JPH1198986A - 雌蕊特異的に発現する遺伝子および前記遺伝子の上流域のゲノムｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、単子葉植物の雌蕊特異的に発現す
る遺伝子および該遺伝子の上流域のゲノムＤＮＡ断片を
提供することを目的とする。 【解決手段】本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基番号
６１−１１３１の塩基配列からなるＤＮＡ、または前記
塩基配列からなるＤＮＡと温和な条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、前記塩基配列からなるＤＮＡがコードする
タンパク質と同じ生物活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡを含むことを特徴とする。本発明のゲノムＤ
ＮＡ配列は、配列番号２の塩基配列若しくはその一部、
またはこれらの塩基配列において１若しくは複数の塩基
が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有すること
を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、単子葉植物由来の
雌蕊特異的に発現する遺伝子に関する。本発明はまた、
前記遺伝子の上流域のゲノムＤＮＡ断片に関する。本発
明はさらに、構造遺伝子および前記構造遺伝子に機能可
能なように結合された前記ゲノム由来のＤＮＡ断片を含
むベクターに関する。

【０００２】本発明は、さらにまた、前記ベクターによ
って形質転換された植物細胞形質転換用細菌、並びに前
記植物細胞形質転換用細菌を介して形質転換された植物
細胞若しくは植物細胞培養体に関する。

【０００３】本発明は、さらに、前記植物細胞を有する
植物またはその種子に関する。

【０００４】

【従来の技術】従来、花器で特異的に発現する遺伝子と
して、葯特異的なもの雄ずい特異的なもの等いくつか単
離例が知られている。さらにそれらの組織特異的に発現
する遺伝子のプロモーターを用いて外来遺伝子を目的の
組織で発現させることにより、植物体の生理・形態を人
為的に操作する例が報告されている。例えば、Marianie
t al. Nature 347,737-741 (1990)には、タバコ葯特異
的プロモーターに RNase(barnase)遺伝子を接続したキ
メラ遺伝子をタバコに導入し、雄性不稔植物を作出させ
たことが記載されている。さらに、特開平６−５０４９
１０には、イネ雄ずい特異的プロモーターの単離が記載
されている。

【０００５】一方、植物の雌性生殖器官で特異的に発現
する遺伝子の報告としては、例えばタバコ雌蕊特異的に
発現するプロリンリッチなタンパク質の遺伝子を開示し
た国際公開ＷＯ92／20713がある。また、Goldman et.a
l. The EMBO Journal 13,2976-2984 (1994)は、タバコ
柱頭特異的プロモーターに RNase (barnase)遺伝子を接
続したキメラ遺伝子をタバコに導入し、雌性不稔植物を
作製したことを記載している。さらに、Budelier et.a
l. Mol. Gen. Genet. 224,183-192 (1990)は、β−グル
クロニダーゼ（以下、「ＧＵＳ」という）遺伝子発現解
析により、トマト由来の雌蕊特異的プロモーターがトマ
トおよびタバコで機能することを確認したと報告してい
る。しかしながら、上記の文献はいずれも双子葉植物に
関する報告であり、単子葉植物では、Schmidt et. al.
The Plant Cell 5,729-737 (1993)が、MADS box遺伝子
の一つが雌蕊特異的に発現することをノーザンハイブリ
ダイゼーションで確認した報告があるのみである。

【０００６】植物の生殖器官の生理や形態を人為的に改
良するためには、生殖器官の各組織で特異的に発現する
遺伝子が必要不可欠である。しかしながら、前述の通り
主要穀物の大部分を占める単子葉植物由来の、雌蕊特異
的遺伝子の報告例は非常にまれであり、しかもその上流
域のゲノムＤＮＡ断片まで同定した例は未だ報告されて
いない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、単子葉植物
由来の雌蕊特異的に発現する遺伝子を提供することを目
的とする。本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基番号６
１−１１３１の塩基配列からなるＤＮＡ、または前記塩
基配列からなるＤＮＡと温和な条件下でハイブリダイズ
し、かつ、前記塩基配列からなるＤＮＡがコードするタ
ンパク質と同じ生物活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡを含み、単子葉植物由来の雌蕊特異的に発現す
ることを特徴とする。

【０００８】本発明はまた、雌蕊特異的な転写を制御す
る配列、すなわちプロモーターを提供することを目的と
する。本発明で開示する配列番号１またはその一部をプ
ローブとしてイネやその他の植物のゲノムをスクリーニ
ングすることにより、雌蕊特異的な転写を制御する配列
（プロモーター）が得られる可能性が高い。例えば、そ
のような配列として本発明の雌蕊特異的な遺伝子の上流
域のゲノムＤＮＡ断片は、配列番号２に記載の塩基配列
若しくはその一部、またはこれらの塩基配列において１
若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩
基配列を有すことを特徴とする。

【０００９】本発明は、さらに、構造遺伝子および前記
構造遺伝子に機能可能なように結合された前記ＤＮＡ断
片またはその一部を含むベクターを提供することを目的
とする。

【００１０】本発明はさらにまた、前記ベクターによっ
て形質転換された植物細胞形質転換用細菌を提供するこ
とを目的とする。

【００１１】本発明はまた、前記植物細胞形質転換用細
菌によって形質転換された植物細胞または植物細胞培養
体を提供することを目的とする。

【００１２】本発明はさらに、前記形質転換された植物
細胞を有する植物またはその種子を提供することを目的
とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
解決のため鋭意研究に努めた結果、単子葉植物のイネの
オリザサティバ（Oryza sativa）の雌蕊特異的に発現す
る遺伝子、および前記遺伝子の上流域のゲノムＤＮＡ断
片を見いだした。

【００１４】より詳しくは、本発明者らは、まずイネ
（Oryza sativa）の雌蕊及び葉由来のｍＲＮＡよりｃＤ
ＮＡを合成した後、ＲＡＰＤプライマーを用いたＰＣＲ
反応を行い、無作為に増幅されたＰＣＲ産物のバンドパ
ターンを比較することにより、雌蕊特異的なｍＲＮＡに
由来するｃＤＮＡクローンを取得した。続いて、ノーザ
ンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲにより上記ｃ
ＤＮＡクローンの発現量を各組織間で比較した。さら
に、イネ（Oryza sativa）の葉から遺伝子ライブラリー
を作成し、上記ｃＤＮＡの配列に対応する約１.６ｋｂ
の長さの遺伝子クローンを単離し、その全塩基配列を決
定した。得られた雌蕊特異的な遺伝子は、ＲＰＣ３１２
遺伝子と命名された。さらに、本発明者らはＲＰＣ３１
２の完全長ｃＤＮＡ断片を取得し、プライマーエクステ
ンションによりｍＲＮＡの転写開始点を決定した。

【００１５】本発明者らはまた、ＲＰＣ３１２遺伝子の
５'上流領域を含む、ＲＰＣ３１２遺伝子の由来するゲ
ノムＤＮＡ断片を同定した。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１７】単子葉植物由来の雌蕊特異的に発現する遺
伝子 本発明の単子葉植物由来の雌蕊特異的に発現する遺伝子
は、配列番号１の塩基番号６１−１１３１の塩基配列か
らなるＤＮＡ、または前記塩基配列からなるＤＮＡと温
和な条件下でハイブリダイズし、かつ前記塩基配列から
なるＤＮＡがコードするタンパク質と同じ生物活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを含み、単子葉植物
由来の雌蕊特異的に発現することを特徴とする。

【００１８】本発明において見いだされたＲＰＣ３１２
遺伝子は、イネ（Oryza sativa）に由来する新規な遺伝
子である。ノーザンハイブリダイゼーション及び逆転写
ＰＣＲの結果から、当該遺伝子はイネの出穂前１〜２週
間の雌蕊で主に発現している。雌蕊以外の組織での発現
量は極めて低く、雌蕊以外で最も発現量の高い未熟種
子、発芽種子においても成熟雌蕊の１００分の１程度で
あった（図１、図２、表１）。

【００１９】本発明によって明らかにされたＲＰＣ３１
２遺伝子のｃＤＮＡ配列を後述の配列表の配列番号１に
示す。配列番号１に示されるようにＲＰＣ３１２遺伝子
は転写されて約１.６ｋｂのｍＲＮＡとなる。配列番号
１から、塩基番号６１−６３のＡＴＧは翻訳開始コドン
であり、塩基番号１１３２−１１３４のＴＡＧは終始コ
ドンであると推定され、ＲＰＣ３１２遺伝子は３５７ア
ミノ酸残基のタンパク質をコードすると予想される。Ｒ
ＰＣ３１２遺伝子の構造遺伝子部分に有意な相同性を示
す遺伝子はこれまでのところなく、全く新規な遺伝子で
ある。

