CN1121958A - α-微管蛋白的嵌合基因的启动子元件 - Google Patents

α-微管蛋白的嵌合基因的启动子元件 Download PDF

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M·A·托里斯
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Abstract

本发明公开了一种来自玉米α-微管蛋白的嵌合基因的植物启动子，并将其用于植物的基因转化。

Description

α-微管蛋白的嵌合基因的启动子元件
在所有种类的细胞中微管是供发挥多种功能的重要元件。尤其在植物中，它们在几种重要的现象中起中心作用，特别在那些涉及形态发生的现象中。在所有的真核生物中，微管由大量高度保守的蛋白质构成，其中最丰富的便是微管蛋白。蛋白质的两种主要亚基已经有人描述过，称为α-微管蛋白和β-微管蛋白。微管的重要功能以及分布的广泛性常暗示，编码微管蛋白的基因是高表达和结构性表达的基因的好例子。事实上，在真核生物中，微管蛋白的亚基是由一族基因编码的。在植物领域，已经研究过一些植物，如玉米，拟南芥属，大豆，豌豆，和胡萝卜中的α-和β-微管蛋白。在所有这些情况中，各种基因组码多个α-和β-微管蛋白基因，它们在植物的发育过程中表达不尽相同。在拟南芥属中，对一族微管蛋白基因的仔细分析揭示有15个基因(6个α-微管蛋白和9个β-微管蛋白)编码这些蛋白质(Kopczak et al.，1992；Snustad et al.，1992)。在玉米中，克隆并测序了3个α-微管蛋白基因(Montoliu et al.，1989；Mont-loiu et al.，1990)，而且还通过PCR分析基因组DNA(Montoliu etal.，1992)检测到另外6个基因。根据最近的研究，从玉米组织中至少有6个不同的α-微管蛋白的DNA顺序已被克隆和定性(Ville-mur et al，1992)。
来自玉米的α-Tub1和α-Tub2基因一前一后排列，中间被至少2kb碱基对的DNA分开。它们在所有的玉米分生组织中表达，而且在胚根系统中高水平地表达(Montoliu et al.，1989)。α-Tub1基因在所有分析过的组织中的表达水平高于α-Tub2基因，此外，它还在花粉中高表达(Montoliu et al.，1990)。体外杂交实验表明，在分生组织中，α-Tub1基因是在静止中心激活期表达的(Rigau etal.，出版中)。在拟南芥属中，找到了一个在花粉中特异表达的基因，但其表达方式不同于玉米基因α-Tub1或α-Tub2(carpeateret al.，1990)。玉米基因α-Tub3在所有正在分裂并有高含量纤维素的植物器官中表达，尤其是未成熟的胚胎中(Montoliu et al.，1990)。
现已发现，来自玉米α-微管基因的启动子调控元件能在单子叶植物和双子叶植物种的花粉，胚根系，分生组织区域及未成熟胚胎中控制组织特异性的表达。本发明可以更好地控制基因在转基因植物中的表达，尤其能更好地控制抗除草剂基因。
本发明的主题是玉米α-微管蛋白的5′调控区域。在本发明中，该区域被定义为上游调控群(upstream regulatory eusemble，URE)，它能用于控制编码异源基因的基因的表达。URE含几个调控元件，当它们连在转基因植物中表达的异源基因的编码区域时，会产生不同方式的受控表达。具体地说，本发明提供了有关从玉米基因α-Tub1的DNA中分离得到的区域的信息，该区域能特异性地控制基因在根、花粉及分生组织中的表达。
本发明的另一方面涉及含这些调控元件的植物嵌合基因。调控元件在功能上与异源基因的编码顺序相连，从而使调控元件能控制由异源基因编码的产物的表达。如果需要，在嵌合基因构建物中也可以部分或全部地插入其他的启动子元件。这类互补性的元件包括(但并不限于)：单子叶植物的内含子顺序如水稻肌动蛋白基因的内含多，它会大大增强异源基因在单子叶植物组织中的表达。本发明还包括植物转化载体，以及用这些载体转化的植物细胞，和含嵌合基因的植物和种子。
根据本发明的另一方面，产生的嵌合基因含有编码含氨基端转运肽的融合多肽的DNA顺序，该转运肽能引导异源肽向植物细胞特有的亚细胞细胞器中进行亚细胞定位。而且在转基因植物中获得基因表达的更佳控制和更佳定靶。
本发明的主题还涉及产生转化的，具有新品质并且尤其能抗除草剂的单子叶或双子叶植物的方法。用该构建物转化的植物细胞通过再生和/或培养可以产生抗性植株。
本发明包括玉米α-微管蛋白的基因的上游调控群(URE)的顺式调控元件。这些顺式调控元件是URE的分立的区域，它们对受其控制的表达施加调控。具体地，本发明包括一种分离的核酸，它含有至少一个允许在根、花粉、分生组织和未成熟胚胎中特异性表达的基因元件。任何微管蛋白的基因都能形成调控元件，尤其是单独的或组合的玉米基因α-Tub1，α-Tub2和α-Tub3，它们为三个相似的α-微管蛋白基因。优先使用玉米α-微管蛋白基因α-Tub1作为调控元件来源。
按照本发明调控元件之一是在根中特异基因表达的。一种根特异性的调控元件含一特定的核苷酸顺序，它能在根中引发基因在其控制下的表达，也就是说是在根中检测到它的基因表达产物的。根特异性的表达可以在根的任何部位找到，例如(但并不限于)根的分生组织区域，根的侧芽、侧根、和根的维管区域。没有在芽尖、茎或叶中检测到基因表达。
为了鉴别那些控制根特异性基因表达的调控元件，必须对玉米α-微管蛋白的完整基因URE进行缺失分析。在一项缺失分析中，连续地将完整URE的核苷酸除去，得到的片段连于报导基因的编码顺序，或连于其他异源编码顺序。通过检测在所期望的特定组织中异源基因产物的存在而排除其他组织，来分析构建物控制组织特异性的基因表达的能力。经鉴别的组织特异性元件也可被修饰，例如通过定点诱变。接着可以测试修饰过的调控元件在各组织在特异性基因表达的能力，并因而鉴别其他在组织中赋于特异性的顺序。这些鉴别调控元件的技术适用于所有的玉米α-微管蛋白基因。例如，以一种优选方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub1的URE表明，控制根特异性的基因表达的调控元件是由SEQ ID No.1代表的顺序的963-1115以及1—1115核苷酸组成的。
本发明的其他调控元件控制花粉特异性的基因表达。花粉特异性的基因表达是人们特别感兴趣而且至关重要的。通常，玉米α-微管蛋白基因α-Tub1在根和花粉中都表达。当从本发明的全URE中分离出玉米α-微管蛋白的基因α-Tub1的特定区域时，其表达完全限定于花粉。花粉特异性的调节元件含一特定的核苷酸顺序，它能在花粉中引发在其控制下的表达，也就是说是在除其他组织之外的花粉中检测到基因产物。如上面鉴别根特异性调控元件那样，通过分析玉米α-微管蛋白基因的各个片段的控制花粉特异性基因表达的能力，鉴别出控制花粉特异性表达的调控元件，不同的是在花粉中检测表达。如上所述地鉴别了对允许花粉特异性表达和核苷酸顺序进行的修饰。来自任何玉米α-微管蛋白基因的花粉特异性调控元件都可用这些技术鉴别。例如，以一种优先的方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub1的URE表明，控制花粉特异性基因表达的调控件是由SEQ ID No.：1顺序中的核苷酸1-1348和1295—1348组成的。
据本发明存在于玉米α-微管蛋白的基因的URE的其他调控元件控制分生组织特异性的基因表达。如上面鉴别其他调控元件那样，鉴别了分生组织特异性基因表达的调控元件。例如，可以使用缺失分析来鉴别在分生组织中特异表达它所控制的基因的任何玉米α-微管蛋白的基因的核苷酸顺序。对这样的顺序可如上进行修饰，并测试以鉴别其他提供分生组织特异性基因表达的顺序。例如以优先的方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub3的URE表明，控制分生组织特异性基因表达的调控元件是由SEQ ID No.：3的顺序的核苷酸1—695和542—695组成的。
