KR20010012118A - 꽃 기관에서 우세한 유전자발현을 명령하는 신규한 디엔에이 단편 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은, 암술 또는 인피에 있어서 외래유전자를 특이적으로 발현시켜, 유전자공학적으로 조작하는 것을 가능하게 하는 신규의 꽃 기관특이적 프로모터 활성을 갖는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열 및 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 이들의 일부의 서열, 또는 이들의 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA단편 및 상기 염기서열 또는 그 일부를 프로우브로서 사용하여 벼 또는 다른 식물유래의 게놈 라이브러리로부터 얻어지는 서열로부터 특정할 수 있는 꽃 기관특이적 프로모터서열이 제공된다.

Description

꽃 기관에서 우세한 유전자발현을 명령하는 신규한 디엔에이 단편{Novel DNA fragments ordering gene expression predominant in flower organ}

본 발명은, 꽃 기관에 있어서 외래유전자를 특이적으로 발현시키는 성질을 갖는 프로모터에 관하는 것이다.

배경기술

기존의, 꽃 기관에서 발현하는 유전자로서, 꽃밥특이적인 것, 암술특이적인 것 등 몇몇이 보고된 예가 있다. 그중에서 유전자의 프로모터 서열까지 분명히 보고되어 있는 예는 그 수가 적다. 쌍자옆 식물에 있어서는, 예컨대 Mariani 등의 문헌(Mariani 등. Nature, 347, 737~741, 1990)에는, 담배의 꽃밥의 융단조직(tapeta)세포 특이적 유전자 TA29의 프로모터의 발현부위 분석이 보고되어 있다. 또한 Goldman 등의 문헌(Goldman 등, The EMBO Journal 13, 2976-2984, 1994)에서는 담배의 암술의 기둥머리 특이적 유전자 STIG1의 분리 및 그 프로모터의 발현부위 분석이 보고되어 있다. 게다가 이들 2개의 문헌에서는, 프로모터에 세균유래의 RNA 분해효소를 연결, 식물세포에 도입하는 것에 의해, 각각 웅성불임, 자성불임 담배를 만들어내고 있다. 이들은 조직특이적 프로모터의 이용에 의한 생리·형태의 인위적조작의 예이기도 하다. 한편, 단자엽식물에 있어서는, 암술 특이적 프로모터의 보고는 아직 없고, 꽃밥 특이적인 프로모터 분리의 보고예가 있을 뿐이다. 예컨대 특표평 6-504910호 공보에는, 벼의 꽃밥 특이적 유전자의 분리 및 그 프로모터 서열과 그 이용방법이 보고되어 있고, 또한 쯔치야 등의 문헌(Tsuchiya 등, Plant Mol. Biol. 26, 1737~1746, 1994)에서는, 벼의 미숙 꽃밥의 융단조직세포 특이적 프로모터의 발현 분석이 보고되어 있다.

식물의 꽃 기관, 특히 생식기관의 형태나 생리적 현상을 인위적으로 개량하기 위하여, 또는 여러가지 다양한 유전자의 꽃 기관에 있어서의 기능을 분석하기 위해서는 꽃 기관에서 특이적인 발현을 나타내는 프로모터가 필수적이다. 그런데 주요곡물의 대부분을 차지하는 단자엽식물에 있어서, 꽃 기관에 있어서 우세한 발현을 하는 유전자의 분리예는 대단히 적다. 특히 암컷 성생식기관인 암술 또는 개화조절을 담당하는 인피에 있어서 우세한 발현을 나타내는 프로모터 서열은 아직 보고되어 있지 않다.

도 1은, RPC213의 노던 분석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 2는, RPC213의 RT-PCR 분석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 3은, RPC213과 RPG106의 제한효소지도의 비교를 나타내는 설명도이다.

도 4는, 전사개시점 부근의 염기서열을 나타내는 설명도이다.

도 5는, 프라이머-연장분석의 결과를 나타내는 사진이다.

도 6은, 프로모터 발현 분석용 벡터의 구축순서를 나타내는 모식도이다.

도 7은, 213프로모터의 GUS에 의한 발현부위분석 결과를 정리한 그래프이다.

도 8은, 213프로모터의 GUS에 의한 발현부위분석의 일례를 나타내는 사진이다.

발명의 개시

본 발명의 목적은, 종래 특히 단자엽 식물에 있어서 불가능하던 암술 또는 인피에 있어서 외래유전자를 특이적으로 발현시켜, 유전자공학적으로 조작하는 것을 가능하게 하는 꽃 기관 특이적 프로모터 활성을 갖는 신규의 DNA 서열을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 벼(물벼)의 암술 cDNA 라이브러리를 암술 프로우브와 잎 프로우브를 사용하여 디퍼렌셜 스크리닝하여, 꽃 기관특이적 발현을 나타내는 클론을 분리 및 동정하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 제1의 측면에 의하면, 서열표의 서열번호2로 표시되는 염기서열중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 그 일부의 서열, 또는 이것들의 서열중 1 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입되거나 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 전사 개시점(상기 서열번호2로 표시되는 염기서열 중, 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류 적어도 500염기로부터 하류에 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제3335번째부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 최초의 번역개시 코돈(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 5016번째로부터 제 5018번째의 염기) 상류 영역에 있는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 번역개시 코돈 상류 영역이, 전사개시점상류 적어도 500염기로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 전사개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류 영역에 있는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 전사개시점 상류 영역이, 적어도 전사개시점 상류 500염기인 것을 특징으로 하는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제 3335번째로부터 제 5108번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 이 서열중 1 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 제2의 측면에 의하면, 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 그 일부의 서열, 또는 이들 서열중 1 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, HindⅢ 부위 (상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 3335번째로부터 제 3340번째의 염기)로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 전사 개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 4995번째로부터 제 4997번째의 염기) 상류 적어도 500염기로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 제 3번째의 BglⅡ 부위(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 5103번째로부터 제 5108번째의 염기)로부터 상류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 최초의 번역개시코돈(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 5016번째로부터 제 5018번째의 염기) 상류 영역인 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이, 전사개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류 영역인 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 이 서열중 1 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편이 제공된다.

본 발명의 제 3의 측면에 의하면, 상기 본 발명에 의한 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편과 그 제어하에 있는 원하는 구조 유전자를 포함하는 키메라 DNA 서열이 제공된다.

본 발명의 제 4의 측면에 의하면, 상기 본 발명에 의한 키메라 DNA 서열을 갖는 형질전환 벡터가 제공된다.

본 발명의 제 5의 측면에 의하면, 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 꽃 기관특이적 프로모터 활성을 유지하는 그 일부의 서열과 혼성화(hybridize)될 수 있는 꽃 기관특이적 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편이 제공된다. 여기서 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 상기 혼성화는 중간 정도의 혼성화 강도의 조건하에서 행하여진다.

본 발명의 제 6의 측면에 의하면, 벼 또는 다른 식물의 게놈 DNA 라이브러리로부터 서열표의 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 그 일부의 서열을 프로우브로서 사용하여 스크리닝하는 것에 의해 얻어지는 DNA 서열로부터 특정할 수 있는 것을 특징으로 하는 꽃 기관특이적 프로모터 서열이 제공된다. 여기서 본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 상기 스크리닝은 중간정도의 혼성화 강도의 조건하에서의 혼성화에 의해 행하여진다.

본 발명의 제 7의 측면에 의하면, 서열표의 서열번호 1로 표시되는 서열중, 제 22번째로부터 제1278번째의 서열 중, 또는 그것들에 상보적인 염기서열중 적어도 연속하는 15염기의 서열을 갖는 DNA 단편이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자 등이 찾아낸 발명의 하나는, 전술한 바와 같이 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열 및 제 3335번째로부터 제 5108번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 이들의 일부의 서열, 또는 이들의 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편이다.

본 발명의 프로모터 서열, 즉 서열번호 2에 기재되어 있는 서열중, 제 1번째로부터 5369번째까지의 서열은, 다른 공지된 프로모터 서열과 상동성이 없는 것으로부터, 신규의 프로모터 서열인 것으로 여겨진다.

본 발명의 DNA 단편이 갖는 프로모터 활성은, 꽃 기관특이적이다. 본 명세서에서, 프로모터 활성이 꽃 기관특이적이라는 것은 본 발명의 DNA 단편이, 다른 기관과 비교하여 주로 ?기의 미숙 암술, 개화기의 성숙 암술, 인피 및 안·外潁에서 우세하게 프로모터 활성을 발현하는 것을 의미한다. 이하 설명되는 실시예중 역전사 PCR 실험에 있어서, 이들의 꽃 기관외의 다른 여러가지 기관에 있어서의 발현량은 미숙 암술에 있어서의 발현량의 약 1/100 미만이었다. 또, 이 경우, 조사한 기관은 상기 꽃 기관 3기관 외에, 개화기의 꽃밥, 파종후 약 1개월의 잎 및 뿌리, 수정후 1∼2주간의 미숙종자, 발아 직후의 종자 및 유합조직이 있다(도 1, 도 2, 표 1 참조).

이 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열에는, 이하의 특징이 있다.

1. 전사개시점은 연속하여 3개 부분에 존재하고, 전사개시점의 염기는 상류부터 C, A, A(시토신, 아데닌, 아데닌)이다(서열번호 2의 제4995∼4997번째의 염기).

2. 최상류 전사개시점의 C(시토신)의 31bp 상류에 TATA 박스(Corden 등, Science 209, 1406~1414, 1980)모양 서열(5′­TATAAA­3′)이 존재한다(서열번호 2의 제4964∼4969번째의 염기).

3. 최상류의 전사개시점의 C(시토신)의 21bp 하류에 한단위의 번역개시코돈 ATG가 존재한다(서열번호 2의 제 5016∼5018번째의 염기).

4. 또한, 1단위의 번역 개시코돈의 273bp 하류에는 81bp의 인트론 서열이 끼어있어 2단위의 ATG가 같은 읽기 프레임에 위치하고 있다.

본 발명에 있어서, 이 서열번호 2의 염기서열중, 추정 구조유전자 영역의 상류부위(구조유전자 영역의 5′말단부근의 염기를 일부 포함하여 있을수도 있음), 즉 제 1번째로부터 제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열 및 제 3335번째로부터 제 5108번째의 염기로 이루어지는 서열을 프로모터 서열로서 특정한 것이지만, 이들의 서열의 일부이더라도 프로모터 활성을 갖는 경우는 본 발명의 범위에 포함되는 것이다. 예컨대, 상기 설명한 바와 같이, 제4995번째에 전사개시점이 존재하는 것으로부터 제 1번째로부터 제 4994번째까지의 영역 또는 제 3335번째로부터 제 4994번째까지의 영역도 프로모터 활성을 갖는 것으로 예상된다.

