CN104781406B - 胁迫诱导型衍生启动子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非生物胁迫诱导型衍生启动子，所述非生物胁迫诱导型衍生启动子来自含有可操作地连接异源可转录DNA序列的Xerophyta viscosa、核苷酸盒、重组载体、细胞和转基因植物。

Description

胁迫诱导型衍生启动子

发明背景

本发明涉及通过非生物胁迫可诱导的衍生植物启动子，以及用所述非生物胁迫诱导性启动子转化的宿主细胞和转基因植物。

非生物胁迫包括干旱、盐度和极端温度。这些胁迫，特别是干旱，引起农作物生产重大的损失。作物耐受干旱条件的能力将是有益于降低这些损失。

PCT/IB2008/054628(公开为WO2009/060402)中描述了在非生物胁迫条件下可诱导的植物启动子，将其内容通过引用合并入本文中。总的来说，与通过组成型启动子的高水平转基因表达相比，胁迫诱导性启动子在转基因植物中具有低的基因表达水平。另一方面，发现从耐干燥的单子叶植物Xerophyta viscosa的基因组分离的胁迫诱导型启动子XvPSap1有效地表达。然而，XvPSap1启动子具有缺陷，因为序列相对大。大的启动子大小是其用于转基因植物研发中的限制因素，因为转基因DNA序列越长，转化效率和形状稳定性越低。因此，这将很大程度地限制XvPSap1在生物技术应用中的使用。

因此，对可以用于转化作物并且其具有短于XvPSap1的长度而且仍然能够至少起到与XvPSap1同样好的作用的非生物胁迫诱导型启动子存在需求。

发明内容

根据本发明的第一个实施方案，提供了从Xerophyta viscosa分离的衍生植物启动子核苷酸序列，其作为通过非生物胁迫可诱导的植物启动子。

所述核苷酸序列可以源自Xerophyta viscose XvPSap1或可以人工合成。

衍生启动子片段核苷酸序列可以包括如下鉴定的一个或多个调控元件：富TC重复序列actttctcca，attttctaac；MYB转录因子结合位点或ABA-应答原件 如图15中所说明的。

所述核苷酸序列可以是：

(a)呈现出SEQ ID NO:1至3中任一个的至少80％序列同一性的核酸序列(图1至3)；或

(b)在严格条件下与SEQ ID NO:1至3中任一个的相反补体杂交的序列(图4至6)；或

(c)SEQ ID NO:1-3中任一个的核酸序列。

优选，所述衍生启动子作为非生物胁迫诱导型启动子起作用。

更优选，所述核苷酸序列可以具有SEQ ID NO:1至3任一个的至少85％、90％或95％同一性。

甚至更优选，核苷酸序列可以是SEQ ID NO:1至3的任一个(图1至3)或在严格条件下与SEQ ID NO:1至3中任一个的相反补体杂交的序列(图4至6)并且作为非生物胁迫诱导型启动子起作用。

所述非生物胁迫可以是渗透胁迫、脱水胁迫、干旱、盐度、干燥或极端温度。

杂交可以在包括约60℃至约65℃下的0.1SSC中洗涤的严格条件下进行。

根据本发明的再一个实施方案，提供了包含本发明启动子片段的核苷酸盒。

根据本发明的再一个实施方案，提供了包含本发明启动子片段的重组植物载体。

所述核苷酸盒或植物载体可以进一步包含异源可转录DNA序列。根据本发明的一个实施方案，异源可转录DNA序列，可操作地连接启动子，可以是编码目标多肽的基因。例如，所述基因可以是耐非生物胁迫基因，其通过植物中的启动子表达时，提供对非生物胁迫的耐受性。更优选，所述基因可以是XvSap1、XvPrx2、XvPer1、XvAld或本领域技术人员已知的任何其他提供非生物胁迫耐受性的基因。

在本发明可替换的实施方案中，所述基因是期望通过非生物胁迫可诱导地在植物中表达的任何基因。所述基因可以是植物基因或外源基因，如动物、细菌、真菌或病毒基因。

再在本发明的另一个实施方案中，异源可转录DNA序列包括转录成功能性RNA(如，shRNA、miRNA、siRNA、mRNA等)的目标多核苷酸序列。

重组植物载体可以是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-衍生质粒构建体。

根据本发明的再一个实施方案，提供了其中已经转化了核苷酸盒或植物载体的宿主细胞。

宿主细胞可以是植物细胞。

根据本发明的再一个实施方案，提供了用本发明的最小植物启动子片段转化的转基因植物或植物部分和可操作地连接本发明的最小植物启动子片段的基因。例如，所述基因可以是耐非生物胁迫基因，其在转基因植物或植物部分中表达时，提供非生物胁迫的耐受性。更优选，基因可以是XvSap1、XvPrx2、XvPer1、XvAld或本领域技术人员已知的任何其他提供非生物胁迫耐受性的基因。

在本发明的可替换实施方案中，所述基因是期望通过非生物胁迫可诱导地在转基因植物或植物部分中表达的任何基因。所述基因可以是植物基因，包括本领域技术人员已知的适于提供非生物胁迫耐受性的植物基因，包括但不限于XvSap1、XvPrx2、XvPer1、XvAld，或所述基因可以是外源基因，如动物、细菌、真菌或病毒基因。

所述转基因植物可以是单子叶或双子叶植物，如玉米、烟草、高粱、小麦、木薯、大麦、燕麦、黑麦、甘薯、大豆、苜蓿、烟草、向日葵、棉花、油菜等。

所述转基因植物部分可以选自由以下组成的组：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞碎屑、胚芽、花粉、胚珠、种子、花、核仁、耳穗、穗轴、叶子、壳、茎、根、根尖、花药、种子和须。

根据本发明的再一个实施方案，提供了通过在启动子控制下引入可操作地连接耐非生物胁迫基因的本发明的最小启动子片段来增强胁迫耐受性的方法，所述启动子在转基因植物或植物部分中表达时，提供了非生物胁迫的耐受性。例如，所述基因可以是XvSap1、XvPrx2、XvPer1、XvAld或本领域技术人员已知的任何其他提供非生物胁迫耐受性的基因。

再在本发明的另一个实施方案中，提供了调控异源可转录DNA序列在宿主细胞或转基因植物中的转录的方法。

再一个实施方案结合通过用本文中所述的核苷酸盒转化植物细胞来生产转基因植物以及从转化的细胞再生植物。

附图简述

图1：显示了XvPSap1D的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

图2：显示了XvPSap1E的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。

图3：显示了XvPSap1G的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。

图4：显示了XvPSap1D的相反补体核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。

图5：显示了XvPSap1E的相反补体核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。

图6：显示了XvPSap1G的相反补体核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。

图7：显示了luc基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。

图8：显示了NosT的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。

图9：显示了pTF101.1载体的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)。

图10：显示了与全长XvPSap1相比的最小XvPSap1启动子片段的示意图。

图11：显示了结合了启动子片段的pBluescript DNA的扩增。A：pBluescript::XvPSap1D。B：pBluescript::XvPSap1E。C：pBluescript::XvPSap1F。D：pBluescript::XvPSap1G。泳道M：1kb DNA阶梯。泳道1和2：pBluescript::启动子片段。泳道3：NTC。

图12：显示了pBluescript启动子构建体的示意图。

图13：显示了pBluescript::启动子::luc:NosT的限制性核酸内切酶分析。A：pBluescript::XvPSap1D::luc:NosT和pBluescript::XvPSap1E::luc:NosT。泳道1：未消化的pBluescript::XvPSap1D::luc:NosT。泳道2、4和6：pBluescript::XvPSap1D::luc:NosT的EcoRI和BamHI限制性消化物。泳道3、5和7：pBluescript::XvPSap1D::luc:NosT的EcoRI和HindIII限制性消化物。泳道8：未消化的pBluescript::XvPSap1E::luc:NosT。泳道9、11和13：pBluescript::XvPSap1E::luc:NosT的EcoRI和BamHI限制性消化物。泳道10、12和14：pBluescript::XvPSap1E::luc:NosT的EcoRI和HindIII限制性消化物。B：pBluescript::XvPSap1F::luc:NosT和pBluescript::XvPSap1G::luc:NosT。泳道1：未消化的pBluescript::XvPSap1F::luc:NosT。泳道2、4和6：pBluescript::XvPSap1F::luc:NosT的EcoRI和BamHI限制性消化物。泳道3、5和7：pBluescript::XvPSap1F::luc:NosT的EcoRI和HindIII限制性消化物。泳道8：未消化的pBluescript::XvPSap1G::luc:NosT。泳道9、11和12：pBluescript::XvPSap1G::luc:NosT的EcoRI和BamHI限制性消化物。泳道10、13和14：pBluescript::XvPSap1G::luc:NosT的EcoRI和HindIII限制性消化物。泳道M1和M2：分别为1kb和100bp DNA阶梯。

