CN1154723C

CN1154723C - 花器特异性基因及其启动子序列

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Publication number: CN1154723C
Application number: CNB971941513A
Authority: CN
Inventors: �ӳɹ�; 高仓由光; 井上刚; 斋藤秀章; 伊藤彻
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-26
Publication date: 2004-06-23
Anticipated expiration: 2017-12-26
Also published as: ATE399858T1; AU739796B2; US20030106106A1; DE69738804D1; EP0913469A4; KR100557306B1; KR19990087254A; AU7891498A; EP0913469A1; US6462185B1; WO1998029542A1; CN1217021A; JP3535525B2; EP0913469B1

Abstract

本发明提供了能对雌蕊或浆片进行基因工程操作的花器特异性启动子，并进一步地提供了在花器中特异性表达的新的壳多糖酶及其基因。本发明的花器特异性启动子包含在由序列表SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸组成的序列中。本发明的启动子包括通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸的衍生自上述序列并具有花器特异性启动子的活性的序列，还包括通过使用序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列作为探针可以得到的，并具有花器特异性启动子活性的那些序列。本发明的花器-特有的壳多糖酶基因由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第1-1097位核苷酸序列组成。另外，它包括此序列的一部分，和含有通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸的衍生自所述序列的序列的DNA片段，所述DNA片段编码的蛋白质所具有的生物学活性等同于由上述核苷酸序列组成的DNA所编码的蛋白质。本发明的花器特异性的壳多糖酶由序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成。另外，它包括此氨基酸序列的一部分，或具有通过缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸的衍生自这些氨基酸的序列的氨基酸序列，所述氨基酸序列构成的蛋白质所具有的生物学活性等同于由上述氨基酸序列组成的蛋白质。

Description

花器特异性基因及其启动子序列

发明所属技术领域

本发明涉及在单子叶植物花器中显示出特异性表达的基因及其启动子序列，本发明还涉及作为抗病原体细菌的防御机制起作用的壳多糖酶和壳多糖酶基因。

现有技术

已报道了一些在花器中特异性表达的基因的分离，所述基因如花药特有基因和雌蕊特有基因。然而，仅报道了少数分离自单子叶植物的基因并阐明了其启动子序列。

这些报道的例子是JP(Kohyo)HEI 6-504910，Tsuchiya等，植物分子生物学(Plant Mol.Bio.)，26，1737-1746，1994等，其中公开了水稻花药特有基因及其表达分布等。

为了人工改良植物花器形态，尤其是胚器官的形态学或生理现象，或分析花器中各种基因的功能，需要有在花器中表现出特异性表达的启动子。然而，在以大多数谷类植物为代表的单子叶植物中，迄今只分离出极少数仅在花器中表达的基因。特别是仍未报道过在作为雌性胚器官的雌蕊或调节开花的浆片中表现出显著表达的启动子序列。

尽管似乎作为抗病原体细菌和真菌的防御机制起作用的壳多糖酶(EC3.2.1.14)是一例在花器中表达的基因，但迄今为止，所报道的大多数来源于植物的壳多糖酶不仅在花器中也在根中组成型表达(例见Neale等，植物细胞(ThePlant Cell)，2，673-684，1990)。例外的是，如马铃薯SK2(Wemmer等，Planta 194，264-273，1994)和番茄Chi2；1(Harikrishna等，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，30，899-911，1996)的壳多糖酶显示出花柱特异性表达。

另一方面，已分离出单子叶植物的一些壳多糖酶，例如，Zhu antLamb(Mol.Gen.Genet，226，289-296，1991)从水稻中分离出被称为RCH10的壳多糖酶，并声称该酶的基因在无菌条件下可在根中组成型表达。另外，Zhu等人(BIO/TECHNOLOGY，12，807-812，1994)通过使用上述基因与苜蓿葡聚糖酶基因构建了对病原体细菌的耐受性有所增强的烟草。

然而在单子叶植物中，仍未报道过在根中不以可检测水平表达，而只在花器中表达的壳多糖酶。

发明简述

本发明的目的是提供新的花器-特有的启动子序列，以使在现有技术中，尤其是在单子叶植物中不可能进行的对雌蕊或浆片的基因操作成为可能。

本发明的另一目的是提供新的壳多糖酶，以使赋予植物抗含有壳多糖的病原体细菌和真菌的普遍抗性成为可能。

图的简述

图1由照片组成，显示对RPC175基因的Northern分析结果。

图2由照片组成，显示对RPC175基因的RT-PCR分析结果，其中 A：模板RNA 1μg(柱头和子房中200g)；

B：1：模板RNA 1μg 2：模板RNA 30ng

3：模板RNA 1ng 4：模板RNA 30pg。

图3包括的照片显示对RPC175基因的基因组Southern分析结果，其中B：BamHI，E：EcoRI，H：HindIII，P：PstI，S：SalI，X：XhoI，J：Tsukinohikari，I：IR24。

图4包括的照片显示经引物延伸法测定RPC175基因的转录起始点的实验结果。通过使用雌蕊或叶RNA为模板，利用两个引物P3FW2和C5FW进行引物延伸反应。序列反应产物(G，A，T，和C)上样的位置相邻，箭头表示延伸产物，对应于产物的核苷酸序列也被示出。

图5是显示RPC175基因启动子3’端结构的模式图。每个碱基上的数字表示将最上游转录起始点的位置定为+1时该碱基的相对位置。

图6为RPC175和RPG102限制性图谱的比较，其中粗线表示克隆的核苷酸序列，而细线表示载体的核苷酸序列；阴影部分表示内含子的核苷酸序列；单位以kbp表示；Ec指的是EcoRI，P指的是PstI，pBS指的是pBluescript，AAAA…指的是polyA。

图7描述用于分析启动子表达的载体的构建方法。

图8描述对与GUS一同使用的RPC175启动子表达的分析结果。横坐标指的是受试的器官，而纵坐标指的是显示出GUS表达的转化体的数目，虚点部分指的是显示出不规则GUS表达的个体的数目。

图9包括的照片显示一例对RPC175启动子在花器中组织特异性表达的分析结果。

图10为RPC175启动子在各种水稻器官中的活性的测量结果。横坐标指的是水稻器官，而纵坐标(对数的)指的是GUS活性，其中○：非转化体●：转化体(R1)。

图11描述了用于表达RPCl75基因所编码蛋白质的载体的构建方法。

图12包括的照片为SDS-PAGE带型，它显示RPC175基因所编码蛋白质的表达的实验结果。通过Ni-NTA树脂纯化经IPTG诱导的转化体中不能溶解的组分，并经SDS-PAGE分离所述组分。M指的是分子量标准。

图13由包括的照片为Western分析图谱，显示由RPC175编码的蛋白质的增溶实验结果。SDS-PAGE之后，通过ECL检测带型。

发明的详细描述

本发明人进行了深入的研究，最终发现的DNA片段含有具有SEQ IDNO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸的序列，此序列的一部分，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸衍生自这些序列并具有启动子活性的序列，因而解决了上述难题。

因此，根据本发明，通过使用SEQ ID NO：1所示核苷酸序列作为探针，在水稻基因组文库中鉴定单子叶植物花器-特有的启动子序列也可解决上述难题。

另外，通过编码壳多糖酶并含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第114-1097位核苷酸，所述序列的一部分的DNA序列，或具有通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸衍生自这些核苷酸序列的序列，其所编码的蛋白质具有的生物学活性等同于由上述核苷酸序列组成的DNA所编码的蛋白质，或通过由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，此序列的一部分组成的壳多糖酶序列，或具有通过缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸衍生自这些氨基酸序列的序列的壳多糖酶氨基酸序列，本发明人解决了上述难题。

下文将详细地描述本发明。

如上所述，本发明人发现的第一个发明涉及DNA，该DNA含有具有SEQID NO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸的序列，所述序列的一部分，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸衍生自这些序列并具有启动子活性的序列。

本发明的启动子序列，即含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸的序列与任何已知的启动子序列基本上没有同源性，因此可认为此序列是新的。例如，根据下文将要给出的实施例2中所述的方法，可从天然的单子叶植物中分离出此序列。

本发明的DNA片段具有花器所特有的启动子活性。本文所用的术语“花器特异性启动子活性”指的是尤其在开花期，相对于其它器官(至少为叶、根、愈伤组织、萌发的种子、不成熟的种子、内稃和外稃)而言，本发明DNA片段的启动子活性在花器(花药，花丝，雌蕊和浆片)中的表达更占优势。已经证实本发明的DNA片段在单子叶植物中是花器所特有的，有可能在其它植物中也是花器所特有的。

SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有下列的一些特性：

1.它具有3个转录起始点，各间隔几个核苷酸，这些起始点全是A(腺嘌呤)后面接TC。具体地说，转录起始点是第1122，1125和1129位的腺嘌呤(A)。

2.最上游转录起始点上游30bp处有一类似TATA盒的序列(5’-TATATAA-3’)(Corden等，科学(Science)，209，1406-1414，1980)。

3.在相同的阅读框中有2个ATG序列，各位于最上游转录起始点下游77bp和113bp处。

4.终止密码子(TGA)位于最上游ATG(第一个ATG)上游21bp处。另外，终止子区域有2个类polyA信号的序列(5’-AATAAA-3’)(Heidecker和Messing，Annu.Rev.Plant Physiol，37，439-466，1986)。本文中的术语“终止子区域”指的是终止密码子下游的区域。

在第1135和1140位之间发现了SnaBI裂解位点，而在第1223和1228位之间存在PstI裂解位点。第1235位之后的区域为结构基因区域。

根据本发明，已发现启动子位于结构基因上游的区域，即位于含有SEQ IDNO：2所示核苷酸序列中的第1-1234位核苷酸的区域。然而，只要含有此区域一部分的序列具有类似的启动子活性，则它们也包括在本发明中。

例如，第1-1228和1-1140位的区域具有花器特异性的启动子活性，这一点将在下文给出的实施例中描述，因此，这些序列包括在本发明中。另外，预期第1-1121位的区域具有类似的启动子活性，因为如上所述，转录起始点位于第1122位。

另外，应注意到启动子序列偶尔在第1-6位核苷酸处含有EcoRI位点，这使得我们能够测定从此位点开始的启动子序列，因此，非常希望从此位点下游一些的核苷酸开始的序列具有启动子活性，这是因为大量报道表明大多数植物启动子的组织或时间特异性或诱导性基本上包含在转录起始点之前的0.3-0.4kb的区域内。例如，在水稻的II型谷蛋白基因启动子中，只需通过转录起始点之前的441bp的片段即可完整地得到组织或时间特异性表达(Takaiwa等，植物分子生物学(Plant Mol.Bio.)，16：49-58，1991)。在花椰菜的自身不相容性相关基因SLG13的启动子中，转录起始点之前的411bp区域指导在雌蕊和花粉中的表达(Dzelzkalns等，植物细胞(the Plant Cell)，5：855-863，1993)。在番茄阴离子过氧化物酶基因启动子中，转录起始点上游的358bp区域即可决定器官特异性以及病原体和创伤诱导性(Mohan等，植物分子生物学(Plaut Mol.Biol.)，22：475-490，1993)。因此，据观察对于很多启动子而言，只有在被报道序列的一部分是含有转录起始点之前的几百个bp核苷酸的区域时，所述部分才能维持全部的功能。

