 퍼메틸화하였다. 단편 이온에 대한 저 질량 범위의 유도체화 올리고당의 일부를 사용하여 FAB 질량 스펙트럼을 수득하였고, 분자 이온에 대한 고 질량 범위의 유도체화 올리고당의 일부를 사용하여 DE-MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 수득하였다. O-결합 글리칸의 존재와 일치하는 시그널은 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
글루코세레브로시다제로부터 O- 글리칸의 결합 분석
퍼메틸화후 환원적 제거의 생성물에 대해 결합 분석을 수행하였다. 전형적인 O-결합 글리칸의 존재와 일치하는 시그널은 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
도 6은 포유동물의 세포인 CHO(차이니즈 햄스터 난소, Chinese hamster ovary) 세포로부터 수득된 GCD( CerezymeTM)와 당근 세포로부터의 본 발명의 GCD의 비교로서 몇 가지 예시적인 글리칸 구조를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, CerezymeTM의 경우 노출 만노스 잔기를 수득하기 위해서는 이들 구조를 리모델링할 필요가 있다. 대조적으로, 본 발명에 따라 식물 세포로부터 수득된 GCD의 경우 예를 들어 글리코실라제로 추가로 처리할 필요없이 노출 만노스 잔기가 곧바로 수득된다.
도 7은 rGCD에서 발견되는 주요 글리칸 구조를 나타낸다. 도 7은 a) 당근 세포 현탁액에서 발현된 hGC상에서 발견된 주된 올리고당 개체(1505.7 m/z); b) 전형적인 N-결합 코어; c) 퓨코실화 식물 N-결합 코어의 제시된 구조들을 나타낸다. N-결합 글리칸은 아스파라긴을 통해 및 도면의 오른에 있는 GlcNac(GN) 잔기의 환원성 종단(reducing end)을 통해 단백질에 커플링된다. 포유동물의 구조는 전형적으로 알파 (1-6) 글리코시드 결합을 사용하는 반면, 퓨코스 잔기가 코어 구조의 일부일 수 있는 N 식물 글리코실화 패턴은 알파 (1-3) 글리코시드 결합을 사용하여 제 1 GlcNac에 결합하였다.
도 8a-8d는 본 발명에 따른 rGCD 단백질상에서 검출되는 N-글리칸의 모든 가능한 구조를 나타낸다.
확인된 지배적인 글리칸 구조는 완두, 벼, 옥수시 및 다른 식용 식물로부터의 식물 당단백질에서 발견되는 코어 글리칸 구조이다. 이 구조는 코어 크실로스 잔기 뿐만 아니라 코어 알파-(1,3)-퓨코스를 포함한다. 바도르(Bardor) 등(33)에 의해 이루어진 연구에 의해 비알레르기 헌혈자중 50%가 그들의 혈청에 코어 크실로스에 대한 특이 항체를 가지고 있고, 25%는 코어 알파-(1,3)-퓨코스에 대한 특이 항체를 가지고 있는 것으로 나타내었다. 그러나, 이러한 항체가 식물-유래 생물약제학적 당단백질의 사용을 제한할 지에 대해서는 여전히 연구되고 있다.
상술한 바와 같이 생성된 hGCD의 소수의 글리칸 개체는 주로 Hex4HexNAc2 내지 Hex8HexNAc2의 고-만노스 구조였다. 복합 구조중 Pent.deoxyHex.Hex4.HexNAc3 및 Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc3과 같은 구조를 나타내었다. Pent.Hex3.HexNAc2가 더 적은 개체에서 검출되었다.
주요 말단 단당류는 부분 처리된 복합 구조 및 고-만노스 구조의 존재와 일치하는 헥소스(만노스 또는 갈락토스) 및 N-아세틸헥소사민이다.
O-결합 올리고당 스크리닝과 관련하여, 전형적인 O-결합 글리칸과 일치하는 시그널은 관찰되지 않았다. 이들 결과가 포유동물의 배양계에서 생성된 재조합 GCD 및 천연 GCD를 비롯하여 다른 세포계로부터의 GCD의 공지된 글리코실화와 일치하는 것과 같이, GCD는 O-결합 올리고당을 갖지 않는 것으로 당업계에 알려져 있다. 그러나, 단당류의 조성물에서, 아라비노스와 일치하는 시그널이 관찰되었다.
본 발명과 관련한 가장 중요한 점은 hGCD 단백질 N-글리칸 조성 분석에서 대부분의 N-글리칸이 만노스 잔기로 종결되는 것으로 나타났다는 것이다. 이것은 대식세포 만노스 수용체에 의한 치료적 hGCD의 흡수를 돕는 만노스 종결 N-글리칸에 대한 요구에 부합하는 것이다. 그러나, 천연 GCD나 포유동물 세포에서 생성된 재조합 GCD 모두는 고-만노스가 아니었다. 따라서, 본 발명은 상술한 바와 같이 생성된 단백질과는 달리 이들 단백질이 만노스 당으로 종결되도록 변형시켜야 하는 시판되는 hGCD 단백질의 커다란 결점을 해소한다.
실시예 6
본 발명에 의한 치료
본 발명에 따라 생성된 재조합 단백질은 바람직하게는 식물 세포 배양에 의해 생성된 적절히 글리코실화된 단백질, 바람직하게는 예를 들어 리소좀 효소 및/또는 고-만노스 글리코실화 단백질을 포함한다.
본 명세서에서의 바람직한 일례에 따라, 본 발명에 따라 생성된 단백질은 예를 들어 리소좀 저장 질환과 같은 리소좀-연관 질환의 치료에 적합하다.
치료방법은 임의로 및 바람직하게 (a) 형질전환 식물 뿌리 세포로부터 정제되고, 리소좀 효소에 비정상적 결함이 있는 세포를 효율적으로 표적시킬 수 있는 생물학적으로 활성인 재조합 형태의 리소좀 효소를 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 생물학적으로 활성인 재조합 효소는 추가(appended) 올리고당상에 노출 말단 만노스 잔기를 가지며; (b) 대상에게 생물학적으로 활성인 재조합 리소좀 효소, 또는 이 생물학적으로 활성인 재조합 리소좀 효소를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 투여한다. 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 재조합 고-만노스 리소좀 효소는 본 발명의 숙주세포에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게도, 숙주세포는 당근 세포이다.