또한, 후자의 서열에 있어서는, 가끔 제 3335번째에 HindⅢ의 절단부위가 있었기 때문에, 이로부터의 서열을 프로모터서열로서 특정한 것이지만, 이것보다 하류의 영역에서 시작되는 서열이더라도 프로모터 활성을 갖는 것으로 당연히 예상된다. 즉, 지금까지 식물로부터 분리되어진 프로모터내에서, 그 전사개시점보다 상류 0.3kb 내지 0.4kb의 영역이 해당 프로모터의 조직·시기특이성 또는 유도성을 거의 완전히 유지하고 있는 것으로 밝혀진 예가 많이 보고되어 있다. 예컨대 벼의 타입 II 루테린 유전자의 프로모터의 경우에, 배유에 있어서의 조직 및 시기특이적 발현은 전사개시점 상류 441bp의 단편만으로 충분히 실현된다(Takaiwa등, Plant Mol. Biol. 16: 49~58, 1991). 또한, Brassica oleracea의 자가불화합성 관련유전자 SLGl3의 프로모터의 경우에는, 전사개시점보다 상류 411bp의 범위가 암술과 화분에 있어서의 발현을 규정하고 있다(Dzelzkalns 등, The Plant Cell 5: 855~863, 1993). 또는 토마토의 음이온성 퍼옥시다제(anionic peroxidase) 유전자의 프로모터의 경우에는, 전사개시점 상류 358bp가 기관특이성 외에, 상해·병원균 유도성도 결정하고 있다(Mohan 등, Plant Mol. Biol. 22: 475~490, 1993). 이와같이 프로모터 서열은, 보고된 염기서열의 일부이더라도, 전사개시점의 상류영역 수백 염기쌍이라면 그 프로모터로서의 기능, 특히 그 특이성을 거의 완전히 유지하는 것이 적지 않다.

따라서, 본 발명의 프로모터 서열에 있어서, 본 발명에 있어서 특징이 되는 꽃 기관특이성을 갖는다. 전사개시점보다 상류 수백bp, 바람직하게는 전사개시점보다 상류 약 500bp의 DNA 단편을 포함하는 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다. 예로서, 본 발명의 염기서열을 기초로 설계된 프라이머를 사용하여, PCR에 의하여 벼 게놈으로부터 용이하게 분리되어진 전사개시점보다 상류 수백bp의 영역, 또는 이것을 포함하는 영역이 본 발명의 프로모터가 본래 갖는 특성을 유지하는 경우, 이 짧은 프로모터 서열은 본 발명에 포함되는 것이다.

또한, 본 발명의 DNA 단편은 예로서 벼를 재료로 하는 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또는, 본 발명에 의해 그 염기서열이 명확하게 되었기 때문에, 본 발명의 DNA 단편의 양말단부분과 각각 대응하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여, 벼의 게놈을 주형으로 하는 PCR 법에 의해 용이하게 제조할 수가 있다. 이 서열이 꽃 기관특이적인가 아닌가의 판단은, 이 프로모터 서열에 β­글루쿠로니다제(GUS) 유전자를 연결시킨 키메라 유전자를 만들어, 벼에 도입하여, 발현부위를 확인하므로써 행할 수 있다.

본 발명은, 이들 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입또는 부가된 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편도 그 범위에 포함한다.

일반적으로, 생리활성을 갖는 DNA의 염기서열이 약간 변경된 경우, 즉 상기염기서열 중의 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 치환되거나 결실되거나 또는 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 부가 혹은 삽입된 경우라도, 상기 DNA의 생리활성이 유지되는 경우가 있다는 것은 주지의 사실이다. 따라서, 상기 본 발명의 프로모터서열에 이와 같은 수식이 가해지고도 여전히 프로모터 활성을 갖는 DNA 서열도 본 발명의 범위내에 포함된다. 즉, 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제 1번째∼제 5369번째의 염기로 이루어지는 서열 및 제 3335번째∼제 5108번째의 염기로 이루어지는 서열, 혹은 프로모터 활성을 갖는 그것들의 일부, 예컨대 전사개시점보다 상류 수백bp로 이루어지는 서열뿐 아니라, 이들 서열중 소수의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 이들 서열에 소수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가되어 프로모터 활성을 갖는 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 이와같이 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제 1번째로부터 제 4994번째까지의 영역, 또는 제 3335번째로부터 제 4994번째까지의 영역의 염기로 이루어지는 서열뿐 아니라, 이들 서열중 소수의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 이들 서열에 소수의 뉴클레오티드가 삽입 혹은 부가되어, 프로모터 활성을 갖는 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

뉴클레오티드의 부가, 삽입, 결실 또는 치환은, 예컨대, 주지기술인 부위특이적 변이유발(예로서, Nucl. Acids Res. 10:6487~6500, 1982)에 의해 실시할 수가 있으며, 본 명세서에 있어서「하나 또는 복수의 뉴클레오티드」라는 것은, 부위특이적 변이유발법에 의해 부가, 삽입, 결실 또는 치환할 수 있는 정도의 수의 뉴클레오티드를 의미한다.

부위특이적 변이유발은, 예컨대, 목적하는 변이인 특정의 불일치 외에는 변이를 받아야되는 한 가닥의 파아지 DNA에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머을 사용하여 다음과 같이 행할 수 있다. 즉, 프라이머로서 상기 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 파아지에 상보적인 사슬을 합성하여, 얻어진 이중쇄 DNA로 파아지 담지성 숙주세균을 형질전환한다. 형질전환된 세균의 배양물을 한천에 플레이트하여, 파아지를 함유하는 단일 세포로부터 프라그를 형성시킨다. 이렇게 하면, 이론적으로는 50%의 새로운 콜로니가 단일 사슬로서 변이를 갖는 파아지를 함유하고, 나머지 50%가 원래의 서열을 갖는다. 얻어진 프라그를, 상기 목적하는 변이를 갖는 DNA와 완전히 일치하는 것과는 하이브리드를 형성하지만, 원래의 사슬을 갖는 불일치하는 것과는 하이브리드를 형성하지 않는 온도에서, 키나아제 처리된 합성 프로우브와 하이브리드를 형성시킨다. 다음에 상기 프로우브와 하이브리드를 형성하는 프라그를 골라서, 배양하여 DNA를 회수한다.

또, 프로모터 서열에, 그 활성을 상실시키지 않는 하나 또는 복수의 뉴클레오티드를 치환, 결실, 부가 또는 삽입하는 방법으로서는, 상기의 부위특이적 변이유발의 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법 및 유전자를 선택적으로 절단한 다음에 선택된 뉴클레오티드를 제거, 부가, 또는 치환하고, 이어서 연결하는 방법이 고려된다.

또한, PCR 법을 사용한 부위특이적 변이도입(Mikaelian et al. Nucl. Acids Res. 20:376. 1992)에 의한, 특정 뉴클레오티드의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이든지, Taq DNA 폴리머라제의 충실도가 낮음을 이용한 랜덤한 뉴클레오티드의 치환(Zhou 등. Nucl. Acids Res. 19:6052, 1991)도 고려된다.

다음에, 본 발명자 들이 더 밝혀낸 발명에 관해서 설명한다.

본 발명은, 벼 또는 그외의 식물유래의 게놈 라이브러리로부터 서열표의 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 그 일부를 프로우브로서 사용하여 얻어지는 서열로 특정할 수 있는 꽃 기관특이적 프로모터 서열이다.

이 서열표의 서열번호1로 표시되는 염기서열은, 후술하는 실시예에 기재된 벼(IR24)를 사용한 디퍼렌셜 스크리닝에 의해 얻어진다. 또는, 본 발명에 의해 그 염기서열이 분명히 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 DNA 단편의 양말단부분과 각각 대응하는 2개의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여, 벼의 꽃 기관 유래 cDNA, 또는 게놈을 주형으로 하는 PCR 법에 의해 용이하게 제조할 수가 있다. 이 염기서열은, 그 전체를 프로우브로서 사용하더라도 좋고, 또는 그 일부를 프로우브로서 사용하더라도 좋다. 게놈 라이브러리의 구축은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 벼의 경우, 예컨대 후술하는 실시예에 상세히 기재되어 있는 방법에 의해 녹옆을 사용하여 구축한다. 이렇게 하여 얻어진 라이브러리로부터 상기 프로우브를 사용하여 프로모터를 포함하는 게놈 단편을 조제하여, 프로모터서열을 특정한다. 이 서열이 꽃 기관특이적인가 아닌가의 판단은, 이 프로모터서열에 β­글루쿠로니다아제(GUS)유전자를 접속한 키메라유전자를 구축하여, 소망의 식물에 도입하여 발현부위를 확인하는 것에 의해 행할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 프로모터서열의 꽃 기관특이성의 정도는 본 명세서속에서 후술하는 실시예3(2)에 기재되어 있는 특이성의 정도와 동등한(적어도 임의의 꽃 기관에서 우세) 정도일 것이 필요하다.

마지막으로, 본 발명의 다른 측면인 꽃 기관특이적 프로모터 검색용 프로우브에 관해서 설명한다. 본 발명의 프로우브는, 서열표의 서열번호1로 표시되는 서열중, 제 22번째로부터 1278번째의 서열중, 또는 그것들에 상보적인 염기서열중의 적어도 연속하는 15염기의 서열을 갖는 DNA 단편으로 이루어진 것이다. 상기한 서열번호 1중의 제22번째∼제1278번째까지의 서열 또는 이 서열과 상동성이 높은 서열은,상술한 꽃 기관특이적인 발현을 하는 가능성이 높다. 따라서, 이 서열 또는 그 일부의 서열을 프로우브로서 사용하여 식물 게놈 DNA를 검색하는 것에 의해, 벼 또는 그 외의 식물중에 존재하는 새로운 꽃 기관특이적 프로모터를 찾아내는 것이 가능해진다. 프로우브는, 상기 서열에 따라서 설계되는 것으로서, 그 길이는 적어도 연속하는 15염기 이상인 것이 바람직하고, 15염기 이상이면 상기 서열의 전체 길이까지의 어느쪽의 길이이더라도 좋다. 또한, 전술한 서열로부터 선정된 DNA 단편을, 상기 서열 또는 이것과 상동성이 높은 서열에 대하여 특이적으로 혼성화하는 성질을 잃지 않도록 염기의 부가, 결실, 삽 입또는 치환된 서열도 본 발명에 포함된다. 또, 이 염기서열의 부가, 결실, 삽입또는 치환의 방법은, 전술한 본 발명의 꽃 기관특이적 프로모터에서 사용하는 방법과 같은 방법으로 행하는 것이 가능하다.

본 발명의 프로우브는, 후술하는 실시예에서 상술하는 방법에 의해 얻어지는 서열표의 서열번호 1에 기재된 DNA 단편을, 적당한 제한효소에 의해서 절단하는 것에 의해 조제할 수 있다. 또한, 이 서열을 포함하는 시료를 사용하여 PCR 반응을 행하는 것에 의해 조제하는 것도 가능하다. 또는, 시판의 DNA 합성기(예컨대, 파킨엘머사제)에 의해 관용된 방법에 의해, 프로우브로 되는 한 가닥의 DNA를 합성하는 것도 가능하다.

본 발명의 프로우브는 관용된 방법에 의해, 예컨대, 방사선동위원소등에 의해 표지할 수 있다. 예컨대 32P를 사용하는 경우는, 랜덤 프라이밍 라벨에 의해 표지하고, 또한 합성올리고머를 사용하는 경우는 인산화효소에 의해 5′말단표지를 한다.

본 발명의 프로우브를 사용한 경우의 혼성화는 관용된 방법으로 행할 수 있다. 일반적으로는, 중간정도의 혼성화 강도(적당한 이온강도(예컨대, 0∼50% 포름아미드, 6 ×SSC, 1 ×덴할트 용액 등)를 기준으로, 실온∼ 50℃에서의 혼성 및 세정에 의해서 행한다. 본 발명의 프로우브를 대상식물의 게놈 라이브러리에 대하여 이용하고, 혼성화한 대상식물의 게놈DNA를 분리하여, 이 유전자의 상류 영역을 특정하는 것에 의해 새로운 꽃 기관특이적 프로모터를 얻을 수 있다.

본 발명의 꽃 기관특이적 프로모터는, 종래 특히 단자엽 식물에 있어서 불가능하던 암술 또는 인피를 유전자공학적으로 조작·개량하는 것을 가능하게 하는 신규의 꽃 기관특이적 프로모터 서열이므로, 하기의 용도에 사용할 수 있다.