【００２０】また、ＲＰＣ３１２遺伝子のｃＤＮＡの部
分断片をプローブとして得られたゲノム由来のＤＮＡ断
片の塩基配列を、配列表の塩基番号２に示す。配列番号
２の塩基番号１９７２−塩基番号１９７７はＴＡＴＡボ
ックス、塩基番号２０８５−２０９２は転写開始部位
（後述する実施例２のプライマー伸長法によって決
定）、塩基番号２１５０−２１５２はＲＰＣ遺伝子の翻
訳のＡＴＧ開始コドン、塩基番号２３７６−４５１４は
イントロンに相当すると推定される。配列番号２の塩基
番号２１５０−２３７５は、配列番号１の塩基番号６１
−２８６に相当する。

【００２１】ＲＰＣ３１２遺伝子のｃＤＮＡクローン
と、ゲノム由来のＤＮＡ断片の塩基配列を比較したとこ
ろ、ＲＰＣ３１２遺伝子はいくつかのイントロンにより
分断されることが判明した（図４）。そのうちのひとつ
は約２ｋｂであり、配列番号２の塩基番号２３７６−４
５１４に相当する。これはイネでは比較的長いイントロ
ンである。

【００２２】配列表の配列番号１で表される塩基配列を
有するＤＮＡ断片は、例えば、イネ(oryza sativa)の雌
蕊よりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ディファレンシ
ャルスクリーニングを行い、雌蕊で特異的に発現するｃ
ＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することにより得られ
る。あるいは、配列表の配列番号１で表される塩基配列
を有するＤＮＡ断片の全体または一部をプローブとし
て、イネの雌蕊ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを
プラークハイブリダイゼーション等の周知技術によって
スクリーニングすることにより得ることができる。ま
た、本明細書に開示された塩基配列に基づいて適当なプ
ライマーを合成し、イネの雌蕊ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲ等の増幅反応を行うことにより所期
のＤＮＡ断片を得ることもできる。

【００２３】また、同様に配列番号１または２に記載の
塩基配列に基づいて、イネのゲノムライブラリーから配
列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得るこ
とができる。ゲノムライブラリーは好ましくは、イネ(o
ryza sativa)の緑葉を用いて構築する。ｃＤＮＡライブ
ラリーおよびゲノムライブラリーの構築、ｃＤＮＡクロ
ーンおよびゲノム由来のＤＮＡ断片の単離についてはこ
れに限定されるものではないが、後述する実施例に詳し
く記載されている。

【００２４】さらに、配列番号１の塩基番号６１−１１
３１の少なくとも一部分と温和な条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡであって、且つ前記ＤＮＡによってコード
されるタンパク質の機能がＲＰＣ３１２遺伝子のコード
するタンパク質の機能を維持している場合、このような
ＤＮＡを含む遺伝子も当然に本発明の範囲内に含まれ
る。この場合、温和なハイブリダイゼーションの条件と
は、同定されるＤＮＡの塩基配列と配列番号１で表され
る塩基配列とが、５０％以上、好ましくは８０％以上の
相同性を有していれば分子雑種を形成しうる任意のハイ
ブリダイゼーション及び洗浄条件が考えられる。このよ
うな条件としては、限定されるわけではないが、例えば
２ＸＳＳＣ、５０℃でのハイブリダイゼーション、２Ｘ
ＳＳＣでの洗浄である。

【００２５】さらに、配列のうち１または複数のヌクレ
オチドが欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ断
片も本発明の範囲に含まれる。

【００２６】一般に、タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列が小さく変更された場合、すなわち、該塩基配
列の中の１又は複数のヌクレオチドが置換され若しくは
欠失し又は１又は複数のヌクレオチドが付加若しくは挿
入された場合でも、該ＤＮＡのコードするタンパク質の
機能が維持される場合があることは周知の事実である。
従って、上記した本発明のＲＰＣ３１２遺伝子配列にこ
のような修飾が加えられ、かつ、該ＤＮＡのコードする
タンパク質の機能が維持される場合、このような遺伝子
も本発明の範囲内に含まれる。すなわち、配列表の配列
番号１の第６１番目−第１１３１番目の塩基から成る配
列に加え、これらの配列のうち少数のヌクレオチドが欠
失し、置換し又はこれらの配列に少数のヌクレオチドが
挿入若しくは付加された、雌蕊特異的なタンパク質をコ
ードする遺伝子のＤＮＡ配列も本発明の範囲に含まれ
る。

【００２７】ヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換
は、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例え
ばNucl.Acids Res.10:6487-6500,1982) により実施する
ことができ、本明細書において「１又は複数のヌクレオ
チド」とは、部位特異的変異誘発法により付加、挿入、
欠失又は置換できる程度の数のヌクレオチドを意味す
る。

【００２８】部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変
異である特定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖フ
ァージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて次のように行うことができる。すなわち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮ
Ａでファージ担持性宿主細菌を形質転換する。形質転換
された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含
有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうする
と、理論的には、５０％の新コロニーが単鎖として変異
を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を
有する。得られたプラークを、上記所望の変異を有する
ＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリッド形成する
が、もとの鎖を有する不一致のものとはハイブリッド形
成しない温度において、キナーゼ処理された合成プロー
ブとハイブリッド形成せしめる。次に該プローブとハイ
ブリッド形成するプラークを拾い、培養し、ＤＮＡを回
収する。

【００２９】なお、ヌクレオチドの置換、欠失、付加又
は挿入は、上記の部位特異的変異誘発の他にも、例えば
遺伝子を変異原で処理する方法及び遺伝子を選択的に切
断し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、又は
置換し、次いで連結する方法によっても行うことができ
る。

【００３０】さらにＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導
入(Mikaelian et al. Nucl. AcidsRes.20:376,1992) に
よる特定ヌクレオチドの置換、欠失、付加又は挿入や、
TaqＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ複製の不正確さを利用
したランダムなヌクレオチドの置換(Zhouet al. Nucl.A
cids Res.19:6052,1991)も考えられる。

【００３１】雌蕊特異的遺伝子の上流域のゲノムＤＮＡ
断片 本発明は、さらに、雌蕊特異的遺伝子の由来するゲノム
ＤＮＡ断片も提供する。

【００３２】本発明の配列番号２に記載されている配列
は、他の公知のＤＮＡ配列と相同性はないことから、新
規なＤＮＡ配列である。この配列を製造するには、例え
ば、後記実施例２の方法にしたがって、天然の単子葉植
物から単離することが可能である。

【００３３】この配列表の配列番号２で表される塩基配
列には、以下の特徴がある。

【００３４】１．後述する実施例２のプライマー伸長法
によれば、塩基番号２０８５−２０９２に転写開始部位
が存在する。

【００３５】２．転写開始点の 118 bp 上流（塩基番号
１９７２−塩基番号１９７７）にはＴＡＴＡボックス
（Corden et.al. Science 209, 1406-1414,1980）様配
列（5'-TATATA-3'）が存在する。

【００３６】３．塩基番号２１５０−２１５２はＲＰＣ
３１２遺伝子の翻訳のＡＴＧ開始コドンが存在する。

【００３７】本発明においては、この配列番号２の塩基
配列をＲＰＣ３１２遺伝子の由来するゲノムＤＮＡ配列
として特定したものであるが、この配列に転写制御活性
を有する配列またはその一部が含まれる可能性が高い。

【００３８】例えば、上述したように、第２０８５番目
に転写開始点が存在することから、第１番目から第２０
８４番目までの領域が転写制御を司る配列を有すること
が予想される。また、転写開始部位よりも下流、さらに
は、翻訳開始部位よりも下流のイントロンの部分も雌蕊
特異的転写制御に寄与する可能性がある。

【００３９】さらに本発明は、これらの配列のうち１ま
たは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付
加されたＤＮＡ断片もその範囲に含むものである。

【００４０】一般に、生理活性を有するＤＮＡの塩基配
列が小さく変更された場合、すなわち、該塩基配列の中
の１又は複数のヌクレオチドが置換され若しくは欠失し
又は１又は複数のヌクレオチドが付加若しくは挿入され
た場合でも、該ＤＮＡの生理活性が維持される場合があ
ることは周知の事実である。従って、上記した本発明の
配列番号２の配列にこのような修飾が加えられたＤＮＡ
配列も、本発明の範囲内に含まれる。すなわち、配列表
の配列番号２で表される塩基配列の一部、例えば転写開
始点より上流数百bpから成る配列に加え、これらの配列
のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれら
の配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された
ＤＮＡ配列も本発明の範囲に含まれる。

【００４１】ヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換
は、例えば、ＲＰＣ３１２遺伝子について上述したよう
な部位特異的変異誘発等の周知技術により実施すること
ができる。

