KR101066024B1

KR101066024B1 - 토마토 유래의 꽃 조직 특이적 유전자 Ｓｌ3108 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101066024B1
Application number: KR1020090009560A
Authority: KR
Inventors: 권석윤; 박정미; 허철구; 임찬주; 김웅범; 송나영; 이복심
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2011-09-21
Also published as: KR20100090352A

Abstract

본 발명은 토마토의 꽃 조직에서 특이적으로 발현되는 Sl3108 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 프로모터, 상기 유전자 또는 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 재조합 벡터를 이용하여 외래 유전자를 꽃 조직 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 단백질에 대한 항체, 및 상기 유전자 또는 상기 항체를 포함하는 꽃 조직 특이성을 진단하기 위한 마이크로어레이에 관한 것이다.

꽃 특이적, Sl3108 유전자, 프로모터, 항체, 형질전환, 마이크로어레이

Description

토마토 유래의 꽃 조직 특이적 유전자 Ｓｌ3108 및 이의 용도{Flower tissue-specific gene Sl3108 from Solanum lycopersicum and uses thereof}

본 발명은 토마토 유래의 꽃 조직 특이적 유전자 Sl3108 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 토마토의 꽃 조직에서 특이적으로 발현되는 Sl3108 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 프로모터, 상기 유전자 또는 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 재조합 벡터를 이용하여 외래 유전자를 꽃 조직 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 단백질에 대한 항체, 및 상기 유전자 또는 상기 항체를 포함하는 꽃 조직 특이성을 진단하기 위한 마이크로어레이에 관한 것이다.

식물은 생태계에 있어서 생산자의 역할을 하며, 탄수화물과 산소를 생성하는 광합성 작용으로 인하여 생물체가 살아가기 위한 근본적인 화합물을 만들어 내는 생화학 반응을 가지고 있다. 산소는 생명체들이 유산소 호흡을 하기 위해 반드시 필요한 중요한 요소이며, 인간을 포함한 많은 동물들의 기본적 에너지를 식물에 의지하여 살아간다.

이러한 식물들이 성장하고 자손을 생성하기 위해서는 생식이 필요한데, 식물 의 생식은 무성생식과 유성생식으로 구분되며, 이 중에서 유성생식은 수분으로부터 시작된다. 수분은 꽃의 꽃가루가 암술머리와 접촉하는 것을 의미하는데, 꽃가루의 이동 경로에는 여러가지가 있지만, 이러한 수분이 이루어지기 위해서는 꽃의 생성이 매우 중요하다.

기존의 35S 프로모터는 쌍자엽식물 조직의 모든 부위에서 발현 효율이 굉장히 좋은 프로모터이다. 그래서 식물체에 유전자를 발현시키는데 있어서 가장 유용하게 사용할 수 있는 프로모터이다. 그러나, 이것은 특정 물질을 형질전환하여 원하는 조직에서 발현시키기에는 불필요한 발현으로 식물에서 느끼는 부담이 매우 크다. 그래서 토마토와 같은 식물에서 줄기나 잎에서의 불필요한 발현을 줄이고 꽃에서 특이적으로 발현하도록 하는 연구가 필요한 것이다.

한국특허공개 제2001-0012118호에는 꽃 기관에서 우세한 유전자 발현을 명령하는 신규한 디엔에이 단편이 개시되어 있으나, 본 발명의 유전자와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 꽃에 특이적으로 존재하는 유전자에 관해 연구하던 중, 토마토 유래의 Sl3108 유전자가 꽃 조직에서 특이적으로 발현되는 것을 밝히고, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 꽃 조직에서 특이적으로 발현되는 Sl3108 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자의 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 외래 유전자를 꽃 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 항체를 포함하는 꽃 조직 특이성을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

꽃 조직 특이성 유전자는 꽃의 생성에 필수적으로 관여하는 유전자로서 발생에 관여하는 단백질-단백질 상호작용, 경로 또는 조절 네트워크의 정보를 밝히는 것이 중요하다. 그러나 이러한 정보를 밝히기 위해 개별적인 유전자를 분석하여 생성하는 것은 실제로 조직 발생에 관여하는 유전자를 밝히는데 매우 오랜 시간이 소모된다.

