PT2723369E - Composição e formulação compreendendo iduronato-2-sulfatase humana recombinante e método para a sua preparação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÃO E FORMULAÇÃO COMPREENDENDO IDURONATO-2-SULFATASE HUMANA RECOMBINANTE E MÉTODO PARA A SUA PREPARAÇÃO"

Campo técnico A presente invenção está relacionada com uma composição compreendendo iduronato-2-sulfatase humana (daqui em diante referido como "IDS"), uma formulação compreendendo a mesma, um método para a sua preparação e o seu uso no tratamento da sindrome de Hunter.

Mais particularmente, a composição para o tratamento da sindrome de Hunter de acordo com a presente invenção compreende como ingrediente activo IDS tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID N0:1, em que o resíduo de cisteína na posição 59 na sequência de aminoácidos IDS de SEQ ID N0:1 é convertido em formilglicina (FGly: ácido 2-amino-3-oxopropiónico) numa proporção molar de 65% ou superior, de preferência numa proporção molar de 75% ou superior e mais de preferência numa proporção molar de 80% ou superior. Ainda, a IDS incluída na composição para o tratamento da sindrome de Hunter possui manose-6-fosfato numa quantidade de 2,0 a 4,0 moles por mole de IDS, de preferência numa quantidade entre 2,3 e 3,5 moles e, mais de preferência, numa quantidade entre 2,5 e 3,0 moles. O método para a preparação da composição para o tratamento da síndrome de Hunter de acordo com a presente invenção compreende: (1) cultura de uma estirpe celular recombinante transformada com um gene codificador de IDS representado por SEQ ID NO:l e colheita da cultura; e (2) purificação a partir da cultura através da cromatografia de permuta iónica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de afinidade, caracterizado por a cromatografia de permuta catiónica ser realizada usando um tampão de eluição com um pH de 4,0 a 6,0.

Ao ter vantagens sobre os produtos convencionais em termos de segurança e eficácia farmacêutica, a composição terapêutica compreendendo IDS e a formulação compreendendo a mesma pode ser eficazmente usada para tratar a síndrome de Hunter. Técnica Antecedente A síndrome de Hunter ou mucossacaridose tipo II é uma doença do armazenamento lisossomal (LSD) em que mucopolissacáridos, também conhecidos como glicosaminogli-canos (GAG), não são partidos correctamente e acumulam-se no corpo devido a uma deficiência de IDS. Uma vez que GAG continua a acumular-se nas células do corpo, vários sinais da sindrome de Hunter tornam-se mais visíveis. As manifestações físicas para algumas pessoas com sindrome de Hunter incluem características faciais distintas e uma cabeça grande. São sintomas representativos da sindrome de Hunter um abdómen aumentado devido a hepatomegalia ou esplenomegalia, surdez, doença valvular cardíaca, doença obstrutiva das vias aéreas e apneia do sono. Igualmente, as principais articulações podem ser afectadas pela sindrome de Hunter, conduzindo a rigidez das articulações e movimentos limitados. Nalguns casos da sindrome de Hunter, o envolvimento do sistema nervoso central conduz a atrasos do desenvolvimento e problemas do sistema nervoso. Sabe-se que a sindrome de Hunter ocorre numa taxa de 1 em 162000 e é um distúrbio genético na forma recessiva ligada ao cromossoma X e portanto com grande sofrimento para a família assim como para o doente.

Foram realizados vários ensaios relativamente ao tratamento da sindrome de Hunter, incluindo o transplante de medula óssea, substituição enzimática e terapia génica. Apesar do transplante de medula óssea ser capaz de parar a maior parte dos sintomas, é difícil encontrar um dador com HLA (antigénio de leucócitos humanos) compatível para todos os doentes. Ainda, um transplante de medula óssea é uma cirurgia importante acompanhada por vários efeitos adversos, incluindo o facto da vida do doente ser posta em risco elevado se o HLA não for compatível. A terapia génica para a sindrome de Hunter entrega um gene IDS normal no corpo com a ajuda de um vector viral, como seja adenovirus ou retrovirus, ou um vector não viral. No entanto, a terapia génica ainda é uma técnica experimental e não tem sido clinicamente aplicável. Relativamente ao tratamento de substituição enzimática para a sindrome de Hunter, administra-se IDS produzida externamente e tem a vantagem de ser simples. No entanto, a substituição enzimática deve ser realizada continuamente, o que acarreta uma despesa elevada. Elaprase® (Shire Pharmaceuticals Group), produzida usando tecnologia de DNA recombinante, foi aprovada pela FDA como um tratamento de substituição enzimática para a sindrome de Hunter. No entanto, este fármaco é muito dispendioso e sofre das desvantagens de ter efeito e segurança reduzidos. 0 documento de MUENZER, J et al., MOL. GENET. METAB., vol. 90, n^ 3, March 2007 (2007-03), pg 329-337, mostra os resultados de um ensaio clinico de fase I/II da terapia de substituição enzimática em mucopolissa-caridose II (sindrome de Hunter). A enzima aqui usada -Idulsulfase (Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cambridge, MA) , é uma forma recombinante de iduronato-2-sulfatase humana tendo um grau de modificação pós-tradução da cisteina 59 para formilglicina de aproximadamente 50%.

Como atrás descrito, apesar de terem sido desenvolvidas várias terapias da sindrome de Hunter, existe ainda uma necessidade premente de uma nova terapia e agente que apresente elevada eficácia terapêutica com elevada segurança.

Divulgação da invenção

Problema técnico

Constitui um objectivo da presente invenção ultrapassar os problemas encontrados nos trabalhos anteriores e proporcionar uma composição para a terapia da sindrome de Hunter, compreendendo IDS recombinante como ingrediente activo, que garante elevada eficácia terapêutica e segurança, conforme produzido pela cultura e processo de purificação melhorados, e um formulação compreendendo a mesma.

Constitui um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para a preparação da composição para o tratamento da sindrome de Hunter e da formulação compreendendo a mesma.

Solução do problema

Para atingir o objectivo acima, a presente invenção proporciona uma composição para a terapia da sindrome de Hunter, compreendendo como ingrediente activo uma IDS tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID N0:1, em que o resíduo de cisteína na posição 59 é convertido em formilglicina (FGly) numa proporção molar de 65% ou superior, de preferência numa proporção molar de 75% ou superior e mais de preferência numa proporção molar de 80% ou superior. IDS, aqui também designada iduronato-2-sulfatase ou I2S, possui um tamanho molecular de 56 kDa quando isolada e purificada a partir de figado, rim ou placenta humana (Bielicki, J. et al. (1990) Biochem, <J. , 271: 75-6). IDS é expressa como uma proteína monomérica de 550 aminoácidos e é secretada para o meio como uma proteína madura activa de 525 aminoácidos, após corte hidrolítico do péptido sinal de 25 aminoácidos. A massa molecular de IDS varia com a glicosilação e encontrou-se variar entre aproximadamente 60 e 90 kDa quando do tratamento com endoglicosidase F, conforme avaliado por SDS-PAGE. IDS possui duas ligações dissulfeto e oito locais de glicosilação ligada em N e é produzida como uma glicoproteína após sofrer modificação pós-tradução, em que os locais de glicosilação ligada em N estão ocupados por cadeias de oligossacáridos complexas de manose híbrida e elevada em eucariotas. Uma vez secretada para o meio de cultura, IDS pode ser usada como um fármaco após passar através de processos de isolamento e purificação típicos. IDS pode existir na forma de glicoproteínas com vários padrões de glicosilação dependendo de vários factores, incluindo, por exemplo, recombinação genética de IDS, transformação (e.g., linhas celulares usadas), técnicas de cultura e purificação.

Nesta invenção, é divulgado que o teor de manose-6-fosfato (M6P) e a taxa de conversão de Cys-59 para FGly possuem uma grande influência na eficácia terapêutica e segurança de IDS. A presença de resíduos de manose-6-fosfato (M6P) permite a ligação específica da enzima aos receptores de M6P na superfície celular, conduzindo à internalização celular da enzima, direccionamento para os lisossomas e subseguente catabolismo de GAF acumulado. A actividade biológica de IDS está também dependente de uma modificação pós-modificação da cisteína conservada (posição 59) para formilglicina. A menos gue de outra forma seja estabelecido, o termo "IDS", como agui usado, significa uma proteína IDS ligada a açúcar, ou seja uma IDS glicosilada. A IDS da presente invenção possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

Como aqui usado, o termo "padrão de glicosilação" de IDS refere-se ao perfil de oligossacáridos ligados aos oito locais de glicosilação da IDS resultante (e.g., locais de glicosilação e tipos de oligossacáridos).