据本发明存在于玉米α-微管蛋白基因中的其他调控元件控制着未成熟胚胎中特异性的基因表达。如上面鉴别其他调控元件那样，鉴别了提供未成熟胚胎特异性基因表达的调控元件。例如，可以使用缺失分析来鉴别在未成熟胚胎中表达它所控制的任何玉米α-微管蛋白基因的核苷酸顺序。对这样的顺序可如上进行修饰并测试以鉴别其他提供未成熟胚胎特异性基因表达的顺序。例如，以优先的方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub3的URE表明，控制未成熟胚胎特异性基因表达的调控元件是由SEQ ID No.：3的顺序的核苷酸1—1076组成的。
按下列方法，有可能获得分离的编码玉米α-微管蛋白基因的上游调控群的核酸，即可以用α-微管蛋白cDNA筛选玉米基因组DNA文库以分离出α-微管蛋白的重组基因组克隆(Montoliu etal.，1989)。获得α-微管蛋白重组DNA的有用方法在Ausubel等人，1989的《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley& Sons，NY，中有描述，或者也可以在到处可获得的大量有关重组DNA技术的手册中的任一本中找到。至于核苷酸顺序测定，有许多为熟练的技术人员所熟知的技术可供使用。例如，α-微管蛋白基因的URE可以亚克隆入测序载体如pBluescript(Stratagene)的多连接点。然后这些pBlueseript亚克隆可用“双链双脱氧法”测序。
编码玉米α-微管蛋白基因的URE的α-Tub1克隆的核苷酸顺序用SEQ ID No.：1表示。
编码玉米α-微管蛋白基因URE的α-Tub2克隆的DNA的核苷酸顺序用SEQ ID4No.：2表示。
编码玉米α-微管蛋白基因URE的α-Tub3克隆的DNA的核苷酸顺序用SEQ ID No.：3表示。
优化的转运肽的核苷酸顺序用SEQ ID No.：4表示。
其他的玉米α-微管蛋白基因的URE可以用同样的战略获得。此外，可以使用所述的α-Tub1，α-Tub2和α-Tub3的URE的转录的顺序作为杂交探针筛选玉米基因组DNA文库和鉴别其他α-微管蛋白基因。从而获得代表玉米α-微管蛋白基因家族的其他成员的克隆。
鉴别控制组织特异性基因表达的顺式调控顺序可以如下进行：转录融合特异顺序和一个异源基因的编码顺序，将嵌合基因转移入合适宿主，并检测异源基因的表达。用来检测表达的测试方法取决于异源顺序的性质。例如，报导基因，如β-葡萄糖醛苷酸酶(GUS)，通常可用来确立嵌合构建物的转录和翻译的能力。已有灵敏地检测转基因生物中报导酶的标准方法。GUS基因能用作检测转基因植物中启动子活性的报导基因，因为该酶在植物细胞中很稳定而且已有定量的荧光测量法及组织化学定位技术。Tefferson et al.，1987EMBO J6，3901，已给出在植物组织中生化法和组织化学法检测GUS活性的标准程序。生化测试是将植物组织裂解液与4-甲基繖形基-β-D-葡糖醛苷酸，GUS的荧光底物相混合，再在37℃保温1小时，测量4-甲基繖形酮的荧光。GUS活性的组织化学定位是在37℃保温5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖醛苷酸(X-Gluc)中的植物组织样品18小时，再观察X-Gluc点的图形。构建这种嵌合基因允许限定调控表达所必需的特异的调控顺序，而且通过分析表明这些顺序能控制异源基因的表达。
本发明还包括一种含来自玉米α-微管蛋白基因的调控元件的植物嵌合基因，该调控元件控制根特异性基因表达，花粉特异性基因表达，分生组织特异性基因表达或未成熟胚胎特异性基因表达，并且连于一种异源基因的编码顺序上，使得调控元件能控制这种异源基因。异源基因可以是除玉米α-微管蛋白基因之外的任何基因。如果必需，可以在嵌合构物部分或全部地含有其他启动元件，如单子叶的内含子，使之足以表达生成有效量的由异源基因编码的多肽并提供任何有利的农业性状，如抗虫，抗线虫，抗真菌以及最好为抗除草剂性能。
因此，本发明包括玉米α-微管蛋白基因和URE区域的嵌合基因，它提供本发明的根特异性的表达并连于编码抗除草剂酶的顺序。最好，URE区域包括α-Tub1的核苷酸1—1115，963—1115或1—1529。如SEQ ID No.：1所示。对这些提供根特异性表达的任何修饰构成了本发明一部分。根会累积某些种类的除草剂，这使它们对低剂量施用的这类除草剂十分敏感。因为玉米α-微管蛋白基因的URE元件能在根部控制高且受控的表达，因此，它们能被用于提供抗性表型。这些元件能用于调控某些编码抗除草剂酶的基因的表达，如来自S.typhimurium的aroA，编码能解除草剂毒性的酶的基因，如来自K.ozaenae的brx基因，它抗溴苯腈。含这些元件的嵌合基因可以用来生产耐农用剂量除草剂的转基因植物。
本发明还包括含玉米α-微管蛋白基的URE的一个区的嵌合基因，此区提供花粉特异性的表达并与异源基因融合。该构建物提供与玉米α-微管蛋白的“正常的”表达在空间上分离的表达，即异源基因在植物花粉中直接表达。换言之，当从URE的上下文中去除一个特定的顺序时，便修饰了组织的特异性的调控。最好，α-Tub1的URE区域包括核苷酸1—1348或295—1348，如SEQ ID No.：1中所示。同样最好的是，将该调控元件与细胞毒性蛋白质融合以形成雄性不育植株。对这些提供花粉特异性表达的嵌合基因进行的任何修饰是本发明的一部分。
本发明包括含玉米α-微管蛋白基因的URE一个区域的嵌合基因，此区提供分生组织特异性的表达并与异源基因融合。最好，α-Tub3的URE区域包括核苷酸1—695或542—695，如SEQ IDNo.：3中所示。对这些提供分生组织特异性表达的嵌合基因的任何修饰是本发明的一部分。
本发明包括含玉米α-微管蛋白基因的URE一个区域的嵌合基因，此区提供分生组织特异性的表达并与异源基因融合。最好，α-Tub3的URE区域包括核苷酸1—1076，如SEQ ID No.：3中所示。对这些提供未成熟织胚胎特异性表达的嵌合基因的任何修饰是本发明的一部分。
使用这些嵌合构建物对于提供抗除草剂性状特别重要。因为大多数除草剂对杂草和作物不加区分，所以通过遗传工程产生抗除草剂的作物植株是具相当农业重要性的，因其允许使用广谱除草剂。因此，本发明包括含玉米α-微管蛋白的URE元件的嵌合基因，该元件将根特异性表达赋于至少部分启动子，此启动子在植物中起作用并且还与至少一部分aroA基因或编码提供除草剂抗性的多肽的顺序相连。作为例子的有提及的赋于抗草甘膦，与5-烯醇成丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)相近的抑制剂，磺酰脲类，咪唑啉酮，乙酰氧羟基酸合成酶(AHS)和4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(CHPPO)的抗性。主要是，α-Tub1的URE区域包括如SEQ IDNo.：1中所示的核苷酸1—1115，963—1115或1—1529，并且和报导基因融合。任何对这些提供未成熟胚胎特异性的表达的嵌合基因的修饰是本发明的一部分。
本发明的嵌合基因的构建是通过将部分或全部的玉米α-微管蛋白的启动子顺序与异源基因的编码顺序相融合，可以用多种方法使这些顺序并列。较佳地，从5′至3′，顺序的次序是这样的：玉米α-微管蛋白的URE、单子叶或双子叶如烟草的内含子顺序，编码顺序和多聚腺嘌呤化(poly(A)位点)。
构建这种嵌合基因的传统方法是本领域的熟练技术人员所熟知的，而且可以在文献中找列，如Ausubel等人(1989)的文献。有多种不同的连接DNA片段的方法可供使用，取决于DNA片段末端的性质。本领域的熟练技术人员知道，对于待表达的异源基因，构建物需要启动子以及使转录产物有效地多聚腺嘌呤化的信号。因此含有已知的CAAT和TATA盒的启动子顺序的玉米α-微管蛋白的URE区域可以直接与没有启动子的编码顺序融合。此外，不含CAAT和TATA盒的玉米α-微管蛋白的URE区域可以连于编码启动子并在植物中起作用的DNA片段。植物启动子可以购买到或者参照其发表的顺序而化学合成。作为这样的一个片段的例子，可以提及的是缩短的花椰菜菜叶病毒的35S启动子，它保留了CAAT和TATA盒。可以使用其他的启动子，如胭脂碱合成酶和核酮糖1，5-二磷酸羧化酶的启动子。启动子片段再连于异源编码顺序。编码顺序的3′端与多聚腺嘌呤化位点融合，例如(但并不局限于此)，胭脂碱合成酶的聚腺嘌呤化位点。此外，可以使用植物转化载体，这些载体在转化植物所需的顺序周围含一个种或多个聚腺嘌呤化位点。