본 발명가는 Sl3108 유전자가 꽃 조직에서 특이적으로 발현하는 사실을 제공함으로써 연구자들이 꽃 조직의 생성과 기능에 대한 단백질-단백질 네트워크나 경로와 같은 정보에 쉽게 접근할 수 있으며, Sl3108 유전자가 꽃 조직 특이성 유전자라는 사실로 인하여 관련 연구에서 위양성(false positive)을 감소시킬 수 있다. 뿐만 아니라 꽃 관련 진단에서 Sl3108 유전자는 마커로서 사용이 가능함으로 보다 쉬운 기능 연구를 수행할 수 있고, 산업적으로 유용한 형질을 개발할 경우, Sl3108에 대한 단백질로 연구 및 분석 타겟을 축소할 수 있으므로 보다 빠른 형질 개발과 육종이 가능하다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 꽃 조직에서 특이적으로 발현되는 Sl3108 (Solanum lycopersicum 3108) 단백질을 제공한다.

DNA 칩과 같은 방법을 통하여 조직 특이적 유전자를 예측해도 실험상에 존재하는 수많은 오류들로 인하여 실제로 조직 기능에 관여하는 유전자인지, housekeeping 유전자인지 또는 실험적인 오류에 의한 것인지 구별이 불가능하다. 그러나 EST(Expressed Sequence Tag)를 기반으로 Audic-Claverie Test를 수행하거나 RT-PCR과 같은 실험을 이용하여 후보군이 조직 특이적 유전자로 밝혀질 경우, 유전적 영향을 주는 요인으로 판단이 가능함으로 후보군에 대한 신뢰성이 증가하게 된다. 본 발명가는 조직 발생에 관여하는 유전자의 후보군을 조사하고, 그것들이 조직 특이적 정보를 포함하는지 조사함으로써 조직 발생에 관여하는 유전자의 후보군에 대한 보다 높은 신뢰성을 제공했다.

본 발명가는 꽃 조직에서 특이적으로 발현하는 유전자를 조사하기 위하여 Expressed Sequence Tag(EST) 자료를 이용하여 EST가 특정한 유전자에 많은 수를 가지는지 조사하고, Audit-Claverie Test를 수행하여 조직 특이적 정보를 가질 수 있는 다수의 유전자를 확인한 다음, 해당 유전자가 알려지지 않은 유전자(novel gene)인지 확인하기 위하여, TISA 데이터베이스에서 관련 정보를 찾고, Gene Ontology 데이터베이스를 이용하여 기능을 분석하며, STRING 데이터베이스에서 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 추출했다. 이 유전자들 중에서 Sl3108 유전자가 실제로 꽃 조직 특이적 유전자임을 RT-PCR 실험을 통해 검증하였다. 도 1은 꽃 조직에 특이적인 유전자를 분석하기 위한 시스템을 도식화한 것으로 유의한 유전자가 실제로 조직 특이적 유전자인지 확인하고, 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 분석하는 것이다.

따라서, 본 발명은 꽃 조직에 특이적으로 발현되는 Sl3108 단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 Sl3108 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 40% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에 따른 Sl3108 단백질은 바람직하게는 토마토 유래이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 Sl3108 단백질과 핵산 서열은 꽃에 관여하는 질병 메커니즘과 꽃 관련 유용 형질에 대한 형질 전환 타겟과 관련된 고등식물과 작물의 육종 타겟으로 이용될 수 있다. 이들 경우에, Sl3108 단백질로 연구 타겟을 축소할 수 있으므로 기술적 이해가 빠르고 연구 결과도 효과적으로 이용될 수 있다. 또한 이 유전자의 프로모터를 이용하여 꽃 특이적으로 외부 유전자의 발현을 조절하여 특정 유용 단백질을 꽃에 축적하거나, 꽃의 형태 및 크기 등 원하는 형질의 도입이 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 Sl3108 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 Sl3108 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 펙틴 메틸에스테라아제(pectin methylesterase)를 코딩하는 것으로 추정되며, 그 크기는 1659bp이다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %" 는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 Sl3108 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 도 4에 기재된 이의 부분적인 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 꽃 조직 특이적 발현을 유도할 수 있다.

또한, 상기 프로모터의 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 3의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 및/또는 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 벡터는 Sl3108P::GUS 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있 다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 페투인 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

발현 벡터에서 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및

상기 재조합된 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 꽃 조직 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

상기 외래 유전자는 식물체 꽃 조직에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 재조합 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 애기장대, 토마토, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질에 대한 항체를 제공한다. 상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 이들 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 유전자 또는 본 발명의 항체를 포함하는, 꽃 조직 특이성을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명의 유전자가 꽃 조직에서 특이적으로 발현되므로, 본 발명의 유전자 또는 항체를 프로브로 이용하여 대상 표적 시료와 혼성화를 실시하면 표적 시료의 조직 특이성을 알 수 있는 것이다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 본 발명의 유전자 또는 항체가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 유전자 또는 항체 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 마이크로어레이는 칩과 상호 교환하여 사용할 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되 는 조건하에 유전자 또는 항체 프로브가 커플링될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

