CZ274394A3 - Promotor elements of chimeric genes of alpha-tubulin, nucleic acids and chimeric genes containing such elements, and their use for transformation of plants - Google Patents

Description

Promotorové elementy chimérických genů cx-tubulinu, nukle-Q^ í,\’j.s VtA ové kyseliny a chimérické geny tyto elementy obsahující, ÍAÍ\'3'dd avy o jejich použití pro transformaci rostlin --7 6 IX '8 0

Oblast techniky | > cnsoa

I

Vynález se týká promotorových elementů chimérických genů α-tubulinu, nukleových kyselin, chimérických genů i 9 5 ^!i vektorů pro transformaci rostlin, které obsahují tyto ele- .p₃ menty, rostlin transformovaných pomocí těchto vektorů a způsobu vytváření výše uvedených rostlin.

Dosavadní stav techniky

Mikrotubuly jsou základními prvky řady funkcí ve všech druzích buněk. Konkrétně u rostlin hrají klíčovou roli v případě několika důležitých jevů, zejména jevů souvisejících s mcrfogenezí. U všech eukaryotních organismů jsou mikrotubuly složeny z rozsáhlého množství vysoce konzervativních proteinů, přičemž nejhojněji jsou přítomné tubuliny. Byly popsány dvě základní podjednotky proteinů, které jsou nazývány cc-tubulin a β-tubulin. Základní funkce mikrotubulů a jejich všudypřítomnost často navozovaly myšlenku, že jsou geny kódující tubuliny dobrým příkladem vysoce a strukturně exprimovaných genů. Ve skutečnosti jsou podjednotky tubulinu u eukaryotních organismů kódovány rodinou genů. Pokud se týká oblasti rostlin, byly α-tubuliny a β-tubuliny studovány u některých rostlin jako je kukuřice, huseníček (Arabidopsis), sója, hrách a mrkev. Ve všech těchto případech jednotlivé genomv kódují rozmanité geny α-tubulinu a β-tubulinu, které jsou odlišně exprimovány během vývoje rostliny. U huseníčku (Arabidopsis) bylo pečlivou analýzou rodiny tubulinových genů nalezeno 15 genů (6 pro α-tubuliny a 9 pro β-tubuliny) kódujících tyto proteiny (Kopczak a kol., 1992, Snustad a kol., 1992). U kukuřice byly klonovány a sekvenovány tři geny α-tubulinů (Montoliu a kol., 1989, Montoliu a kol., 1990), a pomocí analýzy genomové DNA za použití polymerasové řetězové reakce lze detekovat šest dalších (Montoliu a kol., 1992). Podle posledních studií bylo z kukuřičných tkání klonováno a charakterizováno alespoň šest sekvencí DNA rozdílných α-tubulinů (Villemur a kol., 1992).

Geny a-Tub 1 a a-Tub 2 získané z kukuřice jsou uspořádány v tandemu, oddělené nejméně dvěma tisíci párů bází (2 kilobáze, 2 kb) DNA. Jsou exprimovány ve všech meristematických tkáních kukuřice s vysokou úrovní exprese v kořenovém systému (Montoliu a kol., 1989). Gen α-Tub 1 je exprimován ve všech analyzovaných tkáních ve vyšším rozsahu než gen a-Tub 2, a je kromě toho vysoce exprimován v pylu (Montoliu a kol., 1990). Hybridizační experimenty in vitro ukazují, že je gen α-Tub 1 exprimován uvnitř meristematických tkání během klidné centrální aktivace (Rigau a kol., v tisku). V případě huseníčku (Arabidopsis) byl nalezen gen, který je specificky exprimován v pylu, ale nikoliv gen vykazující stejný typ exprese jako kukuřičné geny α-Tub 1 nebo a-Tub 2 (Carpenter a kol., 1990). Kukuřičný gen a-Tub 3 je exprimován ve všech orgánech rostliny, které mají vysoký obsah celulosy, kde probíhá dělení, zejména v nezralých embryích (Montoliu a kol., 1990).

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že promotorové regulační elementy oblastí získaných z kukuřičných genů α-tubulinu mohou řídit tkáňově specifickou expresi v pylu, kořenových systémech, meristematických zónách a nezralých embryích rostlinných druhů, jak jednoděložných tak dvouděložných. Vynález umožňuje větší kontrolu genové exprese u transgenických rostlin, zejména umožňuje lepší kontrolu genů rezistence vůči herbicidům.

Předmětem vynálezu je 5'-regulační oblast kukuřičného genu α-tubulinu. Tato oblast je ve vynálezu definována jako upstream regulační celek (upstream regulátory ensemble, URE), který je použitelný pro kontrolu exprese genů kódujících heterologní geny. URE obsahuje několik regulačních elementů, které, pokud jsou navázány na kódující oblasti heterologních genů exprimovaných v transgenických rostlinách, vykazují rozdílné modely regulované exprese. Vynález obsahuje zejména informace týkající se oblastí izolovaných z DNA získaných z kukuřičných genů α-Tub 1, které specificky kontrolují expresi genů v kořenech, pylu a meristematických tkáních.

Další provedení vynálezu se týká rostlinných chimérických genů obsahujících tyto regulační elementy. Regulační elementy jsou funkčně navázány na kódující sekvence heterologního genu, takže je daný regulační element schopen kontrolovat expresi produktu kódovaného heterologním genem. Pokud je to nutné, jsou ve výše uvedených chimérických genech obsaženy další promotorové elementy, ať už zcela nebo zčásti. Mezi tyto doplňkové elementy patří, ale nejsou na ně nijak omezovány, intronové sekvence jednoděložných rostlin, jako je intron 1 genu rýže pro aktin, které vysoce zesilují expresi heterologních genů v tkáních jednoděložných rostlin. Vynález též zahrnuje vektory pro transformaci rostlin, jakož i rostlinné buňky transformované pomocí těchto vektorů, a rostliny a semena obsahující tento chimérický gen.

Podle dalšího provedení vynálezu jsou vytvářeny chimérické geny obsahující sekvenci DNA kódující fúzní polypeptid obsahující na N-konci tranzitní peptid, který je schopen řídit subcelulární lokalizaci heterologních peptidů do subcelulárních organel specifických pro rostlinné buňky, čímž se dosáhne zvýšené kontroly a lepšího zaměření genetické exprese v transgenických rostlinách.

Předmětem vynálezu je též způsob vytváření transformovaných jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, které vykazují nové vlastnosti, a které jsou zejména rezistentní vůči herbicidům. Z rostlinných buněk transformovaných pomocí výše uvedeného konstruktu mohou vzniknout pomocí regenerace nebo/a transformace rezistentní rostliny.

Vynález zahrnuje cis-regulační elementy upstream regulačního celku (URE) kukuřičných genů α-tubulinu. Tyto cis-regulační elementy jsou samostatné oblasti URE, které způsobují regulaci exprese genů pod jejich kontrolou. Vynález zejména zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu, která obsahuje alespoň jeden genový element umožňující specifickou expresi v kořenech, v pylu, v meristémech a v nezralých embryích. Regulační elementy mohou být získány z libovolného genu pro tubulin, zejména z kukuřičných genů α-Tub 1, a-Tub 2 a a-Tub 3, samotných nebo v kombinaci, které představují tři podobné geny pro α-tubulin. S výhodou se jako zdroj regulačních elementů použije kukuřičný gen pro α-tubulin a-Tub 1.

Jeden z regulačních elementů podle vynálezu vyvolává specifickou genovou expresi v kořenech. Jeden regulační element specifický pro kořeny obsahuje zvláštní nukleotidovou sekvenci, která je schopná iniciovat expresi genu pod jeho kontrolou v kořenech, to znamená je specifický pro to, že je produkt exprese genu detekován v kořenech. Expresi, která je specifická pro kořeny, lze pozorovat v libovolné části kořenů, například, ale bez jakéhokoliv omezení, v meristematických zónách kořenů, laterálních pupenech kořenů, laterálních kořenech a cévních oblastech kořenů. Ve vrcholcích prýtů, lodyhách nebo listech není detekována žádná exprese genu.

Pro identifikaci regulačních elementů, které kontrolují genovou expresi specifickou pro kořeny, je třeba provést analýzu pomocí deletování úplného URE z kukuřičného genu α-tubulinu. V deleční analýze se z úplného URE postupně odstraňují nukleotidy a výsledné fragmenty se ligují ke kódující sekvenci reportérového genu nebo k jiné heterologní kódující sekvenci. U konstruktů se poté analyzuje jejich schopnost kontrolovat genovou expresi specifickou pro tkáně pomocí detekce přítomnosti produktu heterologního genu v požadovaných specifických tkáních a nikoli v jiných tkáních. Tkáňově specifické elementy, které byly identifikovány, lze též modifikovat, například pomocí místně řízené mutageneze. U modifikovaných regulačních elementů může být poté testována jejich schopnost kontrolovat specifickou expresi genu v tkáních a je tak možné identifikovat další sekvence, které způsobují specificitu v tkáních. Tyto postupy identifikace regulačních elementů jsou použitelné pro všechny kukuřičné geny α-tubulinů. Například, podle výhodného provedení, analýza URE kukuřičného genu a-tubulinu α-Tub 1 ukazuje, že regulační elementy, které kontrolují genovou expresi specifickou pro kořeny, jsou tvořeny nukleotidy 963 až 1115 a 1 až 1115 sekvence uvedené jako SEQ ID č. 1.

