ES2391057T3 - Glucocerebrosidasa con alto contenido y de manosa y su producción en cultivo vegetal - Google Patents
Glucocerebrosidasa con alto contenido y de manosa y su producción en cultivo vegetal Download PDFInfo
- Publication number
- ES2391057T3 ES2391057T3 ES04713966T ES04713966T ES2391057T3 ES 2391057 T3 ES2391057 T3 ES 2391057T3 ES 04713966 T ES04713966 T ES 04713966T ES 04713966 T ES04713966 T ES 04713966T ES 2391057 T3 ES2391057 T3 ES 2391057T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cell
- protein
- cells
- plant
- gcd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 13
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 title description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 30
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims abstract description 12
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims abstract description 12
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 9
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 241
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 114
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 99
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 97
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 58
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 39
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 39
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 22
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 claims description 21
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 91
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 78
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 74
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 55
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 54
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 54
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 51
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 36
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 33
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 32
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 31
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 29
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 22
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 19
- -1 for example Proteins 0.000 description 19
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 17
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 101001058943 Homo sapiens Glutaryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 15
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 15
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 13
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 13
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 12
- 229940049197 cerezyme Drugs 0.000 description 12
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 10
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 8
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 8
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 8
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 8
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 8
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 8
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 239000003883 ointment base Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 150000008163 sugars Chemical group 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 7
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 7
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 238000006894 reductive elimination reaction Methods 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 101710116747 Chitinase A Proteins 0.000 description 6
- 101710202612 Endochitinase A Proteins 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 6
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 6
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 5
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 5
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 5
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 5
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 5
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 5
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 5
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 5
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 5
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 5
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 description 5
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 5
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 5
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 239000004821 Contact adhesive Substances 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 4
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 4
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000001253 polyvinylpolypyrrolidone Substances 0.000 description 4
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 4
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 3
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010055991 BglII endonuclease Proteins 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000020322 Gaucher disease type I Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 2
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 108090000470 N-Acetylglucosamine Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 2
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 2
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 2
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000012354 sodium borodeuteride Substances 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000009602 toxicology test Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxynonadecane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)(C(O)=O)CC(O)=O HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 108010089072 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000950314 Figura Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 102100022128 High mobility group protein B2 Human genes 0.000 description 1
- 101000900688 Homo sapiens Grancalcin Proteins 0.000 description 1
- 101001045791 Homo sapiens High mobility group protein B2 Proteins 0.000 description 1
- 108010053927 Iduronate Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-BKJPEWSUSA-N N-acetyl-D-hexosamine Chemical compound CC(=O)NC1C(O)O[C@H](CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-BKJPEWSUSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700011203 Phaseolus vulgaris phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002367 Polyisobutene Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 1
- 101710145348 Putative glutamate-cysteine ligase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical class [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 102000010126 acid sphingomyelin phosphodiesterase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940040563 agaric acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940031955 anhydrous lanolin Drugs 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- NCMHKCKGHRPLCM-UHFFFAOYSA-N caesium(1+) Chemical compound [Cs+] NCMHKCKGHRPLCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-OUBTZVSYSA-N carbane Chemical compound [13CH4] VNWKTOKETHGBQD-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 108091000085 chlorophyll binding Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 239000013536 elastomeric material Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002143 fast-atom bombardment mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002305 glucosylceramides Chemical class 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008202 granule composition Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010019847 hepatosplenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 150000008273 hexosamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000050520 human GCA Human genes 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004108 hypersplenism Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004137 mechanical activation Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEUXZUSUYIHGNL-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;hydrate Chemical class O.CCN(CC)CC JEUXZUSUYIHGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 239000003605 opacifier Substances 0.000 description 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000003209 petroleum derivative Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000012439 solid excipient Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 229960004274 stearic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000000352 storage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007847 structural defect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 239000007143 thioglycolate medium Substances 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Obesity (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Una proteína glucocerebrosidasa humana que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº:7, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosaexpuesta, al menos una fucosa que tiene un enlace alfa(1-3)-glucosídico y al menos una xilosa, y está ligada en suextremo C a un péptido señal que elige dianas vacuolares como se expone en SEC ID Nº: 2.
Description
Glucocerebrosidasa con alto contenido de manosa y su producción en cultivo vegetal
Campo de la invención
La presente invención se refiere a las realizaciones según se caracterizan en las reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenamiento lisosómico más frecuente. Se produce por un trastorno genético recesivo (cromosoma 1 q21-q31) que produce deficiencia de glucocerebrosidasa, también conocida como glucosilceramidasa, que es una enzima lisosómica unida a la membrana que cataliza la hidrólisis del glucoesfingolípido glucocerebrósido (glucosilceramida, GlcCer) a glucosa y ceramida. La enfermedad de Gaucher se produce por mutaciones puntuales en el gen hGCD (glucocerebrosidasa humana) (GBA), que producen acumulación de GlcCer en los lisosomas de macrófagos. Las células de almacenamiento características, llamadas células de Gaucher, se encuentran en el hígado, el bazo y la médula ósea. Los síntomas clínicos asociados incluyen hepatoesplenomegalia grave, anemia, trombocitopenia y deterioro esquelético.
El gen que codifica GCD humana fue secuenciado por primera vez en 1985 (6). La proteína consiste en 497 aminoácidos derivados de un pro-péptido 536-mero. La hGCD madura contiene cinco secuencias consenso de aminoácidos de N-glucosilación (Asn-X-Ser/Thr). Cuatro de estos sitios están normalmente glucosilados. La glucosilación del primer sitio es esencial para la producción de proteína activa. Se han identificado cadenas de oligosacáridos tanto con alto contenido de manosa como complejas (7). La hGCD de placenta contiene 7% de hidrato de carbono, 20% del cual es del tipo con alto contenido de manosa (8). Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida a sitio han proporcionado un mapa inicial de regiones y residuos importantes para el plegamiento, interacción de activadores y localización de sitios activos (9).
El tratamiento de hGCD placentaria con neuraminidasa (dando una asialo-enzima) produce un aumento de las tasas de eliminación y captación por células de hígado de rata con un aumento concomitante en actividad enzimática hepática (Furbish y col., 1981, Biochim. Biophys. Acta 673:425-434). Esta hGC placentaria modificada con glucanos se usa actualmente como agente terapéutico en el tratamiento de enfermedad de Gaucher. Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida a sitio han proporcionado un mapa inicial de regiones y residuos importantes para el plegamiento, interacción de activadores y localización de sitios activos [Grace y col., J. Biol. Chem. 269:2283-2291 (1994)].
Hay tres tipos diferentes de enfermedad de Gaucher, cada uno determinado por el nivel de actividad de hGC. Las principales células afectadas por la enfermedad son los macrófagos, que se agrandan altamente debido a la acumulación de GlcCer y, por tanto, se denominan “células de Gaucher”.
La identificación de un defecto en GCD como causa primaria de la enfermedad de Gaucher condujo al desarrollo de terapia de sustitución de enzimas como estrategia terapéutica para este trastorno.
De Duve sugirió primero que la sustitución de la enzima lisosómica ausente con enzima exógena biológicamente activa podría ser un enfoque viable para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico [Fed Proc. 23:1045 (1964)].
Desde entonces, diversos estudios han sugerido que la terapia de sustitución de enzimas puede ser beneficiosa para tratar diversas enfermedades de almacenamiento lisosómico. El mejor éxito se ha mostrado con individuos con enfermedad de Gaucher de tipo I que se trataron con enzima exógena (β-glucocerebrosidasa), preparada a partir de placenta (Ceredasa™) o, más recientemente, recombinantemente (Cerezyme™).
La glucocerebrosidasa sin modificar derivada de fuentes naturales es una glucoproteína con cuatro cadenas de hidratos de carbono. Esta proteína no elige como diana las células fagocíticas en el cuerpo y, por tanto, es de valor terapéutico limitado. En el desarrollo de la presente terapia para enfermedad de Gaucher, los azúcares terminales en las cadenas de hidratos de carbono de glucocerebrosidasa se eliminan secuencialmente mediante tratamiento con tres glucosidasas diferentes. Este tratamiento con glucosidasa produce una glucoproteína cuyos azúcares terminales consisten en residuos de manosa. Como los fagocitos tienen receptores de manosa que reconocen glucoproteínas y glucopéptidos con cadenas de oligosacáridos que terminan en residuos de manosa, la remodelación de hidratos de carbono de glucocerebrosidasa ha mejorado la elección como diana de la enzima para estas células [Furbish y col., Biochem. Biophys. Acta 673:425, (1981)].
Como se indica en el presente documento, la glucosilación desempeña una función crucial en la actividad de hGCD; por tanto, la desglucosilación de hGCD expresada en líneas celulares usando tanto tunicamicina (células Sf9) como mutaciones puntuales que abolen todos los sitios de glucosilación (tanto células Sf9 como COS-1) produce la pérdida completa de actividad enzimática. Además, se encontró que la hGCD expresada en E. coli era inactiva. Más investigación indicó la significancia de los diversos sitios de glucosilación para la actividad de proteína. Además de la función de glucosilación en la presente actividad de proteína, la enzima comercialmente producida contiene
modificaciones de secuencias de glucano que facilitan la administración específica de fármaco. Las proteínas glucosiladas son remodeladas tras la extracción para incluir sólo manosa que contiene secuencias de glucano.
La enzima GCD humana contiene 4 sitios de glucosilación y 22 lisinas. La enzima recombinantemente producida (Cerezyme™) se diferencia de la enzima placentaria (Ceredasa™) en la posición 495 en la que una arginina ha sido sustituida con una histidina. Además, la composición del oligosacárido se diferencia entre la GCD recombinante y la placentaria ya que la primera tiene más residuos de fucosa y N-acetil-glucosamina mientras que la última retiene una cadena con alto contenido de manosa. Como se menciona anteriormente, ambos tipos de GCD se tratan con tres glucosidasas diferentes (neuraminidasa, galactosidasa y P-N acetil-glucosaminidasa) para exponer manosas terminales, que permite elegir como diana células fagocíticas. Una preparación farmacéutica que comprende la enzima recombinantemente producida se describe en el documento US 5.549.892. Debe observarse que todas las referencias mencionadas se incorporan por este documento por referencia como si se expusieran completamente en el presente documento.
Un inconveniente asociado al tratamiento con terapia de sustitución de enzima lisosómica existente es que la bioactividad in vivo de la enzima es indeseablemente baja, por ejemplo, debido a la baja captación, reducida elección como diana de lisosomas de las células específicas en las que se acumula el sustrato y una corta semivida in vivo funcional en los lisosomas.
Otro inconveniente importante de las terapias de enzimas recombinantes de GCD existentes es su gasto, que puede ser una gran carga económica para los sistemas sanitarios. El alto coste de estas enzimas recombinantes resulta de un complejo protocolo de purificación y de las cantidades relativamente grandes del agente terapéutico requeridas para los tratamientos existentes. Por tanto, hay una necesidad urgente de reducir el coste de GCD de manera que esta terapia que salva vidas pueda proporcionarse más asequiblemente a todos los que la requieran.
Las proteínas para uso farmacéutico se han producido tradicionalmente en sistemas de expresión de mamífero o bacterianos. En la pasada década se desarrolló un nuevo sistema de expresión en plantas. Esta metodología utiliza Agrobacterium, una bacteria que puede insertar moléculas de ADN monocatenarias (T-ADN) en el genoma de la planta. Debido a la relativa simplicidad de introducir genes para la producción a escala industrial de proteínas y péptidos, esta metodología está siendo cada vez más popular como un sistema de expresión de proteínas alternativo (1).
Aunque las modificaciones postraduccionales no existen en sistemas de expresión bacterianos, los sistemas de expresión derivados de plantas facilitan estas modificaciones que se sabe que son cruciales para la expresión y actividad de proteínas. Una de las principales diferencias entre el sistema de expresión de proteínas de mamífero y de plantas es la variación de las cadenas laterales de azúcar de proteína, producidas por las diferencias en las rutas biosintéticas. Se mostró que la glucosilación tenía un profundo efecto sobre la actividad, plegamiento, estabilidad, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tasa de eliminación de la sangre y potencial antigénico de proteínas. De ahí que cualquier producción de proteínas en plantas deba tener en consideración las posibles ramificaciones de la glucosilación de plantas.
La glucosilación de proteínas se divide en dos categorías: modificaciones N-ligadas y O-ligadas (2). Los dos tipos se diferencian en el aminoácido con el que el resto de glucano está unido – las N-ligadas están unidas a residuos de Asn, mientras que las O-ligadas están unidas a residuos de Ser o Thr. Además, las secuencias de glucano de cada tipo llevan rasgos caracterizadores únicos. De los dos tipos, la glucosilación N-ligada es la más abundante, y su efecto sobre la función de proteínas se ha estudiado ampliamente. Por otra parte, los glucanos O-ligados son relativamente escasos y está disponible menos información referente a su efecto sobre proteínas.
Resumen de la invención
La técnica anterior no enseña ni sugiere un dispositivo, sistema o procedimiento para producir selectivamente proteínas glucosiladas en cultivo vegetal. La técnica anterior tampoco enseña ni sugiere un dispositivo, sistema o procedimiento tal para producir proteínas con alto contenido de manosa en cultivo vegetal. La técnica anterior tampoco enseña ni sugiere un dispositivo, sistema o procedimiento para producir proteínas en cultivo vegetal mediante el retículo endoplasmático (RE). La técnica anterior tampoco enseña ni sugiere un dispositivo, sistema o procedimiento tal para producir proteínas en cultivo vegetal mediante el retículo endoplasmático (RE) mientras que evitan el aparato de Golgi. La técnica anterior tampoco enseña ni sugiere un dispositivo, sistema o procedimiento tal para producir proteínas en cultivo vegetal usando una señal del RE para evitar el aparato de Golgi.
La presente invención vence estas desventajas de la técnica anterior proporcionando las realizaciones según se caracterizan por las reivindicaciones.
Debe observarse que el término “cultivo vegetal” como se usa en el presente documento incluye cualquier tipo de célula vegetal transgénica y/o genéticamente manipulada de otro modo que se cultiva en cultivo. La manipulación genética puede ser opcionalmente permanente o transitoria. Preferentemente, el cultivo muestra células que no están ensambladas para formar una planta completa, de forma que al menos una estructura biológica de una planta no está presente. Opcionalmente y preferentemente, el cultivo puede mostrar una pluralidad de tipos diferentes de células vegetales, pero preferentemente el cultivo caracteriza un tipo particular de célula vegetal. Debe observarse
que opcionalmente los cultivos vegetales que muestran un tipo particular de célula vegetal pueden derivarse originariamente de una pluralidad de tipos diferentes de tales células vegetales.
Las células vegetales pueden cultivarse según cualquier tipo de procedimiento de cultivo adecuado que incluye, pero no se limita a, cultivo sobre una superficie sólida (tal como, por ejemplo, un recipiente o placa de cultivo de plástico)
o en suspensión.
Más particularmente, la invención se refiere a células huésped, particularmente células de zanahoria suspendidas transgénicas, vectores y procedimientos para la expresión y producción de alto rendimiento de glucocerebrosidasa (GCD) con alto contenido de manosa biológicamente activa de SEC ID Nº: 8. La invención proporciona además composiciones para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico.
La presente invención también es de células huésped que comprenden nuevas composiciones de vector que permiten la producción eficiente de genes que codifican GCD de SEC ID Nº: 8.
Por tanto, la presente invención resuelve una necesidad que se sentía desde hace tiempo para una tecnología económicamente viable para producir proteínas que tienen requisitos de glucosilación particulares, tales como la glucosilación con alto contenido de manosa de enzimas lisosómicas tales como, por ejemplo, GCD. La presente invención puede resolver esta necesidad que se sentía desde hace tiempo usando cultivo de células vegetales.
Con el fin de explicar adicionalmente la presente invención, ahora se proporciona una breve explicación de la ruta biosintética de proteínas con alto contenido de manosa. La ruta de biosíntesis básica de glucanos N-ligados con alto contenido de manosa y complejos está altamente conservada entre todos los eucariotas. La biosíntesis empieza en el retículo endoplasmático (RE) con la transferencia del precursor del glucano de un vehículo de lípido de dolicol a un residuo de Asn específico sobre la proteína por la oligosacaril transferasa. El precursor se modifica posteriormente en el RE por las glucosidasas I y II y una manosidasa hipotética para dar las estructuras con alto contenido de manosa, similar al procedimiento que se produce en mamíferos.
Otras modificaciones de la secuencia del glucano para estructuras complejas e híbridas se producen en el Golgi. Tales modificaciones incluyen la eliminación de uno de los cuatro residuos de manosa por a-manosidasa I, la adición de un residuo de N-acetilglucosamina, la eliminación de los dos residuos de manosa adicionales por a-manosidasa II, la adición de N-acetilglucosamina y opcionalmente, en esta etapa, residuos de xilosa y fucosa pueden añadirse para dar glucanos N-ligados específicos para plantas. Después de la transferencia de xilosa y fucosa al núcleo, los N-glucanos de tipo complejo pueden procesarse adicionalmente por la adición de fucosa y galactosa terminal. Otras modificaciones pueden tener lugar durante el transporte de glucoproteínas.
Actualmente se usan varios enfoques en la técnica anterior para controlar y confeccionar a medida la glucosilación de proteínas en plantas, teniendo todas deficiencias significativas, particularmente en comparación con la presente invención. Una estrategia son enormes modificaciones, tales como inhibición completa de la glucosilación o eliminación de sitios de glucosilación de la cadena de péptidos. Sin embargo, este enfoque puede producir defectos estructurales. Un enfoque adicional implica la inactivación e introducción de enzimas de procesamiento de hidratos de carbono específicas. De nuevo, este enfoque es difícil y también puede tener efectos perjudiciales sobre las propias células vegetales.
La presente invención vence estas deficiencias de los enfoques de la técnica anterior usando una señal de RE y/o bloqueando la secreción del RE al aparato de Golgi.
Como se indica anteriormente, las proteínas transportadas por el sistema de endomembrana pasan primero al retículo endoplasmático. La señal de transporte necesaria para esta etapa se representa por una secuencia señal en el extremo N de la molécula, el llamado péptido señal. Tan pronto como este péptido señal ha cumplido su función, que es insertar la proteína precursora unida a él en el retículo endoplasmático, se fracciona proteolíticamente de la proteína precursora. En virtud de su función específica, este tipo de secuencia de péptidos señal se ha conservado a un alto grado durante la evolución en todas las células vivas, independientemente de si son bacterias, levaduras, hongos, animales o plantas.