"포유동물 대상" 또는 "포유동물 환자"란 유전자 치료가 필요한 임의의 포유동물을 의미하는 것으로, 사람, 소, 말, 개 및 고양이 대상, 바람직하게는 사람 대상을 포함한다.
용어 "치료"는 또한 병적상태를 치료하거나 이러한 상태의 발생을 예방하여 병적상태 및/또는 하나 이상의 그의 증상을 개선 또는 경감하는 것을 포함한다.
다른 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 리소좀 효소는 노출 만노스 잔기를 가진 적어도 하나의 올리고당 사슬을 포함하는 고-만노스 효소일 수 있다. 이 재조합 효소는 표적 부위에서 표적 세포상의 만노스 수용체와 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게도, 재조합 리소좀 효소는 자연발생 리소좀 효소가 가진 표적 세포에 대한 상응하는 친화력에 비해, 표적 세포에 대해 증가된 친화력을 가진다. 따라서, 각각의 투여량은 GCD에서 비정상적 결함을 가진 세포의 유효 표적화에 따라 달라지며, 이러한 형태의 GCD의 각각의 투여량은 치료 효과를 달성하는 비슷한 방식으로 달리 투여되는 자연발생 GCD의 투여량에 보다 실질적으로 적다.
본 발명의 바람직한 일례에 따라, 단백질은 리소좀 저장 질환의 치료에 적합하고, 따라서 본 발명은 또한 이러한 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 리소좀 저장 질환은 세포의 리소좀내에서 당지질 또는 다당류 폐기물을 파괴하는 효소를 코딩하는 유전자의 결함으로 인해 발생하는 40 개 이상의 장애로 이루어진 그룹이다. 효소적 생성물, 예를 들어 당 및 지질은 이어 신규 생성물으로 재순환될 수 있다. 이들 장애는 각각 리소좀내 효소의 농도에 영향을 미치는 유전적 보통염색체(inherited autosomal) 또는 X-결합 열성 형질로부터 발생한다. 일반적으로, 감염 개체의 세포 및 조직에서 감염 효소는 생물학적 또는 기능적 활성이 없다. 이러한 질병에서, 효소 기능의 결함은 지질 또는 탄수화물 기질을 체내 세포 리소좀에 점진적이고 전신적으로 퇴적하여, 결국에 기관 기능의 손상 및 사망에 이르게 한다. 리소좀 저장 질환의 유전 병인, 임상 징후, 분자생물학 및 가능성이 스크리버(Scriver) 등의 문헌[Scriver et al. eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7th Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995)]에 상세히 설명되어 있다.
리소좀 저장 질환 (및 그와 연관이 있는 결핍 효소)의 예로는 파브리병(α-갈락토시다제), 파아버병(세라미다제), 고셔병(글루코세레브로시다제), Gml 강글리오시드증(β-갈락토시다제), 타이-삭스병(β-헥소사미니다제), 니이만-픽병(스핑고미엘린분해효소), 쉰들러병(Schindler disease)(α-N-아세틸갈락토사미니다제), 헌터 증후군(이듀로네이트-2-설파타제), 슬라이 증후군(Sly syndrome)(β-글루쿠로니다제), 헐러(Hurler) 및 헐러-샤이에 증후군(Hurler-Scheie syndrome)(이듀로니다제), 및 I-Cell/산 필립포 증후군(I-Cell/San Filipo syndrome)(만노스 6-포스페이트 전달체)이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
고셔병은 사람에 있어서 가장 통상적인 리소좀 저장 질환으로, 아시케나지 유대인(Ashkenazi Jewish) 집단에서 가장 빈번히 마주치게 된다. 미국에서 약 5,000 내지 10,000명이 이 질병으로 고생하고 있다[Grabowski, Adv. Hum. Genet. 21: 377-441 (1993)]. 고셔병은 글루코세레브로시다제(hGCD; 글루코실세라미다제)의 결핍으로 인해 발병한다. 이러한 결핍으로 인해 골수, 지라 및 간의 세망내피 세포(reticuloendothelial cell)에 효소 기질인 글루코세레브로시드가 축적되고, 이로써 골수 확장 및 뼈의 노화와 같은 심각한 골격 합병증 및 또한 지라기능항진증, 간비대, 저혈소판증, 빈혈 및 폐 합병증이 발병한다[Grabowski, (1993) ibid.; Lee, Prog. Clin. Biol. Res. 95: 177-217 (1982)].
더욱 특히, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD), 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, α-L-이듀로니다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택될 수 있다. 바람직하게도, 치료 질병이 고셔병인 경우, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 리소좀 효소는 글루코세레브로시다제(GCD)이다.
본 발명의 단백질은 약학 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 일면에 따라, 그의 활성성분으로서 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본 명세서에 사용된 "약학 조성물"은 전형적인 약물, 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 본 명세서에 기술된 하나 이상의 활성성분(예컨대 재조합 단백질)의 제제를 의미한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 단백질 또는 세포의 투여를 촉진하는 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 널리 알려진 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 혼합(mixing), 용해(dissloving), 과립화(granulating), 당의정-제조(dragee-making), 분말화(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포착화(entrapping) 또는 동결건조(lyophilizing) 방법에 의해 제조될 수 있다.
바람직한 일례로, 용어 "약제학적으로 허용되는"이란 동물, 특히 사람에서의 사용에 대해 연방 또는 주정부의 관리 기관에 의해 허가되었거나 미국약전 또는 다른 일반적으로 용인된 약전에 기술되어 있는 것을 의미한다. 이후에서, 어구 "생리학적으로 적합한 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 서로 혼용가능하게 사용되며, 유기체에 유의적인 자극을 일으키지 않으며 생물학적 활성 및 투여되는 컨쥬게이트의 특성을 파괴하지 않는 허용된 담체 또는 희석제를 의미한다.
용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 말한다. 이러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 야채 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 비롯한 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약학조성물이 정맥내로 투여되는 경우, 바람직한 담체는 물이다. 특히 주사액의 경우, 식염수 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실라카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 필요에 따라, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수도 있다. 이들 조성물은 용액제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 통상의 결합제 및 담체, 예컨대 글리세리드와 함께 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제제는 만니놀, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 보통의 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예가 이. 더블유. 마틴(E. W. Martin)에 의해 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적합한 투여형을 제공할 수 있도록 적합한 양의 담체와 함께 치료학적 유효량의 단백질(바람직하게는 정제 형태로)을 포함할 것이다. 제형은 투여 모드에 적합해야 한다.