Další regulační elementy podle vynálezu kontrolují genovou expresi specifickou pro pyl. Tato genová exprese specifická pro pyl je zejména zajímavá a významná. Normálně je kukuřičný gen α-tubulinu a-Tub 1 exprimován jak v kořenech tak v pylu. Pokud jsou z kukuřičného genu α-tubulinu a-Tub 1 izolovány konkrétní oblasti úplného URE podle vynálezu, je exprese lokalizována výhradně v pylu. Regulační element specifický pro pyl obsahuje zvláštní nukleotidovou sekvenci, která je schopná iniciovat expresi genu pod jeho kontrolou v pylu, to znamená, že je produkt genu detekován v pylu a nikoli v dalších tkáních. Regulační elementy, které kontrolují expresi specifickou pro pyl, se identifikují pomocí analýzy fragmentů kukuřičného genu α-tubulinu, kdy se analyzuje jejich schopnost kontrolovat genovou expresi specifickou pro pyl, jak je popsáno výše pro identifikaci regulačních elementů specifických pro kořeny s tím rozdílem, že exprese se detekuje v pylu. Modifikace nukleotidových sekvencí umožňujících expresi specifickou pro pyl se identifikují jak je popsáno výše. Pomocí těchto postupů lze identifikovat regulační elementy specifické pro pyl získané z libovolného kukuřičného genu a-tubulinu. Například, podle výhodného provedení, analýza URE kukuřičného genu α-tubulinu a-Tub 1 ukazuje, že regulační elementy, které kontrolují genovou expresi specifickou pro pyl, jsou tvořeny nukleotidy 1 až 1348 a 1295 až 1348 sekvence uvedené jako SEQ ID č. 1.

které jsou a-tubulinu, meristemy.

genovou expresi

Další regulační elementy podle vynálezu, přítomny v oblastech URE kukuřičného genu kontrolují genovou expresi specifickou pro

Regulační elementy, které způsobují specifickou pro meristemy, se identifikují jako je popsáno výše pro identifikaci ostatních regulačních elementů. Například lze pro identifikaci nukleotidových sekvencí libovolného kukuřičného genu α-tubulinu, které kontrolují expresi genu pod svou kontrolou v meristemech použít deleční analýzu. Tyto sekvence lze modifikovat jak je popsáno výše a testovat za účelem identifikace jiných sekvencí, které způsobují genovou expresi specifickou pro meristemy. Například, podle výhodného provedení, analýza URE kukuřičného genu α-tubulinu a-Tub 3 ukazuje, že regulační elementy, které kontrolují genovou expresi specifickou pro meristemy, jsou tvořeny nukleotidy 1 až 695 a 542 až 695 sekvence uvedené jako SEQ ID č. 3.

Další regulační elementy podle vynálezu, které jsou přítomny v oblastech URE kukuřičného genu a-tubulinu, kontrolují genovou expresi specifickou pro nezralá embrya. Regulační elementy, které způsobují genovou expresi specifickou pro nezralá embrya, se identifikují jako je popsáno výše pro identifikaci ostatních regulačních elementů. Například lze pro identifikaci nukleotidových sekvencí libovolného kukuřičného genu α-tubulinu, které kontrolují expresi genu pod svou kontrolou v nezralých embryích použít deleční analýzu. Tyto sekvence lze modifikovat jak je popsáno výše a testovat za účelem identifikace jiných sekvencí, které způsobují genovou expresi specifickou pro nezralá embrya. Například, podle výhodného provedení, analýza URE kukuřičného genu α-tubulinu a-Tub 3 ukazuje, že regulační elementy, které kontrolují genovou expresi specifickou pro nezralá embrya, jsou tvořeny nukleotidy 1 až 1076 sekvence uvedené jako SEQ ID č. 3.

Izolovanou nukleovou kyselinu kódující upstream regulační celek (URE) je možné získat z kukuřičného genu α-tubulinu následujícím způsobem. Rekombinantní genomové klony kódující α-tubulin se izolují pomocí screeningu genomové DNA-knihovny kukuřice za použití cDNA a-tubulinu (Montoliu a kol., 1989). Vhodné postupy pro získání rekombinantní DNA. kódující α-tubulin jsou popsány například v práci, kterou publikovali Ausubel a kol., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wilea and Sons, New York, nebo v libovolném z řady manuálů týkajících se techonologie rekombinantní DNA, které jsou široce k dispozici. Pro stanovení nukleotidových sekvencí je odborníkovi dostupná a známá rozsáhlá řada postupů. Například, URE genu α-tubulinu lze subklonovat do místa polylinkeru sekvenačního vektoru jako je pBluescript (Stratagene). Tyto pBluescript-subklony lze poté sekvenovat pomocí dvouřetězcového postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů (double strand dideoxy method, Chen a Seeburg, 1985 DNA 4, 165).

Nukleotidová sekvence DNA kódující klon α-Tub 1 URE kukuřičného genu α-tubulinu je znázorněna jako SEQ ID č. 1.

Nukleotidová sekvence DNA kódující klon a-Tub 2 URE kukuřičného genu α-tubulinu je znázorněna jako SEQ ID č. 2.

Nukleotidová sekvence DNA kódující klon a-Tub 3 URE kukuřičného genu α-tubulinu je znázorněna jako SEQ ID č. 3.

Nukleotidová sekvence pro optimalizovaný tranzitní peptid je znázorněna jako SEQ ID č. 4.

Za použití stejného postupu je možné získat URE dalších kukuřičných genů α-tubulinu. Kromě toho lze získat klony reprezentující další členy rodiny kukuřičných genů α-tubulinu za použití transkribovaných sekvencí URE α-Tub 1, a-Tub 2 a a-Tub 3 jako hybridizačních sond za účelem screeningu genomové DNA-knihovny kukuřice a identifikace dalších genů a-tubulinu.

Identifikaci cis-regulačních sekvencí, které kontrolují specifickou genovou expresi v tkáních, lze provést pomocí transkripčních fúzí specifických sekvencí s kódující sekvencí heterologního genu, přenosu tohoto chimérického genu do vhodného hostitele a detekce exprese heterologního genu. Test používaný pro detekci exprese závisí na povaze heterologní sekvence. Pro stanovení transkripční a translační schopností chimérického konstruktu se běžně používají například reportérové geny, jako je gen β-glukuronidasy (GUS) . Pro citlivou detekci reportérového enzymu v transgenickém organismu jsou k dispozici standardní testy. Gen GUS je vhodný jako reportérový gen pro promotorovou aktivitu v transgenických rostlinách kvůli vysoké stabilitě enzymu v rostlinných buňkách a možnosti provádět kvantitativní fluorometrický test a histochemickou lokalizaci. Jefferson a kol., 1987 EMBO J 6, 3901, uvádějí standardní postupy biochemické a histochemické detekce aktivity GUS v rostlinných tkáních. Biochemické testy se provádějí tak, že se smíchají lyzáty rostlinné tkáně s 4-methylumbelliferyl-β-D-glukuranidem, fluorometrickým substrátem pro GUS, provede se inkubace po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °c a poté se změří fluorescence 4-methylumbelliferonu. Histochemická lokalizace aktivity GUS se stanoví inkubací vzorků rostlinných tkání v 5-brom-4-chlor-3-indolyl9 glukuronidu (X-Gluc) po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C a pozorováním charakteru skvrn X-Gluc. Konstrukce takových chimérických genů umožňuje vymezeni specifických regulačních sekvencí nutných pro regulaci exprese a demonstruje pomocí analýzy, že tyto sekvence mohou kontrolovat expresi heterologních genů.

Vynález též zahrnuje obsahující regulační element rostlinný získaný z chimérický gen kukuřičného genu α-tubulinu, který kontroluje specifickou genovou expresi v kořenech, specifickou genovou expresi v pylu, specifickou genovou expresi v meristemu nebo specifickou genovou expresi v nezralých embryích, navázaný ke kódující sekvenci heterologního genu tak, že je tento regulační element schopen kontrolovat heterologní gen. Heterologním genem může být libovolný gen jiný než kukuřičný gen α-tubulinu. Pokud je to nutné, je možné do chimérických konstruktů začlenit další promotorové elementy, buďto celé nebo jejich část, jako jsou introny jednoděložných rostlin, dostatečné pro to, aby se jejich expresí vytvořilo účinné množství polypeptidu kódovaného heterologním genem a poskytující jakoukoliv vlastnost výhodnou z agronomického hlediska, jako je rezistence vůči hmyzu, hádátkům, houbám a výhodně vůči herbicidům.

Vynález tedy zahrnuje chimérické geny obsahující oblasti URE kukuřičného α-tubulinu, které způsobují expresi specifickou pro kořeny podle vynálezu, a které jsou navázány k sekvenci kódující enzym rezistence vůči herbicidům. Výhodně tyto oblasti URE obsahují nukleotidy 1 až 1115, 963 až 1115 nebo 1 až 1529 cc-Tub 1, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 1. Součást vynálezu tvoří libovolná modifikace těchto oblastí způsobující expresi specifickou pro kořeny. Kořeny akumulují určité skupiny herbicidů, což způsobuje, že jsou velmi citlivé na aplikaci těchto herbicidů v nízkých dávkách. Jelikož elementy URE kukuřičného cc-tubulinu mohou řídit vysokou, regulovanou expresi v kořenech, jsou vhodné pro získání rezistentního fenotypu. Tyto elementy jsou vhodné pro regulaci exprese genů kódujících enzymy rezistence vůči herbicidům, jako je aroA z Salmonella typhimurium a enzymy pro detoxifikaci herbicidů, jako je gen brx z Klebsiella ozaenae, která je rezistentní vůči bromoxynilu. Chimérické geny obsahující tyto elementy lze použití pro vytváření transgenických linií rostlin rezistentních vůči agronomickým dávkám herbicidů.

Vynález též zahrnuje chimérické geny, které obsahují oblast URE kukuřičného α-tubulinu, která způsobuje expresi specifickou pro pyl, fúzovanou s heterologním genem. Tento konstrukt způsobuje expresi prostorově odlišnou od normální exprese kukuřičného α-tubulinu v tom, že je heterologní gen exprimován přímo v rostlinném pylu. Jinými slovy, pokud se z celku URE odstraní specifická sekvence, je modifikována specifická regulace tkáně. Výhodně oblasti URE a-Tub 1 obsahují nukleotidy 1 až 1348 nebo 295 až 1348, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 1. Též výhodně může být tento regulační element fúzován s cytotoxickými proteiny pro vytvoření sterilních samčích rostlin. Libovolná modifikace těchto oblastí, která způsobuje expresi specifickou pro pyl, tvoří součást vynálezu.