Muchas proteínas vegetales, que se insertan en el retículo endoplasmático en virtud del péptido señal, no residen en el RE, pero son transportadas del retículo endoplasmático al Golgi y continúan circulando del Golgi a las vacuolas. Una clase de tales señales de clasificación para esta circulación son señales que residen en la parte del extremo C de la proteína precursora [Neuhaus y Rogers, (1998) Plant Mol. Biol. 38:127-144]. Se espera que las proteínas que contienen tanto un péptido señal del extremo N para la inserción en el retículo endoplasmático como una señal que elige dianas vacuolares del extremo C contengan glucanos complejos, que están unidos a ellas en el Golgi [Lerouge y col., (1998) Plant Mol. Biol. 38:31-48]. La naturaleza de tales señales de clasificación del extremo C pueden variar muy ampliamente. El documento US 6.054.637 describe fragmentos de péptidos obtenidos de la región de quitinasa básica de tabaco que es una proteína vacuolar que actúa de péptidos que eligen dianas vacuolares. Un ejemplo de una proteína vacuolar que contiene una señal que elige como diana el extremo C y glucanos complejos es la proteína de almacenamiento faseolina de semillas de judía [Frigerio y col., (1998) Plant Cell 10:1031-1042; Frigerio y col., (2001) Plant Cell 13:1109-1126.].
El paradigma es que en todas las células eucariotas las proteínas vacuolares pasan por el RE y el Golgi antes del secuestro en la vacuola como su destino final. Sorprendentemente, las células de la raíz vegetal transformadas de la presente invención produjeron una GCD con alto contenido de manosa inesperada. Ventajosamente, se encontró que este producto con alto contenido de manosa era biológicamente activo y, por tanto, no se necesitaron etapas adicionales para su activación. Opcionalmente, cualquier tipo de mecanismo que pueda producir glucosilación con alto contenido de manosa, que incluye cualquier tipo de mecanismo para evitar el Golgi, puede usarse según la presente invención.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped vegetal que produce GCD humana de SEC ID Nº: 8. Esta célula puede transformarse o transfectarse con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica esta proteína de interés o con un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico. Tal molécula de ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica la anterior proteína de interés operativamente ligada a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige dianas vacuolares de SEC ID Nº: 8. La primera secuencia de ácidos nucleicos puede estar opcionalmente adicionalmente operativamente ligada a una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige RE (retículo endoplasmático) como diana. La célula huésped de la invención se caracteriza porque la proteína de interés se produce por la célula en una forma altamente manosilada.
La célula huésped de la invención es una célula vegetal y, lo más preferentemente, una célula de raíz vegetal seleccionada del grupo que consiste en célula de raíz, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria transformada por Agrobacterium rhizogenes.
En una realización preferida, la célula de raíz vegetal es una célula de zanahoria. Debe observarse que las células de zanahoria transformadas de la invención se cultivan en suspensión. Como se menciona anteriormente y se describe en los ejemplos, estas células se transformaron con las células de Agrobacterium tumefaciens.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula huésped de la invención comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica GCD humana de SEC ID Nº: 8 que está en enlace operable con una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige dianas vacuolares derivadas del gen de quitinasa básica A de tabaco que tiene SEC ID Nº: 2. Este péptido señal vacuolar tiene la secuencia de aminoácidos que se indica por SEC ID Nº: 2. La primera secuencia de ácidos nucleicos puede estar opcionalmente adicionalmente ligada en un enlace operable con una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige RE (retículo endoplasmático) como diana que se indica por SEC ID Nº: 1. En una realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula huésped de la invención comprende además un promotor que es funcional en células vegetales. Este promotor debería estar operativamente ligado a la molécula recombinante de la invención.
En otra realización, esta molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender opcionalmente además un terminador operativamente ligado que es preferentemente funcional en células vegetales. La molécula de ácido nucleico recombinante de la invención puede comprender opcionalmente además elementos de control, promotores y reguladores adicionales y/o marcadores de selección. Debe observarse que estos elementos reguladores están operativamente ligados a la molécula recombinante.
La proteína de interés con alto contenido de manosa anterior producida por la célula huésped de la invención puede ser una glucoproteína con alto contenido de manosa que tiene residuos de manosa terminales expuestos.
Tal proteína con alto contenido de manosa, la glucocerebrosidasa (GCD), es la glucocerebrosidasa humana (GCD) de SEC ID Nº: 8. En lo sucesivo, GCD, rGCD, rhGCD recombinantes se refieren todas a diversas formas de GCD humana recombinante, a menos que se indique lo contrario.
Como se describe previamente, la enfermedad de Gaucher, el trastorno de almacenamiento lisosómico más frecuente, se produce por mutaciones puntuales en el gen hGCD (glucocerebrosidasa humana) (GBA), que produce la acumulación de GlcCer en los lisosomas de macrófagos. La identificación de la deficiencia de GCD como causa primaria de enfermedad de Gaucher condujo al desarrollo de terapia de sustitución de enzimas como estrategia terapéutica para este trastorno. Sin embargo, la glucosilación desempeña una función crucial en la actividad de hGCD y la captación para células diana.
Por tanto, según otras realizaciones preferidas de la presente invención, se proporciona hGCD adecuadamente glucosilada controlando la expresión de hGCD en cultivo de células vegetales, proporcionándose una señal de RE. La hGCD anterior tiene al menos una cadena de oligosacáridos que comprende un residuo de manosa expuesto para el tratamiento o la prevención de enfermedad de Gaucher.
Todavía más, en una realización particular, esta célula huésped preferida se transforma o se transfecta por una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende además un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y elemento potenciador de la traducción omega del VMT (virus del mosaico el tabaco). Según una realización preferida, este molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia de ácidos nucleicos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 13 y codifica una GCD con alto contenido de manosa que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica
sustancialmente por SEC ID Nº: 14.
Debe apreciarse que la presente invención proporciona además un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima lisosómica biológicamente activa, que es codificada por SEC ID Nº: 8.
En una realización preferida, el vector de expresión de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glucocerebrosidasa humana (GCD) con alto contenido de manosa biológicamente activa. Preferentemente, este vector de expresión preferido comprende una molécula de ácido nucleico recombinante nucleica que tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 13.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una proteína con alto contenido de manosa recombinante como se ha producido anteriormente por la célula huésped de la invención.
Esta proteína con alto contenido de manosa es una enzima lisosómica con alto contenido de manosa biológicamente activa que es glucocerebrosidasa humana (GCD) de SEC ID Nº: 8.
Todavía más, la invención proporciona dicha GCD humana con alto contenido de manosa biológicamente activa recombinante que tiene al menos una cadena de oligosacáridos que comprende un residuo de manosa expuesto.
Según una realización preferida, la GCD humana recombinante de la invención pueden unirse a un receptor de manosa sobre una célula diana en un sitio diana. Preferentemente, este sitio puede estar dentro de un sujeto que padece una enfermedad de almacenamiento lisosómico.
Debe observarse que la enzima lisosómica recombinante tiene elevada afinidad por la célula diana en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosómica que se produce naturalmente para la célula diana. En una realización específica, la célula diana en el sitio diana puede ser una célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
El procedimiento de preparación de la GCD como antes comprende las etapas de: (a) preparar un cultivo de células vegetales huésped recombinantes transformadas o transfectadas con moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que codifican la proteína recombinante de interés o con un vector de expresión que comprende las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes; (b) cultivar este cultivo de células huésped preparado por la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de la proteína, en el que las células huésped producen la proteína en una forma altamente manosilada; (c) recuperar la proteína de las células y recoger las células del cultivo proporcionado en (a); y (d) purificar la proteína de la etapa (c) por un procedimiento de purificación de proteínas adecuado.
Esta enzima recombinante como antes pueden unirse a un receptor de manosa sobre una célula diana en un sitio diana. Más particularmente, la enzima recombinante producida tiene elevada afinidad por la célula diana, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosómica que se produce naturalmente para la célula diana. Por consiguiente, la célula diana en el sitio diana puede ser célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
En otra realización preferida, la célula huésped usada mediante el procedimiento de la invención puede ser una célula de raíz vegetal seleccionada del grupo que consiste en célula de raíz, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria transformada por Agrobacterium rhizogenes. Lo más preferentemente, la célula de raíz vegetal es una célula de zanahoria. Debe observarse particularmente que en el procedimiento de la invención las células de zanahoria huésped transformadas se cultivan en suspensión.
La invención proporciona además una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico que comprende como principio activo la enzima lisosómica con alto contenido de manosa biológicamente activa recombinante como se define por la invención. La composición de la invención puede comprender opcionalmente además diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición de la invención está prevista para el tratamiento de enfermedad de Gaucher.
La invención se refiere además al uso de una GCD humana con alto contenido de manosa biológicamente activa recombinante como antes en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedad de Gaucher.
Por consiguiente, esta enzima lisosómica biológicamente activa es una glucocerebrosidasa humana (GCD) con alto contenido de manosa biológicamente activa de SEC ID Nº: 8 como se define por la invención.
Según la presente invención, se proporciona una célula huésped que produce una proteína con alto contenido de manosa recombinante que comprende un polinucleótido que codifica la proteína recombinante y una señal para hacer que la proteína recombinante se produzca como una proteína con alto contenido de manosa. Preferentemente, el polinucleótido comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de interés operativamente ligada a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal. Opcionalmente, el péptido señal comprende un péptido señal que elige RE (retículo endoplasmático) como diana. El polinucleótido comprende además una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige dianas vacuolares.
La señal hace que la proteína recombinante sea elegida como diana para el RE. Más preferentemente, la señal comprende un péptido señal que hace que la proteína recombinante sea elegida como diana para el RE. Preferentemente, el polinucleótido comprende un segmento de ácido nucleico que codifica el péptido señal.
Opcionalmente y preferentemente, la señal hace que la proteína recombinante evite el Golgi. Preferentemente, la señal comprende un péptido señal que hace que la proteína recombinante no sea elegida como diana para el Golgi. Más preferentemente, el polinucleótido comprende un segmento de ácido nucleico que codifica el péptido señal.
Opcionalmente y preferentemente, la célula huésped es una cualquiera de una célula eucariota y procariota. Opcionalmente, la célula procariota es una célula bacteriana, preferentemente una célula de Agrobacterium tumefaciens. La célula eucariota es una célula vegetal. Más preferentemente, la célula vegetal es una célula de raíz vegetal seleccionada del grupo que consiste en célula de raíz, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria transformada por Agrobacterium rhizogenes. Lo más preferentemente, la célula de raíz vegetal es una célula de zanahoria.
El polinucleótido recombinante comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 8 que está en enlace operable con una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige dianas vacuolares derivadas del gen de la quitinasa básica A de tabaco, péptido señal vacuolar que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica por SEC ID Nº: 2, en el que la primera secuencia de ácidos nucleicos está opcionalmente adicionalmente operativamente ligada a una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige RE (retículo endoplasmático) como diana que se indica por SEC ID Nº: 1.
Más preferentemente, el polinucleótido recombinante comprende además un promotor que es funcional en células vegetales, en el que el promotor está operativamente ligado a la molécula recombinante.
Lo más preferentemente, el polinucleótido recombinante comprende además un terminador que es funcional en células vegetales, en el que el terminador está operativamente ligado a la molécula recombinante.
También más preferentemente, el polinucleótido recombinante comprende opcionalmente además elementos de control, promotores y reguladores adicionales y/o marcadores de selección, en el que los elementos reguladores están operativamente ligados a la molécula recombinante.
La proteína con alto contenido de manosa de la invención es una glucoproteína con alto contenido de manosa que tiene glucosilación con al menos un residuo de manosa expuesto.
La GCD comprende la secuencia de aminoácidos que se indica por SEC ID Nº: 8, codificada por la secuencia de ácidos nucleicos que se indica por SEC ID Nº: 7.
Más preferentemente, la célula se transforma o transfecta con un polinucleótido recombinante o con un vector de expresión que comprende la molécula, polinucleótido recombinante que comprende además un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, y el elemento regulador es el elemento potenciador de la traducción omega del VMT (virus del mosaico el tabaco), y que tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 13 que codifica GCD que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 14.
Según realizaciones preferidas, se proporciona la proteína con alto contenido de manosa recombinante de la invención producida por la célula huésped descrita anteriormente.
Se proporciona una proteína GCA humana con alto contenido de manosa recombinante como se define por SEC ID Nº: 8 producida en cultivo de células vegetales. Preferentemente, la proteína muestra un péptido señal vegetal para elegir como diana una proteína para el RE.
Más preferentemente, el péptido señal vegetal comprende un péptido para elegir como diana la proteína para el RE en un cultivo de células vegetales de raíz. Lo más preferentemente, el cultivo de células vegetales de raíz comprende células de zanahoria.
Según otras realizaciones preferidas más se proporciona el uso de un cultivo de células vegetales para producir una GCD con alto contenido de manosa humana como se define por SEC ID Nº: 8.
El procedimiento de producir la proteína con alto contenido de manosa de la invención comprende preparar un cultivo de células huésped recombinantes transformadas o transfectadas con un polinucleótido recombinante que codifica una proteína recombinante; cultivar el cultivo de células huésped en condiciones que permitan la expresión de la proteína, en el que las células huésped producen la proteína en una forma altamente manosilada.
Preferentemente, el cultivo de células huésped se cultiva en suspensión. Más preferentemente, el procedimiento comprende además purificar la proteína.
El procedimiento se realiza con la célula huésped como se describe previamente.
Preferentemente, la enzima lisosómica está seleccionada del grupo que consiste en glucocerebrosidasa (GCD), esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-N-acerilgalactosamina, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa.
La enzima lisosómica es glucocerebrosidasa (GCD) de SEC ID Nº: 8 Lo más preferentemente, la célula diana en el sitio diana es célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
Preferentemente, la célula huésped es una célula de raíz vegetal seleccionada del grupo que consiste en célula de raíz, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria transformada por Agrobacterium rhizogenes.
Más preferentemente, la célula de raíz vegetal es una célula de zanahoria.
Lo más preferentemente, las células de zanahoria huésped transformadas se cultivan en suspensión.
La enzima recombinante de la invención pueden unirse a un receptor de manosa sobre una célula diana en un sitio diana dentro de un sujeto. Más preferentemente, la enzima lisosómica recombinante de la invención tiene elevada afinidad por la célula diana en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosómica que se produce naturalmente para la célula diana. La enzima lisosómica es glucocerebrosidasa (GCD) de SEC ID Nº: 8.
La enfermedad de almacenamiento lisosómico es enfermedad de Gaucher. También más preferentemente, la célula diana en el sitio diana es una célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
Según otras realizaciones más se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico que comprende como principio activo una enzima lisosómica con alto contenido de manosa biológicamente activa recombinante como se ha descrito anteriormente, composición que opcionalmente comprende además diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La enfermedad de almacenamiento lisosómico es enfermedad de Gaucher. La enzima lisosómica recombinante es una glucocerebrosidasa (GCD) humana con alto contenido de manosa biológicamente activa de SEC ID Nº: 8.
Según otras realizaciones preferidas más se proporciona el uso de una enzima lisosómica con alto contenido de manosa biológicamente activa recombinante de la invención como se ha descrito anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedad de Gaucher.
La invención se describirá adicionalmente mediante las siguientes figuras.
Breve descripción de las figuras
La invención se describe en el presente documento, a modo de ejemplo solo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
Figura 1A-1B 1A muestra el casete de expresión resultante que comprende el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, elemento potenciador de la traducción omega del VMT (virus del mosaico el tabaco), señal que elige RE como diana, la secuencia de GCD humana (también denotada por SEC ID Nº: 7), señal vacuolar y secuencia del terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. 1B muestra un mapa esquemático del esqueleto del plásmido pGreenII. La Figura 2 muestra el análisis de transferencia Western de extractos de célula transformados por hGCD usando anticuerpo específico anti-hGCD. Se usó Cerezyme patrón (carril 1) como control positivo, se usó callo sin transformar como control negativo (carril 2), se muestran diversos extractos de callos seleccionados en los carriles 3-8. La Figura 3A-3C muestra la primera etapa de purificación de rhGCD sobre una resina de intercambio catiónico fuerte (soporte Macro-Prep High-S, Bio-Rad), empaquetada en una columna XK (2,6 x 20 cm). La columna se integró con un sistema AKTA-Prime (Amersham Pharmacia Biotech) que permite la monitorización de la conductividad, pH y absorbancia a 280 nm. La elución de la rh-GCD se obtuvo con tampón de equilibrio que contiene NaCl 600 mM. La Fig. 3A representa un ejecución convencional de esta etapa de purificación. Las fracciones recogidas durante la ejecución se monitorizaron por ensayo de actividad enzimática, como se muestra por la Fig. 3B, y se agruparon los tubos que presentaron actividad enzimática (en el pico de elución). La Fig. 3C muestra la tinción con azul de Coomassie de fracciones de elución ensayadas para actividad. Las Figuras 3D-3F muestran gráficas correspondientes a las de las Figuras 3A-3C, pero para la segunda columna. La Figura 4A-C muestra la etapa de purificación final de la hGCD recombinante sobre una resina de interacción hidrófoba (gel TSK, Toyopearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.), empaquetada en una columna XK (2,6 x 20 cm). La columna se integró con una sistema AKTA-Prime (Amersham Pharmacia Biotech) que permite la monitorización de la conductividad, pH y absorbancia a 280 nm. El conjunto de elución de GCD de la columna previa se cargó a 6 ml/min, seguido de lavado con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV alcanza la referencia. La GCD pura se eluyó por tampón cítrico 10 mM que contenía 50% de etanol.
La Fig. 4A representa una ejecución convencional de este etapa de purificación.
La Fig. 4B muestra las fracciones recogidas durante la ejecución que se monitorizaron por ensayo de actividad
enzimática.
La Fig. 4C muestra tinción con azul de Coomassie de fracciones de elución ensayadas para actividad.
La Figura 5 muestra la actividad de hGCD recombinante tras la captación por macrófagos peritoneales (Figuras
5A-5C), mientras que la Figura 5D muestra una transferencia Western de GCD recombinante según la presente
invención.
La Figura 6 muestra estructuras de glucosilación comparativas para rGCD según la presente invención y las de
Cerezyme™.
La Figura 7 muestra estructuras de glucosilación para rGCD según la presente invención.
La Figura 8 muestra estructuras de glucosilación de N-glucano adicionales para rGCD según la presente
invención.
Descripción detallada de la invención
Las proteínas para uso farmacéutico se han producido tradicionalmente en sistemas de expresión de mamífero o bacterianos. En los últimos años se encontró un nuevo sistema de expresión prometedor en plantas. Debido a la relativa simplicidad de introducir nuevos genes y las posibilidades de producción a gran escala de proteínas y péptidos, la 'farmicultura molecular' se está volviendo cada vez más popular como sistema de expresión de proteínas.
Una de las principales diferencias entre el sistema de expresión de proteínas de mamífero y de planta es la variación de secuencias de glucosilación de proteínas producida por las diferencias en las rutas biosintéticas. Se mostró que la glucosilación tenía un profundo efecto sobre la actividad, plegamiento, estabilidad, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tasa de eliminación de la sangre y potencial antigénico de proteínas. De ahí que cualquier producción de proteína en plantas deba tener en cuenta las posibles ramificaciones de la glucosilación de plantas.