실시예 1: TISA 데이터베이스를 이용한 꽃 조직 특이적 유전자 후보군의 설정

Noh SJ 2006 [DNA Res 13(5) 229-43]는 유전자, 전사체 구조, Alternative Splicing events와 조직 특이성의 정보를 담고 있는 TISA (Tissue-specific Alternative Splicing) 데이터베이스를 발표했다. TISA는 발현 조직의 정보를 포함하고 있는 EST 자료를 유전자 지도로 군집하여 해당 TISA의 유전자들이 각기 조직 별로 가지는 EST 수가 통계적으로 유의한지를 검증하여 조직 특이성 유전자를 판별하는 데이터베이스이다. TISA에서 꽃 조직 특이적 유전자로 예측된 유전자가 있으면 이를 꽃 조직 특이적 유전자의 후보군으로 추출하였다.

실시예 2: 꽃 조직 특이적 유전자의 RT-PCR 실험

토마토 total RNA는 Trizol RNA 추출 매뉴얼을 통해 추출하였으며, 시료는 모두 Microtom을 사용하였다. 사용된 RNA 조직은 모두 6 가지로 그 종류는 종자, 잎, 뿌리, 푸른색 과실, 붉은색 과실 및 꽃이다. 이들의 total RNA 2 ㎍으로부터 Roche Co. Ltd RT-PCR 키트 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 아래와 같다. PCR 조건은 예비변성 94℃ 3 min에 이어, 94℃ 30 sec, 어닐링 57℃ 30 sec, 연장 72℃ 1 min의 35 사이클 후, 72℃ 10 min 동안 최종 연장하였다. 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 PCR 산물을 확인하였다.

프라이머 서열:

정방향 프라이머: 5'-ATGACAAAGAAGGTGGTAATTGG-3' (서열번호 4)

역방향 프라이머: 5'-TTACACCTTCATCATGCCAGC-3' (서열번호 5)

도 2는 Sl3108 유전자의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, Sl3108 유전자는 꽃 조직에서 특이적으로 발현하는 유전자임을 알 수 있다.

실시예 3: Genomic DNA PCR을 통한 꽃 조직 특이적 유전자의 프로모터 분리 및 GUS 발현용 형질전환 벡터의 제작

토마토 Genomic DNA는 CTAB법(Keim P., et al. 1988 Soybean Genet. Newsl. 15, 150-152)을 이용하여 Heinz 품종의 잎에서 추출하였다. 분리된 Genomic DNA 100 ng을 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였으며, 사용된 프라이머는 아래와 같다. PCR 조건은 예비변성 94℃ 3 min에 이어, 94℃ 30 sec, 어닐링 57℃ 30 sec, 연장 72℃ 1 min의 35 사이클 후, 72℃ 10 min 동안 최종 연장하였다.

프라이머 서열:

정방향프라이머: 5'-AAGCTTGGAAACGAGATTCATCTTTGG-3' (서열번호 6)

역방향프라이머: 5'-GGATCCTTTTTTGGTTTTTTGATTTTTTTG-3'(서열번호 7)

PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 확인한 후 Bioneer Co. Ltd의 겔 정제 키트를 이용하여 용출을 수행하고 Promega Co. Ltd의 pGEM-T easy 벡터에 라이게이션을 마치고 SP6, T7 Universal Primer로 Sequencing 확인하였다. 이를 제한효소 사이트인 HindIII와 BamHI을 이용하여 GUS 발현 벡터인 pCAMBIA1391에 라이게이션을 수행하였다 (Sl3108P::GUS 융합 구축물).

실시예 4: 꽃 조직 특이적 GUS 발현 형질전환 식물체 개발

실시예 3에서 제작한 꽃 조직 특이적 GUS 발현용 벡터 (Sl3108P::GUS 융합 구축물)를 Agrobacterium tumefaciens (GV3101)에 1987년에 [G. An 1987 Methods in Enzymo. 153, 292-305]에 의해 발표된 방법으로 형질전환을 수행한 후, 이를 Floral Dip 방법(Clough S.J., Bent A.F. 1998 Plant J. 16, 735-743)으로 애기장 대 (Arabidopsis thaliana L. Heynh. ecotype Col-0)에 형질전환을 수행하였으며, 형질전환 식물체는 3% 수크로스, 50 mg/l 하이그로마이신 B, 0.25% phyta-gel (pH 5.8)를 포함한 MS 배지 (Murashige T., Skoog F. 1962 Physiol. Plant. 15, 473-497)에서 선별해 낼 수 있었다. 최종적으로 이들 형질전환 식물체를 T₂세대에서 GUS 염색 (Jefferson R.A., et al. 1987 EMBO J. 6, 3901-3907)을 수행하여 GUS 발현 패턴을 분석하였다.

