KR100848430B1 - 사과 유래 약 특이적 유전자, 그의 프로모터 및 그를이용한 형질전환 식물체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약 특이적 유전자, 그의 프로모터 및 그를 이용한 형질전환 식물의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 사과(Malus x domestica cv. Fuji) 식물체에서 유래된 약에서만 특이하게 발현되는 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 기재되는 신규 유전자 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3 및 각각 서열번호 4, 5 및 6의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 상기 유전자의 프로모터 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3 및 그를 이용한 형질전환 식물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 약 특이발현 유전자는 식물체의 수정에 관여하는 화분발달 메커니즘을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명의 프로모터 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3은 형질전환 식물체로의 화분이나 약에서만 목적하는 유전자를 발현시키기 위한 특이적 발현에 높은 활성을 나타내므로, 웅성불임 형질전환 식물체의 개발 및 화분 특이적 발현을 요구하는 외래유전자가 도입된 유전자 변형 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

약 특이적 발현, 유전자, 프로모터, 웅성불임, 형질전환 식물

Description

사과 유래 약 특이적 유전자, 그의 프로모터 및 그를 이용한 형질전환 식물체의 제조방법{Anther-specific genes derived from Malus x domestica, promoters thereof and a method for preparing transformed plant using the same}

도 1a는 사과의 잎, 꽃눈, 성숙한 꽃, 수정 후 화탁, 어린 열매의 cDNA를 분리하여 무작위적 프라이머(random primer)를 이용한 PCR 반응결과를 나타내는 사진이고, 도 1b는 생식 기관별 cDNA를 주형으로 본 발명의 신규 유전자 MdASG1(GenBank 접근번호: AF403122)을 대상으로 한 RT-PCR 반응결과를 나타내는 사진이며, 도 1c는 MdASG1을 탐침으로 하여 클로닝한 유사 유전자 MdASG2(GenBank 접근번호: AF403123) 및 MdASG3(GenBank 접근번호: AF403124)의 기관별 발현양상을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 사진이고, 도 1d는 MdASG1과 상기 MdASG2 및 MdASG3의 유전자 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 MdASG1 유전자의 발현양상을 mRNA in situ hybridization을 통하여 확인한 결과를 나타내는 사진이다

도 3은 본 발명의 MdASG1 및 MdASG2 유전자의 mRNA 발현을 억제시킨 형질전 환체 개체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 제조과정을 나타내는 모식도이다.

도 4는 본 발명의 MdASG1 유전자 발현을 억제시킨 형질전환 담배 개체 및 야생형 담배개체의 꽃(A), 약(B) 및 열매(C)를 비교한 사진이다.

도 5는 본 발명의 MdASG2 유전자 발현을 억제시킨 형질전환 담배 개체 및 야생형 담배 개체의 꽃(A), 수술 및 암술(B), 약(C) 및 화분립(pollen grains, D)을 비교한 사진이다.

도 6은 본 발명의 사과의 MdASG1 유전자를 코딩하는 게놈유전자의 염기서열과 프로모터의 염기서열을 나타낸 도면이다.

도 7은 본 발명의 사과 MdASG1 유전자와 상동 유사성을 가지는 MdASG2를 코딩하는 게놈유전자의 염기서열과 프로모터의 염기서열을 나타낸 도면이다.

도 8은 본 발명의 사과 MdASG1 유전자와 상동 유사성을 가지는 MdASG3를 코딩하는 게놈유전자의 염기서열과 프로모터의 염기서열을 나타내는 도면이다.

도 9는 본 발명의 사과 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3 유전자의 프로모터 영역의 염기서열의 상동성 및 잠재적 전사조절 부위의 위치를 나타내는 도면이다.

도 10은 본 발명의 PMdASG2 프로모터 영역의 결실 돌연변이체를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 11은 본 발명의 MdASG2 프로모터를 5' 방향에서 3' 방향으로 순차적으로 결실시킨 재조합 프로모터의 부위를 지닌 돌연변이체를 도입한 형질전환 담배의 약에서 GUS 효소의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 12a는 본 발명의 프로모터 결실 돌연변이체 MdASG2 04가 도입된 형질전환 담배의 꽃 발달 단계를 10단계로 구분하여 분류한 사진이고, 도 12b는 생화학적 방법으로 꽃의 발달 단계별 GUS 효소의 발현량을 조사한 그래프이며, 도 12c는 생식기관의 분화 발달 단계에 따른 GUS 효소의 발현양상을 나타내는 사진이다.

도 13은 본 발명의 프로모터 결실 돌연변이체 MdASG2 04가 도입된 형질전환 담배의 화분립을 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 형광촬영한 결과를 나타내는 사진이다.

도 14는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP(ribosome inactivating protein)를 코딩하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 15는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결한 재조합 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 16은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배의 꽃 기관을 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 17은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 꽃 기관을 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 18은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 형태를 코튼 블루로 염색하여 관찰한 결과(A) 및 상기 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분의 활성을 플루오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate)로 염색하여 관찰한 결과(B)를 나타내는 사진이다.

도 19는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 형태를 코튼 블루로 염색하여 관찰한 결과(A) 및 상기 담배들의 화분의 활성을 플루오레세인 디아세테이트로 관찰한 결과(B)를 나타내는 사진이다.

도 20은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 모양을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 21은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 모양을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 22는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배를 자가수분시킨 경우(A) 및 야생형 담배의 화분을 상기 형질전환 담배의 암술에 묻혀 타가수분시킨 경우(B)의 열매맺힘 여부를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 23은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배를 자가수분시킨 경우(A) 및 야생형 담배의 화분을 상기 형질전환 담배의 암술에 묻혀 타가수분시킨 경우(B)의 열매맺힘 여부를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 신규한 약 특이적 발현 유전자 및 그의 프로모터에 관한 것이다.

인간이 농경을 시작한 이래로 인류는 작물들을 꾸준히 개량해왔으며, 수 천년 간 그 개량의 기본은 교배를 통한 유용 유전형질의 선발이었으며 그것은 교배를 통해 나온 잡종들 중 원하는 형질을 가진 것을 찾아내는 것으로서 많은 시행착오와 시간이 필요한 방법이었다. 그러나, 1983년 미국 몬산토社와 칠턴(Chilton, M.D.), 반 몬터규(Van Montagu, M.), 셸(Schell, J.)이 공동 연구를 통해, 아그로 박테리움 튜메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용할 경우 담배에서 교배를 통하지 않고 직접적인 유전자 삽입이 가능하다는 것을 밝힌 이래로, 쌍자엽에서 단자엽에 이르는 넓은 분포의 유용한 작물들에 대한 형질전환 방법들이 개발되었다.

유전자 삽입 기술의 개발과 함께, 유전자를 식물체 내에서 강력히 발현시킬 수 있는 프로모터(promoter)에 대한 필요성이 나타났고, 추아(Chua, N.H.) 등이 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터의 유용성을 밝혀내면서(Odell, J. T. et al., Nature, 313(6005): 810-2, 1985), 현재 식물체 형질전환의 80% 가량이 35S 프로모터를 통해 이뤄지고 있다. 그러나, 35S 프로모터가 바이러스 유래이기 때문에 식물체 내의 다른 바이러스와의 결합으로 신종 바이러스를 만들어 내거나, 재조합이 일어날 경우 정상적인 유전자를 과발현(over expression)시켜 문제점을 일으킬 가능성이 제기되기도 하며(Cummins, J., Ho, M. W. and Ryan A., Nat. Biotechnol.,. 18(4): 363, 2000), 35S 프로모터의 조직 비특이성으로 인해 모든 조직에서 항시 발현되어 비효율적이라는 문제점이 나타났다. 그리하여, 1980년 대 후반부터 조직 특이적인 프로모터에 대한 연구가 활발히 진행이 되었고, TA29 등을 시작으로 뿌리, 약(葯), 과실, 잎 등의 조직에서 특이적으로 발현하는 프로모터들이 속속 개발되었다. 1994년에는 상업화된 유전자 변형(Genetically Modified) 작물인 후숙 지연 토마토(상품명, Flavr-Savr)의 개발에 열매 특이 프로모터가 이용되었다.