可以将玉米α-微管蛋白的URE元件和本发明的异源编码顺序亚克隆入植物转化载体的多连接点，从而获得嵌合基因。
本发明的5′元件可以通过用限制性的内切核酸酶或外切酶消化玉米α-微管蛋白基因组克隆而得到。含CAAT和TATA盒的限制性片段连于没有启动子的异源基因，如GUS或aroA的编码顺序。本领域的熟练技术人员知道可用其他方法获得玉米α-微管蛋白的5′调控部分，如用化学法或酶法(PCR)合成。异源产物可以是任何基因的编码顺序，它可在这样的构建物中表达。所有这些例子是本发明的一部分。编码顺序的3′端可以任意地与多聚腺嘌呤化位点融合，例如(但并个局限于此)，胭脂碱合成酶的，章肉碱T-DNA的基因7的或拟南芥属组蛋白基因的H4A748基因的多聚腺嘌呤化位点。以外，多聚腺嘌呤化位点也可由异源基因自身提供。
玉米α-微管蛋白的不含TATA盒的5′调控元件可以连于至少部分植物启动子顺序，也就是说至少含CAAT及TATA顺序。最好此启动子是缩短的花椰菜花叶病毒的35S启动子。得到的嵌合复合体可以连于异源编码顺序和多聚腺苷酸化顺序上。
为了获得异源基因的受控的表达，用本发明的嵌合基因转化植物。作为一种在转基因植物中表达异源基因的方法，基因转移在本领域是人们熟知的。烟草是最常用的植物，因为它易于再生，单株的种子产量高而且因为可以用来自农杆菌Ti质粒的载体高频率地转动(Klee et al.，(1987)。Annu.Rev.Plant Physiol 38,467)。双子叶植物，例如(但不限于此)棉花，油菜和大豆是优选的转基因宿主。但是，何种植物可以作为本发明的转基因宿主被有效地转化并再生将是本领域熟练技术人员能力范围之内的事。
已知有许多转化方法。可以用叶圆片上的转化法将嵌合基因引入并再生，如Horsch等人，(1985)Science 227，1229中所述。其他的转化法，如原生质体培养，(Horsch et al.(1984)Science 223,496；DeBlock et al.(1984)EMBRO J2，2143；Barton et al.(1983)Cell 32，1033)或体外转化茎或根的外植体(Zambrisky etal.(1983)EMBO J2，2143；Barton et al.(1983)Cell32，1033)，也可以在本发明的框架下加以使用。最好植物用来自农杆菌的载体进行转化。但是，也有其他方法可以用来将本发明的嵌合基因插入植物细胞。在这些方法中，有基因枪法(Klein et al.，(1983)，Na-ture 32770)，电穿孔法，通过化学诱导吸收DNA以及使用病毒或花粉作为载体。
如果转化方法需要，本发明的嵌合基因可以引入植物转化载体，例如Bevan描述的二元载体(1984)或在欧洲专利申请337,899中所述的另一方法。植物转化载体可通过修饰天然的Agrobacteri-um trmefaciens基因转化系统而得到。天然系统包括大Ti(肿瘤诱导)质粒，它含有一个大片段，即T-DNA，它会转移至被转化的植物中。Ti质粒的另一片段，即vir区域是负责转移T-DNA的。T-DNA被末端重复顺序所围绕。在修饰过的二元载体中，已去除诱导肿瘤的基因并利用vir区域的功能转化用T-DNA边界顺序界定的外来DNA。T区域还含一个可筛选的抗生素抗性记号，和用于插入待转移的顺序的多克隆位点。这些遗传工程菌株是已知的“解除武装”的Agrobacterium tumefaciens而且它们能有效地在植物核基因组中转化由T区域界定的顺序。
表面灭菌的叶圆片用含外来DNA的Agrobacterium tumefa-ciens接种，培养2天，再转入含抗生素的培养基中。在含适当抗生素的培养基中长出根后，选择转化芽，并转入土壤。转基因植物自花授粉，收获这些植物的种子并培养于含抗生素的培养基中。
报导基因或异源基因在根、芽、花粉、分生组织和未成熟胚胎中的表达可以用免疫学或组织化学试验或活性试验来监测。
下面将看到，选择什么样的试验方法检测嵌合基因的表达取决于异源编码区域的性质。例如如果有适当的核苷酸探针，可用Northern分析监测转录。如果有针对异源基因编码的多肽的抗体，可以使用Western分析和免疫-组织化学定位法以监测产物并将多肽定位。取决于异源基因，还可使用生化测试法。例如，通过测量标准底物的乙酰化反应可检测乙酰基转移酶。可以通过测量转化植物的除草剂抗性而监测抗除草剂基因的表达。
本发明还包括含本发明的嵌合基因单子叶及双子叶转基因植物及后代。植物细胞可以利用上述的任一种转化植物的方法，用嵌合基因转化。通常在愈份组织或叶圆片培养中的转化的植物细胞，用本领域熟练技术人员熟知的方法(如Horsch et al.(1985)Science227，1129)被再生完整的转基因植物。最好，转基因植物是棉花，油菜，玉米，烟草或大豆。因为转化的植物将嵌合基因传递给后代，因此可以用转化植物的种子或外植体来维持转基因植物系。
本发明还包括一种产生具有改良的抗除草剂性能的植物的方法。该方法包括用含嵌合基因的载体转化植物，该嵌合基因含对根或分生组织特异的，并连于抗除草剂酶或降解除草剂的酶的编码顺序的调控元件，并选择具所期望性状的植物。最好，这类元件是α-Tub1的URE的区域，含SEQ ID No.：1中的核苷酸1—1115，963—1115或1—1529。转化植物被再生成对施用的除草剂具抗性的植株。
本发明还包括一种产生雄性不育的植物的方法。该方法包括用含嵌合基因的载体转化植物，该嵌合基因含对花粉特异的，并连于细胞毒性蛋白质的编码顺序的调控元件，以及选择具所期望性状的植物。最好，这类元件是α-Tub1的URE的区域，含SEQ ID No.：1中的核苷酸1—1348或1295—1348。转化植物被再生成雄性不育的植株。
本发明还包括一种产生抗除草剂性状的植物的方法。该方法包括用含嵌合基因的载体转化植物细胞，该嵌合基因含对根特异的并连于抗除草剂如N-膦羧基甲基甘氨酸的基因的编码顺序；然后，选出具有所期望的抗除草剂性状的植株。选出的植株是在用除草剂处理时能存活的，而在同样条件下非转化的同物种的植株被杀灭。最好此类元件是α-Tub1的URE区域，含SEQ ID No.：1中核苷酸1—1115，963—1115或1—1529，且异源基因顺序由编码EPSPS合成酶：乙酰乳酸合成酶，或4-羟基苯基丙酮酸双加氧化酶的基因，或者经突变而使它们具有抗性的基因提供的。转化植株再生成抗除草剂的植株。最好，植物是用载体pRPA—RD—65(或pRPA—RD—88)转化，该载体含有：含α-Tub1的URE的核苷酸70—1529的对根特异的调控元件，一个单子叶植物的内含子(pRPA—RD—88单独)，一个优化的转运肽以及抗除草剂基因aroA。
下列实施例将更全面地阐述本发明。
在实施例中引用的核苷酸顺序排为SEQ ID No.：1到4。
图1为亲本质粒pBI 101.1结构。
图2是嵌合构建物α-Tub1/GUS启动子的示意图。数字是依转录起始点给出的。上图对应于α-Tub1和α-Tub2之间的基因间区域，而且通过在适当位点的限制酶消化来形成缺失。下图对应于片段-449，这里，缺失是通过用外切核酸酶III消化数次而得。SacII位点(+48)对应于启动子和质粒pBI101.1的转录融合点。(+)对应于微管蛋白基因α-Tub1的转录起始点。
图3是嵌合构建物α-Tub3/GUS启动子的示意图。数字是依转录起始点给出的。用外切核酸酶III消化数次而形成缺失。BglII位点对应于启动子和质粒pBI101.1的转录融合点。(+)对应于微管蛋白α-Tub的转录起始点。实施例1：a)带GUS报导基因的构建物：