【００４２】配列表の配列番号２で表される塩基配列、
特にその第１番目から第２０８５番目の塩基から成る配
列は、前記のとおり本発明者らによって単離された新規
ＤＮＡ断片である。遺伝子工学の技術分野に精通した技
術者にとって、本発明の開示に基づいて、配列番号２の
塩基配列の少なくとも一部分をプローブとして用い、種
々の単子葉植物のゲノムライブラリーから、本発明と同
様のＤＮＡ断片を単離することは、容易である。この場
合、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、ＲＰＣ３
１２遺伝子について上述したものと同様である。よっ
て、配列番号２の塩基配列の少なくとも一部分とハイブ
リダイズするＤＮＡ断片は、本発明の範囲内である。

【００４３】得られたゲノムＤＮＡ配列が雌蕊特異的で
あるか否かの判断は、例えばこのＤＮＡ配列にβーglucu
ronidase（ＧＵＳ）遺伝子を接続したベクターを構築
し、イネへ導入し、発現部位を確認することにより行な
うことができる。

【００４４】本発明の雌蕊特異的遺伝子およびそれの上
流域のゲノムＤＮＡ配列は、従来特に単子葉植物におい
て不可能であった雌蕊を遺伝子工学的に操作・改良する
ことを可能にするための新規な雌蕊特異的プロモーター
配列を単離する目的に用いることができる。

【００４５】また、本発明のゲノムＤＮＡ配列即ち配列
番号２の一部に、雌蕊特異的な転写制御配列が存在する
場合、例えば下記の用途に用いることができる。

【００４６】（１）本発明のゲノムＤＮＡ配列またはそ
の一部に不稔化を引き起こす構造遺伝子を連結すること
による雌性不稔植物の作出。

【００４７】（２）本発明のゲノムＤＮＡ配列またはそ
の一部に植物細胞の伸長または分裂を促進する構造遺伝
子を連結することによる、雌蕊の部位特異的増大、伸
長。

【００４８】（３）本発明のゲノムＤＮＡ配列またはそ
の一部に受精を促進するような構造遺伝子や乾燥などの
ストレスに抵抗性を付与するような構造遺伝子を連結す
ることによる、雌性生殖器の受精能力の促進。

【００４９】本発明はさらに、構造遺伝子および前記構
造遺伝子に機能可能なように結合された前記ゲノムＤＮ
Ａ断片を含むベクターに関する。「機能可能なように結
合された」とは、ゲノムＤＮＡ断片が、所期の構造遺伝
子の転写を制御可能な状態で前記構造遺伝子に結合され
ていることを意味する。本発明に利用可能なベクター
は、植物細胞形質転換用細菌を形質転換できるものであ
れば、限定されずいかなるものも利用可能である。好ま
しいベクターは、例えば、ｐＵＣプラスミドベクター、
ｐＢＲプラスミドベクター、Ｔｉプラスミドベクター、
Ｒｉプラスミドベクター等に由来するものである。

【００５０】本発明は、さらに、前記ベクターによって
形質転換された植物細胞形質転換用細菌、並びに前記植
物細胞形質転換用細菌を介して形質転換された植物細胞
若しくは植物細胞培養体を提供する。植物細胞形質転換
用細菌は、植物細胞形質転換に利用できるものであれば
どのようなものであってもよい。例えば、Agrobacteriu
m tumefaciens が好ましい。また、植物細胞若しくは植
物細胞培養体は、前記植物細胞形質転換用細菌を介して
例えば、Hiei et al.(Plant J.,6 271-282,1994)に記載
されたような公知の方法に従って形質転換することがで
きる。植物細胞若しくは植物細胞培養体は好ましくは単
子葉植物、より好ましくはイネに由来する。

【００５１】本発明は、さらに、前記植物細胞を有する
植物またはその種子を提供する。本発明の植物は好まし
くは単子葉植物、より好ましくはイネである。

【００５２】以下、実施例によって本発明を説明する
が、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのもの
ではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本
発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明
の技術的範囲に含まれる。

【００５３】

【実施例】実施例１ 雌蕊特異的ｃＤＮＡ断片の単離 水稲品種「ＩＲ２４」を温室で栽培し、以下の実験に供
試した。

【００５４】（１）ＲＮＡの抽出 「IR24」の未熟雌蕊、成熟雌蕊、葯、鱗被、内外穎、
葉、根、未熟種子、発芽種子、カルス、を採取後、直ち
に液体窒素中で凍結し−80℃で保存した。また成熟雌蕊
に関しては一部を柱頭部と子房部に分割した。

【００５５】葉、根は播種後１か月の温室育成の株よ
り、未熟雌蕊は出穂の１〜２週間前、成熟雌蕊、葯、鱗
被、内外穎は開花直前〜数日前、未熟種子は開花後１〜
２週間の株より採取した。また、発芽種子は、N6培地
（Chu et al. Scientia Sinica,18,659-668,1975）上で
それぞれ播種後１〜３週間無菌的に育成した植物体のも
のを用いた。カルスは、2,4-D を 2 mg/l 添加したN6固
形培地上で種子より誘導し、同じ組成の液体培地中で３
週間振盪培養したものを用いた。

【００５６】これらの組織よりSDS-phenol法（ Watanab
e andPrice, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79,6304-6308,1
982）により全ＲＮＡを抽出した。ただし、抽出緩衝液
へ酸化防止剤βメルカプトエタノールを最終濃度 10%
(V/V)になるように添加した。また、逆転写PCR実験に供
試する組織については微量のＤＮＡの混入を極力抑える
ために、塩化リチウム沈澱の代わりにRNaseインヒビタ
ー（ＲＮＡguard Pharmacia社）存在下での DNaseI（F
PLCpure Pharmacia社）処理を行った。

【００５７】未熟雌蕊、成熟雌蕊および葉の全ＲＮＡか
らｍＲＮＡ purification kit（Pharmacia 社）を用い
て添付説明書に従って polyA＋ＲＮＡを抽出・精製し
た。

【００５８】（２）ＲＡＰＤプライマーを用いたディフ
ァレンシャルスクリーニング 基本的には Yoshida et al.（Plant Cell Physiol.35
(7),15-24,1994）の方法に従った。

【００５９】一本鎖ｃＤＮＡ合成を以下の通りに作成し
た。成熟雌蕊及び葉の poly A＋ＲＮＡ 100 ngを、それ
ぞれ、ランダムヘキサマー（30μg/μl 終濃度）を含む
11μl の反応液中で、70℃、10分間、インキュベートし
た後氷冷した。次に、0.5mM dNTP、10mM DTT、2U RNase
インヒビター（ＲＮＡguard Pharmacia社）、200USuper
script逆転写酵素（BRL社）、1×Superscript Buffer
（BRL社）となるようにそれぞれの試薬を加え、最終反
応液量を50μl とした。反応は 37 ℃で一時間行った。
その後、95℃、5 分間の熱処理により酵素を失活させた
後、エタノール沈殿を行い、最後に40μl のH2O に溶解
しPCR 反応の鋳型とした。一本鎖ｃＤＮＡの最終濃度は
2.5μg/μl と見なした。

【００６０】これらの一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い
て PCR反応を行った。反応液組成は、50ng/μl 鋳型ｃ
ＤＮＡ、0.2p mole/μl RAPDプライマー（OPERON社）、
0.2mMdNTP、1×PCR 緩衝液（宝酒造）、0.075U Taqポリ
メラーゼ（rTaq宝酒造）とし、反応液量は50μl で反応
した。PCR 反応は、PCR 装置 Astek PC700を用い、次の
サイクルに従った。94℃、5 分の解離反応の後、94℃-1
分、35℃-2分、72℃-2分のPCR サイクルを 35 サイクル
行い、最後に72℃、5分の伸長反応を行った。PCR 産物
はアガロースゲル電気泳動により、雌蕊由来のバンドパ
ターンと葉由来のバンドパターンを比較した。検出され
た雌蕊に固有なＤＮＡ断片は、プラスミド pCRII（Invi
trogen社）にクローニングして、以後の解析に供した。

【００６１】500 種類のオペロン社製プライマーを用い
て、スクリーニングを行った結果、雌蕊に固有なバンド
を64種類検出した。本出願の請求の範囲に含まれるｃＤ
ＮＡ断片、PC12はプライマーOPC12（5'-TGTCATCCCC-
3'）を用いて取得され、その断片長は約 0.7kbであっ
た。