图14：显示了pTF101.1::启动子::luc:NosT质粒DNA的EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶消化物。泳道M：1kb DNA阶梯。泳道1：未消化的pTF101.1::启动子_片段::luc:NosT DNA。泳道2和3：消化的pTF101.1::XvPSap1D::luc:NosT。泳道4和5：pTF101.1::XvPSap1E::luc:NosT。泳道6和7：消化的pTF101.1::XvPSap1F::luc:NosT。泳道8和9：消化的pTF101.1::XvPSap1G::luc:NosT。

图15：显示了最小XvPSap1启动子中的推定(putative)调控元件。富TC重复序列：actttctcca，attttctaac；MYB结合位点ABRE：

图16：显示了六天脱水处理过程中转基因和野生型N.tabacum植物的荧光素酶活性。A：含水的转基因植物。B：用XvPSap1D转化的转基因植物。C：用XvPSap1E转化的转基因植物。D：用XvPSap1G转化的转基因植物。

图17：显示了六天脱水处理过程的转基因N.tabacum植物中的荧光素酶mRNA水平。A：含水的转基因植物。B：用XvPSap1D转化的转基因植物。C：用XvPSap1E转化的转基因植物。D：用XvPSap1G转化的转基因植物。

图18：显示了六天脱水处理过程中转基因N.tabacum植物中的荧光素酶活性。A：用XvPSap1D转化的T3转基因植物。B：用XvPSap1G转化的T3转基因植物。每个数据点表示四个生物学植物的平均和标准偏差。

图19：显示了六天脱水处理过程中转基因N.tabacum植物中的荧光素酶mRNA水平。数据点表示20个重复的平均(4个生物制品，每个5种技术)。A：用XvPSap1D转化的T3转基因植物。B：用XvPSap1G转化的T3转基因植物。误差棒表示每个时间点的四个生物学植物的五个技术重复的标准偏差。

具体实施方式

现在下文将参考附图更全面地描述本发明，所述附图中显示了本发明的一些但非全部的实施方案。

所述的本发明不应当限于公开的特定实施方案，并且打算将修改和其他实施方案包括在本发明的范围内。尽管本文中使用了特定术语，但它们仅仅是以一般性的和描述性的含义来使用，并非用于限制的目的。

本文中使用的术语具有本领域认知的普通含义，除非另外指出。

本发明提供了具有基因调控活性并且是源自单子叶植物Xerophyta viscosa的XvPSap1(SEQ ID NO:9)启动子的多核苷酸。本发明的衍生启动子片段呈现出调控活性并且是通过非生物胁迫可诱导的。本发明还涉及用非生物胁迫诱导型启动子片段转化的宿主细胞或转基因植物。

与通过组成型启动子的高水平转基因表达相比，胁迫诱导型启动子在转基因植物中导致低的表达水平。例如，XvPSap1非生物胁迫诱导型启动子具有有效的表达水平，但由于启动子的尺寸大，其在转基因植物研发中的使用是有问题的。之前对改进XvPSap1启动子和产生较短的功能活性启动子片段的尝试聚焦于产生5’平截启动子片段，以调控脱水状况下烟草和黑墨西哥甜玉米(BMS)中报道基因的表达。这些5’启动子片段呈现出明显低于全长XvPSap1启动子的表达水平(Oduor等，2009)。由于它们减弱的功能性，XvPSap1启动子的5’启动子片段具有有限的商业用途和/或生物学功能性。

令人惊讶地，然而，当诱变研究在XvPSap1启动子内产生内部删除以产生本发明的衍生启动子片段时，四个衍生启动子片段中的三个，本文中称为XvPSap1D(SEQ ID NO:1)、XvPSap1E(SEQ ID NO:2)和XvPSap1G(SEQ ID NO:3)(图1至3)，引发高水平的基因表达，至少等于全长XvPSap1启动子，没有不利地影响植物生长。本发明的衍生启动子片段比全长XvPSap1启动子大约短50％，并且与全长启动子仅共享40％至50％序列同一性。因此，设想XvPSap1D、XvPSap1E和XvPSap1G启动子片段序列中任一个的83％内的核苷酸序列将是功能性的并且引发高水平基因表达。

如本文中使用的，将关于XvPSap1D、XvPSap1E和XvPSap1G序列的“百分比(％)序列同一性”定义为将序列比对并且如果需要引入缺口以获得最大百分比序列同一性好，候选序列分别与XvPSap1D、XvPSap1E或XvPSap1G序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。用于测定百分比序列同一性目的的比对可以以本领域技术人员知识内的各种方式来实现。这些方式包括，例如，使用计算机软件，如ALIGN、Megalign(DNASTAR)、CLUSTALW或BLAST软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在比较的全长序列获得最大比对需要的任何算法。

在本发明的一个实施方案中，提供了具有本文中所述的衍生启动子序列(即XvPSap1D、XvPSap1E或XvPSap1G)的至少约80％序列同一性，至少约90％序列同一性，或甚至更高序列同一性，如约95％，约96％，约97％，约98％或约99％序列同一性的多核苷酸序列。因此，能够调控可操作地连接的多核苷酸序列的转录并且具有本发明的XvPSap1D、XvPSap1E和XvPSap1D多核苷酸序列的高于80％序列同一性的多核苷酸序列包括在本发明的范围内。

本发明还包括能够在严格条件下与XvPSap1D、XvPSap1E和XvPSap1G衍生启动子片段序列中的任一个的相反互补序列杂交的多核苷酸序列(图4至6)。杂交反应的“严格性”是本领域普通技术人员容易确定的，并且通常是经验主义的计算，其取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度。通常，对于正确的退火，较长的探针需要较高的温度，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA重新退火的能力。这样的“严格”杂交条件的典型实例将是在65℃下使用温和振荡进行18小时的杂交，第一次洗涤在洗涤缓冲液A(0.5％SDS；2×SDS)中在65℃下12min，而第二次洗涤在洗涤缓冲液B(0.1％SDS；0.5％SSC)中在65℃下10min。

将XvPSap1D、XvPSap1E和XvPSap1G启动子片段插入可操作连接的异源可转录DNA序列的上游，并且将这一构建体克隆至载体中。将认识到启动子片段和异源可转录DNA序列可以按序克隆至载体中。在这一构造中，启动子片段可操作地连接相关异源可转录DNA序列并且可以诱导地调控异源可转录DNA序列的转录。对于用于植物转化中的载体，需要什么是本领域技术人员显而易见的。本领域技术人员也知道还可以将特定的组成部分引入载体中，包括，但不限于，3’未翻译区，如终止子；5’未翻译区，如调控元件；增强子；内含子；信号肽；转运肽；和其他组成部分。然后可以使用本领域技术人员已知的任一种植物转化方法，将载体引入植物中，以产生转基因植物。“转基因植物”是指植物或其后代，其中植物的DNA含有已经稳定地引入植物中的外源DNA片段并且其中外源DNA是可遗传的。

