CN103060302A - 痢疾志贺氏菌的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a）衍生的蛋白质。本发明获得了一个编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的新基因SdNanA。将SdNanA基因克隆到原核表达载体6HisT-pRSET质粒上，在大肠杆菌中进行N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白（SdNanA）的高效表达。本发明所获得的重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。

Description

痢疾志贺氏菌的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用，特别涉及来源于痢疾志贺氏菌的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其基因与应用。

背景技术

唾液酸(Sialic acid)是一类神经氨酸的衍生物，目前已经发现的天然的唾液酸衍生物达40多种。其中最主要的是N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid,Neu5Ac）。Neu5Ac通常位于细胞表面糖蛋白和糖脂的糖链非还原末端，在许多与糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用：如细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。N-乙酰神经氨酸的生物学功能多样化，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，特别是在流感（包括禽流感H5N1和2009年的H1N1）的预防和治疗方面有良好的效果。同时，N-乙酰神经氨酸可促进神经突触的发育，对婴幼儿脑部发育非常重要，因此也被用于婴幼儿奶粉添加剂。无论是药用前景还是作为食品添加剂，N-乙酰神经氨酸都具有较高的市场价值。

N-乙酰神经氨酸可从以下几种途径获得：天然产物提取、化学合成、化学酶法、酶法合成等。N-乙酰神经氨酸可从燕窝、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取纯化难，产量低（10-20％），纯度低。

化学合成法合成N-乙酰神经氨酸，由于产物结构的复杂性，需要繁多的保护和去保护步骤。使用化学法合成N-乙酰神经氨酸反应条件苛刻，需要铟等一些贵重金属作为催化剂，N-乙酰神经氨酸得率低。因此，化学法常常和酶法结合使用。

N-乙酰神经氨酸可通过酶法合成，N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase,NanA，EC4.1.3.3）作用下生成N-乙酰神经氨酸。但ManNAc对于工业生产而言成本较高。化学酶法是一种更经济有效的生产N-乙酰神经氨酸的方法，即在碱性条件下，使N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）异构化生成ManNAc；然后采用N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。或用双酶法合成：即用GlcNAc 2-异构酶（GlcNAc2-epimerase，AGE，EC5.1.3.8）催化GlcNAc异构成ManNAc，然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶的作用下缩合产生Neu5Ac。

在工业生产中多以GlcNAc为原料生产Neu5Ac，不论是采用化学酶法还是双酶法，都需要N-乙酰神经氨酸醛缩酶。虽然N-乙酰神经氨酸醛缩酶在高等动物及一些微生物中有存在，但是生物体中其含量极微，难以分离得到足够量的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。因此如何获得性质优良的N-乙酰神经氨酸醛缩酶对N-乙酰神经氨酸的生产非常重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶。

本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，名称为SdNanA，来源于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），是如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a）衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由297个氨基酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的SdNanA可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的SdNanA的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至894位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列表中序列1的第1-894位核苷酸的DNA分子；；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码上述N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的DNA分子；

3)与1）或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由894个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

1）含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的表达盒；

2）含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的重组表达载体；

3）含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的重组微生物；

4）含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的转基因细胞系。

上述生物材料中，1）所述的含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的DNA，该DNA不但可包括启动N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA基因转录的启动子，还可包括终止N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA转录的终止子。进一步，所述含有N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体6HisT-pRSET的多克隆位点插入N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA编码基因得到的重组表达载体。3）所述的重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia），如大肠杆菌BL21（DE3）。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明的又一个目的是提供一种制备N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的方法。

本发明所提供的制备N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的方法，包括将N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA编码基因在生物细胞中进行表达得到N-乙酰神经氨酸醛缩酶的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

本发明的再一个目的是提供一种制备表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的重组微生物的方法。

本发明所提供的制备表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的重组微生物的方法，包括将N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的重组微生物的步骤。

所述的宿主微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia），如大肠杆菌BL21（DE3）。

N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA、编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子或含有编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子的生物材料在制备N-乙酰神经氨酸中的应用，也属于本发明的保护范围。

扩增编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA的核酸分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中，一条引物序列具体可如序列表中序列3所示，另一条引物序列具体可如序列表中序列4所示。