因此，本发明包括得自转录起始点上游几百个bp，优选约500bp区域，并具有本发明中表征的花器-特异性的任何DNA序列。例如，如果使用根据本发明的核苷酸序列设计的引物，经PCR从水稻基因组中能容易地分离出转录起始点上游几百个bp内的区域，而且所述区域表现出本发明启动子所固有的花器特异性，那么该较短的启动子序列也包括在本发明范围内。

本发明范围中另外包括具有通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸的衍生自这些序列的序列并具有启动子活性的DNA片段。

众所周知，当通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸对具有生理学活性的DNA的核苷酸序列稍加修饰时，DNA的生理学活性一般可以维持。因此，本发明范围中包括通过这种细微的修饰衍生自上述启动子序列并具有启动子活性的DNA序列。也就是说，由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸组成的序列，具有启动子活性的此序列的一部分(例如，由转录起始点上游几百个bp组成的那些序列)，通过缺失、取代、插入或增加少量核苷酸衍生自上述序列并具有启动子活性的DNA序列都意图被包括在本发明的范围内。

类似地，由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第1-1140位核苷酸组成的序列，由其第1-1121位核苷酸序列组成的序列，和通过缺失、取代、插入或增加少量核苷酸衍生自上述序列并具有启动子活性的DNA序列都被包括在本发明的范围内。

通过例如众所周知的定点诱变技术(例见核酸研究(Nucl.Acids Res.)，10：6487-6500，1982)可进行核苷酸的增加、插入、缺失或取代。本文所用术语“一个或多个核苷酸”是指能允许通过定点诱变方法增加、插入、缺失或取代的核苷酸数目。

可使用例如合成的寡核苷酸引物以下列方式进行定点诱变，除了特定的不一致处，即所需突变之外，所述引物与需突变的单链噬菌体DNA互补。即噬菌体利用上述寡核苷酸作为引物可合成互补链。接着，用所得双链DNA转化携有噬菌体的宿主细菌，然后将经转化细菌的培养物平铺在琼脂上，形成含有得自单个细胞之噬菌体的噬菌斑，因此理论上50％新形成的菌落会含有单链上携有突变的噬菌体，而其余50％菌落具有原始的序列。将所得噬菌斑与经激酶处理过的合成探针杂交，杂交温度应使与上述具有所需突变的DNA一致的噬菌斑杂交，而与具有原始链的那些噬菌斑不能杂交。然后挑选与探针杂交的噬菌斑，培养，随后回收DNA。

除了上述的定点诱变方法以外，通过用诱变剂处理基因，或通过选择性地裂解基因，然后缺失、增加或取代所需的核苷酸后再连接，以进行核苷酸的取代、缺失、增加或插入启动子序列中，而同时维持其活性。

通过利用PCR法的定点诱变(Mikaelian等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，20：376，1992)，或利用Taq DNA聚合酶低保真性的随机核苷酸取代技术(Zhou等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，19：6052，1991)也可进行特定核苷酸的取代、缺失、增加或插入。

下面将阐明本发明人发现的第二发明。

本发明的第二发明涉及单子叶植物花器特异性的启动子序列，该序列包含在利用SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为探针从水稻基因组文库鉴定的序列中。

通过构建水稻(Oryza sativa)内稃和外稃或雌蕊的cDNA文库，以示差筛选分离在雌蕊，花药和浆片中特异表达的cDNA，并测定其完整的核苷酸序列即可得到SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。如此测定的整个核苷酸序列可用作探针。或者，如果需鉴定的DNA的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的同源性为80％或更高，可利用此序列的一部分作为探针，在这种情况下，可使用任何杂交和洗涤条件，只要它们能形成分子杂合体即可。

使用水稻(Oryzae sativat)绿叶可构建水稻的基因组文库，不过本发明并不局限于此。使用上述探针可从所得文库中鉴定启动子序列。为了确定启动子是花器所特有的，通过将β-葡糖醛酸酶(GUS)基因与启动子序列连接可构建嵌合体基因。将所得嵌合体基因导入水稻植株，然后证实表达位点。

在下文给出的实施例中将要详细描述上述SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的测定，水稻基因组文库的构建和特有的启动子活性的鉴定，不过本发明并不局限于此。

如上所述，SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，尤其是含有第1-1234位核苷酸的序列是本发明人分离的新的DNA片段。根据本发明公开的内容，本领域技术人员利用含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸的核苷酸序列的至少一部分，可从多种单子叶植物基因组文库中容易地分离出具有类似于本发明之一的花器特异性的DNA片段。也可恰当地确立与探针杂交的条件。因此，本发明范围中包括能与由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第1-1234位核苷酸组成的核苷酸序列的至少一部分杂交，并具有类似于本发明的花器特异性的启动子活性的DNA片段。

本发明的启动子是新的花器特异性的启动子，它不仅使花药也使雌蕊和浆片的基因操作和改良成为可能，而在以前这是不可能做到的，尤其是在单子叶植物中，因此启动子可用于例如下列目的。

(1)利用能诱导不育性的结构基因产生雌性不育株，其中所述基因与本发明的启动子或其部分连接。

(2)利用能促进植物细胞伸长或分裂的结构基因使花器特异性地变大或伸长，其中所述基因与本发明的启动子或其部分连接。

(3)利用本发明启动子在浆片中的表达对开花进行基因调控。

(4)利用赋予除草剂耐受性或疾病抗性的基因提供对除草剂或疾病的耐受性有所改善的完整的花器或其部分，其中所述基因与启动子连接。

开花期间，本发明的启动子在水稻的柱头、花柱、花药壁、花丝和浆片中表达。例如，当在改良雄性不育水稻的过程中使用此启动子时，它在花药壁和花丝中的表达可以忽略。另外，有时希望不同的器官对基因产物的敏感程度也不同。此时，本发明的启动子可用于例如特异性地改良柱头和花柱或浆片。

最后将阐明本发明人建立的第三个发明。

第三发明涉及的DNA序列含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第114-1097位核苷酸，或所述序列的一部分，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸的衍生自所述序列的DNA序列，该DNA序列编码的蛋白质所具有的生物学活性等同于由上述核苷酸序列组成的DNA所编码的蛋白质。第三发明进一步涉及由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成的序列，此序列的一部分，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸的衍生自这些氨基酸序列，且该氨基酸序列具有的生物学活性等同于由上述氨基酸序列组成的蛋白质的氨基酸序列。

本发明的DNA序列，即由第114-1097位核苷酸组成的序列，和氨基酸序列表示分别与已知的水稻I类壳多糖酶有67-69％和54-61％同源性的新的壳多糖酶。

由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有下列特性：

根据与多种I类壳多糖酶可能的同源性进行模拟，假定其结构从N-末端起具有下列元件：在N-末端具有连续的疏水氨基酸残基的前导序列(SEQ IDNO：3中的第1-20位氨基酸)；在成熟蛋白质的N-末端区域富含半胱氨酸残基的壳多糖-结合区(SEQ ID NO：3中的第21-61位氨基酸)；和间隔区(SEQ IDNO：3中的第62-83位氨基酸)，间隔区后为催化区(SEQ ID NO：3中的第84-328位氨基酸)。在该催化区中，保留了NYNYG(SEQ ID NO：3中的第198-202位氨基酸)中的第一个酪氨酸残基(Verburg等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，267：3886-3893，1992；SEQ ID NO：3中第199位的Y)被认为是壳多糖酶活性位点。在C-末端，观察到与其它水稻壳多糖酶未显示出同源性的特征性连续氨基酸残基(SEQ ID NO：3中的第318-328位)。分别计算出成熟蛋白质区域(SEQ ID NO：3中的第21-328位)的分子量和等电点约为32KD和7.24。

当在大肠杆菌中表达成熟蛋白质区域(SEQ ID NO：3中的第21-328位氨基酸)、且壳多糖酶活性被作为其生物学活性之一时，实践中即可测定壳多糖酶的活性。

如上文所讨论，植物I类壳多糖酶在成熟蛋白质的N-末端具有富含半胱氨酸的壳多糖结合区，其后紧接间隔区。然而，据Iseli等人(植物生理学(PlantPhysiol.)，10221-226，1993)报道：缺乏这些区域时也可维持壳多糖酶和抗微生物活性。因此，很可能本发明的壳多糖酶仅在催化区，即无需壳多糖结合区和间隔区也具有壳多糖酶活性。因此，预期由SEQ ID NO：3中的第84-328位氨基酸组成的催化区应该具有等同子完整的175蛋白(SEQ ID NO：3中的第1-328位氨基酸)或成熟蛋白质(SEQ ID NO：3中的第21-328位氨基酸)的生物学活性，因此本发明也包括此区域。

如上所述，本发明的新的壳多糖酶具有壳多糖酶活性，因此可用于下列目的：

(1)通过用DNA序列转化植物细胞产生对病虫害具有抗性的植物，所述DNA序列含有本发明SEQ ID NO：1所示DNA序列中第114-1097位核苷酸或其部分，其中所述DNA序列或其部分已与组成型、组织特异性、时间-特异性或诱导型的启动子连接。

(2)利用由壳多糖酶产生的壳寡糖(chitooligosaccharides)为原料生产食品、化妆品和药物。

实施例

实施例1：分离花器特异性的cDNA

在温室中培养稻田水稻品种“Akihikari”，“Tsukinohikari”和“IR24”，并进行下列实验。

(1)提取RNA

收集“IR24”的叶、雌蕊、花药、浆片、内稃和外稃、不成熟的种子、正在萌发的种子、根和愈伤组织和“Akihikari”的内稃和外稃(长度为4.5-6.0mm)，立即在液氮中冷冻，然后储存于-80℃中。雌蕊的一部分被分成柱头和子房组织。

通过Watanabe和Price(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6304-6308，1982)的SDS-苯酚法从这些组织中提取总RNA，不同之处在于在提取缓冲液中加入β-巯基乙醇至终浓度为10％(v/v)以作为抗氧化剂。在RNA酶抑制剂(RNAguard，Pharmacia)的存在下，用DNA酶I(FPLC纯，Pharmacia)处理逆转录PCR实验中所用的组织，而不必进行氯化锂沉淀以使任何痕量DNA的污染降至最低。从播种后在温室中生长1个月的植物中采集叶和根(在下文给出的图2和表1中表示为“根(土壤)”)，开花前7天立即从植物中采集雌蕊、花药、浆片和内稃、外稃、从开花后1-2周的植物中采集不成熟的种子，分别从播种后1和3周，无菌生长于N6培养基(Chu等，Scientia Sinica，18，659-668，1975)中的植物中得到正在萌发的种子和根。

在含有2mg/l 2，4-D的N6固体培养基中由种子诱导愈伤组织，培养后用于相同组成的液体培养基中，振荡培养1周。根据厂商说明，使用Oligotex-dT30 super(Takara Shuzo有限公司)纯化雌蕊和叶中的总RNA以提供polyA+RNA。