Vynález též zahrnuje chimérické geny, které obsahují oblast URE kukuřičného α-tubulinu, která způsobuje expresi specifickou pro meristemy, fúzovanou s heterologním genem. Výhodně oblasti URE a-Tub 3 obsahují nukleotidy 1 až 695 nebo 542 až 695, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 3. Libovolná modifikace těchto oblastí, která způsobuje expresi specifickou pro meristemy, tvoří součást vynálezu.

Vynález též zahrnuje chimérické geny, které obsahují oblast URE kukuřičného α-tubulinu, která způsobuje expresi specifickou pro nezralá embrya, fúzovanou s heterologním genem. Výhodně oblasti URE a-Tub 3 obsahují nukleotidy 1 až

107 6, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 3. Libovolná modifikace těchto oblastí, která způsobuje expresi specifickou pro nezralá embrya, tvoří součást vynálezu.

Použití těchto chimérických konstruktů je zejména významné pro zajišťování rezistence vůči herbicidům. Jelikož většina herbicidů nerozlišuje mezi pleveli a užitkovými rostlinami, má vytvoření užitkových rostlin, které jsou rezistentní vůči herbicidům, pomocí genetického inženýrství, značný agronomický význam, jelikož umožňuje použití herbicidů s širokým spektrem účinnosti. Vynález tedy zahrnuje chimérické geny obsahující alespoň na části promotoru elementy URE kukuřičného α-tubulinu, které způsobují expresi specifickou pro kořeny, které jsou funkční v rostlinách, a které jsou dále fúzovány alespoň s částí genu aroA nebo sekvencí kódující polypeptid zajišťující rezistenci vůči herbicidům. Jako příklady je možno uvést polypeptidy zajišťující rezistenci vůči glyfosatu, vůči inhibitorům podobným 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát-synthase(EPSPS), sulfonylmočovinám, imidazolinonům, a inhibitorům synthasy acetoxyhydroxykyseliny (AHS) a 4-hydroxyfenylpyruvát-dioxygenasy (HPPO). Výhodně oblasti URE a-Tub 1 obsahují nukleotidy 1 až 1115, 963 až 1115 nebo 1 až 1529, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 1, a jsou fúzovány s reportérovým genem. Jejich libovolná modifikace způsobující expresi specifickou pro nezralá embrya tvoří součást vynálezu.

Chimérické geny podle vynálezu jsou konstruovány tak, že se fúzuje promotorové sekvence kukuřičného a-tubulinu, buďto částečná nebo celá, s kódující sekvencí heterologního genu. Vzájemná poloha těchto sekvencí může být vytvořena mnoha různými způsoby. Výhodně je pořadí sekvencí od 5'-konce k 3'-konci následující: URE kukuřičného a-tubulinu, intronová sekvence jednoděložné nebo dvouděložné rostliny, například tagáku, kódující sekvence, a polyadenylační místo.

Běžné způsoby konstrukce takových chimérických genů jsou odoborníkovi dobře známé a lze je nalézt v odkazech v literatuře, například v práci, kterou publikovali Ausubel a kol. (1989). Pro ligaci fragmentů DNA jsou k dispozici různé postupy, jejichž výběr závisí na povaze konců fragmentů DNA. Odborníkovi je známo, že pro to, aby byl heterologní gen exprimován, musí konstrukt obsahovat promotorové elementy a signály pro účinnou polyadenylaci transkriptu. Oblasti URE kukuřičného α-tubulinu, které obsahují promotorové sekvence známé jako CAAT- a TATA-boxy, lze tedy fúzovat přímo s kódující sekvencí bez promotoru. Mimoto, oblasti URE kukuřičného α-tubulinu, které neobsahují CAAT- a TATA-boxy, lze navázat k fragmentu DNA kódujícímu promotor, který je funkční v rostlinách. Rostlinné promotory jsou komerčně dostupné, nebo je lze chemicky syntetizovat na základě jejich publikované sekvence. Jako příklad takového fragmentu je možno uvést zkrácený promotor 35S z viru mozaiky květáku, který si zachovává své CAAT- a TATA-boxy. Je možné použít též jiné promotQ.ry, jako jsou promotory nopalin-synthasy a ribolosa-1,5-bisfosfát-karboxylasy. Promotorový fragment se potom naváže k heterologní kódující sekvenci. 3'-konec kódující sekvence se fúzuje s polyadenylačním místem, například, aniž by to však znamenalo jakékoliv omezení, s polyadenylačním místem nopalin-synthasy. Kromě toho je možné použít vektory pro transformaci rostlin, které které obsahují jedno nebo několik polyadenylačních míst obklopených sekvencemi nutnými pro transformaci rostlin.

Elementy URE kukuřičného α-tubulinu a heterologní kódující sekvence podle vynálezu lze subklonovat do místa polylinkeru vektoru pro transformaci rostlin, tak, že se získají chimérické geny.

5'-elementy podle vynálezu lze získat rozštěpením genomového klonu kukuřičného oc-tubulinu restrikční endonukleasou nebo exonukleasou. Restrikční fragmenty obsahující CAAT- a TATA-boxy se ligují s heterologním genem bez promotoru, jako je kódující sekvence GUS nebo aroA. Odborníkovi je známo, že 5'-regulační elementy kukuřičného α-tubulinu lze získat jinými způsoby, například chemickou syntézou nebo enzymatickou syntézou (polymerasovou řetězovou reakcí). Heterologním produktem může být kódující sekvence libovolného genu, která může být exprimována v takovém konstruktu. Všechny tyto příklady tvoří součást vynálezu. 3'-konec kódující sekvence je popřípadě fúzován s polyadenylačním místem, jako je, aniž by to však znamenalo nějaké omezení, polyadenylační místo nopalin-synthasy, genu 7 T-DNA oktopinu nebo genu H4A748 genu histonu z Arabidopsis. Kromě toho může polyadenylační místo poskytnout sám heterologní gen.

5'-regulační elementy kukuřičného α-tubulinu, které neobsahují TATA-box, lze navázat k alespoň části rostlinné promotorové sekvence, to je k části, která obsahuje alespoň sekvence CAAT a TATA. Výhodně je tímto promotorem zkrácený promotor 35S z viru mozaiky květáku. Výsledný chimérický komplex lze ligovat k heterologní kódující sekvenci a polyadenylační sekvenci.

Za účelem získání regulované exprese heterologních genů se rostliny transformují chimérickými geny podle vynálezu. Jako způsob exprese heterologních genů v transgenických rostlinách je v oboru známý přenos genů. Nej častěji používanou rostlinou je tabák, protože je snadné tuto rostlinu regenerovat, poskytuje vysoký výnos semen z rostliny, a je možné ji s vysokou frekvencí transformovat pomocí vektorů odvozených od Ti-plasmidů Agrobacteria (Klee a kol. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467). Výhodnými transgenickými hcstiteli jsou dvouděložné rostliny, jako je, aniž by to však znamenalo jakékoliv omezení, bavlník, řepka a sója. V možnostech odborníka je však účinná transformace libovolné rostliny a její regenerace jako transgenického hostitele podle vynálezu.

Je známá řada způsobů transformace. Chimérické geny lze introdukovat za použití postupu transformace na listových terčících a regenerace, jak popsali Horsch a kol. (1985) Science 227, 1229. V rámci vynálezu je též možno použít další způsoby transformace, jako je protoplastová kultura (Horsch a kol. (1984) Science 223, 496; DeBlock a kol. (1984) EMBRO J 2, 2143; Bartoň a kol. (1983) Cell 32, 1033) nebo transformace explantátů stonků nebo kořenů in vitro (Zambrisky a kol. (1983) EMBO J 2, 2143; Bartoň a kol. (1983) Cell 32, 1033). Výhodně se rostliny transformují pomocí vektorů odvozených od Agrobacteria. K dispozici jsou však i další způsoby pro inzerci chimérických genů podle vynálezu do rostlinných buněk. Z těchto způsobů je možno uvést postupy využívající techniku biolistic (Klein a kol. (1983) Nátuře 327, 70), elektroporaci, absorpci DNA pomocí chemické indukce a použití virů nebo pylu jako vektorů.

Pokud je to nutné pro transformační postup, může být chimérický gen podle vynálezu introdukován do vektoru pro transformaci rostlin, například binárního vektoru, který popsal Bevan (1984), nebo lze použít jinou metodu, která je popsána v evropské patentové přihlášce 337 899. Vektory pro transformaci rostlin lze získat modifikací přirozeného systému přenosu genů Agrobacterium tumefaciens. Přirozený systém zahrnuje velké Ti-plasmidy (plasmidy indukující nádor), které obsahují velký segment, nazývaný T-DNA, který je přenášen do transformovaných rostlin. Další segment Ti-plasmidu, oblast vir, je zodpovědná za přenos této T-DNA. T-DNA je obklopena koncovými repeticemi. V modifikovaných binárních vektorech byly geny, které indukují nádor, deletovány, a funkce oblasti vir sc využívají pro přenos cizí DNA. ohraničené hraničními sekvencemi T-DNA. T-oblast rovněž obsahuje selektabilní markér rezistence vůči antibiotiku, a polylinker pro vložení přenášené sekvence. Tyto kmeny pro genetické inženýrství jsou známy jako odzbrojené Agrobacterium tumefaciens a umožňují účinnou transformaci sekvencí ohraničených T-oblastí do jaderného genomu rostliny.

Povrchově sterilizované listové terčíky se inokulují Agrobacterium tumefaciens obsahujícím cizorodou DNA, kultivují se po dobu dvou dnů a poté se přenesou na medium obsahující antibiotika. Po zakořenění v mediu obsahujícím příslušná antibiotika se vyberou transformované prýty a přenesou se do půdy. Transgenické rostliny se samoopylí a semena těchto rostlin se sklidí a kultivují v mediu obsahujícím antibiotika.

Expresi reportérového nebo heterologního genu v kořenech, prýtech, pylu, meristemech a nezralých embryích lze monitorovat pomocí imunologických nebo histochemických testů nebo testů aktivity.