【００６２】（３)ｃＤＮＡクローンの発現器官特異性
の解析 1. ノーザンハイブリダイゼーション分析 上記（２）で選抜されたｃＤＮＡクローンについて各器
官での発現パターン及びその発現量を見るためにノーザ
ンハイブリダイゼーションを行った。フィルターの作製
は以下のように行った。まず上述（1）の各器官の全Ｒ
ＮＡ 20μgを、Sambrookら（Molecular Cloning,1982)
の方法に従い、脱イオンした GlyoxalとDMSOを用いて二
次構造を融解させた後、1％アガロースゲル中で分画し
た。次いで、常法のキャピラリートランスファーにより
ＲＮＡをナイロンメンブレン GeneScreen Plus（DU PO
NT社）にブロッティングした。バキュームドライオーブ
ンで80℃、１時間乾燥させた後、フィルターを 20 mM T
ris-Cl（pH8.0）中で5分間煮沸し Glyoxalを除去した。
プローブは、上記ｃＤＮＡ断片のEcoRI 0.8kb 断片をマ
ルチプライムラベリングシステム(Amersham社製）でRI
ラベルしたものを用いた。プレハイブリダイゼーション
およびハイブリダイゼーションはメンブレン添付の説明
書に従い行った。2×SSC、1% SDSで５分、0.2×SSC、1%
SDSで５分、室温で洗浄後、0.16×SSC、1% SDS、65℃
で15分の処理を2回行い、さらに、2×SSC、室温で1分間
洗浄した。

【００６３】PC12のハイブリダイゼーションパターンを
図１に示す。このクローンに対応する遺伝子（「RPC31
2」と命名した）は、雌蕊で強く発現し、発芽種子で低
レベルの発現をしていることが認められた。また、転写
物のサイズは約 1.6kbと推定された。

【００６４】2. 逆転写 PCR分析 ノーザンハイブリダイゼーションで組織特異性が示唆さ
れた遺伝子RPC312の発現特異性をより高い感度で解析す
るために、イネ各器官のＲＮＡを鋳型とした逆転写PCR
を行った。

【００６５】まず、プラスミド pCRIIに挿入されたｃＤ
ＮＡ断片の部分塩基配列の決定を行った。DyeDeoxy ter
minating cycle sequencing kit （ABI）添付の説明書
に従い、M13 M4およびM13RVプライマー（宝酒造(株)）
を用いてサイクルシークエンシング反応を行った後、6
％アクリルアミドゲルで電気泳動を行い、蛍光シークエ
ンサー 373A（ABI 社）により塩基配列を決定した。

【００６６】クローン両側の約300ヌクレオチド分のＤ
ＮＡ塩基配列を基にして、下記の 4種類のプライマーを
ＤＮＡ合成機（ABI社製）により合成した。

【００６７】 312F-Fw 5'-CCAGAAGATGTAGTTGTTCC-3' 312F-Rv 5'-GTCCATGGTGAACACGCTCAACG-3' 312R-Fw 5'-TACCCTAAGTACTTCATCCG-3' 312R-Rv 5'-CCATGAACATCCAGCAGCTC-3' 合成ＤＮＡは、OPCカートリッジ(ABI社製)により精製
し、逆転写PCR実験に供試した。312F-Fw と312F-Rv の
プライマーペアでは 213 bp の産物が、312R-Fwと312R-
Rv のプライマーペアでは 232 bp の産物が期待され
る。

【００６８】また、イネアクチン1遺伝子(Rac1, McElr
oy et al. Plant Mol.Biol.14,163-171, 1990）の配列
を基に合成したプライマー 5'-GTATCCATGAGACTACATACAACT-3' 5'-TACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3' を対照として用いた。このプライマーはイントロンを挟
んだ形で設計してあるので、鋳型ＤＮＡにゲノムＤＮＡ
が混入している場合、ｃＤＮＡ由来の 267 bp の産物の
他にゲノムＤＮＡ由来の 350 bp の産物が増幅されるこ
ととなる。

【００６９】上述の各器官の全ＲＮＡ各 10μg を、 50
0 ng のオリゴ dT15 （Amersham社）と混合し、55μlの
反応液中で 70℃、10分間処理し二次構造を解離させ、
氷上で急冷した後、1×1st strand buffer（BRL 社）、
0.5 mM dNTP mix、、10 mM DTT、2 units/μl RNase イ
ンヒビター（ＲＮＡguard Pharmacia社）、10 units/μ
l 逆転写酵素Superscript（BRL社）となるようにそれぞ
れの試薬を加えた。反応は 100μlの系で、37℃、1 時
間行った。続いて95℃で5分間処理しＲＮＡ-ｃＤＮＡハ
イブリッドを解離させた後、氷上で冷却した。この溶液
のｃＤＮＡの濃度を100ng /μl と見なした。合成され
た各組織のｃＤＮＡを希釈し、100 ng /μl、10 ng /μ
l、1 ng /μl、0.1ng /μl の4種類の希釈系列を作成
し、PCR 反応の鋳型とした。

【００７０】これらのｃＤＮＡを鋳型として用いて PCR
反応を行った。ｃＤＮＡ希釈系列 1μl に対し、最終濃
度で0.5p mole/μl プライマー、0.2mM dNTP、1×PCR
緩衝液、0.05U タックポリメラーゼ（rTaq宝酒造）とな
るようにそれぞれの試薬を加え、最終液量は20μl で反
応した。PCR 反応は、PCR 装置 Perkin Elmer 9600を用
い、次のサイクルに従った。94℃、3 分の解離反応の
後、94℃,0.5分、60℃,1分、72℃,1分のPCR サイクルを
30サイクル行い、最後に72℃、5分の伸長反応を行っ
た。PCR 産物はアガロースゲルで電気泳動後、エチジウ
ムブロマイドで染色し、写真撮影した。各バンドの濃度
を比較し、同じ濃さの任意の２つのサンプルには、本遺
伝子に由来するｃＤＮＡが等量含まれていると評価し
た。

【００７１】まず対照実験としてイネにおいて全ての器
官で構成的に発現していると考えられる Rac1遺伝子の
プライマーを用いて、各器官由来のｃＤＮＡを鋳型にし
て PCRを行った。その結果、調査した全ての器官で、ｃ
ＤＮＡ由来の 267 bp の産物が検出され、ゲノムＤＮＡ
由来の 350 bp の産物は検出されなかった。従って、ｃ
ＤＮＡサンプル中にはゲノムＤＮＡの混入はほとんどな
いと考えられた。

【００７２】次に、RAPDクローン RPC312 に固有なプラ
イマーペア（312F-Fwと312F-Rv、312R-Fwと312R-Rv）を
用いて逆転写PCR実験を行った。両プライマーペアは、
予めプラスミドクローンを使って期待される分子量の産
物が増幅されることを確認しておいた。各器官を用いた
逆転写PCR実験の結果、図 2A に示すように、1ngのｃＤ
ＮＡを PCRの鋳型にした場合に、期待される 232 bpの
産物が検出されたのは、未熟雌蕊、成熟雌蕊、未熟種
子、成熟種子であり、ノーザンハイブリダイゼーション
と類似した結果であった。未熟雌蕊では、鋳型ｃＤＮＡ
量が最小の0.1 ngの場合でも産物が検出されたのに対し
て、葯、内外穎では最低で10 ng、葉では最低で100 ng
のｃＤＮＡ量がバンドの検出に必要であった。また、雌
蕊に着目した場合、子房では柱頭に比べ高い発現が認め
られた。

【００７３】未熟種子、発芽種子における発現量は未熟
雌蕊を1とした場合、1×1０^-2程度と算出され、雌蕊以
外での発現は非常に低レベルであることが示された。以
上の逆転写PCR による定量結果を表１にまとめた。

【００７４】

【表１】

【００７５】（４）ｃＤＮＡクローンの単離 RPC312遺伝子をコードする完全長ｃＤＮＡを単離するた
め、以下の実験を行った。

【００７６】1. ｃＤＮＡライブラリーの作成 成熟雌蕊より単離精製した1μgの poly A＋ＲＮＡを鋳
型とし、ZAP-ｃＤＮＡ合成キット（STRATAGENE社製）を
用いてｃＤＮＡ合成を行った。32P の取り込み率による
定量の結果、oligo-dTプライミングにより逆転写された
第一鎖ｃＤＮＡは約55ng、そこから直接合成された第二
鎖ｃＤＮＡは約72 ngであった。キット添付の説明書に
従ってｃＤＮＡに EcoRIアダプターをつなぎ、XhoIで消
化した後、ベクターUni-ZAPXRへ連結した。その後ファ
ージＤＮＡをGiga-pack Gold packaging extract（STRA
TAGENE社）を用いてファージ粒子へパッケージングし
た。次いで大腸菌PLK-F'を宿主細胞としてプレートへ展
開し、ライブラリーサイズを調べたところ、3×10⁶pfu
の雌蕊ｃＤＮＡライブラリーであると算出された。