在本发明的衍生启动子片段控制下的异源可转录DNA序列可以包括编码多肽的多核苷酸序列或翻译成功能性RNA的多核苷酸序列。

编码可以在衍生植物启动子的控制下诱导表达的目标多肽的异源可转录DNA序列包括，但不限于，给予转化植物所需特征的基因和/或编码经济上重要的多肽的基因。优选，在本发明的启动子片段控制下的转基因可以编码多肽，包括但不限于：耐非生物胁迫的蛋白质；抗体；生物燃料；生物聚合物；工业酶；药物多肽；影响水果成熟的蛋白质，提供提高的营养物含量的蛋白质，包括影响例如脂肪酸、油、蛋白质和/或淀粉产量的蛋白质；影响抗性的蛋白质，包括例如抗细菌蛋白质、抗真菌蛋白质、抗除草剂蛋白质、抗昆虫蛋白质、抗线虫蛋白质或抗病毒蛋白质。或者，异源可转录DNA序列可以翻译成RNA分子，如调控RNA，包括例如miRNA、siRNA、反义RNA等。当转基因植物接受非生物胁迫时，包括干旱、盐度、温度胁迫、干燥、渗透胁迫或干燥，异源可转录DNA序列在衍生启动子片段的控制下表达。预期编码表达形态学中的表型或变化的多肽或mRNA的任何多核苷酸可以用于本发明的实施中。

在本发明的优选实施方案中，提供了耐非生物胁迫的转基因植物的生产，这样的转基因植物包括在本发明的可诱导启动子片段控制下的转基因，如XvSap1、XvPrx2、XvPer1或XvAld(Garwe等，2003，Garwe等，2007，Iyer等，2007和Bhatnagar-Mathur等，2008)，上述基因是编码给予植物非生物胁迫耐受性的多肽的基因的实例。

在本发明中，发明人已经表明了用本发明的衍生启动子片段转化双子叶植物导致可操作地连接启动子并且在启动子控制下的异源可转录DNA序列的转录。然而，预期如果没有更好，将与从单子叶植物Xerophyta viscosa分离衍生启动子片段一样，在单子叶植物中也能很好地执行功能。

包含本发明的衍生启动子片段和目标异源可转录DNA序列的构建体可以用于转化易受非生物胁迫影响的任何植物，特别是作物，如玉米、小麦、水稻、烟草、木薯、高粱、甘薯、大麦、燕麦、黑麦、大豆、苜蓿、向日葵、棉花、油菜等。因此，衍生非生物胁迫诱导型启动子片段的一个可能的商业用途是产生尽管暴露于非生物胁迫但生理学上正常的植物。还可以期望通过将转基因植物接受非生物胁迫，使用所述系统，可诱导地打开其他植物或外源基因，如转基因植物中的细菌、病毒或真菌的基因。

通过以下实施例进一步描述本发明。然而，这些实施例不是解释为以任何方式限制本发明的实质或范围。

实施例1

XvPSap1的诱变

在重组pBluescript::XvPSap1质粒中的XvPSap1(SEQ ID NO:9)启动子上进行内部删除，产生四个缩短的启动子片段，称为XvPSap1D(SEQ ID NO:1)、XvPSap1E(SEQ ID NO:2)、XvPSap1F(SEQ ID NO:7)和XvPSap1G(SEQ ID NO:3)。设计了两个正向引物(引物A(SEQID NO:12)和引物B(SEQ ID NO:13))和两个反向引物(引物C(SEQ ID NO:14)和引物D(SEQID NO:15))(表1)。引物A和B结合XvPSap1的3’-段，分别用于XvPSap1启动子的378bp和575bp片段的扩增(图10A)。相似地，引物C和D结合XvPSap1的5’端，分别用于XvPSap1启动子的546bp和358bp片段的扩增(图10A)。诱变策略涉及使用各自的正向和反向引物的组合物来产生线性化pBluescript载体中的四个推定启动子(图10B)。引物组B和C产生了XvPSap1D启动子片段，B和D产生了XvPSap1E启动子片段，A和C产生了XvPSap1F启动子片段以及A和D产生了XvPSap1G启动子片段。

表1：用于产生各自的pBluescript::XvPSap1启动子片段的引物

对于每个扩增，如下设置25μl反应体积：1X标准缓冲液，0.4μM的每种引物，0.2mMdNTP混合物，0.04U/μl Taq聚合酶，5ng/ul模板DNA，用dH₂O补足最终体积。使用高保真聚合酶(Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，Thermo Scientific)，其具有校对活性。使用以下条件进行扩增：94℃5min；94℃30s，52℃45s，68℃1min，5个循环；接着94℃30s，56℃45s，68℃1min，25个循环；和最后68℃延伸10min。使用GeneAmp9700热循环仪(AppliedBiosystems)进行了PCR反应。

将产生的PCR产物在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳。根据制造商的说明，切除目标条带，并且使用Wizard SV凝胶纯化试剂盒(Promega)纯化。

根据制造商的说明，用Klenow Fragment exo-(Fermentas)处理线性化pBluescript DNA，以促进钝端克隆。如下设置含有XvPSap1D、E、F和G启动子片段的线性化pBluescript DNA的标准钝端连接反应：在20μl的总反应体积中重新连接线性化载体，每个连接反应含有10U T4DNA连接酶和终浓度为1X的连接酶缓冲液(New England Biolabs，USA)，将连接反应温和混合，简短离心，然后在4℃下孵育16小时。

将重组pBluescript质粒(pBluescript::XvPSap1D、E、F和G)转化至感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞中。使感受态细胞在冰上融化。此后，将10μl连接混合物加入100μl等份的感受态细胞中并且温和混合。将这一转化混合物在冰上孵育10min，然后通过在37℃下孵育5min进行热休克，接着立即在冰上孵育2min。将800微升LB培养液加入转化的细胞中并且用强烈搅拌在37℃下孵育1h。将100微升转化混合物涂布于补充了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，并且在37℃下孵育16h。

进行克隆PCR，以使用启动子特异性引物(EcoRI-XvPsap1-F5’-GGAATTCACTGTCTGGTAGCTGG-3’(SEQ ID NO:16)和(BamHI-XvPSap1-R5’-TCCGGATCCTCCCTAATATCTCTCGCTC-3’(SEQ ID NO:17)来鉴别转化的克隆。如下设置25μl PCR扩增反应：1×标准缓冲液，0.4μM的每种引物，0.2mM dNTP混合物，0.04U/μl Taq聚合酶，5ng/ul模板DNA，用dH₂O补足至最终体积。将热稳定性DNA聚合酶，Supertherm Polymerase(Bertec Enterprise)用于扩增。使用以下条件进行扩增：94℃5min；94℃30s，59℃45s，72℃1min，30个循环；和最终72℃延伸10min。

将通过克隆PCR筛选观察到是阳性的克隆接种至补充了100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养液中并且在37℃下振荡孵育16h。对于每个构建体，根据制造商的说明书，使用Bioflux质粒DNA提取和纯化试剂盒(Bioer)分离来自3个不同克隆的质粒DNA。将纯化的质粒DNA储存在-20℃。将质粒DNA测序并且基于序列数据，针对每个启动子构建体选择一个重组质粒用于进一步的下游分析。

成功地扩增了pBluescript::启动子片段，然而，还观察到了通过较高和较低分子量条带显示的非特异性扩增(图11)。在泳道1和2中观察到了对应于大约4kb片段的强条带。该条带对应于线性XvPSap1D、E、F和G启动子片段的预期大小(分别为图11A、B、C和D)。作为负对照，包括没有使用模板的对照PCR反应。在这一对照反应中观察到没有扩增。

成功切除扩增的DNA片段，纯化并用Klenow聚合酶处理，以促进钝端连接。将连接混合物转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中。针对pBluescript::XvPSap1D、E、F和G构建体的每一个，选择十五个克隆用于筛选。所有选择的克隆含有所需的启动子片段。针对每个启动子片段，选择三个克隆用于进一步的分析。测序结果证实了四个缩短的启动子片段已经在pBluescript中成功连接。

实施例2

pBluescript::启动子片段::luc::NosT的产生

使用EcoRI和BamHI的含有启动子片段的pBluescript载体的核酸内切酶消化允许启动子构建体从pBluescript质粒切割。相似地，pBluescript::XvPSap1::luc::NosT的EcoRI和BamHI双重消化(图12)允许去除原始的XvPSap1启动子，形成具有EcoRI和BamHI悬垂物的线性化pBluescript::luc::NosT。