한편, 1930년 이후부터 종자 회사들은 근친교배 조상을 잡종 교배하여 만든 1세대 잡종종자를 개발하여 판매하였다. 1세대 잡종 자손은 잡종 특유의 활력에서 나오는 이점(내병성, 수량성, 품질의 우수성 등등)으로 곡류, 사료 작물 및 원예 과채류의 종자생산에 널리 사용되고 있다. 그러나, 자연 상태에서 많은 식물種은 자가수분을 하므로 잡종종자의 생산을 위해서는 웅성기관인 수술을 인위적으로 제거하고, 근친 교배 품종의 화분을 인공교배하여 생산하므로 생산 비용의 상승과 잡종종자의 생산 순도가 문제되어 왔다. 이에 특정 유전자를 삽입하거나, 특정 유전자를 결손(knock out)시켜서 유전공학적으로 웅성불임을 가지는 개체를 만들려는 노력들이 나타나기 시작하였다. 그러나, 그 선결 과제는 화분이나, 약에서 특이 발현되는 프로모터를 찾는 것이다. 그러한 노력의 일환으로, 1990년에 약 내벽(tapetum)에서만 특이적 발현을 보이는 프로모터인 TA29가 개발되었으며(Koltunow, A. M. et al., Plant Cell, 2(12): 1201-1224, 1990; Sa, G. et al., Transgenic Res., 11(3): 269-78, 2002), 라이보좀 활성저해 단백질(ribosome inactivating protein)이나 N-아세틸-L-포스피노트리신(N-acetyl-L-phosphinothricin)을 외부 처리해 줄 경우 웅성불임이 되도록하는 시스템 등이 개발되었다. 그러나, 아직까지 상기 TA29 프로모터 외에 효율적인 약 특이적 프로모터가 보고되고 있지 않은 실정으로, 다양한 식물종으로부터 보다 효율적인 약특이적 프로모터를 개발하여야할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 약 특이적 유전자 및 그의 프로모터를 개발하고자 예의 노력한 결과 신규한 유전자 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3가 사과의 약에서 특이적으로 발현되고, 그들의 프로모터인 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3가 외래유전자를 화분 특이적으로 발현시킬 수 있고, 더 나아가 상기 프로모터와 세포질 독성 단백질 유전자를 재조합하여 자가수분 식물에 형질전환하여 인공적으로 웅성불임 식물을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 첫 번째 목적은 사과에서 유래된 약에서 특이적으로 발현되는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 유래한 화분 특이적 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 약 특이적 유전자 또는 화분 특이적 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 형질도입한 형질전환체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 마지막 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 웅성불임체를 생산할 수 있는 형질전환체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 MdASG1, 서열번호 2로 기재되는 MdASG2 및 서열번호 3으로 기재되는 MdASG3로 구성된 그룹에서 선택되는 유전자 또는 그와 70 내지 99% 상동성을 나타내고 기능적으로 동등한 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 더욱 바람직하게는 상기 유전자와 80 내지 99%의 상동성을 갖는다.

또한, 본 발명은 서열번호 4의 전체 또는 그의 일부로서 전사활성을 나타내는 활성단편을 포함하는 PMdASG1, 서열번호 5의 전체 또는 그의 일부로서 전사활성을 나타내는 활성단편을 포함하는 PMdASG2 및 서열번호 6의 전체 또는 그의 일부로 서 전사활성을 나타내는 활성단편을 포함하는 PMdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화분 특이적 프로모터를 제공한다. 이때, 상기 활성단편은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, PMdASG2의 전사개시부위인 서열번호 5의 2786번째 염기로부터 -255 내지 +89 염기 사이의 서열 또는 상기 서열과 70 내지 90% 상동성을 가지며 동등한 기능을 갖는 서열인 것이 바람직하며, 상기 서열번호 5의 2786번째 염기로부터 -255 내지 +1 염기 사이의 서열인 것이 더욱 바람직하다.

아울러, 본 발명은 상기 서열번호 1로 기재되는 MdASG1, 서열번호 2로 기재되는 MdASG2 및 서열번호 3으로 기재되는 MdASG3로 구성된 그룹에서 선택되는 유전자 또는 그와 70 내지 99% 상동성을 나타내고 기능적으로 동등한 유전자 또는 그의 안티센스 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 이때, 상기 유전자 또는 그의 안티센스 서열을 포함하는 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 도 3의 개열지도로 나타내어지는 MdASGs/pBluescript, MdASGs/pRTL2 및 MdASGs/pCAMBIA2301로 구성된 그룹으로부터 선택되는 벡터인 것이 바람직하며, MdASGs/pRTL2p인 것이 더욱 바람직하다. 이때, 'MdASGs'에서 's'는 1 내지 3 중 어느 하나의 숫자를 의미한다.

아울러, 본 발명은 상기 서열번호 4의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 PMdASG1, 서열번호 5의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 PMdASG2 및 서열번호 6의 전체 또는 전사활성을 나타내는 활성단편을 포함하는 PMdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화분 특이적 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 이때, 상기 재조합 발현벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 식물형질전환용 아그로박테리움 바이너리 벡터인 것이 바람직하고, 상기 활성단편은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, PMdASG3의 전사개시부위인 서열번호 5의 2786번째 염기로부터 -255 내지 +89 염기 사이의 서열 또는 상기 서열과 70 내지 90% 상동성을 가지며 동등한 기능을 갖는 서열인 것이 바람직하며, 상기 서열번호 5의 2786번째 염기로부터 -255 내지 +1 염기 사이의 서열인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터는 상기 프로모터의 하위에 적어도 하나 이상의 외래 유전자를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 외래 유전자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 리보솜 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein, RIP)을 코딩하는 유전자, 본 발명의 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 또는 그의 안티센스 유전자인 것이 바람직하다. 아울러, 상기 재조합 발현벡터는 특별히 이에 제한된는 것은 아니나, 식물체를 효율적으로 형질전환시키기 위하여, 아그로박테리움의 T-DNA를 포함하는 아그로박테리움 바이너리 재조합 벡터인 것이 바람직하고, e도 14의 개열지도로 나타내어지는 pMd2proRIP 또는 도 15의 개열지도로 나타내어지는 pMd2proASMd2인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 상기 유전자 또는 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 숙주 균주를 형질전환시킨 형질전환 균주를 제공한다. 이때, 상기 숙주 균주는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 식물체의 형질전환을 위한 아그로박테리움인 것이 바람직하며, 상기 형질전환 균주는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 수탁번호 KTCT10769BP로 기탁된 재조합 아그로박테리움 LBA4404/pMd2proASMd2인 것이 더욱 바람직하다.

