KR101158673B1 - 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 이듀로네이트-2-설파타아제(IDS)는 종래 알려진 엘라프라제와 다른 당화 패턴 및 포르밀글리신 함량을 가지며, 효소 활성 및 안전성이 우수하므로, 헌터 증후군의 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법{Composition and Formulation Comprising Recombinant Human Iduronate-2-Sulfatase and Preparation Method Thereof}
본 발명은 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제(Iduronate-2-sulfatase, 이하 "IDS"라 함)를 포함하는 헌터 증후군 치료용 조성물, 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명에 따른 헌터 증후군 치료용 조성물은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 가지는 IDS를 유효성분으로 포함하며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 IDS의 59번 위치의 시스테인이 포르밀글리신(Formylglycine(FGly), 2-amino-3-oxopropionic acid)으로 변경된 비율이 몰비로 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상임을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 헌터 증후군 치료용 조성물에 포함된 IDS는 IDS 1몰 당 2.0 내지 4.0몰, 바림직하게는 2.3 내지 3.5몰, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.0몰의 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)를 가진다.
본 발명에 따른 헌터 증후군 치료용 조성물의 제조방법은
(1) 서열번호 1로 표시되는 IDS를 인코딩하는 유전자로 형질 전환된 유전자 재조합 세포주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
(2) 상기 배양액을 음이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 과정을 통해 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하며,
특히, 상기 배양공정에서 첨가물로 가수분해산물(Hydrolysate) 첨가와 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 pH 4.0 내지 6.0의 완충용액을 용출을 위해 사용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 IDS를 포함하는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 제제는 기존에 시판 중인 제품에 비해 높은 안전성(safety) 및 치료효능을 가지고 있어 헌터 증후군의 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
헌터증후군 또는 제2형 점액다당질증(Mucosaccharidosis type II)은 IDS의 결핍으로 인해 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)과 같은 뮤코다당체가 분해되지 못하여 리소좀 내에 축적되는 리소좀 축적질환(Lysosomal storage diseases, LSD) 중 하나이다. GAG는 신체의 모든 세포 내에 축적되어 여러 가지 증상을 초래하는데, 그러한 증상에는 두드러진 얼굴 모습, 큰 머리, 간이나 비장의 비대로 인한 복부 팽만 등이 포함되며, 청력 상실, 심장판막질환, 폐쇄성 호흡기질환, 수면무호흡 등도 동반. 또한, 관절운동에도 제한이 올 수 있으며 중추신경계의 침범으로 신경계 증상과 발달 지연이 초래될 수 있다. 헌터 증후군은 162,000명당 1명꼴로 발생하는 것으로 알려져 있으며, X 염색체와 연관된 열성(X-linked recessive) 양식으로 유전되어 환자뿐만 아니라 가족에게 큰 고통을 주고 있다.
지금까지 헌터 증후군을 치료하기 위하여, 골수 이식방법, 효소 보충방법 및 유전자 요법 등이 다양하게 시도되어 왔다. 골수 이식방법은 증상은 현저히 개선되지만 환자와 조직적합항원(HLA, human leukocyte antigen)이 맞는 대상을 구하기 어렵고, HLA 부적합 공여자의 수술 전후의 사망률이 높은 단점이 있다. 유전자 요법은 정상적인 IDS 유전자를 아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스 또는 비바이러스성 벡터를 이용하여 체내로 주입하는 방법으로, 현재 실험적인 수준에 머물고 있을 뿐, 임상적으로 사용되고 있지는 못하다. 효소 보충방법은 외부에서 생산된 IDS를 체내에 투여하는 방법으로, 투여방법이 간단한 장점이 있지만 지속적으로 효소를 투여해야 하므로 치료 비용이 많이 소요되는 단점이 있으며, 현재 재조합 기술에 생산되어 미국 FDA의 승인을 받 엘라프라제(Elaprase®; Shire Pharmaceuticals Group)가 시판 중에 있으나, 단가가 매우 비싸고, 효과 및 안전성이 낮은 단점이 있다.
이상 살핀 바와 같이 다양한 헌터 증후군 치료 방법이 개발되어 왔지만, 여전히 높은 치료효능 및 안전성을 가지는 헌터증후군의 새로운 치료제 및 치료 방법에 대한 수요는 절실한 상황이다.
Bielicki, J. et al. Biochem, J., 271: 75~86, 1990
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하고자, IDS 생산을 위한 배양 및 정제 공정을 획기적으로 개선함으로써 높은 치료효능 및 안전성을 갖는 재조합 IDS를 포함하는 헌터증후군 치료용 조성물 및 이를 포함하는 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 IDS를 포함하는 헌터증후군 치료용 조성물 및 이를 포함하는 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 재조합 IDS를 포함하는 헌터증후군 치료용 조성물은, 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 가지는 IDS를 유효성분으로 포함하며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 IDS의 59번 위치의 시스테인이 포르밀글리신(Formylglycine(FGly))으로 변경된 비율이 몰비로 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상 임을 특징으로 한다.
본 발명에서의 IDS는 이듀로네이트-2-설파타아제(Iduronate-2-sulfatase) 또는 I2S로 지칭되기도 하며, 인체의 간, 신장, 태반에서 분리정제된 IDS는 분자크기(molecular size)가 56 kDa 정도이며(Bielicki, J. et al. (1990) Biochem, J., 271: 75~86), 25개 아미노산을 가지는 신호 펩타이드(signal peptide)를 포함하는 550개의 아미노산으로 구성된 단량체 단백질로 발현된 후, 신호 펩타이드가 절단된 525개의 아미노산으로 변경되어 활성을 나타내게 된다. IDS는 당화(glycosylation) 정도에 따라 그 분자크기가 달라지게 되는데, 엔도글리코시다제 F(endoglycosidase F) 처리를 할 경우, SDS-PAGE를 이용하면 60~90 kDa 정도의 크기를 가지는 것으로 밝혀졌다.
IDS는 두 개의 이황화 결합 및 8개의 N-결합된 당화 부위를 갖는데, 진핵생물에서 IDS를 생산하는 과정에서 번역 이후 수식과정(post translational modification)을 거치면서 상기 당화 부위에 복합체(complex), 하이브리드(hybrid) 또는 고 만노스(high mannose) 형태의 올리고당 사슬이 결합하여 당단백질(glycoprotein) 형태로 생성된다. 배양 과정 중에 배양액 내에 분비된 IDS는 통상적인 분리정제 과정을 거쳐 약물로 사용될 수 있으며, IDS는 다양한 인자, 예를 들어, IDS 유전자 재조합 방법, 형질전환 방법(예컨대, 사용된 세포주), 배양 방법 및 정제 방법 등에 따라 다양한 당화 패턴을 갖는 IDS 당단백질을 포함할 수 있다.
본 발명을 통해 IDS 내 만노스-6-포스페이트(M6P)의 함량 및 59번째 시스테인의 포르밀글리신으로의 변경 비율이 IDS의 치료효능 및 안전성 등의 특성에 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었는데, 이는 만노스-6-포스페이트(M6P)는 IDS로 하여금 세포 표면의 M6P 수용체에 특이적으로 결합할 수 있게 하여, 상기 효소의 세포 내로의 도입, 리소좀 타겟팅 및 이로 인한 축적된 GAG의 분해에 도움을 주며, 59번째 시스테인이 포르밀글리신으로 변경되면 IDS의 효소 활성을 높이기 때문인 것으로 보인다.
본 발명에서의 IDS는 별도의 한정이 없다면 당이 결합된, 즉 당화된 IDS 당단백질을 의미하며, 본 발명에서의 IDS는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하지만, 이에 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 발명에서 목적하는 IDS의 활성을 유지하는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 일부 아미노산 잔기의 삽입, 결실 및 치환이 일어난 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하 '통상의 기술자'라 한다)에게는 자명한 것이다.
본 발명에서의 IDS "당화 패턴"은 생성된 IDS 내의 8개의 당화 위치에 결합된 올리고당의 프로파일(예를 들어, 당화 위치 및 결합된 올리고당 종류)을 의미한다.
본 발명에 따른 헌터 증후군 치료용 조성물에 함유된 IDS는 종래 알려진 IDS와 동일한 아미노산 서열(서열번호 1)을 가지나, 상기 설명한 바와 같이 당화 패턴이 상이하며 59번째 시스테인이 포르밀글리신으로 변경된 비율 역시 상이한 것을 특징으로 한다(실시예 <1-5> 및 <1-6> 참조).
즉, 본 발명에 따른 헌터 증후군 치료용 조성물에 함유된 IDS는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 IDS의 59번 위치의 시스테인이 포르밀글리신(FGly)으로 변경된 비율이 몰비로 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상임을 특징으로 하는 반면, 종래 시판 중인 엘라프라제에서의 포르밀글리신으로의 변경 비율은 약 50% 정도로 알려져 있다(Genet Med 2006:8(8):465-473). 포르밀글리신은 IDS의 기질 분해 능력, 즉 IDS의 활성에 깊이 관여하므로, 상기와 같은 본 발명에 따른 치료용 제제와 엘라프라제의 IDS 내 59 번 위치에서의 포르밀글리신 변경 비율 차이로 인해 본 발명에 따른 치료용 조성물 및 이를 포함하는 제제는 기존의 엘라프라제에 비해 높은 헌터 증후군에 대한 치료효능을 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 헌터 증후군 치료용 조성물 또는 제제에 포함된 IDS는 IDS 1몰 당 2.0 내지 4.0몰, 바림직하게는 2.3 내지 3.5몰, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.0몰의 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)를 가진다. M6P는 IDS의 세포내로 흡수 및 리소좀 타겟팅에 기여하므로, IDS 내 M6P 함량이 높은 본 발명에 따른 치료용 제제는 IDS의 세포내 흡수 및 리소좀 타겟 능력이 우수하여 궁극적으로 리소좀 내에 축적된 GAG를 효과적으로 분해할 수 있는 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 IDS를 포함하는 헌터증후군 치료용 제제는 본 발명에 따른 치료용 조성물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 시킴으로써 제공될 수 있다.
