KR20080113367A - 식물에서 시알산의 합성 - Google Patents

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Abstract

식물에서 시알산을 합성하는 방법, 및 시알산을 합성할 수 있는 식물이 제공된다. 추가로, 식물에서 시알산화된 단백질을 생성하는 방법이 또한 제공된다. 시알산을 합성하기 위한 방법은 N-아세틸 뉴라민산 (Neu5Ac) 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써 시알산을 합성하는 식물을 제공하는 것을 포함한다. 식물은 또한 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 공동 발현할 수 있다.
Figure 112008063885912-PCT00001
시알산, Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제

Description

식물에서 시알산의 합성{SYNTHESIS OF SIALIC ACID IN PLANTS}
본 발명은 식물 내 시알산의 합성에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 시알산을 생성하는 방법 및 식물 및 이들 식물로부터 생성된 시알산화된 단백질을 제공한다.
식물은 잠재적으로 저비용이며 재조합 약학적 단백질의 생산을 위한 오염의 위험성이 없는 공장이다. 식물에서 생성되는 대부분의 재조합 단백질은 아미노산 서열, 입체구조(conformation) 및 생물학적 활성에 관한한 포유동물 대응물과 구별할 수 없다. 게다가, 포유동물 글리코단백질은 그것들이 유전자 변환 식물에서 발현될 때 효과적으로 글리코실화된다. 그러나, 식물은 동물 글리코단백질에서 발견되는 것과 다른 N-글리칸을 가지는 분자를 생성한다(Lerouge et al., 1998). 이는 이들 단백질에서 식물-특이적 글리코-에피토프의 존재가 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있을 뿐 아니라(Bardor et al, 2003) 시알산화된 서열과 같은 포유동물형 에피토프의 부재가 혈류로부터 그것의 빠른 제거를 유도할 수 있기 때문에 식물-유래 약물의 사용을 제한할 수 있다. 그 결과, 식물-유래 약물의 N-글리코실화를 조절하는 것은 인간 치료에서 그것들의 사용에 필수 불가결하다.
식물체 내(In planta) 리모델링 전략은 인간의 양립가능한 탄수화물 프로필 을 가지는 식물-유래 항체를 획득하는 것으로 최근에 알려졌다. 일부 전략은 소포체 내 식물항체의 보유를 포함하며(Ko et al ., 2003; Sriraman et al., 2004, Triguero et al ., 2005), 다른 것은 포유동물 글리코실트랜스퍼라제로 식물의 형질전환을 포함한다. 예를 들어, 식물 N-글리코실화는 인간 β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제로 식물의 형질전환에 의해 부분적으로 인체에 적응될 수 있다(Palacpac et al ., 1999; Bakker et al ., 2001). 형질전환된 식물에서 뮤린 항체의 발현은 대응하는 뮤린 IgG에서 관찰되는 것과 유사한 갈락토실화 프로필을 품고있는 식물-유래 항체의 생성을 야기한다(Bakker et al, 2001).
포유동물 IgG는 Fc 도메인에 위치하는 N-글리코실화의 보존부위 상의 2-안테나 N-글리칸을 지탱한다. 이들 올리고당은 약하게 시알산화되고, 말단 Neu5Ac의 부재는 항체 기능 및 안정성을 방해하지 않는다. 대조적으로, 대부분의 다른 순환상의 글리코단백질은 시알산화된 2-, 3 또는 4 안테나 N-글리칸을 가진다. 이들 글리칸 상의 말단 시알산의 존재는 수많은 생물학적 기능을 요구하는데, 첫 번째는 순환계에서 단백질의 반감기 조절이다. 말단 시알산의 부재시에는, 글리코단백질을 간 아시알로글리코단백질 수용체로 검출하였고 혈청으로부터 제거하는데, 이들 단백질을 생물학적으로 단수명이며 비효과적으로 제공한다(Kelm and Schauer, 1997). 따라서, 비-시알산화된 식물-유래 약물은 인간에게 주입될 때 혈류로부터 급속도로 제거될 수 있으며, 예를 들어, 담배-유래 Epo는 시험관 내에서 생물학적으로 활성이지만 그것이 적혈구 형성성(erythropoietic) 조직에 도달하기 전에 혈액순환으로부터 그것이 제거되기 때문에 생체 내에서 비 기능적이다(Matsumoto et al., 1995).
식물항체에 연결된 N-글리칸의 인간 유사 N-글리칸으로 리모델링은 인간 β(1, 4)-갈락토실트랜스퍼라제의 발현에 의해 이미 식물에서 부분적으로 이루어졌고(Palacpac et al., 1999; Bakker et al., 2001), 트랜스퍼라제는 공동-기질로서 내생의 UDP-Gal을 사용한다. 포유동물 시알릴트랜스퍼라제는 또한 식물에 도입되었으며 기능성인 것으로 증명되었고 골지체를 정확하게 표적으로 하였다(Wee et al., 1998). 그러나, 내생의 올리고당의 어떤 시알산화도 관찰되지 않았다. 시알산의 발생 뿐 아니라 식물 내 시알산화 기구는 여전히 논쟁의 소재이다. 그러나, 인간에서 존재하는 주요 시알산인 Neu5Ac 뿐 아니라 그것의 선구체인 N-아세틸만노사민 (D-ManNAc)은 식물에서 검출가능한 양으로 합성되는 것으로 나타나지 않는다(Seveno et al, 2004). 그 결과, 식물 N-글리칸의 시알산화된 올리고당으로의 글리코-엔지니어링은 골지체에서 Neu5Ac의 합성, 활성화 및 전달을 촉매할 수 있는 외생 효소의 공동-발현을 필요로 한다.
포유동물 및 박테리아에서, Neu5Ac의 동화작용 및 이화작용은 다른 경로를 통해 일어난다(Angata and Varki, 2002). 효소의 2개의 주요 분류는 Neu5Ac를 형성하는 것을 필요로 한다. N-아세틸뉴라민산 리아제(Neu5Ac 리아제)는 가역반응에서 Neu5Ac를 N-아세틸만노사민(D-ManNAc) 및 피루브산으로의 분해를 촉매함으로써 시알산의 이화작용에 포함된다. D-ManNAc 및 피루브산의 높은 농도에서, 평형상태는 Neu5Ac의 합성을 이동시킬 수 있다. 글루코사민 2-에피머라제 활성에 결합된, E. coli로부터 Neu5Ac 리가제를 D-GlcNAc로부터 Neu5Ac의 큰-스케일 생산을 위해 사용 하였다(Maru et al., 1998). 또 다르게는, NeuB와 같은 Neu5Ac 합성은 ManNAc의 포스포엔올 피루브산(PEP)으로의 축합을 촉매하며 시알산의 생합성에 직접 포함된다(Tanner, 2005에서 검토).
발명의 개요
본 발명은 식물에서 시알산의 합성에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 시알산을 생성하는 방법 및 식물 및 이들 식물로부터 생성된 시알산화된 단백질을 제공한다.
본 발명의 대상은 식물에서 시알산을 생성하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라서, 하기의 단계를 포함하는 시알산, 예를 들어, N-아세틸 뉴라민산(Neu5Ac)을 합성하는 방법 (A)이 제공된다,
i) Neu5Ac 합성 또는 Neu5Ac 리아제을 암호화하며, 식물에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물을 제공하는 단계, 및
ii) 식물을 성장시키고 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 시알산을 합성하는 단계.
게다가, 성장 단계 후, 시알산은 식물로부터 회수될 수 있다. 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 방법(방법 A)에 관련하며, 제공 단계에서, 식물은 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5 Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하며, 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역에 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 공동-발현된다. 추가로, 제2 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법에 속하며(방법 A), Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 관심의 단백질을 생성하는 방법 (B)를 제공한다,
i) Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물을 제공하는 단계,
ii) 식물을 성장시키고 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하여, 시알산화 된관심의 단백질을 제공하는 단계.
바람직하게는, 시알산화된 관심의 단백질은 2, 3 또는 4 안테나 N-글리칸을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 방법(방법 B)에 관련하며, 시알산화된 단백질은 식물로부터 추출된다. 게다가, 시알산화된 단백질은 분리되고 정제될 수 있다.
본 발명은 Neu5 Ac 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포 또는 종자를 제공한다. 식물, 식물 세포 또는 종자는 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하며, 식물 내에서 하나 이상의 제2 조절 영역에 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 추가로, 조절 영역 및 제2 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 기재한 바와 같은 방법(방법 B)에 관련하며, Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물, 식물 세포 또는 종자 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
본 발명은 Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포, 또는 종자를 포함한다. 식물, 식물 세포 또는 종자는 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역에 효과적으로 연결된 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 추가로, Neu5 Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물, 식물 세포 또는 종자 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
본 발명은 또한 Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 식물에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작용하도록 연결된 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포 또는 종자를 제공한다. 하나 이상의 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 추가로, Neu5Ac 신타제, Neu5 Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물, 식물 세포 또는 종자 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
본 발명은 또한 N-아세틸 뉴라민산 (Neu5Ac) 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 식물 또는 식물의 부분을 일시적으로 형질전환하며, 뉴클레오티드 서열은 식물에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결되고, 뉴클레오티드 서열을 발현하여 시알산을 합성하는 것을 포함하는 시알산을 합성하는 방법(방법 C)을 제공한다. 추가로, Neu5Ac 또는 Neu5 Ac 리아제는 식물 또는 식물의 부분으로부터 회수될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재한 바와 같은 방법(방법 C)와 관련하며, 식물 또는 식물의 부분을 일시적으로 형질전환하는 단계에서, 추가로 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 암호화하며, 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역과 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 공동 발현된다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 관심의 단백질을 생성하는 방법(방법 D)를 제공한다,
i) Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하는 구조체로 식물 또는 식물의 부분을 일시적으로 형질전환하는 단계, 및
ii) 시알산화 된 관심의 단백질을 생성하는 단계.