1) 본 발명의 프로모터 서열 또는 그 일부에 내냉성, 내건조성, 내서성 등, 스트레스내성을 조장하는 구조유전자를 접속하는 것에 의한, 자성(암컷) 생식기관의 수정능력의 개량.

2) 본 발명의 프로모터 서열 또는 그 일부에 불임화를 야기하는 구조유전자를 접속하는 것에 의한 자성불임식물의 생산.

3) 본 발명의 프로모터 서열 또는 그 일부에 식물세포의 신장 또는 분열을 촉진하는 구조유전자를 연결하는 것에 의한, 꽃 기관의 부위특이적 증대, 신장.

4) 인피에 있어서의 발현을 이용하는 것에 의한 유전자공학적인 개화제어.

5) 제초제내성 또는 병해저항성을 부여하는 유전자를 연결하는 것에 의한 꽃 기관전체 또는 그 일부, 예를 들면 암술에의 저항성의 부여.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 예시하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예1: 꽃 기관특이적cDNA의 분리

물벼 품종 「쯔기노 히카리」및「IR24」를 온실에서 재배하여, 이하의 실험에 시료로 제공하였다.

(1) RNA의 추출

「IR24」의 잎, 미숙·성숙암술, 꽃밥, 인피, 내·외 까끄라기, 미숙종자, 발아종자, 뿌리, 유합조직 및 미숙 까끄라기꽃(길이 4. 5∼6. 0mm)를 채취후 즉시 액체 질소중에서 동결하여 -80℃로 보존하였다. 이들 조직보다 페놀-SDS 법(Watanabe and Price, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,79, 6304-6308, 1982)에 의해 전체 RNA를 추출하였다. 단지, 추출완충액에 산화방지제 β- 머캡토에탄올을 최종농도 10%(V/V)가 되도록 첨가하였다. 또한, 역전사 PCR 실험에 시료로 제공되는 조직에 관하여는 미량의 DNA의 혼입을 극력 억제하기 위해서, 염화리튬 침전 대신에, RNase 억제제(RNAguard Pharmacia 사)존재하에서 DNaseI(FPLCpure Pharmacia 사)처리를 하였다. 40mM Tris­Cl pH7.5, 6mM MgCl2의 완충액중에, 0.375 ㎍/㎕의 전체 핵산과 1.75 units/㎕ RNase 억제제를 혼합하고, 여기에, 0. 375 units/㎕의 DNaseI(농도는 어느것이나 최종농도)을 가하여, 37℃에서 10∼30분간 보온하였다. DNaseI은 페놀·클로로포름추출에 의해 실활시켰다.

잎, 뿌리(도1에서는 뿌리(흙)으로 표기)는 파종후 1개월의 온실육성된 포기에서, 미숙암술은 출수전 1주간∼2주간의 포기에서, 성숙암술, 꽃밥, 인피, 내·외 까끄라기는 개화직전∼ 수일전, 미숙종자는 개화후 l∼ 2주간의 포기에서 채취하였다. 또한, 발아종자, 뿌리는 N6 배지(Chu et aI. Scientia Sinica, 18. 659-668, 1975)상에서 파종후 각각 1, 3주간 무균적으로 육성한 식물체의 것을 사용하였다. 유합조직은 2,4-D를 2mg/l 첨가한 N6 고형배지상에서 종자로부터 유도하여, 같은 조성의 액체배지중에서 3주간 진탕배양한 것을 사용하였다. 암술 및 잎의 전체 RNA에 관하여는, 01igotex-dT30 super(다까라주조)를 사용하여 첨부설명서에 따라서 폴리 A+ RNA를 조제하였다.

(2) 암술 cDNA 라이브러리의 구축

암술에서 분리정제한 약 14g의 폴리 A+ RNA를 주형으로 하여, ZAP­cDNA 합성키트(STRATAGENE 사)를 사용하여 cDNA 합성을 하였다. 32P의 혼입율에 의한 정량의 결과, oligo­dT 프라이밍에 의해 역전사된 제1사슬 cDNA는 약 55ng, 이로부터 직접합성된 제2사슬 cDNA는 약 72ng이었다. 키트에 첨부된 설명서에 따라서 cDNA에 EcoRI 어댑터를 연결하고, XhoI로 소화한 후, 벡터 UniZAP XR에 연결하였다. 그 후 파아지 DNA를 Giga pack Gold packaging extract (STRATAGENE 사)를 사용하여 파아지 입자에 팩키징하였다. 이어서 대장균 PLK-F′을 숙주세포로서 플레이트에 전개하여, 라이브러리 사이즈를 조사한 바, 3 ×10⁶pfu의 암술 cDNA 라이브러리인 것으로 산출되었다.

(3)디퍼렌셜 스크리닝

기본적으로는 Gasser et al. (The Plant Cell 1, 15-24, 1989)의 방법에 따랐다. 암술 cDNA 라이브러리에서 약 2,000Pfu의 파아지를 대장균 PLK­F′에 감염시키어, 14 ×10cm각형 샤레에 전개하였다. 각각의 플레이트에 대하여 나일론막 필터 Hybond-N+(Amersham 사)를 사용하여 레프리카 필터를 제조하고, 첨부된 설명서에 따라서 필터를 처리하였다. 혼성용 프로우브로서, 암술과 잎의 폴리 A+ RNA 약 100ng(또는 전체 RNA 약 2㎍)으로 합성한 한가닥 cDNA를 사용하였다. 2㎕의 RNA 용액에 0.5mM의 d(ATG)TP, 10mM의 DTT, 1×M­MuLV 완충액(BRL 사)을 가하여, 30ng/㎕의 랜덤 DNA 헥시머(Pharmacia 사)(또는 80ng/㎕의 올리고dT 프라이머-(Amersham 사))를 가하였다(농도는 어느것이나 최종농도). 65℃에서 5분간 처리하여 RNA의 이차구조를 해리시킨 후, 실온에서 프라이머를 어닐링시켰다. 그리고 1.5unit/㎕의 RNase 억제제(RNA guard Pharmacia 사), 10unit/㎕의 역전사효소 M-MuLV(BRL 사), 4μCi/㎕의 〔α­³²P] dCTP를 가하여(어느것이나 최종농도), 합계 20㎕의 반응액을 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다.

그리고, 비방사성의 dCTP를 최종농도 0.5mM 이 되도록 가하고, 30분간 반응을 지속시켰다. Quick SPin 컬럼 G-50 Sephadex(B0EHRlNGER MANNHElM사)를 사용하여 표지한 DNA 프로우브를 정제하였다. 또한 2N의 Na0H를 등량(최종농도 1N) 가하여 프로우브를 단일가닥으로 만들었다. 필터는 미리 프리-혼성화 완충액(0.25M Na₂HP0₄, pH7.2, 7% SDS, 1mM EDTA, 1×덴할트 용액)내에서 68℃, 10분간 처리하고 , 거기에 단일가닥으로 변한 프로우브(0.2~0.3×10⁷cpm/ml 최종농도)와 캐리어-DNA(0. 1㎎/ml 연어 정소 DNA, 0. 1㎍/ml λDNA, 0. 1㎍/ml 벼 DNA)를 가하여, 68℃에서 하룻밤(16-24시간) 혼성하였다. 필터의 세정은, 완충액(20mM Na₂HP0₄pH 7.2, 1% SDS, 1mM EDTA)중에서 실온, 68℃에서 15분씩 2회 행하였다. 그 후 Kodak X-0mat 필름을 4∼5일간 -70℃에서 필터에 노광시켰다.

약 30,000개의 프라그를 공시한 결과, 암술 프로우브에서 혼성화 시그널이 강하게 검출되고, 더구나 잎 프로우브에서는 시그널이 약한 프라그가 일차선발로 198개 선발되었다. 이중의 152 클론에 관하여, 이차선발을 하였다. 이때, 프라그 혼성화가 높은 백그라운드를 피하기 위해서, 또한 선발의 효율화를 꾀하기 위해서 이하의 방법으로 선발을 하였다. 우선 일차선발된 프라그를 클로로포름을 방울방울 적하한 200㎕의 SM 완충액(0.1M NaCl,7mM MgS0₄, 50mM Tris­Cl pH7.5, 0.01% 젤라틴)중에서 4℃로 보존하였다. 이 보존액을 희석하여, 프라그가 극히 저밀도(10∼100pfu/플레이트)가 되도록 파아지를 뿌리고, 서로 떨어진 프라그를 1개 분리하여, 같은 완충액속에서 보존하였다. 이 보존액으로부터 파아지를 고농도로 포함하는 플레이트 용균액을 준비하여, ZAPcDNA 합성키트의 설명서에 따라서 in vivo 절단을 하여, 파아지 게놈으로부터 플라스미드(pBluescriptSK(-))를 조제하였다.

제한효소 EcoRI 및 XhoI(다까라주조)로 소화하는 것에 의해 cDNA 인서트를 분리 정제하였다. 이것을 0.8% 아가로오즈 겔 전기영동으로 분획화한 후, HybondN^十나일론막 필터에 전사하여, 암술, 잎프로우브 외에, 꽃밥, 발아종자, 뿌리, 유합조직 또는 미숙종자의 전체 RNA로부터 올리고 dT 프라이머를 사용하여 합성한 단일가닥 cDNA 프로우브를 사용하여 디퍼렌셜 혼성화를 하였다. 그 결과, 암술 프로우브에 혼성화하고, 그외의 프로우브에 대하여는 거의 혼성화하지 않은 6개의 cDNA 클론이 얻어졌다. 이중 인서트 cDNA의 길이가 약 1. 5kb의 클론을「RPC213 」으로 명명하여, 이하의 실험에 시료로 제공하였다.

(4) cDNA 클론의 발현기관특이성의 분석

1) 노던 하이브리다이제이션 분석

상기 3)에서 선발된 cDNA 클론「RPC213」에 대해서 각 기관에서의 발현패턴및 그 발현량을 보기위해서 노던 하이브리다이제이션을 하였다. 필터의 제작은 아래와 같이 행하였다.

우선 상기한 1)의 각 기관의 전체 RNA 20㎍을 Sambrook et al. (Molecular Cloning, 1982)의 방법에 따라서, 탈이온화한 GlVoxal과 DMS0를 사용하여 이차구조를 제거한 후, l% 아가로오즈 겔내에서 분획화하였다. 이어서 통상적인 방법에 의해 RNA를 나일론막 Gene Screen Plus(DUP0NT 사)에 전사하였다. 80℃, 진공에서, 1시간 건조시킨 후, 필터를 20mM Tris-Cl pH8. 0 중에서 5분간 끓여서 Glyoxal을 제거하였다. 프로우브는 상기 cDNA의 EcoRI-Xhol l. 5kb단편을 멀티프라임 라벨링 시스템(Amersham사)으로 RI 표지한 것을 사용하였다. 프리-혼성화 및 혼성화는 필터에 첨부된 설명서에 따라서 행하였다. 세정은 2 ×SSC, 1% SDS 및 0.2 ×SSC, 1% SDS를 각각 실온에서 5분, 0.16 ×SSC, l% SDS, 65℃에서 15분씩 2회 행한 후, 2 ×SSC, 실온에서 1분간의 조건으로 행하였다. Kodak X-0mat 필름을 하룻밤 -70℃에서 필터에 노광시켰다.