본 명세서에서 용어 "부형제"는 활성성분의 프로세스(process) 및 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 및 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 야채유 및 폴리에틸렌 글리콜의 형태가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
활성성분의 제형화 및 투여에 대한 추가적 기술이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에서 찾아 볼 수 있고, 이 문헌은 본 명세서에 충분히 설명된 바와 같이 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 명세서에 기술된 약학조성물은 또한 적합한 고체 또는 겔상의 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
적합한 투여 경로로는 예를 들어 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사 뿐만 아니라 근육내, 피하 및 골수 주사를 포함하여 경구, 직장, 경점막, 경피, 장관내 또는 비경구 전달이 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학조성물은 약제학적으로 사용가능한 제제내로 활성성분의 진행(processing)을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여경로에 따라 달라진다.
주사용의 경우, 본 발명의 활성성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 이를테면 핸크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염 완충액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 침투제가 제형화에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
경구 투여의 경우, 활성성분은 예를 들어 GCD와 같은 본 발명에 따라 단백질을 생성하는 모든 세포의 투여를 통해 임의로 제형화될 수 있다. 활성성분 및/또는 세포를 당업계에 널리 공지되어 있는 약제학적으로 허용되는 담체와 배합함으로써 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 활성성분을 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 용액제, 겔, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로 제형화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고형 부형제를 사용하고, 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당과 같은 충진제; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트(gum tragacanth), 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카보메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 폴리머이다. 필요에 따라, 붕괴제(disintegrating agent), 이를테면 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염이 첨가될 수 있다.
적합한 코팅에 의해 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔(carbopol gel), 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있는 진한 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량이 상이한 배합물임을 나타내거나 식별하기 위해, 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학조성물로는 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 제조된 밀봉형 연성 캡슐제 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐제(push-fit capsule)가 포함된다. 압입형 캡슐제는 락토스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 활성성분을 함유할 수 있다. 연성 캡슐제의 경우, 활성성분은 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.
구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지( lozenge)의 형태를 취할 수 있다.
흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성성분은 통상적으로 적합한 추진제(propellant), 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용함으로써 가압팩(pressurized pack) 또는 분무기(nebulizer)로부터 통상 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위(dosage unit)는 정량(metered amount)을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기(inhaler) 또는 취입기(insufflator)로 사용하기 위해, 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재(powder base)와 활성성분의 분말 믹스(powder mix)를 함유하는 예를 들어 젤라틴의 캡슐제 및 카트리지로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기술된 활성성분은 비경구 투여를 위해 예를 들어 급속정주(bolus injection) 또는 지속정주(continuous infusion)에 의해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 임의로 첨가되는 방부제와 함께 단위 투여형, 예를 들어 앰플(ampoule) 또는 다중투여 용기(multidose container)로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁제, 용액제 또는 유제일 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제(formulatory agent)를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약학조성물은 활성 제제의 수용액을 수-가용성 형태로 포함한다. 또한, 활성성분의 현탁제는 적합한 유성의 주사 현탁제으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 적합한 안정화제, 또는 활성성분의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액제를 제조가능케 하는 제제를 함유할 수 있다.
바람직한 일례로, 조성물은 통상법에 따라 사람에게 정맥내 투여하기 위해 만든 약학조성물로서 제형화될 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여하기 위한 약학조성물은 멸균 등장성 수성 완충액(sterile isotonic aqueous buffer)이다. 일반적으로, 제제는 단위 투여형, 예를 들어 활성제의 양을 표시한 앰플 또는 사체트(sachette)와 같은 밀폐 용기중의 건식 동결건조 분말(drylyophilized powder) 또는 무수 농축물(water free concentrate)로서 별도로 또는 함께 혼합하여 공급된다. 조성물이 주입(infusion)에 의해 투여될 경우, 약제등급(pharmaceutical grade)의 멸균수 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀(bottle)을 사용하여 분배할 수 있다. 조성물이 주사(injection)에 의해 투여될 경우, 제제가 투여하기 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같이 음이온에 의해 형성된 염들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같이 양이온에 의해 형성된 염들이 포함된다.
본 발명의 활성성분은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기제를 사용하여 좌제 또는 정체관장제와 같은 직장형 조성물로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기술된 약학조성물은 또한 겔상(gel phase) 담체 또는 부형제의 적합한 고체를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
국소 경로가 임의로 수행될 수 있고, 국소용 담체에 의해 지원된다. 국소 담체는 일반적으로 활성성분의 국소 투여에 적합한 것으로, 당업계에 공지된 임의의 이러한 물질을 포함한다. 국소 담체는 목적하는 형태, 예를 들어 액체 또는 비액체 담체, 로숀, 크림, 페이스트, 겔, 파우더, 연고, 용매, 액체 희석제, 드롭(drop) 등으로 조성물을 제공하도록 선택되며, 자연발생 또는 합성 기원의 물질로 구성될 수 있다. 선택된 담체는 반드시 국소 제형의 활성제 및 다른 성분에 악영향을 미치지 않으며, 국소 제형의 모든 성분에 대해 안정해야한다. 본 명세서에 사용하기에 적합한 국소 담체의 예로는 물, 알콜 및 다른 비독성 유기 용매, 글리세린, 광유, 실리콘, 바셀린, 라놀린, 지방산, 야채유, 파라벤, 왁스 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 바람직한 제형은 무색 무취의 연고, 액체, 로션, 크림 및 겔이다.
연고는 반고형 제제로서, 전형적으로 바셀린 또는 다른 석유 파생물(petroleum derivative)을 기본으로 한다. 당업자들에 의해 인지될 수 있는, 사용가능한 구체적인 연고 기재는 최적의 활성성분 전달을 제공하며, 바람직하게는 다른 목적하는 성질, 예를 들어 완화성 등을 제공하는 것들이다. 다른 담체 또는 비히클과 같이, 연고 기재는 불활성이고 안정해야하고, 염증을 일으키지 않고 감작시키지 않아야 한다. 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995), 1399-1404]에 설명된 바와 같이, 연고 기재는 네 가지 부류로 분류될 수 있다: 유성 기재(oleaginous base); 유화가능 기재(emulsifiable bases); 에멀젼 기재(emulsion bases); 및 수-가용성 기재(water-soluble bases). 유성 연고 기재로는 예를 들어 야채유, 동물에서 수득한 지방, 및 석유에서 수득한 반고형 탄화수소가 포함된다. 흡수 연고 기재(absorbent ointment base)로도 알려진 유화가능 연고 기재는 물을 거의 또는 전혀 함유하지 않으며, 그의 예로 하이드록시스테아린 설페이트, 무수 라놀린 및 친수성 바셀린이 포함된다. 에멀젼 연고 기재는 유중수(W/O) 에멀젼 또는 수중유(O/W) 에멀젼이고, 그의 예로 세틸 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린 및 스테아르산이 포함된다. 바람직한 수-가용성 연고 기재는 가변 분자량의 폴리에틸렌 글리콜로부터 제조되며; 또한 기준(reference)이 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy for further information]에 따라 제조될 수 있다.