(2)构建内稃、外稃和雌蕊的cDNA文库

将约2.2μg和1μg各分离和纯化自内稃，外稃和雌蕊的polyA+RNA用作模板以通过使用ZAP-cDNA合成试剂盒(STRATAGENE)来合成cDNA。对RI摄取比例的测定表明内稃，外稃和雌蕊约462ng和约55ng的cDNA第一链由寡聚dT作引物反转录而来，约1022ng和约72ng的cDNA第二链直接从第一链合成得到。根据厂商说明，将cDNA与EcoRI接头连接，并用XhoI消化以连接到载体Uni-ZAPXR上。接着，使用Giga-pack Gold包装提取物(STRATAGENE)将噬菌体DNA包装到噬菌体颗粒中。用噬菌体转染E.coliPLK-f′宿主细胞，然后将所述细胞接种于平板上并检查每个文库的大小。结果计算出内稃和外稃cDNA文库的大小为1×106pfu(噬斑形成单位)，而雌蕊cDNA文库的大小为3×106pfu。

(3)示差筛选

基本上按照Gasser等人的方法(植物细胞，1，15-24，1989)进行示差筛选。用约2000pfu得自内稃和外稃cDNA文库的噬菌体感染E.coli PLK-F′细胞，并将细胞平铺在方形平皿(14×10cm)。使用尼龙滤膜Hybond-N+(Amersham)为每个平板制备影印滤膜，根据厂商的说明处理该影印滤膜。

将由雌蕊和叶的约100ng polyA+RNA(约2μg总RNA)合成的单链cDNA用作杂交的探针，在2μl RNA溶液中加入0.5mM d(ATG)TP，10mM DTT和1×M-MuLV缓冲液(由BRL制备)，接着加入30ng/μl随机的DNA六聚体(Pharmacia)[或80ng/μl寡聚dT引物(Amersham)](每种情况下的浓度为终浓度)。65℃加热5分钟解离RNA的二级结构之后，在室温下使引物退火再加入1.5单位/μl RNA酶抑制剂(RNAguard，Pharmacia)，10单位/μl反转录酶M-MuLV(由BRL制备)和4μCi/μl[α-32P]dCTP(各以终浓度表示)之后，于37℃将总量为20μl的液体反应混合物维持1小时，随后，再加入未经RI-标记的dCTP使终浓度为0.5mM，将反应持续30分钟。

使用快速自旋柱(Quick Spin Column)G-50 Sephadex(BOEHRINGERMANNHEIM制备)纯化经标记的DNA探针，加入等量的2N NaOH(终浓度为1N)使探针变性。首先于68℃在杂交缓冲液(0.25M Na₂HPO₄ pH7.2，7％SDS，1mM EDTA，1×Denhardt’s溶液)中处理滤膜10分钟。然后加入单链探针(终浓度为0.2-0.3×107cpm/ml)和载体DNA(0.1mg/ml，鲑精DNA，0.1μg/mlλDNA，0.1μg/ml水稻DNA)，于68℃杂交过夜(16-24小时)。

用缓冲液(20mM Na₂HPO₄ pH7.2，1％SDS，1mM EDTA)将滤膜在室温下和68℃下各洗涤两次，每次15分钟，接着于-70℃将所述滤膜暴露于柯达X-Omat胶片4-5天。当检测到约20000个噬斑时，通过初次筛选选出114个与雌蕊探针显示出强杂交信号、但与叶探针只显示出弱信号或背景信号的噬斑。随后，进一步地纯化这些噬斑，在第三次筛选阶段选出41个噬斑。

在这些噬斑中，有一个与叶探针显示出特别弱的信号(与背景难以区分)，于4℃，将该噬斑储存于200μl含有1滴氯仿的SM缓冲液(0.1M NaCl，7mMMgSO₄，50mM Tris-Cl，pH7.5，0.01％明胶)中，然后将如此储存的液体稀释，平铺噬菌体以得到相当低的噬斑密度(10-100pfu/平板)，分离与其它噬斑分开的噬斑并储存于相同缓冲液中。根据ZAPcDNA合成试剂盒中所附的说明，由此液体制备含有高浓度噬菌体的裂解物(平铺裂解物)并进行体内切割，从而从噬菌体基因组中切下质粒[pBluescriptSK(-)]。然后用限制性酶EcoRI和XhoI(Takara Shuzo有限公司)消化质粒，从而分离和纯化出cDNA插入物(约0.8kb)。

(4)cDNA克隆的器官-特异性表达分析

i)Northern杂交分析

对上文(3)中选择的cDNA克隆进行Northern杂交以检查它在多种器官中的表达模式和表达水平。以下列方法制备滤膜，首先根据Sambrook等人(分子克隆，1982)的方法，用去离子化的Glyoxal和DMSO解离得自上文(1)中所述各个器官的总RNA(20μg)的二级结构，然后在1％琼脂糖凝胶上分级分离，接着，通过常规的毛细管转移法将RNA印迹到尼龙膜Gene Screen Plus(杜邦)上，于80℃在真空烘箱中干燥1小时，在20mM的Tris-HCl(pH8.0)中将滤膜煮沸5分钟以除去Glyoxal，使用Multiprime标记系统(Amersham)把用作探针的上述cDNA 0.8kb的EcoRI片断进行RI标记。

根据滤膜中所附的厂商说明进行预-杂交和杂交。室温下用2×SSC，1％SDS和0.2×SSC，1％SDS洗涤滤膜各5分钟，然后于65℃用0.16×SSC，1％SDS洗涤两次各15分钟，室温下再用2×SSC洗涤1分钟。随后于-70℃将所述滤膜暴露于柯达X-Omat胶片过夜，结果如图1所示，只在雌蕊、花药和浆片的泳道中观察到信号，而其它泳道未显示出信号，从而表明上文分离出的示差克隆在雌蕊、花药和浆片中得到强烈表达，但在其它器官中表达水平很低或极低，估计转录物的大小为1.5kb。

通过用光密度计测量信号密度来测定表达剂量，结果是：如将在雌蕊中的表达定为1，则花药和浆片中的相对表达水平分别约为2和4。

ii)逆转录PCR分析

为了在较高精度下分析cDNA克隆的器官-特异性表达，使用多种水稻器官的RNA作为模板进行逆转录PCR。首先，测定cDNA的部分核苷酸序列，通过使用GENESIS 2000荧光测序仪(杜邦)测定插入质粒pBluescript SK(-)中的cDNA的核苷酸序列，根据测序仪中所附的厂商说明，使用M13的RV和M4引物(Takara Shuzo有限公司)进行T7 DNA聚合酶反应，接着在6％丙烯酰胺凝胶上电泳，然后从5′-(EcoRI)和3′-(XhoI)端同时测定核苷酸序列。

根据此DNA 5′-端的约300个核苷酸，用DNA合成仪(ABI制备)合成适当的引物并通过OPC Cartridge(ABI制备)纯化以用于逆转录PCR实验，所述引物为：

5′-GACACCCGCAAGCGTGA-3′(75RV1：17-聚体)和

5′-CCCTTCACCTCCTTGTA-3′(75FW1：17-聚体)；使用这些引物扩增了101bp的产物。

另外，将根据水稻纤动蛋白1基因的序列(Rac1，McElroy等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，14：163-171，1990)合成的下列引物用作对照：

5′-GTATCCATGAGACTACATACAACT-3′(24-聚体)和

5′-TACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3′(22-聚体)；选择这些引物以使内含子包含在这两个引物之间。因此，希望如果模板DNA被基因组DNA污染，基因组DNA的产物(350bp)会与cDNA的产物(267bp)一起扩增。

连续稀释上述各器官的总RNA(1μg，30ng，1ng，30pg)，65℃处理5分钟以解离二级结构。在冰上淬灭后，于37℃在反应混合物中保温30分钟，所述反应混合物含有1×Perkin Elmer Gene Amp缓冲液、1mM dNTPmix、5ng/μl寡聚dT15引物(Amersham)、2.5mMgCl₂、3U/μl RNA酶抑制剂(RNAguard，Pharmacia)和1U/μl逆转录酶M-MuLV(BRL制备)(每种浓度指的都是终浓度)，接着于95℃处理5分钟以解离RNA-cDNA杂合体，然后在冰上冷却。加入一对引物(10-20pmol)，10×缓冲液和1单位的AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer制备)，使总体积为50μl的反应混合物经受PCR 40个循环，每个循环由94℃1分钟，60℃1分钟和72℃2.5分钟组成。

至于对照实验，把从各个器官制备而来的逆转录产物(即总RNA)PCR作为对照实验，PCR使用的引物是据认为在水稻所有器官中都可组成型表达的Rac1基因的引物。结果从被检测的所有器官中检测到预期的PCR产物(267bp)，这表明所用的模板cDNA制品未被大量基因组DNA污染。正在萌发的种子和根的检出限量(模板RNA的量)分别为0.5μg和1ng，而其它器官中的检出限为30ng。假定Rac1基因在本文检测的所有器官中以相同的水平表达，据估计如将雌蕊中的逆转录PCR效率定为1，则正在萌发的种子和根中的分别约为1/17和约30，而其它器官中的所述效率与雌蕊中的几乎相同。

随后，使用克隆特异性引物进行逆转录PCR实验，使用质粒克隆已初步证实所述引物可扩增预期分子量的产物。当将逆转录自1μg RNA的cDNA用作PCR中的模板时，如图2A所示，从雌蕊、花药、不成熟的种子和内稃、外稃中检测到预期的产物(101bp)，即从其它器官的cDNA中未扩增到PCR产物。对于雌蕊而言，在柱头和子房中皆观察到表达。从检测到PCR产物的每个器官中稀释模板RNA并估计表达水平，结果，在雌蕊(柱头和子房)和花药中，由最少量的模板(30pg)扩增了PCR产物，与之相比，在内稃和外稃，和不成熟的种子中分别由30ng或更多模板，和1μg模板扩增了PCR产物(图2B)。

因此，当将雌蕊(柱头和子房)中的表达水平取为1时，据估计花药中的表达水平约为1，而经计算内稃和外稃，和不成熟的种子中的表达水平分别为10-3和3×10-5。也就是说，在除花器以外的器官中，此基因仅以极低的水平表达。表1简述了逆转录PCR和Northern分析的结果。

表1：由Northern分析和逆转录PCR估计RPC175在多种器官中的相对表达剂量(将柱头或雌蕊中的剂量取为1)