그 결과, 도 1에 나타낸 것 같이, 성숙암술에 있어서 강한 혼성 시그널이 검출되고, 내·외 까끄라기와 유합조직에 있어서 약한 시그널이 검출되고, 잎과 꽃밥 및 미숙종자에 있어서 매우 약한 시그널이 검출되었다. 그 밖의 여러가지 기관에 있어서는 시그널이 검출되지 않았다. 따라서, 노던분석의 결과로부터, 분리된 클론은 성숙암술에서 비교적 강하게 발현하고, 내·외 까끄라기와 유합조직에 있어서는 약하게 발현하며, 또한 잎과 꽃밥 및 미숙종자에 있어서는 극히 미량밖에 발현하지 않은 것이 밝혀졌다. 전사물의 사이즈는, 약 1. 6kb로 추정되었다.

2) 역전사 PCR(RT-PCR)분석

cDNA 클론의 기관특이적 발현에 관해서 보다 높은 감도로 분석하기 위해서, 벼의 각 기관의 RNA를 주형으로 한 역전사 PCR을 행하였다. 우선, GENESlS 2000 형광 서열기(DuPont 사)를 사용하여, 플라스미드 PBluescript SK(-)에 삽입된 cDNA의 염기서열을 부분적으로 결정하였다. 서열기에 첨부된 설명서에 따라서, M13 및 M4 프라이머(다까라주조)로부터 T7 DNA 폴리머라제 반응을 하여, 6% 아크릴아미드겔로 전기영동하였다. 5′(EcoRI)측, 3′(XhoI)측의 양방향에서 염기서열을 결정하였다. 이중 3′측의 약 400 뉴클레오티드(mRNA 센스사슬)의 DNA 염기서열을 참고로 하여 프라이머

213S; 5'-CGCTATGGCCCGTTTCAGCT­3′(서열번호3) 및

213AS;5'-GTCGTCCTGCCGCTTCATTAC­3'(서열번호4) 를 DNA 합성기(ABI 사)에 의해 합성하여, 0PC 카트리지(ABI 사)에 의해 정제하여, 역전사 PCR 실험에 시료로 제공하였다. 이 프라이머에 의해 약 250bp의 산물이 증폭되는 것으로 기대된다.

상기한 각 기관의 전체 RNA l0㎍을, 500ng의 올리고 dTl5 프라이머(Amersham 사)와 혼합하고, 55㎕의 반응액속에서 70 ℃, 10분간 처리하여 이차구조를 해리시켜, 얼음상에서 급냉한 후, 1×1st strand buffer(BRL 사), 0.5mM dNTPmix, 10mM DTT, 2 units㎕ RNase 억제제(RNAguard Pharmacia 사), l0 units/㎕ 역전사효소 Superscript(BRL 사)(농도는 어느것이나 최종농도)의 100㎕의 반응액중에서 37℃, 60 분간 보온하였다. 계속하여 95℃로 5분간 처리하여 RNA­cDNA 하이브리드를 해리시킨 후, 얼음상에서 냉각하였다. 이 용액의 cDNA 농도를 100ng/㎕ 라고 간주하였다. 다음으로, 합성된 각 기관의 cDNA를 희석하고, l00ng/㎕, l0 ng/㎕, l ng/㎕, 0.1 ng/㎕의 4종류의 희석계열을 제작하여, PCR 반응의 주형으로 하였다.

PCR 반응은 이하의 조건으로 행하였다. 우선 cDNA 희석액 l㎕에 대하여, 최종농도로 0.5pmole/㎕ 프라이머, 0.2 mM dNTP, l × PCR 완충액, 0.05 U Taq 폴리머라제(다까라주조)의 반응액 20㎕를 조제하였다. 이것을 GeneAmp9600(Perkin Elmer 사)을 사용하여 94℃ 3분을 1회, 94℃ 0.5분, 60℃ 1분, 72℃ 1분을 30 회, 72℃ 6분을 1회의 조건으로 PCR을 행하였다. PCR 산물은 아가로오즈겔 전기영동, 에티디움브로마이드 염색 후, 사진촬영하였다. 각 밴드의 농도를 비교하여, 같은 농도의 2 샘플에는 본 유전자에서 유래하는 cDNA가 등량 포함되어 있는 것으로 평가하였다.

RPC213 유전자의 프라이머에 관하여는, 미리 플라스미드 클론을 사용하여 기대되는 분자량의 산물이 증폭되는 것을 확인하였다. 이 프라이머를 사용하여 역전사 PCR 실험을 한 바, 도 2A에 도시한 바와 같이, 우선, 100 ng의 cDNA를 주형으로 사용한 경우, 성숙암술과 내·외 까끄라기 및 유합조직에 있어서 짙은 PCR 산물의 밴드가 검출되고, 꽃밥과 미숙종자에서는 엷은 밴드가, 또한 잎과 발아종자, 뿌리에 있어서는 대단히 엷은 밴드가 검출되었다. 이중 성숙암술과 내·외 까끄라기에서는, 주형 cDNA 량을 1ng으로까지 희석한 경우에도 PCR 산물이 검출된 데 대하여, 유합조직, 꽃밥 및 미숙종자에서는 10 ng 까지밖에 산물이 검출되지 않았다. 게다가 잎과 발아종자, 뿌리에 있어서는 l00 ng으로 주형을 희석하면 산물이 검출되지 않았다. 이들 밴드의 검출의 유무 및 밴드의 농담의 비교의 결과로부터 RPC213 유전자의 벼 각 기관에 있어서의 발현량을 비교하면, 성숙암술을 1로 한 경우, 내·외 까끄라기에서는 1∼1/10 정도, 꽃밥과 미숙종자 및 유합조직에서는 1/10 정도, 그 밖의 기관에서는 1/100 정도로 추정되었다.

다음으로, 꽃 기관의 각 부위 및 발달단계에서의 발현을 분석하였다. 주형으로서, 성숙암술 전체, 성숙암술의 암술머리, 성숙암술의 씨방, 미숙암술 전체, 인피로부터 조제한 cDNA를 사용하였다. 또한, 잎의 cDNA 및 플라스미드 DNA를 대조구로서 사용하였다. RPC213 특이적 프라이머로 PCR을 행하였다. 그 결과, 도 2B에 나타낸 것같이, 10ng의 cDNA를 주형으로 한 경우, 잎이외의 모든 기관에서 PCR 산물이 검출되었다. 이중 미숙암술, 암술머리 및 인피에 있어서는 주형을 0.l ng까지 희석하더라도 산물이 검출된 데 대하여, 성숙암술 및 그 씨방부에서는 1ng까지밖에 산물이 검출되지 않았다. 이것으로부터, 꽃 기관 각 부위에 있어서의 RPC213의 발현량은 성숙암술 전체를 1로 한 경우, 미숙암술, 암술머리 및 인피에서는 10정도, 또한 씨방에서는 1정도로 추정되었다. 따라서 역전사 PCR의 결과로부터, RPC213 유전자는 미숙암술과 성숙암술의 암술머리 및 인피에서 매우 우세하게 발현되고, 성숙암술의 씨방과 내·외 까끄라기에서는 약하고, 그 밖의 조직에서는 미량 밖에 발현하지 않는 유전자인 것이 분명하여졌다.

이상 l)노던분석의 결과와 2)RT­PCR의 결과를 함께 표1에 정리하였다.

[표1]

(5) RPC213의 염기서열의 결정

꽃 기관 특이적 발현을 나타내는 cDNA 클론 RPC213(약 l. 5kbp)의 전체 염기서열을 형광 서열기(모델373A, Applied Biosystems 사)를 사용하여 결정하였다. Ml3 프라이머(다까라주조)를 사용하여 결정한 염기서열정보를 기초로 프라이머를 합성하고, 미해독영역의 염기서열을 결정하였다. 이 프라이머-작업을 반복하여, 최종적으로 총 염기서열수 1496bp의 RPC213의 염기서열을 결정하였다. 0RF검색을 하여, 최대의 0RF를 얻는 리딩프레임을 동정하였다. 이 리딩프레임에 있어서, 번역종료코돈 TGA의 약 70bp 및 90bp 하류에, 폴리 A 시그널 모양 서열(Heidecker and Messing, Annu. Rev. Plant Physiol. 37, 439-466, 1986)이 위치하고 있었다. RPC213의 전체 염기서열을 서열표의 서열번호1에 나타낸다. 다만, 서열표1의 염기서열에는, 후술하는 게놈 클론의 염기서열을 참고로, 전사개시점 이후의 28bp분을 부가하고 있으므로, 총염기수는 1524bp이다.

서열번호1에 기재된 서열의 특징은 이하와 같다.

nt1, nt2, nt3: 프라이머 연장에 의해서 결정된 RPC213 유전자의 전사개시

점

nt22∼nt24: RPC213 유전자의 1단위의 번역개시코돈

nt295∼nt297: RPC213 유전자의 2단위의 번역개시코돈

nt1276∼nt1278: RPC213 유전자의 번역종료코돈

nt1343∼ nt1348, nt1365∼ ntl370: 폴리 A 부가시그널

nt1507∼ nt1524: 폴리 A

실시예2:프로모터의 분리

(1) 게놈 라이브러리의 제작

게놈의 DNA를 파종후 약 2개월의 벼품종「IR24」의 잎으로부터 SDS-페놀법과 염화리튬침전법으로 분리정제 한 후, 우선 예비 시험으로서 제한효소 MboI(다까라주조)로 부분분해하여, 외관상 16∼23kb 사이즈의 단편을 많이 포함하는 효소반응조건을 결정하였다. 계속하여 이렇게 결정한 반응조건에서 게놈DNA를 소화한 후,서당밀도구배원심을 행하였다. 서당은 완충액(20mM Tris­HCl pH8.0, 1mM EDTA, 200mM NaCl)에 용해하여, 농도를 5단계(10, 17.5, 25, 32.5, 40%)로 제조하였다. 이 서당용액을 원심관(40 PA, 히타치)에 하부로부터 이 순서로 층층이 놓고, 마지막층에 부분분해 DNA 용액을 놓았다. SRP28SA(히타치) 로터를 사용하여 20,000 rpm, 17시간, 20℃에서 원심후, 페리스타 펌프를 사용하여 0.5ml씩 80분획으로 나누어, 16∼23kb의 DNA를 가장 많이 포함하는 분획을 조제하였다. 이 DNA 분획을 벡터-λDASH Ⅱ/BamHI(STRATAGENE 사)에 T4DNA 리가제(B0EHRlNGER MANNHEIM 사)를 사용하여 결찰하고, GigapackⅡ Gold packaging extract(STRATAGENE 사)로 파아지 입자로 패키징하였다. 이상의 순서로 벼 게놈 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리사이즈는 약 5×l0⁶pfu로 산출되었다.

(2) 클론의 선발

약 10,000 pfu의 파아지를 감염용의 대장균 SRBP2와 혼합하고, 14 × 10 cm 각형 샤레에 전개하여, 39℃에서 하룻밤 배양하였다. 나일론막 필터 HybondN⁺(Amersham 사)를 프라그 표면과 접촉시키고, 필터에 첨부된 설명서에 따라서 필터를 처리하였다. 벼의 꽃 기관특이적 cDNA(RPC213)의 5′측의 EcoRI-SalI 0. 6kb 단편을 멀티프라임 라벨링 시스템(Amersham 사)으로 RI 표지한 것을 프로우브로서 사용하여, 프라그 혼성화를 행하였다. 혼성화 및 세정의 조건은 실시예1(3)에 따랐다. 다만, l × 덴할트액과 캐리어-DNA의 사용은 생략하였다. 이 방법에 의해 l00,000 개의 프라그로부터 6개의 양성클론를 선발하였다. 다음으로, 이들 프라그로부터 파아지 DNA를 조제하여, 이들을 주형으로서 RPC213 특이적 프라이머 213S, 213AS를 사용한 PCR을 행하였다. 그 결과, 2 클론(RPG106, RPG107로 명명)에 있어서 기대되는 약 250bp의 산물이 증폭되었다.