더 나아가, 본 발명은 ⅰ) 상기 서열번호 1로 기재되는 MdASG1, 서열번호 2로 기재되는 MdASG2 및 서열번호 3으로 기재되는 MdASG3로 구성된 그룹에서 선택되는 유전자 또는 그와 70 내지 99%의 상동성을 갖고 기능적으로 동등한 유전자 또는 그의 안티센스 서열을 포함하는 재조합 발현벡터 또는 상기 서열번호 4의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 PMdASG1, 서열번호 5의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 PMdASG2 및 서열번호 6의 전체 또는 전사활성을 나타내는 활성단편을 포함하는 PMdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화분 특이적 프로모터 및 이것과 작동가능하게 연결되며 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 재조합 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계, ⅲ) 상기 아그로박테리움과 식물 세포를 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 ⅳ) 상기 형질전환된 식물세포를 조직배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약 또는 화분 특이적 유전자 발현을 갖는 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 상기 서열번호 4의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 PMdASG1, 서열번호 5의 전체 또는 전사활성을 나타내는 일부를 포함하는 PMdASG2 및 서열번호 6의 전체 또는 전사활성을 나타내는 활성단편을 포함하는 PMdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화분 특이적 프로모터 및 이것과 작 동가능하게 연결되는 세포 독성 단백질을 코딩하는 유전자 또는 화분 형성에 필수적인 유전자의 안티센스 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 재조합 발현벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물 세포와 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 ⅳ) 상기 형질전환된 식물세포를 조직배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 웅성불임 식물체의 제조방법을 제공한다. 이때, 상기 세포 독성 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 리보솜 불할성화 단백질인 것이 바람직하고, 상기 화분형성에 필수적인 유전자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 MdASG1, MdASG2 또는 MdASG3인 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 사과의 잎, 화아, 꽃, 화탁 및 열매로부터 제조된 cDNA를 대상으로 분별 표시 PCR(differential display PCR)을 수행하여, 사과의 성숙한 꽃에서 특이적으로 발현되는 신규 유전자를 클로닝하였다. 염기서열 결정결과, 상기 신규 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이를 MdASG1(Malus x domestica anther specific gene 1)이라 명명하였으며, 상기 서열과 염기서열상의 상동 유사성을 가지는 유전자를 탐색한 결과, 두 개의 신규 유전자를 추가적으로 클로닝하여, 이를 각각 MdASG2 및 MdASG3로 명명하였다. 상기 유전자들에 대한 RT-PCR 결과, 상기 유전자들은 모두 약을 포함하는 꽃에서만 특이적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 1c 내지 3 참조). 본 발명의 유전자 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3는 각각 75, 88 및 75개의 아미노산으로 구성된 잠재적 단백질을 코딩하는 개방 판독틀(open reading frame, ORF)를 가지며, 아미노산 서열은 물론 염기서열 상 높은 상동을 나타냈다. 미국 국립 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 통한 상동성 검색 결과, 상기 유전자들과 상동성을 갖는 다른 알려진 유전자는 없는 것으로 나타났다.

상기 유전자들의 기능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 MdASG1 유전자 또는 MdASG2 유전자를 35S 프로모터와 역방향으로 재조합하여 담배에 형질전환시킴으로 상기 유전자의 기능을 확인하였다(도 4 및 5 참조). 그 결과, 두 형질전환체 모두 수술의 발달에 이상이 생기는 표현형을 보였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 상기 형질전환체에서는 수술의 길이가 짧아지고, 화분립(pollen grains)의 생성이 줄어들고 화분 발달도 되지 않아 종자가 맺히지 않는 현상이 나타났다. 따라서, 본 발명에서 사과로부터 분리한 MdASG1 및 MdASG2 유전자는 약의 발달과정에 중요한 역할을 수행하는 유전자임을 알 수 있었다.

본 발명자들은 더 나아가, 본 발명의 유전자 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3에 대한 대한 게놈 DNA를 클로닝하여, 전사활성을 갖는 프로모터 부위를 클로닝하였으며, 이를 각각 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3로 명명하였다. 상기 프로모터는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 전체 또는 그의 일부로서 전사활성을 나타내는 전사활성 단 편을 포함한다. 본 발명의 프로모터들은 외래유전자를 화분 특이적으로 발현시키는 특성을 갖는데, 상세한 염기서열 분석결과, 상기 세 가지 프로모터는 전사개시부위로부터 -255에서 +1위치에서 높은 염기서열 유사성을 나타났으며, 전사개시를 위한 TATA box와 CAAT box는 물론, 전사조절 단백질의 부착부위로서 화분 특이적 발현 유전자 구성요소를 가진 56/59 box(Plant Cell, 7:373-384, 1995), 담배의 화분 유전자에서 발견되는 염기서열 집단인 GTGA motif(Plant Mol. Biol., 45: 577-585, 2001) 및 AGAAA 염기서열을 특징으로 하는 화분 특이적 전사 조절인자인 POLLEN1LELAT52(Plant Mol. Biol., 37: 859-869, 1998)가 존재함을 알 수 있었는데, 특히 TCCACCATA 염기서열과 함께 단백질의 약 특이적 발현을 일으키는 전사 조절인자인 POLLEN1LELAT52 염기서열이, TATA box와 매우 근접하게 존재하고 있다(도 9 참조). 이하, 본 문서에서 특별히 한정이 없는 한 MdASG 프로모터는 서열번호 4, 5 및 6로 기재되는 염기서열 및 그것의 활성 단편을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명자들은 상기 프로모터 및 그와 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자 GUS(β-glucuronidase)로 이루어지는 융합 유전자 컨스트럭트를 제조하여, 본 발명의 프로모터의 활성을 분석하였다(도 10 참조). 그 결과, 본 발명의 프로모터는 식물체의 약에서 화분 발달 과정 중 사분 세포(tetrad)가 되는 단계에서 강하게 작용하는 것으로 나타났다. 이러한 특성을 이용하여, 본 발명자들은 서열번호 5로 기재되는 염기서열 중 1 내지 2874번 또는 그의 일부로서, 프로모터 활성을 나타내는 활성 단편 및 이것과 작동 가능하도록 연결된 이종 외래 유전자로 이루어지는 융합 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 융합 유전자 컨스트럭트는 PMdASG2 프로모터 유전자에 세포질 독성 단백질 코딩 유전자 또는 특정 구조 유전자를 연결하여 정상적 화분생성을 방해함으로 웅성불임체의 제조에 유용하게 이용될 수 있다(도 20 및 21 참조).

아울러, 본 발명자들은 상기 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3 프로모터의 하부에 세포독성을 나타내는 RIP(ribosome inactivating protein)을 코딩하는 유전자 또는 본 발명의 MdASG2 유전자의 안티센스 서열을 연결한 형질전환용 유전자 컨스트럭트를 제조하여 식물 형질전환용 아그로박테리움 바이너리 벡터에 클로닝한 다음, 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질도입시켰다. 상기 형질전환용 유전자 컨스트럭트가 형질도입된 아그로박테리움 중 PMdASG2 04 프로모터 하부에 MdASG2 안티센스 서열이 연결된 재조합 유전자 컨스트럭트가 도입된 아그로박테리움 LBA4404/pMd2proASMd2를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KTCT10769BP로 기탁하였다. 최종적으로 상기와 같이 제조된 아그로박테리움으로 식물체를 감염시켜, 상기 재조합 유전자 컨스트럭트가 식물체 게놈 내부로 삽입된 형질전환 식물체를 제조하였다. 상기 형질전환 식물체의 꽃 발달 과정을 관찰한 결과, 자가수분시에는 열매가 맺히지 않고, 야생형 식물체의 화분을 이용하여 수분한 경우에는 열매가 맺히는 전형적인 웅성불임현상을 관찰할 수 있었다(도 22 및 23 참조). 본 발명에서 사용한 RIP 또는 MdASG2의 안티센스는 발명의 예시에 불과하며, 어떠한 외래 유전자라도 본 발명의 프로모터의 하부에 연결되어 화분 특이적 재조합 유전자 컨스트럭트 및 이를 이용한 형질전환 식물체의 제조에 이용될 수 있다. 본 발명의 형질전환 식물체의 제 조방법은 원치 않는 자가수분을 방지하는 웅성불임체 개발과 화분 특이적 발현을 요구하는 유전자 변형(genetically modified, GM) 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하기로 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

한편, 하기 실시예에서 사용된 백분율 단위는 특별한 언급이 없는 한 부피대 중량(w/v)을 의미한다.

