CN85100412B

CN85100412B - 用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖糖浆的生产方法

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Publication number: CN85100412B
Application number: CN85100412A
Authority: CN
Inventors: 贺家明; 袁建国
Original assignee: SHANDONG INST OF FERMENTED FOO
Current assignee: SHANDONG INST OF FERMENTED FOO
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1985-06-25
Publication date: 1988-02-10
Also published as: CN85100412A

Abstract

用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖浆的生产方法是一种使用新的嗜热链霉菌ＳｉｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＭ１０３３生产固定化葡萄糖异构酶。该菌株可分泌胞外酶且胞外酶产生量可占总酶的８０％以上。此方法不用进行胞内酶释出处理工序，故可简化制酶程序，减少生产设备。

Description

用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖浆的生产方法

本发明是关于葡萄糖异构酶的生产方法，特别是关于固定化葡萄糖异构酶的生产方法及其用于生产高果糖糖浆（即果萄糖浆）的方法。

目前国际工业上使用的嗜热放线菌基本是生产胞内葡萄糖异构酶类型。例如《特许公报》昭49-42555及昭50-17560介绍了一种用嗜热放线菌（嗜热链霉菌）Streptomyces，YT-NO，6生产固定化葡萄糖异构酶的方法，是先将从发酵液中分离、收集到的菌体进行自溶处理，得到酶液，再使酶挂到载体上进行异构化。该方法由于产生的酶多是胞内酶，因此需要一套破坏细胞壁释出酶的工艺及设备，所以上述方法存在工艺较复杂、设备较多的问题。

本发明的目的是采用胞外酶型嗜热放线菌（嗜热链霉菌）Streptomyces M1033（其寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存号为CGMCC N00032）生产葡萄糖异构酶，此酶中胞外酶占总酶量的80%以上，培养液容易过滤，酶蛋白较纯（清发酵液经（NH₄）₂SO₄淀沉，透析脱盐，DEAE-Sephadex A₃₀柱和Sephadex G₁₅₀柱提纯，得均一态葡萄糖异构酶，园盘电泳为一个区带）。因此可以直接用滤清的发酵液作酶源，将酶吸附在大孔阴离子交换树脂载体上，制成固定化葡萄糖异构酶，不用再进行胞内酶释出处理工序，因此简化了工艺，减少了设备。

首先本发明提供了产生胞外葡萄糖异构酶的嗜热放线菌（嗜热链霉菌）菌株Streptomyces M1033。该菌株是发明人在1978年从2847份土样中分离纯化得到的原始菌株，再经紫外线诱变，紫外线与亚硝基胍复合诱变，以及不断纯化所得。经生产实践，国内有关专家鉴定为产胞外葡萄糖异构酶型国产优良菌株。

由于本发明的菌株在葡萄糖天冬素琼脂上不形成可溶性色素;通气培养温度为40-45℃;胞外酶占80%以上，可直接用滤清的发酵液作酶源。因此在主要菌学性质与使用效果上，不同于《特许公报》昭49-42555及昭50-17560的嗜热链霉菌等菌株（这些菌株在葡萄糖天冬琼脂上生成黄褐色素;通气培养温度40-50℃;而且是产胞内葡萄糖异构酶类型）。

本发明的菌株具有以下几方面特征：

一、所说的菌株的生理特征为：

（1）察氏培养基：生长良好，气丝乳白色到深灰色，基丝由白到黄褐色，不形成可溶性色素。

（2）淀粉琼脂：生长良好，气丝由白色到灰色，基丝由乳白色到浅黄色，不形成可溶性色素。

（3）马铃薯浸汁：生长良好，气丝由白色到灰褐色，基丝由金黄色到浅褐色，不形成可溶性色素。

（4）酪氨酸琼脂：生长困难，少数菌落气丝由白色到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶为阴性。

（5）葡糖天冬素琼脂：生长良好，气丝由白色到灰色，基丝由乳白色到浅黄色，不形成可溶性色素。

（6）葡糖蛋白胨琼脂：生长良好，气丝由白到浅灰色，基内菌丝由白色到浅褐色，不形成可溶性色素。

（7）明胶培养基：生长一般，液化明胶能力较弱。

（8）牛奶培养基：生长一般，对牛奶的凝固能力较强。

（9）碳源利用：能够很好的利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇;很难利用棉子糖。

二、所说的菌株的形态特征为：

30-50℃在高氏1号培养基上生长良好，培养3天气丝由白色到灰色，培养3-5天产生灰色胞子。菌落为园形，似伞状，表面呈粉状，胞子丝形状为：弯曲至形成螺旋。胞子形状为：园形、椭园形。

