JP5844459B2 - 組換えヒトイズロン酸−2−スルファターゼを含む組成物および製剤ならびにその調製方法 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
- C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
Description
(1)配列番号1で表されるIDSをコードする遺伝子で形質転換された組換え細胞株を培養し、培養物を得ること;および
(2)培養物をアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
を含み、組換え細胞株が加水分解物の存在下で培養され、カチオン交換クロマトグラフィーがpH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われることを特徴とする。
(1)配列番号1で表されるIDSをコードする遺伝子で形質転換された組換え細胞株を培養し、培養物を得ること;および
(2)培養物をアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
を含み、ここで、組換え細胞株は加水分解物の存在下で培養され、カチオン交換クロマトグラフィーはpH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる。
(1)IDS遺伝子を担持する発現ベクターで宿主細胞を形質転換して組換え細胞株を得ること;
(2)無血清培地中、加水分解物の存在下で組換え細胞株を培養し、培養物を得ること;
(3)アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって培養物からIDSを精製すること、ただし該カチオン交換クロマトグラフィーはpHが4.0〜6.0の範囲にある溶出緩衝液を使って行われる;および
(4)精製されたIDSを医薬上許容される担体と組み合わせること
を含む。
<1-1>遺伝子の取得
既述のとおり[S.Beckebaumら, Immunology, 2003, 109:487-495]、末梢血単核球(PBMC)をヒト血液から単離した。既述のプロトコール[M. J. Hollandら, Clin. Exp. Immunol., 1996, 105:429-435]に従って、PBMCから全RNAを抽出した。全RNAからcDNAライブラリーを構築するために、一本鎖合成キット(Boehringer Mannheim)を利用し、オリゴ-(dT)プライマーを使って、一本鎖cDNAを合成した。これに関連して、1μgの全RNAを含有するエッペンドルフチューブにDEPC処理蒸留水を加えて、最終体積が12.5μlになるようにした。次に、そのチューブに1μgの20pmolオリゴ(dT)プライマーを加えてから、70℃で2分間インキュベートし、冷却した。この反応混合物に、4μgの反応緩衝液、1μgのdNTP、1μgのRNase阻害剤、および1μgの逆転写酵素を加え、次に、それらを42℃で1時間反応させて、一本鎖cDNAを合成した。cDNAをテンプレートとし、配列番号2〜4のプライマーの存在下でPCRを行うことにより、ヒトIDS遺伝子を増幅した。ここでは、遺伝子クローニングにおいて使用するための制限酵素認識部位を含有するように、各プライマーを設計した。
A.pJK-dhfr-IDS-S1ベクターの構築
非コード配列として、抗体の軽鎖シグナル配列(ヒトIgG軽鎖の一部に由来)を、実施例<1-1>によって取得したIDS遺伝子の5'端に、PCR前に導入した。それによって得られたPCR産物を電気泳動によりゲル上で泳動した後、ゲル抽出キットを使ってヒトIDS遺伝子を単離した。単離されたIDS遺伝子およびpJK-dhfr-Or2ベクター(Aprogen)をEcoRVおよびApaIで消化し、16℃で20時間、互いにライゲートした。こうして構築された組換えベクターを大腸菌(E. coli)(DH5α)に形質転換し、次にそれを、50μg/mLアンピシリンを含有するLBプレート上に拡げ、終夜インキュベートした。プレート上で成長したコロニーを選択し、そこからプラスミドを単離するために培養した(図1)。
