CN101466829A

CN101466829A - 唾液酸在植物中的合成

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Publication number: CN101466829A
Application number: CNA2007800111939A
Authority: CN
Inventors: T·帕卡雷特; M·巴多; C·里霍; V·戈莫德; L·费伊; P·勒鲁格; S·阿奎恩; L-P·韦齐纳; M-A·达乌斯特
Original assignee: FRENCH NATIONAL CENTRE FOR SCIENTIFIC RESEARCH; Rouen, University of; Medicago Inc
Current assignee: FRENCH NATIONAL CENTRE FOR SCIENTIFIC RESEARCH; Rouen, University of; Medicago Inc
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2027-02-09
Also published as: ES2368657T3; EP1987137B1; EP2224009B1; JP5502328B2; ATE513918T1; AU2007214227A1; US20090312240A1; ES2399681T3; NZ570455A; US20170247714A1; US9212372B2; CA2649134C; US20160145664A1; PT1987137E; CA2813435C; JP2009525729A; IL193333A0; PT2224009E; EP2224009A1; IL193333A

Abstract

提供了一种在植物中合成唾液酸的方法，以及能够合成唾液酸的植物。此外，还提供了一种在植物中产生唾液酸化的蛋白的方法。所述合成唾液酸的方法包括：提供一种包含编码N－乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，以及表达所述核苷酸序列从而合成唾液酸。所述植物还可以共表达编码差向异构酶、CMP－Neu5Ac合酶、CMP－Neu5Ac运载蛋白和唾液酸转移酶中的一种或多种的核苷酸序列。

Description

唾液酸在植物中的合成

技术领域

本发明涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本发明提供了产生唾液酸的方法和植物，以及由这些植物产生的唾液酸化的蛋白。

背景技术

对于重组药用蛋白的生产，植物是潜在的低成本并且无污染的工具。植物中生产的大多数重组蛋白与它们的哺乳动物对应物在氨基酸序列、构象和生物活性方面没有区别。此外，当哺乳动物糖蛋白在转基因植物中表达的时候能够被有效地糖基化。然而，由植物产生的分子上具有的N-聚糖与存在于动物糖蛋白上的N-聚糖是不同的(Lerouge et al.，1998)。这一点可能限制了从植物制备的药物的应用，这是因为除了缺乏哺乳动物型表位(例如唾液酸化序列)可导致它们被快速地从血流中清除之外，这些蛋白上的植物特异性糖表位会引起人的免疫反应(Bardor et al.，2003)。因此，对从植物制备的药物的N-糖基化进行控制是将它们用于治疗人类的前提条件。

最近已经出现了植物内重塑方法，以用于获得具有与人类相容的糖类特征的来源于植物的抗体。一些方法包括植物抗体在内质网中的驻留(Koetal.，2003；Sriraman et al.，2004，Triguero et al.，2005)，还有一些方法涉及用哺乳动物糖基转移酶来对植物进行转化。例如，通过用人β(1，4)-半乳糖转移酶来转化植物可以部分地将植物N-糖基化人源化(Palacpac et al.，1999；Bakker et al.，2001)。鼠类抗体在转化植物中的表达可以产生来源于植物的抗体，所述抗体具有的半乳糖基化特征与在相应的鼠IgG所观察到的特征类似(Bakker et al.，2001)。

哺乳动物IgG在位于Fc区的N-糖基化保守位点带有二天线(bi-antennary)N-聚糖。这些低聚糖被轻度唾液酸化，并且缺少末端Neu5Ac时也不会影响抗体的功能和稳定性。相反，大部分的其他血液循环糖蛋白具有唾液酸化的二天线N-聚糖、三天线(tri-antennary)N-聚糖或四天线(tetra-antennary)N-聚糖。在这些聚糖上存在末端唾液酸是多种生物功能必需的，其中首要一点是调控所述蛋白在循环系统中的半衰期。不存在末端唾液酸时，糖蛋白会被肝的无唾液酸糖蛋白受体检测到并且被从血清中清除，使得这些蛋白在生物中存在很短暂且没有效力(Kelm andSchauer，1997)。因此，由植物制备的非唾液酸化的药物在注射至人体后可被快速地从血液中清除——例如来源于烟草的Epo在体外有生物活性而在体内无功能，这是因为它在到达红细胞生成组织之前就被从循环中去除(Matsumoto et al.，1995)。

通过人β(1，4)-半乳糖转移酶(一种利用内源UDP-Gal作为协同底物的转移酶)的表达(Palacpac et al.，1999；Bakker et al.，2001)，已经在植物中部分地实现将连接于植物抗体的N-聚糖重塑为类似人的N-聚糖。哺乳动物唾液酸转移酶已经被导入植物中，并且被证明有功能且被正确地定位于高尔基体上(Wee et al.，1998)。然而，没有观察到内源寡糖的唾液酸化。在植物中是否存在唾液酸以及唾液酸化机制仍然是有争议的问题。然而，Neu5Ac(在人体内存在的主要的唾液酸)以及其前体N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)在植物中合成的量似乎不足以被检测(Séveno et al.，2004)。因此，将植物N-聚糖进行糖工程改造成唾液酸化寡糖需要能够催化Neu5Ac合成、激活和在高尔基体中转移的外源性酶的共表达。

在哺乳动物和细菌中，Neu5Ac的合成代谢和分解代谢通过不同途径发生(Angata and Varki，2002)。Neu5Ac的形成主要需要两类酶。通过在可逆反应中催化Neu5Ac分解成N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)和丙酮酸，N-乙酰神经氨酸裂合酶(Neu5Ac裂合酶)参与唾液酸的分解代谢。在高浓度的D-ManNAc和丙酮酸下，上述平衡转向Neu5Ac合成的方向。来自大肠杆菌的Neu5Ac裂合酶与葡糖胺2-差向异构酶活性相结合，被用于从D-GlcNAc大规模生产Neu5Ac(Maru et al.，1998)。或者，Neu5Ac合酶(例如NeuB)催化ManNAc与磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的缩合，并且直接参与唾液酸的生物合成(在Tanner，2005中综述)。

发明内容

本发明的一个目标是提供改进的在植物中产生唾液酸的方法。

根据本发明，提供了一种合成唾液酸——例如N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的方法(A)，包括：

i)提供包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，以及

ii)使所述植物生长并且表达所述核苷酸序列，从而合成所述唾液酸。

此外，在所述使植物生长的步骤后可以从所述植物中回收所述唾液酸。所述调控区可以选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

本发明还涉及上文定义的方法(方法A)，其中在所述提供植物的步骤中，所述植物还包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶或唾液酸转移酶，并且所述第二核苷酸序列与所述核苷酸序列共表达。此外，所述第二调控区可以选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

本发明还涉及上文描述的方法(方法A)，其中为了在所述植物中表达，可以对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白中的一种或多种的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

本发明提供了一种产生目的蛋白的方法(B)，包括：

i)提供一种表达一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，

ii)使所述植物生长并且表达所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，从而产生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。

优选地，唾液酸化的目的蛋白包含二天线N-聚糖、三天线N-聚糖或四天线N-聚糖。

本发明还涉及上文定义的方法(方法B)，其中所述唾液酸化的蛋白提取自所述植物。此外，所述唾液酸化的蛋白可以被分离和纯化。

本发明提供了下述的植物、植物细胞或种子，它们包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列与与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。所述植物、植物细胞或种子还可以包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。此外，所述调控区和所述第二调控区可以选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

本发明涉及上文描述的方法(方法B)，其中为了在所述植物、植物细胞或种子中表达，可以对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶的所述一个或多个的第一核苷酸序列，编码所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

本发明包括包含下述植物、植物细胞或种子，它们包括编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。所述植物、植物细胞或种子还可以包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。此外，为了在所述植物、植物细胞或种子中表达，可以对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白中的一种或多种的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

本发明还提供了包含一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物、植物细胞或种子，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列与在所述植物中有活性的一个或多个调控区可操作地连接。所述一个或多个调控区可以选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。此外，为了在所述植物、植物细胞或种子中表达，可以对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶的所述一个或多个第一核苷酸序列，编码所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

本发明还提供了一种合成唾液酸的方法(方法C)，包括：用编码N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列瞬时转化植物或所述植物的一部分，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，以及表达所述核苷酸序列从而合成唾液酸。此外，可以从所述植物中或所述植物的一部分中回收Neu5Ac或Neu5Ac裂合酶。