El resto de hidrato de carbono es una de las modificaciones postraduccionales más comunes de proteínas. La glucosilación de proteínas se divide en dos categorías: N-ligada y O-ligada. Los dos tipos se diferencian en el aminoácido con el que el resto de glucano está unido – las N-ligadas están unidas a residuos de Asn, mientras que las O-ligadas están unidas a residuos de Ser o Thr. Además, las secuencias de glucano de cada tipo llevan rasgos caracterizadores únicos. De los dos tipos, la glucosilación N-ligada es la más abundante, y su efecto sobre las proteínas se ha estudiado ampliamente. Por otra parte, los glucanos O-ligados son relativamente escasos y está disponible menos información referente a su influencia sobre proteínas. La mayoría de los datos disponibles sobre la glucosilación de proteínas en plantas se basan en glucanos N-ligados, en vez de O-ligados.
La presente invención describe en el presente documento un sistema de expresión vegetal basado en células vegetales transgénicas que son preferentemente células de raíz, opcionalmente y preferentemente cultivadas en suspensión. Este sistema de expresión está particularmente diseñado para la eficiente producción de GCD humana de SEC ID Nº: 8. El término “con alto contenido de manosa” incluye glucosilación que tiene al menos un residuo de manosa expuesto.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped que produce GCD humana de SEC ID Nº: 8. Preferentemente, la proteína recombinante muestra un péptido señal del RE (retículo endoplasmático), más preferentemente un péptido señal que elige RE como diana. Alternativamente o adicionalmente, la proteína recombinante muestra una señal que produce la proteína para evitar el Golgi. La señal permite preferentemente que esta proteína recombinante muestre glucosilación con alto contenido de manosa, más preferentemente reteniendo tal glucosilación, y lo más preferentemente eligiendo como diana el RE y/o evitando el Golgi. Como se describe en mayor detalle en el presente documento, una señal tal se implementa como un péptido señal de SEC ID Nº: 2, que forma parte de la secuencia de proteínas. Debe observarse que la señal es una señal que elige diana es
Los péptidos señal que eligen RE como diana son muy conocidos en la técnica; son péptidos señal del extremo N. Opcionalmente, cualquier péptido señal que elige RE como diana adecuado puede usarse con la presente invención.
Una célula huésped vegetal según la presente invención puede transformarse o transfectarse opcionalmente (permanentemente y/o transitoriamente) con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la GCD de SEC ID Nº: 8 o con un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico. Tal molécula de ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica la GCD de SEC ID Nº: 8 operativamente ligada a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige dianas vacuolares de SEC ID Nº: 2. Debe observarse que, como se usa en el presente documento, el término “operablemente” ligado no se refiere necesariamente a un enlace físico. La primera secuencia de ácidos nucleicos puede opcionalmente y preferentemente estar adicionalmente operativamente ligada a una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige RE (retículo endoplasmático) como diana. La célula huésped de la invención se caracteriza porque la proteína de interés se produce por la célula en una forma que incluye al menos un residuo de manosa expuesto, pero es preferentemente una forma altamente manosilada.
“Células”, “células huésped” o “células huésped recombinantes” son términos usados indistintamente en el presente documento. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a células particulares del sujeto, sino a la progenie o posible progenie de una célula tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en la generación sucesiva debido tanto a mutación como a influencias medioambientales, tal progenie puede, en realidad, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía está incluida dentro del alcance del término como se usa en el presente documento. “Célula huésped” como se usa en el presente documento se refiere a células que pueden transformarse recombinantemente con ADN desnudo o vectores de expresión construidos usando técnicas de ADN recombinante. Como se usa en el presente documento, el término “transfección” significa la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, ADN desnudo o un vector de expresión, en una célula receptora por transferencia génica mediada por ácido nucleico. “Transformación”, como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento en el que un genotipo de célula cambia como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de la proteína deseada.
Debe apreciarse que una resistencia a fármaco u otro marcador de selección están previstos en parte para facilitar la selección de los transformantes. Adicionalmente, la presencia de un marcador de selección, tal como marcador de resistencia a fármaco, puede ser de uso en evitar que los microorganismos contaminantes se multipliquen en el medio de cultivo. Un cultivo puro tal de la célula huésped transformada se obtendría cultivando las células en condiciones que se requieren para la supervivencia del fenotipo inducido.
Como se indica anteriormente, las células vegetales huésped de la invención pueden transfectarse o transformarse con una molécula de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando corresponda, ácido ribonucleico (ARN). También debe entenderse que los términos incluyen, como equivalentes, análogos de tanto ARN como ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos y, según sea aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (tal como sentido o antisentido) y bicatenarios.
La célula huésped vegetal de la invención puede transfectarse o transformarse con un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante. “Vectores de expresión”, como se usa en el presente documento, engloba vectores tales como plásmidos, virus, bacteriófago, fragmentos de ADN integrable y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del huésped. Los vectores de expresión son normalmente construcciones de ADN o ARN auto-replicantes que contienen el gen deseado o sus fragmentos, y elementos de control genéticos operativamente ligados son reconocidos en una célula huésped adecuada y efectúan la expresión de los genes deseados. Estos elementos de control pueden efectuar la expresión dentro de un huésped adecuado. Generalmente, los elementos de control genéticos pueden incluir un sistema de control de la expresión de promotores eucariota. Tal sistema incluye normalmente un promotor de la transcripción, un operador opcional para controlar la aparición de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de expresión de ARN, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma adecuado, uniones de corte y empalme de ARN, secuencias que terminan la transcripción y traducción, etc. Los vectores de expresión normalmente contienen un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula huésped.
Los plásmidos son la forma de vector más comúnmente usada, pero otras formas de vectores que sirven a una función equivalente y que son, o que se hacen, conocidos en la técnica son adecuados para su uso en el presente documento. Véanse, por ejemplo, Pouwels y col. Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 y suplementos), Elsevier, N.Y.; y Rodriquez y col. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988), que se incorporan en el presente documento por referencia.
En general, tales vectores contienen además genes específicos que pueden proporcionar selección fenotípica en células transformadas. También se contempla el uso de vectores de expresión víricos procariotas y eucariotas para expresar los genes que codifican los polipéptidos de la presente invención.
Opcionalmente, el vector puede ser un vector vegetal general (como se describe con respecto a los ejemplos más adelante). Alternativamente, el vector puede ser opcionalmente específico para células de raíz.
La célula huésped de la invención es una célula vegetal y, lo más preferentemente, una célula de raíz vegetal seleccionada del grupo que consiste en célula de raíz vegetal, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria transformada por Agrobacterium rhizogenes.
En una realización preferida, la célula de raíz vegetal es una célula de zanahoria. Debe observarse que las células de zanahoria transformadas de la invención se cultivan en suspensión. Como se ha mencionado anteriormente y se describe en los ejemplos, estas células se transformaron con las células de Agrobacterium tumefaciens de la invención.
Los vectores de expresión o moléculas de ácidos nucleicos recombinantes usados para transfectar o transformar las células huésped de la invención pueden modificarse adicionalmente según procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia para añadir, eliminar o modificar de otro modo secuencias señal de péptidos para alterar la escisión del péptido señal o para aumentar o cambiar la elección de diana de la enzima lisosómica expresada mediante el sistema de endomembrana vegetal. La construcción de expresión se manipula específicamente para
elegir como diana la enzima lisosómica para la localización vacuolar.
El vector de expresión o molécula de ácido nucleico recombinante se manipula para incorporar una secuencia de nucleótidos que codifica una señal de SEC ID Nº: 2 que elige como diana la enzima lisosómica para la vacuola vegetal. La molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula huésped de la invención comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica GCD humana de SEC ID Nº: 8 que está en enlace operable con una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige dianas vacuolares derivadas del gen de la quitinasa básica A de tabaco. Este péptido señal vacuolar tiene la secuencia de aminoácidos que se indica por SEC ID Nº: 2. La primera secuencia de ácidos nucleicos puede estar opcionalmente adicionalmente ligada en un enlace operable con una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal que elige RE (retículo endoplasmático) como diana que se indica por SEC ID Nº: 1. En una realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula huésped de la invención comprende además un promotor que es funcional en células vegetales. Este promotor debería estar operativamente ligado a la molécula recombinante de la invención.
El término “operativamente ligada” se usa en el presente documento para indicar que una primera secuencia de ácidos nucleicos está operativamente ligada con una segunda secuencia de ácidos nucleicos en la que la primera secuencia de ácidos nucleicos está dispuesta en una relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Opcionalmente y preferentemente, las secuencias de ADN operativamente ligadas son contiguas (por ejemplo, ligadas físicamente) y, si fuera necesario para unir dos regiones codificantes de la proteína, en el mismo marco de lectura. Por tanto, una secuencia de ADN y una secuencia(s) reguladora(s) están conectadas de tal forma que permiten la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) están unidas a la(s) secuencia(s) reguladora(s).
En otra realización, esta molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender opcionalmente además un terminador operativamente ligado que es preferentemente funcional en células vegetales. La molécula de ácido nucleico recombinante de la invención puede comprender opcionalmente además elementos de control, promotores y reguladores adicionales y/o marcadores de selección. Debe observarse que estos elementos reguladores están operativamente ligados a la molécula recombinante.
Elementos reguladores que pueden usarse en las construcciones de expresión incluyen promotores que pueden ser tanto heterólogos como homólogos a la célula vegetal. El promotor puede ser un promotor vegetal o un promotor no vegetal que puede activar altos niveles transcripción de una secuencia ligada en células vegetales y plantas. Ejemplos no limitantes de promotores vegetales que pueden usarse eficazmente en la práctica de la invención incluyen el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, rbcS, el promotor para la proteína de unión a clorofila a/b, AdhI, NOS y HMG2, o modificaciones o derivados de los mismos. El promotor puede ser tanto constitutivo como inducible. Por ejemplo, y no a modo de limitación, un promotor inducible puede ser un promotor que promueve la expresión o expresión elevada de la secuencia de nucleótidos de la enzima lisosómica después de la activación mecánica de genes (MGA) de la planta, tejido vegetal o célula vegetal.
Los vectores de expresión usados para transfectar o transformar las células huésped de la invención pueden modificarse adicionalmente según procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia para potenciar u optimizar la expresión génica heteróloga en plantas y células vegetales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, mutar elementos reguladores de ADN para aumentar la fuerza del promotor o para alterar la proteína de interés.
Las enzimas lisosómicas solubles comparten etapas iniciales de la biosíntesis con las proteínas secretoras, es decir, síntesis sobre el ribosoma, unión del péptido señal del extremo N a la superficie del retículo endoplasmático (RE) rugoso, transporte en la luz del RE cuando el péptido señal se escinde y adición de oligosacáridos a residuos de asparagina específicos (N-ligados), seguido de más modificaciones de la proteína naciente en el aparato de Golgi [von Figura y Hasilik, Annu. Rev. Biochem. 55:167-193 (1986)]. Los oligosacáridos N-ligados pueden ser complejos, diversos y heterogéneos, y pueden contener residuos con alto contenido de manosa. Las proteínas se someten adicionalmente a procesamiento en un compartimento pos-RE, pre-Golgi y en el cis-Golgi para formar tanto una señal de reconocimiento dependiente de oligosacáridos de 6-fosfato de manosa N-ligados (M-6-P) como independiente de oligosacáridos de M-6-P N-ligados para enzimas lisosómicas localizadas [Kornfeld & Mellman, Ann. Rev. Cell Biol., 5:483-525 (1989); Kaplan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:2026 (1977)]. La presencia de la señal de reconocimiento de M-6-P produce la unión de la enzima a receptores de M-6-P (MPR). Estas enzimas unidas permanecen en la célula, se encapsidan eventualmente en lisosomas y, por tanto, son segregadas de proteínas elegidas como diana para la secreción o a la membrana plasmática.
Todavía más, en una realización particular, esta célula huésped vegetal preferida se transforma o transfecta por una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende además un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, preferentemente que tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se indica por SEC ID Nº: 9, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, preferentemente que tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se indica por SEC ID Nº: 12, y elemento potenciador de la traducción omega del VMT (virus del mosaico el tabaco). Según una realización preferida, este molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia de ácidos
nucleicos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 13 y codifica una GCD con alto contenido de manosa que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 14.
El vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glucocerebrosidasa humana (GCD) con alto contenido de manosa biológicamente activa de SEC ID Nº: 8. Preferentemente, este vector de expresión preferido comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se indica sustancialmente por SEC ID Nº: 13. Según una realización específica, un vector de expresión preferido utiliza el plásmido pGREEN II como se describe por el siguiente Ejemplo 1.
Un casete de expresión puede estar comprendido dentro del vector de expresión anteriormente descrito.
El término “biológicamente activa” se usa en el presente documento con respecto a cualquier enzima lisosómica recombinante producida en un sistema de expresión vegetal para indicar que la enzima lisosómica recombinante puede hidrolizar tanto sustrato natural, o un análogo, como sustrato sintético de la enzima lisosómica humana o animal correspondiente a niveles detectables.
La GCD humana recombinante de SEC ID Nº: 8 puede unirse a un receptor de manosa sobre una célula diana, en un sitio diana. Este sitio puede estar dentro de un sujeto que padece enfermedad de Gaucher.
Opcionalmente y más preferentemente, la enzima lisosómica recombinante como se define anteriormente tiene elevada afinidad por la célula diana en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosómica que se produce naturalmente para la célula diana. En una realización específica, la célula diana en el sitio diana puede ser una célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
Opcionalmente, la proteína recombinante puede producirse por células vegetales según la presente invención cultivando en un dispositivo descrito con respecto a la patente de EE.UU. nº 6.391.638 concedida el 21 de mayo de 2002 e incorporada por este documento por referencia como si se expusiera completamente en el presente documento. Condiciones para cultivar células vegetales en suspensión con este dispositivo se describen con respecto a la solicitud de patente de EE.UU. titulada “CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM AND METHOD” por uno de los presentes inventores y de propiedad común con la presente solicitud, que se presentó el mismo día que la presente solicitud.
Los ejemplos muestran que una h-GCD recombinante producida por la invención se unió inesperadamente a la membrana interna de las células de zanahoria transformadas de la invención y no se secretó al medio. La rh-GCD soluble puede separarse de residuos de células y otro componente insoluble según medios conocidos en la técnica tales como filtración o precipitación. Por ejemplo, tras un ciclo de congelación-descongelación, las células experimentan rotura y liberación de las proteínas solubles intracelulares, mientras que la h-GCD sigue unida al residuo de membrana insoluble. Esta mezcla de residuos de membrana solubles e insolubles se centrifugó a continuación y la fracción soluble se eliminó, simplificándose así la purificación. La membrana unida h-GCD puede entonces disolverse por rotura mecánica en presencia de un detergente suave, inhibidores de proteasa y reactivo de oxidación neutralizante. La enzima soluble puede purificarse adicionalmente usando técnicas de cromatografía tales como columnas de cromatografía de intercambio catiónico y de interacción hidrófoba. Durante la producción de rh-GCD en el biorreactor y el procedimiento de purificación, la identidad, rendimiento, pureza y actividad enzimática de h-GCD puede determinarse por uno o más ensayos bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, detectar la hidrólisis del sustrato de la enzima o un sustrato análogo, análisis de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y análisis inmunológicos tales como ELISA y transferencia Western.
En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera de otro modo, se entenderá que la palabra “comprenden”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implican la inclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
Debe observarse que, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las forma en singular “un”, “una”, ”el” y “la” incluyen referentes plurales, a menos que el contenido dicte claramente de otro modo.
Debe observarse que el término “tratamiento” también incluye mejora o alivio de una afección patológica y/o uno o más síntomas de la misma, cura de una afección tal o prevención de la génesis de una afección tal.
La enfermedad de Gaucher es la enfermedad de almacenamiento lisosómico más común en seres humanos, con la mayor frecuencia encontrada en la población judía de Ashkenazi. Aproximadamente de 5.000 a 10.000 personas en los Estados Unidos están aquejados de esta enfermedad [Grabowski, Adv. Hum. Genet. 21:377-441(1993)]. La enfermedad de Gaucher resultada de una deficiencia en glucocerebrosidasa (hGCD; glucosilceramidasa). Esta deficiencia conduce a una acumulación del sustrato de la enzima, glucocerebrósido, en células reticuloendoteliales de la médula ósea, bazo e hígado, produciendo complicaciones esqueléticas significativas tales como expansión de la médula ósea y deterioro óseo, y también hiperesplenismo, hepatomegalia, trombocitopenia, anemia y complicaciones pulmonares [Grabowski, (1993) véase arriba; Lee, Prog. Clin. Biol. Res. 95:177-217 (1982)].
La enzima lisosómica usada por el procedimiento es glucocerebrosidasa (GCD) de SEC ID Nº: 8.
La proteína de la presente invención puede usarse para producir una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica incluye como principio activo de la misma dicha proteína como se define anteriormente y en las reivindicaciones y un vehículo farmacéutica aceptable. Como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en el presente documento, tal como una proteína recombinante, con otros componentes químicos tales como fármacos tradicionales, vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de una proteína o célula a un organismo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos de mezcla, disolución, granulación, preparación de comprimidos recubiertos de azúcar, trituración, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
En una realización preferida, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal en la farmacopea europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. En lo sucesivo, los términos “vehículo fisiológicamente adecuado” y “vehículo farmacéuticamente aceptable” se usan indistintamente y se refieren a un vehículo aprobado o un diluyente que no produce irritación significativa a un organismo y no deroga la actividad biológica y propiedades del conjugado administrado.
El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua en un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. También pueden emplearse soluciones salinas y dextrosa acuosa y disoluciones de glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína, preferible en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo de manera que se proporcione la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración.
En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar más los procesos y la administración de los principios activos. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Otras técnicas para la formulación y administración de principios activos pueden encontrarse en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden comprender vehículos o excipientes sólidos o en fase de gel adecuados. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
Vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosa, transdérmica, intestinal o parenteral, que incluyen inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, además de inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Para inyección, los principios activos de la invención pueden formularse en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para administración transmucosa, en la formulación se usan penetrantes. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Para administración por vía oral, los principios activos pueden formularse opcionalmente por administración de las células completas que producen GCD humana de SEC ID Nº: 8 según la presente invención. Los principios activos
también pueden formularse combinando los principios activos y/o las células con vehículos farmacéuticamente aceptables muy conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los principios activos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente. Pueden prepararse preparaciones farmacológicas para uso oral usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes de disgregación tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Los núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin pueden usarse disoluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de principio activo.
Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, además de cápsulas cerradas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los principios activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizadores. Todas las formulaciones para administración por vía oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la vía de administración elegida.
Para administración por vía oral, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.
Para administración por inhalación, los principios activos para su uso se administran convenientemente en forma de una presentación de espray en aerosol de un envase presurizado o un nebulizador usando un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del principio activo y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los principios activos descritos en el presente documento pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con opcionalmente un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente pueden prepararse suspensiones de los principios activos como suspensiones para inyección aceitosa apropiada. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.