"약학적으로 허용되는" 담체란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여하였을 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다.
한편, 본 발명에 따른 제제는 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 제제는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로 중에 적합한 형태가 사용될 수 있다.
본 발명의 제제를 경구 투여하는 경우 본 발명의 제제는 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가될 수 있다. 나아가, 상기 제제는 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함될 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명에 따른 제제는 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등이 사용될 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제가 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제가 추가로 포함될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다. 흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 제제를 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 제제는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)가 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 제제는 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 제제는 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 IDS의 양을 말한다. 본 발명에 따른 제제의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 IDS를 포함하는 제제는 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1 내지 10 ㎎/kg, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ㎎ /kg의 유효용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물의 제조방법은
(1) 서열번호 1로 표시되는 IDS를 인코딩하는 유전자로 형질 전환된 유전자 재조합 세포주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
(2) 상기 배양액을 음이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 과정을 통해 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하며,
특히, 상기 배양공정에서 첨가물로 가수분해산물(Hydrolysate) 첨가와 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 pH 4.0 내지 6.0의 완충용액을 용출을 위해 사용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로 본 발명에 따른 치료용 조성물의 제조방법은
(1) IDS를 인코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시켜 유전자 재조합 세포주를 수득하는 단계;
(2) 상기 형질 전환된 유전자 재조합 세포주를 무혈청 배지에서 가수분해산물을 첨가시켜 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
(3) 상기 배양액을 음이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 과정을 통해 정제하며, 상기 양이온 교환 크로마토그래피를 pH 4.0 내지 6.0의 용출 완충용액을 이용하여 수행하는 단계; 및
4) 상기 정제된 IDS에 약학적으로 허용 가능한 담체를 혼합하는 단계;
를 포함한다.
상기 방법 중 단계 (1)은 IDS를 인코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시켜 유전자 재조합 세포주를 수득하는 단계이다. IDS의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있는데, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 IDS를 인코딩하는 유전자를 이용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 일부 아미노산 잔기가 삽입, 결실 또는 치환된 경우라도 IDS의 활성을 유지하며 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이를 인코딩하는 유전자 서열을 이용하는 것도 가능하다. 또한, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터는 당업계에 알려진 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 발현 벡터는 벡터의 도입을 확인할 수 있는 마커 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 마커 유전자의 예로는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase) 유전자(dhfr) 등을 들 수 있으며, pJK-dhfr-Or2-IDS 벡터(도 2 참조)를 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 상기 단계 (1)에 사용될 수 있는 숙주 세포의 예로는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO), 인간배아신장 세포(HEK), 유아 햄스터 신장세포(BHK), 원숭이 신장 세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포 등 동물유래 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 CHO 세포를 사용할 수 있다. CHO 세포주는 높은 세포성장속도 및 생산성을 나타내며, 유전자 조작이 용이하고, 대규모 현탁 배양에서 증식이 용이하며, 무단백(protein free) 배지에 적응성이 뛰어나, 바이오 의약품 생산에 가장 널리 사용하고 있는 세포주 중 하나이다. 상기 단계 (1)에서의 형질전환 과정은 당업계에 통상적으로 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 방법 중 단계 (2)는 IDS 발현 벡터로 형질 전환된 유전자 재조합 세포주를 무혈청 배지에서 배양하여 배양액을 수득하는 단계이다. 상기 배양은 숙주 세포의 종류에 따라 당업계에 최적화된 배지 및 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 배양시 무혈청(serum free) 배지를 사용하는 것이 바람직한데 무혈청 배지는 동물 유래 혈청(예컨대, 소 혈청 등)이 포함되어 있지 않아, 상기 혈청으로 인한 부작용 또는 위험성의 가능성을 낮출 수 있다.
하나의 실시양태에 있어서, IDS 발현 벡터로 형질 전환된 유전자 재조합 세포주는 대량 생산을 위해 점진적으로 부피를 늘려가면서 배양시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 재조합 세포주는 쉐이커 플라스크에서 배양시킨 후, 수백~수천 L 규모의 생물배양기를 이용하여 배양시킬 수 있다. 상기 배양 공정 중 가수분해산물 첨가물이 포르밀글리신 함량에 중요하다. 바람직한 가수분해산물의 첨가 농도는 최종 배양기 내에서 0.1 ~ 10.0 g/L 이다. 본 발명에서 가수분해산물은 동물 또는 식물 유래 물질을 통상적인 방법에 의해 가수분해시킨 것이 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 대두(soybean), 감자(patato), 맥아(wheatgerm) 및 효모(yeast) 유래 물질을 포함하는 군에서 선택된 1 종 이상을 가수분해시킨 것 등이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법 중 단계 (3)은 단계 (2)에서 얻은 배양액으로부터 음이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 과정을 통해 IDS를 정제하는 단계이다.
상기 4가지 크로마토그래피는 상기 제시된 순서대로 수행하는 것이 바람직하나, 필요에 따라 그 순서를 변경하여 사용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 크로마토그래피의 순서와 더불어 목적하는 성분을 용출시키기 위해 사용된 레진 및 용출 완충용액의 pH가 본 발명의 IDS의 당화 패턴 및 포르밀글리신 함량에 중요하다.
음이온교환 크로마토그래피는 배양액 내에 존재하는 색소와 여러 가지 종류의 불순물을 제거하기 위해 수행하는 것으로서, Q 세파로오스®레진을 충진시킨 컬럼으로부터 pH 5.5 내지 7.5의 용출 완충용액을 이용하여 용출시키는 것을 포함한다.
소수성 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피에서 제거하지 못한 색소와 불순물들을 제거하기 위해 수행하는 것으로서, 페닐 세파로오스®레진을 충진시킨 컬럼으로부터 pH 5.0 내지 7.0의 용출 완충용액을 이용하여 용출시키는 것을 포함한다.
양이온 교환 크로마토그래피는 포르밀글리신 함량을 높이고 기타 불순물을 제거하기 위해 수행하는 것으로서, 양이온교환용 레진을 충진시킨 컬럼으로부터 pH 4.0 내지 6.0의 용출 완충용액을 이용하여 용출시키는 것을 포함한다. 양이온교환용 레진은 GE Healthcare 사의 CM Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, S Sepharose Fast Flow 및 Capto MMC 등을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 용출 완충용액의 pH는 4.0 ~ 6.0이다.
친화성 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피에서 사용하였던 글리세롤을 제거하고 용출액의 부피를 줄이기 위하여 수행하는 것으로서, 블루 세파로오스TM(Blue SepharoseTM) 레진을 충진시킨 컬럼으로부터 pH 6.0 내지 8.0의 용출 완충용액을 이용하여 용출시키는 것을 포함한다.
상기 각각의 크로마토그래피 조건은 통상의 기술자에 의해 최적화되어 사용될 수 있다. 상세한 크로마토그래피 조건은 본 명세서의 실시예 <1-5>를 참조한다.
본 발명에 따른 IDS를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조 방법에는 혼입될 가능성이 있는 바이러스를 불활화시키는 공정이 추가로 포함될 수 있다. 상기 불활화 과정은 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 pH 3.0 ~ 4.0의 범위에서 일정 시간 방치하거나 또는 높은 pH에서 일정 시간 방치함으로써 수행될 수 있다. 상기 불활화 과정은 정제 과정 중에 수행될 수 있으며, 바람직하게는 크로마토그래피 과정 중에, 보다 바람직하게는 소수성 크로마토그래피 과정과 양이온 교환 크로마토그래피 과정 사이에 수행될 수 있다.
한편, 상기 크로마토그래피 과정을 거친 IDS는 통상적인 농축, 여과 등을 거쳐 약물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기와 같이 제조된 약물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되고 적절한 제형화 단계를 거쳐 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 의해 생성된 IDS를 포함하는 조성물은 종래 알려진 IDS를 포함하는 조성물에 비해 1) 포르밀글리신 함량이 높아 치료제로서 유리하며, 2) M6P 함량이 높아 리소좀 내 GAG 분해에 유리하며, 3) 동물 유래의 혈청을 포함하지 않아 안전하고, 4) 99.9% 이상의 순도를 가져 안전성 및 유효성이 우수한 장점을 갖는다.
본 발명의 방법에 따른 재조합 IDS를 포함하는 치료용 조성물 및 제제는 기존에 시판 중인 엘라프라제에 비해 높은 치료효능 및 안전성을 가지고 있어, 헌터 증후군의 치료에 매우 효과적이고 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 IDS를 발현하는 벡터를 제조하기 위한 중간 단계에 사용하는 벡터 pJK-dhfr-IDS-S1를 제조하는 과정을 나타내는 도면.