本发明还涉及上文描述的方法(方法C)，其中在瞬时转化所述植物或所述植物的一部分的步骤中，还包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白，并且所述第二核苷酸序列与所述核苷酸序列共表达。

本发明提供了一种产生目的蛋白的方法(方法D)，包括：

i)用一种构建体瞬时转化植物或所述植物的一部分，所述构建体表达一个或多个第一核苷酸序列和编码所述目的蛋白的第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶，并

ii)产生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。

唾液酸化的目的蛋白可以包含二天线N-聚糖、三天线N-聚糖或四天线N-聚糖。此外，可以从所述植物或所述植物的一部分提取所述唾液酸化的蛋白。所述唾液酸化的目的蛋白也可以被分离和纯化。

本发明还涉及上文描述的方法(方法D)，其中在所述产生步骤后，将包含所述唾液酸化的目的蛋白的植物材料通过口服给予受试者。例如，在所述产生步骤之后，所述植物或所述植物的一部分被最低限度地处理以产生最低限度处理的植物材料，并且将包含所述唾液酸化的目的蛋白的所述最低限度处理的植物材料通过口服给予受试者。

如本文所述，合成Neu5Ac的酶、Neu5Ac裂合酶和NeuB2在植物中的表达可导致功能性酶在植物组织中的累积。合成Neu5Ac的酶可以在任何植物中表达，例如但不限于烟草和紫花苜蓿(Medicago sativa)((alfalfa))，受益于在分子农业应用的数个农业优势的多年生豆类植物(Busse et al.，2001)。

本发明的这些发明内容不必描述本发明的所有的特征。

附图说明

本发明的这些特征和其他特征通过下文的说明将更加显而易见，下文的说明参考了以下的附图，其中：

图1a显示使用FLAG抗体对从野生型烟草BY2细胞(列1)或表达Neu5Ac裂合酶-FLAG的转基因烟草BY2细胞(列2)提取的可溶性蛋白的蛋白印迹分析。图1b和图1c显示无Neu5Ac(图1b)或有Neu5Ac(图1c)时，从表达Neu5Ac裂合酶的烟草BY2细胞分离的胞质蛋白在pH7和37℃下孵育得到的终产物的气相层析谱。图1d显示在37℃下48小时过程中加入10mM外源的Neu5Ac，表达Neu5Ac裂合酶的烟草BY2细胞的胞质单糖的GC谱。图1e和图1f显示在谱(图1c)中检测到的峰1(图1e)以及峰2和3(图1f)的电子轰击质谱。D-ManNAc的1-0-甲基全甲硅烷基(1-0-methyl persilyl)衍生物的主碎片离子被标出。

图2a和图2b显示无D-ManNAc和丙酮酸(图2a)时或者有D-ManNAc和丙酮酸(图2b)时，从表达Neu5Ac裂合酶的烟草BY2细胞分离的胞质蛋白在pH7和37℃下孵育得到的终产物的气相层析谱。图2c显示谱(图2b)中出现的峰的电子轰击质谱。N-乙酰神经氨酸的1-0-甲基甲酯全甲硅烷基衍生物的主碎片离子被标出。

图3a显示使用FLAG抗体对从野生型烟草BY2细胞(列1)或表达Neu5Ac裂合酶-FLAG的转基因烟草BY2细胞(列2)提取的胞质蛋白的蛋白印迹分析。图3b和图3c显示无D-ManNAc和PEP(图3b)或者有D-ManNAc和PEP(图3c)时，从表达NeuB2的苜蓿植物的叶中提取的可溶性蛋白在pH8和37℃下孵育后得到的终产物的气相层析谱。图3d显示谱(图3c)中出现的峰的电子轰击质谱。N-乙酰神经氨酸的1-0-甲基甲酯全甲硅烷基衍生物的主碎片离子被标出。

具体实施方式

本发明涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本发明提供了表达唾液酸的方法和植物，以及由这些植物产生的唾液酸化的蛋白。

以下的描述是优选的实施方案。

本发明提供了在植物中合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的方法。通过在可逆反应中催化Neu5Ac分解成ManNAc和丙酮酸，Neu5Ac裂合酶在细菌中分解代谢唾液酸。因为这个反应是可逆的，所以在存在合适的前体情况下Neu5Ac裂合酶可被用于Neu5Ac的合成。产生Neu5Ac的另一种方法涉及使用Neu5Ac合酶。Neu5Ac合酶催化D-ManNAc和PEP的缩合形成Neu5Ac。

因此，本发明提供了一种合成Neu5Ac的方法，包括：提供包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，使所述植物生长并且表达所述核苷酸序列以合成Neu5Ac。或者，所述方法可以包括在植物中或所述植物的一部分中的瞬时产生Neu5Ac。

使用本领域已知的方法，如此产生的Neu5Ac可以从所述植物中回收，并且在体外被用于蛋白的唾液酸化。或者，Neu5Ac可以用作对在所述植物中共表达的目的蛋白进行唾液酸化的内源性底物。

如果需要，可以通过一个或多个另外的核苷酸序列在所述植物中共表达来提高所述植物中用于合成Neu5Ac的底物(包括但不限于N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc))的水平，所述另外的核酸序列编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶和CMP-Neu5Ac运载蛋白中的一种或多种。例如，可以通过在植物中表达UDP-GlcNAc 2-差向异构酶(例如细菌UDP-GlcNAc 2-差向异构酶或其他来源的差向异构酶形式)来合成ManNAc，该酶将内源性的UDP-GlcNAc转换成ManNAc。或者，可以先产生ManNAc-6-磷酸，之后用磷酸酶进行水解。用这种方法，在植物中表达GlcNAc-6-磷酸2-差向异构酶，例如细菌GlcNAc-6-磷酸2-差向异构酶或哺乳动物UDP-GlcNAc2-差向异构酶/ManNAc激酶。通过将该第二核苷酸序列与编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列共表达，可以使Neu5Ac的水平增加。然而，对一个或多个的上述核苷酸序列共表达的需求将依赖于所选择的宿主植物，这是因为所述植物中可能存在上述一种或多种酶的内源活性。

为了保证由胞质唾液酸对N-聚糖的唾液酸化，可以在植物中共表达细菌或哺乳动物的CMP-Neu5Ac合酶、哺乳动物CMP-Neu5Ac运载蛋白、哺乳动物半乳糖转移酶(用于在唾液酸被转移至N-聚糖之前加成半乳糖)和哺乳动物唾液酸转移酶。在根据本发明的植物中产生的Neu5Ac可以被用作通过CMP-Neu5Ac合酶合成CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的底物，然后所述CMP-Neu5Ac被用作对在所述植物中共表达的目的蛋白进行唾液酸化的底物。在这种情况下，所述植物还可以包含编码唾液酸转移酶的核苷酸序列。已经证明了在植物中可表达哺乳动物唾液酸转移酶和哺乳动物CMP-Neu5Ac合酶(Wee et al.，1998，Misaki，R.，et al.，2006，所述文献通过引用的方式纳入本文)。然而，对一个或多个的上述核苷酸序列共表达的需求将依赖于所选择的宿主植物，这是因为所述植物中可能存在上述一种或多种酶的内源活性。

在核苷酸序列在所述植物中共表达的情况下，可以使用标准的转化技术或瞬时转化技术将每种目的核苷酸序列导入所述植物，或者可以将每株都表达一个或多个目的核苷酸序列的两株植物杂交，以获得能够组合共表达目的核苷酸序列的植物。

因此，本发明还提供了一种产生植物的方法，所述植物可以被用作产生目的唾液酸化蛋白的平台。该方法包括：提供表达一个或多个第一核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，以及表达所述一个或多个核苷酸序列。通过以下两种方式产生目的蛋白：使用标准的技术例如转化，将编码目的蛋白的第二核苷酸序列导入所述平台植物，并且表达所述第二核苷酸序列；或者，将所述平台植物与表达目的蛋白的植物杂交，使得杂交植物的子代中产生的目的蛋白是唾液酸化的。

本发明还提供了一种产生目的蛋白的方法，包括：提供一种表达一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，使所述植物生长，以及表达所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，从而产生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。优选地，唾液酸化的所述目的蛋白包含二天线N-聚糖、三天线N-聚糖或四天线N-聚糖。可以从所述植物提取所述唾液酸化的蛋白，并且根据需要，可以使用标准的方法分离并纯化所述的唾液酸化的蛋白。再者，所述植物可以是用所需构建体稳定转化的，或者所述植物或所述植物的一部分可以是用所需构建体瞬时转化的。

