JPH11290082A - イネのｏｓｄｉｍ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 植物の形態形成に関与するタンパク質を
コードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡのアンチセンス鎖を導
入した植物細胞を培養し再分化個体を得ることを特徴と
する矮性化植物の作製方法、並びにイネにおいて恒常的
な遺伝子発現を誘導できる新規プロモーターである。 【効果】 植物の形態形成に関与するタンパク質をコー
ドするＤＮＡが提供され、このＤＮＡのアンチセンス鎖
を利用することにより、矮性化植物を作製することがで
きる。また、イネにおいて恒常的な遺伝子発現を誘導で
きる新規プロモーターが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の形態形成、
特に草丈に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、及
び該ＤＮＡのアンチセンス鎖を利用した矮性化植物の作
製方法、並びにイネにおいて外来遺伝子を恒常的に発現
させるためのプロモーターに関する。

【０００２】

【従来の技術】成熟したイネが倒伏すると収穫作業が困
難になるとともに収量の著しい低減を招く。一般に草丈
の長いイネは倒伏しやすいので、イネの矮性化は、水稲
品種育種のひとつの重要な目標である。これまでに、イ
ネの矮性化変異体は、遺伝学的な手法により多数同定さ
れてきた。

【０００３】これらの変異体は、ジベレリンの投与によ
り草丈が回復するものとジベレリンの投与によっても草
丈が回復しないものとに大別することができる。前者
は、ジベレリン感受性変異体であり、ジベレリンの生合
成系に関与する酵素などの欠損変異であることが明らか
になっており、最近、この変異体に関与する遺伝子とし
て、アラビドプシスのGA1遺伝子が単離されている［Sun
and Kamiya, Plant Cell 6: 1509-1518, 1994］。一
方、後者はジベレリン非感受性変異体であるが、矮性化
のメカニズムについてはほとんど明らかになっていない
のが現状である。

【０００４】イネの稈長の矮性化は、古典的には、放射
線照射などの突然変異育種、培養変異及び矮性品種との
交配育種などにより行われてきた。これまでに突然変異
育種法によって作出された矮性品種もいくつか知られて
いる。しかし、突然変異育種法により導入された矮性変
異形質の大部分は劣性遺伝子に支配されており、劣悪な
形質を伴うことが多いため、矮性変異形質を優良品種に
導入するためには、通常、長い育種年限を必要とすると
いう問題点があった。

【０００５】また、組織培養法により導入された矮性変
異形質は、複数の劣性遺伝子により支配されている場合
が多いため、戻し交配などにより矮性変異形質を優良品
種に導入することが難しいという問題があった。一方、
上記の古典的矮性化方法の他に、矮性遺伝子の導入によ
り植物を矮性化した事例も報告されている。例えば、ア
グロバクテリウムのrolA-C遺伝子をタバコに導入した例
［Schmullingら. EMBO J. 7: 2621-2692, 1988, Oono
ら. J. J Genetics 62: 501-505, 1987］、イネのOSMAD
S1 遺伝子をタバコに導入した例［Chungら. Plant Mol.
Biol. 26: 657-665, 1994］などの報告がある。

【０００６】このような遺伝子導入により植物を矮性化
する方法によれば、目的とする部位（たとえば節間）の
みを短縮するような育種も可能になると考えられる。従
って、遺伝子導入により植物を矮性化する方法は、非常
に有用性が高いと考えられる。遺伝子導入により植物を
矮性化する方法としては、例えば、ジベレリンの生合成
に関与する遺伝子の導入により植物のジベレリン生合成
系を抑制して植物を矮性化させる方法が考えられる。

【０００７】しかし、ジベレリンの生合成に関与する遺
伝子の導入により植物を矮性化する場合、ジベレリンは
植物ホルモンであるため、目的とする組織以外にも影響
を与え、種子の大きさや数の減少をもたらす一方、他の
組織で生産されたジベレリンによって矮性化の効果が薄
れることが考えられ、実用的とはいえない。ジベレリン
の生合成に関与する遺伝子以外の矮性遺伝子の導入によ
り植物を矮性化する方法も考えられるが、ジベレリンの
生合成に関与せず植物の草丈に関与する遺伝子として同
定された遺伝子としては、アラビドプシスにおいてT-DN
Aタッギングで見出されたdiminuto (DIM)遺伝子［Takah
ashiら. Gene Dev. 9: 97-107, 1995］が知られるのみ
である。従って、矮性遺伝子の導入により植物を矮性化
する場合、半矮性(sd-1)遺伝子以外に品種育種に有用な
矮性遺伝子がないのが現状である。

【０００８】そこで、植物の矮性遺伝子の提供、及び矮
性遺伝子を利用した矮性化植物の作製方法の開発が緊急
の課題となっている。さらに、植物のうちで特に矮性化
が必要とされているイネにおいて、矮性遺伝子を利用し
て矮性化イネの作製するためには、イネにおいて恒常的
な遺伝子発現を誘導できるプロモーターの開発が必要と
なる。

【０００９】従来、形質転換イネにおいて外来遺伝子を
発現させるためにトウモロコシのユビキチン遺伝子のプ
ロモーター及びイネのアクチン遺伝子プロモーターが良
く利用されているが、これらのプロモーターは必ずしも
イネにおいて恒常的な遺伝子発現を誘導できるとはいえ
ない。そこで、植物の矮性遺伝子の提供、及び矮性遺伝
子を利用した矮性化植物の作製方法の開発と併せて、イ
ネにおいて恒常的に遺伝子発現を誘導できるプロモータ
ーの開発が緊急の課題となっている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物の矮性
遺伝子及び矮性遺伝子を使用した矮性化植物の作製方
法、並びにイネにおいて恒常的に外来遺伝子の発現を誘
導できるプロモーターを提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、細胞骨格に関与するタンパク質をコード
する遺伝子であるDIM遺伝子に着目した。DIM遺伝子は、
アラビドプシスのT-DNAタッギング実験により単離され
た矮性遺伝子であり、DIM遺伝子にコードされるタンパ
ク質はFAD依存性オキシダーゼとの相同性が認められ［A
rcadyら. ProteinSci. 4:1243-1244］、細胞骨格を形成
している微小管の組織化に関与すると考えられている。

【００１２】本発明者らは、イネの塩ストレスｃＤＮＡ
ライブラリーからDIM遺伝子と高いホモロジーを示すｃ
ＤＮＡ断片を含むクローンSSU009を同定し、このクロー
ンに含まれるｃＤＮＡをプローブとして使用して、イネ
の葉から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グした結果、DIM遺伝子と高いホモロジーを示す完全長
のｃＤＮＡ（以下、「OSDIMｃＤＮＡ」という）を単離
することに成功し、その塩基配列を決定した。

【００１３】そして、このｃＤＮＡをアンチセンス方向
で組み込んだバイナリーベクターを作製し、このバイナ
リーベクターを導入したアグロバクテリウムによって正
常型のアラビドプシスを形質転換した結果、草丈が著し
く短縮した個体が認められたことから、上記ｃＤＮＡが
植物の草丈を制御するための遺伝子素材として有効であ
ることを明らかにした。