Numa realização, a IDS contida na composição para a terapia da síndrome de Hunter de acordo com a presente invenção possui a mesma sequência de aminoácidos conhecida (SEQ ID N0:1), mas tem um padrão de glicosilação diferente e uma taxa de conversão diferente da cisteina na posição 59 para formilglicina, como descrito atrás (referência aos Exemplos 1-5 e 1-6).

Ou seja, a IDS usada na composição para a terapia da sindrome de Hunter de acordo com a presente invenção possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 com a conversão da cisteina na posição 59 para formilglicina (FGly) numa proporção molar de 65% ou superior, de preferência numa proporção molar de 75% ou superior e mais de preferência numa proporção molar de 80% ou superior, enquanto a taxa de conversão em Elaprase é de aproxima-damente 50% (Genet Med 2006:8(8):465-473). A formilglicina é conhecida como estando profundamente envolvida na capacidade de IDS para degradar o substrato, ou seja na actividade de IDS. Assim, devido à composição da presente invenção e ao agente convencional Elaprase serem diferentes, a composição e a formulação de acordo com a presente invenção pode apresentar eficácia terapêutica superior para a sindrome de Hunter relativamente ao agente convencional Elaprase devido a uma taxa de conversão maior de citosina para formilglicina na posição 59 na sequência de aminoácidos de IDS.

Ainda, a IDS usada na composição ou formulação para a terapia da sindrome de Hunter de acordo com a presente invenção possui manose-6-fosfato numa quantidade entre 2,0 e 4,0 moles por mole de IDS, de preferência numa quantidade entre 2,3 e 3,5 moles e mais de preferência numa quantidade entre cerca de 2,5 e 3,0 moles. M6P desempenha um papel importante na internalização celular de IDS e subsequente direccionamento para os lisossomas intracelulares. Assim, a formulação da presente invenção compreen- dendo IDS com um teor elevado de M6P garante um desempenho elevado do mecanismo de internalização mediada por receptores para esta enzima e direccionamento para os lisossomas, resultando assim no catabolismo eficaz de GAG acumulado. A formulação para a terapia da síndrome de Hunter compreendendo IDS de acordo com a presente invenção pode ser preparada através da formulação da composição da presente invenção com um veículo aceitável em termos farmacêuticos, numa forma adequada.

Como aqui usado, o termo veículo "aceitável em termos farmacêuticos" refere-se a um veículo não tóxico, compatível em termos fisiológicos com o ingrediente activo, o qual é adequado para a ingestão por animais, sem toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, irritação, resposta alérgica e similares indevidos. A composição de acordo com a presente invenção pode ser formulada com um veículo adequado dependendo da via de administração considerada. A formulação de acordo com a presente invenção pode ser administrada oralmente ou parentericamente, mas não lhes está limitado. Para a administração parentérica, pode ser considerada uma via seleccionada de entre as vias transdérmica, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa.

Para administração oral, a composição farmacêu- tica pode ser formulada em combinação com um veículo oral adequado em pós, grânulos, comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões e bolachas usando um método conhecido na arte. Exemplos de veículos adequados para a formulação incluem açúcares tais como lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol e maltitol, amidos tais como amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, e amidos de batata, celuloses tais como celulose, metilcelulose, carboximetil-celulose sódica, e hidroxipropilmetilcelulose, e agentes de enchimento tais como gelatina e polivinilpirrolidona. Facultativamente, a formulação pode ainda compreender um desintegrante ligado de forma cruzada, como seja polivinilpirrolidona, agar, ácido algínico ou alginato de sódio. Ainda, podem ser adicionalmente empregues um agente anti-aglomerante, um lubrificante, um agente molhante, um aromatizante, um emulsionante e um preservativo.

Igualmente, a composição da presente invenção pode ser formulada em combinação com um veículo parentérico numa forma de dosagem parentérica como seja uma preparação injectável, uma preparação transdérmica ou para inalação intranasal usando um método bem conhecido na arte. Para usar na injecção, a formulação deve ser esterilizada e protegida da contaminação com microrganismos tais como bactérias e fungos. Exemplos do veículo adequado para injecção podem incluir, mas não lhes está limitado, água, etanol, poliol (e.g., glicerol, propilenoglicol, polietile-noglicol líquido, etc.), combinações dos mesmos e/ou um solvente contendo um óleo vegetal ou meio de dispersão. Mais de preferência, o veículo pode ser uma solução isotónica como seja solução de Hank, uma solução de Ringer, PBS (soro fisiológico tamponado com fosfatos) contendo trietanolamina ou água estéril injectável, 10% etanol, 40% propilenoglicol e 5% dextrose. Para proteger a preparação injectável da contaminação microbiana, pode ainda compreender um agente antibacteriano ou antifúngico como seja parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, etc. Igualmente, as preparações injectáveis podem ainda compreender, na maior parte dos casos, um agente isotónico como seja açúcar ou cloreto de sódio. Estas formulações estão descritas num documento bem conhecido na área farmacêutica (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania). No que respeita à inalação, a formulação de acordo com a presente invenção pode ser entregue convenientemente na forma de uma aerossol a partir de uma embalagem pressurizada ou vaporizador usando um propelente adequado, como seja diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou gás adequado. No caso de aerossol pressurizado, o tamanho da unidade de dose pode ser determinado por uma válvula para entrega de uma quantidade doseada. Por exemplo, as cápsulas de gelatina e cassetes para usar num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó, como seja lactose ou amido, adequada para estes sistemas.

Outros veículos farmacêuticos adequados estão descritos em (Remington's Pharmaceutical Science, 19th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

Ainda, a formulação de acordo com a presente invenção pode também compreender um ou mais tampões (e.g., soro fisiológico ou PBS), açúcares (e.g. glucose, manose, sucrose ou dextrano), estabilizadores (hidrogenossulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico), anti-oxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes (e.g. EDTA ou glutationa), adjuvantes (e.g. hidróxido de alumínio), agentes de suspensão, espessantes e/ou preservativos (cloreto de benzalcónio, metilparabeno ou propilparabeno e clorobutanol).

Igualmente, a composição da presente invenção pode ser formulada numa forma de dosagem que permite a libertação rápida, controlada ou retardada do ingrediente activo após ser administrado a mamíferos. Uma quantidade eficaz da formulação assim preparada pode ser administrada através de uma variedade de vias incluindo as vias oral, transdérmica, subcutânea, intravenosa e intramuscular. 0 termo "quantidade eficaz" como aqui usado refere-se a uma quantidade de IDS que permite acompanhar o efeito diagnóstico ou terapêutico que ocorre quando administrado num doente. A dose da formulação de acordo com a presente invenção pode variar dependendo de vários factores, incluindo a via de administração, o tipo de indivíduo a ser tratado, o tipo de doença a ser tratada, a via de administração, a gravidade da doença e a idade, sexo, peso, condição e estado de saúde do doente. A formulação compreendendo IDS de acordo com a presente invenção pode ser usada numa dose entre 0,1 e 10 mg/kg e, de preferência, numa dose entre 0,5 e 1,0 mg/kg por dosagem. O método para preparação da composição terapêutica de acordo com a presente invenção compreende: (1) cultura de uma estirpe celular recombinante transformada com um gene codificador de IDS representado por SEQ ID NO:1 e colheita da cultura; e (2) purificação a partir da cultura através de uma cromatografia de permuta aniónica, cromatografia hidro-fóbica, cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de afinidade, em que, a cromatografia de permuta catiónica é realizada usando um tampão de eluição com um pH de 4,0 a 6,0.

Mais particularmente, o método para a preparação da composição terapêutica de acordo com a presente invenção compreende: (1) transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão portador de um gene IDS para obter uma estirpe celular recombinante; (2) cultura de uma estirpe celular recombinante na presença de um hidrolisado num meio sem soro e colheita da cultura; (3) purificação de IDS a partir da cultura por cromatografia de permuta aniónica, cromatografia hidro- fóbica, cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de afinidade, a referida cromatografia de permuta catiónica sendo realizada usando um tampão de eluição variando num pH entre 4,0 e 6,0; e (4) combinação da IDS purificada com um veiculo aceitável em termos farmacêuticos.

No método, o passo (1) é dirigido ao estabelecimento de uma estirpe celular recombinante através da introdução de um vector de expressão portador de um gene IDS numa célula hospedeira. A sequência de aminoácidos de IDS e um gene codificador de IDS são conhecidos na arte. Um gene que codifica IDS tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l é preferido, mas não é considerado como um exemplo limitante. Se uma sequência de aminoácidos mantiver a actividade de IDS que se pensa ser conseguida pela presente invenção, ainda que mutada através de inserção, deleção e/ou substituição de alguns resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l, o seu gene pode ser usado na presente invenção. O vector de expressão portado do gene pode ser construído usando um método convencional conhecido na arte. Ainda, o vector de expressão pode conter um gene marcador que permite a introdução do gene a ser identificado. Exemplos de um gene marcador incluem um gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr), mas não lhe estão limitados. Prefere-se um vector pJK-dhfr-Or2-IDS (FIG. 2).