En una realización, la composición se formula según procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones farmacéuticas para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Generalmente, los componentes se suministran tanto por separado como mezcladas juntas en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Si la composición va a administrarse por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua de calidad farmacéutica estéril o solución salina. Si la composición se administra por inyección puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los componentes puedan mezclarse antes de la administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formas neutras o de sal. Sales farmacéuticamente
aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como aquellos derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.
Los principios activos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden comprender vehículos o excipientes sólidos o de fase de gel adecuados. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
La vía tópica se realiza opcionalmente, y está asistida por un vehículo tópico. El vehículo tópico es uno que es generalmente apto para la administración tópica del principio activo e incluye cualquiera de tales materiales conocidos en la técnica. El vehículo tópico está seleccionado de manera que se proporcione a la composición en la forma deseada, por ejemplo, como un vehículo líquido o no líquido, loción, crema, pasta, gel, polvo, pomada, disolvente, diluyente líquido, gotas y similares, y puede comprender un material de origen tanto que se produce naturalmente como sintético. Claramente es esencial que el vehículo seleccionado no afecte adversamente el agente activo u otros componentes de la formulación tópica, y que sea estable con respecto a todos los componentes de la formulación tópica. Ejemplos de vehículos tópicos adecuados para su uso en el presente documento incluyen agua, alcoholes y otros disolventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras y similares. Formulaciones preferidas en el presente documento son pomadas inodoras incoloras, líquidos, lociones, cremas y geles.
Las pomadas son preparaciones semisólidas que normalmente se basan en petrolato u otros derivados del petróleo. La base de pomada específica que va a usarse, como será apreciado por aquellos expertos en la materia, es una que proporcionará la óptima administración de principios activos y, preferentemente, también proporcionará otras características deseadas, por ejemplo, emoliencia o similares. Al igual que con otros excipientes o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizante. Como se explica en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995), en las páginas 1399-1404, las bases de pomada pueden agruparse en cuatro clases: bases oleaginosas; bases emulsionables; bases en emulsión; y bases solubles en agua. Las bases de pomada oleaginosas incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas obtenidas de animales e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de pomada emulsionables, también conocidas como bases de pomada absorbentes, contienen poco agua o no contienen agua e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra y petrolato hidrófilo. Las bases de pomada en emulsión son tanto emulsiones de agua en aceite (W/O) como emulsiones de aceite en agua (O/W) e incluyen, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de pomada solubles en agua preferidas se preparan a partir de polietilenglicoles de peso molecular variable; de nuevo, puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy para más información.
Las lociones son preparaciones que van a aplicarse a la superficie de la piel sin fricción, y normalmente son preparaciones líquidas o semilíquidas en las que partículas sólidas, que incluyen el agente activo, están presentes en una base de agua o alcohol. Las lociones son normalmente suspensiones de sólidos, y pueden comprender una emulsión aceitosa líquida del tipo aceite en agua. Las lociones son formulaciones preferidas en el presente documento para tratar grandes áreas del cuerpo debido a la facilidad de aplicar una composición más fluida. Generalmente es necesario que la materia insoluble en una loción esté finamente dividida. Las lociones contendrán normalmente agentes de suspensión para producir mejores dispersiones, además de principios activos útiles para la localización y la adhesión del agente activo en contacto con la piel, por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio o similares.
Las cremas que contienen los principios activos seleccionados son, como se conoce en la técnica, emulsiones líquidas o semisólidas viscosas, tanto aceite en agua como agua en aceite. Las bases de crema son lavables con agua y contienen una fase de aceite, un emulsionante y una fase acuosa. La fase aceitosa, también llamada algunas veces la fase “interna”, comprende generalmente petrolato y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico; la fase acuosa supera normalmente, aunque no necesariamente, la fase aceitosa en volumen y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulación en crema, como se ha explicado en Remington, arriba, es generalmente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero.
Se prefieren formulaciones en gel para la aplicación al cuero cabelludo. Como será apreciado por aquellos que trabajan en el campo de la formulación de principios activos tópicos, los geles son sistemas semisólidos tipo suspensión. Los geles de una única fase contienen macromoléculas orgánicas sustancialmente distribuidas uniformemente por todo el vehículo líquido, que es normalmente acuoso, pero que preferentemente también contienen un alcohol y opcionalmente un aceite.
En las formulaciones tópicas de la invención pueden incluirse diversos aditivos conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, pueden usarse disolventes para solubilizar ciertas sustancias de principios activos. Otros
aditivos opcionales incluyen potenciadores de la permeación de la piel, opacificantes, antioxidantes, gelificantes, espesantes, estabilizadores y similares.
Las composiciones tópicas también pueden administrarse a la piel usando parches tipo dérmicos o artículos convencionales en los que la composición de principios activos está contenida dentro de una estructura laminada que sirve de dispositivo de administración de fármaco para fijarse a la piel. En una estructura tal, la composición de principios activos está contenida en una capa, o “depósito”, que se encuentra debajo de una capa de refuerzo superior. La estructura laminada puede contener un único depósito, o puede contener múltiples depósitos. En una realización, el depósito comprende una matriz polimérica de un material de adhesivo de contacto farmacéuticamente aceptable que sirve para fijar el sistema a la piel durante la administración de principios activos. Ejemplos de materiales de adhesivo de contacto para la piel adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenos, polisiloxanos, poliisobutilenos, poliacrilatos, poliuretanos y similares. El adhesivo polimérico particular seleccionado dependerá de los principios activos particulares, vehículo, etc., es decir, el adhesivo debe ser compatible con todos los componentes de la composición que contiene los principios activos. Alternativamente, el depósito que contiene los principios activos y el adhesivo de contacto para la piel están presentes como capas separadas y distintas, encontrándose el adhesivo debajo del depósito que, en este caso, puede ser tanto una matriz polimérica como se ha descrito anteriormente como puede ser un depósito de líquido o hidrogel, o puede tomar alguna otra forma.
La capa de refuerzo en estos laminados que sirve de superficie superior del dispositivo funciona como elemento estructural primario de la estructura laminada y provee al dispositivo de gran parte de su flexibilidad. El material seleccionado para el material de refuerzo debe seleccionarse de manera que sea sustancialmente impermeable a los principios activos y a cualquier otro componente de la composición que contiene los principios activos, previniéndose así la pérdida de cualquier componente por la superficie superior del dispositivo. La capa de refuerzo puede ser tanto oclusiva como no oclusiva, dependiendo de si se desea que la piel se hidrate durante la administración de principios activos. El refuerzo está hecho preferentemente de una lámina o película de un material elastómero preferentemente flexible. Ejemplos de polímeros que son adecuados para la capa de refuerzo incluyen polietileno, polipropileno y poliésteres.
Durante el almacenamiento y antes del uso, la estructura laminada incluye un revestimiento de liberación. Inmediatamente antes de uso, esta capa se elimina del dispositivo para exponer la superficie basal del mismo, tanto el depósito de principios activos como una capa de adhesivo de contacto separada, de manera que el sistema pueda fijarse a la piel. El revestimiento de liberación debe fabricarse a partir de un material impermeable a principios activos/vehículo.
Tales dispositivos pueden fabricarse usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, por colada de una mezcla fluida de adhesivo, principios activos y vehículo sobre la capa de refuerzo, seguido de laminación del revestimiento de liberación. Similarmente, la mezcla de adhesivo puede colarse sobre el revestimiento de liberación, seguido de laminación de la capa de refuerzo. Alternativamente, el depósito de principios activos puede prepararse en ausencia de principios activos o excipiente, y luego cargarse por “remojo” en una mezcla de principios activos/vehículo.
Al igual que con las formulaciones tópicas de la invención, la composición de principios activos contenida dentro de los depósitos de principios activos de este sistema laminado puede contener varios componentes. En algunos casos, los principios activos pueden administrarse “puros”, es decir, en ausencia de líquido adicional. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los principios activos se disolverán, dispersarán o suspenderán en un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado, normalmente un disolvente o gel. Otros componentes que pueden estar presentes incluyen conservantes, estabilizadores, tensioactivo y similares.
Debe observarse que la proteína de la invención se administra preferentemente al paciente en necesidad en una cantidad eficaz. Como se usa en el presente documento, “cantidad eficaz” significa una cantidad necesaria para lograr un resultado seleccionado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de la composición de la invención puede seleccionarse para ser útil para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico.
Composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin previsto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de principio activo eficaz para presentar, aliviar o mejorar síntomas de enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que está tratándose.
La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de aquellos expertos en la materia, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para cualquier principio activo usado en los procedimientos de la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz o dosis puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de actividad en animales. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se ha determinado por ensayos de actividad.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los principios activos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en animales experimentales, por ejemplo,
determinando la CI50 y la DL50 (dosis letal que causa la muerte en el 50% de los animales probados) para un principio activo objeto. Los datos obtenidos de estos ensayos de actividad y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. Por ejemplo, pueden determinarse dosis terapéuticamente eficaces adecuadas para el tratamiento de trastornos genéticos a partir de los experimentos con modelos animales de estas enfermedades.
La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden ser elegida por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, en “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Cap. 1 pág. 1).
La cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma del resto activo que son suficientes para mantener los efectos de modulación, llamada la concentración mínima eficaz (CME). La CME variará para cada preparación, pero opcionalmente puede estimarse a partir de datos en animales completos.
Los intervalos de dosificación también pueden determinarse usando el valor de CME. Las preparaciones pueden administrarse opcionalmente usando una pauta que mantiene niveles en plasma por encima de la CME durante el 10-90% del tiempo, preferible entre el 30-90%, y lo más preferentemente el 50-90%.
Dependiendo de la gravedad y la sensibilidad de la afección que va a tratarse, la dosificación también puede ser una administración única de una composición de liberación lenta descrita antes en este documento, durando el curso del tratamiento de varios días a varias semanas o hasta que se efectúe la cura o se logre la diminución del estado de enfermedad.
Las composiciones de la presente invención pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, lámina de metal o de plástico tal como un envase alveolado. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dispensador también puede ir acompañado de un letrero asociado al recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la preparación, uso o venta de productos farmacéuticos, letrero que refleja la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal letrero, por ejemplo, puede ser de etiquetado aprobado por la Agencia estadounidense del medicamento para fármacos de venta con receta o de un prospecto autorizado. También pueden prepararse composiciones que comprenden un principio activo de la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible, disponerse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada.
Como se usa en el presente documento, el término “modular” incluye inhibir, ralentizar o invertir sustancialmente la progresión de una enfermedad, mejorando sustancialmente los síntomas clínicos de una enfermedad o afección, o previniendo sustancialmente la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad o afección. Por tanto, un “modulador” incluye un agente que puede modular una enfermedad o afección.
Los siguientes ejemplos son representativos de técnicas empleadas por los inventores en llevar a cabo aspectos de la presente invención. Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
Procedimientos experimentales:
Vectores de plásmido
CE-T – Se construyó a partir del plásmido CE obtenido del Prof. Galili [patente de Estados Unidos 5.367.110, 22 de noviembre (1994)].
El plásmido CE se digirió con SalI.
El extremo cohesivo de SalI se hizo romo usando el fragmento grande de ADN polimerasa I. Entonces, el plásmido se digirió con PstI y se ligó a un fragmento de ADN que codificaba la señal que elige RE como diana del gen de endoquitinasa básica [Arabidopsis thaliana] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCA
CTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC, y la señal que elige diana vacuolar de la quitinasa A de tabaco: GATCTTTTAGTCGATACTATG se digirió con SmaI y PstI.
pGREENII – Se obtuvo del Dr. P. Mullineaux [Roger P. Hellens y col., (2000) Plant Mol. Bio. 42:819-832]. La expresión del vector pGREEN II está controlada por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, el elemento potenciador de la traducción omega del VMT (virus del mosaico el tabaco) y la secuencia del terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.
ADNc
hGCD – Se obtuvo de la ATCC (nº de acceso 65696), GC-2.2 [GCS-2 kb; lambda-EZZ-gamma3 Homo sapiens] que contiene beta-glucosidasa ácida [glucocerebrosidasa]. Longitudes de los insertos (kb): 2,20; Tejido: célula WI-38 de fibroblastos.
Construcción de plásmido de expresión
El ADNc que codifica hGCD (número de clon de ATTC 65696) se amplificó usando los cebadores directo: 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' e inverso: 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3'. El producto de ADN purificado por PCR se digirió con las endonucleasas EcoRI y BglII (véanse las secuencias de reconocimiento subrayadas en los cebadores) y se ligó en un vector intermedio que tenía un casete de expresión E-T digerido con las mismas enzimas. El casete de expresión se cortó y se eluyó del vector intermedio y se ligó en el vector binario pGREENII usando las enzimas de restricción SmaI y XbaI, formando el vector de expresión final. La resistencia a kanamicina se confiere por el gen NPTII accionado por el promotor nos obtenido junto con el vector pGREEN (Fig. 1B). El casete de expresión resultante se presenta por la Fig. 1A.
El plásmido resultante se secuenció para garantizar la correcta fusión en marco de las señales usando los siguientes cebadores de secuenciación: promotor 35S de 5': 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3', y el terminador de 3': 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3'.
Establecimiento de callo de zanahoria y cultivos en suspensión de células
Los inventores realizaron el establecimiento de callo de zanahoria y cultivos en suspensión de células como se ha descrito previamente por Torres K.C. (Tissue culture techniques for horticular crops, pág. 111, 169).
Transformación de células de zanahoria y aislamiento de células transformadas
La transformación de células de zanahoria se realizó usando transformación con Agrobacterium por una adaptación de un procedimiento descrito previamente [Wurtele, E.S. y Bulka, K. Plant Sci. 61:253-262 (1989)]. Durante todo el procedimiento se usaron células que crecían en medio líquido en lugar de callos. Los tiempos de incubación y de crecimiento se adaptaron para la transformación de células en cultivo líquido. Brevemente, se transformaron Agrobacteria con el vector pGREEN II por electroporación [den Dulk-Ra, A. y Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72] y luego se seleccionaron usando 30 mg/ml del antibiótico paromomicina. Las células de zanahoria se transformaron con Agrobacteria y se seleccionaron usando 60 mg/ml de los antibióticos paromomicina en medio líquido.
Cribado de células de zanahoria transformadas para el aislamiento de callos que expresan altos niveles de GCD
14 días tras la transformación, células de cultivo se sembraron sobre medios sólidos a dilución del 3% de hematocrito para la formación de callos de agrupaciones individuales de células. Cuando los callos individuales alcanzaron 1-2 cm de diámetro, las células se homogeneizaron en tampón de muestra SDS y los extractos de proteína resultantes se separaron sobre SDS-PAGE [Laemmli U., (1970) Nature 227:680-685] y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (nitrocelulosa Hybond C, 0,45 micrómetros. Nº de catálogo RPN203C de Amersham Life Science). La transferencia Western para la detección de GCD se realizó usando anticuerpos policlonales anti-hGCD (descritos en el presente documento más adelante). Los callos que expresaron niveles significativos de GCD se expandieron y se transfirieron para crecer en medios líquidos para el escalado, purificación de proteínas y análisis.
Preparación de anticuerpos policlonales
75 microgramos de GCD recombinante (Cerezyme™) se suspendieron en 3 ml de adyuvante completo de Freund y se inyectaron a cada uno de dos conejos. A cada conejo se le administró una inyección de refuerzo después de dos semanas. Los conejos se sangraron aproximadamente 10 días después de la inyección de refuerzo y de nuevo a intervalos de una semana hasta que empezó a disminuir el título de anticuerpos. Después de eliminarse del coágulo, el suero se dividió en alícuotas y se guardó a -20ºC.
Escalado del crecimiento de cultivo en un biorreactor
Un callo de aproximadamente 1 cm (de diámetro) de células de zanahoria genéticamente modificadas que contenían el gen rh-GCD se sembró sobre placa de medio de agar de 9 cm de diámetro de Murashige y Skoog (MS) que contenía 4,4 g/l de medio MSD (Duchefa), 9,9 mg/l de HCl de tiamina (Duchefa), 0,5 mg de ácido fólico (Sigma), 0,5 mg/l de biotina (Duchefa), 0,8 g/l de hidrolizado de caseína (Ducifa), azúcar 30 g/l y hormonas 2-4 D (Sigma). El callo se cultivó durante 14 días a 25ºC.
El cultivo celular en suspensión se preparó subcultivando el callo transformado en un medio líquido MSD (Murashige & Skoog (1962) que contenía 0,2 mg/l de ácido 2,4-dicloroacético), como es muy conocido en la técnica. Las células en suspensión se cultivaron en un matraz Erlenmeyer de 250 ml (el volumen de trabajo empieza con 25 ml y después de 7 días aumenta a 50 ml) a 25ºC con velocidad de agitación de 60 rpm. Posteriormente, el volumen de
cultivo celular se aumentó a Erlenmeyer de 1 l mediante la adición de volumen de trabajo hasta 300 ml bajo las mismas condiciones. El inóculo del biorreactor pequeño (10 l) [véase el documento WO98/13469] que contenía 4 l de medio MSD se obtuvo mediante la adición de 400 ml de células en suspensión derivadas de dos Erlenmeyer de 1 l que se cultivaron durante siete días. Después de una semana de cultivo a 25ºC con 1 lpm de flujo de aire, el medio MDS se añadió hasta 10 l y el cultivo continuó bajo las mismas condiciones. Después de cinco días adicionales de cultivo, la mayoría de las células se cosecharon y se recogieron pasando el medio de células a través de una red de 80 μ. El medio adicional se presionó y la torta de concentrado de eritrocitos se guardó a -70ºC.
Más detalles del dispositivo de biorreactor pueden encontrarse con respecto a la patente de EE.UU. nº 6.391.638 concedida el 21 de mayo de 2002.
Purificación de proteínas
Con el fin de separar el medio de GCD insoluble, la torta de células congeladas que contenía aproximadamente 100 g de células en peso húmedo se descongeló, seguido de centrifugación de las células descongeladas a 17000 x g durante 20 min a 4ºC. Los materiales insolubles y las células intactas se lavaron por resuspensión en 100 ml de tampón de lavado (fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, EDTA 20 mM) y luego se precipitaron por centrifugación a 17000 g durante 20 min a 4ºC. La rh-GCD (GCD recombinante humana) se extrajo y se solubilizó mediante homogeneización del sedimento en 200 ml de tampón de extracción (fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, EDTA 20 mM, PMSF 1 mM, ácido ascórbico 20 mM, 3,8 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP), DTT 1 mM y 1% de Triton-x-100). Entonces, el homogeneizado se agitó durante 30 min a temperatura ambiente y se clarificó por centrifugación a 17000 x g durante 20 min a 4ºC. El sedimento se desechó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 5,5 mediante la adición de ácido cítrico concentrado. La turbidez generada después del ajuste del pH se clarificó por centrifugación bajo las mismas condiciones descritas anteriormente.