上で構築したプラスミドの非コード配列をシグナル配列に変えるために、組換えヒトIDSをpJK-dhfr-or2ベクターにサブクローニングした。この目的のために、pJK-dhfr-IDS-S1ベクターをEcoRVおよびApaIで消化することで部分IDS遺伝子(1233bp)を得て、次にそれを、前もって同じ制限酵素で処理しておいたpJK-dhfr-Or2ベクターに挿入することにより、pJK-dhfr-IDS-S2ベクターを構築した。非コード配列およびシグナル配列を5'端に導入するために、pJK-dhfr-IDS-S1ベクターをテンプレートとするPCRに、IDS N1フォワードプライマー(配列番号5)およびIDS4リバースプライマー(配列番号7)を使用した。PCRは、94℃で5分間から開始した後、94℃で1分、55℃で30秒および72℃で40秒を30サイクル行い、72℃で10分間の伸長によって締めくくった。
A.CHO-DG44のトランスフェクション
本発明のIDSを発現させるための宿主細胞としてCHO-DG44を使用した。変異型チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO-DG44は、DHFR酵素をコードする内在性dhfr(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)遺伝子に関して、二重欠失を持っている。DHFR酵素は、葉酸がジヒドロ葉酸(FH2)を経由して核酸のデノボ合成に関与するテトラヒドロ葉酸(FH4)へと変換される過程に関与する。細胞におけるdhfrのレベルはMTXの濃度に依存する。DHFRの基質である葉酸に構造が類似しているMTXは、ジヒドロ葉酸レダクターゼとの結合に関して葉酸と競合するので、MTXの存在下では大半のジヒドロ葉酸レダクターゼがその活性を失う。したがって、もし細胞が十分な量のdhfrを増幅しなければ、細胞は、その生命に必要な核酸を合成することができないので、死んでしまう。これに対して増幅が十分であれば、dhfrが比較的豊富に存在するので、細胞は高濃度のMTX下でも生き残ることができる。この系は、dhfr遺伝子を、したがって目的の構造遺伝子を、増幅することができるトランスフェクト細胞株を選択するために、動物細胞に応用することができる。
培養細胞を0.25%トリプシンで剥離させ、計数し、1ウェルにつき100μgのMEM-アルファ培地(10%透析FBSおよび550μg/mL G418を補充)が入っている96穴プレートに、5×103細胞/ウェルの密度で播種した。翌日、同じ培地を100μg/ウェルの量で加え、細胞を2〜3週間培養してコロニーを形成させた。細胞が50%コンフルエントまで成長した時に、培地を新鮮なものに置き換えた。3日間の維持後に、酵素分析のために培養培地を収集した。
選択した15個のクローンを、MTXの濃度を増加させて培養することにより、IDSが増幅される細胞株を選択した。
株NI4は他の株と混じった状態になっている可能性があった。そこでこの株を単一株に分離した。20nM MTXに耐えるN14クローンを、所望の細胞株が選択されるように、限界希釈法によってサブクローニングした。
A.振とうフラスコ培養
本発明のIDSを生産するためにNI4-S46株を大規模に培養した。この株を、125mL培養フラスコ中のEX-cell302無血清培地(グルタミン、デキストラン硫酸、およびプルロニック(pluronic)F-68を含有)に接種し、5±1%CO2インキュベーター中、37±1℃で培養した。次に細胞を、2〜3日ごとに、振とうフラスコを使って、1:5〜1:8の比率で継代した。継代時に、培養体積をおよそ2,400mLまで徐々に増加させた。多くの振とうフラスコで、細胞を、発酵槽への接種に十分なレベルまで培養した。
振とうフラスコにおける細胞の密度が1.3×106細胞/mLに到達した時に、それらを30L発酵槽に接種した。細胞培養中は、培養条件を、10%以上の溶存酸素含量、37±1℃の培養温度、および7.0±0.2のpHに維持した。必要であれば、細胞試料を採取して、顕微鏡下で観察した。細胞培養物を調べて、細胞数、細胞生存率、pH、グルコース濃度およびグルタミン濃度を分析した。分析結果に基づいて、細胞が十分に成長したと判断された時に、細胞を150L発酵槽に接種した。
30L発酵槽における細胞が0.9×106細胞/mL以上の密度に到達した時に、それらを150L発酵槽に接種した。細胞培養中は、培養条件を、10%以上の溶存酸素含量、37±1℃の培養温度、および7.0±0.2のpHに維持した。必要であれば、細胞試料を採取して、顕微鏡下で観察した。細胞培養を調べて、細胞数、細胞生存率、pH、グルコース濃度およびグルタミン濃度を分析した。分析結果に基づいて、細胞が十分に成長したと判断された時に、細胞を650L発酵槽に接種した。