可以对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶的核苷酸序列进行密码子优化，以增加在所述植物中的表达水平。密码子优化是指选择合适的DNA核苷酸用于寡核苷酸结构嵌段的合成，并且它们随后被酶组装成结构基因或其片段以接近于植物中的密码子选择。

为了优化所述外源序列在植物中的表达，可以根据需要使用或者改变所述核苷酸序列(可以是野生序列或合成序列)，使得产生的相应蛋白例如Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶、目的蛋白或其组合产生的水平高于由未改变的核苷酸序列编码能产生的水平。例如(但不应作为限制)，所述序列可以是针对植物中的密码子选择进行过优化的合成序列，与所述野生序列有至少约80％的同源性——这由序列比较技术确定，所述序列比较技术例如但不限于BLAST(从GenBank获得；使用默认参数)。还应理解的是，编码目的蛋白或其衍生物(表现出有用的生物性质，例如但不限于抗原性的性质)的序列的片段或部分可以在植物组织中表达。

为了使Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和目的蛋白的表达水平和转基因蛋白的产生最大化，可以检查所述核酸序列并且修改所述编码区以优化所述基因在植物中的表达，所使用的方法类似于Sardana等所述的方法(Plant Cell Reports 15：677-681；1996)。来自双子叶植物的高表达基因的密码子选择表有多个来源，其中包括Murray等所述的来源(Nuc AcidsRes.17：477-498；1989)。

因此，本发明提供了一种合成唾液酸的方法，包括：提供包含编码N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，使所述植物生长并表达所述核苷酸序列，从而合成唾液酸。为了在所述植物中表达，可以对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列进行密码子优化。此外，在所述提供植物的步骤中，所述植物还包含与一个或多个在所述植物中有活性的第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白，并且所述第二核苷酸序列与所述核苷酸序列共表达。为了在所述植物中表达，可以对编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白中的一种或多种的所述第二核苷酸序列进行密码子优化。

此外，本发明另外提供了一种产生目的蛋白的方法，包括：提供一种表达一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶，使所述植物生长并表达所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，从而产生所述目的蛋白。为了在所述植物中表达，可以对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶的所述一种或多种第一核苷酸序列、编码所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

此外，本发明涉及下述植物、植物细胞或种子：它们包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。所述植物、植物细胞或种子还可以包含与一个或多个在所述植物中有活性的第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。为了在所述植物、植物细胞或植物种子中表达，可以对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列、编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白中一种或多种的所述第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

本发明还包括包含一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物、植物细胞或种子，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列与一个或多个在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。为了在所述植物中表达，可以对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶的所述一个或多个第一核苷酸序列，编码所述目的蛋白的所述第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

“可操作地连接”是指具体的序列之间直接或间接地相互作用以完成预定的功能——例如介导或调节基因表达。可操作连接的序列之间的相互作用可以被例如与所述可操作连接的序列相互作用的蛋白介导。若序列之间功能连接从而使目的序列的转录被转录调控区介导或调节，则所述转录调控区和所述目的序列是可操作地连接的。

所述术语“植物物质”是指任何从植物获得的材料。植物物质可以包括：全植株、组织、细胞或它们的任何部分。此外，植物物质可以包括细胞内的植物组分、细胞外的植物组分、植物的液体提取物或固体提取物或其组合。此外，植物物质可以包括植物、植物细胞、组织、液体提取物或其组合，它们来自植物叶、茎、果实、根或其组合。植物物质可以包括没有经过任何处理步骤的植物或其部分。然而，也应理解，所述植物材料可以经过下文定义的最低限度处理的步骤，或者更严格的处理——包括部分的蛋白纯化或高度的蛋白纯化，使用的是本领域公知的技术——包括但不限于色谱法、电泳等。

所述术语“最低限度处理的”是指植物物质(例如包含目的蛋白的植物或其部分)被部分地纯化以产生植物提取物、匀浆物、植物匀浆物的级分等。部分的纯化可以包括但不限于破坏植物细胞结构从而形成包含可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物，所述组分可以通过例如但不限于离心、过滤或其组合进行分离。在该方面，使用真空或离心提取可以容易地获得分泌到叶或其他组织的细胞外空间中的蛋白，或者可以在压力下通过滚轴或通过研磨等进行组织提取以从细胞外空间中挤压或释放所述蛋白。最低限度处理也可以包括可溶性蛋白的粗提取物的制备，这样这些制品中来自第二植物产物的污染的量就可以忽略不计。此外，最低限度处理可以包括从叶中水提取水溶性蛋白，然后用任何合适的盐进行沉淀。为了直接使用所述提取物，其他的方法可以包括大规模的离析和汁提取。

植物材料或植物组织形式的所述植物物质可以通过口服被送递至受试者。所述植物物质可以被作为膳食添加剂的一部分与其他食物共同给予，或者被装入胶囊。所述植物物质或植物组织也可以被浓缩以改善或增加口味，或者根据需要与其他材料、成分、药物辅料一起被提供。

根据具体需求或具体情况，考虑到了可以使用多种方式将包含目的异源蛋白的植物给予动物或人等受试者。例如，如果所述蛋白是通过口服给予，那么可以收集所述植物组织并直接喂食受试者，或者收集的植物组织可以在喂食前预先进行干燥，或者可以不预先进行收集而在所述植物的区域放牧动物。将收集的植物组织作为动物饲料的食品添加剂提供也被认为在本发明的范围内。如果用经过很少进一步处理的或者不进行进一步处理的所述植物组织喂食动物，那么所述被给予的植物组织优选是可食用的。此外，在作为食品添加剂使用前，来自所述植物的目的蛋白可以以粗制的形式、部分纯化的形式或者纯化的形式被提取。对于后一种情况，所述蛋白可以在可食用植物或不可食用植物中产生。

如在实施例中更加详细描述的那样，将Neu5Ac裂合酶和Neu5Ac裂合酶-FLAG(Neu5Ac裂合酶的C-端被FLAG表位标记，从而可对转化体中的重组蛋白进行免疫检测)导入植物中。使用抗FLAG抗体的蛋白印迹分析证明了所述转化的细胞中存在MWr32kDa的蛋白(图1a)。此外，在表达Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac裂合酶-FLAG的植物或者从这些植物获得的提取物中检测到了体内的和体外的裂合酶活性。在非转化的植物中没有检测到内源的裂合酶活性。然而，在存在D-ManNAc和丙酮酸时，观察到了利用重组产生的Neu5Ac裂合酶进行的Neu5Ac的合成(见图2b)。因此，重组表达的Neu5Ac裂合酶在植物中是有生物活性的。

将Neu5Ac合酶(例如但不限于NeuB2)和Neu5Ac合酶-FLAG(Neu5Ac合酶的C-端被FLAG表位标记，从而可对转化体中的重组蛋白进行免疫检测)导入植物中。使用抗FLAG抗体的蛋白印迹分析证明了所述转化的细胞中存在MWr37kDa的蛋白。在表达Neu5Ac合酶或Neu5Ac合酶-FLAG的植物或者从这些植物获得的提取物中检测到了体内的和体外的合酶活性。在非转化的植物中没有检测到内源的合酶活性。然而，在存在D-ManNAc和PEP时，观察到了利用重组产生的Neu5Ac合酶进行的Neu5Ac的合成(见图3b、3c)。因此，重组表达的Neu5Ac合酶在植物中是有生物活性的。

“类似物”或“衍生物”包括在沉默核苷酸序列中的任何的置换、缺失或插入，只要所述核苷酸序列以下的性质被保留：沉默靶基因或靶序列的表达，减少靶序列的表达，或者降低由所述靶序列编码的蛋白的合成或活性。例如，核酸序列的衍生物和类似物与沉默核酸序列一般有超过80％的相似性。序列相似性可以使用BLAST算法(GenBank：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/)确定，使用的是默认参数(程序：blastn；数据库：nr；期望值10；过滤：低复杂度；比对：成对比对；字长：11)。类似物或其衍生物还包括在严格杂交条件下(参见Maniatis et al.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，1982，page，387-389；或Ausubel，et al.(eds)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，New York，page 2.10.3)与本文描述的任一条序列杂交的那些核苷酸序列，只要所述序列有沉默靶基因表达的性质即可。这样的严格杂交条件的一个实例可以是与合适的探针(例如但不限于[γ-³²P]dATP标记的探针)在以下缓冲液中于65EC杂交16-20小时：7％SDS、1mM EDTA、0.5M Na₂HPO₄(pH7.2)。随后在5％SDS、1mM EDTA、40mM Na₂HPO₄(pH7.2)中洗涤30分钟，然后在1％SDS、1mM EDTA、40mM Na₂HPO₄(pH7.2)中洗涤30分钟。可以反复在该缓冲液中洗涤以降低背景。