Jak je vidět níže, závisí volba testu exprese chimérického genu na povaze heterologní kódující oblasti. Například lze pro monitorování transkripce, pokud jsou k dispozici příslušné nukleotidové sondy, použít Northern-analýzu. Pokud je k dispozici protilátka proti polypeptidu kódovanému heterologním genem, lze použít pro monitorování produkce a lokalizace polypeptidu Western-analýzu a metodu imuno-histochemické lokalizace. V závislosti na heterologním genu lze použít biochemické testy. Například, acetyltransferasy se detekují pomocí měření acetylace standardního substrátu. Expresi genu rezistence vůči herbicidům lze monitorovat pomocí stanovení rezistence transformované rostliny vůči herbicidům.

Vynález též zahrnuje jak jednoděložné tak dvouděložné transgenické rostliny a jejich potomstvo obsahující chimérické geny podle vynálezu. Rostlinné buňky se transformují chimérickými geny libovolným způsobem pro transformaci rostlin popsaným výše. Transformovaná rostlinná buňka, obvykle v kalusové kultuře nebo v listovém terčíku se regeneruje na kompletní transgenickou rostlinu za použití postupů, které jsou odborníkovi známé (například Horsch a kol. (1985) Science 227, 1129). Výhodně je touto transgenickou rostlinou bavlník, řepka, kukuřice, tabák nebo sója. Jelikož potomstvo transformovaných rostlin předává chimérický gen, používají se pro udržení transgenické rostlinné linie semena nebo explantáty získané z transformovaných rostlin.

Vynález též zahrnuje způsob vytváření rostliny se zlepšenou rezistencí vůči herbicidům. Tento způsob zahrnuje transformaci rostlinné buňky vektorem, který obsahuje chimérický gen obsahující regulační element, specifický pro kořeny nebo meristemy, navázaný na kódující sekvenci enzymu rezistence vůči herbicidům nebo enzymu degradujícího herbicidy, a selekci rostliny s požadovanými vlastnostmi. Výhodně jsou těmito elementy oblasti URE α-Tub 1 obsahující nukleotidy 1 až 1115, 963 až 1115 nebo 1 až 1529, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 1. Z transformovaných rostlin se regenerují rostliny, které jsou rezistentní vůči aplikaci herbicidů.

< Vynález též zahrnuje způsob vytváření rostliny se samčí sterilitou. Tento způsob zahrnuje transformaci rostlinné buňky vektorem, který obsahuje chimérický gen obsahující regulační element, specifický pro pyl, navázaný na kódující sekvenci cytotoxického proteinu, a selekci rostliny s požadovanými vlastnostmi. Výhodně jsou těmito elementy oblasti URE α-Tub 1 obsahující nukleotidy 1 až 1348 nebo. 1295 až 1348, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 1. Z transformovaných rostlin se regenerují rostliny, které vykazují samčí sterilitu.

Vynález též zahrnuje způsob vytváření rostliny rezistentní vůči herbicidům. Tento způsob zahrnuje transformaci rostlinné buňky vektorem, který obsahuje chimérický gen obsahující regulační element, specifický pro kořeny, navázaný na kódující sekvenci genu pro rezistenci vůči herbicidům, jako je N-fosfonomethylglycin, s tím, že se poté provede selekce rostlin s požadovanou rezistencí vůči herbicidům. Vyberou se ty rostliny, které přežijí ošetření herbicidem, který usmrtí netransformované rostliny stejného druhu za stejných podmínek. Výhodně jsou těmito elementy oblasti URE α-Tub 1 obsahující nukleotidy 1 až 1115, 963 až 1115 nebo 1 až 1529, jak jsou uvedeny v SEQ ID č. 1, a heterologní sekvence je poskytnuta genem, který kóduje EPSPS-synthasu, acetolaktasa-synthasu nebo 4-hydroxyfenylpyruvát-dioxygenasu, nebo genem majícím mutace, které způsobují jeho rezistenci. Z transformovaných rostlin se regenerují rostliny, které jsou rezistentní vůči herbicidům. Výhodně Se rostliny transformují vektorem pRPA-RD-65 nebo pRPA-RD-38, který obsahuje regulační element specifický pro kořeny obsahující nukleotidy 70 až 1529 URE α-Tub 1, intron z jednodšložné rostliny (pRPA-RD-77 samotný), optimalizovaný tranzitní peptid a gen rezistence vůči herbicidům Aroa.

Následující příklady provedení vynálezu popisují vynález podrobněji.

Nukleotidové sekvence, na které jsou uváděny odkazy v příkladech provedení vynálezu, jsou označeny SEQ ID č. 1 až 4 a představují následující sekvence:

Popis sekvencí

a-Tub	SEQ 1.	ID	č.	1	představuj e	sekvenci	promotoru	kukuřičného.
a-Tub	SEQ 2.	ID	č.	2	představuj e	sekvenci	promotoru	kukuřičného
	SEQ	ID	č.	3	představuj e	sekvenci	promotoru	kukuřičného

a-Tub 3.

SEQ ID č. 4 představuje modifikovaný tranzitní peptid.

Popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje konstrukci matečného plasmidu pBHOl.l.

Obr. 2 je schematickým zobrazením chimérického konstruktu promotor α-Tub 1 / GUS. Uvedená čísla jsou vztažena k místu iniciace transkripce. Horní část obrázku odpovídá intergenové oblasti mezi α-Tub 1 a a-Tub 2, a byly provedeny delece pomocí restrikce na příslušných místech. Spodní část obrázku odpovídá fragmentu -449, kde byly provedeny delece několikanásobným štěpením exonukleasou III. Místo SacII (+48) odpovídá místu transkripční fúze mezi promotorem a plasmidem pBHOl.l. (+) odpovídá místu iniciace transkripce genu tubulinu α-Tub 1.

Obr. 3 je schematickým zobrazením chimérického konstruktu promotor a-Tub 3 / GUS. Uvedená čísla jsou vztažena k místu iniciace transkripce. Delece byly provedeny několikanásobným štěpením exonukleasou III. Místo BglII odpovídá místu transkripční fúze mezi promotorem a místem BamHI plasmidu pBHOl.l. ( + ) odpovídá místu iniciace transkripce genu tubulinu a-Tub 3. Zkratky v obrázku mají následující význam: RE = regulační elementy, ST = místo počátku trankripce, P = promotor a-Tub 3.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a)

Konstrukt s reportérovým genem GUS

Kazety pro obecné použití reportérového genu GUS, které

se používají v příkladech provedení vynálezu popsal Jefferson a kol., 1987 EMBO J 6, 3901. Stručně, kódující sekvence GUS se liguje s 5'-koncovou částí polyadenylačního místa nopalin-synthasy v místě polylinkeru vektoru pBIN19 získaného z Agrobacterium tumefaciens (Bevan (1984) Nucleics Acids Res. 2, 8711). Vektor pBIN19 obsahuje levé a pravé hraniční sekvence T-DNA nutné pro transformaci rostlin, a gen rezistence vůči kanamycinu. Výsledný konstrukt, pBHOl.l je znázorněn na obrázku 1. Pouze restrikční místa upstream od iniciačního kodonu AUG pro GUS umožňují inzerci promotorových fragmentů DNA.

Tabulka 1 popisuje matečné plasmidy a odvozené konstrukty. Kukuřičný α-Tub 1 a polohy promotorových elementů obsažených v získaných konstruktech jsou znázorněny na obrázku 2.

Konstrukty ρα-Tubl - GUS představují velké překrývající se fragmenty, které překlenují celou délku regulační oblasti (-1410 až 48 na obrázku 2). 5'-konce příslušných konstruktů se získají štěpením 497 bp α-Tub 1 v pBHOl.l (Stratagene) pomocí exonukleasy III (-449 (SpcI - SacII), tabulka 1) . Poloha každé delece je znázorněna na obrázku 2.

b) Transformace rostlin

Zkonstruované plasmidy na bázi pBIN19 se použijí pro transformaci tabáku (Nicotiana tabacum cv petite Havana SRÍ) podle standardních postupů (Horsch a kol. (1985)) s tím rozdílem, že se výchozí transformované rostliny selektují na mediu obsahujícím 100 _zug / ml kanamycinu.

Rostliny se samoopylí, a generace FI se nechá klíčit na mediu obsahujícím 200 _zug / ml kanamycinu za účelem identifikace transformovaných rostlin, jelikož konstrukty na bázi pBIN19 obsahují gen neomycin-fosfotransferasy (NPTII), který poskytuje rezistenci vůči toxickému antibiotiku

kanamycinu. Počet kopií každého GUS-konstruktu integrovaného do genomu tabáku se stanoví pro každou transformovanou rostlinu pomocí analýzy segregačních frekvencí pro rezistenci vůči kanamycinu. Většina transformovaných rostlin obsahuje pouze jeden lokus segergující z konstruktu. Transgenické rostliny se pěstují ve skleníku.