As células hospedeiras disponíveis para o passo (1) podem ser células animais e os seus exemplos incluem, mas não lhes estão limitados, células de ovário de hamster Chinês (CHO), células de rim embrionário humano (HEK), células de rim de hamster bebé (BHK) , célula de rim de macaco 7 (C0S7) e células NSO, com uma preferência para células CHO. As linhas de células CHO são das mais usadas na produção de produtos biomédicos graças às suas elevadas velocidade de crescimento e produtividade, facilidade de manipulação genética, proliferação rápida em culturas em suspensão em larga escala e elevada adaptação a meios sem proteína. A transformação no passo (1) pode ser realizada de acordo com um protocolo conhecido na arte.

No método, o passo (2) é dirigido à cultura da estirpe celular recombinante portadora do vector de expressão de IDS num meio sem soro. A cultura pode ser realizada num meio e em condições optimizados para o tipo de célula hospedeira. Prefere-se um meio sem soro. 0 meio por não ter soro (e.g. soro bovino) evita a probabilidade de induzir efeitos secundários ou riscos associados aos soros. A escala da cultura da estirpe de células recombinantes transformada com um vector de expressão IDS pode ainda ser aumentada. Por exemplo, a estirpe de células recombinantes da presente invenção pode ser cultivada num frasco de agitação e depois expandida para centenas ou milhares de litros num biorreactor. 0 passo de cultura é realizado na presença de um hidrolisado, o qual possui uma influência importante na determinação do teor de formilglicina. De preferência, o hidrolisado é adicionado numa quantidade de modo a originar uma concentração final de 0,1-10,0 g/1. O hidrolisado útil na presente invenção pode ser o que se obtém através da hidrólise de um material animal ou vegetal. Mais particularmente, o hidrolisado pode ser obtido através da hidrólise de pelo menos um substrato seleccionado do grupo consistindo, mas não lhes estando limitado, em soja, batata, gérmen de trigo e levedura.

No método, o passo (3) dirige-se à purificação de IDS a partir da cultura celular através de cromatografia de permuta aniónica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de afinidade.

De preferência, os quatro passos cromatográficos podem ser realizados naquela ordem. No entanto, deverá ser óbvio para os familiarizados com a arte que a ordem poderá ser trocada se necessário. Juntamente com a ordem dos processos cromatográficos, as resinas e os valores de pH dos tampões de eluição são importantes na determinação do padrão de glicosilação e no teor de formilglicina de IDS. A cromatografia de permuta aniónica destina-se a remover corantes e várias impurezas a partir da cultura celular e realiza-se numa coluna cheia com resinas Q Sepharose® usando um tampão de eluição com um pH entre 5,5 e 7,5. A cromatografia hidrofóbica destina-se a remover os corantes e impurezas que permanecem após a cromatografia de permuta aniónica. É realizada numa coluna cheia com resinas de fenil-Sepharose®, usando um tampão de eluição a pH entre 5,0 e 7,0. A cromatografia de permuta catiónica destina-se a seleccionar o teor de formilglicina elevado e a remover as impurezas residuais. Realiza-se numa coluna carregada com resinas de permuta catiónica, usando um tampão de eluição com um pH entre cerca de 4,0 e 6,0. Exemplos de resinas de permuta catiónica úteis na presente invenção podem incluir CM Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, S Sepharose Fast Flow e Capto MMC, todas da GE Healthcare, mas não lhes estão limitadas. De preferência, os tampões de eluição variam no pH entre 4,0 e 6,0. A cromatografia de afinidade destina-se a remover o glicerol usado na cromatografia de permuta catiónica e concentra o volume dos eluatos. É realizada numa coluna carregada com resinas Blue Sepharose®, usando tampão de eluição com um pH de 6,0 a 8,0.

As condições de cada tipo de cromatografia podem ser optimizadas pelos familiarizados com a arte. Relativamente às condições concretas de cromatografia, pode ser feita referência aos Exemplos 1-5 descritos abaixo. O método para a preparação da composição compreendendo IDS como ingrediente activo de acordo com a presente invenção pode ainda compreender inactivação de vírus que podem ser incorporados na composição. A inactivação pode ser conduzida de várias formas e de preferência mantendo a cultura a pH 3,0-4,0 ou a um pH elevado durante um tempo pré-determinado. O processo de inactivação pode ser conseguido durante o processo de purificação, de preferência durante a cromatografia e, mais de preferência, entre a cromatografia hidrofóbica e a cromatografia de permuta catiónica.

Após os processos cromatográficos, a fracção activa assim obtida pode ser concentrada e filtrada para dar IDS que pode ser usada como o ingrediente activo da composição farmacêutica. A composição pode ser misturada com um veículo aceitável em termos farmacêuticos e formulada numa forma de dosagem adequada. A composição compreendendo a IDS, preparada pelo método de acordo com a presente invenção, possui vantagens relativamente a composições IDS convencionais como se segue 1) exerce uma eficácia farmacêutica superior devido a um teor de f ormilglicina mais elevado, 2) pode mais eficazmente catabolizar GAG acumulado nos lisossomas, 3) não possui soro de origem animal e portanto é segura e eficaz devido à sua pureza ser de 99,9% ou superior.

Efeitos vantajosos da invenção A composição compreendendo a IDS recombinante e a formulação compreendendo a mesma de acordo com a presente invenção são superiores em eficácia farmacêutica e segurança relativamente ao agente convencional Elaprase e assim pode ser eficazmente usada para a terapia da sindrome de Hunter.

Breve descrição dos desenhos FIG. 1 é uma ilustração de um esquema para a construção do vector pJK-dhfr-IDS-Sl usado para construir um vector de expressão de IDS. FIG. 2 é uma ilustração de um esquema para a construção do vector de expressão IDS pJK-dhfr-0r2-IDS a partir de pJK-dhfr-IDS-Sl da FIG. 1. FIG. 3 é um fluxograma que ilustra o isolamento e purificação de IDS a partir de CHO-DG44 transformada. FIG. 4 é uma fotografia mostrando um resultado de SDS-PAGE para IDS para análise da sequência N-terminal onde um marcador foi corrido na pista M, IDS glicosilada na pista 1, PNGase F na pista 2 e IDS desglicosilada na pista 3. FIG. 5 é um fluxograma ilustrando o processo de análise da sequência de aminoácidos de IDS. FIG. 6 é uma ilustração que mostra a sequência de aminoácidos da IDS da presente invenção analisada por MALDI-MS/MS e LC-ESI-MS/MS. FIG. 7 é um cromatograma de RP-HPLC de amostras IDS não reduzida e reduzida mostrando a posição das ligações dissulfeto em IDS. FIG. 8 é uma ilustração que mostra as posições das ligações dissulfeto na IDS da presente invenção analisada por MALDI-MS. FIG. 9 é uma ilustração que mostra as posições das ligações dissulfeto na IDS da presente invenção analisada por MALDI-MS/MS. FIG. 10 é uma ilustração que indica as posições das ligações dissulfeto na IDS da presente invenção, obtidas através de MALDI-MS/MS. FIG. 11 é uma fotografia mostrando uma migração de IDS em SDS-PAGE após tratamento com várias enzimas hidrolases de glicósido para avaliar a glicosilação da IDS da presente invenção. FIG. 12 representa cromatogramas de HPAEC-PAD mostrando o teor de manose-6-fosfato na IDS da presente invenção. FIG. 13 é um cromatograma de exclusão por tamanho mostrando a pureza da IDS da presente invenção. FIG. 14 é um cromatograma de iões mostrando a actividade catalítica da IDS da presente invenção num substrato natural. FIG. 15 é um gráfico de Lineweaver-Burk mostrando a proporção da quantidade de IDS internalizada pelas células relativamente à quantidade de IDS adicionada a células fibroblásticas normais. FIG. 16 é um gráfico que mostra a quantidade da IDS da presente invenção internalizada em células fibroblásticas normais humanas e pelas células de doentes que sofrem de síndrome de Hunter. FIG. 17 é uma representação que mostra as medições do teor de formilglicina na IDS da presente invenção. FIG. 18 é uma representação que mostra os pontos IEF (focagem isoeléctrica) da IDS da presente invenção antes e após a cromatografia de permuta catiónica em que M corre na pista M, uma amostra aplicada na cromatografia de permuta catiónica na pista 1, um eluato da cromatografia de permuta catiónica na pista 2 e uma solução de regeneração após cromatografia de permuta catiónica na pista 3.

Modo da invenção

Pode-se conseguir uma melhor compreensão da presente invenção através dos exemplos que se seguem os quais são estabelecidos para ilustrar a presente invenção mas que não devem ser pensados como limitantes da mesma.