도 2는 도 1의 pJK-dhfr-IDS-S1 벡터로부터 IDS를 발현하는 벡터 pJK-dhfr-Or2-IDS를 제조하는 과정을 나타내는 도면.
도 3은 형질 도입된 세포주 CHO-DG44로부터 IDS를 분리 및 정제하는 과정을 나타내는 흐름도.
도 4는 N-말단 서열 분석을 위한 IDS의 SDS-PAGE 결과를 나타는 도면.
(레인 M은 마커이고, 레인 1은 탈당화되지 않은 IDS이며, 레인 2는 PNGase F로 처리한 IDS이고, 레인 3은 탈당화된 IDS를 의미)
도 5는 본 발명에 따른 IDS의 아미노산 서열을 분석하는 과정을 나타낸 흐름도.
도 6은 본 발명에 따른 IDS의 아미노산 서열을 MALDI-MS/MS 및 LC-ESI-MS/MS로 분석한 결과를 나타내는 도면.
도 7은 본 발명의 IDS의 이황화 결합 위치를 알아보기 위한 비환원 시료와 환원 시료의 RP-HPLC 결과를 나타내는 도면.
도 8은 본 발명의 IDS의 이황화 결합 위치를 알아보기 위한 MALDI-MS 결과를 나타내는 도면.
도 9는 본 발명의 IDS의 이황화 결합 위치를 알아보기 위한 MALDI-MS/MS 결과를 나타내는 도면.
도 10은 본 발명의 IDS의 MALDI-MS/MS 결과를 통해 얻어진 아미노산의 이황화 결합 위치를 표시한 도면.
도 11은 본 발명의 IDS의 당질화 여부를 살펴보기 위해 IDS를 다양한 당 절단 효소로 처리한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 도면.
도 12는 본 발명의 IDS의 만노스-6-포스페이트 함량을 살펴보기 위해 수행한 HPAEC-PAD 크로마토그래피 결과를 나타내는 도면.
도 13은 본 발명의 IDS의 순도를 살펴보기 위해 수행한 크기배제 크로마토그래피 결과를 나타내는 도면.
도 14는 본 발명의 IDS의 천연 기질에 대한 활성을 살펴보기 위해 수행한 이온 크로마토그래피 결과를 나타내는 도면.
도 15는 본 발명의 IDS의 세포 내 흡수를 알아보기 위한 정상 섬유아세포에 첨가된 IDS 농도 대비 세포내 흡수된 IDS 양에 관한 라인웨버-버크 플롯(Lineweaver-Burk Plot) 결과를 나타내는 도면.
도 16은 정상 인간 섬유아세포 및 헌터증후군 환자세포로 흡수되는 본 발명의 IDS의 양을 나타내는 도면.
도 17은 본 발명의 IDS의 포르밀글리신 함량 측정 결과를 나타내는 도면.
도 18은 본 발명의 IDS를 제조하는 과정 중, 양이온 교환 크로마토그래피에 전후의 등전 포커싱(IEF : Isoelectric focusing) 결과를 나타내는 도면.
(M은 마커이고, 레인 1은 양이온 교환 크로마토그래피의 Load액이며, 레인 2는 양이온 교환 크로마토그래피의 용출액, 레인 3은 양이온 교환 크로마토그래피의 regeneration액을 의미)
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용한 모든 문헌은 본 발명의 명세서에서 참조한 것이다.
실시예 1: IDS 의 제조
<1-1> 유전자 획득
문헌[S. Beckebaum et al., Immunology, 2003, 109:487-495]에 기재된 방식에 따라 인간 혈액으로부터 말초혈액단핵세포(PMBC)를 분리하였다. 상기 방법을 통해 분리된 PBMC 세포로부터 문헌[M. J. Holland et al., Clin. Exp. Immunol., 1996, 105:429-435]에 기재된 방식에 따라 총 RNA를 추출하였다. 상기 총 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 확립하기 위하여, 올리고(dT) 프라이머 및 단일-가닥 합성 키트(Boehringer mannheim)를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 1 ㎍ 총 RNA를 에펜도르프 튜브에 넣고 DEPC가 처리된 증류수를 넣어 12.5 ㎕가 되도록 조절한 후, 20 pmol의 올리고(dT) 프라이머를 1 ㎍ 첨가하여 70℃에서 2분 동안 가열한 후 냉각하였다. 이 반응액에 반응완충액 4 ㎍, dNTP 1 ㎍, RNase 억제제 1 ㎍ 및 역전사 효소 1 ㎍를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켜 단일 가닥 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 주형으로 하고 서열번호 2 내지 4에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 인간 IDS 유전자를 증폭시켰다. 상기 프라이머 각각에는 클로닝 과정을 위하여 제한효소 인식부위를 도입하였다.
<1-2> 발현 벡터 제조
A. pJK-dhfr-IDS-S1 벡터의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 획득한 IDS 유전자의 앞부분에 비코딩 서열로 항체의 경쇄 신호 서열(인간 IgG 경쇄 부분 서열 유래)을 추가하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자를 겔 전기영동을 한 후, 겔 추출 키트를 사용하여 인간 IDS 유전자를 분리하였다. 상기 분리된 IDS 유전자와 pJK-dhfr-Or2 벡터(Aprogen)를 EcoRV 및 ApaI으로 절단한 다음, 16℃에서 20시간 동안 라이게이션하여 연결하고, 상기 얻어진 벡터를 E. coli(DH5a)에 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 50 ㎍/mL의 암피실린이 함유된 LB 플레이트에 도말한 후 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 플레이트 상의 콜로니를 선별하여 배양한 후, 이들로부터 플라스미드를 분리하였다(도 1 참조).
B. 재조합 인간 IDS 발현 플라스미드의 제조
상기 단계에서 제조한 플라스미드의 비코딩 서열을 재조합 인간 IDS의 신호 서열로 다시 바꾸기 위하여, pJK-dhfr-or2 벡터에 서브클로닝하였다. 구체적으로, pJK-dhfr-IDS-S1 벡터를 EcoRV 및 ApaI으로 절단하여 IDS 일부 유전자(1233 bp)를 얻고, 이를 동일한 제한효소로 절단한 pJK-dhfr-Or2 벡터에 삽입하여 pJK-dhfr-IDS-S2를 제조하였다. 이후 앞부분에 비코딩 서열과 신호 서열을 첨가하기 위해 다시 pJK-dhfr-IDS-S1을 주형으로 하고 IDS N1 정방향 프라이머(서열번호 5) 및 IDS 4 역방향 프라이머(서열번호 7)를 이용하여 94℃에서 5분, 94℃에서 1분, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초를 30번 반복한 후 72℃에서 10분간 반응시키는 조건에서 PCR을 수행하였다.
상기 PCR을 통해 448 bp의 IDS 유전자의 일부를 수득하였으며, 이를 주형으로 하고 IDS N2 정방향 프라이머(서열번호 6) 및 IDS 4 역방향 프라이머(서열번호 7)를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 476 bp의 DNA 단편을 합성하였다.
이후, pJK-dhfr-IDS-S2 벡터를 EcoRV 제한효소로 절단하였으며, 같은 효소를 이용하여 재조합 사람 IDS 일부 유전자(476 bp)를 각각 절단하였다. 절단된 단편을 겔 전기영동을 실시하여 벡터 및 IDS 476 bp 단편을 순수 분리하였다. 상기 벡터 및 삽입물을 T4 DNA 라이게이즈를 사용하여 16℃에서 12시간 라이게이션 반응시켜 pJK-dhfr-Or2-IDS 플라스미드를 제조하였다. 상기 과정을 도 2에 나타내었다.
상기 제조과정을 통해 올바른 IDS 발현용 플라스미드가 제조되었는지 확인하기 위해, pJK-dhfr-Or2-IDS 플라스미드로 DH5a를 형질전환시킨 다음, 암피실린(50 ㎍/mL)이 함유된 LB 배지에 24시간 동안 배양하여 콜로니를 얻고, 상기 콜로니로부터 플라스미드를 분리하여 삽입물의 크기를 확인하였다. 또한, T7 프라이머(서열번호 8)를 이용하여 DNA 서열을 분석하였다.
<1-3> 재조합 인간 IDS 발현 세포주의 선별
A. CHO - DG44 의 형질도입
본 발명에 따른 IDS를 발현시키기 위해 차이니즈 햄스터 난소세포인 CHO-DG44를 숙주세포로 사용하였다. CHO-DG44는 이중결손 방법으로 내생의 dhfr 유전자 기능을 상실시킨 세포주이다. dhfr 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)를 암호화하는 유전자이며 이 단백질은 핵산의 de novo 합성에 관여하는 테트라하이드로폴레이트(FH4)를 폴레이트로부터 디하이드로폴레이트(FH2)를 거쳐 합성하는데 관여하는 효소이다. 이들 세포 내에서, dhfr의 양은 MTX의 농도에 의존적인 것으로 알려져 있다. MTX는 dhfr의 기질인 폴산과 유사한 구조를 가지고 있어 디하이드로폴레이트 환원효소가 폴산에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하며, 이로 인해 대부분의 디하이드로폴레이트 환원효소의 활성이 상실된다. 따라서, 충분한 양의 dhfr이 증폭되지 못한 세포는 생존에 필요한 핵산을 합성하지 못하게 되므로 사멸하게 되는 반면, 증폭이 충분히 일어난 세포는 상대적으로 많은 양의 dhfr이 존재하기 때문에 고농도의 MTX에서도 생존하게 된다. 이러한 시스템을 동물세포에 적용함으로써 형질도입 세포주에서 dhfr 유전자의 증폭 및 그로 인한 목적하는 구조 유전자의 증폭이 일어난 세포주를 선별할 수 있다.