Tabulka 1

Konstrukt

Popis

Matečné plasmidy pBHOl.l kazeta pBIN-19 genu, bez promotoru, získaná z reportérového genu GUS (Jefferson a kol., 1987) (srv. obrázek 1) pRPA-BL-504 paTub 1 podobný jako pBHOl.l s tím rozdílem, že je gen pro GUS nahrazen genem pro chloramfenikol-acetyltransferasu fragment Xhol o velikosti 3085 bp z MG19/6 (Montoliu a kol., 1989) klonovaný do pUC-18; obsahuje celý URE (upstream regulační celek) kukuřičného α-Tub 1 paTub 1-1588 fragment Xhol - Alul velikosti 1588 bp z kukuřičného a-Tub 1 (Montoliu a kol., 1989) klonovaný do pUC-18; obsahuje 1410 bp upstream a 180 bp downstream od místa iniciace transkripce paTub 3-1072 fragment BglII o kukuřičného a-Tub 3 velikosti 1072 bp z (Montoliu a kol., 1990)

klonovaný do místa BamHI v pUC-18; obsahuje 1020 bp upstream a 62 bp downstream od místa iniciace transkripce pRPA-RD-37B pRPA-RD-49 pRPA-RD-26 pRPA-RD-32 kazeta exprimující aroA, která obsahuje optimalizovaný tranzitní peptid fúzovaný ve čtecím rámci (EP 508 909) , gen aroA a polyadenylační signál NOS klonované do pBS II SK(-) (Stratagene) transformační vektor pro jednoděložné rostliny obsahující promotor 35S CaMV, gen bar a polyadenylační signál TR7 klonované mezi místa HindlII a EcoRI v pUC-18; na tupý konec se liguje spojovník (linker) Notl mezi dvě místa AflIII a místo SspI, a vytvoří se fragment Notl o velikosti 3,1 kb obsahující genový konstrukt 35S CaMV - bar fragment EcoRI - Seal o velikosti 1865 bp z paTub 1 klonovaný do pUC-19 rozštěpeného EcoRI a HincII,· sekvence obklopující kodon ATG pro iniciaci translace se zmutuje pomocí polymerasové řetězové reakce tak, že obsahuje místo NCoI za použití směru 5' —>3'

C GGC CGC CGC TCC ACC CGT ACG ACG ACC

ACC ATG GGG GAG fragment Pstl - Ncol o velikosti 1458 bp z pRPA-RD-26 tvořený nukleotidy -1340 až 118 získaný z kukuřičného genu α-Tub 1 (nukleotidy 71 až 1527 v SEQ ID č. 1) se liguje do míst Pstl - Ncol v pRPA-RD-37B, čímž se vytvoří expresivní kazeta kukuřičný α-Tub 1 - optimalizovaný tranzitní peptid - gen aroA - NOS

pRPA-RD-87 fragment Ncol - Pst I o velikosti 600 bp obsahující intron 1 z kukuřičného adhl se klonuje do míst Ncol - Pstl v pRPA-RD-37B, čímž se vytvoří expresivní kazeta obsahující intron 1 z kukuřičného adhl, optimalizovaný tranzitní peptid (EP 508 909), gen aroA a polyadenylační signál NOS pRPA-RD-90 fragment Eagl o velikosti 1430 bp získaný z pRPA-RD-32 (obsahující nukleotidy -1340 až 90 z kukuřičného genu α-Tub 1, sekvence 71 až 1499 v SEQ ID č. 1) rozštěpený s tupými konci pomocí Klenow fragmentu DNA-polymerasy I z DNA Escherichia coli klonovaný do místa Smál v pBS II SK(-) (Stratagene)

Odvozené konstrukty

-1410 fragment HindlII - SacII o velikosti 1474 bp z paTub 1-1588 klonovaný do pBHOl.l rozštěpeného HindlII a Smál; obsahuje 1410 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce a-Tub 3-1020 Fragment HindlII - Smál o velikosti 1115 bp z paTub 3-1072 klonovaný do pBHOl.l rozštěpeného HindlII a Smál; obsahuje 1020 bp upstream a 62 bp downstream od místa iniciace trans-, kripce (srv. obrázek 2) derivát -1410 vytvořený pomocí rozštěpení BamHI a recirkularizace; obsahuje 956 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-956

-449 derivát -1410 vytvořený pomocí rozštěpení Spěl a recirkularizace; obsahuje 449 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-352 derivát -449 (v pBHOl.l) vytvořený pomocí štěpení exonukleaseou III a recirkularizace; obsahuje 352 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-297 derivát -449 (v pBHOl.l) vytvořený pomocí štěpení exonukleaseou III a recirkularizace; obsahuje 297 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-252 derivát -449 (v pBHOl.l) vytvořený pomocí štěpení exonukleaseou III a recirkularizace; obsahuje 252 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-184 derivát -449 (v pBHOl.l) vytvořený pomocí štěpení exonukleaseou III a recirkularizace; obsahuje 184 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-117 derivát -449 (v pBHOl.l) vytvořený pomocí štěpení exonukleaseou III a recirkularizace; obsahuje 117 bp upstream a 48 bp downstream od místa iniciace transkripce

-64 derivát -449 (v pBHOl.l) vytvořený pomocí štěpení exonukleaseou III a recirkularizace; obsahuje 64 bp upstream a 4 8 bp downstream od místa iniciace transkripce

pRPA-RD-53	fragment Sací - EcoRI o velikosti 3,5 kb obsahující expresivní kazetu kukuřičný α-Tub 1 - aroA z pRPA-RD-32 klonovaný do míst Sací - EcoRI v pBIN-19
pRPA-RD-65	fragment Sací - EcoRI o velikosti 3,5 kb obsahující ” expresivní kazetu kukuřičný α-Tub 1 - - aroA z pRPA-RD-32 s konci otupenými T4 DNA-polymerasou klonovaný do místa Ndel v pRPA-RD-49 rozštěpeného s tupými konci pomocí Klenow fragmentu DNA-polymerasy z Escherichia coli; orientace expresivní kazety kukuřičný oc-Tub 1 - aroA z pRPA-RD-32 se ukázala jako odchylná ve srovnání s transkripčními jednotkami genu aroA a bar
pRPA-RD-88	fragment Pstl o velikosti 1,5 kb z pRPA-RD-90 obsahující nukleotidy -1340 až 90 z kukuřičného genu α-Tub 1 (sekvence 71 až 14 99 v SEQ ID č. 1) klonovaný do místa Pstl v pRPA-RD-87 za vytvoření expresivní kazety: kukuřičný α-Tub 1 - intron 1 kukuřičného adhl - optimalizovaný tranzitní pepti (EP 508 909) - gen aroA - polyadenylační signál NOS
pRPA-RD-7	derivát optimalizovaného tranzitního peptidu (EP 508 909, SEQ ID č. 4) který se mutuje pomocí polymerasové řetězové reakce za použití následujících syntetických oligonukleotidů: (1) GAA TTC CGA AAG ACA AAG ATT ATC GCC ATG GCT TCG (nukleotidy 1-36, SEQ ID č. 3); (2) CCG TAG GCC GGC CAC ACC TGC ATA CAT TGA ACT CTT CC (nukleotidy 228 - 181, SEQ ID č. 3); a (3) CGA GAC GCT GTC GTA CCT GCC GCC GCT GTC TAT GGC G (nukleotidy 231 - 267, SEQ ID č. 3);

tento optimalizovaný tranzitní peptid se klonuje do míst EcoRI a EcoRV v pBSII SK (-) (Stratagene) za vytvoření klonovací kazety obsahující optimalizovaný tranzitní peptid

Příklad 2

Histochemická lokalizace aktivity GUS: exprese specifické pro kořeny a pyl

V kořenech, pylu a různých dalších tkáních transgenických rostlin tabáku, z nichž každá obsahuje konstrukty uvedené v tabulce 1, se stanoví aktivita GUS. Postupuje se podle běžných postupů, které popsali Jefferson a kol. (1987) .

Aktivita GUS se histochemicky lokalizuje v transgenických rostlinách obsahujících chimérické geny GUS za použití promotorových fragmentů získaných z kukuřičného genu oc-Tub 1. Vzorky se promyjí ve směsi 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7, 0,2 mM 5-brom-4-chlor-3~indolylglukuronidu (X-Gluc), 0,1 mM hexakyanoželezitanu draselného a 0,1 mM hexakyanoželeznatanu draselného. Vzorky se nanesou na mikroskopická skla a překryjí 80% glycerolem.

V tabulce 2 jsou shrnuty výsledky typických mikrofotografií rostlin tabáku obsahujících regulační elementy kukuřičného genu α-Tub 1. Tabulka 2 ukazuje, že regulační elementy oc-Tub 1 vykazují vysokou hladinu exprese v meristematických tkáních, zejména v meristemech kořenů a pylu.

Aktivita GUS se analyzuje fluorometricky pomocí rozmělnění rostlinné tkáně v extrakčním pufru (50 mM fosforečnanu sodného, 10 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,1 % Sarkosylu, 0,1 % Tritonu X-100 a 10 mM β-merkaptoethanolu). Po centrifugaci lyzátu se supernatant oddělí, umístí se do nové zkumavky a dávkuje se v objemu 100 _zul. Přidá se stejný objem 2mM 4-methylumbelliferyl-p-glukuronidu v extrakčním pufru a provádí se inkubace při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Reakce se zastaví přidáním 0,8 ml 0,2M uhličitanu sodného. Fluorescence 4-methylumbelliferonu (4-MU) se stanoví za použití Hoefférová minifluorometru, jak popsali Jefferson a kol. (1987). Aktivita GUS se vyjádří v pikomolech 4-methylumbelliferonu na jednotku celkové hmotnosti proteinu za minutu. Pro určení promotorových elementů odpovědných za meristemovou specifičnost, s ohledem na expresi specifickou pro pyl, se stanoví v transgenických rostlinách tabáku typ exprese GUS různě deletovaných promotorů (srv. obrázek 2).

Špičky kořenů, špičky prýtů, listy, stonky a pyl získané z transgenických rostlin obsahujících různé sekvenční elementy α-Tub 1 (shrnuté na obrázku 2) řídící expresi GUS se testují pokud jde o aktivitu GUS. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. Všechny konstrukty, které obsahují část URE genu α-Tub kukuřičného a-tubulinu mezi -1410 a -352 (SEQ OD č. 1: 1 až 1058), vyvolávají aktivitu GUS v kořenech transgenických rostlin tabáku. Jak regulační oblast v plné délce tak z ní získané fragmenty vyvolávají vysokou aktivitu v protoplastech tabáku. Pouze při delecích promotorových elementů blíže než 352 bp upstream od místa iniciace transkripce (1058 v SEQ ID č. 1) je aktivita GUS v kořenech transgenických rostlin potlačena, což svědčí o tom, že regulační elementy specifické pro kořeny v α-Tub 1 leží upstream od -352 bp (SEQ ID č. 1: 1 až 1058).

Všechny konstrukty obsahující část URE genu a-Tub kukuřičného a-tubulinu mezi -1410 a -64 (SEQ ID č. 1: 1 až 1058) vyvolávají v pylu transgenických rostlin tabáku aktivitu GUS. Pouze při delecích promotorových elementů blíže než 64 bp upstream od místa iniciace transkripce (1348 v SEQ

ID č. 1) je aktivita GUS v pylu transgenických rostlin potlačena, což svědčí o tom, že regulační elementy specifické pro pyl v α-Tub 1 leží upstream od -64 bp (SEQ ID č. 1: 1 až 1058) .