器官雌蕊(柱头子房) 花药浆片叶

Northern分析 1 (NT NT) 2 4 0

RT-PCR 1 (1 ≤1) 1 NT 0

器官根根(土壤) 萌发中的愈伤组

种子织

Northern分析 0 NT 0 0

RT-PCR 0 0 0 0

器官内稃和外稃不成熟的种子

Northern分析 0 0

RT-PCR 10-3 3×10-5

NT：未分析。

(5)基因组Southern杂交分析

播种1个月后，从稻田水稻植物品种“Tsukinohikari”和“IR24”中分离基因组DNA，并通过苯酚SDS法(Komari等，Theor.Appl.Genet，77，547-552，1989)纯化。用限制性酶BamHI，EcoRI，HindIII，PstI，SalI和XhoI(Takara Shuzo有限公司)消化约5μg DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上分级分离DNA片段。将DNA印迹到尼龙滤膜HybondN+(Amersham)上之后，使用上述0.8kb的cDNA片段进行基因组Southern杂交，所述cDNA片断类似于上述(4)i)被RI标记。

根据滤膜中所附的厂商说明实现杂交和随后的洗涤，结果，尽管进行杂交的条件不允许任何杂交发生(除非基因组DNA与探针具有高度同源性)，但除了一或两条亮带外，还观察到几条弱带(图3)。也就是说，例如，当用EcoRI消化时，检测到1个强信号(2.6kb)和3个1.6kb的弱信号。据认为这种弱带可能与探针具有较短的同源性区域，或不可能与探针具有高的同源性，这些结果表明克隆的基因可能具有很少的水稻基因组相关序列。

(6)全长cDNA分离

使用0.8kb的cDNA克隆作为探针筛选雌蕊的cDNA文库[实施例1(2)]，以与实施例1(3)相同的方式，将约1.6×105pfu含有雌蕊cDNA的噬菌体平铺在8个方形平皿上，并制备影印滤膜。将这些滤膜与使用Multiprime标记系统(Amersham)经RI-标记的上述cDNA(0.8kb)杂交，结果，通过初次筛选得到40个阳性噬斑，在这些噬斑中，对20个进行体内切割，并从噬菌体DNA中切下含有克隆cDNA的质粒。

随后，用EcoRI消化这些质粒并切下cDNA克隆。当将这些克隆互相比较时，最长的(3个克隆)大小约为1.25kb，从中选择1个典型的克隆，测定其3’-端约300个bp的核苷酸序列，当与“Akihikari”用作探针的0.8kb克隆的相应区域比较时，这些克隆包括其3′非翻译区的核苷酸序列互相之间几乎完全符合。

为了详细检查得到的克隆(1.25kb)和克隆(0.8kb)是否来源于相同的基因，可根据上文测定的核苷酸序列合成下列的一对引物：

5′-GACATCATGTCGGCGTCTGCG-3′(175RV1；21-聚体)和

5′-GCCATGACCATGCATACATATGG-3′(175FW1；23-聚体)。然后按照与实施例1(4)ii)中所用的相同的方式对所有水稻器官进行逆转录PCR，不同的是只进行30个循环，所得结果与0.8kb的克隆所得结果相同。

由此说明本发明的基因几乎只在雌蕊、花药和浆片中表达，所述基因在内稃、外稃和不成熟的种子中的表达水平只是在雌蕊、花药和浆片中的表达水平的约1/1,000倍，而在其它器官中未观察到可测的表达水平。这些事实说明选定的1.25kb的cDNA克隆与通过示差筛选分离的0.8kb的cDNA具有相同的来源，因此，在随后分离基因组克隆时可将此cDNA克隆用作探针，此1.25kb的cDNA克隆即为“RPC175”。

(7)RPC175核苷酸序列测定

按下列方法，使用荧光测序仪(373A型，Applied Biosystems)测定在花器中特异性表达的cDNA克隆RPC175(约1.25kb)的完整核苷酸序列。使用位于质粒载体pBluescript SK(-)上的M13引物RV(cDNA的5′-端，解码有义链)和M4(cDNA的3′-端，解码反义链)，所述质粒携有整合于其上的RPC175，首先测定5′-和3′-端的约250-300bp的核苷酸序列。

根据所得的核苷酸序列资料，构建内部的引物并从两端解码有义链和反义链的核苷酸序列，接着，根据如此解码得到的部分核苷酸序列合成另外的引物，连串地解码有义链和反义链的核苷酸序列。因此，包括逆转录PCR中所用的引物在内共使用了9个内部引物(有义链4个，反义链5个)。另一方面，通过限制性分析已知RPC175具有两个ApaI位点，因此，RPC175在这些位点被裂解为3个片段并被亚克隆到质粒载体pBluescript SK(-)的相同位点，然后通过M13引物测定核苷酸序列。

因此通过使用内部引物和亚克隆可测定RPC175完整的核苷酸序列。接着，使用分析核苷酸序列/氨基酸序列用的软件GENETYX-MAC8.0分析所测定的核苷酸序列，结果发现RPC175完整的核苷酸序列由1258bp组成，并在5′-端的相同阅读框中具有被36bp的序列分隔开的2个起始密码子(ATG)，上游的ATG紧接于能形成茎环的序列之后。

通过ORF分析测定的阅读框能够估计氨基酸，因此，据测定当翻译从上游的ATG起始时，编码了340个氨基酸，而当翻译从下游的ATG起始时，编码了328个氨基酸。两个polyA信号(5′-AATAAA-3′)位于终止密码子的下游，RPC175完整的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。应理解最靠前的60bp区域起源于下文将要描述的基因组克隆，SEQ ID NO：1包括从转录起始点至polyA的所有核苷酸。

由RPC175编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3，很有可能在两个ATG中，下游的ATG是转录起始点，这一点将在下文中描述，因此，SEQ ID NO：3给出了从下游ATG至终止密码子共由328个氨基酸组成的氨基酸序列。在SEQID NO：3所示的氨基酸序列中，据估计由第1-20位氨基酸组成的序列是前导序列，而前导序列之后的序列是成熟蛋白质的氨基酸序列，这一点将在下之中阐明。

通过软件GENETYX-MAC/CD 32和用于测定核苷酸序列的互联网程序BLAST进行同源性分析，结果发现，RPC175与水稻，小麦，大麦，玉米，马铃薯和番茄的I类壳多糖酶同源，即在除可变区(SEQ ID NO：3中第62-83位氨基酸)以外的整个区域内显示出同源性，包括具有连串疏水氨基酸的前导序列(第1-20位)，富含半胱氨酸的壳多糖结合区(第21-61位)和催化区(第84-328位)。催化区含有NYNYG中的第一个酪氨酸残基(SEQ ID NO：3中第198-202位氨基酸中第199位的Y)，该残基在大量碱性壳多糖酶中是保守的，据认为是活性位点。据观察C-末端特征性的连串氨基酸(SEQ ID NO：3中第318-328位的氨基酸)与其它水稻壳多糖酶不同。RPC175与多种水稻I类壳多糖酶在核酸水平上显示出约67-69％的同源性，在氨基酸水平上显示出约54-61％的同源性。

经计算成熟蛋白质(SEQ ID NO：3中第21-328位氨基酸)的分子量和等电点分别约为32KD和7.24。

实施例2：分离启动子

(1)构建基因组文库

播种后2个月通过SDS-苯酚法从水稻叶中分离基因组DNA，并通过氯化锂沉淀法纯化以除去RNA。作为预备试验，首先用限制性酶MboI(TakaraShuzo有限公司)部分消化DNA以测定允许表观大小为16-23kb的片段形成的消化条件，接着，在如此测定的反应条件下消化基因组DNA并进行蔗糖密度梯度离心。将蔗糖溶解于缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，200mM NaCl)中，给出5个浓度(10，17.5，25，32.5和40％)的梯度，这些蔗糖溶液在离心管(40PA，Hitachi)中按此次序分层，最后，部分消化的DNA溶液分层于梯度的顶端。20℃下，使用SRP28 SA转头(Hitachi)，于20,000rpm离心17小时后，用压缩泵(AC-2110，Atto制造)将混合物分成80份(每份0.5ml)以提供含有最大量的16-23kb DNA片段的组分。

然后通过T4 DNA连接酶(BOEHRINGER MENNHEIM)的作用使此DNA组分与载体LAMBDA DASH II/BamH(STRATAGENE)连接，再使用GigapackII Gold包装提取物(STRATAGENE)将连接后的载体包装到噬菌体颗粒中。从而构建了水稻基因组文库，经计算该文库的大小约为5×106pfu。

(2)筛选克隆

将约10,000pfu的噬菌体与E.coli SRBP2混合以感染之，并接种于方形平皿(14×10cm)中，39℃温育过夜后，使尼龙滤膜Hybond N+(Amersham)与噬斑表面接触，然后根据滤膜中所附的厂商说明进行操作。探针是水稻花器特异性cDNA(RPC175)的1.2kb EcoRI片段，使用Multiprime标记系统(Amersham)RI-标记该片段后才能用。如此完成噬斑杂交，按与上文实施例1(3)中特定的那些相同的条件进行杂交和洗涤，不同之处在于不使用1×Denhardt’s溶液和载体DNA。初次筛选从约160,000个噬斑中选出了35个阳性克隆，随后，进行二次筛选得到12个阳性克隆。

接着，从这些噬斑中制备噬菌体DNA，将它们用作PCR中的模板，所述PCR使用的引物是前述逆转录PCR中的RPC175-特异性引物175FW1和175RV1。由使用基因特异性引物的PCR实验筛选靶克隆，结果发现在12个克隆中的8个中扩增了约200bp的预期产物，使用另一套引物(75FW1和75RV1)对其中的5个克隆进一步地进行PCR，结果在每种情况下都扩增了比使用cDNA为模板扩增得到的产物长约90bp的产物。

随后，在2个位点测定这5个克隆的PCR产物的核苷酸序列(共约400bp)，当与对照cDNA的核苷酸序列相比时，除内含子序列外，这5个基因组克隆都显示出99％或以上的同源性。根据这些事实，可以推断：这些克隆最可能代表作为此次筛选的靶基因组克隆。

使用75FW1和75RV1得到的产物具有85bp的内含子，在其两端具有5′-GT-AG-3′序列。因此，当将基因组克隆的DNA用作模板时，扩增了比使用cDNA为模板扩增的PCR产物长的产物，此内含子在3′-端具有PstI位点。

(3)亚克隆基因区

用限制性酶EcoRI消化水稻的总基因组DNA，使用RPC175基因为探针进行基因组Southern分析，结果在约1.6kb处出现一弱信号带，另外在约2.6kb处出现一强信号带(图3)。另一方面，从上述5个克隆中提取噬菌体DNA，用EcoRI消化，然后使用RPC175为探针进行Southern杂交，结果发现与RPC175形成杂交的DNA片段局限于2.6kb和1.6kb的片断，这与对基因组DNA的Southern分析结果一致。从核苷酸序列资料中已知在RPC175 3′-末端上游约70bp处具有独特的EcoRI位点，因此，能检测到弱信号的1.6kb片断得归因于用作探针的RPC175 cDNA的3′-区域中从EcoRI至polyA位点这一短区域与基因组DNA片段之间的同源性。

由基因组Southern分析中的信号强度预期：2.6kb的EcoRI片断会包括完整的结构基因区域及其至少约1kb的上游，除非它含有大的内含子。因此，将此片断亚克隆至质粒载体Bluescript SK(-)中，并称之为“RPG102”。为了进一步地分析，用限制性酶PstI消化RPC102并在琼脂糖凝胶上电泳，从而将RPC102分成4个片断，分别约为1.2，0.8，0.4和0.2kb。