시알산화된 관심의 단백질은 2, 3 또는 4 안테나 N-글리칸을 포함할 수 있다. 추가로, 시알산화된 단백질은 식물 또는 식물의 부분으로부터 추출될 수 있다. 관심의 시알산화된 단백질은 또한 분리되고 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법(방법 D)에 관련하며, 생성 단계 후, 관심의 시알산화된 단백질을 포함하는 식물 물질이 피험자에 경구적으로 투여된다. 예를 들어, 생성 단계 후, 식물 또는 식물의 부분은 최소한으로 처리된 식물 물질을 생성하기 위해 최소한으로 처리될 수 있고, 최소한으로 처리된 식물 물질은 피험자에게 경구적으로 투여되는 시알산화된 관심의 단백질을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은, Neu5Ac-합성 효소, Neu5Ac 리아제 및 NeuB2의 식물 내 발현은 식물 조직 내 기능적 효소의 축적을 야기한다. Neu5Ac-합성 효소는 어떤 식물, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 담배 및 메디카고 사티바(Medicago sativa (알팔파)), 분자농업 이용을 위한 몇몇의 농경의 이점으로부터 이익이 되는 다년생 콩과 작물에서 발현될 수 있다(Busse et al., 2001).
본 발명의 개요는 본 발명의 모든 특징을 필수적으로 기재하지는 않는다.
본 발명의 이들 및 다른 특징은 하기의 기재로부터 더욱 명백하게 될 것이며, 그것의 참고는 첨부되는 도면으로 만들어진다:
도 1a는 야생형으로부터 추출된 가용성 단백질(라인 1)또는 항-FLAG 항체를 사용하여 Neu5Ac 리아제-FLAG를 발현하는 유전자 변환 담배 BY2 세포(라인 2)의 웨스턴-블롯 분석을 보여준다. 도 1b 및 도 1c는 Neu5Ac가 없거나(도 1b) 또는 있는 (도 1c) Neu5Ac 리아제를 발현하는 담배 BY2 세포로부터 분리되는 시토졸 단백질의 pH 7 및 37℃에서 배양 후 획득된 최종 결과물의 기체 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 1d는 외인성 10mM Neu5Ac와 함께 48h 동안 37℃에서 Neu5Ac 리아제를 발현하는 담배 BY2 세포들의 시토졸 단당류의 GC 프로필을 보여준다. 도 1e 및 도 1f는 프로필(도 1c)에서 검출된 피크 1(도 1e), 및 피크 2 및 3(도 1f)의 전자 충격 질량 분석을 보여준다. D-ManNAc의 1-O-메틸 퍼실릴의 주요 단편 이온이 나타난다.
도 2a 및 도 2b는 D-ManNAc 및 피루브산이 없거나(도 2a) 또는 있는(도 2b) Neu5Ac 리아제를 발현하는 담배 BY2 세포로부터 분리되는 시토졸 단백질의 pH 7 및 37℃에서 배양 후 획득되는 최종 생성물의 기체 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 2c는 프로필(도 2b)에서 나타나는 피크의 전자 충격 질량 스펙트럼을 보여준다. N-아세틸뉴라민산의 1-O-메틸 메틸에스테르 퍼실릴 유도체의 주요 단편 이온이 나타난다.
도 3a는 항-FLAG 항체를 사용하여 야생형(라인 1) 또는 NeuB2-FLAG를 발현하는 유전자 변환 BY2 세포(라인 2)로부터 추출되는 시토졸 단백질의 웨스턴-블롯 분석을 보여준다. 도 3b 및 도 3c는 D-ManNAc 및 PEP가 없거나(도 3b) 또는 있는(도 3c) NeuB2를 발현하는 알팔파 식물의 잎으로부터 추출된 가용성 단백질의 pH 8 및 37℃에서 배양 후 획득되는 최종 생성물의 기체 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 3d는 프로필(도 3c)에서 나타나는 피크의 전자 충격 질량 스펙트럼을 보여준다. N-아세틸뉴라민산의 1-O-메틸 메틸에스테르 퍼실릴 유도체의 주요 단편 이온 이 나타난다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 식물 내 시알산의 합성에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 이들 식물들로부터 생성된 시알산 및 시알산화된 단백질을 발현하는 방법 및 식물을 제공한다.
하기의 기재는 바람직한 구체예이다.
본 발명은 식물 내에서 N-아세틸 뉴라민산(Neu5Ac)의 합성을 위한 방법을 제공한다. Neu5Ac 리아제는 가역반응에서 Neu5Ac의 ManNAc 및 피루브산으로의 분해를 촉매함으로써 박테리아 내 시알산을 이화한다. 이 반응은 가역적이기 때문에, Neu5Ac 리아제는 적당한 선구체의 존재에서 Neu5Ac의 합성에 사용될 수 있다. Neu5Ac의 생성을 위한 또 다른 방법은 Neu5Ac 신타제의 사용을 포함한다. Neu5Ac 신타제는 D-ManNAc 및 PEP의 축합에 의해 Neu5Ac의 형성을 촉매한다.
따라서, 본 발명은 Neu5Ac 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절영역과 작용하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물을 제공하는 단계, 식물을 성장시키는 단계, Neu5Ac를 합성하기 위한 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함하는 Neu5Ac를 합성하는 방법을 제공한다. 또 다르게는, 방법은 식물 또는 식물의 부분 내에서 Neu5Ac의 일시적인 생성을 포함할 수 있다.
이렇게 형성된 Neu5Ac는 당업계에서 공지된 과정을 사용하여 식물로부터 회수될 수 있고 시험관 내 단백질의 시알산화를 위해 사용될 수 있다. 또 다르게는, Neu5Ac는 식물내에서 공동-발현되는 관심의 단백질의 시알산화를 위한 내생의 기질 로서 사용될 수 있다.
원한다면, 식물 내에서 Neu5Ac의 합성을 위한 기질의 수준은, 이에 제한되는 것은 아니지만, N-아세틸만노사민(D-ManNAC)을 포함하며, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 및 CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 암호화하는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열을 식물 내에서 공동-발현함으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, ManNAc는 UDP-GlcNAc 2-에피머라제, 예를 들어, 박테리아 UDP-GlcNAc 2-에피머라제, 또는 내생의 UDP-GlcNAc를 ManNAc로 전환시키는 다른 근원을 형성하는 에피머라제를 식물 내에서 발현함으로써 합성할 수 있다. 또 다르게는, ManNAc-6-포스페이트가 생성된 후 포스파타제와 함께 가수분해될 수 있다. 이 접근으로, GlcNAc-6-포스페이트 2-에피머라제, 예를 들어, 박테리아 GlcNAc-6-포스페이트 2-에피머라제 또는 포유동물 UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제는 식물 내에서 발현된다. Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 이 제2 뉴클레오티드 서열을 공동-발현함으로써, 증가된 수준의 Neu5Ac가 생성될 수 있다. 그러나, 하나 이상의 상기 뉴클레오티드 서열을 공동-발현하기 위한 필요는 선택된 숙주 식물에 의존할 것이고, 하나 이상의 이들 효소의 외생의 활성으로서 식물 내에서 존재할 것이다.
시토졸 시알산으로부터 N-글리칸의 시알산화를 보증하기 위하여 박테리아 또는 포유동물 CMP-Neu5Ac 신타제, 포유동물 CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 포유동물 갈락토실트랜스퍼라제, (갈락토오스에 추가로 시알산 전에 N-글리칸에 전달될 수 있다) 및 포유동물 시알릴트랜스퍼라제는 식물 내에서 공동-발현될 수 있다. 본 발명에 따르는 식물 내에서 생성된 Neu5Ac는 CMP-Neu5Ac 신타제를 통해 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-Neu5Ac)의 합성을 위한 기질로서 사용될 수 있고, CMP-Neu5Ac는 그 후 또한 식물 내에서 공동-발현되는 관심의 단백질의 시알산화를 위한 기질로서 사용된다. 이 경우에 식물은 또한 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 식물 내에서 포유동물 시알릴트랜스퍼라제 및 포유동물 CMP-Neu5Ac 신타제의 발현은 증명되었다(Wee et al., 1998, Misaki, R., et al, 2006, 본원에 참고로써 포함됨). 그러나, 하나 이상의 상기 뉴클레오티드 서열을 공동-발현하기 위한 필요는 선택되는 숙주 식물에 의존할 수 있고, 하나 이상의 이들 효소의 내생적 활성은 식물 내에서 존재할 수 있다.
뉴클레오티드 서열이 식물내에서 공동-발현되는 경우, 각각의 원하는 뉴클레오티드 서열은 표준 형질전환 기술, 일시적 형질전환 기술을 사용하여 식물로 도입될 수 있고, 또는 하나 이상의 원하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 두 개의 식물 각각은 뉴클레오티드 서열의 요구되는 조합을 공동-발현하는 식물을 획득하는 것과 교배될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 관심의 시알산화된 단백질의 생성을 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있는 식물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물을 제공하는 단계와 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함한다. 관심의 단백질을 생성하기 위해, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열은 표준 기술, 예를 들어, 형질전환을 사용하여 플랫폼 식물로 도입되고, 제2 뉴클레오티드 서열은 발현되며, 또는 플랫폼 식물은 관심의 단백질을 발현하는 식물과 교배되어 교배된 식물의 후손 내에서 생성된 관심의 단백질은 시알산화된다.
본 발명은 또한 Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물을 제공하는 단계, 식물을 성장시키는 단계, 및 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하여 관심의 단백질을 생성하는 단계를 포함하는 관심의 단백질을 생성하는 방법을 제공하며, 관심의 단백질은 시알산화된다. 바람직하게는, 시알산화된 관심의 단백질은 2, 3 또는 4 안테나 N-글리칸을 포함한다. 시알산화된 단백질은 식물로부터 추출될 수 있고, 원한다면, 시알산화된 단백질은 표준 방법을 사용하여 분리되고 정제될 수 있다. 또한, 식물은 원하는 구조체로 안정하게 형질전환될 수 있거나 또는 식물 또는 식물의 부분은 원하는 구조체로 일시적으로 형질전환 될 수 있다.
Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실 트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 식물 내에서 발현의 수준을 증가시시켜 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화에 의해 이는 올리고뉴클레오티드 빌딩 블럭의 합성을 위한 적절한 DNA 뉴클레오티드의 선택 및 그것의 순차적인 효소 조합, 식물 내 코돈 선호도에 접근 하기 위한 그것의 구조적 유전자 또는 단편을 의미한다.
식물 내 외래 서열의 발현을 최적화하기 위해, 서열은 요구되는 바와 같이 사용되거나 변경되어 대응하는 단백질, 예를 들어, Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 관심의 단백질 또는 그것의 조합은 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 때 생성되는 것보다 더 높은 수준에서 생성된다. 예를 들어, 제한이 고려되는 것은 아니지만, 서열은 합성 서열이 될 수 있고, 식물 내 코돈 선호도에 대해 최적화될 수 있고, 서열 비교 기술, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 BLAST(GenBank를 통해 이용가능; 디폴트 변수를 사용)를 사용하여 결정되는 바와 같은 야생형 서열과 함께 적어도 약 80% 상동성을 포함할 수 있다. 또한 유용한 생물학적 특성, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 항원 특성을 나타내는 관심의 단백질 또는 그것의 유도체를 암호화하는 단편들 또는 서열의 부분들이 식물 조직 내에서 발현될 수 있음이 생각된다.
Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제의 발현 수준 및 형질전환 단백질 생성을 최대화하기 위해서, 핵산 서열은 검사될 수 있고 코딩 영역은 Sardana et al(Plant Cell Reports 15:677-681; 1996)에 의해 약술되는 것과 유사한 과정을 사용하여 식물에서 유전자의 발현을 위해 최적화되도록 변형된다. 쌍떡잎식물의 고도로 발현된 유전자로부터 코돈 선호도의 테이블은 Murray 등(Nuc Acids Res. 17:477-498; 1989)을 포함하는 몇몇의 근원으로부터 이용가능하다.
따라서, 본 발명은 N-아세틸 뉴라민산 (Neu5Ac) 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절영역과 작용하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물을 제공하는 단계, 식물을 성장시키는 단계, 뉴클레오티드 서열을 발현함으로써 시알산을 합성하는 단계를 포함하는 시알산을 합성하는 방법을 제공한다. Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 추가로, 제공 단계에서, 식물은 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역에 작용하도록 연결되는 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 추가로 포함할 수 있고, 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 공동-발현된다. 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열은 식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 Neu5Ac 신타제, Neu5 Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물을 제공하는 단계, 식물을 성장시키는 것 및 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하여 관심의 단백질을 생성하는 단계를 포함하는 관심의 단백질을 생성하는 방법은 제공한다. Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
추가로, 본 발명은 식물 내에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결되는 Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포, 또는 종자에 관한 것이다. 식물, 식물 세포, 또는 종자는 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역에 작용하도록 연결되는 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. Neu5 Ac 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5 Ac 트랜스포터를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물, 식물 세포 또는 식물 종자 내에서 발현을 위해 코돈 최적화 될 수 있다.
본 발명은 또한 Neu5 Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열 및 식물 내에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작용하도록 연결된 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포 또는 종자를 포함한다. Neu5Ac 신타제, Neu5 Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
"작용하도록 연결되는"은 특정 서열이 유전자 발현의 매개 또는 조절과 같은 의도된 기능을 직접 또는 간접적으로 수행하는 것을 상호작용함을 의미한다. 작용하도록 연결되는 서열의 상호작용은, 예를 들어, 작용하도록 연결되는 서열과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수 있다. 전사 조절 영역 및 관심의 서열은 서열이 기능적으로 연결되어 관심의 서열의 전사를 허용하는 것이 전사 조절 영역에 의해 매개 또는 조절될 때 실시가능하게 연결된다.
용어 "식물 물질"은 식물로부터 유도되는 어떤 물질을 의미한다. 식물 물질은 완전한 식물, 조직, 세포 또는 그것의 어떤 단편을 포함할 수 있다. 추가로, 식물 물질은 세포 내 식물 성분, 세포 외 식물 성분, 식물의 액체 또는 고체 추출물, 또는 그것의 조합을 포함할 수 있다. 추가로 식물 물질은 식물 잎, 줄기, 열매, 뿌리 또는 그것의 조합으로부터의 식물, 식물 세포, 조직, 액체 추출물 또는 그것의 조합을 포함할 수 있다. 식물 물질은 어떤 진행 단계를 받지 않는 식물 또는 그것의 부분을 포함할 수 있다. 그러나, 또한 식물 물질은 이에 제한되는 것은 아니지만 크로마토그래피, 전기영동 등을 포함하는 당업계에서 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 부분적 또는 상당한 단백질 정제를 포함하는 하기 정의된 바와 같은 최소의 과정 단계 또는 더 엄격한 과정을 받을 수 있다고 생각된다.
용어 "최소 과정"은 식물 물질, 예를 들어, 식물 또는 식물의 부분이 부분적 으로 정제된 관심의 단백질을 포함하여 식물 추출물, 호모지네이트, 식물 호모지네이트의 단편 등을 얻는 것을 의미한다. 부분적 정제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 식물 세포 내 구조를 붕괴시켜 가용성 식물 성분을 포함하는 조성물을 만드는 것을 포함하고, 불가용성 식물 성분은, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과 또는 그것의 조합에 의해 분리될 수 있다. 이와 관련하여, 잎 또는 다른 조직의 세포 외 공간 내에서 분비된 단백질은 진공 또는 원심분리 추출을 사용하여 용이하게 획득될 수 있고, 또는 조직은 세포 외 공간으로부터 단백질 유리를 압착하거나 또는 유리시키기 위해 롤러 또는 분쇄 등을 통해 통과에 의해 압력하에서 추출될 수 있다. 최소 과정은 또한 가용성 단백질의 미정제 추출물의 제조를 포함할 수 있는데, 이 제조는 제2 식물 생성물로부터 무시해도 좋은 오염물을 가질 것이기 때문이다. 추가로, 최소 과정은 잎으로부터 가용성 단백질의 수성 추출물을 포함한 후 어떤 적당한 염과 함께 침전될 수 있다. 다른 방법은 추출의 직접 사용을 허용하기 위해 큰 스케일의 침용과정(maceration) 및 액 추출물을 포함할 수 있다.
식물 물질은, 식물 물질 또는 조직의 형성에서 피험자에 경구적으로 전달될 수 있다. 식물 물질은 다른 음식 또는 캡슐과 함께 식이 보충제의 부분으로서 투여될 수 있다. 식물 물질 또는 조직은 또한 기호성을 개선 또는 증가시키기 위해 농축될 수 있고, 또는 요구되는 바와 같은 다른 물질, 성분 또는 약학적 부형제와 함께 제공될 수 있다.
관심의 이종 조직의 단백질을 포함하는 식물은 필요 및 상황에 의존하는 다 양한 방법으로 피험자, 예를 들어, 동물 또는 인간에 투여될 수 있다고 생각된다. 예를 들어, 단백질이 경구적으로 투여된다면, 식물 조직이 채취될 수 있고 피험자에게 직접적으로 공급될 수 있고 또는 채취된 조직은 피딩에 앞서 건조될 수 있고, 또는 동물은 어떤 우선적 채취도 발생하지 않는 식물에서 방목하는 것이 허용될 수 있다. 이는 또한 동물 먹이에서 식품 공급으로서 제공되는 채취된 식물 조직을 위한 본 발명의 범주 내로 고려된다. 식물 조직이 추가 과정에서 조금이든 아니든 동물에게 먹이로 공급된다면 투여되는 식물 조직은 식용인 것이 바람직하다. 추가로, 식물로부터 획득되는 관심의 단백질은 음식 보충제로서 그것의 사용에 앞서 미정제, 부분적으로 정제 또는 정제된 형태로 추출될 수 있다. 이 후자의 경우에서, 단백질은 식용 또는 비-식용 식물에서 제조될 수 있다.
실시예에서 더욱 상세하게 기재하는 바와 같이, Neu5Ac 리아제, 및 Neu5Ac 리아제-FLAG (Neu5Ac 리아제는 FLAG 에피토프를 가지는 그것의 C-말단에 형질전환주(transformant)에서 재조합 단백질의 면역검출을 허용하기 위해 태그하였다)를 식물로 도입되었다. 항-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴-블롯 분석은 MWr 32 kDa의 단백질이 형질전환된 세포에서 존재함을 증명하였다(도 1a). 추가로 시험관 내와 생체 내 리아제 활성 두 가지 모두는 Neu5Ac 리아제 또는 Neu5Ac 리아제-FLAG를 발현하는 식물로부터 획득한 추출물에서 검출가능하다. 어떤 내생적 리아제 활성도 비-형질전환 식물에서 검출되지 않았다. 그러나, 재조합적으로 생성된 Neu5Ac 리아제를 사용하는 Neu5Ac의 합성은, D-ManNAc 및 피루브산의 존재에서 관찰된다(도 2b 참조). 그런까닭에, 재조합적으로 발현된 Neu5Ac 리아제는 식물체 내에서 생물학적으로 활성이다.
Neu5Ac 신타제(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 NeuB2) 및 Neu5Ac 신타제-FLAG(Neu5Ac 신타제는 FLAG 에피토프를 가지는 그것의 C-말단에 형질전환주(transformant)에서 재조합 단백질의 면역검출을 허용하기 위해 태그하였다)는 식물로 도입되었다. 항-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴-블롯 분석은 MWr 37 kDa의 단백질이 형질전환된 세포에서 존재함을 증명하였다. 시험관 내와 생체 내 신타제 활성 두 가지 모두는 Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 신타제-FLAG를 발현하는 식물로부터 획득한 추출물에서 검출가능하다. 어떤 내생적 신타제 활성도 비-형질전환 식물에서 검출되지 않았다. 그러나, 재조합적으로 생성된 Neu5Ac 신타제를 사용하는 Neu5Ac의 합성은, D-ManNAc 및 PEP의 존재에서 관찰된다(도 3b, 3c 참조). 그런까닭에, 재조합적으로 발현된 Neu5Ac 신타제는 식물에서 생물학적으로 활성이다.
"유사체" 또는 "유도체"는 침묵 뉴클레오티드 서열에서 어떤 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는데, 단, 뉴클레오티드 서열은 표적 서열의 발현을 감소 또는 표적 서열에 의해 암호화되는 단백질의 합성 또는 활성을 감소시키는 표적 유전자 또는 서열의 침묵 발현의 특성을 보유한다. 예를 들어, 핵산 서열의 유도체 및 유사체는 전형적으로 침묵 핵산 서열과 80% 이상 유사하게 나타난다. 서열은 유사하게, 디폴트 변수(Program: blastn; Database: nr; Expect 10; filter: low complexity; Alignment: pairwise; Word size: 11)를 사용하여 BLAST 알고리즘(GenBank: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/)의 사용에 의해 결정될 수 있다. 그것의 유사체 또는 유도체는 또한 본원에 기재된 서열 중 어떤 하나에서 엄격한 교배 조건하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열들을 포함하며(Maniatis et al. , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 387-389, 또는 Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3 참조) 단, 서열은 표적 유전자의 침묵 발현의 특성을 나타낸다. 이러한 엄격한 혼성화 조건의 예는 적당한 프로브, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 16-20 시간 동안 65EC에서 7 % SDS, 1mM EDTA, 0.5M Na2HPO4, pH 7.2 중 [감마-32P]dATP 표지된 프로브와 함께 혼성화될 수 있다. 그 후 5 % SDS, 1mM EDTA 4OmM Na2HPO4, pH 7.2에서 30분 동안 세척 후 1 % SDS, 1mM EDTA 4OmM Na2HPO4, pH 7.2에서 30분 동안 세척하였다. 이 완충제에서 세척은 반복되어 배경을 감소시킬 수 있다.