Tabulka 2

Histochemická analýza transgenických rostlin tkáň

konstrukt	špička kořene	špička prýtu	list	stonek	pyl
-1 410	+ (12/12)	- (12/12)	- (12/12)	- (12/12)	+ (12/12)
-956	+ (6/6)	- (6/6)	- (6/6)	- (6/6)	+ (6/6)
-449	+ (8/8)	- (8/8)	- (8/8)	- (8/8)	+ (8/8)
-352 '	- (12/13)	- (13/13)	- (13/13)	- (13/13)	+ (6/10)
-117	- (9/9)	- (9/9)	- (9/9)	- (9/9)	+ (4/9)
-64	- (11/11)	- (11/11)	- (11/11)	- (11/11)	- (11/11)

Legenda k tabulce 2:

Obrázky označují počet rostlin s modrým zbarvením (+) nebo bez modrého zbarvení (-), exprese je srovnávána s celkovým počtem analyzovaných rostlin, pro každý konstrukt v různých částech rostliny.

Fluorometrický test GUS-konstruktů s promotorem genu α-Tub 1 kukuřičného a-tubulinu

O

X 'CO

X (0

X β -H i—I X CO O M

X

O '>

x o

Ή c

φ tm co c

(0

M

X

N >c '(13

X

X fO x

o i—i >φ

Ή

C r—I O M 4-) β O λ;

c

X

to

O n

iO

LO (0

X

>Φ

Ό lo

LO +1

X

CM

LO +1

LO co

CO X ιΟ *—1 ί—I X

CM +1

ΟΊ η

ιθ

ΙΟ +1 t—I LO

CM +1 ιθ *—I σ χ ιο

X X ,—I

σ	η
σ	Ό	ιθ
X	(Ο	τ-1
+1	+1	+1
ΙΟ	CM	ο
ΡΊ	*—1	η
Γ~-	LO

c

Φ

O λ:

Ή β

X o

μ x

c o

X c

X i—I X CO O

CM ιθ LO Ο *—I ’—I CM ιθ LO Ο ,—I ,—I CM c

Φ >Μ

O

X '>1 i-H

Φ o

O a

>1 β

Ό

X

X β

β

X

C0 β

Ο

X

CM

Ή β

φ >υ

Ή <—I X >

X	LO	σ	5-1 ΙΟ	Γ- ΙΟ ΙΟ
CM	η	η	LO
X	Γ~	CM	X
+1	+1	+1	+1	+1
C0	Γ~	ιΟ	CM	X σ σ X
00	CM	Ό	00
σ	[—	CM	ο

η

Ο ιθ ιθ *—1 ι—I CM

Ο

X

X

X

I ο

rX +1

Γη

CM

Ο ιθ ιθ

X X CM

ΙΟ ιθ σι ι

Pokračování tabulky

Příklad 3

Histochemická lokalizace aktivity GUS: exprese specifická pro meristemy

Aktivita GUS se histochemicky lokalizuje v transgenických rostlinách obsahujících chimérické geny GUS za použití promotorových fragmentů získaných z kukuřičného genu a-Tub 3 (nukleotidy 1 až 1082 v SEQ ID č. 3) . Vzorky se promyjí ve směsi 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7, 0,2 mM

5-brom-4-chlor-3-indolylglukuronidu (X-Gluc), 0,1 mM hexakyanoželezitanu draselného a 0,1 mM hexakyanoželeznatanu draselného. Vzorky se nanesou na mikroskopická skla a překryjí 80% glycerolem.

V tabulce 4 jsou shrnuty výsledky typických mikrofotografií rostlin tabáku obsahujících regulační elementy kukuřičného genu a-Tub 3. Tabulka 4 ukazuje, že regulační elementy a-Tub 3 (nukleotidy 1 až 1082 v SEQ ID č. 3) vykazují vysokou hladinu exprese zejména v meristematických tkáních.

Aktivita GUS se analyzuje fluorometricky pomocí rozmělnění rostlinné tkáně v extrakčním pufru (50 mM fosforečnanu sodného, 10 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,1 % Sarkosylu, 0,1 % Tritonu X-100 a 10 mM β-merkaptoethanolu). Po centrifugaci lyzátu se supernatant oddělí, umístí se do nové zkumavky a dávkuje se v objemu 100 _zul. Přidá se stejný objem 2mM 4-methylumbelliferyl-p-glukuronidu v extrakčním pufru a provádí se inkubace při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Reakce se zastaví přidáním 0,8 ml 0,2M uhličitanu sodného. Fluorescence 4-methylumbelliferonu (4-MU) se stanoví za použití Hoefférová minifluorometru, jak popsali Jefferson a kol. (1987). Aktivita GUS se vyjádří v pikomolech 4-methylumbelliferonu' na jednotku celkové hmotnosti proteinu za minutu. Pro určení promotorových elementů odpovědných za meristemovou specifičnost, s ohledem na expresi specifickou pro meristemy, se stanoví v transgenických rostlinách tabáku typ exprese GUS různě deletovaných promotorů (srv. obrázek 3).

Tabulka 4

Fluorometrický test GUS-konstruktů s promotorem genu α-Tub 1 kukuřičného a-tubulinu z transgenických rostlin tabáku tkáň

dny PO vyklíčení	vrchol	kořene	vrchol kořene kontrolní rostliny	vrchol prýtu	vrchol prýtu kontrolní rostliny
12	12,88	± 6, 68	3, 65	39, 02 ± 22,04	2, 85
16	7,31	± 3, 63	3,56	33,22 ± 22,00	1, 93
19	47, 67	i 35,90	4,78	20,53 ± 4,00	3,06
23	27,17	± 20, 93	5, 97	28,35 ± 10,97	0,42
26	31,77	± 13,81	4,82	35,66 ± 30,88	1,85
30	20, 64	± 12,44	8,10	29,40 ± 17,88	3, 81

Legenda k tabulce 4:

Rostliny byly stabilně transformovány promotorovým fragmentem -1024 fúzovaným s reportérovým genem GUS. Výsledky jsou vyjádřeny v pmol / h x mg proteinu a odpovídají průměru

měření u 6 až 15 rostlin potomstva každé ze čtyř rostlin F1 vzniklých nezávislou transformací.

Příklad 4

Zavedení rezistence vůči herbicidům do tabáku

Fragment Sací - EcoRI o velikosti 3,5 kb získaný z matečného plasmidu pRPA-RD-32 (srv. tabulka 1) se klonuje do míst Sací - EcoRI v pBIN-19. Výsledný konstrukt, nazvaný pRPA-RD-53, obsahuje v transkripčním rámci následující elementy: regulační element kukuřičného α-Tub 1, optimalizovaný tranzitní peptid (OTP), gen aroA, a terminátor nos.

Matečný plasmid pRPA-RD-53 se přenese do Agrobacterium tumefaciens, kmene EHA 105 (Hood a kol. (1986) J. Bacteriol, 168, 1291) pomocí triparentálního křížení a výsledné Agrobacterium se použije pro transformaci na listových terčících tabáku.

Regenerované rostliny tabáku, přibližně 20 cm vysoké, se postříkají ve skleníku glyfosatem, formulovaným v přípravku Round Up. Transformované rostliny obsahující pRPA-RD-53, které jsou životaschopné a v dobrém zdravotním stavu, vykazují zvýšenou toleranci vůči glyfosatu.

Znázornění sekvencí

SEQ ID č. 1

*-i — — »,-***/*<-» w · <* J.“	ACTAC G A GG.-.	G^?TTG<?TGCT	GG TTTG .“.T	A G GG T3\j A	AGGTGATGAT	60
GGTm»--.TG.-.GT	ACTAG.-.AG . A	TCCTGATGCG	GTCATCGTCA	GGCTTGTGTG	CTGCTCTTGT	120
CCCCGTTGTG	G TTTG C AA C .A	CCTGATGTTG	TAAGACTTTC	TGGTTATGTC	CGCCCCGCTG	180
TG 3 G Λ G TG GG	TTATTAAGAA	CGTCGTTATG	G.ATGGTTGTC.	.TACACTACAT	TATTGCTTCT	240
CGATATTGGA	AAACTGT7AT	GCGCCTCGGT	GGATTGTGTT	GTTGTCGTAA	TGTCATC.ACT	300
L G Λ L kj v- L	TGG^.-.Á'a' i'	G.AGGCCTG7C	.-.-.'Jt.·. í C.-.oG	.ATTGCGTT.AT	GAGTTA.-_-.TG	3 60
CTTCAGCGAC	GTTTAAACTT	GTCTAAGGTG	CCATCTAGAT	CATGAACTTG	TCAAGGGTTG	420
CCACTTAGAT	CATGAACTTC	GTAAATATGT	TTTTGGATCC	AAAATATGTT	TTTTATCCTT	480
AAGGGTGTGT	TTGTGTGTTT	GGTTGAATGT	ATAAGAAGGG	ATGAAAGA3G	aatgtcat.aa	540
TTTCTATAGT	GTTTGGTTGA	GAGACAAGTG	AGGACGAGAT	AAATACCTAA	GAAGGGATGA	600
AAGAGGAATG	CCACAATTTC	TATAGTGTTT	GGTTC.AG.AG.A	CAAGTGACAA	TTTCTATAGT	660
GTTTGGTTGA	GAGACAAGTG	AGGGCGAGTA	.-.Ai Al. l G l	'ί AAt íT i' v	GTGGCACCAA	720
ATTTTTGTGA	.-.L'i'LV 1	ATTTTGGACA	LL.---. 1 .‘-.Uí	.t. i Al í	ΑγΑλλ i - .---.	7 80
AACTGGTGTC	ATTTAAATCA	GTGTCACGTT	.ATTAAAATTT	AAAACTATCA	ACTAAAATTG	840
TCTAATGGAT	TATT7ATGTG	GTTTTGTAAA	L í’J í\j L· riG	Jl’Ji l l l	AGTTTTGAAG	900
ATAAGTAAGT	GAAATAGTCA	AATAGACCGT	ACTAAAGGTT	AAG.-.-.TGTAG	GT.ACACTT.AC	960
GACTAGTTTA	l ATgc l IjL aA	AATGGGTTAA	ATTTTTCTTC	TT.ATTCAAAA	TTAAAT.-_-.TA	1020
AGGTGAATTT	AACTACTCTA	ATTTCCTCTG		TCCC — - ’**T“	TC C CTTATTC	1080
GTAATAATAG	GAAGCGGTGA	CAGTTTGGTG	GTGAGAACTC	AGGTATCAAC		1140
GTA.TTTTTGA	AATATTTTGC	TCGTAATGCC	CTGCAAGGTT	TCGATTTCCG	TAGCCAGTAC	1200
ATGTCCGCTC	TTGACCCAGG	TACTGTGACA	CGAACCAACC	GACCGTTGAA	CGGACGTGGA	1260
GCACGAACCA	ITAAAACAAT	CAAAATCTCA	GGGGCTCAAA	CGAAAAAACA	CCGCCCCCTT	1320
CCCTCGCTTG	CGCTGGCACT	CCATCGTGGG	CTCGTGGCCC	AGGCTGTCGT		1380
AAAGCGAGAC	GAGTGGGAGC	AGGCGTAACC	CTAATTGAGC	ATCGCAG.-.GA	TAGGCGTCTT	1440
CGTACTCGCC	TACCTCCGCG	GCTCAAACCT	TTCCCCCTTC	TCCC.-_-.TTCC	TTCCGCCGGC	1500
CGCCGCTCCA	CCCGT.ACG.AC	GACACCATG				1529