(3) 프로모터를 포함하는 영역의 서브클로닝

상기 2개의 RPC213의 게놈 클론으로부터 DNA를 추출하고, 제한효소 SacI, HindⅢ(다까라주조)로 소화후, 0.8% 아가로오즈 겔에서 DNA 단편을 분획하였다. 또한, 물벼품종 아키히카리, IR24의 파종후 약1개월의 식물체로부터, 페놀-SDS 법(Komari et al. Theor. Appl. Genet. 77, 547-552, 1989)에 의해 DNA를 분리정제하였다. 약 5㎍의 DNA를 SacI, HindⅢ로 소화하여, 동일하게 전기영동을 행하였다. 다음으로 DNA를 나일론막 필터 HybondN⁺(Amersham 사)에 블롯팅 한 후, 상기 0.6kb의 cDNA 단편을 실시예1의 4)1과 같이 RI 표지한 것을 프로우브로서 서던 혼성화를 행하였다. 혼성화 및 세정의 조건은 필터에 첨부된 설명서에 따랐다. 그 결과, RPG106에 있어서 전체 게놈DNA의 경우와 동일한 사이즈의 밴드가 나타났다. 그리고 프로우브와 반응한 RPG106의 SacI 6.0kb 단편을 pBluescript의 동일한 사이트에 서브클로닝하였다. 다음으로 프로모터를 포함한 영역을 더 특정하기위해서 BglⅡ, HindⅢ, SacI, SalI의 총 4종의 제한효소를 사용하여 물리지도를 작성하였다(도 3).

(4) RPG106 SacI­SalI 5. 4kb의 전체 염기서열의 결정

게놈클론 RPG106은, 도 3에 도시한 바와 같이 4개의 BglⅡ 부위가 있다. 이들 제한부위를 이용하여, 우선 RPGl06을 5개의 단편으로 분단하였다. 즉, RPG106 SacI 6.0kb(pBluescript)를 BamHI, BglⅡ로 소화하고, SacI-BglⅡ 0.7kb(+pBluescript), BglⅡ 2.1kb, BglⅡ 2.3kb, BglⅡ 0.8kb, BglⅡ-SacⅠ 0.07kb(+pBluescript의 멀티클로닝 부위)의 5개의 단편으로 분해하였다. 이중 앞의 4개의 염기서열을 결정하였다. SacI-BglⅡ 0.7kb에는 pBluescript가 연결한된 상태이기때문에, 플라스미드를 다시 환상화하였다. 그 이외의 3개의 단편에 관하여는, 정방향과 역방향의 양방향으로 pBluescript의 BamHI 부위에 삽입한 플라스미드를 제조하였다. BglⅡ 2. 1kb에는, 그 내부에 2개의 SpeI부위, 1개의 XhoI 부위가 있고, 또한 BglⅡ 2. 3kb 단편중에는 2개의 EcoRV 부위와 l 개의 SalI 및 SpeI 부위가 있다. 각각의 단편에 대하여, 이들 제한부위를 이용하여, 더 세밀하게 서브클로닝을 하고, RPG106 SacI 6.0kb의 거의 전체를 망라하는 총 14종의 플라스미드를 제조하였다. 이들 플라스미드에 대해서, M13 프라이머(다까라주조)를 사용하여 형광서열기(모델 373A, Applied Biosystems 사)에 의해 이중사슬의 염기서열을 결정하였다. 이 방법으로 명확히 해독할 수 없던 영역은 프라이머-작업에 의해 염기서열을 결정하였다. 최종적으로, 총 염기서열수 5396bp의 RPG106 SacI­SalI 5.4kb의 전체 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 서열표의 서열번호2에 나타내었다. 서열번호2에 기재된 서열의 특징은 이하와 같다.

nt1∼nt5369, nt3335∼nt5108: GUS에 의해서 프로모터활성을 확인한 서열

nt4964∼ nt4969: TATA 박스모양 서열

nt4995,4996,4997: 프라이머 연장에 의해서 결정된 RPC213 유전자의 전사개

시점

nt5016∼nt5018: RPC213 유전자의 1단위의 번역개시 코돈

nt5370∼nt5372: RPC213 유전자의 2단위의 번역개시 코돈

nt5162∼ nt5242: 인트론 서열

nt1∼nt6: 제한효소 SacI 부위

nt729∼nt734, nt2811∼nt2816, nt5103∼nt5108: 제한효소 BglⅡ부위

nt3335∼nt3340: 제한효소 HindⅢ 부위

RPC213 cDNA 클론과 염기서열을 비교한 결과, RPC213 유전자의 1단위의 ATG와 2단위의 ATG의 사이에는 81bp의 인트론 서열이 존재하는 것이 밝혀졌다. 또, 도 3의 사선으로 도시한 바와 같이, cDNA의 5′말단으로부터 1단위의 SalI 부위까지 영역(약 300bp)과, 이 영역에 상당하는 게놈 DNA RPGl06의 염기서열은 인트론 서열이외는 완전히 일치하였다.

(5) 전사개시점의 결정

RPC213의 프로모터 영역을 특정하기 위해서, 우선 RT-PCR에 의해 전사단위의 5′말단을 분석하였다. 상술한 게놈클론 RPG106 BglⅡ 2. 3kb 단편의 3′측 약 300bp의 영역의 염기서열을 참고하여 4개의 센스 프라이머 213A, 213B, 213C, 21 3D 및 1개의 안티센스 프라이머-213Z를 합성하였다(도 4참조). 주형으로서 성숙암술 cDNA를 10ng 사용하고, 또한 대조구로서 잎 cDNA를 10ng, 게놈클론 RPG106 BglⅡ 2. 3kb를 10ng 사용하였다. PCR의 반응조건은 실시예1의 (4) 2)에 따랐다. 그 결과, 대조구로 한 잎 cDNA 에서는 어떤 프라이머를 맞추더라도 증폭산물이 얻어지지 않은데 대하여, 암술 cDNA 에서는 213A와 213Z의 조합에 의하여 게놈클론과 같은 사이즈의 산물이 증폭되었다. 이 결과로부터 213A와 213B의 사이에 cDNA 서열의 분단점, 즉 전사개시점, 또는 인트론의 3′말단이 존재한다고 생각되었다.

다음으로 프라이머-연장법에 의한 전사개시점의 결정을 하였다. 이를 위하여, RT-PCR에 사용한 프라이머

213Z; 5'­TGCTGGTATGGATGTGATG­3′(서열번호5)

에 더하여, 프라이머 연장실험을 위해 또하나의 프라이머

213Z-2;5′­ CTGACGAGGCTGTTGCTG-3′(도 4)(서열번호6)를 합성하였다.

양프라이머 10pmoles를, MEGARABEL(다까라주조)키트에 의해, 〔γ­³²P]ATP를 사용하여 5′말단을 표지하였다. 이 말단 표지된 프라이머 0.1pmole(0.3×10⁶cpm)과 미숙 까끄라기꽃(출수전 1∼2주간)과 잎의 전체 RNA 50㎍을 3unit/㎕의 RNase 억제제 (RNAguard, Pharmacia 사)존재하에서 완충액(0. 25M KCl, 2mM Tris­HCl pH8.0, 0.2mM EDTA)중에서 10㎕의 반응계에서 42℃, 2시간동안 어닐링시켰다. 그후, 완충액(66mM Tris-HCl pH8.3, 6.6mM MgCl₂, 1.3mM DTT, 0.66mM dNTP, 130㎍/ml 악티노마이신D)를 30㎕, 역전사효소(SUPERSCRIPT, BRL 사)를 1㎕(200units) 가하여, 42℃에서 1시간 보온하였다. 그리고 초산암모늄을 사용한 에탄올 침전을 행하고, 70% 에탄올로 세정후, 풍건하고 영동용 완충액(T7 Sequencing kit(Pharmacia 사)의 반응정지액과 0.lM Na0H, 1mM EDTA를 2:1로 혼합한 것)에 용해하였다.

전량을 95℃로 3분간 가열한 뒤, 6% 아크릴아미드겔로 전기영동하였다. 또한 같은 프라이머를 사용하여, RPG106 BglⅡ 2.3kb를 포함하는 플라스미드를 주형로 하여 T7 Sequencing kit로 시퀀스반응을 한 산물 및 10bp, 50bp 래더(BRL 사)를 MEGARABEL 키트와 〔γ-³²P]ATP를 사용하여 교환반응에 의해 말단 표지한 산물도 메이커로서 동시에 영동하였다. 그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, 이 유전자가 발현하지 않은 잎의 RNA에서는 연장산물이 얻어지지 않은데 대하여, 미숙 까끄라기꽃의 전체 RNA를 주형으로 한 경우에는, 213Z 프라이머에서는 2개, 213Z-2 프라이머에서는 3개의 연장산물의 밴드가 검출되었다. 인접하여 영동한 시퀀스 래더와 비교한 바, 산물이 검출된 위치는 양 프라이머와 같았다. 이 결과에 의해, 213A와 213B의 사이에는 연속하는 3개의 전사개시염기 "CAA″가 존재하RH, RPC213DMS 이들 시토신 또는 아데닌으로부터 전사되는 것으로 판명하였다. 도 4로부터 분명하듯이, 최상류의 전사개시점의 C(시토신)의 31bp상류에는 TATA 박스서열(5'-TATAAAT­3')이 위치하고 있었다. 이 TATA 박스로부터 전사개시점까지의 거리는, 식물에 있어서 다른 유전자의 예(Joshi, Nuclelc Acids Res., 15, 6643-6653, 1987)와 매우 유사하다. 또한, 이 전사개시점의 C의 21bp하류에는 번역개시 코돈(1단위의 ATG)가 존재하고 있었다. 이 ATG를 포함하는 리딩프레임은, 상기한 cDNA의 리딩프레임과 일치하였기 때문에, 일반적으로는 전사개시점에서 21bp하류의 ATG가 번역개시 코돈이라고 생각된다. 그러나, 전사개시점과 번역개시 코돈의 거리가 너무 가깝게 생각되어, 1단위의 ATG의 273bp 하류에 같은 리딩프레임으로 존재하는 2단위의 ATG가 진정한 번역개시 코돈일 가능성이 있다. 더구나 1단위의 ATG의 A(아데닌)의 3염기 상류의 염기는 C(시토신)인 데 대하여, 2단위의 ATG의 A(아데닌)의 3염기 상류의 염기는 A(아데닌)으로서, 진핵세포의 mRNA에서의 번역개시 코돈의 주변염기의 컨센서스(Kozak, J. Cell Biol., 108, 229-241, 1989)와 잘 일치한다.

실시예3:프로모터 발현부위 분석

(1) 프로모터 발현분석용 벡터의 구축과 벼의 형질전환

분리된 프로모터의 발현을 in vivo에서 분석하기 위해서, GUS 레포터 유전자를 연결한 벡터의 구축을 아래와 같이 행하였다(도 6). 벡터는 pSB21(Komari et al. Plant J., 10, 165-174, 1996)를 채용하였다. 이 벡터내의 35S 프로모터의 양말단에 있는 단일의 HindⅢ 부위와, BamHI 부위를 이용하였다.