实验证明，本发明的N-乙酰神经氨酸醛缩酶SdNanA可催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，可用于生产N-乙酰神经氨酸。

附图说明

图1为SdNanA的PCR扩增结果。

左侧2个泳道均为SdNanA的PCR扩增产物，右侧泳道为DNA分子量标准。

图2为重组质粒pSdNanA的酶切鉴定结果。

M为DNA分子量标准，1为pSdNanA的酶切产物。

图3为基因工程菌pSdNanA/BL21表达产物的SDS-PAGE分析。

从左至右的5个泳道依次为蛋白质分子量标准（单位为kDa），pSdNanA/BL21的细胞破碎上清液，pSdNanA/BL21的细胞破碎沉淀，pSdNanA/BL21全细胞和pRSET/BL21的细胞破碎上清液。

图4为SdNanA纯化后的SDS-PAGE分析。

M为蛋白质分子量标准（单位为kDa），1为细胞破碎上清液，2为纯化后的蛋白。

图5为转化产物的HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、N-乙酰神经氨酸醛缩酶的制备及功能验证

一、痢疾志贺氏菌基因组DNA的提取和sdNanA基因的PCR扩增

采用细菌基因组提取试剂盒（天根公司）提取痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）CGMCC1.1869（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）基因组DNA。以提取的痢疾志贺氏菌基因组总DNA作为模板，以Sd-F和Sd-R为引物，用高保真pyrobest酶（Takara公司）PCR扩增SdNanA基因。引物序列如下：

Sd-F：5′CGACGCACATATGGCAACGAATTTACGTGGC  3′（序列表中序列3）

Sd-R：5′ATAGGATCCTCACCCGCGCTCTTGCATCAACT  3′（序列表中序列4）

PCR程序为：先95℃5分钟；然后在如下条件下进行30个循环：95℃30s，58℃30s，72℃1分钟20秒；最后72℃10分钟。

PCR扩增出900bp左右的片段（图1，箭头示），回收后经过NdeI/BamHI双酶切后连接到克隆载体上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定；测序结果表明，克隆得到的DNA序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由894个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由297个氨基酸残基组成。将该基因命名为sdNanA，将其编码的蛋白命名为SdNanA。

二、含有sdNanA的重组表达载体的构建

将上述步骤一得到的PCR扩增片段用NdeI和BamHI酶切，回收目的片段；同时用NdeI和BamHI酶切载体6HisT-pRSET（公众可从中国科学院微生物所获得，记载过该材料的非专利文献是：TAO,Y.,Guermah,M.,Martinez,E.,

T.，Hasegawa,S.,Takada,R.,Yamamoto,T.,Horikoshi,M.and Roeder,R.G.(1997)SpecificInteractions and Potential Functions of Human TAFII 100.Journal of Biological Chemistry272：6714-6721.），回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段16℃连接，得到目的质粒。将目的质粒用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自Takara，产品目录号为D9057A）。将其均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用NdeI和BamHI进行双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，从图中可见，获得了2900bp左右和900bp左右的酶切片段（图2中箭头示）。将酶切验证正确的质粒进行测序，测序结果表明，在载体6HisT-pRSET的NdeI和BamHI酶切位点间插入了序列表中序列1所示的sdNanA基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pSdNanA。

三、重组表达SdNanA蛋白的基因工程菌的构建及SdNanA蛋白的表达

将重组质粒pSdNanA用氯化钙法转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自天根公司，目录号CB105-02），氨苄青霉素筛选培养，挑取单克隆，以Sd-F和Sd-R为引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定得到900bp左右PCR产物的阳性克隆作为基因工程菌，命名为pSdNanA/BL21。挑取pSdNanA/BL21单菌落37℃振荡培养过夜以获得饱和培养。按照1%的体积比接种于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导5小时后，离心收集菌体，PBS重悬菌体后进行超声波破碎细胞，制样后进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，从图中可见，SdNanA在大肠杆菌中得到高效表达，且蛋白以可溶的形式表达，大小约32kDa。