“调控区”、“调控元件”或“启动子”是指通常(但并非总是)位于基因的蛋白编码区上游的核酸部分，可以包括DNA或RNA或者DNA和RNA两者。如果调控序列是有活性的，并且可操作地关联于目的基因或者可操作地与目的基因连接，那么这将导致所述目的基因的表达。调控元件能介导器官特异性，或者控制发育基因或时序基因的激活。“调控区”包括启动子元件、有启动子基本活性的核心启动子元件、可被外部刺激诱导的元件、介导启动子活性的元件例如负调控元件和转录增强子。本文使用的“调控区”也包括随转录激活的元件，例如调节基因表达的调控元件(如翻译增强子和转录增强子、翻译抑制子和转录抑制子)、上游激活序列以及mRNA稳定性决定子。这后几种元件中有一些可以位于与编码区邻近的位置。

在本发明公开的文本中，术语“调控元件”或“调控区”一般是指通常(但并非总是)位于结构基因的编码序列上游(5’)的DNA序列，它通过识别RNA聚合酶和/或转录所需的其它因子来控制所述编码区的表达在特定位点起始。然而，应理解的是位于内含子中或者所述序列的3’端的其他核苷酸序列也可以调节目的编码区的表达。识别RNA聚合酶或其它转录因子以确保在特定位点起始的调控元件的一个实例是启动子元件。大部分(但并非全部)的真核启动子元件包含TATA盒，该元件是由腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游大约25个碱基对的位置。除了改变基因表达的其他调控元件(如上文列出的)之外，启动子元件还包含负责转录起始的启动子基本元件。

有几种类型的调控区，包括受发育调节的、诱导型的或组成型的。受发育调节的调控区或者对受其控制的基因的差异表达进行控制的调控区在特定器官或器官的组织中并且在该器官或组织发育过程中的特定时间被激活。然而，有些受发育调节的调控区可以优先在某些器官或组织的特定发育阶段有活性，而在所述植物的其他器官或组织中，它们也可以以发育调节的方式出现活性或者有基础水平的活性。组织特异性调控区的实例(例如见具体的(see-specific)调控区)包括napin启动子和十字花科蛋白启动子(cruciferin promoter)(Rask et al.，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau et al.，1994，Plant Cell 14：125-130)。

诱导型调控区是针对诱导物能够直接地或间接地激活一个或多个DNA序列或基因的转录的调控区。在不存在诱导物时，所述DNA序列或基因将不被转录。特异性结合诱导型调控区以激活转录的蛋白因子一般以无活性的形式存在，然后所述诱导物可以直接或间接地将它们转换成有活性的形式。然而，也可能不存在所述蛋白因子。所述诱导物可以是例如蛋白、代谢产物、生长调节因子、除草剂或酚化合物的化学试剂；或者是由热、冷、盐或毒性元素直接产生的生理胁迫；或者是通过病毒等病原体或疾病因素的作用间接产生的生理胁迫。可以通过将诱导物外部施予(例如通过喷雾、洒水、加热或类似的方法)至包含诱导型调控区的细胞或植物从而使所述植物细胞暴露于所述诱导物。诱导型调控元件可以来源于植物基因或非植物基因(如Gatz，C.and Lenk，I.R.P.，1998，Trends Plant Sci.3，352-358；该文献被通过引用的方式纳入本文)。潜在的诱导型启动子的实例包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz，C，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108；该文献被通过引用的方式纳入本文)、类固醇诱导型启动子(Aoyama，T.and Chua，N.H.，1997，Plant J.2，397-404；该文献通过引用的方式被纳入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter，M.G.，et al，1998，Plant Journal 16，127-132；Caddick，M.X.，et al，1998，Nature Biotech.16，177-180；这些文献被通过引用的方式纳入本文)、细胞分裂素诱导型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.and Kieber，J.J.，1998，Plant Cell10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science 274，982-985；这些文献被通过引用的方式纳入本文)和生长素诱导型元件DR5(Ulmasov，T.，et al.，1997，Plant Cell 9，1963-1971；该文献被通过引用的方式纳入本文)。

组成型调控区指导基因在各个植物部分并且整个植物发育过程中连续表达。已知的组成型调控元件的实例包括与以下基因相关的启动子：CaMV35S转录物(Odell et al.，1985，Nature，313：810-812)、稻肌动蛋白1(Zhang et al，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An et al.，1996，Plant J.，10：107-121)或tms2(U.S.5,428,147，它被通过引用的方式纳入本文)、以及磷酸丙糖异构酶1基因(Xu et.al.，1994，PlantPhysiol.106：459-467)、玉米泛素1基因(Cornejo et al，1993，Plant Mol.Biol.29：637-646)、拟南芥(Arabidopsis)的泛素1基因和泛素6基因(Holtorf et al，1995，Plant Mol.Biol.29：637-646)和烟草翻译起始因子4A基因(Mandel et al，1995Plant Mol.Biol.29：995-1004)。本文使用的术语“组成型的”不一定表示受组成型调控区控制的基因在所有细胞类型中表达相同的水平，而是表示所述基因在宽范围的细胞类型中表达，即使经常会出现丰度的变化。

本发明的一个或多个核苷酸序列可以在用本发明的核苷酸序列、构建体或载体转化的任何合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物，所述农作物包括苜蓿、芸苔、芸苔属的多个种、玉米、烟草、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、稻、大豆、小麦、大麦、向日葵和棉花。

因此，本发明还提供了包含以下核苷酸序列的植物、植物细胞或种子：编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶、与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接的核苷酸序列。此外，所述植物、植物细胞或种子可以包含与一个或多个在所述植物中有活性的第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。

本发明还提供了包含一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物、植物细胞或种子，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列与一个或多个在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。

本发明的一种或多种嵌合遗传构建体还可以包含3’非翻译区。3’非翻译区是指这样的基因部分，它包含一段含有多腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号的DNA片段。所述多腺苷酸化信号的特征通常在于影响多聚腺苷酸在mRNA前体3’端的添加。多腺苷酸化信号通常被存在的经典形式的5’AATAAA-3’(虽然偶尔会有所变化)同源物识别。本发明的一种或多种嵌合遗传构建体还可以另外包含增强子(翻译增强子或转录增强子)，它可能是需要的。这些增强子区域是本领域技术人员公知的，并且可以包括ATG起始密码子及邻近序列。所述起始密码子必须在所述编码序列的阅读框内，以保证所述整条序列的翻译。

合适的3’区的非限制性实例是以下基因的包含多腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区：例如胭脂碱合成酶(基因Nos)的农杆菌瘤诱导(Ti)质粒基因，以及例如大豆贮藏蛋白基因和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)小亚基基因的植物基因。

为了有助于鉴定转化的植物细胞，可以进一步处理本发明的构建体以使其包含植物的选择性标记。有用的选择性标记包括提供化学剂抗性的酶，所述化学剂例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等抗生素或者草胺磷(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等除草剂。类似地，可以使用能产生可通过颜色变化来辨别的化合物(例如GUS(β-葡萄糖苷酸酶))或化学发光(例如萤光酶素和GFP)的酶。

本发明还考虑到的部分为包含本发明的嵌合基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子。从植物细胞再生整个植物的方法也是本领域已知的。一般而言，转化的植物细胞被培养在合适的培养基中，所述培养基可以包含抗生素等选择剂，其中选择性标记被用于帮助对转化的植物细胞进行鉴定。一旦形成愈伤组织，可以根据已知方法通过使用合适的植物激素促进芽形成，将所述芽转移至生根培养基中以再生植物。然后，通过种子或者使用无性繁殖技术，所述植物可以被用于建立重复的代。不通过组织培养也可以产生转基因植物。