150L発酵槽における細胞が0.9×106細胞/mL以上の密度に到達した時に、それらを650L発酵槽に接種した。細胞培養中は、培養条件を、3日間は、10%以上の溶存酸素含量、34±1℃の培養温度、および6.9±0.2のpHに維持し、次に、32±1℃の培養温度および6.9±0.2のpHに維持した。必要であれば、細胞数、細胞生存率、pH、グルコース濃度およびグルタミン濃度を分析するために、細胞試料を採取し、顕微鏡下で観察した。分析結果に応じて、細胞成長を継続させるために、グルコース濃度およびグルタミン濃度を調節した。発酵中は、ホルミルグリシン変換を増加させるために加水分解物を加えた。
次に挙げる一連の4つのクロマトグラフィープロセスを使ってIDSを細胞培養物から単離した。
650L発酵槽への接種の10日後、細胞生存率が80〜85%の範囲にとどまっている時に、培養を停止した。ミリポア(Millipore)PODフィルターシステムおよびD0HCフィルター(ミリポア)を使って、0.9バール以下の圧力で、細胞を培養物から収穫した。細胞を除去した後、上清をプレフィルター(ミリポア、0.5+0.2μm)および0.45+0.2μmフィルターでろ過し、使い捨て滅菌ビニルバッグに回収した。収穫した培養物溶液を2〜8℃で貯蔵した。
Aで回収したろ液を、限外濾過システム(タンジェンシャルフロー濾過膜システム)を使って約10倍濃縮した。限外濾過システムの内部に取り付けた膜(カットオフ:30K、Pall)を流量20〜25L/分のWFI(注射用水)で洗浄してから、20mMリン酸ナトリウム(リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素ナトリウム七水和物)を含有する緩衝液(pH7.0〜8.0)で平衡化した。平衡化後に、膜を通過しなかった画分を回収しながら、ろ液を膜に給送した。回収された体積がろ液の初期体積の約1/10になったら、濃縮作業を停止した。濃縮物の体積の3〜4倍の体積で緩衝液を連続的に交換した。電導度およびpHが基準内に入ったら、このプロセスを停止した[基準−電導度:=5.0mS/cm、pH7.0〜8.0]。
Bで回収された濃縮物から色素およびさまざまな不純物を除去するために、Qセファロース樹脂(GE Healthcare)を充填したカラム(GE Healthcare)で、アニオン交換クロマトグラフィーを行った。20mMリン酸ナトリウム(リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素ナトリウム七水和物)を含有する平衡緩衝液(pH7.0〜8.0)でカラムを平衡化した。Bで得た濃縮物を0.45+0.2μmフィルター(Sartorius)でろ過し、平衡化したカラムに、100〜120cm/時間の流速でローディングした。ローディングが完了した後、カラムをまず平衡緩衝液で洗浄し、次に、塩化ナトリウムを含有する洗浄緩衝液(pH5.5〜7.5)で洗浄した。次に、塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液(pH5.5〜7.5)で、標的タンパク質を溶出させた。
アニオン交換クロマトグラフィー後に残っている色素および不純物を除去するために、フェニルセファロース樹脂(GE Healthcare)を充填したカラム(GE Healthcare)で、疎水性クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウムを含有する平衡緩衝液(pH5.0〜7.0)でカラムを平衡化した。Cで得た溶出物を0.45+0.2μmフィルター(Sartorius)でろ過し、平衡化したカラムに、70〜100cm/時間の流速でローディングした。ローディングが完了した後、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。次に、グリセロールを含有する溶出緩衝液(pH5.0〜7.0)で、標的タンパク質を溶出させた。
宿主細胞または実行したプロセスで使用した何らかの材料に由来しうるウイルスを低pH条件によって不活化した。これに関連して、Dで得た溶出物をpH3.0〜4.0に2時間維持し、その酸性度は25%酢酸で調節した。その後、次のプロセスに使用するために、0.5M水酸化ナトリウムを使って溶出物のpHを4.0〜5.0に増加させた。低pHによる不活化は12±2℃で行った。