按照相同的方法将6HisT-pRSET转入大肠杆菌BL21（DE3），将得到的重组大肠杆菌名为pRSET/BL21。将pRSET/BL21作为空载体对照菌按照上述方法进行诱导表达。结果空载体对照菌中没有得到大小约为32kDa目的蛋白。

四、SdNanA蛋白的纯化

将基因工程菌pSdNanA/BL21以1％（体积比）接种量接种至3瓶100ml含有氨苄抗性的自诱导培养基ZYM中，30℃，250rpm条件下进行诱导（加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG），20h后4℃，12000rpm离心，收集菌体。将菌体悬浮于30mlBinding Buffer（20mM Tris；300mM NaCl；20%甘油）中，冰浴，超声波破碎细胞（超声功率400W，破碎5s，间歇10s，总时长60分钟）。将破碎后的菌液于4℃，12000rpm离心20分钟，取上清，用0.22μm滤膜过滤后，用镍柱进行纯化获得单一条带的SdNanA蛋白（图4，泳道1为细胞破碎上清，泳道2为纯化后的蛋白）。将纯化后的蛋白用透析袋除去咪唑，获得纯化的SdNanA蛋白。

含有氨苄抗性的自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μLD+100μL E（以下百分浓度均为质量百分比浓度）；

A.ZY：溶质及其浓度为1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉；溶剂为水。

B.50×M：溶质及其浓度为1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；溶剂为水。

C.50×5052：溶质及其浓度为25%甘油，2.5%葡萄糖，10%乳糖；溶剂为水。

D.溶质及其浓度为1M MgSO₄；溶剂为水。

E.1000×微量元素：溶质及其浓度为50Mm FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM；溶剂为水。

五、SdNanA蛋白的酶活性测定

对SdNanA蛋白进行酶活测定，反应体系为：50mM Tris-HCl pH7.0，10mM N-乙酰甘露糖胺（ManNAc），8.75mM丙酮酸（pyruvic acid，pH7.0），步骤四中从基因工程菌pSdNanA/BL21诱导表达产物中纯化的SdNanA蛋白1mg，反应体系为100μl。37℃反应30分钟后煮沸2分钟终止反应。实验设三次重复，结果取平均值。酶活单位定义为37℃条件下每分钟产生1μmol N-乙酰神经氨酸所需要的酶量为一个单位（U）。

用HPLC来检测生成的N-乙酰神经氨酸，色谱条件为：色谱柱：Aminex HPX-87H(BioRad,CA,USA)；流动相：6mM H₂SO₄水溶液；流动相流速：0.55mL/min；检测器：UV 210nm；进样量：10μl；温度：65℃。HPLC结果如图5所示，图5中A为N-乙酰神经氨酸标准品（购自sigma公司）的HPLC图谱，从图中可见，N-乙酰神经氨酸标准品的保留时间为8.565分钟；图5中B为步骤四中从基因工程菌pSdNanA/BL21诱导表达产物中纯化的SdNanA蛋白的HPLC图谱，从图中可见，保留时间为8.568分钟处为N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）的峰（1）；9.881min处为丙酮酸的峰（2）；11.843min处为ManNAc的峰（3）。此结果说明SdNanA蛋白具有催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸的酶活性。

以外标法定量测定N-乙酰神经氨酸的浓度，在该色谱条件下，N-乙酰神经氨酸标准品的标准曲线是C=0.000601*A(A：峰面积，C：浓度mM)。按照如下公式计算酶活力（U）：，U=C*稀释倍数*1000/30min/蛋白量（mg）。实验设三次重复，结果表明从基因工程菌pSdNanA/BL21诱导表达产物中纯化的SdNanA蛋白的酶活为0.27±0.03U/mg。

Claims (9)

1.一种蛋白，是如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a）衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列表中序列1的第1-894位核苷酸的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

4.下述1）-4）中的任一种生物材料：

1）含有权利要求3所述核酸分子的表达盒；

2）含有权利要求3所述核酸分子的重组表达载体；

3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；

4）含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。

5.制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

6.制备表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物的步骤。

7.权利要求1所述的蛋白质在作为N-乙酰神经氨酸醛缩酶中的应用。

8.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。

9.扩增权利要求2或3所述核酸分子全长或其任一片段的引物对。

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