EXEMPLO 1: Preparação de IDS <1—1> Aquisição do gene Células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas a partir de sangue humano como anteriormente descrito [S. Beckebaum et al., Immunology, 2003, 109:487-495] . RNA total foi extraído dos PBMCs de acordo com um protocolo anteriormente descrito [M. J. Holland et al., Clin. Exp. Immunol., 1996, 105:429-435].

Para construir uma biblioteca de cDNA a partir de RNA total, cDNA de cadeia simples foi sintetizado usando uma sequência iniciadora de oligo(dT) com a ajuda de um kit de síntese de cadeia simples (Boehringer Mannheim). Para tal, água destilada tratada com DEPC foi adicionada a um tubo eppendorf contendo 1 pg do RNA total de modo a formar um volume final de 12,5 μΐ. Em seguida, 1 pg de uma sequência iniciadora oligo(dT) 20 pMol foi adicionado ao tubo, seguido de incubação a 702C durante 2 min e arrefecimento. A esta mistura de reacção adicionaram-se 4 pg de um tampão de reacção, 1 pg de dNTP, 1 pg de um inibidor de RNase e 1 pg de transcriptase reversa que reagiram então a 422C durante uma hora para sintetizar cDNA de cadeia simples. Realizou-se PCR com o cDNA como matriz, na presença de sequências iniciadoras de SEQ ID NOS: 2 a 4, para amplificar um gene IDS humano. Neste contexto, cada uma das sequências iniciadoras foi projectada para conter um local de reconhecimento por enzimas de restrição para usar na clonagem do gene. <l-2> Construção do vector de expressão A. Construção do vector pJK-dhfr-IDS-Sl

Uma sequência sinal da cadeia leve de um anticorpo (derivada de uma parte da cadeia leve de IgG humana) como sequência não codificadora foi introduzida no extremo 5' do gene IDS adquirido no Exemplo <1-1> antes do PCR. Após obtenção do produto de PCR este foi corrido numa electrof orese em gel de agarose, o gene IDS humano foi isolado usando um kit de extracção do gel. 0 gene IDS isolado e o vector pJK-dhfr-0r2 (Aprogen) foram digeridos com EcoRV e Apal e ligados um ao outro a 162C durante 20 horas. O vector recombinante assim construído foi usado para transformar E. coli (DH5a) que foi então semeada numa placa de LB contendo 50 pg/ml de ampicilina e incubada durante a noite. As colónias crescidas nas placas foram seleccionadas e cultivadas de modo a isolar o plasmídeo a partir delas (FIG. 1). B. Construção do plasmídeo de expressão de IDS humana recombinante

Para alterar a sequência não codificadora do plasmídeo atrás construído para uma sequência sinal, a IDS humana recombinante foi subclonada num vector pJK-dhfr-or2. Para tal, o vector pJK-dhfr-IDS-Sl foi digerido com EcoRV e Apal para dar um gene IDS parcial (1233 pb) que foi então inserido no vector pJK-dhfr-0r2 previamente tratado com as mesmas enzimas de restrição, para construir um vector pJK-dhfr-IDS-S2. Para introduzir uma sequência não codificadora e uma sequência sinal no extremo 5', uma sequência iniciadora directa IDS NI (SEQ ID NO: 5) e uma sequência iniciadora reversa IDS4 (SEQ ID NO:7) foram usadas no PCR com o vector pJK-dhf r-IDS-Sl como matriz. Após 5 min a 942C, o PCR foi realizado com 30 ciclos de 942C durante 1 min, 552C durante 30 seg e 722C durante 40 seg e acabando com uma extensão a 722C durante 10 min. A amplificação por PCR deu um gene IDS parcial que tinha 448 pb. Este gene foi usado como matriz para o PCR que foi realizado novamente na presença de uma sequência iniciadora directa IDS N2 (SEQ ID NO:6) e de uma sequência iniciadora reversa IDS4 (SEQ ID NO:7) nas mesmas condições descritas atrás. Isto resultou na síntese de um fragmento de DNA de 476 pb de comprimento.

Subsequentemente, o vector pJK-dhfr-IDS-S2 e o fragmento do gene IDS humano recombinante (47 6 pb) foram separadamente digeridos com EcoRV. Os produtos de digestão foram separados por electroforese em gel para obter o vector e o fragmento de IDS de 47 6 pb de comprimento. 0 vector e inserto foram ligados a 162C durante 12 horas na presença de ligase de DNA de T4 para construir pJK-dhfr-0r2-IDS. Estes procedimentos estão ilustrados na FIG. 2.

Para confirmar a construção do plasmideo de expressão de IDS, DH5 foi transformada com pJK-dhfr-0r2-IDS e cultivada durante 24 horas em placas de LB contendo ampicilina (50 pg/ml). A partir das colónias assim formadas, isolou-se um plasmideo e digeriu-se para determinar o tamanho do inserto. Igualmente, a sequenciação foi realizada usando uma sequência iniciadora T7 (SEQ ID NO:8). <l-3> Selecção da estirpe de expressão de IDS humana recombinante A. Transfecção de CHO-DG44 CHO-DG44 foi usada como uma célula hospedeira para a expressão da IDS da presente invenção. A célula de ovário de hamster chinês mutante CHO-DG44 é portadora de uma dupla deleção no gene da dhfr (di-hidrofolato redutase) endógena que codifica a enzima DHFR. A enzima DHFR está envolvida na conversão de folato através de di-hidrofolato (FH2) em tetra-hidrofolato (FH4), o qual está envolvido na síntese de novo de ácidos nucleicos. O nível de dhfr nas células está dependente da concentração de MTX. MTX, que é estruturalmente semelhante ao ácido fólico, um substrato de DHFR, compete com o ácido fólico para a ligação à di-hidrofolato redutase, de modo que a di-hidroflato redutase perde a sua actividade na presença de MTX. Assim, se as células não amplificarem uma quantidade suficiente de dhfr, elas morrem devido a não conseguirem sintetizar os ácidos nucleicos necessários para a sua vida. Pelo contrário, se a amplificação for suficiente, as células podem sobreviver com uma concentração elevada de MTX devido a terem uma quantidade relativamente abundante de dhfr. Este sistema pode ser aplicado a células animais para seleccionar uma linha celular transfectada que pode amplificar o gene dhfr e assim um gene estrutural de interesse.

Para este fim, um gene dhfr foi introduzido como uma marca amplificável no vector de expressão de IDS pJK-dhfr-0r2-IDS, construído no Exemplo 1-2, a amplificação de genes foi realizada usando MTX e o gene dhfr.

Para tal, a linha celular DG44 (obtida do Dr. Chaisin, Columbia University) foi suspensa em 10 ml de DMEM/F12 (suplementado com nucleótidos e nucleósidos e 10% de soro fetal bovino (FBS)) e colhida por centrifugação a 1000 rpm durante 5 min. As células foram inoculadas em 50 ml de um meio de cultura num frasco T-175 e incubadas a 37±12C numa incubadora de 5±1% C02. Um dia antes da transfecção, o meio de cultura das células DG44 foi removido do frasco T-175 e as células foram lavadas duas vezes com PBS e destacadas por tripsinização. Em seguida, foram semeadas a uma densidade de 5xl05 células num frasco T-25 e cultivadas a 37±1°C durante 24 horas numa incubadora de 5 + 1% C02 · A contaminação com bactérias ou fungos foi avaliada ao microscópio óptico, enquanto PCR-ELISA foi realizado para avaliar se as células estavam contaminadas com micoplasmas.

As células DG-44 sem contaminantes foram trans-fectadas com vector de expressão de IDS pJK-dhfr-0r2-IDS, construído no Exemplo 1-2, usando um kit de Lipofectamina. Assim, 5 pg do vector de expressão e 50 pg de Lipofectamina foram separadamente diluídos em 800 pg de Opti-MEM I, cuidadosamente misturados para não formar bolhas e deixados à temperatura ambiente durante 15 min. Entretanto, as células DG44 foram lavadas uma vez com PBS estéril e três vezes com Opti-MEM I. Às células DG44 foi cuidadosamente adicionada a mistura de DNA-lipofectamina e depois 6,4 ml de Opti-MEM antes da incubação a 37±12C durante 5 horas numa incubadora de 5 + 1% C02. Em seguida, a incubação foi conduzida durante mais 48 horas no meio suplementado com 8 ml de DMEM/F12 e 1,6 ml de FBS para promover a recuperação das membranas celulares e o crescimento das células. B. Selecção de uma estirpe de células resistentes à Geneticina (G418)