로션은 마찰없이 피부 표면에 적용될 수 있는 제제로서, 전형적으로 액상 또는 반액상 제제이며, 활성성분을 비롯한 고체 미립자가 물 또는 알콜 기재에 존재한다. 로션은 통상 고체의 현탁액이며, 수중유형의 액상 유성 에멀젼을 포함할 수 있다. 로션은 더 많은 유체 조성물을 용이하게 적용할 수 있기 때문에 넓은 체 표면적(body area)의 치료에 바람직한 제형이다. 일반적으로 로션중의 불용성 물질은 미세하게 분쇄될 필요가 있다. 로션은 전형적으로 피부와 접촉하는 활성제, 예를 들어 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 등을 국재(localizing) 및 보유(holding)는데 유용한 활성성분 뿐만 아니라 더 잘 분산될 수 있게 하는 현탁화제를 함유할 것이다.
선택된 활성성분을 함유하는 크림은 당업계에 공지된 바와 같이 수중유 또는 유중수의 점성 액체 또는 반고형 에멀젼이다. 크림 기재는 수세가능하며(water-washable), 오일 상, 유화제 및 수성 상을 함유한다. 때때로 "내(internal)" 상으로도 불리는 오일 상은 일반적으로 바셀린 및 바셀린 또는 스테아릴 알콜과 같은 지방 알콜로 구성되며; 반드시 그럴 필요는 없지만, 수성 상은 통상 오일 상의 부피 보다 크며, 일반적으로 습윤제(humectant)를 함유한다. 크림 제형에서 유화제는 앞의 문헌[Remington]에 설명된 바와 같이, 일반적으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양성 계면활성제이다.
겔 제형은 두피에 적용하기에 바람직하다. 국소 활성성분 제형 분야의 종사자들에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 겔은 반고형의 현탁형(suspension-type) 시스템이다. 단상 겔은 담체 액체를 통해 실질적으로 균일하게 분배되는 유기 고분자를 함유하며, 전형적으로는 수성이고, 바람직하게는 알콜 및 임의로 오일을 함유한다.
당업자들에게 공지된 각종 첨가제가 본 발명의 국소 제형에 포함될 수 있다. 예를 들어, 용매는 특정 활성성분 물질을 용해시키는데 사용될 수 있다. 다른 임의의 첨가제로는 피부 침투 촉진제, 유백제, 항산화제, 겔화제, 증점제, 안정화제 등이 포함된다.
본 발명의 국소 조성물은 또한 통상의 피부형 패치(patch) 또는 제품을 사용하여 피부에 전달될 수 있고, 여기서 활성성분의 조성물은 피부에 부착되어 약물 전달 장치로서의 역할을 하는 적층 구조내에 함유된다. 이러한 구조에서, 활성성분의 조성물은 상부 백킹 층(backing layer) 아래에 있는 층 또는 "저장기(reservoir)"에 함유된다. 적층 구조는 단일 저장기를 가질 수 있거나, 복수의 저장기를 가질 수 있다. 하나의 일례로, 저장기는 활성성분의 전달동안 피부에 시스템을 부착할 수 있도록 하는 약제학적으로 허용되는 접촉성 접착제 물질의 중합 매트릭스를 포함한다. 적합한 피부 접촉성 접착제 물질의 예로는 폴리에틸렌, 폴리실록산, 폴리이소부틸렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 선택되는 특정의 중합 접착제는 특정 활성성분, 비히클 등에 따라 달라질 것이며, 즉 접착제는 활성성분-함유 조성물의 모든 성분에 적합(compatibe)해야 한다. 다르게는, 활성성분-함유 저장기 및 피부 접촉성 접착제는 별도 및 별개의 층으로서 존재하며, 이 경우 상술된 바와 같은 중합 매트릭스일 수 있거나 액체 또는 하이드로겔 저장기일 수 있거나 일부 다른 형태를 취할 수 있는 저장기 아래에 접착제가 위치한다.
장치의 상부 표면이 되는 이들 적층물의 백킹층은 적층 구조의 일차적인 구조성분으로서 작용하며, 유연성이 풍부한 장치를 제공한다. 백킹 물질로 선택되는 물질은 활성성분 및 활성성분-함유 조성물의 다른 임의의 성분에 대해 실질적으로 불침투성이어서 장치의 상부 표면을 통해 어느 성분도 손실되지 않도록 선택되어야 한다. 백킹층은 활성성분의 전달동안 피부에 수분을 보충하는 것이 바람직한 지에 따라 차단성(occulsive) 또는 비차단성(non-occulsive)일 수 있다. 바람직하게도, 백킹은 바람직하게는 가요성 엘라스토머 물질의 시트 또는 필름으로 만들어진다. 백킹층에 적합한 폴리머의 예로는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리에스테르가 포함된다.
저장중 및 사용전에는, 적층 구조물은 릴리스 라이너(release liner)를 포함한다. 사용하기 직전에, 이 층은 시스템을 피부에 부착시킬 수 있도록 장치로부터 제거하여 그의 기저면(활성성분 저장기 또는 별도의 접촉성 접착제 층)을 노출시킨다. 릴리스 라이너는 활성성분/비히클 불침투성 물질로 제조되어야 한다.
이러한 장치는 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여, 예를 들어 접착제, 활성성분 및 비히클의 유체 혼합물을 백킹층에 캐스팅(casting)한 다음 릴리스 라이너를 적층함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 접착제 혼합물을 릴리스 라이너위에 캐스팅한 다음 백킹층을 적층할 수도 있다. 다르게는, 활성성분 저장기를 활성성분 또는 부형재의 부재하에 제조한 다음 활성성분/비히클 혼합물중에 "침지(soaking)"하여 부하(load)시킬 수 있다.