IDSはオリゴ糖を伴う糖タンパク質であり、グリカン鎖の末端にあるシアル酸の含量に応じて異なる等電点を有する異性体として存在する。負電荷を有するオリゴ糖として、シアル酸は、カチオン交換樹脂への結合の度合いに関して、シアル酸の含量に応じた相違を示す。この特徴づけを使って、高いシアル酸含量と共に高い活性(高いホルミルグリシン含量)を示すIDSを得るために、そして他の不純物[製品不純物(凝集IDS、加工IDS)、プロセス不純物(宿主細胞タンパク質)]を除去するために、カチオン交換クロマトグラフィーを行った。詳しく述べると、カチオン交換カプト(Capto(商標))MMC樹脂(GE Healthcare)を充填したカラムを、グリセロール添加平衡緩衝液(pH4.0〜5.0)で平衡化した。Eで得た不活化溶出物を0.45+0.2μmフィルター(Sartorius)でろ過し、平衡化したカラムに、100〜120cm/時間の流速でローディングした。次に、カラムを平衡緩衝液で洗浄してから、グリセロール添加溶出緩衝液(pH4.0〜6.0)で溶出させることで、高いシアル酸含量(等電点3.5以下)、高い活性(ホルミルグリシン含量:80±15%)および高い純度(SE-HPLC、98%以上)を有するIDSを得た。
カチオン交換クロマトグラフィーにおいて使用したグリセロールを除去するため、および溶出物の体積を減少させるために、アフィニティークロマトグラフィー(ブルーセファロース、GE Healthcare)を行った。Fで得た溶出物を0.45+0.2μmフィルター(Sartorius)でろ過し、グリセロール添加平衡緩衝液(pH4.5〜5.5)で前もって平衡化しておいたブルーセファロース樹脂充填カラム(GE Healthcare)に100〜120cm/時間の流速でローディングした。ローディングの完了後に、洗浄緩衝液(pH4.5〜5.5)でカラムを洗浄し、標的タンパク質を溶出緩衝液(pH6.0〜8.0)で溶出させた。
限外濾過システム(タンジェンシャルフロー濾過膜システム)を使って、Gで得た溶出物のタンパク質濃度を調節すると共に、精製タンパク質の緩衝液を製剤緩衝液と交換した。限外濾過システムの内部に取り付けた膜(カットオフ:10K、Pall)を流量450〜650mL/分のWFI(注射用水)で洗浄してから、ポリソルベート20を含まない製剤緩衝液(2.25g/Lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.99g/Lリン酸水素ナトリウム七水和物、8g/L塩化ナトリウム、pH6.0〜7.0)で平衡化し、次いで、標的タンパク質を濃縮した。濃縮物の体積の3〜4倍の体積で緩衝液を連続的に交換した。電導度およびpHが基準内に入ったら、このプロセスを停止した[基準−電導度:15.0±3.0mS/cm、pH6.0〜7.0]。濃縮溶液の含量を4.0±0.5mg/mLに調節する。
宿主細胞または使用した材料のいずれかから由来しているかもしれないウイルスを除去するために、ナノフィルター(NFP、ミリポア)を使ってナノろ過を行った。フィルターの完全性試験は、ナノフィルターを注射用水で洗浄した後に行う。完全性試験に合格したら、ポリソルベート20を含まない1Lの製剤緩衝液(2.25g/Lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.99g/Lリン酸水素ナトリウム、8g/L塩化ナトリウム、pH6.0〜7.0)で、ナノフィルターを平衡化した。平衡化の完了後に、Hで得た濃縮物を約2バールの圧力でフィルターに通すことで、ナノろ液を生成した。ろ過が完了した後に、フィルターを製剤緩衝液で洗浄した(後洗浄溶液)。ナノろ過溶液と後洗浄溶液とを合わせた後に、タンパク質含量を測定する。
Iで得たろ液のタンパク質濃度を、ポリソルベート20を含まない製剤緩衝液で調節した。ポリソルベートの添加後に、溶液を0.2μmフィルターでろ過することで、原薬を生成した。原薬を小分けし、使用時まで超低温フリーザー(-70±10℃)で貯蔵した。