【００１４】一方、本発明者らは上記プローブを用いて
イネゲノムライブラリーをスクリーニングすることによ
り、DIM遺伝子と高いホモロジーを示すゲノムＤＮＡ
（以下、「OSDIMゲノムＤＮＡ」という）を単離し、そ
の塩基配列を決定した。そして、ゲノムＤＮＡ及びｃＤ
ＮＡの塩基配列の比較により、プロモーター領域を特定
することに成功した。さらに、本発明者らは、サザン解
析及びノーザン解析によりOSDIMｃＤＮＡがイネのすべ
ての組織で恒常的に発現していることを明らかにし、上
記プロモーター領域が外来遺伝子をイネにおいて恒常的
に発現させるためのプロモーター素材としても有効であ
ることをを明らかにした。

【００１５】すなわち、本発明は、以下の発明を包含す
る。 （１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
質 （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若し
くは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ植物の形態形成に関与する
タンパク質

【００１６】（２）以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列
により表され、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。 （ａ）配列番号２記載の塩基配列 （ｂ）配列番号２記載の塩基配列において、１若しくは
複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列 （３）以下の工程： （ａ）前記（１）記載のＤＮＡのアンチセンス鎖を植物
細胞に導入する工程、及び （ｂ）工程（ａ）で得られる植物細胞を培養し、再分化
個体を得る工程、を含んでなることを特徴とする矮性化
植物の作製方法。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一（以下、「第一発明」という）は、以下の
（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡであ
る。 （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
質 （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若し
くは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ植物の形態形成に関与する
タンパク質

【００１８】ここで、「１若しくは複数個のアミノ酸」
とは、本願の出願時に常用される技術により欠失、置換
若しくは付加することができ、かつタンパク質の植物の
形態形成への関与性を喪失させない限り、その個数は特
に限定されないが、通常は、部位特異的変異誘発法（Zo
llerら., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）
等により欠失、置換若しくは付加することができる個
数、即ち１若しくは数個を意味する。

【００１９】また、「植物の形態形成に関与するタンパ
ク質」とは、植物の形態形成のうち、特に植物の草丈に
関与するタンパク質を意味し、より具体的には、その発
現量が減少すると植物体の矮性化をもたらすようなタン
パク質を意味する。第一発明のＤＮＡは、例えば、イネ
ｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをスクリーニング
することにより得ることができる。イネｃＤＮＡライブ
ラリーは、例えば、以下のようにして作製することがで
きる。

【００２０】イネのカルスや組織（例えば、葉など）か
らＲＮＡを抽出した後、常法に従ってｍＲＮＡを分離・
精製する。このｍＲＮＡを鋳型として用い、プライマー
として合成オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴdT）を
用いて、逆転写酵素（例えば、トリウイルス由来のAMV-
RTase、ラウス関連ウイルス由来のRAV-2等）によりｃＤ
ＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、市販のｃＤＮＡ合
成キットを使用して行うことができる。逆転写反応の
後、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合
成する。得られた二本鎖ｃＤＮＡを市販のファージベク
ター又はプラスミドベクター等に組み込み、これを大腸
菌等に導入することによってイネｃＤＮＡライブラリー
を作製することができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製
に使用するベクターは、市販されているベクターを使用
することができる。

【００２１】イネｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グは、例えば、適当なプローブを作製し、これを用いた
プラークハイブリダイゼーションを行うことにより実施
できる。スクリーニングに使用できるプローブとして
は、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列により表さ
れるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（例え
ば、配列番号３）に基づいて合成されたＤＮＡ、配列番
号1記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質をコ
ードする異種生物由来のＤＮＡ（例えば、アグロバクテ
リウムのDIM遺伝子）の塩基配列に基づいて合成された
ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリーのランダムシークエンシ
ングにより上記ＤＮＡと相同性の確認されたＤＮＡ断
片、等を挙げることができる。

【００２２】また、イネの葉から調製したｃＤＮＡライ
ブラリーの各クローンに含まれるｃＤＮＡ断片の塩基配
列をランダムシークエンスにより解析しGeneBankデータ
ベースを用いてホモロジー検索することにより、既に公
知であるDIM遺伝子の塩基配列と相同性の高いｃＤＮＡ
を有するクローンを単離し［Uchimiya , H. ら、Plant
J., 1005-1009, 1992］、これらのクローンの中からOSD
IMｃＤＮＡと相同性を有する塩基配列を含むクローンを
単離し、このクローンに含まれるｃＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いることもできる。

【００２３】上記プローブを用いてイネｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーングすることにより、プローブと相同
性の高いｃＤＮＡ断片を含むクローンを選別し、このク
ローンからｃＤＮＡ断片を調製することにより、第一発
明のＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡは、サ
ンガー法、マクサム・ギルバート法などの公知の方法に
よって塩基配列決定することができる。

【００２４】第一発明のＤＮＡは、例えば、以下で述べ
る第三発明の矮性化植物の作製方法において使用でき
る。なお、第一発明のＤＮＡを組み込んだプラスミドを
導入した大腸菌IBRC-98-１は、工業技術院生命工学工業
技術研究所にFERM P-16763として寄託されている（寄託
日：平成10年４月16日）。

【００２５】本発明の第二（以下、「第二発明」とい
う）は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列により表さ
れ、かつプロモーター活性を有するＤＮＡである。 （ａ）配列番号２記載の塩基配列 （ｂ）配列番号２記載の塩基配列において、１若しくは
複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列 ここで、「１若しくは複数個の塩基」とは、本願の出願
時に常用される技術により欠失、置換もしくは付加する
ことができ、かつプロモーター活性を喪失させない限
り、その個数は特に限定されないが、通常は、部位特異
的変異誘発法（Zollerら., Nucleic Acids Res. 10, 64
87-6500, 1982）等により欠失、置換若しくは付加する
ことができる個数、即ち１若しくは数個を意味する。

【００２６】第二発明のＤＮＡは、例えば、イネゲノム
ＤＮＡライブラリーから、配列番号１記載のアミノ酸配
列により表されるタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ
（OSDIMゲノムＤＮＡ）をスクリーニングし、その塩基
配列を決定した後、公知の方法に従ってプロモーター領
域を特定し単離することにより得ることができる。プロ
モーター領域の特定は、例えば、ＤＮＡ−ｍＲＮＡのヘ
テロデュプレックスを電子顕微鏡で観察する方法、Ｓ１
マッピングを行なう方法、ｃＤＮＡライブラリーから得
られた遺伝子の塩基配列とゲノムＤＮＡライブラリーか
ら得られた遺伝子の塩基配列とを比較する方法等の公知
の方法を用いて行うことができる。

【００２７】また、ゲノムＤＮＡの塩基配列から開始コ
ドン及び終始コドンを特定することにより、プロモータ
ー領域を特定することもできる。さらに、ゲノムＤＮＡ
の転写開始配列（TATAA-box等）の同定又はｍＲＮＡの
転写開始点の解析により、プロモーター領域を特定する
こともできる。プロモーター活性を有するＤＮＡの単離
は、適当な制限酵素を用いることによって行なうことが
できる。例えば、OSDIMゲノムＤＮＡを制限酵素Nde I、
Nar I等で切断することによりプロモーター活性を有す
るＤＮＡを単離することができる。