본 발명의 국소 제형과 같이, 이들 적층 시스템의 활성성분 저장기내에 담긴 활성성분 조성물은 다수의 성분을 함유할 수 있다. 일부의 경우, 활성성분은 "니트(neat)하게", 즉 추가의 액체의 부재하에 전달될 수 있다. 그러나, 대부분의 경우, 활성성분은 적합한 약제학적으로 허용되는 비히클, 전형적으로 용매 또는 겔에 용해, 분산 또는 현탁될 것이다. 존재할 수 있는 다른 성분으로는 방부제, 안정화제, 계면활성제 등이 포함된다.
고-만노스 리소좀 효소와 같은 본 발명의 단백질은 바람직하게는 이를 필요로 환자에게 유효량으로 투여되는 것을 유념해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 "유효량"는 선택된 결과를 달성하는데 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 리소좀 저장 질환의 치료에 유용하게 선택될 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 약학조성물은 의도하는 목적을 달성하는데 유효한 양으로 활성성분이 함유된 조성물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 치료학적 유효량은 치료할 대상의 생명을 연장하거나 질병의 증상을 예방, 경감 또는 약화시키는데 효과적인 활성성분의 양을 의미한다.
치료학적 유효량은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 설명에 비추어 당업자들에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 임의의 제제의 경우, 치료학적 유효량 또는 용량은 동물에서 활성 에세이로부터 먼저 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 활성 에세이에 의해 결정되는 IC50을 포함하는 순환(circulating) 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 결정될 수 있다.
본원에 기술된 활성성분의 치료 효능 및 독성은 실험 동물에서 표준 약제학적 방법에 의해, 예를 들어 해당 활성 성분에 대한 IC50 및 LD50(시험동물의 50%를 치사시키는 치사량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이들 활성 에세이 및 동물 연구에 의해 수득된 데이터는 사람에게 사용하기 위한 용량 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전 장애의 치료에 적합한 치료학적 유효 투여량은 이들 질환의 동물 모델을 사용한 실험으로부터 결정될 수 있다.
투여량은 사용되는 투여 경로 및 사용하는 투여형태에 따라 변할 수 있다. 적합한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태를 고려하여 의사 개인에 의해 선택될 수 있다. (참조예. Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).
투여의 양 및 간격은 조절작용을 유지하기에 충분한 플라즈마 수준[최소유효농도(minimal effective concentration, MEC)라 불림]을 활성 부위에 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 이 MEC는 각각의 제제에 따라 달라질 것이나, 전체 동물 데이터로부터 임의로 산출될 수 있다.
투여 간격은 또한 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 제제는 시간의 10-90%동안, 바람직하게는 30-90%, 가장 바람직하게는 50-90%동안 상기 플라즈마 수준을 유지하는 처방을 사용하여 임의로 투여될 수 있다.
치료할 상태의 중증도 및 반응도에 따라, 투여는 수일 내지 수주 내내 또는 병을 고치거나 증상이 감퇴될 때까지 치료하는 과정으로서 상기한 저속 방출(slow release) 조성물의 단일 투여일 수 있다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 활성성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 담을 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치, 이를테면 FDA에 의해 승인된 키트(kit)로 제시될 수 있다. 발포(blister) 팩과 같은 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 포일(foil)을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투약 설명서가 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 또한 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 행정기관에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태 또는 인간 또는 가축 투여에 대한 기관의 승인을 반영한다. 이러한 통지서는 예를 들어 처방약에 대한 미국 식품의약청의 승인 라벨이거나 승인된 제품 전단일 수 있다. 적합한 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조하여 적절한 용기에 넣고 처방된 상태를 써넣은 라벨을 붙일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절하다"는 병의 진행을 실질적으로 억제, 감소 또는 반전시키는 것, 상태 또는 질환의 임상적 증상을 실질적으로 개선시키는 것, 또는 상태 또는 질환의 임상적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함된다. 따라서, "조절자(modulator)"는 질환 또는 상태를 조절할 수 있는 제제를 포함한다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006

기타 일례
본 발명은 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 의도된 것이 아님을 이해하여야 한다.
참고 문헌
Figure pat00007
Figure pat00008
SEQUENCE LISTING <110> Protalix Ltd. <120> PRODUCTION OF HIGH MANNOSE PROTEINS IN PLANT CULTURE <130> <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> ER signal peptide <400> 1 Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ala Glu Phe 20 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Vacuolar targeting signal from Tobacco chitinase A <400> 2 Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 1 5 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 cagaattcgc ccgcccctgc a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 ctcagatctt ggcgatgcca ca 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 5 ctcagaagac cagagggct 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 6 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taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcatcgcca g 1491 <210> 8 <211> 497 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val 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acid sequence encoding the vacuolar targeting sequence <400> 11 gatcttttag tcgatactat g 21 <210> 12 <211> 167 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of the Agrobacterium tumefaciens terminator <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 taatttcatg atctgttttg ttgtattccc ttgcaatgca gggcctaggg ctatgaataa 60 agttaatgtg tgaatgtgtg aatgtgtgat tgtgacctga agggatcacg actataatcg 120 tttataataa acaaagactt tgtcccaaaa accccccccc cngcaga 167 <210> 13 <211> 2186 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding high mannose human glucocerebrosidase (GCD) <220> <221> misc_feature <222> (2181)..(2181) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 ttttcacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac 60 ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa 120 ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctacc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc 180 acgaggaaca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga 240 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ctgctgtggg cttcctggag acaatctcac ctggctactc cattcacacc 1980 tacctgtggc atcgccaaga tcttttagtc gatactatgt aatttcatga tctgttttgt 2040 tgtattccct tgcaatgcag ggcctagggc tatgaataaa gttaatgtgt gaatgtgtga 2100 atgtgtgatt gtgacctgaa gggatcacga ctataatcgt ttataataaa caaagacttt 2160 gtcccaaaaa cccccccccc ngcaga 2186 <210> 14 <211> 526 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> High mannose human glucocerebrosidase (GCD) <400> 14 Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ala Glu Phe Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly 20 25 30 Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe 35 40 45 Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser 50 55 60 Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala 65 70 75 80 Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys 85 90 95 Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys 115 120 125 Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro 130 135 140 Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr 145 150 155 160 Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr 165 170 175 Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg 180 185 190 Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys 195 200 205 Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly 210 215 220 Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp 225 230 235 240 Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn 245 250 255 Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly 260 265 270 Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro 275 280 285 Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp 290 295 300 Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp 305 310 315 320 Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu 325 330 335 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu 340 345 350 Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys 355 360 365 Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln 370 375 380 Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp 385 390 395 400 Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val 405 410 415 Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr 420 425 430 Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe 435 440 445 Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn 450 455 460 Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val 465 470 475 480 Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp 485 490 495 Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His 500 505 510 Thr Tyr Leu Trp His Arg Gln Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 515 520 525 12 8 pcdo 12022/ph/00

Claims (35)

  1. 활성 성분으로서, α-L-이듀로니다제, 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase), 헥소사미니다제(hexosaminidase), α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 고-만노스 재조합 리소좀 효소 단백질을 발현하는 식물 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 식물 세포가 모든 식물 세포를 포함하는 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 고-만노스 재조합 리소좀 효소 단백질이 그의 N-말단에서 소포체 시그널 펩티드에 연결된 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 고-만노스 재조합 리소좀 효소 단백질이 소포체 보유 시그널에 연결된 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 고-만노스 재조합 리소좀 효소 단백질이 액포 표적화 시그널에 연결된 약학 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 액포 표적화 시그널이 서열번호: 2인 약학 조성물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    동결건조된 약학 조성물.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    경구 투여를 위해 제형화된 약학 조성물.