在实施例中使用的通用的GUS报导基因盒已由Jefferson等人，1987，EMBO J6，3901描述的。简而言之，将GUS的编码顺序连接在来自A.tumefaciens的载体pBIN19的多连接位点处的胭脂碱合成酶的多聚腺苷酸化位点的5′部分(Bevan(1984)NucleicsAcids Res.12，8711)。载体pBIN19含植物转化所需的T-DNA的左右边界，以及卡那霉素抗性基因。得到的构建物PBI101.1见图1。只有GUS的起始密码子AUG上游的限制性位点才能插入启动子DNA片段。
表1列出了亲本质粒及衍生的构建物。玉米α-Tub1及含于衍生的构建物中的启动子元件的位置列于图2。
构建物pα-Tub1-GUS为长的重迭片段，它函盖了调控区域的全长(图2中的-1410至48)。几个构建物的5′端是通过外切核酸酶III消化pBI101.1(stratagene)中α-Tub1的497碱基对而得的〔-449(SpcI-SacII)，表1〕。各种缺失的位置见图2。b)转化植物
按照标准程序(Horsch等人，(1985))，用基于pBIN19的质粒构建物转化烟草(Nicotiana tabaccm cv petite Havana SRI)，方法的不同处是初始转化子在100μg/ml卡那霉素上筛选。
植物经自花传粉，FI代种子在200μg/ml的卡那霉素上萌发以鉴别转化子，因为基于pBIN19的构建物含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因，它提供对有毒的卡那霉素的抗性。对每个转化子，整合入烟草基因组的每种GUS构建物下的拷贝数通过分析卡那霉素抗性的分离频率计算出。大多数转化子包含一个来自构建物的发生分离计算出的基因(locus)。转基因植物在温室中生长。
                  表I
构建物            描述
亲本质粒
pBI101.1          基因的pBIN-19盒，无启动子，来
                  自GUS报导基因(Jefterson et
                  al.，1987)(cf.图1)
pRPA-BL-504       类似于pBI 101.1，不同处在于氯霉
                  素乙酰基转移酶代替了GUS基因
pα-Tub1          来自MG 19/b的3058bp的XhoI
                  片段(Montoliu et.al.，1989)，克
                  隆入pUC-18；含全部的玉米α-
                  Tub1上游调控群
pα-Tub1—1588    克隆入pUC18的来自玉米α-Tub
                  1的1588bp的XhoI-AluI片段
                  (Montoliu et.al.，1989)；含转录
                  起始点上游1410bp及下游180bp
pα-Tub3—1072         来自玉米α-Tub3的1072bp的
                       BglII片段(Montoliu et.al.，
                       1990)，克隆入pUC-18的BamHI
                       位点；含转录起始点上游1020bp
                       及下游62bp
pRPA-RD-37B            aroA表达盒，含以符合读码框方
                       式融合的优化的转运肽(EP508
                       909)，aroA基因和NOS多聚腺苷
                       酸化信号顺序，克隆入pBSIISK
                       (-)(stratagene)
pRPA-RD-49             单子叶转化载体，含35SCaMV启
                       动子，bar基因以及TR7多聚腺苷
                       酸化信号顺序，克隆入pUC-18的
                       HindIII和EcoRI位点之间。在两
                       个AflIII位点和SspI位点之间的
                       平头末端处将NotI接头连接上
                       去，并形成含基因构建的35S
                       CaMV-bar的3.1kb的NotI片段
pRPA-RD-26             来自克隆入EcoRI-HindII消化的
                       pUC-19的pα-Tub1的1865bp的
                       EcoRI-ScaI片段。翻译起始的
                       ATG旁的顺序用PCR突变从而含
                       NcoI位点，使用的引物为5′→3′：
                       C GGC CGC TCC ACC CGT ACG
                       ACG ACC ACC ATG GGG GAG
pRPA-RD-32             将pRPA-RD-26的1458bp的Pst
                       I-NcoI片段，由来自玉米基因α-
                       Tub1的核苷酸-1340至118构成
                       (SEQ ID No.：1的核苷酸71—
                       1527)，连于pRPA-RD-37B的Pst
                       I—NcoI位点，形成玉米α-Tub1-
                       OTP-aroA基因-NOS表达盒
pRPA-RD-87           将含玉米adhI内含子的600bp
                     NcoI-PstI片段克隆入pRPA-RD-
                     37B的NcoI-PstI位点，形成表达
                     盒：玉米adhI内含子1—优化转运
                     肽(EP508909)，aroA基因和
                     NOS poly(A)化信号
pRPA-RD-90           来自pRPA-RD-32的1430bp的
                     EagI片段(含玉米基因α-Tub1
                     的核苷酸-1340至90；SEQ ID
                     No.：1的顺序71—1499)，并用
                     E.coli的DNA聚合酶I的
                     Klenow片段切成平头末端，克隆
                     入pBSIIsk(-)的SmaI位点
                     (stratagene)
衍生的构建物
—1410                将来自pαTub1-1588的HindIII-
                     SacII片段克隆入HindIII-SmaI
                     消化过的pBI101.1；含转录起点上
                     游1410bp及下游48bp
α-Tub3-1020         将pα-Tub3-1072的1115bp的
                     HindIII-SmaI片段克隆入Hind
                     III-SmaI消化的pBI101.1；含转录