<실시예 1> 사과 cDNA로부터 약 특이 발현 유전자의 탐색

<실시예 1-1> 유전자 탐색

사과의 약 특이적 발현을 하는 유전자를 탐색하기 위하여, 사과(Malus x domestica Borkh cv. Fuji)의 잎, 꽃눈, 성숙한 꽃, 수분이후 화탁(receptacle), 초기 열매를 시료로 하여 제조된 첫 번째 가닥(first strand) cDNA(Sung et al., Mol. Cells, 8(5): 565-77, 1998)를 주형으로 PCR을 하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 50배로 희석하여 1 ㎕를 취하고 무작위적(random) 10-머(SK020, Operon Technology Inc., USA)를 정방향 프라이머(forward primer)로, 5'-T₁₂VN-3'(SK030, Operon Technology Inc., USA, V=dA, dC, dG의 동일한 몰농도의 혼합; N=dA, dC, dG, dT 중의 하나)를 역방향 프라이머(reverse primer)로 하여 PCR을 수행하였다. 성숙한 꽃에서만 나타나는 DNA 밴드를 찾아 클로닝하여 염기서열을 확인하였다(도 1a). 도 1a는 사과의 잎, 꽃눈, 성숙한 꽃, 수정 후 화탁, 어린 열매의 cDNA를 분리하여 무작위적 프라이머(random primer)를 이용한 PCR 반응결과를 나타내는 사진이다. 이때, L은 잎, FB는 화아, MF는 성숙한 꽃, F1은 수정후의 화탁 그리고 F2는 어린 열매를 각각 나타낸다.

상기 DNA 단편을 탐침으로 하여 꽃의 cDNA 라이브러리로부터 상기 DNA 단편에 상응하는 유전자를 클로닝용 벡터(pBluescript SK (-), Stratagene, USA)에 클로닝하였고, 상기 클로닝된 유전자와의 상동 유사성이 높은 2개의 유전자를 추가적으로 클로닝하였으며, 이를 각각 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3로 명명하였다.

상기 유전자들이 실제 사과의 성숙한 꽃에서만 발현되는 지 여부를 확인하기 위하여, 생식기관의 꽃받침, 꽃잎, 수술, 암술로부터 제조된 첫 번째 가닥 cDNA를 주형으로 하고 각각 MdASG1의 염기서열 일부인 정방향 프라이머(forward primer)로 5'-TCTAGTCGGAGCTTCAGTCT-3'(서열번호 7), 역방향 프라이머(reverse primer)로 5'-AATTAGCTCTCGGACAACAC-3'(서열번호 8)를 사용하여 PCR을 수행하였다(도 1b). 도 1b는 생식 기관별 cDNA를 주형으로 본 발명의 신규 유전자 MdASG1(GenBank 접근번호: AF403122)을 대상으로 한 RT-PCR 반응결과를 나타내는 사진이다. 이때, M은 크기 마커, C는 대조군, Se는 꽃받침, Pe는 꽃잎, St는 수술, 그리고 Ca는 암술의 cDNA를 각각 나타내며, 적색 화살표는 본 발명의 약 특이적 유전자가 위치하는 밴 드를 나타낸다. 도 1b에서 보이는 바와 같이, 성숙한 꽃의 수술에서만 이 유전자가 발현됨을 존재함을 확인하였다. 한편, MdASG2와 MdASG3에 대하여도 상기 cDNA를 주형으로 상기 유전자의 염기서열로부터 고안된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(도 1c). 도 1c는 MdASG1을 탐침으로 하여 클로닝한 유사 유전자 MdASG2(GenBank 접근번호: AF403123) 및 MdASG3(GenBank 접근번호: AF403124)의 기관별 발현양상을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1c에서 보이는 바와 같이, MdASG2 및 MdASG3 역시 꽃 기관에서 특이적으로 발현됨을 알 수 있었다.

한편, 상기 클로닝된 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3의 염기서열을 분석하였다. 분석결과, 본 발명의 유전자 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3는 각각 75, 88 및 75개의 아미노산으로 구성된 잠재적 단백질을 코딩하는 개방 판독틀(open reading frame, ORF)을 가지며, 아미노산 서열은 물론 염기서열 상 높은 상동을 나타냈다. 미국 국립 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 통한 상동성 검색 결과, 상기 유전자들과 상동성을 갖는 다른 알려진 유전자는 없는 것으로 나타났다. 한편, 상기 ORF에 의해 코딩되는 잠재적 단백질의 아미노산 서열을 분석하였다(도 1d). 도 1d는 MdASG1과 MdASG2 및 MdASG3의 유전자 서열로부터 추론된 잠재적 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1d에서 보는 바와 같이, 상기 세 가지 유전자로부터 코딩되는 잠재적 단백질은 그 아미노산 서열, 특히 아미노 말단 및 카르복시 말단의 서열의 상동성이 매우 높고, 알라닌 풍부 지 역, N-글리코실기 부착 부위 및 미리스토일기 부착부위를 가지고 있음을 알 수 있었다.

<실시예 1-2> 정위치 혼성화 반응( in situ hybridization)

사과 꽃 기관의 발달과정에서 MdASG1 유전자의 mRNA 발현 패턴을 mRNA in situ hybridization 방법으로 조사하였다(Sung et al., Plant Physiology 120: 969-978, 1999). 먼저, MdASG1 유전자의 센스 가닥 쪽의 DNA를 주형으로 안티센스 RNA를 제조하였다. 미성숙한 꽃에서부터 성숙한 꽃까지 꽃의 발달단계를 단계로 나누어 각 단계의 샘플을 적당한 크기로 자른 후, 고정액(pipes 50mM and 4% p-formaldehyde)으로 고정하여 파라핀 포매(paraffin embedding)시킨 후 10 ㎛ 두께로 자르고, 유리 슬라이드에 부착시킨 다음 MdASG1의 안티센스 mRNA를 탐침으로 하여 MdASG1 유전자의 mRNA 발현 양상을 조사하였다(도 2). 도 2는 본 발명의 MdASG1 유전자의 발현양상을 mRNA in situ 혼성화(hybridization) 기법를 통하여 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 이때, A는 어린 꽃눈(flower primordia)이며, B는 생식기관의 시원(floral organ primordia)이 형성되는 시기의 꽃이고, C는 수술과 암술 기관의 발달이 성숙한 단계의 꽃이다. D~F는 꽃의 발달과정에서 약의 모양으로, D는 미성숙 시기의 약(anther)이고, E는 화분발달이 진행되고 있는 시기의 약이며, F는 화분발달이 끝난 다음 노화가 일어나는 시기의 약이다. 여기서 청색을 띄는 부분이 본 발명의 MdASG1의 유전자가 발현되는 부위를 나타낸다. 도 2에서 보는 바와 같이, MdASG1 유전자는 약이 발달하면서부터 그 발현이 관찰되며(B, C 및 D), 약의 내부를 관찰한 결과 화분의 시원세포인 약 내벽 융단조직(tapetum)에 발현이 집중되며(E), 약 벽이 파괴된 노화된 약에서는 발현의 검출이 어려웠다(F).

<실시예 2> MdASG1 , MdASG2 유전자의 mRNA 발현이 억제된 형질전환체의 제조

<실시예 2-1> MdASG1 안티센스 발현용 형질전환 아그로벡테리움의 제조

상기 실시예 1에서 사과로부터 분리한 MdASG1 유전자가 클로닝되어 있는 pBluescript SK (-) 벡터를 EcoR Ⅰ 및 Xho I으로 절단한 다음, MdASG1 유전자가 포함된 DNA 절편을 수득하여, 클레노우(Klenow) 효소로 말단을 평활화하고, CaMV 35S 프로모터와 35S 터미네이터 사이에 다중 클로닝 부위를 지닌 pRTL-2 벡터(Oregon state Univ., USA)의 Sma I 제한부위에 클로닝하였다. 상기와 같이 제조한 재조합 벡터중 35S 프로모터에 대해 역방향으로 유전자가 클로닝된 것을 선발하였다. 이를 다시 Hind Ⅲ로 양 말단을 절단하여 MdASG1 유전자가 포함된 DNA 절편을 수득한 다음, 클레노우(Klenow) 효소로 말단을 평활화하고 아그로박테리움 전달용 벡터인 pCAMBIA2301(Hajdukiewicz, P. et al., Plant Mol. Biol., 25(6):989-94, 1994)의 Sma I에 클로닝하여 유전자 발현 억제용 식물발현 벡터를 제조하였다(도 3). 도 3은 본 발명의 MdASG1 및 MdASG2 유전자의 mRNA 발현을 억제시킨 형질전환체 개체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 제조과정을 나타내는 모식도이다.