  9. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고-만노스 재조합 리소좀 효소 단백질이 인간 알파 갈락토시다제인 약학 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    파브리병의 치료에 사용되는 약제를 제조하는데 사용되는 약학 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 식물 세포가 동결건조된 식물 세포인 약학 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 약제가 경구 투여를 위해 제형화된 약학 조성물.
  13. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고-만노스 재조합 단백질이 인간 이듀로네이트 설파타제인 약학 조성물.
  14. 청구항 11에 있어서,
    헌터 증후군의 치료에 사용되는 약제를 제조하는데 사용되는 약학 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 식물 세포가 동결건조된 식물 세포인 약학 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 약제가 경구 투여를 위해 제형화된 약학 조성물.
  17. 그의 N-말단에서 식물 소포(ER) 시그널 펩티드에 부착된, α-L-이듀로니다제, 산성 스핑고미엘리나제, 헥소사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니디제, 산성 리파제, α-갈락토시다제, 이듀로네이트 설파타제, α-만노시다제 및 시알리다제로 구성된 그룹중에서 선택된 재조합 단백질.
  18. 청구항 17에 있어서,
    고-만노스 글리코실화를 갖는 재조합 단백질.
  19. 청구항 17에 있어서,
    알파 (1-3) 글리코시드 결합을 가진 적어도 하나의 퓨코스, 및 적어도 하나의 크실로스를 포함하는 재조합 단백질.
  20. 청구항 17에 있어서,
    생물학적으로 활성인 재조합 단백질.
  21. 청구항 17에 있어서,
    ER 보유 시그널을 추가로 포함하는 재조합 단백질.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 ER 보유 시그널이 그의 C-말단에서 부착되는 재조합 단백질.
  23. 청구항 17에 있어서,
    액포 표적화 시그널을 추가로 포함하는 재조합 단백질.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 액포 표적화 시그널이 그의 C-말단에서 부착되는 재조합 단백질.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 액포 표적화 시그널이 서열번호: 2인 재조합 단백질.
  26. 청구항 17에 있어서,
    고립된 재조합 단백질.
  27. 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 이듀로네이트-2-설파타제를 포함하는 재조합 단백질.
  28. 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 알파 갈락토시다제를 포함하는 재조합 단백질.
  29. 활성 성분으로서의 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  30. 청구항 27에 있어서,
    헌터 증후군의 치료에 사용되는 약제를 제조하는데 사용되는 재조합 단백질.
  31. 청구항 28에 있어서,
    파브리병의 치료에 사용되는 약제를 제조하는데 사용되는 재조합 단백질.
  32. 청구항 27의 재조합 단백질을 암호화하는 고립 핵산 서열.
  33. 청구항 28의 재조합 단백질을 암호화하는 고립 핵산 서열.
  34. 청구항 27의 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 식물 세포의 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 이듀로네이트-2-설파타제의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 식물 세포 배양액을 배양하는 단계를 포함하는, 청구항 27의 재조합 단백질의 제조방법.
  35. 청구항 28의 인간 알파-갈락토시다제를 발현하는 식물 세포의 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 알파-갈락토시다제의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 식물 세포 배양액을 배양하는 단계를 포함하는, 청구항 28의 재조합 단백질의 제조방법.
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050032211A1 (en) * 1996-09-26 2005-02-10 Metabogal Ltd. Cell/tissue culturing device, system and method
US20030100945A1 (en) 2001-11-23 2003-05-29 Mindguard Ltd. Implantable intraluminal device and method of using same in treating aneurysms
US7951557B2 (en) * 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
US20080274557A1 (en) * 2005-03-03 2008-11-06 Indiana University Research And Technology Permethylation Of Oligosaccharides
WO2007010533A2 (en) * 2005-07-18 2007-01-25 Protalix Ltd. Mucosal or enteral administration of biologically active macromolecules
WO2008053025A1 (en) 2006-10-31 2008-05-08 Rheinisch-Westfaelische Technische Hochschule Aachen Therapeutic use of gba2
ES2660667T3 (es) 2007-05-07 2018-03-23 Protalix Ltd. Biorreactor desechable a gran escala
ES2564685T3 (es) * 2007-07-03 2016-03-28 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Vacuna contra la enfermedad de edema porcino
US8742079B2 (en) 2007-08-20 2014-06-03 Protalix Ltd. Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof
ITUD20080055A1 (it) * 2008-03-13 2009-09-14 Transactiva S R L Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali
JP5305284B2 (ja) * 2008-03-26 2013-10-02 独立行政法人産業技術総合研究所 糖化合物の質量分析法
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2011017177A1 (en) 2009-07-28 2011-02-10 Shire Human Genetic Therapies Compositions and methods for treating gaucher disease
RU2569744C2 (ru) 2009-08-28 2015-11-27 Маунт Синай Скул Оф Медсин Ферментная заместительная терапия с увеличением дозы для лечения недостаточности кислой сфингомиелиназы
US9194011B2 (en) 2009-11-17 2015-11-24 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
WO2011061736A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Protalix Ltd. Alkaline alpha galactosidase for the treatment of fabry disease
EP2542572B1 (en) 2010-03-02 2015-05-06 Protalix Ltd. Multimeric forms of therapeutic proteins and uses thereof
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
WO2012001641A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Actelion Pharmaceuticals Ltd Stable pharmaceutical compositions
US20130224797A1 (en) * 2010-10-15 2013-08-29 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for producing glycoprotein having mannose residue as non-reducing end of sugar chain