As células em cultura foram descoladas com 0,25% de tripsina, contadas e semeadas a uma densidade de 5xl03 células/alvéolo em placas de 96 alvéolos contendo 100 ug de meio MEM-alfa (suplementado com 10% de FBS dialisado e 550 Ug/ml de G418) por alvéolo. No dia seguinte, o mesmo meio foi adicionado numa quantidade de 100 pg/alvéolo e as células foram cultivadas durante 2-3 semanas para formar colónias. Quando as células cresceram até 50% de confluência, o meio foi substituído com meio fresco. Após manutenção durante 3 dias, o meio de cultura foi colhido para análise de enzimas. O meio foi substituído com 200 pg de um meio fresco de três em três dias. No dia 3-4 após cultura, as células não transfectadas, ou seja as células não resistentes à geneticina, começaram a destacar-se do fundo das placas de 96 alvéolos quando observadas com um microscópio óptico. Os clones seleccionados foram cultivados sendo transferidos sequencialmente de placas de 96 alvéolos para placas de 24 alvéolos, para placas de 6 alvéolos e para placas de 100 mm. Quando as células cresceram até 80-90% de confluência em placas de 100 mm, o nivel de expressão foi novamente medido. As células foram descoladas com 0,25% de tripsina, contadas e semeadas a uma densidade de 5xl05 células/alvéolo/3 ml em placas de 6 alvéolos, mantidas durante 3 dias e contadas. O nivel de expressão da proteína foi analisado quantitativamente. De acordo com os resultados da análise, foram seleccionados 15 clones. C. Selecção da estirpe de expressão de IDS com elevada capacidade de expressão

Os 15 clones seleccionados foram cultivados numa concentração crescente de MTX para seleccionar estirpes celulares em que IDS foi amplificado.

Neste contexto, as células foram inoculadas numa densidade de lxlO6 células/placa de 100 mm/10 ml de meio contendo MTX e cultivadas até 80-90% de confluência. Um décimo do volume da cultura celular foi inoculado novamente numa placa de 100 mm/10 ml. Este processo de subcultura foi repetido duas vezes. As células foram passadas pelo menos três vezes de modo a estarem suficientemente adaptadas a concentrações crescentes de MTX. A concentração de MTX foi aumentada, de 5 nM para os clones seleccionados após uma análise durante os primeiros três dias, para 20 nM. Em cada um dos passos, os clones adaptados a concentrações crescentes de MTX foram cultivados durante três dias para medir a taxas de crescimento. Os niveis de expressão de IDS foram medidos para seleccionar as estirpes celulares em que a amplificação do gene IDS tinha ocorrido, ou seja as estirpes celulares em que o IDS recombinante era expresso a uma taxa elevada. De entre as estirpes celulares selecci-onadas, NI4 foi usada para experiências subsequentes devido a possuir o nivel de expressão mais elevado. D. Selecção de uma estirpe isolada através de diluição limite

Existia a possibilidade de a estirpe NI4 se ter misturado com outras estirpes. Assim, a estirpe foi separada numa estirpe isolada. Os clones NI4 que sobre viveram a MTX 20 nM foram subclonados através de diluição limite de modo a seleccionar uma estirpe celular pretendida.

Primeiro, NI4 foi inoculada a uma densidade de 0,5 células/alvéolo em meio IMDM (Gibco BRL, Cat#12200) em placas de 96 alvéolos e cultivada com o meio substituído de três em três dias. No dia três, as placas foram observadas ao microscópio para excluir os alvéolos em que se tinham formado duas ou mais colónicas por alvéolo. Os alvéolos em que se tinha formado apenas uma colónia por alvéolo foram seleccionados e continuados a serem cultivados. Após cultura durante 15 dias, as células foram subcultivadas em placas de 96 alveólos e quando as células tinham crescido até 90% de confluência, o meio foi substituído por meio fresco.

Um total de 263 estirpes isoladas foi identificado a partir da estirpe NI4. De entre elas, a estirpe S46 tinha a actividade IDS mais elevada e foi designada NI4-S46. <l-4> Cultura celular A. Cultura em frascos de agitação A estirpe NI4-S46 foi cultivada numa escala maior para produzir a IDS da presente invenção. A estirpe foi inoculada em meio Ex-cell 302 sem soro (contendo glutamina, sulfato de dextrano e plurónico F-68) em frascos de cultura de 125 1 e cultivada a 37±1°C numa incubadora de 5±1% C02. Subsequentemente, as células foram passadas numa proporção de 1:5-1:8 cada dois ou três dias usando frascos de agitação. Quando da passagem, o volume da cultura foi gradualmente aumentado para aproximadamente 2400 ml. Em muitos frascos de agitação, as células foram cultivadas até um nível suficiente para ser inoculado num fermentador. B. Cultura em fermentador de 30 1 (volume de trabalho 20 1)

Quando a densidade das células nos frascos de agitação atingiu l,3xl06 células/ml, elas foram inoculadas num fermentador de 30 1. Durante a cultura celular, as condições de cultura foram mantidas num teor de oxigénio dissolvido de 10% ou mais, uma temperatura de cultura de 37±1°C e um pH de 7,0±0,2. Se necessário, amostras de células foram colhidas e observadas ao microscópio. A cultura celular foi examinada para analisar a contagem celular, a viabilidade celular, pH, concentração de glucose e concentração de glutamina. Com base nos resultados da análise, quando se decidiu que as células estavam suficientemente crescidas, as células foram inoculadas num fermentador de 150 1. C. Cultura em fermentador de 150 1 (volume de trabalho 100 1)

Quando as células num fermentador de 30 1 atingiram uma densidade de 0,9xl06 células/ml ou mais, foram inoculadas num fermentador de 150 1. Durante a cultura das células, as condições de cultura foram mantidas a um teor de oxigénio dissolvido de 10% ou superior, uma temperatura de cultura de 37±1°C e um pH de 7,0±0,2. Se necessário, amostras de células foram colhidas e observadas ao microscópio. A cultura celular foi examinada para analisar a contagem celular, a viabilidade celular, pH, concentração de glucose e concentração de glutamina. Com base nos resultados da análise, quando se decidiu que as células estavam suficientemente crescidas, as células foram inoculadas num fermentador de 650 1. D. Cultura em fermentador de 650 1 (volume de trabalho 500 1)

Quando as células num fermentador de 150 1 atingiram uma densidade de 0,9xl06 células/ml ou mais, foram inoculadas num fermentador de 650 1. Durante a cultura das células, as condições de cultura foram mantidas a um teor de oxigénio dissolvido de 10% ou superior, uma temperatura de cultura de 34±1°C e um pH de 6,9±0,2 durante três dias e depois a uma temperatura de cultura de 37±1°C e um pH de 6,9±0,2. Se necessário, amostras de células foram colhidas e observadas ao microscópio para analisar a contagem celular, a viabilidade celular, pH, concentração de glucose e concentração de glutamina. Com base nos resultados da análise, as concentrações de glucose e de glutamina foram ajustadas para continuar o crescimento celular. Durante a fermentação, adicionou-se hidrolisado para aumentar a conversão de formilglicina.

<l-5> Purificação de IDS IDS foi isolada a partir da cultura celular usando uma série dos quatro processos cromatográficos que se seguem. A. Colheita e filtração do meio de cultura

Quando a viabilidade celular se manteve na gama de 80-85% 10 dias após inoculação num fermentador de 650 1, a cultura foi parada. As células foram colhidas da cultura usando o sistema de filtros Millipore POD e o filtro DOHC (Millipore) a uma pressão de 0,9 bar ou inferior. Após remoção das células, o sobrenadante foi filtrado através de um pré-filtro Millipore, 0,5 + 0,2 um) e de um filtro 0,45 + 0,2 μΐϋ e recuperado num saco de vinil descartável estéril. A solução de cultura colhida foi guardada a 2-8 2C. B. Concentração e diafiltração O filtrado recuperado em A foi concentrado cerca de 10 vezes usando um sistema de ultrafiltração (Sistema de Membranas de Fluxo Tangencial). A membrana (tamanho de exclusão: 30K, Pali) instalada dentro do sistema de ultrafiltração foi lavada com WFI (água para injecção) a um fluxo de 20-25 1/min e depois equilibrada com um tampão (pH 7,0-8,0) contendo fosfato de sódio (di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado e hidrogenofosfato de sódio hepta-hidratado) 20 mM. Após equilíbrio, o filtrado foi introduzido na membrana com recuperação das fracções que não passavam a membrana. Uma vez o volume recuperado ser cerca de 1/10 do volume inicial do filtrado, o procedimento de concentração foi parado. O tampão foi consecutivamente mudado para um volume três a quatro vezes maior relativamente ao do concentrado. Se a condutividade e o pH estivessem dentro dos critérios, o processo era parado, [critérios - condutividade: = 5,0 mS/cm, pH 7,0-8,0]. C. Cromatografia de permuta aniónica