도 3에 나타나는 바와 같이, pRTL-2 벡터는 이중의 35S 프로모터와 인핸서, 35S 터미네이터를 가지고 있으며, 식물 형질전환용 아그로박테리움 바이너리 벡터인 pCAMBIA2301는 선별 유전자로 nptⅡ(neomycin phosphotransferase)유전자를 가 지고 있어 카나마이신 저항성을 갖게 된다(Plant molecular Biology Manual, 1988, A3:1-19).

상기 재조합 아그로박테리움 바이너리 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Hoekema et al., Nature, 303: 179-181, 1983)에 도입 후 카나마이신 함유배지에서 상기 재조합 아그로박테리움 바이너리 벡터가 도입된 균주를 선발하였다.

<실시예 2-2> MdASG1 안티센스 발현 형질전환 담배 식물체의 제조

상기 MdASG1 안티센스 발현 재조합 아그로박테리움을 이용하여 하기와 같이 MdASG1 유전자 발현 억제용 재조합 유전자가 도입된 형질전환 담배를 제조하였다: 먼저, 담배의 성숙 종자를 70%(v/v) 에탄올에 1분간 침지한 다음, 멸균수로 3차례 세척하였다. 이어, 2%의 차아염소산 나트륨(sodium hypochloride, NaOCl) 용액에 15분간 침지시킨 후 표면을 살균 멸균수로 7차례 이상 세척하였다. 상기와 같이 멸균처리한 종자를 발아배지(1/2 MS salts, 3% sucorse, 0.8% agar)에 치상한 후, 발아가 시작되어 5주 동안 자란 식물체의 어린잎을 1 cm² 정도의 크기로 잘라 목적 조직으로 선택하였다. 그런 다음, 상기 실시예 2-1에서 제조한 형질전환 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404를 50 ㎎/L의 카나마이신이 포함된 YEP 배지(1% yeast extract, 1% peptone, 0.5% NaCl)에서 OD₆₀₀ 측정값이 0.8이 될 때까지 배양하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리움을 50 μM의 아세토시린곤(acetosyringone)을 첨가한 1/2 MS 배지에서 22℃, 150 rpm으로 2시간 동안 공동 배양하였다. 그리고 나서, 목적 조직으로 선택된 담배 잎절편을 넣고 22℃, 1분간 배양하였다. 이후 절편을 다시 공동 배양 배지(coculture medium; MS salts, 3% sucorse, 0.7% agar)에 치상하여 2일간 배양하였다. 그리고 자엽 절편을 재분화 배지(regeneration medium, MS salts, NAA 0.1 mg/L, BA 0.5 mg/L, sucrose 3%, cefotaxime 250 ㎎/L, kanamycin 200 ㎎/L, 0.7% agar)로 옮겨주고 3주마다 두 차례 계대하였다. 이때, 절편에서 나오는 형질전환된 신초를 다시 카나마이신이 첨가된 뿌리 유도 배지(rooting medium, MS salts, 3% sucrose, kanamycin 200 ㎎/L, 0.7% agar)에서 뿌리를 유도하면서 다시 한번 형질전환체를 선별하였다. 형질전환되지 않은 신초는 색깔이 변하면서 세포괴사(necrosis)가 일어나는데 비하여 형질전환된 신초는 뿌리를 내리면서 정상적으로 성장하였다. 뿌리가 유도된 신초는 순화과정을 거처 토양으로 옮겼다. 상기 형질전환 식물체 내에 PMdASG2 프로모터의 결실 돌연변이가 도입되었는지 확인하기 위하여, 서열번호 9(nptII Forward, 5'-gaggctattcggctatgactg-3') 및 서열번호 10(nptII Reverse, 5'-atcgggagcggcgataccgta-3')으로 기재되는 nptII 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였으며, PCR 반응은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃1분에서 30회 수행하였다. 그 결과, 형질전환 식물체에서는 nptII 프라이머 쌍에 의한 DNA 절편이 검출되었으며 이로부터 상기 형질전환 식물체 내에 외래 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.

MdASG2의 유전자 발현 억제용 재조합 벡터 제작 및 형질전환체 제작도 상기의 방법과 동일하게 수행하였다(도 3 내지 5). 도 4는 본 발명의 MdASG1 유전자 발현을 억제시킨 형질전환 담배 개체 및 야생형 담배개체의 꽃(A), 약(B) 및 열매(C)를 비교한 사진이고, 도 5는 본 발명의 MdASG2 유전자 발현을 억제시킨 형질전환 담배 개체 및 야생형 담배 개체의 꽃(A), 수술 및 암술(B), 약(C) 및 화분립(D)을 비교한 사진이다. 도 4에서 보는 바와 같이, 상기 과정을 통해 MdASG1 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환체는 화분의 형성이 저해되었으며 종자가 맺히지 않는 표현형을 보였고, 도 5에서 보는 바와 같이, MdASG2 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환체 역시 수술의 길이생장이 다소 억제되고 화분형성이 저해되었으며, 종자가 맺히지 않았다. 화분립을 코튼 블루(cotton blue)로 염색하여 관찰하였을 때, 화분립의 양적 감소뿐만 아니라 세포벽이 터져 있는 모양이 관찰되었다.

<실시예 3> 게놈 DNA로부터 MdASG1, MdASG2, MdASG3의 분리

본 발명의 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3 유전자를 게놈 내에 포함하는 게놈 DNA를 분리하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다: 먼저, 사과의 잎으로부터 염색체 DNA를 추출하여, 제한효소 Dra I 또는 EcoR V로 절단한 다음, 프로모터의 분리를 위해 Gene Walker^TM kit(Clonetech, USA)에 포함된 어답터 프라이머를 상기 절단된 염색체 DNA 절편에 결찰시켰다. 이어, MdASG1의 염기서열을 특이적으로 인식하는 서열번호 11로 기재되는 MdASG1 특이적 프라이머(5'-gacgccaacagcaccattg-3') 및 상기 키트를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 이로부터 합성된 0.85 kb 크기의 게놈 DNA 단편을 클로닝하였다(도 6). 도 6은 본 발명의 사과의 MdASG1 유전자를 코 딩하는 게놈유전자의 염기서열과 프로모터의 염기서열을 나타낸 도면이다.

MdASG2 및 MdASG3 역시 각각 서열번호 12로 기재되는 MdASG2 특이적 프라이머(5'-gagtaagtagcgttatagcttc-3') 및 서열번호 13으로 기재되는 MdASG3 특이적 프라이머(5'-aaatcatgaagaataaatttaaata-3')도 상기와 같은 방법을 사용하였으며 각각 3.2 kb, 1.9 kb 크기의 게놈 DNA 단편을 클로닝하였다(도 7 및 8). 도 7은 본 발명의 사과 MdASG1 유전자와 상동 유사성을 가지는 MdASG2를 코딩하는 게놈유전자의 염기서열과 프로모터의 염기서열을 나타낸 도면이고, 도 8은 본 발명의 사과 MdASG1 유전자와 상동 유사성을 가지는 MdASG3를 코딩하는 게놈유전자의 염기서열과 프로모터의 염기서열을 나타낸 도면이다.