【００２８】また、コーディング領域の制限酵素部位か
らエキソヌクレアーゼによってプロモーターの方向にゲ
ノムＤＮＡを削っていき、適当なところまで削れた断片
を探すことによって、第二発明のＤＮＡを得ることもで
きる。さらに、第二発明のＤＮＡは、例えば、フォスフ
ァイト・トリエステル法等の公知の方法に従って化学合
成することにより得ることもできる。さらに、第二発明
のＤＮＡは、その両端に相補的なプライマーを用いたPC
R法により得ることもできる。

【００２９】なお、第二発明のＤＮＡを組み込んだプラ
スミドを導入した大腸菌IBRC-98-２は、工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM P-16764として寄託されてい
る（寄託日：平成10年４月16日）。本発明の第三（以
下、「第三発明」という）は、以下の工程： （ａ）第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を植物細胞に
導入する工程、及び （ｂ）工程（ａ）で得られる植物細胞を培養し、再分化
個体を得る工程、を含んでなることを特徴とする矮性化
植物の作製方法である。

【００３０】以下、各工程ごとに説明する。 （１）工程（ａ） 工程（ａ）は、第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を植
物細胞に導入する工程である。工程（ａ）で使用する植
物細胞は、第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を導入で
き、かつ導入後の培養により再分化個体を形成し得る植
物細胞である限り特に限定されず、いかなる植物に由来
する細胞であっても、またいかなる組織や器官に由来す
る細胞であってもよい。

【００３１】このような細胞としては、例えば、イネ、
トウモロコシ、ムギ、リンゴ、トルコキキョウ、キク等
の植物に由来する細胞であって、頂芽、側芽、花、花
軸、成熟葉、未熟葉、葉柄、根等の組織や器官に由来す
る細胞が挙げられる。遺伝子導入後の培養による再分化
個体の形成の点からいえば、成熟した組織や器官よりも
未熟な組織や器官が好ましく、分裂中の組織や器官がさ
らに好ましい。その理由としては、未熟な又は分裂中の
組織や器官は、組織内の細胞が均質であること、培養に
おける生存率が高いこと、成長速度が速いこと、さらに
in vitroでの全能性を有すること等が挙げられる。

【００３２】第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を植物
細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知のいかな
る方法であってもよい。第一発明のＤＮＡのアンチセン
ス鎖を植物細胞に導入する方法としては、例えば、第一
発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を含む発現ベクターを植
物細胞に導入する方法が例示できる。この際使用する発
現ベクターは、第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を含
むものである限り、特に限定されない。

【００３３】このような発現ベクターの構築は、例え
ば、以下のようにして行うことができる。すなわち、第
一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖をプロモーター及びタ
ーミネーターの間に連結することにより遺伝子カセット
を作製し、この遺伝子カセットを適当な制限酵素を用い
てベクター（例えば、バイナリーベクター等のTiプラス
ミド系ベクター）に導入することにより発現ベクターを
構築することができる。上記発現ベクターにより形質転
換された植物培養細胞の選択を容易にするために、第一
発明のＤＮＡのアンチセンス鎖の下流にマーカー遺伝子
及び／又はレポーター遺伝子を挿入しておくのが好まし
い。マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン抵
抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ビアラフ
ォス抵抗性遺伝子等が挙げられ、レポーター遺伝子とし
ては、例えば、ＧＵＳ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等が挙げら
れる。

【００３４】発現ベクターの植物細胞への導入は、常法
に従って行うことができる。例えば、発現ベクターとし
て、第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を含むバイナリ
ーベクターを使用する場合には、このバイナリーベクタ
ーを、vir領域をもつヘルパープラスミドを有するアグ
ロバクテリウムにエレクトロポレーション法等によって
移した後、このアグロバクテリウムを植物細胞に感染さ
せることにより、宿主ゲノム中に第一発明のＤＮＡのア
ンチセンス鎖を組み込ませることができる。

【００３５】第一発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を植物
細胞に導入し、該植物細胞内でアンチセンスＲＮＡを発
現させることにより、該アンチセンスＲＮＡと植物の形
態に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡとをハイ
ブリッド形成させることができる。これにより、植物の
形態に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳
を阻害することができる。

【００３６】（２）工程（ｂ） 工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られる植物細胞を培養
し、再分化個体を得る工程である。植物細胞を培養し、
再分化個体を得る方法は、公知のいかなる方法に従って
もよい。このような方法としては、例えば、体細胞胚形
成、器官形成等による方法が挙げられる。体細胞胚形成
による方法では、体細胞胚を細胞培養、組織培養、器官
培養等から直接又は間接的に生じさせる。例えば、直接
体細胞胚形成では、遺伝子導入した外植片組織上の単一
細胞又は一群の細胞を培養することにより、カルスが形
成されることなく無性胚が形成される。また、間接体細
胞胚形成では、遺伝子導入した外植片を培養し、続いて
カルス増殖と前胚形成を行い、そして成長調整物質を加
えていない栄養培地にカルスを移植して前胚から二極性
胚形成を誘導する。このようにして形成された胚は、適
当な条件下で発芽し幼植物体を生じ、さらに培養を継続
することにより再分化個体が得られる。

【００３７】器官形成による方法には、遺伝子導入した
外植片からカルスを形成し、カルスから不定器官を生じ
させる方法、遺伝子導入した外植片から直接不定器官を
生じさせる方法、及び腋芽を成長させ幼植物体を生じさ
せる方法等がある。上記方法は、いずれも常法に従って
行うことができる。上記方法のいずれにおいても、植物
細胞の培養条件は、再分化個体を得ることができる限り
特に限定されず、用いる方法に応じて、光の強さとタイ
プ、照明時間、温度、酸素と二酸化炭素の比率、その他
のガスの濃度、培地の成分組成、オーキシンとサイトカ
イニンの濃度、等を適宜決定することができる。

【００３８】工程（ａ）で植物の形態に関与するタンパ
ク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害された植物細胞
を工程（ｂ）で培養することにより得られる再分化個体
は、植物の形態に関するタンパク質の発現が阻害された
個体、すなわち矮性化植物体である。従って、第三発明
の方法により、矮性化植物を作製することができる。

【００３９】

【実施例】以下に、本発明を具体的に説明する。 〔実施例１〕OSDIMｃＤＮＡの単離・同定 （１）イネのｃＤＮＡライブラリーの作製 播種後１０日目のイネの葉（品種：かけはし）から、フ
ェノール−クロロホルム法により総ＲＮＡを抽出し、総
ＲＮＡからOligo (dT)ラテックスを用いてｍＲＮＡを調
製した。これをテンプレートとしてλ ZAP II ベクター
（Stratagene社）上にｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。その後、λ ZAP II ファージライブラリーを、VCS-
M13 ヘルパーファージを用いた in vivo excision によ
って pBluescript SK(-)プラスミドに変換し、大腸菌 S
OLR 株に導入した。