"조절 영역" "조절 인자" 또는 "프로모터"는 전형적으로, 항상 그렇지는 않지만, DNA 또는 RNA 또는 DNA와 RNA 모두로 구성될 수 있는 유전자의 단백질 코딩 영역의 위쪽인 핵산의 부분을 의미한다. 조절 영역이 활성이고, 관심의 유전자와 작용하는 조합 또는 작용하도록 연결될 때, 이는 관심의 유전자의 발현을 야기할 수 있다. 조절 인자는 기관 특이성을 매개 또는 발달 또는 일시적 유전자 활성화를 조절할 수 있다. "조절 영역"은 프로모터 인자, 기초 프로모터 활성을 나타내는 코 어 프로모터 인자, 외부 자극에 반응을 유도할 수 있는 인자, 네거티브 조절 인자 또는 전사 인핸서와 같은 프로모터 활성을 매개하는 인자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "조절 영역"은 전사 후 활성인 인자, 예를 들어, 번역 및 전사 인핸서, 번역 및 전사 억제물질, 서열을 활성화하는 위쪽, 및 mRNA 불안정 결정소를 포함한다. 몇몇의 이들 후자 인자는 코딩 영역에 가까운 쪽에 위치할 수 있다.
본 명세서 본문에서, 용어 "조절 인자" 또는 "조절 영역"은 전형적으로 DNA의 서열은, 보통, 항상은 아니지만, 특정 자리에서 시작하는 전사에 요구되는 RNA 폴리머라제 및/또는 다른 인자에 대한 인식을 제공함으로써 코딩 영역의 발현을 조절하는 구조적 유전자의 코딩 서열의 위쪽(5')을 언급한다. 그러나, 인트론 내에 위치하는 다른 뉴클레오티드 서열, 또는 서열의 3'은 또한 관심의 코딩 영역의 발현의 조절에 기여할 수 있는 것으로 이해된다. 특정 자리에서 개시를 보증하기 위한 RNA 폴리머라제 또는 다른 전사 인자의 인식을 제공하는 조절 인자의 예는 프로모터 인자이다. 대부분, 모두는 아니지만, 진핵 프로모터 인자는 TATA 박스, 보통 전사 시작 자리의 대략 25개의 염기쌍의 위쪽에 위치하는 아데노신 및 티미딘 뉴클레오티드 염기 쌍으로 구성되는 보존된 핵산 서열을 함유한다. 프로모터 인자는 전사의 개시 뿐 아니라 유전자 발현을 조절하는 다른 조절 인자(상기 열거됨)에 책임이 있는 기초 프로모터 인자를 포함한다.
발달적으로 조절되고, 유도성 또는 구조성인 것을 포함하는 몇몇 형태의 조절 영역이 있다. 발달적으로 조절되는 또는 그것의 조절하에서 유전자의 다른 발현을 조절하는 조절 영역은 기관 또는 조직의 발달 동안 특이적 시간에 특정 기관 또 는 기관의 조직 내에서 활성화된다. 그러나, 발달상 조절되는 일부 조절 영역은 바람직하게는 특이적 발달 단계에서 특정 기관 또는 조직 내에서 활성일 수 있고, 그것들은 또한 발달상 조절된 방법 또는 마찬가지로 식물 내에서 다른 기관 또는 조직의 기초 수준에서 활성일 수 있다. 조직-특이적 조절 영역, 예를 들어, 시각 특이적(see-specific) 조절 영역의 예는 나핀 프로모터 및 크루시페린 프로모터를 포함한다(Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130).
유도성 조절 영역은 유도인자에 응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 유도인자의 부재에서, DNA 서열 또는 유전자는 전사될 수 없다. 전형적으로 전사를 활성화하기 위한 유도성 조절 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재할 수 있으며, 이는 그 후 유도인자에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 그러나, 단백질 인자는 또한 부재일 수 있다. 유도 인자는 단백질, 대사물질, 성장 조절인자, 제초제 또는 페놀 화합물 또는 열, 냉기, 염에 의해 부과된 생리적 스트레스, 또는 독성 인자 또는 간접적으로 병원균의 작용을 통해 또는 바이러스와 같은 질병 약제와 같은 화학적 약제일 수 있다. 유도성 조절 영역을 함유하는 식물 세포는 스프레이, 물, 열 또는 유사한 방법에 의하는 것과 같은 세포 또는 식물에 유도인자를 외부로부터 적용함으로써 유도 인자에 노출될 수 있다. 유도성 조절 인자는 식물 또는 비-식물 유전자로부터 유도될 수 있다(예를 들어, Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; 참고로써 포함됨). 잠재적인 유도성 프로모터의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 테트라사이클린-유도성 프로모터(Gatz, C, 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; 참고로써 포함됨), 스테로이드 유도성 프로모터(Aoyama, T. and Chua, N. H. ,1997, Plant J. 2, 397-404; 참고로써 포함됨) 및 에탄올-유도성 프로모터(Salter, M. G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, 참고로써 포함됨) 시토키닌 유도성 IB6 및 CKI1 유전자(Brandstatter, I. and Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; 참고로써 포함됨) 및 옥신 유도성 인자, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971 ; 참고로써 포함됨)를 포함한다.
구조적 조절 영역은 식물의 다양한 부분을 통한 그리고 지속적으로 식물 발달을 통한 유전자의 발현을 지시한다. 공지된 구조적 조절 인자의 예는 CaMV 35S 전사와 관련되는 프로모터(Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), 쌀 액틴 1 (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1 155-1165), 액틴 2 (An et al, 1996, Plant J, 10: 107-121), 또는 tms 2 (U.S. 5,428,147, 참고로써 포함됨), 및 트리오세포스페이트 이소머라제 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자(Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 애기장대(Arabidopsis) 유비퀴틴 1 및 6 유전자(Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637- 646), 및 담배 번역 개시 인자 4A 유전자 (Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004)를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "구조성"은 구 조적 조절 영역의 조절하에서 유전자는 모든 세포 형태에서 동일한 수준에서 발현되지만, 유전자는 비록 변화가 풍부하게 종종 관찰된다 할지라도 세포 형태의 야생 범위에서 발현된다.
하나 이상의 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 또는 구조체 또는 본 발명의 벡터에 의해 변환되는 어떤 적당한 식물 숙주에서 발현될 수 있다. 적당한 숙주의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 알팔파, 카놀라, 브라시카 종(Brassica spp.), 옥수수, 담배, 알팔파, 감자, 인삼, 완두, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기 및 목화를 포함하는 농작물을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포 또는 종자를 제공한다. 따라서, 식물, 식물 세포 또는 종자는 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP- Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하며, 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역과 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 Neu5 Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 식물에서 활성인 하나 이상의 조절 영역과 작용하도록 연결된 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포, 또는 종자를 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 키메릭 유전자 구조체는 3'의 미번역 영역을 추가로 포함할 수 있다. 3' 미번역 영역은 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현을 초래할 수 있는 폴리아데닐레이션 신호 및 어떤 다른 조절 신호를 함유하는 DNA 세그먼트를 포함하는 유전자의 부분을 언급한다. 폴리아데닐레이션 신호는 보통 mRNA 선구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙의 첨가를 초래하는 것을 특징으로 한다. 폴리아세닐레이션 신호는 비록 변화가 흔하지는 않지만, 표준형 5' AATAAA-3'에서 상동성의 존재에 의해 흔히 인식된다. 본 발명의 하나 이상의 키메릭 유전자 구조체는 또한 번역 또는 전사 인핸서인 추가의 인핸서가 요구 될 수 있다면 포함될 수 있다. 이들 인핸서 영역은 당업계에 공지되어 있으며 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈은 완전한 서열의 번역을 보장하기 위해 서열을 코딩하는 리딩 프레임과 함께 동상(in phase)에 있어야 한다.
적당한 3' 영역의 비제한적 예는 노팔린 신타제(Nos gene)와 같은 (Ti) 플라스미드 유전자를 유도하는 아그로박테리움 종양의 폴리아데닐레이션 신호 및 대두 저장 단백질 유전자와 같은 식물 유전자 및 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제(ssRUBISCO) 유전자의 소단위를 함유하는 3' 전사된 비-번역 영역이다.
변형된 식물 세포의 확인에 도움을 주도록, 본 발명의 구조체는 식물 선택 마커를 포함하도록 추가로 조종될 수 있다. 유용한 선택 마커는 항생물질, 예를 들어, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신 또는 제초제, 예로써, 포스피노트리신, 글리포세이트, 클로로술푸론 등과 같은 화학물질에 대한 저항성을 제공하는 효소를 포함한다. 유사하게, GUS (베타-글루쿠로니다제), 또는 발광제, 예로써, 루시 퍼라제 또는 GFP와 같이 색 변화에 의해 화합물의 생성을 확인할 수 있도록 제공하는 효소가 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 고려되는 부분은 본 발명의 키메릭 유전자 구조체를 함유하는 유전자 변환 식물, 식물 세포 또는 종자이다. 식물 세포로부터 전체 식물을 재생하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 변형된 식물 세포는 적절한 배지에서 배양되며, 이는 항생물질과 같은 선택 약제를 함유할 수 있고, 선택 마커는 변형된 식물 세포의 확인을 용이하게 하도록 사용된다. 일단 캘러스(callus) 형태, 묘조(shoot) 형성은 공지된 방법에 따라서 적절한 식물 호르몬을 사용함으로써 촉진될 수 있고 묘조는 식물의 재생을 위해 뿌리 배지로 전달된다. 그 후 식물은 종자로부터 또는 영양번식 기술을 사용하여 반복적 생식을 확립하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 변환 식물은 또한 조직 배양을 사용하지 않고 발생될 수 있다.
본 발명의 조절 인자는 또한 형질전환 또는 일시적 발현에 순응하는 숙주 유기체의 범위 내에서 발현을 위한 관심의 코딩 영역과 함께 합쳐질 수 있다. 이러한 기관은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 식물들, 외떡잎식물과 쌍떡잎식물 두 가지 모두, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 옥수수, 곡류 식물, 밀, 보리, 귀리, 담배, 브라시카, 대두, 콩, 완두, 알팔파, 감자, 토마토, 인삼 및 애기장대를 포함한다.