                     ·起点上游1020bp及下游62bp.
                     (cf图2)
—956                用BammHI消化并重新环化而得的
                     -1410衍生构建物；含转录起点上
                     游956bp及下游48bp
—449                用SpeI消化并重新环化而得的-
                     1410衍生构建物；含转录起点上
                     游449bp和下游48bp
—352        用外切核酸酶III消化并重新环化而
             得的-449(pBI101.1中)衍生构建
             物；含转录起点上游352bp及下
             游48bp。
—297        用外切核酸酶III消化并重新环化而
             得的-449(pBI101.1中)衍生构建
             物；含转录起点上游297bp及下
             游48bp
—252        用外切核酸酶III消化并重新环化而
             得的-449(pBI101.1)中衍生构建
             物；含转录起点上游252bp及下
             游48bp
—184        用外切核酸酶III消化并重新环化而
             得的-449(pBI101.1中)衍生构建
             物；含转录起点上游184bp及下
             游48bp
—117        用外切核酸酶III消化并重新环化而
             得的-449(pBI101.1中)衍生构建
             物；含转录起点上游117bp及下
             游48bp
—64         用外切核酸酶III消化并重新环化而
             得的-449(pBI101.1)中衍生构建
             物；含转录起点上游64bp及下游
             48bp
pRPA-RD-53   含来自pRPA-RD-32的表达盒玉
             米α-Tub1-aroA的3.5kb的
             SacI-EcoRI片段，克隆入pBIN-19
             的ScaI-EwRI位点
pRPA-RD-65     3.5kb的SacI-EcoRI片段，含来
               自pRPA-R-32的表达盒玉米α-
               Tub1-A，通过T4DNA多聚酶使
               末端补平，克隆入用Ecoli的DNA
               聚合酶的Klenow是片段切成平头
               末端的pRPA-RD-49的NdeI位
               点。来自pRPA-RD-32的表达盒玉
               米α-Tub1-aroA的方向与aroA
               及bar基因转录单元的方向经证实
               是相反的
pRPA-RD-88     来自pRPA-R-90的1.5kb的Pst
               I片段，含玉米α-Tub1基因的核
               苷酸-1340至90(SEQ ID No.：1
               中顺序7(至1499)，克隆入pRPA-
               RD-87的PstI位点，形成表达盒：
               玉米α-Tub1-玉米adhI内含子1-
               优化的转运肽(EP508909)，aro
               A基因及NOS poly(A)化信号
pRPA-RD-7：    优化的转运肽(EP508900，SEQ
               ID No.：4)的衍生物；用PCR突
               变，使用下列合成的寡核苷酸：(1)
               GAA TTC CGA AAG ACA AAG
               ATT ATC GCC ATG GCT TCG
              〔核苷酸1—36；SEQ ID No.：3〕；
               (2)CCG TAG GCC GGC CAC
               ACC TGC ATA CAT TGA ACT
               CTT CC〔核苷酸228—181；SEQ
               ID NO：31〕；和(3)CGA GAC
               GCT GTC GTA CCT GCC GCC
               GCT GTC TAT GGC G〔核苷酸
               231.—267；SEQ ID No.：3〕该优
               化的转运肽被克隆入pBSIIsk(-)
              〔stratagene〕的EcoRI和EcoRV
               位点，形成含优化转运肽的克隆盒实施例2：GUS活性的组织化学定位；根及花粉特异性的表达
在含构建物的各转基因烟草的根、花粉及大量其他组织测定GUS活性，并列于表1。按照Jefferson等人(1987)的通常的程序。
在含来自玉米α-Tub1基因的启动子片段的嵌合GUS基因的转基因植株中，进行了GUS活性的组织化学定位。样品用50mMNaPO4，pH7，0.2mM 5-溴-4-氯-3吲哚基-葡糖醛酸(X-Glue)，0.1mM铁氰化钾和0.1mM亚铁氰化钾的混合物洗涤。样品置于显微镜载玻片上。用80％甘油盖住。
表2以总结形式列出含玉米α-Tub1基因的调控元件的烟草植株的典型的显微照像的结果。表2表明α-Tub1的调控元件在分生组织，尤其根的分生组织及花粉中能给出高水平的表达。
用荧光光度法分析GUS活性，在提取缓冲液(50mM NaPO4，10mMEDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton X-100和100mMβ-巯基乙醇)在研磨植物组织。裂解液经离心后，取出上清液，置于新管中以100μl一份地加入。加入等体积的溶于提取液中的2mM4-甲基繖形基-γ-葡糖醛酸，在37℃保温1小时。加入0.8ml Na2CO3(0.2m)使反应终止。4-甲基繖形酮(4-MU)的荧光用Hoeffer微型荧光计，按Jefferson等人(1987)所述的方法进行测量。GUS活性以对每分钟每单位蛋白质总质量的4-MU的皮摩尔数表示。为了确定负责分生组织特异性的和关于花粉特异性表达的启动元件，测定了各种启动子缺失体(cf图2)的GUS在转基因的烟草植株中的表达方式。
测量了含指导GUS表达的α-Tub1的各种顺序元件(总结于图2)的转基因植物的根尖，芽尖，叶，茎和花粉的GUS活力。结果列于表3。所有含有玉米α-微管蛋白的α-Tub基因的URE的-1410和-352(SEQ ID No.：1至1058)之间的部分的构建物都赋与转基因烟草根部以GUS活性。全长的调控区域及其片段都赋与烟草原生质体以高活性。只有缺失转录起点上游小于-352bp(SEQ ID No.：1中的1058)的启动子部分，GUS活性才会在转基因的根中受抑制，这表明α-Tub1的根特异性的调控部分是上游的-352bp(SEQID No.：1至1058)。
所有含有玉米α-微管蛋白的α-Tub基因的URE的-1410和-64(SEQ ID No.：1中1至1058)之间的部分的构建物中都赋与转基因烟草花粉以GUS活性。只有缺失转录起点上游小于-64bp(SEQID No.：1中的1348)的启动子部分，GUS活性才会在转基因的花粉中受抑制，这表明α-Tub1的根特异性的调控部分是上游的-64bp(SEQ ID No.：1至1058)。