DK2665814T3 (en) * 2011-01-20 2017-09-11 Protalix Ltd NUCLEIC ACID CONSTRUCTION FOR EXPRESSION OF ALPHA-GALACTOSIDASE IN PLANTS AND PLANT CELLS
KR101158673B1 (ko) * 2011-06-24 2012-07-03 주식회사 지씨바이오 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
US20160145589A1 (en) 2011-06-24 2016-05-26 Green Cross Corporation Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
AU2012312529B2 (en) 2011-09-20 2018-01-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CA2863829A1 (en) * 2012-02-19 2013-08-22 Protalix Ltd. Oral unit dosage forms and uses of same for the treatment of gaucher disease
KR102096752B1 (ko) 2012-03-02 2020-04-02 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Ｉｉｉ형 고셔병을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2014099931A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US10087452B2 (en) 2013-02-28 2018-10-02 Wellkey Holdings Limited Method for agrobacterium mediated transformation of cambial meristematic plant cells to produce recombinant protein
JP6454650B2 (ja) 2013-03-06 2019-01-23 プロタリクス リミテッド ＴＮＦαポリペプチド阻害剤を発現する植物細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
US20170101633A1 (en) 2014-02-10 2017-04-13 Protalix Ltd. Method of maintaining disease stability in a subject having gaucher's disease
WO2016007909A2 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Biostrategies LC Materials and methods for treating disorders associated with sulfatase enzymes
US10000551B2 (en) 2014-09-11 2018-06-19 Protalix Ltd. Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same
EA038931B9 (ru) * 2014-11-20 2022-02-18 Йиссум Рисерч Дивелопмент Компани Оф Зе Хебрю Юниверсити Оф Иерусалим Лтд. Композиции и способы получения полипептидов с модифицированным профилем гликозилирования в клетках растений
CA2974699A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
AU2016232149B2 (en) * 2015-03-17 2021-09-23 eleva GmbH Glycosylated lysosomal proteins, method of production and uses
EP3454964B1 (en) * 2016-05-13 2021-06-23 Agilent Technologies, Inc. Automated alignment, calibration and standardization of electrophoresis data
BR112018075032A2 (pt) 2016-06-15 2019-03-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai proteínas de hemaglutinina do vírus influenza e seus uso
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
RU2668158C1 (ru) * 2017-06-28 2018-09-26 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Способ очистки имиглюцеразы

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US467993A (en) * 1892-02-02 Alfred jorgensen
US2147271A (en) * 1937-07-16 1939-02-14 Schwarz Lab Inc Pure yeast culture apparatus
US2341259A (en) * 1941-01-22 1944-02-08 Lummus Co Inoculating method and apparatus
US2836434A (en) * 1952-08-21 1958-05-27 Separator Ab Arrangement for sterile interconnection and sealing of apparatuses in a plant for instance for cultivation of bacteria
US3201327A (en) * 1962-08-21 1965-08-17 Sun Oil Co Fermentation apparatus and process
SE371208B (ko) * 1966-10-06 1974-11-11 Sanraku Ocean Co
US3468520A (en) * 1967-05-12 1969-09-23 American Cyanamid Co Combination agitation and transfer unit for suspended cells
US3504185A (en) * 1968-05-09 1970-03-31 Univ Syracuse Res Corp Apparatus for measuring and controlling cell population density in a liquid medium
GB1284077A (en) * 1968-10-18 1972-08-02 British Petroleum Co Process and apparatus for the cultivation of micro-organisms
US3540700A (en) * 1969-01-24 1970-11-17 New Brunswick Scientific Co Rotary processing apparatus
DE2059931C3 (de) * 1970-12-05 1973-10-18 Knapsack Ag, 5033 Huerth-Knapsack Verfahren zum Verhindern von Schaumausbrüchen aus geschlossenen Reaktionsräumen
US3950227A (en) * 1970-12-21 1976-04-13 St. John's University Batch method of establishing and maintaining a controlled aerobic environment for a microbial culture
US3793154A (en) * 1970-12-21 1974-02-19 Univ St Johns Apparatus for gaseous environmental control of batch cultures of micro-organisms
US4179339A (en) * 1977-03-02 1979-12-18 Olympus Optical Company, Ltd. Liquid feeder for automatic culture apparatus
US4228243A (en) * 1978-07-13 1980-10-14 Toray Industries, Inc. Cell culture propagation apparatus
US4328317A (en) * 1980-03-31 1982-05-04 Solargizer International, Inc. Continuous chemical conversion or fermentation apparatus
DE3133314A1 (de) * 1981-08-22 1983-03-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt "vorrichtung zum dispergieren einer zweiten phase in einer ersten phase"
US4519984A (en) * 1982-01-18 1985-05-28 Phillips Petroleum Company Apparatus for carrying out sparged reaction
CH663422A5 (de) * 1982-05-27 1987-12-15 Chemap Ag Verfahren und fermenter zur zuechtung von gewebezellen.