SEQ ID č.	2
GAATTCCCTT	TGTGAGAAAT	CTCCACAAGT	TGGAGCCTCT	CACCCTTACA	AGATTGATCA	60
CAATTAAACC	ACAAGAGTAA	GGGAGGGAAC	AGAAACACAC	ACAAGTGCTA	GAGTCGCAGC	120
AATGACATGC	ACACAAGTCA	AGAAACGAGC	ACACAACACA	GCGCAACGAG	GTCACAGTTC	180

AAACAAG73C	TCAAATC77A AACACAATGA	ATCGAATGCG	TGCTTGCGGA	GTCTAGACGT	240
G*?77G G AAG^G	r* ·» — «-.— * w a · w	Λ . s» - V í — ·	GGGTCCCTTT	TATA.G C G C G A	3 00
- .“.-Ϊ	GAGGCGT«O«^ Tv-C.-.TTT	GG.-_nG3CCAT	X o X . i · v-	TA7C C G 7\j	3 ó 0
ryv* *** *» . »Jv <. w		CACAT.AATCC	VA X i 4	CGGTTTCCGC	420
77 * 7	ACCAGACG3T CCAGACGACC	AG7GCGCCTG	TCG.ACCGTTG	GCCAGCGCTG	480
» *~/-»*-v—-» · *· 0.-.¼.	TAGTCGTTGC GTGGCTGATA	CAACAGACTG	TTCGGCGCAT	TGCGGACCA7	540
« r-\»( \- *» '-yxí i » i		AACCCGAGAG	CAGCGAG77C	GGCCG.A-.GCG	500
q*\Q L L *ζ L Γ*	<—v* -o *—.-» ** /-.rrv-o/^r* * »—»*»*/» * ..-.X <?u	ACCGTTCGGT	GCTACACA3T	CTAGCAACTT	550
77CCC7G777	Qí—tTi·—•jvp-rv“CTTC^V^*'G,1>T	7C7TT7GGAC	TTCACT7AGC	HV“» /-. m ~ fs r* m i j X v. w *» 1	720
G3CAC77AGA	£ * * Τ' Τ'!, 1Γ L Q*P£X	ATCAATTGAC	T7AG737C7A	GAGCATACCT	7S0
777AGC77GA	TCCATATAGC TTTGTACTAA	GTCCTCTTCC	GAGC7CA7T7	TGCC7CACAC	840
7777GC77AA	CATCATGTTA GTTCAAACAT	CATGTG7TG7	GCA7CTAATC	ACCAAACCAA	900
'TZíT^íQZíÍZ	CCCAAGGACA CATTTCCCTT	TCAG7CGGGG	GG AG-GGG G G T	7GG7GG7CGA	960
CGGCCCG37A	CGAAGTGGGT GGGGGCAGGC	GAGAGGGGG7	GCACCA7GGG	CCACCCAG7G	1020
CG7GG7GGGG	TTTTGATCCA TGTAACTCTA	TATAAATCTC		(ZCTíti :i:t	1080
AGTTAAGATG	***.,·«·/**/»* *k m*>** řrvrvp * ρ i.VJV.i i iAU	7AGA777GAC	-GTG	AAT77C7AGA	1140
TCGACCCCT3	—v-»·-» ΓΤΓΓ' ·9?? 1 1 ± 1 V-Vj,-.-“—“ i X X	C7AGACCGCC	77^, /-» Λ ,»	— £ — C' X *T*	1200
GGAACCG7GT	ATGCACAAAG CTGCTGCATT	AT&ATTGTAG	ϋ ΓΖ 2. L X ''T	τγχττ^'Τ'τφχγ:	1250
GG ' A7AAA AG	TTTAGGAATA C-TATATAAAA	CAAGGA7TGA	GC7CCAGA7A	m^rp*. * rp * λ << <* X Λ · .---- - AUnA.	1320
CGAG7CC7G7	Z. Z. 'Τ^Τ'Τ'Τ'^ i Q i ř7''j^vT''T‘TwJvTvQ	AAACCAGGA7	TGAGCTGCAG	qnq^fprprp *,	1380
7AGAG7CCAG	CGTCTCACAG GAGTGGTCCA	.ATTCAAA.TTC	Q* * * — 'PQ*7'* Φ	CACCGC7GAA	1440
GCGAAAAATA.	TCATAAATTC ATAACGAACC	AACCGACCG7	TGCACGC-ACG	1ΓΤΓΓΤΓ	1500
GAGACCGAAC	CGTGAAAÁCA ACCGAAAGCA	CAGGGGC7CA	AACGAAACAA	7CCCGCCCAC	1560
ACTTCC7TCG	CCGGCTCATG GTGGCCACTG	GCCAGGCTG7	CATCCTGTTC	7A7AAAGCGA	1620
GCCGAGGGGA	AGAGCCGGAA CCCTAGCCCA	GCACCGCAGA	GGCGCAGAGA	ČAGGCG7C77	1680
CGTACTCGCC	TATCTCCGCG ACTCAAAGCT	7C7TCCAT77	CC7ACCGCCG	CCGCTGCAGC	1740
TCCACCCCAT	TCCGTCGACA CCATG				1755

SEQ ID č.	3
AGA7C77GA7	7C7G7GCAG7	GCTGGTGATG	GGAAAAAGCG	AAAAACCATC	GG7A7G7777	60
7GAC?AA7A7	GAAAATGGGA	CAAAAACAAC	A7G7G7G777	777CGACCG7	77CCGC7777	120
C7TGTT77AG	7CACAA7AGC	7CGTTTT7A7	CCACA7ATGA	7A7C7CA777	7AGA7AA7AC	180

ATGAACAAAT CATAAT7GA.T TATA7CA7AT C7CAACAAAT TAACCCGT.AA TGAATTATTT TTC7T7GATA G73A7A737A 3A77A3AA7 T7.-_-.733ATT G3.-_-.<-.-. C - . i i...

AT77ACA7CT T.ATTCCGA.T^ 7^77.-.733.-.

240

300

60

420

A7A3737A73 TGACAAT7AT 7TCCG3777T A733.A7773T TCCG7333GT TTTTATCTTA

777373A7AG	TTCCAATTTA	Λ i 'w ΤΤλ i i 1 T	L 'έ.ν.Λ á .V-Λ^	m * 'TV·' ''''Ti a Λ a ΛΛ/V, · zi	AAAATAAGAG	480
AGA7TGT7AC	GTTCGATCCG	GTTT7GAACC	CTAGCTATAC	TTGCCCG7TG	TTGCAACTGG	540
-** ~ * ***»·***· i · <_	CATAGGCG3G	CACAGTCAGC	ACTCAGCAGT	GACAGAGTGC	GCGTGCGACA	600
CACA3TTTCA	» > 1 L 1	CTGAAACGGG	CGGCTATAAA	CAGAACCCGC	TGCTCCCAGG	650
AGCCTCACGC	AGAT.-JL-.TTC	ACCCACATCA	A7G3333CCA	* ' i i A	ACCATC7ATT	720
GG7CCCACAT	GT7CGTGTCA.	CAACATCCTC		AAAGATAGCC	GTCTCGCCAA	780
GACCCCGAGC	CCGCCGCTGC	CCGGACCCGC	CGCCAGCTCA	CACCCACCGT	TGCCGGCCGC	840
7GAGCCGT7C	GAAGCCAAAA	CGGTCGTTAA	CCACCCAGC?	GCCCGTCGGC	TACCATCACG	900
CCGT7AGCCC	CGAACCAGAC	GGCGGCTAGG	TCTTCCGCCG	CGCGCCG3GC	CATCACGGGC	960
CGGCCGCGGC	CTTCTTTCCC	ACGCTGCCTA	TiniGCCGC	CGCGGGGCTG	AGCAGCATTA	1020
TCGCTTC.AGC	TCGGCGTCTT	CACAAA.CGCC	GGCGCAAACT	CTCGCCCGAG	CCCGACAGAT	1080
Q 'ppQ * * Φ'Ρ^ Q	CCATTCCGCC	CACCGATCGA	CCTTCACGCC	AGTCTCGGTC	TCTTCCGAAG	1140
	CGGTTGT7T3	·. «*· * <* <·*»<· ·. /-**-»	AGGAAGATG			1179

SEQ ID č. 4

GAATTCCGAA	AGACAAAG.AT	TATCGCCATG	GCTTCGATCT	CCTCC7CAGT	CGCGACCGTT	60
AGCCGGACCG	CCCCTGCTCA	GGCCAACATG	GTGGCTCCGT	TCACCGGCCT	TAAGTCCAAC	120
GCCGCCTTCC	CCACCACCAA	GAAGGCTAAC	GACTTCTCCA	CCCTTCCCAG	CAACGGTGGT	180
GGAAGAGTTC	AATGTATGCA	GGTGTGGCCG	GCCTACGGCA	ACAAGAAGTT	CGAGACGCTG	240
TCGTACCTGC	CGCCGCTGTC	AATGGCGCCC	ACCGTGATGA	TGGCCTCGTC	GGCCACCGCC	300
GTCGCTCCGT	TCCAGGGGCT	CAAGTCCACC	GCCAGCCTCC	CCGTCGCCCG	CCGCTCCTCC	360
AGAAGCCTCG	GCAACGTCAG	CAACGGCGGA	AGGATCCGGT	GCATG		405

WTnrF.Tnxi«>ro:’rntí«.vnxn.Triw:.