일시적 발현, 형질전환 및 이들 유기체의 재생은 당업계에서 확립되어 있으며 당업자에게 공지되어 있다. 형질전환된 및 재생된 식물을 획득하는 방법은 본 발명에서 중요하지 않다.
"형질전환"은 유전자형적으로, 표현형적으로 또는 두 가지 모두로 명시되는 유전적 정보의 이종간 전달을 의미한다. 숙주에 대한 키메릭 구조체로부터 유전적 정보의 이종간 전달은 유전성일 수 있고, 유전적 정보의 전달은 안정하게 생각되며, 또는 전달은 일시적일 수 있고 유전적 정보의 전달은 유전가능하지 않다. 본 발명은 추가로 안정 또는 일시적인 발현 시스템과 사용에 적합한 키메릭 유전자 구조체를 포함하는 적당한 벡터를 포함한다.
본 발명의 구조체는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미량주사법, 전기천공법 등을 사용하여 식물 세포로 도입될 수 있다. 이러한 기술의 검토를 위해서는 예를 들어, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); 및 Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)를 참고. 다른 방법들은 직접 DNA 흡입, 리포좀의 사용, 전기천공법, 예를 들어, 원생동물을 사용, 미세주입법, 미세발사체 또는 휘스커(whisker) 및 진공 침투를 포함한다. 예를 들어, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91 : 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), 미국 특허 번호 4,945,050; 5,036,006; 및 5,100,792, 1995년 5월 10일 출원된 미국 출원 일련 번호 08/438,666 및 1992년 9월 25일 출원된 07/951,715(모두 참고로써 본원에 포함됨)를 참조.
하기 기재된 바와 같이, 일시적 발현 방법은 본 발명의 구조체를 발현하는데 사용될 수 있다(Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348 참조; 본원에 참고로써 포함됨). 이들 방법은 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아그로-접종 또는 아그로-침윤의 방법을 포함할 수 있지만, 그러나, 다른 일시적인 방법은 또한 상기 주목한 바와 같이 사용될 수 있다. 아그로-접종 또는 아그로-침윤과 함께, 원하는 핵산을 포함하는 아그로 박테리아의 혼합물은 조직의 세포 내 공간, 예를 들어, 잎, 식물의 기생 부분(줄기, 잎, 꽃을 포함), 식물의 다른 부분(줄기, 뿌리, 꽃) 또는 전체 식물에 들어간다. 표피를 가로지른 후 아그로박테리아(Agrobacteria)는 t-DNA 복제물을 세포안으로 감염시키거나 전달한다. t-DNA는 에피좀으로 전사되고 mRNA는 번역되고, 감염된 세포에서 관심의 단백질의 생산을 이끌지만, 핵 내부의 t-DNA의 통로는 일시적이다.
"관심의 유전자", "관심의 뉴클레오티드 서열" 또는 "관심의 코딩 영역"은 숙주 유기체, 예를 들어, 식물 내에서 발현되는 어떤 유전자, 뉴클레오티드 서열 또는 코딩 영역을 의미한다. 이들 용어는 교대로 사용된다. 이러한 관심의 뉴클레오티드 서열은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 유전자 또는 코딩 영역을 포함할 수 있고, 그것의 제품은 먹이, 음식 또는 먹이와 음식 모두에 사용을 위한 공업용 효소, 단백질 보충제, 기능식품, 부가가치 제품 또는 그것의 일부분이다. 뉴클레오티드 서열 또는 관심의 코딩 영역은 또한 약학적으로 활성인 단백질, 예를 들어, 성장 인자, 성장 조절자, 항체, 항원, 및 그것의 단편을 암호화하는 유전자 또는 면역화 또는 백신화 등에 유용한 그것들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인터류킨, 예를 들어, 하나 이상의 IL-1 내지 IL-24, IL-26 및 IL-27, 시토킨, 에리스로포이에틴 (EPO), 인슐린, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF 또는 그것의 조합, 인터페론, 예를 들어, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 혈액 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX 또는 tPA hGH, 수용체, 수용체 작용제, 항체, 뉴로폴리펩티드, 인슐린, 백신, 성장인자, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상피 성장인자, 각질세포 성장인자, 형질전환 성장인자, 성장 조절자, 항원, 자기 항원 그것의 일부분 또는 그것의 조합을 포함한다.
관심의 유전자가 식물에 직접 또는 간접적으로 독성인 생성물을 암호화한다면, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 이러한 독성은 식물 발달의 원하는 조직 내에서 또는 원하는 단계에서 관심의 유전자를 선택적으로 발현시킴으로써 식물을 통해 감소될 수 있다.
관심의 코딩 영역 또는 관심의 뉴클레오티드 서열은 형질전환된 어떤 적당한 식물 숙주에서 발현되거나 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 핵산 분자 또는 유전자 구조체 또는 본 발명의 벡터를 포함할 수 있다. 적당한 숙주의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 애기장대, 카놀라, 브라시카 종(Brassica spp.), 옥수수, 담배, 알팔파, 감자, 인삼, 완두, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기 및 목화를 포함하는 농작물을 포함한다.
시알산 합성, 예를 들어, Neu5Ac 합성은 식물에서 재조합 Neu5Ac 리아제 또는 Neu5Ac 신타제를 발현함으로써 증명되었다. E. coli로부터의 Neu5 Ac 리아제 및 C. jejuni로부터의 NeuB2는 담배 BY2 세포, 아그로박테리움-매개 형질전환에 의한 알팔파 식물의 시토졸에서 각각 발현되었고 또는 식물 세포에서 일시적으로 발현되었다. 어떤 재조합 단백질의 분해도 이들 효소가 이 구획에서 안정함을 나타내는 것으로 관찰되지 않았다. BY2 세포에서 발현되는 Neu5Ac 리아제는 가역 반응에서 Neu5Ac의 D-ManNAc과 피루브산으로의 분해를 촉매할 수 있다. 피루브산과 ManNAc의 존재에서 Neu5Ac의 합성이 또한 관찰되었다. Neu5Ac 리아제는 식물 시토졸의 pH와 가장 중요한 작물의 온도 두 가지 모두 일관된 pH 7 및 25-37℃ 이상에서 생물학적으로 활성이다. 추가로, 외인성의 Neu5Ac의 존재에서 수행되는 먹이 실험은 효소가 식물체 내에서 기능적임을 증명하였다.
Neu5Ac 신타제, C. jejuni로부터의 NeuB2는, 담배 BY2 세포가 발현될 때 D-ManNAc와 PEP의 존재에서 Neu5Ac를 합성하는 것이 관찰되었다. 알팔파 식물에서 NeuB2의 발현은 또한 기능적 효소의 축적을 야기하였다. 따라서, 식물 내에서 미생물 Neu5Ac 리아제 또는 Neu5Ac 신타제의 발현은 Neu5Ac를 합성할 수 있는 효소의 시토졸 내 생성을 야기한다.
내생의 GlcNAc를 ManNAc로 변환할 수 있는 에피머라제는 적절한 아미노당 기질과 함께 Neu5Ac 리아제 또는 Neu5Ac 신타제를 공급하기 위해 식물에서 공동-발현될 수 있다. 이와 관련하여, 담배 BY2 세포에서 기능적 CMP-Neu5Ac 신타제와 CMP-Neu5Ac 트랜스포터의 발현이 보고되었다(Misaki et al., 2006). CMP-Neu5Ac 신타제, CMP- Neu5 Ac 트랜스포터, 또는 CMP-Neu5 Ac 신타제와 CMP-Neu5 Ac 트랜스포터 두 가지 모두를 NeuB2와 함께 공동-발현함으로써 Neu5Ac의 생성이 향상될 수 있다. 식물 내 N-아세틸만노사민(ManNAc) 합성은 몇몇 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, ManNAc는 식물 내에서 발현에 의해 합성될 수 있으며, UDP-GlcNAc 2-에피머라제, 예를 들어 박테리아 UDP-GlcNAc 2-에피머라제는 가역반응에서 UDP-GlcNAc를 ManNAc로 변환한다. UDP-GlcNAc는 N-글리칸 합성 경로를 공급하기 때문에 시토졸에서 존재한다. ManNAc 합성은 또한 GlcNAc-2 에피머라제를 발현함으로써 다른 근원으로부터 달성될 수 있다. 또 다르게는, ManNAc-6-포스페이트는 형성된 후, 포스파타제와 함께 가수분해에 의해 형성될 수 있다(유전자 변환 식물에서). 이 접근으로 GlcNAc-6-포스페이트 2-에피머라제, 예를 들어 박테리아 GlcNAc-6-포스페이트 2-에피머라제 또는 포유동물 UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제는 식물 내에서 발현된다.
시토졸 시알산으로부터 N-글리칸의 시알산화를 보증하기 위해, 박테리아 또는 포유동물 CMP-Neu5Ac 신타제, 포유동물 CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 포유동물 갈락토실트랜스퍼라제, 및 포유동물 시알릴트랜스퍼라제는 식물 내에서 공동-발현될 수 있다(Misaki, R., et. Al. 2006).
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 예시될 것이다.
방법
합성 FLAG 서열 폴리펩티드(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; SEQ ID NO:1)에 대해 지시된 다클론성 항체를 유로젠텍(Eurogentec)(Seraing, Belgium)에서 토끼에서 준비하였다. C18 Bond-Elut 카트리지는 Varian (Sugarland, TX)제 이었다. 대장균 DH5-알파 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 담배 세포 또는 메디카고 사티바(M. sativa) 각각의 클로닝 실험 및 형질전환에 사용하였다. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana Tabacum) 흔히 Bright Yellow 2 (BY-2) 세포를 Gomord et al. (1998)에서 기재한 바와 같이 재배하였다.
Neu5Ac 리아제 및 neuB2 유전자의 클로닝 및 식물 발현 벡터의 구조
Neu5Ac 리아제 및 neuB2 유전자를 PCR로 증폭하였다. Neu5Ac 리아제의 유전자를 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 E. coli K1 게놈 DNA로부터 증폭하였다:
리아제-P1:
5'-AATAGGCCATTACGGCCATGGCAACGAATTTACGTGG-3' (SEQ ID NO:6) 및
리아제-P2:
5'-AATAGGCCGAGGCGGCCTCACCCGCGCTCTTGCAT-3'(SEQ ID NO:7).
neuB2 유전자에 대해, 하기의 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 획득하였다:
neuB2-P1 :
5'-AATAGGCCATTACGGCCATGAAAAAAACTTTAATC-3' (SEQ ID NO:8) 및
neuB2-P2:
5'-AATAGGCCGAGGCGGCCTTACTCACGGATAAGCTC-3' (SEQ ID NO:9).