실시예 <1-2>에서 제조한 IDS 발현 벡터 pJK-dhfr-Or2-IDS는 상기 목적을 위하여 증폭가능한 마커로서 dhfr 유전자를 도입시켰으며, MTX와 dhfr 유전자를 이용한 유전자의 증폭을 실시하였다.
구체적으로, DG44 세포주(콜롬비아 대학의 Chaisin 박사로부터 입수)를 10 mL DMEM/F12 배지(뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 및 10% 우태아혈청(FBS) 함유)에 현탁한 후 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 모으고, 이를 50 mL 배양용 배지가 들어 있는 T-175 플라스크에 접종하여 37±1℃, 5±1% CO2 배양기에서 배양하였다. 유전자 형질도입 하루 전에 T-175 플라스크에서 배양 중인 DG44 세포의 배양액을 제거한 후 PBS 완충액으로 2회 세척하고, 세포에 트립신을 처리하여 떼어 낸 다음, 5×105개의 세포를 T-25 플라스크에 접종하여 37±1℃, 5±1% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 세포의 세균 및 진균의 오염이 없음을 현미경 상 관찰을 통해 확인하였고, 마이코플라스마(mycoplasma)의 오염여부를 PCR-ELISA를 통해 확인하였다.
상기 오염되지 않은 DG-44 세포에 실시예 <1-2>에서 제조한 IDS 발현 벡터 pJK-dhfr-Or2-IDS를 리포펙타민 키트로 형질도입시켰다. 구체적으로, 발현벡터 5 ㎍과 리포펙타민 50 ㎕를 각각 Opti-MEM I 800 ㎕에 희석하고 거품이 생기지 않도록 DNA와 리포펙타민을 섞어 혼합물을 상온에서 15분간 정치하였다. 그 동안 DG44는 멸균된 PBS를 이용하여 1회 세척하고 Opti-MEM I을 이용하여 3회 세척하였다. 상기 DNA-리포펙타민 혼합액을 DG44 세포에 잘 넣어주고, Opti-MEM 6.4 mL를 첨가하여 37±1℃, 5±1% CO2 배양기에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후, DMEM/F12 8 mL 및 FBS 1.6 mL를 첨가하여 48시간 더 배양하여 세포막의 회복 및 세포의 성장이 이루어지게 하였다.
B. 제네티신 ( G418 ) 저항성 세포주 선별
상기 배양된 세포를 0.25% 트립신으로 처리하여 떼어내고 세포수를 측정하여 5×103 세포/웰/100 ㎕가 되도록 MEM-알파 배지(10% 투석된 FBS 및 550 ㎍/mL의 G418 함유)에 현탁한 다음, 96-웰 플레이트에 분주하였다. 다음날 동일한 배지를 100 ㎕/웰로 더 첨가하여 2-3주 동안 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다. 콜로니 형성을 계속 관찰하면서 용기 면적의 약 50% 이상 자랐을 때 동일한 배지로 교환해 주고 3일간 배양한 후에 배양액을 수확하여 효소 분석을 수행하였다.
3일 간격으로 각 웰의 배양액을 흡입하여 제거한 후 새로운 배지 200 ㎕를 첨가하여 배양을 실시하였다. 배양 후 3~4일째 형질도입이 되지 않은 세포주, 즉 제네티신(geneticin)에 저항성을 가지지 못하는 세포주가 사멸하여 96 웰 플레이트의 바닥에서 떨어지기 시작함을 현미경에서 관찰할 수 있었다. 선별된 클론들을 96-웰 플레이트에서 순차적으로 24 웰, 6 웰 플레이트 그리고 100 mm 디쉬로 옮겨주면서 배양하였다. 100 mm 디쉬에서 80~90% 컨플루언시(confluency)를 보이는 수준까지 자랐을 때 발현량을 다시 측정하였다. 세포를 0.25% 트립신을 사용하여 떼어낸 후 세포수를 측정하여 6-웰 플레이트에 5×105 세포/웰/3 mL로 해당 배지를 넣어주고 3일간 배양하여 증가된 세포수를 측정하고 발현된 단백질의 양을 정량하였다. 정량결과에 따라 15개의 클론을 선별하였다.
C. 발현량이 우수한 IDS 발현 세포주 선별
상기 선별된 15개의 클론을 증가된 MTX 농도 하에서 배양시켜 IDS의 증폭이 일어난 세포주를 선별하였다.
구체적으로, 1×106 세포/100 mm/디쉬/10 mL로 세포를 MTX가 포함된 배지에 접종하여 80~90% 수준까지 배양한 후 1/10 부피에 해당하는 세포를 다시 100 mm 디쉬/10 mL에 접종하여 이를 2회 반복하였다. 최소 3 계대 이상의 세포 배양을 반복하여 증가된 MTX 농도의 조건에서도 세포가 충분히 적응할 수 있도록 하였다. MTX 농도의 증가는 최초 5 nM MTX에서 3일간의 분석에 의해 선별된 클론들로부터 시작하였으며, 이후 MTX 농도의 변화는 20 nM로 하였다. 각 단계에서 MTX 증폭에 적응된 클론들은 3일간 세포를 배양하여 세포 성장속도를 측정하였다. 이들 세포주를 대상으로 IDS 발현량을 측정하여, IDS 유전자 증폭이 이루어진, 즉, 재조합 IDS의 발현량이 증가된 세포주를 선별하였다. 상기 선별된 세포주 중 발현량이 가장 높은 세포주 NI4를 이후 실험에 사용하였다.
D. 한계 희석법에 의한 단일 세포주 선별
상기 수득된 세포주 NI4에 다른 세포주가 섞여 있을 가능성이 있으므로 이들 세포주를 단일 세포주로 분리하는 과정을 실시하였다. 20 nM MTX에 의해 증폭된 NI4 클론을 대상으로 한계 희석을 통한 서브클로닝을 수행하여 최종 대상 세포주를 선정하는 작업을 진행하였다.
먼저, NI4를 IMDM 배지(Gibco BRL 社, Cat#12200)가 담긴 96-웰 플레이트에 0.5 세포/웰로 희석하여 접종하고, 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 배양 3일째부터 현미경으로 관찰하여 웰에 2개 이상의 콜로니가 형성되는 웰을 제외하고, 웰 당 한 개의 콜로니만 형성된 웰을 선별하여, 배양 15일 후 96 웰 배양 플레이트로 다시 계대하고 세포의 컨플루언시가 90%에 도달하였을 때 새로운 배지로 교환을 실시하였다.
상기 NI4로부터 총 263 개의 단일 세포주가 선별되었고, 이들로부터 최대 IDS 활성을 나타내는 세포주 S46을 선별하여, 이를 NI4-S46으로 명명하였다.
<1-4> 세포의 배양
A. 쉐이커 플라스크 배양
상기 선별된 NI4-S46 세포주를 하기와 같이 대량으로 배양하여 본 발명의 IDS를 생산하였다. 상기 세포주를 EX-cell 302 무혈청 배지(글루타민, 덱스트란 설페이트, pluronic F-68 함유)가 담긴 125 mL 배양 플라스크에 넣고 5±1% CO2, 37±1℃ 조건 하에서 배양하였다. 이후, 세포를 쉐이커 플라스크(shaker flask)를 이용하여 2~3일 간격으로 1:5~1:8 비율로 계대배양하였다. 계대시 약 2,400 mL까지 점차적으로 부피를 늘려가며 배양하였다. 이들을 여러 개의 쉐이커 플라스크에 배양하여 생물 배양기에 접종할 수 있는 충분한 양이 되면 다음 단계를 수행하였다.
B. 30L 생물배양기( working volume 20L) 배양
쉐이커 플라스크에서 배양 중인 세포가 1.3×106 세포/mL 이상이 되면 세포를 모아, 30L 생물배양기에 접종하여 배양하였다. 세포 배양시 용존산소량 10% 이상, 배양온도 37±1℃, pH 7.0±0.2를 유지하였다. 필요한 경우, 배양액을 채취하여 현미경으로 세포의 상태를 관찰하고 세포수, 세포활성, pH, 글루코스 농도 및 글루타민 농도를 분석하고, 상기 분석 결과 충분한 세포성장이 이루어지면 150 L 생물배양기에 접종하였다.
C. 150L 생물배양기( working volume 100L) 배양
30L 생물배양기에서 배양 중인 세포가 0.9×106 세포/mL 이상이 되면, 150 L 생물배양기에 접종한 후 배양하였다. 세포 배양시 용존산소량 10% 이상, 배양온도 37±1℃, pH 7.0±0.2를 유지하였다. 필요한 경우, 배양액을 채취하여 현미경으로 세포의 상태를 관찰하고 세포수, 세포활성, pH, 글루코스 농도 및 글루타민 농도를 분석하고, 상기 분석 결과 충분한 세포성장이 이루어지면 650 L 생물배양기에 접종하였다.