为了在一系列易于转化或瞬时表达的宿主生物体中表达，本发明的调控元件也可以与目的编码区连接。这样的生物体包括但不限于植物(单子叶植物和双子叶植物)例如但不限于玉米、谷类植物、小麦、大麦、燕麦、烟草、芸苔(Brassica)、大豆、菜豆、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、人参和拟南芥。

用于这些生物体的瞬时表达、转化和再生的方法已经在本领域中建立并为本领域技术人员已知。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键性的。

“转化”是指基因型显性的遗传信息、表型显性的遗传信息或者两者同时在种间的转移。从嵌合构建体转移至宿主的种间转移的遗传信息可以是可遗传的，则所述遗传信息的转移被认为是稳定的；或者所述转移可以是瞬时的，则所述遗传信息的转移是不可遗传的。本发明还包括合适的载体，所述载体含有适合于用在稳定的表达系统或瞬时的表达系统中的嵌合基因构建体。

可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等技术将本发明的构建体导入植物细胞。这些技术的综述参见例如Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademyPress，New York VIII，pp.421-463(1988)；Geierson and Corey，PlantMolecular Biology，第2版.(1988)；以及Miki and Iyer，Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism，2^nd Ed.DT.Dennis，DH Turpin，DD Lefebrve，DB Layzell(eds)，Addi son Wesly，Langmans Ltd.London，pp.561-579(1997)。其他的方法包括直接DNA吸收、应用脂质体、电穿孔(例如使用原生质体)、显微注射、微弹或晶须(microprojectiles orwhiskers)以及真空渗入。例如，参见Bilang，et al.(Gene 100：247-250(1991)，Scheid et al.(Mol.Gen.Genet.228：104-112，1991)、Guercheet al.(Plant Science 52：111-116，1987)、Neuhause et al.(Theor.ApplGenet.75：30-36，1987)、Klein et al.，Nature 327：70-73(1987)、Howell et al.(Science 208：1265，1980)、Horsch et al.(Science 227：1229-1231，1985)、DeBlock et al.，Plant Physiology 91：694-701，1989)、Methods for Plant Molecular Biology(Wei ssbach and Weissbach，eds.，Academic Press Inc.，1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski，eds.，Academic Press Inc.，1989)、Liu andLomonossoff(J Virol Meth，105：343-348，2002，)；美国专利4,945,050、5,036,006和5,100,792；美国专利申请08/438,666(1995年5月10日提交)和07/951,715(1992年9月25日提交)，(所有这些文献、出版物和专利通过引用的方式纳入本文)。

如下文所述，可以使用瞬时表达的方法来表达本发明的构建体(见Liuand Lomonos soff，2002，Journal of Virological Methods，105：343-348；该文献通过引用的方式纳入本文)。这些方法可以包括例如但不限于农杆菌接种或农杆菌浸润的方法，然而如上文所述，也可以使用其他的瞬时方法。通过农杆菌接种或农杆菌浸润，包含所需核酸的农杆菌混合物进入到组织例如叶的胞间隙中、植物的地上部分(包括茎、叶和花)中、植物的其他部分(茎、根、花)中或全植株中。在通过表皮后，所述农杆菌将t-DNA拷贝转染并转移至细胞中。所述t-DNA以附加体的形式转录并且其mRNA被翻译，使得在感染的细胞中产生目的蛋白，然而，t-DNA在核内的传代是瞬时的。

“目的基因”、“目的核苷酸序列”或“目的编码区”是指任何在宿主生物体例如植物中表达的基因、核苷酸序列或编码区。这些术语可以互换使用。这样的目的核苷酸序列可以包括但不限于产物是用于饲料、食物或饲料和食物两者中的工业用酶、蛋白添加剂、营养制剂、附加值产物或者它们的片段的基因或编码区。目的核苷酸序列或编码区也可以包括编码有药物活性的蛋白的基因，所述蛋白例如生长因子、生长调节剂、抗体、抗原以及它们的片段，或者它们的用于免疫或疫苗等的衍生物。这样的蛋白包括但不限于白细胞介素(例如IL-1至IL-24、IL-26和IL-27中一种或多种)、细胞因子类(红细胞生成素(EPO)、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它们的组合)、干扰素类(例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX或tPA hGH)、受体、受体激动剂、抗体、神经多肽、胰岛素、疫苗、生长因子(例如但不限于表皮生长因子、角质化细胞生长因子、转化生长因子)、生长调节剂、抗原、自身抗原、它们的片段或它们的组合。

如果目的基因编码对植物有直接毒性或间接毒性的产物，那么通过以下的方式并使用本发明的方法可以减少整个植物中的该毒性：在适当的组织或者在植物发育的适当阶段选择性地表达目的基因。

目的编码区或目的核苷酸序列可以在任何合适的植物宿主中表达，所述植物宿主包含本发明的核苷酸序列、核酸分子、遗传构建体或质粒或者是被上述核酸转化的。合适的宿主的实例包括但不限于拟南芥、农作物(包括例如芸苔、芸苔属的多个种、玉米、烟草、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、稻、大豆、小麦、大麦、向日葵和棉花)。

通过表达重组Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶，在植物中证实了唾液酸例如Neu5Ac的合成。来自大肠杆菌(E.coli)的Neu5Ac裂合酶和来自空肠弯曲菌(C.jejuni)的NeuB2每个都在烟草BY2细胞的胞质中表达，在农杆菌介导转化的苜蓿植株中表达，或者在植物细胞中瞬时表达。没有观察到所述重组蛋白的降解说明这些酶在该区室中是稳定的。在BY2细胞中表达的Neu5Ac裂合酶能够在可逆反应中催化Neu5Ac裂解成D-ManNAc和丙酮酸。存在丙酮酸和ManNAc时也观察到了Neu5Ac的合成。Neu5Ac裂合酶在pH7和25-37℃的范围内有生物活性，这与植物胞质pH和多数重要作物的温度是一致的。此外，存在外源Neu5Ac时进行的饲喂实验证明所述酶在植物中是有功能的。

当在烟草BY2细胞中表达来自空肠弯曲菌的Neu5Ac合酶(NeuB2)的时候，存在D-ManNAc和PEP的情况下观察到了Neu5Ac的合成。NeuB2在苜蓿植物中的表达也形成功能性酶的累积。因此，微生物Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶在植物中的表达可导致在胞质中产生能合成Neu5Ac的酶。

为了给Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶补充适当的氨基糖底物，在植物中共表达了一种能够将内源GlcNAc转换成ManNAc的差向异构酶。在这方面，功能性CMP-Neu5Ac合酶和CMP-Neu5Ac转运蛋白在烟草BY2细胞中的表达已经有报道(Misaki et al.，2006)。CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac转运蛋白或者CMP-Neu5Ac合酶和CMP-Neu5Ac转运蛋白两者与NeuB2的共表达可以增加Neu5Ac的产量。N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)在植物中的合成可以通过多种方法实现。例如，ManNAc的合成可以通过在植物中表达UDP-GlcNAc 2-差向异构酶(例如细菌UDP-GlcNAc 2-差向异构酶)来实现，该酶在非可逆反应中将UDP-GlcNAc转换成ManNAc。UDP-GlcNAc存在于胞质中，这是因为它为N-聚糖合成通路提供原料。ManNAc合成也可以通过表达其他来源的GlcNAc-2差向异构酶来实现。或者，ManNAc-6-磷酸可以在(转基因植物中)用磷酸酶水解之后形成。利用这种方法，可在植物中表达GlcNAc-6-磷酸2-差向异构酶(例如细菌GlcNAc-6-磷酸2-差向异构酶)或哺乳动物UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/ManNAc激酶。

为了确保来自胞质的N-聚糖的唾液酸化，可以在植物中共表达细菌CMP-Neu5Ac合酶或哺乳动物CMP-Neu5Ac合酶、哺乳动物CMP-Neu5Ac转运蛋白、哺乳动物半乳糖转移酶和哺乳动物唾液酸转移酶(Mi saki，R.，et.A1.2006)。

以下的实施例将对本发明进行进一步说明。

实施例

方法

在Eurogentec(Seraing，Belgium)用兔制备抗合成的FLAG序列多肽(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；SEQ ID NO：1)的多克隆抗体。C₁₈Bond-Elut固相萃取柱来自Varian(Sugarland，TX)。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5-α和根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404分别被用于烟草细胞或紫花苜蓿(M.sativa)的克隆实验和转化中。普通烟草(Nicotiana tabacum)栽培变种Bright Yellow 2(BY-2)细胞的培养如Gomordet al.(1998)所述。