                表2：组织化学分析转基因植物
                                 组    织
 构建物    根尖    芽尖     叶     茎   花粉
 -1410-956-449-352-117-64  +(12/12)+(6/6)+(8/8)-(12/13)-(9/9)-(11/11)  -(12/12)-(6/6)-(8/8)-(13/13)-(9/9)-(11/11)  -(12/12)-(6/6)-(8/8)-(13/13)-(9/9)-(11/11)  (-12/12)-(6/6)-(8/8)-(13/13)-(9/9)-(11/11) +(12/12)+(6/6)+(8/8)+(6/10)+(4/9)-(11/11)
数字表示与整个分析过的植株相比每种构建物植物各部分中带蓝点(用(+)表示)的植株数或无表达的(-)植株数。
        表3：荧光光度测试转基因烟草植株的带玉米
      α-微管蛋白的α-Tub1基因的启动子的GUS构建物
                                   组织
构建物 发芽后天数    全部根2   对照植株根2     整叶2  对照植株叶2 子叶2  对照植株子叶2
 -1410   101525  388±124727±736265±233     151620   39±261±5515±2  131415 148±56 2
 -956   101525  3082±15514934±557237±170     151620   736±499612±36330±15  131415 86±52 15
 -449   101525  405±4070±28469     151620   73±64118±13419±8  131415 172±57 15
 -352   101525  4661526±10     151620   12713±227±2  131415 5±2 15
实施例3：GUS活性的组织化学定位：分生组织特异性表达
在含使用来自玉米α-Tub3基因的启动子片段(SEQ ID No.：3中核苷酸1—1082)的嵌合GUS基因的转基因植株中，进行GUS活性的组织化学定位。样品用50mM NaPO4，pH7；0.2mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖醛酸(X-Gluc)；0.1mM铁氰化钾和0.1mM亚铁氰化钾的混合物洗涤。样品置于显微镜载波片上，用80％甘油盖住。
表4以总结形式列出含玉米α-Tub3基因的调控元件的烟草植株的典型的显微图像的结果。表4表明α-Tub3的调控元件(核苷酸1至1082，SEQ ID No.：3)在分生组织优先给出高水平的表达。
用荧光光度法分析了GUS活性，在提取缓冲液(50mMNaPO4，10mM EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton X-100和100mMβ-巯基乙醇)中研磨植物组织。裂解液经离心后，取出上清液，置于新管中以100μl一份加入。加入等体积的溶于提取液中的2mM4-甲基繖形基-γ-葡糖醛酸，在37℃保温1小时。加入0.8mlNa2CO3(0.2M)使反应终止。4-甲基繖形酮(4-MU)的荧光用Ho-elfer荧光光度计，按Jefferson等人(1987)所述的方法进行测量。GUS活性以每分钟每单位蛋白质总质量的4-MU的皮摩尔数表示。为了确定负责分生组织特异性的启动元件，在转基因的烟草植株中确定了各种启动子缺失体(cf图2)的GUS的表达方式。
          表4：荧光光度测试转基因烟草植株的带玉米
        α-微管蛋白的α-Tub3基因的启动子的GUS构建物
                              组织
  发芽后天数 根尖   对照植物根尖 芽尖   对照植物根尖
   121619232630  12.88±6.687.31±3.6347.67土35.9027.17±20.9331.77±13.8120.64±12.44     3.653.564.785.974.828.10  39.02±22.0433.22±22.0020.53±4.0028.35±10.9735.66±30.8829.40±17.88     2.851.933.060.421.853.81
植物用与GUS报导基因融合的启动子片段—1024稳定转化。结果的pmol/hr×mg蛋白质表示，为4个独立转化的F1植株中每一个的6—16个后代植株的平均值。实施例4：将抗除草剂性能引入烟草
将来自亲本质粒pRPA-RD-32(cf表1)的3.5kb的SacI-EcorI片段克隆入PBIN-19的SacI-EcoRI位点。得到的构建物，叫pRPA-RD-53，在转录框架中含下列元件：玉米α-Tub1调控元件，优化的转运肽(OTP)，aroA基因，和nos终止子。
将亲本质粒pRPA-RD-53通过三亲本杂交转入Agrobacteri-um tumefaciens EHA105菌株(Hood et al.，(1986)J.Bacteriol，168，1291)，得到的农杆菌用于烟草叶圆片的转化。再生的烟草植株，约20cm高，在温室中用Round Up剂型的草甘膦喷洒。含pRPA-RD-53的转化植株存活并健壮，表明对草甘膦的耐受性提高了。SEQ ID No.1：玉米α-Tub1启动子顺序CTCGAGAAGG ACTACGAGGA GGTTGGTGCT GAGTTTGATG AGGGTGAGGA AGGTGATGAT    60GGTGATGAGT ACTAGAAGTA TCCTGATGCG GTCATCGTCA GGCTTGTGTG CTGCTCTTGT   120CCCCGTTGTG GTTTGCAACA CCTGATGTTG TAAGACTTTC TCGTTATGTC CGCCCCGCTG   180TGCCACTGGG TTATTAAGAA CGTCGTTATG GATGGTTGTC TACACTACAT TATTGCTTCT   240CGATATTGGA AAACTGTTAT GCGCCTCGGT GGATTGTGTT GTTGTCGTAA TGTCATCACT   300CATACGCCGC TGGGAATTTT GAGGCCTGTC AAGCATCAGG ATTGCGTTAT GAGTTAAATG   360CTTCAGCGAC GTTTAAACTT GTCTAAGGTG CCATCTAGAT CATGAACTTG TCAAGGGTTG   420CCACTTAGAT CATGAACTTC GTAAATATGT TTTTGGATCC AAAATATGTT TTTTATCCTT   480AAGGGTGTGT TTGTGTGTTT GGTTGAATGT ATAAGAAGGG ATGAAAGAGG AATGTCATAA   540TTTCTATAGT GTTTGGTTGA GAGACAAGTG AGGACGAGAT AAATACCTAA GAAGGGATGA   600AAGAGGAATG CCACAATTTC TATAGTGTTT GGTTCAGAGA CAAGTGACAA TTTCTATAGT   660GTTTGGTTGA GAGACAAGTG AGGGCGAGTA AATACCGCAA TAATTTTTTG GTGGCACCAA   720ATTTTTGTGA AGTTGTATAC ATTTTGGACA CCAATAGAAA ATAGAATTAA AAAAATATAA   780AACTGGTGTC ATTTAAATCA GTGTCACGTT ATTAAAATTT AAAACTATCA ACTAAAATTG   840TCTAATGGAT TATTTATGTG GTTTTGTAAA GTTGTGGAGA TTAAACAACC AGTTTTGAAG   900ATAAGTAAGT GAAATAGTCA AATAGACCGT ACTAAAGGTT