【００７７】2. ｃＤＮＡクローンのスクリーニング イネ雌蕊特異的RAPDクローン（PC12）EcoRI 0.7kb断片
をプローブとして、上記イネｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。プローブは、レディプライムラベリ
ングシステム（Amersham社）で 32Pラベルし、 Quick S
pinカラム Sephadex G-50（BOEHRINGER MANNHEIM社）を
用いて精製したものを用いた。

【００７８】約10,000pfuのファージを感染用の大腸菌P
LK-F'と混合し、14×10cm角型シャーレへ展開し、39℃
で一晩培養した後、ナイロンメンブレンHybondN＋（Ame
rsham社）をプラーク表面と接触させ、メンブレン添付
の説明書に従ってメンブレンを処理した。次に、メンブ
レンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（0.5M Na₂HP
O₄ pH7.2、7% SDS、1mM EDTA）中で65℃、10分間処理
し、プローブ（0.1×10⁶cpm/ml終濃度）を加え、65℃で
一晩（16-24時間）ハイブリダイゼーションを行った。
フィルターの洗浄は、洗浄溶液 1（40mM Na₂HPO₄ pH7.
2、5%SDS、1mM EDTA）、及び、洗浄溶液 2（40 mM Na₂H
PO₄ pH7.2、1%SDS、1mM EDTA）を用いて、それぞれ、65
℃、15分の洗浄を2回行った。

【００７９】約100,000個のプラークをスクリーニング
した結果、1個の陽性クローン（pc312-1-1）を取得し
た。このクローンについて、λZAP ｃＤＮＡ合成キット
の説明書に従って in vivo excision を行い、ファージ
ゲノムよりプラスミド（pBluescriptSK(-)）を調製し
た。このクローンを、制限酵素 EcoRI及び XhoI（宝酒
造(株)）で消化することにより、ｃＤＮＡインサートを
単離しサイズを同定したところ、約 0.7 kbpであった。

【００８０】（５）塩基配列の決定 PC12及び pc312-1-1の全塩基配列を、（３）2の方法に
従い決定した。PC12の全長は 677 bpであった。pc312-1
-1 は全長 670bpのポリA配列を含む3'側部分長ｃＤＮＡ
配列であった。両クローンは、506 bpに渡りオーバーラ
ップし、その領域での相同性は99％以上であった（図
4）。従って、pc312-1-1 は、RPC312の部分長ｃＤＮＡ
であると結論づけた。

【００８１】実施例２ ＲＰＣ３１２の上流域のゲノム
ＤＮＡ断片の単離 （１）ゲノムクローンの単離 1. ゲノムライブラリーの作製 ゲノムＤＮＡを播種後約2ヶ月のイネ（IR24）の葉からS
DS−フェノール法と塩化リチウム沈殿法で単離精製した
後、まず予備試験として制限酵素 MboI（宝酒造）で部
分分解し、見かけ上16〜23kbのサイズの断片を多く含む
酵素反応条件を決定した。続いてこの決定した反応条件
で遺伝子ＤＮＡを消化した後、ショ糖密度勾配遠心を行
った。ショ糖は緩衝液（20mM Tris-HCl pH8.0,1mM EDT
A, 200mMNaCl）へ溶解し、濃度を5段階（10、17.5、25、3
2.5、40％）作成した。このショ糖溶液を遠心管（40PA、
日立）へ下からこの順で重層し、最後に部分分解ＤＮＡ
溶液を重層した。SRP28SA（日立）ローターを用いて20,
000rpm、17時間、20℃で遠心後、ペリスタポンプを用い
て0.5mlずつ80画分に分け、16〜23kbのＤＮＡを最も多
く含む画分を調製した。このＤＮＡ画分をベクターLAMB
DA DASHII/ BamHI（STRATAGENE社）にT4ＤＮＡリガーゼ
（BOEHRINGER MANNHEIM 社）を用いてライゲーション
し、GigapackII Gold packaging extract（STRATAGENE
社）でファージ粒子へパッケージングした。以上の手順
でイネゲノムライブラリーを作成した。ライブラリーサ
イズは約5.0×10⁶ pfuと算出された。

【００８２】2. クローンの選抜 実施例１で得られたイネ雌蕊特異的RAPDクローン（PC1
2）EcoRI 0.7kb断片をプローブとして、上記イネゲノム
ライブラリーをスクリーニングした。プローブは、レデ
ィプライムラベリングシステム(Amersham社）で ³²Pラ
ベルしQuick Spinカラム Sephadex G-50（BOEHRINGER M
ANNHEIM社）を用いて精製したものを用いた。

【００８３】約10,000pfuのファージを感染用の大腸菌S
RBP2と混合し、14×10cm角型シャーレに展開し、39℃で
一晩培養した。ナイロンメンブレンHybondN＋（Amersha
m社）をプラーク表面と接触させ、メンブレン添付の説
明書に従ってメンブレンを処理した。メンブレンを、プ
レハイブリダイゼーション緩衝液（0.5M Na₂HPO₄ pH7.
2、7% SDS、1mM EDTA）中で、65℃、10分間処理し、プ
ローブ（0.1×10⁶cpm/ml終濃度）を加え、65℃で一晩
（16-24時間）ハイブリダイゼーションを行った。フィ
ルターの洗浄は、洗浄溶液 1（40mM Na₂HPO₄ pH7.2、5%
SDS、1mM EDTA）及び洗浄溶液 2（40mM Na₂HPO₄ pH7.
2、1%SDS、1mM EDTA）により、それぞれ、65℃で15分の
処理を2回行った。

【００８４】約100,000万個のプラークをスクリーニン
グした結果、4個の陽性クローンを取得し、そのうち 2
個のクローン（λG312-2,λG312-12）に対し以後の解析
を行った。

【００８５】まず、両クローンのファージＤＮＡを鋳型
とし、PC12に固有なプライマー312RFw、312RRvを用い
て、実施例 1（３） 1の条件に従い、PCRを行った結
果、両クローンで期待される約 230 bp の産物が増幅さ
れることを確認した。

【００８６】次に、ファージＤＮＡ及びイネ全ゲノムＤ
ＮＡ（IR24及び月の光）について、PC12の部分断片をプ
ローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行
った。プローブは、PC12のSalI切断部位より上流（5'
側）の 150bp断片を用いた。ファージＤＮＡ 1μg 、イ
ネゲノムＤＮＡ 10μg を、制限酵素 HindIII、SalI、P
maCI で完全消化して、1％アガロースゲルで電気泳動し
た後、Hybond N＋（Amersham社）メンブレンに転写し
て、ハイブリダイゼーションに供した。プレハイブリダ
イゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄の条件は
プラークハイブリダイゼーションの方法と同様である。
シグナルの検出はイメージングアナライザー（富士フィ
ルム社）を使用した。結果を図３に示す。全ゲノムＤＮ
Ａに着目すると、いずれの酵素を用いた場合にも検出さ
れたバンドは 1本であり、PC12に相同性を有する配列は
ゲノム上で 1コピーであることが確認された。また、独
立した２種類のゲノムクローンで、いずれの酵素におい
ても同じサイズの主バンドが検出された。さらに、２種
類のゲノムクローンを SalI 消化した場合に検出される
バンドは、 IR24 ゲノムＤＮＡ由来のバンドと同じサイ
ズであった。

【００８７】以上、PCR 、ゲノミックサザンの結果か
ら、λG312-2とλG312-12 は、RPC312遺伝子を含むクロ
ーンであると考えた。なお、サザンハイブリダイゼーシ
ョンにおいて、Hind IIIとPmaCI を用いた場合に、両ク
ローン由来のバンドとゲノムＤＮＡ由来のバンドサイズ
が異なっていた。これは、HindIII 消化時には、両クロ
ーンにおいて植物由来の挿入断片とベクターのアームが
結合したＤＮＡ断片を検出しており、また、ゲノムＤＮ
Ａ中のPmaCI 認識配列がメチル化されていることに起因
すると考えられる。

【００８８】（２）RPC312遺伝子の上流域を含むゲノム
ＤＮＡ断片のサブクローニング （１）で、PC12のSalI切断部位より上流（5'側）の 150
bp断片をプローブとしてゲノミックサザンを行うと、Sa
lI消化時に約 3kbのバンドが検出された。このバンドに
相当する断片を、λG312-2からプラスミドベクターBlue
scriptIISK(-)へサブクローニングし、pG312SalBと命名
した。さらに、pG312SalB より上流側約3kb を含むHind
III5.6kbp 断片を、λG312-2からサブクローニングし、
pG312Hin5.6と命名した。

【００８９】これらのクローンについて制限酵素地図を
作成した（図 4）。これらのクローンからさらに短い断
片をサブクローニングして部分塩基配列を決定し、得ら
れた配列を基に合成したプライマーを順次用いることに
よって両クローンの全塩基配列を決定した。