우선, RPG106 SacI 6.0kb(pBluescript)를 HindⅢ, BglⅡ로 이중소화하고, RPC213 유전자의 1단위의 ATG의 87bp 하류에 있는 BglⅡ 부위로부터의 상류영역 약1.8kbp로 이루어지는 프로모터 단편을 조제하였다. 이 단편을 미리 같은 효소로 소화하여 35S 프로모터를 제거한 벡터 pSB21과 접속하였다. 이 플라스미드 벡터를 pY0T213αG라 명명하였다. PY0T213αG에서, RPC213 유전자의 1단위의 ATG와 GUS 유전자의 ATG는 같은 리딩프레임으로 되어있다. 따라서, RPC213 유전자의 번역이 1단위의 ATG에서 개시된 경우, GUS 단백질은 융합단백질로서 번역된다.

다음으로, RPC213 유전자의 번역이 2단위의 ATG에서 개시되는 것을 상정하여, 보다 넓은 범위의 프로모터 단편을 조제하기 위해서, 이하와 같은 방법으로 벡터를 구축하였다. 우선, PCR에 의해 프로모터영역의 일부를 증폭하기 위해서,

1조의 프라이머

213P­5H-2; 5'­GACGTGATCCACGGCATTGACG-3′(서열번호7)

213P 2ndATG-Bam; 5'­CGGGGATCCGTTCTCCTCCACCCACGC-3′(서열번호8)

을 합성하였다. 213P­5H­2는 RPG106의 유일한 HindⅢ 부위의 상류에 위치하고 있다. 또한, 213P 2ndATG-Bam은 RPC213 유전자의 2단위의 번역개시점 ATG 바로 상류의 염기서열과 BamHI 부위를 갖고 있다. 프라이머 각 100pmoles와, 주형의 RPG106을 미리 알칼리변성시킨 DNA 약 l㎍과 Extaq(다까라주조)를 사용하여 100㎕의 반응계에서 PCR을 행하였다. 반응조건은, 94℃ 3분을 1회, 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 2.5분을 20회, 72℃ 6분을 1회로 하였다. 증폭산물을 pCRⅡ(Invitrogen 사)에 클로닝 한 후, 염기서열을 확인하였다. 이 플라스미드를 HindⅢ과 BamHI으로 소화하고, RPC213 프로모터 2.0kb 단편을 분리후, 미리 같은 효소로 처리하여 35S 프로모터를 제거한 벡터 pSB21과 연결하였다. 완성한 플라스미드를 다시 HindⅢ로 소화하고, 탈인산화 후, RPG106 SacI 6.0kb(pBluescript)를 HindⅢ로 소화하여 잘라낸 RPGl06 HindⅢ 3.3kb 단편을 삽입하였다. 이 플라스미드 벡터를 PY0T213βG라 명명하였다. 이 벡터는 RPC213 유전자의 2단위의 ATG의 바로 상류 약5.3kb의 프로모터단편의 하류에 GUS 유전자가 배치된 구조를 갖는다. 이렇게 하여 구축된 양벡터를 각각 아그로박테리움 튜모파시엔스 LBA4404 균주에 3균계 접합에 의해 도입하여, 벼의 형질전환실험에 시료로 제공하였다.

벼의 형질전환은 Hiei et al. (Plant J., 6, 271-282, 1994)의 방법에 따라서, 벼품종「쯔기노히카리」의 미숙배아 유래의 유합조직을 재료로 하였다.

(2) GUS의 조직학적 관찰에 의한 프로모터 발현부위 분석

pY0T213αG 또는 PY0T213βG를 도입한 형질전환체에 대하여, 각각의 개체로부터 잎, 뿌리, 및 출수·개화기의 까끄라기꽃을 채취하고, Jefferson et al. (EMB0 J., 6, 3901-3907, 1987)의 방법에 따라서, X-gluc. (5-bromo­4-chloro­ 3­indoly-β-D­glucuronic acid)를 기질로 한 GUS 염색을 하여, 실체현미경 및 광학현미경하에서 세포조직학적 관찰을 하였다. 까끄라기꽃 내부에 있어서의 조사기관은 암술, 꽃밥, 인피, 내·외 까끄라기 및 까끄라기꽃 기부로 하고, 프로모터에 의한 GUS 발현의 강함을 ++(강한 발현)에서부터 - (발현의 검출한계이하)까지 4단계로 설정하였다(표2). 또, 도 7에 있어서는, 흑색이 강한 발현, 사선이 보통∼약한 발현, 얇은 회색이 매우 약한 발현, 백색이 발현없음을 나타내고, L, R, P, A, RO, G, BS의 순서로 잎, 뿌리, 암술, 꽃밥, 인피, 내·외까끄라기, 까끄라기꽃 기부를 각각 나타낸다.

그 결과, pY0T213αG를 도입한 형질전환체에서는, 조사를 한 어느 기관에 서나 GUS 염색되지 않은 개체가 많지만, 임의의 기관에서 프로모터 활성에 의한 GUS 유전자의 발현을 보인 형질전환체가 5개체 얻어졌다. 이들 개체중, pY0T213αG­17에서는, 암술과 인피에 있어서 GUS 발현이 관찰되고, 내·외 까끄라기와 까끄라기꽃 기부에 있어서도 매우 약한 발현이 인식되었다(표2). 이 결과는, 노던 혼성화분석이나 RT­PCR의 결과와 거의 일치한다. 또한 pY0T213αG­4에 관하여는 GUS 발현이 암술특이적으로 검출되었다(표2). 암술에서의 발현부위는 꽃기둥과 씨방과의 경계부분이었다(도 8A). 5개체중 잎과 뿌리 및 꽃밥에서의 GUS 발현을 보인 개체는 없고, 암술에 있어서 발현을 보인 것이 2개체, 인피에 있어서 발현을 보인 것이 1개체이었다(도 7). 또한, 매우 약한 발현이기는 하지만, 내·외 까끄라기, 까끄라기꽃 기부에 있어서 발현을 보인 개체가 각각 4개체, 3개체였다.

[표 2]

한편, pY0T213βG를 도입한 형질전환체에서는, 13개체중 잎과 뿌리에 있어서의 GUS 발현이 전혀 없든가, 또는 매우 약하고, 또한 꽃 기관에 있어서의 GUS 발현이 검출된 개체, 즉 꽃 기관특이적 프로모터활성을 나타낸 개체가 5개체(pY9T213βG-3,7,8,16,17) 얻어졌다(표2). 이중, 암술, 인피에서 비교적 강하고, 꽃밥에서서는 매우 약한, 즉 노던 혼성화 분석이나 RT­PCR의 결과와 잘 일치하는 형질전환체는 2개체(pY0T213βG­7과 8)이었다. 꽃 기관특이적 발현이 관찰된 개체이외의 형질전환체 총8개체에 있어서도, 잎이나 뿌리에 있어서의 발현이 보이기는 하지만, 꽃 기관에 있어서의 비교적 강한 프로모터활성이 인정되었다(표2). 예컨대, pY0T213βG-6에서는, 잎이나 뿌리에 있어서의 GUS 발현은 관찰되지만, 그 이상으로 특히 암술에 있어서 강한 GUS 발현을 보였다. 또한, 내·외 까끄라기나 꽃밥, 인피 및 까끄라기꽃 기부에 있어서, 약한 발현을 보였다(도 8B). PY0T213βG-17에서는, 잎이나 뿌리에 있어서는 발현이 매우 약하거나, 또는 발현이 거의 없었으나(도 8D), 암술에 있어서 비교적 강한 발현이 보였다(도 8C). pY0T213βG를 도입한 형질전환체의 암술에 있어서, GUS 발현이 관찰되는 부위는 주로 암술머리 부위로, 암술머리축 및 암술머리의 털모양조직에서 발현이 보였다(도8B, C). 기관별로 GUS 발현결과를 정리하면(도 7), 잎, 뿌리에 있어서는 강한 발현을 보인 개체는 없고, 잎에서 전체의 1/2이 강한 발현, 뿌리에서 전체의 1/3의 개체가 보통∼약한 발현이 인정되었으나, 나머지의 개체에 대하여서는 발현이 매우 약하거나, 또는 전혀 없었다. 이에 대하여, 꽃 기관에 있어서는 꽃밥이외의 모든 기관, 즉 암술, 인피, 내·까끄라기 및 까끄라기꽃 기부에 있어서, 강한 프로모터활성이 인정되었다. 이중 특히 암술에 있어서는, 13개체 모두에 있어서 명확한 GUS 발현이 인정되고, 이중 1개체에서 청색으로 강하게 염색된 GUS 염색상(강한 발현)이 얻어졌다. 또한, 인피와 내·외 까끄라기에 있어서도 전체의 2/3정도의 개체에서 프로모터활성에 의한 GUS 유전자의 발현이 인정되고, 이중 반수이상의 개체(각각 5개체, 6개체)에서 강한 GUS 발현이 검출되었다. 또한, 까끄라기꽃 기부에서 강한 발현을 나타내는 개체가 2개체 있었다.

이상의 것으로부터, GUS 유전자와 접속한 2개의 DNA 단편이 꽃 기관에서 우세한 프로모터활성을 갖고 있는 것이 분명하여졌다. 또한, 그 활성의 강함은, 단편의 길이에 있어서 긴 213β의 쪽이 높았다. 213β의 프로모터활성이 213α의 활성보다도 높았던 한편, 전술한 바와 같이 양 프로모터 단편의 기관특이성은 매우 유사한 사실로부터, 213β의 염기서열중에는 포함되나 213α의 염기서열중에는 존재하지 않는 213α에서 5′측의 SacI-HindⅢ 3.3kb 단편이나, 혹은 213α에서 3′측의 BglⅡ로부터 2nd ATG까지의 DNA 서열중에(아마 후자에) RPC213 프로모터의 발현량을 제어하는(높은 발현에 기여하는) 염기서열이 포함되어 있는 것으로 생각된다.

산업상의 이용가능성

본 발명에 의하면, 암술이나 인피등의 여러 꽃 기관에 대하여서도 유전자공학적 조작이 가능해진다.

〈110〉 JAPAN TOBACCO INC.

〈120〉 A NOVEL DNA FRAGMENT WHICH DIRECTS A DOMINANT GENE EXPRESSION IN

FLOWER ORGAN

〈150〉 JP 98-43372

〈151〉 1998-02-25

〈160〉 9

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 1524

〈212〉 DNA

〈213〉 Oryza sativa L.