35a

Literatura:

Amstrong, C. L., Petersen, W. L., Buchhloz, W. G. a Bowen, B. A. (1990) Factors affecting PEG-mediated stable transformation of maize protoplasts. Plant Cell Reports, 9, 335 - 339,

Bedinger, P. a Edgerton, M. D. (1990) Developmental staging of maize microspores reveals a transition in developing microspore proteins. Plant Physiol., 92, 474 - 479,

Carpenter, J. L. Ploense, S. E., Snustad, D. P. a Silflow, C. D. (1992) Preferential Expression of an α-Tubulin Gene of Arabidopsis in Pollen. Plant Cell, 4, 557 - 571,

Chu, C., Wang, C., Sun. C., Hsu, C., Yin, K. a Chu, C. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Scientia Sinica, 18, 659 - 668,

Feldman, L. J. (1984) Regulation of root development. Ann. Rev. Plant Physiol., 35, 223 - 242,

Gorman, C. M., Moffat, L. F. a Howard, B. H. (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 1044 - 1051,

Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. a Bevan, M. W. (1987a) GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion markér in higher plants. EMBO J., 56,

3901 - 3907,

Jefferson, R. A. (1987b) Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS gene fusion systém. Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387 - 405,

Kopczak, S. D., Haas, N. A., Hussey, P. J., Silflow, C. D. a Snustad, D. P. (1992) The Smáli genome of Arabidopsis Contains at Least Six Expressed α-Tubulin Genes. Plant Cell, 4, 539 - 547,

35b

Kosugi, S._z Ohashi, Y., Nakajima, K. a Arai, Y. (1990) An improved assay for β-glucuronidase inf transformed cells: Methanol almost completely suppresses a putative endogenous β-glucuronidase activity. Plant Sci., 70 , 133 - 140,

Mandaron, P., Niogret, M. F., Mache, R. a Moneger, F. (1990) In vitro protein synthesis in isolated microspores of zea mays at several stages of development. Theor. Appl. Genet., 80, 134 - 138,

Mc. Cormick, S. (1991) Molecular analysis of male gametogenesis in plants. Trends Genet., 7, 289 - 303,

Montoliu, L., Puigdoměnech, P. a Rigau, J. (1990) The Tuboc3 gene from Z. mays: structure and expression in dividing plant tissues. Gene, 94, 201 - 207,

Montoliu, L., Rigau, J. a Puigdoměnech, P. (1989) A tandem of α-tubulin genes preferentially expressed in radicular tissues of Z. mays. Plant Mol. biol., 14, 1 - 15,

Montoliu, L., Rigau, J. a Puigdoměnech, P. (1992) Analysis by PCR of the number of homologous genomic sequences to α-tubulin in maize. Pnat Sci., 84, 179 - 185,

Murashigue, T. a Skoog, F. (1962) A revised medium fo rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15, 473 - 497,

Paszkowski, J. a Saul, M. W. (1986) Direct gene transfer to plants. V Methods in Enzymology, svazek 118, Plant Molecular Biology, Academie Press lne. str. 669 - 684,

Snustad, D. P., Haas, N. A., Kopczak, S. D. a Silflow, C. D. (1992) The Smáli genome of Arabidopsis Contains at Nině Expressed β-Tubulin Genes. Plant Cell, 4, 549 - 556,

35c

Stinson, J. R., Eisenber, A. R., Willin, R. P., Pe, Μ. E., Hanson, D. D. a Mascarenhas, J. P. (1987) Genes expressed in the male gametophyte of flowering plants and their isolation. Plant Physiol., 83, 442 - 447,

Villemur, R., Joyce, C. M., Haas, N. A., Godbard, R. H., Kopczak, S. D., Hussey, P. J., Snustad, D. P. a Silflow, C. D. (1992) alpha-Tubulin Gene Family of Maize (Zra-Mays L). Evidence for 2 Ancient alpha-Tubulin Genes in Plants. J. Mol. Biol., 227, 81 - 96.

(z «______x

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY j Λ13lN iS VTA Oh3A.O'S λ'Λ Qbd

   7 6 IX β 0 i I

   01500

   1. Izolovaná nukleová kyselina získaná z kukuřičného?’ i ^(t j genu α-tubulinu, která obsahuje alespoň jeden regulat element, který kontroluje alespoň specifickou expresi v p kořenech, meristematických zónách a nezralých embryích.

   2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, v y značuj íc i se t i m , že genem je kukuřičný gen α-Tub 1. 3. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, v y značuj íc i se t i m , že genem je kukuřičný gen a-Tub 2 4 . Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, v y značuj íc i se t i m , že genem je kukuřičný gen a-Tub 3 5. Izolovaná nukleová kyselina podle nároků 1 až 4, v y značuj íc i se t i m , že regulační element kontroluje expresi genu pod svou kontrolou , která je

   detekovatelná v pylu.

   6. Izolovaná nukleová kyselina podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím , že regulační element kontroluje expresi genu pod svou kontrolou, která je detekovatelná v kořenech. 7. Izolovaná nukleová kyselina podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím , že regulační element kontroluje expresi genu pod svou kontrolou, která je

   detekovatelná v meristemech.

   8. Izolovaná nukleová kyselina podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že regulační element kontroluje expresi genu pod svou kontrolou, která je detekovatelná v nezralých embryích.

   9. Nukleová kyselina podle nároku 5, vyznačující se tím , že regulační element obsahuje nukleotidy 1 až 1348 ze SEQ ID č. 1.

   10. Nukleová kyselina podle nároku 9, vyznačující se tím , že regulační element obsahuje nukleotidy 1295 až 1348 ze SEQ ID č. 1.

   11. Nukleová kyselina podle nároku 6, vyznačující se tím , že regulační element obsahuje nukleotidy 1 až 1529 ze SEQ ID č. 1.

   12. Nukleová kyselina podle nároku 11, vyznačující se tím , že regulační element obsahuje nukleotidy 1 až 1115 ze SEQ ID č. 1.

   13. Nukleová kyselina podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím , že regulační element obsahuje nukleotidy 1 až 695 ze SEQ ID č. 3.

   14. Nukleová kyselina podle nároku 13, vyznačující se tím , že regulační element obsahuje nukleotidy 542 až 695 ze SEQ ID č. 3.

   15. Nukleová kyselina podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že regulační element obsahuje nukleotidy 1 až 1076 ze SEQ ID č. 3.

   16. Rostlinný chimérický gen, tím, že obsahuje dostatečnou vyznačuj ící část promotorové DNA

   !3 -.-.31 podle nároků 1 až 15, která je schopná fungovat v rostlinách, a je funkčně navázána na kódující sekvenci, tak, že způsobuje expresi heterologního genu.

   17. Rostlinný chimérický gen podle nároku 16, vyznačující se tím, že obsahuje mezi promotorem a kódující sekvencí další regulační element genu.

   18. Rostlinný chimérický gen podle nároku 17, vyznačující se tím , že regulačním elementem genu je promotor, který je funkční v rostlinách.

   19. Rostlinný chimérický gen podle nároku 18, v y - z n a č u jící se tím , že dalším regulačním elementem je promotor 35S CaMV z , vil u mozaiky květáku. 20. Rostlinný chimérický gen podle nároku 13, v y - z n a č u jící se tím , že dalším regulačním elementem je promotor rostlinného histonu. 21. Rostlinný chimérický gen podle nároku 18, v y - z n a č u jící se tím že dalším regulačním elementem je promotor genu rýže pro aktin. 22. Rostlinný chimérický gen podle nároků 16 až 21, v y z n a čující se t i m , že obsahuje heterologní

   gen vybraný ze skupiny zahrnující geny kódující enzymy pro metabolismus lipidů, desaturasu, geny rezistence vůči herbicidům a geny kódující 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát-synthasu, acetolaktasu a 4-hydroxyfenyipyruvát-dioxygenasu.

   23. Rostlinný chimérický gen podle nároku 22, vyznačující se tím, že heterologním genem je gen aroA pro rezistenci vůči' glyfosatu.

   24. Vektor pro transformaci rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje rostlinný chimérický gen podle nároků 16 až 23.

   25. Rostlinná buňka, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 24.

   26. Rostlina nebo potomstvo rostliny, vyznačující se tím, že byla regenerována z buňky podle nároku 25.

   27. Rostlina podle nároku 26, vyznačuj ící se t í m , že se jedná o jednoděložnou rostlinu.

   28. Rostlina podle nároku 27, vyznačuj ící se t i m , že se jedná o kukuřici nebo obilovinu.

   29. Rostlina podle nároku 26, vyznačuj ící se t i m , že se jedná o dvouděložnou rostlinu.

   30. Rostlina podle nároku 29, vyznačuj ící se t i m , že se jedná o tabák, bavlník nebo sóju.

   31. Způsob vytvoření rostliny se zlepšenými agronomickými vlastnostmi, vyznačující se tím, že zahrnuje postupně:

   a) transformaci rostlinné buňky vektorem podle nároku 24,

   b) regeneraci rostliny.