D. 650L 생물배양기( working volume 500L) 배양
150L 생물배양기에서 배양 중인 세포가 0.9×106 세포/mL 이상이 되면, 650L 생물배양기에 접종한 후 배양하였다. 세포 배양시 용존산소량 10% 이상, 배양온도 34±1℃, pH 6.9±0.2로 3일간 유지하였다. 3일 후부터 배양온도 32±1℃, pH 6.9±0.2로 유지하였다. 필요한 경우, 배양액을 채취하여 현미경으로 세포의 상태를 관찰하고 세포수, 세포활성, pH, 글루코스 농도 및 글루타민 농도를 분석하고, 상기 분석 결과에 따라 글루코스 및 글루타민 공급량을 조절하여 세포 성장이 이루어지게 하였고 배양공정 중 가수분해산물을 첨가하여 포르밀글리신 증가를 유도하였다.
<1-5> IDS 의 정제
하기 일련의 4단계의 크로마토그래피를 이용하여 실시예 <1-4>에서 수득된 배양액으로부터 IDS를 분리하였다.
A. 배양액 회수 및 여과
650L 배양기에 접종 10일 이후 세포 활성도가 80~85% 범위인 경우, 세포배양을 중단하고 밀리포어(Millipore) POD 필터 시스템 및 D0HC(Millipore) 필터를 이용하여 0.9 bar 이하의 용기 압력에서 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포가 분리된 배양 상등액을 Pre-filter(Millipore, 0.5 + 0.2 ㎛)와 0.45 + 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 여과한 후 멸균된 1회용 비닐백에 담아 회수하였다. 회수된 배양액을 2~8℃에 보관하였다.
B. 농축 및 버퍼교환
상기 A에서 회수한 배양 여과액 부피를 한외여과(ultrafiltration) 장치(Tangential Flow Filtration Membrane System)를 사용하여 약 10배 농축하였다. 한외여과 장치 내 멤브레인(Cut off: 30K, Pall)을 주사용수를 이용하여 20~25 L/분의 속도로 세척한 후 20 mM 인산나트륨(인산이수소나트륨 일수화물과 인산수소나트륨 헵타수화물)이 첨가된 완충용액(pH 7.0~8.0)을 이용하여 평형화하였다. 평형이 이루어지면 배양액 회수액을 멤브레인에 주입시켜 통과하지 못하는 분획을 회수하였다. 최종 회수액의 부피가 초기 배양 여과액 부피의 약 1/10이 되면 농축 과정을 멈추고 농축액의 3~4배에 해당하는 완충용액을 연속적으로 교환시켜 전도도와 pH가 기준 내에 들어오면 공정을 멈추었다[기준-전도도: ≤5.0 mS/cm, pH 7.0~8.0].
C. 음이온교환 크로마토그래피
상기 B에서 획득한 배양 회수액으로부터 색소와 여러 가지 종류의 불순물들을 제거하기 위하여, Q 세파로오스(Q Sepharose, GE Healthcare) 레진을 충진시킨 정제용 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼을 20mM 인산나트륨(인산이수소나트륨 일수화물과 인산수소나트륨 헵타수화물) 첨가 평형 완충용액(pH 7.0~8.0)으로 평형화한 다음, 상기 B에서 얻은 농축액을 0.45 + 0.2 ㎛ 필터(Sartorius)로 여과하여 100~120 cm/h의 선유속으로 컬럼에 로딩하였다. 로딩을 완료하고 상기 평형 완충용액으로 1차 세척한 다음, 소량의 염화나트륨이 첨가된 세척 완충용액(pH 5.5~7.5)으로 2차 세척하였다. 2차 세척이 완료 후, 염화나트륨이 첨가된 용출 완충용액(pH 5.5~7.5)을 이용하여 목적 단백질을 용출하였다.
D. 소수성 크로마토그래피
음이온 교환 크로마토그래피에서 제거하지 못한 색소와 불순물들을 제거하기 위하여, 페닐 세파로오스 레진(Phenyl Sepharose, GE Healthcare)을 충진시킨 정제용 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 소수성 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼을 염화나트륨이 첨가된 평형 완충용액(pH 5.0~7.0)으로 평형화한 다음, 상기 C에서 얻은 용출액을 0.45 + 0.2 ㎛ 필터 (Sartorius)로 여과하여 70~100 cm/h의 선유속으로 컬럼에 로딩하였다. 로딩을 완료하면, 상기 평형 완충용액으로 세척하고, 글리세롤이 첨가된 용출 완충용액(pH 5.0~7.0)으로 목적 단백질을 용출하였다.
E. 낮은 pH를 이용한 바이러스 불활화
숙주세포 또는 공정에 사용되는 부원료로부터 유래될 수 있는 바이러스를 낮은 pH 조건을 이용하여 불활화하였다. 구체적으로, 상기 D의 과정으로 얻은 용출액에 25% 아세트산을 첨가하여 pH를 3.0 ~ 4.0로 조정한 후 2 시간 동안 불활화하였다. 2 시간 경과 후 0.5 M 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 4.0~5.0로 조정하고 다음 공정에 사용하였다. 낮은 pH 불활화 공정은 12±2℃에서 실시하였다.
F. 양이온 교환 크로마토그래피
IDS는 당을 포함하는 당단백질로서 당사슬 말단에 결합되어 있는 시알산의 함량에 따라 다른 등전점을 갖는 이성질체로 존재하게 된다. 시알산은 음전하를 띠는 당으로 시알산의 함량이 다르면 양이온교환용 레진에 결합하는 정도에 차이가 발생하게 된다. 이러한 특성을 이용하여 시알산의 함량과 활성(포르밀글리신 함량)이 높은 IDS를 얻고 기타 불순물[Product impurity (Aggregated IDS, processed IDS), process impurity (Host Cell protein)]을 제거하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로 CaptoTM MMC 양이온교환용 레진을 충진시킨 컬럼(GE Healthcare)을 글리세롤이 첨가된 평형 완충용액(pH 4.0 ~ 5.0)으로 평형화한 다음, E의 과정에서 얻은 불활화물을 0.45 + 0.2 ㎛ 필터(Sartorius)로 여과하여 100~120 cm/h의 선유속으로 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 상기 평형 완충용액으로 세척하고, 글리세롤이 첨가된 용출 완충용액(pH 4.0~6.0)으로 시알산 함량(등전점이 3.5 이하)과 활성(포르밀글리신 함량: 80±15%) 및 순도(SE-HPLC, 98% 이상)가 높은 IDS를 용출시켰다.
G. 친화성 크로마토그래피
양이온 교환 크로마토그래피에서 사용한 글리세롤을 제거하고, 용출액의 부피를 줄이기 위하여 친화성 크로마토그래피(Blue Sepharose, GE Healthcare)를 수행하였다. 블루 세파로오스(Blue Sepharose) 레진을 충진시킨 컬럼(GE Healthcare)을 글리세롤이 첨가된 평형 완충용액(pH 4.5~5.5)으로 평형화시킨 다음, 상기 F 과정으로부터 얻은 용출액을 0.45 + 0.2 ㎛ 필터(Sartorius)로 여과하여 100~120 cm/h의 선유속으로 컬럼에 로딩하였다. 로딩을 완료하면 세척 완충용액(pH 4.5~5.5)으로 세척하고, 용출 완충용액(pH 6.0 ~ 8.0)으로 목적 단백질을 용출하였다.
H. 농축 및 버퍼교환
상기 G에서 얻은 용출액의 단백 농도를 조정하고, 정제된 단백질을 제형화(formulation) 완충용액으로 교환하기 위해 한외여과 장치(Tangential Flow Filtration Membrane System)를 사용하였다. 한외여과 장치 내 멤브레인(Cut off: 10K, Pall)을 주사용수를 이용하여 450~650 mL/분의 속도로 세척하고, 폴리소르베이트 20이 첨가되지 않은 제형화 완충용액(2.25 g/L 인산이수소나트륨 일수화물, 0.99 g/L 인산수소나트륨 헵타수화물, 8 g/L 염화나트륨, pH 6.0 ~ 7.0)을 이용하여 평형화한 다음, 목적 단백질을 농축하였다. 농축액의 3~4배 부피에 해당하는 완충용액을 연속적으로 교환시켜 전도도와 pH가 기준 내에 들어오면 공정을 멈추었다(기준-전도도: 15.0±3.0 mS/cm, pH 6.0~7.0). 농축액의 농도를 4.0±0.5 mg/mL으로 조정하였다.
I. 극미세 여과
숙주세포 또는 공정에 사용되는 부원료로부터 유래될 수 있는 바이러스를 제거하기 위하여 나노필터(NFP, Millipore)를 사용하여 극미세 여과를 수행하였다. 주사용수를 이용해 나노필터를 적신 후 필터에 대한 완전성 시험(integrity test)를 실시하였다. 완전성 시험에 합격한 나노필터에 폴리소르베이트 20을 첨가하지 않은 제형화 완충용액(2.25 g/L 인산이수소나트륨 일수화물, 0.99 g/L 인산수소나트륨 헵타수화물, 8 g/L 염화나트륨, pH 6.0~7.0) 1 L를 흘려주어 평형화하였다. 평형이 완료되면 상기 H 단계에서 얻은 농축액을 약 2 bar의 압력으로 통과시켜 극미세 여과액을 회수하였다. 여과가 완료후, 제형화 완충용액으로 세척하고, 상기 세척액과 극미세 여과액을 모아 단백 농도를 측정하였다.