이들 증폭된 DNA들을 Neu5Ac 리아제 유전자에 대해 플라스미드 벡터 pDNR-LIB의 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터 및 neuB2 유전자에 대해 바이너리 플라스미드 벡터 pC AMBIA 2300 하에 각각 두었다. CaMV35S 프로모터, Neu5Ac 리아제, 및 노팔린 신타제 (Nos) 종결자의 발현 카세트를 카나마이신 저항 유전자와 함께 식물 발현 벡터 pBLTI 121 (Pagny et al., 2000)에 도입하였다.
pBLTI Neu5Ac 리아제-FLAG 및 pBLTI neuB2-FLAG 플라스미드를 발생시키기 위해, 단백질의 C-터미널 말단에서 암호화된 FLAG 펩티드와 함께 유전자를 증폭시키는 것으로 계획된 하기의 4개의 프라이머가 사용되었다:
리아제-FLAG-P1 :
5'-CGGGGTACCAGAGAGATGGCAACGAATTTACGTGGC-3' (SEQ ID NO:2),
리아제-FLAG-P2:
5'GCCGAGCTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCATCCCGCGCTCTTGCATCAACTG-3' (SEQ IDNO:3),
neuB2-YLAG-P1:
5'-CGGGGTACCAGAGAGATGAAAAAAACTTTAATCATCGC-3' (SEQ ID NO:4) 및
neuB2-FLAG-P2:
5'-GCCGAGCTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCATCTCACGGATAAGCTCATCTTC-3' (SEQ ID NO:5),
이들 증폭된 서열을 30 주기 동안 하기의 프로그램과 함께 PCR로 산출하였다: 1분 동안 94℃에서 변성, 58℃에서 1분 동안 어닐링, 및 3분 동안 72℃에서 중합. PCR 생성물을 pCR®-BLUNT II-TOPO® (Invitrogen)으로 클로닝하였다. 식물 세포 내에서 재조합 단배질을 발현하기 전에, 발명자들은 모든 변형된 cDNA 구조체를 시퀀싱에 의해 확인하였다. 이후에, 삽입물들을 KpnI 및 SacI로 동화시킨 후 KpnI-SacI-동화 pBLTI 121에 클로닝하였다. 각각의 벡터(pBLTI 121 또는 pCAMBIA 2300)를 열 충격 형질전환을 통해 아그로박테리움 투메파시엔스 균주에 도입하였다.
BY2 세포 내 발현
담배 BY2 세포를 Murashige와 Skoog (1962) 배지에서 유지하였고 형질전환을 위해 사용하였다. pBLTI121-유도 구조체를 아그로박테리움으로 전달하였다(LB A4404) (Hofgen and Willmitzer, 1988). 유전자 변환 아그로박테리움 세포를 100 μg.mL-1 카나마이신을 함유하는 YEB 배지에서 선택하였고 Gomord 등(1998)에서 기재한 바와 같이 담배의 현탁-배지 세포를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주를 선택하였고 항생물질(100 μg mL-1의 카나마이신 및 250 μg.mL-1의 세포탁심)을 함유하는 MS 배지에서 유지하였다. 게놈 DNA 및 mRNA를 각각의 형질전환주로부터 제조하였고, 관찰한 유전자를 PCR 및 RT-PCR에 의해 담배 현탁-배양 세포에 삽입하고 발현시킨 것을 확인하였다. 면역 스크리닝 후, 재조합 단백질을 생성하는 마이 크로칼리를 유전자 변환 세포의 현탁 배지를 개시하는데 하용하였다(Gomord et al., 1998).
알팔파 식물에서 발현
알팔파 형질전환을 하기의 변형과 함께 Tian 등 (Tian et al., 2002)에 기재되는 바와 같이 필수적으로 수행하였다. 알팔파 유전자형 R2336을 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL1을 사용하여 형질전환하였다. 공동-배지 단계를 0.8 내지 1 OD에서 희석하지 않은 배지로 수행하였고 3% 수크로오스를 Sh2K 배지에서 1.5% 수크로오스 대신에 사용하였다.
Neu5Ac 리아제 및 NeuB2 활성의 분석을 위한 세포 추출물의 제조
4일 배양의 형질전환주의 BY2 현탁액-배양 세포의 1 그램 또는 M. sativa 600mg의 신선한 잎을 채취하였고 프로테이나제 억제제(펩스타틴 1 μg.mL-1, E64 1 μg.mL-1 및 PMSF 1 mM, Sigma)를 함유하는 용액 A(100 mM 트리스-HCl 완충제 (pH=7.4))에서 분쇄하였다. 세포 추출물을 그 후 10000 g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였고, 단백질을 황산 암모늄(최종 농도 80%)으로 침전시킨 후 용액 B(100 mM 트리스-HCl 완충제, Neu5Ac 리아제 분석에 대해 pH=7.4 또는 NeuB2 분석에 대해 pH=8.5 및 10 mM MgCl2)에 대해 Spectra/Por® 막 (차단 10000 Da)으로 투석하였다. 그 후 단백질을 효소 분석 또는 면역검출을 위해 사용하였다.
Neu5Ac 리아제 - FLAG 및 NeuB2 - FLAG 의 면역검출
단백질을 변형 완충제(20 mM 트리스-HCl pH 6.8, 0.3% β-머캅토탄올, 5% (v/v) 글리세롤 및 1% (w/v) SDS),에서 가용화하였고, 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 그 후 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 면역검출을 위해, 막을 FLAG 에피토프에 대해 상승된 토끼 항혈청과 함께 프로빙하였다. 단백질을 호스래디쉬 퍼옥시다제와 결합된 염소 항-토끼 항체와 함께 배양에 의해 검출한 후 4-클로로나프톨을 사용하여 또는 화학발광 반응으로 나타내었다.
Neu5Ac 리아제 및 신타제 분석
가용성 효소 활성을 PEP 4 mM, NADH 4 mM, NaHCO3 20 mM 및 DTE 10 mM와 함께 세포 추출물을 배양함으로써 분석하였다. NADH의 산화를 10분 후 340 nm에서 흡광도의 감소에 의해 측정하였다. Neu5Ac 리아제의 리아제 활성을 Neu5Ac와 함께 형질전환 세포 추출물을 배양한 후 ManNAc의 형성을 측정함으로써 분석하였다. 세포 추출물을 37℃에서 2시간 동안 프로테이나제 억제제(펩스타틴 1 μg.mL-1, E64 1 μg.mL-1 및 PMSF 1 mM) 및 Neu5Ac 40 mM을 함유하는 용액 B(100 mM 트리스-HCl 완충제, pH=7.4 및 10 mM MgCl2)에서 배양하였다. Neu5Ac 리아제의 신타제 활성을 ManNAc 및 피루브산과 함께 형질전환 세포 추출물을 배양한 후 Neu5Ac의 형성을 측정함으로써 분석하였다. 세포 추출물을 37℃에서 2시간 동안 프로테이나제 억제제(펩스타틴 1 μg.mL-1, E64 1 μg.mL-1 및 PMSF 1 mM) 및 ManNAc 20 mM 및 피루브산 40 mM을 함유하는 용액 B(100 mM 트리스-HCl 완충제, pH=7.4 및 10 mM MgCl2)에서 배양하였다. NeuB2의 신타제 활성을 ManNAc 및 PEP와 함께 형질전환 세포 추출물을 배양한 후 Neu5Ac의 형성을 측정함으로써 분석하였다. 세포 추출물을 37℃에서 2시간 동안 프로테이나제 억제제(펩스타틴 1 μg.mL-1, E64 1 μg.mL-1 및 PMSF 1 mM) 및 ManNAc 10 mM 및 PEP 10 mM를 함유하는 용액 B(100 mM 트리스-HCl 완충제, pH=7.4 및 10 mM MgCl2)에서 배양하였다. 반응을 5분 동안 80℃에서 가열함으로써 중단하였고 C18 Bond-Elut 카트리지에서 물과 함께 연속적인 용리로 정제하였고, 동결건조하고 GC-EI-MS 분석을 위해 유도하였다.
피딩 실험
4일령의 담배 BY2 세포를 2일 동안 37℃에서 Neu5Ac 10 mM 또는 ManNAc 30 mM와 함께 BY2 배지에서 배양하여 생체 내에서 Neu5Ac 리아제 또는 신타제 활성을 각각 분석하였다. 2일 후, BY2 세포를 Neu5Ac 또는 ManNAc 없이 BY2 배지와 함께 세척하였고 채취하였다. 세포를 70℃에서 15분 동안 70% 에탄올 중에 불활성 효소에 대해 가열한 후 포터 호모게나이저에 두었다. 호모제네이트를 70% 에탄올로 70℃에서 2회 세척하였다. 남은 펠렛 및 상청액을 각각 세포벽 및 시토졸 프리 단당류의 대표물로서 생각하였다. 상청액 분획의 단당류를 그 후 기체 크로마토그래피로 분석하였다.
GC 분석
효소 분석을 위해, 반응 혼합물을 우선 C18 셉팩(Seppack) 카트리지 상의 정제 단계를 받게 했다. 단당류를 100% 물에서 용리하였다. 동결건조 후, 샘플을 2M 메탄올릭-HCl의 건조 500 μL와 함께 80℃에서 16시간의 메탄올분해를 받도록하였다. 메탄올의 증발 후, 샘플을 20μL의 무수 아세트산 무수물 및 20μL의 피리딘의 첨가에 의해 재-아세틸화하였다. 결과의 N-아세틸 메틸 글리코시드(메틸 에스테르)를 건조시킨 후 그것의 TMS-유도체로 변환하고 기체 크로마토그래피(GC)로 분리하였다. 기체 크로마토그래피를 불꽃 이온화 검출기, 고정상으로서 CP-Sil 5 CP를 가지는 WCOT 융합 실리카 캐필러리 컬럼(capillary column)(길이 25 m, 내부직경 0.25 mm) 및 기체 벡터로서 헬륨과 함께 장착하였다. 오븐 온도 프로그램은: 120℃에서 2분, 160℃까지 10℃ /min , 및 220℃까지 1.5℃/min 그 다음에 280℃까지 20℃/min이었다. 당의 수량화는 표준 단당류와 함께 확립된 반응 인자를 사용하여 피크의 통합 및 대응하는 몰 값의 결정에 의하였다.