接着，将这些DNA片段转移到滤膜上，使用RPC175为探针进行Southern分析。结果在4个片断中的3个中检测列信号(约0.8，0.45和0.1kb)。从核苷酸序列资料中已知在RPC175 5’-末端下游约45bp处具有一个PstI位点，在其下游约120bp处具有另一个PstI位点，因此，由Southern分析检测到的大小为0.1kb的带可归因于此区域。还已知另一个PstI位点位于3’-末端EcoRI位点上游约50bp处，另外，使用限制性酶的分析表明5’-端第二个PstI位点与3”-端PstI位点之间的距离约为0.95kb。因此，假定RPG102除含有上述85bp的内含子外，还含有约200bp的内含子，1.25kb的片断在85bp内含子的PstI位点处被切割成0.8kb和0.45kb的片断。

根据这些事实，可以认为由Southern分析检测到的3条带对应于结构基因区域，启动子区域被包含在1.2kbp的PstI片断中，该片断不与RPC175的cDNA形成分子杂合体。

(4)鉴定启动子区域

通过分析RPC175 cDNA 5′-端的核苷酸序列，阐明了在RPC175此区域的相同阅读框中含有两个ATG。

合成含有下游ATG的引物：

5′-CTTCATGGCCACCTGCAGGTTTGC-3′(C5FW；24-聚体)，并测定RPG102启动子区域3’-端约300bp的核苷酸序列。

为了确保由引物延伸法测定转录起始点，合成了C5F上游约40bp的另一个引物：

5′-TGCGATCATGGCAAGATGC-3′(p3FW2；19-聚体)。

根据MEGARABEL试剂盒(Takara Shuzo有限公司)中所附的说明，通过使用[γ-32P]ATP磷酸化在5′-末端把这些引物(各10pmol)进行RI标记。在3U/μlRNA酶抑制剂(RNAguard，pharmacia)存在下，于40℃，在10μl反应系统的缓冲液(0.25M KCl，2mM Tris-HCl pH8.0，0.2mM EDTA)中将0.1pmol(0.3×106cpm)经标记的引物和20μg雌蕊或叶的总RNA退火2小时。加入30μl另一种缓冲液(66mM Tris-HCl pH8.3，6.6mM MgCl₂，1.3mMDTT，0.66mM dNTP，130μg/ml放线菌素D)和1μl(200单位)逆转录酶(M-MuLV，BRL制备)，然后于37℃将混合物保温1小时，加入乙醇和醋酸铵以使沉淀出现，用70％乙醇洗涤沉淀物之后，风干产物，溶解于电泳缓冲液中，将T7测序试剂盒(Pharmacia)中的反应终止溶液与0.1M NaOH和1mMEDTA(2∶1)混合可以制备这种电泳缓冲液。于95℃将此溶液的1/3加热3分钟，然后在6％丙烯酰胺凝胶上电泳。使用相同的引物，把含有RPR102的质粒作为模板，以T7测序试剂盒进行延伸反应，将所得的产物同时电泳。

结果示于图4，从基因未得到表达的叶RNA中没有得到延伸产物，而使用雌蕊总RNA为模板可检测到2条带(引物为C5FW的情况下)和3条带(引物为P3FW2的情况下)的延伸产物。一起产生的序列梯的比较结果表明在RPG102序列的相同位置处检测到两个引物的产物。

这些结果表明RPG102的转录从几个碱基间隔中存在的3个位置处的A(腺嘌呤)起始。发现TATA盒样序列5’-TATATAA-3’位于从5’-端起第一个转录起始点(腺嘌呤)上游30bp处。TATA盒-样序列的位置与其它植物的基因一致(Joshi，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，15：6643-6653，1987)，另外，如上所述，相同阅读框中两个彼此间隔为36bp的ATG翻译起始密码子位于此转录起始点下游77bp和113bp处(图5)。

(5)测定RPG102完整的核苷酸序列

用实施例2(3)中的PstI消化RPG102形成片段，将其中的1.2，0.8和0.45kb片段亚克隆至pBluescript的相同位点，使用缺失试剂盒kilo-sequencefor(Takara Shuzo有限公司)由上述片段中含有启动子序列的PstI 1.2kb片段的两条链制备逐步缺失100-200bp的缺失克隆(共20个克隆)，并用荧光测序仪(373A型，APPlied Biosystems)，使用M13引物(Takara Shuzo有限公司)测定核苷酸序列。考虑到含有结构基因的0.8kb和0.45kb的片段，使用M13引物(Takara Shuzo有限公司)和上文实施例1(7)中所述的内部引物测定核苷酸序列。另外，使用M13引物和内部引物测定RPG102本身3’区域的核苷酸序列，因而最终阐明了RPG102完整的核苷酸序列。

结果发现RPG102克隆完整的核苷酸序列由2,636bp组成，当与cDNA克隆RPC175的核苷酸序列比较时，在结构基因区域含有两个内含子(85bp和199bp)。这两个内含子两端的核苷酸序列5’GT和AG3’是保守的，基因组克隆RPG102除这些内含子以外的区域的核苷酸序列与cDNA克隆RPC175完全一致。polyA信号样序列5’-AATAAA-3’(Heidecker和Messing，Annu.Rev.PlantPhysiol.，37：439-466，1986)位于3’端EcoRI位点上游约90bp处和翻译终止密码子TAG下游约40bp处。

RPG102完整的核苷酸序列示于SEQ ID NO：2，其中括号中的序列是内含子。图6显示出RPG102和RPC175限制性图谱的比较。

实施例3：分析启动子表达位点

(1)构建载体以分析启动子表达并转化水稻

为了在体内分析分离的启动子的表达，以下列方式构建连接有GUS(β-葡糖醛酸酶)报道基因的载体。如上所述，在最上游转录起始点的下游77bp和113bp处的相同阅读框中含有两个ATG。由于通过实验难以确定哪一个ATG是实际的翻译起始点，因此为这两个ATG都构建了用于分析启动子表达的载体。

SnaBI位点位于上游ATG(第一个ATG)上游64bp处，即最上游转录起始点下游13bp处，而PstI位点位于下游ATG(第二个ATG)的上游12bp处(指SEQID NO：1和2)。这些位点可用于由质粒构建载体，在载体中如在核苷酸序列分析这一步中构建的一样，含有RPC175启动子区域的1.2kb PstI片段已整合到pBluescript的PstI位点上。在分析第一个ATG所用启动子的情况下，用限制性酶PstI和SnaBI消化此质粒，从而切下启动子片段(约1.1kb)，然后用DNA平端化试剂盒(Takara Shuzo有限公司)使其两端平端化。在分析第二个ATG所用启动子的情况下，在pBluescript的除PstI位点以外的限制性位点HindIII和XbaI处消化片段，从而切下启动子片段(约1.2kb)。

此实施例中所用载体是农杆菌属所用的超级二元载体pSB24(Komari等，植物学杂志(Plant J.)，10：165-174，1996)，此载体含有GUS结构基因，所述基因在CaMV35S启动子的下游依次含有castor bean过氧化氢酶的第一个内含子以使表达水平能被内含子提高。用HindIII和XbaI消化此载体，从中除去35S启动子，然后使载体粘端平端化(用于分析第一个ATG)或不平端化(用于分析第二个ATG)，并分别与平端的PstI-SnaBI片段(1.1kb)或HindIII-XbaI片段(1.2kb)连接，从而得到各具有RPC175启动子+IGUS+NOS终止子结构的载体pYOT175IG-1和pYOT175IG-2。为了检查组织特异性可能由内含子引起的任何可能性，构建了未带内含子的另外一个载体，尤其是在用于分析第二个ATG的启动子情况下更应如此。为了此目的，使用了无内含子的超级二元载体pSB21(Komari等，植物学杂志(Plant J.)，10：165-174，1996)，用HindIII和XbaI消化此质粒，从中除去35S启动子，然后将它与上述约1.2kb的HindIII-XbaI片段连接，从而得到具有RPC175启动子+GUS+NOS终止子结构的载体pYOT175G-2。图7表示构建这3个载体以用于表达分析的方法。至于这些载体中的pYOT175IG-1和pYOT175IG-2，当RPC175的翻译从经转化的水稻细胞的上游ATG起始时，分别发生-1型和+1型移码，因此GUS蛋白不会被翻译。

通过三亲交配将如此构建的每个载体从大肠杆菌中转移到根瘤农杆菌中，然后根据Hiei等人的方法(植物学杂志，6：271-282，1994)，借助于农杆菌将这些构建体与潮霉素抗性基因一起平行导入由不成熟的水稻胚(“Tsukinohikari”)发育而来的愈伤组织中，通过PCR证实基因的转移，在温室中培养转化体。

(2)利用GUS的组织学观察结果分析启动子的表达位点

根据Jefferson等人的方法(EMBO J.，6：3901-3907，1987)，使用X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖醛酸)为底物，染色水稻转化体多种器官中的GUS以在立体显微镜和光学显微镜下组织学观察细胞，结果，在插入内含子的构建体(即pYOT175IG-1和pYOT175IG-2)的情况下，在大多数转化体的雌蕊，柱头，花药，花丝和浆片中现察到由RPC175启动子启动的GUS表达。在有些植物中，在内稃和外稃、叶或根中观察到GUS的表达(图8)。

至于无内含子的构建体(pYOT175G-2)，尽管通过PCR和Southern分析证实了基因转移，但在相当比例植物个体的每个被检查器官中未观察到GUS的表达。在有些个体中观察到不规则形式的表达，另外，表达的器官特异性与插入内含子的构建体的情况相当一致(图8)，因此，证实了内含子的存在实际上不会改变组织特异性。

在pYOT175IG-1和pYOT175IG-2中观察到GUS表达的事实有力地阐明第二个ATG是RPC175基因的翻译起始点。

至少在一些组织中显示出GUS表达的转化体中，对于pYOT175IG-1而言，在雌蕊、花药、花丝和浆片中都显示出GUS表达的转化体的比例为81％，对于pYOT175IG-2而言，所述比例为94％，对于pYOT175G-2而言，所述比例为25％。对于每个构建体而言，约50％转化体在内稃、外稃、叶和根中未显示出表达，因此与Northern分析和RT-PCR分析的结果一致。在图8中，纵坐标指的是在特定器官中显示出表达的转化体数目。

在雌蕊的柱头中轴线和分枝点中观察到GUS表达，即GUS基因未在毛状柱头顶端的细胞中表达(图9A)，另一方面，在子房中也未观察到GUS表达。在雄蕊中，除花药外，在花丝中也观察到高频率的GUS表达(图9B)，另外，在浆片的维管束组织和周围的细胞中GUS(图9C)也有高度表达。

接着，检查花器多个发育阶段表达的时间特异性，结果在抽穗和开花期的雌蕊中观察到最强的表达。在最后两片叶的叶耳之间的距离为-5-5cm的生长阶段，含有构建体的转化体的雌蕊显示出GUS表达，所述构建体携有插入的内含子。与之相反，含无内含子构建体的转化体未显示GUS表达，这些结果表明RPC175启动子在开花期的雌蕊中表达较强，而在柱头顶端毛状组织分化期的雌蕊中表达较弱。