Se realizó purificación adicional por el procedimiento de columnas de cromatografía del siguiente modo: 200 ml de medio clarificado se cargaron sobre 20 ml de resina de intercambio catiónico fuerte (soporte Macro-Prep High-S, Bio-Rad) equilibrada en tampón citrato de sodio 25 mM a pH 5,5, empaquetado en una columna XK (2,6 x 20 cm). La columna se integró con un sistema AKTA-Prime (Amersham Pharmacia Biotech) que permitió monitorizar la conductividad, pH y absorbancia a 280 nm. La muestra se cargó a 20 ml/min, después la columna se lavó con tampón de equilibrio (tampón citrato de sodio 25 mM a pH 5,5) a la velocidad de flujo de 12 ml/min hasta que la absorbancia UV alcanzó la línea base. La pre-elución de la rh-GCD se realizó con tampón de equilibrio que contenía NaCl 200 mM y la elución se obtuvo con tampón de equilibrio que contenía NaCl 600 mM. Las fracciones recogidas durante la ejecución se monitorizaron por ensayo de actividad enzimática y se agruparon los tubos que presentaron actividad enzimática (en el pico de elución). Las muestras agrupadas se diluyeron (1:5) en agua que contenía 5% de etanol y el pH se ajustó a 6,0 con NaOH. La muestra que contenía la rh-GCD se aplicó sobre la segunda columna de XK (1,6 x 20cm) empaquetada con 10 ml de la misma resina que en la columna previa. La resina en esta columna se equilibró con tampón citrato 20 mM a pH 6,0 que contenía 5% de etanol. Tras la carga de la muestra, la columna se lavó con el tampón de equilibrio y la GCD se eluyó de la columna por tampón de elución (tampón citrato 20 mM a pH 6,0, 5% de etanol y NaCl 1 M). Las fracciones del pico de absorbente en la etapa de elución se reunieron y se aplicaron sobre una tercera columna.
La etapa de purificación final se realizó sobre una columna XK (1,6 x 20 cm) empaquetada con 8 ml de resina de interacción hidrófoba (gel TSK, Toyopearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.). La resina se equilibró en tampón citrato 10 mM a pH 6,0 que contenía 5% de etanol. El conjunto de elución de GCD de la columna previa se cargó a 6 ml/min seguido de lavado con tampón de equilibrio hasta que el absorbente de UV alcanzó la línea base. La GCD pura se eluyó por tampón crítico 10 mM que contenía 50% de etanol, se recogió y se guardó a -20ºC.
Determinación de la concentración de proteína
Las concentraciones de proteína en extractos y fracciones de células se ensayaron mediante el procedimiento de Lowry/Bradford (ensayo de proteínas de Bio Rad) [Bradford, M., Anal. Biochem. (1976) 72:248] usando un patrón de albúmina de suero bovino (fracción V Sigma). Alternativamente, la concentración de muestras de proteínas homogéneas se determinó por absorción a 280 nm, lmg/ml=1,4 D.O.280. La pureza se determinó por la relación 280/260 nm.
Ensayo de actividad enzimática de GCD
La actividad enzimática de GCD se determinó usando p-nitrofenil-�-D-glucopiranósido (Sigma) como sustrato. El tampón de ensayo contuvo tampón fosfato-citrato 60 mM a pH=6, �-mercaptoetanol 4 mM, EDTA 1,3 mM, 0,15% de Triton X-100, 0,125% de taurocolato de sodio. El ensayo se realizó en placa de ELISA de 96 pocillos, 0-50 microlitros de muestra se incubaron con 250 microlitros de tampón de ensayo y se añadió sustrato a la concentración final de 4 mM. La reacción se incubó a 37ºC durante 60 min. La formación de producto (p-nitrofenilo; pNP) se detectó por absorbancia a 405 nm. La absorbancia a 405 nm se monitorizó a t=0 y en el punto final. Después de 60 min se añadieron 6 microlitros de NaOH 5 N a cada pocillo y de nuevo se monitorizó la absorbancia a 405 nm. La curva patrón de referencia ensayada en paralelo se usó para cuantificar concentraciones de GCD en las muestras probadas [Friedman y col., (1999) Blood, 93(9):2807-16].
Análisis bioquímicos:
Análisis de proteólisis en gel y espectrometría de masas
Las bandas de proteínas teñidas en el gel se cortaron con una hoja de afeitar limpia y las proteínas en el gel se redujeron con DTT 10 mM y se modificaron con yodoacetamida 100 mM en bicarbonato de amonio 10 mM. Los trozos de gel se trataron con 50% de acetonitrilo en bicarbonato de amonio 10 mM para eliminar la tinción de las proteínas tras el secado de los trozos de gel. Los trozos de gel secados se rehidrataron con 10% de acetonitrilo en bicarbonato de amonio 10 mM que contenía aproximadamente 0,1 μg de tripsina por muestra. Los trozos de gel se incubaron durante la noche a 37ºC y los péptidos resultantes se recuperaron con 60% de acetonitrilo con 0,1% de trifluoroacetato.
Los péptidos trípticos se resolvieron por cromatografía de fase inversa sobre capilares de sílice fusionados de 0,1 X 300 mm (J&W, DI de 100 micrómetros) rellenos en casa con R2 porosa (Persepective). Los péptidos se eluyeron usando un gradiente lineal de 80 min del 5 al 95% de acetonitrilo con 0,1% de ácido acético en agua a la velocidad de flujo de aproximadamente 1 μl/min. El líquido de la columna se electropulverizó en un espectrómetro de masas de trampa de iones (LCQ, Finnegan, San Jose, CA). La espectrometría de masas se realizó en el modo de ión positivo usando repetitivamente barrido de EM completo seguido de disociación inducida por colisión (DIC) del ión más dominante seleccionado del primer barrido de EM. Los datos de espectrometría de masas se compararon con la proteólisis simulada y la CID de las proteínas en la base de datos NR-NCBI usando el software Sequest [J. Eng y J. Yates, Universidad de Washington y Finnegan, San Jose].
El extremo amino de la proteína se secuenció sobre el secuenciador de péptidos 494A (Perkin Elmer) según instrucciones del fabricante.
Captación de GCD de macrófagos peritoneales
Se sabe que la elección como diana y la captación de GCD por macrófagos está mediada por el receptor de manosa/N-acetilglucosamina y puede determinarse usando macrófagos peritoneales provocados por tioglicolato obtenidos de ratones, como se describe por Stahl P. y Gordon S. [J. Cell Biol. (1982) 93(1):49-56]. Brevemente, ratones (hembra, cepa C57-B6) se inyectaron intraperitonealmente con 2,5 ml de 2,4% de medio bacto-tioglicolato sin dextrosa (nº de cat. de Difco 0363-17-2). Después de 4-5 días, los ratones tratados se sacrificaron por dislocación cervical y la cavidad peritoneal se aclaró con solución salina tamponada con fosfato. La células se sedimentaron por centrifugación (1000 x g 10 min) y se resuspendieron en DMEM (Beit Haemek, Israel) que contenía 10% de suero bovino fetal. Entonces, las células se sembraron a 1-2x105 célula/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC. Después de 90 minutos, las células no adherentes se lavaron tres veces usando PBS y los macrófagos adherentes se incubaron durante 90 min a 37ºC en medio de cultivo que contenía cantidades especificadas de rhGCD que oscilaban de 0 a 40 microgramos en 200 microlitros de volumen final, en ausencia y presencia de manano de levadura (2-10, 5 mg/ml). Después de la incubación, el medio que contenía rGCD en exceso se eliminó y las células se lavaron tres veces con PBS y luego se lisaron con tampón de lisis (Tris 10 mM a pH=7,3, MgCl2 1 mM, 0,5% de NP-40 e inhibidores de proteasas). La actividad de rGCD recogida por las células se determinó sometiendo los lisados celulares a ensayo de glucosidasa in vitro como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 1
Construcción de plásmido de expresión
Este ejemplo describe la construcción de un plásmido de expresión a modo de ejemplo usado con respecto a los ejemplos dados más adelante, en más detalle.
El ADNc que codifica hGCD (número de clon de ATTC 65696) se amplificó usando los cebadores directo: 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (también denotada por SEC ID Nº: 1) e inverso: 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' (también denotada por SEC ID Nº: 2).
El producto de ADN purificado por PCR se digirió con las endonucleasas EcoRI y BglII (véanse las secuencias de reconocimiento subrayadas en los cebadores) y se ligaron en un vector intermedio que tenía un casete de expresión CE-T digerido con las mismas enzimas. CE-T incluye la señal que elige RE como diana MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA (también denotada por SEC ID Nº: 3) del gen de endoquitinasa básico [Arabidopsis thaliana] y señal que elige diana vacuolar de la quitinasa A de tabaco: DLLVDTM* (también denotada por SEC ID Nº: 4).
El casete de expresión se cortó y se eluyó del vector intermedio y se ligó en el vector binario pGREENII usando las enzimas de restricción Smal y XbaI, formando el vector de expresión final. La resistencia a kanamicina se confiere por el gen NPTII accionado por el promotor nos junto con el vector pGREEN (Fig. 1B). El casete de expresión resultante se presenta por Fig. 1 A.
El plásmido resultante se secuenció para garantizar la correcta fusión en marco de las señales usando los siguientes
cebadores de secuenciación:
Cebador del promotor 35S de 5': 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3' (también denotada por SEC ID Nº: 5) y el terminador de 3': 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3' (también denotada por SEC ID Nº: 6). La secuencia codificante de hGCD clonada verificada se denota por SEC ID Nº: 7.
Ejemplo 2
Transformación de células de zanahoria y cribado para células transformadas que expresan RHGCD
Este ejemplo describe un procedimiento a modo de ejemplo para transformar células de zanahoria según la presente invención, como se usa en los ejemplos más adelante.
La transformación de células de zanahoria se realizó por transformación con Agrobacterium como se ha descrito previamente por [Wurtele y Bulka (1989), véase arriba]. Células de zanahoria genéticamente modificadas se sembraron sobre medio agar Murashige y Skoog (MS) con antibióticos para la selección de transformantes. Como se muestra por la Fig. 2, los extractos preparados a partir de callos que se produjeron se probaron para la expresión de GCD por análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-hGCD, y se compararon con el patrón Cerezyme (control positivo) y extractos de células no transformadas (control negativo). De los diversos callos probados, un callo (número 22) se seleccionó para escalar el crecimiento y la purificación de proteínas.
La transferencia Western se realizó del siguiente modo.
Para este ensayo, proteínas de la muestra obtenida se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a nitrocelulosa. Para este fin, los geles de SDS-poliacrilamida se prepararon del siguiente modo. Los geles de SDS consisten en un gel de apilamiento y un gel de resolución (según Laemmli, UK 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680-685). La composición de los geles de resolución fue del siguiente modo: 12% de acrilamida (Bio-Rad), 4 microlitros de TEMED (N,N,N',N'tetrametiletilendiamina; número de catálogo de Sigma T9281) por 10 ml de disolución de gel, 0,1% de SDS, Tris-HCl 375 mM, pH 8,8 y persulfato de amonio (APS), 0,1%. Se usaron TEMED y persulfato de amonio en este contexto como iniciadores de radicales libres para la polimerización. Aproximadamente 20 minutos después de la iniciación de la polimerización, el gel de apilamiento (3% de acrilamida, 0,1% de SDS, Tris-HCl 126 mM, pH 6,8, 0,1% de APS y 5 microlitros de TEMED por 5 ml de disolución de gel de apilamiento) se vertió sobre el gel de resolución y se insertó un peine de 12 ó 18 espacios para crear los pocillos para muestras.
Las cámaras de ánodo y cátodo se cargaron con disolución de tampón idéntica: tampón Tris-glicina que contenía SDS (Biorad, número de catálogo 161-0772), pH 8,3. El material que contenía antígeno se trató con 0,5 volúmenes de tampón de carga de la muestra (30 ml de glicerol (número de catálogo de Sigma G9012), 9% de SDS, 15 ml mercaptoetanol (número de catálogo M6250), Tris-HCl 187,5 mM, pH 6,8, 500 microlitros de azul de bromofenol, todos los volúmenes por 100 ml de tampón de muestra), y la mezcla se calentó luego a 100ºC durante 5 minutos y se cargó sobre el gel de apilamiento.
La electroforesis se realizó a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, 45-60 minutos usando una intensidad de corriente constante de 50-70 voltios seguido de 45-60 min a 180-200 voltios para geles de 13 por 9 cm de tamaño. Entonces, los antígenos se transfirieron a nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Dassel).
La transferencia de proteínas se realizó como se describe sustancialmente en el presente documento. El gel se dispuso, junto con la nitrocelulosa adyacente, entre papel de filtro Whatmann 3 MM, material espumado de 0,5 cm de espesor conductor y electrodos de alambre que conducían la corriente a modo de electrodos de platino. El papel de filtro, el material espumado y la nitrocelulosa se empaparon minuciosamente con tampón de transferencia (tampón TG de Biorad, número de catálogo 161-0771, se diluyeron 10 veces con metanol y tampón acuoso (20% de metanol)). La transferencia se realizó a 100 voltios durante 90 minutos a 4ºC.
Después de la transferencia, los sitios de unión libres sobre la nitrocelulosa se saturaron a 4ºC durante la noche con tampón de bloqueo que contenía 1% de leche en polvo (Dairy America) y 0,1% de Tween 20 (cat de Sigma P1379) diluido con tampón fosfato (Riedel deHaen, número de catálogo 30435). Las tiras de transferencia se incubaron con un anticuerpo (dilución, 1:6500 en tampón fosfato que contenía 1% de leche en polvo y 0,1% de Tween 20 como antes, pH 7,5) a 37 ºC durante 1 hora.
Después de la incubación con el anticuerpo, la transferencia se lavó tres veces durante 10 minutos en cada caso con PBS (tampón fosfato de sodio tamponado con fosfato (Riedel deHaen, número de catálogo 30435)). Entonces, las tiras de transferencia se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con un anticuerpo secundario adecuado (cabra anti-conejo (molécula completa) HRP (cat de Sigma nº A-4914)), dilución 1:3000 en tampón que contenía 1% de leche en polvo (Dairy America) y 0,1% de Tween 20 (cat de Sigma P1379) diluido con tampón fosfato (Riedel deHaen, número de catálogo 30435)). Después de haberse lavado varias veces con PBS, las tiras de transferencia se tiñeron con reactivos reveladores ECL (Amersham RPN 2209).
Después de sumergir las transferencias en los reactivos ECL, las transferencias se expusieron a película de rayos X FUJI Super RX 18x24 y se revelaron con revelador y fijador FUJI-ANATOMIX (nº de cat de FUJI-X fix FIXRTU 1 out of 2). Las bandas que mostraron las proteínas que se unieron por el anticuerpo fueron visibles después de este tratamiento.
Escalado del crecimiento de cultivo en biorreactores
Los cultivos en suspensión del callo 22 se obtuvieron subcultivando el callo transformado en un medio líquido. Las células se cultivaron en matraces Erlenmeyer con agitación hasta que el volumen total fue suficiente para inocular el biorreactor (como se describe en Procedimientos experimentales). Las células de zanahoria transgénicas genéticamente modificadas pueden cultivarse durante meses, y la cosecha de células puede obtenerse en ciclos de 5 a 7 días (datos no mostrados). En el séptimo día de cultivo, cuando la cantidad de producción de rh-GCD en célula de zanahoria está en el pico, las células se recogieron pasando el cultivo a través de redes de 100 de malla. Debe observarse que las células pueden recogerse por medios conocidos en la técnica tales como filtración o centrifugación. La torta de concentrado de eritrocitos que proporciona el material para la purificación de h-GCD a homogeneidad puede almacenarse a la temperatura de congelación.
Ejemplo 3
Purificación de proteína hgcd activa recombinante de células de zanahoria transformadas
Se encontró que la h-GCD recombinante expresada en células de zanahoria transformadas se unía a membranas internas de las células y no se secretaba al medio. La rotura de células mecánicamente deja la rGCD unida a residuos de membrana insolubles (datos no mostrados). Entonces, la rGCD se disolvió usando detergentes suaves y se separó de residuos de células y otros componentes insolubles. La enzima soluble se purificó adicionalmente usando técnicas de cromatografía, que incluyen columnas de cromatografía de intercambio catiónico e interacción hidrófoba como se describe en Procedimientos experimentales.
Con el fin de separar el medio de la GCD insoluble, la torta de células congeladas que contenía aproximadamente 100 g de células en peso húmedo se descongeló, seguido de centrifugación a 17000 x g durante 20 min a 4ºC. Los materiales insolubles y las células intactas se lavaron por resuspensión en 100 ml de tampón de lavado (fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, EDTA 20 mM) y se precipitaron por centrifugación a 17000 g durante 20 min a 4ºC. La rGCD se extrajo y se solubilizó mediante homogeneización del sedimento en 200 ml de tampón de extracción (fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, EDTA 20 mM, PMSF 1 mM, ácido ascórbico 20 mM, 3,8 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP), DTT 1 mM, 1% de Triton-x-100 (Sigma)). El homogeneizado se agitó durante 30 min a temperatura ambiente y se clarificó por centrifugación a 17000 x g durante 20 min a 4ºC. El sedimento se desechó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 5,5 mediante la adición de ácido cítrico concentrado. La turbidez generada después del ajuste del pH se clarificó por centrifugación bajo las mismas condiciones descritas anteriormente.
Se realizó purificación adicional por columnas de cromatografía del siguiente modo: en una primera etapa, 200 ml de extracto clarificado se cargaron sobre 20 ml de resina de intercambio catiónico fuerte (soporte Macro-Prep High-S, Bio-Rad) equilibrada en tampón citrato de sodio 25 mM a pH 5,5, empaquetado en una columna XK (2,6 x 20 cm). La columna se integró con un sistema AKTA-Prime (Amersham Pharmacia Biotech) que permitió monitorizar la conductividad, pH y absorbancia a 280 nm. La muestra se cargó a 20 ml/min, después la columna se lavó con tampón de equilibrio (tampón citrato de sodio 25 mM a pH 5,5) a la velocidad de flujo de 12 ml/min hasta que la absorbancia UV alcanzó la línea base. La pre-elución de la rh-GCD se realizó con tampón de equilibrio que contenía NaCl 200 mM y la elución se obtuvo con tampón de equilibrio que contenía NaCl 600 mM. Las fracciones recogidas durante la ejecución se monitorizaron por ensayo de actividad enzimática y se agruparon los tubos que presentaron actividad enzimática (en el pico de elución). Las muestras agrupadas se diluyeron (1:5) en agua que contenía 5% de etanol y el pH se ajustó a 6,0 con NaOH.
La Fig. 3A representa una ejecución convencional de esta etapa de purificación. Las fracciones recogidas durante la ejecución se monitorizaron por ensayo de actividad enzimática como se muestra por la Fig. 3B y la Fig. 3C muestra la tinción con azul de Coomassie de fracciones de elución ensayadas para actividad.