使用EcoRI和BamHI(FastDigest，Fermentas)，在60μl的总体积中消化了三微克的每种重组pBluescript质粒。反应混合物含有6μl 10×FastDigest缓冲液，3单位FastDigest EcoRI和3单位FastDigest BamRI。相似地，使用EcoRI和BamHI(FastDigest，Fermentas)，在80μl的总体积中消化了4μg的pBluescript::XvPSap1::luc::NosT。反应混合物含有8μl10×FastDigest缓冲液，4单位FastDigest EcoRI和4单位FastDigest BamRI。将消化混合物在37℃下孵育1h。

将消化的产物在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳，并且切除消化的消化产物并根据制造商的说明书，使用Wizard SV凝胶纯化试剂盒(Promega)纯化。

如下设置位点特异性粘性末端连接反应：在20μl的反应体积中，将纯化的DNA片段(插入DNA)连接线性化载体。每个连接反应含有10U T4DNA连接酶和1X终浓度的连接酶缓冲液(New England Biolabs，USA)。将连接反应温和混合，简短离心，然后在4℃下孵育16小时。

根据实施例1中所述的实验方案，将重组pBluescript质粒(pBluescript::XvPSap1D、E、F、G::luc::NosT)转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中。将转化的细胞涂布于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上并且在37℃下孵育16h。

进行克隆PCR，以使用启动子特异性引物(EcoRI-XvPSap1-F(SEQ ID NO:16)和(BamHI-XvPSap1-R)(SEQ ID NO:17)鉴别阳性转化的克隆。对于每个扩增，如下设置25μl体积：1×标准缓冲液，0.4μM的每种引物，0.2mM dNTP混合物，0.04U/μl Taq聚合酶，5ng/μl模板DNA，用dH₂O补足至最终体积。根据实施例1中所述的实验方案进行扩增。将阳性克隆接种至5ml补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，并且在37℃下振荡培养16h。对于每个重组质粒，根据制造商的说明书，使用Bioflux质粒DNA提取和纯化试剂盒(Bioer)分离3个不同克隆。

通过核酸内切酶消化评价重组质粒DNA。使用EcoRI和BamHI(FastDigest，Fermentas)，在20μl总体积中消化500ng重组质粒DNA。反应混合物含有2μl 10×FastDigest缓冲液，1单位FastDigest EcoRI和1单位FastDigest BamRI。将反应混合物在37℃下孵育1h。此后，将消化的产物在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳。对于每个启动子构建体，选择重组质粒，用于进一步的下游分析。将未消化的质粒DNA储存在-20℃。

为了促进之后的定性和定量分析，在luc和NosT上游单独克隆缩短的启动子。为此，用EcoRI和BamHI成功消化含有缩短的启动子XvPSap1D、E、F和G的单独pBluescript载体，以释放各自的启动子片段。消化产物电泳后，观察到各自对应于XvPSap1D、E、F和G大小的1.103kb、0.913kb、0.903kb和0.713kb的单个线性条带。相似地，pBluescript::XvPSap1::luc::NosT的EcoRI和BamHI双重消化成功除去原始的XvPSap1启动子，形成了具有EcoRI和BamHI悬垂物的线性化pBluescript::luc::NosT。将消化产物电泳时，观察到了对应于pBluescript::luc::NosT预期大小的大约5kb的单个条带。

将目标XvPSap1启动子片段成功切除，纯化并设置粘性末端连接反应。将连接混合物成功地转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中。

对于每个构建体，选择15个克隆用于筛选。在每种情况中，14或15个克隆含有XvPSap1D、E、F或G。

实施例3

二元载体构建体的产生

使用EcoRI和BamHI消化pBluescript::启动子_片段::luc::NosT构建体允许从重组质粒切割每个缩短的启动子盒。相似地，pTF101.1(SEQ ID NO:29)的EcoRI和BamHI双重消化形成了具有粘性EcoRI和HindIII悬垂物的线性化pTF101.1。pTF101.1是用于植物转化实验方案中的二元载体。

最初，使用PvuII(Fermentas)在20μl的总体积中消化3μg的每种重组质粒。将含有2μl 10×缓冲液G和1单位PvuII的反应混合物在37℃下孵育1h。由于相似的大小(大约3kb)，PvuII消化物是区分启动子盒和pBluescript载体所必需的。PvuII切割pBluescript，产生两个大约2.4kb的片段和单个0.5kb的片段。PvuII没有切割启动子构建体。因此，可以区分pBluescript和启动子盒。将消化产物在1％EtBr染色琼脂糖凝胶上电泳，并根据制造商的说明书，使用EZ-10旋转柱PCR纯化试剂盒(Bio Basic Inc)纯化。

使用EcoRI和HindIII(FastDigest，Fermentas)，在50μl的总体积中，消化PvuII消化的纯化启动子盒。反应混合物含有5μl 10×FastDigest缓冲液，3单位FastDigest EcoRI和3单位FastDigest HindIII。将消化混合物在37℃下孵育1h。相似地，使用EcoRI和HindIII消化3μg pTF101.1。将消化产物在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳，并切除所需的消化产物，并根据制造商的说明书，使用Wizard SV凝胶纯化试剂盒(Promega)纯化。

使用50ng载体，针对1:3的载体与插入片段比例，按照实施例2中所述的设置位点特异性粘性末端连接反应。将反应组分充分混合并在4℃下孵育16h。

根据实施例1中所述的实验方案，将重组pBluescript::启动子_片段::luc::NosT转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中。将转化的细胞涂布于补充了100μg/ml链霉素的LB琼脂上，并在37℃下孵育16h。

进行克隆PCR，以使用启动子特异性序列(EcoRI-XvPSap1-F(SEQ ID NO:16)和BamHI-XvPSap1-R(SEQ ID NO:17))鉴别阳性转化的克隆。对于每个扩增，使用实施例1中所述的组分浓度和克隆PCR扩增条件来设置25μl反应体积。

将通过克隆PCR筛选观察到是阳性的克隆接种于5ml补充了100μg/ml链霉素的LB培养液中并在37℃下振荡孵育16h。对于每个构建体，根据制造商的说明书，使用Bioflux质粒DNA提取和纯化试剂盒(Bioer)分离来自3个不同克隆的质粒DNA。

通过核酸内切酶消化来评价分离的重组质粒DNA。使用EcoRI和HindIII(FastDigest，Fermentas)，在20μl总体积中消化500ng重组质粒DNA。反应混合物含有2μl10×FastDigest缓冲液，1单位FastDigest EcoRI和1单位FastDigest BamRI。将反应混合物在37℃下孵育1h。此后，将消化的产物在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳。对于每个启动子构建体，选择一个重组质粒，用于进一步的下游分析。将未消化的质粒DNA储存在-20℃。

对于每个启动子构建体，选择三个克隆用于质粒分离和限制性核酸内切酶分析。将每个分离的质粒接受EcoRI和HindIII消化，并且此后电泳。对于所有样品，观察到了大约3kb的条带(图13)。这是预期的，因为载体主链和启动子::luc::NosT构建体大约3kb。还进行了EcoRI和BamHI限制性核酸内切酶反应，以区分pBluescript载体和启动子::luc::NosT核。在这种情况中，预期对应于启动子和pBluescript::luc::NosT片段的两个截然不同的DNA片段。消化后，观察到两个截然不同的条带(图13)。较大的大约5kb片段对应于pBluescript::luc::NosT的大小，而较小的片段对应于各种启动子片段的大小。

为了促进植物转化，将启动子::luc::NosT构建体克隆至pTF101.1中。pTF101.1载体是含有用于将转基因整合至植物基因组DNA中必需的DNA序列。为了区分通过EcoRI和HindIII消化产生的pBluescript主链和启动子_片段::luc::NosT片段，成功地进行了四个克隆构建体的PvuII消化物。PvuII核酸内切酶切割pBluescript产生大约2.4kb和0.5kb的两个片段。其没有切割大约3kb的启动子盒。将消化产物纯化并接受EcoRI和HindIII消化。这使得启动子从pBluescript切割出来。三个消化的DNA的电泳揭示了三个预期大小的片段的存在。这些是对应于消化的pBluescript载体的0.5kb和2.4kb片段以及对应于启动子盒的大约3kb的片段。pTF101.1的EcoRI和HindIII双重消化是成功的，并且形成了位于T-DNA区域内的具有EcoRI和HindIII悬垂物的线性化pTF101.1。