尽管仍不知道为什么在叶、根或内稃、外稃中观察到表达，但其中整合了T-DNA的水稻基因组位点的位置效应或导入基因的重排可能会引起这些结果。

(3)由GUS荧光测定法测定启动子活性

从pYOT175IG-1和pYOT175G-2中各选择一个系以使通过组织学观察转化世代中的GUS测定的启动子表达位点与Northern分析和RT-PCR的结果较一致。然后，利用MUG(4-甲基形基β-葡糖醛酸)为底物，通过荧光分析法检查下一世代(R1世代)中的GUS表达。从1个非转化体植株，pYOT175IG-1系的1个R1植株和pYOT175G-2系的4个R1植株中收集叶、根、雌蕊、花药(+花丝)、浆片和内稃、外稃，然后从每个植株中提取蛋白质并测定GUS，结果示于图10，尽管不同植株的活性不同，但转化体叶和根中的GUS活性与非转化体中的差不多(18-210个单位)，而转化体雌蕊、花药和浆片中的GUS活性约为非转化体中的10-1000倍。即分别在雌蕊、浆片和花药中观察到极高的活性486-38829单位，1044-14496单位和1808-203190单位/mg蛋白质[本文中的1个单位指的是1分钟内由MUG产生1pmol 4-MU(4-甲基繖形基)的活性]。在内稃和外稃中，观察到为非转化体中的1-10倍的活性(64-650单位)，这些事实表明175启动子的花器特异性表达稳定地维持于转化体的后代中。

因此，通过分析转化世代和下一世代中的GUS证实了此启动子是在花器中特异性表达的启动子。

实施例4：测定175蛋白的壳多糖酶活性

(1)在E.coli中表达由RPC175编码的蛋白质

为了检查由RPC175编码的类壳多糖酶蛋白质是否确实具有壳多糖酶活性，首先使用QIA表达系统(QIAGEN)在E.coli中表达175蛋白。

I)构建表达载体

将pQE30用作表达载体，在此载体中，6个组氨酸残基位于多克隆位点的上游，因此，使用此载体可将蛋白质表达成N-末端具有组氨酸标记的融合蛋白。

图11表示构建方法，RPC175编码类壳多糖酶蛋白质。通过与其它壳多糖酶的结构比较，可以认为RPC175在N-末端具有由20个氨基酸组成的前导序列。在基因构建中，除去了此前导序列。首先，用PstI消化RPC175以制备约1kb的片断，该片断几乎含有成熟蛋白质所有的区域，只是不含N-末端区域的一部分。分开合成下列两个引物：

175mat5Bm 5′-GCGGGATCCGAGCAGTGCGGCAGGCAG-3′；

C5FW2 5′-TTGCAGTAGTCGTCGGTGAG-3′；进行PCR以扩增N-末端其余的部分。用BamHI和PstI消化扩增产物并亚克隆至pBSII中。确定了核苷酸序列之后，用PstI消化此质粒并用CIP处理。在此质粒中插入上述1kb的PstI片断以构建含有RPC175成熟蛋白质完整区域的质粒。接着，用BamHI和HindIII消化此质粒并克隆至已被相同酶消化的载体pQE30中。确定核苷酸序列之后，使用所得的载体(即pQE30-175ΔN)以在E.coli中表达。

ii)在E.coli中表达和纯化蛋白质

制备E.coli M15感受态细胞并用上文构建的表达载体转化，从转化子菌落中提取质粒并证实表达载体的导入。随后，培养E.coli细胞并根据试剂盒中所附的方法用IPTG诱导细胞，简而言之，在50ml含有氨苄青霉素和卡那霉素的2XYT液体培养基中加入1/50培养过夜的E.coli细胞悬浮液等分试样，培养2.5小时后，确证600nm(A₆₀₀)的吸光度约达到0.5，然后加入2-4mMIPTG，再连续培养4.5小时，另外包括两种对照培养物，一种未经IPTG-诱导，另一种涉及仅用载体(pQE30)转化E.coli。离心收集每种培养物的细胞并储存于-80℃，分别根据厂商提供的方法进行粗蛋白的提取及用Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN制备)纯化所述蛋白质。根据Laemmli的方法(自然(Nature)，227：680-685，1970)在12.5-15％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳粗蛋白和纯化蛋白质，然后用考马斯亮蓝(CBB)R250染色。结果在任何培养物的可溶性蛋白质组分中未观察到看上去象是由RPC175编码的蛋白质带，与之形成对照的是，只在经诱导处理的含有pQE30-175ΔN的培养物的不溶性组分中观察到比预期大小(即33KD)稍大一些的带。因此，由RPC175编码的蛋白质几乎是不溶性的，为了使此蛋白质溶解，必需在缓冲液中加入8M的尿素。然而，不溶性蛋白质表达的量相当大，可以在Ni-NTA琼脂糖上纯化。图12表示由以50ml规模培养的细胞纯化的全部175蛋白的1/2的电泳结果。随后，为了提供用于产生抗体的样品，以250ml规模培养E.coli，在与上述相同的条件下提取并纯化不溶性的175蛋白，然后从聚丙烯酰胺凝胶上切下被表达的蛋白质带，用剪刀将切下的聚丙烯酰胺凝胶带进一步地剪成碎片，然后转移到Eppendof管中在匀浆器中磨碎。加入10倍体积的缓冲液(20mM Tris pH8.0，1％SDS)之后，室温下将混合物振荡1个或2个晚上以从丙烯酰胺凝胶中洗脱蛋白质。离心除去凝胶后，在透析管Spectra/Porl MWC0：6-8,000(Spectrum Medical Industries)使上清液对80％丙酮透析过夜，接着，从透析管中回收蛋白质溶液并干燥。

将蛋白质样品悬浮于1×SDS样品缓冲液(Maniatis等，1982)中，95℃处理5分钟，接着，在15％聚丙烯酰胺凝胶上电泳蛋白质，为了确证从切下的凝胶中回收的蛋白质就是所需的蛋白质，可使用Ni-NTA HRP缀合物(QIAGEN)作为抗体进行Western印迹。另一方面，用CBB染色电泳后的凝胶，通过与已知浓度的标记物(预染色的SDS-PAGE低范围标准，BIORAD)比较估计蛋白质的浓度。

iii)抗体的产生

抗体的产生由Sawady技术有限公司进行，当由ELISA测定时，兔抗体的滴度为23,600。使用HRP为第二抗体进行的Western分析结果表明，此抗体以高敏感性与样品蛋白质反应。

iv)RPC175编码蛋白质的增溶

如上所述，当在E.coli中表达时，由RPC175编码的蛋白质几乎(99％或以上)是不溶性的。另一方面，当使用上述抗体对可溶性组分进行Western印迹时，尽管量很小但可以检测到175蛋白。另外，还发现所含的痕量蛋白质可以在Ni-NTA琼脂糖上纯化。一般而言，当在E.coli中表达外源蛋白质时，由于表达的快速诱导，蛋白质经常不能采取正确的折叠结构，而是形成包含体，通过使用较温和的诱导体积可以避免这一现象。因此，为了得到大量可溶形式的175蛋白，有关作为诱导条件主要因素的IPTG浓度和培养温度可进行下列实验，即在3个条件(37℃用2mM IPTG；25℃用0.5mM IPTG；15℃用0.1mM IPTG)下进行诱导。于37℃和25℃连续培养4.5小时，15℃培养18小时。在上述特定的条件下培养之后，细胞在37℃，25℃和15℃分别显示出1.04，0.89和0.85的浊度(A₆₀₀)。离心收集在这些条件下表达蛋白质的E.coli细胞(于50ml液体培养基中)并储存于-80℃中。根据QIAGEN的指示，使用无尿素的缓冲溶液从这些细胞中提取蛋白质，使用Ni-NTA琼脂糖纯化携有HIS标记的175蛋白，最后，用300μl含有10mM Tris的0.1M磷酸盐缓冲液(pH4.5)从Ni-NTA琼脂糖中洗脱175蛋白。在SDS-PAGE上电泳洗脱物(10μl)，接着使用上述抗175蛋白的抗体进行Western分析。由于预期样品中的175蛋白仅为痕量，故在Western印迹中使用ECL+plus系统(Amersham)。加入浓度各为1/10,000的第一和第二抗体，与印迹有分级分离的蛋白质的ECL硝酸纤维素膜各反应1小时，将与底物的反应持续5分钟，将X-射线胶片暴露于光中2-20分钟。结果如图13所示，当IPTG浓度和E.coli的培养温度降低时，纯化的可溶性的175蛋白带的密度有所增加，将这些带的密度与在相同凝胶上电泳的已知浓度的上述175蛋白(将10ng为产生抗体而制备的不溶性组分溶解在8M尿素中制备得到)的带进行比较。结果，按培养条件温和程度的次序，得到的可溶性175蛋白的量为97.6ng，12.4ng和2.1ng。同时用Bio-Rad蛋白质测定法(BIORAD)定量从Ni-NTA琼脂糖凝胶中洗脱的全部蛋白质的10μl等分试样，结果蛋白质含量分别为38μg，24μg和34μg，因此，将175蛋白占洗脱下来的全部蛋白质的比例分别计算为2.57％，0.52％和0.06％，这些结果暗示：降低IPTG浓度和培养温度可增加可溶性175蛋白的比例。

(2)测定E.coli壳多糖酶的活性

通过将由胶态壳多糖溶解的糖类确定为底物的Reissig法测定壳多糖酶活性。按下列方式制备胶态壳多糖。将2g壳多糖粉末逐渐溶解于100ml冷的浓盐酸中，同时升高温度，然后通过G-3玻璃滤器过滤，将滤出液缓慢加入10倍体积的无菌水中，4℃下静置过夜以重新沉淀壳多糖。除去上清液后，将沉淀物重新悬浮于无菌水中，于6000g离心10分钟。重复洗涤直至上清液的pH变为中性，最后将沉淀物悬浮于150ml无菌水中以得到胶态的壳多糖溶液。

按下列方法测定壳多糖酶活性：将100μl酶溶液等分试样与100μl胶态壳多糖溶液混合，37℃保温2小时。于6000rpm离心5分钟后，收集150μl上清液。至于对照试验，于37℃只将相同的酶溶液保温2小时，然后在离心前立即加入胶态壳多糖。在每种上清液中加入15μl 1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)以调节pH值，随后加入10μl 3％解旋酶(SIGMA)，于37℃将混合物保温1小时以水解壳多糖寡聚体，接着加入30μl 0.8M的硼酸钾-KOH(pH10.2)并将混合物煮沸3分钟，同时煮沸溶解于上述检测试剂中的25、50和100nmol N-乙酰葡糖胺(GlcNAC，SIGMA)以提供标准曲线。煮沸过后，立即将混合物置于冰上冷却，接着加入1ml对-二甲氨基苯甲醛(DMAB，Wako Pure Industries，Inc.)溶液，通过将1g DMAB溶解于100ml含有1％盐酸的醋酸中可制备该溶液，37℃保温20分钟后，测定吸光度(A₅₈₅)，由标准曲线计算GlcNAc的量。将1个单位定义为1分钟内导致相当于1μmol N-乙酰葡糖胺的糖类溶解的酶活性。