本发明进一步提供了Streptomyces M1033斜面、种子、发酵方法、发酵清滤液的分离方法及其葡萄糖异构酶的固定化方法，即说明书附图前五步工序所采用的条件和方法：

（1）异构酶菌种斜面：即菌株的斜面培养基和斜面培养方法，也就是菌株，首先在淀粉1-3%，硝酸钾0.05-0.5%，磷酸氢二钾0.01-0.1%，硫酸镁0.01-0.1%，氯化钠0.01-0.1%，硫酸亚铁0.001-0.005%，琼脂1.5-2%的斜面培养基上，高温30℃-50℃培养4～6天。

（2）种子罐：即是种子液配方和种子培养条件及方法，也就是把上面得到的菌种斜面的胞子放入罐内含麸皮3-8%，豆饼0.5-2%，硫酸镁0.05-0.2%，磷酸氢二钾0.05-0.2%，氯化钴0.005-0.05%，PH6.5-7.5的种子培养液里，通气量0.1～0.5升/升/分，高温35°-45℃，培养种子15-24小时。

（3）发酵罐：即是发酵罐的发酵液配方和发酵条件及方法，也就是把上面得到的种子液以5-15%的接种量放入罐内，含有麸皮3-8%，豆饼0.5-2%，硫酸镁0.05-0.2%，磷酸氢二钾0.05-0.2%，氯化钴0.005-0.05%，PH6.5-7.5的发酵液里，通气量0.1-1升/升/分，高温35℃-45℃，发酵55-70小时，发酵液最后PH8-9。

（4）板框压滤：即是从发酵液制备清发酵液的方法，也就是把前一步得到的发酵液，在室温下用板框过滤机经普通滤布过滤，得到清发酵液。

（5）挂酶：即是将清发酵液作酶液，将其中游离酶吸附在某种载体上，制取固定化酶，也就是挂酶工序的酶源、载体、条件和方法。本发明采用南开大学研制的孔径为（5-10）×10^-5毫米、转为氯型或硼酸根型的大孔强碱性苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂为载体，以1公斤干载体作用30-60升清发酵液的比例，在80-180转/分搅拌下，吸附清发酵液中的游离葡萄糖异构酶，则得到了固定化葡萄糖异构酶。

酶活力测定方法如下：

取25毫升发酵液（或干固定化酶1克）加入PH7.8磷酸缓冲液配制的葡萄糖浓度为40%的糖液75毫升（干固定化酶加含0.1%硫酸镁的葡萄糖浓度为40%的糖液100毫升）在70℃下反应1小时，适当稀释后，用旋光法测定生成的果糖，在此条件下生成1毫克果糖的酶量为一单位酶活力。

挂酶后把固定化异构酶装入柱状转化器，使浓度为30-50%、流量为100-150升/时、温度为50-80℃的葡萄糖液通过转化柱，有42%以上的葡萄糖转化为果糖，即制成转化率为42%以上的果葡糖浆，最后进入收集罐。载体树脂经一段时间使用后还可再生，重新挂酶使用。

旋光法测果糖，果糖/还原糖＝转化率（%）。

下面的例子是本发明的最佳实施例，其工艺流程参见说明书附图。

第一步：用本发明的异构酶菌Streptomyces M1033在斜面培养基上培养。

培养基成份为：淀粉2%，硝酸钾0.1%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.05%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸亚铁0.001%，琼脂2%，温度40±1℃，培养5天。

第二步：把所说的异构酶菌胞子接入种子罐中。

培养液的成份为麸皮4%，豆饼1%，硫酸镁0.1%，硫酸氢二钾0.1%，氯化钴0.024%，PH6.7在温度41±1℃通气量0.2-0.4%升/升/分下，培养18小时。