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (22)..(1275)

〈400〉 1

caaaggcaga aaagaaagcc a atg gcg tct tca ggc ctc gca gtt 45

Met Ala Ser Ser Gly Leu Ala Val

1 5

gca gca aca gcc tcg tca gcc tgg ctc tgc tgc ccc aat cat cac atc 93

Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Trp Leu Cys Cys Pro Asn His His Ile

10 15 20

cat acc agc agc agc aga tct cgc aag cat ctt ctt ctc cat ggc ctg 141

His Thr Ser Ser Ser Arg Ser Arg Lys His Leu Leu Leu His Gly Leu

25 30 35 40

tac ggg tct gca cct gca cgt act agg gga cga cgg ccg ccg gtg tgg 189

Tyr Gly Ser Ala Pro Ala Arg Thr Arg Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp

45 50 55

act gcg gcg gcg gcc acc gca gca gcg ccg gcg gac acg gcg gcg tcg 237

Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser

60 65 70

gcg cgg cgg gag cag gtg gag atc gcc cgg tcg ctg aac gcg tgg gtg 285

Ala Arg Arg Glu Gln Val Glu Ile Ala Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val

75 80 85

gag gag aac atg ctc ccg ctg ctc acc ccc gtc gac tcc gcg tgg cag 333

Glu Glu Asn Met Leu Pro Leu Leu Thr Pro Val Asp Ser Ala Trp Gln

90 95 100

ccg cac gac ttc ctt ccc tgc tcg gcc gcg ggc ggc ggc gag gcg ctg 381

Pro His Asp Phe Leu Pro Cys Ser Ala Ala Gly Gly Gly Glu Ala Leu

105 110 115 120

gcg gcg ttc acg gag ggc gtg gcc gag ctg cgc gcg ggc gcc gcc ggc 429

Ala Ala Phe Thr Glu Gly Val Ala Glu Leu Arg Ala Gly Ala Ala Gly

125 130 135

gtg ccg gac gag gtg ctg gtc tgc ctc gtg ggg aac atg gtg acg gag 477

Val Pro Asp Glu Val Leu Val Cys Leu Val Gly Asn Met Val Thr Glu

140 145 150

gag gcg ctc ccg acg tac cag agc atg ggc aac cgc gcc gag ggc ctc 525

Glu Ala Leu Pro Thr Tyr Gln Ser Met Gly Asn Arg Ala Glu Gly Leu

155 160 165

gcc gac ggc acc ggc gtg agc ccc ctc ccc tgg gcg cgc tgg ctc cgc 573

Ala Asp Gly Thr Gly Val Ser Pro Leu Pro Trp Ala Arg Trp Leu Arg

170 175 180

ggc tgg acc gcc gag gag aac cgc cac ggc gac ctc ctc aac cgc tac 621

Gly Trp Thr Ala Glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Arg Tyr

185 190 195 200

ctc tac ctc tcc ggc cgc gtc gac atg cgc cag gtc gag gcc acc gtg 669

Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Val Asp Met Arg Gln Val Glu Ala Thr Val

205 210 215

cac cgc ctc ctc cgc aac ggc atg gag atg ctg gcg ccg gcg agc ccg 717

His Arg Leu Leu Arg Asn Gly Met Glu Met Leu Ala Pro Ala Ser Pro

220 225 230

tac cac ggc ctg atc tac ggc gcg ttc cag gag cgc gcc acc ttc atc 765

Tyr His Gly Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile

235 240 245

tcc cac ggc cac acg gcg agg ctc gcg ggg cag cac ggc gac cgg gcg 813

Ser His Gly His Thr Ala Arg Leu Ala Gly Gln His Gly Asp Arg Ala

250 255 260

ctc gcc aag atc tgc ggc gtg atc gcc gcc gac gag agg cgg cac gag 861

Leu Ala Lys Ile Cys Gly Val Ile Ala Ala Asp Glu Arg Arg His Glu

265 270 275 280

gcg ggc tac acg atg gcg tcc gcc agg ctg ttc gag ctc gac ccg gac 909

Ala Gly Tyr Thr Met Ala Ser Ala Arg Leu Phe Glu Leu Asp Pro Asp

285 290 295

ggc atg gcg cgc gcg ctg gcg gac gtc atg cgc ggg aag gtg acc atg 957

Gly Met Ala Arg Ala Leu Ala Asp Val Met Arg Gly Lys Val Thr Met

300 305 310

ccg ggg cag ctc atg tcg gac ggc cgc gac ggc gac ggc gag cac agc 1005

Pro Gly Gln Leu Met Ser Asp Gly Arg Asp Gly Asp Gly Glu His Ser

315 320 325

ctg ttc gcc cgg ttc tcc gcc gtg gcg gag cgc gcc ggc gtg tac acg 1053

Leu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Val Ala Glu Arg Ala Gly Val Tyr Thr

330 335 340

gcg agg gac tac ggc gaa ctc gtc gag cac ttc gtg cgg agg tgg cgg 1101

Ala Arg Asp Tyr Gly Glu Leu Val Glu His Phe Val Arg Arg Trp Arg

345 350 355 360

gtg gcg gag ctc gcg gcg ggg ctc tcc ggc gag ggc cga cgc gcg cag 1149

Val Ala Glu Leu Ala Ala Gly Leu Ser Gly Glu Gly Arg Arg Ala Gln

365 370 375

gag tac ctg tgc ggg ttg gcg ccc aag atc cgg agg atg gag gag ctg 1197

Glu Tyr Leu Cys Gly Leu Ala Pro Lys Ile Arg Arg Met Glu Glu Leu

380 385 390

gcc cac cgg agg gcg gcc cgc atc gag ccc gct atg gcc cgt ttc agc 1245

Ala His Arg Arg Ala Ala Arg Ile Glu Pro Ala Met Ala Arg Phe Ser

395 400 405

tgg atc ttc gat agg ccc gtc atg ctg ggc tgatc aacccggggc 1290

Trp Ile Phe Asp Arg Pro Val Met Leu Gly

410 415

ttcggttatg gttttatggg cccgtttact gggctctgct tgctcaaatt ataataagct 1350

acatcgtgtg ctaaaataat ttatctttgt tattaaggat tcgtgtgaga aagctatttt 1410

gttttctgta gcaagtttag gaatgtaatg taatgtaatg aagcggcagg acgactgcca 1470

tttgattaag aaaagactcg cgcttgtttg tagtccaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1524

〈210〉 2

〈211〉 418

〈212〉 PRT

〈213〉 Oryza sativa L.

〈400〉 2

Met Ala Ser Ser Gly Leu Ala Val Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Trp

1 5 10 15

Leu Cys Cys Pro Asn His His Ile His Thr Ser Ser Ser Arg Ser Arg

20 25 30

Lys His Leu Leu Leu His Gly Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Ala Arg Thr

35 40 45

Arg Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala

50 55 60

Ala Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg Arg Glu Gln Val Glu Ile

65 70 75 80

Ala Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu Asn Met Leu Pro Leu Leu

85 90 95

Thr Pro Val Asp Ser Ala Trp Gln Pro His Asp Phe Leu Pro Cys Ser

100 105 110

Ala Ala Gly Gly Gly Glu Ala Leu Ala Ala Phe Thr Glu Gly Val Ala

115 120 125

Glu Leu Arg Ala Gly Ala Ala Gly Val Pro Asp Glu Val Leu Val Cys

130 135 140

Leu Val Gly Asn Met Val Thr Glu Glu Ala Leu Pro Thr Tyr Gln Ser

145 150 155 160

Met Gly Asn Arg Ala Glu Gly Leu Ala Asp Gly Thr Gly Val Ser Pro

165 170 175

Leu Pro Trp Ala Arg Trp Leu Arg Gly Trp Thr Ala Glu Glu Asn Arg

180 185 190

His Gly Asp Leu Leu Asn Arg Tyr Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Val Asp

195 200 205

Met Arg Gln Val Glu Ala Thr Val His Arg Leu Leu Arg Asn Gly Met

210 215 220

Glu Met Leu Ala Pro Ala Ser Pro Tyr His Gly Leu Ile Tyr Gly Ala

225 230 235 240

Phe Gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile Ser His Gly His Thr Ala Arg Leu

245 250 255

Ala Gly Gln His Gly Asp Arg Ala Leu Ala Lys Ile Cys Gly Val Ile

260 265 270

Ala Ala Asp Glu Arg Arg His Glu Ala Gly Tyr Thr Met Ala Ser Ala

275 280 285

Arg Leu Phe Glu Leu Asp Pro Asp Gly Met Ala Arg Ala Leu Ala Asp

290 295 300

Val Met Arg Gly Lys Val Thr Met Pro Gly Gln Leu Met Ser Asp Gly

305 310 315 320

Arg Asp Gly Asp Gly Glu His Ser Leu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Val

325 330 335

Ala Glu Arg Ala Gly Val Tyr Thr Ala Arg Asp Tyr Gly Glu Leu Val

340 345 350

Glu His Phe Val Arg Arg Trp Arg Val Ala Glu Leu Ala Ala Gly Leu

355 360 365

Ser Gly Glu Gly Arg Arg Ala Gln Glu Tyr Leu Cys Gly Leu Ala Pro

370 375 380

Lys Ile Arg Arg Met Glu Glu Leu Ala His Arg Arg Ala Ala Arg Ile

385 390 395 400

Glu Pro Ala Met Ala Arg Phe Ser Trp Ile Phe Asp Arg Pro Val Met

405 410 415

Leu Gly

〈210〉 3

〈211〉 5396

〈212〉 DNA

〈213〉 Oryza sativa L.

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (5016)..(5162)

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (5244)..(5396)