<실시예 4> MdASG1, MdASG2 및 MdASG3 유전자의 프로모터 분석

상기 실시예 3에서 클로닝한 MdASG2의 게놈 DNA 단편 중 MdASG2의 프로모터는 번역개시점의 상류로부터 -2874 bp까지의 영역에 해당하는 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성 된다(도 7). 본 발명자들은 상기 프로모터를 'PMdASG2'라 명명하고, PMdASG2 프로모터의 염기서열 상의 특성을, 프로모터 분석 프로그램(The Markov Chain Promoter Prediction Server, http://genes.mit.edu/McPromoter.html; Neural Network Promoter Prediction, http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html; PLACE, http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/signalscan.html; GENSCAN, http://genes.mit.edu/GENSCAN.html; 및 TRANSFAC, http://transfac.gbf-braunschweig.de/TRANSFAC/index.html)을 이용하여 분석하였으며, 마찬가지로, 상기 실시예 3에서 분리한 MdASG1 및 MdASG3의 게놈유전자의 염기서열 분석으로부터 상기 MdASG1 및 MdASG3 유전자의 프로모터 영역을 각각 'PMdASG1' 및 'PMdASG3'로 명명하였다(도 9).

도 9는 본 발명의 사과 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3 유전자의 프로모터 영역의 염기서열의 상동성 및 잠재적 전사조절 부위의 위치를 나타낸 도면이다. 도 9에서 보는 바와 같이, PMdASG2 프로모터는 진핵생물 프로모터의 조절인자(regulatory elements) 부위를 갖고 있음이 확인되었는데, 전사개시를 위한 TATA box(-35)가 존재하였으며 -241 위치에 CAAT box가 존재하였으며, PMdASG2 프로모터 염기서열을 PMdASG1 프로모터 염기서열(도 6), PMdASG3 프로모터 염기서열(도 8)과 비교 분석한 결과, -255에서 +1위치에서 높은 염기서열 상동성을 가지고 있었다. 한편, PMdASG2 프로모터에서 전사조절 단백질의 부착부위로서 화분특이적 발현 유전자의 구성요소인 56/59 박스(Eyal, Y. et al., Plant Cell, 7: 373-384, 1995), 담배의 화분 유전자에서 발견되는 염기서열 집단인 GTGA 모티프(Rogers, H. J. et al., Plant Mol. Biol., 45: 577-585, 2001), AGAAA 염기서열을 특징으로 하는 화분 특이적 전사 조절 인자인 POLLEN1LELAT52(Bate, N. and Twell, D., Plant Mol. Biol., 37: 859-869, 1998)이 존재하였다. 특히, TCCACCATA와 함께 단백질의 약 특이적 발현을 일으키는 전사 조절인자인 POLLEN1LELAT52 염기서열이 프로모터 전체에 다수 존재하였으며, TATA box와 매우 근접한 위치에도 존재하고 있었다(도 9).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 PMdASG2 프로모터는 화분 특이적 발현을 조절하는 인자들을 포함하고 있어 약 특이적 단백질 발현 및 웅성불임 식물체 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> MdASG2 프로모터의 결실 돌연변이 재조합 벡터 제작

본 발명의 PMdASG2 프로모터의 결실 돌연변이체를 제조하기 위하여, PMdASG2의 프로모터 영역을 Taq DNA 중합효소(Takara, Japan)와 서열 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 이때 프라이머는 서열번호 14 내지 17로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 18으로 기재되는 역방향 프라이머를 사용하였으며 상기 정방향 프라이머는 모두 Hind Ⅲ 제한효소 부위를 포함하고 있으며 역방향 프라이머는 Sma I 제한효소 부위를 포함하도록 제조하였다. 상기 프라이머 쌍의 PCR 반응에 의하여 증폭된 결손 PMdASG2 DNA 단편의 크기는 각각 2815, 1979, 1532 및 358 bp이었다. 상기 PCR 산물을 제한효소 Hind Ⅲ와 Sma I으로 절단한 후 GUS(β-glucuronidase)를 코딩하는 유전자 및 NOS 전사종결자(terminator)를 포함하는 바이너리 벡터인 pBI101 플라스미드 벡터(Clontech, USA)에 서브클로닝 하였다. 이로부터 각각 -2.8 kb, -2.0 kb, -1.5 kb 및 -0.4 kb 결실구조(deletion construction)를 포함하는 PMdASG2 프로모터의 결실 돌연변이 플라스미드 벡터 pBI MdASG2 28, pBI MdASG2 20, pBI MdASG2 15 및 pBI MdASG2 04를 제조하였다(도 10). 도 10은 본 발명의 PMdASG2 프로모터 영역의 결실 돌연변이체를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

<실시예 6> 담배 형질전환체에서 PMdASG2 프로모터를 이용한 GUS 발현

<실시예 6-1> 결실 돌연변이체의 GUS 활성 측정

상기 실시예 5에서 제조된 PMdASG2 프로모터의 결실 돌연변이 유전자 컨스트럭트를 상기 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 담배에 형질도입하여, 담배 형질전환체를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 PMdASG2 프로모터의 결실 돌연변이체 유전자 컨스트럭트가 도입된 담배 형질전환체의 GUS 활성의 관찰은 조직염색법과 효소 활성의 측정을 통하여 확인하였다. 조직염색은 1 mM X-Gluc, 0.3 mM 페리시안화 칼륨, 0.3 mM 페로시안화 칼륨, 0.2 % Triton-X 100을 포함하는 0.1 mM 인산버퍼 (pH 7.0)용액에 조직 절편을 넣고 37℃에서 12시간 처리하고, 용액을 제거한 다음, 70%(v/v) 에탄올로 탈색하여 현미경으로 관찰하였고, 효소활성의 측정은 4-MUG (4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide)가 4-MU(7-hydroxy-4-methylcoumarin; 4-methylumbelliferone)로 전환되는 양을 형광으로 측정하여(Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep., 5(4): 387-405, 1987), 프로모터의 활성을 GUS 단백질이 생산된 양으로써 계산하였다(도 11). 도 11은 본 발명의 MdASG2 프로모터를 5' 방향에서 3' 방향으로 순차적으로 결실시킨 재조합 프로모터의 부위를 지닌 돌연변이체를 도입한 형질전환 담배의 약에서 GUS 효소의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 11에서 보듯이, pBI MdASG2 04가 도입된 형질전환 식물체에서 현저히 높은 GUS 활성이 측정되었다. 반면 pBI MdASG2 28, pBI MdASG2 20, pBI MdASG2 15가 도입된 형질전환 식물체에서는 GUS 활성의 변화가 대조군에 비하여 증가하지 않았다. 상기 결과를 통하여 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3 간의 높은 염기서열 유사성을 보이는 -255에서 +1위치에서 약 또는 화분 특이적 발현을 유도하는데 중요한 역할을 하는 인자가 존재할 것으로 여겨지며, GUS의 발현을 유도하는 인자를 억제하는 조절부위가 MdASG2 04의 상위(up stream)에 존재할 것으로 여겨진다.

한편, pBI PMdASG2 04가 도입된 형질전환 담배의 약을 대상으로 하기와 같이 발달단계에 따라 GUS가 발현되는 정도를 관찰하였다: 먼저, 화아 형성의 초기부터 성숙한 꽃이 형성되는 단계를 꽃의 길이에 따라 10개의 단계로 구분하고, 각 단계별로 꽃을 적당한 크기로 자른 뒤 고정액으로 고정하여 파라핀 포매(paraffin embedding)시킨 후 10 ㎛ 두께로 잘라 조직염색을 하였으며, 상기 방법과 동일하게 GUS 효소활성을 측정하였다(도 12a 내지 12c). 도 12a는 본 발명의 프로모터 결실 돌연변이체 MdASG2 04가 도입된 형질전환 담배의 꽃 발달 단계를 10단계로 구분하여 분류한 사진이고, 도 12b는 생화학적 방법으로 꽃의 발달 단계별 GUS 효소의 발현량을 조사한 그래프이며, 도 12c는 생식기관의 분화 발달 단계에 따른 GUS 효소의 발현양상을 나타내는 사진이다.