Las fracciones de elución que contenían la rGCD se aplicaron sobre una segunda columna XK (1,6 x 20 cm) empaquetada con 10 ml de la misma resina que en la columna previa, para una segunda etapa de purificación. La resina en esta columna se equilibró con tampón citrato 20 mM a pH 6,0 que contenía 5% de etanol. Tras la carga de la muestra, la columna se lavó con el tampón de equilibrio y la rGCD se eluyó de la columna por tampón de elución (tampón citrato 20 mM a pH 6,0, 5% de etanol y NaCl 1 M). La Fig. 3D representa una ejecución convencional de esta etapa de purificación. Las fracciones recogidas durante la ejecución se monitorizaron por ensayo de actividad enzimática como se muestra por la Fig. 3E y la Fig. 3F muestra una tinción con azul de Coomassie de fracciones de elución ensayadas para actividad.
Las fracciones del pico de absorbente en la etapa de elución se reunieron y se aplicaron sobre una tercera columna, para una tercera etapa de purificación. La tercera etapa de purificación se realizó sobre una columna XK (1,6 x 20 cm) empaquetada con 8 ml de resina de interacción hidrófoba (gel TSK, Toyopearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.). La resina se equilibró en tampón citrato 10 mM a pH 6,0 que contenía 5% de etanol. El conjunto de elución de GCD de
la columna previa se cargó a 6 ml/min seguido de lavado con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV alcanzó la línea base. La GCD pura se eluyó por tampón cítrico 10 mM que contenía 50% de etanol, se recogió y se guardó a -20ºC.
La Fig. 4A representa una ejecución convencional de esta etapa de purificación. Las fracciones recogidas durante la ejecución se monitorizaron por ensayo de actividad enzimática (Fig. 4B) y la Fig. 4C muestra la tinción con azul de Coomassie de fracciones de elución ensayadas para actividad.
En una purificación por lotes de células que se procesaron, la proteína rGCD se purificó a un nivel superior al 95%; si sólo se realizan la primera y la tercera etapa, la pureza se logra a un nivel de aproximadamente el 80% (resultados no mostrados).
Análisis bioquímicos
Para validar la identidad de rhGCD purificada se realizó un análisis de espectrometría de masas-espectrometría de masas (EM-EM). Los resultados obtenidos mostraron el 49% de cobertura de la secuencia de proteínas que coincidió con la secuencia de aminoácidos predicha, basándose en el ADN del casete de expresión, que incluye el péptido conductor y secuencias que eligen diana.
Captación y actividad de hGCD recombinante en macrófagos peritoneales
Para determinar si la rhGCD producida en zanahoria se ha glucosilado correctamente y puede experimentar captación por células diana y, por tanto, ser útil para el tratamiento de enfermedad de Gaucher, a continuación se ensayó la capacidad de la rhGCD para unirse a y ser captada por macrófagos. La elección como diana de rhGCD para macrófagos está mediada por el receptor de manosa/N-acetilglucosamina (Man/GlcNAc) y puede determinarse usando macrófagos peritoneales provocados por tioglicolato. Como se muestra por la Fig. 5, la rGCD experimenta captación por células a un alto nivel. La Figura 5A muestra la captación por células de rGCD según la presente invención con respecto a la concentración de manano.
La Figura 5A muestra la captación a niveles comparables con Cerezyme™ (esta preparación se preparó al 80% de pureza con sólo la primera y tercera etapas del procedimiento de purificación descrito anteriormente).
Las Figuras 5B y 5C muestran que la captación de rGCD es a un mayor nivel que la de Cerezyme™, ya que esta preparación se preparó a más del 95% de pureza con las tres etapas del procedimiento de purificación descrito anteriormente.
Con respecto a la Figura 5C, el porcentaje de actividad específica de la actividad total, inhibido por 4 mg/ml de manano, es claramente mayor para la GCD de la presente invención (rGCD o GCD recombinante humana) que para el producto actualmente disponible en el mercado del siguiente modo: GCD (mezcla 1 de CB, que es la rGCD de la presente invención) - 75% de Cerezyme - 65%.
Además, como se muestra por las figuras, la adición de manano inhibió claramente la unión de rGCD por las células. A concentración de 2 mg/ml de manano, la unión de rGCD se inhibió el 50%.
Estos resultados muestran que incluso sin remodelar las estructuras de glucano, la rhGCD expresada y purificada de células de zanahoria transformadas puede experimentar captación para elegir específicamente como diana células de macrófago mediante receptores de Man/GlcNAc. Además, esta rhGCD recombinante es enzimáticamente activa.
La Figura 5D muestra que la rhGCD también es reconocida por un anticuerpo anti-GCD en una transferencia Western; rGCD se refiere a la proteína según la presente invención, mientras que el patrón de GCD (mostrado a 5, 10 y 25 ng por carril) es GCD comercialmente comprada (Cerezyme®).
Ejemplo 4
Pruebas de toxicología
El material obtenido según el procedimiento de purificación anterior se probó según protocolos de prueba de toxicología convencionales (Guidance for Industry on Single Dose Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals, Center for Drug Evaluation and Research (CDER) PT 1 (61 FR 43934, 26 de agosto de 1996) y por la modificación de CPMP/ICH/286/95 ICH M3(M) Non-clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals, 16 de noviembre de 2000).
Los ratones se inyectaron del siguiente modo. Una dosis inicial de 1,8 mg/kg (dosis clínica) fue seguida de dosis de 9 y 18 mg/kg. Los grupos de prueba incluyeron seis ratones (ICR CD-1; 3 machos y 3 hembras) para recibir rGCD (en un vehículo líquido que muestra tampón citrato 25 mM, NaCl 150 mM, 0,01% de Tween 80, 5% de etanol) según la presente invención y otros seis ratones para ser tratados con el vehículo solo como grupo de control. Entonces, los ratones se observaron durante 14 días y se sacrificaron. Ninguno de los ratones murió antes de la eutanasia programada. Ninguno de los ratones mostró ningún efecto significativo del tratamiento.
No se encontraron hallazgos y/o cambios patológicos macroscópicos en el peso corporal en cualquiera de los ratones.
Ejemplo 5
Análisis de glucosilación
Se realizó el análisis de estructuras de glucano presentes en rGCD producida como se describe con respecto a los ejemplos previos. Como se describe en mayor detalle más adelante, los resultados indican que la mayoría de los glucanos contienen residuos de manosa terminales, además de estructuras con alto contenido de manosa. Ventajosamente se encontró que este producto con alto contenido de manosa era biológicamente activo y, por tanto, no se necesitaron etapas adicionales para su activación.
Los siguientes procedimientos se usaron para determinar la estructura de glucosilación de la hGCD recombinante producida según los ejemplos dados anteriormente. Brevemente, los enlaces de monosacárido para tanto N- como O-glucanos se determinaron usando una estrategia de hidrólisis y de EM-CG. Este procedimiento estima el tipo de enlace de los hidratos de carbono con el péptido y la composición de monosacárido general de una glucoproteína. Basándose en el conocimiento previo y también en las relaciones entre diversos monosacáridos, este procedimiento puede sugerir los tipos de glucanos en la glucoproteína. Esta información es importante para estimar las posibles estructuras de glucano presentes en la proteína.
Otro procedimiento mostró el análisis de oligosacáridos de la población de N-glucanos. Se realizaron EM-FAB y EM-MALDI-TOF tras la digestión de alícuotas de las muestras con tripsina y la péptido N-glucosidasa F (PNGasa F) y permetilación de los glucanos. Este procedimiento se usa para desprender y aislar hidratos de carbono N-ligados de la glucoproteína enzimáticamente digerida. Se determinan las masas de las poblaciones de glucano en la mezcla de glucanos aislados y sus masas se comparan con aquellas de estructuras conocidas de bases de datos y en vista del análisis de composición de monosacáridos. Las estructuras propuestas también se basan en los patrones de glucosilación del organismo fuente.
Otro procedimiento incluyó analizar la población de O-glucanos tras la eliminación reductora de los glucopéptidos trípticos y tratados con PNGasa F, desalación y permetilación. Los O-glucanos no son liberados por PNGasa F, por tanto, los glucanos que siguen unidos a péptidos son lo más probablemente glucanos O-ligados. Entonces, estos glucanos son liberados por eliminación reductora y se analiza su masa.
El análisis de la composición de monosacáridos (resumido más adelante) reveló una distribución característica de hexosas, hexosaminas y pentosas característica de la glucosilación de plantas. Las relaciones entre GlcNac y manosa sugieren que las estructuras N-ligadas características son la población de glucanos predominante.
El análisis de espectrometría de masas de los N-glucanos de hGCD producidos como se ha descrito anteriormente indica que la población de N-glucanos predominante tiene la composición de monosacáridos Pent.desoxiHex.Hex3.HexNAc2.
Materiales y procedimientos
El análisis se realizó usando una combinación de espectrometría de masas por cromatografía de gases (EM-CG), espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (EM-FAB) y extracción retardada-espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (ER-EM-MALDI-TOF).
Para el análisis de oligosacáridos, la población de N-glucanos se analizó por EM-FAB y ER-EM-MALDI-TOF tras la digestión de alícuotas de las muestras con tripsina y péptido N-glucosidasa F (PNGasa F) y permetilación de los glucanos. La población de O-glucanos se analizó tras la eliminación reductora de los glucopéptidos trípticos y tratados con PNGasa F, desalación y permetilación.
Los enlaces de monosacáridos para tanto N- como O-glucanos se determinaron usando una hidrólisis, derivatización y estrategia de EM-CG.
Descripción experimental
Muestra
Cuando se recibieron los viales de muestra se les dio números de muestra únicos del siguiente modo (Tabla 1):
Tabla 1
- Producto
- número de referencia
- Glucocerebrosidasa. Cuatro tubos que contenían 1 ml de muestra cada uno a un concentración establecida de 0,8 mg/ml en tampón citrato 25 mM a pH 6,0, 0,01% de Tween 80
- 62995 62996 62997 62998
Las muestras se guardaron entre -10 y -30ºC hasta que se requirieron.
Química de proteínas
Diálisis de muestras intactas
Un vial (que contenía 1 ml de proteína a una concentración establecida de 0,8 mg/ml) se inyectó en un casete de diálisis Slide-A-Lyser (corte de peso molecular 10 kDa) y se dializó a 4ºC durante un periodo de 24 horas contra agua, cambiándose el agua 3 veces. Tras la diálisis, la muestra se sacó del casete y se liofilizó.
Digestión con tripsina de las muestras intactas para el cribado de oligosacárido
La muestra liofilizada dializada se resuspendió en tampón bicarbonato de amonio 50 mM ajustado a pH 8,4 con 10% de amoniaco ac. y se digirió con tripsina tratada con TPCK durante 4 horas a 37ºC según los SOP B001 y B003. La reacción se terminó disponiéndola en un bloque térmico a 95ºC durante 2 minutos seguido de liofilización.
Química de hidratos de carbono
Digestión de la péptido N-glucosidasa A
Las mezclas de péptido/glucopéptido trípticamente escindidas de la muestra de glucoproteínas se trató con la enzima péptido N-glucosidasa A (PNGasa A) en tampón acetato de amonio, pH 5,5 a 37ºC durante 15 horas. La reacción se detuvo por liofilización. Los productos resultantes se purificaron usando un cartucho C18 Sep-Pak.
Eliminación reductora
La fracción de Sep-Pak que contenía posibles glucopéptidos O-ligados se disolvió en una disolución de 10 mg/ml de borohidruro de sodio en hidróxido sódico 0,05 M y se incubó a 45ºC durante 16 horas. La reacción se terminó mediante la adición de ácido acético glacial.
Desalación del material reductoramente eliminado
La desalación usando perlas Dowex se realizó según el SOP B022. La muestra se cargó sobre la columna y se eluyó usando 4 ml de 5% de ácido acético ac. Se liofilizó la fracción recogida.
Permetilación de hidratos de carbono liberados
Los hidratos de carbono N-ligados que se eluyeron en la fracción Sep-Pak con 5% de ácido acético ac. y posibles glucanos O-ligados liberados por eliminación reductora se permetilaron usando el procedimiento de hidróxido sódico (NaOH)/yoduro de metilo (MeI) (SOP B018). Una parte de la mezcla de glucanos N-ligados permetilados se analizó por EM-FAB y EM-MALDI-TOF y el resto se sometió a análisis de enlaces.
Análisis de enlaces del hidrato de carbono N-ligado
Derivatización
Las mezclas de muestra de glucanos permetilados obtenidas tras la digestión tríptica y con PNGasa A o eliminación reductora se hidrolizaron (TFA 2 M, 2 horas a 120ºC) y se redujeron (borodeuteruro de sodio (NaBD4) en NH4OH 2 M, 2 horas a temperatura ambiente, SOP B025). El borato producido en la descomposición del borodeuteruro se eliminó por 3 adiciones de una mezcla de metanol en ácido acético glacial (90:10) seguido de liofilización. Entonces, las muestras se acetilaron usando anhídrido acético (1 hora a 100ºC). Las muestras acetiladas se purificaron por extracción en cloroformo. Entonces, los acetatos de alditol parcialmente metilados se examinaron por espectrometría de masas/cromatografía de gases (EM/CG). También se ejecutaron mezclas patrón de acetatos de alditol parcialmente metilados y un blanco bajo las mismas condiciones.
Espectrometría de masas/cromatografía de gases (EM/CG)
Una alícuota (1 μl) de las muestras de hidratos de carbonos derivatizadas disuelta en hexano se analizó por EM/CG usando un espectrómetro de masas Perkin Elmer Turbomass Gold con un cromatógrafo de gases Autosystem XL y un sistema de datos Dell bajo las siguientes condiciones:
- Cromatografía de gases
- Columna:
- DB5
- Inyección:
- Sobre la columna
- Temperatura del inyector:
- 40ºC
- Programa:
- 1 minuto a 40ºC, luego 70ºC/minuto hasta 100ºC, mantenimiento a 100ºC durante 1
- minuto, luego 8ºC/minuto hasta 290ºC, finalmente mantenimiento a 290ºC durante 5
- minutos.
- Gas portador:
- Helio
- Espectrometría de masas
- Voltaje de ionización:
- 70 eV
- Modo de adquisición:
- barrido
- Intervalo de masa:
- 35-450 Dalton
- Resolución de EM:
- Unidad
Análisis de azúcares de glucocerebrosidasa intacta
Derivatización
Una alícuota equivalente a 500 μg de glucocerebrosidasa se liofilizó con 10 μg de arabitol como patrón interno. Ésta se metanolizó luego durante la noche a 80ºC y se secó bajo nitrógeno. Los monosacáridos liberados se re-Nacetilaron usando una disolución de metanol, piridina y anhídrido acético, se secaron de nuevo bajo nitrógeno y se convirtieron en sus derivados de trimetilsililo (TMS) según la SOP B023. Los derivados de TMS se redujeron en volumen bajo nitrógeno, se disolvieron en 2 ml de hexano y se sonicaron durante 3 minutos. Entonces se dejó que las muestras se equilibraran a 4ºC durante la noche. En paralelo se prepararon un blanco que contenía 10 μg de arabitol y una mezcla de monosacáridos patrón que contenía 10 μg de cada uno de fucosa, xilosa, manosa, galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, ácido N-acetilneuramínico y arabitol. Entonces, los derivados de TMS se examinaron por espectrometría de masas/cromatografía de gases (EM/CG).
Espectrometría de masas/cromatografía de gases (EM/CG)
Una alícuota (1 μl) de la muestra de hidratos de carbonos derivatizada disuelta en hexano se analizó por EM/CG usando un espectrómetro de masas Perkin Elmer Turbomass Gold con un cromatógrafo de gases Autosystem XL y un sistema de datos Dell bajo las siguientes condiciones:
Cromatografía de gases
Columna: DB5 Inyección: Sobre la columna Temperatura del inyector: 40ºC Programa: 1 minuto a 90ºC, luego 25ºC/minuto hasta 140ºC, 5ºC/minuto hasta 220ºC, finalmente
10ºC/minuto hasta 300ºC y mantenimiento a 300ºC durante 5 minutos. Gas portador: Helio
Espectrometría de masas
Voltaje de ionización: 70 eV Modo de adquisición: barrido Intervalo de masa: 50-620 Dalton Resolución de EM: Unidad
Extracción retardada-espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (ER-EM-MALDI-TOF) y espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (EM-FAB)
La espectrometría de masas MALDI-TOF se realizó usando un espectrómetro de masas por desorción láser Voyager STR Biospectrometry Research Station acoplado a extracción retardada (ER).
Los glucanos permetilados secados se redisolvieron en metanol:agua (80:20) y se analizaron usando una matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico. Como calibradores externos se usaron bradiquinina, angiotensina y ACTH.
Los análisis de espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos de iones positivos se llevaron a cabo en el espectrómetro de masas M-Scan's VG AutoSpecE que operaba a Vac = 8 kV durante 4500 de intervalo de masa a sensibilidad completa con una resolución de aproximadamente 2500. Se usó una pistola de ión cesio para generar espectros que operaban a 30 kV. Los espectros se registraron en un sistema de datos VAX 3100 M76 usando el software Opus.
Los glucanos permetilados secados se redisolvieron en metanol y se cargaron sobre una diana previamente embadurnada con 2-4 μl de tioglicerol como matriz antes de la inserción en la fuente.
Resultados y discusión
Análisis de azúcares con TMS de glucocerebrosidasa
Cribado de oligosacáridos N-ligados
La glucoproteína intacta se sometió a diálisis, seguido de digestión con tripsina, y los productos liofilizados se digirieron usando PNGasa A y luego se purificaron usando C18 Sep-Pak. La fracción de 5% de ácido acético ac. (que contenía oligosacáridos N-ligados) se permetiló y los espectros de masas de FAB se obtuvieron usando una parte del oligosacárido derivatizado en un intervalo de baja masa para los iones del fragmento y se obtuvieron espectros de masas de ER-MALDI-TOF usando una parte de los oligosacáridos derivatizados en un intervalo de alta masa para los iones moleculares.
Análisis de N-glucanos de glucocerebrosidasa
La Tabla 1 enumera los iones de fragmentos predominantes presentes en los espectros de FAB e iones moleculares presentes en los espectros de MALDI. La región de iones moleculares (mostrada en el Apéndice III) contiene una señal predominante a m/z 1505,8 (de acuerdo con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent.desoxiHex.Hex3.HexNAc2). También se detectó un intervalo de iones cuasimoleculares menos intensos de acuerdo con estructuras complejas y con alto contenido de manosa. Las estructuras con alto contenido de manosa detectadas oscilan en tamaño de Hex5.HexNAc2 a m/z 1579,8 a Hex8.HexNAc2 a m/z 2193,0. Las señales complejas se producen de N-glucanos menos exhaustivamente procesados tales como m/z 1331,7 (de acuerdo con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent.Hex3.HexNAc2) o de N-glucanos mayores, por ejemplo m/z 1751,0 (de acuerdo con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent.desoxiHex.Hex3.HexNAc3), m/z 2375,4 (de acuerdo con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent.desoxiHex2.Hex4.HexNAc4) y m/z 2753,6 (de acuerdo con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent.desoxiHex3.Hex5.HexNAc4).