Neu5Ac裂合酶基因和neuB2基因的克隆以及植物表达载体的构建

通过PCR扩增Neu5Ac裂合酶基因和neuB2基因。通过PCR从大肠杆菌K1基因组DNA扩增Neu5Ac裂合酶基因，使用引物如下：

裂合酶-P1

5′-AATAGGCCATTACGGCCATGGCAACGAATTTACGTGG-3′(SEQ ID NO：6)和

裂合酶-P2

5′-AATAGGCCGAGGCGGCCTCACCCGCGC TCTTGCAT-3′(SEQ ID NO：7)。

对于neuB2基因，使用以下的引物获得DNA片段：

neuB2-P1：

5′-AATAGGCCATTACGGCCATGAAAAAAACTTTAATC-3′(SEQ ID NO：8)和

neuB2-P2：

5′-AATAGGCCGAGGCGGCCTTACTCACGGATAAGCTC-3′(SEQ ID NO：9)。

将上述扩增的DNA分别被置于质粒载体pDNR-LIB中的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制之下(对于Neu5Ac裂合酶基因)和二元质粒载体pCAMBIA2300中(对于neuB2基因)的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制之下。将含有CaMV35S启动子、Neu5Ac裂合酶和胭脂碱合酶(Nos)终止子的表达盒导入具有卡那霉素抗性基因的植物表达载体pBLTI 121(Pagny et al.，2000)中。

为了产生pBLTI Neu5Ac裂合酶-FLAG质粒和pBLTIneuB2-FLAG质粒，使用了为扩增在蛋白C-末端编码有FLAG肽的基因而设计的4种下述引物：裂合酶-FLAG-P1：

5′-CGGGGTACCAGAGAGATGGCAACGAATTTACGTGGC-3′(SEQ ID NO：2)，

裂合酶-FLAG-P2：

5′GCCGAGCTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCATCCCGCGCTCTTGCATCAACTG-3′(SEQ ID NO：3)

neuB2-FLAG-P1：

5′-CGGGGTACCAGAGAGATGAAAAAAACTTTAATCATCGC-3′(SEQ ID NO：4)和

neuB2-FLAG-P2：

5′-GCCGAGCTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCATCTCACGGATAAGCTCATCTTC-3′(SEQ ID NO：5)，

通过PCR用30个循环的以下程序产生这些扩增的序列：94℃变性1分钟，58℃退火1分钟以及72℃聚合3分钟。将PCR产物克隆进

II(Invitrogen)。在植物细胞中表达重组蛋白之前，我们通过测序确认了所有经修饰的cDNA构建体。然后，用KpnI和SacI消化所述插入物，然后将其克隆进经KpnI-SacI消化的pBLTI121中。通过热休克转化将每种载体(pBLTI121或pCAMBIA2300)导入根瘤农杆菌株LBA4404中。

在BY2细胞中表达

将烟草BY2细胞在Murashige and Skoog(1962)培养基中培养并用于转化。将来源于pBLTI121的构建体转化至农杆菌(LB A4404)中(Hofgen andWillmitzer，1988)。在含100μg/mL卡那霉素的YEB培养基上选择转基因的农杆菌细胞，并用于转化悬浮培养的烟草细胞(如Gomord et al.(1998)中所述)。在含抗生素(100μg/mL卡那霉素和250μg/mL噻孢霉素)的MS培养基中选择并培养转化体。从每种转化体制备基因组DNA和mRNA，并且通过PCR和RT-PCR确认目标基因已插入到烟草的悬浮培养细胞中并在所述细胞中表达。进行免疫筛选后，产生重组蛋白的微愈伤组织被用于启动转基因细胞的悬浮培养(Gomord et al.，1998)。

在苜蓿植物中表达

苜蓿的转化基本上按Tian et al.(Tian et al.，2002)的描述进行，并进行了如下的改动。使用根瘤农杆菌AGL1转化苜蓿基因型R2336。用0.8-1OD未稀释的培养物进行共培养步骤，以及在Sh2K培养基中用3％的蔗糖代替1.5％的蔗糖。

制备用于Neu5Ac裂合酶和neuB2活性测试的细胞提取物

收集1克的BY2转化体细胞悬浮培养4天的培养物或600mg的新鲜紫花苜蓿叶，并且在含蛋白酶抑制剂(1μg/mL的胃蛋白酶抑制剂(pepstatine)，1μg/mL的E64和1mM的PMSF，Sigma)的溶液A(100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4))中破碎。然后在4℃下以10000g离心细胞提取物10分钟并用硫酸铵(终浓度80％)沉淀蛋白，然后用膜(截留分子量10000道尔顿)相对于溶液B(100mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4(用于Neu5Ac裂合酶测试)或者pH＝8.5(用于NeuB2测试)和10mM的MgCl₂)透析。然后，将蛋白用于酶测试或免疫检测。

Neu5Ac裂合酶-FLAG和neuB2-FLAG的免疫检测

将蛋白溶解于变性缓冲液(20mM Tris-HCl(pH6.8)，0.3％β-巯基乙醇，5％(v/v)甘油和1％(w/v)SDS)中，煮沸5分钟并通过SDS-PAGE在15％的聚丙烯酰胺凝胶中分离。然后将蛋白转移至醋酸纤维素膜上。对于免疫检测，用抗所述FLAG表位的兔抗血清与膜杂交。通过以下方式检测蛋白：用偶联有辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体孵育，之后使用4-氯萘酚(4-chloronaphtol)或者用化学发光反应进行显示。

Neu5Ac裂合酶和合酶的测试

通过将细胞提取物与4mM PEP、4mM NADH、20mM NaHCO₃和10mM DTE孵育来测试可溶性酶的活性。在10分钟后，通过340nm下光吸收度的减少测定NADH的氧化。通过在转化细胞提取物与Neu5Ac孵育后测定ManNAc的形成测试Neu5Ac裂合酶的裂合酶活性。在包含蛋白酶抑制剂(1μg/mL胃蛋白酶抑制剂、1μg/mL E64和1mM PMSF)和40mM Neu5Ac的溶液B(100mMTris-HCl缓冲液(pH＝7.4)和10mM MgCl₂)中于37℃下孵育细胞提取物2小时。通过在转化细胞提取物与ManNAc和丙酮酸孵育后测定Neu5Ac的形成来测试Neu5Ac裂合酶的合酶活性。在包含蛋白酶抑制剂(1μg/mL胃蛋白酶抑制剂、1μg/mL E64和1mM PMSF)以及20mM ManNAc和40mM丙酮酸的溶液B(100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)和10mM MgCl₂)中于37℃下孵育细胞提取物2小时。通过在转化细胞提取物与ManNAc和PEP孵育后测定Neu5Ac的形成测试NeuB2的合酶活性。在包含蛋白酶抑制剂(1μg/mL胃蛋白酶抑制剂、1μg/mL E64和1mM PMSF)以及10mM ManNAc和10mM PEP的溶液B(100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)和10mM MgCl₂)中于37℃下孵育细胞提取物2小时。在80℃下加热5分钟终止所述反应，并且通过在C₁₈Bond-Elut固相萃取柱上连续用水洗脱进行纯化，冷冻干燥并用于GC-EI-MS分析。

饲喂实验

4天的烟草BY2细胞与10mM Neu5Ac或30mM ManNAc在BY2培养基中于37℃下孵育2天，分别用于在体内测试Neu5Ac裂合酶或Neu5Ac合酶的活性。在2天后，用不含Neu5Ac或ManNAc的BY2培养基洗涤并收集BY2细胞。在70％的乙醇中将所述细胞加热至70℃维持15分钟以使酶失活，然后在波特匀浆器(potter homogenizer)中研磨。在70℃将所述匀浆液用70％的乙醇洗涤两次。剩下的沉淀和上清液被认为分别代表了细胞壁和胞质中游离的单糖。然后通过气相色谱对上清液部分的单糖进行分析。