도 12b 및 12c에서 보이듯이, GUS의 발현은 소포자가 발달하여 사분 세포(tetrad)가 형성되는 단계 5에서 단계 6으로 전환되는 시기에 검출되기 시작하였고, 조직학적으로는 약의 내벽과 약의 내벽에서 유래된 화분립에서 GUS가 강하게 나타났다.

<실시예 6-2> 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용한 화분립의 관찰

화분립에서의 GUS 발현위치를 확인하기 위하여, 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 510 META, Germany)을 이용하여 488 nm의 여기(excitation) 파장을 조사하고 505 nm 이상의 방사(emmision) 파장을 취하여 관찰하였다(도 13). 도 13은 본 발명의 프로모터 결실 돌연변이체 MdASG2 04가 도입된 형질전환 담배의 화분립을 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 형광촬영한 결과를 나타내는 사진이다. 도 13에서 보이는 바와 같이, 화분립을 둘러싸고 있는 벽(wall)에서 GUS가 발현됨을 확인하였다.

<실시예 7> PMdASG2 프로모터를 이용한 담배 웅성불임체 제조

<실시예 7-1> 이종단백질 RIP를 이용한 웅성불임체 제작용 벡터 제작

본 발명의 MdASG2 유전자의 프로모터에 이종단백질을 코딩하는 유전자를 연결하여 상기 이종단백질을 발현시킬 수 있는 식물체 형질전환용 재조합 벡터를 하기와 같이 제조하였다: 먼저, 상기 실시예 5에서 제작한 MdASG2 04 프로모터 유전자(서열번호 17 및 18로 증폭한 358 bp 유전자 단편)를 PCR 클로닝 벡터(pGEM T-vector, Promega, USA)에 클로닝하고 Sma I 제한효소로 절단하였다. 그런 다음, pMTA2913/RIP(Cho, H. J. et al., Mol. Cells, 10(2): 135-41, 2000)를 주형으로 하고, 서열번호 19로 기재되는 정방향 프라이머(RIP Forward: 5'- gtttcagctgaaatgaagatatatgtagtgg-3') 및 서열번호 20로 기재되는 역방향 프라이머 (RIP Reverse 5'-cctcaatattcgactttcatgcacccaaatgca-3')를 사용하여 PCR을 수행하여 세포질 독성 단백질 코딩 유전자인 리보좀 불활성화 단백질(ribosoem inactivating protein, 이하 'RIP'이라 약칭하기로 함)을 코딩하는 유전자를 증폭한 다음, 상기 PCR 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 이어, 상기 RIP을 코딩하는 유전자가 클로닝된 PCR 클로닝 벡터를 Ssp I와 Pvu Ⅱ로 절단하였다. 상기와 같이 얻어진 DNA 단편을 MdASG2 04 프로모터를 가지는 pGEM T-vector에 결찰시키고, Hind Ⅲ 및 EcoR I으로 절단한 다음, 클레노우 효소로 말단을 평활화하여 Hinc Ⅱ 및 Sma I 절편을 잘라낸 pRTL-2 벡터에 클로닝하였다. 상기와 같이 제조된 재조합 벡터 중 35S 터미네이터에 대해 정방향으로 유전자가 클로닝된 것을 선발하였다. 그런 다음, 상기와 같이 제조된 재조합 벡터를 다시 Hind Ⅲ로 절단한 다음, pCAMBIA3301의 Hind Ⅲ 제한효소 부위에 클로닝하여 이종유전자 발현용 재조합 벡터를 제조하였다(도 14). 도 14는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

<실시예 7-2> MdASG2 cDNA의 antisense mRNA를 이용한 웅성불임체 제작용 벡터 제작

본 발명의 MdASG2 유전자의 프로모터에 MdASG2 cDNA를 역방향으로 연결하여 상기 MdASG2의 안티센스 mRNA를 발현시킬 수 있는 식물체 형질전환용 재조합 벡터를 하기와 같이 제조하였다: 먼저, MdASG2 cDNA를 서열번호 21로 기재되는 정방향 프라이머(antisense MdASG2 cDNA Forward: 5'-ggcagctgcaaacttctacaagcctcttaacatt-3') 및 서열번호 22으로 기재되는 역방향 프라이머(antisense MdASG2 cDNA Reverse: 5'-ttgaatatttagcgttatagcttcatttattggcg-3')로 증폭하여 PCT 클로닝 벡터(pGEM T-vector, Promega, USA)에 클로닝한 후, Ssp I와 Pvu Ⅱ로 절단하였다. 이어, 상기 실시예 7-1에서 제조한 MdASG2 04 프로모터를 가지는 pGEM T-vector를 Sma I으로 절단시킨 플라스미드 절편과 결찰시켰다. 그런 다음, 상기 MdASG2 04 프로모터 및 MdASG2 안티센스 서열이 클로닝된 pGEM T-vector를 Hind Ⅲ 및 EcoR I으로 절단하여, 클레노우 효소로 말단을 평활화한 다음, Hinc Ⅱ, Sma I으로 절단한 pRTL-2 벡터에 클로닝하였다. 상기와 같이 제조된 재조합 벡터 중 35S 터미네이터에 대해 역방향으로 유전자가 클로닝된 것을 선발하였다. 그런 다음, 이를 다시 Hind Ⅲ 로 양 말단을 절단한 다음, pCAMBIA3301의 Hind Ⅲ 부위에 클로닝하여 재조합 벡터를 제조하였다(도 15). 도 15는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결한 재조합 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 상기 식물체 형질전환용 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Hoekema et al., Nature, 303: 179-181, 1983)에 도입 후 카나마이신 함유배지에서 상기 재조합 아그로박테리움 바이너리 벡터가 도입된 균주를 선발하였다. 상기 형질도입된 아그로박테리움 중 PMdASG2 04 프로모터 하부에 MdASG2 안티센스 서열이 연결된 재조합 유전자 컨스트럭트가 도입된 아그로박테리움 LBA4404/pMd2proASMd2를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KTCT10769BP로 기탁하였다.

<실시예 7-3> 담배 웅성불임체 제조

상기 실시예 7-1 및 7-2에서 제작한 식물체 형질전환용 재조합 벡터를 상기 실시예 2에서의 방법으로 담배에 도입하여 담배 형질전환체를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 담배 형질전환체의 각종 꽃 기관의 발달과정을 육안으로 관찰하였다(도 16 및 17). 도 16은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배의 꽃 기관을 관찰한 결과를 나타내는 사진이고, 도 17은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 꽃 기관을 관찰한 결과를 나타내는 사진이다. 도 16 및 17에서 보이는 바와 같이, 본발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배는 수술의 길이생장이 다소 줄어들었다. 한편, 상기 형질전환 담배의 화분립의 형태를 확인하기 위하여 코튼 블루로 염색하고, 화분의 활성을 확인하기 위하여 플르오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate)로 염색하여 관찰하였다(도 18 및 19). 도 18은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 형태를 코튼 블루로 염색하여 관찰한 결과(A) 및 상기 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분의 활성을 플루오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate)로 염색하여 관찰한 결과(B)를 나타내는 사진이고, 도 19 는 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 형태를 코튼 블루로 염색하여 관찰한 결과(A) 및 상기 담배들의 화분의 활성을 플루오레세인 디아세테이트로 관찰한 결과(B)를 나타내는 사진이다.

도 18 및 19에서 보이듯이, 상기 형질전환 담배는 화분립의 형태 변화 및 활성저하가 나타났다.