【００４０】この大腸菌 SOLR 株をアンピシリン(50mg/
ml)を含んだマコンキー寒天プレート上で培養してコロ
ニーを形成させた。

【００４１】（２）プローブの作製 ２％のNaClを含む液体培地で培養したイネの懸濁培養細
胞からイネの塩ストレスｃＤＮＡライブラリーを調製し
た。この塩ストレスｃＤＮＡライブラリーから任意のク
ローンを選択し、クローンに含まれるｃＤＮＡの塩基配
列解析及びホモロジー検索を行うことにより、アラビド
プシスのDIM遺伝子と高いホモロジーを示すｃＤＮＡ断
片を含むクローンSSU009を同定した。クローンSSU009か
ら単離したDIM遺伝子と高いホモロジーを示すｃＤＮＡ
断片をＥＣＬ法（Amersham Intl.）によってラベル化
し、これを上記（１）で作製したイネｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするためのプローブとして使用し
た。

【００４２】（３）イネｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング 上記（２）で作製したプローブを使用して上記（１）で
作製したイネｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た結果、30個の陽性クローンが同定された。これらの陽
性クローンに含まれるｃＤＮＡ断片を、部分シークエン
シング（partial sequencing）及び制限断片長多型によ
って解析した結果、これらの陽性クローンに含まれるｃ
ＤＮＡ断片はすべて同じ遺伝子に由来することが明らか
になった。そして、これらの陽性クローンの中から全長
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでい
ると考えられる2.1kbのｃＤＮＡ断片を含むクローンを
選抜した。

【００４３】（４）ｃＤＮＡ断片の塩基配列決定 選抜した全長のＯＲＦを含むｃＤＮＡ断片を含むクロー
ンを用いて、deletionseries を作製して pBluescript
SK（−）にサブクローニングした。得られたｃＤＮＡ断
片の塩基配列を、T７プライマー及びT３プライマー（東
洋紡社製）を用いて、Applied Biosystem 社の373A DNA
シークエンサーによって決定した。決定されたｃＤＮＡ
の塩基配列を配列番号３に示す。

【００４４】塩基配列決定されたｃＤＮＡは、配列番号
３に示されるごとく単一のオープンリーディングフレー
ムを含んでいる。このオープンリーディングフレーム
は、５'末端から170〜172番目のATGから翻訳開始され、
５'末端から1,853〜1,855 番目のTAAで終了する大きな
オープンリーディングフレームである。転写開始点の解
析を行ったところ、開始コドンの上流には、169塩基の
非翻訳配列が存在することが、また終止コドンから295
塩基下流にポリ(Ａ)が付加していることが明らかにな
り、上記ｃＤＮＡは完全長のOSDIMｃＤＮＡであること
が判明した。

【００４５】配列番号３記載の塩基配列から推定される
アミノ酸配列を配列番号３に併記する。このアミノ酸配
列から推定されるタンパク質は 561アミノ酸残基よりな
り、推定される分子量は 65 キロダルトンである。この
アミノ酸配列をアラビドプシスのDIM遺伝子の塩基配列
から推定されるアミノ酸配列と比較したところ、約80％
と高い相同性が認められた。

【００４６】〔実施例２〕イネOSMIDｃＤＮＡのノーザ
ンブロット法及びサザンブロット法による解析 （１）ノーザンブロット法による解析 OSMIDｃＤＮＡがイネの各組織において恒常的に発現し
ているか否かを、ノーザンブロット法を用いて以下のよ
うに解析した。発芽後15日目及び45日目の実生苗の各組
織（根、茎頂、葉身及び葉鞘）からｍＲＮＡを抽出し、
このｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動法により分離し
てナイロンメンブランに転写した後、変性処理（1.5 M
NaCl, 0.5 M NaOH）及び中和処理（0.5 M Tris-HCl pH
7.2, 1.5 M NaCl, 1 mM EDTA)を施した。SSU009に含ま
れるｃＤＮＡ断片をＥＣＬ法によりラベル化し、これを
プローブとして使用して、変性処理（5 x SSC, 5 x Den
hart, 0.5 % SDS, 0.1 mg / ml）を施した Salmon sper
m DNAを含む溶液中で、上記ｍＲＮＡと65℃で15時間ハ
イブリダイゼーションさせた。

【００４７】その後、0.1％ SDSを含む 2 x SSC溶液で
非特異的にメンブランに結合したプローブを洗い、基質
と反応させた後、X線フィルムに密着させて感光させ
た。その結果を図１に示す。図１中、「Ａ」は発芽後15
日目の実生苗、「Ｂ」は発芽後45日目の実生苗における
結果を示す。また、「Ｒ」は根、「Ｌｔ」は茎頂、「Ｌ
ｂ」は葉身、「Ｌｓ」は葉鞘における結果を示す。図１
に示すように、OSDIMｃＤＮＡはイネのすべての組織で
恒常的に発現していることが明らかになった。

【００４８】（２）サザンブロット法による解析 播種後３週間目の「かけはし」及び「ササニシキ」の実
生苗からSDS-フェノール法によりゲノムＤＮＡを抽出
し、５種類の制限酵素（AbaI、BamHI、EcoRI、KpnI、Ps
tI）で完全に消化した。このゲノムＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動法により分離した後、ナイロンメンブ
ランに転写して、変性処理（1.5 Ｍ NaCl,0.5 M NaOH）
及び中和処理（0.5 M Tris-HCl pH 7.2, 1.5 M NaCl, 1
mM EDTA)を施した。

【００４９】SSU009に含まれるｃＤＮＡをＥＣＬ法によ
りラベルし、これをプローブとして使用して、変性処理
（5 x SSC, 5 x Denhart, 0.5％ SDS, 0.1 mg/ml）を施
したSalmon sperm DNAを含む溶液中で、上記ゲノムＤＮ
Ａと65℃で15時間ハイブリダイゼーションさせた。その
後、0.1％ SDSを含む 2 x SSC溶液で非特異的にメンブ
ランに結合したプローブを洗い、基質と反応させた後、
X線フィルムに密着させて感光させた。

【００５０】その結果を図２に示す。図２に示すよう
に、OSDIMｃＤＮＡはイネのゲノム中にハプロイド当た
り１コピーで存在することが明らかになった。

【００５１】〔実施例３〕プロモーター領域の同定 （１）イネゲノムＤＮＡライブラリーの作製 播種後３週間経過後のイネの実生苗（品種：かけはし）
を用いて、SDS−フェノール法によりゲノムＤＮＡを抽
出し、塩化セシウム超遠心法でゲノムＤＮＡを精製した
後、制限酵素 MboI によりゲノムＤＮＡを無作為に切断
した。ＤＮＡ溶液を10−40％ショ糖密度勾配に重層し、
遠心分離により12-20kbのＤＮＡ画分を分取した。ゲノ
ムＤＮＡを EMBL3-BamHIアームに連結させた後、in vit
roパッケージング法によりλファージを再構成させ、こ
れを宿主大腸菌KW57に感染させてゲノムＤＮＡライブラ
リーを作製した。

【００５２】（２）イネゲノムＤＮＡライブラリーのス
クリーニング SSU009から単離したｃＤＮＡをＥＣＬ法によりラベル化
し、これをプローブとして、イネゲノムＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングした結果、18個の陽性クローンが
同定された。 （３）ゲノムＤＮＡの塩基配列決定 スクリーニングして得られた陽性クローンのdeletion s
eriesを作製し、陽性クローンに含まれるゲノムＤＮＡ
断片の塩基配列をDye Terminater Cycle Sequence 法に
従って決定した。