Para remover os corantes e várias impurezas a partir do concentrado recuperado em B, realizou-se cro-matografia de permuta aniónica numa coluna (GE Healthcare) carregada com resinas Sepharose Q (GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio (pH 7,0-8,0) contendo fosfato de sódio (di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado e hidrogenofosfato de sódio hepta-hidratado) 20 mM. O concentrado obtido em B foi filtrado através de um filtro de 0,45pm + 0,25pm (Sartorius) e aplicado a um fluxo de 100-120cm/h na coluna equilibrada. Após completada a aplicação, a coluna foi primeiro lavada com o tampão de equilíbrio e depois com o tampão de lavagem (pH 5,5-7,5) contendo cloreto de sódio. Subsequentemente, uma proteína alvo foi eluída com um tampão de eluição (pH 5,5-7,5) contendo cloreto de sódio. D. Cromatografia hidrofóbica

Para remover os corantes e impurezas que permaneciam após cromatografia de permuta aniónica, realizou-se cromatografia hidrofóbica numa coluna (GE Healthcare) carregada com resinas de fenil-Sepharose (GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio (pH 5,0-7,0) contendo cloreto de sódio. O eluato obtido em C foi filtrado através de um filtro de 0,45ym + 0,25pm (Sartorius) e aplicado a um fluxo de 70-100cm/h na coluna equilibrada. Após completada a aplicação, a coluna foi primeiro lavada com o tampão de equilíbrio. Subsequentemente, uma proteína alvo foi eluída com um tampão de eluição (pH 5,0-7,0) contendo glicerol. E. Inactivação de vírus através de pH baixo

Os vírus que possam derivar das células hospedeiras ou de qualquer material usado nos processos realizados foram inactivados através de uma condição de pH baixo. Para tal, o eluato obtido em D foi mantido durante 2 horas a pH 3,0-4,0 cuja acidez foi ajustada com ácido acético a 25%. Em seguida, o pH do eluato foi aumentado para 4,0-5,0 usando hidróxido de sódio 0,5M para usar no processo seguinte. A inactivação por pH baixo foi realizada a 12±2°C. F. Cromatografia de permuta catiónica IDS é uma glicoproteína com oligossacáridos e existe como um isómero que possui diferentes pontos isoeléctricos de acordo com o teor de ácido siálico no final da cadeia de glicano. Como o ácido siálico possui uma carga negativa, os oligossacáridos apresentam diferenças em termos do grau de ligação à resina de permuta catiónica de acordo com o seu teor de ácido siálico. Usando esta caracterização, a cromatografia de permuta catiónica foi realizada para obter IDS com actividade elevada (um teor elevado de f ormilglicina) com um teor elevado de ácido siálico e para remover outras impurezas [Impurezas do produto (IDS agregado, IDS processado), impurezas do processo (proteína da célula hospedeira)]. Detalhadamente, uma coluna carregada com resinas de permuta catiónica Capto™ MMC (GE Healthcare) foi equilibrada com tampão de equilíbrio adicionado de glicerol (pH 4,0-5,0). O eluato inactivado obtido em E foi filtrado através de um filtro de 0,45pm + 0,25pm (Sartorius) e aplicado a um fluxo de 100-120cm/h na coluna equilibrada. Subsequentemente, a coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio, seguido de eluição com tampão de eluição adicionado de glicerol (pH 4,0-6,0) para dar IDS com um teor elevado de ácido siálico (ponto isoeléctrico 3,5 ou menos), actividade elevada (teor de formilglicina: 80±15%) e pureza elevada (SE-HPLC, 98% ou superior) . G. Cromatografia de afinidade A cromatografia de afinidade (Blue Sepharose, GE Healthcare) foi realizada para remover o glicerol usado na cromatografia de permuta catiónica e para reduzir o volume de eluato. 0 eluato obtido em F foi filtrado através de um filtro de 0,45pm + 0,25pm (Sartorius) e aplicado a um fluxo de 100-120cm/h numa coluna carregada com resina Blue Sepharose (GE Healthcare) que foi previamente equilibrada com tampão de equilíbrio adicionado de glicerol (pH 4,5-5,5). Após completada a aplicação, a coluna foi lavada com tampão de lavagem (pH 4,5-5,5) e a proteína alvo proteína alvo foi eluída com um tampão de eluição (pH 6,0-8,0) . H. Concentração e permuta de tampão

Um sistema de ultrafiltração (Sistema de

Membranas de Fluxo Tangencial) foi usado para ajustar a concentração proteica do eluato obtido em G e para fazer a permuta do tampão da proteína purificada com tampão de formulação. A membrana (tamanho de exclusão: 30K, Pali) instalada dentro do sistema de ultrafiltração foi lavada com WFI (água para injecção) a um fluxo de 450-650 ml/min e depois equilibrada com um tampão de formulação (2,25 g/1 de di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado, 0,99 g/1 de hidrogenofosfato de sódio hepta-hidratado, 8 g/1 de cloreto de sódio, pH 6,0-7,0) sem polissorbato 20, seguido de concentração da proteína alvo. O tampão foi consecutivamente trocado num volume três a quatro vezes superior relativamente ao do concentrado. Se a condutividade e o pH estivessem dentro dos critérios, o processo era parado, [critérios - condutividade: 15,0+3,0 mS/cm, pH 6,0-7,0].

Ajustar o teor da solução concentrada a 4,0 ±0,5 mg/ml. I. Nanofiltração

Usando um nanofiltro (NFP, Millipore), a nanofil-tração foi realizada para remover vírus que pudessem vir das células hospedeiras ou de qualquer um dos materiais usados. O teste da integridade do filtro foi realizado após lavagem do nanofiltro com água para injecção. Uma vez passado o teste da integridade, o nanofiltro foi equilibrado com 1 1 de tampão de formulação (2,25 g/1 de di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado, 0,99 g/1 de hidrogenofosfato de sódio hepta-hidratado, 8 g/1 de cloreto de sódio, pH 6,0-7,0) sem polissorbato 20. Após completado o equilíbrio, o concentrado obtido em H foi passado através do filtro a uma pressão de aproximadamente 2 bar para produzir um nanofiltrado. Após completada a filtração, o filtro foi lavado com o tampão de formulação (solução pós-lavagem). Após combinação da solução de nanofiltração e da solução de pós-lavagem, o teor proteico foi medido. J. Substância fármaco A concentração proteica do filtrado obtido em I foi ajustada com tampão de formulação sem polissorbato 20. Após a adição de polissorbato, a solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm para produzir uma substância fármaco. A substância fármaco foi dividida em pequenas quantidades e guardada num ultracongelador (-70+102C) até ser usada. K. Produto fármaco (Enchimento, rotulagem, embalagem) O stock guardado num ultracongelador foi descongelado num banho-maria mantido a 28±1°C e diluído para uma concentração proteica de aproximadamente 2,05±0,2 mg/ml usando tampão de formulação (2,25 g/1 de di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado, 0,99 g/1 de hidrogenofosfato de sódio hepta-hidratado, 8 g/1 de cloreto de sódio, 0,23 g/1 de polissorbato 20, pH 6,0-7,0). Em seguida, a solução de diluição foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm para produzir uma solução final. Esta solução final foi usada para encher frascos de 6 ml com aproximadamente 3,3 g usando enchimento automático. Uma vez passada a inspecção dos frascos, estes foram embalados para produzir um produto fármaco. O procedimento desde a cultura da estirpe até à produção do produto final está ilustrado na FIG. 3. EXEMPLO COMPARATIVO 1: Preparação de Elaprase A Elaprase®, IDS recombinante comercializada, foi usada como exemplo comparativo. EXEMPLO EXPERIMENTAL 1: Análise estrutural e caracterização da IDS da invenção <1—1> Sequenciação de aminoácidos - sequenciação interna IDS desglicosilada foi separada por SDS-PAGE, seguido de corte do gel. Em seguida, os produtos da digestão resultantes do tratamento com várias endopro-teinases (tripsina, quimotripsina, AspN, quimotripsi-na/tripsina, AspN/tripsina, GluC e GluC/tripsina) foram analisados usando MALDI-MS/MS e LC-ESI-MS/MS (FIG. 5) . Como resultado, foram identificadas sequências com um total de 525 aminoácidos. As sequências de aminoácidos coincidiam com a sequência teórica da IDS humana (FIG. 6). <l-2> Análise das ligações dissulfeto

Num polipéptido, uma ligação dissulfeto é uma ligação covalente, geralmente derivada da acoplagem de dois grupos SH de resíduos de cisteína, desempenhando um papel importante na estabilização de estruturas superiores das proteínas. Teoricamente, os 525 aminoácidos de IDS possuem seis resíduos de cisteína, quatro dos quais foram ligações dissulfeto. Neste exemplo, foi identificada a localização dos resíduos de cisteína responsáveis pelas ligações dissulfeto de IDS. Primeiro, IDS foi desglicosilada através do tratamento com PNGase F para excluir a interferência de açúcares. Para evitar que os resíduos de cisteína que não participam na formação de pontes dissulfeto actuem como factor interferente, 4-vinilpiridina foi usada para converter IDS numa amostra não reduzida de modo que os grupos SH inibidos de formar aleatoriamente ligações S-S. Entretanto, as ligações dissulfeto foram cortadas com DTT, seguido de bloqueio com 4-vinilpiridina para dar uma amostra reduzida. Tripsina e AspN, seleccionadsa com base no resultado do Exemplo Experimental 1-3, foram aplicadas à amostra não reduzida e à amostra reduzida. Os fragmentos peptidicos foram separados por RP-HPLC. Os cromatogramas de RP-HPLC das amostras não reduzidas e das amostras reduzidas foram comparados de modo a discriminar os picos que foram encontrados na amostra não reduzida, mas não na amostra reduzida (FIG. 7).