또한, 상기 형질전환 담배의 화분립의 상태를 정밀하게 관찰하기 위하여, 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 상기 형질전환 담배의 화분립을 관찰하였다(도 20 및 21). 도 20은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 모양을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이고, 도 21은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배 및 야생형 담배의 화분립의 모양을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 20에서 보는 바와 같이, 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배의 화분립은 야생형에 비교하여 심각한 외형적 변화를 일으켰음을 알 수 있었고, 도 21에서 보는 바와 같이, 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 역방향으로 연결하여 도입한 형질전환 담배의 화분립은 보는 바와 같이, 화분립(pollen grains)의 함몰부위(groove)에서 섬유조직(microfibrils)의 형태가 제대로 발달하지 않는 비정상적인 발생이 일어났 음을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기 형질전환 담배의 웅성불임 여부를 관찰하기 위하여, 자가수분 및 야생형 담배의 화분을 상기 형질전환 담배의 암술에 묻히는 타가수분을 수행하였다(도 22 및 23). 도 22은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 RIP를 코딩하는 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배를 자가수분시킨 경우(A) 및 야생형 담배의 화분을 상기 형질전환 담배의 암술에 묻혀 타가수분시킨 경우(B)의 열매맺힘 여부를 관찰한 결과를 나타내는 사진이고, 도 23은 본 발명의 MdASG2 04 프로모터에 MdASG2 cDNA 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배를 자가수분시킨 경우(A) 및 야생형 담배의 화분을 상기 형질전환 담배의 암술에 묻혀 타가수분시킨 경우(B)의 열매맺힘 여부를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.

도 22 및 23에서 보는 바와 같이, 상기 형질전환 담배는 모두 자가수분에 의해 종자가 맺히지 않았고, 야생형 담배의 화분에 의한 타가수분에서는 열매가 맺히는 표현형을 보였다. 이를 통해, 본 발명에 의하여, 암술의 기능은 정상적인 웅성불임 담배가 제조되었음을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 본 발명의 유전자 및 그의 프로모터는 식물의 꽃기관 발달과정에서 중요한 역할을 수행하며, 유용 외래 유전자의 화분 특이적 발현을 가능하게 하고, 더 나아가 세포 독성 단백질 또는 본 발명의 사과 유래의 약 특이적 발현 유전자의 안티센스 mRNA가 발현되도록 고안된 재조합 유전자 컨스트럭트를 식물체에 도입함으로써, 다른 기능은 정상적인 웅성불임 식물체를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.

본 발명은 사과의 약에서 특이적으로 발현하는 신규의 유전자 MdASG1, MdASG2, MdASG3 및 상기 유전자의 프로모터를 제공한다. 본 발명의 약 특이발현 유전자는 식물의 생식기관인 수술의 발달에 있어서 중요한 역할을 수행하기 때문에, 식물체의 수정에 관여하는 화분의 발달 메커니즘을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있고, 그로부터 확인된 프로모터 유전자 PMdASG1, PMdASG2 및 PMdASG3은 화분 특이적 발현을 인식하는 영역을 여러 부위 포함하고 있으며, 형질전환 식물체로의 화분이나 약에서만 목적하는 유전자를 발현시키기 위한 특이적 발현과 높은 활성을 나타내므로 상기 프로모터의 전체 또는 일부를 식물 형질전환체 개발에 이용하면 웅성불임체 개발과 화분 특이적 발현을 요구하는 유전자 변형 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 아울러, 약에서 특이적으로 발현되는 MdASG1, MdASG2 유전자를 상시적 발현을 나타내는 35S 프로모터와 결합하여 제조된 형질전환 담배에서 웅성기관의 변화이외에는 식물 발달의 이상을 발견할 수 없어, MdASG1, MdASG2 유전자의 발현을 조절함으로써 웅성불임 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (24)

1. 서열번호 1로 기재되는 MdASG1, 서열번호 2로 기재되는 MdASG2 및 서열번호 3으로 기재되는 MdASG3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 .
2. 삭제
3. 서열번호 5로 기재되는 PMdASG2의 2530번째 염기로부터 2874번째 염기 사이의 서열로 구성되는 화분 특이적 프로모터
4. 서열번호 5로 기재되는 PMdASG2의 2530번째 염기로부터 2786번째 염기 사이의 서열로 구성되는 화분 특이적 프로모터.
5. 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 기재되는 것을 특징으로 하는 화분 특이적 프로모터.
6. 제 3항 내지 5항 중 어느 한 항의 프로모터 및 이것과 작동 가능하도록 연결되는 외래 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 유전자 컨스트럭트.
7. 제 1항의 유전자 또는 그의 안티센스 서열을 포함하는 재조합 벡터.
8. 제 7항에 있어서, 도 3의 개열지도로 나타내어지는 MdASGs/pBluescript, MdASGs/pRTL2 및 MdASGs/pCAMBIA2301로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터(이때, 'MdASGs'에서 's'는 1 내지 3 중 어느 하나의 숫자를 의미한다).
9. 제 8항에 있어서, 도 3의 개열지도로 나타내어지는 MdASGs/pRTL2 인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
10. 제 1항의 유전자 또는 제 7항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포.
11. 제 3항 또는 5항의 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터.
12. 제 11항에 있어서, 식물형질전환용 아그로박테리움 바이너리 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
13. 제 11항에 있어서, 상기 프로모터 하위에 적어도 하나 이상의 외래 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 안티센스 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
14. 제 13항에 있어서, 상기 외래 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 외래 유전자 는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 리보솜 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein, RIP)을 코딩하는 유전자, MdASG1, MdASG2 및 MdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 또는 그의 안티센스 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
15. 제 13항에 있어서, 아그로박테리움의 T-DNA를 포함하는 아그로박테리움 바이너리 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
16. 제 13항에 있어서, 도 14의 개열지도로 나타내어지는 pMd2proRIP 또는 도 15의 개열지도로 나타내어지는 pMd2proASMd2인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
17. 제 11항의 재조합 벡터를 숙주 균주에 형질전환시켜 제조한 형질전환 균주.
18. 제 17항에 있어서, 상기 숙주 균주는 아그로박테리움인 것을 특징으로 하는 형질전환 균주.
19. 제 18항에 있어서, 수탁번호 KTCT10769BP로 기탁된 재조합 아그로박테리움 LBA4404/pMd2proASMd2인 것을 특징으로 하는 형질전환 균주.
20. ⅰ) 제 1항의 유전자 또는 그의 안티센스 서열을 포함하는 재조합 발현벡터 또는 제 3항 내지 5항 중 어느 한 항의 프로모터 및 그의 하위에 작동가능하게 연결되는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

    ⅱ) 상기 재조합 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계;

    ⅲ) 상기 아그로박테리움과 식물 세포를 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및

    ⅳ) 상기 형질전환된 식물세포를 조직배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 약 또는 화분 특이적 유전자 발현을 갖는 형질전환 식물의 제조방법
21. 제 20항에 있어서, 상기 외래 유전자는 1항의 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자의 안티센스 또는 리보솜 불활성화 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 약 또는 화분 특이적 유전자 발현을 갖는 형질전환 식물의 제조방법.
22. ⅰ) 제 3항 내지 5항 중 어느 한 항의 프로모터 및 그의 하위에 작동가능하도록 연결되는 세포 독성 단백질을 코딩하는 유전자 또는 화분 형성에 필수적인 유전자에 대한 안티센스 서열을 포함하는 식물형질전환용 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

    ⅱ) 상기 재조합 발현벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;

    ⅲ) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물 세포와 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및

    ⅳ) 상기 형질전환된 식물세포를 조직배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 웅성불임 식물체의 제조방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 세포 독성 단백질은 리보솜 불활성화 단백질인 것을 특징으로 하는 웅성불임 식물체의 제조방법.
24. 제 22항에 있어서, 화분 형성에 필수적인 유전자는 MdASG1, MdASG2 및 MdASG3로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자인 것을 특징으로 하는 웅성불임 식물체의 제조방법.

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