GC分析

对于酶测试，首先将所述反应混合液经过C18 Seppack柱进行纯化步骤。用100％的水洗脱单糖。在冷冻干燥后，用500μL 2M无水(dry)甲醇盐酸盐在80℃将所述样品进行16小时的甲醇分解。在将甲醇蒸发后，通过加入20μL的无水乙酸酐和20μL的吡啶将所述样品再乙酰化。形成的N-乙酰甲基糖苷(甲酯)被干燥，然后被转换成其TMS-衍生物并通过气相色谱(GC)分离。所述气相色谱仪配备有火焰电离检测器、WCOT熔融二氧化硅毛细管柱(长25米，内直径0.25毫米)，使用CP-Sil 5CP作为固定相，氦气作为气体载体。炉温程序为：120℃下2分钟，每分钟升高10℃至160℃，每分钟升高1.5℃至220℃，然后每分钟升高20℃至280℃。通过峰积分对糖进行定量测定，并且使用由标准单糖建立的反应因子确定对应的摩尔值。

在植物中的瞬时表达

农杆菌的培养。在2mL含有25μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的YEB或LB培养基中，于28℃下将包含含有上述目的DNA构建体的二元载体的农杆菌克隆培养24小时。用10μL的上述培养物作为起始接种物，用于产生25mL的YEB诱导培养基(YEB培养基，10mM的2(N吗啉代)乙磺酸(MES)，pH调整至5.6，25mg/L的羧苄青霉素，50mg/L的卡那霉素，20μM的乙酰丁香酮)的培养物。将后者在摇床(220rpm)培养箱中于28℃下培养18小时，或者培养至600nm的吸光度(OD600)达到0.8-1。

非转基因烟草的栽培。在温室中，在基于泥炭的基质(AgroMix)上通过种子栽培本生烟草(Nicotiana benthamiana)和普通烟草(Nicotianatabacum)植物。幼苗起初被种植于苗圃中，然后被转移至盆中。每天灌溉植物两次，每次施以180ppm的氮。温室的条件是保持在白天25℃且晚上21℃，在长日照周期下(16小时光照/8小时黑暗的循环)使用20瓦特/平方米水平的人工光照照射植物。可以在不同的生长阶段使用植物，但优选5周-8周的植物。

构建体在烟草中的瞬时表达。在本发明中使用两种瞬时表达的方法：农杆菌接种或农杆菌浸润。在两种方法中，用外力使含有目的转化-DNA(t-DNA)的两种或三种农杆菌培养物的混合物进入叶的胞间隙中。在通过表皮的物理屏障后，所述农杆菌将感染邻近细胞，将t-DNA拷贝转移至所述植物细胞中。利用这些方法，t-DNA进入核是瞬时的，存在于所述t-DNA上的基因以附加体的形式转录并且其mRNA被翻译，导致在转化细胞中产生目的蛋白。农杆菌接种技术使用注射器产生的压力将农杆菌混合物输入至植物组织中，而农杆菌浸润使用的是受控的真空条件。

将按前文所述制备的农杆菌培养物在10000g下离心8分钟，重新悬浮于相同体积的接种培养液中(10mM的MgCl2，10mM的MES，调整至pH5.6并且添加100μM的乙酰丁香酮)，并且在接种前在室温下(RT，23℃)保持1小时。或者，在接种前可以将所述悬浮物在4℃保持24小时。本生烟草和普通烟草的瞬时转化基本上按照Liu和Lomonossoff(2002，Journal ofVirological Methods，105：343-348)的描述进行，有如下的改动。对于上述的构建体的表达，接种两种农杆菌菌株的混合物。第一种菌株包含上述克隆中的一种，第二种菌株包含来自于马铃薯病毒Y的受35S启动子控制的沉默抑制子HcPro。在接种以后，将所述植物培养在温室中。温度保持为白天最低23℃和晚上21℃。每天灌溉植物两次，每次施以180ppm的氮。在4-8天后进行生物量(biomass)的收集。

从转化的生物量制备可溶性蛋白提取物。在叶收集后直接进行分析或者在-80℃将所述生物量冷冻后对叶进行分析。称取约0.1-1g生物量的农杆菌接种叶或农杆菌浸润叶，用于产生总蛋白液体提取物。

使用下述几种提取方法产生总蛋白提取物：通过用研钵和杵研磨植物组织，通过使用polytron，或者通过在Retsch的MixerMill300(MM300)中将它研磨碎。将0.1-1g的植物生物量转移至干净并预冷的研钵中。以1:3(w/v)的比例加入预冷的提取缓冲液(50mM的Tris，150mM的NaCl且pH7.4的缓冲液，并含有2mM的CaCl₂和4％的丁醇)，还加入终浓度为1mM的PMSF和终浓度为10μM的胰凝乳蛋白酶抑制剂。用杵研磨叶，直至形成均匀的制品。然后将所述植物提取物转移至1.5mL的微型管中，并且在4℃以20,000g离心20分钟。或者，将0.1g的植物组织和0.3mL的提取缓冲液加入到非灭菌的1.5mL微型管中。在每个管中加入钨株。将管经过以3分钟为周期的30Hz的搅动。重复所述周期2次。然后按上文的描述将所述植物提取物离心。或者，使用polytron将1g的生物量在3mL的提取缓冲液中研磨碎。

在离心之后将所述上清液转移至干净的微型管中并放置在冰上。最后，通过Bradford法使用BSA作为参照蛋白测定每份蛋白提取物的总蛋白含量。

实施例1

大肠杆菌Neu5Ac裂合酶在烟草BY2细胞中的表达

将编码来自大肠杆菌K1(登录号：D00067)的Neu5Ac裂合酶的基因导入烟草BY2细胞。在使用含有大肠杆菌K1的Neu5Ac裂合酶基因的质粒pBLTI121进行农杆菌介导的转化后，产生转基因的BY2愈伤组织。另外一个构建体在C-末端被FLAG表位标记，以使得可以对转化体中的重组蛋白进行免疫检测。通过RT-PCR分析经卡那霉素抗性选择的转化体的mRNA水平。得到了以下的结果：48个转化体中有36个表达Neu5Ac裂合酶转录物，50个转化体中有30个表达Neu5Ac裂合酶-FLAG转录物。将含有最高mRNA表达水平的愈伤组织转移至悬浮培养物中用于鉴定Neu5Ac裂合酶活性。通过蛋白印迹分析确定转化的BY2细胞的蛋白胞质提取物中存在的Neu5Ac裂合酶-FLAG。使用抗FLAG抗体，在所述转化细胞中特异性地免疫检测到了表观分子量为32kDa的单条蛋白带(图1a)。

对来自表达Neu5Ac裂合酶和Neu5Ac裂合酶-FLAG的悬浮培养的BY2细胞的可溶性蛋白提取物进行了酶测试。两种提取物都显示有裂合酶活性。还对从表达未标记裂合酶的细胞分离的蛋白提取物进行了分析。首先，在存在Neu5Ac的情况下孵育这些提取物以研究它们的裂解酶活性。图1b和1c显示不存在Neu5Ac(图1b)或存在Neu5Ac(图1c)的情况下，在37℃和pH7下孵育Neu5Ac裂合酶蛋白提取物形成的终产物的GC谱。当所述提取物与Neu5Ac孵育时，清晰地检测到三个信号(峰1是内源性信号的肩峰)。这些信号洗脱的保留时间近似于标准品ManNAc的吡喃糖形式(峰1)和呋喃糖形式(峰2和3)的保留时间。通过对所述样品进行的电子碰撞质谱偶联气相色谱(GC-EI MS)确认了这些信号为ManNAcp(图1e)和ManNAcf(图1f)的1-0-甲基全甲硅烷基衍生物。m/z＝173和186的特征离子为包含氮原子(通常出现在氨基糖中)的片段。

将来自野生型烟草BY2细胞的胞质蛋白提取物与Neu5Ac在类似的条件下孵育没有导致任何ManNAc的形成(数据未显示)，因此证明在植物中没有内源性裂解酶的活性。这些数据表明，以大肠杆菌Neu5Ac裂合酶基因转化的BY2细胞表达了能够将Neu5Ac切割成D-ManNAc的功能性酶。

基于在4-10pH范围内对测试中所产生的D-ManNAc进行的GC定量(数据未显示)，所述重组酶的最适pH被确定为约7。此外，所述重组酶表现出了温度依赖的活性，在25-37℃的范围内观察到高的裂解酶活性。在pH7和37℃，来自转化细胞的可溶性蛋白提取物1小时可由10微摩的Neu5Ac生成0.5微摩的ManNAc。低于15℃时，仅检测到了剩余活性。