El espectro de masas de FAB proporciona información referente a estructuras de antena por medio de iones de fragmentos en la región de baja masa del espectro (datos no mostrados). Se detectaron señales que identificaron hexosa (a m/z 219) y HexNAc (a m/z 260) como monosacáridos terminales no reductores en los N-glucanos.
Tabla 2: Masas observadas en los espectros permetilados de glucocerebrosidasa (número de referencia 62996) tras la digestión tríptica y con la péptido N-glucosidasa A
- Señales observadas (m/z)
- Posible asignación
- Baja masa
- 219
- Hex+
- 228
- HexNAc+ (- metanol)
- 260
- HexNAc+
- Alta masa
- 1032,4
- Pent.Hex3.HexNAc+
- 1171,5
- Hex3.HexNAc2OMe + Na+
- 1299,6
- Eliminación de fucosa de m/z 1505,8
- 1331,6
- Pent.Hex3.HexNAc2OMe + Na+
- 1345,6
- desoxiHex.Hex3.HexNAc2OMe + Na+
- 1505,7
- Pent.desoxiHex.Hex3.HexNAc2OMe + Na+
- 1579,8
- Hex5.HexNAc2OMe + Na+
- 1709,9
- Pent.desoxiHex.Hex4.HexNAc2OMe + Na+
- 1750,9
- Pent.desoxiHex.Hex3.HexNAc3OMe + Na+
(continuación)
- Señales observadas (m/z)
- Posible asignación
- 1783,9
- Hex6.HexNAc2OMe + Na+
- 1989,0
- Hex7.HexNAc2OMe + Na+
- 1997,0
- Pent.desoxiHex.Hex3.HexNAc4OMe + Na+
- 2027,0
- No asignado
- 2099,0
- No asignado
- 2130,0
- Pent.desoxiHex2.Hex4.HexNAc3OMe + Na+
- 2193,1
- Hex8.HexNAc2OMe + Na+
- 2375,2
- Pent.desoxiHex2.Hex4.HexNAc4OMe + Na+
- 2753,4
- Pent.desoxiHex3.Hex5.HexNAc4OMe + Na+
Todas las masas en la columna uno son monoisotópicas, a menos que se establezca de otro modo. Los números másicos pueden no relacionarse directamente con los datos brutos ya que el software frecuentemente asigna 5 números másicos a picos de isótopos de 13C, particularmente para masas superiores a 1700 Da.
Análisis de enlaces de N-glucanos de glucocerebrosidasa
El análisis de enlaces se realizó en los hidratos de carbono N-ligados liberados tras la digestión con PNGasa A, purificación con Sep-Pak y permetilación.
Se obtuvo un cromatograma complejo con algunos picos de impurezas que se originaron a partir de los reactivos de 10 derivatización. La comparación del tiempo de retención y los espectros con mezclas patrón permitieron asignaciones provisionales del azúcar que contenía los picos enumerados en la Tabla 3.
Tabla 3: Tiempos de retención de los monosacáridos diversamente ligados detectados como sus acetatos de alditol parcialmente metilados en el análisis de EM-CG de glucocerebrosidasa (número de referencia 62996) tras la digestión tríptica y con la péptido N-glucosidasa A
- Compuestos observados
- Tiempo de retención (min) de glucocerebrosidasa (62996)
- Xilosa terminal
- 10,41
- Fucosa terminal
- 10,84
- Manosa terminal
- 12,29 (principal)
- Galactosa terminal
- 12,55
- Manosa ligada en 2
- 13,40
- Glucosa ligada en 4
- 13,58
- Manosa ligada en 2,6
- 14,91
- Manosa ligada en 3,6
- 15,08
- Manosa ligada en 2,3,6
- 15,87
- GlcNAc ligado en 4
- 16,73
- GlcNAc ligado en 3,4
- 17,59
Cribado de oligosacáridos ligado en 4,3-O
La eliminación reductora se llevó a cabo en la fracción del 60% de 2-propanol (posible fracción de glucopéptidos Oligados) de la purificación de Sep-Pak de glucocerebrosidasa tras las digestiones con tripsina y PNGasa A. La
muestra se desaló tras terminarse la reacción y, después de la eliminación del borato, se permetiló. Se obtuvieron espectros de masas de FAB usando una parte del oligosacárido derivatizado en un intervalo de baja masa para los iones de fragmentos y se obtuvieron espectros de masas de ER-MALDI-TOF usando una parte de los oligosacáridos derivatizados en un intervalo de alta masa para iones moleculares. No se observaron señales de acuerdo con la presencia de glucanos O-ligados (datos no mostrados).
Análisis de enlaces de O-glucanos de glucocerebrosidasa
El análisis de enlaces se llevó a cabo en los productos de la eliminación reductora después de la permetilación. No se observaron señales de acuerdo con la presencia de glucanos O-ligados típicos (datos no mostrados).
La Figura 6 muestra algunas estructuras de glucanos a modo de ejemplo como una comparación entre GCD obtenida de células CHO (ovario de hámster chino), que son células de mamífero (Cerezyme™), y la GCD de la presente invención, de células de zanahoria. Como se muestra, se requiere la remodelación de estas estructuras para obtener residuos de manosa expuestos a Cerezyme™. A diferencia, tales residuos de manosa expuestos se obtienen directamente para la GCD obtenida de células vegetales según la presente invención, sin requerir manipulación adicional, por ejemplo, con glucosilasas.
La Figura 7 representa la estructura de glucanos principal encontrada en rGCD. La Figura 7 muestra estructuras propuestas de: a) la población de oligosacáridos predominante encontrada en hGC expresada en suspensión de células de zanahoria (1505,7 m/z); b) núcleo N-ligado típico; c) núcleo N-ligado vegetal fucosilado. Los glucanos Nligados se acoplan a la proteína por asparagina y mediante el extremo reductor del residuo de GlcNac (GN) a la derecha de los diagramas. Patrones de N-glucosilación de plantas, los residuos de fucosa pueden ser parte de la estructura central, unida al primer GlcNac usando un enlace alfa(1-3)-glucosídico, mientras que las estructuras de mamífero normalmente usan el enlace alfa(1-6)-glucosídico.
Las Figuras 8A-8D muestran todas las posibles estructuras para los N-glucanos detectados en la proteína rGCD según la presente invención.
La estructura de glucanos dominante que se identificó es la estructura de glucanos central encontrada en la mayoría de las glucoproteínas vegetales de guisante, arroz, maíz y otras plantas comestibles. Esta estructura contiene un residuo de xilosa central, además de una alfa-(1,3)-fucosa central. El trabajo realizado por Bardor y col. (33) muestra que el 50% de los donantes de sangre no alérgico tienen anticuerpos específicos para la xilosa central en sus sueros y el 25% tiene anticuerpos específicos para la alfa-(1,3)-fucosa central. Sin embargo todavía tiene que estudiarse si tales anticuerpos podrían introducir limitaciones al uso de glucoproteínas biofarmacéuticas derivadas de las plantas.
Las poblaciones de glucanos secundarias de la hGCD producida como se ha descrito anteriormente fueron principalmente las estructuras con alto contenido de manosa Hex4HexNAc2 a Hex8HexNAc2. Entre las estructuras complejas se presentaron estructuras tales como Pent.desoxiHex2.Hex4.HexNAc3 y Pent.desoxiHex3.Hex5.HexNAc3. Pent.Hex3.HexNAc2 se detectó en proporciones más pequeñas.
Los monosacáridos terminales principales son hexosa (manosa o galactosa) y N-acetilhexosamina, que está de acuerdo con la presencia de estructuras con alto contenido de manosa y estructuras complejas parcialmente procesadas.
Con respecto al cribado de oligosacáridos O-ligados, no se observaron señales que estuvieran de acuerdo con glucanos O-ligados típicos. La GCD se conoce en la técnica por no tener oligosacáridos O-ligados, de forma que estos resultados están de acuerdo con la glucosilación conocida de GCD de otros sistemas de células, que incluye GCD nativa y GCD recombinante producida en sistemas de cultivo de mamífero. Sin embargo, en la composición de monosacáridos se detectaron señales de acuerdo con arabinosa.
Un punto importante es que la composición de N-glucanos de la proteína hGCD mostró que la mayoría de los Nglucanos terminan con residuos de manosa. Esto está de acuerdo con el requisito de que la manosa termine Nglucanos que ayudan en la captación de hGCD terapéutica por el macrófago receptor de manosa. Sin embargo, ni GCD nativa ni GCD recombinante producidas en células de mamífero tienen alto contenido de manosa. Por tanto, la presente invención vence un inconveniente significativo de las proteínas hGCD comercialmente producidas, que es que estas proteínas están modificadas para terminar con azúcares de manosa, a diferencia de la proteína producida como se ha descrito anteriormente.
LISTADO DE SECUENCIAS
SEC ID Nº: 1
Secuencia de aminoácidos del péptido señal de RE:
MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEF
SEC ID Nº: 2
Secuencia de aminoácidos de la señal que elige diana vacuolar de la quitinasa A de tabaco: DLLVDTM
SEC ID Nº: 3
Secuencia de ácidos nucleicos del cebador directo:
5 cagaattcgcccgcccctgca
SEC ID Nº: 4
Secuencia de ácidos nucleicos del cebador inverso:
ctcagatcttggcgatgccaca
SEC ID Nº: 5
10 Secuencia de ácidos nucleicos del cebador directo del promotor 35S: ctcagaagaccagagggct
SEC ID Nº: 6
Secuencia de ácidos nucleicos del cebador inverso del terminador: caaagcggccatcgtgc 15 SEC ID Nº: 7 Secuencia de ácidos nucleicos de ADNc de GCD humana usado para las construcciones de la invención
SEC ID Nº: 8
Secuencia de aminoácidos de glucocerebrosidasa
SEC ID Nº: 9
Secuencia de ácidos nucleicos del promotor 35S
SEC ID Nº: 10
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido señal de RE atgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctc ctatcattatcctcggccgaattc
SEC ID Nº: 11
Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia que elige vacuolar como diana gatcttttagtcgatactatg
SEC ID Nº: 12
Secuencia de ácidos nucleicos del terminador
SEC ID Nº: 13
Secuencia de ácidos nucleicos del casete de expresión de la invención
SEC ID Nº: 14
Secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante de la invención
REFERENCIAS
- 1.
- Ma, J. K. C, Drake, P.M.W. y Christou, P. (2003) Nature reviews 4, 794-805
- 2.
- Lerouge, P., Cabanes-Macheteau, M, Rayon, C, Fischette-Laine, A.C., Gomord, V, Faye, L. (1998) Plant Mol Biol 38, 31-48
- 3.
- Lee, R E. (1982) Prog Clin Biol Res 95, 177-217
- 4.
- Grabowski, G. (1993) Adv Hum Genet. 21, 377-441
- 5.
- Grabowski, G. A. y Hopkin, R. J. (2003) Annual Review of Genomics and Human Genetics 4, 403-436
- 6.
- Sorge, J. W., C.Westwood, B., Beutler, E. (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 7289-7293
- 7.
- Berg-Fussman, A., Grace, M., loannou, Y. y Grabowski, G. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14861-14866
- 8.
- Grace, M., Grabowski, GA. (1990) Biochem Biophys Res Commun 168, 771-777
- 9.
- Grace, M., Newman, K., Scheinker, V., Berg-Fussman, A. y Grabowski, G. (1994) J. Biol. Chem. 269,22832291
- 10.
- Barton, N. W., Brady, R.O., Dambrosia, J.M., Di Bisceglie, A.M., Doppelt, S.H:, Hill, S.C., Mankin, H.J., Murray, G.J., Parker, R.I., Argoff, C.E., et al. (1991) N Engl J Med. 324,1464-1470
- 11.
- Grabowski, G. A., Barton, N. W., Pastores, G., Dambrosia, J. M., Banerjee, T. K., McKee, M. A., Parker, C, Schiffmann, R., Hill, S.C. y Brady, R. O. (1995) Ann Intern Med 122, 33-39
- 12.
- Pastores, G. M., Sibille, A.R., Grabowski, G.A. (1993) Blood 82, 408-416.
- 13.
- Weinreb, N. J., Charrow, J, Andersson, H.C., Kaplan, P, Kolodny, E.H., Mistry, P, Pastores, G, Rosenbloom, B.E., Scott, C.R., Wappner, R.S., Zimran, A. (2002) Am J Med. 113, 112-119
- 14.
- Bijsterbosch, M. K., Donker, W, van de Bilt, H, van Weely, S, van Berkel, T.J., Aerts, JM. (1996) Eur J Biochem 237, 344-3 49
- 15.
- Friedman, B., Vaddi, K., Preston, C, Mahon, E., Cataldo, J. R. y McPherson, J. M. (1999) Blood 93,28072816
- 16.
- Furbish, F. S., Steer, C.J., Krett, N.L., Barranger, J.A. (1981) Biochim Biophys Acta 673, 425-434
- 17.
- Doebber, T., Wu, M., Bugianesi, R, Ponpipom, M., Furbish, F., Barranger, J., Brady, R y Shen, T. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2193-2199
- 18.
- Dwek, R A., Butters, T.D., Piatt, F.M., Zitzmann, N. (2002) Nature reviews 1, 65-75
- 19.
- Neuhaus, J. M., Rogers, J.C. (1998) Plant Mol Biol 38,127-144
- 20.
- Vitale, A y Galili, G. (2001) Plant Physiol. 125,115-118
- 21.
- Hellens, R., Edwards, EA., Leyland, N.R., Bean, S., Mullineaux, P.M. (2000) Plant Mol Biol 42, 819-832
- 22.
- Wurtele, E. S., Bulka, K. (1989) Plant Sci 61, 253-262
- 23.
- den Dulk-Ras, A., Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol Biol. 55, 63-72
- 24.
- Laemmli, U. K. (1970) Nature reviews 227, 680-685
- 25.
- Bradford, M. M. (1976) Anal Biochem 72, 248-254
- 26.
- Stahl, P. G. S. (1982) J Cell Biol 93, 49-56
- 27.
- Takasaki, S., Murray, G., Furbish, F., Brady, R., Barranger, J. y Kobata, A. (1984) J. Biol. Chem. 259, 10112-10117
5 28. Lerouge, P., Cabanes-Macheteau, M., Rayon, C, Fitchette-Laine, A. C, Gomord, V. y Faye, L. (1998) Plant Mol. Biol. 38, 31-48
- 29.
- Frigerio, L, Pastres, A., Prada, A. y Vitale, A. (2001) Plant Cell 13, 1109-1126
- 30.
- Frigerio, L, de Virgilio, M, Prada, A., Faoro, F. y Vitale, A. (1998) Plant Cell 10,1031-1042
- 31.
- Hadlington JL, D. J. (2000) Curr Opin Plant Biol. 3, 461-468.
10 32. Okamoto, T., Shimada, T., Hara-Nishimura, I., Nishimura, M. y Minamikawa, T. (2003) Plant Physiol. 132, 1892-1900
33. Bardor, M., Faveeuw, C, Fitchette, A.-C, Gilbert, D., Galas, L, Trottein, F., Faye, L y Lerouge, P. (2003) Glycobiology 13, 427-434
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Una proteína glucocerebrosidasa humana que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 7, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosa expuesta, al menos una fucosa que tiene un enlace alfa(1-3)-glucosídico y al menos una xilosa, y está ligada en su5 extremo C a un péptido señal que elige dianas vacuolares como se expone en SEC ID Nº: 2.
-
- 2.
- La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa humana está ligada en su extremo N a un péptido señal de retículo endoplasmático.
-
- 3.
- La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 2, en la que dicho péptido señal de retículo endoplasmático es como se expone en SEC ID Nº: 1.
10 4. La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 3 que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 14. - 5. La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa es una proteína aislada.
- 6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1 y un 15 vehículo farmacéuticamente aceptable.
-
- 7.
- Una célula vegetal que expresa la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1.
-
- 8.
- Una célula vegetal que expresa la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 2.
-
- 9.
- La célula vegetal de la reivindicación 7, en la que dicha célula vegetal es una célula de zanahoria.
-
- 10.
- La célula vegetal de la reivindicación 8, en la que dicha célula vegetal es una célula de zanahoria.
20 11. La célula vegetal de la reivindicación 7 u 8, en la que la estructura de glucano principal de dicha proteína glucocerebrosidasa de dicha célula vegetal comprende manosa expuesta. - 12. Una composición farmacéutica para administración por vía oral que comprende células vegetales de la reivindicación 7 u 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
- 13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que dichas células vegetales son células de 25 zanahoria.