Para uma análise mais exacta, as fracções nos picos discriminados foram reduzidas em tamanho através do tratamento adicional com endoproteinases e os picos contendo ligações dissulfeto foram analisados usando MALDI-MS (FIG. 8) .

Os picos com ligações dissulfeto foram analisados novamente relativamente às suas sequências usando MALDI-MS/MS (FIG. 9) para avaliar as posições dos resíduos de cisteína que forma as ligações dissulfeto entre os 525 resíduos de aminoácidos de IDS. Como se mostra na FIG. 10, observou-se que as ligações dissulfeto se formam entre C146-C159 e entre C397-C407. <l-3> Análise do teor de formilglicina IDS degrada o sulfato de heparano e o sulfato de dermatano, ambos são um tipo de glicosaminoglicano (GAG). Esta actividade de degradação não é adguirida até o resíduo de cisteína na posição 59 no centro activo (Cys59) ser convertido em formilglicina (FGly) através de modificação pós-tradução. Assim, a actividade de degradação de IDS foi analisada através da avaliação da modificação pós-tradução de Cys59 para FGly. Para esta análise, usou-se AQUA (guantificação absoluta), um método de análise guantitativa baseado em MS (Espectroscopia de Massa) , em que um substrato sintético marcado radioactivamente (péptido AQUA) é introduzido na amostra. Para analisar quantitativamente formilglicina na posição Cys59, uma diluição seriada do péptido AQUA foi introduzida numa amostra e desenhada uma curva de calibração. As proporções do péptido tipo FGly relativamente ao péptido tipo Cys foram medidas por análise LC-ESI-MS e aplicadas na curva de calibração AQUA para calcular o conteúdo de formilglicina.

Esta análise determinou a conversão de Cys59 para Fgly numa proporção de 80±15%. Considerando a taxa de conversão de Cys50 para Fgly de aproximadamente 50% no agente comercial Elaprase (Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007; Genet Med 2006:8(8):465-473), antecipa-se que a composição terapêutica compreendendo IDS da presente invenção e a formulação preparada com a composição tenha muito maior actividade terapêutica comparativamente com Elaprase. <l-4> Identificação do padrão de glicosilação

Realizou-se um ensaio para avaliar se a IDS da presente invenção é glicosilada e para identificar o padrão de glicosilação se existente. Para este fim, IDS foi tratada com várias enzimas hidrolase de glicósidos, os produtos de digestão foram separados por SDS-PAGE e os seus padrões de mobilidade foram analisados.

Mais detalhadamente, as amostras de IDS foram digeridas com combinações das quatro enzimas hidrolases de glicósidos que se seguem e separadas por SDS-PAGE. TABELA 1. Propriedades das enzimas de hidrólise de açúcares

Como se pode observar na FIG. 11, a IDS da presente invenção foi cortada por PNGase F e Endo H, mas não por O-glicosidase, indicando que a IDS da presente invenção é uma proteína N-glicosilada. Ainda, a IDS foi completamente cortada por PNGase F, mas a sua redução de tamanho foi ligeira quando do tratamento com Endo H. PNGase F actua nos locais de glicosilação dos três padrões, enquanto Endo H actua nos locais de glicosilação do tipo manose elevada e do tipo híbrido. Considerados em conjunto, estes resultados indicam que a IDS possui os três padrões de glicosilação complexos, manose elevado e híbrido. <l-5> Análise do teor de manose-6-fosfato A ligação a um receptor de M6P nas células, manose-6-fosfato (M6P) permite que IDS seja internalizado nas células e assim hidrolisa o sulfato de heparano ou o sulfato de dermatano em lisossomas. Neste Exemplo, IDS foi hidrolisada com ácido usando ácido trifluoroacético (TFA) e sujeito a HPAEC-PAD (Bio-LC) para quantitativamente analisar manose-6-fosfato. IDS foi hidrolisada com TFA 6,75M e o hidrolisado foi analisado usando cromatografia líquida (Cromatografia de permuta iónica de elevada resolução com detecção amperométrica pulsada; HPAEC-PAD). A concentração de M6P previamente conhecida foi analisada nas mesmas condições e as proporções molares de M6P para glicoproteína foram obtidas através de comparação das áreas. A análise foi conduzida em triplicado. Os materiais padrão de M6P e os cromatogramas da composição de M6P da IDS estão mostrados na FIG. 12 e as proporções molares de M6P estão resumidas na Tabela 2, abaixo.

Tabela 2: Análise dos resultados do teor em manose-6- fosfato

Como se pode depreender dos dados da Tabela 2, existem aproximadamente 3 moles de M6P por mole de IDS. Destes resultados pode-se inferir que a composição terapêutica compreendendo a IDS da presente invenção e a formulação preparada com a composição possuem uma elevada capacidade para catabolizar GAG acumulado nos lisossomas. <l-6> Análise de Massa

As massas de IDS glicosilada e de IDS desglico-silada foram medidas usando MALDI-TOF-MS. 0 tratamento de IDS glicosilada com PNGase F deu IDS desglicosilada. MALDI-TOF-MS foi realizada usando Biospectrometria Voyager-DE PRO (Applied Biosystems, USA) acoplada a um espectrómetro de massa dessorção a laser com extracção retardada. 0 instrumento foi normalizado com albumina sérica bovina e IgGl. Os resultados da análise estão resumidos na Tabela 3, abaixo.

Tabela 3: Resultados da análise MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS de IDS

Como é evidente dos dados da Tabela 3, a massa molecular é 77244 Da para IDS glicosilada e 59399 Da para IDS desglicosilada, o gue é semelhante à massa molecular calculada com base na sequência de aminoácidos, a qual é 59298 Da. <l-7> Medição da pureza A pureza de IDS foi medida usando cromatografia de exclusão por tamanho. A cromatografia de exclusão por tamanho é um método cromatográfico em que as moléculas em solução são separadas de acordo com a sua massa molecular relativa e forma. Na cromatografia de exclusão por tamanho, proteínas maiores que o tamanho do poro da coluna não podem penetrar no sistema de poros e passam através da coluna de uma só vez. Subsequentemente, os analitos com massas moleculares ou tamanhos mais pequenos eluem mais tarde. Para esta cromatografia, usou-se o sistema Alliance 2695 HPLC (Waters, WI, USA) acoplado com o detector 2487 UV/VIS (Waters, WI, USA). As proteínas foram detectadas a 214 nm, e analisadas usando o programa informático Empower 2. Os analitos foram aplicados numa coluna TSK G3000SWXL ligada a uma coluna de guarda TSK SWXL (Tosoh, Japan). IDS, após ser diluída para uma concentração de 1,0 mg/ml num tampão de formulação, foi aplicada num volume de 10 μΐ na coluna. Deixou-se migrar com a fase móvel (tampão fosfato de sódio 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,0) a um fluxo de 0,5 ml/min durante 60 min.

Os resultados da análise estão mostrados na FIG. 13. Como se pode observar, os monómeros de IDS tinham um tempo de retenção de aproximadamente 16,4 min e foram eluídos com 100% de pureza. <l-8> Medição da actividade usando substrato sintético A reacção de IDS com o substrato sintético (4-metilumbeliferil-L-iduronida-2-sulfato Na2 (MU-IdoA-2S) durante 4 horas liberta a fracção sulfato (reacção primária). Após a reacção primária, a adição de LEBT (enzimas lisossomais purificadas a partir de testículo bovino) induz uma reacção enzimática secundária com o substrato 4-metilumbeliferil-L-iduronida (reagente obtido após a libertação da fracção sulfato na reacção primária) para separar a fracção 4-metilumbeliferilo da fracção L-iduronida. Devido ao 4-metilumbeliferilo ser fluorogénico, a actividade de IDS foi avaliada medindo a intensidade da fluorescência (Ex. 355 nm/Em. 460 nm) . Encontrou-se que a IDS da presente invenção varia em actividade específica entre 19 e 55 nmol/min/pg. Esta actividade indica que a formilglicina existe no centro activo da enzima como resultado da modificação pós-tradução do resíduo cisteína na posição 59 em IDS. <l-9> Medição da actividade usando substrato natural

Para determinar a reacção com a IDS e o substrato natural, foram medidos os iões sulfato libertados do substrato (dissacárido de heparina) através da reacção com IDS. A mistura de reacção foi aplicada numa coluna iónica (Vydac 302IC) e deixada migrar com a fase móvel de 0,49 g/1 de ácido ftálico a um fluxo de 2 ml/min, durante o qual os iões sulfato livres foram detectados a 290 nm em modo negativo.