将对应于pTF101.1载体和启动子盒的DNA片段成功切除并纯化。设置特定的粘性末端连接反应并用于成功地转化感受态大肠杆菌DH5α细胞。

对于每个构建体，选择10个克隆用于筛选。6个克隆含有XvPSap1D，9个含有XvPSap1E，8个含有XvPSap1F，7个含有XvPSap1G。

对于每个启动子，选择两个克隆用于质粒分离以及EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶分析(图14)。对于每个构建体，消化的pTF101.1::启动子_片段::luc:NosT产生了大约3kb和9kb的线性条带。较小的DNA片段是预期的启动子_片段::luc:NosT盒大小，而较大的片段对应于pTF101.1载体的大小。PCR分析以及消化结构都表明了每个启动子_片段::luc:NosT盒都已经成功地克隆至pTF101.1二元载体中。

实施例4

启动子序列的in silico分析

启动子片段测序后，使用plantCARE软件(Lescot等，2002)评价序列中核心和调控原件的存在。

In silico序列分析证明了该研究中使用的启动子片段没有一个呈现出与任何其他已知植物启动子任何显著的序列同源性，除了XvPSap1。缩短的XvPSap1启动子彼此共享82.57％序列同源性。

通过plantCARE生物信息学工具预测了启动子核心和顺式-作用调控元件。在5’-300bp区域内在每个启动子片段中预测到四个相同的TATA-盒。

试验性地鉴别了各种顺式-作用元件。这些包括涉及干旱-、光-和低温-诱导性以及防御和生物胁迫应答性的元件。观察到了涉及脱落酸、水杨酸和赤霉素应答性的顺式-作用元件。此外，还注意到了涉及分生组织表达、植物生长素-应答性和生理节奏控制的元件。图15中显示了所鉴别的推定核心和调控元件，包括富TC重复序列、MYB转录因子结合位点和ABA-应答元件。

实施例5

根癌农杆菌的转化和筛选

将含有XvPSap1D::luc::NosT、XvPSap1E::luc::NosT、XvPSap1F::luc::NosT和XvPSap1G::luc::NosT的四个pTF101.1重组质粒转化至感受态根癌农杆菌EHA101细胞中。使用两个改变，根据实施例1中所述的实验方案进行了转化。首先，将转化的根癌农杆菌细胞在30℃下孵育6h，替代37℃下的1h。其次，在补充了100μg/ml链霉素、30μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YEP琼脂上进行转化细胞的选择。

进行克隆PCR，以使用启动子特异性引物(EcoRI-XvPSap1-F(SEQ ID NO:16)和BamHI-XvPSap1-R(SEQ ID NO:17))鉴别阳性转化的克隆。对于每个扩增，按照实施例1中所述的设置25μl反应体积。根据实施例1中所述的实方案进行扩增。

将通过克隆PCR筛选观察到是阳性的克隆接种于10ml补充了100μg/ml链霉素、30μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YEP培养液中，并在30℃下振荡培养16h。对于每个构建体，根据制造商的说明书，使用Bioflux质粒DNA提取和纯化试剂盒(Bioer)，分离了来自3个不同克隆的质粒DNA。

通过用EcoRI和HindIII的内切核酸酶消化，证实了分离的重组PTF101.1质粒DNA含有完整的启动子盒。根据实施例3中所述的实验方案进行了消化反应。对于每个启动子构建体，选择一个重组质粒用于进一步的下游分析。通过将200μl细胞加入800μl高压灭菌的50％甘油中来合成甘油储液，将混合物温和混合并储存在-80℃。

pTF101.1构建体成功转化至感受态农杆菌EHA101细胞中。对于每个pTF101.1构建体，选择15个克隆用于筛选，并且每个含有相关的启动子片段。对于每个pTF101::启动子_片段::luc::NosT构建体，选择5个克隆用于进一步的分析。通过EcoRI和HindIII消化成功证实了EHA101中pTF101.1构建体的存在。

实施例6

使用pTF101.1载体构建体的烟草(Nicotiana tabacum)的农杆菌介导-转化

将50微升野生型烟草(SR1生态型)种子转移至无菌2ml Eppendorf中。将种子在含有1ml的补充了0.1％吐温20的20％JIK的溶液中灭菌，将混合物简短涡旋并在室温下孵育15min。将混合物在16000×g下离心30s，并除去JIK溶液。将灭过菌的种子在1ml无菌水中洗涤，涡旋30s并在16000×g下离心1min。除去水，并重复洗涤4次。将灭过菌的种子在无菌滤纸之间干燥，并收集在无菌1.5ml Eppendorf试管中。随后将灭过菌的种子在无菌盆栽土混合物上发芽。将植物在生长室中培养，使用设定的条件(24℃；16h光，8h暗)。将植物在这些条件下维持2至3个月并且每周水洗两次。每两周，用1.14g/l植物雌激素处理植物。

将携带单独的XvPSap1启动子片段表达盒的转化的根癌农杆菌的单个克隆接种至10ml补充了100μg/ml链霉素、30μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YEP培养基中。将培养物在30℃下孵育16h。将1ml的16h培养物接种至200ml补充了合适抗生素的YEP培养基中。将培养物在30℃下孵育，直至获得600nm下大约0.8的吸光值读数。将培养物在6000×g下在4℃下离心20min。丢弃上清液，并且将细菌沉淀物重悬浮于50ml含有MS基础盐的补充了B5维生素溶液、30g/l蔗糖、0.1mg/lα-萘乙酸、1mg/l 6-苄基氨基嘌呤和100μM/l乙酰丁香酮的液体共培养培养基中。用1M KOH将pH调节至5.4。

从2个月大的植物选择四至六英寸叶子。将叶子在无菌水中浸泡30min，并且根据以上描述的实验方案灭菌。将无菌的叶子切成均匀的5mm片段，避开叶缘和中央叶脉。将叶子外植体近轴侧朝上放置在预培养培养基上。预培养由补充了B5维生素溶液、30g/l蔗糖、0.1mg/lα-萘乙酸、1mg/l 6-苄基氨基嘌呤、100μM/l乙酰丁香酮和8g/l植物琼脂的MS基础盐组成。用1M KOH将pH调节至5.7。

将叶子圆片在无菌培养皿中在黑暗中用含有启动子盒的农杆菌接种物感染30min。每10min将培养皿摇动一次。此后，将感染的叶子圆片在无菌滤纸上印迹干燥。还包括了用只含有pTF101.1载体的根癌农杆菌转染的负对照。

将每个转染的外植体转移至共培养培养基中并且在23℃下孵育3天(18h光，6h暗；光强度为140μmol/m²/s)。将叶子的近轴部分保持与培养基接触。共培养培养基包含补充了B5维生素溶液、30g/l蔗糖、0.1mg/lα-萘乙酸、1mg/l 6-苄基氨基嘌呤和100μM/l乙酰丁香酮的MS基础盐。将pH调节至5.4。

3天共培养期后，在包含补充了B5维生素溶液、30g/l蔗糖、0.1mg/lα-萘乙酸、1mg/l6-苄基氨基嘌呤、10μg/l制霉菌素、250mg/l羧苄青霉素和3mg/l BASTA的MS基础盐的发芽培养基上选择叶子圆片。将叶子外植体放置在28℃的18h光条件下，光强度为140μmol/m²/s。每两周将推定的转化体次培养至新鲜培养基上，直至形成相当大的芽。选择了BASTA抗性芽，切除并转移至生根培养基。生根培养基包含补充了10mg/l蔗糖、10μg/l制霉菌素、250mg/l羧苄青霉素和3mg/l BASTA的半强度无激素MS基础盐。

将具有充分确认的根系的推定转化体转移至含有无菌盆栽土的花盆中，并且根据以下条件使用设定的条件培养：24℃；16h光，8h暗。用萨纶覆盖物覆盖植物8天，以帮助适应环境并且最小化脱水。一旦适应环境，将推定的转化体转移至正常生长条件下含有盆栽土的6英寸花盆中。将成熟植物自体受粉并且从成熟的干豆荚中收集种子。根据以下的公式计算转化效率(TE)：