식물에서 일시적 발현
아그로박테리움 성장. 상기 기재한 원하는 DNA 구조체를 지지하는 바이너리 벡터를 함유하는 아그로박테리움 클론을 각각 25 및 50 μg/mL의 카르베니실린 및 카나마이신을 함유하는 2 mL의 YEB 또는 LB 배지에서 24 시간 동안 28℃에서 성장시켰다. 10 μL의 이들 배지를 시작 접종원으로서 사용하여 25 mL의 YEB 유도 배지(YEB 배지, 10 mM 2 (N 모르폴리노) 에탄술폰산 (MES), pH는 5.6으로 조절, 25 mg/L 카르베니실린, 50 mg/L 카나마이신, 20 μM 아세토시링온)의 배양을 초래하였다. 후자를 로타리 쉐이커(220rpm) 배양기 내 28℃에서 18시간 동안 또는 600 nm (OD600)에서 광학 밀도가 0.8 내지 1에 도달할 때까지 성장시켰다.
비-유전자 변환 담배의 성장. 니코티아나 벤타미아나(Nicotianabenthamiana) 및 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물을 온실에서 이탄계 기질(AgroMix)에서 종자로부터 성장시켰다. 묘목을 처음에 묘포에서 성장시켰고 후에 화분에 옮겼다. 식물을 1일 2회 물을 주었고 각 적용에 180 ppm의 질소를 받았다. 온실 조건을 20 Watt m-2의 인공 조명을 가지는 긴 하루 광주기 기간(16시간 명/8시간 암 주기)하에서 낮 동안 25℃ 및 밤 동안 21℃에서 유지하였다. 식물은 다른 성장 단계로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 5 내지 8주의 성장을 선택하였다.
담배에서 구조체의 일시적 발현. 2개의 일시적 발현 방법을 본 발명에서 사용하였다: 아그로-접종 또는 아그로-침윤. 두 가지 방법 모두에서, 관심의 운반-DNA(t-DNA)를 지지하는 2 또는 3개의 아그로박테리아 배양의 혼합물은 잎의 세포내 공간으로 들어가도록 하였다. 일단 표피의 물리적 장벽이 교배되면, 아그로박테리아는 식물 세포로 t-DNA를 옮기는 이웃 세포를 감염시킨다. 이 방법에서, 핵 내부의 t-DNA 통로는 일시적이고, t-DNA 상에 존재하는 유전자는 에피솜으로 전사되고 mRNA는 번역되고, 감염된 세포에서 관심의 단백질의 생성을 이끈다. 아르고-접종 기술은 식물 조직 내에서 아그로박테리아 혼합물을 삽입하는 시린지로 적용되는 압력을 사용하는 반면, 아르고 침윤은 조절된 진공을 사용한다.
앞서 기재한 바와 같이 제조한 아그로박테리움 배양을 8분간 10 000 g 에서 원심분리하고, 동일 부피의 배양 매질(10 mM MgC12, 10 mM MES, pH 5.6로 조절, 및 100 μM 아세토시링온으로 보충)에서 재현탁하였고, 배양에 앞서 1시간 동안 실온(RT, 23℃)으로 유지하였다. 또 다르게는, 현탁액을 배양에 앞서 4℃에서 24시간 동안 유지할 수 있다. N. 벤타미아나 및 N. 타바쿰의 일시적 형질전환을 하기의 변형으로 Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348)에서 기재한 바와 같이 필수적으로 수행하였다. 상기 기재한 구조체의 발현을 위해 2개의 아그로박테리아 균주를 배양하였다. 35S 프로모터의 조절하에서 제1 균주는 상기 기재한 클론 중 하나를 함유하였고 제2 균주는 Potato Virus Y로부터 침묵의 HcPro 억제자를 함유하였다. 접종 후, 식물을 온실에서 배양하였다. 온도를 낮동안 최소 23℃ 및 밤동안 21℃로 유지하였다. 식물을 1일 2회 물을 주었고 각 적용에 180ppm의 질소를 받았다. 바이오매스의 채집을 4-8일 후 시작하였다.
형질전환된 바이오매스로부터 가용성 단백질 추출물의 제조. 바이오매스를 채취 후 또는 -80℃에서 냉동 후 잎을 직접 분석하였다. ~0.1-1 g의 아르고-접종 또는 아르고-침윤된 잎의 바이오매스를 무게를 달았고 전체 단백질 액체 추출물을 산출하는데 사용하였다.
하기의 몇몇의 추출 방법을 전체 단백질 추출물을 산출하는데 사용하였다: 막자사발로 식물 조직을 분쇄, 폴리트론을 사용, 또는 Retsch제의 MixerMill300 (MM300)에서 그것을 분쇄. 0.1-1 g의 식물 바이오매스를 깨끗하고 사전-냉각시킨 막자사발에 옮겼다. 차가운 추출 완충제(트리스 50 mM, 2 mM CaCl2 및 4% 부탄올를 함유하는 NaCl 150 mM pH 7.4 완충제)를 1:3 비율 (w/v)에서 뿐 아니라 PMSF 및 키모스타틴을 각각 1 mM 및 10 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 균질한 제제가 획득될 때까지 잎을 막자로 분쇄하였다. 식물 추출물을 그 후 1.5mL 마이크로튜브 안으로 옮겼고 20,00Og으로 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 또 다르게는, 0.3 mL의 추출 완충제와 함께 O.1g의 식물 조직을 비-멸균 1.5 마이크로튜브로 도입하였다. 텅스텐 비드를 각 튜브에 첨가하였다. 박스를 30 Hz에서 3분 주기의 교반을 받게 하였다. 주기를 2회 반복하였다. 식물 추출물을 그 다음에 상기 기재한 바와 같이 원심분리하였다. 또 다르게는, 1g의 바이오매스를 폴리트론을 사용하여 3mL의 추출 완충제와 함께 분쇄하였다.
하기의 원심분리, 상청액을 깨끗한 마이크로튜브에 옮겼고 얼음에서 유지하였다. 최종적으로 개개의 단백질 추출물의 전체 단백질 함량을 기준 단백질로서 BSA를 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.
실시예 1
담배 BY2 세포에서 E. coli Neu5Ac 리아제의 발현
대장균 K1 (accession number: D00067)로부터 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 유전자를 담배 BY2 세포에 도입하였다. 유전자 변환 BY2 칼리를 E. coli K1 Neu5 Ac 리아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pBLTI121를 가지는 아그로박테리움 매개 형질전환 후 산출하였다. 다른 구조체를 FLAG 에피토프를 가지는 그것의 C-말단에서 태그하여 형질전환주에서 재조합 단백질의 면역검출을 하였다. 카나마이신 저항성에 대해 선택된 형질전환주를 RT-PCR으로 mRNA 수준에 대해 분석하였다. Neu5Ac 리아제 전사를 발현하는 48개의 형질전환주로부터 36개 및 Neu5Ac 리아제-FLAG 전사를 발현하는 50개의 형질전환주로부터 30개를 획득하였다. 가장 높은 mRNA 발현 수준을 품고 있는 칼리를 Neu5Ac 리아제 활성의 특성화를 위한 현탁 배양에 전달하 였다. Neu5Ac 리아제-FLAG의 존재를 웨스턴-블롯 분석에 의해 형질변형된 BY2 세포의 단백질 시토졸 추출물에서 결정하였다. 명백한 32 kDa 분자량을 가지는 단일 단백질 밴드를 항-FLAG 항체를 사용하여 형질전환된 세포에서 특이적으로 면역검출하였다(도 1a).
효소 분석을 Neu5Ac 리아제 및 Neu5Ac 리아제-FLAG를 발현하는 현탁액-배양 BY2 세포로부터 가용성 단백질 추출물 상에서 수행하였다. 추출물은 모두 리아제 활성을 나타내었다. 추가 분석을 비-태그된 리아제를 발현하는 세포로부터 분리한 단백질 추출물 상에서 수행하였다. 이들 추출물을 그것의 리아제 활성을 조사하기 위해 Neu5Ac의 존재에서 우선 배양하였다. 도 1b 및 1c는 pH 7 및 37℃에서 Neu5Ac 의 부재(도 1b) 또는 존재(도 1c)에서 Neu5Ac 리아제 단백질 추출물을 배양함으로써 형성되는 최종-생성물의 GC 프로필을 보여준다. 3개의 신호(피크 1, 내생적 신호의 숄더이다)를 추출물을 Neu5Ac와 함께 배양하였을 때 명확하게 검출하였다. 이들 신호를 표준 ManNAc의 피라노오스(피크 1) 및 푸라노오스(피크 2 및 3)의 것과 유사한 보유 시간에서 용리하였다. 샘플의 전자 충격 질량 분석법(GC-EI MS)과 결합된 기체 크로마토그래피는 ManNAcp (도 1e) 및 ManNAcf(도 1f)의 1-O-메틸 퍼실릴 유도체에 대해 이들 신호의 할당을 확인하였다. m/z = 173 및 186에서 특징적인 이온을 보통 아미노당에 대해 관찰한 바와 같은 질소 원소를 함유하는 단편에 할당하였다.
유사한 조건에서 Neu5Ac와 함께 야생형 담배 BY2 세포로부터의 시토졸 단백질 추출물의 배양은 ManNAc (데이타는 나타내지 않음)의 어떤 형성을 야기하지 않 았고, 따라서 식물 내 내생 리아제 활성의 부재를 증명하였다. 이 데이터는 BY2 세포가 Neu5Ac를 D-ManNAc로 쪼갤 수 있는 기능적 효소를 발현하는 E. coli Neu5Ac 리아제 유전자와 함께 형질전환됨을 나타낸다.
4-10 pH 범위(데이타는 나타내지 않음)에서 수행된 분석에서 산출된 D-ManNAc GC 양화(quantification)에 기초하여 재조합 효소의 최적의 pH를 약 7이 되도록 결정하였다. 게다가, 재조합 효소는 25-37℃ 범위에서 높은 리아제 활성을 가지는 온도 의존적 활성을 나타내었다. pH 7 및 37℃에서, 형질전환된 세포로부터의 가용성 단백질 추출물은 1시간 후 10 μ몰의 Neu5Ac로부터 0.5 μ몰을 형성하였다. 15℃ 이하에서, 유일한 잔여 활성을 검출하였다.