J. 원액 제조 공정
상기 I 과정에서 얻은 여과액에 폴리소르베이트 20을 첨가하지 않은 제형화 완충용액을 첨가하여 단백 농도를 조정하였다. 그 후 폴리소르베이트 첨가한 후 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 원액을 생산하였다. 생산된 원액은 분주하여 초저온 냉동고(-70±10℃)에 보관하였다.
K. 완제품 제조 공정
초저온 냉동고에 보관 중인 원액을 28±1℃ 항온 수조에서 녹인 후 제형화 완충용액(2.25 g/L 인산이수소나트륨 일수화물, 0.99 g/L 인산수소나트륨 헵타수화물, 8 g/L 염화나트륨, 0.23 g/L 폴리소르베이트 20, pH 6.0~7.0)을 이용하여 단백농도가 약 2.05±0.2 mg/mL이 되도록 희석하였다. 이후, 상기 희석액을 0.2 ㎛ 제균 필터로 여과하여 최종원액을 생산하였다. 상기 원액을 자동충전기를 사용하여 6 mL 바이알에 약 3.3 g씩 충전하였다. 충전이 완료되면 이물검사를 통과한 바이알을 포장하여 완제품을 생산하였다.
세포주 배양으로부터 완제품을 제조하는 공정을 도 3에 나타내었다.
비교예 1: 엘라프라제 ® 의 제조
종래 시판(처방) 중인 재조합 IDS인 엘라프라제®를 비교예로 사용하였다.
실험예 1: 본 발명에 따른 IDS 의 구조 및 특성 분석
<1-1> 아미노산 서열 분석 - 내부 서열분석( Internal sequencing )
탈당화된 IDS를 SDS-PAGE를 통해 분리한 후 겔 슬라이싱(gel slicing)하여 분리하였다. 이후, 다양한 엔도프로티나아제(트립신, 키모트립신, AspN, 키모트립신/트립신, AspN/트립신, GluC 및 GluC/트립신)를 처리한 후 그 분해 산물을 MALDI-MS/MS 및 LC-ESI-MS/MS로 분석하였다(도 5). 상기 분석 결과, 총 525개의 아미노산 서열을 확인하였다. 상기 확인된 아미노산 서열은 인간 IDS의 이론 서열과 동일하였다(도 6 참조).
<1-2> 이황화 결합 분석
이황화 결합은 폴리펩타이드 내 2개의 시스테인 잔기의 SH기 사이에 형성되는 가교결합으로서, 단백질의 고차구조를 안정적으로 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 이론상으로 IDS의 525개 아미노산 내에는 6개의 시스테인이 존재하고 이 중 4개의 시스테인이 이황화 결합을 형성한다. 본 실험예에서는 IDS에서 이황화 결합을 형성하는 시스테인의 정확한 위치를 확인하고자 하였다. 먼저, 당에 의한 간섭을 제거하기 위하여, IDS에 PNGase F를 처리하여 탈당화된 IDS를 획득하였다. 이황화 결합을 형성하지 않는 시스테인에 의한 간섭요인을 제거하기 위하여, 4-비닐피리딘을 사용하여 SH기가 비특이적으로 S-S 결합을 형성하는 것을 차단한 비환원 시료를 준비하고, 한편, DTT를 이용하여 이황화 결합을 끊어준 다음 다시 4-비닐피리딘을 사용하여 차단하여 환원 시료를 준비하였다. 상기 비환원 시료 및 환원 시료에 실험예 <1-3>의 결과를 바탕으로 선정한 트립신과 AspN을 처리하였다. 상기 처리된 펩타이드 단편을 RP-HPLC를 이용하여 분리하고, 비환원 시료와 환원 시료의 RP-HPLC 크로마토그램을 비교하여 비환원 시료에는 존재하지만 환원 시료에는 존재하지 않는 피크를 분리하였다(도 7 참조).
보다 정확한 분석을 위해, 상기 분리한 피크들을 추가적으로 엔도프로티나아제로 처리하여 크기를 줄인 다음, MALDI-MS를 이용하여 이황화 결합을 포함하는 피크를 분석하였다(도 8 참조).
이황화 결합을 포함하는 피크를 다시 MALDI-MS/MS를 이용하여 서열분석하였고(도 9), 이를 통해 525개 IDS 아미노산 중 어느 시스테인에서 이황화 결합이 형성되는지 분석하였다. 분석 결과 도 10에서 보는 바와 같이, C146-C159 및 C397-C407 위치에서 이황화 결합이 형성되는 것으로 나타났다.
<1-3> 포르밀글리신 ( formylglycine ) 함량 분석
IDS는 글리코사미노글리칸(GAG)의 일종인 헤파란 설페이트(heparan sulfate)와 더마탄 설페이트(dermatan sulfate)를 분해한다. 이러한 기질 분해 능력은 활성 부위의 59번째 아미노산인 시스테인이 번역 후 수식되어 포르밀글리신(FGly)으로 존재하여야 달성될 수 있다. 따라서, 본 실험예에서는 IDS의 기질 분해 능력을 분석하기 위해, 59번 위치의 시스테인(Cys59)이 포르밀글리신으로 얼마나 수식되어 있는지 분석하고자 하였다. 분석 방법은 MS(Mass Spectroscopy)를 기반으로 한 정량 분석법으로서 방사성 동위원소로 표지된 합성 기질(AQUA 펩타이드)을 시료에 스파이킹(spiking)하여 분석하는 아쿠아(AQUA, absolute quantification) 방법을 이용하였다. Cys59 위치의 포르밀글리신을 정량하기 위하여 단계적으로 희석된 AQUA 펩타이드를 시료에 스파이킹한 다음, 검정 곡선(calibration curve)를 작성하였다. LC-ESI-MS를 이용하여 분석한 후 FGly 형태의 펩타이드와 Cys 형태의 펩타이드 비율을 측정하고, 이를 AQUA 검정 곡선에 대입하여 포르밀글리신의 함량을 계산하였다.
분석 결과, 80±15%의 비율로 Cys59가 FGly로 바뀌어 있음을 확인하였다. 종래 시판 중인 엘라프라제가 약 50% 비율로 Cys59가 FGly로 바뀌어 있음을 고려할 때(Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007; Genet Med 2006:8(8):465-473) 본 발명의 IDS를 포함하는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 제제는 엘라프라제에 비해 활성이 훨씬 높을 것으로 예상된다.
<1-4> 당질화 여부 및 유형 확인
본 발명의 IDS의 당질화 여부 및 당질화 유형을 확인하고자, IDS를 여러 가지 당 절단 효소를 처리하고, SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리한 후 그 이동 정도를 분석하였다.
구체적으로 IDS 시료에 표 1에 열거된 4 가지의 당 절단 효소를 조합하여 처리한 후, SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였다.
Figure 112012010191605-pat00001
분석 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, IDS는 PNGase F와 Endo H에 의해서는 절단되었으나, O-glycosidase에 의해서는 절단되지 않았다. 따라서, 본 발명의 IDS는 N-당질화 단백질인 것으로 확인되었다. 또한, IDS는 PNGase F에 의해서 완전히 절단되었으나 Endo H에 의해서는 약하게 절단되어 크기 감소가 적음을 알 수 있었다. 한편, PNGase F는 3가지 유형의 당질화 위치에 모두 작용하는 효소이지만 Endo H는 고 만노스(high mannose) 유형과 하이브리드(hybrid) 유형의 당질화 위치에만 작용하는 효소이다. 이 결과들을 통해 IDS에는 콤플렉스 유형, 고 만노스(high mannose) 유형 그리고 하이브리드 유형의 세 가지 당질화 유형이 존재함을 확인하였다.
<1-5> 만노스-6-포스페이트(Mannose-6-phosphate) 함량 분석
만노스-6-포스페이트(M6P)는 세포의 M6P 수용체와 반응하여 IDS가 리소좀 내로 들어가 헤파란 설페이트나 더마탄 설페이트를 가수분해할 수 있도록 돕는 역할을 한다.본 실험예에서는 TFA를 이용하여 IDS를 산 가수분해한 후 HPAEC-PAD (Bio-LC)를 이용하여 만노스-6-포스페이트의 함량을 측정하였다.
IDS를 6.75M 트리플루오로아세트산(TFA)으로 가수분해한 후 액체 크로마토그래피(High Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection; HPAEC-PAD)를 이용하여 분석하였다. 농도를 알고 있는 M6P를 동일한 조건에서 분석하여 면적을 비교함으로써 당단백질 몰 대비 M6P의 몰비를 구하였다. 분석은 각각 3회 반복하였다. M6P 표준물질 및 IDS의 M6P 조성 크로마토그램을 도 12에 나타내었고 M6P의 몰비를 표 2에 정리하였다.
Figure 112012010191605-pat00002
표 2에서 보는 바와 같이, 1몰의 IDS 당 약 3몰의 M6P가 존재하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과로 볼 때 본 발명의 IDS를 포함하는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 제제는 생체 내에서 리소좀 내 GAG를 분해하는 능력이 우수할 것으로 사료된다.