超低温フリーザーに貯蔵した原料を28±1℃に維持した水槽で融解し、製剤緩衝液(2.25g/Lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.99g/Lリン酸水素ナトリウム七水和物、8g/L塩化ナトリウム、0.23g/Lポリソルベート20、pH6.0〜7.0)を使って、約2.05±0.2mg/mLのタンパク質濃度に希釈した。その後、その希釈溶液を0.2μmフィルターでろ過することで、最終バルク溶液を生成した。自動充填を使って、この最終バルク溶液を、およそ3.3gずつ、6mLバイアルに充填した。バイアル検査試験に合格したら、バイアルを包装することで、薬物製品を生産した。
市販の組換えIDSであるエラプレース(登録商標)を比較例として使用した。
<1-1>アミノ酸配列決定−内部配列決定
脱グリコシル化IDSをSDS-PAGEによって分離してから、ゲル切り出しを行った。次に、さまざまなエンドプロテイナーゼ(トリプシン、キモトリプシン、AspN、キモトリプシン/トリプシン、AspN/トリプシン、GluC、およびGluC/トリプシン)による処理で生じた消化産物を、MALDI-MS/MSおよびLC-ESI-MS/MSを使って分析した(図5)。結果として合計525アミノ酸の配列が同定された。アミノ酸配列はヒトIDSの理論的配列と一致した(図6)。
ポリペプチドにおいて、ジスルフィド結合は、通常、システイン残基の2つのSH基のカップリングによって生じる共有結合であり、タンパク質の高次構造の安定化に重要な役割を果たす。理論上、IDSの525アミノ酸は6つのシステイン残基を含有し、そのうちの4つがジスルフィド結合を形成する。この例では、IDSのジスルフィド結合を担うシステイン残基の位置を同定した。まず、糖の干渉を排除するために、IDSをPNGase Fで処理することによって脱グリコシル化した。ジスルフィド結合の形成に参加しないシステイン残基が妨害因子として作用するのを防ぐために、4-ビニルピリジンを使ってIDSを非還元試料に変換することで、SH基がS-S結合をランダムに形成しないようにした。一方、ジスルフィド結合をDTTによって切断した後に、4-ビニルピリジンでブロッキングすることで、還元試料を得た。実験例1-3の結果に基づいて選択したトリプシンおよびAspNを非還元試料および還元試料に適用した。こうして得たペプチドフラグメントをRP-HPLCで分離した。非還元試料には見つかるが還元試料には見つからないピークを識別するために、非還元試料および還元試料のRP-HPLCクロマトグラムを比較した(図7)。
IDSは、共にグリコサミノグリカン(GAG)の一種であるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。この分解活性は、活性部位にある59番目のシステイン残基(Cys59)が翻訳後修飾によってホルミルグリシン(FGly)に変換されるまで獲得されない。そこで、Cys59のFGlyへの翻訳後修飾を調べることによって、IDSの分解活性を分析した。この分析には、MS(質量分析)に基づく定量的分析法であるAQUA(絶対定量(absolute quantification))を使用し、ここでは、放射標識合成基質(AQUAペプチド)を試料にスパイクした。Cys59位におけるホルミルグリシンを定量的に分析するために、AQUAペプチドの段階希釈液を試料にスパイクし、検量線を引いた。FGly型ペプチドとCys型ペプチドとの比を、LC-ESI-MS分析によって測定し、AQUA検量線に適用することで、ホルミルグリシンの含量を計算した。
本発明のIDSがグリコシル化されているかどうかを調べ、グリコシル化されているのであれば、そのグリコシル化パターンを同定するためのアッセイを行った。この目的のために、IDSをさまざまなグリコシドヒドロラーゼ酵素で処理し、その消化産物をSDS-PAGEで分離し、それらの移動度パターンを分析した。
細胞上のM6P受容体に結合することで、マンノース-6-リン酸(M6P)は、IDSが細胞内に内在化されることを、したがってリソソーム中のヘパラン硫酸またはデルマタン硫酸を加水分解することを可能にする。この例では、IDSをトリフルオロ酢酸(TFA)で酸加水分解し、HPAEC-PAD(Bio-LC)にかけることで、マンノース-6-リン酸を定量的に分析した。
[表2]マンノース-6-リン酸含量に関する分析結果
MALDI-TOF-MSを使ってグリコシル化IDSおよび脱グリコシル化IDSの質量を測定した。PNGase Fによるグリコシル化IDSの処理は脱グリコシル化IDSを与えた。MALDI-TOF-MSは、遅延引き出しレーザー脱離質量分析計と接続したVoyager-DE PRO Biospectrometry(Applied Biosystems、米国)を使って行った。計器はウシ血清アルブミンおよびIgG1を使って標準化した。分析結果を下記表3に要約する。