【００９０】pG312SalB の片側の配列は、実施例１
（５）で決定したｃＤＮＡ PC12の上流150bpと一致した
ため、λG312-2はRPC312のゲノムクローンであることが
確認された。

【００９１】（３）推定転写制御領域の特定 実施例１（４）で完全長ｃＤＮＡが得られなかったた
め、RPC312遺伝子の転写開始点が推定できなかった。そ
こで、推定転写制御領域を特定するため次の実験を行っ
た。

【００９２】1. 逆転写PCRによる部分ｃＤＮＡ配列の同
定 実施例１（３） 2で合成したプライマーに加え、pG312S
alB に含まれるゲノム配列上に散在するように、21種の
プライマーを合成した。ｃＤＮＡのセンス鎖方向が 14
種類、アンチセンス鎖方向が 7種類である。

【００９３】任意のセンス鎖プライマーとアンチセンス
鎖プライマーを組み合わせ、未熟雌蕊ｃＤＮＡを鋳型と
して逆転写 PCR反応を行った。反応条件は実施例１
（３） 2に記載の方法に従った。得られたPCR 産物のう
ち、明確なバンドが確認されたのは、6 種類であった。
逆転写 PCRで得られた産物のサイズは、ゲノム配列上の
プライマー間の距離と異なる場合があったが、 PCR反応
に用いた両プライマーの間にイントロンが存在するため
と考えられた。また、pG312SalB 配列上で少なくとも片
方のプライマーが HindIII切断部位の上流に位置するよ
うな場合には明確なバンドが確認されなかった。よっ
て、 RPC312 ｍＲＮＡがこの領域の配列を含まない、す
なわち、この領域が、転写開始点より上流であるか、イ
ントロンである可能性が示唆された。

【００９４】PCR 産物が得られたプライマーのうち最も
5' 側のセンス鎖プライマーは、 312SBc （5'-GGCATCC
TGGACAACACC-3'）であった。そこで、 312SBc と 312F-
Fwをプライマーとした場合に増幅される逆転写 PCR産物
を、プラスミドベクター pCRII（Invitrogen社）にクロ
ーニングした。このクローンを pc312cFFwと命名し、塩
基配列を決定した。長さは 595 bp であり、305bp に渡
り実施例１（３）2で決定したｃＤＮＡ配列と一致した
（図４）。また、 pc312cFFwの配列を pG312SalB由来の
ゲノム配列と比較すると、 pc312cFFwはイントロンに相
当すると考えられる 2カ所のゲノム配列により 3つの部
分に分けられ、各エクソン部分がそれぞれゲノム配列と
一致した。ただ、 2番目のエクソン上から 44bp が欠失
していた。これは PCRによるＤＮＡ合成の誤りと考えら
れる。また、イントロンに相当すると考えられる 2つの
配列の両端にはコンセンサス配列（GT-AG）が認められ
た。よって、このPCR産物は RPC312 遺伝子に相当する
ｃＤＮＡであると考えられた。

【００９５】2. 5'RACE法による部分ｃＤＮＡ配列の同
定 1 で同定されたｃＤＮＡ配列を実施例１（５）で決定し
たｃＤＮＡ配列と結合すると約 1.1kbであり、ノーザン
ハイブリダイゼーションから推定されたｍＲＮＡサイズ
には約0.5kb 及ばない。そこで、5'RACE法を実施するこ
とにより、さらに上流のRPC312ｃＤＮＡ配列の同定を試
みた。

【００９６】5'RACE法は Marathon cDNA Amplification
Kit（CLONTECH社）を用いて添付の説明書に従って行っ
た。但し、ｃＤＮＡ合成用のＲＮＡは未熟雌蕊ｐｏｌｙ
Ａ⁺ＲＮＡを使用して、遺伝子特異的アンチセンス鎖プ
ライマーとして、 312wα（5'-CCTGGTGTTGTAGTTGGGCATCAGGTAG-3'） （1st PCR primer） 1J2 （5'-CTGCGCCCAACGAAGTTC-3'） （2nd PCR primer） の 2種類を合成して使用した。

【００９７】RACE産物を、アガロースゲルで電気泳動を
行ったところ、300bp〜500bp の 5本のバンドが検出さ
れた。そこで、これらのバンドを pCRIIにクローニング
して16 個のクローンについて配列を決定した。その結
果、 3クローン（RA312α3,RA312γ1,RA312γ4）では、
2nd PCR primer 1J2 からRPC312由来と考えられる同一
の配列が、240bp 上流まで伸長していた。その他のクロ
ーンは数bp伸長した後に未知遺伝子の3'末 poly A が接
続したものであった。

【００９８】RA312α3 の配列をゲノム配列と比較した
ところ、2 個のエクソンから成る RPC312ｃＤＮＡ断片
であると考えられた。RA312α3 の配列は、1J2 の部位
から上流に 113bpに渡りゲノム配列と一致し、さらにイ
ントロンと考えられるゲノム配列を約 2 kb 挟んだ後、
127bp に渡りゲノム配列と一致した。ただし、下流側の
エクソンはゲノム配列から 27bp の配列が欠失していた
が、これは PCR反応におけるＤＮＡ合成の誤りと考え
た。また、イントロンと考えられる 2139 bpのゲノム配
列の両端にはイントロンのコンセンサス配列（GT-AG）
が存在した。

【００９９】3. プライマー伸長法による転写開始点の
決定 転写産物とのサイズの比較から、RPC312の転写開始点
は、上記 2までで同定したｃＤＮＡ配列の 5' 末から 1
00〜300bp程度上流に位置すると考えられる。また、ｃ
ＤＮＡ配列から推定される読み枠において、ｃＤＮＡ配
列 5' 末から上流に 80〜200bp の範囲には4つの翻訳開
始コドンATGが存在する。さらに、最も5’側のATGのお
よそ70p 上流にはTATAボックス様配列（5'-TATATA-3'）
が位置している。これらの情報を基に 2番目、3 番目の
ATGを含むような2つのプライマーを合成し、プライマー
伸長実験を行ったが、伸長産物は得られなかった。そこ
で転写開始点はさらに下流に存在すると考え、4 番目即
ち最も下流のATGを含む位置にあるプライマー 312B2（5'-ATCGGGAACGTGCCGTTC-3'） を合成し、以下の方法でプライマー伸長実験を行った。
プライマー 10 pmole をMEGARABEL(宝酒造)キットによ
り、 [γ^-32P]ATPを用いて 5'末端をラベルした。この
末端ラベルしたプライマー0.1 pmole（ 0.3×1⁰6 cpm）
と未熟穎花と葉の全ＲＮＡ約40μgとを、3units/μlのR
Naseインヒビター（ RNAguard, Pharmacia社）存在下で
緩衝液（0.25M KCl, 2mM Tris-HCl pH=8.0, 0.2mM EDT
A）中で10μlの反応系で50℃、2時間アニーリングさせ
た。その後、緩衝液（66mM Tris-HCl pH=8.3, 6.6mM Mg
Cl₂,1.3mM DTT，0.66mM dNTP,130μg/mlアクチノマイシ
ンD）を30μl、逆転写酵素（SuperscriptII ,BRL社を1
μl（200 units）加え、50℃で1時間保温した。さらに
酢酸アンモニウムを用いたエタノール沈殿を行い、70％
エタノールで洗浄後、風乾し泳動用緩衝液（T7 Sequenc
ing kit Pharmacia社）の反応停止液と0.1M NaOH,1mM E
DTAを２：１に混合したもの）に溶解した。全量を95℃
で3分間加熱した後、6％アクリルアミドゲルで電気泳動
を行った。また、同じプライマーを用い、ゲノムクロー
ンを含むプラスミドを鋳型に T7 Sequencingkitでシー
ケンス反応を行った産物、および、10bp,50bpラダー(BR
L社)をMEGARABELキットで交換反応により末端ラベルし
たマーカーも同時に泳動した。

【０１００】その結果、図５に示すように、この遺伝子
がほとんど発現していない葉のＲＮＡからは伸長産物が
得られなかったのに対し、未熟穎花の全ＲＮＡを鋳型に
した場合には、数本の伸長産物のバンドが検出された。
隣接して泳動したシーケンスラダーとの比較により、産
物の検出された位置を同定した。その結果、RPC312の転
写は5'-GAGCTGG-3'を特徴とする7塩基内の数ヶ所から開
始されることが明かとなった。最も5'側の転写開始点の
G（グアニン）の114bp上流には5'-TATATA-3'を特徴と
するTATAボックス様配列が存在していた。また、この転
写開始点のグアニンの 64bp 下流には翻訳開始点のATG
（上述の4つのうち最下流のATG）が存在していた（配列
番号 2）。