<1-6> 질량 분석
당화된 IDS와 탈당화된 IDS의 질량을 MALDI-TOF-MS를 사용하여 측정하였다. 탈당화된 IDS는 당화된 IDS에 PNGase F를 처리하여 분리하였다. MALDI-TOF-MS는 Delayed Extraction laser-desorption mass spectrometer와 연결된 Voyager-DE PRO Biospectrometry (Applied Biosystems, USA) 기기를 사용하여 시험을 수행하였고, 기기는 소혈청알부민(BSA)과 IgG1을 사용하여 보정하였다. 분석결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112012010191605-pat00003
표 3에서 보는 바와 같이, 당화된 IDS의 분자량(molecular size)은 77,244 Da이고 탈당화된 IDS의 분자량은 59,399 Da으로 아미노산 서열에 기초한 이론 분자량 59,298 Da과 유사하였다.
<1-7> 순도 측정
크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 방법을 이용하여 IDS의 순도를 평가하였다. 크기배제 크로마토그래피는 상대적인 분자량 및 모양에 따라 단백질을 분리하며 컬럼 공극(pore)의 크기보다 큰 단백질은 한꺼번에 배출되며 이후 분자량 또는 크기의 역순으로 배출된다. 사용된 기기는 얼라이언스(alliance) 2695 HPLC 시스템(Waters, WI, USA)을 사용하였으며, 2487 UV/VIS 검출기(Waters, WI, USA)를 이용하여 214 nm에서 단백질을 검출하여 엠파워 2 소프트웨어(Empower 2 Software)를 이용하여 분석하였다. 컬럼은 TSK G3000SWXL 컬럼 및 TSK SWXL 컬럼용 가드 컬럼(Tosoh, Japan)을 사용하였다. IDS를 제형버퍼로 1.0 mg/mL 농도로 희석한 후 10 ㎕ 부피로 컬럼에 적용하였다. 이동상(20 mM 나트륨 인산염 완충액, 200 mM NaCl, pH 7.0)으로 0.5 mL/min의 유속으로 60분간 분석하였다.
분석결과, 도 13에서 보는 바와 같이, IDS 단량체는 약 16.4분의 지연시간을 가지고 있으며 100%의 순도를 유지하고 있는 것으로 나타났다.
<1-8> 합성 기질을 이용한 활성 측정
합성기질인 4-메틸움벨리페릴-L-이듀로니드-2-설페이트Na2(4-methylumbelliferyl -L-iduronide-2-sulfate Na2, MU-IdoA-2S)와 IDS를 4 시간 동안 반응시키면 기질로부터 설페이트가 1차적으로 유리된다(1차 반응). 1차 반응 후에 LEBT(lysosomal enzymes purified from bovine testis)를 첨가하면 기질인 4-메틸움벨리페릴-L-이듀로니드(1차 반응 시 설페이트가 유리된 반응물)와 2차 효소반응이 진행되어 L-이듀로니드가 유리되고 최종적으로 4-메틸움벨리페릴만 남게 된다. 남아 있는 4-메틸움벨리페릴은 형광을 띠게 되므로 형광의 세기를 측정(Ex.355nm/Em.460nm)하여 IDS의 활성을 평가하였다. 평가 결과, 본 발명의 IDS는 19 ~ 55 nmol/min/㎍ 범위의 비활성을 나타내었다. 상기 활성은 IDS 아미노산 잔기 59번의 시스테인이 번역 후 전사되어 효소의 활성 부위에 포르밀글리신(FGly)이 존재함을 의미한다.
<1-9> 천연 기질을 이용한 활성 측정
IDS와 천연기질과의 반응여부를 확인하기 위하여 헤파린 이당류(heparin disaccharide)와 IDS를 반응시켜 유리된 설페이트 이온을 확인하였다. 반응액을 이온 컬럼(Vydac 302IC)에 주입하고 이동상 0.49 g/L 프탈산을 유속 2 ml/min으로 흘려주어 유리된 설페이트 이온을 290 nm의 파장에서 음성 모드로 검출하였다.
확인 결과 도 14에서 보는 바와 같이, IDS는 천연기질인 헤파린 이당류의 설페이트 이온을 가수분해하는 것으로 나타났으며, 이는 생체 내에 있는 더마탄 설페이트와 헤파란 설페이트의 O-결합된 설페이트를 분해할 수 있음을 의미한다.
<1-10> 시험관내 세포 흡수 활성
정상 인간섬유아세포(normal fibroblast cell) 및 헌터증후군 환자 세포를 이용하여 세포내로의 IDS 흡수능력을 측정하였다. 구체적으로, 정상 섬유아세포와 헌터증후군 환자세포(삼성 서울병원 제공)를 배양한 후 IDS를 농도별로 첨가하여 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 약 20 시간동안 배양하여 세포내로 IDS가 흡수되도록 하였다. 세포를 회수한 다음, 파쇄하여 얻어진 세포 파쇄액으로부터 세포 내에 흡수된 IDS의 양을 측정하였다.
정상 섬유아세포에 첨가된 IDS 농도대비 세포내로 흡수된 IDS의 양으로부터 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 그래프와 라인웨버-버크 플롯(Lineweaver-Burk Plot) 을 작성하여 Kuptake(포화된 IDS가 1/2이 되는 IDS 농도) 값을 계산하였다. 상기 계산된 Kuptake 값은 18.0 nM 이하였다. 이는 IDS의 M6P와 세포 표면의 M6P 수용체의 작용을 통해 IDS가 세포내로 흡수된다는 것을 의미한다(도 15 참조).
또한, 전술한 방법과 동일하게 정상 인간 섬유아세포 뿐만 아니라 헌터증후군 환자세포로 흡수되는 IDS의 양과 활성을 측정해 본 결과, 두 세포 모두 IDS의 양과 활성이 증가함을 확인하여 IDS의 세포내 흡수능력을 확인하였다(도 16 참조).
실험예 2: 임상 시험을 통한 IDS 의 효과 분석
헌터증후군으로 확인된 31명의 환자를 3 그룹으로 나누고, 본 발명의 IDS 단백질을 투여한 다음, 여러 가지 헌터증후군 관련 변수의 변화를 분석하였다. 한편, 양성 대조군으로서 헌터증후군 치료제로 시판중인 엘라프라제(Elaprase®를 투여하여 비교하였다.
<2-1> 소변 GAG 변화(1차 유효성 평가변수) 측정
세 그룹의 헌터증후군 환자 그룹에 각각 엘라프라제(0.5 mg/kg) 및 본 발명의 IDS(0.5 mg/kg 및 1.0 mg/kg)를 24주간 투여한 후 소변에서 GAG (Glycosaminoglycan)의 양을 선행문헌(Conn. Tissue Res. Vol.28, pp317-324, 1990.; Ann. Clin. Biochem. Vol.31, pp147-152, 1994.)에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 측정 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure 112012010191605-pat00004
표 4에서 보는 바와 같이, 엘라프라제 투여시 환자의 소변 내 GAG가 18.7% 감소한 반면, 본 발명의 IDS를 투여한 결과 소변 내 GAG가 동량에서 29.5% 감소하였다. 또한, 본 발명의 IDS를 1.0 mg/kg의 양으로 투여한 결과, GAG 함량이 41.1% 감소하였다. 상기 결과는 본 발명의 IDS가 GAG가 분해되지 않아 축적되는 질환인 헌터 증후군을 치료하는데 효과적임을 보여준다.
<2-2> 6-MWT(6 minute walking test) 변화(2차 유효성 평가변수) 측정
24주간 엘라프라제 및 본 발명의 IDS를 투여한 헌터증후군 환자를 대상으로, 6분 동안 걷는 거리를 선행기술(Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol.166. pp 111-117, 2002.)에 기재된 방법에 따라 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure 112012010191605-pat00005
표 5에서 보는 바와 같이, 엘라프라제 투여 환자의 경우 6-WMT 변화율이 1.3%에 불과한 반면, 본 발명의 IDS를 투여한 환자의 경우 동량에서 18.2%로 증가하였다. 헌터증후군 환자의 경우 관절 구축으로 인해 정상인에 비해 걷는 것이 쉽지 않으나, 본 발명의 IDS는 이를 개선할 수 있어 헌터증후군의 개선에 효과적임을 알 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 가지는 IDS를 유효성분으로 포함하며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 IDS의 59번 위치의 시스테인이 포르밀글리신(FGly)으로 변경된 비율이 몰비로 65% 이상임을 특징으로 하는 헌터증후군 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 가지는 IDS의 59번째 시스테인이 포르밀글리신으로 변경된 비율이 몰비로 75% 이상임을 특징으로 하는 헌터증후군 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 가지는 IDS 1몰 당 2.0 내지 4.0몰의 만노스-6-포스페이트(M6P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 헌터증후군 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 가지는 IDS 1몰 당 2.5 내지 3.0몰의 만노스-6-포스페이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 헌터증후군 치료용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 헌터증후군 치료용 제제.