【００５３】（４）プロモーター領域の同定 ｃＤＮＡの塩基配列とゲノムＤＮＡの塩基配列を、SDC-
GENETYX（SDCソフトウエア開発社製）を用いて解析する
ことにより、プロモーター領域の同定を行った。その結
果、ゲノムＤＮＡの開始コドン直前に約1.3kbの大きな
イントロン及び翻訳領域の中に約0.2kbの短いイントロ
ンが存在することが明らかになった。

【００５４】また、ｍＲＮＡへの転写はゲノムＤＮＡの
開始コドンから1,208塩基上流より開始されること、及
びゲノムＤＮＡは開始コドンの直前に1,039塩基対の大
きなイントロン（-1,054〜-16）を含んでいることが明
らかになった。さらに、ゲノムＤＮＡは、651個のアミ
ノ酸をコードしているものと推定され、アラビドプシス
のDIM遺伝子産物と約80％の相同性を示した。以上の結
果より、ゲノムＤＮＡの開始コドンから2,000塩基がプ
ロモーター領域として同定された（以下、「OSDIMプロ
モーター」という）。OSDIMプロモーターの塩基配列を
配列番号２に示す。

【００５５】OSDIMｃＤＮＡは上記のようにイネのすべ
ての組織で恒常的に発現していることから、OSDIMゲノ
ムＤＮＡもイネのすべての組織で恒常的に発現している
と考えられる。従って、OSDIMプロモーターはイネのす
べての組織で構成的発現を誘導するものと考えられる。
なお、トウモロコシのユビキチン遺伝子等の発現力の強
いプロモーターにはイントロンが含まれていることが認
められているので、このOSDIMプロモーターに含まれる
イントロンも同様な役割を果たしているものと考えられ
る。

【００５６】（４）OSDIMプロモーターのプロモーター
活性の確認 OSDIMプロモーターとGUS遺伝子を連結し、イネ培養細胞
に導入してTransientexpression assayを行った結果、O
SDIMプロモーターは対照として使用したCaMV35Sプロモ
ーターよりも強い遺伝子発現を誘導することが確認され
た。

【００５７】〔実施例４〕OSDIMｃＤＮＡのアンチセン
ス鎖を利用した矮性化アラビドプシスの作製方法 （１）OSDIMｃＤＮＡのアンチセンス鎖を含むアグロバ
クテリウムの作製 OSDIMｃＤＮＡをカリフラワーモザイクウィルス(CaMV)3
5S 転写物のプロモーターおよびアグロバクテリウムの
ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターの間にアンチ
センス方向に連結した遺伝子カセットを作製し、バイナ
リーベクターpSMAB704（農業生物資源研究所）のHindII
I-EcoRIサイトの間を置換して pSMAB-anti OSDIM を構
築した（図３）。構築したバイナリーベクターpSMAB-an
ti OSDIMをアグロバクテリウム(EHA101)にエレクトロポ
レーション法により導入した。

【００５８】（２）アグロバクテリウムによるアラビド
プシスの形質転換 野生型のアラビドプシスの種子を、ホルモンを含まない
ＭＳ（Murashige-Skoog）培地（和光 392-00591）に播
種し、20℃で約３週間培養した。培養により生育した植
物体の根を切断し、１cm長の根の断片を得た。この断片
をCIM培地で２日間培養した後、バイナリーベクターpSM
AB-antiOSDIMを導入したアグロバクテリウムを感染させ
た。感染は、宿主ゲノム中に１個のOSDIMｃＤＮＡが組
み込まれるように行った。感染させた根を静菌剤クラフ
ォラン及び抗生物質ビアラフォスを2ppm含む選択培地に
置床し、５日に一回新たな培地に変えて継代培養した。
１ヶ月程培養を続けると、ビアラフォスに抵抗性を示す
再分化個体（以下、「Ｔ１形質転換体」という）を得る
ことができた。一方、上記アグロバクテリウムを感染さ
せずに、根から上記と同様にして再分化個体（以下、
「野生型」という）を得、これをＴ１形質転換体の対照
とした。

【００５９】Ｔ１形質転換体にOSDIMｃＤＮＡのアンチ
センス鎖が導入されたことは、、OSDIMｃＤＮＡ及び Ca
MV 35Sプロモーターに対する一対のプライマーを用いた
PCRを行い、PCR産物の電気泳動結果より確認した。この
際、プライマーとしては、35SN1：Cdim1と35SN1：Cdim2
の２種類を使用した。各プライマーの塩基配列を以下に
示す。

【００６０】35SN1： CACAATCCCACTATCCTTCG Cdim1： TACGTCGACATGGCAGATCTGCAGGAGC Cdim2： TCAACATGGGCCAGATAACC なお、プライマー35SN１の塩基配列は、Ca35Sプロモー
ターの731〜750番目の塩基配列に対応する。

【００６１】PCR産物の電気泳動結果を図４に示す。図
４中、レーン０はベクターのみを導入した植物について
のPCR結果を、レーン１〜４はＴ１形質転換体について
のPCR結果を示す。図４に示すように、Ｔ１形質転換体
に、OSDIMｃＤＮＡのアンチセンス鎖が導入されている
ことが確認された。

【００６２】その後、Ｔ１形質転換体を自殖し、Ｔ２形
質転換体を得た。Ｔ２形質転換体は、メンデルの法則に
従い、ゲノム中に２個のOSDIMｃＤＮＡが組み込まれた
もの、ゲノム中に１個のOSDIMｃＤＮＡが組み込まれた
もの及びゲノム中にOSDIMｃＤＮＡが組み込まれていな
いものが１：２：１の割合で出現した。以下、ゲノム中
に２個又は１個のOSDIMｃＤＮＡが組み込まれたものを
「Ｔ２形質転換体の矮性変異体」といい、ゲノム中にOS
DIMｃＤＮＡが組み込まれていないものを「Ｔ２形質転
換体の正常型」という。Ｔ２形質転換体の正常型は、Ｔ
２形質転換体の矮性変異体の対照とした。

【００６３】Ｔ１形質転換体と野生型とを比較した結果
を図５に、Ｔ２形質転換体の矮性変異体とＴ２形質転換
体の正常型とを比較した結果を図６に示す。なお、図５
中の左側が野生型であり、右側がＴ１形質転換体であ
る。また、図６中の左側がＴ２形質転換体の正常型であ
り、右側がＴ２形質転換体の矮性変異体である。図５び
６に示すように、OSDIMｃＤＮＡのアンチセンス鎖を導
入した再分化個体（Ｔ１形質転換体及びＴ２形質転換体
の矮性変異体）は、対照の再分化個体（野生型及びＴ２
形質転換体の正常型）よりも著しく草丈が低くなってい
ることが判明した。これにより、OSDIMｃＤＮＡのアン
チセンス鎖を導入した植物細胞を培養し再分化個体を形
成させることより、矮性化植物を作製できることが明ら
かとなった。