도 3은 Sl3108 유전자의 발현 패턴을 Sl3108P::GUS 를 함유하고 있는 애기장대 형질전환 식물체에서 GUS 염색 결과를 통해 나타낸 것이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, Sl3108 유전자는 꽃 조직에서 특이적으로 발현하는 유전자임을 알 수 있다.

실시예 5: Gene Ontology를 이용한 꽃 조직 특이적 유전자의 참조

Gene Ontology (http://www.geneontology.org/)는 유전자의 공통적인 기능에 대해 정리한 데이터베이스로서 서열상의 단순한 유사성에 의해 기능을 유추하는 것이 아니라, 기존에 알려진 기능 정보를 어떻게 통합하여 제공하는가에 초점을 맞추고 있다. Gene Ontology 데이터베이스를 만든 컨소시움은 생물학적 기능을 묘사하는데 사용될 수 있는 ontology를 생성하기 위해 다수의 데이터베이스를 참조하고 있으며, 이들은 기능을 묘사할 수 있는 controlled vocabulary를 확립하는데 그 목적이 있다. Gene Ontology 데이터베이스는 유전자를 Molecular Function, Biological Process, Cellular Component로 구분하고 있으며, 각기 세부적으로 계층적인 controlled vocabulary를 가지고 있다.

꽃 조직에 특이적으로 나타나는 유전자 후보군이 Gene Ontology 데이터베이스 상에서 어떤 기능을 가지는지 확인하기 위하여 Web 상에서 제공하는 검색 기능을 이용하여 꽃 조직 특이적 유전자 후보를 검색하였다. 조사 결과 알려진 정보가 전혀 없음으로 보아 아직 알려지지 않은 유전자로 판단된다.

실시예 6: STRING을 이용한 꽃 조직 특이적 유전자의 단백질 상호작용 분석

STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Proteins; http://string.embl.de)은 단백질 상호작용에 관련된 종합적인 정보를 제공하는 데이터베이스로서, 2000년에 [Snel B 2000 Nucleic Acids Res 28(18) 3442-4]에 의해 발표된 이후 계속적인 업그레이드로 2007년에 version 7.1이 발표되었다.

꽃 조직 특이적 유전자 후보가 가지는 단백질 상호작용의 정보를 확인하기 위하여, STRING에서의 단백질의 서열을 우리의 후보군 데이터와 BLAST alignment (identity>=90% 및 coverage>=20%)를 통하여 단백질을 결정하고, 그에 해당하는 단백질 상호작용 정보를 추출하였다.

분석 결과, STRING 데이터베이스에서 Sl3108은 애기장대의 Pectinesterase family protein (At3g05610, Identity 46%)과 가장 유사한 단백질임을 확인하였지만 여러 단백질 상호작용에 관련된 정보는 확인할 수 없었다. 그러나 단백질의 도메인을 조사한 결과, Pectinesterase catalytic domain (IPR000070)을 포함하고 있 었다. 상기 도메인을 함유하고 있는 단백질 패밀리는 세포벽의 중요구성물질인 펙틴의 변형에 관여한다고 알려져 왔다. 따라서 Sl3108 역시 이와 유사한 기능을 수행할 것으로 추측되어진다. 하지만 이는 서열 유사성에 의해 이루어진 결과일 뿐, 실제 단백질에 대한 결과는 아니므로 결과가 이에 한정되지 않는다.

도 1은 꽃 특이성 유전자를 분석하기 위한 시스템을 도식화한 것이다.

도 2는 Sl3108 유전자의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 Sl3108 유전자의 꽃 조직 특이적 발현을 GUS 염색을 통해 애기장대 형질전환 식물체에서 확인한 결과이다.