TE＝((阳性转化体的数量)/(转化的外植体的数量))×100。

根据以上所述的实验方案，将推定的转基因烟草种子灭菌并在补充了8g/l琼脂和3mg/ml BASTA的MS培养基上发芽。用1M KOH将pH调节至5.7。将植物在生长室中培养，使用设定的条件(24℃；16h白天，8h夜晚)。将具有充分确认的根系的存活BASTA抗性植物转移至含有0.1g/l Gaucho SW处理过的盆栽土的盘中，并且用萨纶覆盖物覆盖1周。三周后，将BASTA抗性转基因植物转移至含有0.1g/l Gaucho SW处理过的盆栽土的花盆中。每隔一周，用1.14g/l植物激素处理植物。

将两个月大的野生型烟草植物用于农杆菌介导的转化。在发芽培养基上三周后，转化的叶子圆片呈现出最小的或没有坏死并且保持绿色。芽的出现是明显可见的。将未转化的叶子圆片转移至补充了3mg/l BASTA的发芽培养基中时，看到了全部坏死，并且圆片呈现出棕色。

推定的XvPsap1D、F和G转化体没有显示出任何不寻常的或异常的表型性状。相反，一些推定的XvPsap1E转化体呈现出矮小的迹象。收集所有植物的T0种子。全部地，成熟的豆荚获得大量种子。然而，一些XvPsap1G植物产生了不含种子的豆荚。在所述植物中观察到的种子的不存在和矮小可以归因于启动子盒随机插入了植物的基因组中。

野生型幼苗呈现出完全坏死并且在补充了BASTA的MS培养基上不能存活。筛选剩余植物的启动子存在后，将阳性转化的植物转移至单独的花盆中。

实施例7

推定的转基因植物的筛选

从推定的转基因植物获取叶子样品，并且在液氮中快速冷冻。使用最小改变，使用Dellaporta提取实验方案(Dellaporta等，1983)来提取基因组DNA。使用研钵和杵棒在液氮中研磨叶组织。将大概100μg的磨碎组织转移至含有1.4ml提取缓冲液(100mM Tris-ClpH8，50mM EDTA pH8，500mM NaCl和10mMβ巯基乙醇)和0.1ml 20％SDS的2ml Eppendorf管中，并在65℃下孵育10min。此后，加入500μl的5M醋酸钾并将样品强烈振荡5min，接着在4℃下孵育20min。然后将样品在16000×g下离心20min。将上清液转移至含有1mi异丙醇的无菌2ml Eppendorf管中并通过温和颠倒来混合。将基因组DNA在-20℃下沉淀24h，接着在16000×g下离心15min。丢弃上清液并且将沉淀物风干10min。将沉淀物在室温下重悬浮于70μl重悬浮缓冲液中(50mM Tris-Cl pH8，10mM EDTA pH8和0.6mg/ml RNase A)。为了除去不溶性碎片，将样品在16000×g下离心5min并且将上清液转移至含有7.5μl 3M醋酸钾和50μl异丙醇的无菌1.5ml Eppendorf管中。将样品充分混合，在4℃下孵育15min并且在16000×g下离心2min。将上清液丢弃并且用1ml 80％的无水乙醇洗涤基因组DNA沉淀物。将混合物在16000×g下离心2min，并除去上清液。将基因组DNA沉淀物重新溶解于100μl TE(10mMTris-Cl，1mM EDTA)中。通过在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上的电泳来评估提取的基因组DNA的质量。

使用基因特异性引物(Barl(SEQ ID NO:18)和BarII(SEQ ID NO:19(表2)))通过421bp DNA片段的PCR扩增来确定bar基因的存在。对于每个扩增，如下使用组分浓度设置50μl反应体积：1×标准缓冲液，0.4μM的每种引物，0.2mM dNTP混合物，0.04U/μl Taq聚合酶，5ng/ul模板DNA，用dH₂O补足至最终体积。使用以下条件进行扩增：94℃，5min；94℃，30s，56℃，45s，72℃，1min，35个循环；和最终72℃延伸10min。使用GeneAmp 9700热循环仪(Applied Biosystems)进行了PCR反应。将所产生的扩增子在1％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳。

相似地，使用启动子特异性正向(EcoR1-XvPSap1-F(SEQ ID NO:16)和luc-特异性反向(SEQ ID NO:20)引物对(表2)，通过大约2kb片段的PCR扩增，确定了启动子和luc基因的存在。对于每个扩增，使用如上所述的组分浓度设置了50μl反应体积。用以下条件进行了扩增：94℃，5min；94℃，30s，54℃，2min，68℃，90s，35个循环；和最终72℃延伸10min。

表2：用于推定的转基因植物筛选的引物组

对于每个基因组DNA分离，浓烈的、高分子量条带是明显的，表明了良好的、高质量的DNA。

对于带有启动子盒的植物，使用启动子特异性正向和luc-特异性反向引物，通过大约3kb的DNA片段的扩增，确定了启动子和luc基因的存在。用XvPSap1D、E、F和G构建体转化烟草植物分别产生了两个、一个、零个和一个转化事件。由于转化效率相对低，针对各个启动子构建体，筛选从单个转化事件产生的植物。鉴别了21株用XvPSap1D构建体转化的烟草植物，7株具有XvPSap1E、9株具有XvPSap1G。对于XvPSap1F，没有鉴别到阳性转化体。

测定了每个启动子构建体的转化效率。针对XvPSap1D、E、G，计算出15％、3.5％和8％的效率。

实施例8

转基因植物的脱水

按照Audran等(1998)所述的进行了脱水处理，使用以下改变：替代水培，在土壤中使植物脱水。针对每个启动子片段，在脱水处理中使用了六株植物。在脱水之前，将植物转移至含有设定量土壤和水的花盆中。将植物移动至Percival室(Percival Intellus控制系统)中并且在设定条件下孵育(26℃；16h白天，8h黑夜；60％湿度；光强度为100μmol/m²/s)，持续1周。对整个植物进行脱水胁迫，并且通过停水6天来实现。在整个脱水期间，每24小时获取四片胁迫的烟草叶子样品。将取样的叶子用于测试荧光素酶活性并且在液氮中立即冷冻并存储在-70℃。将叶子用于RNA分离。

在脱水胁迫处理中包括了另外12株转基因和6株野生型植物。在整个脱水期间，每24小时获取四片叶子样品(代表单个植物)。将取样的叶子用于估算相对含水量。

针对每个时间点的每片取样的叶子或莲座型叶丛计算相对含水量(RWC)。在取样后立即测定每片叶子的鲜重(FW)。将叶子在室温下在无菌水中浸没24h后，测定了完全膨胀重量(FTW)。然后将叶子在70℃下孵育48h，以测定干重(DW)。根据以下公式计算了相对含水量：

RWC＝((FW-DW)/(FTW–DW))×100。

使用HH2湿度计(Delta-T Devices)测定了含有脱水植物的每个花盆的土壤含水量(SWC)。探测每个花盆并且重复三次测定土壤含水量。

为了确定各个启动子是否在应答有限的水条件中是功能活性的，将转基因植物接受六天脱水处理。

在脱水胁迫处理过程中，观察到了形态学变化，如叶色和质地的变化。在第0天和第1天，所有植物的叶子是绿色和饱满的。在第2天到第3天，处理过的植物的叶子开始向下折叠，到第4至第5天，完全折叠并萎软。相反，含水植物的叶子在整个六天的过程中保持绿色和饱满。

在转基因和野生型植物的叶子之间的形态学变化没有显著差异。两个植物组在处理过程中似乎都呈现出相似的症状。

针对RWC测定选择的四片叶子位于植物的中部。这是因为接近于植物顶点的叶子是较小的幼叶。同时接近于植物底部的叶子较大并且较老。

从转基因和野生型烟草植物获得的RWC测量从大约95％降至53％。在处理过程中，每株植物的脱水率是相似的，如通过RWC证明的。然而，在脱水处理的第4天，转基因植物具有低于野生型植物的RWC。含水的转基因植物的RWC值在六天脱水过程中在80％至90％之间波动。