〈400〉 3

gagctcatgt gaccgttctc ggtgagttca gagataacgt ttagacttcc cttatcagcc 60

tcgtgcgggc acctataggg tttgtctgag tcaatctccg atgtcagcca agaaagaaca 120

gagcatacga gtaaatctcc cgtcttgctg taatcaagaa tttggattga agtcaagaaa 180

ttttatctcg gcaggtacac catctcttca ttccgtattc cttgtcgaga tccaccaacc 240

gttctcgagt gatcgagaag gtgtagaatc tgcgacggag ctttgtcgac atttgtcgta 300

ctcgccttag tcgatcttgg tgtagaacca tagagacatg gagccttcgt caatgtcgaa 360

tagaattttc ctgaaatcaa tactcataaa agaatattag atagaaataa cccccgagcg 420

aacgctcaaa gggtaacatg ttatacaatg tatggaaaac tgaaaatgaa ttaaatttac 480

agaccaatgt tttgtatatg agcgtctact cttttaccga cttcgatcag tcaatttgtt 540

aagttatata ctttccctag cccctagcct tgtcgttgga gaatcgttct cggaagataa 600

ggctcttgga cctttgacct gcctcggttg aacaagcact aatcctagcc cccagccgtg 660

aagttggaaa acccgatttc cgattacacg gcttggttaa tacgcacggc gagaactctt 720

acacgaccag atcttacatg gtcttttgtc tctacagtat ccgacaaggc cttattggct 780

ctgggcgtcc ccagccgaag ttcccttagg ttcctcggag gccttgtcaa gacggtgtaa 840

agggacagta ggataggttt caacgctagg tgtcatcgtg gtaagggatc tctgggtaaa 900

acacttggcg atcttgtgta cctgatatca actttgttgg agtaaaggta atgggagaat 960

cgctacacct ctggttgagg accaggtggt agtcgcaact cgaccacttg aagtagaaat 1020

agtgggagaa tcgctacacc gctggtcgag aaccaagtag tagtctaaac tcgaccacta 1080

gaattaaagg tagtgggaga atcgctacac cgctggtcga gaactaggta tagtctaaac 1140

tcgaccacta gaagtaaagg tagtgggaga atcgctacac cgctggtcga ggaccaggta 1200

gtagtcgtaa ctcgaccact agaagtggaa atagtgggag aatcgctaca ccgctggtcg 1260

agaaccaggt gtaatctaaa ctcgaccact tgaagtaaat gtgcgagaga tcgctacgat 1320

tgacgggtct agaaccagtg agtaggtgtc tctcaaccat cttaagtcat ggtgcgagga 1380

ctgctgcgtt attgctgtag tcgtacctcg accatctaaa gttaaggtgc gagagattgc 1440

tacgttttac tagttcaaga accagcgagc gagtagaatt atctctcgaa caccaatgaa 1500

agttgcggtg cgagagattg ctacgtactg gttcgaggac catcgagcga gtagaattat 1560

ctctcgaaca ccaatggaag ttgcggtgcg agagatttct acgtactggt tcgagaacca 1620

gcgagcgagt agaatcatct ctcgaacacc aatggaggtt gcggtgcgaa agattaatat 1680

gcactggttc gaggaccagc gaacgtgtag agttatatct cgaacaccaa tggaagttgc 1740

ggtgcgagag attgctacgt actagttcga ggaccatcga gcgagtagaa ttatttctcg 1800

aacaccaatg gaagttgcgg tgcgagagat tgctacgtac tggttcgaga accagcgagc 1860

gagtagaatt atctctcgaa caccaatgga agtttgcggt gcgagagatt gctacgtact 1920

ggttcaagaa ccatggaagt tgcggtgcga gagatttcta tgtactggtt cgaggaccag 1980

ggagcgagta gaattatctc tcgaacacca atggaagttt gcggtgcgag agattgctac 2040

gtactggttc gagaaccagt gaatgtgtag agttatctct cgaacaccaa tggaggttgc 2100

ggtgcgagag attgctacgt actggttcga gaaccagcga acgtgtagag ttatctctcg 2160

aacacatgga ggttgcggtg cgagagattg ctacgtactg gttcgaggac cagtgaacgt 2220

gtagagttat ctctcgaaca ccaatggagg tgctagagtt ggtttattac atatgcgtct 2280

catgtggcca gcatgactca cacacccaac ttgtagcata tccggatgtc tgttcgcaag 2340

catgtcgggt gatcaagccg acagcgctcg cgaggaatta tccgttaaca accttttctc 2400

gagtagtcta gccatggcgg gtgctatgag ataggtcgtc ggtcttcgtt ggtgggttgg 2460

gcgtgacgac tttgcatttg tcgagatcgt tctcgataat gcggtgtact tgaccacaac 2520

ctagtcgagt gctcaattgt tcctgaaaaa tattttctag aagacaagac atatagcaga 2580

taatatcgag tatgtactca gaaaactgca tggatcttct agtattatca ggatgtaacg 2640

agcagatgta aatattaggc attatgtaaa ccgtaaacaa gcatgattca tacaaaagag 2700

aatagagcga gccccagtgt tagaccgttg tcggcctaac accggaaaca ctcacataat 2760

aaatattgta taaaaaacat gctctaggta aacataataa attatattat agatctgaca 2820

attctgtatg atctgaatag gtacgataaa ttgcatataa aatattgcgt acctttgtag 2880

atacatgccg gatgtatcta cgaaattagt agattcaatc tactgaatac ctttgccttc 2940

ttggtgagga acagcaactc cttaatatgc ttttgcgtgc atggtactgt cccccgtgca 3000

cgtaccatgt aatctggtca tttaattgac ctgtttgtct ttagccccga gtcagattgc 3060

tgcctagaga ttggatagta gtgcagacgt ggaaactccc cgagtccgac tagcatttac 3120

accaataagc agatcaatcc gacgctttga tttccgctcc acgacgcgct tgttttgttg 3180

gtggagatcg atgccgtgtt cggcttggac gcggttaatc gagccctcca ccagttgatg 3240

tggcgcgtgt attggtactg atcaatctcg aaggttgtct gcactgttga ttgacaacct 3300

caaaattgac gtgatccacg gcattgacgt cttgaagctt gagcgatcct gataaatcga 3360

atttgttgac gacgattgtt ccgatctcgt cgggacacgt attctggtag gtttagatca 3420

cccaacagcg aagttgtcga gtagattgtt gtcggagaat ccatctctta aacccatctc 3480

gtcgaaatcc tgaagcacca aaatccccct acctggcgtg ccattatcga cgtttgatgt 3540

ctcgactacg gtatttgcat gtcatggggg atcgttggta ctaggatata cgcgagactg 3600

acgtaaaaga gatggagaca gggattttta tacaggttcg ggcccctgaa ttgtcatata 3660

ataaccctac atcctgttgg ccgaagccgg tattgctctt attcatgata atcacaccat 3720

tacaatattt agggtagcct atctaactat tgtcgacatg gcggtctgac gatctgactc 3780

gtagtcgaca acagggtagc cttcctcctc gaacctgtgc ctgacgagat cagagatagc 3840

gctttcgtct ctcctgacag tatcctgaga caccgtaggg gacttgtcgt gcctatctct 3900

gaagtcgata tccggcgtct tgtcttggcg tatgttggct tgtattggct tgtggctttg 3960

tggcgtttat gttgctcgta tattgtggtg ggtgtgtatt gtccgtgtct tgtatggtgg 4020

gtgtcgattg tgtcccattt ccttctaggg gaccttgtat ttatacccat aggtgtcccc 4080

ttgtccaagt agaactaggg aaaccaatat ggatacaatc cgattagtcc tttgtcgttt 4140

ccatgtagaa ctttggttgt ctttctttat ccggaactcc tcctatatcc gcaggttatt 4200

ttcgtatagg acatgttatg tggtgggtcc taccgagatt tagtcaacta ctattaggta 4260

tgtggtatcc ataaccctga cacataccat gatttttctg tctatcaata actgcctcgg 4320

tgaacttgaa gaagtaggtt gttattgcag caataatgag acaaactagt atttatttat 4380

gatatccctt ggttaagtag tcatgcgtta taataggaac ctctaattcc ctcgtaaata 4440

cagctaagtt tattataaca agagctttaa taatattaaa attgtagcct tttttggatt 4500

tgtacgaaat aattagcctt aaaaaacatt taatgttggt tagctcaaaa tatttggaaa 4560

tggagtgagt atatgttact gacttcaaaa atttttcaaa cggtattcat gtcgttttcg 4620

tgagtggact gaaacagcag taattacatt gaacatttga acacctgtat aaagtattaa 4680

atatatacta aaaaataatt aattatacat attacgacta atttgcaaga cgaatctttt 4740

aagcataatt gctccatgat ttaacaatat agtgctacag taaacatgtg ctaatgacgg 4800

attaattagg cttaataaat tcgtctcacg tttactgacg gattctataa ttgatttttt 4860

tattaatgcc caaacacccc atacaacact ctatataata ctcaatgtga cgtgccaaaa 4920

ctttagacac ctggatgtaa acaccactct gttccttctc ctctataaat ggcaccgggg 4980

tggtttgtcg gcaccaaagg cagaaaagaa agcca atg gcg tct tca ggc 5030

Met Ala Ser Ser Gly

1 5

ctc gca gtt gca gca aca gcc tcg tca gcc tgg ctc tgc tgc ccc aat 5078

Leu Ala Val Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Trp Leu Cys Cys Pro Asn

10 15 20

cat cac atc cat acc agc agc agc aga tct cgc aag cat ctt ctt ctc 5126

His His Ile His Thr Ser Ser Ser Arg Ser Arg Lys His Leu Leu Leu

25 30 35

cat ggc ctg tac ggg tct gca cct gca cgt act agg tatagtag 5170

His Gly Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Ala Arg Thr Arg

40 45

ctgcaacttt attcacaatg tgatgtcacg ttattatata tgtttcgtcg tcaatggcgg 5230

cgaaccttgc agg gga cga cgg ccg ccg gtg tgg act gcg gcg gcg 5276

Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala Ala Ala

1 5 10

gcc acc gca gca gcg ccg gcg gac acg gcg gcg tcg gcg cgg cgg gag 5324

Ala Thr Ala Ala Ala Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg Arg Glu

15 20 25

cag gtg gag atc gcc cgg tcg ctg aac gcg tgg gtg gag gag aac atg 5372

Gln Val Glu Ile Ala Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu Asn Met

30 35 40

ctc ccg ctg ctc acc ccc gtc gac 5396

Leu Pro Leu Leu Thr Pro Val Asp

45 50

〈210〉 4

〈211〉 49

〈212〉 PRT

〈213〉 Oryza sativa L.

〈400〉 4

Met Ala Ser Ser Gly Leu Ala Val Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Trp

1 5 10 15

Leu Cys Cys Pro Asn His His Ile His Thr Ser Ser Ser Arg Ser Arg

20 25 30

Lys His Leu Leu Leu His Gly Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Ala Arg Thr

35 40 45

Arg

〈210〉 5

〈211〉 51

〈212〉 PRT

〈213〉 Oryza sativa L.

〈400〉 5

Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg Arg Glu Gln Val Glu Ile Ala

20 25 30

Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu Asn Met Leu Pro Leu Leu Thr

35 40 45

Pro Val Asp

50

〈210〉 6

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 PRIMER

〈400〉 6

cgctatggcc cgtttcagct 20

〈210〉 7

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 PRIMER

〈400〉 7

gtcgtcctgc cgcttcatta c 21

〈210〉 8

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 PRIMER

〈400〉 8

tgctggtatg gatgtgatg 19

〈210〉 9

〈211〉 18

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 PRIMER

〈400〉 9

ctgacgaggc tgttgctg 18

〈210〉 10

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 PRIMER

〈400〉 10

gacgtgatcc acggcattga cg 22

〈210〉 11

〈211〉 27

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 PRIMER

〈400〉 11

cggggatccg ttctcctcca cccacgc 27

Claims (21)

1. 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제3335번째로부터 제 5108번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 그 일부의 서열, 또는 이들 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편.
2. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 전사개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류 적어도 500염기로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
3. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 최초의 번역개시 코돈(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제5016번째로부터 제5018번째의 염기) 상류영역인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
4. 제 3항에 있어서, 상기 번역개시 코돈 상류영역이 전사개시점 상류 적어도 500염기로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
5. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 전사개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류영역인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
6. 제 5항에 있어서, 상기 전사개시점 상류영역이 적어도 전사개시점 상류 500염기인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
7. 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제3335번째로부터 제5108번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 이 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편.
8. 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 그 일부의 서열, 또는 이들 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터활성을 갖는 DNA 단편.
9. 제 8항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 HindⅢ 부위(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제3335번째로부터 제3340번째의 염기)로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
10. 제 8항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 전사개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류 적어도 500염기로부터 하류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
11. 제 8항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 제3번째의 BglⅡ 부위(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제5103번째로부터 제5108번째의 염기)로부터 상류인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
12. 제 8항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 최초의 번역개시 코돈(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제5016번째로부터 제5018번째의 염기) 상류영역인 DNA 단편.
13. 제 8항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열의 일부의 서열이 전사개시점(상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열중 제4995번째로부터 제4997번째의 염기) 상류영역인 DNA 단편.
14. 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열, 또는 이 서열중 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편.
15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한항에 따른 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편과 그 제어하에 있는 소망의 구조유전자를 포함하는 키메라 DNA 서열.
16. 제 15항에 따른 키메라 DNA 서열을 갖는 형질전환용 벡터.
17. 서열표의 서열번호 2로 표시되는 염기서열중, 제1번째로부터 제5369번째의 염기로 이루어지는 서열 또는 꽃 기관특이적 프로모터 활성을 유지하는 그의 일부의 서열과 혼성화할 수 있는 꽃 기관특이적 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편.
18. 제 17항에 있어서, 상기 혼성화는 중간정도의 혼성화강도 조건하에서 행하여지는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
19. 벼 또는 다른 식물의 게놈 DNA 라이브러리로부터 서열표의 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 그 일부의 서열을 프로우브로서 사용하여 스크리닝하는 것에 의해 얻어지는 DNA 서열로부터 특정할 수 있는 것을 특징으로 하는 꽃 기관특이적 프로모터서열.
20. 제 19항에 있어서, 상기 스크리닝은 중간정도의 혼성화강도 조건하에서의 혼성화에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 꽃 기관특이적 프로모터서열.
21. 서열표의 서열번호1로 표시되는 서열중, 제22번째로부터 제1278번째의 서열중, 또는 그들에 상보적인 염기서열중 적어도 연속하는 15염기의 서열을 갖는 DNA단편.