通过将转化烟草BY2细胞的蛋白提取物在pH7和37℃下与D-ManNAc和丙酮酸孵育，测定了重组Neu5Ac裂合酶合成Neu5Ac的能力。图2a和2b分别显示不存在或存在底物的情况下孵育后的终产物的GC谱。与对照谱(图2a)相比，存在D-ManNAc和丙酮酸的情况下进行的反应的GC谱显示的信号在保留时间上预计为Neu5Ac(图2b中的框)。该信号的电子碰撞质谱(EIMS)(图2c)显示，Neu5Ac片段特异性地具有m/z＝298和420的特征离子，也具有被指定为含氮片段的m/z＝186的离子。这些数据表明，所述重组裂合酶能够在存在D-ManNAc和丙酮酸的情况下合成Neu5Ac。

通过用10mM Neu5Ac培养烟草BY2细胞确定了所述Neu5Ac裂合酶在植物中的活性。也研究了Neu5Ac对烟草BY2细胞的毒性，通过使用碘化丙啶和二乙酸荧光素的细胞活力测试，在48小时的时间内没有出现毒性效应。在23℃-37℃的温度范围内，在48小时以后通过用GC分析胞质单糖确定D-ManNAc的形成。对所有的处理都检测了D-ManNAc(图1d)。用GC对D-ManNAc的定量显示在37℃时该氨基糖的含量比23℃时增加25倍。这些体内实验可证明，所述Neu5Ac裂合酶在植物中是有生物活性的，并且能够作用于外源提供的底物。

空肠弯曲杆菌NeuB2在烟草BY2和苜蓿植物中的表达

来自空肠弯曲杆菌(登录号：NC002163)的Neu5Ac合酶(NeuB2)催化ManNAc和PEP缩合形成Neu5Ac。在使用含有neuB2cDNA的质粒pB LTI121进行农杆菌介导的转化后，产生转基因的BY2的愈伤组织。为了免疫检测所述蛋白，另外一个构建体在C-末端被FLAG表位标记。通过RT-PCR分析经卡那霉素抗性选择的转化体的mRNA水平。将含有最高mRNA表达水平的愈伤组织转移至悬浮培养物中用于分析。然后，通过对由NeuB2-FLAG序列转化的BY2细胞分离的可溶蛋白提取物进行的蛋白印迹分析，确定了NeuB在转化的BY2细胞中的累积。如图3a所示，抗FLAG抗体特异性识别分子量为37kDa的单条蛋白带，该分子量与所述合酶的预期分子量一致。还通过农杆菌介导的转化将neuB2导入苜蓿植物，并且在体外再生植物(Tian et al.，2002)。34株转化的植物中有29株被证明表达neuB2转录物。

在对表达所述细菌Neu5Ac合酶的转化细胞或植物进行分析之前，研究了内源性Neu5Ac合酶活性的出现。将来自野生型烟草BY2细胞和苜蓿植物的可溶蛋白提取物与D-ManNAc和PEP一起孵育。在所述测试中形成的单糖经GC分离并通过GC-EI MS进行特征确定。没有检测到被指定为Neu5Ac的峰或EI MS特征离子，这表明植物不表达能够将PEP缩合到D-ManNAc上形成Neu5Ac的内源性的酶。

通过将D-ManNAc和PEP与从转化有neuB2基因的烟草BY2细胞或苜蓿植物中分离的可溶蛋白提取物进行孵育，确定了在植物中表达的重组NeuB2的合酶活性。图3b和3c显示在没有D-ManNAc和PEP(图3b)或有D-ManNAc和PEP(图3c)的情况下，在pH＝8和37℃下孵育转化的苜蓿提取物得到的GC谱。在与所述合酶的底物孵育之后，特异地检测到在Neu5Ac的预期保留时间洗脱得到的峰。该峰的EI MS表现出的裂解谱类似于标准品Neu5Ac的裂解谱，具有m/z＝298和420的特征离子。在不存在D-ManNAc的条件下孵育后，在GC谱的相应区域的EI-MS谱图中没有检测到这些离子(图3b)。

对表达NeuB2或NeuB2-FLAG序列的烟草BY2细胞的分析得到相同的结果。

因此，neuB2在烟草BY2细胞和苜蓿植物中的表达都导致功能性Neu5Ac合酶的产生。

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所有的引文通过引用的方式纳入本文。

已经就一个或多个实施方案对本发明进行了描述。然而，对本领域技术人员显而易见的是，在不背离权利要求书中限定的本发明的范围的前提下，可以进行多种修改和变动。

Claims

1.一种合成唾液酸的方法，包括：

i)提供一种包含编码N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，以及

ii)使所述植物生长并表达所述核苷酸序列从而合成唾液酸。

2.权利要求1的方法，其中所述唾液酸是Neu5Ac，并且其中在所述使植物生长的步骤后，从所述植物回收所述Neu5Ac。

3.权利要求1的方法，其中所述调控区选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

4.权利要求1的方法，其中在所述提供植物的步骤中，所述植物还包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白，并且所述第二核苷酸序列与所述核苷酸序列共表达。

5.权利要求4的方法，其中所述第二调控区选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

6.权利要求4的方法，其中为了在所述植物中表达，对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白中的一种或多种的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

7.一种产生目的蛋白的方法，包括：

i)提供一种表达一个或多个第一核苷酸序列和编码所述目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶，

8.权利要求7的方法，其中所述唾液酸化的目的蛋白包含二天线N-聚糖、三天线N-聚糖或四天线N-聚糖。

9.权利要求7的方法，其中在所述使植物生长的步骤后，所述唾液酸化的蛋白提取自所述植物。

10.权利要求9的方法，其中所述唾液酸化的目的蛋白被分离和纯化。

11.权利要求7的方法，其中在所述使植物生长的步骤后，将包含所述唾液酸化的目的蛋白的植物材料通过口服给予受试者。

12.权利要求7的方法，其中在所述使植物生长的步骤后，将所述植物进行最低限度的处理，并且将所述包含所述唾液酸化的目的蛋白的经过最低限度处理的植物材料通过口服给予受试者。

13.权利要求10的方法，其中所述唾液酸化的目的蛋白被给予受试者。

14.权利要求7的方法，其中为了在所述植物中表达，对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶的所述一个或多个第一核苷酸序列，编码所述目的蛋白的第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

15.一种植物、植物细胞或种子，包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。

16.权利要求15的植物、植物细胞或种子，还包含与在所述植物、植物细胞或种子中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。

17.权利要求16的植物、植物细胞或种子，其中所述第一调控区和第二调控区选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

18.权利要求16的植物、植物细胞或种子，其中为了在所述植物、植物细胞或种子中表达，对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白中一种或多种的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

19.一种植物、植物细胞或种子，包含一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，并且所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列与在所述植物、植物细胞或种子中有活性的一个或多个调控区可操作地连接。

20.权利要求19的植物、植物细胞或种子，其中所述一个或多个调控区选自于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。

21.权利要求19的植物、植物细胞或种子，其中为了在所述植物、植物细胞或种子中表达，对编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶的所述一个或多个第一核苷酸序列，编码所述目的蛋白的所述第二核苷酸序列，或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。

22.一种合成唾液酸的方法，包括：用编码N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列瞬时转化植物或所述植物的一部分，所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，以及表达所述核苷酸序列从而合成唾液酸。

23.权利要求22的方法，其中所述唾液酸是Neu5Ac，并且其中在所述表达步骤后，从所述植物或所述植物的一部分回收所述Neu5Ac。

24.权利要求22的方法，其中在所述瞬时转化所述植物或所述植物的一部分的步骤中，还包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质：差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶或CMP-Neu5Ac运载蛋白，并且所述第二核苷酸序列与所述核苷酸序列共表达。

25.一种产生目的蛋白的方法，包括：

ii)产生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。

26.权利要求25的方法，其中所述唾液酸化的目的蛋白包含二天线N-聚糖、三天线N-聚糖或四天线N-聚糖。

27.权利要求25的方法，其中在所述产生步骤后，从所述植物或所述植物的一部分提取所述唾液酸化的蛋白。

28.权利要求27的方法，其中所述唾液酸化的目的蛋白被分离和纯化。

29.权利要求25的方法，其中在所述产生步骤后，将包含所述唾液酸化的目的蛋白的植物材料通过口服给予受试者。

30.权利要求25的方法，其中在所述产生步骤后，将所述植物或所述植物的一部分进行最低限度地处理以产生最低限度处理的植物材料，并且将所述包含所述唾液酸化的目的蛋白的最低限度处理的植物材料通过口服给予受试者。