도 4는 Sl3108 유전자의 프로모터의 부분적인 서열을 보여준다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Flower tissue-specific gene Sl3108 from Solanum lycopersicum and uses thereof <130> PN09017 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1659 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 atgacaaaga aggtggtaat tggtggaata gcttctgttc ttgtggtggc ttgtgtggtg 60 gcagcctgtg tcaccctgac taaacatgat tctgaccctt catcaaatgg agttgcaact 120 tcaacaaagt cagttgaatc tatgtgtcaa cccacaccat acaaacaaac ttgtgaaaag 180 accctctccg cagcaaagaa tgtgtccgat ccaaaggact acatcaaggt tgcattcgaa 240 gccactgtgg cagacatcaa gaatgccatc aagaacactg agccagttaa gaaagctgcc 300 agtgatcctt acaccaaaga cgctctcctt gcttgtgaag aggtgtttga tctagccgtt 360 gaggaactaa ggggctctgt cgctaggatt gagaactttg atttctctaa gatgaaggat 420 atagtggatg acctcaagtc atggcttagc gctgtcgttg cttatgaaga gacttgttta 480 gatggtttca ccaaatcaga atacagtgca acccgtgacg aaatgatgaa gctaatgagc 540 accacccggg agctgagtag caatgctctt tccatggtca acagcttcgg tgaaatgatc 600 acacaaaaca caggccttac ccgcaaattg ttatcaaaca 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Leu 145 150 155 160 Asp Gly Phe Thr Lys Ser Glu Tyr Ser Ala Thr Arg Asp Glu Met Met 165 170 175 Lys Leu Met Ser Thr Thr Arg Glu Leu Ser Ser Asn Ala Leu Ser Met 180 185 190 Val Asn Ser Phe Gly Glu Met Ile Thr Gln Asn Thr Gly Leu Thr Arg 195 200 205 Lys Leu Leu Ser Asn Ser Asp Ser Phe Val Glu Ala Ser Asn Arg Lys 210 215 220 Leu Leu Gln Ile Ser Ala Ser Lys Pro Asn Ala Val Val Ser Ala Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gln Tyr Lys Thr Ile Gln Glu Ala Leu Gln Ala Val Pro 245 250 255 Arg Ser Ser Pro Thr Pro Phe Val Ile Leu Ile Lys Ala Gly Thr Tyr 260 265 270 Lys Glu His Ile Glu Ile Glu Lys Asn Met Leu Asn Val Val Leu Ile 275 280 285 Gly Glu Gly Pro Thr Lys Thr Ile Ile Thr Gly Asp Gln Ala Val Val 290 295 300 Pro Asn Arg Ile Ser Thr Trp His Thr Ala Thr Leu Gly Val Cys Gly 305 310 315 320 Asp Gly Phe Val Met Lys Asp Met Gly Ile Glu Asn Thr Ala Gly Pro 325 330 335 Thr Lys Glu Gln Ala Val Ala Leu Arg Ile Asn Ala Asp Arg Ala Val 340 345 350 Leu Tyr Asn Cys Asn Ile Asp Gly Tyr Gln Asp Thr Leu Tyr Ala His 355 360 365 Ser Gly Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Cys Thr Ile Thr Gly Thr Ile Asp 370 375 380 Phe Leu Phe Gly Asp Ala Ser Ala Val Phe Gln Asn Cys Lys Leu Ile 385 390 395 400 Val Arg Lys Pro Gly Pro Asn Gln Ala Cys Met Ile Thr Ala Gln Gly 405 410 415 Arg Met Arg Lys Asp Ser Phe Gly Thr Phe Val Ile Gln Asn Cys Asp 420 425 430 Ile Lys Ala Asp Pro Ala Leu Thr Ser Ala Asn Pro Pro Val Lys Val 435 440 445 Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Lys Glu Phe Ser Lys Thr Ile Ile Met Gln 450 455 460 Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asp Pro Ser Gly Trp Ser Pro Trp Asn 465 470 475 480 Thr Thr Asp Phe Gly Ile His Thr Cys Phe Tyr Ala Glu Tyr Gln Asn 485 490 495 Arg Gly Pro Gly Ala Ala Leu Asp Lys Arg Val Ser Thr Trp Arg Gly 500 505 510 Tyr Gln Lys Asp Ile Ser Gly Asp Val Ile Asn Ser Phe Thr Ala Gly 515 520 525 Lys Phe Ile Asn Thr Gln Gln Pro Trp Leu Pro Val Phe Asp Ile Pro 530 535 540 Tyr Glu Ala Gly Met Met Lys Val 545 550 <210> 3 <211> 2030 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 3 ggaaacgaga ttcatctttg gataatcaga 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Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 꽃 조직에서 특이적으로 발현되는 Sl3108 (Solanum lycopersicum 3108) 단백질.
제1항의 Sl3108 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자.
서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진, 꽃 조직 특이적 발현을 유도하는 Sl3108 (Solanum lycopersicum 3108) 유전자의 프로모터.
제2항의 유전자, 제4항의 프로모터, 또는 제2항의 유전자 및 제4항의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 식물체.
삭제
제4항의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및

상기 재조합된 벡터를 애기장대 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 애기장대 식물체에서 꽃 조직 특이적으로 발현시키는 방법.
삭제
제1항의 단백질에 대한 항체.
삭제