[表3]IDSのMALDI-TOF-MS分析結果
サイズ排除クロマトグラフィーを使ってIDSの純度を測定した。サイズ排除クロマトグラフィーは、溶解状態の分子が相対的分子量および形状によって分離されるクロマトグラフィー法である。サイズ排除クロマトグラフィーでは、カラムの孔径より大きいタンパク質は、その細孔系に入り込むことができず、カラムを直ちに素通りする。続いて、より小さい分子量またはサイズを有する分析物が、遅れて溶出する。このクロマトグラフィーには、2487 UV/VIS検出器(Waters、米国ウィスコンシン州)と接続したAlliance 2695 HPLCシステム(Waters、米国ウィスコンシン州)を使用した。タンパク質を214nmで検出し、Empower 2ソフトウェアを使って分析した。TSK SWXLガードカラムと連結したTSK G3000SWXLカラム(東ソー、日本)に分析物をローディングした。IDSを、製剤緩衝液に1.0mg/mLの濃度まで希釈してから、10μmの体積でカラムにローディングした。それらを移動相(20mMリン酸ナトリウム緩衝液、200mM NaCl、pH7.0)と共に0.5mL/分の流量で60分間流した。
IDSと合成基質(4-メチルウンベリフェリル-L-イズロニド-2-硫酸Na2(MU-IdoA-2S))との4時間の反応により、硫酸部分が放出される(一次反応)。一次反応後に、LEBT(ウシ精巣から精製されたリソソーム酵素)の添加によって、基質4-メチルウンベリフェリル-L-イズロニド(一次反応において硫酸部分の放出後に残る反応物)との二次酵素反応が誘導されて、L-イズロニド部分から4-メチルウンベリフェリル部分が分離する。残った4-メチルウンベリフェリルは蛍光原性であるので、蛍光(励起355nm/蛍光460nm)の強さを測定することによって、IDSの活性を評価した。本発明のIDSは比活性が19〜55nmol/分/μgの範囲にあることがわかった。この活性は、IDSにおける59番目のシステイン残基の翻訳後修飾の結果として、ホルミルグリシンが酵素の活性部位に存在することを示している。
IDSが天然基質と反応するかどうかを決定するために、IDSとの反応によって基質(ヘパリン二糖)から放出される硫酸イオンを測定した。反応混合物をイオンカラム(バイダック(Vydac)302IC)にローディングし、0.49g/Lフタル酸の移動相と共に、2ml/分の流量で流し、その間に、遊離の硫酸イオンをネガティブモードで290nmにおいて検出した。図14に示すように、IDSは、ヘパリン二糖から硫酸イオンを加水分解することが確認された。これは、IDSが、インビボでデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸のO結合型硫酸を分解する能力を有することを示している。
正常な線維芽細胞およびハンター症候群患者細胞を使ってIDSの細胞内在化活性を測定した。これに関連して、正常な線維芽細胞およびハンター症候群患者細胞(韓国ソウルのSamsung Medical Centerから入手)を、5%CO2インキュベーター中、さまざまな濃度のIDSと共に、37℃で20時間インキュベートしながら、培養し、細胞に内在化させた。収穫後に、細胞を溶解し、細胞に内在化されたIDSのレベルを、溶解物において決定した。
ハンター症候群を有する31人の患者を3つの群に分け、本発明のIDSを投与し、ハンター症候群に関連するパラメータについて分析した。市販のハンター症候群治療剤であるエラプレース(登録商標)を陽性対照として使用した。
3つのハンター症候群患者群にエラプレース(0.5mg/kg)および本発明のIDS(0.5mg/kgおよび1.0mg/kg)を24週間投与し、尿GAG(グリコサミノグリカン)レベルを、先に報告されているように測定した(Conn. Tissue Res. Vol.28, pp317-324, 1990;Ann. Clin. Biochem. Vol.31, pp147-152, 1994)。測定値を下記表4に要約する。
[表4]IDS投与による尿GAGレベルの変化