【０１０１】

【発明の効果】本発明によれば、単子葉植物の雌蕊に特
異的な遺伝子の利用が可能となる。さらに、単子葉植物
の雌蕊に対して遺伝子工学的な操作が可能となる。従っ
て、例えば雌性不稔の作出や雌蕊の形態の制御、あるい
は雌性生殖器の受精能力の向上などを行うことができ
る。

【０１０２】

【配列表】

【０１０３】配列番号：１ 配列の長さ：１５４７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa L. ） 品種名：IR24 組織の種類：雌蕊 直接の起源： ライブラリー名：雌蕊mRNA由来λZAPII cDNAライブラリ
ー及び雌蕊 cDNA PCR 産物 クローン名：pc312-1-1,PC12,pc312cFFw及びRA312 α3 配列 TGGCACTGGG GCGGCGCGGC GGCGCATGTG TTCCGGCCGC CGTGGAACGG CACGTTCCCG 60 ATGGGGCCGG GCGGCGGCGG CGGGGGGAGC GTGGGAGGAG GAGGGGGAGC GGCGGCGGCG 120 GCGTCGGTGC CGGCGATGTT CGTGTTCGGG GACTCCCTGA CGGACAACGG GAACAACAAC 180 GACATGACGT CGCTGGCCAA GGCCAACTAC CTCCCCTACG GCATCGACTT CGCCGGCGGC 240 CCAACCGGCC GCTTCTCCAA CGGCTACACC ATGGTCGACG AGATAGCTGA GCTTCTTGGG 300 CTGCCGCTGC TGCCATCTCA CAACGACGCC ACGGGCGACG CCGCGCTCCA CGGCGTGAAC 360 TACGCCTCCG CCGCCGCCGG CATCCTGGAC AACACCGGCC AGAACTTCGT TGGGCGCAGC 420 CCGTTCAACC AGCAGATCAA GAACTTCGAG GCGACGCTGC AGCAGATCTC TGGCAAGCTG 480 GGCGGCGGCG CCGCCGGCAA GCTGGCGCCG TCGCTGGCGC GCAGCATCTT CTACGTCGGG 540 ATGGGCAGCA ACGACTACCT CAACAACTAC CTGATGCCCA ACTACAACAC CAGGAACGAG 600 TACAACGGCG ATCAGTACTC CACTCTCCTC GTGCAGCAGT ACACCAAGCA GCTCACCAGG 660 CTGTACAACC TGGGGGCGCG GAGGTTCGTG ATCGCCGGAG TAGGGTCGAT GGCGTGCATC 720 CCCAACATGC GGGCGAGGAA CCCGGCGAAC ATGTGCTCGC CGGACGTGGA CGACCTCATC 780 ATCCCCTTCA ACAGCAAGGT GAAGTCCATG GTGAACACGC TCAACGTCAA CCTCCCCCGC 840 GCCAAGTTCA TCTTCGTCGA CACCTATGCC ATGATCTCCG AGGTCCTCCG CAACCCGTGG 900 TCCTACGGGT TCAGCGTGGT GGACAGAGGG TGCTGTGGGA TAGGGAGGAA CAGGGGGATG 960 ATCACGTGCC TGCCGTTCCA GCGGCCGTGC CTGAACAGGA ACACCTACAT CTTCTGGGAC 1020 GCCTTCCACC CCACGGAGAG GGTCAACATC TTGCTCGGCA AGGCAGCCTA CTCCGGCGGC 1080 GCCGACCTCG TCCACCCCAT GAACATCCAG CAGCTCGCCG CCTGGCAGCC GTAGCAGCTG 1140 TCGCCGCCGG CGGTCGTGAC ATATATCCTC TCCATTACTC TCTTCGTCCC GAAATATAAA 1200 GAATTTTGGA TGAATGAGAC ATATCTCAGT ACTACGAATT TAGATATGAA GTCTGATTAG 1260 ATTCGTAGTA TGTGTTACAT CCATCCAAAA TCTTTTCTAT TATGTGACGG ATGAAGTACT 1320 TAGGGTATGA ATCTATTCGT TTTTGCATGC AGTGTTACTA TGTTGTTGTA GCTAGGTAGG 1380 GGATGAGCTA ATGAACGAGC TGGGGTGGTG TTTGTTTGTG GGTGTGTTTG TGTGCTCAGT 1440 TTGGATTAGG GCAAGTGCTG CTTGTGTTTG TACTACTACT GCTGCTGAAT ACCCAAAAAA 1500 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1547