通过此检测系统，测定了由在上述3个诱导表达条件下培养的E.coli细胞产生的携有HIS标记的纯化的175蛋白的壳多糖酶活性。另外，提取、纯化并测定两种对照培养物[即一个仅具有含载体(pQE30)的E.coli，另一个未经IPTG诱导]的蛋白质。结果在培养温度为15℃、IPTG浓度为0.1mM时对pQE30-175ΔN进行表达诱导的试验中检测到了表观壳多糖酶活性，此培养物中的酶活性为1.9mU/mg，为对照培养物中的(0-5.1mU/mg蛋白质)3-4倍。然而，应理解此活性是根据由Ni-NTA琼脂糖洗脱的全部蛋白质而得的。如上所述，175蛋白相当于洗脱下来的蛋白质的约2.57％，因此，据估计175蛋白的酶活性至少为几十mU/mg蛋白质。在培养温度为25℃的一批试验中，与对照试验相比，仅检测到极少的壳多糖酶活性。然而，在培养温度为37℃的一批试验中未检测到活性，这可能是由于用于此试验的175蛋白浓度较低的缘故。

根据这些结果，已阐明由RPC175编码的壳多糖酶类蛋白质实际上具有壳多糖酶活性。

表2：由RPC175基因编码的蛋白质的壳多糖酶活性

培养温度表达载体 IPTG浓度(mM) 活性(mU/mg蛋白质)

(℃)

15 pQE30 0 0

15 pQE30 0.1 0.50

15 pQE30-175ΔN 0 0.51

15 pQE30-175ΔN 0.1 1.90

25 pQE30 0 0.99

25 pQE30 0.5 1.04

25 pQE30-175ΔN 0 1.48

25 pQE30-175ΔN 0.5 1.62

37 pQE30 0 0.35

37 pQE30 2 0.72

37 pQE30-175ΔN 0 0.62

37 pQE30-175ΔN 2 0.68

本发明的效果

根据本发明，使不仅对花药，还有雌蕊或浆片的植物花器的基因操作成为可能，因此可构建雌性不育的植物和柱头暴露的水稻植株。另外，也可对开花的特性进行生理性调节。本发明进一步地使构建对含有壳多糖的病原体细菌和真菌具有抗性的植物成为可能。

序列表

SEQ ID NO：1

长度：1318

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：cDNA至mRNA

来源

生物体：稻(Oryza satiVa L.)

品系：IR24

组织类型：雌蕊

直接的来源：

文库：(得自雌蕊mRNA的ZAPII cDNA文库

克隆：RPC175

特征

序列

ATCACTCACC AGCTACGTAC ACTCAACCAA CACACCACTG AAAAGCAAGA TTTTGTTGAA 60

GAAATAAGCA TCTTGCCATG ATCGCAGCAA GGGCTGCAAA CCTGCAGGTG GCC ATG 116

Met

1

AAG GCC CTG GCG CTG GCC GTG CTG GCC CTC GCC TAC GCC GCG GCG ACG 164

Lys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Thr

5 10 15

GCG CGC GCC GAG CAG TGC GGC AGG CAG GCC GGC GGC GCC AGG TGC CCC 212

Ala Arg Ala Glu Gln Cys Gly Arg Gln Ala Gly Gly Ala Arg Cys Pro

20 25 30

AAC AGG CTC TGC TGC AGC AGG TGG GGG TGG TGC GGC CTC ACC GAC GAC 260

Asn Arg Leu Cys Cys Ser Arg Trp Gly Trp Cys Gly Leu Thr Asp Asp

35 40 45

TAC TGC AAG GGC GGC TGC CAG AGC CAG TGC CGC GTC TCC CGC GAC GGC 308

Tyr Cys Lys Gly Gly Cys Gln Ser Gln Cys Arg Val Ser Arg Asp Gly

50 55 60 65

GGC GAC GAC GAC GTC GCC GCG GTG CTG CTC ACG GCG CCG GGC GGC GGC 356

Gly Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Leu Leu Thr Ala Pro Gly Gly Gly

70 75 80

CGC GCC GGC GTG GCG TCC GTC GTG ACG TCG GAC CAG TTC GAG CGC ATG 404

Arg Ala Gly Val Ala Ser Val Val Thr Ser Asp Gln Phe Glu Arg Met

85 90 95

CTG CCC CAC CGC GAC GAC GCG GCG TGC CCC GCC CGC GGG TTC TAC GCC 452

Leu Pro His Arg Asp Asp Ala Ala Cys Pro Ala Arg Gly Phe Tyr Ala

100 105 110

TAC CGC GCC TTC GTC GCC GCG GCC GGC GCG TTC CCG GCC TTC GCC GCC 500

Tyr Arg Ala Phe Val Ala Ala Ala Gly Ala Phe Pro Ala Phe Ala Ala

115 120 125

ACG GGC GAC GCC GAC ACC CGC AAG CGT GAG GTC GCC GCG TTC CTG GCC 548

Thr Gly Asp Ala Asp Thr Arg Lys Arg Glu Val Ala Ala Phe Leu Ala

130 135 140 145

CAG ACT TCC CAC GCG ACC TCT GGT GGG CCC TAC TCG TGG GGC TAC TGC 596

Gln Thr Ser His Ala Thr Ser Gly Gly Pro Tyr Ser Trp Gly Tyr Cys

150 155 160

TAC AAG GAG GTG AAG GGC GCG ACG TCA GAC TTC TGC GTG CCG AAC GCG 644

Tyr Lys Glu Val Lys Gly Ala Thr Ser Asp Phe Cys Val Pro Asn Ala

165 170 175

CGC TGG CCG TGC GCG CCC GGC AAG GCG TAC CAC GCC CGC GGA CCC ATG 692

Arg Trp Pro Cys Ala Pro Gly Lys Ala Tyr His Ala Arg Gly Pro Met

180 185 190

CAA ATC GCA TAC AAC TAC AAC TAT GGG GCG GCC GGC GAG GCG ATC GGC 740

Gln Ile Ala Tyr Asn Tyr Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Glu Ala Ile Gly

195 200 205

GCG GAC CTG CTG GGC AAC CCG GAG CTG GTG GCA ACG GAC CCG ACG GTG 788

Ala Asp Leu Leu Gly Asn Pro Glu Leu Val Ala Thr Asp Pro Thr Val

210 215 220 225

GCG TTC AAG ACG GCG CTG TGG CTG TGG ATG ACC GCG CGG TCG CCG AGC 836

Ala Phe Lys Thr Ala Leu Trp Leu Trp Met Thr Ala Arg Ser Pro Ser

230 235 240

CAG CCG TCG CCG CAC GCC GTC GTC ACG GGG CAG TGG ACT CCG ACT CCC 884

Gln Pro Ser Pro His Ala Val Val Thr Gly Gln Trp Thr Pro Thr Pro

245 250 255

GCG GAC AGC GCG GCC GGC CGC GCG CCA GGC TAC GGG CTC ACC ACG AAC 932

Ala Asp Ser Ala Ala Gly Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Leu Thr Thr Asn