【００６４】

【発明の効果】本発明によって、植物の形態形成、特に
草丈に関与するタンパク質をコードするＤＮＡが提供さ
れる。本発明のＤＮＡのアンチセンス鎖を導入した植物
細胞を培養し、再分化個体を形成させることにより、矮
性化植物を作製することができる。本発明の矮性化植物
の作製方法によれば、目的とする組織のみを短縮化する
こともできる。特に、イネの優良品種への倒伏抵抗性の
付与が望まれているので、本発明のＤＮＡのアンチセン
ス鎖を節間などに導入することにより、節間伸長のみを
抑制することができる。さらに、本発明により、新規プ
ロモーターが提供される。本発明のプロモーターは、イ
ネの全組織において恒常的な遺伝子発現を誘導できるの
で、遺伝子工学によるイネ等の作物品種育種に特に有用
である。

【００６５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：561 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：イネ (Oryza sativa) 細胞の種類：葉 配列 Met Ala Asp Leu Gln Glu Pro Leu Val Arg Pro Lys Arg Lys Lys Val 1 5 10 15 Leu Val Asp Tyr Leu Val Lys Phe Arg Trp Ile Leu Val Ile Phe Val 20 25 30 Val Leu Pro Ile Ser Ala Leu Ile Tyr Phe Asn Ile Tyr Leu Gly Asp 35 40 45 Val Trp Ser Ala Met Lys Ser Glu Lys Arg Arg Gln Lys Glu His Asp 50 55 60 Asp Asn Val Gln Lys Val Val Lys Arg Leu Lys Gln Arg Asn Pro Lys 65 70 75 80 Lys Asp Gly Leu Val Cys Thr Ala Arg Lys Pro Trp Ile Ala Val Gly 85 90 95 Met Arg Asn Val Asp Tyr Lys Arg Ala Arg His Phe Glu Val Asp Leu 100 105 110 Ser Ala Phe Arg Asn Ile Leu Glu Ile Asp Arg Glu Arg Met Val Ala 115 120 125 Lys Val Glu Pro Leu Val Asn Met Gly Gln Ile Thr Arg Ala Thr Cys 130 135 140 Pro Met Asn Leu Ala Leu Ala Val Val Ala Glu Leu Asp Asp Leu Thr 145 150 155 160 Val Gly Gly Leu Ile Asn Gly Tyr Gly Ile Glu Gly Ser Ser His Leu 165 170 175 Tyr Gly Leu Phe Ser Asp Thr Val Val Ala Val Glu Val Val Leu Ala 180 185 190 Asp Gly Arg Val Val Arg Ala Thr Lys Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Leu 195 200 205 Phe Tyr Gly Ile Pro Trp Ser Gln Gly Thr Leu Gly Phe Leu Val Ser 210 215 220 Ala Glu Ile Lys Leu Ile Pro Ile Lys Glu Tyr Met Arg Leu Thr Tyr 225 230 235 240 Thr Pro Val Lys Gly Ser Leu Lys Glu Ile Ala Gln Gly Tyr Cys Asp 245 250 255 Ser Phe Ala Pro Arg Asp Gly Asp Pro Ala Lys Val Pro Asp Phe Val 260 265 270 Glu Gly Met Val Tyr Thr Glu Asn Glu Gly Val Met Met Thr Gly Val 275 280 285 Tyr Ala Ser Lys Glu Glu Ala Lys Lys Lys Gly Asn Lys Ile Asn Cys 290 295 300 Val Gly Trp Trp Phe Lys Pro Trp Phe Tyr Gln His Ala Gln Thr Ala 305 310 315 320 Leu Lys Lys Gly Glu Phe Val Glu Tyr Ile Pro Thr Arg Glu Tyr Tyr 325 330 335 His Arg His Thr Arg Cys Leu Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Ile Leu Pro 340 345 350 Phe Gly Asp Gln Phe Trp Phe Arg Phe Leu Leu Gly Trp Leu Met Pro 355 360 365 Pro Lys Val Ser Leu Leu Lys Ala Thr Gln Gly Glu Ser Ile Arg Asn 370 375 380 Tyr Tyr His Asp Asn His Val Ile Gln Asp Met Leu Val Pro Leu Tyr 385 390 395 400 Lys Val Gly Asp Ala Leu Glu Phe Val His Lys Glu Met Glu Val Tyr 405 410 415 Pro Leu Trp Leu Cys Pro His Arg Leu Tyr Lys Leu Pro Val Lys Thr 420 425 430 Met Val Tyr Pro Glu Pro Gly Phe Glu His His His Arg Gln Gly Asp 435 440 445 Thr Ser Tyr Ala Gln Met Phe Thr Asp Val Gly Val Tyr Tyr Ala Pro 450 455 460 Gly Ala Val Leu Arg Gly Glu Glu Phe Asn Gly Ala Leu Ala Val His 465 470 475 480 Arg Leu Glu Gln Trp Leu Ile Glu Asn His Ser Tyr Gln Pro Gln Tyr 485 490 495 Ala Val Ser Glu Leu Asn Glu Lys Asp Phe Trp Arg Met Phe Asp Ala 500 505 510 Ser His Tyr Glu His Cys Arg Gln Lys Tyr Gly Ala Val Gly Thr Phe 515 520 525 Met Ser Val Tyr Tyr Lys Ser Lys Lys Gly Arg Lys Thr Glu Lys Glu 530 535 540 Val Gln Glu Ala Glu Ala Ala Ile Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Glu 545 550 555 560 Ala