AAGAATTTAG GTACACTTAC   960GACTAGTTTA GATGCCGCAA AATGGGTTAA ATTTTTCTTC TTATTCAAAA TTAAATAATA  1020AGGTGAATTT AACTACTCTA ATTTCCTCTG TTTTTTTAAC TCCCAAACTA TCCCTTATTC  1080GTAATAATAG GAAGCGGTGA CAGTTTGGTG GTGAGAACTC AGGTATCAAC AAAAAGAAAT  1140GTATTTTTGA AATATTTTGC TCGTAATGCC CTGCAAGGTT TCGATTTCCG TAGCCAGTAC  1200ATGTCCGCTC TTGACCCAGG TACTGTGACA CGAACCAACC GACCGTTGAA CGGACGTGGA  1260GCACGAACCA TTAAAACAAT CAAAATCTCA GGGGCTCAAA CGAAAAAACA CCGCCCCCTT  1320CCCTCGCTTG CGCTGGCACT CCATCGTGGG CTCGTGGCCC AGGCTGTCGT TCTGTTCTAT  1380AAAGCGAGAC GAGTGGGAGC AGGCGTAACC CTAATTGAGC ATCGCAGAGA TAGGCGTCTT  1440CGTACTCGCC TACCTCCGCG GCTCAAACCT TTCCCCCTTC TCCCAATTCC TTCCGCCGGC  1500CGCCGCTCCA CCCGTACGAC GACACCATG                                    1529SEQ ID No.2：玉米α-Tub2启动子顺序GAATTCCCTT TGTGAGAAAT CTCCACAAGT TGGAGCCTCT CACCCTTACA AGATTGATCA    60CAATTAAACC ACAAGAGTAA GGGAGGGAAC AGAAACACAC ACAAGTGCTA GAGTCGCAGC   120AATGACATGC ACACAAGTCA AGAAACGAGC ACACAACACA GCGCAACGAG GTCACAGTTC   180AAACAAGTGC TCAAATCTTA AACACAATGA ATCGAATGCG TGCTTGCGGA GTCTAGACGT   240TTTTTCAATG GAGGCTTGGT GTACTGCTCC ATGTGTCTAG GGGTCCCTTT TATAGCCCCA   300AGGCAGCTAG GAGCCGTTGG AGCTCCATTT GGAAGGCCAT TGTTGCCTTC TATCCGTGGG   360TGCACCGGAC AGTACGCGCT CGGGACGCGG CACATAATCC CATGATTGGC CGGTTTCCGC   420TTCTGGGGGC ACCAGACGGT CCAGACGACC AGTGCGCCTG TCGACCGTTG GCCAGCGCTG   480ACGTGGCCAC TAGTCGTTGC GTGGCTGATA CAACAGACTG TTCGGCGCAT TGCGGACCAT   540CCGGTGAATT ATAGCTGATG TAGGCTAAAA AACCCGAGAG CAGCGAGTTC GGCCGAACCG   600TGCACCAGAC TGTATGGTGG GTGGCATCAG ACCGTTCGGT GCTACACAGT CTAGCAACTT   660TTCCCTGTTT CTTCTTTTGT CTTCTTTGTT TCTTTTGGAC TTCACTTAGC TGGGTCCCCT   720GGCACTTAGA CAAATATGAT TAACACTCAA ATCAATTGAC TTAGTGTCTA GAGCATACCT   780TTTAGCTTGA TCCATATAGC TTTGTACTAA GTCCTCTTCC GAGCTCATTT TGCCTCACAC   840TTTTGCTTAA CATCATGTTA GTTCAAACAT CATGTGTTGT GCATCTAATC ACCAAACCAA   900TATAGAAATG CCCAAGGACA CATTTCCCTT TCAGTCGGGG GGAGGGGGGT TGGTGGTCGA   960CGCCCCGGTA CGAAGTGGGT GGGGGCAGGC GAGAGGGGGT GCACCATGGG CCACCCAGTG  1020CGTGGTCCGG TTTTGATCCA TGTAACTCTA TATAAATCTC TATTTAATTC GGTATAAAAT  1080AGTTAAGATG AAAGAGAGAA TAAAATTTAG TAGATTTGAC AGTCATATAA AATTTCTAGA  1140TCGACCCCTG TGGTGGGTGC GTCGAAATTT CTAGACCGCC CTAGGCCGGG GATGACACAT  1200GGAACCGTGT ATGCACAAAG CTGCTGCATT ATAATTGTAG AGATTAATTA TGTTATTTAG  1260GAAATAAAAG TTTAGGAATA GTATATAAAA CAAGGATTGA GCTCCAGATA TATAATAGGC  1320CGAGTCCTGT AATTTTGTGA CATTTTTTTG AAACCAGGAT TGAGCTGCAG TTTTTAGTGT  1380TAGAGTCCAG CGTCTCACAG GAGTGGTCCA ATTCAAATTC GAAAATGTAT CACCGCTGAA  1440GCGAAAAATA TCATAAATTC ATAACGAACC AACCGACCGT TGCACGGACG AGAACTCGAC  1500GAGACCGAAC CGTGAAAACA ACCGAAAGCA CAGGGGCTCA AACGAAACAA TCCCGCCCAC  1560ACTTCCTTCG CCGGCTCATG GTGGCCACTG GCCAGGCTGT CATCCTGTTC TATAAAGCGA  1620GCCGAGGGGA AGAGCCGGAA CCCTAGCCCA GCACCGCAGA GGCGCAGAGA CAGGCGTCTT  1680CGTACTCGCC TATCTCCGCG ACTCAAAGCT TCTTCCATTT CCTACCGCCG CCGCTGCAGC  1740TCCACCCCAT TCCGTCGACA CCATG                                        1765SEQ ID No.3：玉米α-Tub3启动子顺序AGATCTTGAT TCTGTGCAGT GCTGGTGATG GGAAAAAGCG AAAAACCATC GGTATGTTTT     60TGACAAATAT GAAAATGGGA CAAAAACAAC ATGTGTGTTT TTTCGACCGT TTCCGCTTTT    120CTTGTTTTAG TCACAATAGC TCGTTTTTAT CCACATATGA TATCTCATTT TAGATAATAC    180ATGAACAAAT CATAATTGAT TATATCATAT CTCAACAAAT TAACCCGTAA TGAATTATTT    240TTCTTTGATA GTCATATGTA CATTACAATA TTTCGCTTCC ATATGTATGG ATGTGATGTT    300TTAATCGATT GCAACACTAC TTTTATTTTT ATACTCTATG TGACAATTAT TTCCGCTTTT    360ATTTACATCT TATTCCGATC TGTTATCGAT ATCGATTTGT TCCGTCCCGT TTTTATCTTA    420TTTCTGATAG TTCCAATTTA ATCTTATTTT CGAAATAAAG TATGAAAATA