【０１０４】配列番号：２ 配列の長さ：４６２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：遺伝子 DNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa L. ） 品種名：IR24 組織の種類：緑葉 直接の起源： ライブラリー名：緑葉遺伝子DNA 由来λDASHIIライブラ
リー クローン名：pG312Hin5.6 配列 CTCGAGCTCC AGACGACGGT GAGCACCCTA GCCGCCAAGT TTCTGCTCCT AGCCTCCTAC 60 CACTGCTTTG CCGTCACCTC CTCCCCTCCC ATCTTCCCCA CGCGATGACG AGCAACAGTC 120 GTGGCGACGA TGGGAGGGGG AGGCCGACGT CGCGGTGTTC GGGATCTCTA CTGAGCGGAT 180 ACGGCCACAG TGCTATGGCT TCCATCCTCA ATGACTTGGT GCCATGCGAT CCAGCCTTAC 240 AGGGATGGAT ATTGGTGGTG ACAAGGCAGT GGGGTTCTCC GGGTGTCGTT CTGTTGAAGT 300 TGAAGGAGAT GAAGCGGCCC ATGCAATCAC GTTCCATCGT CGTTGGCCTT TCCATAAGCT 360 CCCTCTCCTC GCAGCGACGG AGTTGAGAGT ACTTGTAGCG ATCACAGGGC CATCATGCAC 420 TGTCGGGCAA TAGAGAGAGG AGAAGAGAGA GAAAGAAAAG AGGGGTAGAG CAAGAGTCAA 480 TGACATATGG TCCCACATGC TAACTCAGTC GGTTTGACCA TGTCAACGAG TCACGTCTAC 540 GAAAACCGCC CTTAAAATAA TACGTGAGAG TCAAAGTACA CCTATTTTAA TAGTTGGAGG 600 TTCAAAATAT ATGATAAGTA TTTCGGTTGA AAGATACGGG TTAGATTAGA CTTACCCCGC 660 CGTCCAAAAA AAAGACCAAT CCTACCCATA ACTAGGAATT CATTTTTTTT AACAAGGTAG 720 TATATTTGAA GGGATCAAAG TGGATTTATT CCGAGATTGA AAATGTACGC CGAAGGTCCG 780 TCAACTTGTC ATCGAGTTAC AAAATCGTCC CCCAACCGCA AAACCAGATA TCGGGCGTCT 840 CTTAACTAAC CAAAACCGGT CACAATAGGT CTTTCGGTGG TTTTGACCCC AGTTTTATCC 900 TACGTGGCGG CTGAGTCAGC GTGGGACCTA CGTGGGCCCC ACATGTCAGC GTGGCCACAT 960 TAACCTCCCC CCTCTGTCTT ACCCTCCTCT CTCTTCCTTA TCTCTCTCTC CATTCTCTGA 1020 CTCAGCCGGT GGGAAGAGGA AAGCATCGGC GGCCGCCAAC GCAGTGCTCC CTTTCCCGTC 1080 CCGGTCTCCC CCGCCACCCT CGACTCGCTC CCCTCCCCTT CCCCGCCATT CCCATCCCCA 1140 CCCCCCACAC CCGCTGCCGC CCACCTCGCC GTCTCCACGC CTGACTTCGA CGCCATGGCG 1200 GGGGCCCTCT TCGCGCGCCC CGGTGGCCAC ATGCGCCGCG CGGGCGAGGA GGGTGAGGCT 1260 GTCGCGCTCG TCTCCAACGA GGCCGATGCC GTGTCACCCG CCGCCTCCTC CTCTCCCGCC 1320 TCGCCCCGGC GTCCTCCTCC CTAGCCACCG GCCGGCTTGC CTAGAGAACA TGAGAAAAGA 1380 AGAGAAGAGC GAGAGGAGCA AGGAAGAGAG AGATAACGTG GCAGCCAAAC ATGTGGGTTC 1440 CACGTGGATT AATATTCCAC GCTGATTTAG CAGCCACGTA GAACAAAATC AGGGTCAAGA 1500 CCGTTGAAGG ATTTATTGTG ACCAGTTTTG ATTACTTAAG GGACGCCAGA TATCTGGTTT 1560 TGCACTTAGG GGACGATTTT GTAACTCGAT GACAAGTTGA GGGACCTTCG GTGTACTTTT 1620 TCCTTCCGAG AAAGAAAAAA AAGGCTCCCC TCGGGAGAAA TTCGGCCCGG CCCAGCTCTT 1680 TCAGCTACAC GGGTCCGGTC ACCGCGTCTC GTCGTCGTGG CTTGCCGGCC GGTGATCCAC 1740 CTCACTGTCG CTGCACCAGT GCACAGTGCA CAGCATGGTG CACGGCTTCC GAGGGACGCA 1800 CAGCTCGCTC CACCATGTCC ATGCATTTAC TCGCCACGCC AGAGATGGCA GAGGTGGTGG 1860 TGAAACTGAA ACCTCACCGG CTCAACATTT ACTGCTCCCC CCACCCCATC TACCCACCAA 1920 CCACCGGCGC TAGCTCTCAC CGCTCCAAAA CCCTCTCTCT GCCCCCTCTC CTATATACAC 1980 ACACGCACAG GCGCTAAAGC TCACACTCCT CACTGCCTCA CTGCAGCTCT GCTCCGCTGC 2040 AATGGCGCGC CACCCCGTGC TGATGCTGCT CGTCGTGGTG GTGATGAGCT GGCACTGGGG 2100 CGGCGCGGCG GCGCATGTGT TCCGGCCGCC GTGGAACGGC ACGTTCCCGA TGGGGCCGGG 2160 CGGCGGCGGC GGGGGGAGCG TGGGAGGAGG AGGGGGAGCG GCGGCGGCGG CGTCGGTGCC 2220 GGCGATGTTC GTGTTCGGGG ACTCCCTGAC GGACAACGGG AACAACAACG ACATGACGTC 2280 GCTGGCCAAG GCCAACTACC TCCCCTACGG CATCGACTTC GCCGGCGGCC CAACCGGCCG 2340 CTTCTCCAAC GGCTACACCA TGGTCGACGA GATAGGTGCG TCGCCGTCGC CCATAGCTCC 2400 ATCTATCTAT ATGCTCCATG CATTTGCATT TTGCCTAATG CAGCTTAATA CAAAGATATG 2460 TATTCCCGAA GAAATATGCA GTAGCTAGTA GTGCAGATAT GCTGCTTCTA CTGGATGTCA 2520 CATACATATG GGCCGTCATA GTTCATCTTG TTGTAAATTT TTAAATTACT TAGGGCTTGT 2580 TTGGCACATC TCAAGAAAAA TAAAGTAGAG CTGAGCCAAG CCAAACACTT TCGTTGGGTG 2640 GAACGTTTTC ACAAAATGAA CTAGAGAGAT GGAACTAGGT TTACACTGCT TCACAACCTC 2700 ACTCCGAATT GGAACTCTAC AAAATGGCCC TTAAAACTAG TTTTGCAAGC TATAACGCTT 2760 TGGAATGTTC TTCGAATAAG AAAATGATAA AGTTCAAATA CTTCTATAGC TCTAGCAAGA 2820 AATATTACTT ATTTTGTGTT TTCAGAAAAA AAAAAGGACT TCTTCCATAT TTAGTTATGT 2880 GTGTAGTCAC ACAGTCGGTC ATATGCTAGA AAATAAGTTA TGATAAAAAA ATCAACTCTA 2940 AAATTTAGTA TTGGAATTTA AATTTTAGTA GCGGCTTAAT TATAAGCTAG AGGATGAAAG 3000 ATGGGATATC TTTGGTTTCC TTTTAGGTAC TGTACTGACT GTTCAAAAGT AACTATTTTA 3060 TTTTCATTTT GGGATCTAAT AGTTATAGTT ATGAGCATTT GAATTATGAC TAACAGAAAA 3120 TCTTACTGGA ATTAATGAAG ATTTTCCAAA CCAAGTAGAA TCCAAAGCAC ATAACAACAG 3180 CTACAATGGA CTCTTAGAAA TGGGAGTTGT TAGTATGTGA GGAAGGGCCC ACGCTGCAAA 3240 TTAAACCAAT TGAAGGCTTT GTAATTGTAC TTCTAGTTCA TTATACTTGC TTTTAGCAAC 3300 GGGTGTTGTA GTATGTGAAA TGCTAACTTT AATCTGCTAC TGCTAGTGCA CTGCAATACC 3360 TCCTTAATAA TTAATTACTG ATTAATTAAT CTTGGTACAT CCTTAAGTGA GTTAATCTTA 3420 CAATAAATAA TAAATGGAAG TGTGTTAAGC TAACTACTCT GTTGTGGAAG AGGACTTCAG 3480 TTACTACTTG TTTACCAATC TTTGAAATTT CGTTTCAATG CTAGTATAAT GTTGAAGTAA 3540 TTTATTTATA AATCAAGTGT TTCACCTGTT CCATTCTGGA TGTCTTGGGT GTGCATATCA 3600 TATTTTAATT TCTCAGGAAA CCTACACTTC TTCTCGATCT GTATATGTAT CTGGACACAA 3660 TTGTGTAGGT ATCTACAATT TCATTGTTTG CAATGTTTGG ATAGCTGTCT CCTCTGTTTT 3720 ACTTGAAGAA GCAATGCAAG TCAATATACT AGAGAGGATG CCACAATGAA GCATAGATTA 3780 TGTGTAGTAT ACATAGTACT TGTCCTAATT GAAACCCACA CATGTGCACA CACACACACA 3840 GTGCATGTAA TGGTCCTTGC AAAATTTAGA TTGGTTAGCT AGCTTTGTAT GAACATCCTA 3900 GCTAGCTAGA GTAAGTGCCG CAGTTATAAT ACTCACCACC CTCTTGCATG TGCACATTCA 3960 AAGATTTCAA CTCATATCCA ATATGGCCTC CGTAGTGATC CATGGAGTAA TAATGGCAGT 4020 GCTCTCAATT TCTCCCATGG GTAGGTCTGC CCTACCATTG ATTCACCTCA TGCAGTACAC 4080 ATCATGGTGA TGAATTTTCA TCGACGAGTA GTAGCAGCTA GCACTGTACC AGCGAGTGGG 4140 GAATCAATGT TTCCATGTGA CTCTATCCGG AATTCCAGAG GCTATGGCTG TAAATGCAGA 4200 AGTGTGTGTA CACTGTGCAG CATGCATGGA TGGATGGATA TGCAGTTGCA GTCCTTGATA 4260 AGAATTTACC AGCAACAAGA GTGACATCCT TACAAATTAG TACTAATTAC TAGCCAGATC 4320 TGTCCTTGAC CGCGACTGAT CTTTAGTGTC GTACCTACTC CAGCTTAGTA GTGGTAATAG 4380 CTAAAATTTA TCAGTGCAAA AGATAAATTT AAACTTTGCA AAACAAGAAG ATGTTTGATC 4440 AAGAACAGAG CTAAGCCGTA AGCTTCACTG AAATTATTAT TGTATACTAA TTGTCTCGTT 4500 GGATTTTTCA TCAGCTGAGC TTCTTGGGCT GCCGCTGCTG CCATCTCACA ACGACGCCAC 4560 GGGCGACGCC GCGCTCCACG GCGTGAACTA CGCCTCCGCC GCCGCCGGCA TCCTGGACAA 4620 CACCGG 4626

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、RPC312遺伝子のノーザン解析の結果を
示す写真である。

【図２】図２は、RPC312遺伝子の RT-PCR 解析の結果を
示す電気泳動写真である。

【図３】図３は、RPC312遺伝子の遺伝子クローン及びイ
ネ全DNA のサザン解析を示す写真である。

【図４】図４は、RPC312遺伝子の解析に用いたｃＤＮＡ
クローンおよび遺伝子クローンの制限酵素地図および相
関図を示す。

【図５】図５は、プライマー伸長によるRPC312遺伝子転
写開始点の決定の結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の塩基番号６１−１１３１の
   塩基配列からなるＤＮＡ、または前記塩基配列からなる
   ＤＮＡと温和な条件下でハイブリダイズし、かつ、前記
   塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質と同じ
   生物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含
   む、単子葉植物由来の雌蕊特異的に発現する遺伝子。
2. 【請求項２】 イネに由来する、請求項１に記載の遺伝
   子。
3. 【請求項３】 配列番号２に記載の塩基配列若しくはそ
   の一部、またはこれらの塩基配列において１若しくは複
   数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有
   するＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 構造遺伝子および前記構造遺伝子に機能
   可能なように結合された請求項３に記載のＤＮＡ断片を
   含むベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のベクターによって形質
   転換された植物細胞形質転換用細菌。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の植物細胞形質転換用細
   菌を介して形質転換された植物細胞または植物細胞培養
   体。
7. 【請求項７】 請求項６に記載された植物細胞を有する
   植物またはその種子。