- 14. Uso de la composición farmacéutica como se define por la reivindicación 12 ó 13 para el tratamiento de enfermedad de Gaucher por administración por vía oral.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL15558803A IL155588A0 (en) | 2003-04-27 | 2003-04-27 | Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby |
IL15558803 | 2003-04-27 | ||
PCT/IL2004/000181 WO2004096978A2 (en) | 2003-04-27 | 2004-02-24 | Production of high mannose proteins in plant culture |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2391057T3 true ES2391057T3 (es) | 2012-11-21 |
Family
ID=32697072
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04713966T Expired - Lifetime ES2391057T3 (es) | 2003-04-27 | 2004-02-24 | Glucocerebrosidasa con alto contenido y de manosa y su producción en cultivo vegetal |
ES10012376.9T Expired - Lifetime ES2446965T3 (es) | 2003-04-27 | 2004-02-24 | Producción de glucocerebrosidasa humana con alto contenido de manosa en cultivo vegetal |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES10012376.9T Expired - Lifetime ES2446965T3 (es) | 2003-04-27 | 2004-02-24 | Producción de glucocerebrosidasa humana con alto contenido de manosa en cultivo vegetal |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060204487A1 (es) |
EP (6) | EP2330205B1 (es) |
JP (2) | JP4993693B2 (es) |
KR (3) | KR101332372B1 (es) |
CN (2) | CN102240397A (es) |
AU (1) | AU2004234635B2 (es) |
BR (1) | BRPI0410520B8 (es) |
CA (1) | CA2523539C (es) |
CY (1) | CY1114893T1 (es) |
DK (1) | DK2333083T3 (es) |
ES (2) | ES2391057T3 (es) |
HK (1) | HK1088041A1 (es) |
IL (3) | IL155588A0 (es) |
MX (1) | MXPA05011507A (es) |
PT (1) | PT2333083E (es) |
RU (2) | RU2385928C3 (es) |
SG (2) | SG2007172737A (es) |
SI (1) | SI2333083T1 (es) |
UA (1) | UA89944C2 (es) |
WO (1) | WO2004096978A2 (es) |
ZA (1) | ZA200508680B (es) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050032211A1 (en) * | 1996-09-26 | 2005-02-10 | Metabogal Ltd. | Cell/tissue culturing device, system and method |
US20030100945A1 (en) | 2001-11-23 | 2003-05-29 | Mindguard Ltd. | Implantable intraluminal device and method of using same in treating aneurysms |
US7951557B2 (en) * | 2003-04-27 | 2011-05-31 | Protalix Ltd. | Human lysosomal proteins from plant cell culture |
US20080274557A1 (en) * | 2005-03-03 | 2008-11-06 | Indiana University Research And Technology | Permethylation Of Oligosaccharides |
WO2007010533A2 (en) * | 2005-07-18 | 2007-01-25 | Protalix Ltd. | Mucosal or enteral administration of biologically active macromolecules |
WO2008053025A1 (en) | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Rheinisch-Westfaelische Technische Hochschule Aachen | Therapeutic use of gba2 |
ES2660667T3 (es) | 2007-05-07 | 2018-03-23 | Protalix Ltd. | Biorreactor desechable a gran escala |
ES2564685T3 (es) * | 2007-07-03 | 2016-03-28 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Vacuna contra la enfermedad de edema porcino |
US8742079B2 (en) | 2007-08-20 | 2014-06-03 | Protalix Ltd. | Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof |
ITUD20080055A1 (it) * | 2008-03-13 | 2009-09-14 | Transactiva S R L | Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali |
JP5305284B2 (ja) * | 2008-03-26 | 2013-10-02 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖化合物の質量分析法 |
WO2010117786A1 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Influenza virus vaccines and uses thereof |
WO2011017177A1 (en) | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Shire Human Genetic Therapies | Compositions and methods for treating gaucher disease |
RU2569744C2 (ru) | 2009-08-28 | 2015-11-27 | Маунт Синай Скул Оф Медсин | Ферментная заместительная терапия с увеличением дозы для лечения недостаточности кислой сфингомиелиназы |
US9194011B2 (en) | 2009-11-17 | 2015-11-24 | Protalix Ltd. | Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof |
WO2011061736A1 (en) | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Protalix Ltd. | Alkaline alpha galactosidase for the treatment of fabry disease |
EP2542572B1 (en) | 2010-03-02 | 2015-05-06 | Protalix Ltd. | Multimeric forms of therapeutic proteins and uses thereof |
KR20130075732A (ko) | 2010-03-30 | 2013-07-05 | 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 | 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 |
WO2012001641A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Actelion Pharmaceuticals Ltd | Stable pharmaceutical compositions |
US20130224797A1 (en) * | 2010-10-15 | 2013-08-29 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for producing glycoprotein having mannose residue as non-reducing end of sugar chain |
DK2665814T3 (en) * | 2011-01-20 | 2017-09-11 | Protalix Ltd | NUCLEIC ACID CONSTRUCTION FOR EXPRESSION OF ALPHA-GALACTOSIDASE IN PLANTS AND PLANT CELLS |
KR101158673B1 (ko) * | 2011-06-24 | 2012-07-03 | 주식회사 지씨바이오 | 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법 |
US20160145589A1 (en) | 2011-06-24 | 2016-05-26 | Green Cross Corporation | Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof |
AU2012312529B2 (en) | 2011-09-20 | 2018-01-04 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
CA2863829A1 (en) * | 2012-02-19 | 2013-08-22 | Protalix Ltd. | Oral unit dosage forms and uses of same for the treatment of gaucher disease |
KR102096752B1 (ko) | 2012-03-02 | 2020-04-02 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | Iii형 고셔병을 치료하기 위한 조성물 및 방법 |
WO2014099931A1 (en) | 2012-12-18 | 2014-06-26 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
US10087452B2 (en) | 2013-02-28 | 2018-10-02 | Wellkey Holdings Limited | Method for agrobacterium mediated transformation of cambial meristematic plant cells to produce recombinant protein |
JP6454650B2 (ja) | 2013-03-06 | 2019-01-23 | プロタリクス リミテッド | TNFαポリペプチド阻害剤を発現する植物細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物 |
WO2014159960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof |
EP2789686A1 (en) | 2013-04-11 | 2014-10-15 | Greenovation Biotech GmbH | Expression of phosphorylated glycoproteins in plants |
US20170101633A1 (en) | 2014-02-10 | 2017-04-13 | Protalix Ltd. | Method of maintaining disease stability in a subject having gaucher's disease |
WO2016007909A2 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Biostrategies LC | Materials and methods for treating disorders associated with sulfatase enzymes |
US10000551B2 (en) | 2014-09-11 | 2018-06-19 | Protalix Ltd. | Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same |
EA038931B9 (ru) * | 2014-11-20 | 2022-02-18 | Йиссум Рисерч Дивелопмент Компани Оф Зе Хебрю Юниверсити Оф Иерусалим Лтд. | Композиции и способы получения полипептидов с модифицированным профилем гликозилирования в клетках растений |
CA2974699A1 (en) | 2015-01-23 | 2016-07-28 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccination regimens |
AU2016232149B2 (en) * | 2015-03-17 | 2021-09-23 | eleva GmbH | Glycosylated lysosomal proteins, method of production and uses |
EP3454964B1 (en) * | 2016-05-13 | 2021-06-23 | Agilent Technologies, Inc. | Automated alignment, calibration and standardization of electrophoresis data |
BR112018075032A2 (pt) | 2016-06-15 | 2019-03-26 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | proteínas de hemaglutinina do vírus influenza e seus uso |
EP3606555A4 (en) | 2017-04-07 | 2021-08-04 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES |
RU2668158C1 (ru) * | 2017-06-28 | 2018-09-26 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" | Способ очистки имиглюцеразы |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US467993A (en) * | 1892-02-02 | Alfred jorgensen | ||
US2147271A (en) * | 1937-07-16 | 1939-02-14 | Schwarz Lab Inc | Pure yeast culture apparatus |
US2341259A (en) * | 1941-01-22 | 1944-02-08 | Lummus Co | Inoculating method and apparatus |
US2836434A (en) * | 1952-08-21 | 1958-05-27 | Separator Ab | Arrangement for sterile interconnection and sealing of apparatuses in a plant for instance for cultivation of bacteria |
US3201327A (en) * | 1962-08-21 | 1965-08-17 | Sun Oil Co | Fermentation apparatus and process |
SE371208B (es) * | 1966-10-06 | 1974-11-11 | Sanraku Ocean Co | |
US3468520A (en) * | 1967-05-12 | 1969-09-23 | American Cyanamid Co | Combination agitation and transfer unit for suspended cells |
US3504185A (en) * | 1968-05-09 | 1970-03-31 | Univ Syracuse Res Corp | Apparatus for measuring and controlling cell population density in a liquid medium |
GB1284077A (en) * | 1968-10-18 | 1972-08-02 | British Petroleum Co | Process and apparatus for the cultivation of micro-organisms |
US3540700A (en) * | 1969-01-24 | 1970-11-17 | New Brunswick Scientific Co | Rotary processing apparatus |
DE2059931C3 (de) * | 1970-12-05 | 1973-10-18 | Knapsack Ag, 5033 Huerth-Knapsack | Verfahren zum Verhindern von Schaumausbrüchen aus geschlossenen Reaktionsräumen |
US3950227A (en) * | 1970-12-21 | 1976-04-13 | St. John's University | Batch method of establishing and maintaining a controlled aerobic environment for a microbial culture |
US3793154A (en) * | 1970-12-21 | 1974-02-19 | Univ St Johns | Apparatus for gaseous environmental control of batch cultures of micro-organisms |
US4179339A (en) * | 1977-03-02 | 1979-12-18 | Olympus Optical Company, Ltd. | Liquid feeder for automatic culture apparatus |
US4228243A (en) * | 1978-07-13 | 1980-10-14 | Toray Industries, Inc. | Cell culture propagation apparatus |
US4328317A (en) * | 1980-03-31 | 1982-05-04 | Solargizer International, Inc. | Continuous chemical conversion or fermentation apparatus |
DE3133314A1 (de) * | 1981-08-22 | 1983-03-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "vorrichtung zum dispergieren einer zweiten phase in einer ersten phase" |
US4519984A (en) * | 1982-01-18 | 1985-05-28 | Phillips Petroleum Company | Apparatus for carrying out sparged reaction |
CH663422A5 (de) * | 1982-05-27 | 1987-12-15 | Chemap Ag | Verfahren und fermenter zur zuechtung von gewebezellen. |
US4708938A (en) * | 1984-04-30 | 1987-11-24 | Hickinbotham Winemakers Pty. Ltd. | Alcoholic fermentation |
US4668632A (en) * | 1985-02-06 | 1987-05-26 | Vxr, Inc. | Sparger and apparatus for and method of growing cells |
US5372945A (en) * | 1985-06-06 | 1994-12-13 | Alchas; Paul G. | Device and method for collecting and processing fat tissue and procuring microvessel endothelial cells to produce endothelial cell product |
CN85100412B (zh) * | 1985-06-25 | 1988-02-10 | 山东省食品发酵工业研究所 | 用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及其用于高果糖糖浆的生产方法 |
US4713345A (en) * | 1985-07-29 | 1987-12-15 | Grain Processing Corporation | Fermentation methods and apparatus |
EP0224962A1 (en) * | 1985-11-25 | 1987-06-10 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur | Apparatus for the continuous cultivation of microorganisms in a culture liquid |
US5166072A (en) * | 1986-06-26 | 1992-11-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Apparatus for the cultivation of immobilized micro-organisms |
US4717668A (en) * | 1986-12-12 | 1988-01-05 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Plastic roller bottle for suspension cultures |
US5081036A (en) * | 1987-01-23 | 1992-01-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method and apparatus for cell culture |
US4908315A (en) * | 1987-03-04 | 1990-03-13 | Agristar, Inc. | Integument and method for micropropagation and tissue culturing |
KR970001000B1 (ko) * | 1987-11-28 | 1997-01-25 | 닛본 신야쿠 가부시기가이샤 | 아미노디옥시만니톨의 제법 |
US6846968B1 (en) * | 1988-02-26 | 2005-01-25 | Large Scale Biology Corporation | Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression |
US4931401A (en) * | 1988-09-01 | 1990-06-05 | La Societe De Recherche Snc Inc. | Bioreactor |
US5073491A (en) * | 1988-12-23 | 1991-12-17 | Hoffman-La Roche Inc. | Immobilization of cells in alginate beads containing cavities for growth of cells in airlift bioreactors |
US5549892A (en) | 1988-12-23 | 1996-08-27 | Genzyme Corporation | Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase |
US5100801A (en) * | 1989-01-26 | 1992-03-31 | Biocontrol Systems, Inc. | Device for sequential microbial enrichment in a single apparatus |
US5188946A (en) * | 1989-01-26 | 1993-02-23 | Biocontrol Systems Incorporated | Process and device for sequential microbial enrichment in a single apparatus |
JP2514102B2 (ja) * | 1990-06-13 | 1996-07-10 | ユリカ株式会社 | ユリ科アロエ属に属する植物の真空凍結乾燥体を利用した錠剤製品及びその製造方法 |
EP0462065B1 (de) | 1990-06-15 | 2005-03-02 | Syngenta Participations AG | Neue Signalsequenzen |
EP0471947A1 (en) * | 1990-06-29 | 1992-02-26 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Culture bag |
US5240598A (en) * | 1990-09-18 | 1993-08-31 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Microbubble generator for the transfer of oxygen to microbial inocula and microbubble generator immobilized cell reactor |
US5401650A (en) * | 1990-10-24 | 1995-03-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A |
US5367110A (en) | 1990-11-13 | 1994-11-22 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Transgenic plants overproducing threonine and lysine |
AT394576B (de) * | 1991-01-16 | 1992-05-11 | Vogelbusch Gmbh | Reaktor zur durchfuehrung biologischer reaktionen mittels biokatalysatoren |
US5612188A (en) * | 1991-11-25 | 1997-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Automated, multicompartmental cell culture system |
US5267791A (en) * | 1991-12-13 | 1993-12-07 | Corning Incorporated | Suspended cell culture stirring vessel closure and apparatus |
JPH05219834A (ja) * | 1992-02-14 | 1993-08-31 | Fumiko Kobayashi | ディスポーサブル培養袋及び培養方法 |
IL102189A (en) * | 1992-06-12 | 1995-07-31 | Univ Ben Gurion | Device for growing microorganisms |
US5409833A (en) * | 1993-07-01 | 1995-04-25 | Baxter International Inc. | Microvessel cell isolation apparatus |
US5342781A (en) * | 1993-07-15 | 1994-08-30 | Su Wei Wen W | External-loop perfusion air-lift bioreactor |
ES2235176T3 (es) * | 1994-10-24 | 2005-07-01 | THE TEXAS A & M UNIVERSITY SYSTEM | Inmunizacion oral con plantas transgenicas. |
ES2326705T3 (es) * | 1995-09-14 | 2009-10-16 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Produccion de enzimas lisosomicas en sistemas de expresion basados en plantas. |
CA2246242A1 (en) * | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Institut Fur Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung | Cassettes for the expression of storable proteins in plants |
US6458574B1 (en) * | 1996-09-12 | 2002-10-01 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Treatment of a α-galactosidase a deficiency |
US6083725A (en) * | 1996-09-13 | 2000-07-04 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein |
US20050032211A1 (en) * | 1996-09-26 | 2005-02-10 | Metabogal Ltd. | Cell/tissue culturing device, system and method |
IL119310A (en) * | 1996-09-26 | 1999-07-14 | Metabogal Ltd | Cell/tissue culturing device and method |
US6190913B1 (en) * | 1997-08-12 | 2001-02-20 | Vijay Singh | Method for culturing cells using wave-induced agitation |
US6096546A (en) * | 1998-01-30 | 2000-08-01 | Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods for recovering polypeptides from plants and portions thereof |
AU6021699A (en) * | 1998-09-01 | 2000-03-21 | Penn State Research Foundation | Method and apparatus for aseptic growth or processing of biomass |
JP2002526116A (ja) * | 1998-10-07 | 2002-08-20 | シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト | 植物における治療活性タンパク質 |
US6432698B1 (en) * | 1999-01-06 | 2002-08-13 | Rutgers, The State University | Disposable bioreactor for culturing microorganisms and cells |
JP2002000248A (ja) * | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Daiichi Kagaku Kk | 凍結法及び凍結乾燥法 |
NZ523912A (en) * | 2000-07-31 | 2005-03-24 | Biolex Inc | Expression of biologically active polypeptides in duckweed |
US7138262B1 (en) * | 2000-08-18 | 2006-11-21 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | High mannose proteins and methods of making high mannose proteins |
CA2429210A1 (en) * | 2000-11-15 | 2002-05-23 | Jason C. Goodrick | Expression system for recombinant proteins |
WO2002081695A2 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Syngenta Participations Ag | Genes that are modulated by posttranscriptional gene silencing |
EP1379668B1 (en) * | 2001-04-18 | 2009-08-19 | Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. | The use of genes encoding abc transporters to stimulate the production of secondary metabolites in biological cells |
US7629309B2 (en) * | 2002-05-29 | 2009-12-08 | Zystor Therapeutics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
ES2224792B1 (es) * | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
US7951557B2 (en) * | 2003-04-27 | 2011-05-31 | Protalix Ltd. | Human lysosomal proteins from plant cell culture |
AU2004287645A1 (en) * | 2003-11-06 | 2005-05-19 | Compugen Ltd. | Variants of human glycoprotein hormone alpha chain: compositions and uses thereof |
ATE398167T1 (de) * | 2004-06-02 | 2008-07-15 | Millipore Corp | Einwegreaktor |
WO2005118771A2 (en) * | 2004-06-04 | 2005-12-15 | Xcellerex, Inc. | Disposable bioreactor systems and methods |
US8119406B2 (en) * | 2004-10-13 | 2012-02-21 | Protalix Ltd. | System and method for production of antibodies in plant cell culture |
US20080132743A1 (en) * | 2006-12-01 | 2008-06-05 | Albemarle Corporation | Production of high purity decabromodiphenylalkanes |
ES2660667T3 (es) * | 2007-05-07 | 2018-03-23 | Protalix Ltd. | Biorreactor desechable a gran escala |
-
2003
- 2003-04-27 IL IL15558803A patent/IL155588A0/xx unknown
-
2004
- 2004-02-24 CN CN2011101127063A patent/CN102240397A/zh active Pending
- 2004-02-24 RU RU2005136874A patent/RU2385928C3/ru active Protection Beyond IP Right Term
- 2004-02-24 BR BRPI0410520A patent/BRPI0410520B8/pt active IP Right Grant
- 2004-02-24 EP EP10012375.1A patent/EP2330205B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 EP EP10012373.6A patent/EP2343378B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 EP EP10012372.8A patent/EP2322636B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 SG SG2007172737A patent/SG2007172737A/en unknown
- 2004-02-24 MX MXPA05011507A patent/MXPA05011507A/es active IP Right Grant
- 2004-02-24 KR KR1020057020434A patent/KR101332372B1/ko active IP Right Grant
- 2004-02-24 SI SI200432130T patent/SI2333083T1/sl unknown
- 2004-02-24 DK DK10012376.9T patent/DK2333083T3/da active
- 2004-02-24 UA UAA200511193A patent/UA89944C2/ru unknown
- 2004-02-24 KR KR1020117014421A patent/KR20110089193A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-02-24 US US10/554,387 patent/US20060204487A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-24 EP EP04713966A patent/EP1618177B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 CA CA2523539A patent/CA2523539C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 ES ES04713966T patent/ES2391057T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 PT PT100123769T patent/PT2333083E/pt unknown
- 2004-02-24 SG SG2013021217A patent/SG2013021217A/en unknown
- 2004-02-24 ES ES10012376.9T patent/ES2446965T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 KR KR1020127012693A patent/KR20120093964A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-02-24 CN CN2004800179162A patent/CN1875111B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 AU AU2004234635A patent/AU2004234635B2/en active Active
- 2004-02-24 EP EP10012376.9A patent/EP2333083B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 EP EP10012374A patent/EP2330204A1/en not_active Withdrawn
- 2004-02-24 JP JP2006507577A patent/JP4993693B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-24 WO PCT/IL2004/000181 patent/WO2004096978A2/en active Application Filing
-
2005
- 2005-10-26 ZA ZA200508680A patent/ZA200508680B/xx unknown
- 2005-10-26 IL IL171561A patent/IL171561A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-07-25 HK HK06108225.4A patent/HK1088041A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-04-30 IL IL182888A patent/IL182888A/en active IP Right Review Request
-
2009
- 2009-12-23 RU RU2009148012/10A patent/RU2535342C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-04-27 JP JP2011099013A patent/JP2011184445A/ja active Pending
-
2014
- 2014-01-24 CY CY20141100067T patent/CY1114893T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2391057T3 (es) | Glucocerebrosidasa con alto contenido y de manosa y su producción en cultivo vegetal | |
US9220737B2 (en) | Plant cell culture expressing human lysosomal proteins and uses thereof | |
AU2007201909B2 (en) | Production of High Mannose Proteins in Plant Culture |