Como se mostra na FIG. 14, foi confirmado que IDS hidrolisa o ião sulfato do dissacárido de heparina, indicando que a IDS é capaz de degradar o sulfato ligado em O do sulfato de dermatano e do sulfato de heparano in vivo. <1 — 10> Actividade de entrada na célula in vivo A actividade de internalização celular da IDS foi medida usando células fibroblásticas normais e células de doentes com sindrome de Hunter. Assim, células fibroblás-ticas normais e células de doentes com sindrome de Hunter (obtidas do Samsung Medical Center, Seoul, Korea) foram cultivadas e deixadas a internalizar IDS quando da incubação com várias concentrações de IDS a 372C durante 20 horas numa incubadora de 5% CO2. Após serem colhidas, as células foram lisadas e o nivel de IDS internalizado nas células foi determinado no lisado.

Com base na proporção da concentração de IDS internalizado e de IDS adicionado às células fibroblásticas normais, construíram-se um gráfico de Michaelis-Menten e um gráfico de Lineweaver-Burk, a partir dos quais foi calculada Kiriternaiização (concentração de IDS à qual a velocidade de reacção é metade da velocidade máxima conseguida em concentrações de substrato saturantes). Kintemaiização foi calculada como sendo 18,0 nM ou menos, indicando que IDS foi internalizado nas células através da ligação de M6P aos receptores de M6P na superfície celular (FIG. 15) .

Igualmente, foram analisadas a internalização celular e a actividade de IDS em células de doentes com síndrome de Hunter assim como em células fibroblásticas humanas normais. A internalização e actividade da IDS foram aumentadas em ambas as células, demonstrando que a IDS da presente invenção é internalizada mais eficientemente nas células (FIG. 16). EXEMPLO EXPERIMENTAL 2: Análise clínica do efeito

de IDS

Trinta e um doentes com síndrome de Hunter foram divididos em três grupos, administrado IDS da presente invenção e analisados relativamente aos parâmetros associados à síndrome de Hunter. Elaprase® um agente terapêutico comercializado para a síndrome de Hunter foi usado como um controlo positivo. <2-l> Alteração do nível de GAG na urina (parâmetro primário a testar para o teste de validade)

Aos três grupos de doentes com síndrome de Hunter foi-lhes administrado durante 24 semanas Elaprase (0,5 mg/kg) e o IDS da presente invenção (0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg) e os níveis de GAG (glicosaminoglicano) na urina foram medidos como anteriormente descrito (Conn. Tissue Res. Vol.28, pp317-324, 1990; Ann. Clin. Biochem. Vol.31, ppl47-152, 1994). As medições estão resumidas na Tabela 4, abaixo.

Tabela 4: Alteração do nível de GAG na urina com

administração de IDS

Nos doentes com síndrome de Hunter, como se mostra na Tabela 4, os níveis de GAG na urina foram reduzidos em 18,7% quando da injecção de Elaprase, mas em 29,5% quando da injecção da IDS da presente invenção na mesma dose. Ainda, quando injectada numa dose de 1,0 mg/kg, a IDS da presente invenção reduziu o nível de GAG na urina em 41,1%. Estes resultados demonstram que a IDS da presente invenção é um fármaco eficaz na síndrome de Hunter, uma doença causada pela acumulação de GAG. <2-2> Alteração de 6-MWT (Teste do andar 6 minutos) (segundo parâmetro a testar para o teste de validade)

Após administração de Elaprase e IDS da presente invenção aos doentes com síndrome de Hunter durante 24 semanas, as distâncias que andaram durante 6 minutos foram medidas de acordo com o método descrito em AM. J. Respir. Crit. Care. Med., Vol 166, pp 111-117, 2002. Os resultados estão apresentados na Tabela 5, abaixo.

Tabela 5: resultados do teste 6-MWT

Grupo Elaprase (0,5 mg/kg) IDS da invenção (0,5 IDS da invenção (1,0 mg/kg) mg/kg)

Distância 6-MWT (m) 5,9 67,6 52,8

Alteração de 6-MWT (%) 1,3 18,2 13,4

Como se mostra na Tabela 5, a alteração de 6-MWT foi de apenas 1,3% para os doentes que receberam Elaprase, mas aumentou para 18,2% ara os doentes que receberam a mesma dose de IDS da presente invenção. Os doentes com síndrome de Hunter têm problemas a andar devido a contractura. No entanto, a IDS da presente invenção melhora os sintomas e assim é eficaz no tratamento da síndrome de Hunter.

Texto sem listagem de sequências SEQ ID NO:l sequência de aminoácidos de IDS SEQ ID NO:2 sequência iniciadora directa IDS-1 SEQ ID NO:3 sequência iniciadora directa IDS-2 SEQ ID NO:4 sequência iniciadora reversa IDS-3 SEQ ID NO:5 sequência iniciadora directa IDS-N1 SEQ ID NO:6 sequência iniciadora directa IDS-N2 SEQ ID NO:7 sequência iniciadora reversa IDS-4 SEQ ID NO:8 sequência iniciadora directa T7

Lisboa, 27 de maio de 2016

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma composição de iduronato-2-sulfatase (IDS) tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1, em que um resíduo de cisteína na posição 59 na sequência de aminoácidos IDS está convertido em formilglicina (FGly) numa proporção molar de 65% ou superior, de preferência numa proporção molar de 75% ou superior.
2. 2. A composição de IDS da reivindicação 1, em que a IDS tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 possui manose-6-fosfato numa quantidade de 2,0 a 4,0 moles por mole de IDS, de preferência numa quantidade de 2,5 a 3,0 moles por mole de IDS.
3. 3. Uma formulação, compreendendo a composição de IDS de qualquer uma das reivindicações 1 e 2.
4. 4. A formulação da reivindicação 4, compreendendo ainda: um veículo aceitável em termos farmacêuticos; e, facultativamente, uma ou mais substâncias seleccionadas do grupo consistindo num tampão, um açúcar, um estabilizador, um antioxidante, um bacteriostático, um agente quelante, um adjuvante, um agente de suspensão, um espessante e um preservativo.
5. 5. Um método para a preparação de uma compo- sição de qualquer uma das reivindicações 1 e 2, compreendendo: (1) cultura de uma estirpe celular recombinante transformada com um qene codificador de IDS representada por SEQ ID N0:1 e colheita da cultura; e (2) purificação a partir da cultura através de uma croma-tografia de permuta aniónica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de afinidade, em que a cromatografia de permuta catiónica é realizada usando um tampão de eluição com um pH de 4,0 a 6, 0 .
6. 6. O método da reivindicação 5, compreendendo: (1) transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão portador de um gene IDS para obter uma estirpe celular recombinante; (2) cultura da estirpe celular recombinante na presença de um hidrolisado num meio sem soro e colheita da cultura; (3) purificação de IDS a partir da cultura através de cromatografia de permuta aniónica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de permuta catiónica e cromatografia de afinidade; e (4) combinação de IDS purificada com um veículo aceitável em termos farmacêuticos.
7. 7. O método de qualquer uma das reivindicações 5 e 6, em que a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês. 8. 0 método de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a cromatografia hidrofóbica é realizada usando um tampão de eluição com um pH de 5,0 a 7,0.
8. 9. O método de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a cromatografia de afinidade é realizada usando um tampão de eluição com um pH de 6,0 a 8,0.
9. 10. O método de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a cromatograf ia de permuta aniónica é realizada usando um tampão de eluição com um pH de 5,5 a 7,5.
10. 11. O método de qualquer uma das reivindicações 5 a 10, compreendendo ainda a inactivação de vírus a um pH de 3,0 a 4,0.
11. 12. Uma composição preparada pelo método de qualquer uma das reivindicações 5 a 11.
12. 13. Um método para a preparação de uma formulação, compreendendo a formulação da composição de acordo com as reivindicações 1 ou 2 com um veículo aceitável em termos farmacêuticos e, facultativamente, com uma ou mais substâncias seleccionadas do grupo consistindo num tampão, um açúcar, um estabilizador, um antioxidante, um bacterios-tático, um agente quelante, um adjuvante, um agente de suspensão, um espessante e um preservativo.
13. 14. Uma composição de qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 12, ou formulação de qualquer uma das reivindicações 3 e 4, para usar no tratamento da sindrome de Hunter. Lisboa, 27 de maio de 2016