测定SWC来观察所有花盆的失水速率是否相似并且特定花盆中的土壤明显不同地没有干燥。在含有经受脱水胁迫处理的植物的花盆中的SWC平均从33％降至5％。与RWC测量一样，关于土壤干燥，在植物之间观察到相似的趋势。在整个脱水期间带有浇灌的转基因植物的花盆的SWC在33％至26％之间浮动。

实施例9

通过荧光素酶表达的活动目标图像分析启动子活性

在用于RNA分离取样之前，将叶子单独喷雾并用等量的5mM荧光素(VivoGlo，Promega)上色。在300s/叶的暴露时间下，用3D-光度计(Xenogen IVIS Lumina，Caliper)将荧光素酶活性成像，所述光度计由0.5平方英寸CCD相机和12.5cm的视野组成。使用活动目标图像软件(Capliper)，将通过荧光素酶表达叶子的光子或点数发射定量。选择GFP试验来否定来自叶绿体的任何发光。

在六天脱水处理过程中，测试每株植物的完整叶子由于荧光素酶活性产生的生物发光。对于每个启动子构建体，每天测试一株植物的生物发光。与预期的一样，在野生型植物中没有检测到生物发光，因为这些不含荧光素酶基因。在用XvPsap1D、E和G转化的T1植物的叶子中作为生物发光看到了荧光素酶的表达。这在每片叶子中可以看到是蓝色(最小活性)、绿色(中等活性)和红色(高活性)。

为了定量每片叶子中荧光素酶表达的水平，计算了目标区域(ROI)值。这些值是由于荧光素分解成氧合荧光素检测到的光子或点数的测量。总体上，对于用XvPsap1D、E和G构建体转化的植物，在整个脱水期间，点数提高(分别是图16B、C和D)。

在六天过程中保持含水的植物中，荧光素酶活性保持恒定(图16A)。在用XvPsap1D、E和G转化的植物中，在处理过程中存在相似的活性水平(分别是图16B、C和D)。对于XvPsap1D，早期(第2天)就开始诱导活性并且在剩余的脱水阶段保持。对于XvPsap1E和G，稍后开始(分别为第6天和第4天)。与预期的一样，在野生型植物中没有观察到诱导(图16E)。

实施例10

通过定量实时PCR分析荧光素酶表达

使用的所有玻璃器皿和塑料制品都是双重高压灭菌的并且用0.001％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水制备溶液。用研钵和杵棒将每片储存的叶子在液氮中单独研磨成细粉。在提取程序的过程中，将磨碎的组织维持在4℃，以防止DNA降解。将大约600mg磨碎的组织转移至含有1ml One-Step试剂(Bio Basic)的2ml Eppendorf管中并且通过颠倒混合。此后，将样品在室温下涡旋10min。为了使核蛋白复合物完全分离，将样品在室温下孵育5min。在室温下孵育后，加入200μl氯仿并且将样品颠倒30次，然后在室温下孵育3min。将样品在14000×g下在4℃下离心15min。将上层水相小心地转移至含有1ml异丙醇的新鲜无菌2mlEppendorf管中并且通过颠倒混合。使混合物在室温下静置10min，接着通过在14000×g下在4℃下离心15min来沉淀DNA。将上清液丢弃并用1ml冰冷的75％乙醇洗涤RNA沉淀物，简短涡旋并且在4℃下离心10min。将上清液丢弃并且将RNA沉淀物风干5min接着溶解于89μl0.01％DEPC处理过的水中。通过将RNA在55℃下孵育10min来提高分解。将RNA储存在-70℃。

用脱氧核糖核酸酶(DNAse I；New England Biolabs)处理每个RNA提取，以消化和除去任何基因组DNA杂质。DNAse I反应混合物由100μl总反应体积中的89μl分离的RNA、10μl 10×DNAse缓冲液和2单位的DNAse I组成。将反应温和混合并且在37℃下孵育10min。根据制造商的说明书，使用GeneJet Plant RNA Miniprep试剂盒(Fermentas)纯化样品。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)将纯化的DNA定量。通过在1.2％EtBr染色的琼脂糖凝胶上电泳来评价RNA完整性。此外，使用Agilent2100Bioanalyzer在RNA-6000Nano芯片上评价质量和完整性并且使用Agilent 2100Expert软件(Anatech)分析。

每次分离提取的RNA的浓度范围为89至543ng/μl。在1.2％非变性琼脂糖/EtBr凝胶上电泳时，观察到最小降解至没有降解。28S和18S核糖体RNA(rRNA)条带明显可见。还观察到了较低分子量的条带，对应于5S rRNA和叶绿体RNA。

Agilent Expert软件通过将RNA完整性数值(RIN)分配给每个样品来分析RNA。基于5S和18s rRNA之间以及18S和28S rRNA之间发现的信号量来计算RIN数值。10的RIN数值表示RNA是纯的并且仅存在5S、18S和28S rRNA峰。然而，从植物组织分离的RNA还包括叶绿体RNA。这降低了RIN值，但并不表示RNA质量差。然而，具有低于5.3的RIN数值的纯化RNA通常认为是质量差的并且不适于分析。

Agilent 2100Expert软件产生电泳图谱，具有对应于不同RNA物质的峰。5S、18S和28S rRNA条带明显可见为峰。不存在基因组DNA杂质，因为其作为28S rRNA峰的下游峰可见到。叶绿体RNA的存在显示为位于5S和18S rRNA之间的峰。后28S rRNA峰是明显的，对应于未变性的RNA。

使用Agilent 2100Expert软件分析了每个分离提取的RNA。RIN数值范围为4.6至8.8和100ng/μl至732ng/μl的浓度。从脱水处理的野生型和含有XvPSap1D、E、G的转基因植物以及含水的植物分离的RNA的电泳图谱呈现出所有之前提及的RNA物质。丢弃质量差或浓度低的RNA。

将从脱水期间的每株烟草植物的四片叶子样品提取的纯化RNA集合并用于cDNA合成。每个cDNA合成反应使用大约500ng RNA。将反应重复进行4次，以作为技术cDNA合成重复。对于cDNA合成，根据制造商的说明书，使用了M-MuLV RNase H+逆转录酶(Finnzymes)。cDNA合成反应混合物由大约500ng RNA、终浓度0.05μg寡(dT)15引物、0.45μg随机六聚物、1×RT缓冲液(包括dNTP和MgCl2)和0.04μl M-MuLV RNase H+逆转录酶(包括RNA抑制剂)组成，用无核酸酶的水补足至20μl的总体积并充分混合。对于cDNA合成，选择了1:10的随机六聚物与寡(dT)15的比例，因为这种方法提高了合成反应的灵敏度。PCR循环条件由25℃孵育5min，42℃1小时，85℃15min接着4℃下2min的最终步骤组成。将等份的cDNA合成在1.2％琼脂糖/EtBr凝胶上电泳，以分析cDNA质量。将cDNA储存在-20℃，直至进一步使用。

将来自处理样品的集合的cDNA的连续稀释用于产生五-点标准曲线。对于18SrRNA和荧光素酶标准曲线，分别制备了10-倍和3-倍稀释系列。对于L25核糖体蛋白和延伸因子-1α标准曲线，制备了4-倍稀释系列。

使用Rotor Gene 60002plex HRM(Corbett Life Science Research)，通过实时PCR，研究了内参基因和荧光素酶基因的表达。将含有反应缓冲液、热灭活的DNA聚合酶、dNTP和工作浓度的3mM MgCl2的Kapa Sybr Fast试剂盒(Kapa BioSystems)master混合物用于每个PCR反应。每个PCR反应含有终浓度的1×Kapa Sybr Fast，0.04μM基因特异性引物(表3)、2μl cDNA和无核酸酶的水，至20μl的总体积。将用于荧光素酶(RT-luc-F2(SEQ IDNO:21)和RT-luc-R2(SEQ ID NO:22)、18S rRNA(RT-18S-F3(SEQ ID NO:23)和RT-18S-R3(SEQ ID NO:24))、L25核糖体蛋白(RT-Rib-F3(SEQ ID NO:25)和RT-Rib-R3(SEQ ID NO:26))和延伸因子-1α(RT-EF-F1(SEQ ID NO:27)和RT-EF-R1(SEQ ID NO:28))的基因特异性引物组用于分开的反应中。每个稀释点反应重复进行四次。在每个实时运行中部包括逆转录对照(集合的RNA)也不包括模板对照(NTC)。使用以下条件进行了扩增：95℃，5min；95℃5s，60℃20s，72℃5s，45个循环。使用Rotor-Gene 6000Series软件(Corbett LifeSciences Research)进行了标准曲线的产生和分析。