【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：2000 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：イネ (Oryza sativa) 細胞の種類：葉 配列の特徴 存在位置：1...2,000 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GACATCATAC TTGGCCCACT TAATATGCCA TATGGCTATT TTTAAGTCAA TATTTCTATT 60 AGAAAATATC CCTTTTGCCC TTAATTTATA TACAACTATA TACTAAAAGG GAGAAAACCA 120 AGATGAATAA ACAACATTGC ATATATACTT CCCATTATTT CAATATGTGC ACATGAAACT 180 TAAGCAATTA CTATCGTATA CACTTGCTAG TACATAATTT ATTTTCGTTT TACATAATTT 240 ACTAAACATT ATCTTAAAAA AATAAAGCAT ACAAATTTTC TCTTATATAT GTGAATGATG 300 GGGGTATAAG TGTCATTTAT CAAGAGAGTT GTTGGTTTAA GGATAAGTTT GAACTAAAAT 360 AAAAACTTGA ATGAGTAATA TGGATAGACT GAAACATTAA GAACTAAACT GAGCTTTGGA 420 TGAAACTTGG AGGACCACTT TAGCTATTCA CCCTTCATAT TTTATCATCT TATAATAATA 480 AAAATACTAA TTATAAAAAA ATTTAAATAA AACGGACGAT AAAAATTAGA CGCAAAAACT 540 TATAACTGCA CTTGAAGACA GGGGAGTACC GGAGTGCCAT TTAAAATTGG GAAAACGGAA 600 AAGTGAAATA TTGAGCTGAA TTTCCGGGCG CTGGGGAGTA GGGGGGTCAA AAGAGTCATT 660 TACCGGGTAT TTCTCGCCCG TTCGCCATCT CTAGTCGTGT AGTACCGCCG AAAAGGAATT 720 TCCCTTTCCG CCCATGCGCT GTGCGCTCCA CTCCAATACT TGAGTCCCCC ATCCCCAGAC 780 TCCGCCACCA CCACCTCCGG TTCCCCACCC CGACCAGCGG CGCCAGAGCA GAGGCAGTGA 840 GGCCGAGCTC CTCGCCTCGC CTCGCCGTCT CCGCCCGCGC GGCGCTGCCG CCGAGCCGCC 900 GCCGGCCTCC TCCTCCTCCT CCTTCCCGGT TCGGATCGGG CCCAAGGTAT ATGCCACTCG 960 TCTTCTCTCC CTCCTCCCCG CCGCTTCATG AGCCACCGGA GATTGCCTTG AGGGGATTTC 1020 TTCCCGCTCG GATCGACGGA TCCAGTCCCG TTTCTTCCGG GTTCTTGCGG TGTAGAGTCG 1080 TAGTCGTAGT GGTAGTGTTG GTAGCGGCTT GTTTTTCGAG GGAGGGATTT GGGGGGGTTT 1140 GGTTGGTTCG GGTTCTTGGG GAGGGTTTAG CTGAACCCGT GAGGTTTCTG AGGTCCCCGC 1200 CTGAACAGAT CTGTGGTGTC TCCGTGTGGG AGCATGTTTT GCTGCGTGCG TGCGTGCGTG 1260 CATGCTAGCC ATGGATTGGT GCTCACGCCG CATGCGTGAG CTTTGGGGGG GGGGGGGGTT 1320 CAGTTGTTGT TGGATTATGT GAGCGAGAAC GCATGATACG ATGCAATGCC GCGGTCCTTT 1380 TTGTTGTGAT GGGCAGCCTC ACAGCATGCG TGCTGCGGCA TTCACATGGA CGTCGACACC 1440 GTGTCGATTC TTTTTGTGTC TCTTGTTGTG TTGTGAAATT TTTCATGAAT GGTGCAAGGT 1500 GGCGGTTGGT CTTGGATGTG GATGTTGAGC TGGGGAGGAT CAGTTATCCT ACAAATTGCA 1560 TCTTAGTAGT ACATATGTTG ACATGGCATT ACTGATTCAC CCTCCTTTTT TTGCTTCTGC 1620 ATGTCATTGC CCTGTTACCC CTTAAAATAG GTTCTATTAT GGTATACCTA TCCAGTGTGC 1680 AAGAATGATA TGCCTTTGAC ATTGTTGCGT CATCTTTACT TGGTACTTTA GATGGTAAAA 1740 TGGAAGTGTG ATGGATGTAA CTGTGTCAAT ACAGCGGAGA AGATATTAAT CAATAATCAT 1800 GTACATTTGT TGTTTTTGGC ATCTTCTCAT GTAAAATCTT TTGGGTCTGT TCTTGTTATG 1860 TGCTTCACTT TCACTTTTAC TGTTTTTTTT TTAATTTTCA AGAAACATAC AGCTTCAGTG 1920 TGGTGATTGA TAAAAATCAT TACTCTAACT AATTCTGTTT TCTCCTCGAA CTGTTCTGTT 1980 CCTAGAGCCG GACTGCAGCC 2000