  6. 제5항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체; 및
    완충제, 카보하이트레이트, 안정화제, 항산화제, 정균제, 킬레이트화제, 아쥬반트, 현탁제, 농후제 및 보존제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
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DK12803297.6T DK2723369T4 (da) 2011-06-24 2012-06-15 Sammensætning og formulering omfattende rekombinant humant iduronat-2-sulfatase og fremgangsmåde til fremstilling deraf
PL12803297.6T PL2723369T5 (pl) 2011-06-24 2012-06-15 Kompozycja i formulacja zawierające rekombinowaną, ludzką 2-sulfatazę iduronianu i sposób ich otrzymywania
HRP20160490TT HRP20160490T4 (hr) 2011-06-24 2012-06-15 Pripravak i oblik koji sadrže rekombinantnu humanu iduronat-2-sulfatazu te postupci njihove pripreme
MX2013015127A MX341946B (es) 2011-06-24 2012-06-15 Composicion y formulacion que comprende iduronato - 2 - sulfatasa humana recombinante y metodo de preparacion de la misma.
EA201490149A EA026499B1 (ru) 2011-06-24 2012-06-15 Композиция и лекарственное средство, содержащие рекомбинантную человеческую идуронат-2-сульфатазу, и способ их получения
EP12803297.6A EP2723369B2 (en) 2011-06-24 2012-06-15 Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
ES12803297T ES2575377T5 (es) 2011-06-24 2012-06-15 Composición y formulación que comprende iduronato-2-sulfatasa humana recombinante y método de preparación de la misma
RS20160383A RS54822B2 (sr) 2011-06-24 2012-06-15 Kompozicija i formulacija koja obuhvata rekombinovanu humanu iduronat-2-sulfatazu i postupak za njeno dobijanje
PCT/KR2012/004734 WO2012177020A2 (en) 2011-06-24 2012-06-15 Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
CA2839674A CA2839674C (en) 2011-06-24 2012-06-15 Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
PE2013002881A PE20140734A1 (es) 2011-06-24 2012-06-15 Composicion y formulacion que comprende iduronato-2-sulfatasa humano recombinante y metodo de preparacion de las mismas
AU2012274215A AU2012274215B2 (en) 2011-06-24 2012-06-15 Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
PT128032976T PT2723369E (pt) 2011-06-24 2012-06-15 Composição e formulação compreendendo iduronato-2-sulfatase humana recombinante e método para a sua preparação
CN201280030629.XA CN103635203B (zh) 2011-06-24 2012-06-15 包含重组人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的组合物和制剂及其制备方法
HUE12803297A HUE027431T2 (en) 2011-06-24 2012-06-15 Formulation and formulation containing recombinant human iduronate-2-sulfatase and methods for its preparation
NZ620284A NZ620284B2 (en) 2011-06-24 2012-06-15 Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
FIEP12803297.6T FI2723369T4 (fi) 2011-06-24 2012-06-15 Koostumus ja formulaatio, joka käsittää rekombinanttia ihmisen iduronaatti-2-sulfataasia ja sen valmistusmenetelmä
JP2014516901A JP5844459B2 (ja) 2011-06-24 2012-06-15 組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼを含む組成物および製剤ならびにその調製方法
IL230120A IL230120B (en) 2011-06-24 2013-12-23 Preparations containing recombinant iduronate-2-sulfatase and their uses
CO14010749A CO6862105A2 (es) 2011-06-24 2014-01-21 Composición y formulación que comprende iduronato-2-sulfatasa humano recombinante y método de preparación de las mismas
HK14109110.0A HK1195731A1 (zh) 2011-06-24 2014-09-09 包含重組人艾杜糖醛酸- -硫酸酯酶的組合物和製劑及其製備方法
US14/809,856 US9249397B2 (en) 2011-06-24 2015-07-27 Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
JP2015225934A JP6000432B2 (ja) 2011-06-24 2015-11-18 組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼを含む組成物および製剤ならびにその調製方法
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CY20161100468T CY1117861T1 (el) 2011-06-24 2016-05-30 Συνθεση και σκευασμα που περιλαμβανουν ανασυνδυασμενh ανθρωπινη ιδουρονικh 2-σουλφαταση και μεθοδος παρασκευης αυτων
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101380740B1 (ko) * 2012-06-29 2014-04-11 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 이듀로네이트-2-설파타제의 정제
US9150841B2 (en) 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
WO2017003270A1 (ko) * 2015-07-02 2017-01-05 주식회사 녹십자 헌터증후군 치료제 및 치료방법
KR20170004814A (ko) 2015-07-02 2017-01-11 주식회사 녹십자 헌터증후군 치료제
US9896672B2 (en) 2011-06-24 2018-02-20 Green Cross Corporation Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
KR20190136271A (ko) 2018-05-30 2019-12-10 주식회사 녹십자 대뇌 측뇌실 투여에 의해 헌터증후군을 치료하기 위한 방법 및 조성물

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012101671A1 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
KR101158673B1 (ko) * 2011-06-24 2012-07-03 주식회사 지씨바이오 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
US20140004097A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Method of producing recombinant iduronate-2-sulfatase
CN106153745B (zh) * 2015-03-31 2020-11-10 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗体蛋白二硫键配对分析方法
CN106153746B (zh) * 2015-03-31 2020-11-06 三生国健药业（上海）股份有限公司 IgG2型单抗二硫键配对分析方法
CN106153744B (zh) * 2015-03-31 2020-11-10 三生国健药业（上海）股份有限公司 融合蛋白二硫键配对分析方法
SG11201805598WA (en) * 2015-12-30 2018-07-30 Green Cross Corp Methods and compositions for treating hunter syndrome
US20190055513A1 (en) * 2016-02-22 2019-02-21 Agency For Science, Technology And Research Cell culture medium
KR20190139951A (ko) 2017-04-14 2019-12-18 리젠엑스바이오 인크. 인간 뉴런 또는 신경교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 이두로네이트-2 설파타제(ids)를 이용한 뮤코다당증 ii형의 치료
WO2019022563A2 (ko) * 2017-07-28 2019-01-31 한미약품 주식회사 이두로네이트 2-설파타제 결합체
MA50746A (fr) 2017-10-02 2020-08-12 Denali Therapeutics Inc Protéines de fusion comprenant des enzymes d'enzymothérapie substitutive
EP3846780A4 (en) * 2018-09-05 2022-11-30 Sangamo Therapeutics, Inc. ENZYMATIC TESTS FOR QUANTIFICATION OF THERAPY IN PATIENTS WITH MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYPE I OR II
EP3826664A4 (en) 2019-02-06 2022-10-26 Sangamo Therapeutics, Inc. METHOD FOR THE TREATMENT OF TYPE I MUCOPOLYSACCHARIDOSES

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932211A (en) 1991-11-12 1999-08-03 Women's And Children's Hospital Glycosylation variants of iduronate 2-sulfatase
IL155588A0 (en) 2003-04-27 2003-11-23 Metabogal Ltd Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby
AU2004210936C1 (en) 2003-02-11 2010-12-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Diagnosis and treatment of Multiple Sulfatase Deficiency and other using a Formylglycine Generating Enzyme (FGE)
WO2005113765A2 (en) * 2004-05-06 2005-12-01 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of activation of sulfatases and methods and compositions of using the same
KR101158673B1 (ko) * 2011-06-24 2012-07-03 주식회사 지씨바이오 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
KR101380740B1 (ko) 2012-06-29 2014-04-11 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 이듀로네이트-2-설파타제의 정제

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular Genetics and Metabolism 90 (2006.12.) pp 329-337.
Yonsei Med J. Vol52, No2 (2011.3) page263-267.
재조합 CHO 세포 무혈청 현탁 배양에 의한 헌터증후군 효소치료제 Iduronate 2-sulphatase의 생산성 향상에 관한 연구, 강원대학교학위논문, 2008, 이보라.

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9896672B2 (en) 2011-06-24 2018-02-20 Green Cross Corporation Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
US10174299B2 (en) 2011-06-24 2019-01-08 Green Cross Corporation Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
US10344270B2 (en) 2012-06-29 2019-07-09 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for treatment of Hunter syndrome
US9051556B2 (en) 2012-06-29 2015-06-09 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Purification of iduronate-2-sulfatase
US9150841B2 (en) 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
US9492511B2 (en) 2012-06-29 2016-11-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for treatment of hunter syndrome
KR101380740B1 (ko) * 2012-06-29 2014-04-11 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 이듀로네이트-2-설파타제의 정제
US11530393B2 (en) 2012-06-29 2022-12-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions comprising iduronate-2-sulfatase
US9719074B2 (en) 2012-06-29 2017-08-01 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
EP2867245B1 (en) 2012-06-29 2018-09-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Purification of iduronate-2-sulfatase
EP3441398A1 (en) 2012-06-29 2019-02-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Purification of iduronate-2-sulfatase
WO2017003270A1 (ko) * 2015-07-02 2017-01-05 주식회사 녹십자 헌터증후군 치료제 및 치료방법
US10561713B2 (en) 2015-07-02 2020-02-18 Green Cross Corporation Hunter syndrome therapeutic agent and treatment method
EA038110B1 (ru) * 2015-07-02 2021-07-07 Грин Кросс Корпорейшн Способ лечения синдрома гунтера
KR20170004814A (ko) 2015-07-02 2017-01-11 주식회사 녹십자 헌터증후군 치료제
KR20190136271A (ko) 2018-05-30 2019-12-10 주식회사 녹십자 대뇌 측뇌실 투여에 의해 헌터증후군을 치료하기 위한 방법 및 조성물

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