ハンター症候群患者にエラプレースおよび本発明のIDSを24週間投与した後、患者が6分間に歩く距離をAM.J. Respir. Crit. Care. Med., Vol.166, pp 111-117, 2002に記載の方法に従って測定した。結果を下記表5に記載する。
[表5]6-MWT試験結果
配列番号2:IDS-1フォワードプライマー配列
配列番号3:IDS-2フォワードプライマー配列
配列番号4:IDS-3リバースプライマー配列
配列番号5:IDS-N1フォワードプライマー配列
配列番号6:IDS-N2フォワードプライマー配列
配列番号7:IDS-4リバースプライマー配列
配列番号8:T7フォワードプライマー配列
Claims (12)
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)を活性成分として含み、該IDSのアミノ酸配列中の59番目のシステイン残基が平均76%以上のモル比でホルミルグリシン(FGly)に変換されており、前記IDSがマンノース-6-リン酸(M6P)をIDS1モルにつき2.3〜3.5モルの量で含有することを特徴とする、ハンター症候群処置用組成物。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)がマンノース-6-リン酸(M6P)をIDS1モルにつき2.5〜3.0モルの量で含有する、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1または2に記載の組成物を含む、ハンター症候群処置用製剤。
- 医薬上許容される担体と、
緩衝剤、糖質、安定剤、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤、アジュバント、懸濁化剤、増粘剤、および保存剤からなる群より選択される物質と
を含む、請求項3に記載の製剤。 - (1)配列番号1で表されるイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)をコードする遺伝子で形質転換された組換え細胞株を加水分解物の存在下で無血清培養し、培養物を得ること;および
(2)培養物をアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
を含み、前記カチオン交換クロマトグラフィーは、pH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる、ハンター症候群処置用組成物の調製方法。 - (1)配列番号1で表されるイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)をコードする遺伝子を担持する発現ベクターで宿主細胞を形質転換して組換え細胞株を得ること;
(2)無血清培地中、加水分解物の存在下で該組換え細胞株を培養し、培養物を得ること;
(3)アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって該培養物からIDSを精製すること、および
(4)精製されたIDSを医薬上許容される担体と組み合わせること
を含み、前記カチオン交換クロマトグラフィーは、pH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる、ハンター症候群処置用組成物の調製方法。 - 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項5または6に記載の方法。
- 疎水性クロマトグラフィーがpH5.0〜7.0の溶出緩衝液を使って行われる、請求項5または6に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーがpH6.0〜8.0の溶出緩衝液を使って行われる、請求項5または6に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーがpH5.5〜7.5の溶出緩衝液を使って行われる、請求項5または6に記載の方法。
- 3.0〜4.0のpHでウイルスを不活化することをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 請求項5または6に記載の方法に従って調製された組成物を製剤化することを含む、ハンター症候群処置用製剤の調製方法。
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