Neu5 Ac를 합성하기 위한 재조합 Neu5 Ac 리아제의 능력을 pH 7 및 37℃에서 D-ManNAc 및 피루브산과 함께 형질전환된 담배 BY2 세포의 단백질 추출물을 배양함으로써 결정하였다. 도 2a 및 도 2b는 각각 기질의 부재 또는 존재에서 배양 후 최종-생성물의 GC 프로필을 나타낸다. 대조구 프로필(도 2a)와 비교할 때, D-ManNAc 및 피루브산의 존재에서 수행된 반응의 GC 프로필은 Neu5Ac에 대해 기대한 보유 시간에 신호를 나타냈다(도 2b의 박스). 이 신호의 전자 충격 질량 분석(EI MS)은(도 2c) Neu5Ac에 특이적인 m/z =298 및 420에서 특징적인 이온 및 질소-함유 단편에 할당된 m/z = 186에서 이온을 나타내었다. 이 데이타는 재조합 리아제는 D-ManNAc 및 피루브산의 존재에서 Neu5 Ac를 합성할 수 있음을 나타낸다.
Neu5Ac 리아제의 식물 내 활성을 10 mM Neu5Ac과 함께 담배 BY2 세포를 피딩함으로써 결정하였다. 담배 BY2 세포 상의 Neu5Ac의 독성을 조사하였으며, 프로피 디움 요오드화물 및 플루오레세인 디아세테이트를 사용하여 세포 생존력을 시험함으로써 48시간의 기간에 걸쳐 어떤 독성 효과도 관찰되지 않았다. D-ManNA의 형성을 23℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 48시간 기간 후 GC로 시토졸 단당류를 분석함으로써 결정하였다. D-ManNAc를 모든 처리에서 검출하였다(도 1d). GC에 의한 D-ManNAc의 양화는 23℃와 비교하여 37℃에서 이 아미노당의 함량 중 25-배 증가를 나타내었다. 이들 생체 내 실험은 Neu5Ac 리아제가 식물에서 생물학적으로 활성이며 외생적으로 공급된 기질에서 작용할 수 있음을 증명한다.
담배 BY2 및 알팔파 식물에서 캄필로박터 ( Campylobacter jejuni ) NeuB2 의 발현
캄필로박터(Campylobacter jejuni)(등록 번호: NC002163)로부터의 Neu5Ac 신타제, NeuB2는 D-ManNAc 및 PEP의 축합에 의한 Neu5Ac의 형성을 촉매한다. 유전자 변환 BY2 칼리를 neuB2 cDNA를 함유하는 플라스미드 pBLTI121와 함께 아그로박테리움 매개 형질전환 후 발생시켰다. 단백질의 면역검출을 위해 제2 구조체를 FLAG 에피토프를 가지는 그것의 C-말단 끝에서 태그하였다. 카나마이신 저항성에 대해 선택된 형질전환주를 RT-PCR에 의해 mRNA 수준에 대해 분석하였다. 가장 높은 mRNA 발현 수준을 품고 있는 칼리를 분석을 위해 현탁액 배양에서 전달하였다. 형질전환된 BY2 세포에서 NeuB의 축적은 그 후 NeuB2-FLAG 서열과 함께 형질전환된 BY2 세포로부터 분리된 단백질 가용성 추출물의 웨스턴-블롯 분석에 의해 결정하였다. 도 3a에서 예시한 바와 같이, 항-FLAG 항체는 신타제의 기대된 분자량과 일치하는 MW=37 kDa에서 단일 단백질 밴드를 특이적으로 인식하였다. neuB2를 또한 아그로박 테리움-매개 형질전환에 의한 알팔파 식물 및 식물의 시험관 내 재생에 도입하였다(Tian et al., 2002). 34개의 형질전환된 식물로부터, 29개는 neuB2 전자를 발현하는 것으로 증명되었다.
박테리아 Neu5Ac 신타제를 발현하는 형질전환된 세포 및 식물의 분석에 앞서, 내생의 Neu5Ac 신타제 활성의 발생을 조사하였다. 야생형 담배 BY2 세포와 알팔파 식물 모두로부터 단백질 가용성 추출물을 D-ManNAc 및 PEP와 함께 배양하였다. 분석에서 형성된 단당류를 GC로 분리하였고 GC-EI MS에 의해 특성화된다. Neu5Ac에 할당된 어떤 피크 또는 EI MS 특징적 이온도 검출되지 않았고, 식물은 D-ManNAc에서 PEP의 축합에 의해 Neu5Ac를 형성할 수 있는 내생적 효소를 발현하지 않음을 나타내었다.
식물에서 발현된 재조합 NeuB2의 신타제 활성을 neuB2 유전자와 함께 형질전환된 담배 BY2 세포 또는 알팔파 식물로부터 분리된 가용성 단백질 추출물과 함께 D-ManNAc 및 PEP의 배양으로 결정하였다. 도 3b 및 3c는 pH=8 및 37℃에서 D-ManNAc 및 PEP가 없거나(도 3b) 또는 있는(도 3c) 형질전환된 알팔파 추출물의 배양에 의해 획득된 GC 프로필을 나타낸다. Neu5Ac에 대해 기대되는 보유 시간에서 용리된 피크를 신타제의 기질과 함께 배양 후 특이적으로 검출하였다. 이 피크의 EI MS는 m/z =298 및 420에서 특징적인 이온과 함께 표준 Neu5 Ac와 유사한 단편화 패턴을 나타내었다. 이 이온들은 D-ManNAc의 부재에서 배양 후 대응하는 영역의 GC 프로필의 EI-MS 스펙트럼에서 검출되지 않았다(도 3b).
동일한 결과를 NeuB2 또는 NeuB2-FLAG 서열을 발현하는 담배 BY2 세포의 분 석에 의해 획득하였다.
따라서, 담배 BY2 세포와 알팔파 식물 두 가지 모두에서 neuB 2의 발현은 기능적 Neu5 Ac 신타제의 생성을 야기하였다.
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모든 인용은 본원에 참고로써 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 기재하였다. 그러나, 많은 변형 및 변화가 청구항에 기재된 바와 같은 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 제공될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (30)

  1. i) N-아세틸 뉴라민산(Neu5Ac) 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절영역과 작용하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물을 제공하는 단계,
    ii) 식물을 성장시키고 뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써 시알산을 합성하는 단계를 포함하는 시알산을 합성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시알산은 Neu5Ac이고, 성장 단계 후, Neu5Ac는 식물로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제공 단계에서, 식물은 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터 중 한 가지 이상을 암호화하며, 식물 내에서 활성인 한 가지 이상의 제2 조절 영역과 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 공동-발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제2 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, Neu5Ac 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터 중 한 가지 이상을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. i) Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하는 식물을 제공하는 단계,
    ii) 식물을 성장시키고 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 시알산화된 관심의 단백질을 생성하는 단계를 포함하는 관심의 단백질을 생성하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 관심의 단백질은 2, 3 또는 4 안테나 N-글리칸을 포함하는 시알산화된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 성장 단계 후, 시알산화된 단백질은 식물로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 관심의 시알산화된 단백질은 분리되고 정제된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 성장 단계 후, 관심의 시알산화된 단백질을 포함하는 식물 물질은 피험자에게 경구적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 성장 단계 후, 식물은 최소한으로 처리되며, 시알산화된 관심의 단백질을 포함하는 최소한으로 처리된 식물 물질은 피험자에게 경구적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 시알산화된 관심의 단백질은 피험자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 한 가지 이상의 제1 뉴클레오티드, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레 오티드, 또는 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. Neu5 Ac 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하며, 식물 내에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 세포, 또는 종자.
  16. 제15항에 있어서, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하며, 식물, 식물 세포 또는 종자 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역에 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물, 식물 세포 또는 종자.
  17. 제16항에 있어서, 제1 및 제2 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물, 식물 세포 또는 종자.
  18. 제16항에 있어서, Neu5Ac 신타제 또는 Neu5 Ac 리아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5Ac 트랜스포터를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴 클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물, 식물 세포 또는 종자 내에서 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 식물, 식물 세포 또는 종자.
  19. Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드, 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드, 식물, 식물 세포 또는 종자에서 활성인 하나 이상의 조절 영역과 작용하도록 연결된 제1 및 제2 뉴클레오티드를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 종자.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 조절 영역은 구조적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물, 식물 세포 또는 종자.
  21. 제19항에 있어서, Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열, 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 또는 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 두 가지 모두는 식물, 식물 세포 또는 종자 내에서 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 식물, 식물 세포 또는 종자.
  22. N-아세틸 뉴라민산 (Neu5Ac) 신타제 또는 Neu5Ac 리아제를 암호화하며, 식물에서 활성인 조절 영역과 작용하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 가지는 식물 또는 식물의 부분을 일시적으로 형질전환하는 단계와, 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 시알산을 합성하는 단계를 포함하는 시알산을 합성하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 시알산은 Neu5Ac이고, 발현 단계 후, Neu5Ac는 식물 또는 식물의 부분으로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 식물 또는 식물의 부분을 일시적으로 형질전환하는 단계에서, 한 가지 이상의 에피머라제, CMP-Neu5 Ac 신타제, 또는 CMP-Neu5 Ac 트랜스포터를 암호화하며, 식물 내에서 활성인 하나 이상의 제2 조절 영역에 작용하도록 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 공동-발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. i) Neu5Ac 신타제, Neu5Ac 리아제, 에피머라제, CMP-Neu5Ac 신타제, CMP-Neu5Ac 트랜스포터, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 하나 이상의 제1 뉴클레오티드 서열 및 관심의 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 발현하는 구조체로 식물 또는 식물의 부분을 일시적으로 형질전환하는 단계, 및
    ii) 시알산화된 관심의 단백질을 생성하는 단계를 포함하는 관심의 단백질을 생성하는 방법,
  26. 제25항에 있어서, 관심의 단백질은 2, 3, 또는 4 안테나 N-글리칸을 포함하는 시알산화된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 생성 단계 후, 시알산화된 단백질은 식물 또는 식물의 부분으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 시알산화된 관심의 단백질은 분리 및 정제된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 생성 단계 후, 시알산화된 관심의 단백질을 포함하는 식물 물질은 피험자에게 경구적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제25항에 있어서, 식물 또는 식물의 부분을 생성하는 단계 후 최소한으로 처리하여 최소한으로 처리된 식물 물질을 생성하고, 시알산화된 관심의 단백질을 포함하는 최소한으로 처리된 식물 물질은 피험자에게 경구적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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