【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：2150 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イネ (Oryza sativa) 細胞の種類：葉 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：170...1,852 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 ACCTCCGGTT CCCCACCCCG ACCAGCGGCG CCAGAGCAGA GGCAGTGAGG CCGAGCTCCT 60 CGCCTCGCCT CGCCGTCTCC GCCCGCGCGG CGCTGCCGCC GAGCCGCCGC CGGCCTCCTC 120 CTCCTCCTCC TTCCCGGTTC GGATCGGGCC CAAGAGCCGG ACTGCAGCC ATG GCA 175 Met Ala 1 GAT CTG CAG GAG CCC CTC GTT CGT CCG AAG AGG AAG AAG GTT TTG GTG 223 Asp Leu Gln Glu Pro Leu Val Arg Pro Lys Arg Lys Lys Val Leu Val 5 10 15 GAC TAC TTG GTA AAG TTC CGA TGG ATT CTG GTG ATC TTT GTG GTG CTC 271 Asp Tyr Leu Val Lys Phe Arg Trp Ile Leu Val Ile Phe Val Val Leu 20 25 30 CCC ATT TCC GCT CTG ATC TAC TTC AAT ATC TAT TTG GGC GAT GTC TGG 319 Pro Ile Ser Ala Leu Ile Tyr Phe Asn Ile Tyr Leu Gly Asp Val Trp 35 40 45 50 TCT GCC ATG AAA TCT GAG AAA CGT CGC CAG AAG GAA CAT GAT GAC AAT 367 Ser Ala Met Lys Ser Glu Lys Arg Arg Gln Lys Glu His Asp Asp Asn 55 60 65 GTG CAA AAA GTT GTG AAG CGG CTC AAG CAG AGG AAC CCA AAG AAG GAT 415 Val Gln Lys Val Val Lys Arg Leu Lys Gln Arg Asn Pro Lys Lys Asp 70 75 80 GGC CTT GTT TGC ACA GCT AGG AAG CCC TGG ATT GCT GTT GGC ATG CGC 463 Gly Leu Val Cys Thr Ala Arg Lys Pro Trp Ile Ala Val Gly Met Arg 85 90 95 AAT GTA GAC TAC AAG CGT GCT AGG CAT TTT GAG GTT GAC CTT TCC GCC 511 Asn Val Asp Tyr Lys Arg Ala Arg His Phe Glu Val Asp Leu Ser Ala 100 105 110 TTC AGG AAC ATT CTT GAG ATT GAC AGA GAG AGA ATG GTT GCC AAG GTT 559 Phe Arg Asn Ile Leu Glu Ile Asp Arg Glu Arg Met Val Ala Lys Val 115 120 125 130 GAG CCT CTT GTC AAC ATG GGC CAG ATA ACC AGA GCT ACA TGC CCA ATG 607 Glu Pro Leu Val Asn Met Gly Gln Ile Thr Arg Ala Thr Cys Pro Met 135 140 145 AAC CTT GCC CTT GCA GTT GTT GCT GAG CTT GAT GAC CTT ACT GTT GGG 655 Asn Leu Ala Leu Ala Val Val Ala Glu Leu Asp Asp Leu Thr Val Gly 150 155 160 GGA CTG ATC AAT GGG TAT GGT ATT GAA GGG AGC TCT CAC CTC TAT GGT 703 Gly Leu Ile Asn Gly Tyr Gly Ile Glu Gly Ser Ser His Leu Tyr Gly 165 170 175 CTT TTC TCT GAC ACT GTT GTC GCC GTG GAA GTT GTT CTT GCA GAC GGT 751 Leu Phe Ser Asp Thr Val Val Ala Val Glu Val Val Leu Ala Asp Gly 180 185 190 CGA GTT GTT AGA GCC ACT AAG GAT AAT GAG TAC TCT GAC CTT TTC TAT 799 Arg Val Val Arg Ala Thr Lys Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Leu Phe Tyr 195 200 205 210 GGC ATT CCC TGG TCC CAG GGA ACA CTT GGG TTT CTT GTT TCC GCT GAG 847 Gly Ile Pro Trp Ser Gln Gly Thr Leu Gly Phe Leu Val Ser Ala Glu 215 220 225 ATC AAA CTC ATT CCC ATC AAG GAA TAC ATG AGG CTC ACA TAT ACT CCA 895 Ile Lys Leu Ile Pro Ile Lys Glu Tyr Met Arg Leu Thr Tyr Thr Pro 230 235 240 GTT AAA GGG TCA CTG AAG GAG ATA GCA CAA GGT TAT TGT GAT TCG TTT 943 Val Lys Gly Ser Leu Lys Glu Ile Ala Gln Gly Tyr Cys Asp Ser Phe 245 250 255 GCA CCA CGA GAT GGT GAT CCT GCA AAG GTC CCA GAC TTC GTT GAG GGA 991 Ala Pro Arg Asp Gly Asp Pro Ala Lys Val Pro Asp Phe Val Glu Gly 260 265 270 ATG GTG TAC ACA GAA AAT GAG GGT GTC ATG ATG ACT GGT GTT TAT GCT 1039 Met Val Tyr Thr Glu Asn Glu Gly Val Met Met Thr Gly Val Tyr Ala 275 280 285 290 TCC AAA GAA GAG GCA AAG AAG AAG GGC AAT AAG ATC AAC TGT GTC GGG 1087 Ser Lys Glu Glu Ala Lys Lys Lys Gly Asn Lys Ile Asn Cys Val Gly 295 300 305 TGG TGG TTC AAG CCT TGG TTT TAC CAA CAT GCT CAG ACA GCA CTC AAG 1135 Trp Trp Phe Lys Pro Trp Phe Tyr Gln His Ala Gln Thr Ala Leu Lys 310 315 320 AAG GGT GAG TTT GTG GAG TAC ATT CCA ACA AGA GAG TAC TAC CAC CGT 1183 Lys Gly Glu Phe Val Glu Tyr Ile Pro Thr Arg Glu Tyr Tyr His Arg 325 330 335 CAC ACC CGG TGT CTG TAC TGG GAG GGG AAG CTG ATC TTG CCA TTC GGC 1231 His Thr Arg Cys Leu Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Ile Leu Pro Phe Gly 340 345 350 GAC CAA TTC TGG TTC AGG TTC CTC TTG GGC TGG CTG ATG CCA CCA AAG 1279 Asp Gln Phe Trp Phe Arg Phe Leu Leu Gly Trp Leu Met Pro Pro Lys 355 360 365 370 GTG TCT CTG CTC AAG GCC ACA CAG GGT GAA TCT ATC AGG AAT TAC TAC 1327 Val Ser Leu Leu Lys Ala Thr Gln Gly Glu Ser Ile Arg Asn Tyr Tyr 375 380 385 CAT GAC AAC CAT GTG ATT CAA GAC ATG CTG GTT CCC TTG TAC AAA GTT 1375 His Asp Asn His Val Ile Gln Asp Met Leu Val Pro Leu Tyr Lys Val 390 395 400 GGA GAT GCT CTT GAG TTT GTT CAC AAG GAA ATG GAG GTT TAT CCA CTG 1423 Gly Asp Ala Leu Glu Phe Val His Lys Glu Met Glu Val Tyr Pro Leu 405 410 415 TGG CTG TGC CCG CAC CGG CTC TAC AAG CTC CCT GTG AAA ACC ATG GTG 1471 Trp Leu Cys Pro His Arg Leu Tyr Lys Leu Pro Val Lys Thr Met Val 420 425 430 TAC CCA GAG CCT GGC TTT GAG CAC CAC CAC AGG CAA GGT GAC ACT AGC 1519 Tyr Pro Glu Pro Gly Phe Glu His His His Arg Gln Gly Asp Thr Ser 435 440 445 450 TAT GCC CAG ATG TTC ACC GAT GTT GGT GTG TAC TAT GCT CCT GGT GCT 1567 Tyr Ala Gln Met Phe Thr Asp Val Gly Val Tyr Tyr Ala Pro Gly Ala 455 460 465 GTC CTG AGG GGC GAG GAG TTC AAT GGC GCT CTA GCT GTC CAC AGG CTG 1615 Val Leu Arg Gly Glu Glu Phe Asn Gly Ala Leu Ala Val His Arg Leu 470 475 480 GAG CAG TGG CTG ATT GAG AAC CAC AGC TAC CAG CCA CAG TAC GCT GTA 1663 Glu Gln Trp Leu Ile Glu Asn His Ser Tyr Gln Pro Gln Tyr Ala Val 485 490 495 TCT GAG CTC AAC GAG AAG GAC TTC TGG AGG ATG TTT GAT GCT TCT CAC 1711 Ser Glu Leu Asn Glu Lys Asp Phe Trp Arg Met Phe Asp Ala Ser His 500 505 510 TAC GAG CAT TGC CGC CAA AAG TAT GGT GCC GTC GGT ACC TTT ATG AGC 1759 Tyr Glu His Cys Arg Gln Lys Tyr Gly Ala Val Gly Thr Phe Met Ser 515 520 525 530 GTC TAC TAC AAG TCC AAG AAG GGA AGG AAG ACT GAG AAG GAG GTG CAG 1807 Val Tyr Tyr Lys Ser Lys Lys Gly Arg Lys Thr Glu Lys Glu Val Gln 535 540 545 GAA GCC GAG GCC GCC ATC CTC GAG CCA GCC TAC GCT GAT GAG GCG TAA 1855 Glu Ala Glu Ala Ala Ile Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Glu Ala * 550 555 560 TTTCGTTGAG ACCTTTGATG GTTTAGTCGT CCGGGTTTTC TCCCCATTCC AAATGGGATT 1915 TTTCATCTGA ACTATCCTTT TGCTTAGAAC TTGATGTGCA GTGTTTGTAG CACTTTGTAA 1975 TCCTGTCATC GTCGTCCGTC TGCTCTTGGT ACTTCTTTCA CCCTTGATCA AGTTGCTGAA 2035 CTTAGTCAGG ACTTAAGTGG TATTTAACCC AAGATCTGAA TAATTTTGTG GCTACTGGAC 2095 TAGTTAATTT CCTCAGCTAT TAATTTGAGC TGTAGCATCA GATGAGGTGA ACTTT 2150

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｘ線フィルムの感光結果を示す写真である。

【図２】OSDIMｃＤＮＡのサザンブロット法による解析
結果を示す写真である。

【図３】バイナリーベクターpSMAB−antiOSDIMの構造を
示す図である。

【図４】ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。

【図５】アラビドプシスの野生型とＴ１形質転換体との
草丈を比較した写真である。

【図６】アラビドプシスのＴ２形質転換体の正常型とＴ
２形質転換体の矮性化変異体との草丈を比較した写真で
ある。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年４月２１日

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
   質 （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若し
   くは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつ植物の形態形成に関与する
   タンパク質
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列によ
   り表され、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。 （ａ）配列番号２記載の塩基配列 （ｂ）配列番号２記載の塩基配列において、１若しくは
   複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
3. 【請求項３】 以下の工程： （ａ）請求項１記載のＤＮＡのアンチセンス鎖を植物細
   胞に導入する工程、及び （ｂ）工程（ａ）で得られる植物細胞を培養し、再分化
   個体を得る工程、を含んでなることを特徴とする矮性化
   植物の作製方法。