US4708938A (en) * 1984-04-30 1987-11-24 Hickinbotham Winemakers Pty. Ltd. Alcoholic fermentation
US4668632A (en) * 1985-02-06 1987-05-26 Vxr, Inc. Sparger and apparatus for and method of growing cells
US5372945A (en) * 1985-06-06 1994-12-13 Alchas; Paul G. Device and method for collecting and processing fat tissue and procuring microvessel endothelial cells to produce endothelial cell product
CN85100412B (zh) * 1985-06-25 1988-02-10 山东省食品发酵工业研究所 用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖糖浆的生产方法
US4713345A (en) * 1985-07-29 1987-12-15 Grain Processing Corporation Fermentation methods and apparatus
EP0224962A1 (en) * 1985-11-25 1987-06-10 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Apparatus for the continuous cultivation of microorganisms in a culture liquid
US5166072A (en) * 1986-06-26 1992-11-24 Bayer Aktiengesellschaft Apparatus for the cultivation of immobilized micro-organisms
US4717668A (en) * 1986-12-12 1988-01-05 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Plastic roller bottle for suspension cultures
US5081036A (en) * 1987-01-23 1992-01-14 Hoffmann-La Roche Inc. Method and apparatus for cell culture
US4908315A (en) * 1987-03-04 1990-03-13 Agristar, Inc. Integument and method for micropropagation and tissue culturing
KR970001000B1 (ko) * 1987-11-28 1997-01-25 닛본 신야쿠 가부시기가이샤 아미노디옥시만니톨의 제법
US6846968B1 (en) * 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US4931401A (en) * 1988-09-01 1990-06-05 La Societe De Recherche Snc Inc. Bioreactor
US5073491A (en) * 1988-12-23 1991-12-17 Hoffman-La Roche Inc. Immobilization of cells in alginate beads containing cavities for growth of cells in airlift bioreactors
US5549892A (en) 1988-12-23 1996-08-27 Genzyme Corporation Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase
US5100801A (en) * 1989-01-26 1992-03-31 Biocontrol Systems, Inc. Device for sequential microbial enrichment in a single apparatus
US5188946A (en) * 1989-01-26 1993-02-23 Biocontrol Systems Incorporated Process and device for sequential microbial enrichment in a single apparatus
JP2514102B2 (ja) * 1990-06-13 1996-07-10 ユリカ株式会社 ユリ科アロエ属に属する植物の真空凍結乾燥体を利用した錠剤製品及びその製造方法
EP0462065B1 (de) 1990-06-15 2005-03-02 Syngenta Participations AG Neue Signalsequenzen
EP0471947A1 (en) * 1990-06-29 1992-02-26 Sekisui Chemical Co., Ltd. Culture bag
US5240598A (en) * 1990-09-18 1993-08-31 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Microbubble generator for the transfer of oxygen to microbial inocula and microbubble generator immobilized cell reactor
US5401650A (en) * 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US5367110A (en) 1990-11-13 1994-11-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Transgenic plants overproducing threonine and lysine
AT394576B (de) * 1991-01-16 1992-05-11 Vogelbusch Gmbh Reaktor zur durchfuehrung biologischer reaktionen mittels biokatalysatoren
US5612188A (en) * 1991-11-25 1997-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Automated, multicompartmental cell culture system
US5267791A (en) * 1991-12-13 1993-12-07 Corning Incorporated Suspended cell culture stirring vessel closure and apparatus
JPH05219834A (ja) * 1992-02-14 1993-08-31 Fumiko Kobayashi ディスポーサブル培養袋及び培養方法
IL102189A (en) * 1992-06-12 1995-07-31 Univ Ben Gurion Device for growing microorganisms
US5409833A (en) * 1993-07-01 1995-04-25 Baxter International Inc. Microvessel cell isolation apparatus
US5342781A (en) * 1993-07-15 1994-08-30 Su Wei Wen W External-loop perfusion air-lift bioreactor
ES2235176T3 (es) * 1994-10-24 2005-07-01 THE TEXAS A &amp; M UNIVERSITY SYSTEM Inmunizacion oral con plantas transgenicas.
ES2326705T3 (es) * 1995-09-14 2009-10-16 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Produccion de enzimas lisosomicas en sistemas de expresion basados en plantas.
CA2246242A1 (en) * 1996-02-08 1997-08-14 Institut Fur Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung Cassettes for the expression of storable proteins in plants
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
US20050032211A1 (en) * 1996-09-26 2005-02-10 Metabogal Ltd. Cell/tissue culturing device, system and method
IL119310A (en) * 1996-09-26 1999-07-14 Metabogal Ltd Cell/tissue culturing device and method
US6190913B1 (en) * 1997-08-12 2001-02-20 Vijay Singh Method for culturing cells using wave-induced agitation
US6096546A (en) * 1998-01-30 2000-08-01 Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for recovering polypeptides from plants and portions thereof
AU6021699A (en) * 1998-09-01 2000-03-21 Penn State Research Foundation Method and apparatus for aseptic growth or processing of biomass
JP2002526116A (ja) * 1998-10-07 2002-08-20 シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト 植物における治療活性タンパク質
US6432698B1 (en) * 1999-01-06 2002-08-13 Rutgers, The State University Disposable bioreactor for culturing microorganisms and cells
JP2002000248A (ja) * 2000-06-23 2002-01-08 Daiichi Kagaku Kk 凍結法及び凍結乾燥法
NZ523912A (en) * 2000-07-31 2005-03-24 Biolex Inc Expression of biologically active polypeptides in duckweed
US7138262B1 (en) * 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
CA2429210A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-23 Jason C. Goodrick Expression system for recombinant proteins
WO2002081695A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Syngenta Participations Ag Genes that are modulated by posttranscriptional gene silencing
EP1379668B1 (en) * 2001-04-18 2009-08-19 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. The use of genes encoding abc transporters to stimulate the production of secondary metabolites in biological cells
US7629309B2 (en) * 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
ES2224792B1 (es) * 2002-06-28 2007-02-16 Era Plantech, S.L. Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas.
US7951557B2 (en) * 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
AU2004287645A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-19 Compugen Ltd. Variants of human glycoprotein hormone alpha chain: compositions and uses thereof
ATE398167T1 (de) * 2004-06-02 2008-07-15 Millipore Corp Einwegreaktor
WO2005118771A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Xcellerex, Inc. Disposable bioreactor systems and methods
US8119406B2 (en) * 2004-10-13 2012-02-21 Protalix Ltd. System and method for production of antibodies in plant cell culture
US20080132743A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-05 Albemarle Corporation Production of high purity decabromodiphenylalkanes
ES2660667T3 (es) * 2007-05-07 2018-03-23 Protalix Ltd. Biorreactor desechable a gran escala

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Publication number Publication date
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MXPA05011507A (es) 2006-07-03
IL182888A0 (en) 2007-08-19
RU2385928C2 (ru) 2010-04-10
EP2343378A1 (en) 2011-07-13
EP1618177A2 (en) 2006-01-25
EP2333083B1 (en) 2014-01-01
AU2004234635A1 (en) 2004-11-11
US20060204487A1 (en) 2006-09-14
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RU2005136874A (ru) 2006-06-10
SG2013021217A (en) 2015-08-28
KR101332372B1 (ko) 2013-11-27
EP2330205A1 (en) 2011-06-08
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JP4993693B2 (ja) 2012-08-08
RU2535342C2 (ru) 2014-12-10
EP1618177A4 (en) 2007-07-04
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EP2322636A1 (en) 2011-05-18
AU2004234635B2 (en) 2010-05-13
CN1875111A (zh) 2006-12-06
ES2391057T3 (es) 2012-11-21
IL155588A0 (en) 2003-11-23
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