AAAATAAGAG    480AGATTGTTAC GTTCGATCCG GTTTTGAACC CTAGCTATAC TTGCCCGTTG TTGCAACTGG    540CCGGCCATTC CATAGGCGGG CACAGTCAGC ACTCAGCAGT GACAGAGTGC GCGTGCGACA    600CACAGTTTCA AATTTCAAAA CTGAAACGGG CGGCTATAAA CAGAACCCGC TGCTCCCAGG    660AGCCTCACGC AGATAAATTC ACCCACATCA ATGCGGCCCA AATATTTATA ACCATCTATT    720GGTCCCACAT GTTCGTGTCA CAACATCCTC TACCGCAGGT AAAGATAGCC GTCTCGCCAA    780GACCCCGAGC CCGCCGCTGC CCGGACCCGC CGCCAGCTCA CACCCACCGT TGCCGGCCGC    840TGAGCCGTTC GAAGCCAAAA CGGTCGTTAA CCACCCAGCT GCCCGTCGGC TACCATCACG    900CCGTTAGCCC CGAACCAGAC GGCGGCTAGG TCTTCCGCCG CGCGCCGCGC CATCACGGGC    960CGGCCGCGGC CTTCTTTCCC ACGCTGCCTA TAAAAGCCGC CGCGGGGCTG AGCAGCATTA   1020TCGCTTCAGC TCGGCGTCTT CACAAACGCC GGCGCAAACT CTCGCCCGAG CCCGACAGAT   1080CTTCAATTCC CCATTCCGCC CACCGATCGA CCTTCACGCC AGTCTCGGTC TCTTCCGAAG   1140GCGTCGCGCG CGGTTGTTTG AGAGGGGAGG AGGAAGATG                          1179SEQ ID No.4：修饰的转运肽GAATTCCGAA AGACAAAGAT TATCGCCATG GCTTCGATCT CCTCCTCAGT CGCGACCGTT    60AGCCGGACCG CCCCTGCTCA GGCCAACATG GTGGCTCCGT TCACCGGCCT TAAGTCCAAC   120GCCGCCTTCC CCACCACCAA GAAGGCTAAC GACTTCTCCA CCCTTCCCAG CAACGGTGGT   180GGAAGAGTTC AATGTATGCA GGTGTGGCCG GCCTACGGCA ACAAGAAGTT CGAGACGCTG   240TCGTACCTGC CGCCGCTGTC AATGGCGCCC ACCGTGATGA TGGCCTCGTC GGCCACCGCC   300GTCGCTCCGT TCCAGGGGCT CAAGTCCACC GCCAGCCTCC CCGTCGCCCG CCGCTCCTCC   360AGAAGCCTCG GCAACGTCAG CAACGGCGGA AGGATCCGGT GCATG                   405
为方便起见，将文中提及的参考文献列于下面。参考文献
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Claims (31)

1.一种来自α-微管蛋白基因的分离的核酸，其特征在于，含有至少一个控制至少一种花粉，根，分生组织和未成熟胚胎中的特异性表达的调控元件。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，该基因是玉米α-Tub1基因。
3.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，该基因是玉米α-Tub2基因。
4.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，该基因是玉米α-Tub3基因。
5.如权利要求1—4所述的分离的核酸，其特征在于，该调控元件控制在其控制下的基因的表达，且能在花粉中检测出。
6.如权利要求1—4所述的分离的核酸，其特征在于，该调控元件控制在其控制下的基因的表达，且能在根中检测出。
7.如权利要求1—4所述的分离的核酸，其特征在于，该调控元件控制在其控制下的基因的表达，且能在分生组织中检测出。
8.如权利要求1—4所述的分离的核酸，其特征在于，该调控元件控制在其控制下的基因的表达，且能在未成熟胚胎中检测出。
9.如权利要求5所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQID No：1中的核苷酸1—1348。
10.如权利要求9所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQID No：1中的核苷酸1295—1348。
11.如权利要求6所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQID No.：1中核苷酸1—1529。
12.如权利要求11所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQID No.：1的核苷酸1—1115。
13.如权利要求7和8所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQ ID No.：3中核苷酸1—695。
14.如权利要求13所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQID No.：3中核苷酸542—695。
15.如权利要求7和8所述的核酸，其特征在于，调控元件含SEQ ID No.：3中核苷酸1—1076。
16.一种植物嵌合基因，其特征在于，含有权利要求1—15中任一权利要求所述的启动子DNA的充分的部分，该部分启动子DNA能在植物中起作用并在功能上连于编码顺序从而能使异源基因表达。
17.如权利要求16所述的植物嵌合基因，其特征在于，在启动子和编码顺序之间，含有此基因的另一个调控元件。
18.如权利要求17所述的植物嵌合基因，其特征在于，基因调控元件是能在植物中发挥功能的启动子。
19.如权利要求18所述的植物嵌合基因，其特征在于，另外的调控元件是花椰菜花叶病毒的35S CaMV启动子。
20.如权利要求18所述的植物嵌合基因，其特征在于，另外的调控元件是植物组蛋白启动子。
21.如权利要求18所述的植物嵌合基因，其特征在于，另外的调控元件是水稻肌动蛋白基因启动子。
22.如权利要求16—21所述的植物嵌合基因，其特征在于，它含有选自下列中的一种异源基因：编码脂质代谢的酶、去饱和酶的基因、抗除草剂基因，或编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，乙酰乳酸酶和4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPO)的基因。
23.如权利要求22所述的植物嵌合基因，其特征在于，并源基因是抗草甘膦的aroA基因。
24.一种植物转化载体，其特征在于，含有如权利要求16—23所述的植物嵌合基因。
25.含有如权利要求24所述的载体的植物细胞。
26.植物或植物后代，其特征在于，它是由如权利要求25所述的细胞再生而得的。
27.如权利要求26所述的植株，其特征在于，它是单子叶植物。
28.如权利要求27所述的植物，其特征在于，它是玉米或谷类作物。
29.如权利要求26所述的植物，其特征在于，这是双子叶植物。
30.如权利要求29所述的植物，其特征在于，它是烟草，棉花或大豆。
31.一种产生具有改良的农学性状的方法，其特征在于，它依次包括：
a)用权利要求24所述的载体转化植物细胞，
b)再生植株。
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