260 265 270

ATC CTC ACC GGC GGG CTC CAG TGC GCC GGC GGC AAC GGC GGC GCC GAC 980

Ile Leu Thr Gly Gly Leu Gln Cys Ala Gly Gly Asn Gly Gly Ala Asp

275 280 285

CGG GTC GCG TTC TAC AAG CGC TAC TGC GAC GTG CTC GGC GTC GGC TAC 1028

Arg Val Ala Phe Tyr Lys Arg Tyr Cys Asp Val Leu Gly Val Gly Tyr

290 295 300 305

GGG CCC AAC CTG GAC TGC TTC GGC CAG GCG CCG TTC GAC GGC GAC ATC 1076

Gly Pro Asn Leu Asp Cys Phe Gly Gln Ala Pro Phe Asp Gly Asp Ile

310 315 320

ATG TCG GCG TCT GCG GCG AAG TAG ACGTGTGCGC CGCCGTGCCG GCCCCGATCG 1130

Met Ser Ala Ser Ala Ala Lys

325

ATCGAATAAA ATTGCGTGTG AGTACGCACT TCGCACGGTC GCTCTGCAGC CAGAGTGAGT 1190

GAGTTTGCTT TATGTATTTT TCGGTTTCGG GCGAGGAATT CTTCATGGAT CTGTGAAAGC 1250

CCATATGTAT GCATGGTCAT GGCATGAATA AAGTAGTACT GATCTTCTCG AAAAAAAAAA 1310

AAAAAAAA 1318

SEQ ID NO：2

长度：2636

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

来源

生物体：稻

品系：IR24

组织类型：绿叶

直接的来源：

文库：(得自绿叶基因组DNA的dashII基因组文库

克隆：RPG102

特征

序列

GAATTCATAT CTATCATACA AAGAGATCTA GGTTGCATTT CTTCATATAG ATCCTGTCTC 60

ATCCTGGGTA GTTGTAACGC AAACTTTCCA ACGAATCAAA CCAGAGCACG GCTCGATCTG 120

GCTGATGCAT GTGTGACATC GAATCCCAGG AAACAAAGAC GATCGTTTTC ACTACTGTTC 180

TATCTCTTCA TCTAGTTTAA TTAATGCCCT GTATATTCGA TCGTGCATCC ATGTATCAGT 240

GGGCTCAGTT AAACAAAGCA GACGCAGGCA TGCAGGAGAT GAAAACGAGC AACGCACCCT 300

CGTGCTGCCC GAAAGACAGT GTACTCTCCA CACTGGCATG ACTCATTTCT ACGGGTGAAA 360

ACAGAGCGGA TTCAGACAGA TAATGGTCAT ACCATATCCT AAACCATATT TTTTAAGCGG 420

ATTCAGAGTG GGTGCGGATA GGATACGGAT GCGCATGCGG AGAGGATTAT TTCGGATGTC 480

GGAAATGGTG CGGAATCAGT TCGAAAAAGA TTAAATTTAT CGGATGTTAC ATGTGTATAC 540

AATCAATACA ATATTAAGTT AGCAATGCAA GAAACAATAA TACAATAATC AATAAACGAT 600

CCATCATACT AATTATGTGC TTAAGTGTTA AACAATATGA ATACATGATG TCTATAATAT 660

AAAAATACAG CTACGCAAGT ATGCCATGAG AAGGTGAAAG CCTCAGACTA AGAAATCTAT 720

GCTAATTGAT AAATTAGTAC ATTGGATAGA CCAACTTATG TTATATGCAA TAGATAGAGT 780

GATTACATGT GTTGATAAAT TCGAATTATC CGGCAAACGG CCAATCGGAT AATCCGATAG 840

AAATGTCGGA TAATCTGCAT CCACCGGATT TTAGAGATAC CATATCCTCA TCCGCATCCG 900

CATTATACTA TCCTCATCCG CATTCATATC CGCCGGATTT CTAAAAGCCC ATACCATATC 960

CTCGTTTGGA ACGGATTCGG AGTGGATCGG ATCTATCCGA TCGGTTTTCA CTCCTACTCA 1020

TTTCACACAA GATGAGGCCA TCACCTTGCA TAACCGATTT TACACAAGCT AGATGAGGCC 1080

ATGATCTCCT CTATATAAGA GGCCATGCAG TCTGTGGCTT CATCACTCAC CAGCTACGTA 1140

CACTCAACCA ACACACCACT GAAAAGCAAG ATTTTGTTGA AGAAATAAGC ATCTTGCCAT 1200

GATCGCAGCA AGGGCTGCAA ACCTGCAGGT GGCC ATG AAG GCC CTG GCG CTG GCC 1255

Met Lys Ala Leu Ala Leu Ala

1 5

GTG CTG GCC CTC GCC TAC GCC GCG GCG ACG GCG CGC GCC GAG CAG TGC 1303

Val Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Arg Ala Glu Gln Cys

10 15 20

GGC AGG CAG GCC GGC GGC GCC AGG TGC CCC AAC AGG CTC TGC TGC AGC 1351

Gly Arg Gln Ala Gly Gly Ala Arg Cys Pro Asn Arg Leu Cys Cys Ser

25 30 35

AGG TGG GGG TGG TGC GGC CTC ACC GAC GAC TAC TGC AAG GGC GGC TGC 1399

Arg Trp Gly Trp Cys Gly Leu Thr Asp Asp Tyr Cys Lys Gly Gly Cys

40 45 50 55

CAG AGC CAG TGC CGC GTC TCC CGC GAC GGC GGC GAC GAC GAC GTC GCC 1447

Gln Ser Gln Cys Arg Val Ser Arg Asp Gly Gly Asp Asp Asp Val Ala

60 65 70

GCG GTG CTG CTC ACG GCG CCG GGC GGC GGC CGC GCC GGC GTG GCG TCC 1495

Ala Val Leu Leu Thr Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Gly Val Ala Ser

75 80 85

GTC GTG ACG TCG GAC CAG TTC GAG CGC ATG CTG CCC CAC CGC GAC GAC 1543

Val Val Thr Ser Asp Gln Phe Glu Arg Met Leu Pro His Arg Asp Asp

90 95 100

GCG GCG TGC CCC GCC CGC GGG TTC TAC GCC TAC CGC GCC TTC GTC GCC 1591

Ala Ala Cys Pro Ala Arg Gly Phe Tyr Ala Tyr Arg Ala Phe Val Ala

105 110 115

GCG GCC GGC GCG TTC CCG GCC TTC GCC GCC ACG GGC GAC GCC GAC ACC 1639

Ala Ala Gly Ala Phe Pro Ala Phe Ala Ala Thr Gly Asp Ala Asp Thr

120 125 130 135

CGC AAG CGT GAG GTC GCC GCG TTC CTG GCC CAG ACT TCC CAC GCG ACC 1687

Arg Lys Arg Glu Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Thr Ser His Ala Thr

140 145 150

TCT G[GTAACGTAG TAACGTTTAC TTGTCACGTT GGAACTCACG TGTACGTACA CATGT 1746

Ser

CTTATGCACG AGTGCGCATG TGTCCCTGCA G]GT GGG CCC TAC TCG TGG GGC TAC 1799

Gly Gly Pro Tyr Ser Trp Gly Tyr

155 160

TGC TAC AAG GAG GTG AAG GGC GCG ACG TCA GAC TTC TGC GTG CCG AAC 1847

Cys Tyr Lys Glu Val Lys Gly Ala Thr Ser Asp Phe Cys Val Pro Asn

165 170 175

GCG CGC TGG CCG TGC GCG CCC GGC AAG GCG TAC CAC GCC CGC GGA CCC 1895

Ala Arg Trp Pro Cys Ala Pro Gly Lys Ala Tyr His Ala Arg Gly Pro

180 185 190

ATG CAA ATC GCA TA[GTAAGAGAAC GCAAAGGAGC AAACCAAAAAC GTCCATATAA AT 1951

Met Gln Ile Ala Tyr

195

GAACTTGCAA ACAAAAAATC CACAAAATGG ACGAACACTA GAAAAATCTT AAAATGCAAC 2011

GGGATTTCAT CCGTGAAACG TTCAATTTCG AGACTAGTAC TATTTGGACT GAACAAATGA 2071

CAAACTACTG GAATCTAATT TTCAAATTCA ATTTCAG]C AAC TAC AAC TAT GGG GCG 2127

Asn Tyr Asn Tyr Gly Ala

200

GCC GGC GAG GCG ATC GGC GCG GAC CTG CTG GGC AAC CCG GAG CTG GTG 2175

Ala Gly Glu Ala Ile Gly Ala Asp Leu Leu Gly Asn Pro Glu Leu Val

205 210 215

GCA ACG GAC CCG ACG GTG GCG TTC AAG ACG GCG CTG TGG CTG TGG ATG 2223

Ala Thr Asp Pro Thr Val Ala Phe Lys Thr Ala Leu Trp Leu Trp Met

220 225 230 235

ACC GCG CGG TCG CCG AGC CAG CCG TCG CCG CAC GCC GTC GTC ACG GGG 2271

Thr Ala Arg Ser Pro Ser Gln Pro Ser Pro His Ala Val Val Thr Gly

240 245 250

CAG TGG ACT CCG ACT CCC GCG GAC AGC GCG GCC GGC CGC GCG CCA GGC 2319

Gln Trp Thr Pro Thr Pro Ala Asp Ser Ala Ala Gly Arg Ala Pro Gly

255 260 265

TAC GGG CTC ACC ACG AAC ATC CTC ACC GGC GGG CTC CAG TGC GCC GGC 2367

Tyr Gly Leu Thr Thr Asn Ile Leu Thr Gly Gly Leu Gln Cys Ala Gly

270 275 280

GGC AAC GGC GGC GCC GAC CGG GTC GCG TTC TAC AAG CGC TAC TGC GAC 2415

Gly Asn Gly Gly Ala Asp Arg Val Ala Phe Tyr Lys Arg Tyr Cys Asp

285 290 295

GTG CTC GGC GTC GGC TAC GGG CCC AAC CTG GAC TGC TTC GGC CAG GCG 2463

Val Leu Gly Val Gly Tyr Gly Pro Asn Leu Asp Cys Phe Gly Gln Ala

300 305 310 315

CCG TTC GAC GGC GAC ATC ATG TCG GCG TCT GCG GCG AAG TAG ACGTGTGCG 2514

Pro Phe Asp Gly Asp Ile Met Ser Ala Ser Ala Ala Lys

320 325

CCGCCGTGCC GGCCCCGATC GATCGAATAA AATTGCGTGT GAGTACGCAC TTCGCACGGT 2574

CGCTCTGCAG CCAGAGTGAG TGAGTTTGCT TTATGTATTT TTCGGTTTCG GGCGAGGAAT 2634

TC 2636

SEQ ID NO：3

长度：328

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：

来源

生物体：稻

品系：IR24

组织类型：雌蕊

直接的来源：

文库：(得自雌蕊mRNA的ZAPII cDNA文库

克隆：RPC 175

特征

序列

Met Lys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Ala Arg Ala Glu Gln Cys Gly Arg Gln Ala Gly Gly Ala

20 25 30

Arg Cys Pro Asn Arg Leu Cys Cys Ser Arg Trp Gly Trp Cys Gly

35 40 45

Leu Thr Asp Asp Tyr Cys Lys Gly Gly Cys Gln Ser Gln Cys Arg

50 55 60

Val Ser Arg Asp Gly Gly Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Leu Leu

65 70 75

Thr Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Gly Val Ala Ser Val Val Thr

80 85 90

Ser Asp Gln Phe Glu Arg Met Leu Pro His Arg Asp Asp Ala Ala

95 100 105

Cys Pro Ala Arg Gly Phe Tyr Ala Tyr Arg Ala Phe Val Ala Ala

110 115 120

Ala Gly Ala Phe Pro Ala Phe Ala Ala Thr Gly Asp Ala Asp Thr

125 130 135

Arg Lys Arg Glu Vak Ala Ala Phe Leu Ala Gln Thr Ser His Ala

140 145 150

Thr Ser Gly Gly Pro Tyr Ser Trp Gly Tyr Cys Tyr Lys Glu Val

155 160 165

Lys Gly Ala Thr Ser Asp Phe Cys Val Pro Asn Ala Arg Trp Pro

170 175 180

Cys Ala Pro Gly Lys Ala Tyr His Ala Arg Gly Pro Met Gln Ile

185 190 195

Ala Tyr Asn Tyr Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Glu Ala Ile Gly Ala

200 205 210

Asp Leu Leu Gly Asn Pro Glu Leu Val Ala Thr Asp Pro Thr Val

215 220 225

Ala Phe Lys Thr Ala Leu Trp Leu Trp Met Thr Ala Arg Ser Pro

230 235 240

Ser Gln Pro Ser Pro His Ala Val Val Thr Gly Gln Trp Thr Pro

245 250 255

Thr Pro Ala Asp Ser Ala Ala Gly Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Leu

260 265 270

Thr Thr Asn Ile Leu Thr Gly Gly Leu Gln Cys Ala Gly Gly Asn

275 280 285

Gly Gly Ala Asp Arg Val Ala Phe Tyr Lys Arg Tyr Cys Asp Val

290 295 300

Leu Gly Val Gly Tyr Gly Pro Asn Leu Asp Cys Phe Gly Gln Ala

305 310 315

Pro Phe Asp Gly Asp Ile Met Ser Ala Ser Ala Ala Lys *

320 325

Claims

1.一种DNA片段，该片段具有SEQ ID NO：2中第1-1234位置的序列，或所述序列的具有花器特异性启动子活性的一部分，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸而衍生自所述序列并具有启动子活性的序列。

2.权利要求1所要求的DNA片段，其中所述的SEQ ID NO：2核苷酸序列中第1-1234位置的序列的一部分是来自于转录起始点上游区域的序列。

3.权利要求2所要求的DNA片段，其中所述序列的所述部分含有转录起始点上游区域至少500个核苷酸。

4.一种DNA片段，该片段具有SEQ ID NO：2核苷酸序列中第1-1140位置的序列，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸的衍生自所述序列并具有启动子活性的序列。

5.一种DNA片段，该片段具有SEQ ID NO：2核苷酸序列中第1-1121位置的序列，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸的衍生自所述序列并具有启动子活性的序列。

6.一种DNA片段，该片段具有可杂交的核苷酸序列，或所述序列的一部分，或通过缺失、取代、插入或增加一个或多个核苷酸而衍生自所述序列之一的序列，其中所述可杂交的核苷酸序列在中度严紧条件下能与含有SEQ IDNO：2中第1-1234位所示序列的DNA序列杂交并具有花器特异性的启动子活性。