表3：用于定量实时PCR的寡核苷酸引物

使用针对每个内参基因的引物对的实时PCR用于确定每个潜在内参基因的表达稳定性。为了最小化PCR运行之间的变化，一个运行中进行含有一个引物对的所有反应。从四个技术重复计算了平均表达水平并且通过将相对标准曲线输入每个运行中。通过PCR指数期中的扩增阈值确定了相对基因表达，鉴别出Ct值并将Ct值与标准曲线进行比较(Muller等，2002)。使用GeNorm和NormFinder(GenEx，MultiD)评价了潜在内参基因的稳定性。

如上设置实时PCR反应混合物和条件。为了最小化PCR运行之间的变化，在一个运行中进行了含有一个引物对的所有反应。将标准曲线输入每个运行中，以确定Ct值以及目标基因和内参基因的浓度。将计算的值的平均用于目标基因的相对量化。将第0天针对转录产物水平获得的值用作校准，以确定脱水过程中是否发生了目标基因表达的显著变化。根据Pfaffl等式(Pfaffl，2001)，使用Gen Ex软件(MultiD)，确定了量化水平。一个样品的Pfaffl等式是目标基因vs.校准样品(对照)和内参基因(参照)vs.校准样品(对照)的比例。根据等式：E＝10^[-1/slope]计算了扩增效率(E)。考虑了对照和样品中的靶标基因(Δ^Ct靶标)以及对照和样品中的内参基因(Δ^Ct参照)的Ct值的差异(Pfaffl，2001)。等式如下：

比例＝((E_靶标)^{ΔCt靶标(对照-样品)})/((E_参照)^{ΔCt参照(对照-样品)})

为了量化luc基因表达水平，进行了定量实时PCR。进行该量化来证实从完整叶子的启动子分子获得的结果。

如通过电泳后的DNA斑点所证实，cDNA合成是成功的。

基于产物大小以及是否已经在熔化曲线中观察到单个峰，针对单个扩增子选择了单个引物组。产生了针对每个潜在内参基因和luc基因的标准曲线。针对潜在内参基因的效率、R-值和R^2-值列于表4中。

表4：潜在内参基因和luc基因的效率、R-值和R^2-值

对分离自脱水处理的植物的cDNA进行了定量实时PCR。输入针对每个内参基因产生的标准曲线并且使用geNorm和NormFinder评价内参基因的稳定性。geNorm是基于如果两个基因稳定表达则这两个基因之间的表达比例应当相同的假设(Vandesompele等，2001)。将每个基因的相对稳定性(M)限定为基因与其他内参基因的平均成对变化。M值越低，内参基因越稳定。geNorm鉴别了L25核糖体蛋白和EF-1α，具有0.037785的M值，是最佳内参基因。

NormFinder通过比较基因之间的变化评价了内参基因的稳定性。最稳定的内参基因是具有最低变化的那些。Normfinder鉴别出EF-1α为最稳定的内参基因，接着是L25核糖体蛋白。两个程序都鉴别出18S rRNA为三个中最不稳定的。

基于geNorm和NormFinder两者的分析，选择EF-1α和L25核糖体蛋白作为内参基因。应当注意到Schmidt和Delaney(2010)也推断出这些基因在烟草脱水胁迫处理分析中是最合适的。

RNA的获取和纯化是定量实时PCR中的第一步，并且因此RNA需要是高质量的。此外，RNA应当不含基因组DNA，特别是如果靶标是缺乏内含子的基因。由于靶标基因(luc)不含任何内含子，因此在每个实时运行中包括了RNA对照反应，以证明不存在基因组DNA并且随后证实任何检测到的luc mRNA不是基因组DNA杂质的产物，而是cDNA模板的产物。在所有实时运行中，没有检测到作为基因组DNA产物的luc mRNA。对于内参基因，获得了相同结果。在没有模板对照的反应中也没有检测到产物。

与完整叶子中的荧光素酶活性的分析相同，通过在每个时间点测量luc mRNA转录产物，仅在一个植物中测定了启动子分析。结果是数据的全部分析是不可能的。然而，将qRT-PCR用作工具来评价T1植物中的启动子活性并且没有测定绝对活性。因此评价了每个启动子的整体趋势。因为研究中没有包括重复，在单个植物的叶子中测定了读数之间的标准偏差。

总体上，对于用XvPSap 1D、E和G转化的植物，在脱水期间，提高了luc mRNA转录产物，并且所有都导致相似的诱导水平(分别是图17B、C和D)。在六天期间保持含水的植物中，luc mRNA转录产物保持恒定(图17A)。对于XvPSap1E，早期就开始诱导(第2天和第3天)并且在剩余的脱水期间保持。对于XvPSap1D和G，诱导也是早期开始的(第1天)，但转录产物水平分别在第3天和第2天降低，然后朝向脱水期结束时，再次提高。与预期的一样，在野生型植物中没有观察到诱导。

尽管在每个时间点只在一个生物植物中确定了分析，但明显观察到了整体趋势。所有启动子片段能够驱动luc mRNA转录产物的表达。在脱水期间，这些转录产物的水平提高至相似的水平。

实施例11

为了验证T1转基因植物中获得的启动子表达结果，按照以下所述的，使用最小的改变，重复实施例9和10中所用的方法。使用了用XvPSap1D或XvPSap1G衍生启动子构建体转化的T3转基因植物。在这个实施例中，每个衍生启动子构建体使用了四个生物学植物。对于每个生物学材料，包括五种技术重复。

使用以下的最小改变，按照说明书的实施例8中所述的进行了脱水处理。对于每个处理，针对每个启动子片段(XvPSap1D和XvPSap1G)，将24株植物暴露于脱水处理，用于启动子活性的分析。另外，在脱水处理中包括了24株植物(XvPSap1D)，用于相对含水量(RWC)的测定。

此外，按照实施例9中所述的进行了荧光素酶表达的活动目标成像，使用以下的修改。使用了用XvPSap1D或XvPSap1G衍生启动子构建体转化的T3转基因植物。此外，与实施例中的一个相比，每个启动子构建体，使用了四个生物学植物。因此，在图18中，单个数据点反映出获自总共16片叶子累积的表达结果的平均的数据。

相似地，使用T3转基因植物，按照实施例10中所述的，进行了通过定量实时PCR的荧光素酶表达的分析。每个启动子构建体使用了四个生物植物，并且每个植物进行了五种技术重复。这一分析的结果显示于图19中。

参考文献

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Woo,N.S.,et al.(2008)Plant Methods,4:27.

Claims (9)

1.一种衍生启动子，选自SEQ ID NO:1-3中的任一个的核酸序列；

其中所述衍生启动子作为启动子起作用。

2.根据权利要求1所述的衍生启动子，其中所述衍生启动子是诱导型启动子。

3.根据权利要求2所述的衍生启动子，其中所述衍生启动子是通过非生物胁迫可诱导的，其中所述非生物胁迫是脱水胁迫。

4.一种核苷酸盒，包含权利要求1至3中任一项所述的衍生启动子，可操作地连接异源可转录DNA序列，和，其中表达盒进一步可选含有可操作地连接异源可转录DNA序列的终止子序列。

5.一种重组载体，包含权利要求4所述的核苷酸盒。

6.一种用权利要求5所述的重组载体转化的宿主细胞。

7.一种调控宿主细胞中异源可转录DNA序列的转录的方法，所述方法包括用权利要求4所述的核苷酸盒转化宿主细胞。

8.一种调节转基因植物中异源可转录DNA序列的转录的方法，所述方法包括用权利要求4所述的核苷酸盒转化所述植物。

9.一种生产转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求4所述的核苷酸盒引入宿主细胞中，并且从所述细胞再生转基因植物。