第三步：把上述种子液以10%的接种比例接入发酵罐中。

发酵液的成份为麸皮5%，豆饼1.2%，硫酸镁0.1%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钴0.024%，PH6.7在温度41±1℃，通气量0.2-0.8升/升/分下，发酵65小时，最后发酵液PH9以上，酶活为350单位/毫升。

第四步：把上一步所得发酵液在40米²板框滤机普通滤布上过滤。每1米³发酵液过滤1小时，得清发酵液，其酶活占总酶活80%以上。

第五步：用大孔强碱性苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂（南开大学协作研制），商品名：NS-43或D201NS，孔径：7×10^-5毫米，转为氯型后，以1公斤树脂加45升清发酵液的比例，在100转/分搅拌下，直接吸附清滤液中的异构酶，形成固定化葡萄糖异构酶。其酶活为10，000单位/克（干），总酶的回收率为70%。

以后各工序为：先将此固相酶装入200升的柱状转化器内，同时以甘薯淀粉为原料，加淀粉酶液化，加糖化酶糖化，並精制，得DE（葡萄糖值）95、电阻率10000欧姆厘米的葡萄糖液。使葡萄糖液在浓度40%、PH8.0、温度60±1℃、流量120升/时的条件下，通过转化器，则有42%的葡萄糖转化为果糖，酶的转化比（1公斤干固定化酶转化得干果葡糖浆公斤数）为1∶3000。再经离子交换和真空浓缩后可得71%的干物质的成品-果葡糖浆。该产品经山东省食品检测站检测无阿洛酮糖附产品，没有色杂质污染;山东省卫生防疫站及山东省医科院作慢性毒理试验、致畸试验，致突试验，均阴性。

Claims

1、使用新的嗜热放线菌（嗜热链霉菌，Streptomyces）菌株生产固定化葡萄糖异构酶的方法，其特征在于所说的菌株Streptomyces M1033分泌胞外酶，胞外酶产生量占总酶的80%以上。该方法包括：

〈一〉培养（第一步异构酶菌种斜面，第二步种子罐，第三步发酵罐）。

〈二〉分离发酵液（板框压滤）。

〈三〉固定（挂酶）。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于生产酶所用的菌株是Streptomyces M1033，其寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存号为：CGMCC NO0032。

3、按照权利要求1和2所述的〈一〉培养（第一步异构酶菌种斜面，第二步种子罐，第三步发酵罐）方法，其特征在于培养的

第一步异构酶菌种斜面：是菌种首先在淀粉1-3%，硝酸钾0.05～0.5%，磷酸氢二钾0.01～0.1%，硫酸镁0.01-0.1%，氯化钠0.01-0.1%，硫酸亚铁0.001-0.005%，琼脂1.5-2%的斜面培养基上高温30°-50℃培养4-6天。

第二步种子罐：是把第一步得到的菌种斜面的胞子放入含麸皮3-8%，豆饼0.5-2%，硫酸镁0.05-0.2%，磷酸氢二钾0.05-0.2%，氯化钴0.005-0.05%，PH6.5-7.5的培养基上，通气量0.1升/升/分，高温35°-45℃培养种子15-24小时。

第三步发酵罐：是把第二步得到的种子液以5-15%的接种量放入发酵罐内，用含有麸皮3-8%，豆饼0.5-2%，硫酸镁0.05-0.2%，磷酸氢二钾0.05-0.2%，氯化钴0.005-0.05%，PH6.5-7.5的培养基上，通气量0.1-1升/升/分，高温35°-45℃发酵55-70小时，发酵液最后PH8-9。

4、按照权利要求1和2所述的〈二〉分离发酵液（板框压滤）方法，其特征在于把〈一〉培养（第一步异构酶菌种斜面，第二步种子罐，第三步发酵罐）所得到的发酵液，在室温下，用板框过滤机，经普通滤布过滤，得到清发酵液。

5、按照权利要求1和2所述的〈三〉固定（挂酶）方法，其特征在于把〈二〉分离发酵液（板框压滤）方法所得的清发酵液作酶液，采用中国天津南开大学研制的孔径为（5-10）×10^-5毫米转为氯型或硼酸根型的大孔强碱性苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂为载体，以1公斤干载体作用30-60升清发酵液的比例，在80-180转/分搅拌下，吸附清发酵液中的游离葡萄糖异构酶，则可得到本发明所述的固定化葡萄糖异构酶。